基于s－腺苷蛋氨酸类似物的免疫检测方法及应用于指导个体化用药的制作方法
基于s－腺苷蛋氨酸类似物的免疫检测方法及应用于指导个体化用药的制作方法
【专利说明】基于S-腺昔蛋氨酸类似物的免疫检测方法及应用于指导个 体化用药
[0001 ]本发明专利申请延续临时美国专利US61/801，547题目为"S-腺巧蛋氨酸的免疫检 测用于个体化用药或者用于健康与癌症评估"，提交日期为2013年3月15日.本专利申请将 包括上述临时专利的全部内容。 发明领域
[0002] 本发明设及测定S-腺巧蛋氨酸在生物样品中的含量，S-腺巧蛋氨酸可作为许多疾 病的标志物。
[0003] 本发明设及使用由本发明中的抗原类似物制备的抗体的方法，测定S-腺巧蛋氨酸 在生物样品中的含量，S-腺巧蛋氨酸可作为许多疾病的标志物。
[0004] 本发明设及测定S-腺巧蛋氨酸在生物样品中的含量，S-腺巧蛋氨酸可作为许多疾 病的标志物，S-腺巧蛋氨酸的含量与疾病进展有关系，根据S-腺巧蛋氨酸的水平制定合适 的治疗方案。
[0005] 本发明设及诊断、筛查、早期检测癌症的方法，且可W用来监测肿瘤和其它疾病的 治疗效果和复发监测。
[0006] 本发明还设及一种开发祀向特异检测系统，该系统用来决定病人是否会对祀向特 异性药物有反应，具体的设及一种经济的、在同时开发诊断试剂和治疗药物时提供协同作 用的系统。
[0007] 本发明设及发现、筛选、寻找、检出、开发和评估测定甲基化指数的方法，甲基化指 数可用于疾病进展、治疗和对治疗反应的监测指标。
[000引本发明设及使用甲基化指数(有些文献说成甲基化状态，即S-腺巧蛋氨酸/S-腺巧 同型半脫氨酸)作为标志物、方法、机制、试剂、系统与试剂盒用于检测和诊断癌症和其它疾 病，也用于监测癌症进展，检测各种癌症和其它疾病的治疗效果。癌症进一步恶化发展一般 认为与进行性整体DNA低甲基化，区域性CpG过度甲基化和遗传物质不稳定性增强有关系。 甲基化指数降低与整体DNA低甲基化和遗传物质不稳定性增强有相关关系。因此，甲基化指 数是辅助健康状况与疾病进展\和的较好的标志物。
[0009] 发明的背景
[0010] S-腺巧甲硫氨酸或S-腺巧蛋氨酸（SAMe)几乎存在于体内所有的组织及体液中。 SAM对于转甲基作用运一过程至关重要，而甲基化几乎参与到生命的每一方面。SAM是体内 DNA、RNA、蛋白质、脂类及小分子甲基转移反应中的甲基供体。正常的胚胎发育需要适当的 DNA甲基化，有研究证明甲基转移酶缺失可能导致死亡（Pegg,A.E.，Feith,D.J. ,Fong, L.Y.,Coleman,C.S.,0'Brian,T.G.,and Shantz,L.M.,2003,Biochem.Soc.Trans.31,356-360)。许多肿瘤细胞中DNA的甲基化呈现异常，DNA甲基化模式的改变甚至可诱发致肿瘤因 子基因的表达或沉默肿瘤抑制因子的基因，有研究表明，给与晒齿类动物缺乏甲基的食物 将引发肝癌。
[0011] SAMe具有转硫基作用。SAMe脱甲基后生成S-腺巧同型半脫氨酸（SAH)，随后SAH水 解生成同型半脫氨酸，经转硫基作用后生成脫硫酸，随后进一步转换为半脫氨酸并最终成 为谷脫甘肤。谷脫甘肤是肝细胞的抗氧化剂，可作为解毒剂。
[0012] SAMe的另一个重要功能是转氨丙基作用。SAM脱簇后将氨丙基转移给与腐胺，生成 亚精胺和精胺，运两种物质对细胞生长、分化W及DNA和RNA的稳定至关重要。此外，该反应 过程的副产物甲硫腺巧(MTA)是一种强效止痛消炎药，运可能是SAMe对骨关节炎、类风湿性 关节炎和纤维肌痛的临床治疗有功效的原因。
[0013] SAMe是免疫体系中一种重要的物质，可维护细胞膜的正常功能，且有助于大脑中 血清素、稱黑激素及多己胺的等化学物质的产生与分解。缺乏维生素 B12或叶酸铁可造成 SAMe水平降低。SAMe还是一种抗氧化剂，可W保护机体免受活性氧分子的损害，活性氧分子 可能来自于机体自身或环境污染，被认为是造成衰老及变性疾病的重要因素。一般认为 SAMe可提高机体内其它氨基酸的功能水平。
[0014] 进一步的研究表明，SAMe经裂解酶裂解后转化为甲硫分子和高丝氨酸，它是tRNA 的氨基下酸链供体，也是生物素生物合成的氨基酸链供体。脱簇后的SAMe则是生物合成神 经调节物质多胺，亚精胺和精胺的氨丙基供体（Zappia et al(1979),Biomedical and Pharmacologcial roles of Adenosylmethionine and the Central Nervous System, page I,Pergamon Press.N.Y.)D
[0015] SAMe在临床上可作为肝脏疾病化riedel H，Goa，K丄?，and Benfield P. ,(1989)， S-AdenosyI-I-methionine: a review of its pharmacological properties and therapeutic potential in liver dysfunction and affective disorders in relation to its physiological role in cell metabolism.Drugs. 38，389-416)、关节 炎（Di Padova C,( 1987 ),Sadenosyl-I-methionine in the treatment of osteoarthritis:review of the clinical studies.Am J.Med.83，（Suppl. 5) ,6-65似及 抑郁症（Kagan，B, Sultzer D.L. ,Rosenlicht N and Gerner R.(1990), Oral S-adenosy!methionine in depressionia randomized,double blind,placebo-controlled trial. Am. J.Psychiatry 147,591-595.)的治疗药物。阿兹海默症患者脑脊髓液中的SAMe 水平降f氏(Bottiglieri et al，( 1990) ,Cerebrospinal fluid Sadenosy 1-1-methionine in depression and dementia:effects of treatment with parenteral and oral S-adenosy 1-1-methionine .J.Neurol .Neurosurg.Psychiatry 53,1096-1098.) D初步的研究 结果表明，给予SAMe可改善阿兹海默症患者的认知能力（Bottiglierietal(1994)，The clinical potential of admetionine(S-adenosyl-l_methioinine)in neurological disorders . Drugs 48,137-152.) D阿兹海默症患者脑脊髓液中的SAMe水平急剧下降 (Morrison et al，（1996)，Brain S-adenosyImethionine levels are severely decreased in Alzheimer's disease,Journal of Neurochemistry,67，1328-1331.)，中白 金森氏症患者血液中的SAMe水平也显著下降（Cheng et al，（1997), Levels of L-methionine S-adenosyItransferase activity in erythrocytes and concentrations of S-adenosy!methionine and S-adenosy!homocysteine in whole blood of patients with Parkinson's disease.Experimental Neurology 145,580-585.)。
[0016] 使用抗肿瘤药甲氨蝶吟的患者体内SAMe水平降化，该药物与SAMe-起使用可减少 其神经毒性（Bottiglieri et al(1994),The Clinical Potential of Ademetionine(S- adenosy!methionine)in neurological disorders,Drugs,48(2)，137-152.)。
[0017] 有研究报道艾滋病伴有痴呆症或痴呆/HIV病毒感染复合性脑病患者的脑脊液中 SAM-e水平，发现其SAM-e水平比无 HIV感染的痴呆病人明显降化（Keating et al(1991)， Evidence of brain methyltransferase inhibition and early brain involvement in HIV positive patients Lancet:337:935-9.)〇
[0018] De La Cruz等人的研究表明，SAMe是一种有效的抗氧化剂，长期施用SAMe可通过 增强抗氧化防御功能改变大脑、肝脏及肾脏组织中的氧化状态（De La Cruz et al， Effects of chronic administration of S-adenosyI-I-methionine on brain oxidative stress in rats.Naunyn-Schmiedeberg's Archives Pharmacol，2000，361: 47-52.)。
[0019] 无肝脏疾病及有肝脏疾病的患者口服SAMe后，其肝脏中谷脫甘版水平均有上升 (Vendemiale G et al，（1989),Effect of oral S-adenosy1-1-methionine on hepatic glutathione in patients with liver disease.Scand J Gastroenterol；24:407-15.)〇 在口服SAMe后，肝内胆汁齡积患者的搔痒症状及胆汁齡积有所改善(Giudici et al，化e use of admethionine(SAM-e) in the treatment of cholestatic liver disorders.Metaanalysis of clinical trials.IniMato et al editors.Methionine Metabolism:Molecular Mechanism and Clinical Implications.Madrid:CSIC Press; 1992pp67-79.)。而原发性纤维肌痛患者在短期服用SAMe后其症状也有所改善(Tavoni et al,Evaluation of S-adenosyImethioine in Primary Fibromaylgia. The American Journal of Medicine,Vol 83(suppl 5A),PP 107-110,1987. )D此外SAMe还可用于骨关节 炎白勺、冶疗（Koenig B.A long-term( two years ) c I in i ca I trial with Sadenosylmethionine for the treatment of osteoarthritis.The American Journal of Medicine,Vol83(su卵I 5A)，Nov.20，1987pp 89-94)。
[0020] SAMe在细胞的基础代谢过程中发挥重要作用，因此在许多似乎不相关的领域仍具 有重要的临床意义，其中它在酒精性肝硬化的临床治疗方面的应用最引人瞩目，因为酒精 性肝硬化在医学上目前还无法治愈DMato等人的研究表明口服SMe可将酒精性肝硬化的总 死亡率和/或发展为肝移植的概率降化达29%，而安慰剂治疗组仅12% (Mato et al (1999),S-adenosylmethionine in alcohol liver cirrhosis:a randomized,placebo-control led ,double blind,multi-center clinical trial,Journal of Hepatology,30， 1081-1089.)〇
[0 021] SAMe不仅可W减弱肿瘤坏死因子-a所造成的损害，同时还可减少其分泌量，因此 在这种炎症因子增加时施用SAMe可获得很好的效果（Watson WH，Zhao Y，Chawla民K， (1999)Biochem J Aug.15;342(Pt I):21-5.SlSadenosylmethionine attenuates the Iipopolysaccharide-induced expression of the gene for tumour necrosis factor alpha.)。还有研究表明，SAMe具有减弱强效免疫抑制剂环抱素 A的毒性的功能(Galan A,et al，Cyclosporine A toxicity and effect of the s-adenosylmethionine,Ars Pharmaceutica，40:3;151-163,1999.)D
[0022] 在体外培养人红细胞的过程中添加 SAMe时，SAMe可穿透细胞膜并使细胞内ATP增 加从而使细胞形态得W恢复化I^iedel et al，S-adenosyl-lmethionine:A review of its pharmacological properties and therapeutic potential in liver dysfunction and affective disorders in relation to its physiological role in cell metabolism, Drugs38(3):389-416，1989)。
[0023] 有研究表明SAMe有利于偏头痛的治疗（Friedel et al，S-adenosyl-Imethionine:A review of its pharmacological properties and therapeutic potential in liver dysfunction and affective disorders in relation to its physiological role in cell metabolism,Drugs 38(3):389-416,1989)。
[0024] SAMe也用于治疗外周动脉闭塞性疾病患病人，发现它可W降化的血液粘稠度，可 能是通过影响红细胞的变形能力实现的。
[00巧]用发酵法可获得纯度为60%~80%的SAMe,也就是说最终产物包含60%~80%具 有生物活性的（S，S)-SAMe，其余20~40%为不具生物活性(R，S)-SAMe(Gross，A. ,Geresh, S. ,and 师itesides，Gm(1983)Appl .Biochem.Biotech.8,415 ?) D酶促合成方法得到的不具 生物活性的同分异构物的比例超过60%(Matos，JR，RauschelFM，Wong，CH.S-Adenosylmethionine:Studies on Chemical and Enzymatic Synthesis.Biotechnology and Applied Biochemistry 9,39-52(1987) D利用对映体分离技术可^分离、纯化具有活 性的SAMe。最新的分离技术可^大规模地分离手性分子，且花费较小。此外，用特定的立体 结构选择法有望合成具有生物活性的对映体，但该技术目前尚未成熟(Matos, JR ,Rauschel FM,Wong,CH.S-AdenosylmethionineiStudies on Chemical and Enzymatic Synthesis . Biotechnology and Applied Biochemistry 9,39-52(1987；Hoffman , Chromatographic Analysis of the Chiral and Covalent Instability of S-adenosy1-1-methionine,Biochemistry 1986，254444-4449:Segal D and Eichler D，The Specificity of Interaction between S-adenosyl-1-methionine and a nucleolar2-0-methyltransferase,Archives of Biochemistry and Biophysics，Vol.275,No .2， December，pp.334-343,1989)D
[0026] De la Haba最先证明硫是手性分子，仅其中一个可合成并应用在生物领域（（De Ia Haba et al 1.六111.化6111.5〇〇.81，3975-3980，1959))。0魔和1?歴的甲基化对于细胞的正 常生长至关重要，SAMe是该甲基化反应中唯一的甲基供体，该过程由甲基转移酶催化。 Segal和Eichler等的研究表明（S，S)-SAM-e与酶的结合紧密度比无生物活性的(R，S)-SM-e强10倍，从而证明了一种与硫手性中屯、空间特异的结合的新方式。有报道表明，（R，S)-SAM-e与其它的甲基转移酶结合的程度与（S，S)-SAM-e-致，因此(R，S)-SAM-e可充当该酶 的竞争抑制剂（Segal D and Eichler D，The Specificity of Interaction between S-adenosyI-I-methionine and a nucleolar 2-0-methyltransferase,Archives of Biochemistry and Biophysics，Vol.275,No.2,December pp.334-343,1989；Borchardt 民T and Wu YS, Potential inhibitors of S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.民ole of the Asymmetric Sulfonium Pole in the Enzymatic binding of S-adenosyl-1-methionine,Journal of Medicinal Chemistry，1976，Vol 19，N〇.9，1099-1103.)。
[0027] 无论是在其光学纯的SAMe对映体形式或是与其它外消旋混合物，SAMe在室溫下的 稳定性不佳，可能降解而产生不可取的产物。SAMe与其对映体呈现分子内不稳定从而导致 在高溫及室溫条件下分子失去稳定性或断裂。因此获得新的SAMe的稳定盐成为许多专利的 主题，为工业化生产SAMe提供基础。本发明得W使用现有技术中已公开的稳定SAMe对映体 的SAMe盐进行抗体鉴定和其它方面的工作。
