纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法
纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于电化学免疫传感器构建技术领域，具体设及一种WTi化纳米管复合材 料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，该电化学免疫传感器可 用于检测α-甲胎蛋白。
【背景技术】
[0002] 准确、灵敏地检测与疾病相关的蛋白质对许多现代研究领域，包括生物化学、生物 医学W及临床诊断都至关重要。尤其是临床检测与肿瘤及传染病相关的蛋白质对疾病的早 期检测和可靠性预测至关重要。甲胎蛋白（曰-fetoprotein,AFP)是胚胎发育早期的一种主 要血清蛋白，在健康的成人体内，其值通常低于25 ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高对原发性 肝癌诊断具有重要的意义。许多免疫分析法，包括巧光免疫分析、电化学酶免疫分析、化学 发光免疫分析、酶联免疫吸附法等均被广泛用于检测肿瘤标记物。在众多免疫分析法中，电 化学免疫分析法是最快速、有效和灵敏的分析方法。
[0003] 随着纳米科学与技术的飞速发展，各种各样的纳米材料，包括碳纳米材料、石墨締 纳米材料、量子点、贵金属等被广泛应用于免疫传感器中用来提高其分析性能。例如，Juan Tang等人用碳纳米颗粒修饰的仿生界面作免疫传感器探头，用不规则形状的金纳米颗粒 标记的HRP-anti-AFP作为示踪标记物，用来检测AFP，其线性范围为0.02 -4.0 ng/mL，检测 限为10 pg/mUGanesh K. Parshetti等人用金纳米/壳聚糖修饰玻碳电极，用哑铃形Au-Fe3化异质结构标记信号抗体Ab2，用来检测AFP，其线性范围为0.01-40ng/mL，检测限为 2.3 pg/mL。然而运些免疫传感器均存在线性范围较窄，检测限较高，稳定性较低等问题，因 此需要运用新技术、方法和材料来制备具有更好性能的免疫传感器。
[0004] 在众多纳米材料中，Ti〇2纳米管由于其比表面积大、机械稳定性好、合成方法简 便、环境友好性、无毒、管状结构W及优异的生物相容性等内在优点吸引了广泛的关注。然 而，由于Ti化纳米材料的表面惰性，很难将抗体、抗原直接负载于其表面。为克服运些缺点， 交联法、共价结合法W及包埋法等被用来在Ti化纳米材料上固定生物分子。更重要的是， Ti化纳米管从未在免疫分析中用作示踪标记物。
[000引BS3是一种双氨基交联剂，具有水溶性、非裂解性、膜不渗透性等特点，它含有一个 末端氨基反应基团（Sulfo-NHS醋基），可与任何含有伯胺基团的分子反应。因此，其广泛应 用于生物分子的交联。
[0006]蛋白A和蛋白G均可被用于定向负载抗体。Qiang Zhu等人用化fion修饰工作电极， 将Protein A吸附于电极表面用于负载捕获抗体Abl，用负载大量金纳米颗粒和簇基官能团 的石墨締片作为标记物来负载二抗@氧化还原探针，用于多路复用检测AFP、CEA和猪链球菌 2(SS2)。其中AFP的线性范围为0.016-50 ng/mL，检测限为5.4 pg/mLJeremy M. Fowler 等人也进行了一系列报道研究，他们用琉基化蛋白G为支架在免疫传感器表面定向负载更 高量的捕获抗体Abl，用于免疫分析测试。然而，由于蛋白G还能与IgG的Fab片段相结合，运 可能会破坏抗体的定向负载，从而导致干扰。运些缺点可W通过基因截断蛋白G而产生的蛋 白G/而得W解决，蛋白G/对IgG仍有亲和力，但是它缺少了白蛋白、Fab片段W及膜结合位 点。由于蛋白护只能结合IgG的Fc片段，因此它可W更有效地用于定向捕获抗体Abl，并使它 们的抗原结合位点暴露在外部来结合目标抗原。
[0007] 本发明分别通过水热法、化学氧化聚合法W及巧樣酸Ξ钢还原法最终合成出 GNPs-PANI-TNT复合材料，将其分散于壳聚糖溶液中并滴加在电极表面。WBS3为氨基交联 剂将蛋白G/共价结合在壳聚糖表面，用于定向负载捕获抗体AbUBS 3还被用于结合HRP和信 号抗体W制备示踪标记物。本发明克服了现有报道中出现的线性范围较窄，检测限较高W 及稳定性较差等缺点，目前还未见有相关报道。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种WTi化纳米管复合材料为定向负载 支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，该电化学免疫传感器能够快速地测定 甲胎蛋白，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种WTi化纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构 建方法，其包括如下步骤： ① GNPs-PANI-TNT复合材料的制备： Ti化纳米管的制备:将0.6 g Ti化纳米颗粒和120 mL、10 Μ的NaOH水溶液混合后，转 移至反应蓋中，120±5°C下水热反应48 h，弃去上清液，所得白色粗制品洗涂后，在60°C条 件下干燥2 h，备用，记为TNTs; 聚苯胺-Ti〇2纳米管复合材料的合成:将0.2660 g TNTs、8.57 mL 0.1 Μ苯胺盐酸液、 W及10 mL 0.1 Μ的盐酸混合，0-5°C冰浴下磁力揽拌30 minW获得均匀的分散液;然后 在2 h内加入8.57 mUO.l Μ的过硫酸锭盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3 h，室溫静置 过夜，固液分离，所得沉淀物用去离子水洗涂至pH为7,60°C下干燥3 h后研磨成粉末，备 用，记为 PANI-TNT; 金纳米颗粒-聚苯胺-Ti〇2纳米管复合材料的制备：取18 mg PANI-TNT和18 mL超纯 水，混匀，在揽拌条件下加入1 mUO.Ol Μ的HAuCU溶液和1 mL、0.01 Μ的封端剂巧樣酸 Ξ钢溶液，然后在20 min内加入1血新制的0.1 Μ的NaBH4溶液，室溫下继续揽拌0.5 h后 静置过夜，离屯、分离，沉淀物洗涂后，60°C下干燥过夜，备用，记为GNPs-PANI-TNT; ② 标记信号抗体Ab2的制备： 氨基化Ti化纳米管的制备:将100 mg TNTs与20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3-氨丙 基Ξ乙氧基硅烷(APTES)混合后，机械揽拌过夜W防止TNTs沉淀，离屯、分离，弃去上清液，所 得固体残留物洗涂、干燥后，室溫下储存备用，记为NH2-TNT; 辣根过氧化物酶I氨基化Ti化纳米管I信号抗体生物共辆体的制备:将2 mg BS3溶解在 0.5 mL、0.02 Μ的PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3 mg N出-TNT分散于溶液A中，揽拌下加 入350化2 mg·血-1的辣根过氧化物酶(皿P)水溶液并在室溫下解育30 min,然后加入20 化含0.6 mg·血-1信号抗体Ab2的PBS缓冲液(0.02 M)，4°C下揽拌4 h，离屯、分离，所得沉淀 物用PBS缓冲液洗涂并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室溫下封闭30 min,最后用PBS缓 冲液洗涂后，分散于含0.1%牛血清蛋白的1.0 mL PBS缓冲液中，备用，记为皿PIN此-TNTI Ab2； ③免疫传感器的构建： 首先，将5 mg步骤①所得GNPs-PANI-TNT分散于1 mL含0.2%壳聚糖的HAc溶液中，超 声20 minW得到均匀的分散液，取5化分散液滴加在预处理好的玻碳电极表面，室溫下自 然惊干;然后在玻碳电极表面滴加10化含2 mg·血-iBS3的PBS缓冲液(0.02 M)并在室溫 下解育1 h，随后滴加10化1 mg· m[i的蛋白护，室溫下解育60 min,浸入PBS缓冲液中洗 涂3 min,然后将该玻碳电极用5化封闭缓冲液解育30 min,再分别用洗涂缓冲液(PBST)和 PBS缓冲液洗涂3 min,最后将5化0.44 mg· ml/i的捕获抗体Abl滴加在该玻碳电极表面， 室溫下解育1 h，再在4°C、100%湿度饱和环境下解育过夜后，分别用洗涂缓冲液和PBS缓冲 液洗涂，即得电化学免疫传感器。
