维持尺寸和生物学活性的冷冻干燥的聚电解质复合物的制作方法
维持尺寸和生物学活性的冷冻干燥的聚电解质复合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的参考
[0002] 本申请要求要求于2013年6月10日提交的美国临时专利申请号61/833,010的权益 和优先权，其内容W其全部内容通过引用结合于此。
技术领域
[0003] 本发明设及在溶液中具有提高稳定性并对长期存储中的物理或化学降解具有改 善的抗性的聚电解质复合组合物;用于获得运种聚电解质复合组合物的方法W及运些聚电 解质复合组合物用于递送核酸的用途。
【背景技术】
[0004] 近年来已经付诸了大量努力W开发用于递送治疗药物的纳米颗粒组合物，治疗药 物如但不限于蛋白质、肤、脱氧核糖核酸(DNA)、如质粒(pDNA)和寡脱氧核巧酸(0DN)、W及 核糖核酸如小干扰核糖核酸(SiRNA)和小发夹核糖核酸(ShRNA)。然而，显示运些胶态组合 物在溶液中具有有限的稳定性，并长期储存容易发生物理或化学降解[1]。
[000引通过冷冻干燥(freeze-化ying)，也称为冻干Qyo地iIization)，运些组合物的脱 水被用于提高它们的长期稳定性[2-4]。运个过程由3个主要步骤组成:冷冻、初级干燥和二 级干燥。它提供了在减少的体积中使干燥的组合物再水化W增加活性剂的浓度并达到治疗 剂量的可能性。运在自组装聚阳离子和核酸(NA)之间的聚电解质复合组合物的情况下是特 别令人感兴趣的，上述自组装需要在稀释条件下制备W产生小而尺寸均匀的纳米颗粒[1]。
[0006] -般需要向组合物中加入冻干保护剂W防止冻干时不可逆的聚结和溶液中纳米 颗粒的官能度的损失[4,5]。冻融研究允许识别待用于给定的组合物的潜在的冻干保护剂 [6,7]。二糖(如薦糖、海藻糖、乳糖等），寡糖/多糖(如纤维素、葡聚糖等），聚合物(如PEG、 PVP等)等已经用作冻干保护剂W稳定长期存储的组合物[3,4]。海藻糖也将是一个极好的 纳米颗粒冻干保护剂[4,11-13]。然而，据发现在高溫下储存时，冷冻干燥的无定形二糖会 比多糖更容易结晶，增加复合物聚结的风险[14]，但是多糖却被发现由于其蓬松是低效率 的冻干保护剂[15，16]。寡糖可能是优越的稳定剂，因为它们具有二糖和多糖对于复合物最 佳稳定都具有的有利性质[17]。已证明低分子量葡聚糖在冻干和再水化时保留阳离子多聚 物(polyplex)物理化学性质和功能方面是有效的，同时在体内和体外研究中与薦糖相比保 持了更高的细胞活力[1引。
[0007] 缓冲剂可W用于稳定抑和防止在通过冻干过程的冷冻阶段时发生的溶质的低溫 浓缩期间纳米颗粒酸解[2]。必须谨慎选择冻干期间使用的缓冲剂，因为在冷冻期间某些会 结晶或沉淀(憐酸盐、班巧酸盐或酒石酸盐），引起pH值变化最高达4个单位[2，20-23] DTg'， 指的是最大低溫浓缩的溶液的玻璃化转变溫度，是选择用于冷冻干燥的赋形剂时要考虑的 重要参数;它是能够实施初级干燥而不会影响最终产品的最高溫度的良好估计。巧樣酸钢 是非结晶性缓冲剂，因为其在不同pH值的较高1旨'[22]及其接近中性的口1(3(口1(33 = 6.4)