[0028] 近年来，临床诊断等领域都有广泛的发展，既在于越来越多的可被简便而准确测 定的体液中的代谢物或外源性药物等分子，也在于检测方法方面的进展。在过去的几十年 中，许多物质如禁忌药物和其它生物分子的检测已是司空见惯。基于抗原与抗体反应的免 疫检测也被广泛地应用在运一方面。基于抗体的特异性及高亲和力，免疫检测可W精确地 定量检测生物液体中的极低浓度的物质。
[0029] 因此，需要一种改进的检测方法，W定量甲基化指数，并把甲基化指数作为生物指 标，W检测、诊断癌症及其它疾病，并有助于监测病情发展、治疗效果和预后。
[0030] 图标说明
[0031] 【图1】为化ISA测定两个抗SAM单克隆抗体效价的曲线。其中X-轴显示0D450值，Y-轴显示纯化的腹水抗体在化g/iil时的稀释倍数。
[0032] 【图2】为不同的SAM类似物和SAM与抗SAM单克隆抗体的竞争交叉曲线。ELISA方法 测得SAM类似物（SAH、蛋氨酸、腺巧）与84号克隆的交叉反应不超过1.25%。其中X-轴表示 SAM和SAM类似物不同浓度值，WnM为单位，Y-轴是竞争抑制比率。
[0033] 【图3】为不同的SAM类似物和SAM与抗SAM单克隆抗体的竞争交叉曲线。ELISA方法 测得SAM类似物(SAH、蛋氨酸、腺巧)与118号克隆。其中X-轴表示SAM和SAM类似物的不同浓 度值，反应不超过1% D^nM为单位，Y-轴是A/A0,即是有竞争抗原的孔和空白对照孔(零竞 争孔)的0D450值的比。
[0034] 【图4】为竞争性ELISA定量SAM的标准曲线。其中X-轴表示SAM浓度的对数，Y-轴显 示抑制反应的LOG IT值。
[0035] 【图5】为本发明改进的新的SAM类似物的合成过程。
[0036] 【图6】为蛋氨酸转硫代谢途径。缩写:THF:四氨叶酸;MS:蛋氨酸合成酶;B歷T:甜菜 碱同型半脫氨酸甲基转移酶;MAT:蛋氨酸腺巧甲基转移酶;SAM: S-腺巧蛋氨酸;SAH: S-腺巧 同型半脫氨酸;SA皿:S-腺巧同型半脫氨酸水解酶;ADA:腺巧脱氨酶;AK:腺巧激酶;CBS:脫 硫酸0-合成酶。发明的综述：
[0037] 本发明提供用于治疗哺乳动物类癌症的方法，包括W下步骤：（a)确定的所述哺乳 动物类患有癌症的生物样品中的甲基化指数；（b)测定所述哺乳动物类的样品中甲基化指 数;和(C)基于(b)的结果选择合适的癌症治疗方案治疗所述哺乳动物类的癌症。
[0038] 甲基化指数是通过下列步骤测得的：（i)采集样品；（ii)样品与抗S-腺巧蛋氨酸特 异性抗体混合；（iii)测定样品中的S-腺巧蛋氨酸与（ii)中抗体的结合情况；（iv)定量 (iii)中S-腺巧蛋氨酸抗体与S-腺巧蛋氨酸结合量，W算出样品中S-腺巧蛋氨酸的浓度； (曰2)用本发明建立的免疫测定方法测定体内S-腺巧同型半脫氨酸含量；（曰3)计算(al)/ (a2)比率即是样品的甲基化指数。
[0039] 本发明还提供了确定癌症治疗方案用于治疗肿瘤患者的方法，包括：（a)测定患者 样品中的甲基化指数；（b)比较样品中和对照组中甲基化指数的水平，W确定所测的甲基化 指数是否有预测意义;和(C)根据(b)的结果决定合适的治疗方案。根据甲基化指数的大小 不仅指导治疗方案，而且可W提示病人对当前治疗反应好还是反应不佳。
[0040] 治疗人类抑郁症或屯、理疾病的方法由W下组成：用W下方法测定人类体内S-腺巧 蛋氨酸含量：（i)采集样品；（ii)样品与抗S-腺巧蛋氨酸特异性抗体混合；（iii)测定样品中 的S-腺巧蛋氨酸与（ii)中抗体的结合情况；（iv)定量(iii)中S-腺巧蛋氨酸抗体与S-腺巧 蛋氨酸结合量，W算出样品中S-腺巧蛋氨酸的浓度;分析甲基化指数和抑郁症或屯、理性疾 病的关系;根据(b)的相关结果决定合适剂量的有效药物治疗抑郁症或屯、理性疾病。
[0041] -种用于在受试者中诊断精神性疾病或/和神经变性病症或预测受试者对于精神 性疾病或/和神经变性病症的易感性的方法，该方法包括：（a)获得一个或多个来自受试者 的生物样品；（b)测定样品中S-腺巧蛋氨酸水平或甲基化指数;和(C)比较(b)中样品中的生 物标志物(S-腺巧蛋氨酸水平或甲基化指数)的水平与对照样品中相应的生物标志物的水 平，其中如果来自受试者的样品的两个或更多生物标志物的水平与对照的相比较明显异 常，预计受试者将容易患精神性疾病或神经退行性疾病。
[0042] -种检测在患者中疾病的存在或不存在的方法，其中所述的疾病是伴随着S-腺巧 蛋氨酸缺陷的各种疾病:选定怀疑患有所述疾病的患者或处于具有所述疾病的风险的人； 从所述患者或潜在患者中收集生物样品;使用从S-腺巧蛋氨酸的半抗原类似物制备的抗体 测定所述生物样品中S-腺巧蛋氨酸的水平;分析生物样品中S-腺巧蛋氨酸的水平与所述疾 病存在或不存的关系。
[0043] -种用于评估受试者是否需要进行用S-腺巧蛋氨酸的单独治疗或与其它化疗剂 合用的方法，包括W下步骤组合：（a)从怀疑需要运种治疗的受试者中收集体液样品；（b)测 定所述样品中S-腺巧蛋氨酸水平的量；（C)测量的S-腺巧同型半脫氨酸的水平并计算的甲 基化指数；（d)比较所述样品与的正常标准的甲基化指数;和（e)如果所述样品的甲基化指 数超出正常范围，提示需要S-腺巧蛋氨酸治疗。
[0044] 对于本发明的阐述
[0045] 本发明提供了对患有多种疾病的的患者的检查、诊断、治疗和健康评估。他们的健 康状况可W通过精确地测定检测S-腺巧蛋氨酸和S-腺巧同型半脫氨酸的浓度进行评估。准 确测定上述分子 将会算出甲基化指数，该指数可反映人体的健康状况。
[0046] 本发明的测定法使用特性抗S-腺巧蛋氨酸及其特定类似物。该抗体是通过接种宿 主动物获得的。所使用的免疫原包括免疫W下分子式的一系列化合物(S-腺巧蛋氨酸半抗 原一类)的直接或间接禪合物：
[004引包括其对映体、非对映体、对映体富集的混合物、外消旋混合物、一个原子富集的 形式或其结晶形式、非结晶形式、无定形形式、其带电和不带电的形式、溶剂化物、代谢物W 及它们的盐;其中A是从下组中选出：
[(K)加]其中，M是选自N、N+、C、S、S+、Se、Se+和P的组成的组中；--表示用于各如上所定义 的基团的键合位置；
[O化1 ] X独立地选自H、邸3、OfcOH、邸2畑2、OH、0邸3、畑2、SH、C册和CN组成的组中；
[0化2 ] Z独立地选自邸3、OfcOH、邸2畑2、OH、0邸3、畑2、SH、C册和CN组成的组中；
[0化3] B和C是独立地选自H、0H、N出、甜、F、C1、化和I组成的组中；
[0化4] D独立地选自畑2、OH、甜、F、Cl、化和I组成的组中；
[0化日]Y独立地选自H、邸3、OfcOH、邸2畑2、OH、0邸3、畑2、SH、C册和CN组成的组中；
[0化6] W独立地选自H、COOH、CON出、COOC出、CN、C册组成的组中及运些官能衍生物；
[0057] 然后收集宿主动物的血清。抗体制备细节请参见我们的另外一个美国专利 8344115,其全部内容通过引用结合于此，如同它被在此重复一样。
[0058] 在另一个方面，本发明提供小鼠单克隆和兔多克隆抗体，包括天然的、重组的、人 源化及嵌合的抗S-腺巧蛋氨酸抗体和抗S-腺巧同型半脫氨酸抗体，制备方法见美国专利 8344115中所描述。
[0059] 本发明还提供了使用抗SAM和SAH单克隆抗体的免疫测定方法，W定量甲基化指数 和SM，明确SAM和甲基化指数，对于指导和选择使用SM的治疗方案和评估病人的健康状态 等。
[0060] 本发明还进一步提供使用该甲基化指数作为人群普查标记物，提示个体的一般健 康状态。
[0061] 本发明进一步提供了快速、可靠和廉价的免疫测定方法来测量尿或血清/血浆样 品中SAM和SAH水平，全血半定量快速检测试纸条及小型设备在开发中。在本发明的一个实 施方案中，膜是预浸用抗SAM(或抗SAH)抗体-染料(胶体金)偶联物。第二抗体被固定在对照 区。抗SAM(或抗SAH)抗体被固定在试验区。样品沿着膜迁移流动时，样品中的抗原与胶体金 偶联的抗体形成抗原-抗体复合物。如果SAM(或SAH)存在，抗原-抗体复合物形成，并会被在 运两个测试和控制区的抗体捕获，因此粉红色(胶体金)条带就会在运两个区域形成。如果 SAM(或SAH)抗原不存在，抗体-染料(或胶体金)结合物通过对照区二抗体被捕获，从而粉色 带只见于对照区，运表明试验条件本身是正确地，结果是可靠和有效的。标准品和样品的同 时测试，比较测试区的和对照区的信号（阳性带颜色和宽度)强度，来大致确定SAM(或SAH) 含量的高低，一种半定量的SAM(或SAH)的测试方法。
[0062] 如上述同样机制的竞争性免疫测定方法，试验区固定有SAM(或SAH)抗原。样本中 的SAM(或SAH)与固定在测试区膜上的SAM(或SAH)竞争性地结合数量有限的抗体-染料(胶 体金)偶联物。来自标本中的SAM(或SAH)越多，膜上SAM(或SAH)与抗体偶联物结合的越少， 粉色线会月浅。如果样品中没有SAM(或SAH)或者极低的，测试区和控制区会同时出现两个 较强的带(或线）。
[0063] 半定量快速检测试纸条是消费者或患者在服用SAM-e作为治疗药物前，治疗过程 中，W及决定何时停药时使用较为理想的检测方法。
[0064] 本发明还提供用于哺乳动物类疾病个性化用药的方法。该方法包括测量患者体液 中的甲基化指数，基于所测的甲基化指数水平，提出一个可能有效的治疗方案。
[0065] 本发明还提供一种用于监测癌症患者的治疗功效的方法，诊断时测定第一个时间 点的甲基化指数;治疗患者疗程完成后测定第二个时间点的甲基化指数水平；比较第二个 时间点的第一个时间点的受试者的甲基化指数变化，W确定癌症治疗的效果，甲基化指数 提高预示治疗效果好。
[0066] 在另一个方面，本发明提供用于治疗哺乳动物类癌症患者的方法，该方法包括W 下步骤的方法：（a)测定述哺乳动物类癌症的样品的甲基化指数；（b)分析所测得到的甲基 化指数与相应的癌症进度发展的关系；（C)基于(b)的结果选择合适的癌症治疗方案治疗所 述哺乳动物类患有的癌症。该方法包括收集来自I期、期或IV期癌症患者血液样品， 并分别测定SAM和SAH的水平，然后计算出甲基化指数，探求甲基化指数与癌症阶段(或分 期）的关联关系，然后选择适当的治疗方案用于治疗所述哺乳动物。
[0067] 本发明也在确定DNA甲基转移酶抑制剂对于治疗癌症到底是否有效，有多大效果 的问题具有非常好的评估价值。甲基化指数是评估DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂在特定组 织和器官内如何发挥作用，发挥作用的程度和特异性方面的最好的工具或手段。因此，用本 发明提供的免疫方法简单方便地测定甲基化指数，可W评估DNA甲基转移酶抑制剂功效。 [00 6引本发明还提供：
[0069] 1、指导用S-腺巧蛋氨酸进行的治疗
[0070] SAMe治疗的有效的疾病包括轻度到中度的抑郁症，骨关节炎（比非类固醇消炎药 更好），纤维肌痛。SAMe治疗效果一般的情况也有所报道。最有可能的原因是与其它多数疾 病的治疗情形类似，即某些患者，则不适合使用的SAMe而另一些病人是SAMe治疗的很好候 选对象。为了找出病人是否是使用某些药物的最佳候选，有些必要的检测需要做。申请人已 经发现，最好是在治疗疾病之前，测定血液或尿液样品中SAM的水平。
[0071] WSAMe为辅助治疗的各种疾病，例如肝脏疾病，维生素 B12或叶酸缺乏，癌症，用左 旋多己化-多己）治疗帕金森氏症患者。原因是运些疾病可引起体内的SAM水平明显降低肯 定的SAM的水平是否实际上是减少了，最好的方式是直接测量血浆的SAM水平。有的时候SAM 水平可W因治疗和疾病本身等情况有所降低。因此，监测的SAM水平对于改善整体的治疗效 果非常重要的，无论治疗药物中是否有SAMe。在W适当的治疗方案治疗抑郁症，骨关节炎， 纤维肌痛，帕金森氏，阿尔茨海默氏病，痴呆，肝脏疾病，滑囊炎，肌腫炎，慢性腰背痛，多发 性硬化症，脊髓损伤，偏头痛，铅中毒，W及延缓衰老等，当SAM水平低于一定的阔值时，补充 合适剂量的SAMe将有利于整体治疗。当治疗还没有开始，如果检测到SAM不足，先静脉注射 SAMe, W上疾病的症状会迅速缓解。
[0072] 另一方面，由于药物或食物与SAMe的相互作用的信息报道与研究非常有限，加上 SAMe也不是没有的显著精神和屯、血管方面的不良影响和风险运一事实，正确的做法是，在 没有条件听取医生的建议（Fet;row,C.W.et al. "Efficacy of the dietary SU 卵 Iement Sadenosyl-L-methionine."Annals of Pharmacotherapy 35no. 11(November 2001): 1414-1425)的情况下，应该积极指导消费者，W避免运种未受监控地服用作为膳食补充剂 SAMe出现不期望发生的结果。SAMe与其它抗抑郁的处方同时服用会引起五径色胺综合征， 运是相当危险的。SAM的免疫测定方法，是让临床实验室和患者自己能够快速知道体内SAM 水平的最佳途径。该免疫分析灵敏、简单、快速、不需要昂贵的设备。不同时间测定的结果之 间是可比的。此外，正常血浆的SAM浓度似乎因 W下因素而有所不同：性别、个体的体重、种 族、饮食、健康状况、是否服用药物等等。因此，监测个体的SAM水平且与该个体的其它时间 或正常对照下SAM水平相比较，对于正确地指导个体化使用SAMe, W达到最佳的治疗结果起 到至关重要的作用。
[0073] 2、疾病发生和预后与甲基化指数的关联
[0074] 甲基化指数定义为SAM与SAH的浓度比。在某些情况下，用甲基化指数比SAM水平尤 其重要而准确。原因包括= (I)SAM是在甲基转移酶(COMT)作用后SAM甲基化反应的直接末端 产物。（2)SAM水平随种族、性别、体重和饮食而变化。甲基化指数可W减少运些因素引起的 差异。
[0075] 癌症被认为具有遗传和表观遗传双重起因。DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰 之一。越来越多的研究发现一度被忽视的表观遗传学对许许多多的生命现象都有影响，运 说明甲基化对癌症的影响只能会是更加深远。在癌症发生的不同阶段，癌细胞中DNA甲基化 水平是不同的。异常DNA甲基化在癌症中普遍存在，表现为基因组范围总体低甲基化和区域 性高甲基化的特定模式。总体DNA低甲基化与原癌基因，例如C-JUN，C-MYC，和C-Ha-Ras的激 活相关联，并导致基因组的不稳定性。位于肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛的高甲基化导 致转录静化和基因组不稳定。CpG岛高甲基化是引起基因失活突变的另外和/或补充机制， 现今被认为是癌症发生的重要因素。肿瘤抑制基因（例如p53基因）启动子区域CpG岛高甲基 化引起的基因失活还与癌症的发展和不良预后相关。研究结果表明针对甲基化模式或状况 的治疗和预防性使用药物或营养添加剂在人类肝细胞癌化CC)中的意义，开辟了使用分子 祀点，包括在此研究中发现的祀点，对有效抑制肝细胞癌的发生和发展有重大意义(Diego F. Calvisi et al . ('Mechanistic and Prognostic Significance of Aberrant Methylation in the Molecular Pathogenesis of Human Hepatocellular Carcinoma.'' J Clin Invest.2007:117(9):2713-2722.)。
[0076] 去甲基化制剂可降低DM甲基化的水平，是一种颇具前景的化学治疗药，目前已被 用于治疗癌症的研究化Steller M.''DNA methylation and cancer therapy:new developments and expectationsCurr Opin Oncol.2005Jan;17( I):55-60.2005Jan;17 (I):55-60.)O
[0077] 在本发明中，癌症或肿瘤包含了所有的在病人体内恶性生长的新生物，包括原发 肿瘤和任何转移肿瘤。癌症可W分为液体肿瘤或实体肿瘤。液体肿瘤包括血液来源的肿瘤， 如骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤）、白血病(例如华氏综合症、慢性淋己细胞白血病和其它白血 病）、淋己瘤(如B细胞淋己瘤、霍奇金淋己瘤）。实体肿瘤可能出现在器官中，包括肺癌、乳腺 癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌及肝癌等。在本文中，癌细胞包含了肿瘤细胞，指的是具 有异常的细胞分裂速率(速率增加）的细胞。癌细胞包含但不仅限于肉瘤，还包括鱗状细胞 癌、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、恶性腺瘤、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、未分 化型癌、支气管癌、黑素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、肝外胆管癌、乳头状癌、移行细胞 癌、绒毛膜癌、胚胎性癌、乳腺癌、胃肠癌、结肠癌、膀脫癌、前列腺癌W及头部和颈部的鱗状 细胞癌等；肉瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索肉瘤、血管 肉瘤、内皮肉瘤、淋己管肉瘤、滑膜肉瘤、间皮肉瘤等;血液肿瘤包括骨髓瘤、白血病(例如急 性骨髓性白血病、慢性淋己细胞白血病、粒细胞性白血病、单核细胞白血病和淋己细胞性白 血病)和淋己癌（如滤泡性淋己瘤、套细胞淋己瘤、弥漫性大B细胞淋己瘤、恶性淋己瘤、浆细 胞瘤、网状细胞肉瘤和霍奇金病）；神经系统肿瘤则包括神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经管细胞 瘤、神经銷瘤或室管膜瘤等。
[0078] 3、胚胎发育与人的全面健康与甲基化指数的关联
[0079] SAM和SAH的水平可能通过影响DNA的甲基化水平(运种作用反过来将引起基因激 活的特定改变)来控制体细胞胚胎发生。SAM水平上升可能是胚胎形成和发育成完整的胚胎 的先决条件（Munksgaard D, et al. ('Somatic embryo development in carrot is associated with an increase in lev els of S-adenosy!methionine ,S-adenosy!homocysteine and DNA methylation/'Physiologia Plantarum,Volume 93, Issue I,Article first published online:90CT 2008)。
[0080] 4、一般人的健康评估和筛选与甲基化指数的关联
[0081] 甲基转移酶(MT)在人类疾病的形成过程中起重要作用。多己胺(DA)多己胺是由患 者体内多己胺过多造成。比如，有关精神分裂症起因的多己胺(DA)假说多己胺(DA)是说精 神分裂症是由患者体内多己胺过多造成。儿茶酪氧位甲基转移酶(COMT)可降解中枢神经系 统中的儿茶酪胺类神经递质(包括多己胺类），COMT为一些精神分裂症的诊断治疗奠定了基 础（Renson J et al ('Action of the inhibitors of catechol ortho-methyl transferase on the adrenal catecholamines in the rat.''Arch Int Physiol Biochim. 1960May ;68:534-7.)。人体内有超过30种不同的甲基转移酶，其底物都是对人体 功能至关重要的多种物质。
