细胞稳定化的制作方法
细胞稳定化的制作方法
【专利说明】细胞稳定化 发明背景
[0001 ]本申请要求于2013年6月13日提交的美国临时申请号61 /834，517的权益，该临时 申请通过引用全文并入本文。
技术领域
[0002] 本发明设及细胞的稳定化。 相关领域的描述
[0003] 有核细胞(例如，真核细胞)的长期储存通常需要在毒性冷冻保护剂DMSO的存在下 超低的溫度。除了由冷藏系统的常见失效导致的损失之外，活细胞从冷冻状态的恢复是有 挑战性的，且通常仅少部分的投入细胞存活。
[0004] 在过去的20年中，已花费数百万美元的研究基金来尝试开发用于在环境溫度下稳 定化真核细胞的替代方法。运些努力背后的动力是环境溫度稳定化的真核细胞储备物用于 生物医学研究、产品开发W及在诊断学、再生医学、治疗学、血液供应物流学和细胞移植中 直接应用的优势。
[000引基于对可在干燥状态下存活多年的极端微生物如缓步动物、轮虫或面虫（brine shrimp)的研究，有人假设可W在真核细胞培养物中开发模拟运一分子现象的技术和方案。 遗憾的是，即使在数十年的研究之后，仍未实现细胞的实用干燥储存稳定化。所描述的最好 的稳定化技术采用海藻糖一一一种非还原糖分子作为干燥介质。载有海藻糖的哺乳动物细 胞可被干燥但需要几乎立即再水化，并且即使那样存活率仍然有限。已经证明，干燥细胞储 存即使持续几分钟也会导致彻底的细胞死亡。
[0006] 因此，存在开发允许细胞在环境溫度下基本干燥储存且再水化时保持活力的制 剂、组合物和方法的需要。
【发明内容】
[0007] 本文所述的制剂、组合物和方法有利地使细胞在基本干燥的条件下储存时维持存 活状态，使得细胞在干燥储存至少一小时，且在某些实施方案中至少一周的时间段后再水 化时保持至少一种功能性质，例如，细胞活力，从而在无需冷冻或冻干的情况下显著增加可 用于运输和储存活细胞的时间。在本发明的一个方面，提供了组合物，其包含在没有冷冻或 任选地没有冻干的情况下基本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本干燥储存至少1小时后 再水化时，再水化的细胞表现出至少一种与脱水和基本干燥储存之前的细胞基本相同的功 能性质。
[0008] 在某些实施方案中，所述组合物包含至少一种干燥储存稳定剂，该干燥储存稳定 剂优选地选自氨基酸、合成氨基酸、肤、非还原糖、馨合剂、水溶性聚合物和四氨喀晚。在一 个实施方案中，不存在为糖分子（例如，海藻糖）的稳定剂，或者如果存在为糖分子的稳定 剂，则还存在另一种不是糖分子的稳定剂。
[0009] 在某些其他实施方案中，提供了包含至少一种调亡抑制剂、优选可逆调亡抑制剂 的组合物。示例性的调亡抑制剂选自阳服-e IF2-a抑制剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、 JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、IREl抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧 蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0010] 在另一个方面，提供了组合物，其中在脱水之前用包含至少一种调亡抑制剂的预 脱水制剂处理细胞W产生预处理的细胞。在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂选 自PE服-eIF2-a抑制剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、 IREl抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1 抑制剂。
[0011] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是PE服-eIF2-a抑制剂。
[0012] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂。
[0013] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制剂。
[0014] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。
[0015] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是MEK抑制剂。
[0016] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。
[0017] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和P38MAP激酶抑制 剂。
[0018] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。
[0019] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。
[0020] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。
[0021] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0022] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种邸蛋白 伴侣诱导剂。
[0023] 在某些其他实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种自 隧诱导剂。
[0024] 在又一个实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种存活 蛋白。
[0025] 在本发明的另一个方面，提供了包含再水化的细胞的组合物，其中该再水化的细 胞是在没有冷冻或冻干的情况下基本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本干燥储存至少1 小时后再水化时，该再水化的细胞表现出至少一种与脱水和基本干燥储存之前的细胞基本 相同的功能性质。
[0026] 在某些实施方案中，所述细胞的再水化在再水化制剂的存在下发生，并且优选地 该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂。
[0027] 在某些其他实施方案中，所述再水化缓冲液中的至少一种调亡抑制剂选自PEW-e I F2-a抑制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制 剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0028] 在其他实施方案中，所述再水化制剂包含调亡抑制剂W及选自ER蛋白伴侣诱导 剂、自隧诱导剂和存活蛋白中的一种或多种。
[0029] 在一个实施方案中，再水化后的至少一种功能性质包括代谢活性。
[0030] 在某些实施方案中，所述代谢活性通过测定ATP含量或脫天蛋白酶测定试验来度 量。
[0031] 在某些其他实施方案中，再水化后的代谢活性在细胞再水化后24小时、细胞再水 化后48小时、细胞再水化后72小时或细胞再水化后一周测量。
[0032] 在其他实施方案中，所述组合物在再水化前W脱水形式稳定化至少24小时，在再 水化前W脱水形式稳定化至少48小时，在再水化前W脱水形式稳定化至少72小时，或在再 水化前W脱水形式稳定化至少一周。
[0033] 在其他方面，提供了脱水制剂，其包含抑缓冲液;合成氨基酸、水溶性聚合物；W及 第一氨基酸或肤。在某些实施方案中，所述脱水制剂进一步包含非还原糖、至少一种调亡抑 制剂或第二氨基酸。
[0034] 在又一个方面，提供了在没有冻干的情况下将一种或多种细胞在环境溫度下基本 干燥储存的方法，该方法包括:将一种或多种细胞在脱水制剂中溫育，W及在脱水制剂的存 在下使该一种或多种预处理的细胞脱水，W产生一种或多种基本干燥储存的细胞。在其他 方面，提供了在没有冻干的情况下将一种或多种细胞在环境溫度下基本干燥储存的方法， 该方法包括:将所述一种或多种细胞与包含调亡抑制剂的预脱水制剂一起溫育W产生一种 或多种预处理的细胞，去除所述预脱水制剂；W及在脱水制剂的存在下使所述一种或多种 预处理的细胞脱水，W产生一种或多种基本干燥储存的细胞。
[0035] 在一个实施方案中，所述方法中使用的脱水制剂包含至少一种干燥储存稳定剂， 并且在没有使用预脱水制剂时可进一步包含至少一种调亡抑制剂(在一个实施方案中其为 可逆调亡抑制剂）。
[0036] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在将一种或多种细胞与所述预脱水制 剂一起溫育之前将所述一种或多种细胞固定至固体支持体上。
[0037] 在又一个实施方案中，所述方法进一步包括采用包含至少一种调亡抑制剂的再水 化制剂将所述一种或多种基本干燥储存的细胞再水化，W产生再水化的细胞。
[0038] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂与所述再水化制剂 中的至少一种调亡抑制剂相同，而在其他实施方案中，所述预脱水制剂中的至少一种调亡 抑制剂与所述再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂不同。
【附图说明】
[0039] 图1是ER应激通路的S种近端ER跨膜传感器的示意图，（A)GRP78结合的失活状态， (B)GRP78的释放导致激活IREl。
[0040] 图2是邸应激通路(A)、由调亡抑制剂抑制的ER应激通路的阻断步骤和祀标(B)的 示意图。
[0041] 图3示出了采用本文所述的制剂和方法基本干燥储存的间充质干细胞(MSC)保持 在再水化时分化成脂肪细胞(B图）、骨细胞(C图）和软骨细胞(D图）的能力。
[0042] 图4示出了化La细胞在脱水和室溫下储存5小时后的长期活力。（A)干燥5小时并随 后进行五天的再水化后的细胞活力。(B)每毫升的活细胞数目。将细胞接种到新鲜的细胞培 养板中，并采用根据本文公开的一个实施方案的组合物对各组进行处理。
[0043] 图5示出了相对于未处理的对照的脫天蛋白酶3/7活化。脫天蛋白酶活化计算为在 标准组织培养条件下培养的测试样品中的活性与未处理的细胞的活性之比。使测试的细胞 脱水并在室溫下干燥储存5小时，随后进行5天的再水化。
[0044] 图6示出了细胞在脱水、干燥状态储存7小时并且储存后再水化后的存活。在重新 接种后3天W及再水化后共7天评价细胞活力。不同的稳定化制剂影响细胞存活W及细胞增 殖。未受到保护的对照和海藻糖稳定化的细胞没有产生任何存活的细胞。 发明详述
[0045] 不希望受任何理论的限制，预期本文所述的某些实施方案的制剂和组合物稳定化 细胞膜和细胞的细胞器的完整性，同时还阻断调亡(例如，通过在脱水前的限定阶段和在再 水化时阻断特定ER应激通路），W提供在环境溫度下储存至少一个小时的基本干燥的细胞， 该基本干燥的细胞在被再水化至少一小时的时间段后保持至少一种功能性质。在某些实施 方案中，采用调亡抑制剂阻断特定m?应激通路。在其他实施方案中，采用调亡抑制剂结合ER 蛋白伴侣诱导剂来阻断特定ER应激通路，W驱使ER应激通路朝向适应性反应而非调亡。
[0046] 在某些实施方案中，采用脱水制剂使细胞脱水，该脱水制剂优选地包含至少一种 干燥储存稳定剂和至少一种调亡抑制剂。
[0047] 在某些其他实施方案中，在将细胞在脱水制剂的存在下脱水W产生基本干燥储存 的细胞之前，采用包含调亡抑制剂的预脱水制剂预处理细胞预定的一段时间，例如1小时。 将基本干燥储存的细胞在再水化制剂的存在下再水化，该再水化制剂优选地包含调亡抑制 剂，该调亡抑制剂可与预脱水制剂中的调亡抑制剂相同或不同。在特定的一段时间，例如1 小时之后，去除再水化制剂，并且可根据预期的最终用途，将细胞在生长培养基或其他合适 的溶液和缓冲液中再水化。 定义
[0048] 除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术 人员通常理解的含义相同的含义。本文引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用全 文并入本文。
[0049] 如本文所用的，术语"真核细胞"是指在真核生物(优选人类)的真核细胞发育的任 何给定阶段(包括受精的卵母细胞、母细胞W及其他胚胎阶段、胎儿或成人）的体液或组织 中存在的至少一种有核细胞。可采用本发明的制剂、组合物和方法在环境溫度下基本干燥 储存的示例性细胞包括但不限于成纤维细胞、角质形成细胞、软骨细胞、黑素细胞、成骨细 胞、骨细胞、肌细胞、屯、肌细胞、神经元、雪旺细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、 T细胞、B细胞、记忆细胞、网织红细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细 胞、巨隧细胞、巨核细胞、树突细胞、脂肪细胞、膜岛细胞、卵母细胞、精母细胞、胎盘厮带血 细胞、母细胞、合子、上皮细胞(例如，乳腺细胞、子宫内膜细胞、膜腺腺泡细胞、杯状细胞、朗 格汉斯细胞、成釉细胞和帕内特细胞）、牙细胞(odontocytes)、肝细胞、脂细胞、壁细胞、肺 细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、视网膜光感受器和色素细胞、晶状体细胞W及干 细胞(包括多能或全能胚胎干细胞、胎儿干细胞、iPS细胞和间充质干细胞)或其混合物。干 细胞可WW未分化或部分分化状态在环境溫度下基本干燥储存。
[0050] 如本文所用的，术语"预处理的细胞"是指在脱水之前已经用包含至少一种调亡抑 制剂的预脱水制剂处理过的细胞。预处理的细胞预先载有调亡抑制剂，W允许采用含有或 缺少调亡抑制剂的脱水制剂在没有m?应激通路活化的情况下基本干燥储存预处理的细胞。 在某些实施方案中，在添加脱水制剂之前，将包含调亡抑制剂的预脱水制剂从预处理的细 胞中去除，但细胞内调亡抑制剂的浓度足W在没有邸应激通路活化的情况下基本干燥储存 细胞。
[0051 ]如本文所用的，术语"在环境溫度下基本干燥储存"或"在环境溫度下基本干燥储 存的"是指采用本发明的制剂、组合物和方法，在没有冷冻或冻干的情况下将细胞在环境溫 度下储存，同时使细胞在再水化状态下保持至少一种功能性质的能力。基本干燥储存的细 胞不一定需要消除所有的内部自由水，但优选去除至少45%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或最多98%的内部自由水。根据待干燥储存的细胞的 类型、所使用的预脱水和/或脱水制剂W及基本干燥储存的细胞的预期用途，可将基本干燥 储存的细胞在环境溫度下储存不同的时间段。可将细胞W脱水状态储存W下的时间段：1) 数小时，例如，1、2、6、12或18小时；2)数天，例如，1天、2天、4天或6天;3)数周，例如，1周、2周 或3周;4)数月，例如，1个月、2个月、4个月、6个月、8个月或11个月；W及5)甚至数年，例如，1 年、2年、5年、10年、20年或更多年。
[0052] 如本文所用的，术语"固定的"是指粘附于固体表面或与固体表面直接接触的基本 干燥储存的细胞。可将细胞在添加脱水制剂和干燥之前固定，或可在预脱水步骤之前固定 并在整个脱水过程中保持固定。合适的固体表面包括但不限于:载玻片、珠子、忍片、膜、片、 网、柱、亲和树脂、海绵、塑料(包括96孔板）、培养皿和烧瓶、管、容器、器皿、天然基质(诸如 但不限于胶原和藻酸盐水凝胶)或细胞可W借其生长的任何其他基层。
[0053] 如本文所用的，"调亡抑制剂"是指能够下调、减少、抑制或W其他方式调节所期望 的酶的量和/或活性或通路(优选地在ER应激通路中的步骤)W防止诱导细胞调亡的任何化 合物或试剂，包括ER蛋白伴侣诱导剂、自隧诱导剂W及内源或外源性存活蛋白。对运些酶或 通路的抑制可通过本领域已知的多种机制中的任何机制来实现，该机制包括但不限于:直 接与酶结合(优选W可逆的方式），或者短暂地抑制编码酶或祀标的基因的表达(例如，转录 成mRNA，翻译成新生多肤，和/或最终多肤修饰成成熟蛋白质）。调亡抑制剂包括本文所述的 具体的调亡抑制剂。
[0054] 如本文所用的，术语"抑制"是指化合物或试剂下调、减少、降低、抑制、灭活或至少 部分地抑制酶的活性或者酶或蛋白质的表达的能力。优选地，该抑制是可逆的。 ER应激通路
[0055] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少一种调 亡抑制剂，该调亡抑制剂阻断ER应激通路中的至少一个必要步骤。
[0056] 如图IA所示，高等真核生物的未折叠蛋白质反应(UPR)信号传导通过S个近端邸 跨膜传感器一阳服、激酶/RNA酶IRE巧日转录因子ATF6来引发(例如，参见Kaufman RJ(2002) J Clin Invest HO:1389-1398.doi:10.1172/jci0216886；Mori K(2000)Cell 101:451-454.doi:10.1016/s0092-8674(00)80855-7;Ron D，Walter P(2007)化t Rev Mol Cell Biol 8:519-529.(1〇1:10.1038/11^11219)。阳服的活化通过61的〇(〇翻译起始因子）的憐酸化 导致蛋白质翻译在整体范围内的抑制（图lB;Harding等人，（2000)1〇10611 5:897-904.(1〇1:10.1016/31097-2765(00)80330-5)。与此相伴，阳服通过增加转录因子41。4的翻 译促进UPR特异性基因的转录。IRE1通过从XBP1 mRNA上切除内含子产生选择性剪接的更有 效形式的XBPl (例如，参见Calfon等人（2002)化ture 415:92-96. doi : 10.1038/415092a)。 第SUPR传感器一ATF6，是一种ER跨膜蛋白质，在其胞质侧上具有转录激活结构域。
[0057] 如图2A所示，在邸应激事件中，ATF6经历蛋白质水解，由此从邸膜释放其胞质反式 激活结构域。一旦被释放，该胞质反式激活结构域即进入细胞核化aze等人，（1999)Mol Biol Cell 10:3787-3799.doi :10.1091/mbc. 10.11.3787)并启动另外的UPR基因的转录。 由UPR引起的ER应激的近端传感器的活化导致复杂的基因调节模式。因此IPR信号旨在通过 上调邸蛋白伴侣如BiP、GRP94、巧网蛋白和化dj4提高蛋白质折叠能力来减轻和减少邸中高 水平的错折叠蛋白质（例如，参见Okada等人，（2002)Biochem J 366:585-594.doi: 10.1042/bj20020391;Yoshida等人，（1998)J Biol Chem 273:33741-33749.doi :10.1074/ jbc. 273.50.33741)。然而，在邸中的正确蛋白质折叠无法得到恢复的事件中，基因如CHOP 被上调并可导致调亡通路的激活。 l.GRP78/BiP
[0058] GRP78/BiP是内质网完整性和应激诱导的自隧所需的分子蛋白伴侣HSP家族的成 员。GRP78在调节未折叠蛋白质反应化PR)中起核屯、作用，并且是真核细胞中自隧的专性组 分，并可在细胞适应和致癌存活中发挥重要作用。GRP78的一种客户蛋白质是蛋白质双链 RNA激活的蛋白样内质网激酶(PE服），并且其与阳服的结合阻止阳服寡聚。GRP78还与客户 蛋白质IREl和ATF6结合W防止IREl的寡聚和ATF6的活化。GRP78在促进邸内部多聚体蛋白 质复合物的组装中发挥作用。 2.IREl
[0059] 需要肌醇的酶I(IREl)是一种具有核酸内切酶活性的ser/thr蛋白质激酶。IREl在 作为对基于内质网的应激信号的响应而改变基因表达方面是重要的，并且通过其N末端结 构域感测内质网的网眼中的未折叠蛋白质，从而导致酶的自活化。活性的核糖核酸内切酶 结构域对XBPlmRNA进行剪接W产生新的C末端，从而将其转化成有效的未折叠蛋白质反应 转录激活因子并触发生长停滞和调亡。激酶结构域通过反式自憐酸化而得到激活，并且激 酶活性对于核糖核酸内切酶结构域的活化是必需的。IREl被广泛表达且在膜腺组织中观察 到其高水平。IREl是二硫键连接的同二聚体，且二聚体形成由N末端腔结构域内的疏水作用 驱动并通过二硫键而稳定化。IREl还与HSPA5(未折叠蛋白质反应的负调节物)结合。该相互 作用可破坏同二聚体化作用并阻止IREl的激活。 3. 阳服
[0060] 真核生物翻译起始因子2-a激酶3，也称为P服R样内质网激酶或蛋白质激酶R(PKR) 样内质网激酶(PE服），是一种在人类中由EIF2AK3基因编码的酶。PE服对真核生物翻译起始 因子2化IF2)的a亚基进行憐酸化，导致其失活，并由此导致翻译引发的快速减少和对总体 蛋白质合成的抑制。它是位于内质网化R)中的I型膜蛋白，在内质网中它通过由错折叠蛋白 质导致的ER应激而得到诱导。 4. ATF6
[0061] 运种基因编码在内质网化R)应激过程中激活未折叠蛋白质反应(UPR)的祀基因的 转录因子。虽然它是转录因子，但运种蛋白质是不常见的，因为它作为嵌入ER中的跨膜蛋白 质而合成。它起到邸应激传感器/转导器的作用 ，并且在ER应激诱导的蛋白质水解后，它通 过存在于编码ER蛋白伴侣的基因的启动子中的顺式作用ER应激应答元件化RSE)而起到细 胞核转录因子的作用。该蛋白质已经被鉴定为静止的而非增殖性鱗状癌细胞的存活因子。 5. ASKl
[0062] 调亡信号调节激酶I (ASKl)也称为丝裂原活化蛋白激酶5(MAP3K5)，它是MAP激酶 家族的成员，并且同样是丝裂原活化蛋白激酶通路的一部分。ASKl直接将MKK4(SEK1)/MKK7 和MKK3/MKK6憐酸化，运随之响应于一系列应激如氧化应激、内质网应激和巧流入，W不依 赖Raf的方式激活C-Jun N末端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶。
[0063] 在无应激条件下，ASKl通过其C末端卷曲螺旋域(CCC)进行寡聚（对于其活化是必 需的），但由于减少的硫氧还蛋白（Trx)和巧W及整合素结合蛋白I(CIBl)的抑制作用，其仍 保持为无活性形式。Trx通过直接与其N末端卷曲螺旋域(NCC)结合而抑制ASKl激酶活性。 Trx和CIBl分别W氧化还原或巧敏感性方式调节ASKl活化。两者似乎都与TNF-a受体相关因 子2(TRAF2)---种ASKl活化剂相竞争。然后，TRAF2和TRAro被募集到ASKl，W形成更大分 子量的复合物(参见图2A)。随后，ASKl不仅通过CCC，还通过NCC来形成同寡聚相互作用，运 导致ASKl通过在苏氨酸845处的自憐酸化而完全活化。 6. JNK
[0064] C-Jun-N末端激酶(JNK1/2/3)是在哺乳动物细胞中发现的丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)级联的S个主要组之一的下游组分，其中另外两个由细胞外信号调节激酶化RK1/2) 和p38蛋白激酶(p38.a、e、丫、S)组成。每一组的激酶均为包括MAPK的=模块级联的一部分， 该MPK通过由MAPK激酶(MAPKK)引起的憐酸化而得到激活，该MPK激酶随之通过由MAPKK激 酶(MAPKKK)引起的憐酸化而得到激活。已将JNK和p38的活化与调亡的诱导相联系。通过采 用多种细胞类型，证明了 JNK的持续活化诱导细胞死亡，并且证明通过显性阴性化N)抑制剂 对JNK活化的阻滞阻止了由一系列调亡刺激导致的杀伤。通过对祀向破坏化k基因的小鼠的 分析也证明了 JNK在调亡中的作用。JNKl和JNK2均缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)对由多 种应激刺激导致的调亡具有完全的抗性，该应激刺激包括基因毒物、UV福射和茵香霉素，并 且化k3-/-神经元在对兴奋毒素的调亡反应中表现出严重的缺陷。而且，已证明JNK2对于在 未成熟胸腺细胞中的抗-CD3诱导的调亡是必需的。 7. P38MAP 激酶
[0065] P38MAP激酶(a、e、丫和S)是MAPK家族的成员，并且W下四种P38MPK均已经在高等 真核生物中进行克隆：p38-a/XMpk2/CSBP、p38-e/p38-的2、p38- 丫 /SAPK3/ERK6和p38-S/ SAPK4。运四种蛋白质在其氨基酸序列上有60-70%相同，并且均被MKK6(MAPK激酶-6)激活。 已证明另一种MPK激酶一MKK3(MAPK激酶-3)将p38-a、p38-丫和P38-S(而非P38-02)憐酸化 并激活。哺乳动物P38MAPK家族通过细胞应激而激活，该细胞应激包括UV福射、热激和高渗 透应激。
[0066] 由于越来越多的转录因子被认为是p38的直接祀标，因此P38MAP激酶的活化还可 直接影响基因转录。已经描述了 ATFUATF2和ATF-6、MEF2A/C(肌细胞增强因子-2A/C)、 SAPlA(信号传导淋己细胞活化分子相关蛋白-1A) W及ElkUETS域转录因子-1)的直接憐酸 化和活化。 8. MEK
[0067] "MEK1"和"MEK2"是丝裂原活化的邸K活化激酶的缩写巧中邸K是细胞外信号调节 蛋白激酶，MAPK的另一个名称）dMEK巧PMEK2是双功能的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶， 并且也被称为MAP激酶。Ras-GTP激活Raf ,Raf激活MEKl和MEK2，而MEKl和MEK2激活MAP激酶 (MAPK)。一旦被激活，Raf和其他激酶将两个相邻的丝氨酸残基(在MEK-I的情况下为S 2IS和 S222 )上的MEK憐酸化。运些憐酸化对于MEK活化为激酶是必需的。随之，MEK将在由单个氨基 酸分开的两个残基上的MAP激酶憐酸化，该单个氨基酸为:酪氨酸(Y"5)和苏氨酸(T"3)。在 将MP激酶憐酸化之前，MEK似乎与MAP激酶紧密关联，表明MEK对MAP激酶的憐酸化可能需要 两种蛋白质之间预先的强相互作用。 9. PI3K-Akt 通路
[0068] 憐脂酷肌醇3'-激酶(PUK)-Akt信号传导通路被多种类型的细胞刺激或毒性损伤 激活，并且调苄基本的细胞功能如转录、翻译、增殖、生长和存活。生长因子与其受体酪氨酸 激酶(RTK)或G蛋白偶联受体(GPCR)的结合分别刺激Ia和Ib类PI3K同种型。PUK催化憐脂酷 肌醇-3,4,5-S憐酸(PIP3)在细胞膜处的产生。PIP3转而作为帮助激活Akt的第二信使。一 旦成为活性的，Akt可通过使参与调亡、蛋白质合成、代谢和细胞循环的底物憐酸化来控制 关键的细胞过程。 10. XBP-I
[0069] 该基因编码通过与被称为X盒的启动子元件结合而调节MHC II类基因的转录因 子。该基因产物为bZIP蛋白，其也被鉴定为与T细胞白血病病毒I型启动子的启动子中的增 强子结合的细胞转录因子。已经发现，未折叠蛋白质在内质网巧R)中积累时，该基因的mRNA 通过经由核酸内切酶肌醇需求酶I(IREl)介导的非常规剪接机制被加工成活性形式。所产 生的来自剪接的mRNA的26nt的损失导致移码和同种型XBPl(S),该同种型XBPl(S)是功能活 性转录因子。由未剪接的mRNA编码的同种型一XBPl(U)是组成型表达的，并且被认为起到 XBPl(S)的负反馈调节物的作用，其关闭祀基因在邸应激的恢复阶段中的转录。XBPl的假基 因已被鉴别出且位于5号染色体。 11. eIF2-a
[0070] eIF2-a是翻译起始因子，其通过与GTP和起始因子tRNA形成S元复合物而在蛋白 质合成的早期步骤中起作用。该复合物与40s核糖体亚基结合，随后与mRNA结合形成43S起 始前复合物。连接60S核糖体亚基W形成80S起始复合物之前，将与eIF-2结合的GTP水解并 释放eIF-2-GDP二元复合物。为了 eIF-2再循环并催化另一轮的引发，与eIF-2结合的GDP必 须W经由eIF-2B催化的反应的方式与GTP交换。eIF2-a被阳服、GCN2、皿I和PKR等至少4种激 酶被憐酸化，并且憐酸化使eIF-2/GDP/eIF-2B复合物稳定化并阻止GDP/GTP交换反应，由此 减少eIF-2在连续数轮引发之间的再循环并导致翻译的全面抑制。 12. GSK3
[0071] 糖原合成酶激酶-3(GSK3)最初被鉴定为参与糖原代谢的控制的酶。近年来已经证 明它在调节各种不同的细胞功能中具有关键作用，运些细胞功能包括蛋白质合成的引发、 细胞增殖、细胞分化、调亡，并且其作为Wnt信号传导级联的组分是胚胎发育所必需的。GSK3 作为膜岛素信号传导通路中的核屯、负调节物且在膜岛素抗性中发挥作用。 13. NRF2
[0072] 核因子(红系衍生2)样2也被称为NFE2L2或NRF2,是在人类中由NFE2L2基因所编码 的转录因子。NRF2抗氧化反应通路是针对氧化应激的细胞毒性效应的主要细胞防御。NRF2 增加了若干种抗氧化酶的表达。
[0073] NRF2是碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子。在正常或未应激的条件下，NRF2通过 Kelch样-ECH-相关蛋白UKEAP1)和滞蛋白3(化Ilin 3)(其通过泛素化降解NRF2)保持在细 胞质中。在氧化应激下，NRF2不被降解，而是转移到细胞核中，在那里它引发抗氧化基因及 其蛋白质的转录。 14. KEAPl
[0074] 已经证明Kelch样ECH相关蛋白UKEAPl)与NRF2(抗氧化反应的主要调节物）相互 作用。在静态下，NRF2通过与KEAPl结合而错定在细胞质中，KEAPl转而促进泛素化和随后的 NRF2蛋白质水解。运种结合和NRF2在细胞质中的进一步降解是KEAP1对NRF2的抑制效应的 机制。 15. ATF4
[007引激活转录因子4(化X-响应性增强子元件B67)也称为ATF4,是人类中由ATF4基因编 码的蛋白质。该基因编码最初被鉴定为广泛表达的哺乳动物DNA结合蛋白的转录因子，该 DNA结合蛋白可W结合HTLV-I的LTR中的tax-响应性增强子元件。编码的蛋白质还被分离并 被称为cAMP反应元件结合蛋白2 (CREB-2)。由该基因编码的蛋白质属于DNA结合蛋白家族， 该家族包括转录因子的AP-I家族、cAMP反应元件结合蛋白（CREB)和CR邸样蛋白。运些转录 因子共享蛋白质-蛋白质相互作用中设及的亮氨酸拉链区，该亮氨酸拉链区位于充当DNA结 合域的一段碱性氨基酸的C末端。已描述了编码相同蛋白质的两个替代转录物。两个假基因 位于X染色体上含有较大反向重复的区域中的q28处。 干燥储存稳定剂 1.天然和合成的氨基酸
[0076] 同样如本文所述的，某些实施方案中脱水制剂可在用于将功能性细胞在环境溫度 下基本干燥储存的脱水制剂中包含至少一种氨基酸或合成氨基酸。
[0077] 在某些实施方案中，该天然氨基酸选自甘氨酸、谷氨酷胺、谷氨酸和脯氨酸。
[0078] 在某些其他实施方案中，该脱水制剂和组合物可含有一种或多种具有通式I的合 成氨基酸，
其中Ri、R2、R3独立地选自芳基、芳烷基、-H、-C出和-C出-C曲，其中当Ri和R2为C出或Ofe-C出时，化为H或不存在，其中X选自-C出-，-C出CH2-，-OfcC出CH2-，-OfcC出OfcC出-，
并且其中Y选自COO和S03。
[0079] 在所述组合物中有用的示例性合成氨基酸包括在W02010132508和美国专利8， 519,125中描述的那些，运些文献的内容通过引用全文并入本文。可在本发明组合物中采用 的合成氨基酸包括径脯氨酸和甜菜碱(N，N，N-S甲基甘氨酸）。 2. 肤
[0080] 在某些实施方案中，本文所述的用于将细胞在环境溫度下基本干燥储存的脱水制 剂可含有肤。有利的是，已确定包含稳定量(例如，约IOmM到200mM)的小二肤或二肤类似物 的某些脱水制剂(包括表1中列出的那些）出乎意料地能够将细胞在环境溫度下基本干燥储 存，并且储存持续超过运些细胞的冷藏的时间段。示例性的二肤具有氨基酸序列丙氨酸-谷 氨酷胺。 3. =糖
[0081] 如本文所述，本文所述的某些实施方案中，所述制剂可在用于将细胞在环境溫度 下基本干燥储存的脱水制剂或组合物中包含至少一种=糖。=糖是由两个糖巧键连接的= 个单糖组成的寡糖。糖巧键可在组分单糖上的任意径基基团之间形成，且不同的键组合（区 域选择性)和立体化学(a-或e-)产生S糖，该S糖为具有不同的化学和物理性质的非对映 异构体。可基于本公开内容并根据本领域的常规实践来完成稳定储存组合物中所包含的一 种或多种特定=糖的选择，并且该选择可受到包括其他制剂组分在内的多个因素的影响。 示例性的=糖包括但不限于麦芽=糖、异麦芽=糖、棉子糖、松=糖(melezitriose)、黑曲 霉=糖和酬糖。在用于细胞的基本干燥储存的某些实施方案(包括表1中列出的制剂）中，该 S糖是松S糖并且优选浓度为约1 %-20 %，更优选约5.0-15 %，其中"约"可理解为表示量 的变化，该量的变化可W是比所述量高或低少于25%，更优选少于20%，且更优选少于 15%、10%、5% 或 1%。 4. 水溶性聚合物
