一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂的制作方法
一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测试剂技术领域，具体设及一种用于肺癌诊断和预后判断免疫 组化检测试剂。
【背景技术】
[0002] 肺癌的全称为"原发性支气管肺癌"，其发病率及死亡率近年来上升速度极快。我 国肺癌发病的重点在城市，发病率男性为癌症发病的第一位，女性为癌症发病的第Ξ位。肺 癌的治愈率很低，尚属于一种很难治愈的癌症，究其原因在于病程进展快，发现、诊断和治 疗则相对较晚，早期的发现和诊断对肺癌的治愈至关重要。
[0003] 目前在临床上对肺癌的恶性度判别主要还是基于在组织病理水平对肿瘤组织和 肿瘤细胞进行常规形态学观察，它对癌细胞的分化程度和侵犯特性有较强的辨别能力，但 是运种基于形态学的解读一方面受病理医师经验等人为因素影响，另一方面缺乏更深层次 的与病人个体发病因素相关的分子依据。对肺癌的发生根源，即基因或相关功能性蛋白等 分子进行检测，对肺癌诊断及预后判断具有重要意义，免疫组织化学检测是深刻认识和有 效控制肿瘤恶性本质的非常重要的方法。
[0004] 免疫组织化学技术应用免疫学抗原抗体反应基本原理，通过抗体对体内蛋白质分 子抗原的特异性识别，W及化学标记(巧光素、酶、金属离子、同位素等）的第二抗体的显色 等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肤和蛋白质）的表达量及其亚细胞定位。近年来，随 着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认 识的不断深入，免疫组化在肿瘤的分子诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。
[0005] 本申请项目前期研究发现E皿2蛋白的表达与定位在肺癌中产生异变，自主研发的 EHD2特异抗体可用于肺癌的免疫组化检测。EHD2化psinhomology化H)-domain-containing protein 2)是EHD蛋白的一种，是一类新型膜转运调控蛋白，含有高度保守的 EH结构域。参与受体内吞等胞膜转运的多步调控，是整个胞膜转运机制的必不可少的重要 环节，在多种细胞中起分子与物质运输及信号传导等关键作用，它的失调将导致细胞信号 应答失当及细胞功能素乱，并可能进而引发疾病。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观 准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特性。目前，由EHD2特异抗体制备的免疫组 化试剂未见报道。
【发明内容】
[0006] 为解决【背景技术】中提到的目前在临床上对肿瘤的判别主要还是基于在组织病理 水平对肿瘤组织和肿瘤细胞进行常规形态学观察，受病理医师经验等人为因素影响较大， 缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据的问题，本发明公布了一种用于肺癌 诊断和预后判断免疫组化检测试剂。
[0007] 本发明解决的技术问题通过W下技术方案来实现：
[000引一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，是W-种对人E皿2蛋白特异的 抗体作为一抗或核屯、抗体；w化学标记包括巧光素、酶、金属离子或同位素作为通用第二抗 体，通过显色等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肤和蛋白质）的表达量及其亚细胞定 位。
[0009] 所述E皿2蛋白是指由基因 EHD2编码的蛋白，所述基因 EHD2的GeneBank国际通用序 列编号为：NM_014601，所述基因 EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：W_ 055416。
[0010] 所述一种对人EHD2蛋白特异的抗体，其特征在于，所述抗体能特异性识别人EHD2 蛋白，所述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQ ID NO: 1-543,由该氨基酸序列构成的一种 多肤，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。
[0011] W所述多肤的氨基酸序列为核屯、序列对其进行修饰，所述修饰为在所述多肤N端 连接一个半脫氨酸;修饰后的所述多肤经纯化后作为抗原对动物进行免疫W制备E皿2抗体 并进行抗原纯化。
