预防骨关节炎的方法和化合物的制作方法
预防骨关节炎的方法和化合物的制作方法
【专利说明】预防骨关节炎的方法和化合物
[0001] 本发明设及利用抑制(a-氨基-3-?基-5-甲基-4-异恶挫丙酸KAMPA)和红藻氨酸 化A)谷氨酸受体(GluRs)中的一种或两种的化合物，预防早期或晚期的创伤后骨关节炎的 治疗剂和药物组合物，其用途W及方法。
[0002] 骨关节炎（OA)为设及关节软骨和骨，特别是软骨下骨的机械异常的退变性关节 病，如关节退变。骨改变通常在软骨丧失之前。它可W由多种因素引起，包括遗传、发育、代 谢和力学。在后面的情况下，急性创伤如在个体生命的某一阶段的关节或肢体的损伤可促 成后期的病况，在一些情况下相当迟，即5-15年后。的确，在NHS每年为矫正半月板撕裂实施 的95，000例前交叉初带重建(A化)手术和38,000例关节镜检查中，受治疗的患者有50%在 5-15年后发展为早期0A。运些患者中的一部分继续需要全关节置换治疗，运是极其常见且 昂贵的方案，经受膝关节置换手术的患者有高达20%未成功。类似地，膝关节半月板撕裂和 任何关节中的肌腫/初带/关节盘损伤易于关节退变，在多年之后最终导致骨关节炎。
[0003] OA的症状可W包括关节疼痛，导致活动丧失、压痛、僵硬、锁闭、W及有时积液。患 者还可能经受肌肉疫李和肌腫收缩。偶尔地，关节还可能充满液体。由于活动减弱，邻近的 肌肉可能萎缩，并且初带可能变得更加松弛。
[0004] 尽管体内的任何关节都可能被影响，但是OA通常受累手、脚、脊柱和较大的负重关 节，如髓和膝关节。随着OA的发展，受累关节形状改变、僵硬且疼痛，并且通常在轻微使用时 感觉稍好，但是过度或长期使用时感觉更差，因而将该疾病与类风湿性关节炎区分开。此 夕h并且更深远地，基于RA是自身免疫性的全身性疾病，而OA不设及全身性的免疫应答且是 局部性的，OA可W与RA区分开来。
[0005] 在较小的关节（如手指）中，可能形成被称为希伯登氏结节(远端指间关节处)和/ 或布夏尔氏结节(近端指间关节处）的硬骨肿大，并且尽管它们不一定疼痛，但是明显限制 了手指的活动。位于脚趾的OA导致拇囊炎的形成，使其变红或肿胀。一些人在其经受任何疼 痛之前，注意到了运些身体变化。
[0006] 在美国，OA是关节炎的最常见形式，并且是慢性残疾的主要原因。它在美国影响了 近2700万人，在英国影响了约8百万人。膝关节OA是最常见的肌肉骨骼疾病之一，影响了近2 亿5千1百万人。在运些人群中，特别值得关注的是超过30%的患有急性前交叉初带(A化)或 半月板损伤的患者在损伤后5年内发展为放射学(radiographic)膝关节0A。关节创伤可能 导致一系列急性损伤，包括骨软骨骨折、初带或半月板撕裂W及关节软骨损伤。运通常与关 节内出血有关，并且引起创伤后关节炎症。尽管解决了急性症状并且可W手术修复一些损 伤，但是关节损伤引起了软骨、骨和其它关节组织中的慢性重建过程，运引发了合成代谢和 分解代谢过程之间的炎性和代谢失衡，组织重建和生物力学变化。运些生物力学和生物化 学变化之间的相互作用将进程引导退变性关节病，运最终导致关节衰退。
[0007] 因此，存在暗示损伤具有发展为关节退变和OA的可能性的有力证据。确实，运导致 了被称为创伤后骨关节炎(PTOA)的OA疾病的子集的定义，即多年之后可能导致OA的损伤继 发性退变性关节病。在年轻人和活跃个体如参与运动的那些个体中特别普遍，在运动期间 会增加持续此类损伤的风险。因此，其可被定义为损伤之前正常关节存在，损伤时结构受损 且该关节未受全身性疾病损坏(Pickering, 1984)。关节创伤受累全部关节组织，导致可能 发展为关节退变并随后发展为OA的生理学、生物力学和生物化学变化。
[0008] 治疗通常包括运动、生活方式改变和镇痛药的组合。如果疼痛使人虚弱，则可能需 要关节置换手术W改善生活质量。关节损伤后有时推荐手术干预W矫正异常的关节生物力 学，降低继发性损伤的风险，并理想地降低OA的风险。不幸地，手术干预(例如ACL重建、半月 板切除术、半月板置换)未恢复正常的关节生物力学或预防膝关节0A。因此，重要的是了解 运些患者中的哪些将发展为早发性膝关节OAW及膝关节OA的运种发作是否可W预防或延 迟。同时，疼痛管理和手术是当前的选择，目前没有解决创伤后关节炎及其预防的被批准的 疗法。对于关节创伤后发展为OA的风险有清晰的认识，因此明显且迫切需要开发并实施预 防创伤后软骨退变的方案。
[0009] 氨基酸谷氨酸是脊椎动物神经系统中主要的神经递质。然而，与传入和交感神经 终端一样，谷氨酸由滑膜关节中的众多细胞释放，所述细胞包括巨隧细胞、淋己细胞、滑膜 细胞、成骨细胞和软骨细胞。谷氨酸通过与各种GluR结合而发挥其生理作用，所述GluR被分 为功能上不同的两类:离子型QGluR)和促代谢型(mGluR)。
[0010] iGluR担当谷氨酸口控离子通道，基于其药理学被分为S种不同的亚群:N-甲基-D-天冬氨酸（匪DA)、a-氨基-3-径基-5-甲基-4-异恶挫丙酸（AMPA) W及红藻氨酸化A)。 mGluR是G蛋白偶联的受体，根据其结构和生理活性可分为八种不同的亚型(mGluRl-8)。谷 氨酸能信号通路由五种高亲和力的化+依赖型兴奋性氨基酸转运蛋白化AAT)调节:EAATl/ GLAST、EAAT2/GLT-1、EAAT3/EAAC1、EAAT4 W及EAAT5。在滑膜关节中，功能性GluR和EAAT由 滑膜细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腫细胞、巨隧细胞W及淋己细胞表达。
[0011] 我们最近的数据显示，人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)表达调节化S释放IL-6和 proMMP2的功能性GluR(27)。
[0012] 已知IL-6的浓度在来自阳性RA患者的滑膜组织和滑液中显著升高，并与放射学关 节破坏相关。化-6通过诱导血管生成、炎性细胞的浸润和滑膜增生促进滑膜炎，通过诱导破 骨细胞形成引起骨吸收，并且通过刺激滑膜细胞和软骨细胞的基质金属蛋白酶(MMP)表达 弓旭软骨退变。RA中升高的化-6水平主要由化S产生，其中巨隧细胞和软骨细胞产生显著但 更低的水平。比-6^/^]、鼠研究突出了 IL-6在RA的病理学中的重要作用，其中关节炎的严重 性降低和发作延迟是主要结果。如不能清除细菌感染并进行有效的T细胞记忆应答的IL-6 缺陷小鼠所示，用抗IL-6受体抑制剂托珠单抗治疗RA患者显著改善了滑膜炎和放射学变 化，然而，运些显著益处通常伴随着对宿主免疫力的负面影响，如在IL-6缺陷的小鼠中所 见，其不能清除细菌感染且增加有效T细胞记忆应答。
[001引我们最近公开的数据(Flood等2007)显示，匪DA受体的激活降低了人RA化S的 pro匪P-2的释放。非竞争性NMDA財吉抗剂MK801显著增加了RA中的pro匪P-2的释放，但在正 常的FLS中不能如此。然而，竞争性NMDAR括抗剂D-AP5W及AMPA/KA受体括抗剂CFM-2和NBQX 不影响FLS中MMP-2的表达。该项工作显示，RA FLS中NMDA GluR的激活依赖于括抗剂的性 质。
[0014]此外，高谷氨酸浓度通过KA受体的激活增加了RA FLS中的IL-6的释放，并且运受 AMPA/KA受体括抗剂NBQX而不受AMPA受体括抗剂CFM-2或者不受NMDA受体抑制剂MK801或D-AP5的抑制。运显示对IL-6的作用由红藻氨酸受体而非AMPA或NMDA受体介导。
[0015] 我们意外发现，当没有OA疾病的实证时，通过在损伤时或大约损伤时向关节施用， 特别是AMPA和KA(AMPA/KA)GluR抑制剂的子集在创伤后发展为OA的预防性防止中具有治疗 益处。在希望不受任何生物学解释限制的情况下，我们认为损伤时与疾病相关的滑液谷氨 酸浓度的增加激活了AMPA/KA GluR,反过来导致骨重建、力学响应、炎症、疼痛W及不期望 的退变。因此，在损伤时或不久之后，可W治疗性地祀向此类GluR, W预防导致充分发展期 或晚期OA的中期至长期退变性关节病的后续发展。
[0016] 在该项工作之前，在关节炎，更具体而言在OA的情况中，GluR括抗剂已经被全身性 独占使用，W通过药物对神经传递的作用减轻患有确确诊或晚期OA疾病的患者的疼痛和/ 或炎症性疼痛。在退变过程中，与OA相关的疼痛通常很晚才出现，运是为什么OA随着损伤之 后症状出现必定很难治疗。事实上，疼痛的存在是关节炎的临床诊断的一部分。运意味着当 给予药物治疗W预防OA发作/发展时，不会给予药物治疗W阻止疼痛。事实上，按照定义，处 于发展OA风险(例如A化断裂、半月板撕裂、肩袖损伤等之后）的患者不会患有关节炎（即X射 线下关节空间狭窄）。迄今为止的所有工作都集中于对显示疾病的患者的疼痛进行治疗，甚 至利用全身给药，因为运些药物的主要效果是通过其对脑和脊髓的作用。例如，Martel-Pelletier(2012)报道了KA受体括抗剂在伤害性感受中发挥作用，W及对离子型谷氨酸受 体iGluR5括抗剂LY545694治疗膝关节OA的中枢神经系统疼痛进行了测试，但未作为改变疾 病的OA药物或在处于发展OA的风险的患者中进行测试。此外，Szekely等（1997)报道了口服 施用AMPA/KA受体的非竞争性括抗剂GYKI 52466在晒齿动物关节炎（通过向右后爪注射 0.1ml弗氏佐剂诱导）中对于慢性疾病的第二阶段的右爪的初期水肿或左爪的继发性泛发 性炎症诱导的肿胀无作用，但是减弱了痛觉过敏和体重减轻，显示了对慢性疼痛的中屯、效 应用。该研究显示出没有疾病改变作用，且设及中枢性疼痛机制。
[0017]相反，測1'旧经确定：当没有关节OA的证据时，iv化创伤时或之后不久，向iii)受 损的关节i)直接或祀向递送ii)Glu財吉抗剂的特定子集，显著预防或降低了发展早期0A，即 导致晚期OA的退变性关节病的可能性（即括抗剂的作用是预防性的而非治疗性的）。因此， 本发明对于预防作为关节损伤的结果而发生的OA疾病具有极好的潜力。一旦OA疾病被确 诊，则本发明与治疗或逆转OA疾病无关。
【发明内容】
[0018] 在本发明的第一方面，提供了被配制W施用于关节的AMPA和/或KA Glu財吉抗剂， 其用于在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。
[0019] 在本发明的可选的第一方面，提供了AMPA和/或KA GluR括抗剂在制备药物中的用 途，所述药物用于向关节施用W在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后 骨关节炎的可能性。
[0020] 最优选地，所述关节为由创伤损伤的关节。
[0021] 本文提及的创伤设及导致改变的关节和组织生物力学或炎症、损害关节承受机械 应力的能力的任何事件。例如，运包括但不限于可形成直接的宏观损伤和微观损伤的对关 节的强力机械冲击，其可能损害组织如何分散关节负荷并引发组织退变。此外或可选地，包 括关节挫伤、脱白，肌腫和初带损伤的低能损伤也可能引起类似的生物力学变化并导致病 状。
[0022] 通常但不完全，运包括但不限于:关节软骨表面损伤、骨折、初带和/或肌腫松弛或 缺陷、初带和/或半月板和/或肌腫破裂、关节囊和滑膜损伤、骸骨功能障碍、关节软骨的压 迫和/或剪切损伤。
[0023] 在本发明的优选实施方案中，所述疾病为未患有类风湿性关节炎(RA)或OA的个体 的早期或晚期的创伤后骨关节炎(OA)。
[0024] 适用于本发明的AMPA和/或KA GluR括抗剂包括但不限于:6-氯基-7-硝基哇喔嘟-2，3-二酬(CNQX)、6，7-二硝基哇喔嘟-2，3-二酬(DNQX)、NS102-选择性红藻氨酸受体而非 AMPA受体、犬尿哇嘟酸内源性配体和替占帕奈( Tezampanel) ;2,3-二径基-6-硝基-7-氨横 酷基-苯并[f]哇喔嘟-2,3-二酬(NBQX)和丫-谷氨酷基乙胺或5-N-乙基-谷氨酷胺化-茶氨 酸）。特别优选的括抗剂包括:2，3-二径基-6-硝基-7-氨横酷基-苯并[f]哇喔嘟-2，3-二酬 (NBQX)、6-氯基-7-硝基哇喔嘟-2，3-二酬(CNQX)、替占帕奈和2，3-二径基-6-硝基-7-氨横 酷基-苯并[f]哇喔嘟-2,3-二酬(NBQX)和丫-谷氨酷基乙胺或5-N-乙基-谷氨酷胺化-茶氨 酸）、4-(8-甲基-9H-1 ,3-二氧杂环戊并[4,5-11][2,3]苯并二氮杂卓-5-基）-苯胺 (6￥1(152466)、1-糞基乙酷基精胺（1-酷5)^及1-(4'-氨基苯基)-3,5-二氨-7,8-二甲氧基-4H-2,3-苯并二氮杂卓-4-酬(CFM-2)。本领域技术人员已知的其它Glu財吉抗剂也可用于本 发明。关于AMPA和/或KA受体的前述括抗剂的活性可W总结如下。
[0026] *同时括抗NMDA受体
[0027] 在本发明的另一方面，提供了被配制W施用于关节(理想地由创伤损伤的关节）的 组合治疗剂，其包含AMPA和/或KA Glu財吉抗剂W及至少一种其它治疗剂，其用于预防所述 受损的关节的创伤后骨关节炎。
[00%]更理想地，所述AMPA和/或KA GluR括抗剂理想地为可注射的液体或局部制剂的形 式。
[0029] W溶液提供的本发明的治疗剂W溶液或悬液滴剂的形式分散药理学活性括抗剂。 药理学活性括抗剂位于溶液中的药物组合物，除此之外，还包含溶剂和/或稳定剂。
[0030] 为了局部应用于皮肤，可将药理学活性括抗剂制成乳霜、软膏、胶状物、粉末、溶液 或悬液等。可用于所述药物的乳霜或软膏制剂是本领域已知的常规制剂，例如，如药剂学标 准教科书(如《英国药典》）中所述。
[0031]用于关节应用的药物制剂具有确保创伤处的高药物浓度和低全身性药物暴露的 优势，因此降低了任何全身性不良事件的风险。此外，已经显示，药物的全身递送在关节处 未达到必要的活性，因此关节的谷氨酸浓度未实现期望的技术效果，从而预防关节退变和 疾病发作。
[00创在本发明的另一优选实施方案中，所述括抗剂W I-IOOmM的浓度，更理想地W2.5-25mM的浓度提供，包括其间的各0.1 mM浓度。最理想地，所述括抗剂W选自包含2.5mM、5mM、 7.5mM、lOmM、12.5mM、15mM、17.5mM、20mM、22.5mM 或25mM 的组的浓度提供。
[0033] 在本发明的另一优选实施方案中，提供了预防受损的关节的创伤后骨关节炎的方 法，所述方法包括在所述关节受损时或大约受损的时候，向所述关节施用被配制W施用于 所述关节的AMPA和/或KA GluR括抗剂。
[0034] 在本发明的优选实施方案中，所述疾病为未患有类风湿性关节炎(RA)或骨关节炎 (OA)的个体的早期或晚期的创伤后0A。
[0035] 更优选地，所述方法包括W下述剂量施用所述括抗剂：人0.03mg/kg;大鼠 IOmg/ kg; W及小鼠30mg/kg。
[0036] 本文描述的发明用于哺乳动物，特别是用于人，但是本发明也具有兽医应用，因而 用于马、猪、犬、猫科动物、有蹄类动物、灵长类动物，或者用于确实能够继续发展为退变性 关节病或肢体障碍如OA的任何承重肢体型动物。
[0037] 在本发明的任何前述方面的优选实施方案中，所述受损的关节包括但不限于任何 四肢关节，如:脚趾、踩关节、膝关节、后膝关节、臀部、手指、腕关节、肘关节或肩部，或者包 括颈和任何肋骨的任何脊柱关节。
[0038] 贯穿本说明书的描述和权利要求，词语"包括"和"包含"W及所述词语的变体，例 如"包括（comprising)"和"包括（comprises)"，意为"包括但不限于"，并且不排除其它部 分、添加物、组分、整数或步骤。贯穿本说明书的描述和权利要求，单数涵盖复数，除非上下 文另有要求。特别地，当使用不定冠词时，本说明书应被理解为预期复数W及单数，除非上 下文另有要求。
