用于种子消毒的处理的制作方法
用于种子消毒的处理的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及种子处理。该方法利用真空压力来消毒种子的病原体，例如真菌、细 菌、病毒、类病毒、病毒样生物、卵菌纲、植原体、原生动物、线虫等。该方法适用于例如来自 葫芦科植物，尤其是西瓜、甜瓜、南瓜小果(squash)、南瓜、黄瓜和葫芦的种子或来自茄科植 物，尤其是西红柿、辣椒和茄子的种子。
【背景技术】
[0002] 种子携带的病原体每年造成重大经济损失。具体地，它们降低作物产量、使其质量 下降，并让蔬菜胆藏变得更加困难。因此，对于耕种者，有必要收到不含病原体的种子，因为 在耕种季节期间控制很难实现。
[0003] 通常，种子经过各种处理W杀死种子上存在的病原体，从而避免病原体从种子到 待种植作物的传播，并防止对种子本身的伤害。运种处理也可W增加种子的胆藏期。运对用 于播种的种子和可能在发芽后适于消费或工业加工的种子均适用。对于发芽过程开始后用 于繁殖或用于消费或工业加工的种子，理论上保存发芽能力或酶活性至关重要。
[0004] 种子消毒需要消除外部和内部的种子携带的疾病而不负面影响种子特征，例如存 活力、发芽和出苗速度W及植物的最后高度。可W通过从化学到物理技术的各种技术进行 种子消毒。
[0005] 化学产品例如过氧乙酸、盐酸或次氯酸钢可W降低例如种子携带的西瓜嗜酸菌 (Acidovorax Citrulli)接种，但它们通常不能从已经感染的种子中消除细菌(Dutta,B， Avci,U,Hahn,M.G.和Walcott R.R.2012.Phytopathology 102/5461-468)。
[0006] 其他手段例如热水浸溃或使用湿热空气目前正在使用，但它们不是对所有种子都 有作用，并且可能导致一些种子缺陷。
[0007] 化学和物理手段的组合例如化学品的真空浸渗也是已知的。运种技术的目的是使 消毒产品与病原体接近，无论是仍然在种子外面或直接在种子内部。参见例如W094/15448， 其中对栋桐油种子施用真空浸渗（F 1 O O d等G i t a i t i S，R . D .，和Wa 1 C O 11， R.R.2008.Annu.Rev.Phytopathol.,45:371-397;Nagy et 日1)。还参见Docea等，May 1976, Acta Horticulturae, International Symposium Bucharest,58/1977,其中通过真空浸渗 径基哇嘟钟消毒来自西红柿种子的番茄溃瘍病棒状杆菌（Corynebacterium michiganense)O
[000引然而，值得注意的是在所有运些研究中，种子被人为地感染，运与天然感染的种子 有本质区别。事实上，人为感染是对成熟种子进行的，因此通常只是表面污染种子。运样，相 对容易在种子外部实现消毒化学溶液与病原体之间的接触，从而明显有效地消毒人为接种 的种子。然而，西瓜嗜酸菌和其他此类种子携带的病原体的天然感染早在结巧的第一阶段， 即开花阶段已经开始。在运个阶段，感染到达种子内部非常深的部分，该部分之后通过标准 的湿种子消毒无法到达（Dutta,B,Avci ,U,Hahn,M.G. and Walcott R..R..2012.Phytopathology 102/5461-468)0
[0009] 因此，虽然运些各种消毒技术似乎是令人感兴趣的，它们不够有效用于生产商业 品质的种子批，即其中病原体失活的种子批。种子批可能仍然感染，使其滞销或受到警告和 法律免责声明。可能不得不销毁它们，对种子公司或农民造成经济损失。
[0010] 因此，开发用于消毒种子并获得不含感染性病原体的具有商业价值的种子批的新 方法是令人感兴趣的。
[00"] 发明简述
[0012] 本发明的目的通过消毒种子的方法实现，该方法包括：
[0013] a)将种子和消毒液置于真空反应器;其中在步骤b)之前或之后将种子浸入消毒液 中；
[0014] b)施加真空压力；
[0015] C)释放所述真空压力；
[0016] d)重复步骤b-c，至少一次；
[0017] e)将沉没部分的种子与漂浮部分分离，其中所述沉没部分包含经消毒的种子。
[0018] 优选地，重复步骤b-c直到在步骤C中观察不到新的沉没部分。在一个实施方案中， 在每一个步骤b-c循环后收集沉没部分。
[0019] 在另一个实施方案中，步骤a-e进行不超过2小时，优选不超过1小时，更优选不超 过30分钟。在另一个实施方案中，步骤b中施加的真空压力为400-985m己，优选500-980m己， 最优选在400-500和975-985m己之间。在另一个实施方案中，步骤b-c的多个循环随着各循 环中真空压力的增加进行，例如步骤b-c每次循环后真空压力增加 IOOm己。技术人员将测定 真空压力的运些参数，例如施加的最大真空压力可W为975-985m己，真空压力的递增量可 ^为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 210、220、230、240、250、260、270、280、290、300111己及其之间的任意真空压力。并且，递增量 可W是相等的，例如步骤b-c每次循环后真空压力增加50m己，或是不规律的，例如步骤b-c 第一次循环后真空压力增加50m己，第二次步骤b-c后真空压力增加60m己，第S次步骤b-c 后真空压力增加70m己，等。
[0020] 在一个优选的实施方案中，种子来自葫芦科植物，更具体地选自西瓜、甜瓜、南瓜 小果、南瓜、黄瓜和葫芦，或茄科作物，更具体地选自西红柿、辣椒和茄子。在另一个实施方 案中，消毒液可W是杀死任何病原体，例如真菌、细菌、病毒、类病毒、病毒样生物、卵菌纲、 植原体、原生动物和/或线虫的化学剂，例如包含至少0 .!%、〇.2%、0.3%、0.4%、0.5%、 0.75%、1%、1.5%、2%、3%、4%或5%二氯异氯尿酸钢、次氯酸钢或次氯酸巧的溶液。本发 明可有利地应用于天然被病原体感染的种子。"天然被病原体感染的种子"是指种子在植物 中或植物上形成种子期间被病原体感染。此类在种子形成期间感染种子的病原体通常称为 种子携带的病原体。种子携带的病原体的实例是：（i)豆类中的萨氏假单胞菌菜豆致病变种 (Pseudomonas savastanoi pv.Phaseolicola)和地毯草黄单抱菌赤小豆致病变种 (Xanthomonas axonopodis pv.地aseoli),(ii)芸苔属中的甘蓝茎点霉（陆oma Iingam)和 野油菜黄单抱菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris), (iii)胡萝h 中的胡萝H连隔抱菌(Alternaria dauci)、根交链抱霉（Alternaria radicina)、根交链抱 霉（Alternaria radicina)和天竺葵黄单抱菌胡萝^致病变种（Xanthomonas hortorum pv.carotae), (iv)芹菜中的芹菜生壳针抱(Septoria apiicola), (V)野宦中的Acidovorax valerianel Iae , (vi )葫芦中的食酸菌属（Acidovorax spp .)、燕麦嗜酸菌属西瓜亚种 (Acidovorax avenae subsp. citrulli)、小南瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实 斑驳花叶病毒和甜瓜坏死斑点病毒，（Vii)窝宦中的窝宦花叶病毒，（Viii)魏豆中的魏豆种 子携带的花叶病毒、魏豆早褐病毒和魏豆细菌性枯萎病菌（Pseudomonas syringae pv.pisi)，（ix)辣椒中的烟草花叶病毒和黄单抱菌属(Xanthomonas spp. )，（X)西红柿中的 棒状杆菌属（Clavibacter spp.)、密西根棒状杆菌亚种（Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis)、凤果花叶病毒、烟草花叶病毒、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)和 黄单抱菌属。
[0021]本发明还设及用于生产基本上不含病原体，例如不含种子携带的病原体的种子的 方法，包括W下步骤：
[00剖 a.提供种子；
[0023] b.通过应用本发明的消毒方法处理所述种子;和
[0024] C.回收所述经处理的种子作为基本上不含活病原体的种子。
[0025] 本发明进一步设及通过W上生产方法获得或可获得的种子。本发明进一步设及基 本上不含活病原体，例如不含种子携带的病原体的种子，其包含消毒液，例如二氯异氯尿酸 钢、次氯酸钢或次氯酸巧。本发明可有利地应用于选自葫芦科和茄科的种子，更具体的，西 瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜、葫芦、西红柿、辣椒和茄子。
[0026] 在另一个方面，本发明设及包含二氯异氯尿酸钢的溶液用作处理种子的消毒剂。 在一个具体的实施方案中，通过真空浸渗将所述溶液引入种子。在另一个实施方案中，本发 明设及包含二氯异氯尿酸钢的溶液用作处理已经被外部感染的种子的消毒剂。运些溶液包 括，例如至少0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.75%、1%、1.5%、2%、3%、4%或5%的 二氯异氯尿酸钢。
[0027] 还在另一个方面，本发明还设及用于进行本发明消毒方法的设备，包括：
[0028] i.包括腔室的反应器，所述反应器可W被封闭W在所述腔室内施加真空压力；
[0029] ii.用于在所述反应室中施加真空压力的装置；
[0030] iii.用于收集沉没部分的种子的装置；
[0031] iv.用于释放真空压力的装置；
[0032] V.用于将消毒液与收集的沉没部分的种子分离，并将收集的消毒液再次引入反应 室的装置；
[0033] Vi.任选的，用于仅在施加期望的真空压力后将种子引入溶液的装置。
[0034] 发明详述
[0035] 因此，本发明设及基于W下的两步法:第一步是真空浸渗消毒液，进一步通过选择 沉没部分来完成第二步。更具体的，本发明设及消毒种子的方法，包括：
[0036] a)将种子和消毒液置于真空反应器;其中在步骤b)之前或之后将种子浸入消毒液 中；
[0037] b)施加真空压力；
[0038] C)释放所述真空压力；
[0039] d)重复步骤b-c，至少一次；
[0040] e)将沉没部分的种子与漂浮部分分离，其中所述沉没部分包含经消毒的种子。
[0041] 可用根据本发明的方法处理任何类型的种子。例如，种子可包括可用于农学、园艺 或观赏目的的单子叶和双子叶植物的种子。具体的，可用本发明的方法处理的提供种子的 重要植物类别是蔬菜、谷物和草。谷物包括但不限于小麦、小黑麦、大麦、黑麦、水稻和燕麦。 草包括草坪和牧草，例如无芒雀麦、蓝草、高羊茅草坪草和狗牙根草。其他草是热带草，例如 甘薦、玉米、小米和高梁。蔬菜包括茄科植物和葫芦科。茄科种子，例如马铃馨、西红柿、烟 草、茄子和辣椒种子是适于根据本发明的方法处理的种子，十字花科种子也一样，例如花挪 菜、西兰花、甘蓝、羽衣甘蓝和大头菜。其他合适的种子包括胡萝h香菜、甜菜、棉花、果树、 浆果植物的种子和葡萄种子。此外，本发明的方法可用于树例如松、云杉、冷杉、山杨和各种 阔叶树的种子。还可W使用禾本科、豆科和锦葵科的种子。具体地，该方法用于处理chapter 5,International Rules for Seed Testing,International Seed Testing Associat ion, Zurich, Switzer land, 1996 的附件所列的种子。
