一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法
一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医生物技术领域，设及一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价 的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 犬细小病毒(化nine Parvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属，是自主复制型 单链DNA病毒，直径约22nm，呈二十面体立体对称结构，无囊膜，壳粒32个。CPV能引起犬的急 性、接触性、高度致死性传染病，临床W剧烈呕吐、出血性肠炎或非化脈性屯、肌炎和白细胞 显著减少为主要特征，有两种临床表现型，出血性肠炎型和屯、肌炎型。W幼犬最易感，发病 率为50~100%，病死率在10~50%，是危害宠物犬、警犬W及其他犬科动物最重要病原之 一。1982年我国首次报道了该病，随后在东北、华北和西南等地区的警犬和良种犬中陆续发 生和蔓延。2001年该病广泛流行，造成了极大的损失。我国2008年修订的《一、二、Ξ类动物 疫病病种名录》将犬细小病毒病列为Ξ类动物疫病。
[0003] 疫苗免疫是预防该病的重要措施，而血凝抑制化I)效价是评价免疫效果的重要指 标，HI效价达到1:80时可W耐受CPV的攻击。目前市场上已有的CPV抗体检测胶体金试纸条 W及其他检测CPV抗体的方法如ELISA试剂盒仅能测血清抗体是否阳性，而无法检测其抗体 HI效价，因此无法确切评价疫苗免疫效果。血凝抑制试验作为检测CPV抗体的一种经典实验 室方法，亦是国家标准方法(GB/T 14926.57-2008)，但该试验的准确性和稳定性与CPV的毒 株、红细胞的来源、反应溫度、缓冲体系及其抑值等多种因素密切相关，不易被操作者所掌 握，加之试验所需材料一一猪红细胞采集、处理、保存问题，试验步骤繁琐等因素严重影响 了该试验方法的广泛应用。
[0004] 胶体金免疫层析法（Colloidal gold immunochromatogra地y assay,CGIA)是由 固相酶免疫测定技术发展而来的固相标记免疫测定的新技术。该方法具有使用方便快速， 便于基层使用和现场使用；成本低，不需要特殊的仪器设备;结果读取直观等优点，已成为 当前动物疫病检测领域中广泛采用的免疫学检测方法之一。
[0005] 目前，尚未有简便、快速的胶体金试纸条可用于犬血清中CPV抗体HI效价的测定。
【发明内容】
[0006] 根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制 效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[000引一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条，其特征在于，在胶 体金标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb;在检测线T线上同样 包被有CPV治疗性单克隆抗体McAb;对照线C线上包被羊抗鼠 IgG，所述CPV治疗性单克隆抗 体为血凝相关单克隆抗体。
[0009] 在所述胶体金标记物垫上喷的胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为1-10 μg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb的浓度为0.5-2mg/ml;所述对 照线C线上包被羊抗鼠 IgG的浓度为0.5-2mg/ml。
[0010] 所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb与所述对照线C线上包被羊抗 鼠 IgG的浓度比值为2:1。
[0011] 在所述胶体金标记物垫上喷的胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为3.72 μg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb的浓度为Img/ml;所述对照线 C线上包被羊抗鼠 IgG的浓度为0.5mg/ml。
[0012] 检测时将犬血清从1:10开始倍比稀释，使用16抗原单位的标准抗原时，CGIA效价 乘W4即为犬血清中抗体HI效价;使用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘W8即为HI效 价;使用8抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘W2即为HI效价;使用4抗原单位的标准抗原 时，CGIA效价等于HI效价。
[OOU]检测时可使用32、16、8和4个抗原单位的标准抗原。
[0014] 上述的胶体金试纸条，其特征在于，反应时间为10-30min，反应溫度为37±2°C，胶 体金溶液的抑值为8.2。
[0015] 本发明还请求保护包括上述的胶体金试纸条的试剂盒。
[0016] 本发明还请求保护使用上述的胶体金试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方 法。本发明设及的一种CPV治疗性单克隆抗体，由杂交瘤细胞(保藏号CGMCC No. 4304)分泌、 制备腹水并纯化而得。
[0017] 上述单克隆抗体在CPV抗体HI效价检测中的应用。其特征在于，CPV的结构特点是 立体对称的，因此存在多个相同的抗原表位，可同时结合两个W上相同的单抗;在胶体金标 记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb，反应膜检测线(T线)上同样 包被CPV治疗性单克隆抗体McAb，而对照线(C线)上包被羊抗鼠 IgG;检测时，先将样本倍比 稀释后与CPV标准抗原等体积混合，稀释样本中抗体与CPV标准抗原上的血凝素结合，当CPV 标准抗原未完全被中和时，则剩余CPV与Au-McAb结合形成复合物，进而与T线上的McAb结 合显色；当样本中抗体完全中和了CPV标准抗原，则无剩余CPV可与Au-McAb形成复合物，T线 不显色。
[0018] -种利用胶体金免疫层析技术，建立的简便、快速测定CPV抗体HI效价的方法。其 特征在于将犬血清倍比稀释后，分别与16个抗原单位的CPV标准抗原1:1等体积混合，在37 ±2°C反应一段时间后，滴入上述CPV治疗性单克隆抗体制备的胶体金试纸条，WT线消失的 最大血清稀释度乘W 4为犬血清CPV抗体HI效价。