[0039] 在此将本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请W引用的方式 并入。未认可任何参考文献构成现有技术。此外，未认可任何现有技术构成本领域公知常识 的一部分。
[0040] 可W结合任何其它方面来描述本发明各方面的优选特征。
[0041] 根据下述实例，本发明的其它特征将是显而易见的。一般而言，本发明延伸至本说 明书（包括所附的权利要求和附图）中公开特征的任何创新性特征或任何创新性组合。因 此，与本发明的具体方面、实施方案或实施例一同描述的特征、整数、特性、化合物或化学部 分应被理解为适用于本文描述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与此不相容。
[0042] 此外，除非另有说明，本文公开的任何特征均可被用于相同或相似目的的可选特 征替代。
[0043] 现在将参考下述实施例和附图更详细地描述本发明，其中：
[0044] 图Ia和b .初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的膝关节的肿胀、滑膜炎症和IL-6mRNA表达。（A)与AIA大鼠相比，在21天内，在NBQX处理的大鼠中发现显著更小的膝关节肿 胀(**冲<0.OOlK(B)与AIA大鼠相比，在NBQX处理大鼠的右侧发炎膝关节中发现显著更少 的IL-SmRNA表达(冲<0.05)。（ C和D)第21天解剖的大鼠膝关节中的滑膜炎症的组织病理学 分析。（C)与AIA大鼠相比，NBQX处理的大鼠具有显著更低的炎症评分(**冲<0.001)。（0)来 自初始动物的正常滑膜衬里层(SL)为2-4层细胞厚，在其正下方具有脂肪组织(Ad),并且正 常关节面(AS)由软骨下骨(Bo)之上的一层光滑软骨(Ca)组成。AIA大鼠中出现的滑膜增生 (血管繫形成（P))、渗出物化）、浸润（I)和关节面退变，在NBQX处理的大鼠中没那么严重。 MTP，内侦順骨平台；LTP，外侧腔骨平台;MFC，内侦搬骨裸;LFC，外侧股骨裸;M，半月板。较大 关节图片上的框显示下方图片的拍摄位置。比例尺：（C-E)Imm, (F、H和J)50皿，（G、I和KHOO Jifflo
[0045] 图2a和b.初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的足迹分析。（A)在第一天，来自S个 实验组的后肢足迹轨迹。AIA大鼠通常缺少右侧足印（圈出的），而AIA+NBQX处理的大鼠显示 出与初始动物类似的步态模式。上方图显示了足旋转程度、跨步长和站立宽度的测量。（B-D)右侧发炎肢体的足旋转（B)、站立宽度(C)和跨步长(D)分析。数据W组平均值+/-SEM示 出。（B)与初始大鼠相比，AIA和AIA+NBQX处理的大鼠右侧肢体具有显著更大的足旋转程度。 在第1天和第2天，AIA大鼠不能承重，因此在图上缺少数据点。与初始相比，AIA和AIA+NBQX 处理的大鼠的站立宽度增加(C)而跨步长减小(D)。与初始相比的AIA+NBQX，冲<0.05，*冲< 0.0 Ol;与初始相比的AIA，胖<0.05，#胖<0.0 Ol。
[0046] 图3a和b.在第21天解剖的初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的关节退变和重建。 (A) 来自各处理组的代表性大鼠的外侧股骨裸的甲苯胺蓝染色。(A和B)与AIA大鼠相比，AIA +NBQX大鼠显示出不太严重的软骨和骨病理学评分(P<0.OOlK(C)当分为关节隔室时，与 AIA大鼠的股骨裸相比，AIA+NBQX大鼠显示出显著更低的关节严重性评分(P<0.001)。通过 甲苯胺蓝染色(A)显示，AIA大鼠中的大量骨重建在AIA+NBQX大鼠中显著降低(P<0.0 Ol) (A 和D(BC参数））。（0)与AIA大鼠相比，AIA+NBQX大鼠中软骨细胞外形、蛋白聚糖损失和潮标完 整性评分也更低(P<〇.01) dMTP，内侧腔骨平台；LTP，外侧腔骨平台；MFC,内侧股骨裸;LFC， 外侧股骨裸;CSI，软骨表面完整性;CA,软骨细胞外形;PL，蛋白聚糖损失;TI,潮标完整性； BC，骨变化。冲 <0.05，*冲 <0.01，**冲 <0.001。
[0047] 图4a和b. AIA和AIA+NBQX发炎的大鼠 W及对侧对照大鼠膝关节中的宏观关节病状 和骨表型mRNA表达。(A)X-射线分析显示AIA大鼠的腔骨平台和股骨裸严重糜烂(箭头）"AIA +NBQX大鼠显示出更光滑的关节表面，与对侧对照膝关节中所见的相似。（B)MRI分析验证了 X-射线中所见的糜烂(箭头），同时显示了AIA大鼠中存在严重的滑膜炎症(星号）"AIA+NBQX 膝关节中的滑膜炎症大幅减少，关节糜烂也大幅减少。FC，股骨裸;TP，腔骨平台。（C-G)与 AIA和AIA+NBQX的对侧对照膝关节相比，AIA发炎的膝关节中的组织蛋白酶K、胶原I、RANKL 和RANKL/0PG比例mRNA表达水平显著增加。（C和D)与AIA+NBQX的对侧对照相比，发炎的AIA+ NBQX膝关节中的组织蛋白酶K和胶原I mRNA表达也显著增加。（C)与AIA发炎的膝关节相比， 在AIA+NBQX发炎的膝关节中发现组织蛋白酶K mRNA表达显著减少。（F)OPG的表达没有差 异。冲<0.05，* 冲<0.01，** 冲<0.001。
[004引图5a-c.来自初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的外侧股骨裸的KAl (A)和AMPAR2 (B) 的免疫组织化学。AIA和AIA+NBQX中出现更多的表达KAl和AMPAR2(黑色箭头）的初始大 鼠的软骨细胞。在初始大鼠中，运两种蛋白都未定位于骨细胞或单核骨细胞(黑色=角形， 初始X40图片）中，然而，在AIA和AIA+NBQX大鼠中，AMPAR2在骨细胞，主要在骨重建区域中 表达(空屯、S角形，AIAX40图片）。在AIA大鼠中，单核骨细胞和骨重建区域的KAl和AMPAR2 染色很强(AIAX40图片）"AIA+NBQX处理的大鼠显示更少的骨重建，W及随后两种蛋白的着 色更浅（交叉线S角形，AIA+NBQX X 40图片）。与初始大鼠和AIA+NBQX大鼠中所见的少量染 色相比，在AIA大鼠中发现了大量的TRAP染色，显示存在更多破骨细胞(C)。连续切片显示了 AIA大鼠的TRAP阳性破骨细胞中KAl和AMPAR2的表达(空屯、箭头）。在所有动物中，滑膜衬里 层细胞都表达KAl和AMPAR2(数据未显示）。用X 40物镜显示了较小图片中的黑框。相应的阴 性对照（没有第一抗体)和兔IgG对照对于KAl和AMPAR2是阴性的（数据未显示）。比例尺:大 图，lOOwn;小图，50WI1。
[00例图6a和b.HTO手术之后，穿过关节的负荷变化后GluR和EAAT mRNA的表达。(A)在来 自OA患者的内侧(暗线)和外侧(亮线)软骨下骨骨核检测到红藻氨酸GluR mRNA的表达。（B) 在取自另一OA患者HTO手术时或术后6个月的骨核中，红藻氨酸GluR和EAATlex9skip mRNA 的表达改变，与人骨中谷氨酸信号通路的力学调节一致。
[0050] 图7.定位于人OA样本（患者MSI)的内侧腔骨平台(MTP)中部的软骨中的GluR和转 运蛋白代表性免疫组织化学。(A)AMPAR2的阳性染色出现在细胞中，并且从纤维化软骨表面 直到中部/深部区域界面观察到染色，然而在潮标附近未观察到染色。在软骨的中上部区域 染色最强。（B)从表面直到中部/深部区域界面观察到KAl阳性染色，而在潮标附近的深部区 域未观察到染色。表面软骨细胞的染色出现于细胞中。（C化AATl未定位于该患者的软骨，然 而在位于另一患者的纤 维化软骨表面的软骨细胞克隆中观察到了微弱的染色（图8)。（0) EAAT3的阳性染色出现在细胞中，并且从纤维化软骨表面直到深部区域观察到染色，然而在 潮标旁边未观察到染色。在表面附近染色最强。箭头指示潮标的位置。框指示更高倍放大图 片的拍摄位置。比例尺：X5图，500皿；X20图，100皿。
[0051] 图8.来自OA患者（不同于图7的患者（JS2))MTP中部的纤维化软骨表面附近的 EAATl表达。在软骨细胞克隆的周围观察到该阳性染色。染色出现于细胞周围。箭头指示潮 标的位置。框指示更高放大倍数的图片的拍摄位置。比例尺：X5图，500皿；XlO图，200皿； X 20 图，100 皿。
[0052] 图9.定位于人OA样本（患者MSDMTP中部的骨中的GluR和转运蛋白代表性免疫组 织化学。A、C、D、E和F都是来自MTP相同位置的图片。(A)番红-0染色W显示骨和软骨的结构。 该区域已经被重建，并且潮标(TM)几乎完全消失。还观察到了潮标破坏(TMB)。运可能是血 管侵入，但是需要CD34免疫组织化学对其进行验证。如密集表面和细胞构成所示，骨也经历 了重建(BR) "(C)AMPAR2定位于重建区域，特别是TMB区域(箭头）。该染色出现于细胞周围。 在来自骨正常区域的骨衬里层细胞(B中的小箭头）中未观察到染色。偶尔观察到骨细胞 AMPAR2染色，但是仅在小区域内（B中的大箭头）。（0化Al定位于重建的骨中（箭头），并且出 现于细胞内。在正常骨的骨衬里层细胞或骨细胞中未观察到KAl染色。化化AATl染色位于血 管周围，并且在重建的骨(大箭头)和TMB区域(小箭头)被观察到。在正常的骨中未观察到阳 性染色。（F化AAT3定位于正常的骨(数据未显示）、重建的骨(大箭头)和TMB区域(小箭头）的 骨衬里层细胞中。染色在细胞中W及细胞周围。观察到一些骨细胞染色(数据未显示）。比例 尺:A、C、D、E和尸，200皿;8，100皿。
[0053] 图10.定位于人OA样本(患者MSI)的滑膜中的GluR和转运蛋白代表性免疫组织化 学。所有图片都来自滑膜组织中的相同位置。（A)苏木精和伊红染色W显示滑膜组织的结 构。小箭头指示滑膜衬里层细胞，星号指示血管。大箭头突出了血管周围存在淋己样聚集。 该淋己样聚集结合增厚的滑膜衬里层指示了滑膜组织的炎症。（B、C、D和E)AMPAR2、KA1、 EAATl和EAAT3都定位于滑膜衬里层的滑膜细胞和血管中。比例尺:200皿。
[0054] 图11.在MNX大鼠中NBQX处理之后的膝关节肿胀。按照右侧膝关节测量值减去左侧 膝关节测量值来计算平均膝关节肿胀。在第8天，与初始大鼠（P<0.01)和用25mM NBQX处理 的MNX大鼠（P<0.05)相比，用媒介物对照处理的MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。在第 14天，与初始大鼠（P<0.05)、用12.5mM(P<0.05)和2.5mM(P<0.01)NBQX处理的大鼠相比，媒 介物对照MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。MNX大鼠对比初始大鼠，AAP<〇.01，AP< 0.05;MNX+2.5mM NBQX对比初始大鼠 ，#P < 0.05;MNX+12.5mM NBQX，*冲 < 0.01，冲 < 0.05; MNX+25mM NBQX，参P < 0.05 cMNX对比MNX+25mM NBQX，〇P < 0.05 ;MNX对比MNX+12.5mM NBQX，QP < 0.05;MNX对比2.5mM NBQX，OOP < 0.0 l。单因素 ANOVA和费舍尔事后检验。
[0055] 图12.在MNX大鼠中，NBQX处理之后进行双足平衡测试。NBQX处理之后MNX大鼠的左 后腿和右后腿之间的承重差异。在第8天，与初始大鼠（P<0.0 Ol)，12.5mM(P<0.05)、2.5mM(P <0.01)和25mM(P<0.01)NBQX处理大鼠相比，紧接着在第二次NBQX注射之后，媒介物对照处 理的MNX大鼠的左腿和右腿之间的承重具有显著更大的差异。MNX大鼠对比初始大鼠 ，A A AP< 0.001，A AP< 0.01，AP< 0.05;MNX+2.5mM NBQX对比韦刀始大鼠，##P< 0.01，#P< 0. 05 ;MNX+12.5mM NBQX对比初始大鼠，*冲 < 0 . Ol，冲 < 0.05 ;MNX+25mM NBQX对比初始大 鼠，参参P < 0.0 l，参P < 0.05cMNX对比MNX巧5mM NBQX，OOnP < 0.0 l，OnP < 0.05 ;MNX对比 MNX+12.5mM NBQX，□ P < 0.05; MNX对 2.5mM NBQX，〇〇P<0.01，〇P<0.05。单因素 ANOVA和 费舍尔事后检验。
[0056] 图13.在初带破裂的鼠中NBQX处理之后的膝关节肿胀。在第7天(P<0.05)和第21天 (P<0.001)，与媒介物对照相比，在NBQX处理的鼠中发现了显著更小的膝关节肿胀。与第0天 的测量值相比，从第2天开始，NBQX处理的鼠的膝关节肿胀未显示出显著差异。与第0天相 比，媒介物处理的鼠在各时间点具有显著更大的膝关节肿胀。*对比第0天NBQX，**对比第0 天对照，***对第0天对照，+NBQX对比对照，+++NBQX对比对照。
[0057] 图14.拍摄的左膝关节(未负荷）和右膝关节（负荷）的EAACl免疫组织化学图片。 1. ILlRO =鼠 ID。在关节内侦U ,WlOX放大率（IOOiiM比例尺)拍摄图片A和B，W40 X放大率 a00i^M比例尺)拍摄图片C和D，W及W40X放大率巧0i^M比例尺)拍摄图片E、F、G、H，（空屯、S 角形=未染色的细胞，空屯、箭头=染色的细胞）。(MTP =内侧腔骨平台，MFC =内侧股骨裸，M =半月板，S =滑膜）。在左腿和右腿上的骨衬里层细胞中（黑色=角形C和D)都存在明显染 色。在整个软骨的软骨细胞和骨细胞的骨基质之间也存在染色(空屯、箭头）。尽管EAACl是强 抗体，仍存在一些未染色的软骨细胞和骨细胞（空屯、=角形）。然而，与左腿相比，右腿滑膜 中存在大量染色。
[005引图15.拍摄的左膝关节(未负荷)和右膝关节（负荷）的红藻氨酸1免疫组织化学图 片。1.3L0R1 =鼠 ID。在关节内侧，W10 X放大率（IOOiiM比例尺)拍摄图片A和B，W40 X放大 率（IOOiiM比例尺)拍摄图片C和D，W及W40X放大率(50iiM比例尺)拍摄图片E、F、G、H(空屯、 S角形=未染色的细胞，空屯、箭头=染色的细胞）。（MTP=内侧腔骨平台，MFC=内侧股骨 裸，M=半月板，S =滑膜KKA抗体在整个软骨的软骨细胞中具有强染色（空屯、箭头(F和H))。 在未负荷的膝关节中存在一些染色的骨衬里层细胞(黑色=角形c)，在负荷的膝关节中具 有更强染色（黑色=角形D)。骨细胞中几乎不存在染色。与未负荷的对照相比，负荷膝关节 的滑膜中的更多细胞被阳性染色(A和B)。
[0059] 图16.拍摄的左膝关节(未负荷）和右膝关节（负荷）的GluR2免疫组织化学图片。 1. ILlRO =鼠 ID。在关节内侦U ,WlOX放大率（IOOiiM比例尺)拍摄图片A和B，W40 X放大率 a00i^M比例尺)拍摄图片C和D，W及W40X放大率巧0i^M比例尺)拍摄图片E、F、G、H，（空屯、S 角形=未染色的细胞，空屯、箭头=染色的细胞）。(MTP =内侧腔骨平台，MFC =内侧股骨裸，M =半月板，S =滑膜）dG1uR2抗体在整个软骨范围内的软骨细胞中具有强染色。与未负的对 照巧和G)相比，在负荷膝关节的骨衬里层细胞中的染色更强(黑色S角形D)。如化)和(G)中 所示，存在更多的骨细胞染色，但是负荷和未负荷的腿之间存在较小差异。与未负荷的膝关 节(A)相比，负荷的膝关节(B)中也可W观察到滑膜染色。
[0060] 材料和方法 [0061 ]动物.