[0082] 如本文所述，某些实施方案可在用于全血样品中核酸和/或多肤分子的基本稳定 储存的制剂和组合物中包含至少一种水溶性聚合物。运样的水溶性聚合物包括聚乙締化咯 烧和聚乙締醇，并且可W理解，技术人员根据本公开内容可选择用于基本干燥储存的制剂 和组合物的其他水溶性聚合物，因为其可基于所采用的组合物的其他组分和被储存的特定 细胞类型而变化。某些实施方案(包括但不限于在表1中所示的那些)预期包含浓度(基于体 积，即vol/vol)为约0.1-10% (vol/vol)，更优选约0. l-5%(vol/vol)，且更优选1.0% (vol/vol)的水溶性聚合物，其中"约"可理解为表示量的变化，该量的变化可W是比所述量 高或低少于50%，更优选少于40%，更优选少于30%，且更优选少于20%、15%、10%或5%。 在某些实施方案中，该水溶性聚合物为分子量范围为约30-70，000道尔顿且约87-90 %水解 的聚乙締醇，其中"约"可理解为表示量的变化，该量的变化可W是比所述量高或低少于 50%，更优选少于40%，更优选少于30%，且更优选少于20%、15%、10%或5%。 5. 非还原糖
[0083] 同样如本文所述，某些实施方案可在环境溫度下的预脱水和/或脱水制剂W及组 合物中包含至少一种非还原糖。非还原糖为缺少功能性醒基的糖分子。示例性的非还原糖 包括薦糖和海藻糖。在用于细胞的基本干燥储存的实施方案中，该非还原糖为W约1.0-200mM，优选约50mM-200mM，且更优选约150mM的浓度存在的海藻糖，其中"约"可理解为表示 量的变化，该量的变化可W是比所述量高或低少于25%，更优选少于20%，且更优选少于 15%、10%、5% 或 1%。 6. 聚酸
[0084] 根据某些实施方案，聚酸可包含在本文所述的用于将功能性细胞在环境溫度下基 本稳定储存的脱水制剂中。聚酸通常是指在其主链中含有多于一个酸官能团的聚合物。聚 酸是通过醇脱水形成的相对稳定的化合物。用于在所述制剂、组合物和方法中使用的示例 性的聚酸包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇和聚苯酸。在某些实施方案中，聚酸的分子量为 约5,000到15,000道尔顿。 7.四氨喀晚
[0085] 在某些实施方案中，所述干燥储存稳定剂是四氨喀晚。示例性的四氨喀晚为5-径 基四氨喀晚巧-hydro巧ectoine)。在某些脱水制剂和组合物中，使用约IOmM到约200mM浓度 的5-径基四氨喀晚。 制剂试剂 1. pH缓冲液
[0086] 根据某些实施方案，本文所述的、用于将功能性细胞在环境溫度下基本干燥储存 的脱水制剂和组合物可包含一种或多种抑缓冲液，该pH缓冲液可W是由于其抵抗溶液(如 pH缓冲液存在于其中的水溶液)的pH变化的能力而被本领域所知的大量化合物中的任意化 合物。可基于本公开内容并根据本领域中的常规实践来完成包含在稳定储存组合物中的一 种或多种特定抑缓冲液的选择，并且该选择可受到多种因素的影响，该因素包括期望维持 的pH、生物样品的性质、将要采用的溶剂条件、将要使用的制剂的其他组分W及其他标准。 例如，通常使用在质子解离常数(pKa)为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或 1.0抑单位内的抑下的抑缓冲液，质子解离常数是缓冲液的特征。
[0087] pH缓冲液的非限制性实例包括巧樣酸、酒石酸、苹果酸、横基水杨酸、横基间苯二 甲酸、草酸、棚酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙横酸）、CAPS0(3-(环己基氨基)-2-径基-1-丙横酸）、EPPS(4-(2-^基乙基)-1-赃嗦丙横酸）、肥PES(4-(2-^基乙基）赃嗦-1-乙横酸）、 MES(2-(N-吗嘟基）乙横酸）、M0PS(3-(N-吗嘟基）丙横酸）、M0PS0(3-吗嘟基-2-径基丙横 酸）、PIPES(1，4-赃嗦二乙横酸）、TAPS(N-[S(^基甲基）甲基]-3-氨基丙横酸）、TAPS0(2-径基-3-[^(径基甲基）甲基氨基]-1-丙横酸）、TES(N-[S(^基甲基）甲基]-2-氨基乙横 酸）、bicine(N，N-双（2-径基乙基)甘氨酸）、化icine(N-[S(^基甲基）甲基]甘氨酸）、S (^巧圣基甲基）氨基甲烧）和双-S(2-[双（2-径基乙基）氨基]-2-巧圣基甲基）-1,3-丙二 醇）。本文中设及的某些实施方案(包括表X中列出的那些中的多个)可W WpH为约4.0、4.1、 4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、 8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的制剂为特征，其中"约"可理解为表示 量的变化，该量的变化可W是比所述抑值高或低少于1，优选少于0.5,优选少于0.25,且更 优选少于0.1个抑单位。 2. 馨合剂
[008引根据某些实施方案，馨合剂(化elating agent)或馨合剂(化elator)可包含在本 文所述的、用于血液样品中的完整活细胞的基本稳定储存的组合物中，并且由于其与金属 阳离子复合并阻碍金属阳离子的反应性的能力而被熟悉本领域的技术人员所知。示例性的 馨合剂包括二乙締 S胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸化DTA)、乙二醇四乙酸化GTA)、反式- 1,2-二氨基环己烧-N，N，N'，N'-四乙酸(CDTA)、l，2-双（2-氨基苯氧基）乙烧-N，N，N'，N'-四 乙酸(BAPTA)、l，4,7，10-四氮杂环十二烧-l，4,7，10-四乙酸(D0TA)、N-(2-?基乙基）乙二 胺-N，N'，N'-S乙酸、葡萄糖酸钢和次氮基S乙酸(NTA)。一种馨合剂是葡萄糖酸钢并且W 约1.0-50mM，更优选约10-40mM，且更优选约25mM的浓度存在，其中"约"可理解为表示量的 变化，该量的变化可W是比所述量高或低少于25%，更优选少于20%，且更优选少于15%、 10%、5% 或 1%。 表1 用于将功能性细胞在环境溫度下基本干燥储存的示例性脱水制剂
脱水过程
[0089] 本发明的MCS脱水制剂能够在存在或不存在采用预脱水制剂的先前处理的情况 下，在脱水过程中维持细胞膜和细胞器的完整性W及细胞的总体形态，W使得细胞在基本 干燥储存后再水化时，细胞保持至少一种如脱水之前的细胞的功能性质，例如，细胞活力。
[0090] 例如，可通过简单的目测来确定脱水细胞的干燥，W确保所有水分均已蒸发或去 除。在一些实施方案中，可优选地包括水分指示物，W确定已经实现的干燥程度。将细胞基 本干燥的时间可根据MCS脱水制剂中存在的试剂而变化。根据制剂组分和细胞所固定的器 皿的几何形状，细胞最适宜在约一到S小时的时间段内脱水。细胞在约32°C-39°C的溫度范 围内，优选在约37°C下脱水，并可在培养箱中或在采用控制溫度、氧气水平和相对湿度的环 境室的更加受控的条件下脱水。通过调节相对湿度可调节脱水的速率。例如，在包含水溶性 聚合物(例如，PVA)的MCS制剂中脱水的细胞将花费更长的时间来脱水，所W可降低相对湿 度W有利于优化脱水时间。另外，多种干细胞的基本干燥储存在5 %的氧气浓度下进行，W 确保细胞维持在基本在免疫学上未分化的状态。
[0091] 可采用在细胞上方保持活跃的空气流动同时控制溫度和湿度的其他脱水方法。
[0092] 可采用可气密密封的罩或袋来储存基本干燥的细胞，W使得内容物可被密封W在 与用于细胞脱水的条件相似的气候条件下储存。基本干燥储存的细胞最适宜在恒溫如室溫 下储存。 调亡抑制剂
[0093] 在某些实施方案中，本文所述的预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少 一种调亡抑制剂。在某些实施方案中，该至少一种调亡抑制剂阻断细胞调亡的诱导。在其他 实施方案中，该调亡抑制剂阻断ER应激通路中的至少一个步骤，且优选为可逆抑制剂。
[0094] 在某些实施方案中，所述脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂。在其他实施方案中， 所述预脱水制剂或再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂，并且在其他实施方案中，所述预 脱水制剂和再水化制剂各自包含至少一种调亡抑制剂。在 预脱水制剂和再水化制剂中存在 的至少一种调亡抑制剂可W是相同的或可W是不同的。在某些其他实施方案中，所述预脱 水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少两种调亡抑制剂。
[0095] 调亡抑制剂(包括本文所举例的那些)通常可通过多个商业制造商和供应商(包括 但不限于Calbiochem、SelleckCh em、Si gma-A Idr i ch、EMD Millipore、IXLabs和 medcheme邱ress)商购获得，或可采用已知的方法(包括本文公开的那些方法)合成。每种调 亡抑制剂的最佳浓度可通过滴定在预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂中的调亡抑制 剂的量来确定，运完全在本领域技术人员的技能范围内。
[0096] 示例性的调亡抑制剂包括： 1. 阳服-eIF2-a抑制剂
[0097] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂阻断PE服-eIF2-aa通路。示例性的 阳服-eIF2-aa 通路抑制剂是 salubrinal、Sal-003(3-苯基-N-[2，2，2-S 氯-1-[ (4-氯苯基） 硫代氨基甲酯氨基]乙基]丙-2-締酷胺）、GSK 2606414(7-甲基-5-(l-{[3-(S氣甲基）苯 基]乙酷基}-2，3-二氨-IH-吗隙-5-基)-7H-化咯并[2，3d]喀晚-4-胺）、GSK 2656157( 1-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-化咯并[2，3-d]喀晚-5-基）-4-氣吗I噪嘟-1-基)-2-(6-甲基化晚-2-基）乙酬)和ISRIB(反式-N，N'-(环己烧-1,4-二基)双(2-(4-氯苯氧基）乙酷胺）。
[0098] Salubrinal是eIF2-a憐酸酶的特异性抑制剂。Salubrinal间接地抑制eIF2，运是 由于其a-亚基的减少的脱憐酸化导致通常由诸如氧化应激或内质网中未折叠蛋白质的积 累等事件所触发的应激响应通路的激活。
[0099] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将salubrinal W约InM到约2.0咖的浓度范围，优选约1碰到900碰，更优选约10碰 至lj250nM，并且更优选约30nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 2. ASKl抑制剂
[0100] 在其他实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂，其阻断JNK和P38MAP 激酶的下游活化。多种合适的ASKl抑制剂是已知的（例如，参见美国专利号8,178,555、8， 378，108、8，440，665和8，598，360)或者是可商购的，例如，MLS-0315763 (国立卫生研究院 (化tional Institute of Health))。示例性的ASKl抑制剂包括但不限于苯并二氮杂草酬 (benzodiazepinone)抑制剂化im等人，（2009) J.Biol.化em. 284:1593-1603)、NDQI-I和 MLS-0315763。
[0101] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将NDQI-IW约50nM到约3. OiiM的浓度范围，优选约250nM到2.0測，更优选约400nM 到2.OiiM,并且更优选约1.OiiM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。
[0102] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些其他实 施方案中，可W将MLS-0315763 W约InM到约50化M的浓度范围，优选约InM到25化M，更优选 约InM到IOOnM,并且更优选约IOnM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 3. NRF2-KEAP1 抑制剂
[0103] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂阻断NRF2-KEAP1通路。
[0104] 示例性的NRF2-KEAP1通路抑制剂包括但不限于鼠尾草酸、S祗类化合物、萝h硫素 (sulphora地ane)和叔下基氨酿。
[0105] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将萝h硫素 W约50nM到约1.OiiM的浓度范围，优选约50nM至化OOnM，更优选约IOOnM 至lj400nM，并且更优选约220nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 4. JNK抑制剂
[0106] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。考虑将任何JNK抑制 剂用于本发明的制剂、组合物和方法中。JNK抑制剂通常是本领域技术人员已知的（例如，参 见美国专利号6，949，544、7，129，242、7，326，418、8，143，271W及8，530，480)。
[0107] 示例性的JNK抑制剂包括但不限于SP600125(蔥并[l-9-cd]化挫-6(2H)-酬KJNK-IN-8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-下締 -1-基]氨基]-N-[3-甲基-4-[[4-(3-化晚基)-2-喀晚基]氨基]苯基]-苯甲酯胺）和JNK-抑制剂IX(N-(3-氯基-4,5,6,7-四氨苯并[b]嚷 吩-2-基)-1-糞甲酯胺）。
[0108] 在进一步的实施方案中，JNK抑制剂与P38MAP激酶抑制剂组合使用W阻断ASKl的 下游活化。 5. P38MP激酶抑制剂
[0109] 在某些其他实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是P38MAP激酶抑制剂。P38MAP 激酶抑制剂通常是众所周知的（例如，参见美国专利号7,521，460、7,592,455、7,728,013W 及7,795,256)。
[0110] 示例性的P38MP激酶抑制剂包括但不限于SB203580(4-(4-(4-氣苯基)-2-(4-(甲 基亚横酷基）苯基)-lH-咪挫-5-基川比晚）、LY2228820(5-(2-叔下基-4-(4-氣苯基)-lH-咪 挫-5-基)-3-新戊基-3H-咪挫并[4,5-b]化晚-2-胺二甲横酸盐）、PD169316(4-(4-氣苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-化晚基)-lH-咪挫）、PH-797804(3-(4-(2,4-二氣节氧基)-3-漠-6-甲基-2-氧代化晚-l(2H)-基)-N，4-二甲基苯甲酯胺）、SB202190(4-(4-(4-氣苯基)-5-川比 晚-4-基)-lH-咪挫-2-基)苯酪）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔下基-1-对甲苯基-IH-化挫-5-基）-3-(4-(2-吗嘟基乙氧基）糞-1-基）脈）、￥乂-702(1-(5-氨基甲酯基-6-(2,4-二氣苯 基川比晚-2-基）-1-(2,6-二氣苯基）脈）、TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲基苯基）-5-嚷挫 基]-2-化晚基]-苯甲酯胺。
[0111] 在某些其他实施方案中，所述预脱水制剂和/或再水化制剂包含JNK抑制剂和 P38MAP激酶抑制剂W阻断下游ASKl依赖性信号传导。 6. GSK3抑制剂
[0112] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂和/或再水化制剂包含阻断GSK3的调亡抑制 剂。多种GSK3抑制剂适于在本文所述的制剂和方法中使用。GSK3抑制剂是本领域技术人员 公知的（例如，参见美国专利号 6,057，117、6，153,618、6,417，185、6,465,231、6,489,344、 6,608,632、6,800,632、6,949,547、7,045,519、7,037,918、7,425,557、8，143,271^及8， 664,244)，并且多种GSK3抑制剂是可商购的，例如，CHIR98014、N-6-[2-[ [4-(2,4-二氯苯 基）-5-( IH-咪挫-2-基）-2-喀晚基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-化晚二胺（Selleckchem.com; 目录号S2745) W及丙戊酸（Si卵a-Al化ich，St丄OUis ,MO;目录号P4543)。
[0113] 特别优选的GSK3抑制剂包括但不限于CHIR98014、丙戊酸盐、CT 99021和CT 20026。
[0114] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将CHIR98014 W约0.25iiM到约3. OiiM的浓度范围，优选约O . 5iiM到2.75咖，更优选 约1. OiiM到2. OiiM，并且更优选约1.25iiM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 7. IRE-I抑制剂
[0115] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含阻断IREl的 调亡抑制剂。IREl抑制剂是已知的（例如，参见美国专利号8，372，861)。
[0116] 示例性的IREl抑制剂包括但不限于IREl抑制剂I(N-[(2-^基糞-1-基)亚甲基]嚷 吩-2-横酷胺KIREl抑制剂11(3/-甲酯基-少-径基-5^-甲氧基联苯基-3-甲酯胺）W及IREl 抑制剂III(8-甲酯基-7-径基-4-甲基香豆素，7-径基-4-甲基-2-氧代-2H-色締-8-甲醒）。 8. 脫天蛋白酶-1抑制剂
[0117] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0118] 用于在本文所述的制剂、组合物和方法中使用的示例性脫天蛋白酶-1抑制剂包括 但不限于脫天蛋白酶-1抑制剂II (Ac-YVAD-氯甲基甲酬）、N-(2-哇嘟基)鄉氨酷-天冬氨酷-(2,6-二氣苯氧基）甲基甲酬（其中天冬氨酷残基是a-甲基化或非a-甲基化的）、VX-765 ((S)-1-( (S)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酯氨基)-3,3-二甲基下酷基)-N-( (2R,3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氨巧喃-3-基川比咯烧-2-甲酯胺)和ZVAD-氣甲基甲酬。 9. 巧蛋白酶抑制剂
[0119] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。存在至少15种 不同的巧蛋白酶同种型(巧蛋白酶1-15)。巧蛋白酶抑制剂是本领域技术人员公知的（例如， 参见美国专利号 5,541，290、6,448,245、7,001，770、7,476,754^及7,932,266)。本发明的 预脱水制剂和/或再水化制剂可包含任何合适的巧蛋白酶抑制剂或巧蛋白酶抑制剂的组 厶 1=1 O
[0120] 用于在本文所述的制剂、组合物和方法中使用的特别优选的巧蛋白酶抑制剂包括 但不限于巧蛋白酶抑制剂I (N-乙酷基-Leu-Leu-正亮氨酸-C册）、巧蛋白酶抑制剂II (N-乙 酷基-Leu-Leu-Met)、巧蛋白酶抑制剂III(Z-Val-Phe-CHO)、巧蛋白酶抑制剂IVU-Leu-Leu-Tyr-C出F)、巧蛋白酶抑制剂V(吗嘟基酷脈基;-化^高苯丙氨酸-C出F)、巧蛋白酶抑制 剂VK4-氣苯基横酷基-A^^Leu-C册）、巧蛋白酶抑制剂X(Z-Leu-a-氨基下酸-CON肥抽日）、巧 蛋白酶抑制剂XI(Z-ka-氨基下酸-C0NH(C此)3-吗嘟）和巧蛋白酶抑制剂XII(Z-k正鄉氨 酸-CONH-C出-2-化晚基）。 10. MEK抑制剂
[0121] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是MEKl或MEK2抑制剂。MEKl和MEK2 抑制剂是已知的（例如，参见美国专利号6,310,060、6,440,966、6,638,945、7,001，905、7， 169,816、7,745,663、7,803,839、7,897,624、8,394,822,8492,427^及8,642,584)，并且是 可商购的。
[0122] 示例性的MEK抑制剂包括但不限于PD0325901，N-[(2R)-2,3-二?基丙氧基]-3,4-二氣-2-[(2-氣-4-舰苯基)氨基]-苯甲酯胺;MEK162(5-[(4-漠-2-氣苯基)氨基]-4-氣-N-(2-径基乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪挫-6-甲酯胺）、PD184352(2-(2-氯-4-舰苯基氨基)-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氣苯甲酯胺）、pimaseパ化（（S)-N-(2,3-二?基丙基)-3-(2-氣-4-舰苯基氨基)异烟酷胺）、司美替尼(6-(4-漠-2-氯苯基氨基)-7-氣-N-(2-^基乙氧基)-3-甲基-3H-苯并[d]咪挫-5-甲酯胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氣-4-舰苯基氨基)- 6,8-二甲基-2,4,7-S氧代-3,4,6,7-四氨化晚并[4,3-d]喀晚基)苯基）乙酷胺）、 PD98059(2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并化喃-4-酬）、110126-610化（22,32)-2,3-双 (氨基(2-氨基苯硫基)亚甲基)班巧腊，乙醇）。
[0123] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将PD0325901W约InM到约l.OiiM的浓度范围，优选约IOnM到500nM，更优选约20nM 至lj250nM，并且更优选约50nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 11.PI3K通路抑制剂
[0124] 在某些其他实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。
[0125] 用于在本文所述的制剂、组合物和方法中使用的示例性PI3K抑制剂包括但不限于 dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-哇嘟-3-基咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基)苯基] 丙腊）、60(：-0941(2-(1护吗|挫-4-基)-6-[[4-(甲基横酷基)-1-赃嗦基]甲基]-4-(4-吗嘟 基）嚷吩并[3,2-d]喀晚）、1￥294002(2-(4-吗嘟基）-8-苯基-佔-1-苯并化喃-4-酬）、 idealalisib(5-氣-3-苯基-2-[(lS)-1-(7H-嚷岭-6-基氨基）丙基]-4(3H)-哇挫嘟酬）、 burpar 1 i S化（5-(2，6-二吗嘟基喀晚-4-基）-4-(S氣甲基）邮晚-2-胺）、GDC-0032 (4-[ 5，6-二氨-2-[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-lH-l，2,4-S挫-5-基]咪挫并[1，2-(1][1，4]苯并氧氮杂 草-9-基]-a，a-二甲基-IH-化挫-1-乙酷胺）、PI-103(3-(4-(4-吗嘟基川比晚并[3'，2' ：4,5] 巧喃并[3,2-d]喀晚-2-基)苯酪）、NU7441(8-(4-二苯并嚷吩基)-2-(4-吗嘟基苯并 化喃-4-酬）、GSK2636771(2-甲基甲基-3-(S氣甲基)苯基]甲基]-6-(4-吗嘟基)-IH-苯并咪挫-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(lS)-1-(9H-嚷岭-6-基氨基）乙基]-1-(2H)-异哇嘟酬）、)(L147(N-(3-(苯并k][l，2,5]嚷二挫-5-基氨基)哇喔嘟-2-基)-4-甲基 苯横酷胺）、TGX-221(7-甲基-2-(4-吗嘟基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-化晚并[l，2-a]喀 晚-4-酬）、PIK-90(N-(7，8-二甲氧基-2，3-二氨-咪挫并[1，2-C]哇挫嘟-5-基)-烟酷胺）、渥 曼青霉素（11-(乙酷氧基)-1,6b,7,8,9a, 10,11, Ub-八氨-1-(甲氧基甲基)-9a, 1化-二甲 基-，（15,663,9日5，111?，1化1〇-3护氣[4,3,2-(16]巧并[4,5-11]-2-苯并化喃-3,6,9-^酬）、 VS-5584(5-[8-甲基-9-(1-甲基乙基）-2-(4-吗嘟基）-9H-嚷岭-6-基]-2-喀晚胺）和TG-100703(3-(2,4-二氨基-6-蝶晚基)-苯酪）。
[0126] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将LY294002W约IOnM到约2.0測的浓度范围，优选约20碰至1]1.0咖，更优选约50碰 至化OOnM,并且更优选约120nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 ER蛋白伴侣诱导剂
[0127] 在某些方面，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少一种调亡抑制 剂和ER蛋白伴侣诱导剂。用于在本文所述的制剂、组合物和方法中使用的合适的ER蛋白伴 侣诱导剂包括但不限于BIX、丙戊酸盐和裡。 1. BIX
[0128] BiP诱导剂X(BIX)在筛选诱导GRP78/BiP表达的化合物时得到鉴定。BIX优先诱导 BiP,轻微诱导GRP94(94W)a葡萄糖调节蛋白质）、巧网蛋白和C/EBP同源蛋白。通过BiP基因 上游的邸应激响应元件的激活经由ATF6(活化转录因子6)通路来介导BIX对BiP mRNA的诱 导。 2. 丙戊酸盐
[0129] 丙戊酸(2-丙戊酸）已被批准用于癒痛、双相躁狂症和偏头痛的预防和治疗。丙戊 酸在室溫下为液体，但它可W与碱如氨氧化钢反应W形成盐丙戊酸钢，其为固体。丙戊酸盐 的作用机制尚未完全清楚，但已经证明其抑制CYP2C9、葡糖醒酷基转移酶和环氧化物水解 酶并导致大脑中丫-氨基下酸(GABA)水平增加。丙戊酸盐的施用增加了GRP78/BiP的表达， 从而使S种近端跨膜传感器PE服、IREl和ATF6稳定在有利的失活状态。 3.裡
[0130] 元素裡用于治疗多种情绪障碍。裡的施用增加了 GRP78/BiP的表达，从而使S种近 端跨膜传感器PE服、IREl和ATF6稳定在期望的失活状态。 自隧诱导剂
[0131] 在某些其他方面，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少一种调亡 抑制剂和自隧诱导剂。自隧诱导剂是一系列不同的化合物，其有利地促进不需要的或错折 叠的蛋白质的溶酶体降解，从而提高WR对细胞的效果。尽管不希望受到任何理论的束缚， 但有人认为调亡抑制剂和自隧诱导剂的组合阻断m?应激通路，同时进一步促进可能由于脱 水而产生的错折叠蛋白质的降解，从而有助于W保持至少一种如脱水前细胞的功能性质的 方式将细胞再水化。
[0132] 示例性的自隧诱导剂包括但不限于氣司必林、=氣拉嗦、匹莫齐特、尼卡地平、尼 古地平、洛赃下胺、胺舰酬、雷帕霉素、白襲芦醇和SMER。
[0133] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将雷帕霉素 W约InM到约1 .OiiM的浓度范围，优选约20nM到200nM，更优选约20nM 到80nM，并且更优选约20nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 存活蛋白
[0134] 在另一个方面，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含存活蛋白。示例 性的存活蛋白为Bd-xL。
[0135] 8(31-义1^是8化-2家族的成员，并且是位于线粒体中的跨膜蛋白。据报道8(：1^两种 形式存在，即长的形式Bcl-XL和较短的剪接变体形式Bcl-xS"Bcl-xL在内源性调亡通路的 水平下起作用，而外源性通路(Fas/TNF死亡受体)直接导致脫天蛋白酶激活，从而防止线粒 体内容物如细胞色素 C的释放，细胞色素 C将导致脫天蛋白酶激活。促-存活和抗-存活Bd-2 家族蛋白质的相对量决定细胞是否将经历细胞死亡是调亡领域中的一个已确定的概念。
[0136] 在某些实施方案中，采用脂质体制剂将Bd-xL递送至细胞W确保足够的Bcl-XL细 胞内摄取。 预脱水制剂
[0137] 在某些方面，用于细胞的基本干燥储存的组合物和方法包括另外的步骤:在脱水 之前用预脱水制剂处理细胞。在一个实施方案中，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂， 优选可逆调亡抑制剂。在另一个实施方案中，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至 少一种ER蛋白伴侣诱导剂、至少一种自隧诱导剂或至少一种存活蛋白。
[0138] 在某些实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂选自PE服-eIF2-a抑 制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制剂、GSK3抑 制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0139] 在一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是PE服-eIF2-a抑制 剂。在某些实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂选自salubrinal、Sal-003(3-苯基-N-[2,2， 2-S氯-1-[(4-氯苯基)硫代氨基甲酯氨基]乙基] 丙-2-締酷胺）、GSK 2606414(7-甲基-5-(1-{[3-(立氣甲基)苯基化酷基}-2,3-二氨-I-H-吗隙-5-基)-7-H-化咯并[2,3d]喀晚-4-胺）、GSK 2656157a-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-化咯并[2,3-d]喀晚-5-基)-4-氣吗|噪嘟-1-基)-2-(6-甲基化晚-2-基）乙酬)和ISRIB(反式-N，N'-(环己烧-l，4-二基)双(2-(4-氯苯氧 基）乙酷胺）。在某些其他实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂是salubrinal。
[0140]在另一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂，优 选NDQI-I或MLS-0315763。
[0141 ]在又一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制 剂。在某些实施方案中，该NRF2-KEAP1抑制剂选自鼠尾草酸、S祗类化合物、萝h硫素和叔下 基氨酿。
[0142] 在又一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。在 某些实施方案中，该GSK3抑制剂选自CHIR98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(lH-咪挫-2-基)-2-喀晚基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-化晚二胺）、丙戊酸盐、CT99021和CT20026。