[0012] 所述免疫组化检测试剂，用于对肺癌组织中EHD2的表达水平和定位进行检测，是 采用前述对人E皿2蛋白特异的抗体作为一抗或核屯、抗体。
[0013] 作为所述通用第二抗体的酶可为辣根过氧化物酶皿P、骨型碱性憐酸酶、激酶或蛋 白酶。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明公开了 EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，由于E皿2蛋白参 与受体与胞膜转运的多步调控，W及在各种细胞中对维持物质运输与信号传导等起关键作 用，与肿瘤等疾病的发生密切相关。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地从分子 水平反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特点，符合肿瘤的精准医疗原则和趋势。
[0016] 本发明公开的EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，W对人EHD2蛋白 特异的抗体作为一抗或核屯、抗体，制备肺癌免疫组化检测试剂，制备出的试剂特异性好，灵 敏度高，显色性好。
【附图说明】
[0017]图巧免疫印迹检测结果；
[0018] 图2为肺癌组织200倍镜下免疫组化图：其中左上为癌旁正常组织，右下为癌组织；
[0019] 图3为肺癌组织200倍镜下免疫组化图；
[0020] 图4为肺癌组织400倍镜下免疫组化图。
【具体实施方式】
[0021] W下结合附图和实施例来对本发明做详细的说明
[0022] 实施例
[0023] -种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于，W对人EHD2蛋白 特异的抗体作为一抗或核屯、抗体；W辣根过氧化物酶HRP作为第二抗体化学标记，通过稀 释、显色等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肤和蛋白质）的表达量及其亚细胞定位;所 述EHD2蛋白是指由基因 EHD2编码的蛋白，所述基因 E皿2的GeneBank国际通用序列编号为： NM_014601，所述基因 E皿2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为:NP_055416;所述一种 对人E皿2蛋白特异的抗体，其特征在于，所述抗体能特异性识别人E皿2蛋白，所述识别位点 的氨基酸序列为:503-SEQ ID N0:l-543,由该氨基酸序列构成的一种多肤，其氨基酸序列 为沈Q ID NO: 1。
[0024] 1、E皿2免疫组织化学检测
[0025] 1)实验材料来源：
[0026] 肺癌切片取自天津市肿瘤医院肿瘤组织标本库，常规脱蜡。一抗稀释液、辣根过氧 化物酶化RP)标记的通用二抗、二氨基联苯胺(DAB)底物、底物稀释液等购自中杉金桥。
[0027] 2)免疫组化检测试剂组配条件及样本组织中E皿2表达与定位的检测方法：
[00%]方法主要步骤为:组织切片脱蜡至水，抗原修复，内源过氧化物酶阻断，W1: 200滴 加实施例（1)制备得到的抗体作为一抗，4°C解育过夜。缓冲液洗3次每次5min。滴加通用HRP 酶标二抗，在室溫下解育30分钟。缓冲液洗3次每次5min"DAB显色，复染，脱水封片后显微镜 下观察染色情况。
[00巧]3)结果：
[0030] 癌旁正常组织中E皿2在上皮细胞核中强着色、浆或膜表达阳性(见图2左上部）。癌 组织中，E皿2表达水平和定位发生异常，或几乎为阴性（见图2右下部）；或表达减弱（见图 3);或核中阴性浆中增强（图4 )。
[0031] 2、E皿2特异抗体的制备
[0032] 1)实验材料来源
[0033] 新英格兰大白兔购于上海强耀生物，多肤
[0034] CD邸FALA甜LIEAKLEG服LPA化PR化VPPSKR畑KGSAE由天津赛尔生物技术有限公司 定制并与KLH偶联，CNBr活化的凝胶珠，福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自Invihigen公 司。
[0035] 2)动物免疫
[0036] 取4月龄新西兰大白兔3只，将lOOug抗原多肤溶于0.2ml 0.1M PBS(pH7.2)，与等 体积福氏完全佐剂充分混匀，腹部皮下多点注射。第一次免疫后第15和29天，分别用lOOug 多肤/0.2mlPBS与等体积福氏不完全佐剂充分混合后加强免疫。
[0037] 3化皿2抗血清的制备