[0082] 甲基化指数被作为人类总体健康、"活方'或"健康"的一个重要指标。
[0083] 此外，血浆中正常的SAM浓度因人而异，主要取决于性别（一般来说男性高于女 性），个体体重，还可能种族和饮食等等。SAM和SAH在代谢上关联紧密，因此SA田农度受到W 上各因素的影响与SAM相似，用两种物质（SAM和SAH)的比值应该很有可W排除或减轻运些 因素的影响。
[0084] SAH和SAM与屯、血管疾病、抑郁症、癌症W及与老化相关的疾病如阿兹海默症等的 关联是有据可查的。甲基化对于胎儿的发育、分化、蛋白质表达的表观遗传调控(主要通过 DNA，RNA和组蛋白的甲基化)十分关键。SAM和甲基化指数的高低是衡量人体"活力"的指标 或"健康"的标志。
[0085] 本发明的重大意义在于其提供了：
[0086] 1、直接、准确地定量所有各种生物样品甲基化指数的方法。
[0087] 2、在所有的实验室中都可W做到的直接、准确地定量甲基化指数的方法。
[0088] 3、直接、准确地定量甲基化指数的方法，用于评估整体的健康状况，肿瘤(癌症)预 测和预后，所有疾病的治疗(用S-腺巧蛋氨酸的治疗或其它治疗)效果的评估。
[0089] 4、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在肿瘤鉴别诊断中的应用。
[0090] 5、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在癌症化疗耐受（效果）中的应 用。
[0091] 6、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在胚胎形成，分化及衰老研究中 的应用。
[0092] 7、用试纸条或其它介质的半定量和定性免疫方法测定甲基化指数，W方便消费者 用于上述1-6方面。
[0093] 8、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，W方便消费者监测S-腺巧蛋氨酸作为处方和非处方药物治疗一些疾病状态。
[0094] 9、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，W方便消费者用于尿 液和血样品。
[00M] 10、定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，用于指导并监测S-腺巧蛋氨酸作为药物的治 疗情况。
[0096] 本发明也提供用S-腺巧蛋氨酸和包括S-腺巧蛋氨酸的综合治疗分析及方案。本发 明尤其提供了合成Aza-S-腺巧蛋氨酸半抗原的重要改进。详细阐述见下合成方案1和图5。
[0097] 合成方案1 [009引
5
[0099] 收集了病人血浆样品，用含有本发明中半抗原制备的抗体的酶联免疫吸附实验 化LI SA)方法测定了 S-腺巧蛋氨酸(SAM)和S-腺巧同型半脫氨酸(SAH)含量。ELISA形式包括 W下几种：
[0100] 形式1:(1)样品或标准品，（2)抗体，（3)半抗原-酶偶联物，（4)二抗包被的试纸条 或酶联板，二抗举例:羊抗鼠抗体或羊抗兔抗体，（5)洗涂液，（6)酶底物，（7)终止液(如果使 用"终点"模式，终止液可有可无;如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0101] 形式2: (1)样品或标准品，（2)抗体，（3)二抗-酶偶联物，（4)半抗原-载体蛋白包被 的试纸条或酶联板，（5)洗涂液，（6)酶底物，（7)终止液(如果使用"终点"模式终止液可有可 无;如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0102] 形式3: (1)针对2个决定簇的2个配对抗体，（2)样品或标准品，（3)在（1)中的一个 抗体与酶偶联，（4)洗涂液，（5)酶底物，（6)终止液(如果使用"终点"模式终止液可有可无； 如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0103] 本发明同时阐明基于免疫学方法化LISA等）的测定SAM的检测试剂盒(包含抗SAM 的抗体）。化ISA试剂盒可W是W上任何一种形式。例如，ELISA试剂盒可W包括W下成分： (a)二抗吸附在固相介质上，（b)包被（固化)半抗原及类似物，免疫原或其它含有免疫原的 类似的蛋白，（C) W固体或溶解形式的酶底物，（d)示踪物标记半抗原或类似物(示踪物或酶 偶联物），（e)缓冲液和洗液，（f)附加成分，主要用于防止非特异性吸附或结合或聚集。（g) 加样枪、解育器、标准品、标准曲线、结果读数仪。
[0104] SAM和SAH含量测定W后，甲基化指数即可W算出（SAM/SAH)，用于评估个体的健康 状况。从11里健康人的测定结果看，健康正常人SAM水平为147 ± 16nM，SAH水品为29 ± 1 InM, 甲基化指数为5 ± 1。癌症病人平均SAM为103 ± 52nM，动脉粥样硬化病人平均SAM为113 ± 15nM，W含有兔单抗测定SAH试剂盒初步测定动脉粥样硬化病人血浆中SAH明显升高，SAM/ SAH则明显降低。肝脏病人平均SAM为45 ± SnM(从26例样品），比正常人的SAM水平明显降低。 SAM和SAH的比值，及甲基化指数比SAM或SAH能够更精确地反映一般健康状况，疾病状态，发 展和预后。一般认为健康人的甲基化指数应该大于4(该值与检测方法有关，运个值是由高 压液相和质谱的方法算出来的）在病理状况下，由于SAM水平降低，同时SAH水平升高，甲基 化指数小于4,甚至小于1。降低的甲基化指数反过来会影响体内重要物质如DNA，RNA，多肤， 激素，神经递质等的甲基化过程，从而导致身体病变的发生或恶化。
[0105] 甲基化指数也可W用来决定化疗方案。甲基化指数明显降低的肿瘤病人可W使用 较积极的方案。甲基化指数可W用来根据癌症阶段和每个病人的具体情况选择合适的治疗 方案，显示甲基化指数在个体化治疗和用药中的应用价值。
[0106] 实施例简述
[0107] W下实施例旨在展示上述提及的部分检测方法，化合物和抗体的应用个例(所有 设及的数字均有变动范围且受具体实验条件所限，此为生物学领域实验受多方面影响的常 理)和治疗方案，不应该认为有可能限制本发明的范畴。
[010引实施例1
[0109] 制备抗S-腺巧蛋氨酸和S-腺巧同型半脫氨酸单抗隆和多克隆抗体
[0110] 试剂：
[0111] AdaM:Azaadenosyl 二氨基蛋氨酸，
[0112] ASAM: Aza-SAM,或者氮-腺巧蛋氨酸
[0113] BgG:牛丫球蛋白
[0114] BSA:牛血清白蛋白
[0115] BTG:牛thyrogloblulin
[0116] CSAM:碳-腺巧蛋氨酸或者6-甲基6-去氨西奈芬净
[0117] daH:去氨-5-腺巧同型半脫氨酸
[011引 da服0:daH横酸盐
[0119] DCC:二环己基碳二亚胺
[0120] DMF:二甲基甲酯胺
[0121] EDAC:乙基碳二亚胺盐酸盐
[0122] ELISA:酶联免疫吸附检测
[0123] GAM plate/strip:羊抗鼠免疫球蛋白包被吸附板或者条
[0124] GAR plate/strip:羊抗兔免疫球蛋白包被吸附板或者条 [01巧]HRP:辣根过氧化物酶
[0126] IB:解育缓冲液
[0127] KLH:血蓝蛋白
[012引畑S: N-径基班巧酷亚胺 [01巧]PBS:憐酸盐缓冲盐水
[0130] RT:保留时间（高效液相色谱），或室溫
[0131] SAH: S-腺巧同型半脫氨酸
[0132] SAM: S-腺巧蛋氨酸
[0133] 1、制备AdaM-NHS:把21.7mg(0.107mmole)的DCC 和7.2mg(0.061mmole)NHS 加入到 装有AdaM(15. lmg，ca.0.041mmole)e的瓶子中过夜，残留固体真空干燥3-4小时，在氮气环 境中加入大约105毫升干燥的DMF，然后将瓶子密封。该溶液在室溫环境下揽拌过夜。薄层色 谱分析显示有N服醋形成。
[0134] 2、准备AdaM-BSA:称取59.Smg BSA加入圆底烧瓶中，加入5毫升新鲜制备的IOOmm 的憐酸钢缓冲溶液，pH值为8.25。在4度水浴中剧烈揽拌，将上述方法制备的NHS每隔几分钟 缓慢加入10化。共加入150化后，混合物变为色。再加一毫升的DMSO溶液助溶。另外加50化的 NHS到DMF中，溶液再次变色。采用水浴超声处理5分钟后分5次各加入10化的畑SdDMF中共加 入15化L的N服后，超声混合20分钟。为了确保无游离半抗原，用PBS缓冲液透析（1.5升X 4) 2 天W上。最终体积约36毫升，估算BSA浓度为1.66mg/mL。
[0135] 3、准备AdaM-KLH:利用上述方法，称出17.5毫克KLH，15.1毫克AdaM。透析后的最终 体积为29.5毫升，浓度为0.6毫克/毫升。
[0136] 4、准备AdaM-PlX:称取4.72mg AdaM溶于ImL DMF中，再加入6.5毫克抓C. HC巧口 4. Omg的NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫过夜。称取1.5mg的PlX溶于pH 8.2的ImL IOmM PBS中，随后将活化的AdaM缓慢的加入至化化缓冲液中，暗处混合揽拌过夜。混合物用 IOmm抑7.3的PBS透析48小时，透析后的最终体积为3.5毫升，浓度为1.4毫克/毫升。
[0137] 5、准备SAH-BSA:称取SAH(Sigma)3. Smg溶于1.5mL DMF中，再加入 10毫克抓C.HCl 和4.5mg的NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫24小时。称取12.9毫克BSA溶于2mL pH 7.810mm的PBS中。将SAH溶液缓慢加入到BSA溶液中混合，4度暗处混合揽拌过夜。反应混合 物化Omm抑7.3的PBS透析72小时。透析后的最终体积为8.4毫升，浓度为1.4毫克/毫升。 [0 13引 6、准备SAH-化L:称取1.5mg的SAH溶于ImL DMF，再加入4毫克抓C ? HC巧日2mg的 NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫过夜。称取1.5mg的化L溶于4.7血50mM pH 9.6PBS 中，随后将活化的SAH缓慢的加入到化L缓冲液中，暗处混合揽拌过夜。混合物用IOmm pH 7.3的PBS透析48小时，透析后的最终体积为7.0毫升，浓度为0.93毫克/毫升。
[0139] 7、制备单克隆抗体SAM和SAH的一般流程：
[0140] 基于Kolher和Milstein的方法（自然，1975,第256期，495-497页），目前常见的方 法是用小鼠制备单克隆抗体。
[0141] 用Ba化/c小鼠做单克隆抗体的免疫和腹水生产，多次皮下注射免疫原（总体积为 ImL)初始注射用完全弗氏佐剂和AdaM-BSA或AdaM-KLH按照1:1的比例完全混合并在PBS中 充分乳化。随后的注射用弗氏不完全佐剂。
[0142] 定期收集免疫动物的血液离屯、分离细胞。将获得的抗血清进行检测评估，W确定 免疫反应和抗体效价。根据应用程序，抗体可直接使用。在必要时，可W进一步纯化免疫球 蛋白，用硫酸锭或硫酸钢或蛋白A的柱层析。
[0143] 可W通过注射到宿主体内获得腹水， 然后通过蛋白质的亲和柱纯化腹水得到单克 隆抗体。也可W通过体外培养的方法制备杂交瘤细胞制备单克隆抗体。
[0144] 融合前=天小鼠静脉注射免疫原做最后加强。收获小鼠脾脏后用弗式压碎器磨 碎。脾细胞与骨髓瘤NS-I细胞按5:1的比例融合。融合后的细胞悬液，再接种在96孔板中。杂 交瘤细胞在含18 %胎牛血清的RPMI1640中生长，加入HAT和HT进行补充筛选。用AdaM-P化筛 选出的阳性克隆进行进一步培养。最后的选出有阳性有交叉的克隆。选定的克隆，注入小鼠 腹腔生产腹水。
[0145] 通过多次筛选，我们确定了具有更好的特异性并且与其他类似物的交叉较小的几 个克隆，对2株单克隆抗体的效价进行了测试，结果显示在图1:
[0146] 8、兔多克隆抗体SAM与SAH:
[0147] 用新西兰白兔做多克隆抗体生产，多次皮下注射免疫原（总体积为ImL)免疫过程 如生产单克隆抗体的免疫小鼠过程。对于抗-SAM和抗-SAH的兔抗血清的检测效价均为1: 12000。
[014引实施例2
[0149] 抗体的特异性
[0150] 为进一步测试运些克隆的特异性，84号克隆的交叉反应很低，仅1.25% (见图2)。 交叉反应中使用的S种SAM类似物为S-腺巧同型半脫氨酸（SAH)、蛋氨酸和腺巧。在竞争 ELISA中类似物的剂量高于SAM剂量约80倍。IOiiM SAH、蛋氨酸、和腺巧时，竞争反应没有出 现。当SAM加入量远低于类似物时，从图2可W见到清晰的抑制反应，抑制率超过了40%，然 而=种类似物却没有抑制现象。
[01引]118号克隆与SAH、蛋氨酸和腺巧的交叉反应也是很低（图3)。竞争化ISA中，SAM、 SAH、蛋氨酸和腺巧使用剂量与实例2中相同。结果显示，游离的SAM显著的抑制抗SAM单克隆 抗体118号与包被在ELSIA板微孔中的AdaM的结合，然而SAH、蛋氨酸和腺巧却没有抑制。
[0152] 实施例3
[0153] 竞争化SIA法
[0154] 试剂；
[0155] IB: IOmM憐酸缓冲液、150mM NaCl，0.2 %BSA，0.1 % 吐溫-20，0.1 %Procl in，抑7.4
[0156] 样本：（a) SAM甲苯横酸盐硫酸氨盐（Sigma) (b) SAH盐（分子量406.39) (C)腺巧 (Sigma) (d)甲硫氨酸（Sigma)。HRP标记羊抗鼠 IgG(H+L)二抗化arthOx，San FYancisco， CA) dHRP底物:单组份底物溶液化A-blue四甲基联苯胺底物。抗原稀释液:0.5%BSA的IB。包 被缓冲液:50mM碳酸盐缓冲液抑9.6。洗液:PBS pH7.5，0.1 %吐溫-20。
[0157] (l)、AdaM-BSA包被于化SIA板，封闭后甩干，然后与SAM、SAH、甲硫氨酸和腺巧竞 争。类似物溶于40化抗原稀释液，再加入44化0.02化g/mL纯化的抗SAM单克隆抗体和16化 IB巧ris(IOOmM P册.5)缓冲液，于37°C-起解育1-2小时。
[0158] (2)、用PBST洗板S次，甩干。
[0159] (3)、每孔加入100化合适浓度的HRP标记羊抗鼠 IgG二抗，37°C解育20分钟。
[0160] (4)、洗板S次甩干。
[0161] (5)、每孔加入10化L HRP底物，解育10-15分钟。
[0162] (6)、每孔加入50化2N出S〇4终止反应。
[0163] (7)、酶标仪读取0D4加值。
[0164] 为测量生物样本中SAM含量，开发了竞争化ISA法。
[01化]SAM、SAH竞争化ISA法标准曲线如图4所示。
[0166] L0GIT = ln[(A/A0)/(l-A/A0)]，其中A为样本或者标准品0D450值，AO为抗原为0时 的OD450值。LOG口负值表示A/A0低于50%，抑制率(1-A/A0)高于50%。
[0167] 精确称量12.6mg标准品，溶于少量的DMF溶液，然后在0 . ImM HCl中完全溶解，于 250mL容量瓶中定容。W此于IOOmL容量瓶中各自配制the扣g/mL. 2.5iig/mL，1.25iig/mL， 0.625]ig/mL，0.3125iig/mL and 0.15625]ig/mL标准品溶液。
[016引实施例4
[0169] 制备了 HRP-偶联的抗SAM单克隆抗体克隆84,另外一个抗SAM的单克隆抗体与84抗 体配对，有可能建立夹屯屯LISA W便定量SAM。
[0170] 实施例5
[0171] 血样品收集步骤
[0172] 所有正常和病人样品收集前均获得知情同意。采集静脉血到抓TA抗凝管，摇匀后 马上放到含有冰水混合物的容器中。在采血后的30分钟内，做W下步骤:预先将离屯、机冷却 到4摄氏度，将采血管直接放到合适的转头中，W2000g离屯、30分钟。迅速将血浆全部转移到 Eppendo计管中，每10化L血浆加入10化IN醋酸。样品或者立即测定SAM和SAH或者标记，分 装，置于-20°C或-70°C冻存待W后测定。移除血浆后剩余的全血细胞分装冻存用于测定 SAM，SAH或DNA，有些样品，专口分出白细胞层，冻存W便将来从白细胞中提取DNA。
[0173] 实施例6
[0174] 11例20-50岁的身材正常的亚裔男性和女性血样品，按W上竞争性化ISA方法测定 SAM和SAH含量。平均SAM水平为147 ± 16nM，SAH水品为29± 1 InM，甲基化指数为5 ± 1。将会有 更多血浆样品用于SAM和SAH的免疫测定，W观察不同种族，年龄，性别，体重，饮食，生活方 式对SAM和SAH的影响。随着大规模的针对SAM/SAH的流行病学研究的开展，与不同疾病状态 下SAM/SAH的比较，用甲基化指数作为一般健康指征将会更加明确。
[0175] 实施例7
[0176] W直接法竞争化ISA测定住院准备化疗的病人的血样品SAM和SAH含量。12例癌症 病人平均SAM为103±52nM，平均SAH为250±90nM，平均甲基化指数为0.5。更多的诊断信息 明确，症状，资政分期，病情进展，治疗，复发，预后明确的临床样品的分析工作正在进行，W 期得到完整的甲基化指数与癌症各个方面的关系的资料来进一步验证。多种癌症化疗前后 样品已经收集。测定人血白细胞的DNA甲基化程度。癌症病人的DNA甲基化异常和甲基化指 数或整体DNA甲基化程度的关系也将为健康状况和治疗方案有指导作用。
[0177] 实施例8
[0178] 动脉粥样硬化和屯、脏病患者（重症监护病人）的血浆样品也用我们建立的竞争性 ELISA来分析SAM和SAH含量，商业化ISA试剂盒测定同型半脫氨酸化CY)含量。10例动脉粥样 硬化病人样品平均SAM为113±15nM，SAH含量为680±258nM，W含有兔单克隆抗SAH抗体 (ablll903 ,abeam, Cambridge, MA，USA)建立的SAH试剂盒初步测定屯、脏突发病人血浆中SAH 明显升高。更多的数据证明SM/SAH在动脉粥样硬化病(包括冠状动脉，脑血管和外周血管） 中明显降低。甲基化指数和被认为与屯、血管疾病死亡率有正相关的同型半脫氨酸含量的关 系很明确（因为SAH是HCY的来源）。SAM/SAH可能比肥Y更好，能更直接地反映屯、脏病的发作 和评估治疗有效性的指标。
[0179] 实施例9
[0180] 肝脏疾病比如传染性肝炎(有些伴有胆管狭窄），肝硬化，肝纤维化等的血浆样品 也用我们建立的竞争性ELISA来分析SM和SAH含量。26例病人样品平均SAM为45 ± 8nM，远比 正常人的SAM水平低;但是SAH水平则明显高于正常人，为342 ± 129nM，甲基化指数平均值大 约为0.13.