[0143] 在进一步的实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是MEK抑制剂。在 某些实施方案中，该MEK抑制剂选自PD0325901，N-[(2R)-2,3-二?基丙氧基]-3,4-二氣-2-[(2-氣-4-舰苯基)氨基]-苯甲酯胺;MEKl 62 (5- [(4-漠-2-氣苯基)氨基]-4-氣-N- (2-径基 乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪挫-6-甲酯胺）、PD184352(2-(2-氯-4-舰苯基氨基)-N-(环丙基 甲氧基)-3,4-二氣苯甲酯胺）、pimaseパ化（（S)-N-(2,3-二?基丙基)-3-(2-氣-4-舰苯基 氨基）异烟酷胺）、司美替尼（6-(4-漠-2-氯苯基氨基）-7-氣-N-(2-^基乙氧基）-3-甲基-3H-苯并[d]咪挫-5-甲酯胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氣-4-舰苯基氨基)-6，8-二 甲基-2,4,7-S氧代-3,4,6,7-四氨化晚并[4,3-d]喀晚-U2H)-基)苯基）乙酷胺KPD98059 (2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并化喃-4-酬）W及U0126-化細（（22,32)-2,3-双（氨基 (2-氨基苯硫基)亚甲基)班巧腊，乙醇）。
[0144] 在又一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。在某 些实施方案中，该JNK抑制剂选自SP600125(蔥并[l-9-cd]化挫-6(2H)-酬）、JNK-IN-8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-下締-1-基]氨基]-N-[3-甲基-4-[ [4-(3-化晚基)-2-喀晚 基]氨基]苯基]-苯甲酯胺）；JNK-抑制剂IX(N-(3-氯基-4,5,6,7-四氨苯并[b]嚷吩-2-基)-1-糞甲酯胺）。
[0145] 在另一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和 P38MAP激酶抑制剂。在某些实施方案中，该P38MAP激酶抑制剂选自SB203580(4-(4-(4-氣苯 基)-2-(4-(甲基亚横酷基)苯基)-lH-咪挫-5-基川比晚）、LY2228820(5-(2-叔下基-4-(4-氣 苯基)-lH-咪挫-5-基)-3-新戊基-3H-咪挫并[4,5-b]化晚-2-胺二甲横酸盐）、PD169316(4-(4-氣苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-化晚基)-lH-咪挫）、PH-797804(3-(4-(2,4-二氣节氧 基)-3-漠-6-甲基-2-氧代化晚基)-N，4-二甲基苯甲酯胺）、SB202190(4-(4-(4-氣 苯基)-5-(化晚-4-基)-lH-咪挫-2-基)苯酪）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔下基-1-对甲苯 基-IH-化挫-5-基）-3-(4-(2-吗嘟基乙氧基）糞-1-基）脈）、VX-702( 1-(5-氨基甲酯基-6-(2,4-二氣苯基川比晚-2-基）-1-(2,6-二氣苯基)脈）W及TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲 基苯基)-5-嚷挫基]-2-化晚基]-苯甲酯胺。
[0146] 在进一步的实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。 在某些实施方案中，该PI3K抑制剂选自dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-哇 嘟-3-基咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基)苯基]丙腊）、60(：-0941(2-(1护吗|挫-4-基)-6-[[4-(甲 基横酷基）-1-赃嗦基]甲基]-4-(4-吗嘟基）嚷吩并[3,2-d]喀晚）、LY294002(2-(4-吗嘟 基)-8-苯基-4H-1-苯并化喃-4-酬）、idealalisib(5-氣-3-苯基-2-[aS)-1-(7H-嚷岭-6-基氨基）丙基]-4(3H)-哇挫嘟酬）、bu巧arlisib(5-(2,6-二吗嘟基喀晚-4-基）-4-(S氣甲 基川比晚-2-胺）、GDC-0032(4-[5,6-二氨-2-[3-甲基-1-a-甲基乙基)-lH-l，2,4-S挫-5-基]咪挫并[l，2-d][l，4]苯并氧氮杂革-9-基]-a，a-二甲基-lH-化挫-1-乙酷胺）、PI-103 (3-(4-(4-吗嘟基川比晚并[3' ,2' :4,5]巧喃并[3,2-d]喀晚-2-基)苯酪）、NU7441(8-(4-二 苯并嚷吩基）-2-(4-吗嘟基苯并化喃-4-酬）、GSK2636771(2-甲基甲基-3-(二氣甲基）苯基]甲基]-6-(4-吗嘟基)-lH-苯并咪挫-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嚷岭-6-基氨基）乙基]异哇嘟酬）、)(L147(N-(3-(苯并[c][l，2,5]嚷 二挫-5-基氨基）哇喔嘟-2-基)-4-甲基苯横酷胺）、TGX-221(7-甲基-2-(4-吗嘟基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-化晚并[l，2-a]喀晚-4-酬）、PIK-90(N-(7,8-二甲氧基-2,3-二氨-咪 挫并[1，2-C]哇挫嘟-5-基）-烟酷胺）、渥曼青霉素（11-(乙酷氧基)-1，化，7，8，9a，10，11， Ub-八氨-1-(甲氧基甲基）-9a，l化-二甲基-，（15,66尺，9曰5，11尺，1化1〇-3护氣[4,3,2-(16] 巧并[4,5-h]-2-苯并化喃-3,6,9-S酬）、VS-5584(5-[8-甲基-9-(1-甲基乙基)-2-(4-吗嘟 基)-9H-嚷岭-6-基]-2-喀晚胺)和TG-100703(3-( 2，4-二氨基-6-蝶晚基)-苯酪）。
[0147] 在一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。在某 些实施方案中，该IRE-I抑制剂选自IRE1抑制剂I (N-[(2-径基糞-1-基)亚甲基]嚷吩-2-横 酷胺KIREl抑制剂11(3/-甲酯基-4基(径基-5基（甲氧基联苯基-3-甲酯胺）W及IREl抑制 剂111(8-甲酯基-7-径基-4-甲基香豆素，7-径基-4-甲基-2-氧代-2H-色締-8-甲醒）。
[0148] 在一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。 在某些实施方案中，该巧蛋白酶抑制剂选自巧蛋白酶抑制剂KN-乙酷基-Leu-Leu-正亮氨 酸-CHO)、巧蛋白酶抑制剂IKN-乙酷基-Leu-Leu-Met)、巧蛋白酶抑制剂III (Z-Val-I^e-C册）、巧蛋白酶抑制剂IV(Z-Leu-Leu-Tyr-C此F)、巧蛋白酶抑制剂V(吗嘟基酷脈基;-Val-高苯丙氨酸-C出F)、巧蛋白酶抑制剂VK4-氣苯基横酷基-化I-Leu-CHO)、巧蛋白酶抑制剂X (Z-Leu-a-氨基下酸-CON肥抽日）、巧蛋白酶抑制剂XKZA-Q-氨基下酸-C0NH(C出）3-吗嘟）和 巧蛋白酶抑制剂XII(2寸-正鄉氨酸-CONH-C出-2-化晚基）。
[0149] 在一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制 剂。在某些实施方案中，该脫天蛋白酶-1抑制剂选自脫天蛋白酶-1抑制剂IKAc-YVAD-氯甲 基甲酬）、N-(2-哇嘟基)鄉氨酷-天冬氨酷-(2,6-二氣苯氧基）甲基甲酬(其中天冬氨酷残基 是曰-甲基化或非曰-甲基化的）、\0(-765((5)-1-((5)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酯氨基)-3,3-二 甲基下酷基)-N-((2R，3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氨巧喃-3-基川比咯烧-2-甲酯胺)和ZVAD-氣甲基甲酬。
[0150] 在另一个方面，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种邸蛋白伴侣诱 导剂。在某些实施方案中，该ER蛋白伴侣诱导剂选自BIX、丙戊酸盐和裡。
[0151] 在另一个方面，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种自隧诱导剂。 在某些实施方案中，该自隧诱导剂选自氣司必林、=氣拉嗦、匹莫齐特、尼卡地平、尼古地 平、洛赃下胺、胺舰酬、雷帕霉素、白襲芦醇和SMER。
[0152] 在另一个方面，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种存活蛋白。在 一个实施方案中，该存活蛋白为Bd-xL。 再水化制剂
[0153] 在某些其他方面，用于细胞的基本干燥储存的组合物和方法进一步包括采用再水 化制剂将基本干燥储存的细胞再水化。在一个实施方案中，该再水化制剂包含至少一种调 亡抑制剂，优选可逆调亡抑制剂。在另一个实施方案中，该再水化制剂包含至少一种调亡抑 制剂和至少一种ER蛋白伴侣诱导剂。
[0154] 在某些实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂选自PE服-eIF2-a抑 制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制剂、GSK3抑 制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0155] 在一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是PE服-eIF2-a抑制 剂。在某些实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂选自salubrinal、Sal-003(3-苯基-N-[2,2， 2-S氯-1-[(4-氯苯基)硫代氨基甲酯氨基]乙基]丙-2-締酷胺）、GSK 2606414(7-甲基-5-(1-{[3-(立氣甲基)苯基化酷基}-2,3-二氨-I-H-吗隙-5-基)-7-H-化咯并[2,3d]喀晚-4-胺）、GSK 2656157a-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-化咯并[2,3-d]喀晚-5-基)-4-氣吗|噪嘟-1-基)-2-(6-甲基化晚-2-基）乙酬)和ISRIB(反式-N，N'-(环己烧-l，4-二基)双(2-(4-氯苯氧 基）乙酷胺）。在某些其他实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂是salubrinal。
[0156] 在另一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂，优 选NDQI-I或MLS-0315763。
[0157] 在又一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制 剂。在某些实施方案中，该NRF2-KEAP1抑制剂选自鼠尾草酸、S祗类化合物、萝h硫素和叔下 基氨酿。
[0158] 在又一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。在 某些实施方案中，该GSK3抑制剂选自CHIR98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(lH-咪挫- 2-基)-2-喀晚基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-化晚二胺）、丙戊酸盐、CT99021和CT20026。
[0159] 在进一步的实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是肥1(抑制剂。在 某些实施方案中，该MEK抑制剂选自PD0325901，N-[(2R)-2,3-二?基丙氧基]-3,4-二氣-2-[(2-氣-4-舰苯基)氨基]-苯甲酯胺;MEKl 62 (5- [(4-漠-2-氣苯基)氨基]-4-氣-N- (2-径基 乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪挫-6-甲酯胺）、PD184352(2-(2-氯-4-舰苯基氨基)-N-(环丙基 甲氧基)-3,4-二氣苯甲酯胺）、pimaseパ化（（S)-N-(2,3-二?基丙基)-3-(2-氣-4-舰苯基 氨基）异烟酷胺）、司美替尼（6-(4-漠-2-氯苯基氨基）-7-氣-N-(2-^基乙氧基）-3-甲基-3H-苯并[d]咪挫-5-甲酯胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氣-4-舰苯基氨基)-6，8-二 甲基-2,4,7-S氧代-3,4,6,7-四氨化晚并[4,3-d]喀晚-U2H)-基)苯基）乙酷胺KPD98059 (2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并化喃-4-酬）W及U0126-化細（（22,32)-2,3-双（氨基 (2-氨基苯硫基)亚甲基)班巧腊，乙醇）。
[0160] 在又一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。在某 些实施方案中，该JNK抑制剂选自SP600125(蔥并[l-9-cd]化挫-6(2H)-酬）、JNK-IN-8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-下締-1-基]氨基]-N-[3-甲基-4-[ [4-(3-化晚基)-2-喀晚 基]氨基]苯基]-苯甲酯胺）；JNK-抑制剂IX(N-(3-氯基-4,5,6,7-四氨苯并[b]嚷吩-2-基)-1-糞甲酯胺）。
[0161] 在另一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和 P38MAP激酶抑制剂。在某些实施方案中，该P38MAP激酶抑制剂选自SB203580(4-(4-(4-氣苯 基)-2-(4-(甲基亚横酷基)苯基)-lH-咪挫-5-基川比晚）、LY2228820(5-(2-叔下基-4-(4-氣 苯基)-lH-咪挫-5-基)-3-新戊基-3H-咪挫并[4,5-b]化晚-2-胺二甲横酸盐）、PD169316(4-(4-氣苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-化晚基)-lH-咪挫）、PH-797804(3-(4-(2,4-二氣节氧 基)-3-漠-6-甲基-2-氧代化晚基)-N，4-二甲基苯甲酯胺）、SB202190(4-(4-(4-氣 苯基)-5-(化晚-4-基)-lH-咪挫-2-基)苯酪）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔下基-1-对甲苯 基-IH-化挫-5-基）-3-(4-(2-吗嘟基乙氧基）糞-1-基）脈）、VX-702( 1-(5-氨基甲酯基-6-(2,4-二氣苯基川比晚-2-基）-1-(2,6-二氣苯基)脈）W及TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲 基苯基)-5-嚷挫基]-2-化晚基]-苯甲酯胺。
[0162] 在进一步的实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。 在某些实施方案中，该PI3K抑制剂选自dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-哇 嘟-3-基咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基)苯基]丙腊）、60(：-0941(2-(1护吗|挫-4-基)-6-[[4-(甲 基横酷基）-1-赃嗦基]甲基]-4-(4-吗嘟基）嚷吩并[3,2-d]喀晚）、LY294002(2-(4-吗嘟 基)-8-苯基-4H-1-苯并化喃-4-酬）、idealalisib(5-氣-3-苯基-2-[aS)-1-(7H-嚷岭-6-基氨基）丙基]-4(3H)-哇挫嘟酬）、bu巧arlisib(5-(2,6-二吗嘟基喀晚-4-基）-4-(S氣甲 基川比晚-2-胺）、GDC-0032(4-[5,6-二氨-2-[3-甲基-1-a-甲基乙基)-lH-l，2,4-S挫-5-基]咪挫并[l，2-d][l，4]苯并氧氮杂辜-9-基]-a，a-二甲基-lH-化挫-1-乙酷胺）、PI-103 (3-(4-(4-吗嘟基川比晚并[3' ,2' :4,5]巧喃并[3,2-d]喀晚-2-基)苯酪）、NU7441(8-(4-二 苯并嚷吩基）-2-(4-吗嘟基苯并化喃-4-酬）、GSK2636771(2-甲基甲基-3-(S氣甲基）苯基]甲基]-6-(4-吗嘟基)-lH-苯并咪挫-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嚷岭-6-基氨基）乙基]异哇嘟酬）、)(L147(N-(3-(苯并[c][l，2,5]嚷 二挫-5-基氨基）哇喔嘟-2-基)-4-甲基苯横酷胺）、TGX-221(7-甲基-2-(4-吗嘟基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-化晚并[l，2-a]喀晚-4-酬）、PIK-90(N-(7,8-二甲氧基-2,3-二氨-咪 挫并[l，2-c]哇挫嘟-5-基）-烟酷胺）、渥曼青霉素（11-(乙酷氧基)-1，化，7,8,9a，10，ll， Ub-八氨-1-(甲氧基甲基）-9a，l化-二甲基-，（15,66尺，9曰5，11尺，1化1〇-3护氣[4,3,2-(16] 巧并[4,5-h]-2-苯并化喃-3,6,9-S酬）、VS-5584(5-[8-甲基-9-(1-甲基乙基)-2-(4-吗嘟 基)-9H-嚷岭-6-基]-2-喀晚胺)和TG-100703(3-( 2，4-二氨基-6-蝶晚基)-苯酪）。
[0163] 在一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。在某 些实施方案中，该IRE-I抑制剂选自IRE1抑制剂I (N-[(2-径基糞-1-基)亚甲基]嚷吩-2-横 酷胺KIREl抑制剂11(3/-甲酯基-少-径基-5/-甲氧基联苯基-3-甲酯胺）W及IREl抑制剂 III(8-甲酯基-7-径基-4-甲基香豆素，7-径基-4-甲基-2-氧代-2H-色締-8-甲醒）。
[0164] 在一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。 在某些实施方案中，该巧蛋白酶抑制剂选自巧蛋白酶抑制剂KN-乙酷基-Leu-Leu-正亮氨 酸-CHO)、巧蛋白酶抑制剂IKN-乙酷基-Leu-Leu-Met)、巧蛋白酶抑制剂III (Z-Val-I^e-C册）、巧蛋白酶抑制剂IV(Z-Leu-Leu-Tyr-C此F)、巧蛋白酶抑制剂V(吗嘟基酷脈基;-Val-高苯丙氨酸-C出F)、巧蛋白酶抑制剂VI (4-氣苯基横酷基-化I-Leu-CHO)、巧蛋白酶抑制剂X (Z-Leu-a-氨基下酸-CON肥抽日）、巧蛋白酶抑制剂XI(ZA-a-氨基下酸-CONH(C出）3-吗嘟）和 巧蛋白酶抑制剂XII(2寸-正鄉氨酸-CONH-C出-2-化晚基）。
[0165] 在一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制 剂。在某些实施方案中，该脫天蛋白酶-1抑制剂选自脫天蛋白酶-1抑制剂II(Ac-YVAD-氯甲 基甲酬）、N-(2-哇嘟基)鄉氨酷-天冬氨酷-(2,6-二氣苯氧基）甲基甲酬(其中天冬氨酷残基 是a-甲基化或非a-甲基化的）、VX-765((S)-1-((S)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酯氨基)-3,3-二 甲基下酷基)-N-((2R，3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氨巧喃-3-基川比咯烧-2-甲酯胺）和ZVAD-氣甲基甲酬。
[0166] 在另一个方面，该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种邸蛋白伴侣诱 导剂。在某些实施方案中，该ER蛋白伴侣诱导剂选自BIX、丙戊酸盐和裡。
[0167] 在另一个方面，该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种自隧诱导剂。 在某些实施方案中，该自隧诱导剂选自氣司必林、=氣拉嗦、匹莫齐特、尼卡地平、尼古地 平、洛赃下胺、胺舰酬、雷帕霉素、白襲芦醇和SMER。
[0168] 在另一个方面，该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种存活蛋白。在 一个实施方案中，该存活蛋白为Bd-xL。 方法
[0169] 在本发明的另一个方面，提供了在没有冷冻或冻干的情况下将一种或多种细胞在 环境溫度下基本干燥储存的方法，该方法包括:将所述一种或多种细胞与包含干燥储存稳 定剂的脱水制剂一起溫育；W及在脱水制剂的存在下使该一种或多种预处理的细胞脱水， W产生一种或多种基本干燥储存的细胞。在某些实施方案中，该脱水制剂进一步包含至少 一种调亡抑制剂，并且该方法可进一步包括采用包含至少一种调亡抑制剂的再水化缓冲液 将一种或多种基本干燥储存的细胞再水化。
[0170] 在本发明的另一个方面，提供了在没有冷冻或冻干的情况下将一种或多种细胞在 环境溫度下基本干燥储存的方法，该方法包括:将所述一种或多种细胞与包含调亡抑制剂 的预脱水制剂一起溫育W产生一种或多种预处理的细胞，去除所述预脱水制剂；W及在脱 水制剂的存在下使该一种或多种预处理的细胞脱水，W产生一种或多种基本干燥储存的细 胞。在某些实施方案中，该方法可进一步包括采用包含至少一种调亡抑制剂的再水化缓冲 液将一种或多种基本干燥储存的细胞再水化。
[0171] 多种调亡抑制剂可在高浓度下或长时间暴露时对细胞产生毒性作用。相反，细胞 暴露于预脱水制剂或再水化制剂的时间太短或调亡抑制剂浓度太低将不会在脱水期间产 生期望的额外的处理效果。因此，对于采用预脱水步骤和再水化步骤将细胞基本干燥储存 的方法，需要适当地控制暴露时间W实现期望的抑制效果。
[0172] 在某些实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂选自阳服-eIF2-a抑 制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制剂、GSK3抑 制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0173] 在一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是阳服-eIF2-a抑制 剂。在某些实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂选自salubrinal、Sal-003(3-苯基-N-[2,2， 2-S氯-1-[(4-氯苯基)硫代氨基甲酯氨基]乙基]丙-2-締酷胺）、GSK 2606414(7-甲基-5-(1-{[3-(立氣甲基)苯基化酷基}-2,3-二氨-I-H-吗隙-5-基)-7-H-化咯并[2,3d]喀晚-4- 胺）、GSK 2656157a-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-化咯并[2,3-d]喀晚-5-基)-4-氣吗|噪嘟-1-基)-2-(6-甲基化晚-2-基）乙酬)和ISRIB(反式-N，N'-(环己烧-l，4-二基)双(2-(4-氯苯氧 基）乙酷胺）。在某些其他实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂是salubrinal。
[0174] 在另一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂，优 选NDQI-I或MLS-0315763。
[0175] 在又一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制 剂。在某些实施方案中，该NRF2-KEAP1抑制剂选自鼠尾草酸、S祗类化合物、萝h硫素和叔下 基氨酿。
[0176] 在又一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。在 某些实施方案中，该GSK3抑制剂选自CHIR98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(lH-咪挫- 2-基)-2-喀晚基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-化晚二胺）、丙戊酸盐、CT99021和CT20026。
[01W]在进一步的实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是肥1(抑制剂。在 某些实施方案中，该MEK抑制剂选自PD0325901，N-[(2R)-2,3-二?基丙氧基]-3,4-二氣-2-[(2-氣-4-舰苯基)氨基]-苯甲酯胺;MEKl 62 (5- [(4-漠-2-氣苯基)氨基]-4-氣-N- (2-径基 乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪挫-6-甲酯胺）、PD184352(2-(2-氯-4-舰苯基氨基)-N-(环丙基 甲氧基)-3,4-二氣苯甲酯胺）、pimaseパ化（（S)-N-(2,3-二?基丙基)-3-(2-氣-4-舰苯基 氨基）异烟酷胺）、司美替尼（6-(4-漠-2-氯苯基氨基）-7-氣-N-(2-^基乙氧基）-3-甲基-3H-苯并[d]咪挫-5-甲酯胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氣-4-舰苯基氨基)-6，8-二 甲基-2,4,7-S氧代-3,4,6,7-四氨化晚并[4,3-d]喀晚-U2H)-基)苯基）乙酷胺KPD98059 (2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并化喃-4-酬）W及U0126-化細（（22,32)-2,3-双（氨基 (2-氨基苯硫基)亚甲基)班巧腊，乙醇）。
[0178] 在又一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。在某 些实施方案中，该JNK抑制剂选自SP600125(蔥并[l-9-cd]化挫-6(2H)-酬）、JNK-IN-8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-下締-1-基]氨基]-N-[3-甲基-4-[ [4-(3-化晚基)-2-喀晚 基]氨基]苯基]-苯甲酯胺）；JNK-抑制剂IX(N-(3-氯基-4,5,6,7-四氨苯并[b]嚷吩-2-基)- 1-糞甲酯胺）。
[0179] 在另一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和 P38MAP激酶抑制剂。在某些实施方案中，该P38MAP激酶抑制剂选自SB203580(4-(4-(4-氣苯 基)-2-(4-(甲基亚横酷基)苯基)-lH-咪挫-5-基川比晚）、LY2228820(5-(2-叔下基-4-(4-氣 苯基)-lH-咪挫-5-基)-3-新戊基-3H-咪挫并[4,5-b]化晚-2-胺二甲横酸盐）、PD169316(4-(4-氣苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-化晚基)-lH-咪挫）、PH-797804(3-(4-(2,4-二氣节氧 基)-3-漠-6-甲基-2-氧代化晚基)-N，4-二甲基苯甲酯胺）、SB202190(4-(4-(4-氣 苯基)-5-(化晚-4-基)-lH-咪挫-2-基)苯酪）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔下基-1-对甲苯 基-IH-化挫-5-基）-3-(4-(2-吗嘟基乙氧基）糞-1-基）脈）、VX-702( 1-(5-氨基甲酯基-6-(2,4-二氣苯基川比晚-2-基）-1-(2,6-二氣苯基)脈）W及TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲 基苯基)-5-嚷挫基]-2-化晚基]-苯甲酯胺。
[0180] 在进一步的实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。 在某些实施方案中，该PI3K抑制剂选自dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-哇 嘟-3-基咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基)苯基]丙腊）、60(：-0941(2-(1护吗|挫-4-基)-6-[[4-(甲 基横酷基）-1-赃嗦基]甲基]-4-(4-吗嘟基）嚷吩并[3,2-d]喀晚）、LY294002(2-(4-吗嘟 基)-8-苯基-4H-1-苯并化喃-4-酬）、idealalisib(5-氣-3-苯基-2-[aS)-1-(7H-嚷岭-6-基氨基）丙基]-4(3H)-哇挫嘟酬）、bu巧arlisib(5-(2,6-二吗嘟基喀晚-4-基）-4-(S氣甲 基川比晚-2-胺）、GDC-0032(4-[5,6-二氨-2-[3-甲基-1-a-甲基乙基)-lH-l，2,4-S挫-5-基]咪挫并[l，2-d][l，4]苯并氧氮杂草-9-基]-a，a-二甲基-lH-化挫-1-乙酷胺）、PI-103 (3-(4-(4-吗嘟基川比晚并[3' ,2' :4,5]巧喃并[3,2-d]喀晚-2-基)苯酪）、NU7441(8-(4-二 苯并嚷吩基）-2-(4-吗嘟基苯并化喃-4-酬）、GSK2636771(2-甲基甲基-3-(二氣甲基）苯基]甲基]-6-(4-吗嘟基)-lH-苯并咪挫-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嚷岭-6-基氨基）乙基]异哇嘟酬）、)(L147(N-(3-(苯并[c][l，2,5]嚷 二挫-5-基氨基）哇喔嘟-2-基)-4-甲基苯横酷胺）、TGX-221(7-甲基-2-(4-吗嘟基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-化晚并[l，2-a]喀晚-4-酬）、PIK-90(N-(7,8-二甲氧基-2,3-二氨-咪 挫并[1，2-C]哇挫嘟-5-基）-烟酷胺）、渥曼青霉素（11-(乙酷氧基)-1，化，7，8，9a，10，11， Ub-八氨-1-(甲氧基甲基）-9a，l化-二甲基-，（15,66尺，9曰5，11尺，1化1〇-3护氣[4,3,2-(16] 巧并[4,5-h]-2-苯并化喃-3,6,9-S酬）、VS-5584(5-[8-甲基-9-(1-甲基乙基)-2-(4-吗嘟 基)-9H-嚷岭-6-基]-2-喀晚胺)和TG-100703(3-( 2，4-二氨基-6-蝶晚基)-苯酪）。
[0181] 在一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。在某 些实施方案中，该IRE-I抑制剂选自IRE1抑制剂I (N-[(2-径基糞-1-基)亚甲基]嚷吩-2-横 酷胺KIREl抑制剂11(3/-甲酯基-少-径基-5/-甲氧基联苯基-3-甲酯胺）W及IREl抑制剂 III(8-甲酯基-7-径基-4-甲基香豆素，7-径基-4-甲基-2-氧代-2H-色締-8-甲醒）。
[0182] 在一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。 在某些实施方案中，该巧蛋白酶抑制剂选自巧蛋白酶抑制剂KN-乙酷基-Leu-Leu-正亮氨 酸-CHO)、巧蛋白酶抑制剂IKN-乙酷基-Leu-Leu-Met)、巧蛋白酶抑制剂III (Z-Val-I^e-C册）、巧蛋白酶抑制剂IV(Z-Leu-Leu-Tyr-C此F)、巧蛋白酶抑制剂V(吗嘟基酷脈基;-Val-高苯丙氨酸-C出F)、巧蛋白酶抑制剂VK4-氣苯基横酷基-化I-Leu-CHO)、巧蛋白酶抑制剂X (Z-Leu-a-氨基下酸-CON肥抽日）、巧蛋白酶抑制剂XKZA-Q-氨基下酸-C0NH(C出）3-吗嘟）和 巧蛋白酶抑制剂XII(2寸-正鄉氨酸-CONH-C出-2-化晚基）。
[0183] 在一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制 剂。在某些实施方案中，该脫天蛋白酶-1抑制剂选自脫天蛋白酶-1抑制剂IKAc-YVAD-氯甲 基甲酬）、N-(2-哇嘟基)鄉氨酷-天冬氨酷-(2,6-二氣苯氧基）甲基甲酬(其中天冬氨酷残基 是曰-甲基化或非曰-甲基化的）、\0(-765((5)-1-((5)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酯氨基)-3,3-二 甲基下酷基)-N-((2R，3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氨巧喃-3-基川比咯烧-2-甲酯胺)和ZVAD-氣甲基甲酬。