[0019] 本发明中试纸条检测线（T线）消失时的血清最高稀释倍数为试纸条检测效价即 CGIA效价。
[0020] 本发明中所用单抗为根据国标方法筛选的特异性针对血凝素的单抗，本发明发明 人通过大量的实验验证W及深入的综合分析得出在本发明试纸条的各个相应的生物垫上 包被特定的生物试剂可特异性结合标准抗原(CPV病毒)上的血凝素从而捕获抗原，犬血清 与标准抗原反应后，本试纸条通过是否检测到游离血凝素从而间接反应出犬血清抗体的HI 效价。并在本发明试纸条的各个相应的生物垫上包被特定比例范围的生物试剂可使相应的 效果更加明显。
[0021] 本发明提供了运用试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法，可替代血凝血抑 的方法，大大简便了实验操作并缩短了操作时间，降低了对操作者的要求，扩大了使用范 围。
[0022] 本发明试纸条用于犬血清抗体HI效价的定性检测时，只需将犬血清直接稀释至1: 20(使用16个抗原单位的标准抗原)检测即可，若试纸条检测血清CGIA效价Μ : 20,即HI效 价Μ : 80，则说明免疫合格;若CGIA< 1: 20，即HI效价< 1:80，则说明免疫不合格。同理，使用 其他抗原单位的标准抗原检测时，只需将犬血清分别稀释至1:10(32个抗原单位检测）、1: 40 (8个抗原单位检测）1:80 (4个抗原单位检测）。 杂交瘤细胞保藏信息： 杂交瘤细胞株名称:CPV 1D3 菌株分类:小鼠杂交瘤细胞系 保藏编号为:CGMCC No.4304 保藏日期:2010年11月03日 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(简称CGMCC) 保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0023] 图1为试纸条内部结构示意图；
[0024] 图2为试纸条外部结构示意图。
【具体实施方式】：
[0025] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方 式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其 他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本 发明的保护范围之内。
[0026] 本发明实验材料的来源：
[0027] 生物材料：
[00%] CPV治疗性单克隆抗体、CPV标准抗原化A 效价为1:2560)、标准血清1化1效价为1: 80)、标准血清2化I效价为1:5120)均由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供。
[0029] 羊抗鼠 IgG，2mg/ml，购买自北京中衫金桥生物技术有限公司
[0030] 说明：国标方法中的血凝抑制试验的原理基础就是病毒上的血凝素凝集红细胞出 现血凝反应，血凝相关单抗是指针对病毒上血凝素的单抗，本CPV治疗性单抗是具有此特性 的单抗，因此称为血凝相关单抗。
[0031] 实施例1、犬细小病毒治疗性单克隆抗体制备
[0032] 1.杂交瘤的培养：
[0033] 将杂交瘤单克隆抗体细胞株(保藏号CGMCC No.4304)进行扩增培养，由96孔增至 24孔，再增至T25细胞瓶扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，8~9天后 开始收集腹水，所得腹水1200化pm离屯、30min去除油脂和沉淀，上清液用0.22μπι微孔滤膜过 滤，冻存备用。
[0034] 2.单克隆抗体的纯化：
[0(X3日]在上述过滤单抗腹水中加入与其等体积PBS缓冲液，用Protein G Sepharose 4B 层析柱分离纯化，收集蛋白洗脱峰，W抑7.2的PBS透析过夜，用截留分子量为30KD的滤膜超 滤浓缩。得到纯化的单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定纯度，分别在25KD和50KD处有两条带，为 轻链和重链;测定单抗蛋白浓度为7.75mg/ml，并用国标方法(GB/T 14926.57-2008)鉴定单 抗的免疫活性，效价为1:2560。
[0036] 实施例2、犬细小病毒治疗性单克隆抗体制备的胶体金试纸条
[0037] 1.胶体金的制备及鉴定
[0038] 取0.01 %氯金酸水溶液100ml加热至沸，揽动下准确加入1 %巧樣酸Ξ钢水溶液 2ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后W蒸馈水恢复 到原体积，如此制备的金溶胶在530±5nm处有最大吸收峰。冷却后加入超纯水恢复至原体 积，置4°C保存。烧制好的胶体金眼观为紫红色，透明、澄清；用分光光度计测定其最大吸收 峰为530nm，吸光度值为0.954。透过电镜观察烧制的胶体金大小均匀一致，散在分布;测量 100个胶体金颗粒大小，计算其平均值为25nm，变异系数9.6%。
[0039] 2.免疫胶体金标记的犬细小病毒治疗性单克隆抗体结合物的制备、纯化及鉴定
[0040] 在蛋白等电点（pi)略偏碱的条件下胶体金和蛋白的结合力最好，单抗的pi为约 8.0左右，调节胶体金溶液抑分别为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.5、9.0，将犬细小病 毒单克隆抗体100倍稀释后分别取1〇μ1、2化1、30μ1、4化1、50μ1、6化1，分别加入到1ml不同 抑胶体金溶液的离屯、管中；5min后，在上述各管内分别加入0.1ml 10 %化C1，混匀静置化W 上观察结果(见表1)。未加入蛋白和蛋白量不足的管中，胶体金不稳定，会呈现由红变蓝的 聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量时，胶体金稳定，保持红色不变。记录颜色 保持不变的最低单抗用量，W最低量的基础再加10%-20%即为1ml胶体金溶液待标记单抗 的实际用量。
[0041 ]表1.蛋白标记量及胶体金溶液piH确定
[0042]
[0043] 由上表可见，pH值在8.2，标记用单抗为3. lOyg/每毫升胶体金(3.10μg/ml)时，胶 体金保持红色不变，且单抗用量最少；在此基础上加10 % -20 %单抗用量均可行，本发明中 使用最低标记单抗量加20%，即为3.72μg/ml。最终选择抑值为8.2，犬细小病毒治疗性单克 隆抗体标记实际用量为3.72μg/ml。