[0010] 具体的，步骤②中，所述洗涂缓冲液(PBST)为:含0.05 %(w/v)Tween 20的PBS缓冲 液(0.05 M, pH 7.4); 步骤③中，所述封闭缓冲液为:含5 %(w/v)牛血清蛋白（BSA)的PBS缓冲液(0.05 M，pH 7.4)。
[0011] 和现有技术相比，本发明方法发明的有益效果： 在电极表面引入GNPs-PANI-TNT复合材料，增加了该免疫传感器的导电性和生物相容 性。通过滴加 Protein 能定向负载Abl，提高Abl的结合效率。同时，与Protein A相比， Protein护有更广泛的适用性和更高的定向捕捉抗体能力。利用Ti化纳米管比表面积大、 生物相容性好的优点，借助BS3将酶和抗体固定在氨基化Ti化纳米管表面用作免疫示踪标记 物，可提高酶和抗体的负载量，从而提高该传感器的灵敏度和检测限。
【附图说明】
[001引图1为不同材料的测试图谱，其中，A为TNTs的SM图，B为TNTs的??Μ图，C为PANI-TNT的SEM图，D和E分别为GNPs-PANI-TNT复合材料、及其局部放大的沈Μ图，F为GNPs-PANI-TNT复合材料的邸X图； 图2为不同材料的XRD图谱，其中，a为TNTs，，b为PANI，C为GNPs-PANI-TNT; 图3为不同材料的FT-IR图谱，其中，a为TNTs，b为畑2-TNT，c为PANI，d为GNPs-PANI- TNT； 图4为奈奎斯特图，其中，a为裸GCE，b为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖，C为GNPs-PANI-TNT I壳 聚糖I蛋白G/，d为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖I蛋白护| BSA，e为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖I蛋白 G'l BSAI Abl，f 为GNPs-PANI-TNT I 壳聚糖 I 蛋白 G'l BSAI Abl IAFPI Ab2 修饰的 GCE; 图5为测试溶液的pH值对本发明免疫传感器电流响应的影响； 图6为培育时间对本发明免疫传感器电流响应的影响； 图7为还原峰电流随AFP浓度增加的变化曲线； 图8 为本发明免疫传感器对不同组成的测试溶液的特异性，其中，A:5 ngml/i AFP;B:5 η卵L_i AFP + 100 η卵L_i CEA;C:5ng血-1 AFP + 100 ng血-1 PSA;D:5 η卵L_i AFP + 100 n卵L_i CA125;E:5 ngmL-i AFP + 100 ngmL-i IgG;F:5 n卵L_i AFP + 100 ngmL-i BSA。
【具体实施方式】
[0013] W下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围 并不局限于此。
[0014] 下述实施例中，所用到的BS3、蛋白G/均购自西格玛奥德里奇有限公司，捕获抗体 Abl、信号抗体Ab2均购自成都双流正龙生化制品研究室。
[001引实施例1 一种WTi化纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构 建方法，其包括如下步骤： ① GNPs-PANI-TNT复合材料的制备： Ti化纳米管的制备:将0.6 g Ti化纳米颗粒和120 mL、10 Μ的NaOH水溶液混合后，转 移至W聚四氣乙締为内衬的高压反应蓋中，120°C下水热反应48 h，弃去上清液，所得白色 粗制品用0.1 Μ HC1洗涂Ξ次，然后用去离子水洗至pH为7,所得产品再用超纯水洗涂Ξ 次，离屯、分离，在60°C条件下干燥2 h，备用，记为TNTs; 聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的合成:将0.2660 g TNTs、含8.57 mL苯胺的0.1 Μ盐 酸、W及10 mL 0.1 Μ的盐酸混合，0-5°C冰浴下磁力揽拌30 minW获得均匀的分散液;然 后在2 h内逐滴加入8.57 mUO.l Μ的过硫酸锭盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3 h，室 溫静置过夜，固液分离，所得深绿色沉淀物用去离子水洗涂至抑为7，在真空干燥箱中60°C 下干燥3 h后研磨成粉末，备用，记为PANI-TNT; 金纳米颗粒-聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的制备：取18 mg PANI-TNT和18 mL超纯 水，混匀，在揽拌条件下加入1 mUO.Ol Μ的HAuCU溶液和1 mL、0.01 Μ的封端剂巧樣酸 Ξ钢溶液，然后在20 min内逐滴加入1 mL新制的0.1 Μ的化肌4溶液(0-4°C)，室溫下继 续揽拌0.5 h后静置过夜，离屯、分离，沉淀物用超纯水和乙醇洗涂后，在真空干燥箱中60°C 下干燥过夜，备用，记为GNPs-PANI-TNT; ② 标记信号抗体Ab2的制备： 氨基化Ti化纳米管的制备:将100 mg TNTs与20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3-氨丙 基Ξ乙氧基硅烷(APTES)混合后，机械揽拌过夜W防止TNTs沉淀，离屯、分离，弃去上清液，所 得固体残留物用超纯水洗涂Ξ次、在60°C条件下干燥后，室溫下储存备用，记为NH2-TNT; 辣根过氧化物酶I氨基化Ti化纳米管I信号抗体生物共辆体的制备:将2 mg BS3溶解在 0.5血、0.02 Μ的PBS缓冲液(pH 7.4)中获得溶液A，然后将3 mg N出-TNT分散于溶液A中， 揽拌下加入350化2 mg· mL-i的HRP水溶液并在室溫下培育30 min,然后加入20化含0.6 mg · ml/i信号抗体Ab2的PBS缓冲液(0.02 M)，4°C下缓慢揽拌4 h，离屯、分离，所得沉淀物用 PBS缓冲液洗涂并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室溫下封闭30 min,最后用PBS缓冲液 洗涂后，分散于含0.1%牛血清蛋白的1.0 mL PBS缓冲液中，备用，记为HRPiN出-TNT|Ab2; ③ 免疫传感器的构建： 首先，将5 mg步骤①所得GNPs-PANI-TNT与1 mL含0.2%壳聚糖的0.2 Μ HAc溶液混 合，超声20 minW得到均匀的分散液，然后取5化分散液滴加在预处理好的玻碳电极(GCE) 表面，室溫下自然惊干;然后在玻碳电极表面滴加10化2 mg· m[iBS3的PBS缓冲液(0.02 M)并在室溫下解育1 h，随后立即滴加10化1 mg· mL-i的蛋白护，室溫下解育60 min,浸 入PBS缓冲液中洗涂3 min,然后将该玻碳电极用5化封闭缓冲液解育30 minW封闭可能残 留的非特异性活性位点，再分别用洗涂缓冲液和PBS缓冲液洗涂3 min,最后将5 μL 0.44 mg · ml/i的捕获抗体Abl滴加在该玻碳电极表面，室溫下解育1 h，再在4°C、100%湿度饱和 环境下解育过夜后，分别用洗涂缓冲液和PBS缓冲液洗涂W除去物理吸附的捕获抗体Abl， 即得电化学免疫传感器。在4°C下储存备用。