[0181] 实施例10
[0182] 抑郁症病人的血液样品也用来测定SAM含量。预计运类病人样品由湘雅第二附属 医院精神健康研究所(无明显器质性病变的抑郁症)和宁波第第二医院神经内科和康复科 (有明显器质性病变的抑郁症)提供。尤其要比较用SAM-e或其它药物治疗前后样品中SAM和 SAH含量。10例样品中SAM水平为20±18nM，SAH为340±180nM.甲基化指数平均约为0.064。 SAM和甲基化指数是指导个体化用药治疗抑郁症的有益的武器(指标），并对预后有指导意 义。定性和半定量SAM试纸条将对于抑郁症病人是否使用SAM或其它抗抑郁药物治疗，使用 多少剂量等，提供了简单方便的评判方法。运将帮助病人合理地选择对自己有利的药物与 剂量。
[0183] 实施例11
[0184] 己金森氏病人的血液样品也用来测定SAM含量。样品由宁波第二医院神经内科和 康复科确诊后提供。同样用本发明中建立的竞争性化ISA方法测定血浆样品中SAM和SAH水 平。
[0185] 实施例12
[0186] 风湿性关节炎和多发性硬化病人的血液样品也用来测定SAM含量。样品由宁波第 二医院康复科确诊为骨关节炎和多发性硬化后提供。同样用本发明中建立的竞争性化ISA 方法测定血浆样品中SAM和SAH水平。研究发现，SAM水平和甲基化指数在骨关节炎和多发性 硬化病人中有明显改变。骨关节炎和多发性硬化病人的SAM和SAH水平在服用SAM或其它有 效治疗药物前后进行比较会有变化。SAM和甲基化指数也将会是骨关节炎和多发性硬化病 个体化用药和知道预后的有效指征。定性和半定量SAM试纸条将对于运些病人是否使用SAM 或其它治疗骨关节炎和多发性硬化病药物进行治疗，使用多少剂量等，提供了简单方便的 评判方法。运将帮助病人合理地选择对自己有利的药物与剂量。
[0187] 实施例13
[0188] 实施例子6-12中样品的甲基化指数测定方法如下：用本发明中建立的免疫测定方 法如竞争性化ISA方法同时测定SAM和SAH的含量，计算SAM和SAH的比值，就是甲基化指数。 甲基化指数应该比单一的SAM或SAH或HCY指标更能精确地更有说服力地评估健康状况，疾 病状态，病情发展和预后。一般认为正常人甲基化指数大于4。在病理情况下，会小于4，甚至 小于1，原因是在病理状况下SAM水平减低同时SAH水平升高。降低的甲基化指数反过来同时 会进一步影响DNA，RNA，多肤，激素，神经递质等重要生命分子的甲基化过程的正常进行。所 W把甲基化指数调整到正常范围内对人体健康有益。
[0189] 实施例14
[0190] 化合物1:2'，3'-0-异丙叉腺巧（25克，82毫摩尔，反应式1)和除水干燥的化晚 (200mL) -起倒入500毫升单口圆底烧瓶中，在氮气的保护下使用磁子强力揽拌。圆底烧瓶 在热烘干器上加热并强力揽拌使腺巧溶解，5分钟后所用固体物完全溶解。将混合物溶液放 置在冰水浴中20分钟左右。对甲苯横酷氯固体分8次在一个小时左右加完，W防止反应明显 放热。混合物在(TC保持反应5天，使用薄层色谱检测反应完全后，往产物中加入IOOmL纯水 和300mL乙酸乙醋。混合物转移到分液漏斗中，加入IOOmL的3摩尔每升的盐酸，分离出来的 有机层分五次每次使用200mL纯水冲洗，W除掉有机层中过量的化晚盐酸盐。有机层使用减 压蒸馈旋干，再使用IOOmL的二氯甲烧溶解，然后缓慢的加入1.1化庚烧并不停的揽拌，通过 分液漏斗分离出31.1克的白色沉淀，使用质谱和核磁共振谱确定其结构。
[0191] 实施例15
[0192] 化合物2:化合物1 (32.2克，70毫摩尔）放入300mL带密封的磁性揽拌装置中，然后 加入200mL含有2M的甲胺四氨巧喃溶液，然后将反应装置密封。反应装置浸入到50摄氏度的 油浴中反应两天并不停揽拌，然后将反应装置带出油浴，最后放置在冰水浴中反应30分钟。 打开密封盖，使用氮气将多余的甲胺吹干。将产物使用旋转蒸发器旋干。使用5%甲醇二氯 甲烧溶液过色谱柱纯化产物，收集到3.51可得化合物2，使用核磁共振确定其结构。
[0193] 实施例16
[0194] 化合物3:5.0克（15.6毫摩尔)氨基化合物2放置在SOOmL的单口瓶中，往单口瓶中 加入150血干燥的乙腊和2.1克（16.38毫摩尔）的二异丙基乙胺，在35°C揽拌30分钟，再加入 2.55克漠下烧，然后加入288mg舰化四下锭，混合物在40°C反应5天。反应产物使用减压蒸馈 浓缩，浓缩物使用5%的甲醇二氯甲烧溶 液过层析柱，收集到5.36克产物，产率为82%。
[0195] 实施例17
[0196] 化合物4:甲醋化合物3(7.76克，18.4mmo 1)放入250mL的圆底烧瓶中，往圆底烧瓶 中加入15mL甲醇和15mL纯水，揽拌10分钟。加入1.55克固体氨氧化裡揽拌反应2小时(直到 薄层色谱和液相色谱检测反应完全）。粗品浓缩后进行下一步，无需进一步纯化。
[0197] 实施例18
[0198] 化合物5:约7克的粗裡盐4溶解于150毫升3摩尔每升的盐酸，在室溫下揽拌反应4 小时(直到原料完全消失在化C和LCMS)。粗的混合物经过滤后，然后在压力下浓缩干燥。粗 渣使用5次，每次120克的40%甲醇水洗脱液过柱纯化。将纯化的组分汇集，然后集中在高真 空下，在40°C下干燥。该产品是一种栋色的油状物质。产品通过高效液相色谱、质谱和核磁 共振谱确认。4.8克99.55%产品转入9瓶Wl :1甲醇和水的混合物分装，每一瓶样品集中在 40°C高真空下干燥完全。
[0199] 所有在本申请中引用的专利，专利申请和期刊出版物，包括其中引用的参考资料， 在此通过引用的方式全部并入本发明。
[0200] 虽然本发明的许多实施方案包括目前优选的实施方案被简单描述如上，许多其它 稍有变化的类似的实施方案实属在本公开的阐述和W下权利要求之范围内。因此，该所提 供的优选实施方案和实施例的细节不被解释为限制性的。应当理解的是，运里使用的术语 仅仅是描述而不是限制性的，并且各种类似的变体和许多等效物或概念将不脱离其宗旨或 离开所要求保护的发明的范围。
[0201] 实施例19
[0202] 测定了一期癌症病人的SAM和SAH水平，对于甲基化指数小于2(比正常平均值小一 倍左右），建议给化疗的病人SAM-e进行辅助治疗。
[0203] 实施例20
[0204] 可W测定病人尿液或者血液(如果尿液中有些特别的成分影响测定结果使得结果 偏低等）中的甲基化指数是个体化治疗抑郁症病人的好办法。SAM治疗方案可W包括如下：
[0205] 每天服用SAM-e 800-1600毫克SAMe的经口服6周。SAMe通过静脉注射或给予肌肉 注射，剂量范围从200至400mg/天至多8周。口服1000-1600毫克/天15天至6周。静脉注射 150-400毫克/每天持续3-4周的剂量是最常见的。400mg的S-腺巧-心甲硫氨酸-1,4-下二横 酸稳定盐(诺尔制药公司，米兰，意大利)每日肌肉注射。75-200毫克SAMe肌肉注射14-30天。 200-400毫克/250毫升生理盐水，前S天静脉注射的治疗，随后W400毫克/日的SMe治疗4-14天。
[0206] 使用在本发明中开发的甲基化指数化ISA试剂盒，对服用高剂量（MOOmg/天）的 SAM-e的病人每3-5天测量的甲基化指数，W便有效地及时地调整SAM-e的剂量。如果甲基化 指数增加太快，比如在任何两次测定之间差别超过5倍或甲基化指数为一个特定数字如0.5 (同时患者明显伴有与SAM-e使用相关联的临床症状时），建议减少用量，特别是对于有高血 压或其它屯、血管疾病的患者。高危人群最好每日测试甲基化指数或每天使用SAM和SAH快速 检测试纸条W定性或半定量检测在血液或尿中SAM和SAH水平，W确保SAM-e用药的安全性， W避免任何可能的副作用。
[0207] 对于那些每日口服SAM-e低于400毫克的情况，也建议测定甲基化指数，或者至少 在需要的时候测定，或者每周测定一次，W便明确SAM的用量是否合适，W及何时停止服药。
[0208] 除非甲基化指标恢复正常并稳定一两个星期，不要停止服药SAM-e。
[0209] 对于甲基化指数正常或接近正常的抑郁症患者，不要将SAM-e作为首选治疗用药 或方法。相反，使用其他类型的抗抑郁药品。但是，甲基化指数仍然可能是一个很好的指标 来监测药物治疗的有效性等。定期进行检测甲基化指数仍然是重要的，W确定何时可W停 止药物治疗。
[0210] 实施例21
[0211] 可W测定病人尿液或者血液(如果尿液中有些特别的成分影响测定结果使得结果 偏低等）中的甲基化指数是个体化治疗肝脏和/或胆管狭窄病人的好办法。SAM治疗方案可 W包括如下：
[0212] 对于成年人，根据肝脏和/或胆管狭窄或其它疾病的严重性，可W使用如下方案：
[0213] 每天口服SAM-e 1600毫克SAM-e约2周。SAM-e通过静脉注注射，剂量1000 mg/天约4 周。
[0214] 治疗妊娠期间胆管阻塞问题，缓慢地静脉输注500毫克的Tmnsmeti!(珍，2次/天，持 续14天，然后每天2次口服SAM-e 500毫克SAM-e知道分娩完毕。另外，每天口服600毫克的 Samyr?也可W用来处理妊娠性胆汁渺积的问题。每天口服SAM-e 1800毫克Samy愧)和 beta-mimetics。每天口服2次SAM-e 500毫克/次。其它SAM-e使用方法：1000毫克每日肌肉 注射直到分娩;200毫克/天静脉注射持续20天;400毫克/次，2次/天静脉注射知道分娩;800 毫克/天静脉滴注3小时，持续20天。SOOmg的S-腺巧-1^-甲硫氨酸-1,4-下二横酸稳定盐(诺 尔化noil)制药公司，米兰，意大利)每日静脉注射。
[0215] 使用在本发明中开发的甲基化指数化ISA试剂盒，对服用高剂量（〉600mg/天）的 SAM-e的病人每3天测量的甲基化指数，W便有效地及时地调整SAM-e的剂量。如果甲基化指 数增加太快，比如在任何两次测定之间差别超过5倍或甲基化指数为一个特定数字（同时患 者明显伴有与SAM-e使用相关联的临床症状时），建议减少用量，特别是对于有高血压或其 它屯、血管疾病的患者。高危人群最好每日测试甲基化指数或每天使用SAM和SAH快速检测试 纸条W定性或半定量检测在血液或尿中SAM和SAH水平，W确保SAM-e用药的安全性，W避免 任何可能的副作用。
[0216] 对于那些每日口服SAM-e低于600毫克的情况，也建议测定甲基化指数，或者至少 在需要的时候测定，或者每周测定一次，W便明确SAM的用量是否合适，W及何时停止服药。
[0217] 除非甲基化指标恢复正常并稳定一两个星期，不要停止服药SAM-e。
[0218] 所有在本申请中引用的专利，专利申请和期刊出版物，包括其中引用的参考资料， 在此通过引用的方式全部并入本发明。
[0219] 虽然本发明的许多实施方案包括目前优选的实施方案被简单描述如上，许多其它 稍有变化的类似的实施方案实属在本公开的阐述和W下权利要求之范围内。因此，该所提 供的优选实施方案和实施例的细节不被解释为限制性的。应当理解的是，运里使用的术语 仅仅是描述而不是限制性的，并且各种类似的变体和许多等效物或概念将不脱离其宗旨或 离开所要求保护的发明的范围。
【主权项】
1. 哺乳动物类癌症治疗方法： (a) 测定癌症病人体液中的甲基化指数 (b) 分析病人的疾病阶段和进展变化和甲基化指数的关系 (c) 根据(b)的结果决定合适的治疗方案2. 上述权利要求1中甲基化指数使用以下方法测定的： (al)用以下方法测定哺乳类体内S-腺苷蛋氨酸含量：（i)采集样品；（ii)样品与抗S-腺 苷蛋氨酸特异性抗体混合；（iii)测定样品中的S-腺苷蛋氨酸与{ii}中抗体的结合情况； (iv)定量Uii}中S-腺苷蛋氨酸抗体与S-腺苷蛋氨酸结合量，以算出样品中S-腺苷蛋氨酸 的浓度；（a2)用本发明建立的免疫测定方法测定体内S-腺苷同型半胱氨酸含量；（a3)计算 (al)/(a2)比率即是样品的甲基化指数。3. 选择哺乳动物类肿瘤治疗方案： (a) 测定癌症病人体液中的甲基化指数 (b) 比较甲基化指数和对照的甲基化指数，看看测得的病人的甲基化指数是否有指导 意义 (c) 根据(b)的结果决定合适的治疗方案。根据甲基化指数的大小不仅指导治疗方案， 而且可以提示病人对当前治疗反应好还是反应不佳。4. 治疗人类抑郁症或情绪异常性疾病的方法由以下组成： (a) 用以下方法测定人类体内S-腺苷蛋氨酸含量：（i)采集样品；（ii)样品与抗S-腺苷 蛋氨酸特异性抗体混合；（iii)测定样品中的S-腺苷蛋氨酸与（ii)中抗体的结合情况；（iv) 定量(iii)中S-腺苷蛋氨酸抗体与S-腺苷蛋氨酸结合量，以算出样品中S-腺苷蛋氨酸的浓 度； (b) 分析甲基化指数和抑郁症或情绪异常性疾病的的关系 (c) 根据(b)的相关结果决定合适剂量的有效药物治疗抑郁症或情绪异常性疾病5. 上述权利要求4中治疗的药物:苯乙肼，苯环丙胺，吗氯贝胺，丙咪嗪，阿米替林，地昔 帕明，去甲替林，多虑平，普罗替林，曲米帕明，氯米帕明，阿莫沙平，氟西汀，舍曲林，帕罗西 汀，西酞普兰，氟伏沙明，文拉法辛，马普替林，阿莫沙平，曲唑酮，安非他酮，度洛西汀，艾司 西酞普兰，西酞普兰，奈法唑酮，文拉法辛，米那普仑，瑞波西汀，米氮平，Kava-卡瓦，圣约翰 疣，S-腺苷蛋氨酸，促甲状腺激素释放激素，神经激肽受体，拮抗剂，甲状腺素，神经肽，以神 经肽受体和激素为靶子的化合物。6. -种用于在受试者中诊断精神性疾病或/和神经变性病症或预测受试者对于精神性 疾病或/和神经变性病症的易感性的方法，该方法包括：（a)获得一个或多个来自受试者的 生物样品；（b)测定样品中S-腺苷蛋氨酸水平或甲基化指数;和(c)比较(b)中样品中的生物 标志物(S-腺苷蛋氨酸水平或甲基化指数)的水平与对照样品中相应的生物标志物的水平， 其中如果来自受试者的样品的两个或更多生物标志物的水平与对照的相比较明显异常，预 计受试者将容易患精神性疾病或神经退行性疾病。7. 上述权利要求6中对照样品来源于1个或多个没有精神性疾病或/和神经变性性疾患 的个体或正常人（阴性对照）。另外还包括已被明确诊断为精神性疾病或神经退行性疾病的 受试者（阳性对照）。8. -种检测在患者中疾病的存在或不存在的方法，其中所述的疾病是伴随着S-腺苷蛋 氨酸缺陷的各种疾病:选定怀疑患有所述疾病的患者或处于具有所述疾病的风险的人;从 所述患者或潜在患者中收集生物样品;使用从S-腺苷蛋氨酸的半抗原类似物制备的抗体测 定所述生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平;分析生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平与所述疾病 存在或不存的关系。9. 一种用于评估受试者是否需要进行用S-腺苷蛋氨酸的单独治疗或与其它化疗剂合 用的方法，包括以下步骤组合：（a)从怀疑需要这种治疗的受试者中收集体液样品；（b)测定 所述样品中S-腺苷蛋氨酸水平的量；（c)测量的S-腺苷同型半胱氨酸的水平并计算的甲基 化指数；（d)比较所述样品与的正常标准的甲基化指数;和(e)如果所述样品的甲基化指数 超出正常范围，提示需要S-腺苷蛋氨酸治疗。10. 个性化药物治疗哺乳动物类疾病的方法，该方法包括从患者体液中测量甲基化指 数，并基于所测定的甲基化指数水平，提出一个最有可能有效的治疗方案。11. 一种用于监测癌症患者的治疗功效的方法，诊断时测定第一个时间点的甲基化指 数;治疗患者;疗程完成后测定第二个时间点的甲基化指数水平;比较第二个时间点的第一 个时间点的受试者的甲基化指数变化，以确定癌症治疗的效果。
【专利摘要】本发明提供了检测患者中的疾病的存在或不存在的方法，其中所述疾病是伴随着S-腺苷蛋氨酸(或S-腺苷甲硫氨酸)水平降低的情况：寻找被怀疑具有所述疾病或处于具有患所述疾病的风险的病人；从所述患者中获得生物样品；使用从S-腺苷蛋氨酸的半抗原类似物制备的抗体测定所述生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平；将该样品中S-腺苷蛋氨酸的水平与是否存在或不存在所怀疑的疾病或其严重程度相关联。本发明还提供了用于确定S-腺苷同型半胱氨酸(或称S-腺苷高半胱氨酸)的方法，以便计算出甲基化指数(SAM/SAH的比率)，该指数是表示一个人是否健康的指标。此外，本发明还包括用于确定S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的试纸条的方法。
【IPC分类】A61K31/7076, A61P35/00, G01N33/574
【公开号】CN105492012
【申请号】CN201480015695
【发明人】郝秀娟, 埃塞克·安格雷斯
【申请人】湖南天合生物技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年3月18日
【公告号】CA2906955A1, EP2968386A1, US20140271945, WO2014146137A1
【专利说明】基于S-腺昔蛋氨酸类似物的免疫检测方法及应用于指导个 体化用药
[0001 ]本发明专利申请延续临时美国专利US61/801，547题目为"S-腺巧蛋氨酸的免疫检 测用于个体化用药或者用于健康与癌症评估"，提交日期为2013年3月15日.本专利申请将 包括上述临时专利的全部内容。 发明领域
[0002] 本发明设及测定S-腺巧蛋氨酸在生物样品中的含量，S-腺巧蛋氨酸可作为许多疾 病的标志物。
[0003] 本发明设及使用由本发明中的抗原类似物制备的抗体的方法，测定S-腺巧蛋氨酸 在生物样品中的含量，S-腺巧蛋氨酸可作为许多疾病的标志物。
[0004] 本发明设及测定S-腺巧蛋氨酸在生物样品中的含量，S-腺巧蛋氨酸可作为许多疾 病的标志物，S-腺巧蛋氨酸的含量与疾病进展有关系，根据S-腺巧蛋氨酸的水平制定合适 的治疗方案。
[0005] 本发明设及诊断、筛查、早期检测癌症的方法，且可W用来监测肿瘤和其它疾病的 治疗效果和复发监测。
[0006] 本发明还设及一种开发祀向特异检测系统，该系统用来决定病人是否会对祀向特 异性药物有反应，具体的设及一种经济的、在同时开发诊断试剂和治疗药物时提供协同作 用的系统。
[0007] 本发明设及发现、筛选、寻找、检出、开发和评估测定甲基化指数的方法，甲基化指 数可用于疾病进展、治疗和对治疗反应的监测指标。
[000引本发明设及使用甲基化指数(有些文献说成甲基化状态，即S-腺巧蛋氨酸/S-腺巧 同型半脫氨酸)作为标志物、方法、机制、试剂、系统与试剂盒用于检测和诊断癌症和其它疾 病，也用于监测癌症进展，检测各种癌症和其它疾病的治疗效果。癌症进一步恶化发展一般 认为与进行性整体DNA低甲基化，区域性CpG过度甲基化和遗传物质不稳定性增强有关系。 甲基化指数降低与整体DNA低甲基化和遗传物质不稳定性增强有相关关系。因此，甲基化指 数是辅助健康状况与疾病进展\和的较好的标志物。