[0184] 在另一个方面，所述方法中使用的再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一 种ER蛋白伴侣诱导剂。在某些实施方案中，该ER蛋白伴侣诱导剂选自BIX、丙戊酸盐和裡。
[0185] 在另一个方面，所述方法中使用的再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一 种自隧诱导剂。在某些实施方案中，该自隧诱导剂选自氣司必林、=氣拉嗦、匹莫齐特、尼卡 地平、尼古地平、洛赃下胺、胺舰酬、雷帕霉素、白襲芦醇和SMER。
[0186] 在另一个方面，所述方法中使用的再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一 种存活蛋白。在一个实施方案中，该存活蛋白为Bd-xL。
[0187] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是可逆调亡抑制剂。在所述方法中， 可使用可逆调亡抑制剂在预脱水和/或再水化阶段中处理细胞W使细胞载有保护量的调亡 抑制剂，例如，W阻断一种或多种ER应激通路激活，W使得在预脱水制剂和/或再水化制剂 去除和细胞重悬时可逆抑制剂最终从细胞中稀释W避免延长的暴露时间。 试剂盒
[0188] 在某些其他方面，提供了试剂盒，其包含含有干燥储存稳定剂的液体脱水制剂，用 于放置一种或多种细胞W进行基本干燥储存的样品容器，W及包含关于使用所述液体脱水 制剂将一种或多种细胞基本干燥储存的使用说明的包装插页。在某些实施方案中，该脱水 制剂进一步包含至少一种调亡抑制剂，并且仍可进一步包含含有至少一种调亡抑制剂的再 水化缓冲液。
[0189] 在某些其他实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于在脱水前固定一种或多种细 胞的固体支持体，包含至少一种调亡抑制剂的预脱水制剂，包含至少一种干燥储存稳定剂 的、用于所述一种或多种细胞的基本干燥储存的脱水制剂，W及包含关于将所述一种或多 种细胞固定至所述固体支持体W及关于采用所述预脱水制剂和脱水制剂将一种或多种细 胞基本干燥储存的说明的包装插页。在又一个实施方案中，所述试剂盒可进一步包含再水 化缓冲液，该再水化缓冲液包含至少一种调亡抑制剂。 用于筛选制剂的通用方案
[0190] 可采用W下方案来分析和选择用于细胞的基本干燥储存的预脱水制剂、脱水制剂 和/或再水化制剂及其组合，该细胞在再水化后至少一小时保持至少一种功能性质。简而言 之，将细胞接种到96孔板(20，000个细胞/孔）中的DMBl培养基或预脱水制剂(例如，DMBl培 养基+至少一种调亡抑制剂）中，并于37°C下溫育1小时至最多24小时。溫育后，将培养基从 细胞中吸出并丢弃，并且向每个孔中添加 IOyl脱水制剂。将开放的96孔板在37°C下溫育，如 果干燥半满的96孔板则溫育75分钟，或者如果干燥全满的96孔板则溫育95分钟。将干燥的 细胞在室溫下储存1小时并采用可变量的包含至少一种调亡抑制剂的再水化制剂或在完全 DMEM培养基中再水化。将再水化的细胞在37°C的C〇2调节的培养箱中溫育1小时或24小时的 时间段。在指定的时间点，向再水化的细胞添加台吩蓝，并采用细胞计数器对细胞进行计 数。通过台吩蓝染色的细胞的数目除W细胞总数来确定细胞存活百分比，从而确定非存活 细胞的分数，并随后计算存活细胞的百分比。 用于测定细胞的功能性质的试验
[0191] 本发明的基本干燥储存的细胞在再水化时保持至少一种该细胞在经历脱水前的 功能性质。所述一种功能性质可选自：代谢活性，细胞活力，增殖、分化、响应于信号刺激(如 生长因子引起的）W及表达预期细胞生物标志物（如RNA合成、蛋白质）的能力，和或分泌功 能。运些功能性质可采用任何方法来检测或分析，该方法包括本文公开的方法W及本领域 技术人员已知的其他方法。下文描述了用于检测再水化的干燥储存细胞的至少一种功能性 质的示例性方法。 1.细胞活力测定
[0192] 可采用台吩蓝染色程序来测量细胞活力。台吩蓝是一种具有带负电荷的生色团的 染料，除非细胞膜受损，否则其不与细胞相互作用，因此活细胞排斥该染料，而在显微镜下 检查时受损的细胞呈蓝色。在Leitz Fluoved显微镜下一式S份在带有格室（Gr id 化ambersKHycor)的9mm KOVA载玻片上进行细胞计数。报告了相对于未处理的对照细胞的 细胞存活百分比。 2. ATP含量测定
[0193]可根据制造商的说明采用Cell Titer-Glo发光法细胞活力测定(Cell Titer-Glo Luminiscent Cell viability AssayKPromega)来测定ATP含量。将Cell Titer-Glo Luminiscent试剂添加至细胞产生了与细胞内ATP的量成比例的发光信号。ATP的量与培养 物中存在的细胞的数目成正比，因此它是一种在再水化的细胞制备物中测定活(代谢活性） 细胞数目的均相法。 3. 脫天蛋白酶测定
[0194] 可根据制造商的说明采用脫天蛋白酶-Glo 3/7测定（Caspase-Glo3/7 Assay) (Promega)来测量细胞调亡的程度。简而言之，该测定提供含有四肤序列DEVD的促发光 (pro-luminescent)脫天蛋白酶-3/7底物。该底物被裂解W释放氨基蛋光素(一种用于产生 光的蛋光素酶底物）。单一脫天蛋白酶-Glo 3/7试剂的添加导致细胞裂解，随后导致底物的 脫天蛋白酶裂解W及发光信号的产生。脫天蛋白酶活化的倍数计算为在标准组织培养条件 下培养的测试样品中的活性与未处理的细胞的活性之比。
[0195] W说明而非限制的方式提供W下的实施例。 实施例1 在再水化后五天，示例性制剂保持活细胞并防止基本干燥储存的细胞的细胞调亡
[0196] 该实施例表明，在环境溫度下基本干燥储存5小时后再水化后多达5天，本文所述 的示例性预脱水制剂、脱水制剂和再水化制剂保持细胞活力并防止细胞被诱导调亡。
[0197] 采用预定的预脱水制剂(5(：1(3曰1油'111曰1)和5〔3(]\11^5-0315763))将化1^曰细胞基本 干燥储存，然后用表1所示的制剂亚组处理，并在96孔板中脱水且在环境溫度下储存5小时。 采用再水化制剂(RCl(salubrinal)和RC3(MLS-0315763))将细胞再水化，并且通过向96孔 板中添加 CellTiter-glo来测量ATP含量。在细胞裂解后，将50iil样品转移至白色384孔板中 进行定量。通过测量ATP发光来测定基本干燥储存的细胞的细胞活力。
[0198] 此外，在再水化后5天测定那些显示阳性ATP活性的基本干燥储存的细胞的ATP含 量。如表2所示，所有的无制剂对照细胞在第5天均是不存活的，而大部分的采用本文所述的 制剂和方法基本干燥储存的细胞仍保持存活(高达90%的细胞活力），显示了完整的、代谢 活性细胞的稳定化。
[0199] 还通过测量脫天蛋白酶活性对再水化的细胞进行分析，W确定基本干燥储存5天 随后再水化5天是否导致细胞调亡的诱导。将再水化5天的细胞暴露于脫天蛋白酶-glo (Promega) W检测脫天蛋白酶3/7的活性。脫天蛋白酶活化计算为在标准组织培养条件下培 养的测试样品中的活性与未处理的细胞的活性之比（表2)。一或低于一的结果被认为是表 明不存在升高的脫天蛋白酶活性且表明没有观察到调亡的结果。 表2 在再水化后五天，示例性制剂保持活细胞并防止基本干燥储存的细胞的细胞调亡
[0200] 如表2所示，相对于背景值没有或几乎没有观察到可检测的脫天蛋白酶活性，表明 在干燥储存5天并随后再水化至少5天后没有诱导调亡。 实施例2 在基本干燥储存后再水化后屯天，示例性制剂保持活细胞
[0201] 该实施例表明，本文所述的示例性制剂能够使活化La细胞在再水化后保持至少屯 小时。
[0202] 简而言之，采用预定的预脱水制剂(SCl(salubrinal)和SC3(MLS-0315763))和表1 所示的脱水制剂亚组将化La细胞基本干燥储存屯小时，随后采用W下列出的再水化制剂 (RCl(salubrinal)和RC3(MLS-0315763))再水化。采用台吩蓝法，在再水化后屯天对细胞活 力进行评价。结果在表3和图4中示出。 表3 在基本干燥储存后再水化后屯天，示例性制剂保持活细胞
[0203] 如表3所示，在再水化屯小时后，未受到保护的对照和海藻糖稳定化的细胞没有产 生任何活细胞，而本发明的示例性制剂W不同程度保持化La细胞活力多达屯小时，从而导 致相对于金标准海藻糖干燥的细胞的显著的改善。 实施例3 在基本干燥储存至少120小时期间，包含祀向ER应激通路的示例性调亡抑制剂的制剂 保持细胞活力
[0204] 该实施例表明，当在本文所述的制剂、组合物和方法中使用时，祀向邸应激通路的 不同步骤的多种调亡抑制剂能够将细胞在环境溫度下基本干燥储存至少24小时。
[020引简而言之，将人新生儿成纤维细胞悬浮于化scade培养基（Cascade Media) 106中， 并W每个试验100-5000个细胞的密度将10化1培养物接种在96孔板中，并且在环境气氛的 环境下溫育，同时保持升高的C02水平（5 %-10% )和37°C的溫度W及85-95%的相对湿度。 将培养物调整为预脱水制剂的特定组成和每种调亡抑制剂的培养基特定浓度。将细胞在37 °C下溫育至少一小时但不超过3小时的一段时间。彻底去除预脱水制剂，并且向每个孔中添 加 IO-ISiil的MCS脱水制剂41(表1)。将细胞在37°(3、5%0)2、20%相对湿度下基本风干90分 钟，在环境溫度下储存24、48或120小时。在合适的时间，通过用再水化制剂处理将基本干燥 储存的细胞再水化，该再水化制剂包含与100-20化1预脱水制剂中相同浓度的调亡抑制剂。 通过如本文所述测量ATP含量来确定细胞活力。
[0206]结果在表4中示出： 表4 在基本干燥储存至少120小时期间，包含祀向ER应激通路的示例性调亡抑制剂的制剂 保持细胞活力
[0207] 如表4所示，在干燥储存后120小时，祀向ER应激通路中的不同步骤的示例性调亡 抑制剂保持了大量活细胞，该活细胞保 持至少一种功能性质。通过24虹的干燥储存，未处理 的对照和用金标准海藻糖处理的细胞没有或几乎没有保持活细胞，而本文所述的制剂和方 法导致显著的细胞活力，并且细胞在基本干燥储存至少120小时的时间内仍保持存活。 实施例4 在再水化后至少两周的时间内，基本干燥储存的间充质干细胞保持分化能力
[0208] 该实施例表明，间充质干细胞(MSC)在环境溫度下基本干燥储存至少两周后保持 其分化能力。
[0209] 将MSC采用100纳摩尔到2000纳摩尔的salubrinal和表1中所示的MSC制剂205基本 干燥储存，并在室溫下储存两周。将基本干燥储存的细胞在包含相似浓度的salubrinal的 再水化制剂的存在下再水化，在典型的培养条件(37°C、5 % C〇2、85-95 %畑)下溫育一小时， 并在此时将培养基更换为MSC生长培养基并使之恢复且增殖48小时，并作为单层（图3A-C) 或作为微团培养物（micromass cultures)(图3D)传代至12孔板中，之后暴露于由 LifeTechnologies TM提供的 StemPro TM脂肪形成（Adipogenesis)(B)、骨生成 (Osteogenesis)(C) W及软骨形成(Chondrogenesis) (D)试剂盒培养基制品中；每3天用进 料处理细胞21-30天。相对于未分化的MSC培养物(A)的表型的明显变化是显而易见的，其中 明显的脂质小球与(B)中可见的脂肪细胞一致，含巧的沉积物与(C)中的骨细胞一致，且柱 样生长与化）中的软骨细胞一致，表明本文所述的制剂保持MSC的分化潜能的能力而并不妨 碍MSC的分化潜能。
[0210] 除非上下文另有要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语"包含"及其变化 形式如"包括"和"含有"应理解为开放式包容性含义，即应理解为"包括但不限于"。
[0211] 贯穿本说明书对"一个实施方案"或"实施方案"或"方面"的提及意指结合该实施 方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明 书在各个位置中出现的措词"在一个实施方案中"或"在实施方案中"不一定都指代相同的 实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可W在一个或多个实施方案中W任何合适的方式 组合。
[0212] 尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显 而易见的是运些实施方案仅W示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下 现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方 案可用于实施本发明。目的在于W下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖运些权利 要求范围内的方法和结构及其等同物。
【主权项】
1. 一种组合物，其包含在没有冷冻的情况下基本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本 干燥储存至少1小时后再水化时，再水化的细胞表现出至少一种与脱水和基本干燥储存之 前的细胞基本相同的功能性质，其中该组合物包含至少一种不是二糖的干燥储存稳定剂。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞是真核细胞。3. 根据权利要求2所述的组合物，其中所述干燥储存稳定剂选自氨基酸、合成氨基酸、 肽、肽类似物、三糖、螯合剂、水溶性聚合物和四氢嘧啶。4. 根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含至少一种凋亡抑制剂。5. 根据权利要求4所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。6. 根据权利要求4所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂选自PERK-eIF2_a抑制 剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、p38MAP激酶抑制剂、IREl抑制剂、GSK3抑制 剂、MEK抑制剂、P13K通路抑制剂、妈蛋白酶抑制剂以及胱天蛋白酶-1抑制剂。7. 根据权利要求2所述的组合物，其中在脱水之前用包含至少一种凋亡抑制剂的预脱 水制剂处理所述细胞以在脱水前产生预处理的细胞。8. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。9. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂选自PERK-eIF2_a抑制 剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、p38MAP激酶抑制剂、IREl抑制剂、GSK3抑制 剂、PIK3通路抑制剂、MEK抑制剂、妈蛋白酶抑制剂以及胱天蛋白酶-1抑制剂。10. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是PERK-eIF2_a抑制 剂。11. 根据权利要求10所述的组合物，其中所述PERK-eIF2_a抑制剂选自salubrinal、 3&1-003(3-苯基_1'1-[2,2,2-二氯-1-[(4-氯苯基)硫代氨基甲酰氨基]乙基]丙-2-稀酰胺）、 GSK 2606414(7-甲基-5-(1-{[3-(三氟甲基）苯基]乙酰基}-2,3_二氢-I-H-吲哚-5-基)-7-H-吡咯并[2,3d]嘧啶-4-胺）、GSK 2656157(1-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧 啶-5-基)-4-氟吲哚啉-1-基)-2-(6-甲基吡啶-2-基）乙酮)和ISRIB(反式-N，N'_(环己烷-1，4_二基)双(2-(4-氯苯氧基)乙酰胺）。12. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述PERK-eIF2-a抑制剂是salubrinal。13. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是ASKl抑制剂。14. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述ASKl抑制剂是NDQI-I或MLS-0315763。15. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制 剂。16. 根据权利要求15所述的组合物，其中所述NRF2-KEAP1抑制剂选自鼠尾草酸、三萜类 化合物、萝卜硫素和叔丁基氢醌。17. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是GSK3抑制剂。18. 根据权利要求17所述的组合物，其中所述GSK3抑制剂选自CHIRgSOlWNe-D-tU-Uj-二氯苯基 )-5-(1-Η-咪唑-2-基 )-2-嘧啶基] 氨基] 乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺） 、丙 戊酸盐、CT 99021 和CT 20026。19. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是MEK抑制剂。20. 根据权利要求19所述的组合物，其中所述MEK抑制剂选自PD0325901，N-[ (2R)-2，3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺;MEK162(5-[(4-溴-2-氟 苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪唑-6-甲酰胺）、PD184352(2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺）、pima Sertib((S)-N-(2,3-二 羟基丙基)-3-(2-氟-4-碘苯基氨基)异烟酰胺）、司美替尼(6-(4-溴-2-氯苯基氨基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基）-3-甲基-3H-苯并[d]咪唑-5-甲酰胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-6,8_二甲基_2,4,7_三氧代_3,4,6,7_四氢吡啶并[4,3-(1]嘧啶-1 (2H)-基）苯基）乙酰胺）、PD98059(2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并吡喃-4-酮）以及 1]〇1264切!1((22,32)-2,3-双(氨基(2-氨基苯硫基)亚甲基)琥珀腈，乙醇）。21. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是JNK抑制剂。22. 根据权利要求21所述的组合物，其中所述JNK抑制剂选自SP600125 (蒽并[l-9-cd] 吡唑-6(2H)_酮）、了疆-1^8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-丁烯-1-基]氨基]4-[3-甲 基-4- [[ 4- (3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]-苯甲酰胺）；JNK-抑制剂IX (N- (3-氰基-4，5， 6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)-1 -萘甲酰胺）。23. 根据权利要求22所述的组合物，其进一步包含p38MAP激酶抑制剂。24. 根据权利要求23所述的组合物，其中所述p38MAP激酶抑制剂选自SB203580(4-(4-(4-氟苯基)-2-(4-(甲基亚磺酰基)苯基)-1Η-咪唑-5-基)吡啶）、LY2228820(5-(2-叔丁基-4-(4-氟苯基）-1Η-咪唑-5-基）-3-新戊基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-胺二甲磺酸盐）、 TO169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1Η-咪唑）、PH-797804(3-(4-(2, 4-二氟苄氧基)-3-溴-6-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)_基）-叱4-二甲基苯甲酰胺）、38202190 (4-(4-(4-氟苯基)-5-(吡啶-4-基)-1Η-咪唑-2-基)苯酚）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔丁 基-1-对甲苯基-IH-吡唑-5-基)-3-(4-(2-吗啉基乙氧基)萘-1-基)脲）、VX-702( 1-(5-氨基 甲酰基-6-(2,4-二氟苯基）吡啶-2-基)-1-(2,6-二氟苯基）脲）以及了厶1(-7150-[4-[2-乙 基-4-( 3-甲基苯基)-5-噻唑基]-2-吡啶基]-苯甲酰胺。25. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是PI3K抑制剂。26. 根据权利要求25所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂选自dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-喹啉-3-基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基）苯基]丙腈）、GDC-0941(2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)-1-哌嗪基]甲基]-4-(4-吗啉基)噻吩并[3,2-d]嘧 啶）、LY294002(2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮）、idealalisib(5-氟-3-苯基-2-[(lS)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)_ 喹唑啉酮）、burparlisib(5-(2,6-二吗啉基 嘧啶-4-基)-4-(三氟甲基）吡啶-2-胺）、⑶C-0032(4-[5,6-二氢-2-[3-甲基-1-(1-甲基乙 基)-1Η-1，2,4-三唑-5-基]咪唑并[1，2-(1][1，4]苯并氧氮杂革-9-基]-€[，€1-二甲基-1!1-吡 唑-1-乙酰胺）、PI-103(3-(4-(4-吗啉基)吡啶并[3' ,2' :4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基)苯 酚）、NU7441(8-(4-二苯并噻吩基)-2-(4-吗啉基）-4Η-1-苯并吡喃-4-酮）、GSK2636771(2-甲基-1-[ [2-甲基-3-(三氟甲基)苯基]甲基]-6-(4-吗啉基)-1Η-苯并咪唑-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(lS)-1-(9-H-嘌呤-6-基氨基）乙基]-1-(2H)_ 异喹啉酮）、XL147(N-(3-(苯并[c][l，2,5]噻二唑-5-基氨基）喹喔啉-2-基)-4-甲基苯磺酰胺）、TGX-221(7-甲 基-2-(4-吗啉基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-吡啶并[l，2-a]嘧啶-4-酮）、PIK-90(N-(7， 8-二甲氧基-2,3-二氢-咪唑并[l，2-c]喹唑啉-5-基)-烟酰胺）、渥曼青霉素（11-(乙酰氧 基)-1，613,7,8,9&，10，11，1113-八氢-1-(甲氧基甲基）-9&，1113-二甲基-，（15,6匕1?，9&5，111?， llbR)-3H-氟[4,3,2-de]茚并[4,5-h]-2-苯并吡喃-3,6,9-三酮）、￥5-5584(5-[8-甲基-9- (1-甲基乙基)-2-(4-吗啉基)-9H-嘌呤-6-基]-2-嘧啶胺)和TG-100703(3-(2,4-二氨基-6-蝶啶基) _苯酌O。27. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是IRE-I抑制剂。28. 根据权利要求27所述的组合物，其中所述IRE-I抑制剂选自IREl抑制剂I (N-[ (2-羟 基萘-1-基）亚甲基]噻吩-2-磺酰胺）、IRE1抑制剂11(3^甲酰基-V-羟基-δ'-甲氧基联苯 基-3-甲酰胺）以及IREl抑制剂111(8-甲酰基-7-羟基-4-甲基香豆素，7-羟基-4-甲基-2-氧 代-2Η-色烯-8-甲醛）。29. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是钙蛋白酶抑制剂。30. 根据权利要求29所述的组合物，其中所述钙蛋白酶抑制剂选自钙蛋白酶抑制剂I (N-乙酰基-Leu-Leu-正亮氨酸-CHO)、钙蛋白酶抑制剂II(N-乙酰基-Leu-Leu-Met)、钙蛋白 酶抑制剂III (Z-Val-Phe-CHO )、钙蛋白酶抑制剂I V( Z-Leu-Leu-Tyr-CH2F )、钙蛋白酶抑制 剂V(吗啉基酰脲基;-Val-高苯丙氨酸-CH2F)、钙蛋白酶抑制剂VI (4-氟苯基磺酰基-Val-Leu-CHO)、钙蛋白酶抑制剂X(Z-Leu_a-氨基丁酸-C0NHC2H5)、钙蛋白酶抑制剂XKZ-L-α-氨 基丁酸-C0NH(CH2)3-吗啉)和钙蛋白酶抑制剂XII(Z-L-正缬氨酸-C0NH-CH2-2-吡啶基）。31. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是胱天蛋白酶-1抑制 剂。32. 根据权利要求31所述的组合物，其中所述胱天蛋白酶-1抑制剂选自胱天蛋白酶-1 抑制剂IKAc-YVAD-氯甲基甲酮）、N-(2-喹啉基)缬氨酰-天冬氨酰-(2,6_二氟苯氧基）甲基 甲酮(其中天冬氨酰残基是a-甲基化或非a-甲基化的）、VX-765((S)-1-((S)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-N-((2R，3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氢呋喃-3-基)吡咯 烷-2-甲酰胺)和ZVAD-氟甲基甲酮。33. 根据权利要求9所述的组合物，其进一步包含至少一种ER蛋白伴侣诱导剂。34. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述ER蛋白伴侣诱导剂选自BIX、丙戊酸盐和 锂。35. 根据权利要求9所述的组合物，其进一步包含至少一种自噬诱导剂。36. 根据权利要求35所述的组合物，其中所述自噬诱导剂选自氟司必林、三氟拉嗪、匹 莫齐特、尼卡地平、尼古地平、洛哌丁胺、胺碘酮、雷帕霉素、白藜芦醇和SMER。37. 根据权利要求9所述的组合物，其进一步包含至少一种存活蛋白。38. 根据权利要求37所述的组合物，其中所述存活蛋白是Bcl-xL。39. -种包含再水化的细胞的组合物，其中该再水化的细胞是在没有冷冻的情况下基 本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本干燥储存至少1小时后再水化时，该再水化的细胞表 现出至少一种与脱水和基本干燥储存之前的细胞基本相同的功能性质。40. 根据权利要求39所述的组合物，其中所述细胞的再水化在再水化制剂的存在下发 生。41. 根据权利要求40所述的组合物，其中所述再水化制剂包含至少一种凋亡抑制剂。42. 根据权利要求41所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。43. 根据权利要求39所述的组合物，其中所述再水化制剂进一步包含选自ER蛋白伴侣 诱导剂、自噬诱导剂和存活蛋白中的一种或多种。44. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种功能性质包括代谢活性。45. 根据权利要求44所述的组合物，其中所述代谢活性通过测定ATP含量来度量。46. 根据权利要求45所述的组合物，其中所述代谢活性通过胱天蛋白酶测定试验来度 量。47. 根据权利要求1所述的组合物，其中再水化后的代谢活性在细胞再水化后24小时测 量。48. 根据权利要求1所述的组合物，其中再水化后的代谢活性在细胞再水化后48小时测 量。49. 根据权利要求1所述的组合物，其中再水化后的代谢活性在细胞再水化后72小时测 量。50. 根据权利要求1所述的组合物，其中再水化后的代谢活性在细胞再水化后一周测 量。51. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在再水化之前以脱水形式稳定化至 少24小时。52. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在再水化之前以脱水形式稳定化至 少48小时。53. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在再水化之前以脱水形式稳定化至 少72小时。54. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在再水化之前以脱水形式稳定化至 少一周。55. -种脱水制剂，其包含： (i) pH缓冲液； (ii) 合成氨基酸； (iii) 水溶性聚合物；以及 (iv) 第一氨基酸或肽。56. 根据权利要求55所述的脱水制剂，其进一步包含非还原糖、至少一种凋亡抑制剂或 第二氨基酸。57. -种在没有冷冻的情况下将一种或多种细胞在环境温度下基本干燥储存的方法， 其包括： (i) 将所述一种或多种细胞与包含干燥储存稳定剂和至少一种凋亡抑制剂的脱水制剂 一起温育；以及 (ii) 在脱水制剂的存在下使所述一种或多种细胞脱水，以产生一种或多种基本干燥储 存的细胞。58. -种在没有冷冻的情况下将一种或多种细胞在环境温度下基本干燥储存的方法， 其包括： (i) 将所述一种或多种细胞与包含至少一种凋亡抑制剂的预脱水制剂一起温育； (ii) 从所述一种或多种细胞中去除所述预脱水制剂；以及 (iii) 在包含至少一种不是二糖的干燥储存稳定剂的脱水制剂的存在下使所述一种或 多种细胞脱水，以产生一种或多种基本干燥储存的细胞。59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述脱水制剂是表1中的脱水制剂中的一种。60. 根据权利要求59所述的方法，其中所述脱水制剂是表1中的脱水制剂中的一种。61. 根据权利要求58所述的方法，其中所述凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。62. 根据权利要求59所述的方法，其进一步包括在将一种或多种细胞与所述预脱水制 剂一起温育之前将所述一种或多种细胞固定至固体支持体上。63. 根据权利要求58所述的方法，其进一步包括采用包含至少一种凋亡抑制剂的再水 化制剂将所述一种或多种基本干燥储存的细胞再水化，以产生再水化的细胞。64. 根据权利要求59所述的方法，其进一步包括采用包含至少一种凋亡抑制剂的再水 化制剂将所述一种或多种基本干燥储存的细胞再水化，以产生再水化的细胞。65. 根据权利要求59所述的方法，其中所述凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。66. 根据权利要求59所述的方法，其中所述预脱水制剂中的至少一种凋亡抑制剂与所 述再水化制剂中的至少一种凋亡抑制剂相同。67. 根据权利要求60所述的方法，其中所述预脱水制剂中的至少一种凋亡抑制剂与所 述再水化制剂中的至少一种凋亡抑制剂不同。68. -种试剂盒，其包含含有不是二糖的干燥储存稳定剂的液体脱水制剂，用于放置一 种或多种细胞以进行基本干燥储存的样品容器，以及包含关于使用所述液体脱水制剂将一 种或多种细胞基本干燥储存的使用说明的包装插页。69. 根据权利要求68所述的试剂盒，其中所述脱水制剂进一步包含至少一种凋亡抑制 剂。70. 根据权利要求68所述的试剂盒，其进一步包含用于在脱水前固定一种或多种细胞 的固体支持体，包含至少一种凋亡抑制剂的预脱水制剂，包含至少一种不是二糖的干燥储 存稳定剂的、用于所述一种或多种细胞的基本干燥储存的脱水制剂，以及包含关于将所述 一种或多种细胞固定至所述固体支持体以及关于采用所述预脱水制剂和脱水制剂将一种 或多种细胞基本干燥储存的说明的包装插页。71. 根据权利要求68所述的试剂盒，其进一步包含再水化缓冲液，该再水化缓冲液包含 至少一种凋亡抑制剂。72. 根据权利要求70所述的试剂盒，其进一步包含再水化缓冲液，该再水化缓冲液包含 至少一种凋亡抑制剂。
【专利摘要】本发明涉及细胞在环境温度下的稳定化。更具体地，本发明涉及允许细胞脱水和再水化并且显著提高功能性细胞在室温下干燥储存后的恢复性的制剂、组合物、试剂盒和方法。