[0016] 具体的，步骤②中，所述洗涂缓冲液(PBST)为:含0.05 %(w/v)Tween 20的PBS缓冲 液(0.05 M, pH 7.4); 步骤③中，所述封闭缓冲液为:含5 %(w/v)牛血清蛋白（BSA)的PBS缓冲液(0.05 M，pH 7.4)。
[0017] ④现聯过程： 为进行免疫反应和电化学测试，上述制备所得的电化学免疫传感器先用5化不同浓度 的AFP稀释液或血清样品在室溫下解育50 min,然后分别用洗涂缓冲液(PBST)和PBS缓冲液 洗涂1.5 min。再用5化步骤②所得产物皿P In此-TNT|Ab2在室溫下解育50 min,并分别用 洗涂缓冲液(PBST)和PBS缓冲液洗涂3 min。随后，将该电化学免疫传感器、参比电极、对电 极置于含10 mL PBS缓冲液的电化学电池中，接着将氨酿(最终浓度2 ml)和过氧化氨(最终 浓度1 mM)注入此电池中，在脉冲振幅50 mV、脉冲宽度50 ms、0.2~-0.2 V范围内进行差 分脉冲伏安(DPV)扫描，W定量测定AFP。
[0018] 复合材料的表征： 为表征TNTs、PANI-TNT、GNPs-PANI -TNT复合材料的形貌W及Ξ元复合材料的组成，图1 展示了它们的SEM图及TNTs的TEM图。从图1的A中可看出，所制备的TNTs均匀分散，具有清 晰的细长的管状形态，其长度约几百纳米，直径小于15 nm。而且，其中没有发现明显的P25 颗粒，运表明Ti化纳米颗粒经水热反应后完全转化为Ti化纳米管。图1的B中还展示了 TNTs的 TEM图来表征其形态，从图中可看出TNTs具有细长的管状形态，其比表面积大，非常适合用 于负载生物分子作为电化学免疫传感器的标记物。在图1的C中可清晰看出当苯胺氧化聚合 在TNTs上后，每几根TNTs随机捆绑在一起，运主要是由于PANI覆盖在TNTs上造成的。图1中 的巧良好地证明了经化学氧化聚合后，PANI-TNT复合材料成功合成。当GNPs通过化学还原法 沉积在PANI-TNT复合材料上后，GNPs-PANI-TNT复合材料的结构和形貌展示在图1的D和E 中，从图中可清楚看到PANI-TNT纳米复合材料表面均匀分散的球状颗粒，且无任何聚合现 象，颗粒平均直径约13 nm，运证明了GNPs被成功负载在PANI-TNT纳米材料上。
[0019] 为探究GNPs-PANI-TNT纳米复合材料的元素组成，本发明还进行了邸X分析(如图1 中的F所示）。图中的Ti峰和0峰来自TNTs，C峰来自PANI。然而，从图中没有观察至化ANI的另 一个特征峰一N峰，运是由于它与Ti元素的其中一个峰重叠在一起。此外，在-2.10 keV处还 观察到一个高强度的GNP峰。运些邸X图谱的结果进一步证明了PANI-TNT复合材料的成功合 成W及GNPs被成功负载于PANI表面，运与SEM表征结果一致。
[0020] 图2展示了TNTs(曲线a)、PANI (曲线b)和GNPs-PANI-TNT(曲线C)的典型XRD图谱。 曲线a中3移在9.0° ,24.4° ,28.1°, 48.5°和62.6°处出现的五个特征衍射峰分别对应正交 晶型TNTs的（200)，（ 110)，（600)，（020)和(002)晶面。PANI在雜为25.3°处有一个结晶峰，在 完@为14.7°和20.5°处有两个无定形特征峰（曲线6)。25.3°处结晶峰的强度明显比两个无定 形峰强，运表明苯胺绿盐(ES-PANI)具有局部结晶的结构。局部结晶源自于ES-PANI内π巧 的跨链堆积，因而ES-PANI拥有良好的电荷转移和导电性。GNPs-PANI-TNT(曲线c)除了含有 TNTs特征峰W及ES-PANI在:雜为16.3°和20.1°处的两个小峰外，还在'泌为38.5°，44.5° 和64.7°处展示了几个金的特征峰，它们分别对应金纳米颗粒的（110)，（200)和(220)晶 面衍射。曲线C表明GNPs被成功沉积于PANI-TNT表面W及Ξ元复合材料的成功形成。值得注 意的是，源自于TNT和ES-PANI的2得峰位置有微小的偏移，运可能是由于PANI和TNT之间强烈 的相互作用而引起的晶型改变。
[0021 ]图 3为TNT(曲线a)、畑2-TNT(曲线b)、PANI (曲线C)和 GNPs-PANI-TNT(曲线d)的FT-IR图谱，它提供了纳米材料的结构信息，证明了复合材料的形成。TNTs在3000-3700 cnfi的 一个宽度吸收峰和1631 cnfi的一个尖峰，均归因于表面的氨氧基振动。另外，400-700 cm ^的另一个特征吸收峰归属于纳米材料的Ti-0伸缩振动和Ti-0-Ti桥梁振动（曲线a)。如曲 线b所示，伯胺基(-N也)在3400-3500 cnfi处的对称和不对称伸缩振动峰与TNTs上的0-H伸 缩吸收带重叠在一起。1625 cnfi和1508 cnfi处的峰属于N-H弯曲振动峰，且曲线b中1625 cnfi处的峰明显比曲线a中1631 cnfi处吸附水分子的吸收峰强，运些表明TNTs的成功氨基 化。在曲线C中，1299 cnfi，1125 cnfi和797 cnfi处的吸收峰分别来自于仲芳香胺，N=Q=N(Q 代表酿环）伸缩W及芳香族的C-H面外弯曲振动。在1563 cnfi和1474 cnfi处的峰分别属于 酿环和苯环的C=C伸缩振动。运些红外特征吸收峰表明苯胺成功转化为聚苯胺。更重要的 是，1 242 cnfi处的峰属于C-N+'伸缩振动峰，运再次证明了ES-PANI的存在。GNPs-PANI-TNT 展示了PANI的特征吸收峰口00-1600 cnfi)W及Ti-0-Ti和Ti-0的振动吸收带(400-700 cm -1)(曲线d)。正如预期的那样，GNPs没有产生明显的FT-IR吸收峰。然而，Ξ元复合材料的形 成导致了PANI特征吸收峰位置的偏移，其中1563，1474，1299和1125 cnfi (曲线b)的 吸收峰分别移动至1580，1497，1309和1147 cnfi(曲线C)。运些位移是由PANI和TNTs之 间强烈的相互作用引起的。
[0022] 电化学阻抗(EIS)法监测免疫传感器的组装过程： 电化学阻抗图谱(EIS)是用来评估动力学过程和修饰电极界面性能的有效工具。因此， 电化学阻抗被用来探测本发明实施例1所制备得到的用W检测AFP的电化学免疫传感器的 组装过程。
[0023] 阻抗实验在含0.1 Μ电解质KC1的5 mM K3[Fe(CN)6] |K4[Fe(CN)6]中进行，并在 0.209 V的直流电压上叠加5 mV的交流电压。在100 K化~100 mHz频率范围内记录奈奎斯 特图，如图4所示。图4中的所有奈奎斯特图在高频区呈现一个半圆，它对应电子转移电阻 (Ret);在低频区包含一个直线部分，它对应扩散控制过程。半圆直径与修饰电极表面的铁氯 化钟电子传递系数成反比。纳米材料和生物分子的附着形成了一个电子和传质阻挡层，它 阻碍铁氯化钟向电极表面的扩散，因而减小了电子传递系数。如预料那样，裸GCE电极（曲线 a)有一个很小的半圆，它代表表面电阻很小，对应扩散控制过程。在曲线b-f中，裸GCE电极 依次被修饰上GNPs-PANI-TNTi壳聚糖分散体系、蛋白护、BSA、捕获抗体Abl和信号抗体Ab2， 从图中可W看出，伴随着逐步修饰过程，半圆直径逐渐增加，表明各种材料被层层组装于电 极表面。
[0024] 电化学免疫传感器检测条件的优化： 测试溶液的pH值是影响酶传感器性能的一个重要因素，因为强酸和强碱环境均会破坏 生物分子的活性。溶液抑对免疫传感器电流响应的影响如图5所示。电流响应值在抑4.0- 7. ο范围内随着pH值的增加而快速增加，当pH超过7. ο后，开始减小。因此，含ο. 10 Μ的ο. 05 Μ pH 7.0 PBS缓冲液被选作检测液用于检测AFP。
[002引 AFP在GNPs-PANI-TNT惊聚糖愼白GMBSAlAbl上的培育时间是影响免疫传感器 分析性能的另一个重要因素。在室溫下，AFP免疫传感器的电流响应值随AFP培育时间的增 加而显著增加，超过50 min后基本达到一个恒定值(如图6所示），运表明AFP与电极表面的 捕获抗体Abl的结合达到饱和。因此，将50 min选作此夹屯、型免疫分析的培育时间。