[0038] 于免疫结束后一周颈动脉取血，37°C静置3小时后离屯、取血清。
[0039] 4)抗原凝胶珠制备
[0040] CN化活化的凝胶珠于ImM HC1中浸泡30分钟，用偶联缓冲液(含0.1M化HC03 pH 8.3，和0.5M化Cl)清洗，按Img多肤加1ml凝胶的比例混合反应体系，4度偶联过夜，1M乙醇 胺浸泡3小时后用清洗液1 (含50mM Tris，1M NaCl，pH8.0)和清洗液2(含50mM甘氨酸，1M NaCl，pH 3.5)交叉清洗八遍少85清洗1遍。
[0041 ] 5化皿2抗体的纯化
[0042]血清与上述抗原凝胶珠按体积比为20:1的混合，加与混合后体系等体积的PBS，混 匀1小时后离屯、，用PBS清洗凝胶珠，用抑3巧樣酸钢溶液洗脱联在凝胶珠上的抗体，调pH至 6.5-7.5，得到纯化后的E皿2抗体。
[0043 ] 3、对E皿2抗体采用免疫印迹法进行特异性检测
[0044] 1)实验材料来源：
[0045] 293T细胞购于美国American Type Culture Collection(ATCC)公司，RPMI1940培 养液、BSA、HRP标记抗兔二抗、Lipo2000转染试剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂、E化 化学发光检测试剂等购于Invitrogen公司，E皿1、E皿2、E皿3、E皿4表达质粒为自制。
[0046] 2)细胞培养
[0047] 293T细胞培养于RPMI1940培养液中，37°C、5 % C02培养贴壁生长;细胞传代时先弃 去培养液，再用憐酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗两遍，加入0.05%膜蛋 白酶消化2分钟，加入培养基终止消化。细胞保持良好状态，两天传一代。转染时分别加入表 达E皿1、E皿2、E皿3、E皿4的质粒及转染试剂，2天后收取细胞做免疫印迹实验。
[004引 3)免疫印迹方法
[0049] 将各种细胞预留足够数量至离屯、管中，离屯、后RIPA裂解液裂解细胞，煮样，再离 屯、。制得样品后，使用BCA检测试剂进行蛋白浓度的测定。每个样品分别取80ug蛋白总量进 行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到PVDF膜上，室溫5%牛奶封闭1小时。洗涂 后，与一抗(实施例1中制备的抗体Wl:2000加入PBS和5%BSA)在室溫解育1小时。然后与1: 5000稀释的抗兔二抗室溫解育1小时。最后用化学发光检测试剂检测。
[0050] 4)结果:上述抗体对E皿2蛋白具有高度的特异性，表现为仅仅针对EHD2才有信号， 而对哪怕高度同源的其它E皿蛋白也不能识别。检测结果见图1。图中：样品Ve为空表达载 体，无信号;样品1过表达E皿1蛋白，无信号;样品2过表达EHD2蛋白，在对应分子量70kd位置 呈一条主带，信号清晰，并没有其它明显背景条带;样品3过表达EHD3蛋白，无信号;样品4过 表达EHD4蛋白，无信号。综上，本实施例提供的抗体在正常位置70kd处具有强烈的信号，而 且在其他位置均无信号，结果表明本发明提供的抗体具有很好的特异性。
[0051] W上实验结果表明，采用本发明提供抗体为核屯、的免疫组化检测方法，能很好地 检测肺癌组织细胞中E皿2的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读EHD2在癌组 织细胞中的定位和表达情况，并W此为依据判别肺癌的个体化异质性。
[0052] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不用W限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于，以对一种人EHD2蛋 白特异的抗体作为一抗或核心抗体；以化学标记包括荧光素、酶、金属离子或同位素作为通 用第二抗体，通过显色等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肽和蛋白质）的表达量及其亚 细胞定位;所述EHD2蛋白是指由基因EHD2编码的蛋白；所述基因EHD2的GeneBank国际通用 序列编号为：NM_014601;所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_ 055416;所述一种对人EHD2蛋白特异的抗体是指抗体能特异性识别人EHD2蛋白，所述识别 位点的氨基酸序列为:503-SEQIDNO: 1-543,由该氨基酸序列构成的一种多肽，其氨基酸 序列为SEQIDN0:1。2. 