[0042] 在一个实施方案中，本发明可应用于来自W下的种子：葫芦科，更具体地选自西 瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜和葫芦或茄科，更具体地选自西红柿、辣椒和茄子。优选地， 消毒葫芦科或茄科的种子包括足W使种子基本上不含任何活病原体，例如种子携带的病原 体的消毒液，从而使种子满足检疫规定。
[0043] 优选的，该方法可应用于天然被病原体感染的种子，例如被种子携带的病原体感 染的种子。在葫芦科，更具体的选自西瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜和葫芦的种子的情况 下，最重要的种子携带的细菌感染由嗜酸菌属(Acidovorax)引起，更具体地由西瓜嗜酸菌 引起;最重要的种子携带的病毒感染由烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的种引起，更具体地 由黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)或黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)引起。对于茄科，更具体 地选自西红柿、辣椒和茄子的种子，最重要的种子携带的细菌感染由棒状杆菌属 (Clav化acter)引起，更具体地由番茄溃瘍病棒状杆菌引起，甚至更具体地由密西根棒状杆 菌亚种、假单胞菌属和黄单抱菌属引起;最重要的种子携带的病毒感染由TMV、化pMVP引起。 类病毒也可W引起感染。
[0044] 在一些实施方案中，根据本发明的方法允许生产其中至少90、95、96、97、98、99或 100%的种子被消毒的种子批。在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法允许生产 其中100%的种子被消毒的种子批。
[0045] 在一些实施方案中，根据本发明的方法允许生产消毒种子而不影响它们的发芽质 量。在一些实施方案中，所得的消毒种子具有至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99或100%的发芽率。在一个特别优选的实施方案中，所得的消毒种子具有100% 的发芽率。换言之，根据本发明的方法允许生产其中至少90、95、96、97、98、99或100 %的消 毒种子发芽的种子批。在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法允许生产其中 100%的消毒种子发芽的种子批。
[0046] 真空浸渗步骤
[0047] 本发明方法中的真空浸渗步骤旨在将消毒液中包含的消毒剂渗透入种子。它通过 W下进行:施加真空W从种子组织空间中除去空气，将种子与消毒液接触(通过浸入），并释 放真空。在第一个实施方案中，将待处理的种子在施加真空压力之前浸入消毒液。不希望被 任何理论所限制，据信种子中的自由空间被消毒液填满。
[004引可W将施加于被消毒液浸没的种子的初始真空压力设置为400-500和975-985m己 之间，例如500m己-700m己或700-820m己，还例如576m己-66?己或740-816m己。优选地，真 空步骤通过首先施加400-700m己，优选400-600m己的真空压力来进行。然后立即释放真空 或在1秒-5分钟之后，优选少于2分钟的真空期之后，优选少于1分钟释放真空。技术人员根 据种子类型和种子数量及其他将容易确定运些时间和真空压力的参数。
[0049] 当引入消毒液，优选水溶液时，部分或全部种子开始可W是漂浮的。不希望被任何 理论所限制，据信在每次真空/去真空的循环步骤中，压力差异迫使溶液进入种子组织中去 除空气的空间，运使种子下沉。由于溶液包含消毒产品，溶液渗透进入由真空清除的种子空 气空间可W改进溶液和病原体表面的接触，并提高消毒处理的效率。该真空/去真空的循环 步骤通常重复至少一次W增加该方法的效率。优选地，重复该步骤直到在释放真空压力后 不再观察到新的沉没部分。如本文所用，"沉没部分"是指密度大于水或水溶液的种子部分。
[0050] 当重复真空/去真空的循环时，有利地，真空压力在每个循环增加，例如，真空压力 在每个真空/去真空循环后增加 IOOm己。技术人员将确定真空压力的运些参数，例如待施加 的最大真空压力可W是975-985m己，且真空压力的递增量可W为10、20、30、40、50、60、70、 80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、 270、280、290、300111己及其之间的任意真空压力。并且，递增量可^是相等的，例如步骤13-〇 每次循环后真空压力增加50m己，或是不规律的，例如步骤b-c第一次循环后真空压力增加 50m己，第二次步骤b-c后真空压力增加60m己，第S次步骤b-c后真空压力增加70m己等。
[0051] 确定特定的真空压力和每个真空/去真空步骤的时机W获得种子的两个部分，一 个沉没部分和一个漂浮部分。技术人员将确定获得足够量的沉没种子的具体条件，优选在 最短时间内。
[0052] 通常，将约Ikg当量的种子浸入5-10升消毒液例如二氯异氯尿酸钢，如0.1%二氯 异氯尿酸、0.1 %次氯酸钢或0.1 %次氯酸巧中，并首先施加压力为400-700m己，优选400-600m己的真空压力，然后在少于2分钟，优选1分钟的时间之后释放真空压力，并再次施加真 空压力，优选W增加的真空压力，例如直到真空压力达到在含水溶液的密闭空间中可能的 最大水平，即975-985m己。
[0053] 如本文所用，术语"消毒液"是指杀死有害生物例如任何病原体的包含消毒剂例如 化学剂的任何溶液。溶液优选是水溶液。任何已知的杀真菌剂和杀菌剂，例如抗生素、抗菌 剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原虫剂和抗寄生生物剂和其他用于植物材料优选种子的消毒剂 可用于本发明的方法。消毒剂的实例包括但不限于漠、氯、亚氯酸盐、舰、过氧化氨、高儘酸 钟、盐酸、过乙酸、过氧乙酸、硫酸、憐酸、甲醒、戊二醒、氨氧化钢、苯酪、过氧单硫酸醋、=憐 酸钢、季锭盐、银和铜(离子或盐）、舰、漠、=氯生等。在一个优选的实施方案中，消毒液包含 基于氯的消毒剂，例如二氯异氯尿酸钢、次氯酸钢或次氯酸巧。在一个优选的实施方案中， 消毒液包含二氯异氯尿酸钢作为消毒剂，其已知用于保持花瓶里的插瓶花。在另一个优选 的实施方案中，消毒液包含次氯酸钢或次氯酸巧作为消毒剂。优选的，消毒液是具有至少 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.75%、1%、1.5%、2%、3%、4%或 5%二氯异氯尿酸 钢、次氯酸钢或次氯酸巧的水溶液。优选的，消毒液是具有〇.1%-2%、优选0.25%-2.5%、 还优选0.5 % -2 %二氯异氯尿酸钢、次氯酸钢或次氯酸巧的水溶液。
[0054] 替代的真空浸渗步骤
[0055] 在本发明方法的真空浸渗步骤的第二个实施方案中，将种子和消毒液置于真空反 应器中，但在施加真空压力前，种子不与消毒液接触。例如，在施加真空压力前，可W将种子 保持在反应室中的消毒液上方的篮子中。然后降低篮子使种子浸入消毒液中。
[0056] 方法的其他部分如第一个实施方案所述的进行。
[0057] 通常，将约Ikg当量的种子放在消毒液上方的篮子中，施加压力为400-700m己，优 选400-600m己的真空压力，然后将种子浸入5-10升消毒液中，例如二氯异氯尿酸钢、次氯酸 钢或次氯酸巧，如0.1 %二氯异氯尿酸钢、0.1 %次氯酸钢或0.1 %次氯酸巧，然后在少于2分 钟，优选1分钟的时间之后释放真空压力，并再次施加真空压力，优选W增加的真空压力。 [00 5引选择步骤
[0059] 发明人的功劳在于已经意识到，经处理种子的下沉行为实际上反应了消毒液渗透 进入种子材料的程度，并提供方便的手段W观察消毒过程的效率，并从未处理种子中分炼 出经处理的种子。
[0060] 因此，该方法的第二个步骤旨在通过丢弃真空浸渗步骤后仍然漂浮的种子部分 和/或通过收集沉没部分来将仍然漂浮的种子部分与沉没的种子部分分离。实际上认为漂 浮种子没有吸收足够量的消毒液，因此仍然存在剩余病原体的卫生风险。此外，收集沉没部 分或丢弃漂浮部分出乎意料地似乎对总体上种子批的发芽质量有益，从而允许生产其中至 少90、95、96、97、98、99或100%的种子被消毒的种子批，更优选允许生产其中100%的种子 被消毒的种子批。在一些实施方案中，沉没部分包含至少90、95、96、97、98、99或100%的消 毒种子，更优选100%的消毒种子。在一些实施方案中，沉没部分的种子的发芽率为至少85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。在一个特别优选的实施方案中， 沉没部分的种子的发芽率为100%。
[0061] 可W在每个真空/去真空循环后或在方法结束时收集沉没部分。对于一些种子，沉 没部分可能是仅有的部分，即没有漂浮部分的种子。
[0062] 在本发明的第二个步骤中，漂浮部分的分离优选是快速的，通常在几分钟内，例如 1秒至5分钟，例如少于2分钟，优选少于1分钟。优选地，本发明的方法不包含任何的浸泡步 骤，例如W094/15448中所述的那些浸泡步骤，尤其它不包含任何超过12小时的浸泡步骤。
[0063] 有利地，整个方法从浸没种子到收集种子优选不超过2小时，优选甚至不超过1小 时，更优选不超过30分钟。
[0064] 收集后，可W洗涂并干燥种子。可W进一步用其他的用于种子净化或保护的处理 来处理种子。例如，可W通过包衣、造粒或包膜应用其他常规的种子处理，尤其为了防止种 子或植株损坏，包括但不限于杀真菌剂或杀虫剂处理。
[0065] 用于产生基本上不含活病原体的种子的方法
[0066] 在第二个方面，本发明提供用于产生基本上不含活病原体，例如不含活的种子携 带的病原体的种子的方法，包括W下步骤：
[0067] a)提供种子；
[0068] b)通过应用本发明的消毒方法处理所述种子，和
[0069] C)回收所述经处理的种子作为基本上不含活病原体的种子。如本文所用，"基本上 不含病原体"或"基本上不含活病原体"的种子是在发芽后，在无菌环境中将不会发展任何 感染病的种子。在一个实施方案中，"基本上不含病原体"或"基本上不含活病原体"（两者可 互换使用）的种子是不包含任何活形式或感染形式的W下感染因子的种子:真菌、细菌、病 毒、类病毒、病毒样生物、卵菌纲、植原体、原生动物和/或线虫。所述方法通常包括（i)提供 种子；（ii)通过应用本发明的消毒方法处理所述种子，和（iii)回收所述经处理的种子作为 基本上不含活病原体的种子。在一些实施方案中，通过该方法产生的种子"基本上不含活的 种子携带的病原体"或"基本上不含种子携带的病原体"。
[0070] 通过该生产方法获得或可获得的种子的特征在于：（i)它们基本上不含活病原体， 和(i i)它们包含消毒液，例如二氯异氯尿酸钢、次氯酸钢或次氯酸巧。
[0071] 因此，本发明设及基本上不含活病原体且包含消毒液，例如二氯异氯尿酸钢、次氯 酸钢或次氯酸巧的种子。优选地，此类种子选自葫芦科和茄科，更具体的西瓜、甜瓜、南瓜小 果、南瓜、黄瓜、葫芦西红柿、辣椒和茄子。
[0072] 本发明还设及二氯异氯尿酸钢作为消毒剂W处理种子的用途。在一个实施方案 中，通过真空浸渗将所述二氯异氯尿酸钢引入种子中，例如W至少〇.!%、〇.4%、0.75%、 1%、1.5%、2%、3%、4% 或 5% 的浓度。
[0073] 发明人的功劳还在于已经意识到，目前已知用来保持花瓶中的插瓶花的二氯异氯 尿酸钢可用来消毒种子。并且，与目前已知的所有其他消毒液相反，二氯异氯尿酸钢保持， 并在某些情况下甚至提高种子的发芽质量。
[0074] 用于进行本发明方法的设备
[0075] 本发明还设及用于进行本发明方法的设备。
[0076] 在一个实施方案中，用于进行本发明消毒方法的设备包含：
[0077] i.包括腔室的反应器，所述反应器可W被封闭W在内部施加真空压力；
[0078] ii.用于收集沉没部分的种子的装置；