[0062] 实施的使用动物的所有方案都符合内政部化ome Office)的指南，并且遵循国际 疼痛学会的指南。从化rlan(Oxfordshire，UK)获得雄性路易鼠（用于AIA)(~200g)，S只一 组在常规笼中饲养。大鼠自由获取食物和水，并保持12小时光/暗循环。
[0063] 关节炎诱导和治疗方案.
[0064] 对于AIA，在7天的定居周期之后，向动物右侧皮下注射用等体积的弗氏完全佐剂 (CFA;0.25mg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)Sigma)乳化的甲基化的牛血清 白蛋白（mBSA;0.5mg/ml ;Sigma，Poole，UK)。7天之后，向左侧实施第二次皮下注射所述乳 剂。第二次注射(第0天)之后14天，向15只大鼠的右膝关节实施关节内注射mBSA(5化1盐水 中含有0.5mg)，W用作AIA组。另外15只大鼠的右膝关节接受关节内注射混合有2.5mM NBQX (Tocris，化istol，UK)的0.5mg mBSA的50iil盐水。运些大鼠用作NBQX治疗组。所使用NBQX的 浓度基于调查大鼠角叉菜胶性关节炎的疼痛的研究（1)。6只对照大鼠未接受皮下或关节内 注射。
[00化]膝关节肿胀.
[0066] 利用Mi1:utoyo(RTM)数显卡尺(RS Components Ltd,No;rthants,UK)对所有大鼠的 发炎(右)和未发炎(左）的膝关节直径进行测量，W定量肿胀。在第0天(紧接着关节炎诱导 之前)测量基线读数，W及在第1、2、3、4、7、9、14和21天对AIA大鼠进行测量。每一膝关节取3 组读数，发炎的和未发炎的膝关节的平均值之间的差异W膝关节肿胀的毫米值给出。
[0067] 比-犯 LISA.
[0068] 对于AIA，在基线处(第0天）和第1、2、3、7、14W及21天，通过尾部采血从各只大鼠 收集血清。按照制造商的说明书，利用大鼠 IL-6 Quantikine"试剂盒（R&D Systems， Ab ingdon，UK)定量来自各组的6只大鼠的IL-6水平。
[0069] 组织学疾病评估.
[0070] 在第21天，炼选9只AIA大鼠、9只NBQX大鼠和3只对照大鼠，将它们的膝关节完整解 剖，并在10 %中性缓冲福尔马林溶液（Sigma)中固定2天。将膝关节于4°C，10 %的抓TA (Fisher Scientific,Lou曲borough,UK)中脱巧，在石蜡中包埋，W冠状平面进行切片（6]i m)，并用苏木精和伊红对滑膜炎症进行染色，或者用甲苯胺蓝/番红-0对软骨进行染色，W 及进行骨评分或者保存用于免疫组织化学分析。由不知情处理组的两名独立观察者对滑膜 炎症和关节退变进行评分。利用已建立的评分系统对滑膜炎症进行评分(3)。简言之，对3个 参数进行了评分:滑膜增生(血管繫形成）（0-3)、滑膜浸润(0-5) W及滑液渗出（0-3)，从而 给出每一关节的最高评分11。利用改进的Mankin评分(表1)对关节退变进行评分，所述改进 的Mankin评分由软骨表面完整性(0-6)、软骨细胞外形(0-2)、蛋白聚糖损失(0-4)、潮标完 整性(0-2)和骨变化(0-3)组成，从而给出每一关节象限(qua化ant)(内侧和外侧股骨裸(分 别为MFC和LFC) W及内侧和外侧腔骨平台（分别为MTP和LTP))的最高评分17,每一膝关节总 计最局68分。在每一膝关口中，对相距~500曲1的两个代表性切片进行关节退变评分。
[0071] 足迹评分.
[00 72] 如前所述，在第0、1、2、3、4、7、9、14和21天，通过足迹分析对后肢步行模式进行评 估(4)。将6只AIA、NBQX和对照大鼠的后爪浸入无毒颜料中，然后让其在铺有纸的走道（Im 长，IOcm宽）自由行走。每个实验日，各大鼠进行=组每边至少两个步进循环(连续的6步）。 对=个参数进行测量:肢体旋转（与行走方向平行的穿过脚垫中屯、的线与穿过第=足趾的 线之间的角度）、跨步长(同侧脚之间的距离)和站立宽度(右侧和左侧步进循环的脚之间的 距离）。
[0073] 宏观膝关节分析
[0074] 脱巧之前，通过射线照相术和MRI对整个膝关节进行检查。利用柯达FX Pro体内成 像系统（Advanced Molecular Vision ,Grantham,UK)获得9只AIA大鼠、9只NBQX大鼠和3只 对照大鼠的发炎和未发炎的膝关节射线照片，利用柯达分子成像软件第5版，利用下述参数 对图片进行分析:35kV下30秒曝光时间、4.96F-stop、71.4mm F0V、9.8mm焦平面。
[OOW]利用MRI实验中屯、（EMRIC,School of Biosciences,Cardiff University)的高空 间分辨率MRI扫描方案对6只AIA大鼠和6只NBQX大鼠的发炎和未发炎的膝关节进行成像。在 扫描之前，将每对膝关节包埋进50ml离屯、管内的1%琼脂糖(Promega)中。利用配备有发送-接收正交线圈的化址er Biospin Advance 9.4T(400mHz)MRI系统来实施MRI。扫描采集参 数如下：回声时间1250msec、重复时间24msec、视场640 X 280 X 280mm，矩阵640 X 280 X 280， W及翻转角180°。随后在化raVision 5. UBr址er)和Analyze 10.0软件(Mayo Biomedical Imaging ResourceJochester,MN,USA)中观察和分析图片。
[0076] 谷氨酸受体和IL-6信使RNA(mRNA)表达.
[0077] 在第21天，从炼选的6只AIA大鼠和6只NBQX大鼠的发炎和未发炎的膝关节中切出 半月板、骸骨、股骨干、股骨裸和腔骨平台。在HTO手术时，从患者中取出人骨核（bone core)，立即在干冰中保存，然后置于-80°C的冰箱中。如前所述，利用TRIzoK Invitrogen, 化iS1 ey，UK)提取总RNA(5)，DNA酶处理(DNA-free?，Ambion，Warrington，UK)，再纯化并通 过UV吸收进行定量。利用Superscript? III反转录酶（Invitrogen)和RNasin核糖核酸酶抑 制剂（Promega)，将用随机引物（Promega, Southampton,UK)延伸的RNA(300ng)反转录并进 行RT-PCR(S)。设计引物(Primer 3似延伸GluR、EAAT和比-6基因的内含子，从而将基因组 与互补DNA(CDNA)扩增(表2)区分开，并且将PCR产物克隆并测序W确定正确的扩增产物。将 大鼠或人的脑和脾脏CDNA分别用作GluR和化-6mRNA表达的阳性对照。通过具有优化的引物 和MgCh浓度的QRT-PCR(不含MgCh的 SYBR" Green JumpStart? Taq ReadyMix?) (Sigma) W及热循环方案（表2)，利用MX3000P PCR系统和软件（Stratagene)对GluR和比-6 表达的变化进行评估。利用Pfaff I相对定量法(6)，将各基因的标准曲线(对于GluR和IL-6 表达，分别为大鼠脑和脾脏cDNA)重复至少3次，W确保用于相对定量的引物效率(90-110% 效率W及护>0.95)。利用齡抑1。111(16'鉴定看家基因（64?0山册1?1'1、66。2和￥胖齡2)最稳定的 表达组合，W将祀基因标准化(7)。
[007引半月板横切(MNX)模型.
[0079] 我们已经建立了骨关节炎的半月板横切(MNX)大鼠模型。按照内政部许可实施手 术切除，其中切穿并取出部分内侧副初带，然后实施内侧半月板横切。在麻醉下实施手术。 然后使动物从手术中恢复。
[0080] 利用MNX模型，我们对直接向膝关节注射NBQX的效果进行了测试。有如下5组雄性 斯普拉格-杜勒大鼠，每组3只动物：
[0081 ] -MNX+无菌出0(媒介物对照）
[0082] -MNX+2.5mM NB臘
[0083] -MNX+12.5mM NB臘
[0084] -MNX+25mM NB臘 [00化]-初始大鼠
[0086] NBQX处理的大鼠接受两次关节内注射，第一次紧接在MNX手术之后，第二次在7天 之后。同时在皮下给予单次剂量的下丙诺啡W减轻手术之后的疼痛。下丙诺啡在长达12小 时内有效且不影响炎症。在同一时间，媒介物对照大鼠接受W相同方式递送的无菌出0注 射。在21天内，在第0、1、2、3、7、8、10、14和21天，对重量、膝关节肿胀(数显卡尺)^及双足平 衡（incapacitance KLinton双足平衡测痛仪)进行测量。所述Linton双足平衡测痛仪测量 将大鼠固定在透明有机玻璃盒时施加于每一后腿的重量。然后可W计算左腿和右腿之间的 承重差异。在第21天，使所有大鼠安乐死，并将膝关节固定于福尔马林中用于组织学研究。
[0087] 创伤后膝关节骨关节炎的无创模型
[0088] 我们已经建立了由初带破裂导致的创伤后膝关节退变的无创小鼠模型。该模型的 无创性质意为大型手术影响疼痛、炎症而不会掩盖关节炎发作的早期变化，并且不需要假 手术对照。
[0089] 利用定制的杯子支持弯曲的膝关节，向12周龄巧7B16小鼠 （n = 10)的右膝关节施 加负荷（12N，4Hz，正弦波；封成杜oForce? 3200，BOSE，USA)。在负荷周期期间，施加的压缩 力释放之后位移的持续增加显示在1-6个循环之间发生初带破裂。左膝关节用作未负荷的 对照。初带破裂之后立即向小鼠右膝关节给予关节内注射20mM NBQX，而对照小鼠接受关节 内注射无菌此〇(媒介物对照）。同时在皮下给予单次剂量的下丙诺啡，W减轻负荷之后长达 12小时的疼痛。
[0090] 第一周每天都进行贩行评分，然后在接下来几周每隔几天进行贩行评分，W对动 物的幸福和疼痛缓解的潜在需求进行评估。在第〇、1、2、3、7、16和21天，利用数显卡尺对膝 关节肿胀进行测量。在第21天，使所有的小鼠安乐死，并将膝关节固定于福尔马林中用于组 织学研究。
[0091] 免疫组织化学 [009。动物操作:
[0093]利用红藻氨酸抗体(抗KAl，1:400稀释）、AMPA受体-2抗体(抗离子型谷氨酸受体- 2，I: IOO，都来自 Abeam，Cambr idge，UK)、化AST抗体（GLAST11-S，I: IOO) W 及EAACI抗体 化AACl 1-A，1: 200,都来自 Al地a Dia即OStiC International ,Texas ,USA)，逐次在石蜡膝 关节切片（9个AIA膝关节、9个NBQX膝关节和6个对照膝关节）中对GluR和转运蛋白进行定 位。同时在6只MNX大鼠和6只初始大鼠中对AMPAR2进行定位。将处理用于组织学研究的切片 脱蜡，并在抗原修复之前，利用Img/ml膜蛋白酶(Sigma)于37°C复水20分钟。将内源性过氧 化物酶活性用0.3%的过氧化氨（Sigma)阻断30分钟，然后在1XTBS/0.1%吐溫中洗涂S 次，每次15分钟。用10%的正常封闭血清(Sigma)处理切片1小时，用第一抗体在4°C解育过 夜，然后在1 X TBS/0.1 %吐溫中洗S次。按照制造商的说明，利用兔VECTASTAIN ELITE ABC 辣根过氧化物酶试剂盒（Vector Laboratories,Peterborough,UK)对免疫染色进行检测。 利用儀增强二氨基联苯胺（DAB) (Vector Laboratories)使切片显色，在Mayer ' S苏木精 (Fisher Scientif ic)中复染，用自来水洗涂，脱水，在二甲苯中清洗，并封片。在Leica DMRB显微镜下观察玻片。除非另外说明，所有的解育都在室溫进行。
[0094] 人体操作:
[00%]利用与上述动物操作所详述的相同的抗体和技术，对来自=个人骨关节炎内侧腔 骨平台样本的连续切片进行1(41、41?41?2、6441'1(61^\51'巧蛇44了3化4401)免疫染色。
[0096] 统计分析.