如权利要求1所述的一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于， 以所述多肽的氨基酸序列为核心序列对其进行修饰，所述修饰为在所述多肽N端连接一个 半胱氨酸;修饰后的所述多肽经纯化后作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体并进行抗 原纯化。3. 如权利要求1所述的一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于， 所述免疫组化检测试剂，用于对肺癌组织中EHD2的表达水平和定位进行检测，是采用前述 对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体。4. 如权利要求1所述的一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于， 作为所述通用第二抗体的酶可为辣根过氧化物酶HRP、骨型碱性磷酸酶、激酶或蛋白酶。
【专利摘要】本发明属于生物检测试剂技术领域，具体涉及一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于，以对一种人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体；以化学标记包括荧光素、酶、金属离子或同位素作为通用第二抗体,通过显色等作用来检测组织细胞内目标抗原(多肽和蛋白质)的表达量及其亚细胞定位；所述EHD2蛋白是指由基因EHD2编码的蛋白，所述基因EHD2的GeneBank国际通用序列编号为：NM_014601，所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_055416。本发明公开了EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，由于EHD2蛋白参与受体与胞膜转运的多步调控，以及在各种细胞中对维持物质运输与信号传导等起关键作用，与肿瘤等疾病的发生密切相关。
【IPC分类】G01N33/574, G01N33/68
【公开号】CN105486874
【申请号】CN201511004669
【发明人】应国光, 刘博
【申请人】天津市应世博科技发展有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月25日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测试剂技术领域，具体设及一种用于肺癌诊断和预后判断免疫 组化检测试剂。
【背景技术】
[0002] 肺癌的全称为"原发性支气管肺癌"，其发病率及死亡率近年来上升速度极快。我 国肺癌发病的重点在城市，发病率男性为癌症发病的第一位，女性为癌症发病的第Ξ位。肺 癌的治愈率很低，尚属于一种很难治愈的癌症，究其原因在于病程进展快，发现、诊断和治 疗则相对较晚，早期的发现和诊断对肺癌的治愈至关重要。
[0003] 目前在临床上对肺癌的恶性度判别主要还是基于在组织病理水平对肿瘤组织和 肿瘤细胞进行常规形态学观察，它对癌细胞的分化程度和侵犯特性有较强的辨别能力，但 是运种基于形态学的解读一方面受病理医师经验等人为因素影响，另一方面缺乏更深层次 的与病人个体发病因素相关的分子依据。对肺癌的发生根源，即基因或相关功能性蛋白等 分子进行检测，对肺癌诊断及预后判断具有重要意义，免疫组织化学检测是深刻认识和有 效控制肿瘤恶性本质的非常重要的方法。
[0004] 免疫组织化学技术应用免疫学抗原抗体反应基本原理，通过抗体对体内蛋白质分 子抗原的特异性识别，W及化学标记(巧光素、酶、金属离子、同位素等）的第二抗体的显色 等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肤和蛋白质）的表达量及其亚细胞定位。近年来，随 着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认 识的不断深入，免疫组化在肿瘤的分子诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。