[24]，其适用于冻干的可注射组合物。心组氨酸也能够是适用的，因为它的S个地a值之一 为6.1，它在冷冻干燥时在pH 5.5至6.5下几乎不表现出结晶，并且它具有高的Tg'（-33°C) [12,25]。使用赋形剂，主要是冻干保护剂和一些缓冲剂，对于用聚(D，!^-乳酸-共-乙醇酸） (化GA) (U.S. 2011/262490) [26-28]、聚（1-赖氨酸）。化）[29]、聚乳酸（PLA) (U.S. 2011/ 0275704) [30]、明胶[31]、聚乙締亚胺(PEI) [7,15,17,32-37]形成的冷冻干燥的聚电解质 复合组合物的开发，已经被表征。
[0008] 基于PEI的纳米颗粒系统在冷冻干燥中是最特征化的。已经证实几种二糖在冷冻 干燥期间对于冻干保护PEI/NA纳米颗粒是有效的。现有的冻干保护剂筛选研究表明，需要 相对高浓度的薦糖(对于包含50iig DNA/mL的组合物相当于37.5% (wt/v)) W在冻融时保持 70kDa(重均分子量(Mw))支化PEI/DNA的粒径，但是会尽管导致在C(zeta)电位和转染效率 方面的急剧下降[32]。更近期的工作表明，可W在浓度低得多的薦糖、乳糖或海藻糖(对于 包含50yg DNA/mL的组合物相当于1.25%(巧1八））中冷冻干燥2540曰(1^支化阳1/0魁复合 物而无颗粒聚结或体外转染损失，可接受的C电位增加（10~20mV)，和用乳糖组合物的最高 体内转染效率[33]。甘露醇，W及薦糖或海藻糖，也可W用于防止干燥时PEI/DNA复合物的 聚结和冷冻效率的损失，但对于PEI/0DN或核酶复合物不需待冷冻干燥保护剂[34]。
[0009] 先前的研究证实，需要高薦糖/DNA重量比W在冷冻干燥时稳定纳米颗粒，导致组 合物与用于典型的质粒DM剂量的皮下（SC)或肌内（IM)注射不相容的同渗重摩 (osmolality)[32]。
[0010] 研究了使用葡聚糖（多糖）作为二糖的替代物来稳定冻干的70kDa(Mw)支化PEI/ DNA复合物的可能性。葡聚糖3kDa在保持复合物完整性方面与薦糖一样有效，同时降低了重 构溶液的同渗重摩约40% [15]。葡聚糖3W)a的/薦糖组合物能够浓缩高达10倍再水化到近 同渗重摩时的浓度，提供更适合体内注射的剂量(例如，lmg/mL)，如通过测定时不存在浊度 的变化确定的，在浓缩时不会改变粒径。然而，为了达到十倍浓度之后的那个最终浓度，在 加入冻干保护剂之前，必须W20化g/mL的初始DNA浓度制备颗粒[1引，运超过确保生产小而 尺寸均匀的纳米颗粒的典型最大浓度（IOOyg DNA/mL) [ 1 ]，提示在运些组合物中的颗粒尺 寸和多分散性可W-直较高。
[0011]此外，使用葡聚糖的主要缺点是它们已知的与PEG的不相容性，其稳定效果随着脂 质复合物（Iipoplexes)的PEG化的程度增加而降低[17]。葡聚糖化Da防止聚乙二醇化的 阳I/DNA复合物完全聚结，但是粒径仍会增加170%至240% [7]。菊粉，另一种寡糖，是用于 聚乙二醇化的脂质复合物或阳离子多聚物的有效的冻干保护剂[7]。
