microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒中的应用
microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域；更具体地，涉及microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前 病变的试剂盒中的应用，为临床上HPV阳性妇女的分流W及宫颈癌或其癌前病变的检测提 供辅助诊断。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是全球最常见的女性恶性肿瘤之一。据世界卫生组织国际癌症研究署 (International Agency for Research on CancerJARC)估计，2008年全球约有52. 9万例 新发宫颈癌，其中85%发生在欠发达地区，59%发生在亚洲；死亡病例达27. 5万，其中85% 死亡病例发生在发展中国家。据中国癌症中必72个肿瘤登记处的数据显示，中国在2009年 登记的宫颈癌发病率为12. 96/10万，且中国宫颈癌的发病正呈年轻化趋势发展（应倩等， "中国2009年宫颈癌发病与死亡分析"中国肿瘤2013,22:612-616)。宫颈癌的高发病率和 年轻化趋势严重影响着中国广大妇女的健康和生活质量，因此对宫颈癌或其癌前病变的早 期诊断和防治意义十分重大。
[0003] 自20世纪40年代W来，己氏涂片开始被广泛用于宫颈癌筛查。宫颈细胞学检查 具有较高的特异性，但其最主要的不足是敏感性低。单次常规己氏涂片对于诊断高级别宫 颈上皮内瘤变（cervical inhaepithelial neoplasia，CIN)的敏感性仅为 50%左右。20 世纪90年代开始发展了液基细胞学（liquid-based ecology, LBC)检查，LBC通过专用设 备实现了液基细胞的薄层制片，提高了宫颈脱落细胞标本的满意率，但对于诊断高级别CIN 的敏感性仍较低，仅为38-65 %，送与常规己氏涂片相比，并无显著差异。
[0004] 德国著名医学科学家Harald zur Hausen早在20世纪70年代研究发现高危型人 乳头状瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌的成因。事实上，宫颈癌的发 病一般需要经历从HPV持续感染到不同程度的CIN(CIN1-CIN3)，最后发展成为宫颈癌。送 个过程一般比较漫长，平均需要10-15年时间，送为宫颈癌或其癌前病变的早期发现和阻 断提供了足够的时间。基于高危型HPV与宫颈癌之间存在明确的病因关系，HPV检测已被 欧洲生殖道感染和肿瘤研究组织巧UR0GIN)推荐作为宫颈癌的初筛手段。然而，HPV检测 的最大局限性在于阳性预测值低。有研究表明，近90%的HPV阳性妇女是一过性感染，HPV 会在2年内被机体免疫清除，仅有少数发展为持续感染（de Sanjos6 et al.，"Worldwide prev曰lence 曰nd genotype distribution of cervic曰1 hum曰n p曰pillom曰virus DNA in women with normal cytology:a meta-analysis"Lancet Infect. Dis. 2007,7:453-459)； 而在HPV持续感染的妇女中也仅有少数会最终发生宫颈癌（化bie and化schieri， "Understanding HPV tests and their appropriate applications" Cytopathology 2013,24:289-308)。临床上，HPV检测容易导致阴道镜回叫率和宫颈活检的比例增加，造成 过度诊疗，从而增加了患者的精神压力及随诊费用。因此，选择恰当的方法对HPV初筛阳性 妇女进行合适的分流是有效管理大量HPV初筛阳性妇女的关键。
[0005] microRNA(miRNA)是近年来发现的一类非编码小分子RNA，它能在转录后水平调 控基因的表达，其表达情况与机体众多生理病理状态密切相关。越来越多的研究证据表明， 异常的miRNA表达是人类疾病的标志，包括肿瘤。但遗憾的是，miRNA(特别是宫颈脱落细 胞中的miRNA)检测在宫颈癌或其癌前病变筛查中的应用研究却仍不多。此外，关于新的与 宫颈癌或其癌前病变相关miRNA也有待进一步挖掘。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒中的 应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供miR-375和/或miR-424的用途，用于制备诊断宫颈癌 或其癌前病变的诊断试剂。
[0008] 在一个优选例中，所述的诊断试剂包括：
[000引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0010] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[00川在本发明的另一方面，提供特异性检测miR-375和/或miR-424的试剂的用途，用 于制备诊断宫颈癌或其癌前病变的诊断试剂盒。
[0012] 在一个优选例中，所述的特异性检测miR-375和/或miR-424的试剂包括：
[001引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0014] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[001引在另一优选例中，所述的特异性扩增miR-424的引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:8 和沈Q ID NO: 11所示。
[0016] 在另一优选例中，所述的特异性扩增miR-375的引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:9 和沈Q ID NO: 11所示。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种用于诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒，所述试 剂盒中包括：
[001引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0019] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[0020] 在一个优选例中，所述试剂盒中包括特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424 的DM探针，并且，还包括：
[0021] (3)捕获抗体，其是抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体，其包含于溶液中或被固定于 固相载体上；和
[0022] (4)检测抗体，其是连接有可检测信号的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体。
[0023] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括选自下组的一种或多种试剂或组件：
[0024] 样品裂解液；
[0025] 洗涂液；
[002引变性液；
[0027] 阴性质控品；
[002引 阳性质控品；
[0029] 鉴定可检测信号的试剂；和/或
[0030] 微孔板。
[0031] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括；特异性扩增miR-218的引物；或特异性 识别（结合）miR-218的探针；较佳地为DNA探针。较佳地，所述的特异性扩增miR-218的 引物的核巧酸序列如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示。
[0032] 在另一优选例中，所述的可检测信号选自；碱性磯酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖 氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，过氧化氨酶或葡萄糖淀粉酶；所述的鉴定可检测信号的 试剂是所述碱性磯酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，过氧化 氨酶或葡萄糖淀粉酶的底物。
[0033] 在另一优选例中，所述试剂盒中包括特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物， 并且，还包括：
[0034] 总RNA提取试剂；
[00对逆转录试剂；
[0036] miR-375 和 / 或 miR-424 逆转录引物；
[0037] miRNA的PCR检测试剂；
[00測 miRNA核酸扩增引物；
[003引阴性质控品；和/或
[0040] 阳性质控品。
[0041] 在本发明的另一方面，提供一种诊断宫颈癌或其癌前病变的方法，所述方法包括： 应用所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞样本中miR-375和/或miR-424的存在 量；较佳地，该方法包括：
[0042] (1)将待测样本裂解后，与所述的特异性识别miR-375和/或miR-424的DNA探针 进行杂交反应，获得杂交液；
[0043] (2)将杂交液加样到包被有捕获抗体的固相载体上，在固相载体上形成捕获抗体 与DNA-RNA杂合体二元复合物；
[0044] (3)将检测抗体加样于固相载体，在固相载体上形成捕获抗体、DNA-RNA杂合体和 检测抗体Η元复合物；
[0045] (4)鉴定固相载体上的可检测信号，确定待测样品中miR-375和/或miR-424的存 在量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞中的存在量，则提 示该受试者存在宫颈癌或其癌前病变；
[0046] 或者，所述方法包括：应用所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞样本中 miR-375和/或miR-424的存在量；较佳地，该方法包括：
[0047] (a)提取受试者离体宫颈组织或细胞样本的总RNA ;
[0048] 化）利用miR-375和/或miR-424逆转录引物进行逆转录，获得miR-375和/或 miR-424 的 cDNA ;
[0049] (C)利用特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物进行PCR扩增，确定miR-375 和/或miR-424的存在量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或 细胞中的存在量，则提示该受试者存在宫颈癌或其癌前病变。
[0050] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0051] 图1、组织学正常、高级别CIN(CIN2-CIN3)、鱗状细胞癌（see)的宫颈脱落细胞（η =6)中miRNA的表达谱。
[0052] 图2、一些感兴趣的miRNA在高级别CIN(CIN2-CIN3)、鱗状细胞癌（see)的宫颈脱 落细胞中的表达的上调或下调情况。
[0053] 图3、RT-qPCR检测宫颈癌组织和正常组织中miR-375相对表达水平。
[0054] 图4、RT-qPCR检测宫颈癌组织和正常组织中miR-424相对表达水平。
[0055] 图5、针对CIN2+(CIN2及W上）样本，各候选miRNA的R0C曲线。
[0056] 图6、针对CIN3+样本各候选miRNA的R0C曲线。
【具体实施方式】
[0057] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现miR-375和miR-424在宫颈癌或其癌 前病变的组织或细胞内明显低表达。进一步的大样本验证发现，送种低表达与宫颈癌或其 癌前病变存在明显的相关性。基于此，本发明提供了一种基于测定miR-375和/或miR-424 的存在量的宫颈癌或其癌前病变的诊断方法，该方法较现有的临床宫颈癌或其癌前病变诊 断方法具有更好的准确性。
[0058] 术语
[0059] 如本文所用，"待测样本"或"待测核酸值NA)样本"是指待检测的核酸样本，其中 含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标miRNA。较佳地，所述的"待测样本" 是宫颈组织、宫颈脱落细胞或其裂解物。