[0079] iii.用于在所述反应室中施加真空压力的装置；
[0080] iv.用于释放真空压力的装置；
[0081] V.任选的，用于将消毒液与收集的沉没部分的种子分离，并将收集的消毒液再次 引入反应室的装置；
[0082] Vi.任选的，用于在施加期望的真空压力后将种子引入溶液的装置。
[0083] 图1示出了根据本发明的反应器的一个实例。
[0084] 设备的反应器(1)可W是具有腔室(2)的任何反应器，所述腔室用于包含浸没在消 毒液中的种子且抗真空(也称为真空室）。通常，它可W由有机玻璃或抗真空压力的其他材 料制成，优选透明的，用于观察过程中种子的行为(下沉或漂浮）。例如，在70L有机玻璃反应 器中，反应室可W包含10-50升体积的消毒液和种子。
[0085] 反应器可W包含盖(3)，优选在其上部，所述盖可W打开W引入种子和/或消毒液， 且可W密封关闭W允许在反应室中施加真空压力。
[0086] 设备可W进一步包含例如在反应器上侧与盖相连的真空管(4)和在反应室内施加 真空压力的真空累巧）。有利地，反应器进一步包含压力计(7)和/或用于控制反应室内真空 压力的装置和/或用于释放真空的装置(6)。或者，可W通过使用滤器或通过旋转腔室并将 漂浮种子从容器上部排到另一个容器来从溶液上部收集漂浮部分。
[0087] 反应器优选升高的，例如具有支架（11)并包含例如在其下部的用于排出沉没部分 的种子的出口阀（8)和收集沉没部分的种子的收集器(9)，所述收集器例如置于反应室下 方。收集器可W包括带多孔壁(或半透）的容器从而将种子保留在容器中，且收集的消毒液 可W从容器中排出。有利地，设备进一步包含用于从收集器中提取所收集的消毒液并将其 再次引入反应室的装置(1〇)(例如用管道或累）。
[0088] 在特定的实施方案中，真空管(4)还可进一步包含夹子。
[0089] 本发明的特定实施方案将在W下实施例中说明。
【具体实施方式】
[0090] 实施例1:消毒天然被细菌性果斑病感染的西瓜种子：
[0091] 细菌性果斑病(BFB)是由细菌西瓜嗜酸菌引起的疾病，其对于农民是毁灭性的，因 为果实损失可W达到超过90%的田间生产。根据Walcott, R.R.2005.The Plant胎alth Inshuctor. DOI: 10.1094/PHI-I-2005-1025-02-http : //Vww. apsnet. org/edcenter/ in1:;ropp/lessons/p;rokaryotes/F*ages/Bacte;rialBlotch. aspx.，细菌性果斑病（BFB)影响 所有生长阶段的叶子和大量葫芦科宿主的果实。在种植后5-8天，可W首先在葫芦科幼苗子 叶的底面观察到例如水浸的症状。与BFB相关的病变外观油腻，且在干燥条件下（例如在午 后可W观察到)也存在。水浸病开始时是离散的斑点，但然后凝聚并沿着子叶的脉延伸。它 们最终变干，在子叶叶脉上并沿着子叶叶脉形成延长的、深色至红栋色的病变。相似症状出 现在甜瓜和其他葫芦科幼苗上。在成熟的西瓜叶上，不同的深色至红栋色的病变沿着叶脉 发展。疾病的果腐期造成经济损失。实际上，西瓜果实的WB症状刚好在收获成熟期之前出 现，在果实的上表面表现为小的（直径<1毫米）、形状不规则的、橄揽色的斑点。运些病变尽 管初始较小，但可W扩散并覆盖果实的整个上表面。在感染早期，运些病变是固定的，很少 渗透进入果肉。在果皮病变中可能发生栋色裂缝。在后期，由于被二次殖民生物入侵，果实 腐烂成稀腐。
[0092] 在生产中WB侵染的管理极为困难。优选地，仅在没有任何WB存在记录的地区W 田间轮作方式产生种子。根据Walcott,"no chemical or 地ysical seed treatments are 100%effective at eradicating A.avenae subsp.Cihulli"。尽管包括热疗、化OCl、发 酵、HCl和过乙酸的种子处理显著降低BFB的幼苗传播，它们会对种子生理产生不利影响。影 响种子处理效率的两个因素是：1)种子处理无力渗透种皮，和2)在种子上/内的细菌位置。 由于在移植中发生BFB的风险，具有较低水平侵染的种子的存放较高，仅种子处理不能控制 BFB。
[0093] 因此，目前为止，据信化学疾病管理和种子健康测试作用有限:尽管可能检测严重 侵染的种子批，鉴定具有低侵染的批很困难。
[0094] 通常，种子公司每个种子批测试30000-50000粒种子(Gitaitis,R.D.，和Walcott, R.R. 2008. Annu. Rev. Phytopathol. ,45:3 71-397),运在时间和财政上是巨大负担，因为当 30000或50000粒种子中没有一例测试为阳性时，种子批可W被接受。即使用运样大的样品， 种子公司和种植者仍然面临危险，因为种子批可能W在50000粒种子样品中不可检测的低 水平感染。
[00M]在本发明中，从商业种子批中获得0.化g西瓜种子，其在田间生产中天然被BFB感 染。在1.0%二氯异氯尿酸钢的标准消毒过程后，它们仍然是感染的。将具有标准水分含量 5.5-7.5 %的干燥种子与包含0.2 %二氯异氯尿酸钢的1.0升消毒液一起置于10升玻璃容器 中。施加真空压力，升至约500m己，然后释放。重复该真空/去真空过程，每次增加真空压力 约loom己，达到约975-985m己的最大可达到的真空压力。该过程导致在容器中形成两个种 子部分:一个沉没部分和一个漂浮部分。收集漂浮部分的种子，并对其再次施加真空过程。 继续真空循环直到漂浮种子不再下沉。然后取出并丢弃漂浮种子。运个过程需要20-30分 钟。
[0096] 然后用自来水洗涂沉没的种子10分钟，并干燥。运些种子已经消毒BFB。它们可进 一步容易鉴别，因为种子内部仍然包含消毒产品的痕迹。
[0097] 测试了4200粒种子，用汗盒法(sweat box assay)发现BFB阴性(参见W下参照）。
[0098] 实施例2:消毒天然被细菌性果斑病感染的甜瓜种子：
[0099] 将被WB天然感染的49kg甜瓜种子通过标准消毒程序（1%和2%浓度的二氯异氯 尿酸钢;持续时间：10分钟;冲洗10分钟)消毒两次。然后测试经消毒种子的BFB，发现仍然严 重被侵染。
[0100] 将4.化g运种种子批与20升包含0.5%二氯异氯尿酸钢的消毒液一起置于70升反 应器中（如图1所示）。
[0101] 施加真空，升至约500m己，然后释放。重复该真空/去真空过程，每次增加真空压力 约IOOm己，达到约975-985m己的最大可达到的真空压力。该过程导致在容器中形成两个种 子部分:一个沉没部分和一个漂浮部分。继续真空循环直到漂浮种子不再下沉。然后取出并 丢弃漂浮种子。运个过程需要20-30分钟。
[0102] 然后用自来水洗涂沉没的种子10分钟，并干燥。运些具有商业价值的种子批已经 消毒BFB。它们可进一步容易鉴别，因为种子内部仍然包含消毒产品的痕迹。
[0103] 在49kg中，消毒部分代表48kg的种子。为测试消毒过程，如下对40000粒种子进行 健康测试：
[0104] 根据USDA国家种子健康系统化1.2Seminis Inc.PCR-Wash方法用聚合酶链式反应 (PCR)分析测试10000粒种子。可W从国家种子健康系统获得标准程序，其是由USDA-APHIS 批准且由爱荷华州立大学种子科学中屯、注册的授权个人和公共实体来进行支持对国际种 子运输颁发联邦植物检疫证书所需的某些活动的程序。参见"Vegetable Crop Method-Reference Manual B" ,2014 年 5 月版，第 56 页。
[01 化]可从ht1:p: //www. see化ealth. org/f iles/p壯A/egetable_Crops. pdf获取国家种 子健康系统。
[0106] 根据已知的且可W从国家种子健康系统获得的USDA国家种子健康系统化1.1幼苗 生长法，用幼苗生产分析测试20000粒种子。
[0107] 通过与之前的生长分析相似的汗盒法测试10000粒种子，其中将种子播种在生长 室条件适于发展疾病的封闭容器中。然后用与生长法相似的方法测试幼苗。
[0108] 没有发现一粒种子被感染，相反，漂浮部分为约Ikg且测试为BFB阳性（10000粒种 子的汗盒法）。
[0109] 在第4&7天计数发芽，结果是重的部分为99%/99%，漂浮部分为96%/92% (根据 chapter 5,International Rules for Seed Testing, International Seed Testing Association,Zu;rich,Switze;rland, 1996的附件的发芽测试）。
[0110] 实施例3:消毒天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)感染的黄瓜种子：
[0111] 在本实施例中，从商业种子批获得黄瓜种子，其在田间生产中天然被CGMMV感染。
[0112] 用标准方法和真空浸渗法消毒种子。在本实施例中，从开始施加最大压力为975-985m己的真空。该过程导致在容器中形成两个种子部分:一个沉没部分和一个漂浮部分。继 续真空循环直到漂浮种子不再下沉。然后取出并丢弃漂浮种子。运个过程需要15-20分钟。
[0113] 在本实施例中使用两种化学物。标准消毒(A)和真空浸渗(B)的10%=憐酸钢，和 标准消毒(C)和真空浸渗(D)的0.4%二氯异氯尿酸钢。参见表1的CGMMV ELISA分析结果和 发牙结果。
[0114] 我们还测试了通过真空浸渗施加的不同浓度的二氯异氯尿酸钢对CGMMV和发芽的 影响（表1I)。处理E是未处理对照;处理F是真空浸渗0.75%二氯异氯尿酸钢;处理G是真空 浸渗1.5 %二氯异氯尿酸钢;处理H是真空浸渗2.0 %二氯异氯尿酸钢。
[0115] 表1:ELISA分析测试的CGMMV感染
[0117] 表1I: ELISA分析测试的CGMMV感染
[0120] 根据chapter 7: seed health testing methods ； International Seed Testing Association, Zurich, Switzerland, 2010的附件中的种子测试的国际规则的方法7-026通 过化ISA分析测试CGMMV。
[0121] 根据chapter 5, International Rules for Seed Testing, International Seed Testing Association,Zurich,Switzerland, 1996的附件进行发芽测试。
[0122] 实施例4:消毒天然被烟草花叶病毒(ToMV)感染的西红柿种子
[0123] 从商业种子批获得西红柿种子，其在田间生产中天然被ToMV感染。将种子批预先 用标准方法消毒3次，没有成功(对照）。
[0124] 在本实施例中，通过真空浸渗方法用4升2%Virkon(50%过氧单硫酸钟、5%氨基 横酸和15%烷基苯横酸钢。Virkon是USA的杜邦子公司Antec国际有限公司的注册商标）消 毒30克干燥种子。
[0125]将种子置于密闭室中消毒液上方的穿孔篮中，施加真空。W约975-985m己的最大 可达到的真空压力施加真空压力，然后将种子浸入溶液并释放真空。重复真空/去真空循环 4次，最后所有种子沉没。收集种子，冲洗5分钟并干燥。结果:在所有西红柿种子批中，ToMV 水平降至对照水平的〇%(参见表1II)。一个种子批的发芽水平增加2%，其他种子批的发芽 水平降低5%。
[01 巧]在ISHI规则下测试ToMVQnternational Seed Health Initiative,参见Qiapter 7:Seed Health Testing Methods 7-028:Detection of infectious tobamoviruses on Lycopersicon escuIenturn(tomato)by the local lesion assay(indexing)on Nicotiana tabacum plants ,p 1-10的附件，由The International Seed Testing Association!； ISTA)Zi jrichstr. 50发表,CH-8303Bassersdorf, Switzerland. January I, 2013)。