[001引最近，向线性PEI/DNA复合物中加入缓冲剂（IOmM k组氨酸pH 6)，W6的氨基/憐 酸醋(N/P)比制备，会引起颗粒流体动力学直径降低(从176至118nm)和多分散性指数(PDI) 减小(从0.18至0.13)，引起C电位增加(从29.6至36.3mV)，但对其体外代谢活性和基因表达 无显著影响[36]。据发现葡聚糖是用于运些复合物的一种很差的冻干保护剂，而薦糖，在至 少2000的冻干保护剂/DNA重量比（对于含50yg DNA/mL的组合物相当于10%(w/v))下，在冷 冻干燥时会对其产生稳定作用。含14 %的乳果糖（Iactosucrose)、10 %径丙基0环糊精/ 6.5%薦糖或10%聚维酬/6.3%薦糖的等渗组合物在40°C下储存6个周的时间是稳定的，其 中颗粒小于170nm。乳果糖或径丙基0环糊精/薦糖组合物的体外最有效的[36]。另一种缓冲 剂，pH 7的S乙醇胺，据发现对于保持PEI -甘露二糖(PE Im) /pDNA复合物在冷冻干燥时与 50%甘油组合是有效的。冷冻干燥的组合物能够存储在-20°C或4°C下长达30天，并仍然保 持200nm的粒径(wo 2010/125544)[37]。
[0013] 使用PEI共价结合至聚乙二醇（PEG)和胆固醇（畑ol)，PEG-PEI-畑ol(0.554mg/ mL)/pDNA(0.15mg/mL)，在乳糖或薦糖（0.3、1.5或3%(巧八））中制备的脂质阳离子多聚物 (Iipopolyplexes)可W被冷冻干燥和再水化成5、1或0.5mg/mL的最终DNA浓度，而无需向组 合物中加入缓冲剂。在-20或-80°C ,60%畑存储冷冻干燥的样品2年后或在重构和在4°C下 存储样品长达3个月之后(WO 2009/021017)，粒径或生物学活性(体外、体内、癌症患者中） 在运些组合物之间几乎没有看到变化[35]。事实上，先前已经报道，脂质阳离子多聚物在低 薦糖含量(对于包含50g DNA/血的组合物相当于0.0625%(w/v))下经过冻融之后便不太易 于降解，而无需对其物理化学性质修饰且对照物的转染效率至少50% [32]。
[0014] 鉴于本领域的当前技术状态，仍然需要一种聚电解质复合组合物，其提供聚电解 质复合物在溶液中增加的稳定性，并改善聚电解质复合物在长时间储存中对物理或化学降 解(设及，例如，冷冻干燥)的抗性，并能够在代表接近等渗的有效剂量的浓度下再水化。
【发明内容】
[0015] 本发明的各个方面设及一种聚电解质复合组合物，包含聚合物、核酸分子、冻干保 护剂和缓冲剂，所述组合物在冷冻干燥和再水化之后保持聚电解质复合物的生物学活性。
[0016] 本发明的各个方面设及一种聚电解质复合组合物，包含壳聚糖、含量为约50iig/mL 的脱氧核糖核酸、含量为约0.5 % (w/V)至约1 % (w/v)的海藻糖和含量为约3mM至约4mM之间 的组氨酸。
[0017] 本发明的各个方面设及一种聚电解质复合组合物，包含壳聚糖、含量为约IO^g/ mL的脱氧核糖核酸、含量为约l%(w/v)至2%(w/v)的海藻糖和含量为约6mM至约SmM之间的 组氨酸。
[0018] 本发明的各个方面设及一种制备聚电解质复合组合物的方法，该聚电解质复合组 合物保持其在冷冻干燥和再水化之后的生物学活性，方法包括W下步骤:将壳聚糖与冻干 保护剂和缓冲剂混合W形成壳聚糖组合物;独立地将核酸与冻干保护剂和缓冲剂混合W形 成核酸组合物;和将壳聚糖组合物与核酸组合物混合W形成聚电解质复合组合物。
[0019] 本发明的各个方面设及一种试剂盒，包含如本文中限定的聚电解质复合组合物； 和重构组合物的说明书。
[0020] 本发明的各个方面设及如本文中限定的聚电解质复合组合物用于向需要其的受 试者递送核酸的用途。
【附图说明】