[0060] 如本文所用，"目标核酸"是指感兴趣的核酸，例如其是一种标志物或是疾病相关 的。
[0061] 如本文所用，"DNA-RNA杂合体"是指一种核酸，其含有两条链，其中一条链是DNA 链，另一条链是RNA链，所述的DNA链和RNA链的核巧酸序列是基本上互补的。"基本上互 补"是指核巧酸的序列是足够互补的，可W W-种可预见的方式发生相互作用，形成双链。 通常，两条"基本上互补"的核巧酸序列互相之间至少有70%的核巧酸是互补的；优选的， 至少有80%的核巧酸是互补的；更优选的，至少有90%的核巧酸是互补的；进一步优选的， 至少有95%的核巧酸是互补的；如98%、99%或100%。
[0062] 如本文所用，"探针"是指一种具有已知核巧酸序列的单链核酸（本发明中优选 DNA)，其具有与目标核酸基本上互补的核巧酸序列结构，可W与"目标核酸"形成双链。所 述的"探针"可W携带标记物或不携带标记物。例如，标记物可W连接在探针的5'末端或 3'末端。
[0063] 如本文所用，"捕获抗体"是指可被包被在固相载体上的，特异性地识别和结合所 述的DNA-RNA杂合体的抗体，其不结合单链的核酸（包括DNA或RNA等）。所述的"捕获抗 体"通过识别双链杂交体的双螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特 异性的。将抗体包被在固相载体上是本领域技术人员熟知的技术。术语"捕获抗体"可W 与"包被抗体"互换使用。
[0064] 如本文所用，"检测抗体"是指特异性地识别和结合所述的DNA-RNA杂合体的抗体， 其不结合单链的核酸（包括DM或RNA等）。所述的"检测抗体"通过识别双链杂交体的双 螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特异性的。所述的"检测抗体"携 带有可检测信号，用于报告双链杂交体的捕获情况。
[0065] miR-375和/或miR-424作为诊断标志物
[0066] 本发明人通过miRNA芯片技术，比较分析了组织学正常、高级别CIN(CIN2-CIN 3)、鱗状细胞癌（see)的宫颈脱落细胞中miRNA的表达谱。利用miRNA的相对表达量，筛选 获得了多个表达差异较显著的miRNA作为宫颈癌及其癌前病变诊断潜在的标志物。其中有 14 个 miRNA (let-7b、miR-145、miR-126、miR-199a、miR-195、miR-29a、miR-375、miR-lOb、 miR-29c、miR-218、miR-424、miR-100、miR-12化、miR-99a)在宫颈癌及其癌前病变组织中 表达下调，17 个 miRNA(miR-155、miR-92a、miR-92b、miR-224、miR-221、miR-222、miR-31、 miR-182、miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-185、miR-93) 在宫颈癌及其癌前病变组织中表达上调。进而，本发明人通过回顾性和前瞻性研究，在大 样本量中进行miRNA表达研究，结合与宫颈细胞学检测技术的比较，最终确定了 miR-375、 miR-424在宫颈癌或癌前病变的组织或细胞中表达量显著降低，miR-375、miR-424单独或 组合可应用于诊断宫颈癌及其癌前病变。
[0067] 其中，miR-375 〇isa-miR-375 (MIMAT0000728))序列如下：
[0068] 5, -UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3,（SEQ ID N0:1);
[0069] miR-424 〇isa-miR-424(MIMAT0001341))序列如下：
[0070] 5'-CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA-3,（SEQ ID N0:2)。
[0071] 值得注意的是，目前还没有关于杂交捕获技术用于miRNA检测的相关报道，更没 有检测宫颈脱落细胞中miRNA的相关报道。
[0072] 基于本发明的新发现，可W WmiR-375和/或miR-424作为诊断标志物（标记物）。 通过分析待测样本（样品）中miR-375和/或miR-424的表达情况或存在量，从而得知受 试者是否患有宫颈癌及其癌前病变W及判断患病的严重程度，为疾病的诊断或预后提供依 据。作为本发明的优选方式，当测得miR-375和/或miR-424的表达量或存在量显著比正 常组织低2倍W上，更佳地低3倍W上，更佳地低4倍W上，则判断提供该待测样本的受试 者可能患有宫颈癌及其癌前病变。作为本发明的优选方式，所述的待测样品或待测样本是 患者的宫颈组织、宫颈脱落细胞或其裂解物。
[0073] 可采用各种技术来检测miR-375和/或miR-424的表达情况或存在量，送 些技术均包含在本发明中。检测核酸可用的已有技术如（但不限于）：基因芯片技术 (microarray)、Nanostring nCounter、RNA-seq、核酸质谱、探针杂交技术、聚合酶链反应 (PCR)、Ncxrthe;rn Blot等方法。优选的方法将在后面描述。
[0074] 本领域中，疾病中发生差异表达的基因作为标志物是人们已知的，然而本领域人 员基于检测灵敏度等方面的考虑，通常均选择与正常基因表达相比，表达发生显著性上调 的标志物作为研究对象，开发检测标记物的试剂。而本发明中，选择了表达下调的miRNA作 为诊断标志物，并且也可实现良好的检测效果，送是在人们的预期之外的。
[00巧]miR-375 和 / 或 miR-424 的检测
[0076] 作为本发明的一种选择方式，采用基于核酸扩增的miRNA检测方法。一种基于核 酸扩增的检测方法包括：
[0077] (1)提取待测样本中总RNA (包含miRNA);
[0078] (2)对目的miRNA (包括miR-375和/或miR-424)进行逆转录，合成相应的cDNA ;
[0079] (3)采用目的miRNA (包括miR-375和/或miR-424)特异的上下游引物，通过PCR 特异性扩增目的miRNA,使检测信号放大；
[0080] (4)确定目的miRNA (包括miR-375和/或miR-424)的表达量；若miR-375和/ 或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞中的存在量，则该受试者存在宫颈癌或 其癌前病变。
[0081] 作为本发明的优选方式，采用基于杂交捕获的miRNA检测方法来检测待测样本中 miR-375和/或miR-424存在量或表达量。
[0082] 基于杂交捕获的miRNA检测方法类似于化ISA反应原理。但是，本发明人设计的方 法中，抗体捕获的对象是特殊的，即由DNA与RNA互补形成的DNA-RNA杂合体，而非常规的 蛋白质。具体原理是；样本中的存在miR-375和/或miR-424,所述miRNA可与特异性DNA 探针结合为DNA-RNA杂合体，DNA-RNA杂合体与包被有捕获抗体的固相载体（如微孔板）上 的捕获抗体结合，再与偶联有可检测信号的检测抗体结合，通过检测可检测信号，定性检测 样本中的miR-375和/或miR-424, W及实现诊断。
[0083] W双链杂合体作为抗原与W蛋白质作为抗原不同，本发明的针对DNA-RNA双链杂 合体的抗体无特定的序列或抗原决定簇的要求，其特异地识别杂合体所特有的双螺旋结 构。抗DNA-RNA抗体（无论是单克隆或多克隆抗体）能与任何DNA-RNA杂合体相结合。
[0084] 作为本发明的优选方式，一种基于杂交捕获的miRNA检测方法包括：
[0085] (1)待测样本裂解液裂解后释放核酸，得到含有miRNA的样本；
[0086] (2)将含有miRNA的样本与特定的单链DNA检测探针混合后杂交，形成DNA-RNA杂 交体。所述单链DNA探针根据目的miRNA序列设计。此杂交体可由事先联到固相载体表面 (如96孔微孔板表面）的识别探针的特异捕获抗体或核酸捕获；
[0087] (3)位于固相载体上的被捕获的DNA-RNA杂交分子由一个偶联有可检测标志物的 抗DNA-RNA杂交分子的检测抗体结合；
[008引 （4)加入与标记的可检测标志物相对应的检测底物，产生指示miR-375和/或 miR-424存在量或表达量的信号；若miR-375和/或miR- 424的存在量显著低于正常宫颈 组织或细胞中的存在量，则该受试者存在宫颈癌或其癌前病变。
[0089] 作为本发明的可选择方式，所述的DNA-RNA杂交分子上可结合多个单克隆抗体， 每个单克隆抗体分子亦可偶联多个可检测标志物如酶分子，从而使得生物样品中特定核酸 的量能通过该信号系统得W逐级放大。
[0090] 本发明的基于杂交捕获的miRNA检测方法无需采用对实验室环境要求高的PCR 技术，克服了 PCR技术中实验污染不易控制、假阴性高、存在的竞争抑制W及受样本保存及 DNA提取过程等影响的缺点。
[0091] PCR检测需要专口的临床PCR实验室，适用于软硬件条件相对较好的机构，可能 不适用于基层医院的检查。同时，PCR检测方法灵敏度极高，在操作时需要避免假阳性及 交叉污染的产生。而基于杂交捕获的miRNA诊断技术则适用面更广，对操作环境及仪器的 要求相对较低，且检测的准确性也良好。基于杂交捕获的miRNA诊断方法是一项快速、简 便、灵敏的方法，由于不需要核酸提取且没有PCR方法的模板扩增过程，成功地克服了 PCR 方法的弱点，即交叉污染、繁琐的DM分离预处理、定量测定不准确、引物受病毒变异的影 响等。同时也能够克服传统化ISA方法灵敏度低、无法定量测定等缺点，检测灵敏度可达 lX10l5mol(即fmol)W上。因此，该技术更适用于中国基层地区对于HPV阳性患者的分流 W及宫颈癌或其癌前病变的诊断。
[0092] 检测miR-375和/或miR-424的试剂盒
[0093] 作为本发明的优选方式，提供了基于杂交捕获的miRNA检测试剂盒。较佳地，所述 试剂盒中包括：特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针。更佳地，所述试剂盒 中还包括；捕获抗体，其是抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体，其包含于溶液中或被固定于固 相载体上；和检测抗体，其是连接有可检测信号的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体。
[0094] 所述的探针的选择或设计可W根据具体检测的目标miRNA而改变，探针的长度也 可W根据目标核酸的长度而定。作为本发明的优选方式，探针试剂是含有脈盐的缓冲溶液， 具有保存核酸探针不被降解的作用，并且和变性后的样本混合进行杂交时，使抑值接近中 性，有利于进行核酸的碱基互补配对杂交。
[0095] 所述的捕获抗体与所述的检测抗体可W应用相同的抗体或不同的抗体来制备，即 检测抗体在不携带可检测信号的情况下可W是与捕获抗体相同的或不同的。W DNA-RNA 杂合体作为抗原与W蛋白质作为抗原不同，抗DNA-RNA杂合体所产生的抗体无特定的序 列或抗原决定簇的要求，其特异性识别双链杂交体所特有的双螺旋结构。抗DNA-RNA抗 体（无论是单克隆或多克隆抗体）能与任何DNA-RNA双链杂交体相结合。利用特定的 双链杂交体来制备抗所述双链杂交体的抗体的方法是本领域已知的技术，例如可W按照 Kitagawa&Stollar 的方法化itagawa Y,Stollar BD, Mol Immunol 1982,19 :413-420)来 制备多克隆抗体；或可W按照Fliss等的方法（Fliss I,Laurent Μ, Emond E, et al.,Appl Environ Microbiol 1993,59:2698-2705)来制备单克隆抗体。
[0096] 本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与包被抗体相结合（偶 联、连接）即可。例如，所述的固相载体选自；微量滴定板（如96孔板）、载玻片、试纸或微 球。将抗体包被到固相载体上的技术也是本领域技术人员所熟知的。
[0097] 所述的可检测信号是连接或偶联于检测抗体上的、用于报告检测抗体的结合情况 的报告分子。优选的，所述的可检测信号选自；碱性磯酸酶（AP)，辣根过氧化物酶（HRP)， 葡萄糖氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，过氧化氨酶或葡萄糖淀粉酶。送些可检测信号具 有特定的底物，在与底物接触后可W发生显色反应或其它可被检测到或可见的反应，从而 报告检测抗体的结合情况。所述的底物比如；用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺（0PD)、四甲 基联苯胺（TMB)、ABTS;用于碱性磯酸醋酶的对硝基苯磯酸醋（p-nitro地en^地〇3地ate, p-NPP)、CDP-Star ;等等。