[01巧]根据AOSA规则测试种子进行发芽测试（Volume I Principles and Procedures, Table 6A. Methods of testing laboratory germination ,p.6-55, So Ianumn Iycopersicum var.lycopersicum(tomato),由Association of Official Seed Analyst' S(AOSA)发表 160152nd Avenue, Suite I,Moline, IL 61265 USA,October 1,2012)。
[0130] 实施例5:标准二氯异氯尿酸钢消毒(外洗）：
[0131] 种:甜瓜或西瓜
[0132] 方法:将IOkg种子添加至45升1%或2%的二氯异氯尿酸钢中。将种子在溶液中混 合30分钟，然后用自来水洗涂10分钟，然后干燥至原来的水含量。
[0133] 实施例6:通过降低的真空压力消毒天然被细菌性果斑病感染的甜瓜种子
[0134] 如实施例5所述，将天然被BFB感染的甜瓜种子用标准消毒程序消毒2次，发现其仍 然被BFB感染。
[0135] 将=批Ikg的该种子批与3.0升包含1.0%二氯异氯尿酸钢的消毒液一起置于10升 玻璃容器中。W=个不同水平施加30次真空/去真空循环(每个循环持续1-1.5分钟）：（i)水 平八:完全真空至975-98 5，。1)水平8:中等水平740-816111己，和。11)水平(：:低水平的576-667m己。40分钟之后（即实现30次真空/去真空循环之后），丢弃漂浮部分，收集沉没部分，洗 涂40分钟并干燥。
[0136] 测试各处理水平(A、B、C)的5000粒种子，用聚合酶链式反应(PCR)根据USDA国家种 子健康系统饥1.4孟山都改进的PCR方法发现WB阴性。可W从国家种子健康系统获得标准 程序，其是由USDA-APHIS批准且由爱荷华州立大学种子科学中屯、注册的授权个人和公共实 体来进行支持对国际种子运输颁发联邦植物检疫证书所需的某些活动的程序。参见可从 http: //www. seedhealth. org/f iles/pdf A/egetable_Crops. pdf 获得的"Vegetable Crop Method-Reference Manual B"国家种子健康系统，2014年5月版，第56页。
[0137] 实施例7:消毒天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)感染的西瓜种子：
[0138] 从在田间生产中天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV)感染的商业种子批获得 0.150kg西瓜种子。将该样品与0.5升包含0.2%二氯异氯尿酸钢的消毒液一起置于1升玻璃 容器中。施加真空，升至约700m己，然后释放。重复该真空/去真空过程，每次增加真空压力 约50m己，达到约985m己的最大真空压力。该过程持续40分钟，然后收集沉没部分。测试2000 粒种子的CGMMV，根据chapter 7(参见health testing methods; International Seed Testing Associat ion, Zurich, Switzer land, 2010)的附件中种子测试的国际规则的7-026 方法用化ISA分析发现阴性。
[0139] 实施例8:使用化(C10)2处理消毒天然被CMM(密西根棒状杆菌亚种)感染的西红柿 种子
[0140] 从在田间生产中天然被CMM感染的商业种子批获得西红柿种子。如下文所述，通过 真空浸渗(VI)方法用4升1%次氯酸巧进行真空处理。将种子置于密闭室中消毒液上方的穿 孔篮中，施加真空。W约975-985m己的最大可达到的真空压力施加真空压力，然后将种子浸 入溶液并释放真空。重复真空/去真空循环4次，最后所有种子沉没。收集种子，冲洗5分钟并 干燥。在VI处理1小时后或不用VI处理，在相同溶液中进行浸泡处理。
[0141] 根据 Association of Of f icial Seed Analysts(AOSA) (http :// www.aosaseed. com/)进行发芽测j 试。
[0142] 采用可在网址 ht1:p ://www. worldseed. o;rg//isfyishi_vegetable .html发现的根 据国际种子联盟（ISF)种子健康方法手册的"用于检测西红柿种子上密西根棒状杆菌亚种 的方法"获得密西根棒状杆菌亚种的感染结果。
[0143] 所有结果示于下表1V。
[0146] VI:真空浸渗，EN:能量=在毛巾卷中种植后第5天获取的早期发芽计数，OG:最佳 发芽=在毛巾卷中种植后第14天的发芽计数，UT:可用移植=种在溫室中的盘里。认为对商 业种植者而言可用的幼苗计数，UNIF:平均移植化NIF):种在溫室中的盘里。认为大小平均 的幼苗计数。
[0147] 实施例9:消毒天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)感染的黄瓜种子：
[014引在本实施例中，处理天然被CGMMV感染的商业黄瓜种子(2kg)。将感染种子置于包 含20升的1.33%二氯异氯尿酸钢的反应器中。从500m己开始，逐渐施加真空/去真空循环 (即真空浸渗），每个循环增加50m己，直到最大985m己。然后，我们W985m己的最大真空压力 继续真空/去真空循环，总共30次循环。该过程导致在容器中形成两个种子部分:一个沉没 部分和一个漂浮部分。分别收集两个部分。该过程需要45分钟。根据chapter 7: seed health testing methods；International Seed Testing Association,Zurich , Swi tzer land，2010的附件中种子测试国际规则的7-026方法用化ISA分析测试CGMMV。
[0149] 在24°C解育箱的培养皿(TOP)上进行发芽测试，出苗后第4天计数根突(4d的TOP)。
[0150] 结果示于下表V。
[0153] VI:真空浸渗
[0154] 实施例10:消毒天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)感染的黄瓜种子：
[01W]用标准消毒或真空浸渗方法处理在田间生产中天然被CGMMV感染的两种商业黄瓜 种子样品。将1500粒种子在300ml溶液中进行所有处理40分钟，然后用自来水洗涂40分钟。 对于标准消毒，我们使用2.5%二氯异氯尿酸钢溶液，对于真空浸渗，我们使用包含1.5%二 氯异氯尿酸钢的溶液。从500m己开始，逐渐施加真空/去真空循环，每个循环增加 IOOrn己，直 到最大985m己。然后，我们W985m己的最大真空压力继续真空/去真空循环，总共30次循环。 在处理结束时，丢弃漂浮种子，收集重的部分，洗涂并干燥用于测试。
[0156] 根据chapter 7: seed health testing methods ； International Seed Testing Associat ion, Zurich, Switzer land, 2010的附件中种子测试国际规则的7-026方法用ElLISA 分析测试CGMMV。在24°C解育箱的培养皿(TOP)上进行发芽测试，出苗后第4天计数根突(4d 的TOP)。结果不于下表VI。
[0157] 表VI [015 引
【主权项】
1. 消毒种子的方法，包括： a) 将种子和消毒液置于真空反应器中；其中在步骤b)之前或之后将种子浸入消毒液 中； b) 施加真空压力； c) 释放所述真空压力； d) 重复步骤b-c，至少一次； e) 将沉没部分的种子与漂浮部分分离，其中所述沉没部分包含经消毒的种子。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b-c的每次循环后收集所述沉没部分。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤a-e进行不超过2小时，优选不超过1小时， 更优选不超过30分钟。4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中在步骤b施加的真空压力为400-985m巴。5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤b和c在适于获得两个部分种子，一个 沉没部分和一个漂浮部分的条件下进行。6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中进行多次步骤b-c循环，每个循环增加真 空压力，例如步骤b-c的每次循环后真空压力增加100m巴。7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述种子来自： (i)萌芦科，更具体地选自西瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜和萌芦;或(ii)茄科，更具体地选自西红柿、辣椒和茄子。8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述消毒液是包含二氯异氰尿酸钠的溶 液，例如，包含至少0.1 %二氯异氰尿酸钠的溶液。9. 根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述种子天然被病原体感染。10. 用于生产基本上不含活病原体的种子的方法，包括以下步骤： a) 提供种子； b) 通过应用权利要求1-9任一项所述的消毒方法处理所述种子;和 c) 回收所述经处理的种子作为基本上不含活病原体的种子。11. 可通过权利要求10所述的方法获得的种子。12. 基本上不含活病原体的包含二氯异氰尿酸钠的种子。13. 权利要求12所述的种子，选自萌芦科和茄科，更具体地，西瓜、甜瓜、南瓜小果、南 瓜、黄瓜、萌芦、西红柿、辣椒和茄子。14. 包含二氯异氰尿酸钠的溶液作为消毒剂来处理种子的用途。15. 权利要求14所述的用途，其中所述消毒剂通过真空浸渗引入所述种子。16. 根据权利要求14-15任一项所述的用途，其中所述溶液是包含二氯异氰尿酸钠的溶 液，例如，包含至少0.1 %二氯异氰尿酸钠的溶液。17. 用于进行权利要求1-9任一项所述的方法的设备，包括： a) 具有腔室的反应器，所述反应器可以被封闭以在内部施加真空压力； b) 用于收集沉没部分的种子的装置； c) 用于在所述反应室中施加真空压力的装置； d) 用于释放真空压力的装置； e) 任选的，用于将消毒液与收集的沉没部分的种子分离，并将收集的消毒液再次引入 反应室的装置； f)任选的，用于仅在施加期望的真空压力后将种子引入所述溶液的装置。
【专利摘要】本发明涉及植物材料，尤其是种子的处理。该方法使用真空压力来消毒种子中的病原体。种子消毒很重要，因为被病原体感染的种子可以使其繁殖，并导致作物高损失。该方法适用于来自葫芦科的种子，具体地是西瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜和葫芦，但也适于来自茄科的种子，具体地是西红柿、辣椒和茄子。
【IPC分类】A01C1/08
【公开号】CN105491873
【申请号】CN201480046975
【发明人】A·奥勒辛斯基, K·库比克
【申请人】维尔莫林公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月3日