[0097] 在参数(单因素 ANOVA与费舍尔(Fisher' S)事后检验或I'ukey-Kramer事后检验)或 非参数(克鲁斯卡尔-沃利斯化ruskal-Wallis)与曼-惠特尼(Mann-怖itney)事后检验）统 计检验之前，利用Minitab 16软件对数据进行正态分布和方差齐性检验。所有数据都W平 均值±平均值的标准误(SEM)示出。
[009引结果
[0099] 通过NB臘处理降低了滑膜炎症和IL-6表达
[0100] 在诱导之后的最初几天，对AIA大鼠的膝关节肿胀的评估显示了严重的极性炎症 应答（图1A)。在AIA大鼠中，第一天平均肿胀为4.4mm(±0.14mm)，然而在NBQX大鼠中，该水 平显著更低，仅为2.95mm(±0.23mm)，表明NBQX处理之后峰值膝关节肿胀降低33% (P< 0.001，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼-惠特尼事后检验）。在整个21天实验的各时间点，都观 察到了 NBQX处理大鼠的膝关节肿胀显著减弱(P<0.001，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼-惠特 尼事后检验）。
[0101] AIA大鼠的血清IL-6浓度降至IL-SQuant化ine?试剂盒的最小可检测剂量(2lpg/ ml)W下，因此使其无法定量。
[0102] 从第21天对AIA大鼠关节组织中IL-SmRNA表达的研究显示，化-6在股骨裸、股骨 干、腔骨平台和骸骨中的表达水平太低不能被定量（尽管可检测到）。与AIA大鼠相比，在 NBQX处理大鼠的发炎膝关节的半月板中，比-6的相对表达水平显著更低(P<0.05,克鲁斯卡 尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验）（图1B)。尽管不显著，但是在左侧未发炎的膝关节中 也观察到了相同的模式。
[0103] 对在第21天切除的AIA、NBQX和对照小鼠的膝关节滑膜炎症进行的组织学检查显 示，与NBQX处理的大鼠相比，AIA大鼠的滑膜炎症评分更严重(P<0.0 Ol，单因素 ANOVA与费舍 尔事后检验）（图1C)。来自对照动物的正常滑膜衬里层为2-4层细胞厚，在其正下方具有脂 肪组织，并且正常的关节面由软骨下骨之上的一层光滑的软骨组成（图1D)。在AIA大鼠中存 在滑膜增生(血管繫形成）、渗出物、浸润和关节面退变（图ID)。运在NBQX处理的大鼠中明显 不那么严重（图1D)。
[0104] NB臘处理恢复承重
[0105] 紧接着诱导关节炎之后的足迹分析显示了 AIA与NBQX处理的大鼠之间的显著差 异。虽然在第1天和第2天，AIA大鼠没有可测量的足迹（图2A和2B)，但是运些天NBQX大鼠能 够承重，展现出可与对照大鼠中所见的那些比较的清晰足迹。来自足迹的步态参数分析显 示AIA和NBQX处理的大鼠的行走异常，与对照大鼠相比时，足旋转程度（图2B，P<0.05)和站 立宽度（图2C，P<0.05)显著更大，而跨步长（图2D，P<0.05)显著更短（单因素 ANOVA和化k巧-Kramer事后检验）。在第14天，AIA和NBQX组的跨步 长恢复正常，并且在第21天，所有组的站 立宽度都是正常的。
[0106] 通过NB臘处理降低了膝关节退变
[0107] 与AIA大鼠相比，关节退变的组织学评估显示NBQX处理的大鼠中显著更少的软骨 和骨病状（图3)。AIA大鼠显示关节软骨下的软骨损失W及大量的骨变化（图3A)。NBQX处理 的大鼠显示与对照动物中所见的相类似的软骨和骨表型，在外边缘具有较少重建（图3A)。 与AIA大鼠相比，NBQX处理大鼠的平均关节退变严重性评分显著降低(P<0.001，用克鲁斯卡 尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验，图3B)。将关节分为4个隔室(MTP、LTP、MFC和LFC)，与 AIA大鼠相比，NBQX处理大鼠的MFC和LFC中显示出显著更少的关节退变(分别为P<0.〇dPP< 0.05，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验）（图3C)。将严重性评分分为5种参数， 与AIA相比，显示尽管NBQX处理显著降低了软骨细胞外形(P<0.05 )、蛋白聚糖损失(P<0.01) 和潮标完整性(P<〇.01)的评分，但是在骨变化中观察到了最大差异(P<〇.OOlK全部都为克 鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验）（图3D)。
[0108] 在第21天，X射线和MRI显示AIA大鼠的关节糜烂和滑膜炎症（图4) dNBQX处理大鼠 的X射线中观察到了较少的关节糜烂，其显示出更圆的光滑关节面，与对照动物的关节面更 相似（图4A)。在第21天，AIA大鼠的MRI验证了 X射线中所见的严重糜烂，同时显示出大量的 滑膜炎症（图4B)"MRI显示，NBQX处理极大地降低了滑膜炎症W及关节糜烂(图4B)。
[0109] 通过NB臘处理改变了GluR的表达
[0110] KAl和AMPAR2蛋白在所有大鼠的软骨细胞和滑膜衬里层细胞中都表达(未显示）， 并且在AIA的重建的骨中富集(图5)。在AIA和AIA+NBQX的重建区域中，骨中的骨细胞和其它 单核细胞表达AMPAR2(图5B) dNBQX降低了重建的程度，伴随着Glu郎日性细胞的明显减少（图 5)。在初始动物中，没有AMPAR2和KAl定位于单核骨细胞中（图5) dAIA中富集的TRAP阳性破 骨细胞在连续切片中共表达KAl和AMPAR2，并且在初始大鼠和AIA+NBQX大鼠中没那么大量 (图 5)。
[0111] 响应力学变化的GluR和EAAT表达
[0112] KAl的表达在腔骨平台的内侧和外侧之间有所不同，其中在内侧存在表达，在外侧 不存在表达（图6A)。在不同的HTO患者中，HTO手术之后，EAATlex9skip的表达丧失，而KAl的 表达开启（图6B)。
[0113] GluR和转运蛋白在来自S个人OA样本的内侧腔骨平台(MTP)中部的软骨、骨和滑 膜中的定位
[0114] 在人OA软骨中观察到离子型GluR和转运蛋白的阳性染色:从纤维化软骨表面直到 中部/深部区域观察到了AMPAR2、EAAT3和KAl。在纤维化的软骨表面附近观察到了EAATl的 表达。此夕1'，八1口八尺2、1(八1、6八八1'巧此八八13定位于人0八组织的骨重建区域。此夕1'，八1口八尺2、1(八1、 EAATl和EAAT3都定位于滑膜衬里层的滑膜细胞W及人OA组织的血管中。取自不同物种的组 织的关节滑液中Glu浓度的比较示于表3中。
[0115] GluR的括抗作用减弱了关节创伤之后的膝关节肿胀和病状
[0116] 利用MNX模型，经过手术的大鼠在手术之后立即接受关节内注射不同浓度的NBQX， 并在7天之后进行第二次注射。在一些鼠中实施无菌水注射W用作对照。在21天内，在第0、 1、 2、3、7、8、10、14和21天，对重量、膝关节肿胀(数显卡尺)和双足平衡化inton双足平衡测 痛仪)进行测量。所有大鼠在整个实验中不断增加重量。NBQX对膝关节肿胀的效果令人鼓 舞，特别是在第二次NBQX注射之后第8天和第14天（图11)。在第8天，与初始大鼠(P<0.01)和 用25mM NBQX处理的MNX大鼠（P<0.05)相比，媒介物对照处理的MNX大鼠具有显著更大的膝 关节肿胀。在第14天，与初始大鼠。<0.05)，12.51111。<0.05)和2.5111]\1。<0.01作89乂处理的 大鼠相比，媒介物对照MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。该数据支持我们先前在抗原诱 导的关节炎(AIA)大鼠模型中的结果，并且表明NBQX对丽X手术之后的膝关节具有抗炎效 果。
[0117] 双足平衡测试显示，在第8天，紧接着第二次NBQX注射之后，与初始大鼠（P< 0.001)，12.51111。<0.05)、2.5111]\1。<0.01)和251111。<0.01)相比，媒介物对照处理的]\1版大鼠 的左腿和右腿之间的承重具有显著更大的差异（图12)。该数据支持我们先前的结果:在紧 接着注射之后的几天中，NBQX处理提供了疼痛缓解。
[0118] 利用我们的无创初带破裂模型，在右膝关节给予创伤后的鼠关节内注射20mM NBQX。左膝关节用作未负荷对照。在一些鼠中实施无菌水注射W用作媒介物对照。在第0、1、 2、 3、7、16和21天，利用数显卡尺对膝关节肿胀进行测量。所有鼠在整个实验中不断增加重 量。贩行评分未严重到足W批准疼痛缓解的额外剂量。NBQX对膝关节肿胀的效果令人鼓舞， 伴随着在第7天(P<0.05)和第21天(P<0.001)，与媒介物对照相比，NBQX处理的鼠中显著更 小的膝关节肿胀（图13)。此外，从第2天起，与第0天的测量值相比，NBQX处理鼠的膝关节肿 胀未显示出显著差异。形成强烈对比的是，与第0天相比，媒介物处理的小鼠在每一时间点 具有显著更大的膝关节肿胀，表明在没有NBQX的情况下，膝关节直径从未恢复至对照值。
[0119] 关节创伤之后的GluR和EAAT表达.
[0120] 使6只鼠的右膝关节负荷9N的最大负荷0.05秒，持续40个循环，其中各负荷循环之 间的基线为2N。负荷循环的起落持续0.025秒。该周计划有3个负荷事件，其中在第二次负荷 时ACL破裂(因此不需要第3次负载）。在第二次负荷事件之后两天(A化破裂之后)炼选鼠，并 切除膝关节。将6只小鼠的左关节用作未负荷对照。
[01別]与未负荷对照相比，EAACUEAAT3K图14)、1(41(图15)和61111?2(41口41?2)的免疫组 织化学在负荷膝关节的滑膜上显示更强的染色（图16)。染色在两个膝关节的整个关节组织 中都存在，但是通常在负荷膝关节特别是骨中更强。
[0122] 讨论
[0123] 我们的数据显示，在关节损伤时和/或其后不久，用AMPA和/或KA Glu財吉抗剂处理 有问题的关节，降低了与创伤后OA的发作或发展相关的退变病状、炎症和疼痛。
[0124] 参考文献
[0125] 前言
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[0147] 表1.关节退变评分系统 [014 引
[0149] 表2.用于QRT-PCR的GIuR、EAAT和IL6的引物和循环条件
[0150]
[0152]表3.患病或未患病的不同物种中比较关节谷氨酸的浓度
【主权项】
1.AMPA和/或KAGluR拮抗剂，其被配制以施用于由创伤受损的关节，其用于在受损的 关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。2. 如权利要求1所述的用于预防或治疗创伤后骨关节炎(0A)的AMPA和/或KAGluR拮抗 剂，其特征在于，所述疾病为早期(退变性关节病)或晚期(晚期0A)的创伤后0A。3. 如权利要求1或2所述的用于预防或治疗创伤后骨关节炎(0A)的AMPA和/或KAGluR 拮抗剂，其特征在于，所述关节未患有骨关节炎(0A)或类风湿性关节炎(RA)。4. 如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮抗 剂，其特征在于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)、6，7-二硝基喹 喔啉-2,3-二酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2,3_二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯 并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸）、4-(8_ 甲基-9Η-1，3-二氧杂环戊并[4，5-h] [2，3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(GYKI52466)、1-萘基 乙酰基精胺（1_NAS)、以及1_(4'_氨基苯基)_3，5-二氢-7，8_二甲氧基-4H-2，3_苯并二氮杂 卓-4-酮(CFM-2)。5. 如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA拮抗剂，其特征在 于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)、6，7-二硝基喹喔啉-2，3-二 酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[幻喹喔 啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸）、4-(8_甲基-9H-1， 3_二氧杂环戊并[4,5-11][2,3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(6￥1(152466)、1-萘基乙基精胺 (1-NAS)、以及1-(4 ' -氨基苯基）-3，5-二氢-7，8-二甲氧基-4Η-2，3-苯并二氮杂卓-4-酮 (CFM-2)。6. 如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0Α的KAGluR拮抗剂，其特征 在于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)、6，7-二硝基喹喔啉-2，3-二酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2，3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔 啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸）、以及4-(8-甲基-9H-1，3-二氧杂环戊并[4，5-h] [2，3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(GYKI52466)。7. 如权利要求1-6中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮抗 剂，其中所述拮抗剂以1 -1OOmM的浓度施用。8. 如权利要求7所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮抗剂，其中所 述浓度为2.5-25mM。9. 如权利要求8所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮抗剂，其中所 述浓度选自：2·5mM、5mM、7·5mM、10mM、12·5mM、15mM17·5mM、20mM、22·5mM或25mM〇10. 如权利要求1-9中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KAGluR拮 抗剂，其中所述AMPA和/或KAGluR拮抗剂为可注射的液体或局部制剂的形式。11. 如权利要求1-10中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮 抗剂，其中所述AMPA和/或KAGluR拮抗剂为溶液或悬液形式。12. 如权利要求1-11中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮 抗剂，其中所述损伤选自：关节软骨表面损伤、骨折、韧带松弛或缺陷、韧带和/或半月板和/ 或肌腱破裂、关节囊和滑膜损伤、髌骨功能障碍、以及关节软骨的压迫和/或剪切损伤。13. 包含权利要求1-12中任一项所述的AMPA和/或KAGluR拮抗剂的药物组合物，其中 所述药理活性拮抗剂在溶液中，所述组合物被配制以施用于关节，并包含溶剂和/或稳定 剂。14. 包含权利要求1-12中任一项所述的AMPA和/或KAGluR拮抗剂的药物组合物，其中 所述药物组合物为乳霜、软膏、胶状物或粉末形式。15. 如权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述组合物被配制以施用于哺乳动物。16. 如权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物被配制以施用于人、马、猪、犬、 猫科动物、有蹄类动物、灵长类动物或任何承重肢体型哺乳动物。17. 如权利要求1-12中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮 抗剂，或者如权利要求13-16中任一项所述的药物组合物，其中所述受损的关节选自：脚趾、 踝关节、膝关节、后膝关节、臀部、手指、腕关节、肘关节或肩部、脊柱关节以及肋骨。18. 包含AMPA和/或KAGluR拮抗剂以及至少一种其它治疗剂的组合治疗剂，其被配制 以施用于由创伤受损的关节，其用于预防所述受损的关节的创伤后骨关节炎。19. 如权利要求18所述的组合治疗剂，其中所述组合治疗剂包含权利要求1-12中任一 项所述的AMPA和/或KAGluR拮抗剂，以及可用于预防或治疗创伤后0A的至少一种其它治疗 剂。20. 预防受损的关节的创伤后骨关节炎的方法，其包括在所述关节受损时或大约受损 的时候，向个体施用被配制以施用于所述关节的AMPA和/或KAGluR拮抗剂。21. 如权利要求19所述的方法，其中所述AMPA和/或KAG1uR拮抗剂如权利要求1 -12中 任一项所述。22. 如权利要求20或21所述的方法，其中所述疾病为早期(退变性关节病)或晚期（晚期 OA)的创伤后骨关节炎(OA)。23. 如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述AMPA和/或KAGluR拮抗剂为权利 要求18或19所述的组合治疗剂的形式。24. 如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂在人中以下述剂量施用： 0 · 03mg/kg或约 0 · 03mg/kg。25. 基本如本文所述的权利要求1-12和17所述的用途，权利要求13-16所述的药物组合 物，权利要求18-19所述的组合治疗剂，或者权利要求20-24所述的方法。 26.AMPA和/或KAGluR拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于向由创伤受损的关 节施用以在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。