[0098] 此外，为了便于操作，本发明所述杂交捕获试剂盒中还可含有其它用于解链、杂 交、捕获、洗涂、检测、显色等操作所需要的各种试剂。所述的试剂包括但不限于上述样品裂 解液试剂、杂交试剂、洗涂试剂W及识别所述可检测信号的底物或显色剂。W及阳性质控品 和阴性质控品。
[0099] 样品裂解液中的高浓度盐离子及去垢剂的存在，能使蛋白质变性将病原体裂解， 革己标核酸得到释放。同时裂解液中的脈盐也能有效保护核酸，延长样本的保存时间。
[0100] 作为本发明的另一种可选方式，作为本发明的优选方式，提供了基于核酸扩增的 miRNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物。较佳 地，还包括：总RNA提取试剂；逆转录试剂；miR-375和/或miR-424逆转录引物；miRNA的 PCR检测试剂；miRNA核酸扩增引物；阴性质控品和/或阳性质控品。
[0101] 本发明所述与宫颈癌或其癌前病变相关的miR-375或miR-424既可W作为独立的 诊断标志物，也可W组合用作诊断标志物，或还可W是miR-375、miR-424和miR-218的组 合。相应的诊断方法及试剂盒可W是针对miR-375和miR-424的单独或组合W及miR-375 和miR-424与miR-218的组合检测。此外，还可结合其它诊断宫颈癌或其癌前病变的标志 物共同应用。
[010引 其中，miR-218 0isa-miR-218(MIMAT0000275))的序列如下：
[0103] 5'-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3'（SEQ ID N0:3)。
[0104] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第Η版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0105] 实施例1、宫颈癌相关miRNA标志物的筛选
[0106] 1、miRNA表达差异的芯片初筛
[0107] 本发明首先通过miRNA芯片，比较分析了组织学正常、高级别CIN (CIN2-CIN3)、鱗 状细胞癌（SCC)的宫颈脱落细胞（η = 6)中miRNA的表达谱（图1)。利用AN0VA分析，从 875个人基因组miRNA(Sanger miRBase releasel3. 0)中，筛选获得了 31个表达差异较显 著的miRNA作为宫颈癌或其癌前病变诊断潜在的标志物。其中，有14个miRNA(let-7b、 miR-145、miR-126、miR-199a、miR-195、miR-29a、miR-375、miR-lOb、miR-29c、miR-218、 miR-424、miR-100、miR-12化、miR-99a)在宫颈癌或其癌前病变组织中表达下调，有17 个 miRNA(miR-155、miR-92a、miR-92b、miR-224、miR-221、miR-222、miR-31、miR-182、 miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-185、miR-9：3)在宫颈 癌或其癌前病变组织中表达上调。在上述31个表达差异miRNA中，miR-375和miR-424等 几个miRNA表达变化幅度较大（图2)。
[0108] 2、RT-qPCR测定miR-375和miR-424在宫颈癌和正常组织中表达差异
[0109] 通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)在正常和宫颈癌组织中验证前述确定的几个 miRNA的差异表达特性。
[0110] 其中，引物如下（其中，U6作为miRNA内参）：
[0111] miR-375 逆转录引物；5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCA CGC-3GEQIDN0:4)';
[0112] miR-424 逆转录引物；5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTC AAA-3' (SEQ ID N0:5);
[0113] U6 逆转录引物；5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'（SEQ ID N0:6);
[0114] miR-218 逆转录引物；5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACA TGG-3'（SEQ ID N0:7)
[0115] miR-375qPCR 上游引物；5, -AGCCGTTTGTTCGTTCGGCT-3'（SEQ ID N0:8);
[011 引 miR-424qPCR 上游引物；5, -CGAAGCAGCAGCAATTCATG-3,（沈Q ID N0:9);
[0117] miR-218qPCR 上游引物；5, -GCGCGTTGTGCTTGATCTAA-3'（沈Q ID N0:10)
[0118] miRNA qPCR 通用下游引物；5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3'（沈Q ID N0:11);
[0119] U6qPCR 上游引物；5, -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'（沈Q ID N0:12);
[0120] U6qPCR 下游引物；5, -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3,（SEQ ID N0:13)。
[012 1] 其中，RT-qPCR流程如下：
[0122] (i)宫颈脱落细胞中总RNA (包含miRNA)的提取
[0123] 用液基细胞学检查专用的细胞软刷在宫颈表面顺时转旋转5圈后将刷子浸入液 基细胞学检查专用的细胞保存液中。用于进行总RNA提取，提取方法如下；（1)将细胞保存 液（含宫颈脱落细胞）转移到15ml离必管中，4°C，150化pm离必10分钟。（2)弃上清，加 入1. 0ml 4°C化izol溶液，用移液器灭菌枪头反复吹打后转移到1. 5ml灭菌离必管中，静置 10分钟。（3)加入0. 2ml氯仿，充分震荡60砂，冰上静置30分钟，4°C，12000巧m离必15分 钟。（4)吸取上清，转移到另一个1. 5ml灭菌离必管中，加等体积的4°C异丙醇，混匀，冰上静 置15分钟。巧)4°C，12000巧m离必15分钟，弃上清，保留沉淀。（6)加4°C，75%己醇DEPC 水溶液1. 0ml，混匀，4°C，750化pm离必5分钟，弃上清。（7)重复一次上述步骤巧），弃上清 后倒置于吸水纸上吸干。（8)加10 μ 1 DEPC水。冰上静置30分钟充分溶解RNA，或-8(TC 冰箱保存备用。
[0124] (ii)基于PCR检测的miRNA茎环法逆转录
[0125] 包括；（1)总RNA预变性：在200 μ 1灭菌离必管中加入0. 5 μ g总RNA和适量 DEPC水，使总体积为6.8μ 1。（2)利用PCR仪进行预变性，程序如下；7(TC X10分钟， 4°C化rever。（3)冰上操作，按表1在200 μ 1灭菌离必管中加入各种试剂及RNA溶液（总 体积为1〇μ U。（4)在PCR仪中完成逆转录反应，反应程序如下；16°C Χ30分钟；42°C Χ30 分钟；85°C X 5 分钟；4°C forever。
[0126] 表1、miRNA茎环逆转录反应体系
[0127]
[012引 （iii)英光实时定量PCR(qPCR)检测miRNA
[0129] (1)按表2加入qPCR反应体系的各组成成分及加量体积（总体积为20 μ 1)。（2) qPCR反应程序如下；95°C Χ30砂；(95°C Χ5砂+60°C Χ30砂）Χ40个循环；溶解曲线 步骤。做结果判读；WU6作为内参，用2 A"表示miRNA的相对表达水平，其中Act = Ct (miRNA)-Ct扣6)。2 数值越大表示对应的miRNA相对表达水平越高；2 数值越小 表示对应的miRNA相对表达水平越低。
[0130] 表2、qPCR反应体系
[0131]
[0132] 应用上述RT-qPCR技术，针对170例宫颈癌组织W及68例正常组织，统计两种组 织样本中miR-375相对表达水平的平均值，比较发现miR-375在宫颈癌组织中的相对表达 较正常组织降低了约4. 45倍。此外，针对147例宫颈癌组织W及74例正常组织，统计两种 组织样本中miR-375相对表达水平的平均值，比较发现，miR-424在宫颈癌组织中的相对表 达较正常组织降低了约4. 10倍，结果如图3和图4。RT-qPCR结果初步掲示了 miR-375和 miR-424检查在宫颈癌筛查中的潜在价值。
[0133] 进一步地，本发明人进行了回顾性研究，对已有的735例不同组织学病理状态的 宫颈脱落细胞中进行miRNA的检测，已知735例中240例正常宫颈、100例CIN1U11例 CIN2U17例CIN3U67例宫颈癌。RT-qPCR的结果也发现，miR-375、miR-424在宫颈癌及高 级别CIN(CIN2-3)宫颈脱落细胞中的表达显著低于它们在正常宫颈或CIN1宫颈脱落细胞 中的表达，降低的表达量均高于4倍。
[0134] 3、miRNA检测结合细胞学研究考察miRNA用于宫颈癌的可行性
[0135] 通过回顾性和前瞻性研究，评估宫颈脱落细胞miRNA检测在HPV阳性妇女中的 分层筛查中是否有作用。采用薄层液基细胞学（Thinprep)进行宫颈细胞学检查，并根据 TBS2001灯he Bethesda System 2001)作出宫颈细胞病理学诊断。根据前期筛选试验，纳入 miR-：Ma、miR-92a、miR-93、miR-218、miR-375 W及 miR-424 共 6 个 miRNA 作为候选 miRNA, 根据筛选结果重点考察miR-375和miR-424作为宫颈癌潜在的新生物标志物与宫颈癌或其 癌前病变的关系，并通过绘制R0C曲线评估各候选miRNA检测及宫颈细胞学检查在宫颈筛 查中的作用。
[0136] 在前瞻性研究中，本发明人分析比较了年龄为30-65岁的高危型HPV阳性妇女中 各候选miRNA表达检测和宫颈细胞学检查在筛查高级别宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中的异 同。用SPSS19. 0进行统计分析，P<0. 05为统计学具有显著性差异。总共有6112名妇女参 与了 HPV检测，其中有1450例HPV阳性病例，但送中间的297例HPV阳性根据排除标准被 排除。其余的1153例HPV阳性妇女的样本中有121例样本由于样本量不足而排除，另外11 例样本的miRNA检测结果无效（Ct〉35)而被进一步排除。最终共计纳入1021例符合条件 的HPV阳性样本分别进行了有效的己氏涂片和miRNA检测。
[0137] 根据最大约登指数（maximal Youden index)得出miR-375和miR-424较U6的相 对表达 cut-off 值分别为 0. 965 X 10 3 和 1. 353 X 10 5。W SPSS 软件（versionl7. 0)进行 统计分析，两组结果间的比较用非参数检验（Mann-Whitney U检验）。诊断级别和阴阳性 判定根据病理学标准（Pathology and Genetics of Tumors of the Breast and 化111日16 genital organs (World Health Organization, 2003))进行判定和比较。组织学诊断分歧 的样本，由病理学专家讨论并最终形成组织学的诊断共识。特异性根据检测结果为阴性的 样本占病理学阴性样本的百分数计算；灵敏度根据检测结果为阳性的样本占病理学阳性样 本的百分数计算。
[0138] 结果发现，在诊断CIN2+(CIN2及更高级别病变，包括宫颈癌）时，miR-375和 miR-424单独检测的特异性均与细胞学检查相当（78. 1%和79. 3% VS. 75. 4%，P〉0. 05)， 灵敏度显著高于细胞学检查（76.0%和74. 9% vs. 63.8%，P<0. 01)，阳性预测值显著高 于细胞学检查化6. 3%和65. 3% VS. 58. 4%，P = 0.04)，阴性预测值显著高于细胞学检 查（85. 4%和 85. 7% VS. 79. 3%, P = 0.01)。在诊断 CIN3+时，miR-375 和 miR-424 单独 检测的特异性均与细胞学检查相当（71. 3%和71.6% VS. 70. 0%，P〉0. 05)，灵敏度显著高 于细胞学检查（82. 3%和80.9% VS. 69.8%，P<0. 01)，阳性预测值均与细胞学检查相当 (71. 6%和71. 3% VS. 70. 0%，P〉0. 05)，阴性预测值显著高于细胞学检查巧3. 3%和93. 7% VS. 89. 7%, P = 0. 02)。