【IPC分类】A61K31/4706, A01N1/02, A61K31/17
【公开号】CN105491883
【申请号】CN201480044962
【发明人】朱蒂·穆勒-科恩, 保罗·迪亚兹, 罗尔夫·穆勒, 瓦斯科·利贝拉尔, 阿尔伯特·佩雷斯-拉达格
【申请人】生物马特里卡公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月13日
【公告号】CA2915250A1, EP3007556A2, US20160135446, WO2015002729A2, WO2015002729A3
【专利说明】细胞稳定化 发明背景
[0001 ]本申请要求于2013年6月13日提交的美国临时申请号61 /834，517的权益，该临时 申请通过引用全文并入本文。
技术领域
[0002] 本发明设及细胞的稳定化。 相关领域的描述
[0003] 有核细胞(例如，真核细胞)的长期储存通常需要在毒性冷冻保护剂DMSO的存在下 超低的溫度。除了由冷藏系统的常见失效导致的损失之外，活细胞从冷冻状态的恢复是有 挑战性的，且通常仅少部分的投入细胞存活。
[0004] 在过去的20年中，已花费数百万美元的研究基金来尝试开发用于在环境溫度下稳 定化真核细胞的替代方法。运些努力背后的动力是环境溫度稳定化的真核细胞储备物用于 生物医学研究、产品开发W及在诊断学、再生医学、治疗学、血液供应物流学和细胞移植中 直接应用的优势。
[000引基于对可在干燥状态下存活多年的极端微生物如缓步动物、轮虫或面虫（brine shrimp)的研究，有人假设可W在真核细胞培养物中开发模拟运一分子现象的技术和方案。 遗憾的是，即使在数十年的研究之后，仍未实现细胞的实用干燥储存稳定化。所描述的最好 的稳定化技术采用海藻糖一一一种非还原糖分子作为干燥介质。载有海藻糖的哺乳动物细 胞可被干燥但需要几乎立即再水化，并且即使那样存活率仍然有限。已经证明，干燥细胞储 存即使持续几分钟也会导致彻底的细胞死亡。
[0006] 因此，存在开发允许细胞在环境溫度下基本干燥储存且再水化时保持活力的制 剂、组合物和方法的需要。
【发明内容】
[0007] 本文所述的制剂、组合物和方法有利地使细胞在基本干燥的条件下储存时维持存 活状态，使得细胞在干燥储存至少一小时，且在某些实施方案中至少一周的时间段后再水 化时保持至少一种功能性质，例如，细胞活力，从而在无需冷冻或冻干的情况下显著增加可 用于运输和储存活细胞的时间。在本发明的一个方面，提供了组合物，其包含在没有冷冻或 任选地没有冻干的情况下基本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本干燥储存至少1小时后 再水化时，再水化的细胞表现出至少一种与脱水和基本干燥储存之前的细胞基本相同的功 能性质。
[0008] 在某些实施方案中，所述组合物包含至少一种干燥储存稳定剂，该干燥储存稳定 剂优选地选自氨基酸、合成氨基酸、肤、非还原糖、馨合剂、水溶性聚合物和四氨喀晚。在一 个实施方案中，不存在为糖分子（例如，海藻糖）的稳定剂，或者如果存在为糖分子的稳定 剂，则还存在另一种不是糖分子的稳定剂。
[0009] 在某些其他实施方案中，提供了包含至少一种调亡抑制剂、优选可逆调亡抑制剂 的组合物。示例性的调亡抑制剂选自阳服-e IF2-a抑制剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、 JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、IREl抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧 蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0010] 在另一个方面，提供了组合物，其中在脱水之前用包含至少一种调亡抑制剂的预 脱水制剂处理细胞W产生预处理的细胞。在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂选 自PE服-eIF2-a抑制剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、 IREl抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1 抑制剂。
[0011] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是PE服-eIF2-a抑制剂。
[0012] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂。
[0013] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制剂。
[0014] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。
[0015] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是MEK抑制剂。
[0016] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。
[0017] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和P38MAP激酶抑制 剂。
[0018] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。
[0019] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。
[0020] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。
[0021] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0022] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种邸蛋白 伴侣诱导剂。
[0023] 在某些其他实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种自 隧诱导剂。
[0024] 在又一个实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种存活 蛋白。
[0025] 在本发明的另一个方面，提供了包含再水化的细胞的组合物，其中该再水化的细 胞是在没有冷冻或冻干的情况下基本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本干燥储存至少1 小时后再水化时，该再水化的细胞表现出至少一种与脱水和基本干燥储存之前的细胞基本 相同的功能性质。
[0026] 在某些实施方案中，所述细胞的再水化在再水化制剂的存在下发生，并且优选地 该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂。
[0027] 在某些其他实施方案中，所述再水化缓冲液中的至少一种调亡抑制剂选自PEW-e I F2-a抑制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制 剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0028] 在其他实施方案中，所述再水化制剂包含调亡抑制剂W及选自ER蛋白伴侣诱导 剂、自隧诱导剂和存活蛋白中的一种或多种。
[0029] 在一个实施方案中，再水化后的至少一种功能性质包括代谢活性。
[0030] 在某些实施方案中，所述代谢活性通过测定ATP含量或脫天蛋白酶测定试验来度 量。
[0031] 在某些其他实施方案中，再水化后的代谢活性在细胞再水化后24小时、细胞再水 化后48小时、细胞再水化后72小时或细胞再水化后一周测量。
[0032] 在其他实施方案中，所述组合物在再水化前W脱水形式稳定化至少24小时，在再 水化前W脱水形式稳定化至少48小时，在再水化前W脱水形式稳定化至少72小时，或在再 水化前W脱水形式稳定化至少一周。
[0033] 在其他方面，提供了脱水制剂，其包含抑缓冲液;合成氨基酸、水溶性聚合物；W及 第一氨基酸或肤。在某些实施方案中，所述脱水制剂进一步包含非还原糖、至少一种调亡抑 制剂或第二氨基酸。
[0034] 在又一个方面，提供了在没有冻干的情况下将一种或多种细胞在环境溫度下基本 干燥储存的方法，该方法包括:将一种或多种细胞在脱水制剂中溫育，W及在脱水制剂的存 在下使该一种或多种预处理的细胞脱水，W产生一种或多种基本干燥储存的细胞。在其他 方面，提供了在没有冻干的情况下将一种或多种细胞在环境溫度下基本干燥储存的方法， 该方法包括:将所述一种或多种细胞与包含调亡抑制剂的预脱水制剂一起溫育W产生一种 或多种预处理的细胞，去除所述预脱水制剂；W及在脱水制剂的存在下使所述一种或多种 预处理的细胞脱水，W产生一种或多种基本干燥储存的细胞。
[0035] 在一个实施方案中，所述方法中使用的脱水制剂包含至少一种干燥储存稳定剂， 并且在没有使用预脱水制剂时可进一步包含至少一种调亡抑制剂(在一个实施方案中其为 可逆调亡抑制剂）。
[0036] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在将一种或多种细胞与所述预脱水制 剂一起溫育之前将所述一种或多种细胞固定至固体支持体上。
[0037] 在又一个实施方案中，所述方法进一步包括采用包含至少一种调亡抑制剂的再水 化制剂将所述一种或多种基本干燥储存的细胞再水化，W产生再水化的细胞。
[0038] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂与所述再水化制剂 中的至少一种调亡抑制剂相同，而在其他实施方案中，所述预脱水制剂中的至少一种调亡 抑制剂与所述再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂不同。
【附图说明】
[0039] 图1是ER应激通路的S种近端ER跨膜传感器的示意图，（A)GRP78结合的失活状态， (B)GRP78的释放导致激活IREl。
[0040] 图2是邸应激通路(A)、由调亡抑制剂抑制的ER应激通路的阻断步骤和祀标(B)的 示意图。
[0041] 图3示出了采用本文所述的制剂和方法基本干燥储存的间充质干细胞(MSC)保持 在再水化时分化成脂肪细胞(B图）、骨细胞(C图）和软骨细胞(D图）的能力。
[0042] 图4示出了化La细胞在脱水和室溫下储存5小时后的长期活力。（A)干燥5小时并随 后进行五天的再水化后的细胞活力。(B)每毫升的活细胞数目。将细胞接种到新鲜的细胞培 养板中，并采用根据本文公开的一个实施方案的组合物对各组进行处理。
[0043] 图5示出了相对于未处理的对照的脫天蛋白酶3/7活化。脫天蛋白酶活化计算为在 标准组织培养条件下培养的测试样品中的活性与未处理的细胞的活性之比。使测试的细胞 脱水并在室溫下干燥储存5小时，随后进行5天的再水化。
[0044] 图6示出了细胞在脱水、干燥状态储存7小时并且储存后再水化后的存活。在重新 接种后3天W及再水化后共7天评价细胞活力。不同的稳定化制剂影响细胞存活W及细胞增 殖。未受到保护的对照和海藻糖稳定化的细胞没有产生任何存活的细胞。 发明详述
[0045] 不希望受任何理论的限制，预期本文所述的某些实施方案的制剂和组合物稳定化 细胞膜和细胞的细胞器的完整性，同时还阻断调亡(例如，通过在脱水前的限定阶段和在再 水化时阻断特定ER应激通路），W提供在环境溫度下储存至少一个小时的基本干燥的细胞， 该基本干燥的细胞在被再水化至少一小时的时间段后保持至少一种功能性质。在某些实施 方案中，采用调亡抑制剂阻断特定m?应激通路。在其他实施方案中，采用调亡抑制剂结合ER 蛋白伴侣诱导剂来阻断特定ER应激通路，W驱使ER应激通路朝向适应性反应而非调亡。
[0046] 在某些实施方案中，采用脱水制剂使细胞脱水，该脱水制剂优选地包含至少一种 干燥储存稳定剂和至少一种调亡抑制剂。
[0047] 在某些其他实施方案中，在将细胞在脱水制剂的存在下脱水W产生基本干燥储存 的细胞之前，采用包含调亡抑制剂的预脱水制剂预处理细胞预定的一段时间，例如1小时。 将基本干燥储存的细胞在再水化制剂的存在下再水化，该再水化制剂优选地包含调亡抑制 剂，该调亡抑制剂可与预脱水制剂中的调亡抑制剂相同或不同。在特定的一段时间，例如1 小时之后，去除再水化制剂，并且可根据预期的最终用途，将细胞在生长培养基或其他合适 的溶液和缓冲液中再水化。 定义
[0048] 除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术 人员通常理解的含义相同的含义。本文引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用全 文并入本文。
[0049] 如本文所用的，术语"真核细胞"是指在真核生物(优选人类)的真核细胞发育的任 何给定阶段(包括受精的卵母细胞、母细胞W及其他胚胎阶段、胎儿或成人）的体液或组织 中存在的至少一种有核细胞。可采用本发明的制剂、组合物和方法在环境溫度下基本干燥 储存的示例性细胞包括但不限于成纤维细胞、角质形成细胞、软骨细胞、黑素细胞、成骨细 胞、骨细胞、肌细胞、屯、肌细胞、神经元、雪旺细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、 T细胞、B细胞、记忆细胞、网织红细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细 胞、巨隧细胞、巨核细胞、树突细胞、脂肪细胞、膜岛细胞、卵母细胞、精母细胞、胎盘厮带血 细胞、母细胞、合子、上皮细胞(例如，乳腺细胞、子宫内膜细胞、膜腺腺泡细胞、杯状细胞、朗 格汉斯细胞、成釉细胞和帕内特细胞）、牙细胞(odontocytes)、肝细胞、脂细胞、壁细胞、肺 细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、视网膜光感受器和色素细胞、晶状体细胞W及干 细胞(包括多能或全能胚胎干细胞、胎儿干细胞、iPS细胞和间充质干细胞)或其混合物。干 细胞可WW未分化或部分分化状态在环境溫度下基本干燥储存。
[0050] 如本文所用的，术语"预处理的细胞"是指在脱水之前已经用包含至少一种调亡抑 制剂的预脱水制剂处理过的细胞。预处理的细胞预先载有调亡抑制剂，W允许采用含有或 缺少调亡抑制剂的脱水制剂在没有m?应激通路活化的情况下基本干燥储存预处理的细胞。 在某些实施方案中，在添加脱水制剂之前，将包含调亡抑制剂的预脱水制剂从预处理的细 胞中去除，但细胞内调亡抑制剂的浓度足W在没有邸应激通路活化的情况下基本干燥储存 细胞。
[0051 ]如本文所用的，术语"在环境溫度下基本干燥储存"或"在环境溫度下基本干燥储 存的"是指采用本发明的制剂、组合物和方法，在没有冷冻或冻干的情况下将细胞在环境溫 度下储存，同时使细胞在再水化状态下保持至少一种功能性质的能力。基本干燥储存的细 胞不一定需要消除所有的内部自由水，但优选去除至少45%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或最多98%的内部自由水。根据待干燥储存的细胞的 类型、所使用的预脱水和/或脱水制剂W及基本干燥储存的细胞的预期用途，可将基本干燥 储存的细胞在环境溫度下储存不同的时间段。可将细胞W脱水状态储存W下的时间段：1) 数小时，例如，1、2、6、12或18小时；2)数天，例如，1天、2天、4天或6天;3)数周，例如，1周、2周 或3周;4)数月，例如，1个月、2个月、4个月、6个月、8个月或11个月；W及5)甚至数年，例如，1 年、2年、5年、10年、20年或更多年。
[0052] 如本文所用的，术语"固定的"是指粘附于固体表面或与固体表面直接接触的基本 干燥储存的细胞。可将细胞在添加脱水制剂和干燥之前固定，或可在预脱水步骤之前固定 并在整个脱水过程中保持固定。合适的固体表面包括但不限于:载玻片、珠子、忍片、膜、片、 网、柱、亲和树脂、海绵、塑料(包括96孔板）、培养皿和烧瓶、管、容器、器皿、天然基质(诸如 但不限于胶原和藻酸盐水凝胶)或细胞可W借其生长的任何其他基层。
[0053] 如本文所用的，"调亡抑制剂"是指能够下调、减少、抑制或W其他方式调节所期望 的酶的量和/或活性或通路(优选地在ER应激通路中的步骤)W防止诱导细胞调亡的任何化 合物或试剂，包括ER蛋白伴侣诱导剂、自隧诱导剂W及内源或外源性存活蛋白。对运些酶或 通路的抑制可通过本领域已知的多种机制中的任何机制来实现，该机制包括但不限于:直 接与酶结合(优选W可逆的方式），或者短暂地抑制编码酶或祀标的基因的表达(例如，转录 成mRNA，翻译成新生多肤，和/或最终多肤修饰成成熟蛋白质）。调亡抑制剂包括本文所述的 具体的调亡抑制剂。
[0054] 如本文所用的，术语"抑制"是指化合物或试剂下调、减少、降低、抑制、灭活或至少 部分地抑制酶的活性或者酶或蛋白质的表达的能力。优选地，该抑制是可逆的。 ER应激通路
[0055] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少一种调 亡抑制剂，该调亡抑制剂阻断ER应激通路中的至少一个必要步骤。
[0056] 如图IA所示，高等真核生物的未折叠蛋白质反应(UPR)信号传导通过S个近端邸 跨膜传感器一阳服、激酶/RNA酶IRE巧日转录因子ATF6来引发(例如，参见Kaufman RJ(2002) J Clin Invest HO:1389-1398.doi:10.1172/jci0216886；Mori K(2000)Cell 101:451-454.doi:10.1016/s0092-8674(00)80855-7;Ron D，Walter P(2007)化t Rev Mol Cell Biol 8:519-529.(1〇1:10.1038/11^11219)。阳服的活化通过61的〇(〇翻译起始因子）的憐酸化 导致蛋白质翻译在整体范围内的抑制（图lB;Harding等人，（2000)1〇10611 5:897-904.(1〇1:10.1016/31097-2765(00)80330-5)。与此相伴，阳服通过增加转录因子41。4的翻 译促进UPR特异性基因的转录。IRE1通过从XBP1 mRNA上切除内含子产生选择性剪接的更有 效形式的XBPl (例如，参见Calfon等人（2002)化ture 415:92-96. doi : 10.1038/415092a)。 第SUPR传感器一ATF6，是一种ER跨膜蛋白质，在其胞质侧上具有转录激活结构域。
[0057] 如图2A所示，在邸应激事件中，ATF6经历蛋白质水解，由此从邸膜释放其胞质反式 激活结构域。一旦被释放，该胞质反式激活结构域即进入细胞核化aze等人，（1999)Mol Biol Cell 10:3787-3799.doi :10.1091/mbc. 10.11.3787)并启动另外的UPR基因的转录。 由UPR引起的ER应激的近端传感器的活化导致复杂的基因调节模式。因此IPR信号旨在通过 上调邸蛋白伴侣如BiP、GRP94、巧网蛋白和化dj4提高蛋白质折叠能力来减轻和减少邸中高 水平的错折叠蛋白质（例如，参见Okada等人，（2002)Biochem J 366:585-594.doi: 10.1042/bj20020391;Yoshida等人，（1998)J Biol Chem 273:33741-33749.doi :10.1074/ jbc. 273.50.33741)。然而，在邸中的正确蛋白质折叠无法得到恢复的事件中，基因如CHOP 被上调并可导致调亡通路的激活。 l.GRP78/BiP
[0058] GRP78/BiP是内质网完整性和应激诱导的自隧所需的分子蛋白伴侣HSP家族的成 员。GRP78在调节未折叠蛋白质反应化PR)中起核屯、作用，并且是真核细胞中自隧的专性组 分，并可在细胞适应和致癌存活中发挥重要作用。GRP78的一种客户蛋白质是蛋白质双链 RNA激活的蛋白样内质网激酶(PE服），并且其与阳服的结合阻止阳服寡聚。GRP78还与客户 蛋白质IREl和ATF6结合W防止IREl的寡聚和ATF6的活化。GRP78在促进邸内部多聚体蛋白 质复合物的组装中发挥作用。 2.IREl
[0059] 需要肌醇的酶I(IREl)是一种具有核酸内切酶活性的ser/thr蛋白质激酶。IREl在 作为对基于内质网的应激信号的响应而改变基因表达方面是重要的，并且通过其N末端结 构域感测内质网的网眼中的未折叠蛋白质，从而导致酶的自活化。活性的核糖核酸内切酶 结构域对XBPlmRNA进行剪接W产生新的C末端，从而将其转化成有效的未折叠蛋白质反应 转录激活因子并触发生长停滞和调亡。激酶结构域通过反式自憐酸化而得到激活，并且激 酶活性对于核糖核酸内切酶结构域的活化是必需的。IREl被广泛表达且在膜腺组织中观察 到其高水平。IREl是二硫键连接的同二聚体，且二聚体形成由N末端腔结构域内的疏水作用 驱动并通过二硫键而稳定化。IREl还与HSPA5(未折叠蛋白质反应的负调节物)结合。该相互 作用可破坏同二聚体化作用并阻止IREl的激活。 3. 阳服
[0060] 真核生物翻译起始因子2-a激酶3，也称为P服R样内质网激酶或蛋白质激酶R(PKR) 样内质网激酶(PE服），是一种在人类中由EIF2AK3基因编码的酶。PE服对真核生物翻译起始 因子2化IF2)的a亚基进行憐酸化，导致其失活，并由此导致翻译引发的快速减少和对总体 蛋白质合成的抑制。它是位于内质网化R)中的I型膜蛋白，在内质网中它通过由错折叠蛋白 质导致的ER应激而得到诱导。 4. ATF6
[0061] 运种基因编码在内质网化R)应激过程中激活未折叠蛋白质反应(UPR)的祀基因的 转录因子。虽然它是转录因子，但运种蛋白质是不常见的，因为它作为嵌入ER中的跨膜蛋白 质而合成。它起到邸应激传感器/转导器的作用 ，并且在ER应激诱导的蛋白质水解后，它通 过存在于编码ER蛋白伴侣的基因的启动子中的顺式作用ER应激应答元件化RSE)而起到细 胞核转录因子的作用。该蛋白质已经被鉴定为静止的而非增殖性鱗状癌细胞的存活因子。 5. ASKl
[0062] 调亡信号调节激酶I (ASKl)也称为丝裂原活化蛋白激酶5(MAP3K5)，它是MAP激酶 家族的成员，并且同样是丝裂原活化蛋白激酶通路的一部分。ASKl直接将MKK4(SEK1)/MKK7 和MKK3/MKK6憐酸化，运随之响应于一系列应激如氧化应激、内质网应激和巧流入，W不依 赖Raf的方式激活C-Jun N末端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶。
[0063] 在无应激条件下，ASKl通过其C末端卷曲螺旋域(CCC)进行寡聚（对于其活化是必 需的），但由于减少的硫氧还蛋白（Trx)和巧W及整合素结合蛋白I(CIBl)的抑制作用，其仍 保持为无活性形式。Trx通过直接与其N末端卷曲螺旋域(NCC)结合而抑制ASKl激酶活性。 Trx和CIBl分别W氧化还原或巧敏感性方式调节ASKl活化。两者似乎都与TNF-a受体相关因 子2(TRAF2)---种ASKl活化剂相竞争。然后，TRAF2和TRAro被募集到ASKl，W形成更大分 子量的复合物(参见图2A)。随后，ASKl不仅通过CCC，还通过NCC来形成同寡聚相互作用，运 导致ASKl通过在苏氨酸845处的自憐酸化而完全活化。 6. JNK
[0064] C-Jun-N末端激酶(JNK1/2/3)是在哺乳动物细胞中发现的丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)级联的S个主要组之一的下游组分，其中另外两个由细胞外信号调节激酶化RK1/2) 和p38蛋白激酶(p38.a、e、丫、S)组成。每一组的激酶均为包括MAPK的=模块级联的一部分， 该MPK通过由MAPK激酶(MAPKK)引起的憐酸化而得到激活，该MPK激酶随之通过由MAPKK激 酶(MAPKKK)引起的憐酸化而得到激活。已将JNK和p38的活化与调亡的诱导相联系。通过采 用多种细胞类型，证明了 JNK的持续活化诱导细胞死亡，并且证明通过显性阴性化N)抑制剂 对JNK活化的阻滞阻止了由一系列调亡刺激导致的杀伤。通过对祀向破坏化k基因的小鼠的 分析也证明了 JNK在调亡中的作用。JNKl和JNK2均缺乏的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)对由多 种应激刺激导致的调亡具有完全的抗性，该应激刺激包括基因毒物、UV福射和茵香霉素，并 且化k3-/-神经元在对兴奋毒素的调亡反应中表现出严重的缺陷。而且，已证明JNK2对于在 未成熟胸腺细胞中的抗-CD3诱导的调亡是必需的。 7. P38MAP 激酶
[0065] P38MAP激酶(a、e、丫和S)是MAPK家族的成员，并且W下四种P38MPK均已经在高等 真核生物中进行克隆：p38-a/XMpk2/CSBP、p38-e/p38-的2、p38- 丫 /SAPK3/ERK6和p38-S/ SAPK4。运四种蛋白质在其氨基酸序列上有60-70%相同，并且均被MKK6(MAPK激酶-6)激活。 已证明另一种MPK激酶一MKK3(MAPK激酶-3)将p38-a、p38-丫和P38-S(而非P38-02)憐酸化 并激活。哺乳动物P38MAPK家族通过细胞应激而激活，该细胞应激包括UV福射、热激和高渗 透应激。
[0066] 由于越来越多的转录因子被认为是p38的直接祀标，因此P38MAP激酶的活化还可 直接影响基因转录。已经描述了 ATFUATF2和ATF-6、MEF2A/C(肌细胞增强因子-2A/C)、 SAPlA(信号传导淋己细胞活化分子相关蛋白-1A) W及ElkUETS域转录因子-1)的直接憐酸 化和活化。 8. MEK
[0067] "MEK1"和"MEK2"是丝裂原活化的邸K活化激酶的缩写巧中邸K是细胞外信号调节 蛋白激酶，MAPK的另一个名称）dMEK巧PMEK2是双功能的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸蛋白激酶， 并且也被称为MAP激酶。Ras-GTP激活Raf ,Raf激活MEKl和MEK2，而MEKl和MEK2激活MAP激酶 (MAPK)。一旦被激活，Raf和其他激酶将两个相邻的丝氨酸残基(在MEK-I的情况下为S 2IS和 S222 )上的MEK憐酸化。运些憐酸化对于MEK活化为激酶是必需的。随之，MEK将在由单个氨基 酸分开的两个残基上的MAP激酶憐酸化，该单个氨基酸为:酪氨酸(Y"5)和苏氨酸(T"3)。在 将MP激酶憐酸化之前，MEK似乎与MAP激酶紧密关联，表明MEK对MAP激酶的憐酸化可能需要 两种蛋白质之间预先的强相互作用。 9. PI3K-Akt 通路
[0068] 憐脂酷肌醇3'-激酶(PUK)-Akt信号传导通路被多种类型的细胞刺激或毒性损伤 激活，并且调苄基本的细胞功能如转录、翻译、增殖、生长和存活。生长因子与其受体酪氨酸 激酶(RTK)或G蛋白偶联受体(GPCR)的结合分别刺激Ia和Ib类PI3K同种型。PUK催化憐脂酷 肌醇-3,4,5-S憐酸(PIP3)在细胞膜处的产生。PIP3转而作为帮助激活Akt的第二信使。一 旦成为活性的，Akt可通过使参与调亡、蛋白质合成、代谢和细胞循环的底物憐酸化来控制 关键的细胞过程。 10. XBP-I
[0069] 该基因编码通过与被称为X盒的启动子元件结合而调节MHC II类基因的转录因 子。该基因产物为bZIP蛋白，其也被鉴定为与T细胞白血病病毒I型启动子的启动子中的增 强子结合的细胞转录因子。已经发现，未折叠蛋白质在内质网巧R)中积累时，该基因的mRNA 通过经由核酸内切酶肌醇需求酶I(IREl)介导的非常规剪接机制被加工成活性形式。所产 生的来自剪接的mRNA的26nt的损失导致移码和同种型XBPl(S),该同种型XBPl(S)是功能活 性转录因子。由未剪接的mRNA编码的同种型一XBPl(U)是组成型表达的，并且被认为起到 XBPl(S)的负反馈调节物的作用，其关闭祀基因在邸应激的恢复阶段中的转录。XBPl的假基 因已被鉴别出且位于5号染色体。 11. eIF2-a
[0070] eIF2-a是翻译起始因子，其通过与GTP和起始因子tRNA形成S元复合物而在蛋白 质合成的早期步骤中起作用。该复合物与40s核糖体亚基结合，随后与mRNA结合形成43S起 始前复合物。连接60S核糖体亚基W形成80S起始复合物之前，将与eIF-2结合的GTP水解并 释放eIF-2-GDP二元复合物。为了 eIF-2再循环并催化另一轮的引发，与eIF-2结合的GDP必 须W经由eIF-2B催化的反应的方式与GTP交换。eIF2-a被阳服、GCN2、皿I和PKR等至少4种激 酶被憐酸化，并且憐酸化使eIF-2/GDP/eIF-2B复合物稳定化并阻止GDP/GTP交换反应，由此 减少eIF-2在连续数轮引发之间的再循环并导致翻译的全面抑制。 12. GSK3
[0071] 糖原合成酶激酶-3(GSK3)最初被鉴定为参与糖原代谢的控制的酶。近年来已经证 明它在调节各种不同的细胞功能中具有关键作用，运些细胞功能包括蛋白质合成的引发、 细胞增殖、细胞分化、调亡，并且其作为Wnt信号传导级联的组分是胚胎发育所必需的。GSK3 作为膜岛素信号传导通路中的核屯、负调节物且在膜岛素抗性中发挥作用。 13. NRF2
[0072] 核因子(红系衍生2)样2也被称为NFE2L2或NRF2,是在人类中由NFE2L2基因所编码 的转录因子。NRF2抗氧化反应通路是针对氧化应激的细胞毒性效应的主要细胞防御。NRF2 增加了若干种抗氧化酶的表达。
[0073] NRF2是碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子。在正常或未应激的条件下，NRF2通过 Kelch样-ECH-相关蛋白UKEAP1)和滞蛋白3(化Ilin 3)(其通过泛素化降解NRF2)保持在细 胞质中。在氧化应激下，NRF2不被降解，而是转移到细胞核中，在那里它引发抗氧化基因及 其蛋白质的转录。 14. KEAPl
[0074] 已经证明Kelch样ECH相关蛋白UKEAPl)与NRF2(抗氧化反应的主要调节物）相互 作用。在静态下，NRF2通过与KEAPl结合而错定在细胞质中，KEAPl转而促进泛素化和随后的 NRF2蛋白质水解。运种结合和NRF2在细胞质中的进一步降解是KEAP1对NRF2的抑制效应的 机制。 15. ATF4
[007引激活转录因子4(化X-响应性增强子元件B67)也称为ATF4,是人类中由ATF4基因编 码的蛋白质。该基因编码最初被鉴定为广泛表达的哺乳动物DNA结合蛋白的转录因子，该 DNA结合蛋白可W结合HTLV-I的LTR中的tax-响应性增强子元件。编码的蛋白质还被分离并 被称为cAMP反应元件结合蛋白2 (CREB-2)。由该基因编码的蛋白质属于DNA结合蛋白家族， 该家族包括转录因子的AP-I家族、cAMP反应元件结合蛋白（CREB)和CR邸样蛋白。运些转录 因子共享蛋白质-蛋白质相互作用中设及的亮氨酸拉链区，该亮氨酸拉链区位于充当DNA结 合域的一段碱性氨基酸的C末端。已描述了编码相同蛋白质的两个替代转录物。两个假基因 位于X染色体上含有较大反向重复的区域中的q28处。 干燥储存稳定剂 1.天然和合成的氨基酸
[0076] 同样如本文所述的，某些实施方案中脱水制剂可在用于将功能性细胞在环境溫度 下基本干燥储存的脱水制剂中包含至少一种氨基酸或合成氨基酸。
[0077] 在某些实施方案中，该天然氨基酸选自甘氨酸、谷氨酷胺、谷氨酸和脯氨酸。
[0078] 在某些其他实施方案中，该脱水制剂和组合物可含有一种或多种具有通式I的合 成氨基酸，
其中Ri、R2、R3独立地选自芳基、芳烷基、-H、-C出和-C出-C曲，其中当Ri和R2为C出或Ofe-C出时，化为H或不存在，其中X选自-C出-，-C出CH2-，-OfcC出CH2-，-OfcC出OfcC出-，
并且其中Y选自COO和S03。
[0079] 在所述组合物中有用的示例性合成氨基酸包括在W02010132508和美国专利8， 519,125中描述的那些，运些文献的内容通过引用全文并入本文。可在本发明组合物中采用 的合成氨基酸包括径脯氨酸和甜菜碱(N，N，N-S甲基甘氨酸）。 2. 肤
[0080] 在某些实施方案中，本文所述的用于将细胞在环境溫度下基本干燥储存的脱水制 剂可含有肤。有利的是，已确定包含稳定量(例如，约IOmM到200mM)的小二肤或二肤类似物 的某些脱水制剂(包括表1中列出的那些）出乎意料地能够将细胞在环境溫度下基本干燥储 存，并且储存持续超过运些细胞的冷藏的时间段。示例性的二肤具有氨基酸序列丙氨酸-谷 氨酷胺。 3. =糖
[0081] 如本文所述，本文所述的某些实施方案中，所述制剂可在用于将细胞在环境溫度 下基本干燥储存的脱水制剂或组合物中包含至少一种=糖。=糖是由两个糖巧键连接的= 个单糖组成的寡糖。糖巧键可在组分单糖上的任意径基基团之间形成，且不同的键组合（区 域选择性)和立体化学(a-或e-)产生S糖，该S糖为具有不同的化学和物理性质的非对映 异构体。可基于本公开内容并根据本领域的常规实践来完成稳定储存组合物中所包含的一 种或多种特定=糖的选择，并且该选择可受到包括其他制剂组分在内的多个因素的影响。 示例性的=糖包括但不限于麦芽=糖、异麦芽=糖、棉子糖、松=糖(melezitriose)、黑曲 霉=糖和酬糖。在用于细胞的基本干燥储存的某些实施方案(包括表1中列出的制剂）中，该 S糖是松S糖并且优选浓度为约1 %-20 %，更优选约5.0-15 %，其中"约"可理解为表示量 的变化，该量的变化可W是比所述量高或低少于25%，更优选少于20%，且更优选少于 15%、10%、5% 或 1%。 4. 水溶性聚合物