[0044] 按照上述选定的最适条件进行胶体金的标记后，加入1 % B S A，将金标结合物 2000巧m离屯、30min，取上清12000rpm离屯、30min，沉淀用ο.02mol/L pH7.2含ο. 1 %BSA的PBS 溶解，恢复到原体积。再超离1次，沉淀用上述PBS溶解，使OD53G = 1.2。0.22μπι微孔滤膜过滤， 4°C保存备用。
[0045] 3.最佳反应膜浓度的确定
[0046] 将纯化的CPV-McAb稀释成4个浓度：2mg/ml、1.5mg/ml、Img/ml、0.5mg/ml，分别用 喷膜机喷在硝酸纤维素膜(NC膜）的检测线（Τ线）处;再将羊抗鼠 IgG稀释成3个浓度：2mg/ ml、Img/ml、0.5mg/ml，用喷膜机喷在硝酸纤维素膜的对照线(C线)处。两两组合形成12个检 测反应膜，再分别与确定好浓度的免疫胶体金制备的金标垫组装制成试纸条小样，检测标 准抗原及PBS，选择PBS检测时T线背景最干净、C线最清晰，而检测标准抗原时T线最清晰的 组合作为最佳反应膜浓度(见表2)。
[0047] 表2.反应膜浓度确定
[004引
[0049]由表2可见，T线CPV-McAb浓度在Img/ml，C线羊抗鼠 IgG浓度为0.5mg/ml时，检测抗 原T线和C线颜色最清晰;检测PBS时T线背景干净，C线颜色最清晰。因此，最终选择T线CPV-McAb最适浓度为Img/ml，C线上羊抗鼠 IgG最佳浓度为0.5mg/ml。
[0化日]4.试纸条的组装
[0051] 将制备好的样品垫、结合物垫、反应膜和吸水垫按顺序接续粘贴在预先裁好的粘 性背板上。再用切条机切成0.4cm宽的长条，装入试纸条专用盒内，如图1、图2。
[0052] 5.试纸条的测试
[0053] 按照优选的最佳条件制备试纸条并组装成盒，检测12份质控犬粪便样品，验证其 检测性能并与PCR方法检测结果进行比较，其中2份样品结果不同，符合率为83.3% (表3)， 说明试纸条敏感性、特异性良好。
[0054] 表3.试纸条测试结果
[0化5]
[0化6]实施例3、快速检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法 [0057] 1.抗原单位的确定
[0化引将标准抗原用PBS从1:2开始倍比稀释至1:2048，吸取8041逐滴缓慢滴入上述制备 的试纸条加样孔内，30min判定结果。当C线和T线同时出现红色条带时，W最高稀释倍数的 抗原定为1个抗原单位。此最高稀释倍数为1:512，即标准抗原稀释512倍时为1个抗原单位。
[0059] 2.反应抗原量的确定
[0060] 配制512、256、128、64、32、16、8、4、2和1个抗原单位的标准抗原（即分别将标准抗 原作原倍不稀释、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512 稀释）；将标准血清 1 和标准血清2先用PBS做10倍稀释之后，再进行倍比稀释至1:10240备用；用微量移液器将稀 释好的标准血清1和标准血清2各吸取50μ1至96孔酶标板上，分别加入各个抗原单位的标准 抗原50μ1，在微量振荡器上轻轻混匀，用封板膜封好，置37 ± 2°C恒溫培养箱反应30min，并 在加样记录单上记录好血清和抗原的稀释度;吸取80μ1抗原抗体反应混合物逐滴缓慢滴入 上述制备的试纸条加样孔内，30min内判定结果，比较10种不同稀释度的标准抗原与血清反 应效果的差异。判定标准:一定稀释度的血清与选定抗原单位完全反应时，用上述试纸条检 测应为阴性；W完全中和选定抗原单位的血清最高稀释倍数作为血清中抗体的CGIA效价， 良PT线不出现红色条带时的血清最高稀释倍数为抗体CGIA效价。10种抗原单位检测时，标准 血清1和标准血清2抗体的CGIA效价检测如表4。
[0061 ]表4.不同抗原单位标准血清CGIA效价
[0062]
[0063]
[0064] 选择原则:选择检测时Τ线出现明显红色条带，并且在稀释抗体的范围内能恰好被 完全中和的抗原量作为标准抗原。如表4可见，使用512、256、128和64个抗原单位时，抗原量 过高，超出了标准血清1可中和范围，因此不能使用;使用2个抗原单位和1个抗原单位时，抗 原量过低，不足W中和标准血清2最高稀释度（1:10240)时的抗体，无剩余抗原可被试纸条 检出，所W检测标准血清2，Τ线不出现红色条带，因此同样不适合用运两个 抗原单位作为检 测用标准抗原。最终可选择32、16、8、4个抗原单位作为检测用标准抗原。
[0065] 3.反应时间确定（W16单位标准抗原为例）
[0066] 在37 ± 2°C下进行实验，取16单位标准抗原50μ1与640倍稀释标准血清50μ1混合后 分别反应:0、5、10、15、20、25、30111；[]1之后，进行试纸条检测，了解不同反应时间不同^及反 应溫度下的反应效果。在37±2°C的溫度下，反应lOmin至30min均能达到相似的结果，本发 明中选择15min，既保证了反应稳定又减少了反应时间，因此最终选择反应条件为37±2°C 15min来进行后续的工作。
[0067] 说明：本发明中只描述W16单位标准抗原为例的情况，实际上在本发明的申请日 前也同样做过4,8,32单位标准抗原的实验，其反应条件基本与W16单位标准抗原的相同， 在此就不一一列举。
[0068] 实施例4、快速检测CPV抗体HI效价的方法与HI试验比较(W16单位标准抗原为例）
[0069] 1.二种方法监测实验犬血清抗体消长规律
[0070] 将44份CPV攻毒的实验犬血清样品分别进行试纸条快速检测方法和HI试验检测。 HI试验按国标方法(GB/T 14926.57-2008)进行;试纸条快速检测方法按选定的最佳反应条 件进行检测(结果见表5)。
[0071] 表5. 2种方法检测实验犬血清样品结果
[0072]
[0074]结果表明：血清4倍CGIA效价即HI效价。在44份血清样品中有37份符合4倍CGIA等 于HI效价的关系，符合率为84.1 %。
[00巧]2. 2种方法检测临床犬血清抗体
[0076] 将42份临床犬血清样品分别进行试纸条快速检测方法和HI试验检测。HI试验按国 标方法(GB/T 14926.57-2008)进行;试纸条快速检测方法按选定的最佳反应条件进行检测 (结果见表6)。
[0077] 表6. 2种方法检测临床犬血清样品结果(16单位抗原）
[007引
[0080]结果表明：临床犬血清同样符合4倍CGIA效价即HI效价。在42份血清样品中有41份 符合4倍CGIA等于HI效价的关系，符合率为97.6%。