【公告号】EP3016493A1, US20160174557, WO2015001043A1
【技术领域】
[0001] 本发明设及种子处理。该方法利用真空压力来消毒种子的病原体，例如真菌、细 菌、病毒、类病毒、病毒样生物、卵菌纲、植原体、原生动物、线虫等。该方法适用于例如来自 葫芦科植物，尤其是西瓜、甜瓜、南瓜小果(squash)、南瓜、黄瓜和葫芦的种子或来自茄科植 物，尤其是西红柿、辣椒和茄子的种子。
【背景技术】
[0002] 种子携带的病原体每年造成重大经济损失。具体地，它们降低作物产量、使其质量 下降，并让蔬菜胆藏变得更加困难。因此，对于耕种者，有必要收到不含病原体的种子，因为 在耕种季节期间控制很难实现。
[0003] 通常，种子经过各种处理W杀死种子上存在的病原体，从而避免病原体从种子到 待种植作物的传播，并防止对种子本身的伤害。运种处理也可W增加种子的胆藏期。运对用 于播种的种子和可能在发芽后适于消费或工业加工的种子均适用。对于发芽过程开始后用 于繁殖或用于消费或工业加工的种子，理论上保存发芽能力或酶活性至关重要。
[0004] 种子消毒需要消除外部和内部的种子携带的疾病而不负面影响种子特征，例如存 活力、发芽和出苗速度W及植物的最后高度。可W通过从化学到物理技术的各种技术进行 种子消毒。
[0005] 化学产品例如过氧乙酸、盐酸或次氯酸钢可W降低例如种子携带的西瓜嗜酸菌 (Acidovorax Citrulli)接种，但它们通常不能从已经感染的种子中消除细菌(Dutta,B， Avci,U,Hahn,M.G.和Walcott R.R.2012.Phytopathology 102/5461-468)。
[0006] 其他手段例如热水浸溃或使用湿热空气目前正在使用，但它们不是对所有种子都 有作用，并且可能导致一些种子缺陷。
[0007] 化学和物理手段的组合例如化学品的真空浸渗也是已知的。运种技术的目的是使 消毒产品与病原体接近，无论是仍然在种子外面或直接在种子内部。参见例如W094/15448， 其中对栋桐油种子施用真空浸渗（F 1 O O d等G i t a i t i S，R . D .，和Wa 1 C O 11， R.R.2008.Annu.Rev.Phytopathol.,45:371-397;Nagy et 日1)。还参见Docea等，May 1976, Acta Horticulturae, International Symposium Bucharest,58/1977,其中通过真空浸渗 径基哇嘟钟消毒来自西红柿种子的番茄溃瘍病棒状杆菌（Corynebacterium michiganense)O
[000引然而，值得注意的是在所有运些研究中，种子被人为地感染，运与天然感染的种子 有本质区别。事实上，人为感染是对成熟种子进行的，因此通常只是表面污染种子。运样，相 对容易在种子外部实现消毒化学溶液与病原体之间的接触，从而明显有效地消毒人为接种 的种子。然而，西瓜嗜酸菌和其他此类种子携带的病原体的天然感染早在结巧的第一阶段， 即开花阶段已经开始。在运个阶段，感染到达种子内部非常深的部分，该部分之后通过标准 的湿种子消毒无法到达（Dutta,B,Avci ,U,Hahn,M.G. and Walcott R..R..2012.Phytopathology 102/5461-468)0
[0009] 因此，虽然运些各种消毒技术似乎是令人感兴趣的，它们不够有效用于生产商业 品质的种子批，即其中病原体失活的种子批。种子批可能仍然感染，使其滞销或受到警告和 法律免责声明。可能不得不销毁它们，对种子公司或农民造成经济损失。
[0010] 因此，开发用于消毒种子并获得不含感染性病原体的具有商业价值的种子批的新 方法是令人感兴趣的。
[00"] 发明简述
[0012] 本发明的目的通过消毒种子的方法实现，该方法包括：
[0013] a)将种子和消毒液置于真空反应器;其中在步骤b)之前或之后将种子浸入消毒液 中；
[0014] b)施加真空压力；
[0015] C)释放所述真空压力；
[0016] d)重复步骤b-c，至少一次；
[0017] e)将沉没部分的种子与漂浮部分分离，其中所述沉没部分包含经消毒的种子。
[0018] 优选地，重复步骤b-c直到在步骤C中观察不到新的沉没部分。在一个实施方案中， 在每一个步骤b-c循环后收集沉没部分。
[0019] 在另一个实施方案中，步骤a-e进行不超过2小时，优选不超过1小时，更优选不超 过30分钟。在另一个实施方案中，步骤b中施加的真空压力为400-985m己，优选500-980m己， 最优选在400-500和975-985m己之间。在另一个实施方案中，步骤b-c的多个循环随着各循 环中真空压力的增加进行，例如步骤b-c每次循环后真空压力增加 IOOm己。技术人员将测定 真空压力的运些参数，例如施加的最大真空压力可W为975-985m己，真空压力的递增量可 ^为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、 210、220、230、240、250、260、270、280、290、300111己及其之间的任意真空压力。并且，递增量 可W是相等的，例如步骤b-c每次循环后真空压力增加50m己，或是不规律的，例如步骤b-c 第一次循环后真空压力增加50m己，第二次步骤b-c后真空压力增加60m己，第S次步骤b-c 后真空压力增加70m己，等。
[0020] 在一个优选的实施方案中，种子来自葫芦科植物，更具体地选自西瓜、甜瓜、南瓜 小果、南瓜、黄瓜和葫芦，或茄科作物，更具体地选自西红柿、辣椒和茄子。在另一个实施方 案中，消毒液可W是杀死任何病原体，例如真菌、细菌、病毒、类病毒、病毒样生物、卵菌纲、 植原体、原生动物和/或线虫的化学剂，例如包含至少0 .!%、〇.2%、0.3%、0.4%、0.5%、 0.75%、1%、1.5%、2%、3%、4%或5%二氯异氯尿酸钢、次氯酸钢或次氯酸巧的溶液。本发 明可有利地应用于天然被病原体感染的种子。"天然被病原体感染的种子"是指种子在植物 中或植物上形成种子期间被病原体感染。此类在种子形成期间感染种子的病原体通常称为 种子携带的病原体。种子携带的病原体的实例是：（i)豆类中的萨氏假单胞菌菜豆致病变种 (Pseudomonas savastanoi pv.Phaseolicola)和地毯草黄单抱菌赤小豆致病变种 (Xanthomonas axonopodis pv.地aseoli),(ii)芸苔属中的甘蓝茎点霉（陆oma Iingam)和 野油菜黄单抱菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris), (iii)胡萝h 中的胡萝H连隔抱菌(Alternaria dauci)、根交链抱霉（Alternaria radicina)、根交链抱 霉（Alternaria radicina)和天竺葵黄单抱菌胡萝^致病变种（Xanthomonas hortorum pv.carotae), (iv)芹菜中的芹菜生壳针抱(Septoria apiicola), (V)野宦中的Acidovorax valerianel Iae , (vi )葫芦中的食酸菌属（Acidovorax spp .)、燕麦嗜酸菌属西瓜亚种 (Acidovorax avenae subsp. citrulli)、小南瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜果实 斑驳花叶病毒和甜瓜坏死斑点病毒，（Vii)窝宦中的窝宦花叶病毒，（Viii)魏豆中的魏豆种 子携带的花叶病毒、魏豆早褐病毒和魏豆细菌性枯萎病菌（Pseudomonas syringae pv.pisi)，（ix)辣椒中的烟草花叶病毒和黄单抱菌属(Xanthomonas spp. )，（X)西红柿中的 棒状杆菌属（Clavibacter spp.)、密西根棒状杆菌亚种（Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis)、凤果花叶病毒、烟草花叶病毒、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)和 黄单抱菌属。
[0021]本发明还设及用于生产基本上不含病原体，例如不含种子携带的病原体的种子的 方法，包括W下步骤：
[00剖 a.提供种子；
[0023] b.通过应用本发明的消毒方法处理所述种子;和
[0024] C.回收所述经处理的种子作为基本上不含活病原体的种子。
[0025] 本发明进一步设及通过W上生产方法获得或可获得的种子。本发明进一步设及基 本上不含活病原体，例如不含种子携带的病原体的种子，其包含消毒液，例如二氯异氯尿酸 钢、次氯酸钢或次氯酸巧。本发明可有利地应用于选自葫芦科和茄科的种子，更具体的，西 瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜、葫芦、西红柿、辣椒和茄子。
[0026] 在另一个方面，本发明设及包含二氯异氯尿酸钢的溶液用作处理种子的消毒剂。 在一个具体的实施方案中，通过真空浸渗将所述溶液引入种子。在另一个实施方案中，本发 明设及包含二氯异氯尿酸钢的溶液用作处理已经被外部感染的种子的消毒剂。运些溶液包 括，例如至少0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.75%、1%、1.5%、2%、3%、4%或5%的 二氯异氯尿酸钢。
[0027] 还在另一个方面，本发明还设及用于进行本发明消毒方法的设备，包括：
[0028] i.包括腔室的反应器，所述反应器可W被封闭W在所述腔室内施加真空压力；
[0029] ii.用于在所述反应室中施加真空压力的装置；
[0030] iii.用于收集沉没部分的种子的装置；
[0031] iv.用于释放真空压力的装置；
[0032] V.用于将消毒液与收集的沉没部分的种子分离，并将收集的消毒液再次引入反应 室的装置；
[0033] Vi.任选的，用于仅在施加期望的真空压力后将种子引入溶液的装置。
[0034] 发明详述
[0035] 因此，本发明设及基于W下的两步法:第一步是真空浸渗消毒液，进一步通过选择 沉没部分来完成第二步。更具体的，本发明设及消毒种子的方法，包括：
[0036] a)将种子和消毒液置于真空反应器;其中在步骤b)之前或之后将种子浸入消毒液 中；
[0037] b)施加真空压力；
[0038] C)释放所述真空压力；
[0039] d)重复步骤b-c，至少一次；
[0040] e)将沉没部分的种子与漂浮部分分离，其中所述沉没部分包含经消毒的种子。
[0041] 可用根据本发明的方法处理任何类型的种子。例如，种子可包括可用于农学、园艺 或观赏目的的单子叶和双子叶植物的种子。具体的，可用本发明的方法处理的提供种子的 重要植物类别是蔬菜、谷物和草。谷物包括但不限于小麦、小黑麦、大麦、黑麦、水稻和燕麦。 草包括草坪和牧草，例如无芒雀麦、蓝草、高羊茅草坪草和狗牙根草。其他草是热带草，例如 甘薦、玉米、小米和高梁。蔬菜包括茄科植物和葫芦科。茄科种子，例如马铃馨、西红柿、烟 草、茄子和辣椒种子是适于根据本发明的方法处理的种子，十字花科种子也一样，例如花挪 菜、西兰花、甘蓝、羽衣甘蓝和大头菜。其他合适的种子包括胡萝h香菜、甜菜、棉花、果树、 浆果植物的种子和葡萄种子。此外，本发明的方法可用于树例如松、云杉、冷杉、山杨和各种 阔叶树的种子。还可W使用禾本科、豆科和锦葵科的种子。具体地，该方法用于处理chapter 5,International Rules for Seed Testing,International Seed Testing Associat ion, Zurich, Switzer land, 1996 的附件所列的种子。
[0042] 在一个实施方案中，本发明可应用于来自W下的种子：葫芦科，更具体地选自西 瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜和葫芦或茄科，更具体地选自西红柿、辣椒和茄子。优选地， 消毒葫芦科或茄科的种子包括足W使种子基本上不含任何活病原体，例如种子携带的病原 体的消毒液，从而使种子满足检疫规定。