[0005] 本申请项目前期研究发现E皿2蛋白的表达与定位在肺癌中产生异变，自主研发的 EHD2特异抗体可用于肺癌的免疫组化检测。EHD2化psinhomology化H)-domain-containing protein 2)是EHD蛋白的一种，是一类新型膜转运调控蛋白，含有高度保守的 EH结构域。参与受体内吞等胞膜转运的多步调控，是整个胞膜转运机制的必不可少的重要 环节，在多种细胞中起分子与物质运输及信号传导等关键作用，它的失调将导致细胞信号 应答失当及细胞功能素乱，并可能进而引发疾病。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观 准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特性。目前，由EHD2特异抗体制备的免疫组 化试剂未见报道。
【发明内容】
[0006] 为解决【背景技术】中提到的目前在临床上对肿瘤的判别主要还是基于在组织病理 水平对肿瘤组织和肿瘤细胞进行常规形态学观察，受病理医师经验等人为因素影响较大， 缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据的问题，本发明公布了一种用于肺癌 诊断和预后判断免疫组化检测试剂。
[0007] 本发明解决的技术问题通过W下技术方案来实现：
[000引一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，是W-种对人E皿2蛋白特异的 抗体作为一抗或核屯、抗体；w化学标记包括巧光素、酶、金属离子或同位素作为通用第二抗 体，通过显色等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肤和蛋白质）的表达量及其亚细胞定 位。
[0009] 所述E皿2蛋白是指由基因 EHD2编码的蛋白，所述基因 EHD2的GeneBank国际通用序 列编号为：NM_014601，所述基因 EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：W_ 055416。
[0010] 所述一种对人EHD2蛋白特异的抗体，其特征在于，所述抗体能特异性识别人EHD2 蛋白，所述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQ ID NO: 1-543,由该氨基酸序列构成的一种 多肤，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。
[0011] W所述多肤的氨基酸序列为核屯、序列对其进行修饰，所述修饰为在所述多肤N端 连接一个半脫氨酸;修饰后的所述多肤经纯化后作为抗原对动物进行免疫W制备E皿2抗体 并进行抗原纯化。
[0012] 所述免疫组化检测试剂，用于对肺癌组织中EHD2的表达水平和定位进行检测，是 采用前述对人E皿2蛋白特异的抗体作为一抗或核屯、抗体。
[0013] 作为所述通用第二抗体的酶可为辣根过氧化物酶皿P、骨型碱性憐酸酶、激酶或蛋 白酶。
[0014] 有益效果
[0015] 本发明公开了 EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，由于E皿2蛋白参 与受体与胞膜转运的多步调控，W及在各种细胞中对维持物质运输与信号传导等起关键作 用，与肿瘤等疾病的发生密切相关。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地从分子 水平反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床特点，符合肿瘤的精准医疗原则和趋势。
[0016] 本发明公开的EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，W对人EHD2蛋白 特异的抗体作为一抗或核屯、抗体，制备肺癌免疫组化检测试剂，制备出的试剂特异性好，灵 敏度高，显色性好。
【附图说明】
[0017]图巧免疫印迹检测结果；
[0018] 图2为肺癌组织200倍镜下免疫组化图：其中左上为癌旁正常组织，右下为癌组织；
[0019] 图3为肺癌组织200倍镜下免疫组化图；
[0020] 图4为肺癌组织400倍镜下免疫组化图。
【具体实施方式】
[0021] W下结合附图和实施例来对本发明做详细的说明
[0022] 实施例
[0023] -种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于，W对人EHD2蛋白 特异的抗体作为一抗或核屯、抗体；W辣根过氧化物酶HRP作为第二抗体化学标记，通过稀 释、显色等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肤和蛋白质）的表达量及其亚细胞定位;所 述EHD2蛋白是指由基因 EHD2编码的蛋白，所述基因 E皿2的GeneBank国际通用序列编号为： NM_014601，所述基因 E皿2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为:NP_055416;所述一种 对人E皿2蛋白特异的抗体，其特征在于，所述抗体能特异性识别人E皿2蛋白，所述识别位点 的氨基酸序列为:503-SEQ ID N0:l-543,由该氨基酸序列构成的一种多肤，其氨基酸序列 为沈Q ID NO: 1。