[0081 ]综合表5和表6结果，犬血清CGIA效价与HI效价的关系表现为，86份血清样品中有 78份符合4倍CGIA等于HI效价，符合率为90.7%。
[0082] 另外，根据《实验动物病毒性疾病》（田克恭等著）WHI效价1:80作为判定标准：> 80为免疫效价合格，〈80为免疫效价不合格;依据上述结果推算血清CGIA效价^ 20为合格， 〈20为不合格。则结合表2和表3,2种方法的差异性分析结果如表7。
[0083] 表7.两种方法检测犬血清样品免疫效价差异性分析结果
[0084]
[0085] 表7显示：两种方法检测判定合格与不合格免疫血清的符合率为：（77+8)/86 X 100% =98.8%。说明该方法检验血清样品定性检测其抗体水平时，与HI试验结果符合率极 高，可替代HI试验快速检测犬血清中CPV抗体的HI效价。
[0086] 用于犬血清抗体HI定性检测时，需测定其HI效价是否Μ :80。使用16抗原单位作 为检测用标准抗原时，仅需将待检血清稀释至1:20，同时用试纸条检测标准抗原W及稀释 血清和标准抗原的反应混合液，若检测标准抗原的试纸条C线和Τ线均显色，而检测血清和 标准抗原反应混合液的试纸条C线显色Τ线不显色，则说明此血清抗体CGIA效价含1:20，即 HI效价含1:80，说明免疫合格;若检测标准抗原的试纸条C线和Τ线均显色，而检测血清和标 准抗原反应混合液的试纸条C线和T线也均显色，则说明此血清抗体CGIA效价<1:20，即HI效 价<1:80,说明免疫不合格。同理，使用其他抗原单位的标准抗原检测时，只需将犬血清分别 稀释至1:10(32个抗原单位）、1:40(8个抗原单位）、1:80(4个抗原单位)使用。
[0087] 用32抗原单位时，需使用的抗原量增多；用8和4抗原单位时，需分别将待测血清从 1:10倍比稀释至1:40和1:80,增加检测操作。因此，推荐使用16单位抗原用于检测。
[0088] 附:32单位抗原、8单位抗原和4单位抗原检测结果见表8-10
[0089] 表8. 2种方法检测临床犬血清样品结果比较(32单位抗原）
[0090]
[0091]
[0092] 表9. 2种方法检测临床犬血清样品结果比较(8单位抗原）
[0093]
[0094]
[0095] 表10. 2种方法检测临床犬血清样品结果比较(4单位抗原）
[0096]
[0097]
【主权项】
1. 一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条，其特征在于，在胶体 金标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，S卩Au-McAb;在反应膜检测线T线上 同样包被有CPV治疗性单克隆抗体McAb;对照线C线上包被羊抗鼠IgG，所述CPV治疗性单克 隆抗体为血凝相关单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，在所述胶体金标记物垫上喷的胶 体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为l-10yg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗 性单克隆抗体McAb的浓度为0.5-2mg/ml;所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度为0.5-2mg/ml〇3. 根据权利要求2所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线T线上包被的CPV治疗 性单克隆抗体McAb与所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度比值为2:1。4. 根据权利要求3所述的胶体金试纸条，其特征在于，在所述胶体金标记物垫上喷的胶 体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为3.72yg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗 性单克隆抗体McAb的浓度为lmg/ml;所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度为0.5mg/ml。5. 根据权利要求1-4任一所述的胶体金试纸条，其特征在于，检测时将犬血清从1:10开 始倍比稀释，使用16抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以4即为犬血清中抗体HI效价;使 用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以8即为HI效价;使用8抗原单位的标准抗原时， CGIA效价乘以2即为HI效价;使用4抗原单位的标准抗原时，CGIA效价等于HI效价。6. 根据权利要求5所述的胶体金试纸条，其特征在于，检测时可使用32、16、8和4个抗原 单位的标准抗原。7. 根据权利要求1-6任一所述的胶体金试纸条，其特征在于，反应时间为10-30min，反 应温度为37 ± 2°C，胶体金溶液的pH值为8.2。8. 包括权利要求1-7任一所述的胶体金试纸条的试剂盒。9. 使用权利要求1-7任一所述的胶体金试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。本发明涉及CPV治疗性单克隆抗体制备而成的试纸条，定量检测时将犬血清从1:10开始倍比稀释，与16个抗原单位的CPV标准抗原中和后，再滴入本试纸条中，试纸条检测线(T线)消失时的血清最高稀释倍数为试纸条检测效价(CGIA效价)，CGIA效价乘以4即为犬血清中抗体HI效价；使用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以8即为HI效价；使用8抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以2即为HI效价；使用4抗原单位的标准抗原时，CGIA效价等于HI效价。本方法与血凝血抑检测方法结果的符合率达90.7％，抗体定性检测结果的符合率达98.8％，可用于CPV疫苗免疫效果评价。CGMCC No.430420101103
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/577, G01N33/558
【公开号】CN105486871
【申请号】CN201510830541
【发明人】孙明, 陈西钊, 申屠芬琴, 马永缨, 杨欣艳