[0139] 并且，本发明人发现，miR-375和miR-424的组合检测W及miR-375、miR-424和 miR-218的组合检测与细胞学检查相比，具有更高的灵敏度、特异性、阴/阳性预测值；而该 组合检测与miR-375和miR-424的单独检测相比，具有相似的灵敏度和阴性预测值W及更 高的特异性和阳性预测值。
[0140] 进而，本发明人通过绘制R0C曲线评估各候选miRNA检测及宫颈细胞学检查在 宫颈筛查中异同。共纳入1021例HPV阳性样本，其中579例病理学正常，83例CIN1，144 例CIN2, 208例CIN3, 7例浸润性宫颈癌。W U6为内参，RT-qPCR检测miR-424, miR-375, miR-34a，miR-218 的相对表达 cut-off 值分别为 1. 353X 10 5,0. 965X 10 3,〇. 759X 10 3， 1.928X 10 5(灵敏度和特异性相关数据见前述）。己氏涂片（Pap test)结果根据 ASCUS (abnormal squamous cells of uncertain si即i円cance)标准判断。W miRNA 相对 表达量低于cut-off值或己氏涂片结果为ASCUS及W上判定为检测阳性；W miRNA相对表 达量等于或高于cut-off值或己氏涂片结果为阴性判定为检测阴性。相关根据卡方检测 任earson化i-square test)比较不同方法的筛查效率，并通过Logistic回归分析遽选出 有效的分层筛查方法。
[0141] 获得的R0C曲线如图5、图6。结果显示，对于HPV初筛阳性的妇女进行miR-375 和miR-424检测优于宫颈细胞学检测的分层筛查方法。
[0142] 上述结果证明了 miR-375、miR-424的单独或组合W及miR-375和miR-424与 miR-218的组合检查在宫颈癌筛查中的重要价值，而对于HPV初筛阳性的妇女进行miRNA的 分层筛查更优于宫颈细胞学检查。
[0143] 实施例2、miRNA检测试剂盒的制备
[0144] 1、基于RT-qPCR技术的试剂盒
[0145] 本实施例中，所述基于核酸扩增的miRNA检测试剂盒包括下列组成：
[014引 （1)总RNA提取试剂；Trizol溶液，氯仿，异丙醇，己醇，DEPC水；
[0147] (2)miRNA逆转录试剂；逆转录酶、RNA酶抑制剂、逆转录缓冲液、dNTP混合物。[0148] (3)miRNA逆转录引物；miR-375逆转录引物和miR-424逆转录引物，用作内参的 U6的逆转录引物。
[014引 （4)miRNA的PCR检测试剂；Taq酶、Mg2\ PCR缓冲液、dNTP混合物、核酸染料。
[0150] (5)miRNA 核酸扩增引物；miR-375qPCR 上游引物，miR-424qPCR 上游引物，miRNA qPCR通用下游引物。用作内参的U6的上游引物和下游引物。
[0151] (6)阴性质控品；为不含核酸的RNA稀释液。
[0152] (7)阳性质控品；为含一定量miRNA的稀释物。
[0153] 2、基于杂交捕获的miRNA检测试剂盒
[0154] 本实施例中，基于杂交捕获的miRNA检测试剂盒包括下列组成：
[0155] (1)样品裂解液；为含1. 75M氨氧化钢的溶液。
[0156] (2)探针试剂；为含有miRNA检测所需的单链DNA探针。
[0157] 其中探针序列如下：
[015引 miR-375 探针；5, -TCACGCGAGCCGAACGAACAAA-3,（沈Q ID N0:14);
[0159] miR-424 探针；5, -TTCAAAACATGAATTGCTGCTG-3,（SEQ ID NO:15)。
[0160] (3)捕获微孔板；为包被有特异性捕获抗体ATCC#皿8730 (溶于碳酸盐缓冲液 (pH9. 6)中，W 0. 1 μ g/ml，100 μ 1/孔对96孔板进行包被）的固相载体，即96孔板。
[0161] (4)检测试剂；为含偶联有碱性磯酸酶的抗DNA-RNA杂合体的高特异性抗体 (ATCC細Β8730)的溶液（抗体浓度；100ng/ml)。溶液中还含有；0. 6Μ化C1、0.1 mM MgC12、 0. 25% Tween-20。。
[0162] (5)底物试剂；为碱性磯酸酶化学发光底物，即0. 4mM CDP-Star溶液。
[0163] (6)浓缩洗涂液；为Tris-HCl缓冲盐溶液灯BS)。
[0164] (7)阴性质控品；为不含核酸的生理盐水。
[0165] 做阳性质控品；为含一定量miRNA的稀释物。
[0166] 实施例3、基于杂交捕获法的miRNA检测
[0167] 利用前述实施例2制备的基于杂交捕获的miRNA检测试剂盒，进行miR-375或 miR-424的检测。
[0168] (1)样品处理；取临床样本与样本裂解液（同实施例2)混合，在46°C水浴中赔育 45-60分钟。
[0169] (2)核酸杂交：从水浴中取出裂解样本，冷却至室温。取一块96孔微孔板用作杂 交微孔板，加入裂解样本和单链DNA探针试剂，用封板膜封住杂交微孔板。随后将杂交微孔 板放在微孔板加热振荡器上，110化pm振荡3-5分钟，混匀。在46°C条件下赔育60分钟，然 后取出杂交微孔板，冷却至室温。样本中的存在的miR-375或miR-424将与单链DNA探针 结合形成DNA-RNA双杂合体；
[0170] (3)抗体捕获；取捕获微孔板一块，将杂交微孔板中的液体（约100 μ 1/孔）完 全转移至捕获微孔板对应的孔中；用封板膜封住捕获微孔板，放置于微孔板加热振荡器上， 25 °C条件下110化pm振荡60分钟。
[017。 （4)检测抗体识别：取出捕获微孔板，将板中的液体（约100μ 1/孔）移除；加入 检测试剂（如实施例2)，用封板膜封住捕获微孔板，25Γ条件下赔育45-60分钟。
[0172] (5)化学发光检测：去除捕获微孔板中的检测试剂，用洗涂液清洗捕获微孔板；捕 获微孔板中加入底物试剂，室温避光赔育15-30分钟，在化学发光免疫分析仪上读数。化学 发光的信号（Signal)/噪声（Noise)比例用S/N表示。
[0173] 基于杂交捕获的miR-424检测结果如表3所示。
[0174] 表 3
[0175]
[0176] 实施例4、基于杂交捕获法的miRNA检测的临床应用
[0177] 获取10位受试者的宫颈脱落细胞，应用如实施例3的杂交捕获法进行miR-424和 miR-375检测。W正常样本的杂交捕获结果作为参照，根据测得的结果来判断受试者的患病 情况，并进行预后，结果如下：
[0178] 3位受试者测得样本中miR-424和miR-375均显著低于（低2倍W上）正常样本 中miR-424和miR-375含量；建议后续进行积极检查和治疗。
[0179] 7位受试者测得样本中miR-424和miR-375均与正常样本中放入miR-424和 miR-375含量相当或接近；确定为低危人群。
[0180] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考郝样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，送些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. miR-375和/或miR-424的用途，用于制备诊断宫颈癌或其癌前病变的诊断试剂。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂包括： (1) 特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或 (2) 特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。3. 特异性检测miR-375和/或miR-424的试剂的用途，用于制备诊断宫颈癌或其癌前 病变的诊断试剂盒。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的特异性检测miR-375和/或miR-424 的试剂包括： (1) 特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或 (2) 特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。5. -种用于诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括： (1) 特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或 (2) 特异性识别miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性识别miR-375和 /或miR-424的DNA探针，并且，还包括： (3) 捕获抗体，其是抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体，其包含于溶液中或被固定于固相 载体上；和 (4) 检测抗体，其是连接有可检测信号的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括选自下组的一种 或多种试剂或组件： 样品裂解液； 洗涤液； 变性液； 阴性质控品； 阳性质控品； 鉴定可检测信号的试剂；和/或 微孔板。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测信号选自：碱性磷酸酶，辣 根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶；所 述的鉴定可检测信号的试剂是所述碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半 乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶的底物。9. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性扩增miR-375和 /或miR-424的引物，并且，还包括： 总RNA提取试剂； 逆转录试剂； miR-375和/或miR-424逆转录引物；miRNA的PCR检测试剂； miRNA核酸扩增引物； 阴性质控品；和/或 阳性质控品。10. -种诊断宫颈癌或其癌前病变的方法，其特征在于，所述方法包括：应用权利要求 6-8任一所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞样本中miR-375和/或miR-424的 存在量；较佳地，该方法包括： (1) 将待测样本裂解后，与所述的特异性识别miR-375和/或miR-424的DNA探针进行 杂交反应，获得杂交液； (2) 将杂交液加样到包被有捕获抗体的固相载体上，在固相载体上形成捕获抗体与 DNA-RNA杂合体二元复合物； (3) 将检测抗体加样于固相载体，在固相载体上形成捕获抗体、DNA-RNA杂合体和检测 抗体三元复合物； (4) 鉴定固相载体上的可检测信号，确定待测样品中miR-375和/或miR-424的存在 量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞中的存在量，则提示 该受试者存在宫颈癌或其癌前病变； 或者，所述方法包括：应用权利要求9所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞 样本中miR-375和/或miR-424的存在量；较佳地，该方法包括： (a) 提取受试者离体宫颈组织或细胞样本的总RNA; (b) 利用miR-375和/或miR-424逆转录引物进行逆转录，获得miR-375和/或miR-424 的cDNA; (c) 利用特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物进行PCR扩增，确定miR-375和/ 或miR-424的存在量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞 中的存在量，则提示该受试者存在宫颈癌或其癌前病变。
【专利摘要】本发明涉及microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒中的应用。首次揭示了miR-375和miR-424在宫颈癌或其癌前病变的组织或细胞内明显低表达，且这种低表达与宫颈癌或其癌前病变存在明显的相关性。本发明还提供了测定miR-375和/或miR-424的存在量的宫颈癌或其癌前病变的诊断方法和试剂盒。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105486866