[0021 ]现在将参考附图。
[0022]图IA，B和C。图IA图示说明了显示在没有冻干保护剂存在下经过冻融(F/T)之后看 到的纳米颗粒聚结(尺寸5倍增加）的曲线图，而向组合物加入至少l%w/v的甘露醇、0.5% (w/v)薦糖、0.5%(w/v)葡聚糖f5kDa或0.1%(w/v)海藻糖二水合物时，防止了聚结(直径< 15化m);图IB图示说明了显示使用最低的所指示的冻干保护剂含量的转染效率的曲线图； 图IC图示说明了显示在冻融之后纳米颗粒维持巧光素酶表达的曲线图，而在无冻干保护剂 时观察到显著降低。转染效率和蛋光素酶表达水平都表示为无赋形剂(OFT)的新鲜对照物 的百分比，而对照物具有43%的总细胞的转染效率和8.03610化1]/111111111旨蛋白的蛋光素酶 表达水平。
[002引图2A-H。图姻示说明了显示在1或10%(w/v)甘露醇（图2A-2B)、薦糖（图2C-2D)或 葡聚糖5kDa(图沈-2F)的存在下冻融的纳米颗粒比不含冻干保护剂（图2G)的新鲜制备的颗 粒组合物更呈球形的图像。在无冻干保护剂之下冻融的纳米颗粒发生严重聚结(图2H)。
[0024]图3A-D。图3A图示说明了显示冷冻干燥和再水化成包含0.5% (w/v)薦糖、葡聚糖 化化或海藻糖二水合物的等体积组合物引起纳米颗粒聚结的曲线图；再水化的颗粒具有 比新鲜制备的复合物更大的最高达24倍的Z-平均；图3B图示说明了显示其强度上的平均尺 寸比新鲜制备的颗粒更大的最高达9.5倍的曲线图；图3C图示说明了显示多分散性指数 (PDI)超过0.35的曲线图；和图3D图示说明了显示C电位为0或负值的曲线图。
[002引图4A-C。图4A-C图示说明了显示向包含0.5%冻干保护剂的组合物中加入pH 4.5 或抑6.5的巧樣酸/巧樣酸S钢缓冲剂引起新鲜样品中形成微观聚集体和冻融之后完全聚 结的曲线图。
[0026] 图5A-B。图5A图示说明了显示新鲜制备的壳聚糖/DNA复合物具有不同形态的图 像；图5B图示说明了显示加入pH 6.5的心组氨酸达到13.75mM的最终浓度，引起形成稍大 的、更接近球形的纳米颗粒的图像。
[0027] 图6A-C。图6A-B图示说明了曲线图，显示了向含0.5%冻干保护剂的组合物中加入 k组氨酸不引起发生聚结的曲线图：在新鲜和冻融的组合物中观察到粒径稍有增加；图6C 图示说明了显示PDI仍然低于0.35的曲线图。
[002引图7A-I。图7A-C的图示说明了显示在0.5或1 % (w/v)赋形剂和13.75mM组氨酸的存 在下冷冻干燥的纳米颗粒可W用低至其原始体积的10%再水化而不影响粒径，但其PDI下 降的曲线图；图7D-F图示说明了显示包含0.5% (w/v)薦糖或海藻糖二水合物和13.75mM组 氨酸的组合物可W被冷冻干燥和再水化成原始体积(化IX)或20倍(化20X)其初始浓度而无 颗粒聚结的曲线图；图7G-I图示说明了显示0.5%(w/v)薦糖或海藻糖二水合物组合物能够 用尽可能少的3.44mM k组氨酸进行冷冻干燥而无其粒径或PDI变化的曲线图。
[0029] 图8A-GH。图8A-C图示说明了显示在复合物形成之前，用赋形剂稀释壳聚糖和DNA 对新鲜制备的纳米颗粒粒径几乎没有影响，但在k组氨酸的存在下产生的颗粒具有较低的 PDI的曲线图，图8D-H图不说明了显不含0.5% (w/v)薦糖或海澡糖和3.44mM组氨酸的组合 物进行RhlX或Rh20X之后未观察到粒径变化(Z-平均或强度上的平均粒径），但在化20X时 PDI小幅降低的曲线图。用0.5% (w/v)葡聚糖，颗粒更大，但仍保持约300nm，并且PDI从在 化1X时的0.4减小降低至化20X时的0.18。