[0009] 发明的背景
[0010] S-腺巧甲硫氨酸或S-腺巧蛋氨酸（SAMe)几乎存在于体内所有的组织及体液中。 SAM对于转甲基作用运一过程至关重要，而甲基化几乎参与到生命的每一方面。SAM是体内 DNA、RNA、蛋白质、脂类及小分子甲基转移反应中的甲基供体。正常的胚胎发育需要适当的 DNA甲基化，有研究证明甲基转移酶缺失可能导致死亡（Pegg,A.E.，Feith,D.J. ,Fong, L.Y.,Coleman,C.S.,0'Brian,T.G.,and Shantz,L.M.,2003,Biochem.Soc.Trans.31,356-360)。许多肿瘤细胞中DNA的甲基化呈现异常，DNA甲基化模式的改变甚至可诱发致肿瘤因 子基因的表达或沉默肿瘤抑制因子的基因，有研究表明，给与晒齿类动物缺乏甲基的食物 将引发肝癌。
[0011] SAMe具有转硫基作用。SAMe脱甲基后生成S-腺巧同型半脫氨酸（SAH)，随后SAH水 解生成同型半脫氨酸，经转硫基作用后生成脫硫酸，随后进一步转换为半脫氨酸并最终成 为谷脫甘肤。谷脫甘肤是肝细胞的抗氧化剂，可作为解毒剂。
[0012] SAMe的另一个重要功能是转氨丙基作用。SAM脱簇后将氨丙基转移给与腐胺，生成 亚精胺和精胺，运两种物质对细胞生长、分化W及DNA和RNA的稳定至关重要。此外，该反应 过程的副产物甲硫腺巧(MTA)是一种强效止痛消炎药，运可能是SAMe对骨关节炎、类风湿性 关节炎和纤维肌痛的临床治疗有功效的原因。
[0013] SAMe是免疫体系中一种重要的物质，可维护细胞膜的正常功能，且有助于大脑中 血清素、稱黑激素及多己胺的等化学物质的产生与分解。缺乏维生素 B12或叶酸铁可造成 SAMe水平降低。SAMe还是一种抗氧化剂，可W保护机体免受活性氧分子的损害，活性氧分子 可能来自于机体自身或环境污染，被认为是造成衰老及变性疾病的重要因素。一般认为 SAMe可提高机体内其它氨基酸的功能水平。
[0014] 进一步的研究表明，SAMe经裂解酶裂解后转化为甲硫分子和高丝氨酸，它是tRNA 的氨基下酸链供体，也是生物素生物合成的氨基酸链供体。脱簇后的SAMe则是生物合成神 经调节物质多胺，亚精胺和精胺的氨丙基供体（Zappia et al(1979),Biomedical and Pharmacologcial roles of Adenosylmethionine and the Central Nervous System, page I,Pergamon Press.N.Y.)D
[0015] SAMe在临床上可作为肝脏疾病化riedel H，Goa，K丄?，and Benfield P. ,(1989)， S-AdenosyI-I-methionine: a review of its pharmacological properties and therapeutic potential in liver dysfunction and affective disorders in relation to its physiological role in cell metabolism.Drugs. 38，389-416)、关节 炎（Di Padova C,( 1987 ),Sadenosyl-I-methionine in the treatment of osteoarthritis:review of the clinical studies.Am J.Med.83，（Suppl. 5) ,6-65似及 抑郁症（Kagan，B, Sultzer D.L. ,Rosenlicht N and Gerner R.(1990), Oral S-adenosy!methionine in depressionia randomized,double blind,placebo-controlled trial. Am. J.Psychiatry 147,591-595.)的治疗药物。阿兹海默症患者脑脊髓液中的SAMe 水平降f氏(Bottiglieri et al，( 1990) ,Cerebrospinal fluid Sadenosy 1-1-methionine in depression and dementia:effects of treatment with parenteral and oral S-adenosy 1-1-methionine .J.Neurol .Neurosurg.Psychiatry 53,1096-1098.) D初步的研究 结果表明，给予SAMe可改善阿兹海默症患者的认知能力（Bottiglierietal(1994)，The clinical potential of admetionine(S-adenosyl-l_methioinine)in neurological disorders . Drugs 48,137-152.) D阿兹海默症患者脑脊髓液中的SAMe水平急剧下降 (Morrison et al，（1996)，Brain S-adenosyImethionine levels are severely decreased in Alzheimer's disease,Journal of Neurochemistry,67，1328-1331.)，中白 金森氏症患者血液中的SAMe水平也显著下降（Cheng et al，（1997), Levels of L-methionine S-adenosyItransferase activity in erythrocytes and concentrations of S-adenosy!methionine and S-adenosy!homocysteine in whole blood of patients with Parkinson's disease.Experimental Neurology 145,580-585.)。
[0016] 使用抗肿瘤药甲氨蝶吟的患者体内SAMe水平降化，该药物与SAMe-起使用可减少 其神经毒性（Bottiglieri et al(1994),The Clinical Potential of Ademetionine(S- adenosy!methionine)in neurological disorders,Drugs,48(2)，137-152.)。
[0017] 有研究报道艾滋病伴有痴呆症或痴呆/HIV病毒感染复合性脑病患者的脑脊液中 SAM-e水平，发现其SAM-e水平比无 HIV感染的痴呆病人明显降化（Keating et al(1991)， Evidence of brain methyltransferase inhibition and early brain involvement in HIV positive patients Lancet:337:935-9.)〇
[0018] De La Cruz等人的研究表明，SAMe是一种有效的抗氧化剂，长期施用SAMe可通过 增强抗氧化防御功能改变大脑、肝脏及肾脏组织中的氧化状态（De La Cruz et al， Effects of chronic administration of S-adenosyI-I-methionine on brain oxidative stress in rats.Naunyn-Schmiedeberg's Archives Pharmacol，2000，361: 47-52.)。
[0019] 无肝脏疾病及有肝脏疾病的患者口服SAMe后，其肝脏中谷脫甘版水平均有上升 (Vendemiale G et al，（1989),Effect of oral S-adenosy1-1-methionine on hepatic glutathione in patients with liver disease.Scand J Gastroenterol；24:407-15.)〇 在口服SAMe后，肝内胆汁齡积患者的搔痒症状及胆汁齡积有所改善(Giudici et al，化e use of admethionine(SAM-e) in the treatment of cholestatic liver disorders.Metaanalysis of clinical trials.IniMato et al editors.Methionine Metabolism:Molecular Mechanism and Clinical Implications.Madrid:CSIC Press; 1992pp67-79.)。而原发性纤维肌痛患者在短期服用SAMe后其症状也有所改善(Tavoni et al,Evaluation of S-adenosyImethioine in Primary Fibromaylgia. The American Journal of Medicine,Vol 83(suppl 5A),PP 107-110,1987. )D此外SAMe还可用于骨关节 炎白勺、冶疗（Koenig B.A long-term( two years ) c I in i ca I trial with Sadenosylmethionine for the treatment of osteoarthritis.The American Journal of Medicine,Vol83(su卵I 5A)，Nov.20，1987pp 89-94)。
[0020] SAMe在细胞的基础代谢过程中发挥重要作用，因此在许多似乎不相关的领域仍具 有重要的临床意义，其中它在酒精性肝硬化的临床治疗方面的应用最引人瞩目，因为酒精 性肝硬化在医学上目前还无法治愈DMato等人的研究表明口服SMe可将酒精性肝硬化的总 死亡率和/或发展为肝移植的概率降化达29%，而安慰剂治疗组仅12% (Mato et al (1999),S-adenosylmethionine in alcohol liver cirrhosis:a randomized,placebo-control led ,double blind,multi-center clinical trial,Journal of Hepatology,30， 1081-1089.)〇
[0 021] SAMe不仅可W减弱肿瘤坏死因子-a所造成的损害，同时还可减少其分泌量，因此 在这种炎症因子增加时施用SAMe可获得很好的效果（Watson WH，Zhao Y，Chawla民K， (1999)Biochem J Aug.15;342(Pt I):21-5.SlSadenosylmethionine attenuates the Iipopolysaccharide-induced expression of the gene for tumour necrosis factor alpha.)。还有研究表明，SAMe具有减弱强效免疫抑制剂环抱素 A的毒性的功能(Galan A,et al，Cyclosporine A toxicity and effect of the s-adenosylmethionine,Ars Pharmaceutica，40:3;151-163,1999.)D
[0022] 在体外培养人红细胞的过程中添加 SAMe时，SAMe可穿透细胞膜并使细胞内ATP增 加从而使细胞形态得W恢复化I^iedel et al，S-adenosyl-lmethionine:A review of its pharmacological properties and therapeutic potential in liver dysfunction and affective disorders in relation to its physiological role in cell metabolism, Drugs38(3):389-416，1989)。
[0023] 有研究表明SAMe有利于偏头痛的治疗（Friedel et al，S-adenosyl-Imethionine:A review of its pharmacological properties and therapeutic potential in liver dysfunction and affective disorders in relation to its physiological role in cell metabolism,Drugs 38(3):389-416,1989)。
[0024] SAMe也用于治疗外周动脉闭塞性疾病患病人，发现它可W降化的血液粘稠度，可 能是通过影响红细胞的变形能力实现的。
[00巧]用发酵法可获得纯度为60%~80%的SAMe,也就是说最终产物包含60%~80%具 有生物活性的（S，S)-SAMe，其余20~40%为不具生物活性(R，S)-SAMe(Gross，A. ,Geresh, S. ,and 师itesides，Gm(1983)Appl .Biochem.Biotech.8,415 ?) D酶促合成方法得到的不具 生物活性的同分异构物的比例超过60%(Matos，JR，RauschelFM，Wong，CH.S-Adenosylmethionine:Studies on Chemical and Enzymatic Synthesis.Biotechnology and Applied Biochemistry 9,39-52(1987) D利用对映体分离技术可^分离、纯化具有活 性的SAMe。最新的分离技术可^大规模地分离手性分子，且花费较小。此外，用特定的立体 结构选择法有望合成具有生物活性的对映体，但该技术目前尚未成熟(Matos, JR ,Rauschel FM,Wong,CH.S-AdenosylmethionineiStudies on Chemical and Enzymatic Synthesis . Biotechnology and Applied Biochemistry 9,39-52(1987；Hoffman , Chromatographic Analysis of the Chiral and Covalent Instability of S-adenosy1-1-methionine,Biochemistry 1986，254444-4449:Segal D and Eichler D，The Specificity of Interaction between S-adenosyl-1-methionine and a nucleolar2-0-methyltransferase,Archives of Biochemistry and Biophysics，Vol.275,No .2， December，pp.334-343,1989)D
[0026] De la Haba最先证明硫是手性分子，仅其中一个可合成并应用在生物领域（（De Ia Haba et al 1.六111.化6111.5〇〇.81，3975-3980，1959))。0魔和1?歴的甲基化对于细胞的正 常生长至关重要，SAMe是该甲基化反应中唯一的甲基供体，该过程由甲基转移酶催化。 Segal和Eichler等的研究表明（S，S)-SAM-e与酶的结合紧密度比无生物活性的(R，S)-SM-e强10倍，从而证明了一种与硫手性中屯、空间特异的结合的新方式。有报道表明，（R，S)-SAM-e与其它的甲基转移酶结合的程度与（S，S)-SAM-e-致，因此(R，S)-SAM-e可充当该酶 的竞争抑制剂（Segal D and Eichler D，The Specificity of Interaction between S-adenosyI-I-methionine and a nucleolar 2-0-methyltransferase,Archives of Biochemistry and Biophysics，Vol.275,No.2,December pp.334-343,1989；Borchardt 民T and Wu YS, Potential inhibitors of S-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.民ole of the Asymmetric Sulfonium Pole in the Enzymatic binding of S-adenosyl-1-methionine,Journal of Medicinal Chemistry，1976，Vol 19，N〇.9，1099-1103.)。
[0027] 无论是在其光学纯的SAMe对映体形式或是与其它外消旋混合物，SAMe在室溫下的 稳定性不佳，可能降解而产生不可取的产物。SAMe与其对映体呈现分子内不稳定从而导致 在高溫及室溫条件下分子失去稳定性或断裂。因此获得新的SAMe的稳定盐成为许多专利的 主题，为工业化生产SAMe提供基础。本发明得W使用现有技术中已公开的稳定SAMe对映体 的SAMe盐进行抗体鉴定和其它方面的工作。
[0028] 近年来，临床诊断等领域都有广泛的发展，既在于越来越多的可被简便而准确测 定的体液中的代谢物或外源性药物等分子，也在于检测方法方面的进展。在过去的几十年 中，许多物质如禁忌药物和其它生物分子的检测已是司空见惯。基于抗原与抗体反应的免 疫检测也被广泛地应用在运一方面。基于抗体的特异性及高亲和力，免疫检测可W精确地 定量检测生物液体中的极低浓度的物质。
[0029] 因此，需要一种改进的检测方法，W定量甲基化指数，并把甲基化指数作为生物指 标，W检测、诊断癌症及其它疾病，并有助于监测病情发展、治疗效果和预后。
[0030] 图标说明
[0031] 【图1】为化ISA测定两个抗SAM单克隆抗体效价的曲线。其中X-轴显示0D450值，Y-轴显示纯化的腹水抗体在化g/iil时的稀释倍数。
[0032] 【图2】为不同的SAM类似物和SAM与抗SAM单克隆抗体的竞争交叉曲线。ELISA方法 测得SAM类似物（SAH、蛋氨酸、腺巧）与84号克隆的交叉反应不超过1.25%。其中X-轴表示 SAM和SAM类似物不同浓度值，WnM为单位，Y-轴是竞争抑制比率。
[0033] 【图3】为不同的SAM类似物和SAM与抗SAM单克隆抗体的竞争交叉曲线。ELISA方法 测得SAM类似物(SAH、蛋氨酸、腺巧)与118号克隆。其中X-轴表示SAM和SAM类似物的不同浓 度值，反应不超过1% D^nM为单位，Y-轴是A/A0,即是有竞争抗原的孔和空白对照孔(零竞 争孔)的0D450值的比。