[0026] 分析性能评估： HRP由于其稳定性、高催化性W及超高灵敏度，成为电化学免疫分析中广泛研究的示踪 酶。在运里，本发明通过双氨基化试剂BS3将HRP和捕获抗体负载于Ti化纳米管表面形成了免 疫分析的示踪标记物。实验前，检测液用高纯氮气除氧15 min,在检测过程中保持氮气环 境。在出化的帮助下，HRP催化氨酿转化为苯酿，随后苯酿被电化学还原为氨酿来提供检测信 号，如下两反应式所示：
[0027] 在最优条件下，差分脉冲伏安(DPV)被用来评估免疫传感器的分析性能。如图7所 示，还原峰电流随AFP浓度的增加而增加，校准曲线（图7中的插图）显示峰电流与分析物浓 度的对数之间有良好的线性关系，线性范围为0.01 ng/mL至350 ng/mL，相关系数为 0.994(n=4).在信噪比为3的条件下，AFP的检测限低至1.5 pg/mL，运不仅低于之前报道的 多种免疫分析方法，还低于那些具有放大策略的免疫传感器。
[0028] 免疫传感器的重现性、特异性、稳定性和在血清样品中的应用 本发明进一步研究了实施例1制备所得夹屯、型电化学免疫传感器的特异性、重现性和 稳定性。为评估该免疫传感器的特异性，本发明引入了几种可能的干扰物，包括癌胚抗原 (CEA)，前列腺癌蛋白抗原(PSA)，肿瘤抗原125(CA125)，免疫球蛋白G(IgG)和牛血清蛋白 (BSA)。此免疫传感器分别用含有上述其中一种干扰物（100 ng · mL-i)的5 ng · mL-i AFP解 育。如图8所示，与没有干扰物相比，由干扰物引起的电流变化小于5%，运表明此免疫传感器 具有良好的选择性。
[0029] 为了探究此免疫传感器的准确度和重现性，本发明用相同样品分别制备五根电极 在相同条件下进行研究测试，所得相对标准偏差(RSD)为5.2%。表明此免疫传感器准确度 和重现性良好。
[0030] 此外，此免疫传感器的稳定性也通过测量它们在4°C条件下储存3周前后的电流响 应进行了评估。结果表明，3周后92.1%的电流响应得W保留，运表明此免疫传感器具有良好 的稳定性。
[0031] 该免疫传感器对实际血清样品分析的适用性通过标准加入法进行了评估。实验结 果显示在表1中。回收率/检测率为96.4% - 106.0%，运表明本发明的电化学免疫传感器可 被用于日常临床诊断中人体血清中AFP的检测。
[0032] 表1用本发明免疫传感器检测加入人体血清中的AFP(n=3)
【主权项】
1. 一种以Ti〇2纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构 建方法，其特征在于，包括如下步骤： ①GNPs-PANI-TNT复合材料的制备： Ti02纳米管的制备:将0.6gTi02纳米颗粒和120mL、10Μ的NaOH水溶液混合后，转 移至反应釜中，120±5°C下水热反应48h，弃去上清液，所得白色粗制品洗涤后，在60°C条 件下干燥2h，备用，记为TNTs; 聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的合成:将0.2660gTNTs、8.57mL0.1Μ苯胺盐酸液、以及10mL0.1Μ的盐酸混合，0-5°C冰浴下磁力搅拌30min以获得均匀的分散液;然后在2 h内加入8.57mL、0.1Μ的过硫酸铵盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3h，室温静置过 夜，固液分离，所得沉淀物用去离子水洗涤至pH为7,60°C下干燥3h后研磨成粉末，备用， 记为PANI-TNT; 金纳米颗粒-聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的制备:取18mgPANI-TNT和18mL超纯水， 混匀，在搅拌条件下加入1mL、0.01Μ的HAuCl4溶液和1mL、0.01Μ的封端剂柠檬酸三 钠溶液，然后在20min内加入1mL新制的0.1Μ的NaBH4溶液，室温下继续搅拌0.5h后静 置过夜，离心分离，沉淀物洗涤后，60°C下干燥过夜，备用，记为GNPs-PANI-TNT; ② 标记信号抗体Ab2的制备： 氨基化Ti〇2纳米管的制备:将100mgTNTs与20mL乙醇、1mL28%氨水和4mL3-氨丙 基三乙氧基硅烷混合后，机械搅拌过夜以防止TNTs沉淀，离心分离，弃去上清液，所得固体 残留物洗涤、干燥后，室温下储存备用，记为NH2-TNT; 辣根过氧化物酶I氨基化Ti02纳米管|信号抗体生物共辄体的制备:将2mgBS3溶解在 0.5mL、0.02Μ的PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3mgNH2-TNT分散于溶液A中，搅拌下加 入350yL2mg·ml/1的辣根过氧化物酶水溶液并在室温下孵育30min，然后加入20yL含 0.6mg11/1信号抗体Ab2的PBS缓冲液，4°C下搅拌4h，离心分离，所得沉淀物用PBS缓冲液 洗涤并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室温下封闭30min，最后用PBS缓冲液洗涤后，分 散于含0.1%牛血清蛋白的1.0mLPBS缓冲液中，备用，记为HRP|NH2-TNT|Ab2; ③ 免疫传感器的构建： 首先，将5mg步骤①所得GNPs-PANI-TNT分散于1mL含0.2%壳聚糖的HAc溶液中，超 声20min以得到均匀的分散液，取5yL分散液滴加在预处理好的玻碳电极表面，室温下自 然晾干;然后在玻碳电极表面滴加10yL含2mg·ml/1BS3的PBS缓冲液并在室温下孵育1 h，随后滴加10yL1mg.mL-1的蛋白G、室温下孵育60min，浸入PBS缓冲液中洗涤3min， 然后将该玻碳电极用5yL封闭缓冲液孵育30min，再分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤3 min，最后将5yL0.44mg.1111/1的捕获抗体Abl滴加在该玻碳电极表面，室温下孵育1h， 再在4°C、100%湿度饱和环境下孵育过夜后，分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤，即得电化 学免疫传感器。2.如权利要求1所述以Ti02纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免 疫传感器的构建方法，其特征在于，步骤②中，所述洗涤缓冲液为：含0.05 %Tween20的 PBS缓冲液； 步骤③中，所述封闭缓冲液为:含5 %牛血清蛋白的PBS缓冲液。
【专利摘要】本发明涉及一种以TiO2纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，其分别通过水热法、化学氧化聚合法以及柠檬酸三钠还原法最终合成出GNPs-PANI-TNT复合材料，将其分散于壳聚糖溶液中并滴加在电极表面。以BS3为双氨基交联剂将蛋白G′共价结合在壳聚糖表面，用于定向负载捕获抗体(Ab1)。BS3还被用于结合辣根过氧化物酶（HRP）和信号抗体（Ab2）以制备示踪标记物。采用本发明方法制备所得的电化学免疫传感器能够快速的测定α-甲胎蛋白AFP，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。
【IPC分类】G01N33/58, G01N33/543, G01N27/327, G01N33/68
【公开号】CN105486873
【申请号】CN201510893519
【发明人】刘小强, 霍小鹤, 刘培培, 朱杰
【申请人】河南大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月8日