【专利摘要】本申请涉及利用抑制AMPA和KA谷氨酸受体(GluR)中的一种或两种的化合物预防早期或晚期的创伤后骨关节炎的治疗剂和药物组合物，其用途以及方法。
【IPC分类】A61K9/08, A61K45/06, A61K31/498
【公开号】CN105491998
【申请号】CN201480047577
【发明人】黛博·梅森, 克利奥·邦尼特
【申请人】加的夫大学学院咨询有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月3日
【公告号】EP3016636A1, WO2015001349A1
【专利说明】预防骨关节炎的方法和化合物
[0001] 本发明设及利用抑制(a-氨基-3-?基-5-甲基-4-异恶挫丙酸KAMPA)和红藻氨酸 化A)谷氨酸受体(GluRs)中的一种或两种的化合物，预防早期或晚期的创伤后骨关节炎的 治疗剂和药物组合物，其用途W及方法。
[0002] 骨关节炎（OA)为设及关节软骨和骨，特别是软骨下骨的机械异常的退变性关节 病，如关节退变。骨改变通常在软骨丧失之前。它可W由多种因素引起，包括遗传、发育、代 谢和力学。在后面的情况下，急性创伤如在个体生命的某一阶段的关节或肢体的损伤可促 成后期的病况，在一些情况下相当迟，即5-15年后。的确，在NHS每年为矫正半月板撕裂实施 的95，000例前交叉初带重建(A化)手术和38,000例关节镜检查中，受治疗的患者有50%在 5-15年后发展为早期0A。运些患者中的一部分继续需要全关节置换治疗，运是极其常见且 昂贵的方案，经受膝关节置换手术的患者有高达20%未成功。类似地，膝关节半月板撕裂和 任何关节中的肌腫/初带/关节盘损伤易于关节退变，在多年之后最终导致骨关节炎。
[0003] OA的症状可W包括关节疼痛，导致活动丧失、压痛、僵硬、锁闭、W及有时积液。患 者还可能经受肌肉疫李和肌腫收缩。偶尔地，关节还可能充满液体。由于活动减弱，邻近的 肌肉可能萎缩，并且初带可能变得更加松弛。
[0004] 尽管体内的任何关节都可能被影响，但是OA通常受累手、脚、脊柱和较大的负重关 节，如髓和膝关节。随着OA的发展，受累关节形状改变、僵硬且疼痛，并且通常在轻微使用时 感觉稍好，但是过度或长期使用时感觉更差，因而将该疾病与类风湿性关节炎区分开。此 夕h并且更深远地，基于RA是自身免疫性的全身性疾病，而OA不设及全身性的免疫应答且是 局部性的，OA可W与RA区分开来。
[0005] 在较小的关节（如手指）中，可能形成被称为希伯登氏结节(远端指间关节处)和/ 或布夏尔氏结节(近端指间关节处）的硬骨肿大，并且尽管它们不一定疼痛，但是明显限制 了手指的活动。位于脚趾的OA导致拇囊炎的形成，使其变红或肿胀。一些人在其经受任何疼 痛之前，注意到了运些身体变化。
[0006] 在美国，OA是关节炎的最常见形式，并且是慢性残疾的主要原因。它在美国影响了 近2700万人，在英国影响了约8百万人。膝关节OA是最常见的肌肉骨骼疾病之一，影响了近2 亿5千1百万人。在运些人群中，特别值得关注的是超过30%的患有急性前交叉初带(A化)或 半月板损伤的患者在损伤后5年内发展为放射学(radiographic)膝关节0A。关节创伤可能 导致一系列急性损伤，包括骨软骨骨折、初带或半月板撕裂W及关节软骨损伤。运通常与关 节内出血有关，并且引起创伤后关节炎症。尽管解决了急性症状并且可W手术修复一些损 伤，但是关节损伤引起了软骨、骨和其它关节组织中的慢性重建过程，运引发了合成代谢和 分解代谢过程之间的炎性和代谢失衡，组织重建和生物力学变化。运些生物力学和生物化 学变化之间的相互作用将进程引导退变性关节病，运最终导致关节衰退。
[0007] 因此，存在暗示损伤具有发展为关节退变和OA的可能性的有力证据。确实，运导致 了被称为创伤后骨关节炎(PTOA)的OA疾病的子集的定义，即多年之后可能导致OA的损伤继 发性退变性关节病。在年轻人和活跃个体如参与运动的那些个体中特别普遍，在运动期间 会增加持续此类损伤的风险。因此，其可被定义为损伤之前正常关节存在，损伤时结构受损 且该关节未受全身性疾病损坏(Pickering, 1984)。关节创伤受累全部关节组织，导致可能 发展为关节退变并随后发展为OA的生理学、生物力学和生物化学变化。
[0008] 治疗通常包括运动、生活方式改变和镇痛药的组合。如果疼痛使人虚弱，则可能需 要关节置换手术W改善生活质量。关节损伤后有时推荐手术干预W矫正异常的关节生物力 学，降低继发性损伤的风险，并理想地降低OA的风险。不幸地，手术干预(例如ACL重建、半月 板切除术、半月板置换)未恢复正常的关节生物力学或预防膝关节0A。因此，重要的是了解 运些患者中的哪些将发展为早发性膝关节OAW及膝关节OA的运种发作是否可W预防或延 迟。同时，疼痛管理和手术是当前的选择，目前没有解决创伤后关节炎及其预防的被批准的 疗法。对于关节创伤后发展为OA的风险有清晰的认识，因此明显且迫切需要开发并实施预 防创伤后软骨退变的方案。
[0009] 氨基酸谷氨酸是脊椎动物神经系统中主要的神经递质。然而，与传入和交感神经 终端一样，谷氨酸由滑膜关节中的众多细胞释放，所述细胞包括巨隧细胞、淋己细胞、滑膜 细胞、成骨细胞和软骨细胞。谷氨酸通过与各种GluR结合而发挥其生理作用，所述GluR被分 为功能上不同的两类:离子型QGluR)和促代谢型(mGluR)。
[0010] iGluR担当谷氨酸口控离子通道，基于其药理学被分为S种不同的亚群:N-甲基-D-天冬氨酸（匪DA)、a-氨基-3-径基-5-甲基-4-异恶挫丙酸（AMPA) W及红藻氨酸化A)。 mGluR是G蛋白偶联的受体，根据其结构和生理活性可分为八种不同的亚型(mGluRl-8)。谷 氨酸能信号通路由五种高亲和力的化+依赖型兴奋性氨基酸转运蛋白化AAT)调节:EAATl/ GLAST、EAAT2/GLT-1、EAAT3/EAAC1、EAAT4 W及EAAT5。在滑膜关节中，功能性GluR和EAAT由 滑膜细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腫细胞、巨隧细胞W及淋己细胞表达。
[0011] 我们最近的数据显示，人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)表达调节化S释放IL-6和 proMMP2的功能性GluR(27)。
[0012] 已知IL-6的浓度在来自阳性RA患者的滑膜组织和滑液中显著升高，并与放射学关 节破坏相关。化-6通过诱导血管生成、炎性细胞的浸润和滑膜增生促进滑膜炎，通过诱导破 骨细胞形成引起骨吸收，并且通过刺激滑膜细胞和软骨细胞的基质金属蛋白酶(MMP)表达 弓旭软骨退变。RA中升高的化-6水平主要由化S产生，其中巨隧细胞和软骨细胞产生显著但 更低的水平。比-6^/^]、鼠研究突出了 IL-6在RA的病理学中的重要作用，其中关节炎的严重 性降低和发作延迟是主要结果。如不能清除细菌感染并进行有效的T细胞记忆应答的IL-6 缺陷小鼠所示，用抗IL-6受体抑制剂托珠单抗治疗RA患者显著改善了滑膜炎和放射学变 化，然而，运些显著益处通常伴随着对宿主免疫力的负面影响，如在IL-6缺陷的小鼠中所 见，其不能清除细菌感染且增加有效T细胞记忆应答。
[001引我们最近公开的数据(Flood等2007)显示，匪DA受体的激活降低了人RA化S的 pro匪P-2的释放。非竞争性NMDA財吉抗剂MK801显著增加了RA中的pro匪P-2的释放，但在正 常的FLS中不能如此。然而，竞争性NMDAR括抗剂D-AP5W及AMPA/KA受体括抗剂CFM-2和NBQX 不影响FLS中MMP-2的表达。该项工作显示，RA FLS中NMDA GluR的激活依赖于括抗剂的性 质。
[0014]此外，高谷氨酸浓度通过KA受体的激活增加了RA FLS中的IL-6的释放，并且运受 AMPA/KA受体括抗剂NBQX而不受AMPA受体括抗剂CFM-2或者不受NMDA受体抑制剂MK801或D-AP5的抑制。运显示对IL-6的作用由红藻氨酸受体而非AMPA或NMDA受体介导。
[0015] 我们意外发现，当没有OA疾病的实证时，通过在损伤时或大约损伤时向关节施用， 特别是AMPA和KA(AMPA/KA)GluR抑制剂的子集在创伤后发展为OA的预防性防止中具有治疗 益处。在希望不受任何生物学解释限制的情况下，我们认为损伤时与疾病相关的滑液谷氨 酸浓度的增加激活了AMPA/KA GluR,反过来导致骨重建、力学响应、炎症、疼痛W及不期望 的退变。因此，在损伤时或不久之后，可W治疗性地祀向此类GluR, W预防导致充分发展期 或晚期OA的中期至长期退变性关节病的后续发展。
[0016] 在该项工作之前，在关节炎，更具体而言在OA的情况中，GluR括抗剂已经被全身性 独占使用，W通过药物对神经传递的作用减轻患有确确诊或晚期OA疾病的患者的疼痛和/ 或炎症性疼痛。在退变过程中，与OA相关的疼痛通常很晚才出现，运是为什么OA随着损伤之 后症状出现必定很难治疗。事实上，疼痛的存在是关节炎的临床诊断的一部分。运意味着当 给予药物治疗W预防OA发作/发展时，不会给予药物治疗W阻止疼痛。事实上，按照定义，处 于发展OA风险(例如A化断裂、半月板撕裂、肩袖损伤等之后）的患者不会患有关节炎（即X射 线下关节空间狭窄）。迄今为止的所有工作都集中于对显示疾病的患者的疼痛进行治疗，甚 至利用全身给药，因为运些药物的主要效果是通过其对脑和脊髓的作用。例如，Martel-Pelletier(2012)报道了KA受体括抗剂在伤害性感受中发挥作用，W及对离子型谷氨酸受 体iGluR5括抗剂LY545694治疗膝关节OA的中枢神经系统疼痛进行了测试，但未作为改变疾 病的OA药物或在处于发展OA的风险的患者中进行测试。此外，Szekely等（1997)报道了口服 施用AMPA/KA受体的非竞争性括抗剂GYKI 52466在晒齿动物关节炎（通过向右后爪注射 0.1ml弗氏佐剂诱导）中对于慢性疾病的第二阶段的右爪的初期水肿或左爪的继发性泛发 性炎症诱导的肿胀无作用，但是减弱了痛觉过敏和体重减轻，显示了对慢性疼痛的中屯、效 应用。该研究显示出没有疾病改变作用，且设及中枢性疼痛机制。
[0017]相反，測1'旧经确定：当没有关节OA的证据时，iv化创伤时或之后不久，向iii)受 损的关节i)直接或祀向递送ii)Glu財吉抗剂的特定子集，显著预防或降低了发展早期0A，即 导致晚期OA的退变性关节病的可能性（即括抗剂的作用是预防性的而非治疗性的）。因此， 本发明对于预防作为关节损伤的结果而发生的OA疾病具有极好的潜力。一旦OA疾病被确 诊，则本发明与治疗或逆转OA疾病无关。
【发明内容】
[0018] 在本发明的第一方面，提供了被配制W施用于关节的AMPA和/或KA Glu財吉抗剂， 其用于在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。
[0019] 在本发明的可选的第一方面，提供了AMPA和/或KA GluR括抗剂在制备药物中的用 途，所述药物用于向关节施用W在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后 骨关节炎的可能性。
[0020] 最优选地，所述关节为由创伤损伤的关节。
[0021] 本文提及的创伤设及导致改变的关节和组织生物力学或炎症、损害关节承受机械 应力的能力的任何事件。例如，运包括但不限于可形成直接的宏观损伤和微观损伤的对关 节的强力机械冲击，其可能损害组织如何分散关节负荷并引发组织退变。此外或可选地，包 括关节挫伤、脱白，肌腫和初带损伤的低能损伤也可能引起类似的生物力学变化并导致病 状。
[0022] 通常但不完全，运包括但不限于:关节软骨表面损伤、骨折、初带和/或肌腫松弛或 缺陷、初带和/或半月板和/或肌腫破裂、关节囊和滑膜损伤、骸骨功能障碍、关节软骨的压 迫和/或剪切损伤。
[0023] 在本发明的优选实施方案中，所述疾病为未患有类风湿性关节炎(RA)或OA的个体 的早期或晚期的创伤后骨关节炎(OA)。
[0024] 适用于本发明的AMPA和/或KA GluR括抗剂包括但不限于:6-氯基-7-硝基哇喔嘟-2，3-二酬(CNQX)、6，7-二硝基哇喔嘟-2，3-二酬(DNQX)、NS102-选择性红藻氨酸受体而非 AMPA受体、犬尿哇嘟酸内源性配体和替占帕奈( Tezampanel) ;2,3-二径基-6-硝基-7-氨横 酷基-苯并[f]哇喔嘟-2,3-二酬(NBQX)和丫-谷氨酷基乙胺或5-N-乙基-谷氨酷胺化-茶氨 酸）。特别优选的括抗剂包括:2，3-二径基-6-硝基-7-氨横酷基-苯并[f]哇喔嘟-2，3-二酬 (NBQX)、6-氯基-7-硝基哇喔嘟-2，3-二酬(CNQX)、替占帕奈和2，3-二径基-6-硝基-7-氨横 酷基-苯并[f]哇喔嘟-2,3-二酬(NBQX)和丫-谷氨酷基乙胺或5-N-乙基-谷氨酷胺化-茶氨 酸）、4-(8-甲基-9H-1 ,3-二氧杂环戊并[4,5-11][2,3]苯并二氮杂卓-5-基）-苯胺 (6￥1(152466)、1-糞基乙酷基精胺（1-酷5)^及1-(4'-氨基苯基)-3,5-二氨-7,8-二甲氧基-4H-2,3-苯并二氮杂卓-4-酬(CFM-2)。本领域技术人员已知的其它Glu財吉抗剂也可用于本 发明。关于AMPA和/或KA受体的前述括抗剂的活性可W总结如下。
[0026] *同时括抗NMDA受体
[0027] 在本发明的另一方面，提供了被配制W施用于关节(理想地由创伤损伤的关节）的 组合治疗剂，其包含AMPA和/或KA Glu財吉抗剂W及至少一种其它治疗剂，其用于预防所述 受损的关节的创伤后骨关节炎。
[00%]更理想地，所述AMPA和/或KA GluR括抗剂理想地为可注射的液体或局部制剂的形 式。
[0029] W溶液提供的本发明的治疗剂W溶液或悬液滴剂的形式分散药理学活性括抗剂。 药理学活性括抗剂位于溶液中的药物组合物，除此之外，还包含溶剂和/或稳定剂。
[0030] 为了局部应用于皮肤，可将药理学活性括抗剂制成乳霜、软膏、胶状物、粉末、溶液 或悬液等。可用于所述药物的乳霜或软膏制剂是本领域已知的常规制剂，例如，如药剂学标 准教科书(如《英国药典》）中所述。
[0031]用于关节应用的药物制剂具有确保创伤处的高药物浓度和低全身性药物暴露的 优势，因此降低了任何全身性不良事件的风险。此外，已经显示，药物的全身递送在关节处 未达到必要的活性，因此关节的谷氨酸浓度未实现期望的技术效果，从而预防关节退变和 疾病发作。
[00创在本发明的另一优选实施方案中，所述括抗剂W I-IOOmM的浓度，更理想地W2.5-25mM的浓度提供，包括其间的各0.1 mM浓度。最理想地，所述括抗剂W选自包含2.5mM、5mM、 7.5mM、lOmM、12.5mM、15mM、17.5mM、20mM、22.5mM 或25mM 的组的浓度提供。
[0033] 在本发明的另一优选实施方案中，提供了预防受损的关节的创伤后骨关节炎的方 法，所述方法包括在所述关节受损时或大约受损的时候，向所述关节施用被配制W施用于 所述关节的AMPA和/或KA GluR括抗剂。