[0082] 如本文所述，某些实施方案可在用于全血样品中核酸和/或多肤分子的基本稳定 储存的制剂和组合物中包含至少一种水溶性聚合物。运样的水溶性聚合物包括聚乙締化咯 烧和聚乙締醇，并且可W理解，技术人员根据本公开内容可选择用于基本干燥储存的制剂 和组合物的其他水溶性聚合物，因为其可基于所采用的组合物的其他组分和被储存的特定 细胞类型而变化。某些实施方案(包括但不限于在表1中所示的那些)预期包含浓度(基于体 积，即vol/vol)为约0.1-10% (vol/vol)，更优选约0. l-5%(vol/vol)，且更优选1.0% (vol/vol)的水溶性聚合物，其中"约"可理解为表示量的变化，该量的变化可W是比所述量 高或低少于50%，更优选少于40%，更优选少于30%，且更优选少于20%、15%、10%或5%。 在某些实施方案中，该水溶性聚合物为分子量范围为约30-70，000道尔顿且约87-90 %水解 的聚乙締醇，其中"约"可理解为表示量的变化，该量的变化可W是比所述量高或低少于 50%，更优选少于40%，更优选少于30%，且更优选少于20%、15%、10%或5%。 5. 非还原糖
[0083] 同样如本文所述，某些实施方案可在环境溫度下的预脱水和/或脱水制剂W及组 合物中包含至少一种非还原糖。非还原糖为缺少功能性醒基的糖分子。示例性的非还原糖 包括薦糖和海藻糖。在用于细胞的基本干燥储存的实施方案中，该非还原糖为W约1.0-200mM，优选约50mM-200mM，且更优选约150mM的浓度存在的海藻糖，其中"约"可理解为表示 量的变化，该量的变化可W是比所述量高或低少于25%，更优选少于20%，且更优选少于 15%、10%、5% 或 1%。 6. 聚酸
[0084] 根据某些实施方案，聚酸可包含在本文所述的用于将功能性细胞在环境溫度下基 本稳定储存的脱水制剂中。聚酸通常是指在其主链中含有多于一个酸官能团的聚合物。聚 酸是通过醇脱水形成的相对稳定的化合物。用于在所述制剂、组合物和方法中使用的示例 性的聚酸包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇和聚苯酸。在某些实施方案中，聚酸的分子量为 约5,000到15,000道尔顿。 7.四氨喀晚
[0085] 在某些实施方案中，所述干燥储存稳定剂是四氨喀晚。示例性的四氨喀晚为5-径 基四氨喀晚巧-hydro巧ectoine)。在某些脱水制剂和组合物中，使用约IOmM到约200mM浓度 的5-径基四氨喀晚。 制剂试剂 1. pH缓冲液
[0086] 根据某些实施方案，本文所述的、用于将功能性细胞在环境溫度下基本干燥储存 的脱水制剂和组合物可包含一种或多种抑缓冲液，该pH缓冲液可W是由于其抵抗溶液(如 pH缓冲液存在于其中的水溶液)的pH变化的能力而被本领域所知的大量化合物中的任意化 合物。可基于本公开内容并根据本领域中的常规实践来完成包含在稳定储存组合物中的一 种或多种特定抑缓冲液的选择，并且该选择可受到多种因素的影响，该因素包括期望维持 的pH、生物样品的性质、将要采用的溶剂条件、将要使用的制剂的其他组分W及其他标准。 例如，通常使用在质子解离常数(pKa)为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或 1.0抑单位内的抑下的抑缓冲液，质子解离常数是缓冲液的特征。
[0087] pH缓冲液的非限制性实例包括巧樣酸、酒石酸、苹果酸、横基水杨酸、横基间苯二 甲酸、草酸、棚酸盐、CAPS(3-(环己基氨基)-1-丙横酸）、CAPS0(3-(环己基氨基)-2-径基-1-丙横酸）、EPPS(4-(2-^基乙基)-1-赃嗦丙横酸）、肥PES(4-(2-^基乙基）赃嗦-1-乙横酸）、 MES(2-(N-吗嘟基）乙横酸）、M0PS(3-(N-吗嘟基）丙横酸）、M0PS0(3-吗嘟基-2-径基丙横 酸）、PIPES(1，4-赃嗦二乙横酸）、TAPS(N-[S(^基甲基）甲基]-3-氨基丙横酸）、TAPS0(2-径基-3-[^(径基甲基）甲基氨基]-1-丙横酸）、TES(N-[S(^基甲基）甲基]-2-氨基乙横 酸）、bicine(N，N-双（2-径基乙基)甘氨酸）、化icine(N-[S(^基甲基）甲基]甘氨酸）、S (^巧圣基甲基）氨基甲烧）和双-S(2-[双（2-径基乙基）氨基]-2-巧圣基甲基）-1,3-丙二 醇）。本文中设及的某些实施方案(包括表X中列出的那些中的多个)可W WpH为约4.0、4.1、 4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、 6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、 8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0的制剂为特征，其中"约"可理解为表示 量的变化，该量的变化可W是比所述抑值高或低少于1，优选少于0.5,优选少于0.25,且更 优选少于0.1个抑单位。 2. 馨合剂
[008引根据某些实施方案，馨合剂(化elating agent)或馨合剂(化elator)可包含在本 文所述的、用于血液样品中的完整活细胞的基本稳定储存的组合物中，并且由于其与金属 阳离子复合并阻碍金属阳离子的反应性的能力而被熟悉本领域的技术人员所知。示例性的 馨合剂包括二乙締 S胺五乙酸(DTPA)、乙二胺四乙酸化DTA)、乙二醇四乙酸化GTA)、反式- 1,2-二氨基环己烧-N，N，N'，N'-四乙酸(CDTA)、l，2-双（2-氨基苯氧基）乙烧-N，N，N'，N'-四 乙酸(BAPTA)、l，4,7，10-四氮杂环十二烧-l，4,7，10-四乙酸(D0TA)、N-(2-?基乙基）乙二 胺-N，N'，N'-S乙酸、葡萄糖酸钢和次氮基S乙酸(NTA)。一种馨合剂是葡萄糖酸钢并且W 约1.0-50mM，更优选约10-40mM，且更优选约25mM的浓度存在，其中"约"可理解为表示量的 变化，该量的变化可W是比所述量高或低少于25%，更优选少于20%，且更优选少于15%、 10%、5% 或 1%。 表1 用于将功能性细胞在环境溫度下基本干燥储存的示例性脱水制剂
脱水过程
[0089] 本发明的MCS脱水制剂能够在存在或不存在采用预脱水制剂的先前处理的情况 下，在脱水过程中维持细胞膜和细胞器的完整性W及细胞的总体形态，W使得细胞在基本 干燥储存后再水化时，细胞保持至少一种如脱水之前的细胞的功能性质，例如，细胞活力。
[0090] 例如，可通过简单的目测来确定脱水细胞的干燥，W确保所有水分均已蒸发或去 除。在一些实施方案中，可优选地包括水分指示物，W确定已经实现的干燥程度。将细胞基 本干燥的时间可根据MCS脱水制剂中存在的试剂而变化。根据制剂组分和细胞所固定的器 皿的几何形状，细胞最适宜在约一到S小时的时间段内脱水。细胞在约32°C-39°C的溫度范 围内，优选在约37°C下脱水，并可在培养箱中或在采用控制溫度、氧气水平和相对湿度的环 境室的更加受控的条件下脱水。通过调节相对湿度可调节脱水的速率。例如，在包含水溶性 聚合物(例如，PVA)的MCS制剂中脱水的细胞将花费更长的时间来脱水，所W可降低相对湿 度W有利于优化脱水时间。另外，多种干细胞的基本干燥储存在5 %的氧气浓度下进行，W 确保细胞维持在基本在免疫学上未分化的状态。
[0091] 可采用在细胞上方保持活跃的空气流动同时控制溫度和湿度的其他脱水方法。
[0092] 可采用可气密密封的罩或袋来储存基本干燥的细胞，W使得内容物可被密封W在 与用于细胞脱水的条件相似的气候条件下储存。基本干燥储存的细胞最适宜在恒溫如室溫 下储存。 调亡抑制剂
[0093] 在某些实施方案中，本文所述的预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少 一种调亡抑制剂。在某些实施方案中，该至少一种调亡抑制剂阻断细胞调亡的诱导。在其他 实施方案中，该调亡抑制剂阻断ER应激通路中的至少一个步骤，且优选为可逆抑制剂。
[0094] 在某些实施方案中，所述脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂。在其他实施方案中， 所述预脱水制剂或再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂，并且在其他实施方案中，所述预 脱水制剂和再水化制剂各自包含至少一种调亡抑制剂。在 预脱水制剂和再水化制剂中存在 的至少一种调亡抑制剂可W是相同的或可W是不同的。在某些其他实施方案中，所述预脱 水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少两种调亡抑制剂。
[0095] 调亡抑制剂(包括本文所举例的那些)通常可通过多个商业制造商和供应商(包括 但不限于Calbiochem、SelleckCh em、Si gma-A Idr i ch、EMD Millipore、IXLabs和 medcheme邱ress)商购获得，或可采用已知的方法(包括本文公开的那些方法)合成。每种调 亡抑制剂的最佳浓度可通过滴定在预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂中的调亡抑制 剂的量来确定，运完全在本领域技术人员的技能范围内。
[0096] 示例性的调亡抑制剂包括： 1. 阳服-eIF2-a抑制剂
[0097] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂阻断PE服-eIF2-aa通路。示例性的 阳服-eIF2-aa 通路抑制剂是 salubrinal、Sal-003(3-苯基-N-[2，2，2-S 氯-1-[ (4-氯苯基） 硫代氨基甲酯氨基]乙基]丙-2-締酷胺）、GSK 2606414(7-甲基-5-(l-{[3-(S氣甲基）苯 基]乙酷基}-2，3-二氨-IH-吗隙-5-基)-7H-化咯并[2，3d]喀晚-4-胺）、GSK 2656157( 1-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-化咯并[2，3-d]喀晚-5-基）-4-氣吗I噪嘟-1-基)-2-(6-甲基化晚-2-基）乙酬)和ISRIB(反式-N，N'-(环己烧-1,4-二基)双(2-(4-氯苯氧基）乙酷胺）。
[0098] Salubrinal是eIF2-a憐酸酶的特异性抑制剂。Salubrinal间接地抑制eIF2，运是 由于其a-亚基的减少的脱憐酸化导致通常由诸如氧化应激或内质网中未折叠蛋白质的积 累等事件所触发的应激响应通路的激活。
[0099] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将salubrinal W约InM到约2.0咖的浓度范围，优选约1碰到900碰，更优选约10碰 至lj250nM，并且更优选约30nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 2. ASKl抑制剂
[0100] 在其他实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂，其阻断JNK和P38MAP 激酶的下游活化。多种合适的ASKl抑制剂是已知的（例如，参见美国专利号8,178,555、8， 378，108、8，440，665和8，598，360)或者是可商购的，例如，MLS-0315763 (国立卫生研究院 (化tional Institute of Health))。示例性的ASKl抑制剂包括但不限于苯并二氮杂草酬 (benzodiazepinone)抑制剂化im等人，（2009) J.Biol.化em. 284:1593-1603)、NDQI-I和 MLS-0315763。
[0101] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将NDQI-IW约50nM到约3. OiiM的浓度范围，优选约250nM到2.0測，更优选约400nM 到2.OiiM,并且更优选约1.OiiM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。
[0102] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些其他实 施方案中，可W将MLS-0315763 W约InM到约50化M的浓度范围，优选约InM到25化M，更优选 约InM到IOOnM,并且更优选约IOnM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 3. NRF2-KEAP1 抑制剂
[0103] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂阻断NRF2-KEAP1通路。
[0104] 示例性的NRF2-KEAP1通路抑制剂包括但不限于鼠尾草酸、S祗类化合物、萝h硫素 (sulphora地ane)和叔下基氨酿。
[0105] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将萝h硫素 W约50nM到约1.OiiM的浓度范围，优选约50nM至化OOnM，更优选约IOOnM 至lj400nM，并且更优选约220nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 4. JNK抑制剂
[0106] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。考虑将任何JNK抑制 剂用于本发明的制剂、组合物和方法中。JNK抑制剂通常是本领域技术人员已知的（例如，参 见美国专利号6，949，544、7，129，242、7，326，418、8，143，271W及8，530，480)。
[0107] 示例性的JNK抑制剂包括但不限于SP600125(蔥并[l-9-cd]化挫-6(2H)-酬KJNK-IN-8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-下締 -1-基]氨基]-N-[3-甲基-4-[[4-(3-化晚基)-2-喀晚基]氨基]苯基]-苯甲酯胺）和JNK-抑制剂IX(N-(3-氯基-4,5,6,7-四氨苯并[b]嚷 吩-2-基)-1-糞甲酯胺）。
[0108] 在进一步的实施方案中，JNK抑制剂与P38MAP激酶抑制剂组合使用W阻断ASKl的 下游活化。 5. P38MP激酶抑制剂
[0109] 在某些其他实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是P38MAP激酶抑制剂。P38MAP 激酶抑制剂通常是众所周知的（例如，参见美国专利号7,521，460、7,592,455、7,728,013W 及7,795,256)。
[0110] 示例性的P38MP激酶抑制剂包括但不限于SB203580(4-(4-(4-氣苯基)-2-(4-(甲 基亚横酷基）苯基)-lH-咪挫-5-基川比晚）、LY2228820(5-(2-叔下基-4-(4-氣苯基)-lH-咪 挫-5-基)-3-新戊基-3H-咪挫并[4,5-b]化晚-2-胺二甲横酸盐）、PD169316(4-(4-氣苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-化晚基)-lH-咪挫）、PH-797804(3-(4-(2,4-二氣节氧基)-3-漠-6-甲基-2-氧代化晚-l(2H)-基)-N，4-二甲基苯甲酯胺）、SB202190(4-(4-(4-氣苯基)-5-川比 晚-4-基)-lH-咪挫-2-基)苯酪）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔下基-1-对甲苯基-IH-化挫-5-基）-3-(4-(2-吗嘟基乙氧基）糞-1-基）脈）、￥乂-702(1-(5-氨基甲酯基-6-(2,4-二氣苯 基川比晚-2-基）-1-(2,6-二氣苯基）脈）、TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲基苯基）-5-嚷挫 基]-2-化晚基]-苯甲酯胺。
[0111] 在某些其他实施方案中，所述预脱水制剂和/或再水化制剂包含JNK抑制剂和 P38MAP激酶抑制剂W阻断下游ASKl依赖性信号传导。 6. GSK3抑制剂
[0112] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂和/或再水化制剂包含阻断GSK3的调亡抑制 剂。多种GSK3抑制剂适于在本文所述的制剂和方法中使用。GSK3抑制剂是本领域技术人员 公知的（例如，参见美国专利号 6,057，117、6，153,618、6,417，185、6,465,231、6,489,344、 6,608,632、6,800,632、6,949,547、7,045,519、7,037,918、7,425,557、8，143,271^及8， 664,244)，并且多种GSK3抑制剂是可商购的，例如，CHIR98014、N-6-[2-[ [4-(2,4-二氯苯 基）-5-( IH-咪挫-2-基）-2-喀晚基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-化晚二胺（Selleckchem.com; 目录号S2745) W及丙戊酸（Si卵a-Al化ich，St丄OUis ,MO;目录号P4543)。
[0113] 特别优选的GSK3抑制剂包括但不限于CHIR98014、丙戊酸盐、CT 99021和CT 20026。
[0114] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将CHIR98014 W约0.25iiM到约3. OiiM的浓度范围，优选约O . 5iiM到2.75咖，更优选 约1. OiiM到2. OiiM，并且更优选约1.25iiM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 7. IRE-I抑制剂
[0115] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含阻断IREl的 调亡抑制剂。IREl抑制剂是已知的（例如，参见美国专利号8，372，861)。
[0116] 示例性的IREl抑制剂包括但不限于IREl抑制剂I(N-[(2-^基糞-1-基)亚甲基]嚷 吩-2-横酷胺KIREl抑制剂11(3/-甲酯基-少-径基-5^-甲氧基联苯基-3-甲酯胺）W及IREl 抑制剂III(8-甲酯基-7-径基-4-甲基香豆素，7-径基-4-甲基-2-氧代-2H-色締-8-甲醒）。 8. 脫天蛋白酶-1抑制剂
[0117] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0118] 用于在本文所述的制剂、组合物和方法中使用的示例性脫天蛋白酶-1抑制剂包括 但不限于脫天蛋白酶-1抑制剂II (Ac-YVAD-氯甲基甲酬）、N-(2-哇嘟基)鄉氨酷-天冬氨酷-(2,6-二氣苯氧基）甲基甲酬（其中天冬氨酷残基是a-甲基化或非a-甲基化的）、VX-765 ((S)-1-( (S)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酯氨基)-3,3-二甲基下酷基)-N-( (2R,3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氨巧喃-3-基川比咯烧-2-甲酯胺)和ZVAD-氣甲基甲酬。 9. 巧蛋白酶抑制剂
[0119] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。存在至少15种 不同的巧蛋白酶同种型(巧蛋白酶1-15)。巧蛋白酶抑制剂是本领域技术人员公知的（例如， 参见美国专利号 5,541，290、6,448,245、7,001，770、7,476,754^及7,932,266)。本发明的 预脱水制剂和/或再水化制剂可包含任何合适的巧蛋白酶抑制剂或巧蛋白酶抑制剂的组 厶 1=1 O
[0120] 用于在本文所述的制剂、组合物和方法中使用的特别优选的巧蛋白酶抑制剂包括 但不限于巧蛋白酶抑制剂I (N-乙酷基-Leu-Leu-正亮氨酸-C册）、巧蛋白酶抑制剂II (N-乙 酷基-Leu-Leu-Met)、巧蛋白酶抑制剂III(Z-Val-Phe-CHO)、巧蛋白酶抑制剂IVU-Leu-Leu-Tyr-C出F)、巧蛋白酶抑制剂V(吗嘟基酷脈基;-化^高苯丙氨酸-C出F)、巧蛋白酶抑制 剂VK4-氣苯基横酷基-A^^Leu-C册）、巧蛋白酶抑制剂X(Z-Leu-a-氨基下酸-CON肥抽日）、巧 蛋白酶抑制剂XI(Z-ka-氨基下酸-C0NH(C此)3-吗嘟）和巧蛋白酶抑制剂XII(Z-k正鄉氨 酸-CONH-C出-2-化晚基）。 10. MEK抑制剂
[0121] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是MEKl或MEK2抑制剂。MEKl和MEK2 抑制剂是已知的（例如，参见美国专利号6,310,060、6,440,966、6,638,945、7,001，905、7， 169,816、7,745,663、7,803,839、7,897,624、8,394,822,8492,427^及8,642,584)，并且是 可商购的。
[0122] 示例性的MEK抑制剂包括但不限于PD0325901，N-[(2R)-2,3-二?基丙氧基]-3,4-二氣-2-[(2-氣-4-舰苯基)氨基]-苯甲酯胺;MEK162(5-[(4-漠-2-氣苯基)氨基]-4-氣-N-(2-径基乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪挫-6-甲酯胺）、PD184352(2-(2-氯-4-舰苯基氨基)-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氣苯甲酯胺）、pimaseパ化（（S)-N-(2,3-二?基丙基)-3-(2-氣-4-舰苯基氨基)异烟酷胺）、司美替尼(6-(4-漠-2-氯苯基氨基)-7-氣-N-(2-^基乙氧基)-3-甲基-3H-苯并[d]咪挫-5-甲酯胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氣-4-舰苯基氨基)- 6,8-二甲基-2,4,7-S氧代-3,4,6,7-四氨化晚并[4,3-d]喀晚基)苯基）乙酷胺）、 PD98059(2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并化喃-4-酬）、110126-610化（22,32)-2,3-双 (氨基(2-氨基苯硫基)亚甲基)班巧腊，乙醇）。
[0123] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将PD0325901W约InM到约l.OiiM的浓度范围，优选约IOnM到500nM，更优选约20nM 至lj250nM，并且更优选约50nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 11.PI3K通路抑制剂
[0124] 在某些其他实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。
[0125] 用于在本文所述的制剂、组合物和方法中使用的示例性PI3K抑制剂包括但不限于 dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-哇嘟-3-基咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基)苯基] 丙腊）、60(：-0941(2-(1护吗|挫-4-基)-6-[[4-(甲基横酷基)-1-赃嗦基]甲基]-4-(4-吗嘟 基）嚷吩并[3,2-d]喀晚）、1￥294002(2-(4-吗嘟基）-8-苯基-佔-1-苯并化喃-4-酬）、 idealalisib(5-氣-3-苯基-2-[(lS)-1-(7H-嚷岭-6-基氨基）丙基]-4(3H)-哇挫嘟酬）、 burpar 1 i S化（5-(2，6-二吗嘟基喀晚-4-基）-4-(S氣甲基）邮晚-2-胺）、GDC-0032 (4-[ 5，6-二氨-2-[3-甲基-1-(1-甲基乙基)-lH-l，2,4-S挫-5-基]咪挫并[1，2-(1][1，4]苯并氧氮杂 草-9-基]-a，a-二甲基-IH-化挫-1-乙酷胺）、PI-103(3-(4-(4-吗嘟基川比晚并[3'，2' ：4,5] 巧喃并[3,2-d]喀晚-2-基)苯酪）、NU7441(8-(4-二苯并嚷吩基)-2-(4-吗嘟基苯并 化喃-4-酬）、GSK2636771(2-甲基甲基-3-(S氣甲基)苯基]甲基]-6-(4-吗嘟基)-IH-苯并咪挫-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(lS)-1-(9H-嚷岭-6-基氨基）乙基]-1-(2H)-异哇嘟酬）、)(L147(N-(3-(苯并k][l，2,5]嚷二挫-5-基氨基)哇喔嘟-2-基)-4-甲基 苯横酷胺）、TGX-221(7-甲基-2-(4-吗嘟基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-化晚并[l，2-a]喀 晚-4-酬）、PIK-90(N-(7，8-二甲氧基-2，3-二氨-咪挫并[1，2-C]哇挫嘟-5-基)-烟酷胺）、渥 曼青霉素（11-(乙酷氧基)-1,6b,7,8,9a, 10,11, Ub-八氨-1-(甲氧基甲基)-9a, 1化-二甲 基-，（15,663,9日5，111?，1化1〇-3护氣[4,3,2-(16]巧并[4,5-11]-2-苯并化喃-3,6,9-^酬）、 VS-5584(5-[8-甲基-9-(1-甲基乙基）-2-(4-吗嘟基）-9H-嚷岭-6-基]-2-喀晚胺）和TG-100703(3-(2,4-二氨基-6-蝶晚基)-苯酪）。
[0126] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将LY294002W约IOnM到约2.0測的浓度范围，优选约20碰至1]1.0咖，更优选约50碰 至化OOnM,并且更优选约120nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 ER蛋白伴侣诱导剂
[0127] 在某些方面，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少一种调亡抑制 剂和ER蛋白伴侣诱导剂。用于在本文所述的制剂、组合物和方法中使用的合适的ER蛋白伴 侣诱导剂包括但不限于BIX、丙戊酸盐和裡。 1. BIX
[0128] BiP诱导剂X(BIX)在筛选诱导GRP78/BiP表达的化合物时得到鉴定。BIX优先诱导 BiP,轻微诱导GRP94(94W)a葡萄糖调节蛋白质）、巧网蛋白和C/EBP同源蛋白。通过BiP基因 上游的邸应激响应元件的激活经由ATF6(活化转录因子6)通路来介导BIX对BiP mRNA的诱 导。 2. 丙戊酸盐
[0129] 丙戊酸(2-丙戊酸）已被批准用于癒痛、双相躁狂症和偏头痛的预防和治疗。丙戊 酸在室溫下为液体，但它可W与碱如氨氧化钢反应W形成盐丙戊酸钢，其为固体。丙戊酸盐 的作用机制尚未完全清楚，但已经证明其抑制CYP2C9、葡糖醒酷基转移酶和环氧化物水解 酶并导致大脑中丫-氨基下酸(GABA)水平增加。丙戊酸盐的施用增加了GRP78/BiP的表达， 从而使S种近端跨膜传感器PE服、IREl和ATF6稳定在有利的失活状态。 3.裡
[0130] 元素裡用于治疗多种情绪障碍。裡的施用增加了 GRP78/BiP的表达，从而使S种近 端跨膜传感器PE服、IREl和ATF6稳定在期望的失活状态。 自隧诱导剂
[0131] 在某些其他方面，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少一种调亡 抑制剂和自隧诱导剂。自隧诱导剂是一系列不同的化合物，其有利地促进不需要的或错折 叠的蛋白质的溶酶体降解，从而提高WR对细胞的效果。尽管不希望受到任何理论的束缚， 但有人认为调亡抑制剂和自隧诱导剂的组合阻断m?应激通路，同时进一步促进可能由于脱 水而产生的错折叠蛋白质的降解，从而有助于W保持至少一种如脱水前细胞的功能性质的 方式将细胞再水化。
[0132] 示例性的自隧诱导剂包括但不限于氣司必林、=氣拉嗦、匹莫齐特、尼卡地平、尼 古地平、洛赃下胺、胺舰酬、雷帕霉素、白襲芦醇和SMER。
[0133] 在将细胞基本干燥储存多于24小时（例如，48或120小时）的时间段的某些实施方 案中，可W将雷帕霉素 W约InM到约1 .OiiM的浓度范围，优选约20nM到200nM，更优选约20nM 到80nM，并且更优选约20nM添加至预脱水制剂和/或再水化制剂中。 存活蛋白
[0134] 在另一个方面，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含存活蛋白。示例 性的存活蛋白为Bd-xL。
[0135] 8(31-义1^是8化-2家族的成员，并且是位于线粒体中的跨膜蛋白。据报道8(：1^两种 形式存在，即长的形式Bcl-XL和较短的剪接变体形式Bcl-xS"Bcl-xL在内源性调亡通路的 水平下起作用，而外源性通路(Fas/TNF死亡受体)直接导致脫天蛋白酶激活，从而防止线粒 体内容物如细胞色素 C的释放，细胞色素 C将导致脫天蛋白酶激活。促-存活和抗-存活Bd-2 家族蛋白质的相对量决定细胞是否将经历细胞死亡是调亡领域中的一个已确定的概念。
[0136] 在某些实施方案中，采用脂质体制剂将Bd-xL递送至细胞W确保足够的Bcl-XL细 胞内摄取。 预脱水制剂
[0137] 在某些方面，用于细胞的基本干燥储存的组合物和方法包括另外的步骤:在脱水 之前用预脱水制剂处理细胞。在一个实施方案中，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂， 优选可逆调亡抑制剂。在另一个实施方案中，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至 少一种ER蛋白伴侣诱导剂、至少一种自隧诱导剂或至少一种存活蛋白。
[0138] 在某些实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂选自PE服-eIF2-a抑 制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制剂、GSK3抑 制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0139] 在一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是PE服-eIF2-a抑制 剂。在某些实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂选自salubrinal、Sal-003(3-苯基-N-[2,2， 2-S氯-1-[(4-氯苯基)硫代氨基甲酯氨基]乙基] 丙-2-締酷胺）、GSK 2606414(7-甲基-5-(1-{[3-(立氣甲基)苯基化酷基}-2,3-二氨-I-H-吗隙-5-基)-7-H-化咯并[2,3d]喀晚-4-胺）、GSK 2656157a-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-化咯并[2,3-d]喀晚-5-基)-4-氣吗|噪嘟-1-基)-2-(6-甲基化晚-2-基）乙酬)和ISRIB(反式-N，N'-(环己烧-l，4-二基)双(2-(4-氯苯氧 基）乙酷胺）。在某些其他实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂是salubrinal。
[0140]在另一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂，优 选NDQI-I或MLS-0315763。
[0141 ]在又一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制 剂。在某些实施方案中，该NRF2-KEAP1抑制剂选自鼠尾草酸、S祗类化合物、萝h硫素和叔下 基氨酿。
[0142] 在又一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。在 某些实施方案中，该GSK3抑制剂选自CHIR98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(lH-咪挫-2-基)-2-喀晚基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-化晚二胺）、丙戊酸盐、CT99021和CT20026。