[0024] 1、E皿2免疫组织化学检测
[0025] 1)实验材料来源：
[0026] 肺癌切片取自天津市肿瘤医院肿瘤组织标本库，常规脱蜡。一抗稀释液、辣根过氧 化物酶化RP)标记的通用二抗、二氨基联苯胺(DAB)底物、底物稀释液等购自中杉金桥。
[0027] 2)免疫组化检测试剂组配条件及样本组织中E皿2表达与定位的检测方法：
[00%]方法主要步骤为:组织切片脱蜡至水，抗原修复，内源过氧化物酶阻断，W1: 200滴 加实施例（1)制备得到的抗体作为一抗，4°C解育过夜。缓冲液洗3次每次5min。滴加通用HRP 酶标二抗，在室溫下解育30分钟。缓冲液洗3次每次5min"DAB显色，复染，脱水封片后显微镜 下观察染色情况。
[00巧]3)结果：
[0030] 癌旁正常组织中E皿2在上皮细胞核中强着色、浆或膜表达阳性(见图2左上部）。癌 组织中，E皿2表达水平和定位发生异常，或几乎为阴性（见图2右下部）；或表达减弱（见图 3);或核中阴性浆中增强（图4 )。
[0031] 2、E皿2特异抗体的制备
[0032] 1)实验材料来源
[0033] 新英格兰大白兔购于上海强耀生物，多肤
[0034] CD邸FALA甜LIEAKLEG服LPA化PR化VPPSKR畑KGSAE由天津赛尔生物技术有限公司 定制并与KLH偶联，CNBr活化的凝胶珠，福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂购自Invihigen公 司。
[0035] 2)动物免疫
[0036] 取4月龄新西兰大白兔3只，将lOOug抗原多肤溶于0.2ml 0.1M PBS(pH7.2)，与等 体积福氏完全佐剂充分混匀，腹部皮下多点注射。第一次免疫后第15和29天，分别用lOOug 多肤/0.2mlPBS与等体积福氏不完全佐剂充分混合后加强免疫。
[0037] 3化皿2抗血清的制备
[0038] 于免疫结束后一周颈动脉取血，37°C静置3小时后离屯、取血清。
[0039] 4)抗原凝胶珠制备
[0040] CN化活化的凝胶珠于ImM HC1中浸泡30分钟，用偶联缓冲液(含0.1M化HC03 pH 8.3，和0.5M化Cl)清洗，按Img多肤加1ml凝胶的比例混合反应体系，4度偶联过夜，1M乙醇 胺浸泡3小时后用清洗液1 (含50mM Tris，1M NaCl，pH8.0)和清洗液2(含50mM甘氨酸，1M NaCl，pH 3.5)交叉清洗八遍少85清洗1遍。
[0041 ] 5化皿2抗体的纯化
[0042]血清与上述抗原凝胶珠按体积比为20:1的混合，加与混合后体系等体积的PBS，混 匀1小时后离屯、，用PBS清洗凝胶珠，用抑3巧樣酸钢溶液洗脱联在凝胶珠上的抗体，调pH至 6.5-7.5，得到纯化后的E皿2抗体。
[0043 ] 3、对E皿2抗体采用免疫印迹法进行特异性检测
[0044] 1)实验材料来源：
[0045] 293T细胞购于美国American Type Culture Collection(ATCC)公司，RPMI1940培 养液、BSA、HRP标记抗兔二抗、Lipo2000转染试剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂、E化 化学发光检测试剂等购于Invitrogen公司，E皿1、E皿2、E皿3、E皿4表达质粒为自制。
[0046] 2)细胞培养
[0047] 293T细胞培养于RPMI1940培养液中，37°C、5 % C02培养贴壁生长;细胞传代时先弃 去培养液，再用憐酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗两遍，加入0.05%膜蛋 白酶消化2分钟，加入培养基终止消化。细胞保持良好状态，两天传一代。转染时分别加入表 达E皿1、E皿2、E皿3、E皿4的质粒及转染试剂，2天后收取细胞做免疫印迹实验。
[004引 3)免疫印迹方法
[0049] 将各种细胞预留足够数量至离屯、管中，离屯、后RIPA裂解液裂解细胞，煮样，再离 屯、。制得样品后，使用BCA检测试剂进行蛋白浓度的测定。每个样品分别取80ug蛋白总量进 行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到PVDF膜上，室溫5%牛奶封闭1小时。洗涂 后，与一抗(实施例1中制备的抗体Wl:2000加入PBS和5%BSA)在室溫解育1小时。然后与1: 5000稀释的抗兔二抗室溫解育1小时。最后用化学发光检测试剂检测。