【申请号】CN201410482605
【发明人】韩斌, 谢幸, 吕卫国, 程晓东, 王新宇, 胡杰锋, 华绍炳
【申请人】杭州德同生物技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域；更具体地，涉及microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前 病变的试剂盒中的应用，为临床上HPV阳性妇女的分流W及宫颈癌或其癌前病变的检测提 供辅助诊断。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是全球最常见的女性恶性肿瘤之一。据世界卫生组织国际癌症研究署 (International Agency for Research on CancerJARC)估计，2008年全球约有52. 9万例 新发宫颈癌，其中85%发生在欠发达地区，59%发生在亚洲；死亡病例达27. 5万，其中85% 死亡病例发生在发展中国家。据中国癌症中必72个肿瘤登记处的数据显示，中国在2009年 登记的宫颈癌发病率为12. 96/10万，且中国宫颈癌的发病正呈年轻化趋势发展（应倩等， "中国2009年宫颈癌发病与死亡分析"中国肿瘤2013,22:612-616)。宫颈癌的高发病率和 年轻化趋势严重影响着中国广大妇女的健康和生活质量，因此对宫颈癌或其癌前病变的早 期诊断和防治意义十分重大。
[0003] 自20世纪40年代W来，己氏涂片开始被广泛用于宫颈癌筛查。宫颈细胞学检查 具有较高的特异性，但其最主要的不足是敏感性低。单次常规己氏涂片对于诊断高级别宫 颈上皮内瘤变（cervical inhaepithelial neoplasia，CIN)的敏感性仅为 50%左右。20 世纪90年代开始发展了液基细胞学（liquid-based ecology, LBC)检查，LBC通过专用设 备实现了液基细胞的薄层制片，提高了宫颈脱落细胞标本的满意率，但对于诊断高级别CIN 的敏感性仍较低，仅为38-65 %，送与常规己氏涂片相比，并无显著差异。
[0004] 德国著名医学科学家Harald zur Hausen早在20世纪70年代研究发现高危型人 乳头状瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌的成因。事实上，宫颈癌的发 病一般需要经历从HPV持续感染到不同程度的CIN(CIN1-CIN3)，最后发展成为宫颈癌。送 个过程一般比较漫长，平均需要10-15年时间，送为宫颈癌或其癌前病变的早期发现和阻 断提供了足够的时间。基于高危型HPV与宫颈癌之间存在明确的病因关系，HPV检测已被 欧洲生殖道感染和肿瘤研究组织巧UR0GIN)推荐作为宫颈癌的初筛手段。然而，HPV检测 的最大局限性在于阳性预测值低。有研究表明，近90%的HPV阳性妇女是一过性感染，HPV 会在2年内被机体免疫清除，仅有少数发展为持续感染（de Sanjos6 et al.，"Worldwide prev曰lence 曰nd genotype distribution of cervic曰1 hum曰n p曰pillom曰virus DNA in women with normal cytology:a meta-analysis"Lancet Infect. Dis. 2007,7:453-459)； 而在HPV持续感染的妇女中也仅有少数会最终发生宫颈癌（化bie and化schieri， "Understanding HPV tests and their appropriate applications" Cytopathology 2013,24:289-308)。临床上，HPV检测容易导致阴道镜回叫率和宫颈活检的比例增加，造成 过度诊疗，从而增加了患者的精神压力及随诊费用。因此，选择恰当的方法对HPV初筛阳性 妇女进行合适的分流是有效管理大量HPV初筛阳性妇女的关键。
[0005] microRNA(miRNA)是近年来发现的一类非编码小分子RNA，它能在转录后水平调 控基因的表达，其表达情况与机体众多生理病理状态密切相关。越来越多的研究证据表明， 异常的miRNA表达是人类疾病的标志，包括肿瘤。但遗憾的是，miRNA(特别是宫颈脱落细 胞中的miRNA)检测在宫颈癌或其癌前病变筛查中的应用研究却仍不多。此外，关于新的与 宫颈癌或其癌前病变相关miRNA也有待进一步挖掘。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒中的 应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供miR-375和/或miR-424的用途，用于制备诊断宫颈癌 或其癌前病变的诊断试剂。
[0008] 在一个优选例中，所述的诊断试剂包括：
[000引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0010] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[00川在本发明的另一方面，提供特异性检测miR-375和/或miR-424的试剂的用途，用 于制备诊断宫颈癌或其癌前病变的诊断试剂盒。
[0012] 在一个优选例中，所述的特异性检测miR-375和/或miR-424的试剂包括：
[001引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0014] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[001引在另一优选例中，所述的特异性扩增miR-424的引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:8 和沈Q ID NO: 11所示。
[0016] 在另一优选例中，所述的特异性扩增miR-375的引物的核巧酸序列如SEQ ID N0:9 和沈Q ID NO: 11所示。
[0017] 在本发明的另一方面，提供一种用于诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒，所述试 剂盒中包括：
[001引 （1)特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或
[0019] (2)特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。
[0020] 在一个优选例中，所述试剂盒中包括特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424 的DM探针，并且，还包括：
[0021] (3)捕获抗体，其是抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体，其包含于溶液中或被固定于 固相载体上；和
[0022] (4)检测抗体，其是连接有可检测信号的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体。
[0023] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括选自下组的一种或多种试剂或组件：
[0024] 样品裂解液；
[0025] 洗涂液；
[002引变性液；
[0027] 阴性质控品；
[002引 阳性质控品；
[0029] 鉴定可检测信号的试剂；和/或
[0030] 微孔板。
[0031] 在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括；特异性扩增miR-218的引物；或特异性 识别（结合）miR-218的探针；较佳地为DNA探针。较佳地，所述的特异性扩增miR-218的 引物的核巧酸序列如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示。
[0032] 在另一优选例中，所述的可检测信号选自；碱性磯酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖 氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，过氧化氨酶或葡萄糖淀粉酶；所述的鉴定可检测信号的 试剂是所述碱性磯酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，过氧化 氨酶或葡萄糖淀粉酶的底物。
[0033] 在另一优选例中，所述试剂盒中包括特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物， 并且，还包括：
[0034] 总RNA提取试剂；
[00对逆转录试剂；
[0036] miR-375 和 / 或 miR-424 逆转录引物；
[0037] miRNA的PCR检测试剂；
[00測 miRNA核酸扩增引物；
[003引阴性质控品；和/或
[0040] 阳性质控品。
[0041] 在本发明的另一方面，提供一种诊断宫颈癌或其癌前病变的方法，所述方法包括： 应用所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞样本中miR-375和/或miR-424的存在 量；较佳地，该方法包括：
[0042] (1)将待测样本裂解后，与所述的特异性识别miR-375和/或miR-424的DNA探针 进行杂交反应，获得杂交液；
[0043] (2)将杂交液加样到包被有捕获抗体的固相载体上，在固相载体上形成捕获抗体 与DNA-RNA杂合体二元复合物；
[0044] (3)将检测抗体加样于固相载体，在固相载体上形成捕获抗体、DNA-RNA杂合体和 检测抗体Η元复合物；
[0045] (4)鉴定固相载体上的可检测信号，确定待测样品中miR-375和/或miR-424的存 在量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞中的存在量，则提 示该受试者存在宫颈癌或其癌前病变；
[0046] 或者，所述方法包括：应用所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞样本中 miR-375和/或miR-424的存在量；较佳地，该方法包括：
[0047] (a)提取受试者离体宫颈组织或细胞样本的总RNA ;
[0048] 化）利用miR-375和/或miR-424逆转录引物进行逆转录，获得miR-375和/或 miR-424 的 cDNA ;
[0049] (C)利用特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物进行PCR扩增，确定miR-375 和/或miR-424的存在量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或 细胞中的存在量，则提示该受试者存在宫颈癌或其癌前病变。
[0050] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0051] 图1、组织学正常、高级别CIN(CIN2-CIN3)、鱗状细胞癌（see)的宫颈脱落细胞（η =6)中miRNA的表达谱。
[0052] 图2、一些感兴趣的miRNA在高级别CIN(CIN2-CIN3)、鱗状细胞癌（see)的宫颈脱 落细胞中的表达的上调或下调情况。
[0053] 图3、RT-qPCR检测宫颈癌组织和正常组织中miR-375相对表达水平。
[0054] 图4、RT-qPCR检测宫颈癌组织和正常组织中miR-424相对表达水平。
[0055] 图5、针对CIN2+(CIN2及W上）样本，各候选miRNA的R0C曲线。
[0056] 图6、针对CIN3+样本各候选miRNA的R0C曲线。
【具体实施方式】
[0057] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现miR-375和miR-424在宫颈癌或其癌 前病变的组织或细胞内明显低表达。进一步的大样本验证发现，送种低表达与宫颈癌或其 癌前病变存在明显的相关性。基于此，本发明提供了一种基于测定miR-375和/或miR-424 的存在量的宫颈癌或其癌前病变的诊断方法，该方法较现有的临床宫颈癌或其癌前病变诊 断方法具有更好的准确性。
[0058] 术语
[0059] 如本文所用，"待测样本"或"待测核酸值NA)样本"是指待检测的核酸样本，其中 含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标miRNA。较佳地，所述的"待测样本" 是宫颈组织、宫颈脱落细胞或其裂解物。
[0060] 如本文所用，"目标核酸"是指感兴趣的核酸，例如其是一种标志物或是疾病相关 的。