[0034] 【图4】为竞争性ELISA定量SAM的标准曲线。其中X-轴表示SAM浓度的对数，Y-轴显 示抑制反应的LOG IT值。
[0035] 【图5】为本发明改进的新的SAM类似物的合成过程。
[0036] 【图6】为蛋氨酸转硫代谢途径。缩写:THF:四氨叶酸;MS:蛋氨酸合成酶;B歷T:甜菜 碱同型半脫氨酸甲基转移酶;MAT:蛋氨酸腺巧甲基转移酶;SAM: S-腺巧蛋氨酸;SAH: S-腺巧 同型半脫氨酸;SA皿:S-腺巧同型半脫氨酸水解酶;ADA:腺巧脱氨酶;AK:腺巧激酶;CBS:脫 硫酸0-合成酶。发明的综述：
[0037] 本发明提供用于治疗哺乳动物类癌症的方法，包括W下步骤：（a)确定的所述哺乳 动物类患有癌症的生物样品中的甲基化指数；（b)测定所述哺乳动物类的样品中甲基化指 数;和(C)基于(b)的结果选择合适的癌症治疗方案治疗所述哺乳动物类的癌症。
[0038] 甲基化指数是通过下列步骤测得的：（i)采集样品；（ii)样品与抗S-腺巧蛋氨酸特 异性抗体混合；（iii)测定样品中的S-腺巧蛋氨酸与（ii)中抗体的结合情况；（iv)定量 (iii)中S-腺巧蛋氨酸抗体与S-腺巧蛋氨酸结合量，W算出样品中S-腺巧蛋氨酸的浓度； (曰2)用本发明建立的免疫测定方法测定体内S-腺巧同型半脫氨酸含量；（曰3)计算(al)/ (a2)比率即是样品的甲基化指数。
[0039] 本发明还提供了确定癌症治疗方案用于治疗肿瘤患者的方法，包括：（a)测定患者 样品中的甲基化指数；（b)比较样品中和对照组中甲基化指数的水平，W确定所测的甲基化 指数是否有预测意义;和(C)根据(b)的结果决定合适的治疗方案。根据甲基化指数的大小 不仅指导治疗方案，而且可W提示病人对当前治疗反应好还是反应不佳。
[0040] 治疗人类抑郁症或屯、理疾病的方法由W下组成：用W下方法测定人类体内S-腺巧 蛋氨酸含量：（i)采集样品；（ii)样品与抗S-腺巧蛋氨酸特异性抗体混合；（iii)测定样品中 的S-腺巧蛋氨酸与（ii)中抗体的结合情况；（iv)定量(iii)中S-腺巧蛋氨酸抗体与S-腺巧 蛋氨酸结合量，W算出样品中S-腺巧蛋氨酸的浓度;分析甲基化指数和抑郁症或屯、理性疾 病的关系;根据(b)的相关结果决定合适剂量的有效药物治疗抑郁症或屯、理性疾病。
[0041] -种用于在受试者中诊断精神性疾病或/和神经变性病症或预测受试者对于精神 性疾病或/和神经变性病症的易感性的方法，该方法包括：（a)获得一个或多个来自受试者 的生物样品；（b)测定样品中S-腺巧蛋氨酸水平或甲基化指数;和(C)比较(b)中样品中的生 物标志物(S-腺巧蛋氨酸水平或甲基化指数)的水平与对照样品中相应的生物标志物的水 平，其中如果来自受试者的样品的两个或更多生物标志物的水平与对照的相比较明显异 常，预计受试者将容易患精神性疾病或神经退行性疾病。
[0042] -种检测在患者中疾病的存在或不存在的方法，其中所述的疾病是伴随着S-腺巧 蛋氨酸缺陷的各种疾病:选定怀疑患有所述疾病的患者或处于具有所述疾病的风险的人； 从所述患者或潜在患者中收集生物样品;使用从S-腺巧蛋氨酸的半抗原类似物制备的抗体 测定所述生物样品中S-腺巧蛋氨酸的水平;分析生物样品中S-腺巧蛋氨酸的水平与所述疾 病存在或不存的关系。
[0043] -种用于评估受试者是否需要进行用S-腺巧蛋氨酸的单独治疗或与其它化疗剂 合用的方法，包括W下步骤组合：（a)从怀疑需要运种治疗的受试者中收集体液样品；（b)测 定所述样品中S-腺巧蛋氨酸水平的量；（C)测量的S-腺巧同型半脫氨酸的水平并计算的甲 基化指数；（d)比较所述样品与的正常标准的甲基化指数;和（e)如果所述样品的甲基化指 数超出正常范围，提示需要S-腺巧蛋氨酸治疗。
[0044] 对于本发明的阐述
[0045] 本发明提供了对患有多种疾病的的患者的检查、诊断、治疗和健康评估。他们的健 康状况可W通过精确地测定检测S-腺巧蛋氨酸和S-腺巧同型半脫氨酸的浓度进行评估。准 确测定上述分子 将会算出甲基化指数，该指数可反映人体的健康状况。
[0046] 本发明的测定法使用特性抗S-腺巧蛋氨酸及其特定类似物。该抗体是通过接种宿 主动物获得的。所使用的免疫原包括免疫W下分子式的一系列化合物(S-腺巧蛋氨酸半抗 原一类)的直接或间接禪合物：
[004引包括其对映体、非对映体、对映体富集的混合物、外消旋混合物、一个原子富集的 形式或其结晶形式、非结晶形式、无定形形式、其带电和不带电的形式、溶剂化物、代谢物W 及它们的盐;其中A是从下组中选出：
[(K)加]其中，M是选自N、N+、C、S、S+、Se、Se+和P的组成的组中；--表示用于各如上所定义 的基团的键合位置；
[O化1 ] X独立地选自H、邸3、OfcOH、邸2畑2、OH、0邸3、畑2、SH、C册和CN组成的组中；
[0化2 ] Z独立地选自邸3、OfcOH、邸2畑2、OH、0邸3、畑2、SH、C册和CN组成的组中；
[0化3] B和C是独立地选自H、0H、N出、甜、F、C1、化和I组成的组中；
[0化4] D独立地选自畑2、OH、甜、F、Cl、化和I组成的组中；
[0化日]Y独立地选自H、邸3、OfcOH、邸2畑2、OH、0邸3、畑2、SH、C册和CN组成的组中；
[0化6] W独立地选自H、COOH、CON出、COOC出、CN、C册组成的组中及运些官能衍生物；
[0057] 然后收集宿主动物的血清。抗体制备细节请参见我们的另外一个美国专利 8344115,其全部内容通过引用结合于此，如同它被在此重复一样。
[0058] 在另一个方面，本发明提供小鼠单克隆和兔多克隆抗体，包括天然的、重组的、人 源化及嵌合的抗S-腺巧蛋氨酸抗体和抗S-腺巧同型半脫氨酸抗体，制备方法见美国专利 8344115中所描述。
[0059] 本发明还提供了使用抗SAM和SAH单克隆抗体的免疫测定方法，W定量甲基化指数 和SM，明确SAM和甲基化指数，对于指导和选择使用SM的治疗方案和评估病人的健康状态 等。
[0060] 本发明还进一步提供使用该甲基化指数作为人群普查标记物，提示个体的一般健 康状态。
[0061] 本发明进一步提供了快速、可靠和廉价的免疫测定方法来测量尿或血清/血浆样 品中SAM和SAH水平，全血半定量快速检测试纸条及小型设备在开发中。在本发明的一个实 施方案中，膜是预浸用抗SAM(或抗SAH)抗体-染料(胶体金)偶联物。第二抗体被固定在对照 区。抗SAM(或抗SAH)抗体被固定在试验区。样品沿着膜迁移流动时，样品中的抗原与胶体金 偶联的抗体形成抗原-抗体复合物。如果SAM(或SAH)存在，抗原-抗体复合物形成，并会被在 运两个测试和控制区的抗体捕获，因此粉红色(胶体金)条带就会在运两个区域形成。如果 SAM(或SAH)抗原不存在，抗体-染料(或胶体金)结合物通过对照区二抗体被捕获，从而粉色 带只见于对照区，运表明试验条件本身是正确地，结果是可靠和有效的。标准品和样品的同 时测试，比较测试区的和对照区的信号（阳性带颜色和宽度)强度，来大致确定SAM(或SAH) 含量的高低，一种半定量的SAM(或SAH)的测试方法。
[0062] 如上述同样机制的竞争性免疫测定方法，试验区固定有SAM(或SAH)抗原。样本中 的SAM(或SAH)与固定在测试区膜上的SAM(或SAH)竞争性地结合数量有限的抗体-染料(胶 体金)偶联物。来自标本中的SAM(或SAH)越多，膜上SAM(或SAH)与抗体偶联物结合的越少， 粉色线会月浅。如果样品中没有SAM(或SAH)或者极低的，测试区和控制区会同时出现两个 较强的带(或线）。
[0063] 半定量快速检测试纸条是消费者或患者在服用SAM-e作为治疗药物前，治疗过程 中，W及决定何时停药时使用较为理想的检测方法。
[0064] 本发明还提供用于哺乳动物类疾病个性化用药的方法。该方法包括测量患者体液 中的甲基化指数，基于所测的甲基化指数水平，提出一个可能有效的治疗方案。
[0065] 本发明还提供一种用于监测癌症患者的治疗功效的方法，诊断时测定第一个时间 点的甲基化指数;治疗患者疗程完成后测定第二个时间点的甲基化指数水平；比较第二个 时间点的第一个时间点的受试者的甲基化指数变化，W确定癌症治疗的效果，甲基化指数 提高预示治疗效果好。
[0066] 在另一个方面，本发明提供用于治疗哺乳动物类癌症患者的方法，该方法包括W 下步骤的方法：（a)测定述哺乳动物类癌症的样品的甲基化指数；（b)分析所测得到的甲基 化指数与相应的癌症进度发展的关系；（C)基于(b)的结果选择合适的癌症治疗方案治疗所 述哺乳动物类患有的癌症。该方法包括收集来自I期、期或IV期癌症患者血液样品， 并分别测定SAM和SAH的水平，然后计算出甲基化指数，探求甲基化指数与癌症阶段(或分 期）的关联关系，然后选择适当的治疗方案用于治疗所述哺乳动物。
[0067] 本发明也在确定DNA甲基转移酶抑制剂对于治疗癌症到底是否有效，有多大效果 的问题具有非常好的评估价值。甲基化指数是评估DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂在特定组 织和器官内如何发挥作用，发挥作用的程度和特异性方面的最好的工具或手段。因此，用本 发明提供的免疫方法简单方便地测定甲基化指数，可W评估DNA甲基转移酶抑制剂功效。 [00 6引本发明还提供：
[0069] 1、指导用S-腺巧蛋氨酸进行的治疗
[0070] SAMe治疗的有效的疾病包括轻度到中度的抑郁症，骨关节炎（比非类固醇消炎药 更好），纤维肌痛。SAMe治疗效果一般的情况也有所报道。最有可能的原因是与其它多数疾 病的治疗情形类似，即某些患者，则不适合使用的SAMe而另一些病人是SAMe治疗的很好候 选对象。为了找出病人是否是使用某些药物的最佳候选，有些必要的检测需要做。申请人已 经发现，最好是在治疗疾病之前，测定血液或尿液样品中SAM的水平。
[0071] WSAMe为辅助治疗的各种疾病，例如肝脏疾病，维生素 B12或叶酸缺乏，癌症，用左 旋多己化-多己）治疗帕金森氏症患者。原因是运些疾病可引起体内的SAM水平明显降低肯 定的SAM的水平是否实际上是减少了，最好的方式是直接测量血浆的SAM水平。有的时候SAM 水平可W因治疗和疾病本身等情况有所降低。因此，监测的SAM水平对于改善整体的治疗效 果非常重要的，无论治疗药物中是否有SAMe。在W适当的治疗方案治疗抑郁症，骨关节炎， 纤维肌痛，帕金森氏，阿尔茨海默氏病，痴呆，肝脏疾病，滑囊炎，肌腫炎，慢性腰背痛，多发 性硬化症，脊髓损伤，偏头痛，铅中毒，W及延缓衰老等，当SAM水平低于一定的阔值时，补充 合适剂量的SAMe将有利于整体治疗。当治疗还没有开始，如果检测到SAM不足，先静脉注射 SAMe, W上疾病的症状会迅速缓解。
[0072] 另一方面，由于药物或食物与SAMe的相互作用的信息报道与研究非常有限，加上 SAMe也不是没有的显著精神和屯、血管方面的不良影响和风险运一事实，正确的做法是，在 没有条件听取医生的建议（Fet;row,C.W.et al. "Efficacy of the dietary SU 卵 Iement Sadenosyl-L-methionine."Annals of Pharmacotherapy 35no. 11(November 2001): 1414-1425)的情况下，应该积极指导消费者，W避免运种未受监控地服用作为膳食补充剂 SAMe出现不期望发生的结果。SAMe与其它抗抑郁的处方同时服用会引起五径色胺综合征， 运是相当危险的。SAM的免疫测定方法，是让临床实验室和患者自己能够快速知道体内SAM 水平的最佳途径。该免疫分析灵敏、简单、快速、不需要昂贵的设备。不同时间测定的结果之 间是可比的。此外，正常血浆的SAM浓度似乎因 W下因素而有所不同：性别、个体的体重、种 族、饮食、健康状况、是否服用药物等等。因此，监测个体的SAM水平且与该个体的其它时间 或正常对照下SAM水平相比较，对于正确地指导个体化使用SAMe, W达到最佳的治疗结果起 到至关重要的作用。
[0073] 2、疾病发生和预后与甲基化指数的关联
[0074] 甲基化指数定义为SAM与SAH的浓度比。在某些情况下，用甲基化指数比SAM水平尤 其重要而准确。原因包括= (I)SAM是在甲基转移酶(COMT)作用后SAM甲基化反应的直接末端 产物。（2)SAM水平随种族、性别、体重和饮食而变化。甲基化指数可W减少运些因素引起的 差异。
[0075] 癌症被认为具有遗传和表观遗传双重起因。DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰 之一。越来越多的研究发现一度被忽视的表观遗传学对许许多多的生命现象都有影响，运 说明甲基化对癌症的影响只能会是更加深远。在癌症发生的不同阶段，癌细胞中DNA甲基化 水平是不同的。异常DNA甲基化在癌症中普遍存在，表现为基因组范围总体低甲基化和区域 性高甲基化的特定模式。总体DNA低甲基化与原癌基因，例如C-JUN，C-MYC，和C-Ha-Ras的激 活相关联，并导致基因组的不稳定性。位于肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛的高甲基化导 致转录静化和基因组不稳定。CpG岛高甲基化是引起基因失活突变的另外和/或补充机制， 现今被认为是癌症发生的重要因素。肿瘤抑制基因（例如p53基因）启动子区域CpG岛高甲基 化引起的基因失活还与癌症的发展和不良预后相关。研究结果表明针对甲基化模式或状况 的治疗和预防性使用药物或营养添加剂在人类肝细胞癌化CC)中的意义，开辟了使用分子 祀点，包括在此研究中发现的祀点，对有效抑制肝细胞癌的发生和发展有重大意义(Diego F. Calvisi et al . ('Mechanistic and Prognostic Significance of Aberrant Methylation in the Molecular Pathogenesis of Human Hepatocellular Carcinoma.'' J Clin Invest.2007:117(9):2713-2722.)。
[0076] 去甲基化制剂可降低DM甲基化的水平，是一种颇具前景的化学治疗药，目前已被 用于治疗癌症的研究化Steller M.''DNA methylation and cancer therapy:new developments and expectationsCurr Opin Oncol.2005Jan;17( I):55-60.2005Jan;17 (I):55-60.)O
[0077] 在本发明中，癌症或肿瘤包含了所有的在病人体内恶性生长的新生物，包括原发 肿瘤和任何转移肿瘤。癌症可W分为液体肿瘤或实体肿瘤。液体肿瘤包括血液来源的肿瘤， 如骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤）、白血病(例如华氏综合症、慢性淋己细胞白血病和其它白血 病）、淋己瘤(如B细胞淋己瘤、霍奇金淋己瘤）。实体肿瘤可能出现在器官中，包括肺癌、乳腺 癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌及肝癌等。在本文中，癌细胞包含了肿瘤细胞，指的是具 有异常的细胞分裂速率(速率增加）的细胞。癌细胞包含但不仅限于肉瘤，还包括鱗状细胞 癌、基底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、恶性腺瘤、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、未分 化型癌、支气管癌、黑素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、肝外胆管癌、乳头状癌、移行细胞 癌、绒毛膜癌、胚胎性癌、乳腺癌、胃肠癌、结肠癌、膀脫癌、前列腺癌W及头部和颈部的鱗状 细胞癌等；肉瘤包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索肉瘤、血管 肉瘤、内皮肉瘤、淋己管肉瘤、滑膜肉瘤、间皮肉瘤等;血液肿瘤包括骨髓瘤、白血病(例如急 性骨髓性白血病、慢性淋己细胞白血病、粒细胞性白血病、单核细胞白血病和淋己细胞性白 血病)和淋己癌（如滤泡性淋己瘤、套细胞淋己瘤、弥漫性大B细胞淋己瘤、恶性淋己瘤、浆细 胞瘤、网状细胞肉瘤和霍奇金病）；神经系统肿瘤则包括神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经管细胞 瘤、神经銷瘤或室管膜瘤等。
[0078] 3、胚胎发育与人的全面健康与甲基化指数的关联
[0079] SAM和SAH的水平可能通过影响DNA的甲基化水平(运种作用反过来将引起基因激 活的特定改变)来控制体细胞胚胎发生。SAM水平上升可能是胚胎形成和发育成完整的胚胎 的先决条件（Munksgaard D, et al. ('Somatic embryo development in carrot is associated with an increase in lev els of S-adenosy!methionine ,S-adenosy!homocysteine and DNA methylation/'Physiologia Plantarum,Volume 93, Issue I,Article first published online:90CT 2008)。
[0080] 4、一般人的健康评估和筛选与甲基化指数的关联
[0081] 甲基转移酶(MT)在人类疾病的形成过程中起重要作用。多己胺(DA)多己胺是由患 者体内多己胺过多造成。比如，有关精神分裂症起因的多己胺(DA)假说多己胺(DA)是说精 神分裂症是由患者体内多己胺过多造成。儿茶酪氧位甲基转移酶(COMT)可降解中枢神经系 统中的儿茶酪胺类神经递质(包括多己胺类），COMT为一些精神分裂症的诊断治疗奠定了基 础（Renson J et al ('Action of the inhibitors of catechol ortho-methyl transferase on the adrenal catecholamines in the rat.''Arch Int Physiol Biochim. 1960May ;68:534-7.)。人体内有超过30种不同的甲基转移酶，其底物都是对人体 功能至关重要的多种物质。
[0082] 甲基化指数被作为人类总体健康、"活方'或"健康"的一个重要指标。