[0034] 在本发明的优选实施方案中，所述疾病为未患有类风湿性关节炎(RA)或骨关节炎 (OA)的个体的早期或晚期的创伤后0A。
[0035] 更优选地，所述方法包括W下述剂量施用所述括抗剂：人0.03mg/kg;大鼠 IOmg/ kg; W及小鼠30mg/kg。
[0036] 本文描述的发明用于哺乳动物，特别是用于人，但是本发明也具有兽医应用，因而 用于马、猪、犬、猫科动物、有蹄类动物、灵长类动物，或者用于确实能够继续发展为退变性 关节病或肢体障碍如OA的任何承重肢体型动物。
[0037] 在本发明的任何前述方面的优选实施方案中，所述受损的关节包括但不限于任何 四肢关节，如:脚趾、踩关节、膝关节、后膝关节、臀部、手指、腕关节、肘关节或肩部，或者包 括颈和任何肋骨的任何脊柱关节。
[0038] 贯穿本说明书的描述和权利要求，词语"包括"和"包含"W及所述词语的变体，例 如"包括（comprising)"和"包括（comprises)"，意为"包括但不限于"，并且不排除其它部 分、添加物、组分、整数或步骤。贯穿本说明书的描述和权利要求，单数涵盖复数，除非上下 文另有要求。特别地，当使用不定冠词时，本说明书应被理解为预期复数W及单数，除非上 下文另有要求。
[0039] 在此将本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请W引用的方式 并入。未认可任何参考文献构成现有技术。此外，未认可任何现有技术构成本领域公知常识 的一部分。
[0040] 可W结合任何其它方面来描述本发明各方面的优选特征。
[0041] 根据下述实例，本发明的其它特征将是显而易见的。一般而言，本发明延伸至本说 明书（包括所附的权利要求和附图）中公开特征的任何创新性特征或任何创新性组合。因 此，与本发明的具体方面、实施方案或实施例一同描述的特征、整数、特性、化合物或化学部 分应被理解为适用于本文描述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与此不相容。
[0042] 此外，除非另有说明，本文公开的任何特征均可被用于相同或相似目的的可选特 征替代。
[0043] 现在将参考下述实施例和附图更详细地描述本发明，其中：
[0044] 图Ia和b .初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的膝关节的肿胀、滑膜炎症和IL-6mRNA表达。（A)与AIA大鼠相比，在21天内，在NBQX处理的大鼠中发现显著更小的膝关节肿 胀(**冲<0.OOlK(B)与AIA大鼠相比，在NBQX处理大鼠的右侧发炎膝关节中发现显著更少 的IL-SmRNA表达(冲<0.05)。（ C和D)第21天解剖的大鼠膝关节中的滑膜炎症的组织病理学 分析。（C)与AIA大鼠相比，NBQX处理的大鼠具有显著更低的炎症评分(**冲<0.001)。（0)来 自初始动物的正常滑膜衬里层(SL)为2-4层细胞厚，在其正下方具有脂肪组织(Ad),并且正 常关节面(AS)由软骨下骨(Bo)之上的一层光滑软骨(Ca)组成。AIA大鼠中出现的滑膜增生 (血管繫形成（P))、渗出物化）、浸润（I)和关节面退变，在NBQX处理的大鼠中没那么严重。 MTP，内侦順骨平台；LTP，外侧腔骨平台;MFC，内侦搬骨裸;LFC，外侧股骨裸;M，半月板。较大 关节图片上的框显示下方图片的拍摄位置。比例尺：（C-E)Imm, (F、H和J)50皿，（G、I和KHOO Jifflo
[0045] 图2a和b.初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的足迹分析。（A)在第一天，来自S个 实验组的后肢足迹轨迹。AIA大鼠通常缺少右侧足印（圈出的），而AIA+NBQX处理的大鼠显示 出与初始动物类似的步态模式。上方图显示了足旋转程度、跨步长和站立宽度的测量。（B-D)右侧发炎肢体的足旋转（B)、站立宽度(C)和跨步长(D)分析。数据W组平均值+/-SEM示 出。（B)与初始大鼠相比，AIA和AIA+NBQX处理的大鼠右侧肢体具有显著更大的足旋转程度。 在第1天和第2天，AIA大鼠不能承重，因此在图上缺少数据点。与初始相比，AIA和AIA+NBQX 处理的大鼠的站立宽度增加(C)而跨步长减小(D)。与初始相比的AIA+NBQX，冲<0.05，*冲< 0.0 Ol;与初始相比的AIA，胖<0.05，#胖<0.0 Ol。
[0046] 图3a和b.在第21天解剖的初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的关节退变和重建。 (A) 来自各处理组的代表性大鼠的外侧股骨裸的甲苯胺蓝染色。(A和B)与AIA大鼠相比，AIA +NBQX大鼠显示出不太严重的软骨和骨病理学评分(P<0.OOlK(C)当分为关节隔室时，与 AIA大鼠的股骨裸相比，AIA+NBQX大鼠显示出显著更低的关节严重性评分(P<0.001)。通过 甲苯胺蓝染色(A)显示，AIA大鼠中的大量骨重建在AIA+NBQX大鼠中显著降低(P<0.0 Ol) (A 和D(BC参数））。（0)与AIA大鼠相比，AIA+NBQX大鼠中软骨细胞外形、蛋白聚糖损失和潮标完 整性评分也更低(P<〇.01) dMTP，内侧腔骨平台；LTP，外侧腔骨平台；MFC,内侧股骨裸;LFC， 外侧股骨裸;CSI，软骨表面完整性;CA,软骨细胞外形;PL，蛋白聚糖损失;TI,潮标完整性； BC，骨变化。冲 <0.05，*冲 <0.01，**冲 <0.001。
[0047] 图4a和b. AIA和AIA+NBQX发炎的大鼠 W及对侧对照大鼠膝关节中的宏观关节病状 和骨表型mRNA表达。(A)X-射线分析显示AIA大鼠的腔骨平台和股骨裸严重糜烂(箭头）"AIA +NBQX大鼠显示出更光滑的关节表面，与对侧对照膝关节中所见的相似。（B)MRI分析验证了 X-射线中所见的糜烂(箭头），同时显示了AIA大鼠中存在严重的滑膜炎症(星号）"AIA+NBQX 膝关节中的滑膜炎症大幅减少，关节糜烂也大幅减少。FC，股骨裸;TP，腔骨平台。（C-G)与 AIA和AIA+NBQX的对侧对照膝关节相比，AIA发炎的膝关节中的组织蛋白酶K、胶原I、RANKL 和RANKL/0PG比例mRNA表达水平显著增加。（C和D)与AIA+NBQX的对侧对照相比，发炎的AIA+ NBQX膝关节中的组织蛋白酶K和胶原I mRNA表达也显著增加。（C)与AIA发炎的膝关节相比， 在AIA+NBQX发炎的膝关节中发现组织蛋白酶K mRNA表达显著减少。（F)OPG的表达没有差 异。冲<0.05，* 冲<0.01，** 冲<0.001。
[004引图5a-c.来自初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的外侧股骨裸的KAl (A)和AMPAR2 (B) 的免疫组织化学。AIA和AIA+NBQX中出现更多的表达KAl和AMPAR2(黑色箭头）的初始大 鼠的软骨细胞。在初始大鼠中，运两种蛋白都未定位于骨细胞或单核骨细胞(黑色=角形， 初始X40图片）中，然而，在AIA和AIA+NBQX大鼠中，AMPAR2在骨细胞，主要在骨重建区域中 表达(空屯、S角形，AIAX40图片）。在AIA大鼠中，单核骨细胞和骨重建区域的KAl和AMPAR2 染色很强(AIAX40图片）"AIA+NBQX处理的大鼠显示更少的骨重建，W及随后两种蛋白的着 色更浅（交叉线S角形，AIA+NBQX X 40图片）。与初始大鼠和AIA+NBQX大鼠中所见的少量染 色相比，在AIA大鼠中发现了大量的TRAP染色，显示存在更多破骨细胞(C)。连续切片显示了 AIA大鼠的TRAP阳性破骨细胞中KAl和AMPAR2的表达(空屯、箭头）。在所有动物中，滑膜衬里 层细胞都表达KAl和AMPAR2(数据未显示）。用X 40物镜显示了较小图片中的黑框。相应的阴 性对照（没有第一抗体)和兔IgG对照对于KAl和AMPAR2是阴性的（数据未显示）。比例尺:大 图，lOOwn;小图，50WI1。
[00例图6a和b.HTO手术之后，穿过关节的负荷变化后GluR和EAAT mRNA的表达。(A)在来 自OA患者的内侧(暗线)和外侧(亮线)软骨下骨骨核检测到红藻氨酸GluR mRNA的表达。（B) 在取自另一OA患者HTO手术时或术后6个月的骨核中，红藻氨酸GluR和EAATlex9skip mRNA 的表达改变，与人骨中谷氨酸信号通路的力学调节一致。
[0050] 图7.定位于人OA样本（患者MSI)的内侧腔骨平台(MTP)中部的软骨中的GluR和转 运蛋白代表性免疫组织化学。(A)AMPAR2的阳性染色出现在细胞中，并且从纤维化软骨表面 直到中部/深部区域界面观察到染色，然而在潮标附近未观察到染色。在软骨的中上部区域 染色最强。（B)从表面直到中部/深部区域界面观察到KAl阳性染色，而在潮标附近的深部区 域未观察到染色。表面软骨细胞的染色出现于细胞中。（C化AATl未定位于该患者的软骨，然 而在位于另一患者的纤 维化软骨表面的软骨细胞克隆中观察到了微弱的染色（图8)。（0) EAAT3的阳性染色出现在细胞中，并且从纤维化软骨表面直到深部区域观察到染色，然而在 潮标旁边未观察到染色。在表面附近染色最强。箭头指示潮标的位置。框指示更高倍放大图 片的拍摄位置。比例尺：X5图，500皿；X20图，100皿。
[0051] 图8.来自OA患者（不同于图7的患者（JS2))MTP中部的纤维化软骨表面附近的 EAATl表达。在软骨细胞克隆的周围观察到该阳性染色。染色出现于细胞周围。箭头指示潮 标的位置。框指示更高放大倍数的图片的拍摄位置。比例尺：X5图，500皿；XlO图，200皿； X 20 图，100 皿。
[0052] 图9.定位于人OA样本（患者MSDMTP中部的骨中的GluR和转运蛋白代表性免疫组 织化学。A、C、D、E和F都是来自MTP相同位置的图片。(A)番红-0染色W显示骨和软骨的结构。 该区域已经被重建，并且潮标(TM)几乎完全消失。还观察到了潮标破坏(TMB)。运可能是血 管侵入，但是需要CD34免疫组织化学对其进行验证。如密集表面和细胞构成所示，骨也经历 了重建(BR) "(C)AMPAR2定位于重建区域，特别是TMB区域(箭头）。该染色出现于细胞周围。 在来自骨正常区域的骨衬里层细胞(B中的小箭头）中未观察到染色。偶尔观察到骨细胞 AMPAR2染色，但是仅在小区域内（B中的大箭头）。（0化Al定位于重建的骨中（箭头），并且出 现于细胞内。在正常骨的骨衬里层细胞或骨细胞中未观察到KAl染色。化化AATl染色位于血 管周围，并且在重建的骨(大箭头)和TMB区域(小箭头)被观察到。在正常的骨中未观察到阳 性染色。（F化AAT3定位于正常的骨(数据未显示）、重建的骨(大箭头)和TMB区域(小箭头）的 骨衬里层细胞中。染色在细胞中W及细胞周围。观察到一些骨细胞染色(数据未显示）。比例 尺:A、C、D、E和尸，200皿;8，100皿。
[0053] 图10.定位于人OA样本(患者MSI)的滑膜中的GluR和转运蛋白代表性免疫组织化 学。所有图片都来自滑膜组织中的相同位置。（A)苏木精和伊红染色W显示滑膜组织的结 构。小箭头指示滑膜衬里层细胞，星号指示血管。大箭头突出了血管周围存在淋己样聚集。 该淋己样聚集结合增厚的滑膜衬里层指示了滑膜组织的炎症。（B、C、D和E)AMPAR2、KA1、 EAATl和EAAT3都定位于滑膜衬里层的滑膜细胞和血管中。比例尺:200皿。
[0054] 图11.在MNX大鼠中NBQX处理之后的膝关节肿胀。按照右侧膝关节测量值减去左侧 膝关节测量值来计算平均膝关节肿胀。在第8天，与初始大鼠（P<0.01)和用25mM NBQX处理 的MNX大鼠（P<0.05)相比，用媒介物对照处理的MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。在第 14天，与初始大鼠（P<0.05)、用12.5mM(P<0.05)和2.5mM(P<0.01)NBQX处理的大鼠相比，媒 介物对照MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。MNX大鼠对比初始大鼠，AAP<〇.01，AP< 0.05;MNX+2.5mM NBQX对比初始大鼠 ，#P < 0.05;MNX+12.5mM NBQX，*冲 < 0.01，冲 < 0.05; MNX+25mM NBQX，参P < 0.05 cMNX对比MNX+25mM NBQX，〇P < 0.05 ;MNX对比MNX+12.5mM NBQX，QP < 0.05;MNX对比2.5mM NBQX，OOP < 0.0 l。单因素 ANOVA和费舍尔事后检验。
[0055] 图12.在MNX大鼠中，NBQX处理之后进行双足平衡测试。NBQX处理之后MNX大鼠的左 后腿和右后腿之间的承重差异。在第8天，与初始大鼠（P<0.0 Ol)，12.5mM(P<0.05)、2.5mM(P <0.01)和25mM(P<0.01)NBQX处理大鼠相比，紧接着在第二次NBQX注射之后，媒介物对照处 理的MNX大鼠的左腿和右腿之间的承重具有显著更大的差异。MNX大鼠对比初始大鼠 ，A A AP< 0.001，A AP< 0.01，AP< 0.05;MNX+2.5mM NBQX对比韦刀始大鼠，##P< 0.01，#P< 0. 05 ;MNX+12.5mM NBQX对比初始大鼠，*冲 < 0 . Ol，冲 < 0.05 ;MNX+25mM NBQX对比初始大 鼠，参参P < 0.0 l，参P < 0.05cMNX对比MNX巧5mM NBQX，OOnP < 0.0 l，OnP < 0.05 ;MNX对比 MNX+12.5mM NBQX，□ P < 0.05; MNX对 2.5mM NBQX，〇〇P<0.01，〇P<0.05。单因素 ANOVA和 费舍尔事后检验。
[0056] 图13.在初带破裂的鼠中NBQX处理之后的膝关节肿胀。在第7天(P<0.05)和第21天 (P<0.001)，与媒介物对照相比，在NBQX处理的鼠中发现了显著更小的膝关节肿胀。与第0天 的测量值相比，从第2天开始，NBQX处理的鼠的膝关节肿胀未显示出显著差异。与第0天相 比，媒介物处理的鼠在各时间点具有显著更大的膝关节肿胀。*对比第0天NBQX，**对比第0 天对照，***对第0天对照，+NBQX对比对照，+++NBQX对比对照。
[0057] 图14.拍摄的左膝关节(未负荷）和右膝关节（负荷）的EAACl免疫组织化学图片。 1. ILlRO =鼠 ID。在关节内侦U ,WlOX放大率（IOOiiM比例尺)拍摄图片A和B，W40 X放大率 a00i^M比例尺)拍摄图片C和D，W及W40X放大率巧0i^M比例尺)拍摄图片E、F、G、H，（空屯、S 角形=未染色的细胞，空屯、箭头=染色的细胞）。(MTP =内侧腔骨平台，MFC =内侧股骨裸，M =半月板，S =滑膜）。在左腿和右腿上的骨衬里层细胞中（黑色=角形C和D)都存在明显染 色。在整个软骨的软骨细胞和骨细胞的骨基质之间也存在染色(空屯、箭头）。尽管EAACl是强 抗体，仍存在一些未染色的软骨细胞和骨细胞（空屯、=角形）。然而，与左腿相比，右腿滑膜 中存在大量染色。
[005引图15.拍摄的左膝关节(未负荷)和右膝关节（负荷）的红藻氨酸1免疫组织化学图 片。1.3L0R1 =鼠 ID。在关节内侧，W10 X放大率（IOOiiM比例尺)拍摄图片A和B，W40 X放大 率（IOOiiM比例尺)拍摄图片C和D，W及W40X放大率(50iiM比例尺)拍摄图片E、F、G、H(空屯、 S角形=未染色的细胞，空屯、箭头=染色的细胞）。（MTP=内侧腔骨平台，MFC=内侧股骨 裸，M=半月板，S =滑膜KKA抗体在整个软骨的软骨细胞中具有强染色（空屯、箭头(F和H))。 在未负荷的膝关节中存在一些染色的骨衬里层细胞(黑色=角形c)，在负荷的膝关节中具 有更强染色（黑色=角形D)。骨细胞中几乎不存在染色。与未负荷的对照相比，负荷膝关节 的滑膜中的更多细胞被阳性染色(A和B)。
[0059] 图16.拍摄的左膝关节(未负荷）和右膝关节（负荷）的GluR2免疫组织化学图片。 1. ILlRO =鼠 ID。在关节内侦U ,WlOX放大率（IOOiiM比例尺)拍摄图片A和B，W40 X放大率 a00i^M比例尺)拍摄图片C和D，W及W40X放大率巧0i^M比例尺)拍摄图片E、F、G、H，（空屯、S 角形=未染色的细胞，空屯、箭头=染色的细胞）。(MTP =内侧腔骨平台，MFC =内侧股骨裸，M =半月板，S =滑膜）dG1uR2抗体在整个软骨范围内的软骨细胞中具有强染色。与未负的对 照巧和G)相比，在负荷膝关节的骨衬里层细胞中的染色更强(黑色S角形D)。如化)和(G)中 所示，存在更多的骨细胞染色，但是负荷和未负荷的腿之间存在较小差异。与未负荷的膝关 节(A)相比，负荷的膝关节(B)中也可W观察到滑膜染色。
[0060] 材料和方法 [0061 ]动物.