[0143] 在进一步的实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是MEK抑制剂。在 某些实施方案中，该MEK抑制剂选自PD0325901，N-[(2R)-2,3-二?基丙氧基]-3,4-二氣-2-[(2-氣-4-舰苯基)氨基]-苯甲酯胺;MEKl 62 (5- [(4-漠-2-氣苯基)氨基]-4-氣-N- (2-径基 乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪挫-6-甲酯胺）、PD184352(2-(2-氯-4-舰苯基氨基)-N-(环丙基 甲氧基)-3,4-二氣苯甲酯胺）、pimaseパ化（（S)-N-(2,3-二?基丙基)-3-(2-氣-4-舰苯基 氨基）异烟酷胺）、司美替尼（6-(4-漠-2-氯苯基氨基）-7-氣-N-(2-^基乙氧基）-3-甲基-3H-苯并[d]咪挫-5-甲酯胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氣-4-舰苯基氨基)-6，8-二 甲基-2,4,7-S氧代-3,4,6,7-四氨化晚并[4,3-d]喀晚-U2H)-基)苯基）乙酷胺KPD98059 (2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并化喃-4-酬）W及U0126-化細（（22,32)-2,3-双（氨基 (2-氨基苯硫基)亚甲基)班巧腊，乙醇）。
[0144] 在又一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。在某 些实施方案中，该JNK抑制剂选自SP600125(蔥并[l-9-cd]化挫-6(2H)-酬）、JNK-IN-8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-下締-1-基]氨基]-N-[3-甲基-4-[ [4-(3-化晚基)-2-喀晚 基]氨基]苯基]-苯甲酯胺）；JNK-抑制剂IX(N-(3-氯基-4,5,6,7-四氨苯并[b]嚷吩-2-基)-1-糞甲酯胺）。
[0145] 在另一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和 P38MAP激酶抑制剂。在某些实施方案中，该P38MAP激酶抑制剂选自SB203580(4-(4-(4-氣苯 基)-2-(4-(甲基亚横酷基)苯基)-lH-咪挫-5-基川比晚）、LY2228820(5-(2-叔下基-4-(4-氣 苯基)-lH-咪挫-5-基)-3-新戊基-3H-咪挫并[4,5-b]化晚-2-胺二甲横酸盐）、PD169316(4-(4-氣苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-化晚基)-lH-咪挫）、PH-797804(3-(4-(2,4-二氣节氧 基)-3-漠-6-甲基-2-氧代化晚基)-N，4-二甲基苯甲酯胺）、SB202190(4-(4-(4-氣 苯基)-5-(化晚-4-基)-lH-咪挫-2-基)苯酪）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔下基-1-对甲苯 基-IH-化挫-5-基）-3-(4-(2-吗嘟基乙氧基）糞-1-基）脈）、VX-702( 1-(5-氨基甲酯基-6-(2,4-二氣苯基川比晚-2-基）-1-(2,6-二氣苯基)脈）W及TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲 基苯基)-5-嚷挫基]-2-化晚基]-苯甲酯胺。
[0146] 在进一步的实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。 在某些实施方案中，该PI3K抑制剂选自dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-哇 嘟-3-基咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基)苯基]丙腊）、60(：-0941(2-(1护吗|挫-4-基)-6-[[4-(甲 基横酷基）-1-赃嗦基]甲基]-4-(4-吗嘟基）嚷吩并[3,2-d]喀晚）、LY294002(2-(4-吗嘟 基)-8-苯基-4H-1-苯并化喃-4-酬）、idealalisib(5-氣-3-苯基-2-[aS)-1-(7H-嚷岭-6-基氨基）丙基]-4(3H)-哇挫嘟酬）、bu巧arlisib(5-(2,6-二吗嘟基喀晚-4-基）-4-(S氣甲 基川比晚-2-胺）、GDC-0032(4-[5,6-二氨-2-[3-甲基-1-a-甲基乙基)-lH-l，2,4-S挫-5-基]咪挫并[l，2-d][l，4]苯并氧氮杂革-9-基]-a，a-二甲基-lH-化挫-1-乙酷胺）、PI-103 (3-(4-(4-吗嘟基川比晚并[3' ,2' :4,5]巧喃并[3,2-d]喀晚-2-基)苯酪）、NU7441(8-(4-二 苯并嚷吩基）-2-(4-吗嘟基苯并化喃-4-酬）、GSK2636771(2-甲基甲基-3-(二氣甲基）苯基]甲基]-6-(4-吗嘟基)-lH-苯并咪挫-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嚷岭-6-基氨基）乙基]异哇嘟酬）、)(L147(N-(3-(苯并[c][l，2,5]嚷 二挫-5-基氨基）哇喔嘟-2-基)-4-甲基苯横酷胺）、TGX-221(7-甲基-2-(4-吗嘟基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-化晚并[l，2-a]喀晚-4-酬）、PIK-90(N-(7,8-二甲氧基-2,3-二氨-咪 挫并[1，2-C]哇挫嘟-5-基）-烟酷胺）、渥曼青霉素（11-(乙酷氧基)-1，化，7，8，9a，10，11， Ub-八氨-1-(甲氧基甲基）-9a，l化-二甲基-，（15,66尺，9曰5，11尺，1化1〇-3护氣[4,3,2-(16] 巧并[4,5-h]-2-苯并化喃-3,6,9-S酬）、VS-5584(5-[8-甲基-9-(1-甲基乙基)-2-(4-吗嘟 基)-9H-嚷岭-6-基]-2-喀晚胺)和TG-100703(3-( 2，4-二氨基-6-蝶晚基)-苯酪）。
[0147] 在一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。在某 些实施方案中，该IRE-I抑制剂选自IRE1抑制剂I (N-[(2-径基糞-1-基)亚甲基]嚷吩-2-横 酷胺KIREl抑制剂11(3/-甲酯基-4基(径基-5基（甲氧基联苯基-3-甲酯胺）W及IREl抑制 剂111(8-甲酯基-7-径基-4-甲基香豆素，7-径基-4-甲基-2-氧代-2H-色締-8-甲醒）。
[0148] 在一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。 在某些实施方案中，该巧蛋白酶抑制剂选自巧蛋白酶抑制剂KN-乙酷基-Leu-Leu-正亮氨 酸-CHO)、巧蛋白酶抑制剂IKN-乙酷基-Leu-Leu-Met)、巧蛋白酶抑制剂III (Z-Val-I^e-C册）、巧蛋白酶抑制剂IV(Z-Leu-Leu-Tyr-C此F)、巧蛋白酶抑制剂V(吗嘟基酷脈基;-Val-高苯丙氨酸-C出F)、巧蛋白酶抑制剂VK4-氣苯基横酷基-化I-Leu-CHO)、巧蛋白酶抑制剂X (Z-Leu-a-氨基下酸-CON肥抽日）、巧蛋白酶抑制剂XKZA-Q-氨基下酸-C0NH(C出）3-吗嘟）和 巧蛋白酶抑制剂XII(2寸-正鄉氨酸-CONH-C出-2-化晚基）。
[0149] 在一个实施方案中，该预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制 剂。在某些实施方案中，该脫天蛋白酶-1抑制剂选自脫天蛋白酶-1抑制剂IKAc-YVAD-氯甲 基甲酬）、N-(2-哇嘟基)鄉氨酷-天冬氨酷-(2,6-二氣苯氧基）甲基甲酬(其中天冬氨酷残基 是曰-甲基化或非曰-甲基化的）、\0(-765((5)-1-((5)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酯氨基)-3,3-二 甲基下酷基)-N-((2R，3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氨巧喃-3-基川比咯烧-2-甲酯胺)和ZVAD-氣甲基甲酬。
[0150] 在另一个方面，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种邸蛋白伴侣诱 导剂。在某些实施方案中，该ER蛋白伴侣诱导剂选自BIX、丙戊酸盐和裡。
[0151] 在另一个方面，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种自隧诱导剂。 在某些实施方案中，该自隧诱导剂选自氣司必林、=氣拉嗦、匹莫齐特、尼卡地平、尼古地 平、洛赃下胺、胺舰酬、雷帕霉素、白襲芦醇和SMER。
[0152] 在另一个方面，该预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种存活蛋白。在 一个实施方案中，该存活蛋白为Bd-xL。 再水化制剂
[0153] 在某些其他方面，用于细胞的基本干燥储存的组合物和方法进一步包括采用再水 化制剂将基本干燥储存的细胞再水化。在一个实施方案中，该再水化制剂包含至少一种调 亡抑制剂，优选可逆调亡抑制剂。在另一个实施方案中，该再水化制剂包含至少一种调亡抑 制剂和至少一种ER蛋白伴侣诱导剂。
[0154] 在某些实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂选自PE服-eIF2-a抑 制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制剂、GSK3抑 制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0155] 在一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是PE服-eIF2-a抑制 剂。在某些实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂选自salubrinal、Sal-003(3-苯基-N-[2,2， 2-S氯-1-[(4-氯苯基)硫代氨基甲酯氨基]乙基]丙-2-締酷胺）、GSK 2606414(7-甲基-5-(1-{[3-(立氣甲基)苯基化酷基}-2,3-二氨-I-H-吗隙-5-基)-7-H-化咯并[2,3d]喀晚-4-胺）、GSK 2656157a-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-化咯并[2,3-d]喀晚-5-基)-4-氣吗|噪嘟-1-基)-2-(6-甲基化晚-2-基）乙酬)和ISRIB(反式-N，N'-(环己烧-l，4-二基)双(2-(4-氯苯氧 基）乙酷胺）。在某些其他实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂是salubrinal。
[0156] 在另一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂，优 选NDQI-I或MLS-0315763。
[0157] 在又一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制 剂。在某些实施方案中，该NRF2-KEAP1抑制剂选自鼠尾草酸、S祗类化合物、萝h硫素和叔下 基氨酿。
[0158] 在又一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。在 某些实施方案中，该GSK3抑制剂选自CHIR98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(lH-咪挫- 2-基)-2-喀晚基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-化晚二胺）、丙戊酸盐、CT99021和CT20026。
[0159] 在进一步的实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是肥1(抑制剂。在 某些实施方案中，该MEK抑制剂选自PD0325901，N-[(2R)-2,3-二?基丙氧基]-3,4-二氣-2-[(2-氣-4-舰苯基)氨基]-苯甲酯胺;MEKl 62 (5- [(4-漠-2-氣苯基)氨基]-4-氣-N- (2-径基 乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪挫-6-甲酯胺）、PD184352(2-(2-氯-4-舰苯基氨基)-N-(环丙基 甲氧基)-3,4-二氣苯甲酯胺）、pimaseパ化（（S)-N-(2,3-二?基丙基)-3-(2-氣-4-舰苯基 氨基）异烟酷胺）、司美替尼（6-(4-漠-2-氯苯基氨基）-7-氣-N-(2-^基乙氧基）-3-甲基-3H-苯并[d]咪挫-5-甲酯胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氣-4-舰苯基氨基)-6，8-二 甲基-2,4,7-S氧代-3,4,6,7-四氨化晚并[4,3-d]喀晚-U2H)-基)苯基）乙酷胺KPD98059 (2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并化喃-4-酬）W及U0126-化細（（22,32)-2,3-双（氨基 (2-氨基苯硫基)亚甲基)班巧腊，乙醇）。
[0160] 在又一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。在某 些实施方案中，该JNK抑制剂选自SP600125(蔥并[l-9-cd]化挫-6(2H)-酬）、JNK-IN-8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-下締-1-基]氨基]-N-[3-甲基-4-[ [4-(3-化晚基)-2-喀晚 基]氨基]苯基]-苯甲酯胺）；JNK-抑制剂IX(N-(3-氯基-4,5,6,7-四氨苯并[b]嚷吩-2-基)-1-糞甲酯胺）。
[0161] 在另一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和 P38MAP激酶抑制剂。在某些实施方案中，该P38MAP激酶抑制剂选自SB203580(4-(4-(4-氣苯 基)-2-(4-(甲基亚横酷基)苯基)-lH-咪挫-5-基川比晚）、LY2228820(5-(2-叔下基-4-(4-氣 苯基)-lH-咪挫-5-基)-3-新戊基-3H-咪挫并[4,5-b]化晚-2-胺二甲横酸盐）、PD169316(4-(4-氣苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-化晚基)-lH-咪挫）、PH-797804(3-(4-(2,4-二氣节氧 基)-3-漠-6-甲基-2-氧代化晚基)-N，4-二甲基苯甲酯胺）、SB202190(4-(4-(4-氣 苯基)-5-(化晚-4-基)-lH-咪挫-2-基)苯酪）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔下基-1-对甲苯 基-IH-化挫-5-基）-3-(4-(2-吗嘟基乙氧基）糞-1-基）脈）、VX-702( 1-(5-氨基甲酯基-6-(2,4-二氣苯基川比晚-2-基）-1-(2,6-二氣苯基)脈）W及TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲 基苯基)-5-嚷挫基]-2-化晚基]-苯甲酯胺。
[0162] 在进一步的实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。 在某些实施方案中，该PI3K抑制剂选自dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-哇 嘟-3-基咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基)苯基]丙腊）、60(：-0941(2-(1护吗|挫-4-基)-6-[[4-(甲 基横酷基）-1-赃嗦基]甲基]-4-(4-吗嘟基）嚷吩并[3,2-d]喀晚）、LY294002(2-(4-吗嘟 基)-8-苯基-4H-1-苯并化喃-4-酬）、idealalisib(5-氣-3-苯基-2-[aS)-1-(7H-嚷岭-6-基氨基）丙基]-4(3H)-哇挫嘟酬）、bu巧arlisib(5-(2,6-二吗嘟基喀晚-4-基）-4-(S氣甲 基川比晚-2-胺）、GDC-0032(4-[5,6-二氨-2-[3-甲基-1-a-甲基乙基)-lH-l，2,4-S挫-5-基]咪挫并[l，2-d][l，4]苯并氧氮杂辜-9-基]-a，a-二甲基-lH-化挫-1-乙酷胺）、PI-103 (3-(4-(4-吗嘟基川比晚并[3' ,2' :4,5]巧喃并[3,2-d]喀晚-2-基)苯酪）、NU7441(8-(4-二 苯并嚷吩基）-2-(4-吗嘟基苯并化喃-4-酬）、GSK2636771(2-甲基甲基-3-(S氣甲基）苯基]甲基]-6-(4-吗嘟基)-lH-苯并咪挫-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嚷岭-6-基氨基）乙基]异哇嘟酬）、)(L147(N-(3-(苯并[c][l，2,5]嚷 二挫-5-基氨基）哇喔嘟-2-基)-4-甲基苯横酷胺）、TGX-221(7-甲基-2-(4-吗嘟基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-化晚并[l，2-a]喀晚-4-酬）、PIK-90(N-(7,8-二甲氧基-2,3-二氨-咪 挫并[l，2-c]哇挫嘟-5-基）-烟酷胺）、渥曼青霉素（11-(乙酷氧基)-1，化，7,8,9a，10，ll， Ub-八氨-1-(甲氧基甲基）-9a，l化-二甲基-，（15,66尺，9曰5，11尺，1化1〇-3护氣[4,3,2-(16] 巧并[4,5-h]-2-苯并化喃-3,6,9-S酬）、VS-5584(5-[8-甲基-9-(1-甲基乙基)-2-(4-吗嘟 基)-9H-嚷岭-6-基]-2-喀晚胺)和TG-100703(3-( 2，4-二氨基-6-蝶晚基)-苯酪）。
[0163] 在一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。在某 些实施方案中，该IRE-I抑制剂选自IRE1抑制剂I (N-[(2-径基糞-1-基)亚甲基]嚷吩-2-横 酷胺KIREl抑制剂11(3/-甲酯基-少-径基-5/-甲氧基联苯基-3-甲酯胺）W及IREl抑制剂 III(8-甲酯基-7-径基-4-甲基香豆素，7-径基-4-甲基-2-氧代-2H-色締-8-甲醒）。
[0164] 在一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。 在某些实施方案中，该巧蛋白酶抑制剂选自巧蛋白酶抑制剂KN-乙酷基-Leu-Leu-正亮氨 酸-CHO)、巧蛋白酶抑制剂IKN-乙酷基-Leu-Leu-Met)、巧蛋白酶抑制剂III (Z-Val-I^e-C册）、巧蛋白酶抑制剂IV(Z-Leu-Leu-Tyr-C此F)、巧蛋白酶抑制剂V(吗嘟基酷脈基;-Val-高苯丙氨酸-C出F)、巧蛋白酶抑制剂VI (4-氣苯基横酷基-化I-Leu-CHO)、巧蛋白酶抑制剂X (Z-Leu-a-氨基下酸-CON肥抽日）、巧蛋白酶抑制剂XI(ZA-a-氨基下酸-CONH(C出）3-吗嘟）和 巧蛋白酶抑制剂XII(2寸-正鄉氨酸-CONH-C出-2-化晚基）。
[0165] 在一个实施方案中，该再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制 剂。在某些实施方案中，该脫天蛋白酶-1抑制剂选自脫天蛋白酶-1抑制剂II(Ac-YVAD-氯甲 基甲酬）、N-(2-哇嘟基)鄉氨酷-天冬氨酷-(2,6-二氣苯氧基）甲基甲酬(其中天冬氨酷残基 是a-甲基化或非a-甲基化的）、VX-765((S)-1-((S)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酯氨基)-3,3-二 甲基下酷基)-N-((2R，3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氨巧喃-3-基川比咯烧-2-甲酯胺）和ZVAD-氣甲基甲酬。
[0166] 在另一个方面，该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种邸蛋白伴侣诱 导剂。在某些实施方案中，该ER蛋白伴侣诱导剂选自BIX、丙戊酸盐和裡。
[0167] 在另一个方面，该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种自隧诱导剂。 在某些实施方案中，该自隧诱导剂选自氣司必林、=氣拉嗦、匹莫齐特、尼卡地平、尼古地 平、洛赃下胺、胺舰酬、雷帕霉素、白襲芦醇和SMER。
[0168] 在另一个方面，该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种存活蛋白。在 一个实施方案中，该存活蛋白为Bd-xL。 方法
[0169] 在本发明的另一个方面，提供了在没有冷冻或冻干的情况下将一种或多种细胞在 环境溫度下基本干燥储存的方法，该方法包括:将所述一种或多种细胞与包含干燥储存稳 定剂的脱水制剂一起溫育；W及在脱水制剂的存在下使该一种或多种预处理的细胞脱水， W产生一种或多种基本干燥储存的细胞。在某些实施方案中，该脱水制剂进一步包含至少 一种调亡抑制剂，并且该方法可进一步包括采用包含至少一种调亡抑制剂的再水化缓冲液 将一种或多种基本干燥储存的细胞再水化。
[0170] 在本发明的另一个方面，提供了在没有冷冻或冻干的情况下将一种或多种细胞在 环境溫度下基本干燥储存的方法，该方法包括:将所述一种或多种细胞与包含调亡抑制剂 的预脱水制剂一起溫育W产生一种或多种预处理的细胞，去除所述预脱水制剂；W及在脱 水制剂的存在下使该一种或多种预处理的细胞脱水，W产生一种或多种基本干燥储存的细 胞。在某些实施方案中，该方法可进一步包括采用包含至少一种调亡抑制剂的再水化缓冲 液将一种或多种基本干燥储存的细胞再水化。
[0171] 多种调亡抑制剂可在高浓度下或长时间暴露时对细胞产生毒性作用。相反，细胞 暴露于预脱水制剂或再水化制剂的时间太短或调亡抑制剂浓度太低将不会在脱水期间产 生期望的额外的处理效果。因此，对于采用预脱水步骤和再水化步骤将细胞基本干燥储存 的方法，需要适当地控制暴露时间W实现期望的抑制效果。
[0172] 在某些实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂选自阳服-eIF2-a抑 制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制剂、GSK3抑 制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0173] 在一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是阳服-eIF2-a抑制 剂。在某些实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂选自salubrinal、Sal-003(3-苯基-N-[2,2， 2-S氯-1-[(4-氯苯基)硫代氨基甲酯氨基]乙基]丙-2-締酷胺）、GSK 2606414(7-甲基-5-(1-{[3-(立氣甲基)苯基化酷基}-2,3-二氨-I-H-吗隙-5-基)-7-H-化咯并[2,3d]喀晚-4- 胺）、GSK 2656157a-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-化咯并[2,3-d]喀晚-5-基)-4-氣吗|噪嘟-1-基)-2-(6-甲基化晚-2-基）乙酬)和ISRIB(反式-N，N'-(环己烧-l，4-二基)双(2-(4-氯苯氧 基）乙酷胺）。在某些其他实施方案中，该阳服-eIF2-a抑制剂是salubrinal。
[0174] 在另一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂，优 选NDQI-I或MLS-0315763。
[0175] 在又一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制 剂。在某些实施方案中，该NRF2-KEAP1抑制剂选自鼠尾草酸、S祗类化合物、萝h硫素和叔下 基氨酿。
[0176] 在又一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。在 某些实施方案中，该GSK3抑制剂选自CHIR98014(N6-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(lH-咪挫- 2-基)-2-喀晚基]氨基]乙基]-3-硝基-2,6-化晚二胺）、丙戊酸盐、CT99021和CT20026。
[01W]在进一步的实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是肥1(抑制剂。在 某些实施方案中，该MEK抑制剂选自PD0325901，N-[(2R)-2,3-二?基丙氧基]-3,4-二氣-2-[(2-氣-4-舰苯基)氨基]-苯甲酯胺;MEKl 62 (5- [(4-漠-2-氣苯基)氨基]-4-氣-N- (2-径基 乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪挫-6-甲酯胺）、PD184352(2-(2-氯-4-舰苯基氨基)-N-(环丙基 甲氧基)-3,4-二氣苯甲酯胺）、pimaseパ化（（S)-N-(2,3-二?基丙基)-3-(2-氣-4-舰苯基 氨基）异烟酷胺）、司美替尼（6-(4-漠-2-氯苯基氨基）-7-氣-N-(2-^基乙氧基）-3-甲基-3H-苯并[d]咪挫-5-甲酯胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氣-4-舰苯基氨基)-6，8-二 甲基-2,4,7-S氧代-3,4,6,7-四氨化晚并[4,3-d]喀晚-U2H)-基)苯基）乙酷胺KPD98059 (2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并化喃-4-酬）W及U0126-化細（（22,32)-2,3-双（氨基 (2-氨基苯硫基)亚甲基)班巧腊，乙醇）。
[0178] 在又一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。在某 些实施方案中，该JNK抑制剂选自SP600125(蔥并[l-9-cd]化挫-6(2H)-酬）、JNK-IN-8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-下締-1-基]氨基]-N-[3-甲基-4-[ [4-(3-化晚基)-2-喀晚 基]氨基]苯基]-苯甲酯胺）；JNK-抑制剂IX(N-(3-氯基-4,5,6,7-四氨苯并[b]嚷吩-2-基)- 1-糞甲酯胺）。
[0179] 在另一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和 P38MAP激酶抑制剂。在某些实施方案中，该P38MAP激酶抑制剂选自SB203580(4-(4-(4-氣苯 基)-2-(4-(甲基亚横酷基)苯基)-lH-咪挫-5-基川比晚）、LY2228820(5-(2-叔下基-4-(4-氣 苯基)-lH-咪挫-5-基)-3-新戊基-3H-咪挫并[4,5-b]化晚-2-胺二甲横酸盐）、PD169316(4-(4-氣苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-化晚基)-lH-咪挫）、PH-797804(3-(4-(2,4-二氣节氧 基)-3-漠-6-甲基-2-氧代化晚基)-N，4-二甲基苯甲酯胺）、SB202190(4-(4-(4-氣 苯基)-5-(化晚-4-基)-lH-咪挫-2-基)苯酪）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔下基-1-对甲苯 基-IH-化挫-5-基）-3-(4-(2-吗嘟基乙氧基）糞-1-基）脈）、VX-702( 1-(5-氨基甲酯基-6-(2,4-二氣苯基川比晚-2-基）-1-(2,6-二氣苯基)脈）W及TAK-715(N-[4-[2-乙基-4-(3-甲 基苯基)-5-嚷挫基]-2-化晚基]-苯甲酯胺。
[0180] 在进一步的实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。 在某些实施方案中，该PI3K抑制剂选自dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-哇 嘟-3-基咪挫并[4,5-c]哇嘟-1-基)苯基]丙腊）、60(：-0941(2-(1护吗|挫-4-基)-6-[[4-(甲 基横酷基）-1-赃嗦基]甲基]-4-(4-吗嘟基）嚷吩并[3,2-d]喀晚）、LY294002(2-(4-吗嘟 基)-8-苯基-4H-1-苯并化喃-4-酬）、idealalisib(5-氣-3-苯基-2-[aS)-1-(7H-嚷岭-6-基氨基）丙基]-4(3H)-哇挫嘟酬）、bu巧arlisib(5-(2,6-二吗嘟基喀晚-4-基）-4-(S氣甲 基川比晚-2-胺）、GDC-0032(4-[5,6-二氨-2-[3-甲基-1-a-甲基乙基)-lH-l，2,4-S挫-5-基]咪挫并[l，2-d][l，4]苯并氧氮杂草-9-基]-a，a-二甲基-lH-化挫-1-乙酷胺）、PI-103 (3-(4-(4-吗嘟基川比晚并[3' ,2' :4,5]巧喃并[3,2-d]喀晚-2-基)苯酪）、NU7441(8-(4-二 苯并嚷吩基）-2-(4-吗嘟基苯并化喃-4-酬）、GSK2636771(2-甲基甲基-3-(二氣甲基）苯基]甲基]-6-(4-吗嘟基)-lH-苯并咪挫-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嚷岭-6-基氨基）乙基]异哇嘟酬）、)(L147(N-(3-(苯并[c][l，2,5]嚷 二挫-5-基氨基）哇喔嘟-2-基)-4-甲基苯横酷胺）、TGX-221(7-甲基-2-(4-吗嘟基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-化晚并[l，2-a]喀晚-4-酬）、PIK-90(N-(7,8-二甲氧基-2,3-二氨-咪 挫并[1，2-C]哇挫嘟-5-基）-烟酷胺）、渥曼青霉素（11-(乙酷氧基)-1，化，7，8，9a，10，11， Ub-八氨-1-(甲氧基甲基）-9a，l化-二甲基-，（15,66尺，9曰5，11尺，1化1〇-3护氣[4,3,2-(16] 巧并[4,5-h]-2-苯并化喃-3,6,9-S酬）、VS-5584(5-[8-甲基-9-(1-甲基乙基)-2-(4-吗嘟 基)-9H-嚷岭-6-基]-2-喀晚胺)和TG-100703(3-( 2，4-二氨基-6-蝶晚基)-苯酪）。
[0181] 在一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。在某 些实施方案中，该IRE-I抑制剂选自IRE1抑制剂I (N-[(2-径基糞-1-基)亚甲基]嚷吩-2-横 酷胺KIREl抑制剂11(3/-甲酯基-少-径基-5/-甲氧基联苯基-3-甲酯胺）W及IREl抑制剂 III(8-甲酯基-7-径基-4-甲基香豆素，7-径基-4-甲基-2-氧代-2H-色締-8-甲醒）。
[0182] 在一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。 在某些实施方案中，该巧蛋白酶抑制剂选自巧蛋白酶抑制剂KN-乙酷基-Leu-Leu-正亮氨 酸-CHO)、巧蛋白酶抑制剂IKN-乙酷基-Leu-Leu-Met)、巧蛋白酶抑制剂III (Z-Val-I^e-C册）、巧蛋白酶抑制剂IV(Z-Leu-Leu-Tyr-C此F)、巧蛋白酶抑制剂V(吗嘟基酷脈基;-Val-高苯丙氨酸-C出F)、巧蛋白酶抑制剂VK4-氣苯基横酷基-化I-Leu-CHO)、巧蛋白酶抑制剂X (Z-Leu-a-氨基下酸-CON肥抽日）、巧蛋白酶抑制剂XKZA-Q-氨基下酸-C0NH(C出）3-吗嘟）和 巧蛋白酶抑制剂XII(2寸-正鄉氨酸-CONH-C出-2-化晚基）。
[0183] 在一个实施方案中，所述方法中使用的至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制 剂。在某些实施方案中，该脫天蛋白酶-1抑制剂选自脫天蛋白酶-1抑制剂IKAc-YVAD-氯甲 基甲酬）、N-(2-哇嘟基)鄉氨酷-天冬氨酷-(2,6-二氣苯氧基）甲基甲酬(其中天冬氨酷残基 是曰-甲基化或非曰-甲基化的）、\0(-765((5)-1-((5)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酯氨基)-3,3-二 甲基下酷基)-N-((2R，3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氨巧喃-3-基川比咯烧-2-甲酯胺)和ZVAD-氣甲基甲酬。