【技术领域】
[0001] 本发明属于电化学免疫传感器构建技术领域，具体设及一种WTi化纳米管复合材 料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，该电化学免疫传感器可 用于检测α-甲胎蛋白。
【背景技术】
[0002] 准确、灵敏地检测与疾病相关的蛋白质对许多现代研究领域，包括生物化学、生物 医学W及临床诊断都至关重要。尤其是临床检测与肿瘤及传染病相关的蛋白质对疾病的早 期检测和可靠性预测至关重要。甲胎蛋白（曰-fetoprotein,AFP)是胚胎发育早期的一种主 要血清蛋白，在健康的成人体内，其值通常低于25 ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高对原发性 肝癌诊断具有重要的意义。许多免疫分析法，包括巧光免疫分析、电化学酶免疫分析、化学 发光免疫分析、酶联免疫吸附法等均被广泛用于检测肿瘤标记物。在众多免疫分析法中，电 化学免疫分析法是最快速、有效和灵敏的分析方法。
[0003] 随着纳米科学与技术的飞速发展，各种各样的纳米材料，包括碳纳米材料、石墨締 纳米材料、量子点、贵金属等被广泛应用于免疫传感器中用来提高其分析性能。例如，Juan Tang等人用碳纳米颗粒修饰的仿生界面作免疫传感器探头，用不规则形状的金纳米颗粒 标记的HRP-anti-AFP作为示踪标记物，用来检测AFP，其线性范围为0.02 -4.0 ng/mL，检测 限为10 pg/mUGanesh K. Parshetti等人用金纳米/壳聚糖修饰玻碳电极，用哑铃形Au-Fe3化异质结构标记信号抗体Ab2，用来检测AFP，其线性范围为0.01-40ng/mL，检测限为 2.3 pg/mL。然而运些免疫传感器均存在线性范围较窄，检测限较高，稳定性较低等问题，因 此需要运用新技术、方法和材料来制备具有更好性能的免疫传感器。
[0004] 在众多纳米材料中，Ti〇2纳米管由于其比表面积大、机械稳定性好、合成方法简 便、环境友好性、无毒、管状结构W及优异的生物相容性等内在优点吸引了广泛的关注。然 而，由于Ti化纳米材料的表面惰性，很难将抗体、抗原直接负载于其表面。为克服运些缺点， 交联法、共价结合法W及包埋法等被用来在Ti化纳米材料上固定生物分子。更重要的是， Ti化纳米管从未在免疫分析中用作示踪标记物。
[000引BS3是一种双氨基交联剂，具有水溶性、非裂解性、膜不渗透性等特点，它含有一个 末端氨基反应基团（Sulfo-NHS醋基），可与任何含有伯胺基团的分子反应。因此，其广泛应 用于生物分子的交联。
[0006]蛋白A和蛋白G均可被用于定向负载抗体。Qiang Zhu等人用化fion修饰工作电极， 将Protein A吸附于电极表面用于负载捕获抗体Abl，用负载大量金纳米颗粒和簇基官能团 的石墨締片作为标记物来负载二抗@氧化还原探针，用于多路复用检测AFP、CEA和猪链球菌 2(SS2)。其中AFP的线性范围为0.016-50 ng/mL，检测限为5.4 pg/mLJeremy M. Fowler 等人也进行了一系列报道研究，他们用琉基化蛋白G为支架在免疫传感器表面定向负载更 高量的捕获抗体Abl，用于免疫分析测试。然而，由于蛋白G还能与IgG的Fab片段相结合，运 可能会破坏抗体的定向负载，从而导致干扰。运些缺点可W通过基因截断蛋白G而产生的蛋 白G/而得W解决，蛋白G/对IgG仍有亲和力，但是它缺少了白蛋白、Fab片段W及膜结合位 点。由于蛋白护只能结合IgG的Fc片段，因此它可W更有效地用于定向捕获抗体Abl，并使它 们的抗原结合位点暴露在外部来结合目标抗原。
[0007] 本发明分别通过水热法、化学氧化聚合法W及巧樣酸Ξ钢还原法最终合成出 GNPs-PANI-TNT复合材料，将其分散于壳聚糖溶液中并滴加在电极表面。WBS3为氨基交联 剂将蛋白G/共价结合在壳聚糖表面，用于定向负载捕获抗体AbUBS 3还被用于结合HRP和信 号抗体W制备示踪标记物。本发明克服了现有报道中出现的线性范围较窄，检测限较高W 及稳定性较差等缺点，目前还未见有相关报道。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种WTi化纳米管复合材料为定向负载 支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，该电化学免疫传感器能够快速地测定 甲胎蛋白，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种WTi化纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构 建方法，其包括如下步骤： ① GNPs-PANI-TNT复合材料的制备： Ti化纳米管的制备:将0.6 g Ti化纳米颗粒和120 mL、10 Μ的NaOH水溶液混合后，转 移至反应蓋中，120±5°C下水热反应48 h，弃去上清液，所得白色粗制品洗涂后，在60°C条 件下干燥2 h，备用，记为TNTs; 聚苯胺-Ti〇2纳米管复合材料的合成:将0.2660 g TNTs、8.57 mL 0.1 Μ苯胺盐酸液、 W及10 mL 0.1 Μ的盐酸混合，0-5°C冰浴下磁力揽拌30 minW获得均匀的分散液;然后 在2 h内加入8.57 mUO.l Μ的过硫酸锭盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3 h，室溫静置 过夜，固液分离，所得沉淀物用去离子水洗涂至pH为7,60°C下干燥3 h后研磨成粉末，备 用，记为 PANI-TNT; 金纳米颗粒-聚苯胺-Ti〇2纳米管复合材料的制备：取18 mg PANI-TNT和18 mL超纯 水，混匀，在揽拌条件下加入1 mUO.Ol Μ的HAuCU溶液和1 mL、0.01 Μ的封端剂巧樣酸 Ξ钢溶液，然后在20 min内加入1血新制的0.1 Μ的NaBH4溶液，室溫下继续揽拌0.5 h后 静置过夜，离屯、分离，沉淀物洗涂后，60°C下干燥过夜，备用，记为GNPs-PANI-TNT; ② 标记信号抗体Ab2的制备： 氨基化Ti化纳米管的制备:将100 mg TNTs与20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3-氨丙 基Ξ乙氧基硅烷(APTES)混合后，机械揽拌过夜W防止TNTs沉淀，离屯、分离，弃去上清液，所 得固体残留物洗涂、干燥后，室溫下储存备用，记为NH2-TNT; 辣根过氧化物酶I氨基化Ti化纳米管I信号抗体生物共辆体的制备:将2 mg BS3溶解在 0.5 mL、0.02 Μ的PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3 mg N出-TNT分散于溶液A中，揽拌下加 入350化2 mg·血-1的辣根过氧化物酶(皿P)水溶液并在室溫下解育30 min,然后加入20 化含0.6 mg·血-1信号抗体Ab2的PBS缓冲液(0.02 M)，4°C下揽拌4 h，离屯、分离，所得沉淀 物用PBS缓冲液洗涂并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室溫下封闭30 min,最后用PBS缓 冲液洗涂后，分散于含0.1%牛血清蛋白的1.0 mL PBS缓冲液中，备用，记为皿PIN此-TNTI Ab2； ③免疫传感器的构建： 首先，将5 mg步骤①所得GNPs-PANI-TNT分散于1 mL含0.2%壳聚糖的HAc溶液中，超 声20 minW得到均匀的分散液，取5化分散液滴加在预处理好的玻碳电极表面，室溫下自 然惊干;然后在玻碳电极表面滴加10化含2 mg·血-iBS3的PBS缓冲液(0.02 M)并在室溫 下解育1 h，随后滴加10化1 mg· m[i的蛋白护，室溫下解育60 min,浸入PBS缓冲液中洗 涂3 min,然后将该玻碳电极用5化封闭缓冲液解育30 min,再分别用洗涂缓冲液(PBST)和 PBS缓冲液洗涂3 min,最后将5化0.44 mg· ml/i的捕获抗体Abl滴加在该玻碳电极表面， 室溫下解育1 h，再在4°C、100%湿度饱和环境下解育过夜后，分别用洗涂缓冲液和PBS缓冲 液洗涂，即得电化学免疫传感器。