[0061] 如本文所用，"DNA-RNA杂合体"是指一种核酸，其含有两条链，其中一条链是DNA 链，另一条链是RNA链，所述的DNA链和RNA链的核巧酸序列是基本上互补的。"基本上互 补"是指核巧酸的序列是足够互补的，可W W-种可预见的方式发生相互作用，形成双链。 通常，两条"基本上互补"的核巧酸序列互相之间至少有70%的核巧酸是互补的；优选的， 至少有80%的核巧酸是互补的；更优选的，至少有90%的核巧酸是互补的；进一步优选的， 至少有95%的核巧酸是互补的；如98%、99%或100%。
[0062] 如本文所用，"探针"是指一种具有已知核巧酸序列的单链核酸（本发明中优选 DNA)，其具有与目标核酸基本上互补的核巧酸序列结构，可W与"目标核酸"形成双链。所 述的"探针"可W携带标记物或不携带标记物。例如，标记物可W连接在探针的5'末端或 3'末端。
[0063] 如本文所用，"捕获抗体"是指可被包被在固相载体上的，特异性地识别和结合所 述的DNA-RNA杂合体的抗体，其不结合单链的核酸（包括DNA或RNA等）。所述的"捕获抗 体"通过识别双链杂交体的双螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特 异性的。将抗体包被在固相载体上是本领域技术人员熟知的技术。术语"捕获抗体"可W 与"包被抗体"互换使用。
[0064] 如本文所用，"检测抗体"是指特异性地识别和结合所述的DNA-RNA杂合体的抗体， 其不结合单链的核酸（包括DM或RNA等）。所述的"检测抗体"通过识别双链杂交体的双 螺旋结构而实现与双链杂交体的结合，而并非是碱基序列特异性的。所述的"检测抗体"携 带有可检测信号，用于报告双链杂交体的捕获情况。
[0065] miR-375和/或miR-424作为诊断标志物
[0066] 本发明人通过miRNA芯片技术，比较分析了组织学正常、高级别CIN(CIN2-CIN 3)、鱗状细胞癌（see)的宫颈脱落细胞中miRNA的表达谱。利用miRNA的相对表达量，筛选 获得了多个表达差异较显著的miRNA作为宫颈癌及其癌前病变诊断潜在的标志物。其中有 14 个 miRNA (let-7b、miR-145、miR-126、miR-199a、miR-195、miR-29a、miR-375、miR-lOb、 miR-29c、miR-218、miR-424、miR-100、miR-12化、miR-99a)在宫颈癌及其癌前病变组织中 表达下调，17 个 miRNA(miR-155、miR-92a、miR-92b、miR-224、miR-221、miR-222、miR-31、 miR-182、miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-185、miR-93) 在宫颈癌及其癌前病变组织中表达上调。进而，本发明人通过回顾性和前瞻性研究，在大 样本量中进行miRNA表达研究，结合与宫颈细胞学检测技术的比较，最终确定了 miR-375、 miR-424在宫颈癌或癌前病变的组织或细胞中表达量显著降低，miR-375、miR-424单独或 组合可应用于诊断宫颈癌及其癌前病变。
[0067] 其中，miR-375 〇isa-miR-375 (MIMAT0000728))序列如下：
[0068] 5, -UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3,（SEQ ID N0:1);
[0069] miR-424 〇isa-miR-424(MIMAT0001341))序列如下：
[0070] 5'-CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA-3,（SEQ ID N0:2)。
[0071] 值得注意的是，目前还没有关于杂交捕获技术用于miRNA检测的相关报道，更没 有检测宫颈脱落细胞中miRNA的相关报道。
[0072] 基于本发明的新发现，可W WmiR-375和/或miR-424作为诊断标志物（标记物）。 通过分析待测样本（样品）中miR-375和/或miR-424的表达情况或存在量，从而得知受 试者是否患有宫颈癌及其癌前病变W及判断患病的严重程度，为疾病的诊断或预后提供依 据。作为本发明的优选方式，当测得miR-375和/或miR-424的表达量或存在量显著比正 常组织低2倍W上，更佳地低3倍W上，更佳地低4倍W上，则判断提供该待测样本的受试 者可能患有宫颈癌及其癌前病变。作为本发明的优选方式，所述的待测样品或待测样本是 患者的宫颈组织、宫颈脱落细胞或其裂解物。
[0073] 可采用各种技术来检测miR-375和/或miR-424的表达情况或存在量，送 些技术均包含在本发明中。检测核酸可用的已有技术如（但不限于）：基因芯片技术 (microarray)、Nanostring nCounter、RNA-seq、核酸质谱、探针杂交技术、聚合酶链反应 (PCR)、Ncxrthe;rn Blot等方法。优选的方法将在后面描述。
[0074] 本领域中，疾病中发生差异表达的基因作为标志物是人们已知的，然而本领域人 员基于检测灵敏度等方面的考虑，通常均选择与正常基因表达相比，表达发生显著性上调 的标志物作为研究对象，开发检测标记物的试剂。而本发明中，选择了表达下调的miRNA作 为诊断标志物，并且也可实现良好的检测效果，送是在人们的预期之外的。
[00巧]miR-375 和 / 或 miR-424 的检测
[0076] 作为本发明的一种选择方式，采用基于核酸扩增的miRNA检测方法。一种基于核 酸扩增的检测方法包括：
[0077] (1)提取待测样本中总RNA (包含miRNA);
[0078] (2)对目的miRNA (包括miR-375和/或miR-424)进行逆转录，合成相应的cDNA ;
[0079] (3)采用目的miRNA (包括miR-375和/或miR-424)特异的上下游引物，通过PCR 特异性扩增目的miRNA,使检测信号放大；
[0080] (4)确定目的miRNA (包括miR-375和/或miR-424)的表达量；若miR-375和/ 或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞中的存在量，则该受试者存在宫颈癌或 其癌前病变。
[0081] 作为本发明的优选方式，采用基于杂交捕获的miRNA检测方法来检测待测样本中 miR-375和/或miR-424存在量或表达量。
[0082] 基于杂交捕获的miRNA检测方法类似于化ISA反应原理。但是，本发明人设计的方 法中，抗体捕获的对象是特殊的，即由DNA与RNA互补形成的DNA-RNA杂合体，而非常规的 蛋白质。具体原理是；样本中的存在miR-375和/或miR-424,所述miRNA可与特异性DNA 探针结合为DNA-RNA杂合体，DNA-RNA杂合体与包被有捕获抗体的固相载体（如微孔板）上 的捕获抗体结合，再与偶联有可检测信号的检测抗体结合，通过检测可检测信号，定性检测 样本中的miR-375和/或miR-424, W及实现诊断。
[0083] W双链杂合体作为抗原与W蛋白质作为抗原不同，本发明的针对DNA-RNA双链杂 合体的抗体无特定的序列或抗原决定簇的要求，其特异地识别杂合体所特有的双螺旋结 构。抗DNA-RNA抗体（无论是单克隆或多克隆抗体）能与任何DNA-RNA杂合体相结合。
[0084] 作为本发明的优选方式，一种基于杂交捕获的miRNA检测方法包括：
[0085] (1)待测样本裂解液裂解后释放核酸，得到含有miRNA的样本；
[0086] (2)将含有miRNA的样本与特定的单链DNA检测探针混合后杂交，形成DNA-RNA杂 交体。所述单链DNA探针根据目的miRNA序列设计。此杂交体可由事先联到固相载体表面 (如96孔微孔板表面）的识别探针的特异捕获抗体或核酸捕获；
[0087] (3)位于固相载体上的被捕获的DNA-RNA杂交分子由一个偶联有可检测标志物的 抗DNA-RNA杂交分子的检测抗体结合；
[008引 （4)加入与标记的可检测标志物相对应的检测底物，产生指示miR-375和/或 miR-424存在量或表达量的信号；若miR-375和/或miR- 424的存在量显著低于正常宫颈 组织或细胞中的存在量，则该受试者存在宫颈癌或其癌前病变。
[0089] 作为本发明的可选择方式，所述的DNA-RNA杂交分子上可结合多个单克隆抗体， 每个单克隆抗体分子亦可偶联多个可检测标志物如酶分子，从而使得生物样品中特定核酸 的量能通过该信号系统得W逐级放大。
[0090] 本发明的基于杂交捕获的miRNA检测方法无需采用对实验室环境要求高的PCR 技术，克服了 PCR技术中实验污染不易控制、假阴性高、存在的竞争抑制W及受样本保存及 DNA提取过程等影响的缺点。
[0091] PCR检测需要专口的临床PCR实验室，适用于软硬件条件相对较好的机构，可能 不适用于基层医院的检查。同时，PCR检测方法灵敏度极高，在操作时需要避免假阳性及 交叉污染的产生。而基于杂交捕获的miRNA诊断技术则适用面更广，对操作环境及仪器的 要求相对较低，且检测的准确性也良好。基于杂交捕获的miRNA诊断方法是一项快速、简 便、灵敏的方法，由于不需要核酸提取且没有PCR方法的模板扩增过程，成功地克服了 PCR 方法的弱点，即交叉污染、繁琐的DM分离预处理、定量测定不准确、引物受病毒变异的影 响等。同时也能够克服传统化ISA方法灵敏度低、无法定量测定等缺点，检测灵敏度可达 lX10l5mol(即fmol)W上。因此，该技术更适用于中国基层地区对于HPV阳性患者的分流 W及宫颈癌或其癌前病变的诊断。
[0092] 检测miR-375和/或miR-424的试剂盒
[0093] 作为本发明的优选方式，提供了基于杂交捕获的miRNA检测试剂盒。较佳地，所述 试剂盒中包括：特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针。更佳地，所述试剂盒 中还包括；捕获抗体，其是抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体，其包含于溶液中或被固定于固 相载体上；和检测抗体，其是连接有可检测信号的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体。
[0094] 所述的探针的选择或设计可W根据具体检测的目标miRNA而改变，探针的长度也 可W根据目标核酸的长度而定。作为本发明的优选方式，探针试剂是含有脈盐的缓冲溶液， 具有保存核酸探针不被降解的作用，并且和变性后的样本混合进行杂交时，使抑值接近中 性，有利于进行核酸的碱基互补配对杂交。
[0095] 所述的捕获抗体与所述的检测抗体可W应用相同的抗体或不同的抗体来制备，即 检测抗体在不携带可检测信号的情况下可W是与捕获抗体相同的或不同的。W DNA-RNA 杂合体作为抗原与W蛋白质作为抗原不同，抗DNA-RNA杂合体所产生的抗体无特定的序 列或抗原决定簇的要求，其特异性识别双链杂交体所特有的双螺旋结构。抗DNA-RNA抗 体（无论是单克隆或多克隆抗体）能与任何DNA-RNA双链杂交体相结合。利用特定的 双链杂交体来制备抗所述双链杂交体的抗体的方法是本领域已知的技术，例如可W按照 Kitagawa&Stollar 的方法化itagawa Y,Stollar BD, Mol Immunol 1982,19 :413-420)来 制备多克隆抗体；或可W按照Fliss等的方法（Fliss I,Laurent Μ, Emond E, et al.,Appl Environ Microbiol 1993,59:2698-2705)来制备单克隆抗体。
[0096] 本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与包被抗体相结合（偶 联、连接）即可。例如，所述的固相载体选自；微量滴定板（如96孔板）、载玻片、试纸或微 球。将抗体包被到固相载体上的技术也是本领域技术人员所熟知的。
[0097] 所述的可检测信号是连接或偶联于检测抗体上的、用于报告检测抗体的结合情况 的报告分子。优选的，所述的可检测信号选自；碱性磯酸酶（AP)，辣根过氧化物酶（HRP)， 葡萄糖氧化酶，目-D-半乳糖巧酶，脈酶，过氧化氨酶或葡萄糖淀粉酶。送些可检测信号具 有特定的底物，在与底物接触后可W发生显色反应或其它可被检测到或可见的反应，从而 报告检测抗体的结合情况。所述的底物比如；用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺（0PD)、四甲 基联苯胺（TMB)、ABTS;用于碱性磯酸醋酶的对硝基苯磯酸醋（p-nitro地en^地〇3地ate, p-NPP)、CDP-Star ;等等。
[0098] 此外，为了便于操作，本发明所述杂交捕获试剂盒中还可含有其它用于解链、杂 交、捕获、洗涂、检测、显色等操作所需要的各种试剂。所述的试剂包括但不限于上述样品裂 解液试剂、杂交试剂、洗涂试剂W及识别所述可检测信号的底物或显色剂。W及阳性质控品 和阴性质控品。