[0030] 图9A-D。图9A-B图示说明了显示转染效率和巧光素酶表达水平的按照无赋形剂的 新鲜对照物(无 Lyo-化S(O)-新鲜）的百分比表示的曲线图，对照物具有53%的总细胞的转 染效率和6.76E-扣M巧光素酶/mg蛋白质的表达水平。含0.5% (w/v)冻干保护剂的组合物 在冷冻干燥之前具有接近对照物的100%的转染效率，并且在冷冻干燥之后低于对照物的 45%，而同时在冷冻干燥后其蛋光素酶表达水平低于对照物的25%。图9C-D图示说明了显 示同时包含0.5%冻干保护剂和3.441111的心组氨酸的组合物在冷冻干燥之前具有接近对照 物的110%的转染效率，在再水化至等体积(化IX)之后超过对照物的80%，并且对于包含海 藻糖的组合物按照20X再水化之后达到高达对照物的77 %。含心组氨酸和薦糖或海藻糖二 水合物的组合物具有类似于对照物的巧光素酶表达水平(对照物的116%至66%)，而对于 包含葡聚糖5kDa的那些则表达为对照物的57 %至12 %。
[0031 ] 图10A-F。图IOA-D图示说明了显示含0.5%海藻糖二水合物和3.5mM心组氨酸的 浓缩纳米颗粒组合物通过20X倍系数再水化之后引起尺寸和PDI的少量增加，但复合物的C 电位没有变化;使用一个或两个连续的冷冻干燥/再水化循环W达到最终20X浓度系数对纳 米颗粒物理化学性质没有影响的曲线图；图IOE-F图示说明了显示在单次冷冻干燥(FD/ 化20x)之后浓缩20X的组合物具有对照物100 %的转染效率，而经过两个连续的冷冻干燥循 环邮（10X+2X)和化(5X+4X)]之后，它们具有对照物的至少85 %的转染效率的曲线图。具有 20X终浓度系数的所有组合物在它们冷冻干燥一次或两次时具有对照物64 %至69 %的巧光 素酶表达水平。
[00创图11A-C。图1IA-B中图示说明了显示在包含1 %或2% (w/v)海藻糖和7或3.5mM组 氨酸的CS/siRNA组合物的化IX或化20X之后，对于在颗粒形成之后10化g/mL的SiRNA浓度， 观察到最低粒径变化(Z-平均）的曲线图。运些组合物的PDI在化IX之后低于0.25而在化20X 之后小于0.20;图IlC图示说明了显示包含1 %海藻糖和7mM k组氨酸的组合物在抑之后保 留沉默效率，而残余eGFP表达水平为未处理细胞的52至47%之间，无论组合物是新鲜的、 化IX或是化IOX的。
【具体实施方式】
[0033] 本发明源于本发明人的W下发现:壳聚糖核酸纳米颗粒能够被冷冻干燥和浓缩， 再水化之后无粒径变化或生物学活性损失或高渗溶液的产生，条件是在待冻干的颗粒悬浮 液中存在合适的冻干保护剂类型和浓度，W及缓冲剂类型和浓度。
[0034] 因此，本发明一个实施方式提供了运样的聚电解质复合组合物，其提供了聚电解 质复合物在溶液中增加的稳定性和/或聚电解质复合物对长期储存中的物理或化学降解的 改善的抗性。
[0035] 本发明的另一个实施方式提供了运样的冷冻干燥的聚电解质复合组合物，其提供 了聚电解质复合物在溶液中的稳定性和/或聚电解质复合物对长期储存中的物理或化学降 解的改善的抗性。