[0010] 具体的，步骤②中，所述洗涂缓冲液(PBST)为:含0.05 %(w/v)Tween 20的PBS缓冲 液(0.05 M, pH 7.4); 步骤③中，所述封闭缓冲液为:含5 %(w/v)牛血清蛋白（BSA)的PBS缓冲液(0.05 M，pH 7.4)。
[0011] 和现有技术相比，本发明方法发明的有益效果： 在电极表面引入GNPs-PANI-TNT复合材料，增加了该免疫传感器的导电性和生物相容 性。通过滴加 Protein 能定向负载Abl，提高Abl的结合效率。同时，与Protein A相比， Protein护有更广泛的适用性和更高的定向捕捉抗体能力。利用Ti化纳米管比表面积大、 生物相容性好的优点，借助BS3将酶和抗体固定在氨基化Ti化纳米管表面用作免疫示踪标记 物，可提高酶和抗体的负载量，从而提高该传感器的灵敏度和检测限。
【附图说明】
[001引图1为不同材料的测试图谱，其中，A为TNTs的SM图，B为TNTs的??Μ图，C为PANI-TNT的SEM图，D和E分别为GNPs-PANI-TNT复合材料、及其局部放大的沈Μ图，F为GNPs-PANI-TNT复合材料的邸X图； 图2为不同材料的XRD图谱，其中，a为TNTs，，b为PANI，C为GNPs-PANI-TNT; 图3为不同材料的FT-IR图谱，其中，a为TNTs，b为畑2-TNT，c为PANI，d为GNPs-PANI- TNT； 图4为奈奎斯特图，其中，a为裸GCE，b为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖，C为GNPs-PANI-TNT I壳 聚糖I蛋白G/，d为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖I蛋白护| BSA，e为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖I蛋白 G'l BSAI Abl，f 为GNPs-PANI-TNT I 壳聚糖 I 蛋白 G'l BSAI Abl IAFPI Ab2 修饰的 GCE; 图5为测试溶液的pH值对本发明免疫传感器电流响应的影响； 图6为培育时间对本发明免疫传感器电流响应的影响； 图7为还原峰电流随AFP浓度增加的变化曲线； 图8 为本发明免疫传感器对不同组成的测试溶液的特异性，其中，A:5 ngml/i AFP;B:5 η卵L_i AFP + 100 η卵L_i CEA;C:5ng血-1 AFP + 100 ng血-1 PSA;D:5 η卵L_i AFP + 100 n卵L_i CA125;E:5 ngmL-i AFP + 100 ngmL-i IgG;F:5 n卵L_i AFP + 100 ngmL-i BSA。
【具体实施方式】
[0013] W下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围 并不局限于此。
[0014] 下述实施例中，所用到的BS3、蛋白G/均购自西格玛奥德里奇有限公司，捕获抗体 Abl、信号抗体Ab2均购自成都双流正龙生化制品研究室。
[001引实施例1 一种WTi化纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构 建方法，其包括如下步骤： ① GNPs-PANI-TNT复合材料的制备： Ti化纳米管的制备:将0.6 g Ti化纳米颗粒和120 mL、10 Μ的NaOH水溶液混合后，转 移至W聚四氣乙締为内衬的高压反应蓋中，120°C下水热反应48 h，弃去上清液，所得白色 粗制品用0.1 Μ HC1洗涂Ξ次，然后用去离子水洗至pH为7,所得产品再用超纯水洗涂Ξ 次，离屯、分离，在60°C条件下干燥2 h，备用，记为TNTs; 聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的合成:将0.2660 g TNTs、含8.57 mL苯胺的0.1 Μ盐 酸、W及10 mL 0.1 Μ的盐酸混合，0-5°C冰浴下磁力揽拌30 minW获得均匀的分散液;然 后在2 h内逐滴加入8.57 mUO.l Μ的过硫酸锭盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3 h，室 溫静置过夜，固液分离，所得深绿色沉淀物用去离子水洗涂至抑为7，在真空干燥箱中60°C 下干燥3 h后研磨成粉末，备用，记为PANI-TNT; 金纳米颗粒-聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的制备：取18 mg PANI-TNT和18 mL超纯 水，混匀，在揽拌条件下加入1 mUO.Ol Μ的HAuCU溶液和1 mL、0.01 Μ的封端剂巧樣酸 Ξ钢溶液，然后在20 min内逐滴加入1 mL新制的0.1 Μ的化肌4溶液(0-4°C)，室溫下继 续揽拌0.5 h后静置过夜，离屯、分离，沉淀物用超纯水和乙醇洗涂后，在真空干燥箱中60°C 下干燥过夜，备用，记为GNPs-PANI-TNT; ② 标记信号抗体Ab2的制备： 氨基化Ti化纳米管的制备:将100 mg TNTs与20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3-氨丙 基Ξ乙氧基硅烷(APTES)混合后，机械揽拌过夜W防止TNTs沉淀，离屯、分离，弃去上清液，所 得固体残留物用超纯水洗涂Ξ次、在60°C条件下干燥后，室溫下储存备用，记为NH2-TNT; 辣根过氧化物酶I氨基化Ti化纳米管I信号抗体生物共辆体的制备:将2 mg BS3溶解在 0.5血、0.02 Μ的PBS缓冲液(pH 7.4)中获得溶液A，然后将3 mg N出-TNT分散于溶液A中， 揽拌下加入350化2 mg· mL-i的HRP水溶液并在室溫下培育30 min,然后加入20化含0.6 mg · ml/i信号抗体Ab2的PBS缓冲液(0.02 M)，4°C下缓慢揽拌4 h，离屯、分离，所得沉淀物用 PBS缓冲液洗涂并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室溫下封闭30 min,最后用PBS缓冲液 洗涂后，分散于含0.1%牛血清蛋白的1.0 mL PBS缓冲液中，备用，记为HRPiN出-TNT|Ab2; ③ 免疫传感器的构建： 首先，将5 mg步骤①所得GNPs-PANI-TNT与1 mL含0.2%壳聚糖的0.2 Μ HAc溶液混 合，超声20 minW得到均匀的分散液，然后取5化分散液滴加在预处理好的玻碳电极(GCE) 表面，室溫下自然惊干;然后在玻碳电极表面滴加10化2 mg· m[iBS3的PBS缓冲液(0.02 M)并在室溫下解育1 h，随后立即滴加10化1 mg· mL-i的蛋白护，室溫下解育60 min,浸 入PBS缓冲液中洗涂3 min,然后将该玻碳电极用5化封闭缓冲液解育30 minW封闭可能残 留的非特异性活性位点，再分别用洗涂缓冲液和PBS缓冲液洗涂3 min,最后将5 μL 0.44 mg · ml/i的捕获抗体Abl滴加在该玻碳电极表面，室溫下解育1 h，再在4°C、100%湿度饱和 环境下解育过夜后，分别用洗涂缓冲液和PBS缓冲液洗涂W除去物理吸附的捕获抗体Abl， 即得电化学免疫传感器。在4°C下储存备用。
[0016] 具体的，步骤②中，所述洗涂缓冲液(PBST)为:含0.05 %(w/v)Tween 20的PBS缓冲 液(0.05 M, pH 7.4); 步骤③中，所述封闭缓冲液为:含5 %(w/v)牛血清蛋白（BSA)的PBS缓冲液(0.05 M，pH 7.4)。