[0099] 样品裂解液中的高浓度盐离子及去垢剂的存在，能使蛋白质变性将病原体裂解， 革己标核酸得到释放。同时裂解液中的脈盐也能有效保护核酸，延长样本的保存时间。
[0100] 作为本发明的另一种可选方式，作为本发明的优选方式，提供了基于核酸扩增的 miRNA检测试剂盒，所述试剂盒中包括特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物。较佳 地，还包括：总RNA提取试剂；逆转录试剂；miR-375和/或miR-424逆转录引物；miRNA的 PCR检测试剂；miRNA核酸扩增引物；阴性质控品和/或阳性质控品。
[0101] 本发明所述与宫颈癌或其癌前病变相关的miR-375或miR-424既可W作为独立的 诊断标志物，也可W组合用作诊断标志物，或还可W是miR-375、miR-424和miR-218的组 合。相应的诊断方法及试剂盒可W是针对miR-375和miR-424的单独或组合W及miR-375 和miR-424与miR-218的组合检测。此外，还可结合其它诊断宫颈癌或其癌前病变的标志 物共同应用。
[010引 其中，miR-218 0isa-miR-218(MIMAT0000275))的序列如下：
[0103] 5'-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3'（SEQ ID N0:3)。
[0104] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第Η版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0105] 实施例1、宫颈癌相关miRNA标志物的筛选
[0106] 1、miRNA表达差异的芯片初筛
[0107] 本发明首先通过miRNA芯片，比较分析了组织学正常、高级别CIN (CIN2-CIN3)、鱗 状细胞癌（SCC)的宫颈脱落细胞（η = 6)中miRNA的表达谱（图1)。利用AN0VA分析，从 875个人基因组miRNA(Sanger miRBase releasel3. 0)中，筛选获得了 31个表达差异较显 著的miRNA作为宫颈癌或其癌前病变诊断潜在的标志物。其中，有14个miRNA(let-7b、 miR-145、miR-126、miR-199a、miR-195、miR-29a、miR-375、miR-lOb、miR-29c、miR-218、 miR-424、miR-100、miR-12化、miR-99a)在宫颈癌或其癌前病变组织中表达下调，有17 个 miRNA(miR-155、miR-92a、miR-92b、miR-224、miR-221、miR-222、miR-31、miR-182、 miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-15b、miR-16、miR-25、miR-185、miR-9：3)在宫颈 癌或其癌前病变组织中表达上调。在上述31个表达差异miRNA中，miR-375和miR-424等 几个miRNA表达变化幅度较大（图2)。
[0108] 2、RT-qPCR测定miR-375和miR-424在宫颈癌和正常组织中表达差异
[0109] 通过逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)在正常和宫颈癌组织中验证前述确定的几个 miRNA的差异表达特性。
[0110] 其中，引物如下（其中，U6作为miRNA内参）：
[0111] miR-375 逆转录引物；5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCA CGC-3GEQIDN0:4)';
[0112] miR-424 逆转录引物；5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTC AAA-3' (SEQ ID N0:5);
[0113] U6 逆转录引物；5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'（SEQ ID N0:6);
[0114] miR-218 逆转录引物；5，-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACA TGG-3'（SEQ ID N0:7)
[0115] miR-375qPCR 上游引物；5, -AGCCGTTTGTTCGTTCGGCT-3'（SEQ ID N0:8);
[011 引 miR-424qPCR 上游引物；5, -CGAAGCAGCAGCAATTCATG-3,（沈Q ID N0:9);
[0117] miR-218qPCR 上游引物；5, -GCGCGTTGTGCTTGATCTAA-3'（沈Q ID N0:10)
[0118] miRNA qPCR 通用下游引物；5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3'（沈Q ID N0:11);
[0119] U6qPCR 上游引物；5, -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'（沈Q ID N0:12);
[0120] U6qPCR 下游引物；5, -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3,（SEQ ID N0:13)。
[012 1] 其中，RT-qPCR流程如下：
[0122] (i)宫颈脱落细胞中总RNA (包含miRNA)的提取
[0123] 用液基细胞学检查专用的细胞软刷在宫颈表面顺时转旋转5圈后将刷子浸入液 基细胞学检查专用的细胞保存液中。用于进行总RNA提取，提取方法如下；（1)将细胞保存 液（含宫颈脱落细胞）转移到15ml离必管中，4°C，150化pm离必10分钟。（2)弃上清，加 入1. 0ml 4°C化izol溶液，用移液器灭菌枪头反复吹打后转移到1. 5ml灭菌离必管中，静置 10分钟。（3)加入0. 2ml氯仿，充分震荡60砂，冰上静置30分钟，4°C，12000巧m离必15分 钟。（4)吸取上清，转移到另一个1. 5ml灭菌离必管中，加等体积的4°C异丙醇，混匀，冰上静 置15分钟。巧)4°C，12000巧m离必15分钟，弃上清，保留沉淀。（6)加4°C，75%己醇DEPC 水溶液1. 0ml，混匀，4°C，750化pm离必5分钟，弃上清。（7)重复一次上述步骤巧），弃上清 后倒置于吸水纸上吸干。（8)加10 μ 1 DEPC水。冰上静置30分钟充分溶解RNA，或-8(TC 冰箱保存备用。
[0124] (ii)基于PCR检测的miRNA茎环法逆转录
[0125] 包括；（1)总RNA预变性：在200 μ 1灭菌离必管中加入0. 5 μ g总RNA和适量 DEPC水，使总体积为6.8μ 1。（2)利用PCR仪进行预变性，程序如下；7(TC X10分钟， 4°C化rever。（3)冰上操作，按表1在200 μ 1灭菌离必管中加入各种试剂及RNA溶液（总 体积为1〇μ U。（4)在PCR仪中完成逆转录反应，反应程序如下；16°C Χ30分钟；42°C Χ30 分钟；85°C X 5 分钟；4°C forever。
[0126] 表1、miRNA茎环逆转录反应体系
[0127]
[012引 （iii)英光实时定量PCR(qPCR)检测miRNA
[0129] (1)按表2加入qPCR反应体系的各组成成分及加量体积（总体积为20 μ 1)。（2) qPCR反应程序如下；95°C Χ30砂；(95°C Χ5砂+60°C Χ30砂）Χ40个循环；溶解曲线 步骤。做结果判读；WU6作为内参，用2 A"表示miRNA的相对表达水平，其中Act = Ct (miRNA)-Ct扣6)。2 数值越大表示对应的miRNA相对表达水平越高；2 数值越小 表示对应的miRNA相对表达水平越低。
[0130] 表2、qPCR反应体系
[0131]
[0132] 应用上述RT-qPCR技术，针对170例宫颈癌组织W及68例正常组织，统计两种组 织样本中miR-375相对表达水平的平均值，比较发现miR-375在宫颈癌组织中的相对表达 较正常组织降低了约4. 45倍。此外，针对147例宫颈癌组织W及74例正常组织，统计两种 组织样本中miR-375相对表达水平的平均值，比较发现，miR-424在宫颈癌组织中的相对表 达较正常组织降低了约4. 10倍，结果如图3和图4。RT-qPCR结果初步掲示了 miR-375和 miR-424检查在宫颈癌筛查中的潜在价值。
[0133] 进一步地，本发明人进行了回顾性研究，对已有的735例不同组织学病理状态的 宫颈脱落细胞中进行miRNA的检测，已知735例中240例正常宫颈、100例CIN1U11例 CIN2U17例CIN3U67例宫颈癌。RT-qPCR的结果也发现，miR-375、miR-424在宫颈癌及高 级别CIN(CIN2-3)宫颈脱落细胞中的表达显著低于它们在正常宫颈或CIN1宫颈脱落细胞 中的表达，降低的表达量均高于4倍。
[0134] 3、miRNA检测结合细胞学研究考察miRNA用于宫颈癌的可行性
[0135] 通过回顾性和前瞻性研究，评估宫颈脱落细胞miRNA检测在HPV阳性妇女中的 分层筛查中是否有作用。采用薄层液基细胞学（Thinprep)进行宫颈细胞学检查，并根据 TBS2001灯he Bethesda System 2001)作出宫颈细胞病理学诊断。根据前期筛选试验，纳入 miR-：Ma、miR-92a、miR-93、miR-218、miR-375 W及 miR-424 共 6 个 miRNA 作为候选 miRNA, 根据筛选结果重点考察miR-375和miR-424作为宫颈癌潜在的新生物标志物与宫颈癌或其 癌前病变的关系，并通过绘制R0C曲线评估各候选miRNA检测及宫颈细胞学检查在宫颈筛 查中的作用。
[0136] 在前瞻性研究中，本发明人分析比较了年龄为30-65岁的高危型HPV阳性妇女中 各候选miRNA表达检测和宫颈细胞学检查在筛查高级别宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中的异 同。用SPSS19. 0进行统计分析，P<0. 05为统计学具有显著性差异。总共有6112名妇女参 与了 HPV检测，其中有1450例HPV阳性病例，但送中间的297例HPV阳性根据排除标准被 排除。其余的1153例HPV阳性妇女的样本中有121例样本由于样本量不足而排除，另外11 例样本的miRNA检测结果无效（Ct〉35)而被进一步排除。最终共计纳入1021例符合条件 的HPV阳性样本分别进行了有效的己氏涂片和miRNA检测。
[0137] 根据最大约登指数（maximal Youden index)得出miR-375和miR-424较U6的相 对表达 cut-off 值分别为 0. 965 X 10 3 和 1. 353 X 10 5。W SPSS 软件（versionl7. 0)进行 统计分析，两组结果间的比较用非参数检验（Mann-Whitney U检验）。诊断级别和阴阳性 判定根据病理学标准（Pathology and Genetics of Tumors of the Breast and 化111日16 genital organs (World Health Organization, 2003))进行判定和比较。组织学诊断分歧 的样本，由病理学专家讨论并最终形成组织学的诊断共识。特异性根据检测结果为阴性的 样本占病理学阴性样本的百分数计算；灵敏度根据检测结果为阳性的样本占病理学阳性样 本的百分数计算。
[0138] 结果发现，在诊断CIN2+(CIN2及更高级别病变，包括宫颈癌）时，miR-375和 miR-424单独检测的特异性均与细胞学检查相当（78. 1%和79. 3% VS. 75. 4%，P〉0. 05)， 灵敏度显著高于细胞学检查（76.0%和74. 9% vs. 63.8%，P<0. 01)，阳性预测值显著高 于细胞学检查化6. 3%和65. 3% VS. 58. 4%，P = 0.04)，阴性预测值显著高于细胞学检 查（85. 4%和 85. 7% VS. 79. 3%, P = 0.01)。在诊断 CIN3+时，miR-375 和 miR-424 单独 检测的特异性均与细胞学检查相当（71. 3%和71.6% VS. 70. 0%，P〉0. 05)，灵敏度显著高 于细胞学检查（82. 3%和80.9% VS. 69.8%，P<0. 01)，阳性预测值均与细胞学检查相当 (71. 6%和71. 3% VS. 70. 0%，P〉0. 05)，阴性预测值显著高于细胞学检查巧3. 3%和93. 7% VS. 89. 7%, P = 0. 02)。