[0036] 在一些运些实施方式中，聚电解质复合物是基于多糖的聚电解质复合物。在一些 情况下，聚电解质复合物是多糖和核酸之间的聚电解质复合物。
[0037] 正如本文中所用，术语"聚电解质"是指其重复单元带有电解质基团的聚合物。因 此，聚电解质包括聚阳离子和聚阴离子。运些基团在水溶液中离解，使得聚合物带电荷。聚 电解质性质因此既类似于电解质又类似于聚合物。
[0038] 如本文所用，术语"多糖"是指由通过糖巧键结合在一起的单糖单元的长链所组成 的、在水解时得到组成单糖或寡糖的分子。
[0039] 在一些情况下，多糖是壳聚糖。正如本文中所用，术语"壳聚糖"是指一种由随机分 布的-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酷单元)和N-乙酷基-D-葡糖胺（乙酷化单元)组成的线 性多糖。它通常通过用碱性氨氧化钢处理邮和其他甲壳类的壳制成。壳聚糖具有广泛的有 益性质，包括生物相容性、生物可降解性、粘膜粘合(mucoaa化esive)性能、抗微生物/抗真 菌活性和非常低毒性。
[0040] 壳聚糖的分子量W及链上的胺基团的量(脱乙酷或孤A的程度)对其生物学和生理 学特性具有重大影响。例如，乙酷基的含量和分布影响生物可降解性，因为不存在乙酷基团 或其均匀分布(无规而不是嵌段)会引起酶降解的速率非常低。
[0041] 在运些实施方式的一些实践中，壳聚糖可W包含化学修饰。包含化学修饰的壳聚 糖的实例包括，但不限于:具有W下的壳聚糖类化合物：（i)可W共价连接至壳多糖和/或壳 聚糖、或离子地或疏水地粘附于与核酸或寡核巧酸复合的壳聚糖类化合物的特异性或非特 异性的细胞祀向部分，和（ii)壳多糖和壳聚糖的各种衍生物或修饰，其用于改变它们的物 理、化学或生理学性质。运种修饰的壳聚糖的实例是具有W下各项的壳聚糖类化合物:特异 性或非特异性祀向配体、膜渗透剂、亚细胞定位组件、溶内吞体(endosomo Iy t i C)(胞溶)剂、 核定位信号、胶体稳定剂、促进血液中长循环半衰期的试剂和化学衍生物(如盐、0-乙酷化 和N-乙酷化衍生物）。用于壳聚糖的化学修饰的一些位点包括:C2(NH-C0-C出或N出）、C3(0H) 或 Cs(OfcOH)D
[0042] 在本文中限定的运些实施方式的某些实践中，壳聚糖具有的特定平均分子量 (Mn)，其为约4W)a至约200W)a之间，优选约化化至约200W)a之间，更优选约化化至约100W)a 之间，更优选约IOkDa至约SOkDa之间。壳聚糖进一步具有的具体脱乙酷度(抓A)为优选约 70%至约100%之间，更优选约80%至95%之间。
[0043] 在运些实施方式的某些实践中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)中的 一种或多种。核酸例如是质粒(pDNA)、微环或寡脱氧核巧酸(ODN)中的一种或多种。核酸还 可W是小干扰核糖核酸(S iRNA)和小发夹核糖核酸(ShRNA)或信使核糖核酸(mRNA)中的一 种或多种。
[0044] 依据聚合物的胺基团与核酸的憐酸醋基团的摩尔比(N/P比）确定进入如本文中所 限定的组合物的聚合物和核酸的比率。在一些实施方式中，如本文中所限定的组合物的N/P 比为约1.2至约30之间，优选N作比为约2至约10之间，更优选N作比为约5。