[0050] 4)结果:上述抗体对E皿2蛋白具有高度的特异性，表现为仅仅针对EHD2才有信号， 而对哪怕高度同源的其它E皿蛋白也不能识别。检测结果见图1。图中：样品Ve为空表达载 体，无信号;样品1过表达E皿1蛋白，无信号;样品2过表达EHD2蛋白，在对应分子量70kd位置 呈一条主带，信号清晰，并没有其它明显背景条带;样品3过表达EHD3蛋白，无信号;样品4过 表达EHD4蛋白，无信号。综上，本实施例提供的抗体在正常位置70kd处具有强烈的信号，而 且在其他位置均无信号，结果表明本发明提供的抗体具有很好的特异性。
[0051] W上实验结果表明，采用本发明提供抗体为核屯、的免疫组化检测方法，能很好地 检测肺癌组织细胞中E皿2的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读EHD2在癌组 织细胞中的定位和表达情况，并W此为依据判别肺癌的个体化异质性。
[0052] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，并不用W限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于，以对一种人EHD2蛋 白特异的抗体作为一抗或核心抗体；以化学标记包括荧光素、酶、金属离子或同位素作为通 用第二抗体，通过显色等作用来检测组织细胞内目标抗原（多肽和蛋白质）的表达量及其亚 细胞定位;所述EHD2蛋白是指由基因EHD2编码的蛋白；所述基因EHD2的GeneBank国际通用 序列编号为：NM_014601;所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_ 055416;所述一种对人EHD2蛋白特异的抗体是指抗体能特异性识别人EHD2蛋白，所述识别 位点的氨基酸序列为:503-SEQIDNO: 1-543,由该氨基酸序列构成的一种多肽，其氨基酸 序列为SEQIDN0:1。2. 如权利要求1所述的一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于， 以所述多肽的氨基酸序列为核心序列对其进行修饰，所述修饰为在所述多肽N端连接一个 半胱氨酸;修饰后的所述多肽经纯化后作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体并进行抗 原纯化。3. 如权利要求1所述的一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于， 所述免疫组化检测试剂，用于对肺癌组织中EHD2的表达水平和定位进行检测，是采用前述 对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体。4. 如权利要求1所述的一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于， 作为所述通用第二抗体的酶可为辣根过氧化物酶HRP、骨型碱性磷酸酶、激酶或蛋白酶。
【专利摘要】本发明属于生物检测试剂技术领域，具体涉及一种用于肺癌诊断和预后判断免疫组化检测试剂，其特征在于，以对一种人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体；以化学标记包括荧光素、酶、金属离子或同位素作为通用第二抗体,通过显色等作用来检测组织细胞内目标抗原(多肽和蛋白质)的表达量及其亚细胞定位；所述EHD2蛋白是指由基因EHD2编码的蛋白，所述基因EHD2的GeneBank国际通用序列编号为：NM_014601，所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_055416。本发明公开了EHD2抗体在制备肺癌免疫组化检测试剂中的应用，由于EHD2蛋白参与受体与胞膜转运的多步调控，以及在各种细胞中对维持物质运输与信号传导等起关键作用，与肿瘤等疾病的发生密切相关。
【IPC分类】G01N33/574, G01N33/68
【公开号】CN105486874
【申请号】CN201511004669
【发明人】应国光, 刘博
【申请人】天津市应世博科技发展有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月25日
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