[0043] 优选的，该方法可应用于天然被病原体感染的种子，例如被种子携带的病原体感 染的种子。在葫芦科，更具体的选自西瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜和葫芦的种子的情况 下，最重要的种子携带的细菌感染由嗜酸菌属(Acidovorax)引起，更具体地由西瓜嗜酸菌 引起;最重要的种子携带的病毒感染由烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的种引起，更具体地 由黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)或黄瓜果实斑驳花叶病毒(CFMMV)引起。对于茄科，更具体 地选自西红柿、辣椒和茄子的种子，最重要的种子携带的细菌感染由棒状杆菌属 (Clav化acter)引起，更具体地由番茄溃瘍病棒状杆菌引起，甚至更具体地由密西根棒状杆 菌亚种、假单胞菌属和黄单抱菌属引起;最重要的种子携带的病毒感染由TMV、化pMVP引起。 类病毒也可W引起感染。
[0044] 在一些实施方案中，根据本发明的方法允许生产其中至少90、95、96、97、98、99或 100%的种子被消毒的种子批。在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法允许生产 其中100%的种子被消毒的种子批。
[0045] 在一些实施方案中，根据本发明的方法允许生产消毒种子而不影响它们的发芽质 量。在一些实施方案中，所得的消毒种子具有至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99或100%的发芽率。在一个特别优选的实施方案中，所得的消毒种子具有100% 的发芽率。换言之，根据本发明的方法允许生产其中至少90、95、96、97、98、99或100 %的消 毒种子发芽的种子批。在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法允许生产其中 100%的消毒种子发芽的种子批。
[0046] 真空浸渗步骤
[0047] 本发明方法中的真空浸渗步骤旨在将消毒液中包含的消毒剂渗透入种子。它通过 W下进行:施加真空W从种子组织空间中除去空气，将种子与消毒液接触(通过浸入），并释 放真空。在第一个实施方案中，将待处理的种子在施加真空压力之前浸入消毒液。不希望被 任何理论所限制，据信种子中的自由空间被消毒液填满。
[004引可W将施加于被消毒液浸没的种子的初始真空压力设置为400-500和975-985m己 之间，例如500m己-700m己或700-820m己，还例如576m己-66?己或740-816m己。优选地，真 空步骤通过首先施加400-700m己，优选400-600m己的真空压力来进行。然后立即释放真空 或在1秒-5分钟之后，优选少于2分钟的真空期之后，优选少于1分钟释放真空。技术人员根 据种子类型和种子数量及其他将容易确定运些时间和真空压力的参数。
[0049] 当引入消毒液，优选水溶液时，部分或全部种子开始可W是漂浮的。不希望被任何 理论所限制，据信在每次真空/去真空的循环步骤中，压力差异迫使溶液进入种子组织中去 除空气的空间，运使种子下沉。由于溶液包含消毒产品，溶液渗透进入由真空清除的种子空 气空间可W改进溶液和病原体表面的接触，并提高消毒处理的效率。该真空/去真空的循环 步骤通常重复至少一次W增加该方法的效率。优选地，重复该步骤直到在释放真空压力后 不再观察到新的沉没部分。如本文所用，"沉没部分"是指密度大于水或水溶液的种子部分。
[0050] 当重复真空/去真空的循环时，有利地，真空压力在每个循环增加，例如，真空压力 在每个真空/去真空循环后增加 IOOm己。技术人员将确定真空压力的运些参数，例如待施加 的最大真空压力可W是975-985m己，且真空压力的递增量可W为10、20、30、40、50、60、70、 80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、 270、280、290、300111己及其之间的任意真空压力。并且，递增量可^是相等的，例如步骤13-〇 每次循环后真空压力增加50m己，或是不规律的，例如步骤b-c第一次循环后真空压力增加 50m己，第二次步骤b-c后真空压力增加60m己，第S次步骤b-c后真空压力增加70m己等。
[0051] 确定特定的真空压力和每个真空/去真空步骤的时机W获得种子的两个部分，一 个沉没部分和一个漂浮部分。技术人员将确定获得足够量的沉没种子的具体条件，优选在 最短时间内。
[0052] 通常，将约Ikg当量的种子浸入5-10升消毒液例如二氯异氯尿酸钢，如0.1%二氯 异氯尿酸、0.1 %次氯酸钢或0.1 %次氯酸巧中，并首先施加压力为400-700m己，优选400-600m己的真空压力，然后在少于2分钟，优选1分钟的时间之后释放真空压力，并再次施加真 空压力，优选W增加的真空压力，例如直到真空压力达到在含水溶液的密闭空间中可能的 最大水平，即975-985m己。
[0053] 如本文所用，术语"消毒液"是指杀死有害生物例如任何病原体的包含消毒剂例如 化学剂的任何溶液。溶液优选是水溶液。任何已知的杀真菌剂和杀菌剂，例如抗生素、抗菌 剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗原虫剂和抗寄生生物剂和其他用于植物材料优选种子的消毒剂 可用于本发明的方法。消毒剂的实例包括但不限于漠、氯、亚氯酸盐、舰、过氧化氨、高儘酸 钟、盐酸、过乙酸、过氧乙酸、硫酸、憐酸、甲醒、戊二醒、氨氧化钢、苯酪、过氧单硫酸醋、=憐 酸钢、季锭盐、银和铜(离子或盐）、舰、漠、=氯生等。在一个优选的实施方案中，消毒液包含 基于氯的消毒剂，例如二氯异氯尿酸钢、次氯酸钢或次氯酸巧。在一个优选的实施方案中， 消毒液包含二氯异氯尿酸钢作为消毒剂，其已知用于保持花瓶里的插瓶花。在另一个优选 的实施方案中，消毒液包含次氯酸钢或次氯酸巧作为消毒剂。优选的，消毒液是具有至少 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.75%、1%、1.5%、2%、3%、4%或 5%二氯异氯尿酸 钢、次氯酸钢或次氯酸巧的水溶液。优选的，消毒液是具有〇.1%-2%、优选0.25%-2.5%、 还优选0.5 % -2 %二氯异氯尿酸钢、次氯酸钢或次氯酸巧的水溶液。
[0054] 替代的真空浸渗步骤
[0055] 在本发明方法的真空浸渗步骤的第二个实施方案中，将种子和消毒液置于真空反 应器中，但在施加真空压力前，种子不与消毒液接触。例如，在施加真空压力前，可W将种子 保持在反应室中的消毒液上方的篮子中。然后降低篮子使种子浸入消毒液中。
[0056] 方法的其他部分如第一个实施方案所述的进行。
[0057] 通常，将约Ikg当量的种子放在消毒液上方的篮子中，施加压力为400-700m己，优 选400-600m己的真空压力，然后将种子浸入5-10升消毒液中，例如二氯异氯尿酸钢、次氯酸 钢或次氯酸巧，如0.1 %二氯异氯尿酸钢、0.1 %次氯酸钢或0.1 %次氯酸巧，然后在少于2分 钟，优选1分钟的时间之后释放真空压力，并再次施加真空压力，优选W增加的真空压力。 [00 5引选择步骤
[0059] 发明人的功劳在于已经意识到，经处理种子的下沉行为实际上反应了消毒液渗透 进入种子材料的程度，并提供方便的手段W观察消毒过程的效率，并从未处理种子中分炼 出经处理的种子。
[0060] 因此，该方法的第二个步骤旨在通过丢弃真空浸渗步骤后仍然漂浮的种子部分 和/或通过收集沉没部分来将仍然漂浮的种子部分与沉没的种子部分分离。实际上认为漂 浮种子没有吸收足够量的消毒液，因此仍然存在剩余病原体的卫生风险。此外，收集沉没部 分或丢弃漂浮部分出乎意料地似乎对总体上种子批的发芽质量有益，从而允许生产其中至 少90、95、96、97、98、99或100%的种子被消毒的种子批，更优选允许生产其中100%的种子 被消毒的种子批。在一些实施方案中，沉没部分包含至少90、95、96、97、98、99或100%的消 毒种子，更优选100%的消毒种子。在一些实施方案中，沉没部分的种子的发芽率为至少85、 86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。在一个特别优选的实施方案中， 沉没部分的种子的发芽率为100%。
[0061] 可W在每个真空/去真空循环后或在方法结束时收集沉没部分。对于一些种子，沉 没部分可能是仅有的部分，即没有漂浮部分的种子。
[0062] 在本发明的第二个步骤中，漂浮部分的分离优选是快速的，通常在几分钟内，例如 1秒至5分钟，例如少于2分钟，优选少于1分钟。优选地，本发明的方法不包含任何的浸泡步 骤，例如W094/15448中所述的那些浸泡步骤，尤其它不包含任何超过12小时的浸泡步骤。
[0063] 有利地，整个方法从浸没种子到收集种子优选不超过2小时，优选甚至不超过1小 时，更优选不超过30分钟。
[0064] 收集后，可W洗涂并干燥种子。可W进一步用其他的用于种子净化或保护的处理 来处理种子。例如，可W通过包衣、造粒或包膜应用其他常规的种子处理，尤其为了防止种 子或植株损坏，包括但不限于杀真菌剂或杀虫剂处理。
[0065] 用于产生基本上不含活病原体的种子的方法
[0066] 在第二个方面，本发明提供用于产生基本上不含活病原体，例如不含活的种子携 带的病原体的种子的方法，包括W下步骤：
[0067] a)提供种子；
[0068] b)通过应用本发明的消毒方法处理所述种子，和
[0069] C)回收所述经处理的种子作为基本上不含活病原体的种子。如本文所用，"基本上 不含病原体"或"基本上不含活病原体"的种子是在发芽后，在无菌环境中将不会发展任何 感染病的种子。在一个实施方案中，"基本上不含病原体"或"基本上不含活病原体"（两者可 互换使用）的种子是不包含任何活形式或感染形式的W下感染因子的种子:真菌、细菌、病 毒、类病毒、病毒样生物、卵菌纲、植原体、原生动物和/或线虫。所述方法通常包括（i)提供 种子；（ii)通过应用本发明的消毒方法处理所述种子，和（iii)回收所述经处理的种子作为 基本上不含活病原体的种子。在一些实施方案中，通过该方法产生的种子"基本上不含活的 种子携带的病原体"或"基本上不含种子携带的病原体"。
[0070] 通过该生产方法获得或可获得的种子的特征在于：（i)它们基本上不含活病原体， 和(i i)它们包含消毒液，例如二氯异氯尿酸钢、次氯酸钢或次氯酸巧。
[0071] 因此，本发明设及基本上不含活病原体且包含消毒液，例如二氯异氯尿酸钢、次氯 酸钢或次氯酸巧的种子。优选地，此类种子选自葫芦科和茄科，更具体的西瓜、甜瓜、南瓜小 果、南瓜、黄瓜、葫芦西红柿、辣椒和茄子。
[0072] 本发明还设及二氯异氯尿酸钢作为消毒剂W处理种子的用途。在一个实施方案 中，通过真空浸渗将所述二氯异氯尿酸钢引入种子中，例如W至少〇.!%、〇.4%、0.75%、 1%、1.5%、2%、3%、4% 或 5% 的浓度。
[0073] 发明人的功劳还在于已经意识到，目前已知用来保持花瓶中的插瓶花的二氯异氯 尿酸钢可用来消毒种子。并且，与目前已知的所有其他消毒液相反，二氯异氯尿酸钢保持， 并在某些情况下甚至提高种子的发芽质量。
[0074] 用于进行本发明方法的设备
[0075] 本发明还设及用于进行本发明方法的设备。
[0076] 在一个实施方案中，用于进行本发明消毒方法的设备包含：
[0077] i.包括腔室的反应器，所述反应器可W被封闭W在内部施加真空压力；
[0078] ii.用于收集沉没部分的种子的装置；
[0079] iii.用于在所述反应室中施加真空压力的装置；
[0080] iv.用于释放真空压力的装置；