[004引已经进行用壳聚糖/核酸聚电解质复合物的研究[38-45]。运些研究设及包含核酸 (如，例如，脱氧核糖核酸或核糖核酸）和具有8至200kDa之间的数均分子量(Mn)和72%至 95 %之间的脱乙酷度（DDA)的壳聚糖进行高效率转染的组合物(WO 2009/0075383和WO 2012/159215)。然而，运些研究既没有考虑也没有解决与运些组合物长期稳定化作用相关 的多重挑战。
[0046] 现有工作还没有解决按照治疗浓度通过在减少的体积中再水化冷冻干燥的组合 物而生产等渗壳聚糖/核酸组合物的可能性。二糖(如薦糖或甘露醇)将会防止壳聚糖类多 聚物在冷冻干燥和短期储存（<2个月）时的聚结和官能度损失[8-10]。初始组合物的pH对 于冷冻干燥期间壳聚糖水解的状态是很关键的，一旦溶液pH从6降至4.1，降解速率增加30 倍[2]。为了保证组合物的足够缓冲作用，缓冲剂的摩尔浓度必须至少等于壳聚糖单体的摩 尔浓度，但在注射的最终组合物中要低于0.1 MW防止与生理缓冲剂竞争，和其他不良影响。 壳聚糖水解率会随着HCl浓度增加而增加[1引，并在溶剂的存在下会降低，促进更紧凑的壳 聚糖链构象，糖巧键位于结构的中屯、对于水解作用不太易于接近[19]。
[0047] 视黄醇被封装于水可溶性的壳聚糖（18W)a，96%DDA)中W形成的球形纳米颗粒， 其随后冻干3天，并在无任何冻干保护剂下易于再水化。尽管运些再水化颗粒具有稍小的平 均尺寸和分布广度，但冻干对它们的C电位没有影响，也没有降解封装的视黄醇[46]。用于 口服膜岛素递送的冷冻干燥的壳聚糖(80W)a，85%DDA)/聚(Y-谷氨酸）纳米颗粒被冷冻干 燥在1.5%海藻糖中，而尽管干饼发生强巧塌，却没有改变改尺寸或再水化复合物的形态 (平均粒径<245nm，PDI<0.3)或膜岛素含量的降低[47]。已经证明壳聚糖纳米颗粒在酸性 pH值下对水解敏感：PH= 1.2，颗粒降解；在PH= 2 . O时，它们28 %更大。用S甲基壳聚糖 (TMC; 200kDa，85 %孤A，季锭化程度(DQ) 15 %或30 % )或TMC-半脫氨酸结合物（TMC-切S)和 膜岛素形成的聚电解质复合物W20的薦糖/膜岛素 w/w比率冻干在薦糖中，而在再水化之后 没有改变粒径、C电位或膜岛素封装效率[4引。用于递送加替沙星的海藻酸盐(75-l OOkDa)/ 壳聚糖(65-90kDa，孤A>80%)纳米颗粒配制于5%w/v甘露醇中，冷冻干燥并室溫下储存长 达12个月。按照初始体积再水化后，仅观察到粒径少量增加(从345nm至410nm)，而并未改变 其神位或其体外加替沙星释放曲线[49]。甲氧基聚化二醇)-接枝的壳聚糖（10kDa，97% DDA)共聚合物的引入氨甲蝶岭的聚合物纳米颗粒经过制备，在无冻干保护剂下冻干长达两 天，再水化在去离子水中，并随后进行表征:粒径低于l〇〇nm，C电位值介于+20至+40mV之间， 而负载效率超过65% [50]。
[0048] 正如本文中所用，术语电位"是指胶体体系中的电动电位。它通常使用希腊字母 的Zeta(C)表示，因此是C-电位。C电位是滑动平面相对于本体流体远离界面的点的位置处 的界面双层(DL)中的电位。C电位是分散介质和附连至分散的颗粒的流体静态层之间的电 位差。