[0062] 实施的使用动物的所有方案都符合内政部化ome Office)的指南，并且遵循国际 疼痛学会的指南。从化rlan(Oxfordshire，UK)获得雄性路易鼠（用于AIA)(~200g)，S只一 组在常规笼中饲养。大鼠自由获取食物和水，并保持12小时光/暗循环。
[0063] 关节炎诱导和治疗方案.
[0064] 对于AIA，在7天的定居周期之后，向动物右侧皮下注射用等体积的弗氏完全佐剂 (CFA;0.25mg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)Sigma)乳化的甲基化的牛血清 白蛋白（mBSA;0.5mg/ml ;Sigma，Poole，UK)。7天之后，向左侧实施第二次皮下注射所述乳 剂。第二次注射(第0天)之后14天，向15只大鼠的右膝关节实施关节内注射mBSA(5化1盐水 中含有0.5mg)，W用作AIA组。另外15只大鼠的右膝关节接受关节内注射混合有2.5mM NBQX (Tocris，化istol，UK)的0.5mg mBSA的50iil盐水。运些大鼠用作NBQX治疗组。所使用NBQX的 浓度基于调查大鼠角叉菜胶性关节炎的疼痛的研究（1)。6只对照大鼠未接受皮下或关节内 注射。
[00化]膝关节肿胀.
[0066] 利用Mi1:utoyo(RTM)数显卡尺(RS Components Ltd,No;rthants,UK)对所有大鼠的 发炎(右)和未发炎(左）的膝关节直径进行测量，W定量肿胀。在第0天(紧接着关节炎诱导 之前)测量基线读数，W及在第1、2、3、4、7、9、14和21天对AIA大鼠进行测量。每一膝关节取3 组读数，发炎的和未发炎的膝关节的平均值之间的差异W膝关节肿胀的毫米值给出。
[0067] 比-犯 LISA.
[0068] 对于AIA，在基线处(第0天）和第1、2、3、7、14W及21天，通过尾部采血从各只大鼠 收集血清。按照制造商的说明书，利用大鼠 IL-6 Quantikine"试剂盒（R&D Systems， Ab ingdon，UK)定量来自各组的6只大鼠的IL-6水平。
[0069] 组织学疾病评估.
[0070] 在第21天，炼选9只AIA大鼠、9只NBQX大鼠和3只对照大鼠，将它们的膝关节完整解 剖，并在10 %中性缓冲福尔马林溶液（Sigma)中固定2天。将膝关节于4°C，10 %的抓TA (Fisher Scientific,Lou曲borough,UK)中脱巧，在石蜡中包埋，W冠状平面进行切片（6]i m)，并用苏木精和伊红对滑膜炎症进行染色，或者用甲苯胺蓝/番红-0对软骨进行染色，W 及进行骨评分或者保存用于免疫组织化学分析。由不知情处理组的两名独立观察者对滑膜 炎症和关节退变进行评分。利用已建立的评分系统对滑膜炎症进行评分(3)。简言之，对3个 参数进行了评分:滑膜增生(血管繫形成）（0-3)、滑膜浸润(0-5) W及滑液渗出（0-3)，从而 给出每一关节的最高评分11。利用改进的Mankin评分(表1)对关节退变进行评分，所述改进 的Mankin评分由软骨表面完整性(0-6)、软骨细胞外形(0-2)、蛋白聚糖损失(0-4)、潮标完 整性(0-2)和骨变化(0-3)组成，从而给出每一关节象限(qua化ant)(内侧和外侧股骨裸(分 别为MFC和LFC) W及内侧和外侧腔骨平台（分别为MTP和LTP))的最高评分17,每一膝关节总 计最局68分。在每一膝关口中，对相距~500曲1的两个代表性切片进行关节退变评分。
[0071] 足迹评分.
[00 72] 如前所述，在第0、1、2、3、4、7、9、14和21天，通过足迹分析对后肢步行模式进行评 估(4)。将6只AIA、NBQX和对照大鼠的后爪浸入无毒颜料中，然后让其在铺有纸的走道（Im 长，IOcm宽）自由行走。每个实验日，各大鼠进行=组每边至少两个步进循环(连续的6步）。 对=个参数进行测量:肢体旋转（与行走方向平行的穿过脚垫中屯、的线与穿过第=足趾的 线之间的角度）、跨步长(同侧脚之间的距离)和站立宽度(右侧和左侧步进循环的脚之间的 距离）。
[0073] 宏观膝关节分析
[0074] 脱巧之前，通过射线照相术和MRI对整个膝关节进行检查。利用柯达FX Pro体内成 像系统（Advanced Molecular Vision ,Grantham,UK)获得9只AIA大鼠、9只NBQX大鼠和3只 对照大鼠的发炎和未发炎的膝关节射线照片，利用柯达分子成像软件第5版，利用下述参数 对图片进行分析:35kV下30秒曝光时间、4.96F-stop、71.4mm F0V、9.8mm焦平面。
[OOW]利用MRI实验中屯、（EMRIC,School of Biosciences,Cardiff University)的高空 间分辨率MRI扫描方案对6只AIA大鼠和6只NBQX大鼠的发炎和未发炎的膝关节进行成像。在 扫描之前，将每对膝关节包埋进50ml离屯、管内的1%琼脂糖(Promega)中。利用配备有发送-接收正交线圈的化址er Biospin Advance 9.4T(400mHz)MRI系统来实施MRI。扫描采集参 数如下：回声时间1250msec、重复时间24msec、视场640 X 280 X 280mm，矩阵640 X 280 X 280， W及翻转角180°。随后在化raVision 5. UBr址er)和Analyze 10.0软件(Mayo Biomedical Imaging ResourceJochester,MN,USA)中观察和分析图片。
[0076] 谷氨酸受体和IL-6信使RNA(mRNA)表达.
[0077] 在第21天，从炼选的6只AIA大鼠和6只NBQX大鼠的发炎和未发炎的膝关节中切出 半月板、骸骨、股骨干、股骨裸和腔骨平台。在HTO手术时，从患者中取出人骨核（bone core)，立即在干冰中保存，然后置于-80°C的冰箱中。如前所述，利用TRIzoK Invitrogen, 化iS1 ey，UK)提取总RNA(5)，DNA酶处理(DNA-free?，Ambion，Warrington，UK)，再纯化并通 过UV吸收进行定量。利用Superscript? III反转录酶（Invitrogen)和RNasin核糖核酸酶抑 制剂（Promega)，将用随机引物（Promega, Southampton,UK)延伸的RNA(300ng)反转录并进 行RT-PCR(S)。设计引物(Primer 3似延伸GluR、EAAT和比-6基因的内含子，从而将基因组 与互补DNA(CDNA)扩增(表2)区分开，并且将PCR产物克隆并测序W确定正确的扩增产物。将 大鼠或人的脑和脾脏CDNA分别用作GluR和化-6mRNA表达的阳性对照。通过具有优化的引物 和MgCh浓度的QRT-PCR(不含MgCh的 SYBR" Green JumpStart? Taq ReadyMix?) (Sigma) W及热循环方案（表2)，利用MX3000P PCR系统和软件（Stratagene)对GluR和比-6 表达的变化进行评估。利用Pfaff I相对定量法(6)，将各基因的标准曲线(对于GluR和IL-6 表达，分别为大鼠脑和脾脏cDNA)重复至少3次，W确保用于相对定量的引物效率(90-110% 效率W及护>0.95)。利用齡抑1。111(16'鉴定看家基因（64?0山册1?1'1、66。2和￥胖齡2)最稳定的 表达组合，W将祀基因标准化(7)。
[007引半月板横切(MNX)模型.
[0079] 我们已经建立了骨关节炎的半月板横切(MNX)大鼠模型。按照内政部许可实施手 术切除，其中切穿并取出部分内侧副初带，然后实施内侧半月板横切。在麻醉下实施手术。 然后使动物从手术中恢复。
[0080] 利用MNX模型，我们对直接向膝关节注射NBQX的效果进行了测试。有如下5组雄性 斯普拉格-杜勒大鼠，每组3只动物：
[0081 ] -MNX+无菌出0(媒介物对照）
[0082] -MNX+2.5mM NB臘
[0083] -MNX+12.5mM NB臘
[0084] -MNX+25mM NB臘 [00化]-初始大鼠
[0086] NBQX处理的大鼠接受两次关节内注射，第一次紧接在MNX手术之后，第二次在7天 之后。同时在皮下给予单次剂量的下丙诺啡W减轻手术之后的疼痛。下丙诺啡在长达12小 时内有效且不影响炎症。在同一时间，媒介物对照大鼠接受W相同方式递送的无菌出0注 射。在21天内，在第0、1、2、3、7、8、10、14和21天，对重量、膝关节肿胀(数显卡尺)^及双足平 衡（incapacitance KLinton双足平衡测痛仪)进行测量。所述Linton双足平衡测痛仪测量 将大鼠固定在透明有机玻璃盒时施加于每一后腿的重量。然后可W计算左腿和右腿之间的 承重差异。在第21天，使所有大鼠安乐死，并将膝关节固定于福尔马林中用于组织学研究。
[0087] 创伤后膝关节骨关节炎的无创模型
[0088] 我们已经建立了由初带破裂导致的创伤后膝关节退变的无创小鼠模型。该模型的 无创性质意为大型手术影响疼痛、炎症而不会掩盖关节炎发作的早期变化，并且不需要假 手术对照。
[0089] 利用定制的杯子支持弯曲的膝关节，向12周龄巧7B16小鼠 （n = 10)的右膝关节施 加负荷（12N，4Hz，正弦波；封成杜oForce? 3200，BOSE，USA)。在负荷周期期间，施加的压缩 力释放之后位移的持续增加显示在1-6个循环之间发生初带破裂。左膝关节用作未负荷的 对照。初带破裂之后立即向小鼠右膝关节给予关节内注射20mM NBQX，而对照小鼠接受关节 内注射无菌此〇(媒介物对照）。同时在皮下给予单次剂量的下丙诺啡，W减轻负荷之后长达 12小时的疼痛。
[0090] 第一周每天都进行贩行评分，然后在接下来几周每隔几天进行贩行评分，W对动 物的幸福和疼痛缓解的潜在需求进行评估。在第〇、1、2、3、7、16和21天，利用数显卡尺对膝 关节肿胀进行测量。在第21天，使所有的小鼠安乐死，并将膝关节固定于福尔马林中用于组 织学研究。
[0091] 免疫组织化学 [009。动物操作:
[0093]利用红藻氨酸抗体(抗KAl，1:400稀释）、AMPA受体-2抗体(抗离子型谷氨酸受体- 2，I: IOO，都来自 Abeam，Cambr idge，UK)、化AST抗体（GLAST11-S，I: IOO) W 及EAACI抗体 化AACl 1-A，1: 200,都来自 Al地a Dia即OStiC International ,Texas ,USA)，逐次在石蜡膝 关节切片（9个AIA膝关节、9个NBQX膝关节和6个对照膝关节）中对GluR和转运蛋白进行定 位。同时在6只MNX大鼠和6只初始大鼠中对AMPAR2进行定位。将处理用于组织学研究的切片 脱蜡，并在抗原修复之前，利用Img/ml膜蛋白酶(Sigma)于37°C复水20分钟。将内源性过氧 化物酶活性用0.3%的过氧化氨（Sigma)阻断30分钟，然后在1XTBS/0.1%吐溫中洗涂S 次，每次15分钟。用10%的正常封闭血清(Sigma)处理切片1小时，用第一抗体在4°C解育过 夜，然后在1 X TBS/0.1 %吐溫中洗S次。按照制造商的说明，利用兔VECTASTAIN ELITE ABC 辣根过氧化物酶试剂盒（Vector Laboratories,Peterborough,UK)对免疫染色进行检测。 利用儀增强二氨基联苯胺（DAB) (Vector Laboratories)使切片显色，在Mayer ' S苏木精 (Fisher Scientif ic)中复染，用自来水洗涂，脱水，在二甲苯中清洗，并封片。在Leica DMRB显微镜下观察玻片。除非另外说明，所有的解育都在室溫进行。
[0094] 人体操作:
[00%]利用与上述动物操作所详述的相同的抗体和技术，对来自=个人骨关节炎内侧腔 骨平台样本的连续切片进行1(41、41?41?2、6441'1(61^\51'巧蛇44了3化4401)免疫染色。
[0096] 统计分析.