[0083] 此外，血浆中正常的SAM浓度因人而异，主要取决于性别（一般来说男性高于女 性），个体体重，还可能种族和饮食等等。SAM和SAH在代谢上关联紧密，因此SA田农度受到W 上各因素的影响与SAM相似，用两种物质（SAM和SAH)的比值应该很有可W排除或减轻运些 因素的影响。
[0084] SAH和SAM与屯、血管疾病、抑郁症、癌症W及与老化相关的疾病如阿兹海默症等的 关联是有据可查的。甲基化对于胎儿的发育、分化、蛋白质表达的表观遗传调控(主要通过 DNA，RNA和组蛋白的甲基化)十分关键。SAM和甲基化指数的高低是衡量人体"活力"的指标 或"健康"的标志。
[0085] 本发明的重大意义在于其提供了：
[0086] 1、直接、准确地定量所有各种生物样品甲基化指数的方法。
[0087] 2、在所有的实验室中都可W做到的直接、准确地定量甲基化指数的方法。
[0088] 3、直接、准确地定量甲基化指数的方法，用于评估整体的健康状况，肿瘤(癌症)预 测和预后，所有疾病的治疗(用S-腺巧蛋氨酸的治疗或其它治疗)效果的评估。
[0089] 4、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在肿瘤鉴别诊断中的应用。
[0090] 5、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在癌症化疗耐受（效果）中的应 用。
[0091] 6、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在胚胎形成，分化及衰老研究中 的应用。
[0092] 7、用试纸条或其它介质的半定量和定性免疫方法测定甲基化指数，W方便消费者 用于上述1-6方面。
[0093] 8、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，W方便消费者监测S-腺巧蛋氨酸作为处方和非处方药物治疗一些疾病状态。
[0094] 9、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，W方便消费者用于尿 液和血样品。
[00M] 10、定量和定性测定S-腺巧蛋氨酸，用于指导并监测S-腺巧蛋氨酸作为药物的治 疗情况。
[0096] 本发明也提供用S-腺巧蛋氨酸和包括S-腺巧蛋氨酸的综合治疗分析及方案。本发 明尤其提供了合成Aza-S-腺巧蛋氨酸半抗原的重要改进。详细阐述见下合成方案1和图5。
[0097] 合成方案1 [009引
5
[0099] 收集了病人血浆样品，用含有本发明中半抗原制备的抗体的酶联免疫吸附实验 化LI SA)方法测定了 S-腺巧蛋氨酸(SAM)和S-腺巧同型半脫氨酸(SAH)含量。ELISA形式包括 W下几种：
[0100] 形式1:(1)样品或标准品，（2)抗体，（3)半抗原-酶偶联物，（4)二抗包被的试纸条 或酶联板，二抗举例:羊抗鼠抗体或羊抗兔抗体，（5)洗涂液，（6)酶底物，（7)终止液(如果使 用"终点"模式，终止液可有可无;如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0101] 形式2: (1)样品或标准品，（2)抗体，（3)二抗-酶偶联物，（4)半抗原-载体蛋白包被 的试纸条或酶联板，（5)洗涂液，（6)酶底物，（7)终止液(如果使用"终点"模式终止液可有可 无;如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0102] 形式3: (1)针对2个决定簇的2个配对抗体，（2)样品或标准品，（3)在（1)中的一个 抗体与酶偶联，（4)洗涂液，（5)酶底物，（6)终止液(如果使用"终点"模式终止液可有可无； 如果使用"速率"模式，不需要终止液）
[0103] 本发明同时阐明基于免疫学方法化LISA等）的测定SAM的检测试剂盒(包含抗SAM 的抗体）。化ISA试剂盒可W是W上任何一种形式。例如，ELISA试剂盒可W包括W下成分： (a)二抗吸附在固相介质上，（b)包被（固化)半抗原及类似物，免疫原或其它含有免疫原的 类似的蛋白，（C) W固体或溶解形式的酶底物，（d)示踪物标记半抗原或类似物(示踪物或酶 偶联物），（e)缓冲液和洗液，（f)附加成分，主要用于防止非特异性吸附或结合或聚集。（g) 加样枪、解育器、标准品、标准曲线、结果读数仪。
[0104] SAM和SAH含量测定W后，甲基化指数即可W算出（SAM/SAH)，用于评估个体的健康 状况。从11里健康人的测定结果看，健康正常人SAM水平为147 ± 16nM，SAH水品为29 ± 1 InM, 甲基化指数为5 ± 1。癌症病人平均SAM为103 ± 52nM，动脉粥样硬化病人平均SAM为113 ± 15nM，W含有兔单抗测定SAH试剂盒初步测定动脉粥样硬化病人血浆中SAH明显升高，SAM/ SAH则明显降低。肝脏病人平均SAM为45 ± SnM(从26例样品），比正常人的SAM水平明显降低。 SAM和SAH的比值，及甲基化指数比SAM或SAH能够更精确地反映一般健康状况，疾病状态，发 展和预后。一般认为健康人的甲基化指数应该大于4(该值与检测方法有关，运个值是由高 压液相和质谱的方法算出来的）在病理状况下，由于SAM水平降低，同时SAH水平升高，甲基 化指数小于4,甚至小于1。降低的甲基化指数反过来会影响体内重要物质如DNA，RNA，多肤， 激素，神经递质等的甲基化过程，从而导致身体病变的发生或恶化。
[0105] 甲基化指数也可W用来决定化疗方案。甲基化指数明显降低的肿瘤病人可W使用 较积极的方案。甲基化指数可W用来根据癌症阶段和每个病人的具体情况选择合适的治疗 方案，显示甲基化指数在个体化治疗和用药中的应用价值。
[0106] 实施例简述
[0107] W下实施例旨在展示上述提及的部分检测方法，化合物和抗体的应用个例(所有 设及的数字均有变动范围且受具体实验条件所限，此为生物学领域实验受多方面影响的常 理)和治疗方案，不应该认为有可能限制本发明的范畴。
[010引实施例1
[0109] 制备抗S-腺巧蛋氨酸和S-腺巧同型半脫氨酸单抗隆和多克隆抗体
[0110] 试剂：
[0111] AdaM:Azaadenosyl 二氨基蛋氨酸，
[0112] ASAM: Aza-SAM,或者氮-腺巧蛋氨酸
[0113] BgG:牛丫球蛋白
[0114] BSA:牛血清白蛋白
[0115] BTG:牛thyrogloblulin
[0116] CSAM:碳-腺巧蛋氨酸或者6-甲基6-去氨西奈芬净
[0117] daH:去氨-5-腺巧同型半脫氨酸
[011引 da服0:daH横酸盐
[0119] DCC:二环己基碳二亚胺
[0120] DMF:二甲基甲酯胺
[0121] EDAC:乙基碳二亚胺盐酸盐
[0122] ELISA:酶联免疫吸附检测
[0123] GAM plate/strip:羊抗鼠免疫球蛋白包被吸附板或者条
[0124] GAR plate/strip:羊抗兔免疫球蛋白包被吸附板或者条 [01巧]HRP:辣根过氧化物酶
[0126] IB:解育缓冲液
[0127] KLH:血蓝蛋白
[012引畑S: N-径基班巧酷亚胺 [01巧]PBS:憐酸盐缓冲盐水
[0130] RT:保留时间（高效液相色谱），或室溫
[0131] SAH: S-腺巧同型半脫氨酸
[0132] SAM: S-腺巧蛋氨酸
[0133] 1、制备AdaM-NHS:把21.7mg(0.107mmole)的DCC 和7.2mg(0.061mmole)NHS 加入到 装有AdaM(15. lmg，ca.0.041mmole)e的瓶子中过夜，残留固体真空干燥3-4小时，在氮气环 境中加入大约105毫升干燥的DMF，然后将瓶子密封。该溶液在室溫环境下揽拌过夜。薄层色 谱分析显示有N服醋形成。
[0134] 2、准备AdaM-BSA:称取59.Smg BSA加入圆底烧瓶中，加入5毫升新鲜制备的IOOmm 的憐酸钢缓冲溶液，pH值为8.25。在4度水浴中剧烈揽拌，将上述方法制备的NHS每隔几分钟 缓慢加入10化。共加入150化后，混合物变为色。再加一毫升的DMSO溶液助溶。另外加50化的 NHS到DMF中，溶液再次变色。采用水浴超声处理5分钟后分5次各加入10化的畑SdDMF中共加 入15化L的N服后，超声混合20分钟。为了确保无游离半抗原，用PBS缓冲液透析（1.5升X 4) 2 天W上。最终体积约36毫升，估算BSA浓度为1.66mg/mL。
[0135] 3、准备AdaM-KLH:利用上述方法，称出17.5毫克KLH，15.1毫克AdaM。透析后的最终 体积为29.5毫升，浓度为0.6毫克/毫升。
[0136] 4、准备AdaM-PlX:称取4.72mg AdaM溶于ImL DMF中，再加入6.5毫克抓C. HC巧口 4. Omg的NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫过夜。称取1.5mg的PlX溶于pH 8.2的ImL IOmM PBS中，随后将活化的AdaM缓慢的加入至化化缓冲液中，暗处混合揽拌过夜。混合物用 IOmm抑7.3的PBS透析48小时，透析后的最终体积为3.5毫升，浓度为1.4毫克/毫升。
[0137] 5、准备SAH-BSA:称取SAH(Sigma)3. Smg溶于1.5mL DMF中，再加入 10毫克抓C.HCl 和4.5mg的NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫24小时。称取12.9毫克BSA溶于2mL pH 7.810mm的PBS中。将SAH溶液缓慢加入到BSA溶液中混合，4度暗处混合揽拌过夜。反应混合 物化Omm抑7.3的PBS透析72小时。透析后的最终体积为8.4毫升，浓度为1.4毫克/毫升。 [0 13引 6、准备SAH-化L:称取1.5mg的SAH溶于ImL DMF，再加入4毫克抓C ? HC巧日2mg的 NHS，密封揽拌混合均匀，置于暗处室溫过夜。称取1.5mg的化L溶于4.7血50mM pH 9.6PBS 中，随后将活化的SAH缓慢的加入到化L缓冲液中，暗处混合揽拌过夜。混合物用IOmm pH 7.3的PBS透析48小时，透析后的最终体积为7.0毫升，浓度为0.93毫克/毫升。
[0139] 7、制备单克隆抗体SAM和SAH的一般流程：
[0140] 基于Kolher和Milstein的方法（自然，1975,第256期，495-497页），目前常见的方 法是用小鼠制备单克隆抗体。
[0141] 用Ba化/c小鼠做单克隆抗体的免疫和腹水生产，多次皮下注射免疫原（总体积为 ImL)初始注射用完全弗氏佐剂和AdaM-BSA或AdaM-KLH按照1:1的比例完全混合并在PBS中 充分乳化。随后的注射用弗氏不完全佐剂。
[0142] 定期收集免疫动物的血液离屯、分离细胞。将获得的抗血清进行检测评估，W确定 免疫反应和抗体效价。根据应用程序，抗体可直接使用。在必要时，可W进一步纯化免疫球 蛋白，用硫酸锭或硫酸钢或蛋白A的柱层析。
[0143] 可W通过注射到宿主体内获得腹水， 然后通过蛋白质的亲和柱纯化腹水得到单克 隆抗体。也可W通过体外培养的方法制备杂交瘤细胞制备单克隆抗体。
[0144] 融合前=天小鼠静脉注射免疫原做最后加强。收获小鼠脾脏后用弗式压碎器磨 碎。脾细胞与骨髓瘤NS-I细胞按5:1的比例融合。融合后的细胞悬液，再接种在96孔板中。杂 交瘤细胞在含18 %胎牛血清的RPMI1640中生长，加入HAT和HT进行补充筛选。用AdaM-P化筛 选出的阳性克隆进行进一步培养。最后的选出有阳性有交叉的克隆。选定的克隆，注入小鼠 腹腔生产腹水。
[0145] 通过多次筛选，我们确定了具有更好的特异性并且与其他类似物的交叉较小的几 个克隆，对2株单克隆抗体的效价进行了测试，结果显示在图1:
[0146] 8、兔多克隆抗体SAM与SAH:
[0147] 用新西兰白兔做多克隆抗体生产，多次皮下注射免疫原（总体积为ImL)免疫过程 如生产单克隆抗体的免疫小鼠过程。对于抗-SAM和抗-SAH的兔抗血清的检测效价均为1: 12000。
[014引实施例2
[0149] 抗体的特异性
[0150] 为进一步测试运些克隆的特异性，84号克隆的交叉反应很低，仅1.25% (见图2)。 交叉反应中使用的S种SAM类似物为S-腺巧同型半脫氨酸（SAH)、蛋氨酸和腺巧。在竞争 ELISA中类似物的剂量高于SAM剂量约80倍。IOiiM SAH、蛋氨酸、和腺巧时，竞争反应没有出 现。当SAM加入量远低于类似物时，从图2可W见到清晰的抑制反应，抑制率超过了40%，然 而=种类似物却没有抑制现象。
[01引]118号克隆与SAH、蛋氨酸和腺巧的交叉反应也是很低（图3)。竞争化ISA中，SAM、 SAH、蛋氨酸和腺巧使用剂量与实例2中相同。结果显示，游离的SAM显著的抑制抗SAM单克隆 抗体118号与包被在ELSIA板微孔中的AdaM的结合，然而SAH、蛋氨酸和腺巧却没有抑制。
[0152] 实施例3
[0153] 竞争化SIA法
[0154] 试剂；
[0155] IB: IOmM憐酸缓冲液、150mM NaCl，0.2 %BSA，0.1 % 吐溫-20，0.1 %Procl in，抑7.4
[0156] 样本：（a) SAM甲苯横酸盐硫酸氨盐（Sigma) (b) SAH盐（分子量406.39) (C)腺巧 (Sigma) (d)甲硫氨酸（Sigma)。HRP标记羊抗鼠 IgG(H+L)二抗化arthOx，San FYancisco， CA) dHRP底物:单组份底物溶液化A-blue四甲基联苯胺底物。抗原稀释液:0.5%BSA的IB。包 被缓冲液:50mM碳酸盐缓冲液抑9.6。洗液:PBS pH7.5，0.1 %吐溫-20。
[0157] (l)、AdaM-BSA包被于化SIA板，封闭后甩干，然后与SAM、SAH、甲硫氨酸和腺巧竞 争。类似物溶于40化抗原稀释液，再加入44化0.02化g/mL纯化的抗SAM单克隆抗体和16化 IB巧ris(IOOmM P册.5)缓冲液，于37°C-起解育1-2小时。
[0158] (2)、用PBST洗板S次，甩干。
[0159] (3)、每孔加入100化合适浓度的HRP标记羊抗鼠 IgG二抗，37°C解育20分钟。
[0160] (4)、洗板S次甩干。
[0161] (5)、每孔加入10化L HRP底物，解育10-15分钟。
[0162] (6)、每孔加入50化2N出S〇4终止反应。
[0163] (7)、酶标仪读取0D4加值。
[0164] 为测量生物样本中SAM含量，开发了竞争化ISA法。
[01化]SAM、SAH竞争化ISA法标准曲线如图4所示。
[0166] L0GIT = ln[(A/A0)/(l-A/A0)]，其中A为样本或者标准品0D450值，AO为抗原为0时 的OD450值。LOG口负值表示A/A0低于50%，抑制率(1-A/A0)高于50%。
[0167] 精确称量12.6mg标准品，溶于少量的DMF溶液，然后在0 . ImM HCl中完全溶解，于 250mL容量瓶中定容。W此于IOOmL容量瓶中各自配制the扣g/mL. 2.5iig/mL，1.25iig/mL， 0.625]ig/mL，0.3125iig/mL and 0.15625]ig/mL标准品溶液。
[016引实施例4
[0169] 制备了 HRP-偶联的抗SAM单克隆抗体克隆84,另外一个抗SAM的单克隆抗体与84抗 体配对，有可能建立夹屯屯LISA W便定量SAM。
[0170] 实施例5
[0171] 血样品收集步骤
[0172] 所有正常和病人样品收集前均获得知情同意。采集静脉血到抓TA抗凝管，摇匀后 马上放到含有冰水混合物的容器中。在采血后的30分钟内，做W下步骤:预先将离屯、机冷却 到4摄氏度，将采血管直接放到合适的转头中，W2000g离屯、30分钟。迅速将血浆全部转移到 Eppendo计管中，每10化L血浆加入10化IN醋酸。样品或者立即测定SAM和SAH或者标记，分 装，置于-20°C或-70°C冻存待W后测定。移除血浆后剩余的全血细胞分装冻存用于测定 SAM，SAH或DNA，有些样品，专口分出白细胞层，冻存W便将来从白细胞中提取DNA。
[0173] 实施例6
[0174] 11例20-50岁的身材正常的亚裔男性和女性血样品，按W上竞争性化ISA方法测定 SAM和SAH含量。平均SAM水平为147 ± 16nM，SAH水品为29± 1 InM，甲基化指数为5 ± 1。将会有 更多血浆样品用于SAM和SAH的免疫测定，W观察不同种族，年龄，性别，体重，饮食，生活方 式对SAM和SAH的影响。随着大规模的针对SAM/SAH的流行病学研究的开展，与不同疾病状态 下SAM/SAH的比较，用甲基化指数作为一般健康指征将会更加明确。
[0175] 实施例7
[0176] W直接法竞争化ISA测定住院准备化疗的病人的血样品SAM和SAH含量。12例癌症 病人平均SAM为103±52nM，平均SAH为250±90nM，平均甲基化指数为0.5。更多的诊断信息 明确，症状，资政分期，病情进展，治疗，复发，预后明确的临床样品的分析工作正在进行，W 期得到完整的甲基化指数与癌症各个方面的关系的资料来进一步验证。多种癌症化疗前后 样品已经收集。测定人血白细胞的DNA甲基化程度。癌症病人的DNA甲基化异常和甲基化指 数或整体DNA甲基化程度的关系也将为健康状况和治疗方案有指导作用。
[0177] 实施例8
[0178] 动脉粥样硬化和屯、脏病患者（重症监护病人）的血浆样品也用我们建立的竞争性 ELISA来分析SAM和SAH含量，商业化ISA试剂盒测定同型半脫氨酸化CY)含量。10例动脉粥样 硬化病人样品平均SAM为113±15nM，SAH含量为680±258nM，W含有兔单克隆抗SAH抗体 (ablll903 ,abeam, Cambridge, MA，USA)建立的SAH试剂盒初步测定屯、脏突发病人血浆中SAH 明显升高。更多的数据证明SM/SAH在动脉粥样硬化病(包括冠状动脉，脑血管和外周血管） 中明显降低。甲基化指数和被认为与屯、血管疾病死亡率有正相关的同型半脫氨酸含量的关 系很明确（因为SAH是HCY的来源）。SAM/SAH可能比肥Y更好，能更直接地反映屯、脏病的发作 和评估治疗有效性的指标。
[0179] 实施例9
[0180] 肝脏疾病比如传染性肝炎(有些伴有胆管狭窄），肝硬化，肝纤维化等的血浆样品 也用我们建立的竞争性ELISA来分析SM和SAH含量。26例病人样品平均SAM为45 ± 8nM，远比 正常人的SAM水平低;但是SAH水平则明显高于正常人，为342 ± 129nM，甲基化指数平均值大 约为0.13.