[0017] ④现聯过程： 为进行免疫反应和电化学测试，上述制备所得的电化学免疫传感器先用5化不同浓度 的AFP稀释液或血清样品在室溫下解育50 min,然后分别用洗涂缓冲液(PBST)和PBS缓冲液 洗涂1.5 min。再用5化步骤②所得产物皿P In此-TNT|Ab2在室溫下解育50 min,并分别用 洗涂缓冲液(PBST)和PBS缓冲液洗涂3 min。随后，将该电化学免疫传感器、参比电极、对电 极置于含10 mL PBS缓冲液的电化学电池中，接着将氨酿(最终浓度2 ml)和过氧化氨(最终 浓度1 mM)注入此电池中，在脉冲振幅50 mV、脉冲宽度50 ms、0.2~-0.2 V范围内进行差 分脉冲伏安(DPV)扫描，W定量测定AFP。
[0018] 复合材料的表征： 为表征TNTs、PANI-TNT、GNPs-PANI -TNT复合材料的形貌W及Ξ元复合材料的组成，图1 展示了它们的SEM图及TNTs的TEM图。从图1的A中可看出，所制备的TNTs均匀分散，具有清 晰的细长的管状形态，其长度约几百纳米，直径小于15 nm。而且，其中没有发现明显的P25 颗粒，运表明Ti化纳米颗粒经水热反应后完全转化为Ti化纳米管。图1的B中还展示了 TNTs的 TEM图来表征其形态，从图中可看出TNTs具有细长的管状形态，其比表面积大，非常适合用 于负载生物分子作为电化学免疫传感器的标记物。在图1的C中可清晰看出当苯胺氧化聚合 在TNTs上后，每几根TNTs随机捆绑在一起，运主要是由于PANI覆盖在TNTs上造成的。图1中 的巧良好地证明了经化学氧化聚合后，PANI-TNT复合材料成功合成。当GNPs通过化学还原法 沉积在PANI-TNT复合材料上后，GNPs-PANI-TNT复合材料的结构和形貌展示在图1的D和E 中，从图中可清楚看到PANI-TNT纳米复合材料表面均匀分散的球状颗粒，且无任何聚合现 象，颗粒平均直径约13 nm，运证明了GNPs被成功负载在PANI-TNT纳米材料上。
[0019] 为探究GNPs-PANI-TNT纳米复合材料的元素组成，本发明还进行了邸X分析(如图1 中的F所示）。图中的Ti峰和0峰来自TNTs，C峰来自PANI。然而，从图中没有观察至化ANI的另 一个特征峰一N峰，运是由于它与Ti元素的其中一个峰重叠在一起。此外，在-2.10 keV处还 观察到一个高强度的GNP峰。运些邸X图谱的结果进一步证明了PANI-TNT复合材料的成功合 成W及GNPs被成功负载于PANI表面，运与SEM表征结果一致。
[0020] 图2展示了TNTs(曲线a)、PANI (曲线b)和GNPs-PANI-TNT(曲线C)的典型XRD图谱。 曲线a中3移在9.0° ,24.4° ,28.1°, 48.5°和62.6°处出现的五个特征衍射峰分别对应正交 晶型TNTs的（200)，（ 110)，（600)，（020)和(002)晶面。PANI在雜为25.3°处有一个结晶峰，在 完@为14.7°和20.5°处有两个无定形特征峰（曲线6)。25.3°处结晶峰的强度明显比两个无定 形峰强，运表明苯胺绿盐(ES-PANI)具有局部结晶的结构。局部结晶源自于ES-PANI内π巧 的跨链堆积，因而ES-PANI拥有良好的电荷转移和导电性。GNPs-PANI-TNT(曲线c)除了含有 TNTs特征峰W及ES-PANI在:雜为16.3°和20.1°处的两个小峰外，还在'泌为38.5°，44.5° 和64.7°处展示了几个金的特征峰，它们分别对应金纳米颗粒的（110)，（200)和(220)晶 面衍射。曲线C表明GNPs被成功沉积于PANI-TNT表面W及Ξ元复合材料的成功形成。值得注 意的是，源自于TNT和ES-PANI的2得峰位置有微小的偏移，运可能是由于PANI和TNT之间强烈 的相互作用而引起的晶型改变。
[0021 ]图 3为TNT(曲线a)、畑2-TNT(曲线b)、PANI (曲线C)和 GNPs-PANI-TNT(曲线d)的FT-IR图谱，它提供了纳米材料的结构信息，证明了复合材料的形成。TNTs在3000-3700 cnfi的 一个宽度吸收峰和1631 cnfi的一个尖峰，均归因于表面的氨氧基振动。另外，400-700 cm ^的另一个特征吸收峰归属于纳米材料的Ti-0伸缩振动和Ti-0-Ti桥梁振动（曲线a)。如曲 线b所示，伯胺基(-N也)在3400-3500 cnfi处的对称和不对称伸缩振动峰与TNTs上的0-H伸 缩吸收带重叠在一起。1625 cnfi和1508 cnfi处的峰属于N-H弯曲振动峰，且曲线b中1625 cnfi处的峰明显比曲线a中1631 cnfi处吸附水分子的吸收峰强，运些表明TNTs的成功氨基 化。在曲线C中，1299 cnfi，1125 cnfi和797 cnfi处的吸收峰分别来自于仲芳香胺，N=Q=N(Q 代表酿环）伸缩W及芳香族的C-H面外弯曲振动。在1563 cnfi和1474 cnfi处的峰分别属于 酿环和苯环的C=C伸缩振动。运些红外特征吸收峰表明苯胺成功转化为聚苯胺。更重要的 是，1 242 cnfi处的峰属于C-N+'伸缩振动峰，运再次证明了ES-PANI的存在。GNPs-PANI-TNT 展示了PANI的特征吸收峰口00-1600 cnfi)W及Ti-0-Ti和Ti-0的振动吸收带(400-700 cm -1)(曲线d)。正如预期的那样，GNPs没有产生明显的FT-IR吸收峰。然而，Ξ元复合材料的形 成导致了PANI特征吸收峰位置的偏移，其中1563，1474，1299和1125 cnfi (曲线b)的 吸收峰分别移动至1580，1497，1309和1147 cnfi(曲线C)。运些位移是由PANI和TNTs之 间强烈的相互作用引起的。
[0022] 电化学阻抗(EIS)法监测免疫传感器的组装过程： 电化学阻抗图谱(EIS)是用来评估动力学过程和修饰电极界面性能的有效工具。因此， 电化学阻抗被用来探测本发明实施例1所制备得到的用W检测AFP的电化学免疫传感器的 组装过程。
[0023] 阻抗实验在含0.1 Μ电解质KC1的5 mM K3[Fe(CN)6] |K4[Fe(CN)6]中进行，并在 0.209 V的直流电压上叠加5 mV的交流电压。在100 K化~100 mHz频率范围内记录奈奎斯 特图，如图4所示。图4中的所有奈奎斯特图在高频区呈现一个半圆，它对应电子转移电阻 (Ret);在低频区包含一个直线部分，它对应扩散控制过程。半圆直径与修饰电极表面的铁氯 化钟电子传递系数成反比。纳米材料和生物分子的附着形成了一个电子和传质阻挡层，它 阻碍铁氯化钟向电极表面的扩散，因而减小了电子传递系数。如预料那样，裸GCE电极（曲线 a)有一个很小的半圆，它代表表面电阻很小，对应扩散控制过程。在曲线b-f中，裸GCE电极 依次被修饰上GNPs-PANI-TNTi壳聚糖分散体系、蛋白护、BSA、捕获抗体Abl和信号抗体Ab2， 从图中可W看出，伴随着逐步修饰过程，半圆直径逐渐增加，表明各种材料被层层组装于电 极表面。
[0024] 电化学免疫传感器检测条件的优化： 测试溶液的pH值是影响酶传感器性能的一个重要因素，因为强酸和强碱环境均会破坏 生物分子的活性。溶液抑对免疫传感器电流响应的影响如图5所示。电流响应值在抑4.0- 7. ο范围内随着pH值的增加而快速增加，当pH超过7. ο后，开始减小。因此，含ο. 10 Μ的ο. 05 Μ pH 7.0 PBS缓冲液被选作检测液用于检测AFP。
[002引 AFP在GNPs-PANI-TNT惊聚糖愼白GMBSAlAbl上的培育时间是影响免疫传感器 分析性能的另一个重要因素。在室溫下，AFP免疫传感器的电流响应值随AFP培育时间的增 加而显著增加，超过50 min后基本达到一个恒定值(如图6所示），运表明AFP与电极表面的 捕获抗体Abl的结合达到饱和。因此，将50 min选作此夹屯、型免疫分析的培育时间。