[0097] 在参数(单因素 ANOVA与费舍尔(Fisher' S)事后检验或I'ukey-Kramer事后检验)或 非参数(克鲁斯卡尔-沃利斯化ruskal-Wallis)与曼-惠特尼(Mann-怖itney)事后检验）统 计检验之前，利用Minitab 16软件对数据进行正态分布和方差齐性检验。所有数据都W平 均值±平均值的标准误(SEM)示出。
[009引结果
[0099] 通过NB臘处理降低了滑膜炎症和IL-6表达
[0100] 在诱导之后的最初几天，对AIA大鼠的膝关节肿胀的评估显示了严重的极性炎症 应答（图1A)。在AIA大鼠中，第一天平均肿胀为4.4mm(±0.14mm)，然而在NBQX大鼠中，该水 平显著更低，仅为2.95mm(±0.23mm)，表明NBQX处理之后峰值膝关节肿胀降低33% (P< 0.001，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼-惠特尼事后检验）。在整个21天实验的各时间点，都观 察到了 NBQX处理大鼠的膝关节肿胀显著减弱(P<0.001，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼-惠特 尼事后检验）。
[0101] AIA大鼠的血清IL-6浓度降至IL-SQuant化ine?试剂盒的最小可检测剂量(2lpg/ ml)W下，因此使其无法定量。
[0102] 从第21天对AIA大鼠关节组织中IL-SmRNA表达的研究显示，化-6在股骨裸、股骨 干、腔骨平台和骸骨中的表达水平太低不能被定量（尽管可检测到）。与AIA大鼠相比，在 NBQX处理大鼠的发炎膝关节的半月板中，比-6的相对表达水平显著更低(P<0.05,克鲁斯卡 尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验）（图1B)。尽管不显著，但是在左侧未发炎的膝关节中 也观察到了相同的模式。
[0103] 对在第21天切除的AIA、NBQX和对照小鼠的膝关节滑膜炎症进行的组织学检查显 示，与NBQX处理的大鼠相比，AIA大鼠的滑膜炎症评分更严重(P<0.0 Ol，单因素 ANOVA与费舍 尔事后检验）（图1C)。来自对照动物的正常滑膜衬里层为2-4层细胞厚，在其正下方具有脂 肪组织，并且正常的关节面由软骨下骨之上的一层光滑的软骨组成（图1D)。在AIA大鼠中存 在滑膜增生(血管繫形成）、渗出物、浸润和关节面退变（图ID)。运在NBQX处理的大鼠中明显 不那么严重（图1D)。
[0104] NB臘处理恢复承重
[0105] 紧接着诱导关节炎之后的足迹分析显示了 AIA与NBQX处理的大鼠之间的显著差 异。虽然在第1天和第2天，AIA大鼠没有可测量的足迹（图2A和2B)，但是运些天NBQX大鼠能 够承重，展现出可与对照大鼠中所见的那些比较的清晰足迹。来自足迹的步态参数分析显 示AIA和NBQX处理的大鼠的行走异常，与对照大鼠相比时，足旋转程度（图2B，P<0.05)和站 立宽度（图2C，P<0.05)显著更大，而跨步长（图2D，P<0.05)显著更短（单因素 ANOVA和化k巧-Kramer事后检验）。在第14天，AIA和NBQX组的跨步 长恢复正常，并且在第21天，所有组的站 立宽度都是正常的。
[0106] 通过NB臘处理降低了膝关节退变
[0107] 与AIA大鼠相比，关节退变的组织学评估显示NBQX处理的大鼠中显著更少的软骨 和骨病状（图3)。AIA大鼠显示关节软骨下的软骨损失W及大量的骨变化（图3A)。NBQX处理 的大鼠显示与对照动物中所见的相类似的软骨和骨表型，在外边缘具有较少重建（图3A)。 与AIA大鼠相比，NBQX处理大鼠的平均关节退变严重性评分显著降低(P<0.001，用克鲁斯卡 尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验，图3B)。将关节分为4个隔室(MTP、LTP、MFC和LFC)，与 AIA大鼠相比，NBQX处理大鼠的MFC和LFC中显示出显著更少的关节退变(分别为P<0.〇dPP< 0.05，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验）（图3C)。将严重性评分分为5种参数， 与AIA相比，显示尽管NBQX处理显著降低了软骨细胞外形(P<0.05 )、蛋白聚糖损失(P<0.01) 和潮标完整性(P<〇.01)的评分，但是在骨变化中观察到了最大差异(P<〇.OOlK全部都为克 鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验）（图3D)。
[0108] 在第21天，X射线和MRI显示AIA大鼠的关节糜烂和滑膜炎症（图4) dNBQX处理大鼠 的X射线中观察到了较少的关节糜烂，其显示出更圆的光滑关节面，与对照动物的关节面更 相似（图4A)。在第21天，AIA大鼠的MRI验证了 X射线中所见的严重糜烂，同时显示出大量的 滑膜炎症（图4B)"MRI显示，NBQX处理极大地降低了滑膜炎症W及关节糜烂(图4B)。
[0109] 通过NB臘处理改变了GluR的表达
[0110] KAl和AMPAR2蛋白在所有大鼠的软骨细胞和滑膜衬里层细胞中都表达(未显示）， 并且在AIA的重建的骨中富集(图5)。在AIA和AIA+NBQX的重建区域中，骨中的骨细胞和其它 单核细胞表达AMPAR2(图5B) dNBQX降低了重建的程度，伴随着Glu郎日性细胞的明显减少（图 5)。在初始动物中，没有AMPAR2和KAl定位于单核骨细胞中（图5) dAIA中富集的TRAP阳性破 骨细胞在连续切片中共表达KAl和AMPAR2，并且在初始大鼠和AIA+NBQX大鼠中没那么大量 (图 5)。
[0111] 响应力学变化的GluR和EAAT表达
[0112] KAl的表达在腔骨平台的内侧和外侧之间有所不同，其中在内侧存在表达，在外侧 不存在表达（图6A)。在不同的HTO患者中，HTO手术之后，EAATlex9skip的表达丧失，而KAl的 表达开启（图6B)。
[0113] GluR和转运蛋白在来自S个人OA样本的内侧腔骨平台(MTP)中部的软骨、骨和滑 膜中的定位
[0114] 在人OA软骨中观察到离子型GluR和转运蛋白的阳性染色:从纤维化软骨表面直到 中部/深部区域观察到了AMPAR2、EAAT3和KAl。在纤维化的软骨表面附近观察到了EAATl的 表达。此夕1'，八1口八尺2、1(八1、6八八1'巧此八八13定位于人0八组织的骨重建区域。此夕1'，八1口八尺2、1(八1、 EAATl和EAAT3都定位于滑膜衬里层的滑膜细胞W及人OA组织的血管中。取自不同物种的组 织的关节滑液中Glu浓度的比较示于表3中。
[0115] GluR的括抗作用减弱了关节创伤之后的膝关节肿胀和病状
[0116] 利用MNX模型，经过手术的大鼠在手术之后立即接受关节内注射不同浓度的NBQX， 并在7天之后进行第二次注射。在一些鼠中实施无菌水注射W用作对照。在21天内，在第0、 1、 2、3、7、8、10、14和21天，对重量、膝关节肿胀(数显卡尺)和双足平衡化inton双足平衡测 痛仪)进行测量。所有大鼠在整个实验中不断增加重量。NBQX对膝关节肿胀的效果令人鼓 舞，特别是在第二次NBQX注射之后第8天和第14天（图11)。在第8天，与初始大鼠(P<0.01)和 用25mM NBQX处理的MNX大鼠（P<0.05)相比，媒介物对照处理的MNX大鼠具有显著更大的膝 关节肿胀。在第14天，与初始大鼠。<0.05)，12.51111。<0.05)和2.5111]\1。<0.01作89乂处理的 大鼠相比，媒介物对照MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。该数据支持我们先前在抗原诱 导的关节炎(AIA)大鼠模型中的结果，并且表明NBQX对丽X手术之后的膝关节具有抗炎效 果。
[0117] 双足平衡测试显示，在第8天，紧接着第二次NBQX注射之后，与初始大鼠（P< 0.001)，12.51111。<0.05)、2.5111]\1。<0.01)和251111。<0.01)相比，媒介物对照处理的]\1版大鼠 的左腿和右腿之间的承重具有显著更大的差异（图12)。该数据支持我们先前的结果:在紧 接着注射之后的几天中，NBQX处理提供了疼痛缓解。
[0118] 利用我们的无创初带破裂模型，在右膝关节给予创伤后的鼠关节内注射20mM NBQX。左膝关节用作未负荷对照。在一些鼠中实施无菌水注射W用作媒介物对照。在第0、1、 2、 3、7、16和21天，利用数显卡尺对膝关节肿胀进行测量。所有鼠在整个实验中不断增加重 量。贩行评分未严重到足W批准疼痛缓解的额外剂量。NBQX对膝关节肿胀的效果令人鼓舞， 伴随着在第7天(P<0.05)和第21天(P<0.001)，与媒介物对照相比，NBQX处理的鼠中显著更 小的膝关节肿胀（图13)。此外，从第2天起，与第0天的测量值相比，NBQX处理鼠的膝关节肿 胀未显示出显著差异。形成强烈对比的是，与第0天相比，媒介物处理的小鼠在每一时间点 具有显著更大的膝关节肿胀，表明在没有NBQX的情况下，膝关节直径从未恢复至对照值。
[0119] 关节创伤之后的GluR和EAAT表达.
[0120] 使6只鼠的右膝关节负荷9N的最大负荷0.05秒，持续40个循环，其中各负荷循环之 间的基线为2N。负荷循环的起落持续0.025秒。该周计划有3个负荷事件，其中在第二次负荷 时ACL破裂(因此不需要第3次负载）。在第二次负荷事件之后两天(A化破裂之后)炼选鼠，并 切除膝关节。将6只小鼠的左关节用作未负荷对照。
[01別]与未负荷对照相比，EAACUEAAT3K图14)、1(41(图15)和61111?2(41口41?2)的免疫组 织化学在负荷膝关节的滑膜上显示更强的染色（图16)。染色在两个膝关节的整个关节组织 中都存在，但是通常在负荷膝关节特别是骨中更强。
[0122] 讨论
[0123] 我们的数据显示，在关节损伤时和/或其后不久，用AMPA和/或KA Glu財吉抗剂处理 有问题的关节，降低了与创伤后OA的发作或发展相关的退变病状、炎症和疼痛。
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[0152]表3.患病或未患病的不同物种中比较关节谷氨酸的浓度
【主权项】
1.AMPA和/或KAGluR拮抗剂，其被配制以施用于由创伤受损的关节，其用于在受损的 关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。2. 如权利要求1所述的用于预防或治疗创伤后骨关节炎(0A)的AMPA和/或KAGluR拮抗 剂，其特征在于，所述疾病为早期(退变性关节病)或晚期(晚期0A)的创伤后0A。3. 如权利要求1或2所述的用于预防或治疗创伤后骨关节炎(0A)的AMPA和/或KAGluR 拮抗剂，其特征在于，所述关节未患有骨关节炎(0A)或类风湿性关节炎(RA)。4. 如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮抗 剂，其特征在于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)、6，7-二硝基喹 喔啉-2,3-二酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2,3_二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯 并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸）、4-(8_ 甲基-9Η-1，3-二氧杂环戊并[4，5-h] [2，3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(GYKI52466)、1-萘基 乙酰基精胺（1_NAS)、以及1_(4'_氨基苯基)_3，5-二氢-7，8_二甲氧基-4H-2，3_苯并二氮杂 卓-4-酮(CFM-2)。5. 如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA拮抗剂，其特征在 于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)、6，7-二硝基喹喔啉-2，3-二 酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[幻喹喔 啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸）、4-(8_甲基-9H-1， 3_二氧杂环戊并[4,5-11][2,3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(6￥1(152466)、1-萘基乙基精胺 (1-NAS)、以及1-(4 ' -氨基苯基）-3，5-二氢-7，8-二甲氧基-4Η-2，3-苯并二氮杂卓-4-酮 (CFM-2)。6. 如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0Α的KAGluR拮抗剂，其特征 在于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2，3-二酮(CNQX)、6，7-二硝基喹喔啉-2，3-二酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2，3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔 啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸）、以及4-(8-甲基-9H-1，3-二氧杂环戊并[4，5-h] [2，3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(GYKI52466)。7. 如权利要求1-6中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮抗 剂，其中所述拮抗剂以1 -1OOmM的浓度施用。8. 如权利要求7所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮抗剂，其中所 述浓度为2.5-25mM。9. 如权利要求8所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮抗剂，其中所 述浓度选自：2·5mM、5mM、7·5mM、10mM、12·5mM、15mM17·5mM、20mM、22·5mM或25mM〇10. 如权利要求1-9中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KAGluR拮 抗剂，其中所述AMPA和/或KAGluR拮抗剂为可注射的液体或局部制剂的形式。11. 如权利要求1-10中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮 抗剂，其中所述AMPA和/或KAGluR拮抗剂为溶液或悬液形式。12. 如权利要求1-11中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮 抗剂，其中所述损伤选自：关节软骨表面损伤、骨折、韧带松弛或缺陷、韧带和/或半月板和/ 或肌腱破裂、关节囊和滑膜损伤、髌骨功能障碍、以及关节软骨的压迫和/或剪切损伤。13. 包含权利要求1-12中任一项所述的AMPA和/或KAGluR拮抗剂的药物组合物，其中 所述药理活性拮抗剂在溶液中，所述组合物被配制以施用于关节，并包含溶剂和/或稳定 剂。14. 包含权利要求1-12中任一项所述的AMPA和/或KAGluR拮抗剂的药物组合物，其中 所述药物组合物为乳霜、软膏、胶状物或粉末形式。15. 如权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述组合物被配制以施用于哺乳动物。16. 如权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物被配制以施用于人、马、猪、犬、 猫科动物、有蹄类动物、灵长类动物或任何承重肢体型哺乳动物。17. 如权利要求1-12中任一项所述的用于预防或治疗创伤后0A的AMPA和/或KAGluR拮 抗剂，或者如权利要求13-16中任一项所述的药物组合物，其中所述受损的关节选自：脚趾、 踝关节、膝关节、后膝关节、臀部、手指、腕关节、肘关节或肩部、脊柱关节以及肋骨。18. 包含AMPA和/或KAGluR拮抗剂以及至少一种其它治疗剂的组合治疗剂，其被配制 以施用于由创伤受损的关节，其用于预防所述受损的关节的创伤后骨关节炎。19. 如权利要求18所述的组合治疗剂，其中所述组合治疗剂包含权利要求1-12中任一 项所述的AMPA和/或KAGluR拮抗剂，以及可用于预防或治疗创伤后0A的至少一种其它治疗 剂。20. 预防受损的关节的创伤后骨关节炎的方法，其包括在所述关节受损时或大约受损 的时候，向个体施用被配制以施用于所述关节的AMPA和/或KAGluR拮抗剂。21. 如权利要求19所述的方法，其中所述AMPA和/或KAG1uR拮抗剂如权利要求1 -12中 任一项所述。22. 如权利要求20或21所述的方法，其中所述疾病为早期(退变性关节病)或晚期（晚期 OA)的创伤后骨关节炎(OA)。23. 如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述AMPA和/或KAGluR拮抗剂为权利 要求18或19所述的组合治疗剂的形式。24. 如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂在人中以下述剂量施用： 0 · 03mg/kg或约 0 · 03mg/kg。25. 基本如本文所述的权利要求1-12和17所述的用途，权利要求13-16所述的药物组合 物，权利要求18-19所述的组合治疗剂，或者权利要求20-24所述的方法。 26.AMPA和/或KAGluR拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于向由创伤受损的关 节施用以在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。
【专利摘要】本申请涉及利用抑制AMPA和KA谷氨酸受体(GluR)中的一种或两种的化合物预防早期或晚期的创伤后骨关节炎的治疗剂和药物组合物，其用途以及方法。
【IPC分类】A61K9/08, A61K45/06, A61K31/498
【公开号】CN105491998
【申请号】CN201480047577
【发明人】黛博·梅森, 克利奥·邦尼特
【申请人】加的夫大学学院咨询有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月3日
【公告号】EP3016636A1, WO2015001349A1
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