【申请人】北京世纪元亨动物防疫技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月25日
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医生物技术领域，设及一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价 的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 犬细小病毒(化nine Parvovirus，CPV)属细小病毒科，细小病毒属，是自主复制型 单链DNA病毒，直径约22nm，呈二十面体立体对称结构，无囊膜，壳粒32个。CPV能引起犬的急 性、接触性、高度致死性传染病，临床W剧烈呕吐、出血性肠炎或非化脈性屯、肌炎和白细胞 显著减少为主要特征，有两种临床表现型，出血性肠炎型和屯、肌炎型。W幼犬最易感，发病 率为50~100%，病死率在10~50%，是危害宠物犬、警犬W及其他犬科动物最重要病原之 一。1982年我国首次报道了该病，随后在东北、华北和西南等地区的警犬和良种犬中陆续发 生和蔓延。2001年该病广泛流行，造成了极大的损失。我国2008年修订的《一、二、Ξ类动物 疫病病种名录》将犬细小病毒病列为Ξ类动物疫病。
[0003] 疫苗免疫是预防该病的重要措施，而血凝抑制化I)效价是评价免疫效果的重要指 标，HI效价达到1:80时可W耐受CPV的攻击。目前市场上已有的CPV抗体检测胶体金试纸条 W及其他检测CPV抗体的方法如ELISA试剂盒仅能测血清抗体是否阳性，而无法检测其抗体 HI效价，因此无法确切评价疫苗免疫效果。血凝抑制试验作为检测CPV抗体的一种经典实验 室方法，亦是国家标准方法(GB/T 14926.57-2008)，但该试验的准确性和稳定性与CPV的毒 株、红细胞的来源、反应溫度、缓冲体系及其抑值等多种因素密切相关，不易被操作者所掌 握，加之试验所需材料一一猪红细胞采集、处理、保存问题，试验步骤繁琐等因素严重影响 了该试验方法的广泛应用。
[0004] 胶体金免疫层析法（Colloidal gold immunochromatogra地y assay,CGIA)是由 固相酶免疫测定技术发展而来的固相标记免疫测定的新技术。该方法具有使用方便快速， 便于基层使用和现场使用；成本低，不需要特殊的仪器设备;结果读取直观等优点，已成为 当前动物疫病检测领域中广泛采用的免疫学检测方法之一。
[0005] 目前，尚未有简便、快速的胶体金试纸条可用于犬血清中CPV抗体HI效价的测定。
【发明内容】
[0006] 根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制 效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。
[0007] 本发明的技术方案如下：
[000引一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条，其特征在于，在胶 体金标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb;在检测线T线上同样 包被有CPV治疗性单克隆抗体McAb;对照线C线上包被羊抗鼠 IgG，所述CPV治疗性单克隆抗 体为血凝相关单克隆抗体。
[0009] 在所述胶体金标记物垫上喷的胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为1-10 μg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb的浓度为0.5-2mg/ml;所述对 照线C线上包被羊抗鼠 IgG的浓度为0.5-2mg/ml。
[0010] 所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb与所述对照线C线上包被羊抗 鼠 IgG的浓度比值为2:1。
[0011] 在所述胶体金标记物垫上喷的胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为3.72 μg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗性单克隆抗体McAb的浓度为Img/ml;所述对照线 C线上包被羊抗鼠 IgG的浓度为0.5mg/ml。
[0012] 检测时将犬血清从1:10开始倍比稀释，使用16抗原单位的标准抗原时，CGIA效价 乘W4即为犬血清中抗体HI效价;使用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘W8即为HI效 价;使用8抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘W2即为HI效价;使用4抗原单位的标准抗原 时，CGIA效价等于HI效价。
[OOU]检测时可使用32、16、8和4个抗原单位的标准抗原。
[0014] 上述的胶体金试纸条，其特征在于，反应时间为10-30min，反应溫度为37±2°C，胶 体金溶液的抑值为8.2。
[0015] 本发明还请求保护包括上述的胶体金试纸条的试剂盒。
[0016] 本发明还请求保护使用上述的胶体金试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方 法。本发明设及的一种CPV治疗性单克隆抗体，由杂交瘤细胞(保藏号CGMCC No. 4304)分泌、 制备腹水并纯化而得。
[0017] 上述单克隆抗体在CPV抗体HI效价检测中的应用。其特征在于，CPV的结构特点是 立体对称的，因此存在多个相同的抗原表位，可同时结合两个W上相同的单抗;在胶体金标 记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，即Au-McAb，反应膜检测线(T线)上同样 包被CPV治疗性单克隆抗体McAb，而对照线(C线)上包被羊抗鼠 IgG;检测时，先将样本倍比 稀释后与CPV标准抗原等体积混合，稀释样本中抗体与CPV标准抗原上的血凝素结合，当CPV 标准抗原未完全被中和时，则剩余CPV与Au-McAb结合形成复合物，进而与T线上的McAb结 合显色；当样本中抗体完全中和了CPV标准抗原，则无剩余CPV可与Au-McAb形成复合物，T线 不显色。
[0018] -种利用胶体金免疫层析技术，建立的简便、快速测定CPV抗体HI效价的方法。其 特征在于将犬血清倍比稀释后，分别与16个抗原单位的CPV标准抗原1:1等体积混合，在37 ±2°C反应一段时间后，滴入上述CPV治疗性单克隆抗体制备的胶体金试纸条，WT线消失的 最大血清稀释度乘W 4为犬血清CPV抗体HI效价。