[0181] 实施例10
[0182] 抑郁症病人的血液样品也用来测定SAM含量。预计运类病人样品由湘雅第二附属 医院精神健康研究所(无明显器质性病变的抑郁症)和宁波第第二医院神经内科和康复科 (有明显器质性病变的抑郁症)提供。尤其要比较用SAM-e或其它药物治疗前后样品中SAM和 SAH含量。10例样品中SAM水平为20±18nM，SAH为340±180nM.甲基化指数平均约为0.064。 SAM和甲基化指数是指导个体化用药治疗抑郁症的有益的武器(指标），并对预后有指导意 义。定性和半定量SAM试纸条将对于抑郁症病人是否使用SAM或其它抗抑郁药物治疗，使用 多少剂量等，提供了简单方便的评判方法。运将帮助病人合理地选择对自己有利的药物与 剂量。
[0183] 实施例11
[0184] 己金森氏病人的血液样品也用来测定SAM含量。样品由宁波第二医院神经内科和 康复科确诊后提供。同样用本发明中建立的竞争性化ISA方法测定血浆样品中SAM和SAH水 平。
[0185] 实施例12
[0186] 风湿性关节炎和多发性硬化病人的血液样品也用来测定SAM含量。样品由宁波第 二医院康复科确诊为骨关节炎和多发性硬化后提供。同样用本发明中建立的竞争性化ISA 方法测定血浆样品中SAM和SAH水平。研究发现，SAM水平和甲基化指数在骨关节炎和多发性 硬化病人中有明显改变。骨关节炎和多发性硬化病人的SAM和SAH水平在服用SAM或其它有 效治疗药物前后进行比较会有变化。SAM和甲基化指数也将会是骨关节炎和多发性硬化病 个体化用药和知道预后的有效指征。定性和半定量SAM试纸条将对于运些病人是否使用SAM 或其它治疗骨关节炎和多发性硬化病药物进行治疗，使用多少剂量等，提供了简单方便的 评判方法。运将帮助病人合理地选择对自己有利的药物与剂量。
[0187] 实施例13
[0188] 实施例子6-12中样品的甲基化指数测定方法如下：用本发明中建立的免疫测定方 法如竞争性化ISA方法同时测定SAM和SAH的含量，计算SAM和SAH的比值，就是甲基化指数。 甲基化指数应该比单一的SAM或SAH或HCY指标更能精确地更有说服力地评估健康状况，疾 病状态，病情发展和预后。一般认为正常人甲基化指数大于4。在病理情况下，会小于4，甚至 小于1，原因是在病理状况下SAM水平减低同时SAH水平升高。降低的甲基化指数反过来同时 会进一步影响DNA，RNA，多肤，激素，神经递质等重要生命分子的甲基化过程的正常进行。所 W把甲基化指数调整到正常范围内对人体健康有益。
[0189] 实施例14
[0190] 化合物1:2'，3'-0-异丙叉腺巧（25克，82毫摩尔，反应式1)和除水干燥的化晚 (200mL) -起倒入500毫升单口圆底烧瓶中，在氮气的保护下使用磁子强力揽拌。圆底烧瓶 在热烘干器上加热并强力揽拌使腺巧溶解，5分钟后所用固体物完全溶解。将混合物溶液放 置在冰水浴中20分钟左右。对甲苯横酷氯固体分8次在一个小时左右加完，W防止反应明显 放热。混合物在(TC保持反应5天，使用薄层色谱检测反应完全后，往产物中加入IOOmL纯水 和300mL乙酸乙醋。混合物转移到分液漏斗中，加入IOOmL的3摩尔每升的盐酸，分离出来的 有机层分五次每次使用200mL纯水冲洗，W除掉有机层中过量的化晚盐酸盐。有机层使用减 压蒸馈旋干，再使用IOOmL的二氯甲烧溶解，然后缓慢的加入1.1化庚烧并不停的揽拌，通过 分液漏斗分离出31.1克的白色沉淀，使用质谱和核磁共振谱确定其结构。
[0191] 实施例15
[0192] 化合物2:化合物1 (32.2克，70毫摩尔）放入300mL带密封的磁性揽拌装置中，然后 加入200mL含有2M的甲胺四氨巧喃溶液，然后将反应装置密封。反应装置浸入到50摄氏度的 油浴中反应两天并不停揽拌，然后将反应装置带出油浴，最后放置在冰水浴中反应30分钟。 打开密封盖，使用氮气将多余的甲胺吹干。将产物使用旋转蒸发器旋干。使用5%甲醇二氯 甲烧溶液过色谱柱纯化产物，收集到3.51可得化合物2，使用核磁共振确定其结构。
[0193] 实施例16
[0194] 化合物3:5.0克（15.6毫摩尔)氨基化合物2放置在SOOmL的单口瓶中，往单口瓶中 加入150血干燥的乙腊和2.1克（16.38毫摩尔）的二异丙基乙胺，在35°C揽拌30分钟，再加入 2.55克漠下烧，然后加入288mg舰化四下锭，混合物在40°C反应5天。反应产物使用减压蒸馈 浓缩，浓缩物使用5%的甲醇二氯甲烧溶 液过层析柱，收集到5.36克产物，产率为82%。
[0195] 实施例17
[0196] 化合物4:甲醋化合物3(7.76克，18.4mmo 1)放入250mL的圆底烧瓶中，往圆底烧瓶 中加入15mL甲醇和15mL纯水，揽拌10分钟。加入1.55克固体氨氧化裡揽拌反应2小时(直到 薄层色谱和液相色谱检测反应完全）。粗品浓缩后进行下一步，无需进一步纯化。
[0197] 实施例18
[0198] 化合物5:约7克的粗裡盐4溶解于150毫升3摩尔每升的盐酸，在室溫下揽拌反应4 小时(直到原料完全消失在化C和LCMS)。粗的混合物经过滤后，然后在压力下浓缩干燥。粗 渣使用5次，每次120克的40%甲醇水洗脱液过柱纯化。将纯化的组分汇集，然后集中在高真 空下，在40°C下干燥。该产品是一种栋色的油状物质。产品通过高效液相色谱、质谱和核磁 共振谱确认。4.8克99.55%产品转入9瓶Wl :1甲醇和水的混合物分装，每一瓶样品集中在 40°C高真空下干燥完全。
[0199] 所有在本申请中引用的专利，专利申请和期刊出版物，包括其中引用的参考资料， 在此通过引用的方式全部并入本发明。
[0200] 虽然本发明的许多实施方案包括目前优选的实施方案被简单描述如上，许多其它 稍有变化的类似的实施方案实属在本公开的阐述和W下权利要求之范围内。因此，该所提 供的优选实施方案和实施例的细节不被解释为限制性的。应当理解的是，运里使用的术语 仅仅是描述而不是限制性的，并且各种类似的变体和许多等效物或概念将不脱离其宗旨或 离开所要求保护的发明的范围。
[0201] 实施例19
[0202] 测定了一期癌症病人的SAM和SAH水平，对于甲基化指数小于2(比正常平均值小一 倍左右），建议给化疗的病人SAM-e进行辅助治疗。
[0203] 实施例20
[0204] 可W测定病人尿液或者血液(如果尿液中有些特别的成分影响测定结果使得结果 偏低等）中的甲基化指数是个体化治疗抑郁症病人的好办法。SAM治疗方案可W包括如下：
[0205] 每天服用SAM-e 800-1600毫克SAMe的经口服6周。SAMe通过静脉注射或给予肌肉 注射，剂量范围从200至400mg/天至多8周。口服1000-1600毫克/天15天至6周。静脉注射 150-400毫克/每天持续3-4周的剂量是最常见的。400mg的S-腺巧-心甲硫氨酸-1,4-下二横 酸稳定盐(诺尔制药公司，米兰，意大利)每日肌肉注射。75-200毫克SAMe肌肉注射14-30天。 200-400毫克/250毫升生理盐水，前S天静脉注射的治疗，随后W400毫克/日的SMe治疗4-14天。
[0206] 使用在本发明中开发的甲基化指数化ISA试剂盒，对服用高剂量（MOOmg/天）的 SAM-e的病人每3-5天测量的甲基化指数，W便有效地及时地调整SAM-e的剂量。如果甲基化 指数增加太快，比如在任何两次测定之间差别超过5倍或甲基化指数为一个特定数字如0.5 (同时患者明显伴有与SAM-e使用相关联的临床症状时），建议减少用量，特别是对于有高血 压或其它屯、血管疾病的患者。高危人群最好每日测试甲基化指数或每天使用SAM和SAH快速 检测试纸条W定性或半定量检测在血液或尿中SAM和SAH水平，W确保SAM-e用药的安全性， W避免任何可能的副作用。
[0207] 对于那些每日口服SAM-e低于400毫克的情况，也建议测定甲基化指数，或者至少 在需要的时候测定，或者每周测定一次，W便明确SAM的用量是否合适，W及何时停止服药。
[0208] 除非甲基化指标恢复正常并稳定一两个星期，不要停止服药SAM-e。
[0209] 对于甲基化指数正常或接近正常的抑郁症患者，不要将SAM-e作为首选治疗用药 或方法。相反，使用其他类型的抗抑郁药品。但是，甲基化指数仍然可能是一个很好的指标 来监测药物治疗的有效性等。定期进行检测甲基化指数仍然是重要的，W确定何时可W停 止药物治疗。
[0210] 实施例21
[0211] 可W测定病人尿液或者血液(如果尿液中有些特别的成分影响测定结果使得结果 偏低等）中的甲基化指数是个体化治疗肝脏和/或胆管狭窄病人的好办法。SAM治疗方案可 W包括如下：
[0212] 对于成年人，根据肝脏和/或胆管狭窄或其它疾病的严重性，可W使用如下方案：
[0213] 每天口服SAM-e 1600毫克SAM-e约2周。SAM-e通过静脉注注射，剂量1000 mg/天约4 周。
[0214] 治疗妊娠期间胆管阻塞问题，缓慢地静脉输注500毫克的Tmnsmeti!(珍，2次/天，持 续14天，然后每天2次口服SAM-e 500毫克SAM-e知道分娩完毕。另外，每天口服600毫克的 Samyr?也可W用来处理妊娠性胆汁渺积的问题。每天口服SAM-e 1800毫克Samy愧)和 beta-mimetics。每天口服2次SAM-e 500毫克/次。其它SAM-e使用方法：1000毫克每日肌肉 注射直到分娩;200毫克/天静脉注射持续20天;400毫克/次，2次/天静脉注射知道分娩;800 毫克/天静脉滴注3小时，持续20天。SOOmg的S-腺巧-1^-甲硫氨酸-1,4-下二横酸稳定盐(诺 尔化noil)制药公司，米兰，意大利)每日静脉注射。
[0215] 使用在本发明中开发的甲基化指数化ISA试剂盒，对服用高剂量（〉600mg/天）的 SAM-e的病人每3天测量的甲基化指数，W便有效地及时地调整SAM-e的剂量。如果甲基化指 数增加太快，比如在任何两次测定之间差别超过5倍或甲基化指数为一个特定数字（同时患 者明显伴有与SAM-e使用相关联的临床症状时），建议减少用量，特别是对于有高血压或其 它屯、血管疾病的患者。高危人群最好每日测试甲基化指数或每天使用SAM和SAH快速检测试 纸条W定性或半定量检测在血液或尿中SAM和SAH水平，W确保SAM-e用药的安全性，W避免 任何可能的副作用。
[0216] 对于那些每日口服SAM-e低于600毫克的情况，也建议测定甲基化指数，或者至少 在需要的时候测定，或者每周测定一次，W便明确SAM的用量是否合适，W及何时停止服药。
[0217] 除非甲基化指标恢复正常并稳定一两个星期，不要停止服药SAM-e。
[0218] 所有在本申请中引用的专利，专利申请和期刊出版物，包括其中引用的参考资料， 在此通过引用的方式全部并入本发明。
[0219] 虽然本发明的许多实施方案包括目前优选的实施方案被简单描述如上，许多其它 稍有变化的类似的实施方案实属在本公开的阐述和W下权利要求之范围内。因此，该所提 供的优选实施方案和实施例的细节不被解释为限制性的。应当理解的是，运里使用的术语 仅仅是描述而不是限制性的，并且各种类似的变体和许多等效物或概念将不脱离其宗旨或 离开所要求保护的发明的范围。
【主权项】
1. 哺乳动物类癌症治疗方法： (a) 测定癌症病人体液中的甲基化指数 (b) 分析病人的疾病阶段和进展变化和甲基化指数的关系 (c) 根据(b)的结果决定合适的治疗方案2. 上述权利要求1中甲基化指数使用以下方法测定的： (al)用以下方法测定哺乳类体内S-腺苷蛋氨酸含量：（i)采集样品；（ii)样品与抗S-腺 苷蛋氨酸特异性抗体混合；（iii)测定样品中的S-腺苷蛋氨酸与{ii}中抗体的结合情况； (iv)定量Uii}中S-腺苷蛋氨酸抗体与S-腺苷蛋氨酸结合量，以算出样品中S-腺苷蛋氨酸 的浓度；（a2)用本发明建立的免疫测定方法测定体内S-腺苷同型半胱氨酸含量；（a3)计算 (al)/(a2)比率即是样品的甲基化指数。3. 选择哺乳动物类肿瘤治疗方案： (a) 测定癌症病人体液中的甲基化指数 (b) 比较甲基化指数和对照的甲基化指数，看看测得的病人的甲基化指数是否有指导 意义 (c) 根据(b)的结果决定合适的治疗方案。根据甲基化指数的大小不仅指导治疗方案， 而且可以提示病人对当前治疗反应好还是反应不佳。4. 治疗人类抑郁症或情绪异常性疾病的方法由以下组成： (a) 用以下方法测定人类体内S-腺苷蛋氨酸含量：（i)采集样品；（ii)样品与抗S-腺苷 蛋氨酸特异性抗体混合；（iii)测定样品中的S-腺苷蛋氨酸与（ii)中抗体的结合情况；（iv) 定量(iii)中S-腺苷蛋氨酸抗体与S-腺苷蛋氨酸结合量，以算出样品中S-腺苷蛋氨酸的浓 度； (b) 分析甲基化指数和抑郁症或情绪异常性疾病的的关系 (c) 根据(b)的相关结果决定合适剂量的有效药物治疗抑郁症或情绪异常性疾病5. 上述权利要求4中治疗的药物:苯乙肼，苯环丙胺，吗氯贝胺，丙咪嗪，阿米替林，地昔 帕明，去甲替林，多虑平，普罗替林，曲米帕明，氯米帕明，阿莫沙平，氟西汀，舍曲林，帕罗西 汀，西酞普兰，氟伏沙明，文拉法辛，马普替林，阿莫沙平，曲唑酮，安非他酮，度洛西汀，艾司 西酞普兰，西酞普兰，奈法唑酮，文拉法辛，米那普仑，瑞波西汀，米氮平，Kava-卡瓦，圣约翰 疣，S-腺苷蛋氨酸，促甲状腺激素释放激素，神经激肽受体，拮抗剂，甲状腺素，神经肽，以神 经肽受体和激素为靶子的化合物。6. -种用于在受试者中诊断精神性疾病或/和神经变性病症或预测受试者对于精神性 疾病或/和神经变性病症的易感性的方法，该方法包括：（a)获得一个或多个来自受试者的 生物样品；（b)测定样品中S-腺苷蛋氨酸水平或甲基化指数;和(c)比较(b)中样品中的生物 标志物(S-腺苷蛋氨酸水平或甲基化指数)的水平与对照样品中相应的生物标志物的水平， 其中如果来自受试者的样品的两个或更多生物标志物的水平与对照的相比较明显异常，预 计受试者将容易患精神性疾病或神经退行性疾病。7. 上述权利要求6中对照样品来源于1个或多个没有精神性疾病或/和神经变性性疾患 的个体或正常人（阴性对照）。另外还包括已被明确诊断为精神性疾病或神经退行性疾病的 受试者（阳性对照）。8. -种检测在患者中疾病的存在或不存在的方法，其中所述的疾病是伴随着S-腺苷蛋 氨酸缺陷的各种疾病:选定怀疑患有所述疾病的患者或处于具有所述疾病的风险的人;从 所述患者或潜在患者中收集生物样品;使用从S-腺苷蛋氨酸的半抗原类似物制备的抗体测 定所述生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平;分析生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平与所述疾病 存在或不存的关系。9. 一种用于评估受试者是否需要进行用S-腺苷蛋氨酸的单独治疗或与其它化疗剂合 用的方法，包括以下步骤组合：（a)从怀疑需要这种治疗的受试者中收集体液样品；（b)测定 所述样品中S-腺苷蛋氨酸水平的量；（c)测量的S-腺苷同型半胱氨酸的水平并计算的甲基 化指数；（d)比较所述样品与的正常标准的甲基化指数;和(e)如果所述样品的甲基化指数 超出正常范围，提示需要S-腺苷蛋氨酸治疗。10. 个性化药物治疗哺乳动物类疾病的方法，该方法包括从患者体液中测量甲基化指 数，并基于所测定的甲基化指数水平，提出一个最有可能有效的治疗方案。11. 一种用于监测癌症患者的治疗功效的方法，诊断时测定第一个时间点的甲基化指 数;治疗患者;疗程完成后测定第二个时间点的甲基化指数水平;比较第二个时间点的第一 个时间点的受试者的甲基化指数变化，以确定癌症治疗的效果。
【专利摘要】本发明提供了检测患者中的疾病的存在或不存在的方法，其中所述疾病是伴随着S-腺苷蛋氨酸(或S-腺苷甲硫氨酸)水平降低的情况：寻找被怀疑具有所述疾病或处于具有患所述疾病的风险的病人；从所述患者中获得生物样品；使用从S-腺苷蛋氨酸的半抗原类似物制备的抗体测定所述生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平；将该样品中S-腺苷蛋氨酸的水平与是否存在或不存在所怀疑的疾病或其严重程度相关联。本发明还提供了用于确定S-腺苷同型半胱氨酸(或称S-腺苷高半胱氨酸)的方法，以便计算出甲基化指数(SAM/SAH的比率)，该指数是表示一个人是否健康的指标。此外，本发明还包括用于确定S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的试纸条的方法。
【IPC分类】A61K31/7076, A61P35/00, G01N33/574
【公开号】CN105492012
【申请号】CN201480015695
【发明人】郝秀娟, 埃塞克·安格雷斯
【申请人】湖南天合生物技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年3月18日
【公告号】CA2906955A1, EP2968386A1, US20140271945, WO2014146137A1
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