[0026] 分析性能评估： HRP由于其稳定性、高催化性W及超高灵敏度，成为电化学免疫分析中广泛研究的示踪 酶。在运里，本发明通过双氨基化试剂BS3将HRP和捕获抗体负载于Ti化纳米管表面形成了免 疫分析的示踪标记物。实验前，检测液用高纯氮气除氧15 min,在检测过程中保持氮气环 境。在出化的帮助下，HRP催化氨酿转化为苯酿，随后苯酿被电化学还原为氨酿来提供检测信 号，如下两反应式所示：
[0027] 在最优条件下，差分脉冲伏安(DPV)被用来评估免疫传感器的分析性能。如图7所 示，还原峰电流随AFP浓度的增加而增加，校准曲线（图7中的插图）显示峰电流与分析物浓 度的对数之间有良好的线性关系，线性范围为0.01 ng/mL至350 ng/mL，相关系数为 0.994(n=4).在信噪比为3的条件下，AFP的检测限低至1.5 pg/mL，运不仅低于之前报道的 多种免疫分析方法，还低于那些具有放大策略的免疫传感器。
[0028] 免疫传感器的重现性、特异性、稳定性和在血清样品中的应用 本发明进一步研究了实施例1制备所得夹屯、型电化学免疫传感器的特异性、重现性和 稳定性。为评估该免疫传感器的特异性，本发明引入了几种可能的干扰物，包括癌胚抗原 (CEA)，前列腺癌蛋白抗原(PSA)，肿瘤抗原125(CA125)，免疫球蛋白G(IgG)和牛血清蛋白 (BSA)。此免疫传感器分别用含有上述其中一种干扰物（100 ng · mL-i)的5 ng · mL-i AFP解 育。如图8所示，与没有干扰物相比，由干扰物引起的电流变化小于5%，运表明此免疫传感器 具有良好的选择性。
[0029] 为了探究此免疫传感器的准确度和重现性，本发明用相同样品分别制备五根电极 在相同条件下进行研究测试，所得相对标准偏差(RSD)为5.2%。表明此免疫传感器准确度 和重现性良好。
[0030] 此外，此免疫传感器的稳定性也通过测量它们在4°C条件下储存3周前后的电流响 应进行了评估。结果表明，3周后92.1%的电流响应得W保留，运表明此免疫传感器具有良好 的稳定性。
[0031] 该免疫传感器对实际血清样品分析的适用性通过标准加入法进行了评估。实验结 果显示在表1中。回收率/检测率为96.4% - 106.0%，运表明本发明的电化学免疫传感器可 被用于日常临床诊断中人体血清中AFP的检测。
[0032] 表1用本发明免疫传感器检测加入人体血清中的AFP(n=3)
【主权项】
1. 一种以Ti〇2纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构 建方法，其特征在于，包括如下步骤： ①GNPs-PANI-TNT复合材料的制备： Ti02纳米管的制备:将0.6gTi02纳米颗粒和120mL、10Μ的NaOH水溶液混合后，转 移至反应釜中，120±5°C下水热反应48h，弃去上清液，所得白色粗制品洗涤后，在60°C条 件下干燥2h，备用，记为TNTs; 聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的合成:将0.2660gTNTs、8.57mL0.1Μ苯胺盐酸液、以及10mL0.1Μ的盐酸混合，0-5°C冰浴下磁力搅拌30min以获得均匀的分散液;然后在2 h内加入8.57mL、0.1Μ的过硫酸铵盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3h，室温静置过 夜，固液分离，所得沉淀物用去离子水洗涤至pH为7,60°C下干燥3h后研磨成粉末，备用， 记为PANI-TNT; 金纳米颗粒-聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的制备:取18mgPANI-TNT和18mL超纯水， 混匀，在搅拌条件下加入1mL、0.01Μ的HAuCl4溶液和1mL、0.01Μ的封端剂柠檬酸三 钠溶液，然后在20min内加入1mL新制的0.1Μ的NaBH4溶液，室温下继续搅拌0.5h后静 置过夜，离心分离，沉淀物洗涤后，60°C下干燥过夜，备用，记为GNPs-PANI-TNT; ② 标记信号抗体Ab2的制备： 氨基化Ti〇2纳米管的制备:将100mgTNTs与20mL乙醇、1mL28%氨水和4mL3-氨丙 基三乙氧基硅烷混合后，机械搅拌过夜以防止TNTs沉淀，离心分离，弃去上清液，所得固体 残留物洗涤、干燥后，室温下储存备用，记为NH2-TNT; 辣根过氧化物酶I氨基化Ti02纳米管|信号抗体生物共辄体的制备:将2mgBS3溶解在 0.5mL、0.02Μ的PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3mgNH2-TNT分散于溶液A中，搅拌下加 入350yL2mg·ml/1的辣根过氧化物酶水溶液并在室温下孵育30min，然后加入20yL含 0.6mg11/1信号抗体Ab2的PBS缓冲液，4°C下搅拌4h，离心分离，所得沉淀物用PBS缓冲液 洗涤并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室温下封闭30min，最后用PBS缓冲液洗涤后，分 散于含0.1%牛血清蛋白的1.0mLPBS缓冲液中，备用，记为HRP|NH2-TNT|Ab2; ③ 免疫传感器的构建： 首先，将5mg步骤①所得GNPs-PANI-TNT分散于1mL含0.2%壳聚糖的HAc溶液中，超 声20min以得到均匀的分散液，取5yL分散液滴加在预处理好的玻碳电极表面，室温下自 然晾干;然后在玻碳电极表面滴加10yL含2mg·ml/1BS3的PBS缓冲液并在室温下孵育1 h，随后滴加10yL1mg.mL-1的蛋白G、室温下孵育60min，浸入PBS缓冲液中洗涤3min， 然后将该玻碳电极用5yL封闭缓冲液孵育30min，再分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤3 min，最后将5yL0.44mg.1111/1的捕获抗体Abl滴加在该玻碳电极表面，室温下孵育1h， 再在4°C、100%湿度饱和环境下孵育过夜后，分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤，即得电化 学免疫传感器。2.如权利要求1所述以Ti02纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免 疫传感器的构建方法，其特征在于，步骤②中，所述洗涤缓冲液为：含0.05 %Tween20的 PBS缓冲液； 步骤③中，所述封闭缓冲液为:含5 %牛血清蛋白的PBS缓冲液。
【专利摘要】本发明涉及一种以TiO2纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，其分别通过水热法、化学氧化聚合法以及柠檬酸三钠还原法最终合成出GNPs-PANI-TNT复合材料，将其分散于壳聚糖溶液中并滴加在电极表面。以BS3为双氨基交联剂将蛋白G′共价结合在壳聚糖表面，用于定向负载捕获抗体(Ab1)。BS3还被用于结合辣根过氧化物酶（HRP）和信号抗体（Ab2）以制备示踪标记物。采用本发明方法制备所得的电化学免疫传感器能够快速的测定α-甲胎蛋白AFP，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。
【IPC分类】G01N33/58, G01N33/543, G01N27/327, G01N33/68
【公开号】CN105486873
【申请号】CN201510893519
【发明人】刘小强, 霍小鹤, 刘培培, 朱杰
【申请人】河南大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月8日
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