[0019] 本发明中试纸条检测线（T线）消失时的血清最高稀释倍数为试纸条检测效价即 CGIA效价。
[0020] 本发明中所用单抗为根据国标方法筛选的特异性针对血凝素的单抗，本发明发明 人通过大量的实验验证W及深入的综合分析得出在本发明试纸条的各个相应的生物垫上 包被特定的生物试剂可特异性结合标准抗原(CPV病毒)上的血凝素从而捕获抗原，犬血清 与标准抗原反应后，本试纸条通过是否检测到游离血凝素从而间接反应出犬血清抗体的HI 效价。并在本发明试纸条的各个相应的生物垫上包被特定比例范围的生物试剂可使相应的 效果更加明显。
[0021] 本发明提供了运用试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法，可替代血凝血抑 的方法，大大简便了实验操作并缩短了操作时间，降低了对操作者的要求，扩大了使用范 围。
[0022] 本发明试纸条用于犬血清抗体HI效价的定性检测时，只需将犬血清直接稀释至1: 20(使用16个抗原单位的标准抗原)检测即可，若试纸条检测血清CGIA效价Μ : 20,即HI效 价Μ : 80，则说明免疫合格;若CGIA< 1: 20，即HI效价< 1:80，则说明免疫不合格。同理，使用 其他抗原单位的标准抗原检测时，只需将犬血清分别稀释至1:10(32个抗原单位检测）、1: 40 (8个抗原单位检测）1:80 (4个抗原单位检测）。 杂交瘤细胞保藏信息： 杂交瘤细胞株名称:CPV 1D3 菌株分类:小鼠杂交瘤细胞系 保藏编号为:CGMCC No.4304 保藏日期:2010年11月03日 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(简称CGMCC) 保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
【附图说明】
[0023] 图1为试纸条内部结构示意图；
[0024] 图2为试纸条外部结构示意图。
【具体实施方式】：
[0025] 提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方 式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其 他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本 发明的保护范围之内。
[0026] 本发明实验材料的来源：
[0027] 生物材料：
[00%] CPV治疗性单克隆抗体、CPV标准抗原化A 效价为1:2560)、标准血清1化1效价为1: 80)、标准血清2化I效价为1:5120)均由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供。
[0029] 羊抗鼠 IgG，2mg/ml，购买自北京中衫金桥生物技术有限公司
[0030] 说明：国标方法中的血凝抑制试验的原理基础就是病毒上的血凝素凝集红细胞出 现血凝反应，血凝相关单抗是指针对病毒上血凝素的单抗，本CPV治疗性单抗是具有此特性 的单抗，因此称为血凝相关单抗。
[0031] 实施例1、犬细小病毒治疗性单克隆抗体制备
[0032] 1.杂交瘤的培养：
[0033] 将杂交瘤单克隆抗体细胞株(保藏号CGMCC No.4304)进行扩增培养，由96孔增至 24孔，再增至T25细胞瓶扩增培养。然后收集细胞瓶内的细胞注射到小鼠腹腔内，8~9天后 开始收集腹水，所得腹水1200化pm离屯、30min去除油脂和沉淀，上清液用0.22μπι微孔滤膜过 滤，冻存备用。
[0034] 2.单克隆抗体的纯化：
[0(X3日]在上述过滤单抗腹水中加入与其等体积PBS缓冲液，用Protein G Sepharose 4B 层析柱分离纯化，收集蛋白洗脱峰，W抑7.2的PBS透析过夜，用截留分子量为30KD的滤膜超 滤浓缩。得到纯化的单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定纯度，分别在25KD和50KD处有两条带，为 轻链和重链;测定单抗蛋白浓度为7.75mg/ml，并用国标方法(GB/T 14926.57-2008)鉴定单 抗的免疫活性，效价为1:2560。
[0036] 实施例2、犬细小病毒治疗性单克隆抗体制备的胶体金试纸条
[0037] 1.胶体金的制备及鉴定
[0038] 取0.01 %氯金酸水溶液100ml加热至沸，揽动下准确加入1 %巧樣酸Ξ钢水溶液 2ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后W蒸馈水恢复 到原体积，如此制备的金溶胶在530±5nm处有最大吸收峰。冷却后加入超纯水恢复至原体 积，置4°C保存。烧制好的胶体金眼观为紫红色，透明、澄清；用分光光度计测定其最大吸收 峰为530nm，吸光度值为0.954。透过电镜观察烧制的胶体金大小均匀一致，散在分布;测量 100个胶体金颗粒大小，计算其平均值为25nm，变异系数9.6%。
[0039] 2.免疫胶体金标记的犬细小病毒治疗性单克隆抗体结合物的制备、纯化及鉴定
[0040] 在蛋白等电点（pi)略偏碱的条件下胶体金和蛋白的结合力最好，单抗的pi为约 8.0左右，调节胶体金溶液抑分别为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.5、9.0，将犬细小病 毒单克隆抗体100倍稀释后分别取1〇μ1、2化1、30μ1、4化1、50μ1、6化1，分别加入到1ml不同 抑胶体金溶液的离屯、管中；5min后，在上述各管内分别加入0.1ml 10 %化C1，混匀静置化W 上观察结果(见表1)。未加入蛋白和蛋白量不足的管中，胶体金不稳定，会呈现由红变蓝的 聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量时，胶体金稳定，保持红色不变。记录颜色 保持不变的最低单抗用量，W最低量的基础再加10%-20%即为1ml胶体金溶液待标记单抗 的实际用量。
[0041 ]表1.蛋白标记量及胶体金溶液piH确定
[0042]
[0043] 由上表可见，pH值在8.2，标记用单抗为3. lOyg/每毫升胶体金(3.10μg/ml)时，胶 体金保持红色不变，且单抗用量最少；在此基础上加10 % -20 %单抗用量均可行，本发明中 使用最低标记单抗量加20%，即为3.72μg/ml。最终选择抑值为8.2，犬细小病毒治疗性单克 隆抗体标记实际用量为3.72μg/ml。