[0139] 并且，本发明人发现，miR-375和miR-424的组合检测W及miR-375、miR-424和 miR-218的组合检测与细胞学检查相比，具有更高的灵敏度、特异性、阴/阳性预测值；而该 组合检测与miR-375和miR-424的单独检测相比，具有相似的灵敏度和阴性预测值W及更 高的特异性和阳性预测值。
[0140] 进而，本发明人通过绘制R0C曲线评估各候选miRNA检测及宫颈细胞学检查在 宫颈筛查中异同。共纳入1021例HPV阳性样本，其中579例病理学正常，83例CIN1，144 例CIN2, 208例CIN3, 7例浸润性宫颈癌。W U6为内参，RT-qPCR检测miR-424, miR-375, miR-34a，miR-218 的相对表达 cut-off 值分别为 1. 353X 10 5,0. 965X 10 3,〇. 759X 10 3， 1.928X 10 5(灵敏度和特异性相关数据见前述）。己氏涂片（Pap test)结果根据 ASCUS (abnormal squamous cells of uncertain si即i円cance)标准判断。W miRNA 相对 表达量低于cut-off值或己氏涂片结果为ASCUS及W上判定为检测阳性；W miRNA相对表 达量等于或高于cut-off值或己氏涂片结果为阴性判定为检测阴性。相关根据卡方检测 任earson化i-square test)比较不同方法的筛查效率，并通过Logistic回归分析遽选出 有效的分层筛查方法。
[0141] 获得的R0C曲线如图5、图6。结果显示，对于HPV初筛阳性的妇女进行miR-375 和miR-424检测优于宫颈细胞学检测的分层筛查方法。
[0142] 上述结果证明了 miR-375、miR-424的单独或组合W及miR-375和miR-424与 miR-218的组合检查在宫颈癌筛查中的重要价值，而对于HPV初筛阳性的妇女进行miRNA的 分层筛查更优于宫颈细胞学检查。
[0143] 实施例2、miRNA检测试剂盒的制备
[0144] 1、基于RT-qPCR技术的试剂盒
[0145] 本实施例中，所述基于核酸扩增的miRNA检测试剂盒包括下列组成：
[014引 （1)总RNA提取试剂；Trizol溶液，氯仿，异丙醇，己醇，DEPC水；
[0147] (2)miRNA逆转录试剂；逆转录酶、RNA酶抑制剂、逆转录缓冲液、dNTP混合物。[0148] (3)miRNA逆转录引物；miR-375逆转录引物和miR-424逆转录引物，用作内参的 U6的逆转录引物。
[014引 （4)miRNA的PCR检测试剂；Taq酶、Mg2\ PCR缓冲液、dNTP混合物、核酸染料。
[0150] (5)miRNA 核酸扩增引物；miR-375qPCR 上游引物，miR-424qPCR 上游引物，miRNA qPCR通用下游引物。用作内参的U6的上游引物和下游引物。
[0151] (6)阴性质控品；为不含核酸的RNA稀释液。
[0152] (7)阳性质控品；为含一定量miRNA的稀释物。
[0153] 2、基于杂交捕获的miRNA检测试剂盒
[0154] 本实施例中，基于杂交捕获的miRNA检测试剂盒包括下列组成：
[0155] (1)样品裂解液；为含1. 75M氨氧化钢的溶液。
[0156] (2)探针试剂；为含有miRNA检测所需的单链DNA探针。
[0157] 其中探针序列如下：
[015引 miR-375 探针；5, -TCACGCGAGCCGAACGAACAAA-3,（沈Q ID N0:14);
[0159] miR-424 探针；5, -TTCAAAACATGAATTGCTGCTG-3,（SEQ ID NO:15)。
[0160] (3)捕获微孔板；为包被有特异性捕获抗体ATCC#皿8730 (溶于碳酸盐缓冲液 (pH9. 6)中，W 0. 1 μ g/ml，100 μ 1/孔对96孔板进行包被）的固相载体，即96孔板。
[0161] (4)检测试剂；为含偶联有碱性磯酸酶的抗DNA-RNA杂合体的高特异性抗体 (ATCC細Β8730)的溶液（抗体浓度；100ng/ml)。溶液中还含有；0. 6Μ化C1、0.1 mM MgC12、 0. 25% Tween-20。。
[0162] (5)底物试剂；为碱性磯酸酶化学发光底物，即0. 4mM CDP-Star溶液。
[0163] (6)浓缩洗涂液；为Tris-HCl缓冲盐溶液灯BS)。
[0164] (7)阴性质控品；为不含核酸的生理盐水。
[0165] 做阳性质控品；为含一定量miRNA的稀释物。
[0166] 实施例3、基于杂交捕获法的miRNA检测
[0167] 利用前述实施例2制备的基于杂交捕获的miRNA检测试剂盒，进行miR-375或 miR-424的检测。
[0168] (1)样品处理；取临床样本与样本裂解液（同实施例2)混合，在46°C水浴中赔育 45-60分钟。
[0169] (2)核酸杂交：从水浴中取出裂解样本，冷却至室温。取一块96孔微孔板用作杂 交微孔板，加入裂解样本和单链DNA探针试剂，用封板膜封住杂交微孔板。随后将杂交微孔 板放在微孔板加热振荡器上，110化pm振荡3-5分钟，混匀。在46°C条件下赔育60分钟，然 后取出杂交微孔板，冷却至室温。样本中的存在的miR-375或miR-424将与单链DNA探针 结合形成DNA-RNA双杂合体；
[0170] (3)抗体捕获；取捕获微孔板一块，将杂交微孔板中的液体（约100 μ 1/孔）完 全转移至捕获微孔板对应的孔中；用封板膜封住捕获微孔板，放置于微孔板加热振荡器上， 25 °C条件下110化pm振荡60分钟。
[017。 （4)检测抗体识别：取出捕获微孔板，将板中的液体（约100μ 1/孔）移除；加入 检测试剂（如实施例2)，用封板膜封住捕获微孔板，25Γ条件下赔育45-60分钟。
[0172] (5)化学发光检测：去除捕获微孔板中的检测试剂，用洗涂液清洗捕获微孔板；捕 获微孔板中加入底物试剂，室温避光赔育15-30分钟，在化学发光免疫分析仪上读数。化学 发光的信号（Signal)/噪声（Noise)比例用S/N表示。
[0173] 基于杂交捕获的miR-424检测结果如表3所示。
[0174] 表 3
[0175]
[0176] 实施例4、基于杂交捕获法的miRNA检测的临床应用
[0177] 获取10位受试者的宫颈脱落细胞，应用如实施例3的杂交捕获法进行miR-424和 miR-375检测。W正常样本的杂交捕获结果作为参照，根据测得的结果来判断受试者的患病 情况，并进行预后，结果如下：
[0178] 3位受试者测得样本中miR-424和miR-375均显著低于（低2倍W上）正常样本 中miR-424和miR-375含量；建议后续进行积极检查和治疗。
[0179] 7位受试者测得样本中miR-424和miR-375均与正常样本中放入miR-424和 miR-375含量相当或接近；确定为低危人群。
[0180] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考郝样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，送些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. miR-375和/或miR-424的用途，用于制备诊断宫颈癌或其癌前病变的诊断试剂。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂包括： (1) 特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或 (2) 特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。3. 特异性检测miR-375和/或miR-424的试剂的用途，用于制备诊断宫颈癌或其癌前 病变的诊断试剂盒。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的特异性检测miR-375和/或miR-424 的试剂包括： (1) 特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或 (2) 特异性识别（结合）miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。5. -种用于诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括： (1) 特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物；或 (2) 特异性识别miR-375和/或miR-424的探针；较佳地为DNA探针。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性识别miR-375和 /或miR-424的DNA探针，并且，还包括： (3) 捕获抗体，其是抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体，其包含于溶液中或被固定于固相 载体上；和 (4) 检测抗体，其是连接有可检测信号的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括选自下组的一种 或多种试剂或组件： 样品裂解液； 洗涤液； 变性液； 阴性质控品； 阳性质控品； 鉴定可检测信号的试剂；和/或 微孔板。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测信号选自：碱性磷酸酶，辣 根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶；所 述的鉴定可检测信号的试剂是所述碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-D-半 乳糖苷酶，脲酶，过氧化氢酶或葡萄糖淀粉酶的底物。9. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括特异性扩增miR-375和 /或miR-424的引物，并且，还包括： 总RNA提取试剂； 逆转录试剂； miR-375和/或miR-424逆转录引物；miRNA的PCR检测试剂； miRNA核酸扩增引物； 阴性质控品；和/或 阳性质控品。10. -种诊断宫颈癌或其癌前病变的方法，其特征在于，所述方法包括：应用权利要求 6-8任一所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞样本中miR-375和/或miR-424的 存在量；较佳地，该方法包括： (1) 将待测样本裂解后，与所述的特异性识别miR-375和/或miR-424的DNA探针进行 杂交反应，获得杂交液； (2) 将杂交液加样到包被有捕获抗体的固相载体上，在固相载体上形成捕获抗体与 DNA-RNA杂合体二元复合物； (3) 将检测抗体加样于固相载体，在固相载体上形成捕获抗体、DNA-RNA杂合体和检测 抗体三元复合物； (4) 鉴定固相载体上的可检测信号，确定待测样品中miR-375和/或miR-424的存在 量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞中的存在量，则提示 该受试者存在宫颈癌或其癌前病变； 或者，所述方法包括：应用权利要求9所述的试剂盒检测受试者离体宫颈组织或细胞 样本中miR-375和/或miR-424的存在量；较佳地，该方法包括： (a) 提取受试者离体宫颈组织或细胞样本的总RNA; (b) 利用miR-375和/或miR-424逆转录引物进行逆转录，获得miR-375和/或miR-424 的cDNA; (c) 利用特异性扩增miR-375和/或miR-424的引物进行PCR扩增，确定miR-375和/ 或miR-424的存在量；若miR-375和/或miR-424的存在量显著低于正常宫颈组织或细胞 中的存在量，则提示该受试者存在宫颈癌或其癌前病变。
【专利摘要】本发明涉及microRNA在制备诊断宫颈癌或其癌前病变的试剂盒中的应用。首次揭示了miR-375和miR-424在宫颈癌或其癌前病变的组织或细胞内明显低表达，且这种低表达与宫颈癌或其癌前病变存在明显的相关性。本发明还提供了测定miR-375和/或miR-424的存在量的宫颈癌或其癌前病变的诊断方法和试剂盒。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105486866
【申请号】CN201410482605
【发明人】韩斌, 谢幸, 吕卫国, 程晓东, 王新宇, 胡杰锋, 华绍炳
【申请人】杭州德同生物技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月19日
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