[0081] V.任选的，用于将消毒液与收集的沉没部分的种子分离，并将收集的消毒液再次 引入反应室的装置；
[0082] Vi.任选的，用于在施加期望的真空压力后将种子引入溶液的装置。
[0083] 图1示出了根据本发明的反应器的一个实例。
[0084] 设备的反应器(1)可W是具有腔室(2)的任何反应器，所述腔室用于包含浸没在消 毒液中的种子且抗真空(也称为真空室）。通常，它可W由有机玻璃或抗真空压力的其他材 料制成，优选透明的，用于观察过程中种子的行为(下沉或漂浮）。例如，在70L有机玻璃反应 器中，反应室可W包含10-50升体积的消毒液和种子。
[0085] 反应器可W包含盖(3)，优选在其上部，所述盖可W打开W引入种子和/或消毒液， 且可W密封关闭W允许在反应室中施加真空压力。
[0086] 设备可W进一步包含例如在反应器上侧与盖相连的真空管(4)和在反应室内施加 真空压力的真空累巧）。有利地，反应器进一步包含压力计(7)和/或用于控制反应室内真空 压力的装置和/或用于释放真空的装置(6)。或者，可W通过使用滤器或通过旋转腔室并将 漂浮种子从容器上部排到另一个容器来从溶液上部收集漂浮部分。
[0087] 反应器优选升高的，例如具有支架（11)并包含例如在其下部的用于排出沉没部分 的种子的出口阀（8)和收集沉没部分的种子的收集器(9)，所述收集器例如置于反应室下 方。收集器可W包括带多孔壁(或半透）的容器从而将种子保留在容器中，且收集的消毒液 可W从容器中排出。有利地，设备进一步包含用于从收集器中提取所收集的消毒液并将其 再次引入反应室的装置(1〇)(例如用管道或累）。
[0088] 在特定的实施方案中，真空管(4)还可进一步包含夹子。
[0089] 本发明的特定实施方案将在W下实施例中说明。
【具体实施方式】
[0090] 实施例1:消毒天然被细菌性果斑病感染的西瓜种子：
[0091] 细菌性果斑病(BFB)是由细菌西瓜嗜酸菌引起的疾病，其对于农民是毁灭性的，因 为果实损失可W达到超过90%的田间生产。根据Walcott, R.R.2005.The Plant胎alth Inshuctor. DOI: 10.1094/PHI-I-2005-1025-02-http : //Vww. apsnet. org/edcenter/ in1:;ropp/lessons/p;rokaryotes/F*ages/Bacte;rialBlotch. aspx.，细菌性果斑病（BFB)影响 所有生长阶段的叶子和大量葫芦科宿主的果实。在种植后5-8天，可W首先在葫芦科幼苗子 叶的底面观察到例如水浸的症状。与BFB相关的病变外观油腻，且在干燥条件下（例如在午 后可W观察到)也存在。水浸病开始时是离散的斑点，但然后凝聚并沿着子叶的脉延伸。它 们最终变干，在子叶叶脉上并沿着子叶叶脉形成延长的、深色至红栋色的病变。相似症状出 现在甜瓜和其他葫芦科幼苗上。在成熟的西瓜叶上，不同的深色至红栋色的病变沿着叶脉 发展。疾病的果腐期造成经济损失。实际上，西瓜果实的WB症状刚好在收获成熟期之前出 现，在果实的上表面表现为小的（直径<1毫米）、形状不规则的、橄揽色的斑点。运些病变尽 管初始较小，但可W扩散并覆盖果实的整个上表面。在感染早期，运些病变是固定的，很少 渗透进入果肉。在果皮病变中可能发生栋色裂缝。在后期，由于被二次殖民生物入侵，果实 腐烂成稀腐。
[0092] 在生产中WB侵染的管理极为困难。优选地，仅在没有任何WB存在记录的地区W 田间轮作方式产生种子。根据Walcott,"no chemical or 地ysical seed treatments are 100%effective at eradicating A.avenae subsp.Cihulli"。尽管包括热疗、化OCl、发 酵、HCl和过乙酸的种子处理显著降低BFB的幼苗传播，它们会对种子生理产生不利影响。影 响种子处理效率的两个因素是：1)种子处理无力渗透种皮，和2)在种子上/内的细菌位置。 由于在移植中发生BFB的风险，具有较低水平侵染的种子的存放较高，仅种子处理不能控制 BFB。
[0093] 因此，目前为止，据信化学疾病管理和种子健康测试作用有限:尽管可能检测严重 侵染的种子批，鉴定具有低侵染的批很困难。
[0094] 通常，种子公司每个种子批测试30000-50000粒种子(Gitaitis,R.D.，和Walcott, R.R. 2008. Annu. Rev. Phytopathol. ,45:3 71-397),运在时间和财政上是巨大负担，因为当 30000或50000粒种子中没有一例测试为阳性时，种子批可W被接受。即使用运样大的样品， 种子公司和种植者仍然面临危险，因为种子批可能W在50000粒种子样品中不可检测的低 水平感染。
[00M]在本发明中，从商业种子批中获得0.化g西瓜种子，其在田间生产中天然被BFB感 染。在1.0%二氯异氯尿酸钢的标准消毒过程后，它们仍然是感染的。将具有标准水分含量 5.5-7.5 %的干燥种子与包含0.2 %二氯异氯尿酸钢的1.0升消毒液一起置于10升玻璃容器 中。施加真空压力，升至约500m己，然后释放。重复该真空/去真空过程，每次增加真空压力 约loom己，达到约975-985m己的最大可达到的真空压力。该过程导致在容器中形成两个种 子部分:一个沉没部分和一个漂浮部分。收集漂浮部分的种子，并对其再次施加真空过程。 继续真空循环直到漂浮种子不再下沉。然后取出并丢弃漂浮种子。运个过程需要20-30分 钟。
[0096] 然后用自来水洗涂沉没的种子10分钟，并干燥。运些种子已经消毒BFB。它们可进 一步容易鉴别，因为种子内部仍然包含消毒产品的痕迹。
[0097] 测试了4200粒种子，用汗盒法(sweat box assay)发现BFB阴性(参见W下参照）。
[0098] 实施例2:消毒天然被细菌性果斑病感染的甜瓜种子：
[0099] 将被WB天然感染的49kg甜瓜种子通过标准消毒程序（1%和2%浓度的二氯异氯 尿酸钢;持续时间：10分钟;冲洗10分钟)消毒两次。然后测试经消毒种子的BFB，发现仍然严 重被侵染。
[0100] 将4.化g运种种子批与20升包含0.5%二氯异氯尿酸钢的消毒液一起置于70升反 应器中（如图1所示）。
[0101] 施加真空，升至约500m己，然后释放。重复该真空/去真空过程，每次增加真空压力 约IOOm己，达到约975-985m己的最大可达到的真空压力。该过程导致在容器中形成两个种 子部分:一个沉没部分和一个漂浮部分。继续真空循环直到漂浮种子不再下沉。然后取出并 丢弃漂浮种子。运个过程需要20-30分钟。
[0102] 然后用自来水洗涂沉没的种子10分钟，并干燥。运些具有商业价值的种子批已经 消毒BFB。它们可进一步容易鉴别，因为种子内部仍然包含消毒产品的痕迹。
[0103] 在49kg中，消毒部分代表48kg的种子。为测试消毒过程，如下对40000粒种子进行 健康测试：
[0104] 根据USDA国家种子健康系统化1.2Seminis Inc.PCR-Wash方法用聚合酶链式反应 (PCR)分析测试10000粒种子。可W从国家种子健康系统获得标准程序，其是由USDA-APHIS 批准且由爱荷华州立大学种子科学中屯、注册的授权个人和公共实体来进行支持对国际种 子运输颁发联邦植物检疫证书所需的某些活动的程序。参见"Vegetable Crop Method-Reference Manual B" ,2014 年 5 月版，第 56 页。
[01 化]可从ht1:p: //www. see化ealth. org/f iles/p壯A/egetable_Crops. pdf获取国家种 子健康系统。
[0106] 根据已知的且可W从国家种子健康系统获得的USDA国家种子健康系统化1.1幼苗 生长法，用幼苗生产分析测试20000粒种子。
[0107] 通过与之前的生长分析相似的汗盒法测试10000粒种子，其中将种子播种在生长 室条件适于发展疾病的封闭容器中。然后用与生长法相似的方法测试幼苗。
[0108] 没有发现一粒种子被感染，相反，漂浮部分为约Ikg且测试为BFB阳性（10000粒种 子的汗盒法）。
[0109] 在第4&7天计数发芽，结果是重的部分为99%/99%，漂浮部分为96%/92% (根据 chapter 5,International Rules for Seed Testing, International Seed Testing Association,Zu;rich,Switze;rland, 1996的附件的发芽测试）。
[0110] 实施例3:消毒天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)感染的黄瓜种子：
[0111] 在本实施例中，从商业种子批获得黄瓜种子，其在田间生产中天然被CGMMV感染。
[0112] 用标准方法和真空浸渗法消毒种子。在本实施例中，从开始施加最大压力为975-985m己的真空。该过程导致在容器中形成两个种子部分:一个沉没部分和一个漂浮部分。继 续真空循环直到漂浮种子不再下沉。然后取出并丢弃漂浮种子。运个过程需要15-20分钟。
[0113] 在本实施例中使用两种化学物。标准消毒(A)和真空浸渗(B)的10%=憐酸钢，和 标准消毒(C)和真空浸渗(D)的0.4%二氯异氯尿酸钢。参见表1的CGMMV ELISA分析结果和 发牙结果。
[0114] 我们还测试了通过真空浸渗施加的不同浓度的二氯异氯尿酸钢对CGMMV和发芽的 影响（表1I)。处理E是未处理对照;处理F是真空浸渗0.75%二氯异氯尿酸钢;处理G是真空 浸渗1.5 %二氯异氯尿酸钢;处理H是真空浸渗2.0 %二氯异氯尿酸钢。
[0115] 表1:ELISA分析测试的CGMMV感染
[0117] 表1I: ELISA分析测试的CGMMV感染
[0120] 根据chapter 7: seed health testing methods ； International Seed Testing Association, Zurich, Switzerland, 2010的附件中的种子测试的国际规则的方法7-026通 过化ISA分析测试CGMMV。
[0121] 根据chapter 5, International Rules for Seed Testing, International Seed Testing Association,Zurich,Switzerland, 1996的附件进行发芽测试。
[0122] 实施例4:消毒天然被烟草花叶病毒(ToMV)感染的西红柿种子
[0123] 从商业种子批获得西红柿种子，其在田间生产中天然被ToMV感染。将种子批预先 用标准方法消毒3次，没有成功(对照）。
[0124] 在本实施例中，通过真空浸渗方法用4升2%Virkon(50%过氧单硫酸钟、5%氨基 横酸和15%烷基苯横酸钢。Virkon是USA的杜邦子公司Antec国际有限公司的注册商标）消 毒30克干燥种子。
[0125]将种子置于密闭室中消毒液上方的穿孔篮中，施加真空。W约975-985m己的最大 可达到的真空压力施加真空压力，然后将种子浸入溶液并释放真空。重复真空/去真空循环 4次，最后所有种子沉没。收集种子，冲洗5分钟并干燥。结果:在所有西红柿种子批中，ToMV 水平降至对照水平的〇%(参见表1II)。一个种子批的发芽水平增加2%，其他种子批的发芽 水平降低5%。
[01 巧]在ISHI规则下测试ToMVQnternational Seed Health Initiative,参见Qiapter 7:Seed Health Testing Methods 7-028:Detection of infectious tobamoviruses on Lycopersicon escuIenturn(tomato)by the local lesion assay(indexing)on Nicotiana tabacum plants ,p 1-10的附件，由The International Seed Testing Association!； ISTA)Zi jrichstr. 50发表,CH-8303Bassersdorf, Switzerland. January I, 2013)。