[0044] 按照上述选定的最适条件进行胶体金的标记后，加入1 % B S A，将金标结合物 2000巧m离屯、30min，取上清12000rpm离屯、30min，沉淀用ο.02mol/L pH7.2含ο. 1 %BSA的PBS 溶解，恢复到原体积。再超离1次，沉淀用上述PBS溶解，使OD53G = 1.2。0.22μπι微孔滤膜过滤， 4°C保存备用。
[0045] 3.最佳反应膜浓度的确定
[0046] 将纯化的CPV-McAb稀释成4个浓度：2mg/ml、1.5mg/ml、Img/ml、0.5mg/ml，分别用 喷膜机喷在硝酸纤维素膜(NC膜）的检测线（Τ线）处;再将羊抗鼠 IgG稀释成3个浓度：2mg/ ml、Img/ml、0.5mg/ml，用喷膜机喷在硝酸纤维素膜的对照线(C线)处。两两组合形成12个检 测反应膜，再分别与确定好浓度的免疫胶体金制备的金标垫组装制成试纸条小样，检测标 准抗原及PBS，选择PBS检测时T线背景最干净、C线最清晰，而检测标准抗原时T线最清晰的 组合作为最佳反应膜浓度(见表2)。
[0047] 表2.反应膜浓度确定
[004引
[0049]由表2可见，T线CPV-McAb浓度在Img/ml，C线羊抗鼠 IgG浓度为0.5mg/ml时，检测抗 原T线和C线颜色最清晰;检测PBS时T线背景干净，C线颜色最清晰。因此，最终选择T线CPV-McAb最适浓度为Img/ml，C线上羊抗鼠 IgG最佳浓度为0.5mg/ml。
[0化日]4.试纸条的组装
[0051] 将制备好的样品垫、结合物垫、反应膜和吸水垫按顺序接续粘贴在预先裁好的粘 性背板上。再用切条机切成0.4cm宽的长条，装入试纸条专用盒内，如图1、图2。
[0052] 5.试纸条的测试
[0053] 按照优选的最佳条件制备试纸条并组装成盒，检测12份质控犬粪便样品，验证其 检测性能并与PCR方法检测结果进行比较，其中2份样品结果不同，符合率为83.3% (表3)， 说明试纸条敏感性、特异性良好。
[0054] 表3.试纸条测试结果
[0化5]
[0化6]实施例3、快速检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法 [0057] 1.抗原单位的确定
[0化引将标准抗原用PBS从1:2开始倍比稀释至1:2048，吸取8041逐滴缓慢滴入上述制备 的试纸条加样孔内，30min判定结果。当C线和T线同时出现红色条带时，W最高稀释倍数的 抗原定为1个抗原单位。此最高稀释倍数为1:512，即标准抗原稀释512倍时为1个抗原单位。
[0059] 2.反应抗原量的确定
[0060] 配制512、256、128、64、32、16、8、4、2和1个抗原单位的标准抗原（即分别将标准抗 原作原倍不稀释、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512 稀释）；将标准血清 1 和标准血清2先用PBS做10倍稀释之后，再进行倍比稀释至1:10240备用；用微量移液器将稀 释好的标准血清1和标准血清2各吸取50μ1至96孔酶标板上，分别加入各个抗原单位的标准 抗原50μ1，在微量振荡器上轻轻混匀，用封板膜封好，置37 ± 2°C恒溫培养箱反应30min，并 在加样记录单上记录好血清和抗原的稀释度;吸取80μ1抗原抗体反应混合物逐滴缓慢滴入 上述制备的试纸条加样孔内，30min内判定结果，比较10种不同稀释度的标准抗原与血清反 应效果的差异。判定标准:一定稀释度的血清与选定抗原单位完全反应时，用上述试纸条检 测应为阴性；W完全中和选定抗原单位的血清最高稀释倍数作为血清中抗体的CGIA效价， 良PT线不出现红色条带时的血清最高稀释倍数为抗体CGIA效价。10种抗原单位检测时，标准 血清1和标准血清2抗体的CGIA效价检测如表4。
[0061 ]表4.不同抗原单位标准血清CGIA效价
[0062]
[0063]
[0064] 选择原则:选择检测时Τ线出现明显红色条带，并且在稀释抗体的范围内能恰好被 完全中和的抗原量作为标准抗原。如表4可见，使用512、256、128和64个抗原单位时，抗原量 过高，超出了标准血清1可中和范围，因此不能使用;使用2个抗原单位和1个抗原单位时，抗 原量过低，不足W中和标准血清2最高稀释度（1:10240)时的抗体，无剩余抗原可被试纸条 检出，所W检测标准血清2，Τ线不出现红色条带，因此同样不适合用运两个 抗原单位作为检 测用标准抗原。最终可选择32、16、8、4个抗原单位作为检测用标准抗原。
[0065] 3.反应时间确定（W16单位标准抗原为例）
[0066] 在37 ± 2°C下进行实验，取16单位标准抗原50μ1与640倍稀释标准血清50μ1混合后 分别反应:0、5、10、15、20、25、30111；[]1之后，进行试纸条检测，了解不同反应时间不同^及反 应溫度下的反应效果。在37±2°C的溫度下，反应lOmin至30min均能达到相似的结果，本发 明中选择15min，既保证了反应稳定又减少了反应时间，因此最终选择反应条件为37±2°C 15min来进行后续的工作。
[0067] 说明：本发明中只描述W16单位标准抗原为例的情况，实际上在本发明的申请日 前也同样做过4,8,32单位标准抗原的实验，其反应条件基本与W16单位标准抗原的相同， 在此就不一一列举。
[0068] 实施例4、快速检测CPV抗体HI效价的方法与HI试验比较(W16单位标准抗原为例）
[0069] 1.二种方法监测实验犬血清抗体消长规律
[0070] 将44份CPV攻毒的实验犬血清样品分别进行试纸条快速检测方法和HI试验检测。 HI试验按国标方法(GB/T 14926.57-2008)进行;试纸条快速检测方法按选定的最佳反应条 件进行检测(结果见表5)。
[0071] 表5. 2种方法检测实验犬血清样品结果
[0072]
[0074]结果表明：血清4倍CGIA效价即HI效价。在44份血清样品中有37份符合4倍CGIA等 于HI效价的关系，符合率为84.1 %。
[00巧]2. 2种方法检测临床犬血清抗体
[0076] 将42份临床犬血清样品分别进行试纸条快速检测方法和HI试验检测。HI试验按国 标方法(GB/T 14926.57-2008)进行;试纸条快速检测方法按选定的最佳反应条件进行检测 (结果见表6)。
[0077] 表6. 2种方法检测临床犬血清样品结果(16单位抗原）
[007引
[0080]结果表明：临床犬血清同样符合4倍CGIA效价即HI效价。在42份血清样品中有41份 符合4倍CGIA等于HI效价的关系，符合率为97.6%。