[0184] 在另一个方面，所述方法中使用的再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一 种ER蛋白伴侣诱导剂。在某些实施方案中，该ER蛋白伴侣诱导剂选自BIX、丙戊酸盐和裡。
[0185] 在另一个方面，所述方法中使用的再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一 种自隧诱导剂。在某些实施方案中，该自隧诱导剂选自氣司必林、=氣拉嗦、匹莫齐特、尼卡 地平、尼古地平、洛赃下胺、胺舰酬、雷帕霉素、白襲芦醇和SMER。
[0186] 在另一个方面，所述方法中使用的再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一 种存活蛋白。在一个实施方案中，该存活蛋白为Bd-xL。
[0187] 在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是可逆调亡抑制剂。在所述方法中， 可使用可逆调亡抑制剂在预脱水和/或再水化阶段中处理细胞W使细胞载有保护量的调亡 抑制剂，例如，W阻断一种或多种ER应激通路激活，W使得在预脱水制剂和/或再水化制剂 去除和细胞重悬时可逆抑制剂最终从细胞中稀释W避免延长的暴露时间。 试剂盒
[0188] 在某些其他方面，提供了试剂盒，其包含含有干燥储存稳定剂的液体脱水制剂，用 于放置一种或多种细胞W进行基本干燥储存的样品容器，W及包含关于使用所述液体脱水 制剂将一种或多种细胞基本干燥储存的使用说明的包装插页。在某些实施方案中，该脱水 制剂进一步包含至少一种调亡抑制剂，并且仍可进一步包含含有至少一种调亡抑制剂的再 水化缓冲液。
[0189] 在某些其他实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于在脱水前固定一种或多种细 胞的固体支持体，包含至少一种调亡抑制剂的预脱水制剂，包含至少一种干燥储存稳定剂 的、用于所述一种或多种细胞的基本干燥储存的脱水制剂，W及包含关于将所述一种或多 种细胞固定至所述固体支持体W及关于采用所述预脱水制剂和脱水制剂将一种或多种细 胞基本干燥储存的说明的包装插页。在又一个实施方案中，所述试剂盒可进一步包含再水 化缓冲液，该再水化缓冲液包含至少一种调亡抑制剂。 用于筛选制剂的通用方案
[0190] 可采用W下方案来分析和选择用于细胞的基本干燥储存的预脱水制剂、脱水制剂 和/或再水化制剂及其组合，该细胞在再水化后至少一小时保持至少一种功能性质。简而言 之，将细胞接种到96孔板(20，000个细胞/孔）中的DMBl培养基或预脱水制剂(例如，DMBl培 养基+至少一种调亡抑制剂）中，并于37°C下溫育1小时至最多24小时。溫育后，将培养基从 细胞中吸出并丢弃，并且向每个孔中添加 IOyl脱水制剂。将开放的96孔板在37°C下溫育，如 果干燥半满的96孔板则溫育75分钟，或者如果干燥全满的96孔板则溫育95分钟。将干燥的 细胞在室溫下储存1小时并采用可变量的包含至少一种调亡抑制剂的再水化制剂或在完全 DMEM培养基中再水化。将再水化的细胞在37°C的C〇2调节的培养箱中溫育1小时或24小时的 时间段。在指定的时间点，向再水化的细胞添加台吩蓝，并采用细胞计数器对细胞进行计 数。通过台吩蓝染色的细胞的数目除W细胞总数来确定细胞存活百分比，从而确定非存活 细胞的分数，并随后计算存活细胞的百分比。 用于测定细胞的功能性质的试验
[0191] 本发明的基本干燥储存的细胞在再水化时保持至少一种该细胞在经历脱水前的 功能性质。所述一种功能性质可选自：代谢活性，细胞活力，增殖、分化、响应于信号刺激(如 生长因子引起的）W及表达预期细胞生物标志物（如RNA合成、蛋白质）的能力，和或分泌功 能。运些功能性质可采用任何方法来检测或分析，该方法包括本文公开的方法W及本领域 技术人员已知的其他方法。下文描述了用于检测再水化的干燥储存细胞的至少一种功能性 质的示例性方法。 1.细胞活力测定
[0192] 可采用台吩蓝染色程序来测量细胞活力。台吩蓝是一种具有带负电荷的生色团的 染料，除非细胞膜受损，否则其不与细胞相互作用，因此活细胞排斥该染料，而在显微镜下 检查时受损的细胞呈蓝色。在Leitz Fluoved显微镜下一式S份在带有格室（Gr id 化ambersKHycor)的9mm KOVA载玻片上进行细胞计数。报告了相对于未处理的对照细胞的 细胞存活百分比。 2. ATP含量测定
[0193]可根据制造商的说明采用Cell Titer-Glo发光法细胞活力测定(Cell Titer-Glo Luminiscent Cell viability AssayKPromega)来测定ATP含量。将Cell Titer-Glo Luminiscent试剂添加至细胞产生了与细胞内ATP的量成比例的发光信号。ATP的量与培养 物中存在的细胞的数目成正比，因此它是一种在再水化的细胞制备物中测定活(代谢活性） 细胞数目的均相法。 3. 脫天蛋白酶测定
[0194] 可根据制造商的说明采用脫天蛋白酶-Glo 3/7测定（Caspase-Glo3/7 Assay) (Promega)来测量细胞调亡的程度。简而言之，该测定提供含有四肤序列DEVD的促发光 (pro-luminescent)脫天蛋白酶-3/7底物。该底物被裂解W释放氨基蛋光素(一种用于产生 光的蛋光素酶底物）。单一脫天蛋白酶-Glo 3/7试剂的添加导致细胞裂解，随后导致底物的 脫天蛋白酶裂解W及发光信号的产生。脫天蛋白酶活化的倍数计算为在标准组织培养条件 下培养的测试样品中的活性与未处理的细胞的活性之比。
[0195] W说明而非限制的方式提供W下的实施例。 实施例1 在再水化后五天，示例性制剂保持活细胞并防止基本干燥储存的细胞的细胞调亡
[0196] 该实施例表明，在环境溫度下基本干燥储存5小时后再水化后多达5天，本文所述 的示例性预脱水制剂、脱水制剂和再水化制剂保持细胞活力并防止细胞被诱导调亡。
[0197] 采用预定的预脱水制剂(5(：1(3曰1油'111曰1)和5〔3(]\11^5-0315763))将化1^曰细胞基本 干燥储存，然后用表1所示的制剂亚组处理，并在96孔板中脱水且在环境溫度下储存5小时。 采用再水化制剂(RCl(salubrinal)和RC3(MLS-0315763))将细胞再水化，并且通过向96孔 板中添加 CellTiter-glo来测量ATP含量。在细胞裂解后，将50iil样品转移至白色384孔板中 进行定量。通过测量ATP发光来测定基本干燥储存的细胞的细胞活力。
[0198] 此外，在再水化后5天测定那些显示阳性ATP活性的基本干燥储存的细胞的ATP含 量。如表2所示，所有的无制剂对照细胞在第5天均是不存活的，而大部分的采用本文所述的 制剂和方法基本干燥储存的细胞仍保持存活(高达90%的细胞活力），显示了完整的、代谢 活性细胞的稳定化。
[0199] 还通过测量脫天蛋白酶活性对再水化的细胞进行分析，W确定基本干燥储存5天 随后再水化5天是否导致细胞调亡的诱导。将再水化5天的细胞暴露于脫天蛋白酶-glo (Promega) W检测脫天蛋白酶3/7的活性。脫天蛋白酶活化计算为在标准组织培养条件下培 养的测试样品中的活性与未处理的细胞的活性之比（表2)。一或低于一的结果被认为是表 明不存在升高的脫天蛋白酶活性且表明没有观察到调亡的结果。 表2 在再水化后五天，示例性制剂保持活细胞并防止基本干燥储存的细胞的细胞调亡
[0200] 如表2所示，相对于背景值没有或几乎没有观察到可检测的脫天蛋白酶活性，表明 在干燥储存5天并随后再水化至少5天后没有诱导调亡。 实施例2 在基本干燥储存后再水化后屯天，示例性制剂保持活细胞
[0201] 该实施例表明，本文所述的示例性制剂能够使活化La细胞在再水化后保持至少屯 小时。
[0202] 简而言之，采用预定的预脱水制剂(SCl(salubrinal)和SC3(MLS-0315763))和表1 所示的脱水制剂亚组将化La细胞基本干燥储存屯小时，随后采用W下列出的再水化制剂 (RCl(salubrinal)和RC3(MLS-0315763))再水化。采用台吩蓝法，在再水化后屯天对细胞活 力进行评价。结果在表3和图4中示出。 表3 在基本干燥储存后再水化后屯天，示例性制剂保持活细胞
[0203] 如表3所示，在再水化屯小时后，未受到保护的对照和海藻糖稳定化的细胞没有产 生任何活细胞，而本发明的示例性制剂W不同程度保持化La细胞活力多达屯小时，从而导 致相对于金标准海藻糖干燥的细胞的显著的改善。 实施例3 在基本干燥储存至少120小时期间，包含祀向ER应激通路的示例性调亡抑制剂的制剂 保持细胞活力
[0204] 该实施例表明，当在本文所述的制剂、组合物和方法中使用时，祀向邸应激通路的 不同步骤的多种调亡抑制剂能够将细胞在环境溫度下基本干燥储存至少24小时。
[020引简而言之，将人新生儿成纤维细胞悬浮于化scade培养基（Cascade Media) 106中， 并W每个试验100-5000个细胞的密度将10化1培养物接种在96孔板中，并且在环境气氛的 环境下溫育，同时保持升高的C02水平（5 %-10% )和37°C的溫度W及85-95%的相对湿度。 将培养物调整为预脱水制剂的特定组成和每种调亡抑制剂的培养基特定浓度。将细胞在37 °C下溫育至少一小时但不超过3小时的一段时间。彻底去除预脱水制剂，并且向每个孔中添 加 IO-ISiil的MCS脱水制剂41(表1)。将细胞在37°(3、5%0)2、20%相对湿度下基本风干90分 钟，在环境溫度下储存24、48或120小时。在合适的时间，通过用再水化制剂处理将基本干燥 储存的细胞再水化，该再水化制剂包含与100-20化1预脱水制剂中相同浓度的调亡抑制剂。 通过如本文所述测量ATP含量来确定细胞活力。
[0206]结果在表4中示出： 表4 在基本干燥储存至少120小时期间，包含祀向ER应激通路的示例性调亡抑制剂的制剂 保持细胞活力
[0207] 如表4所示，在干燥储存后120小时，祀向ER应激通路中的不同步骤的示例性调亡 抑制剂保持了大量活细胞，该活细胞保 持至少一种功能性质。通过24虹的干燥储存，未处理 的对照和用金标准海藻糖处理的细胞没有或几乎没有保持活细胞，而本文所述的制剂和方 法导致显著的细胞活力，并且细胞在基本干燥储存至少120小时的时间内仍保持存活。 实施例4 在再水化后至少两周的时间内，基本干燥储存的间充质干细胞保持分化能力
[0208] 该实施例表明，间充质干细胞(MSC)在环境溫度下基本干燥储存至少两周后保持 其分化能力。
[0209] 将MSC采用100纳摩尔到2000纳摩尔的salubrinal和表1中所示的MSC制剂205基本 干燥储存，并在室溫下储存两周。将基本干燥储存的细胞在包含相似浓度的salubrinal的 再水化制剂的存在下再水化，在典型的培养条件(37°C、5 % C〇2、85-95 %畑)下溫育一小时， 并在此时将培养基更换为MSC生长培养基并使之恢复且增殖48小时，并作为单层（图3A-C) 或作为微团培养物（micromass cultures)(图3D)传代至12孔板中，之后暴露于由 LifeTechnologies TM提供的 StemPro TM脂肪形成（Adipogenesis)(B)、骨生成 (Osteogenesis)(C) W及软骨形成(Chondrogenesis) (D)试剂盒培养基制品中；每3天用进 料处理细胞21-30天。相对于未分化的MSC培养物(A)的表型的明显变化是显而易见的，其中 明显的脂质小球与(B)中可见的脂肪细胞一致，含巧的沉积物与(C)中的骨细胞一致，且柱 样生长与化）中的软骨细胞一致，表明本文所述的制剂保持MSC的分化潜能的能力而并不妨 碍MSC的分化潜能。
[0210] 除非上下文另有要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语"包含"及其变化 形式如"包括"和"含有"应理解为开放式包容性含义，即应理解为"包括但不限于"。
[0211] 贯穿本说明书对"一个实施方案"或"实施方案"或"方面"的提及意指结合该实施 方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明 书在各个位置中出现的措词"在一个实施方案中"或"在实施方案中"不一定都指代相同的 实施方案。此外，特定的特征、结构或特性可W在一个或多个实施方案中W任何合适的方式 组合。
[0212] 尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显 而易见的是运些实施方案仅W示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下 现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方 案可用于实施本发明。目的在于W下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖运些权利 要求范围内的方法和结构及其等同物。
【主权项】
1. 一种组合物，其包含在没有冷冻的情况下基本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本 干燥储存至少1小时后再水化时，再水化的细胞表现出至少一种与脱水和基本干燥储存之 前的细胞基本相同的功能性质，其中该组合物包含至少一种不是二糖的干燥储存稳定剂。2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述细胞是真核细胞。3. 根据权利要求2所述的组合物，其中所述干燥储存稳定剂选自氨基酸、合成氨基酸、 肽、肽类似物、三糖、螯合剂、水溶性聚合物和四氢嘧啶。4. 根据权利要求2所述的组合物，其进一步包含至少一种凋亡抑制剂。5. 根据权利要求4所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。6. 根据权利要求4所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂选自PERK-eIF2_a抑制 剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、p38MAP激酶抑制剂、IREl抑制剂、GSK3抑制 剂、MEK抑制剂、P13K通路抑制剂、妈蛋白酶抑制剂以及胱天蛋白酶-1抑制剂。7. 根据权利要求2所述的组合物，其中在脱水之前用包含至少一种凋亡抑制剂的预脱 水制剂处理所述细胞以在脱水前产生预处理的细胞。8. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。9. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂选自PERK-eIF2_a抑制 剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、p38MAP激酶抑制剂、IREl抑制剂、GSK3抑制 剂、PIK3通路抑制剂、MEK抑制剂、妈蛋白酶抑制剂以及胱天蛋白酶-1抑制剂。10. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是PERK-eIF2_a抑制 剂。11. 根据权利要求10所述的组合物，其中所述PERK-eIF2_a抑制剂选自salubrinal、 3&1-003(3-苯基_1'1-[2,2,2-二氯-1-[(4-氯苯基)硫代氨基甲酰氨基]乙基]丙-2-稀酰胺）、 GSK 2606414(7-甲基-5-(1-{[3-(三氟甲基）苯基]乙酰基}-2,3_二氢-I-H-吲哚-5-基)-7-H-吡咯并[2,3d]嘧啶-4-胺）、GSK 2656157(1-(5-(4-氨基-7-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧 啶-5-基)-4-氟吲哚啉-1-基)-2-(6-甲基吡啶-2-基）乙酮)和ISRIB(反式-N，N'_(环己烷-1，4_二基)双(2-(4-氯苯氧基)乙酰胺）。12. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述PERK-eIF2-a抑制剂是salubrinal。13. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是ASKl抑制剂。14. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述ASKl抑制剂是NDQI-I或MLS-0315763。15. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制 剂。16. 根据权利要求15所述的组合物，其中所述NRF2-KEAP1抑制剂选自鼠尾草酸、三萜类 化合物、萝卜硫素和叔丁基氢醌。17. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是GSK3抑制剂。18. 根据权利要求17所述的组合物，其中所述GSK3抑制剂选自CHIRgSOlWNe-D-tU-Uj-二氯苯基 )-5-(1-Η-咪唑-2-基 )-2-嘧啶基] 氨基] 乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺） 、丙 戊酸盐、CT 99021 和CT 20026。19. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是MEK抑制剂。20. 根据权利要求19所述的组合物，其中所述MEK抑制剂选自PD0325901，N-[ (2R)-2，3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺;MEK162(5-[(4-溴-2-氟 苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-IH-苯并咪唑-6-甲酰胺）、PD184352(2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺）、pima Sertib((S)-N-(2,3-二 羟基丙基)-3-(2-氟-4-碘苯基氨基)异烟酰胺）、司美替尼(6-(4-溴-2-氯苯基氨基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基）-3-甲基-3H-苯并[d]咪唑-5-甲酰胺）、曲美替尼(N-(3-(3-环丙基-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-6,8_二甲基_2,4,7_三氧代_3,4,6,7_四氢吡啶并[4,3-(1]嘧啶-1 (2H)-基）苯基）乙酰胺）、PD98059(2-(2-氨基-3-甲氧基苯基）-4H-苯并吡喃-4-酮）以及 1]〇1264切!1((22,32)-2,3-双(氨基(2-氨基苯硫基)亚甲基)琥珀腈，乙醇）。21. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是JNK抑制剂。22. 根据权利要求21所述的组合物，其中所述JNK抑制剂选自SP600125 (蒽并[l-9-cd] 吡唑-6(2H)_酮）、了疆-1^8(3-[[4-(二甲基氨基)-1-氧代-2-丁烯-1-基]氨基]4-[3-甲 基-4- [[ 4- (3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]-苯甲酰胺）；JNK-抑制剂IX (N- (3-氰基-4，5， 6，7-四氢苯并[b]噻吩-2-基)-1 -萘甲酰胺）。23. 根据权利要求22所述的组合物，其进一步包含p38MAP激酶抑制剂。24. 根据权利要求23所述的组合物，其中所述p38MAP激酶抑制剂选自SB203580(4-(4-(4-氟苯基)-2-(4-(甲基亚磺酰基)苯基)-1Η-咪唑-5-基)吡啶）、LY2228820(5-(2-叔丁基-4-(4-氟苯基）-1Η-咪唑-5-基）-3-新戊基-3H-咪唑并[4,5-b]吡啶-2-胺二甲磺酸盐）、 TO169316(4-(4-氟苯基)-2-(4-硝基苯基)-5-(4-吡啶基)-1Η-咪唑）、PH-797804(3-(4-(2, 4-二氟苄氧基)-3-溴-6-甲基-2-氧代吡啶-1(2H)_基）-叱4-二甲基苯甲酰胺）、38202190 (4-(4-(4-氟苯基)-5-(吡啶-4-基)-1Η-咪唑-2-基)苯酚）、BIRB 796(达马莫德；1-(3-叔丁 基-1-对甲苯基-IH-吡唑-5-基)-3-(4-(2-吗啉基乙氧基)萘-1-基)脲）、VX-702( 1-(5-氨基 甲酰基-6-(2,4-二氟苯基）吡啶-2-基)-1-(2,6-二氟苯基）脲）以及了厶1(-7150-[4-[2-乙 基-4-( 3-甲基苯基)-5-噻唑基]-2-吡啶基]-苯甲酰胺。25. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是PI3K抑制剂。26. 根据权利要求25所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂选自dactolisib(2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-氧代-8-喹啉-3-基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基）苯基]丙腈）、GDC-0941(2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)-1-哌嗪基]甲基]-4-(4-吗啉基)噻吩并[3,2-d]嘧 啶）、LY294002(2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮）、idealalisib(5-氟-3-苯基-2-[(lS)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)_ 喹唑啉酮）、burparlisib(5-(2,6-二吗啉基 嘧啶-4-基)-4-(三氟甲基）吡啶-2-胺）、⑶C-0032(4-[5,6-二氢-2-[3-甲基-1-(1-甲基乙 基)-1Η-1，2,4-三唑-5-基]咪唑并[1，2-(1][1，4]苯并氧氮杂革-9-基]-€[，€1-二甲基-1!1-吡 唑-1-乙酰胺）、PI-103(3-(4-(4-吗啉基)吡啶并[3' ,2' :4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基)苯 酚）、NU7441(8-(4-二苯并噻吩基)-2-(4-吗啉基）-4Η-1-苯并吡喃-4-酮）、GSK2636771(2-甲基-1-[ [2-甲基-3-(三氟甲基)苯基]甲基]-6-(4-吗啉基)-1Η-苯并咪唑-4-甲酸）、IPI-145(8-氯-2-苯基-3-[(lS)-1-(9-H-嘌呤-6-基氨基）乙基]-1-(2H)_ 异喹啉酮）、XL147(N-(3-(苯并[c][l，2,5]噻二唑-5-基氨基）喹喔啉-2-基)-4-甲基苯磺酰胺）、TGX-221(7-甲 基-2-(4-吗啉基)-9-[1-(苯基氨基）乙基]-4H-吡啶并[l，2-a]嘧啶-4-酮）、PIK-90(N-(7， 8-二甲氧基-2,3-二氢-咪唑并[l，2-c]喹唑啉-5-基)-烟酰胺）、渥曼青霉素（11-(乙酰氧 基)-1，613,7,8,9&，10，11，1113-八氢-1-(甲氧基甲基）-9&，1113-二甲基-，（15,6匕1?，9&5，111?， llbR)-3H-氟[4,3,2-de]茚并[4,5-h]-2-苯并吡喃-3,6,9-三酮）、￥5-5584(5-[8-甲基-9- (1-甲基乙基)-2-(4-吗啉基)-9H-嘌呤-6-基]-2-嘧啶胺)和TG-100703(3-(2,4-二氨基-6-蝶啶基) _苯酌O。27. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是IRE-I抑制剂。28. 根据权利要求27所述的组合物，其中所述IRE-I抑制剂选自IREl抑制剂I (N-[ (2-羟 基萘-1-基）亚甲基]噻吩-2-磺酰胺）、IRE1抑制剂11(3^甲酰基-V-羟基-δ'-甲氧基联苯 基-3-甲酰胺）以及IREl抑制剂111(8-甲酰基-7-羟基-4-甲基香豆素，7-羟基-4-甲基-2-氧 代-2Η-色烯-8-甲醛）。29. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是钙蛋白酶抑制剂。30. 根据权利要求29所述的组合物，其中所述钙蛋白酶抑制剂选自钙蛋白酶抑制剂I (N-乙酰基-Leu-Leu-正亮氨酸-CHO)、钙蛋白酶抑制剂II(N-乙酰基-Leu-Leu-Met)、钙蛋白 酶抑制剂III (Z-Val-Phe-CHO )、钙蛋白酶抑制剂I V( Z-Leu-Leu-Tyr-CH2F )、钙蛋白酶抑制 剂V(吗啉基酰脲基;-Val-高苯丙氨酸-CH2F)、钙蛋白酶抑制剂VI (4-氟苯基磺酰基-Val-Leu-CHO)、钙蛋白酶抑制剂X(Z-Leu_a-氨基丁酸-C0NHC2H5)、钙蛋白酶抑制剂XKZ-L-α-氨 基丁酸-C0NH(CH2)3-吗啉)和钙蛋白酶抑制剂XII(Z-L-正缬氨酸-C0NH-CH2-2-吡啶基）。31. 根据权利要求9所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是胱天蛋白酶-1抑制 剂。32. 根据权利要求31所述的组合物，其中所述胱天蛋白酶-1抑制剂选自胱天蛋白酶-1 抑制剂IKAc-YVAD-氯甲基甲酮）、N-(2-喹啉基)缬氨酰-天冬氨酰-(2,6_二氟苯氧基）甲基 甲酮(其中天冬氨酰残基是a-甲基化或非a-甲基化的）、VX-765((S)-1-((S)-2-(4-氨基-3-氯苯甲酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-N-((2R，3S)-2-乙氧基-5-氧代-四氢呋喃-3-基)吡咯 烷-2-甲酰胺)和ZVAD-氟甲基甲酮。33. 根据权利要求9所述的组合物，其进一步包含至少一种ER蛋白伴侣诱导剂。34. 根据权利要求33所述的组合物，其中所述ER蛋白伴侣诱导剂选自BIX、丙戊酸盐和 锂。35. 根据权利要求9所述的组合物，其进一步包含至少一种自噬诱导剂。36. 根据权利要求35所述的组合物，其中所述自噬诱导剂选自氟司必林、三氟拉嗪、匹 莫齐特、尼卡地平、尼古地平、洛哌丁胺、胺碘酮、雷帕霉素、白藜芦醇和SMER。37. 根据权利要求9所述的组合物，其进一步包含至少一种存活蛋白。38. 根据权利要求37所述的组合物，其中所述存活蛋白是Bcl-xL。39. -种包含再水化的细胞的组合物，其中该再水化的细胞是在没有冷冻的情况下基 本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本干燥储存至少1小时后再水化时，该再水化的细胞表 现出至少一种与脱水和基本干燥储存之前的细胞基本相同的功能性质。40. 根据权利要求39所述的组合物，其中所述细胞的再水化在再水化制剂的存在下发 生。41. 根据权利要求40所述的组合物，其中所述再水化制剂包含至少一种凋亡抑制剂。42. 根据权利要求41所述的组合物，其中所述至少一种凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。43. 根据权利要求39所述的组合物，其中所述再水化制剂进一步包含选自ER蛋白伴侣 诱导剂、自噬诱导剂和存活蛋白中的一种或多种。44. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种功能性质包括代谢活性。45. 根据权利要求44所述的组合物，其中所述代谢活性通过测定ATP含量来度量。46. 根据权利要求45所述的组合物，其中所述代谢活性通过胱天蛋白酶测定试验来度 量。47. 根据权利要求1所述的组合物，其中再水化后的代谢活性在细胞再水化后24小时测 量。48. 根据权利要求1所述的组合物，其中再水化后的代谢活性在细胞再水化后48小时测 量。49. 根据权利要求1所述的组合物，其中再水化后的代谢活性在细胞再水化后72小时测 量。50. 根据权利要求1所述的组合物，其中再水化后的代谢活性在细胞再水化后一周测 量。51. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在再水化之前以脱水形式稳定化至 少24小时。52. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在再水化之前以脱水形式稳定化至 少48小时。53. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在再水化之前以脱水形式稳定化至 少72小时。54. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物在再水化之前以脱水形式稳定化至 少一周。55. -种脱水制剂，其包含： (i) pH缓冲液； (ii) 合成氨基酸； (iii) 水溶性聚合物；以及 (iv) 第一氨基酸或肽。56. 根据权利要求55所述的脱水制剂，其进一步包含非还原糖、至少一种凋亡抑制剂或 第二氨基酸。57. -种在没有冷冻的情况下将一种或多种细胞在环境温度下基本干燥储存的方法， 其包括： (i) 将所述一种或多种细胞与包含干燥储存稳定剂和至少一种凋亡抑制剂的脱水制剂 一起温育；以及 (ii) 在脱水制剂的存在下使所述一种或多种细胞脱水，以产生一种或多种基本干燥储 存的细胞。58. -种在没有冷冻的情况下将一种或多种细胞在环境温度下基本干燥储存的方法， 其包括： (i) 将所述一种或多种细胞与包含至少一种凋亡抑制剂的预脱水制剂一起温育； (ii) 从所述一种或多种细胞中去除所述预脱水制剂；以及 (iii) 在包含至少一种不是二糖的干燥储存稳定剂的脱水制剂的存在下使所述一种或 多种细胞脱水，以产生一种或多种基本干燥储存的细胞。59. 根据权利要求58所述的方法，其中所述脱水制剂是表1中的脱水制剂中的一种。60. 根据权利要求59所述的方法，其中所述脱水制剂是表1中的脱水制剂中的一种。61. 根据权利要求58所述的方法，其中所述凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。62. 根据权利要求59所述的方法，其进一步包括在将一种或多种细胞与所述预脱水制 剂一起温育之前将所述一种或多种细胞固定至固体支持体上。63. 根据权利要求58所述的方法，其进一步包括采用包含至少一种凋亡抑制剂的再水 化制剂将所述一种或多种基本干燥储存的细胞再水化，以产生再水化的细胞。64. 根据权利要求59所述的方法，其进一步包括采用包含至少一种凋亡抑制剂的再水 化制剂将所述一种或多种基本干燥储存的细胞再水化，以产生再水化的细胞。65. 根据权利要求59所述的方法，其中所述凋亡抑制剂是可逆凋亡抑制剂。66. 根据权利要求59所述的方法，其中所述预脱水制剂中的至少一种凋亡抑制剂与所 述再水化制剂中的至少一种凋亡抑制剂相同。67. 根据权利要求60所述的方法，其中所述预脱水制剂中的至少一种凋亡抑制剂与所 述再水化制剂中的至少一种凋亡抑制剂不同。68. -种试剂盒，其包含含有不是二糖的干燥储存稳定剂的液体脱水制剂，用于放置一 种或多种细胞以进行基本干燥储存的样品容器，以及包含关于使用所述液体脱水制剂将一 种或多种细胞基本干燥储存的使用说明的包装插页。69. 根据权利要求68所述的试剂盒，其中所述脱水制剂进一步包含至少一种凋亡抑制 剂。70. 根据权利要求68所述的试剂盒，其进一步包含用于在脱水前固定一种或多种细胞 的固体支持体，包含至少一种凋亡抑制剂的预脱水制剂，包含至少一种不是二糖的干燥储 存稳定剂的、用于所述一种或多种细胞的基本干燥储存的脱水制剂，以及包含关于将所述 一种或多种细胞固定至所述固体支持体以及关于采用所述预脱水制剂和脱水制剂将一种 或多种细胞基本干燥储存的说明的包装插页。71. 根据权利要求68所述的试剂盒，其进一步包含再水化缓冲液，该再水化缓冲液包含 至少一种凋亡抑制剂。72. 根据权利要求70所述的试剂盒，其进一步包含再水化缓冲液，该再水化缓冲液包含 至少一种凋亡抑制剂。
【专利摘要】本发明涉及细胞在环境温度下的稳定化。更具体地，本发明涉及允许细胞脱水和再水化并且显著提高功能性细胞在室温下干燥储存后的恢复性的制剂、组合物、试剂盒和方法。
【IPC分类】A61K31/4706, A01N1/02, A61K31/17
【公开号】CN105491883
【申请号】CN201480044962
【发明人】朱蒂·穆勒-科恩, 保罗·迪亚兹, 罗尔夫·穆勒, 瓦斯科·利贝拉尔, 阿尔伯特·佩雷斯-拉达格
【申请人】生物马特里卡公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月13日
【公告号】CA2915250A1, EP3007556A2, US20160135446, WO2015002729A2, WO2015002729A3
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