[01巧]根据AOSA规则测试种子进行发芽测试（Volume I Principles and Procedures, Table 6A. Methods of testing laboratory germination ,p.6-55, So Ianumn Iycopersicum var.lycopersicum(tomato),由Association of Official Seed Analyst' S(AOSA)发表 160152nd Avenue, Suite I,Moline, IL 61265 USA,October 1,2012)。
[0130] 实施例5:标准二氯异氯尿酸钢消毒(外洗）：
[0131] 种:甜瓜或西瓜
[0132] 方法:将IOkg种子添加至45升1%或2%的二氯异氯尿酸钢中。将种子在溶液中混 合30分钟，然后用自来水洗涂10分钟，然后干燥至原来的水含量。
[0133] 实施例6:通过降低的真空压力消毒天然被细菌性果斑病感染的甜瓜种子
[0134] 如实施例5所述，将天然被BFB感染的甜瓜种子用标准消毒程序消毒2次，发现其仍 然被BFB感染。
[0135] 将=批Ikg的该种子批与3.0升包含1.0%二氯异氯尿酸钢的消毒液一起置于10升 玻璃容器中。W=个不同水平施加30次真空/去真空循环(每个循环持续1-1.5分钟）：（i)水 平八:完全真空至975-98 5，。1)水平8:中等水平740-816111己，和。11)水平(：:低水平的576-667m己。40分钟之后（即实现30次真空/去真空循环之后），丢弃漂浮部分，收集沉没部分，洗 涂40分钟并干燥。
[0136] 测试各处理水平(A、B、C)的5000粒种子，用聚合酶链式反应(PCR)根据USDA国家种 子健康系统饥1.4孟山都改进的PCR方法发现WB阴性。可W从国家种子健康系统获得标准 程序，其是由USDA-APHIS批准且由爱荷华州立大学种子科学中屯、注册的授权个人和公共实 体来进行支持对国际种子运输颁发联邦植物检疫证书所需的某些活动的程序。参见可从 http: //www. seedhealth. org/f iles/pdf A/egetable_Crops. pdf 获得的"Vegetable Crop Method-Reference Manual B"国家种子健康系统，2014年5月版，第56页。
[0137] 实施例7:消毒天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)感染的西瓜种子：
[0138] 从在田间生产中天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV)感染的商业种子批获得 0.150kg西瓜种子。将该样品与0.5升包含0.2%二氯异氯尿酸钢的消毒液一起置于1升玻璃 容器中。施加真空，升至约700m己，然后释放。重复该真空/去真空过程，每次增加真空压力 约50m己，达到约985m己的最大真空压力。该过程持续40分钟，然后收集沉没部分。测试2000 粒种子的CGMMV，根据chapter 7(参见health testing methods; International Seed Testing Associat ion, Zurich, Switzer land, 2010)的附件中种子测试的国际规则的7-026 方法用化ISA分析发现阴性。
[0139] 实施例8:使用化(C10)2处理消毒天然被CMM(密西根棒状杆菌亚种)感染的西红柿 种子
[0140] 从在田间生产中天然被CMM感染的商业种子批获得西红柿种子。如下文所述，通过 真空浸渗(VI)方法用4升1%次氯酸巧进行真空处理。将种子置于密闭室中消毒液上方的穿 孔篮中，施加真空。W约975-985m己的最大可达到的真空压力施加真空压力，然后将种子浸 入溶液并释放真空。重复真空/去真空循环4次，最后所有种子沉没。收集种子，冲洗5分钟并 干燥。在VI处理1小时后或不用VI处理，在相同溶液中进行浸泡处理。
[0141] 根据 Association of Of f icial Seed Analysts(AOSA) (http :// www.aosaseed. com/)进行发芽测j 试。
[0142] 采用可在网址 ht1:p ://www. worldseed. o;rg//isfyishi_vegetable .html发现的根 据国际种子联盟（ISF)种子健康方法手册的"用于检测西红柿种子上密西根棒状杆菌亚种 的方法"获得密西根棒状杆菌亚种的感染结果。
[0143] 所有结果示于下表1V。
[0146] VI:真空浸渗，EN:能量=在毛巾卷中种植后第5天获取的早期发芽计数，OG:最佳 发芽=在毛巾卷中种植后第14天的发芽计数，UT:可用移植=种在溫室中的盘里。认为对商 业种植者而言可用的幼苗计数，UNIF:平均移植化NIF):种在溫室中的盘里。认为大小平均 的幼苗计数。
[0147] 实施例9:消毒天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)感染的黄瓜种子：
[014引在本实施例中，处理天然被CGMMV感染的商业黄瓜种子(2kg)。将感染种子置于包 含20升的1.33%二氯异氯尿酸钢的反应器中。从500m己开始，逐渐施加真空/去真空循环 (即真空浸渗），每个循环增加50m己，直到最大985m己。然后，我们W985m己的最大真空压力 继续真空/去真空循环，总共30次循环。该过程导致在容器中形成两个种子部分:一个沉没 部分和一个漂浮部分。分别收集两个部分。该过程需要45分钟。根据chapter 7: seed health testing methods；International Seed Testing Association,Zurich , Swi tzer land，2010的附件中种子测试国际规则的7-026方法用化ISA分析测试CGMMV。
[0149] 在24°C解育箱的培养皿(TOP)上进行发芽测试，出苗后第4天计数根突(4d的TOP)。
[0150] 结果示于下表V。
[0153] VI:真空浸渗
[0154] 实施例10:消毒天然被黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)感染的黄瓜种子：
[01W]用标准消毒或真空浸渗方法处理在田间生产中天然被CGMMV感染的两种商业黄瓜 种子样品。将1500粒种子在300ml溶液中进行所有处理40分钟，然后用自来水洗涂40分钟。 对于标准消毒，我们使用2.5%二氯异氯尿酸钢溶液，对于真空浸渗，我们使用包含1.5%二 氯异氯尿酸钢的溶液。从500m己开始，逐渐施加真空/去真空循环，每个循环增加 IOOrn己，直 到最大985m己。然后，我们W985m己的最大真空压力继续真空/去真空循环，总共30次循环。 在处理结束时，丢弃漂浮种子，收集重的部分，洗涂并干燥用于测试。
[0156] 根据chapter 7: seed health testing methods ； International Seed Testing Associat ion, Zurich, Switzer land, 2010的附件中种子测试国际规则的7-026方法用ElLISA 分析测试CGMMV。在24°C解育箱的培养皿(TOP)上进行发芽测试，出苗后第4天计数根突(4d 的TOP)。结果不于下表VI。
[0157] 表VI [015 引
【主权项】
1. 消毒种子的方法，包括： a) 将种子和消毒液置于真空反应器中；其中在步骤b)之前或之后将种子浸入消毒液 中； b) 施加真空压力； c) 释放所述真空压力； d) 重复步骤b-c，至少一次； e) 将沉没部分的种子与漂浮部分分离，其中所述沉没部分包含经消毒的种子。2. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤b-c的每次循环后收集所述沉没部分。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤a-e进行不超过2小时，优选不超过1小时， 更优选不超过30分钟。4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中在步骤b施加的真空压力为400-985m巴。5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤b和c在适于获得两个部分种子，一个 沉没部分和一个漂浮部分的条件下进行。6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中进行多次步骤b-c循环，每个循环增加真 空压力，例如步骤b-c的每次循环后真空压力增加100m巴。7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述种子来自： (i)萌芦科，更具体地选自西瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜和萌芦;或(ii)茄科，更具体地选自西红柿、辣椒和茄子。8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述消毒液是包含二氯异氰尿酸钠的溶 液，例如，包含至少0.1 %二氯异氰尿酸钠的溶液。9. 根据权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述种子天然被病原体感染。10. 用于生产基本上不含活病原体的种子的方法，包括以下步骤： a) 提供种子； b) 通过应用权利要求1-9任一项所述的消毒方法处理所述种子;和 c) 回收所述经处理的种子作为基本上不含活病原体的种子。11. 可通过权利要求10所述的方法获得的种子。12. 基本上不含活病原体的包含二氯异氰尿酸钠的种子。13. 权利要求12所述的种子，选自萌芦科和茄科，更具体地，西瓜、甜瓜、南瓜小果、南 瓜、黄瓜、萌芦、西红柿、辣椒和茄子。14. 包含二氯异氰尿酸钠的溶液作为消毒剂来处理种子的用途。15. 权利要求14所述的用途，其中所述消毒剂通过真空浸渗引入所述种子。16. 根据权利要求14-15任一项所述的用途，其中所述溶液是包含二氯异氰尿酸钠的溶 液，例如，包含至少0.1 %二氯异氰尿酸钠的溶液。17. 用于进行权利要求1-9任一项所述的方法的设备，包括： a) 具有腔室的反应器，所述反应器可以被封闭以在内部施加真空压力； b) 用于收集沉没部分的种子的装置； c) 用于在所述反应室中施加真空压力的装置； d) 用于释放真空压力的装置； e) 任选的，用于将消毒液与收集的沉没部分的种子分离，并将收集的消毒液再次引入 反应室的装置； f)任选的，用于仅在施加期望的真空压力后将种子引入所述溶液的装置。
【专利摘要】本发明涉及植物材料，尤其是种子的处理。该方法使用真空压力来消毒种子中的病原体。种子消毒很重要，因为被病原体感染的种子可以使其繁殖，并导致作物高损失。该方法适用于来自葫芦科的种子，具体地是西瓜、甜瓜、南瓜小果、南瓜、黄瓜和葫芦，但也适于来自茄科的种子，具体地是西红柿、辣椒和茄子。
【IPC分类】A01C1/08
【公开号】CN105491873
【申请号】CN201480046975
【发明人】A·奥勒辛斯基, K·库比克
【申请人】维尔莫林公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月3日
【公告号】EP3016493A1, US20160174557, WO2015001043A1
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