[0081 ]综合表5和表6结果，犬血清CGIA效价与HI效价的关系表现为，86份血清样品中有 78份符合4倍CGIA等于HI效价，符合率为90.7%。
[0082] 另外，根据《实验动物病毒性疾病》（田克恭等著）WHI效价1:80作为判定标准：> 80为免疫效价合格，〈80为免疫效价不合格;依据上述结果推算血清CGIA效价^ 20为合格， 〈20为不合格。则结合表2和表3,2种方法的差异性分析结果如表7。
[0083] 表7.两种方法检测犬血清样品免疫效价差异性分析结果
[0084]
[0085] 表7显示：两种方法检测判定合格与不合格免疫血清的符合率为：（77+8)/86 X 100% =98.8%。说明该方法检验血清样品定性检测其抗体水平时，与HI试验结果符合率极 高，可替代HI试验快速检测犬血清中CPV抗体的HI效价。
[0086] 用于犬血清抗体HI定性检测时，需测定其HI效价是否Μ :80。使用16抗原单位作 为检测用标准抗原时，仅需将待检血清稀释至1:20，同时用试纸条检测标准抗原W及稀释 血清和标准抗原的反应混合液，若检测标准抗原的试纸条C线和Τ线均显色，而检测血清和 标准抗原反应混合液的试纸条C线显色Τ线不显色，则说明此血清抗体CGIA效价含1:20，即 HI效价含1:80，说明免疫合格;若检测标准抗原的试纸条C线和Τ线均显色，而检测血清和标 准抗原反应混合液的试纸条C线和T线也均显色，则说明此血清抗体CGIA效价<1:20，即HI效 价<1:80,说明免疫不合格。同理，使用其他抗原单位的标准抗原检测时，只需将犬血清分别 稀释至1:10(32个抗原单位）、1:40(8个抗原单位）、1:80(4个抗原单位)使用。
[0087] 用32抗原单位时，需使用的抗原量增多；用8和4抗原单位时，需分别将待测血清从 1:10倍比稀释至1:40和1:80,增加检测操作。因此，推荐使用16单位抗原用于检测。
[0088] 附:32单位抗原、8单位抗原和4单位抗原检测结果见表8-10
[0089] 表8. 2种方法检测临床犬血清样品结果比较(32单位抗原）
[0090]
[0091]
[0092] 表9. 2种方法检测临床犬血清样品结果比较(8单位抗原）
[0093]
[0094]
[0095] 表10. 2种方法检测临床犬血清样品结果比较(4单位抗原）
[0096]
[0097]
【主权项】
1. 一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条，其特征在于，在胶体 金标记物垫上喷有胶体金标记的CPV治疗性单克隆抗体，S卩Au-McAb;在反应膜检测线T线上 同样包被有CPV治疗性单克隆抗体McAb;对照线C线上包被羊抗鼠IgG，所述CPV治疗性单克 隆抗体为血凝相关单克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，在所述胶体金标记物垫上喷的胶 体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为l-10yg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗 性单克隆抗体McAb的浓度为0.5-2mg/ml;所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度为0.5-2mg/ml〇3. 根据权利要求2所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线T线上包被的CPV治疗 性单克隆抗体McAb与所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度比值为2:1。4. 根据权利要求3所述的胶体金试纸条，其特征在于，在所述胶体金标记物垫上喷的胶 体金标记的CPV治疗性单克隆抗体的浓度为3.72yg/ml;在所述检测线T线上包被的CPV治疗 性单克隆抗体McAb的浓度为lmg/ml;所述对照线C线上包被羊抗鼠IgG的浓度为0.5mg/ml。5. 根据权利要求1-4任一所述的胶体金试纸条，其特征在于，检测时将犬血清从1:10开 始倍比稀释，使用16抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以4即为犬血清中抗体HI效价;使 用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以8即为HI效价;使用8抗原单位的标准抗原时， CGIA效价乘以2即为HI效价;使用4抗原单位的标准抗原时，CGIA效价等于HI效价。6. 根据权利要求5所述的胶体金试纸条，其特征在于，检测时可使用32、16、8和4个抗原 单位的标准抗原。7. 根据权利要求1-6任一所述的胶体金试纸条，其特征在于，反应时间为10-30min，反 应温度为37 ± 2°C，胶体金溶液的pH值为8.2。8. 包括权利要求1-7任一所述的胶体金试纸条的试剂盒。9. 使用权利要求1-7任一所述的胶体金试纸条检测犬血清中CPV抗体HI效价的方法。
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测犬细小病毒抗体血凝抑制效价的胶体金试纸条、试剂盒及检测方法。本发明涉及CPV治疗性单克隆抗体制备而成的试纸条，定量检测时将犬血清从1:10开始倍比稀释，与16个抗原单位的CPV标准抗原中和后，再滴入本试纸条中，试纸条检测线(T线)消失时的血清最高稀释倍数为试纸条检测效价(CGIA效价)，CGIA效价乘以4即为犬血清中抗体HI效价；使用32抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以8即为HI效价；使用8抗原单位的标准抗原时，CGIA效价乘以2即为HI效价；使用4抗原单位的标准抗原时，CGIA效价等于HI效价。本方法与血凝血抑检测方法结果的符合率达90.7％，抗体定性检测结果的符合率达98.8％，可用于CPV疫苗免疫效果评价。CGMCC No.430420101103
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/577, G01N33/558
【公开号】CN105486871
【申请号】CN201510830541
【发明人】孙明, 陈西钊, 申屠芬琴, 马永缨, 杨欣艳
【申请人】北京世纪元亨动物防疫技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年11月25日
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