[0049] 生产壳聚糖和聚乙醇酸(PGA)、a-PGA、PGA的可溶性盐、PGA的金属盐或肝素的纳米 颗粒用于将核酸递送至祀向位点用于治疗骨质疏松症。纳米颗粒具有266nm的平均尺寸，并 且可W被冷冻干燥和再水化在低至2.5%的海藻糖中，尺寸增加13%，或冷冻干燥和再水化 在2.5%甘露醇中，平均粒径增加57%化8 7,901，711)[51]。？66化的壳聚糖（1101^)曰，87% DDAVpDNA纳米颗粒冻干在1%甘露醇中，并随后4°C或-20°C储存1个月，或冻干在40%薦糖 中，并随后储存于-20°C下，而没有改变其尺寸、C电位和转染效率[引。其他纳米颗粒，DNA: 壳聚糖（901d)a):裂解肤（电荷比1:6:1-/+/-)，冷冻干燥在10%乳糖中之后保留了其尺寸 (300-350nm)，并在口服给予之后72小时于兔子中证明了报告子基因 CMV-CAT的体内表达 (WO 97/42975)[52]O
[0050] 壳聚糖(CS:170kDa，84%孤AVsiRNA复合物(N/P比= 50)的冻干的研究表明，10% 的薦糖对于保持再水化之后的粒径是必需的。新鲜制备的复合物在加入薦糖之后粒径稍微 增加（126至169nm)，而在冷冻干燥和再水化之后为142nm[9]。在没有冻干保护剂的情况下， 再水化的复合物对于在动态光散射化LS)中的粒径测定过大。样品基因敲低效率随SiRNA浓 度升高而增大并依赖于薦糖的存在:对于较低的SiRNA浓度（<25nm)，用10%的薦糖获得最 高敲低率(60% );对于最高SiRNA浓度（50nM) ,5%薦糖足W达到最大敲低效率(70% )。在 5%或更多的薦糖中配制壳聚糖/siRNA(50nm)复合物时，检测到10%的H1299细胞活力下 降。在室溫下胆存长达2个月之后10%的薦糖组合物的沉默活性达到32%[9]。
[0051 ] 已经示出，当冷冻干燥在0.05% (w/v)壳聚糖和1 % (w/v)聚乙締醇(PVA)的溶液中 时，用于递送寡核巧酸和SiRNA的壳聚糖涂覆的PLGA复合物发生聚结[10]。在冷冻干燥在补 充有缓冲剂的更浓组合物:0.25 % (w/v)壳聚糖，10 % (w/v)PVA和0.5M pH 4.4的乙酸缓冲 剂中时也引起产生复合物聚结[53]。可W通过W大于5:1的冻干保护剂:纳米球重量比加入 甘露醇避免冷冻干燥后产生的聚结[10]。在不存在壳聚糖涂层时，仅通过使用大于1:1的冻 干保护剂纳米球重量比就可W避免冷冻干燥后的PLGA/寡核巧酸颗粒的聚结[10]。
[0052] 最后，壳聚糖/DNA复合形成物形成于化is-HCl缓冲剂中，通过在水介质中离屯、而 分离，并在无冻干保护剂冷冻干燥之前填充到模具中QP4354445) [54]。
[0053] 为了保持按照稀释方案制备的聚合物/核酸多聚物冷冻干燥后的物理化学性质和 转染效率，组合物需要包括与再水化成0.5至Img DNA/mL的等渗注射液相容的浓度的冻干 保护剂(二糖、=糖或多元醇）。注射剂的最终剂量因此非常有限，因为冷冻干燥的组合物不 能再水化成更高浓度而不会变得高度高渗。添加缓冲剂至高浓度冻干保护剂对保持冷冻干 燥之后的纳米颗粒性质影响不大。然而，可能需要它的存在是为了控制在注射之前具有较 低冻干保护剂浓度的再水化的组合物的pH值。虽然葡聚糖/薦糖组合物容许冷冻干燥的支 化的基于阳I的组合物的10倍浓度再水化至近同渗重摩，但运些组合物受限于葡聚糖和薦 糖，并且不包括任何可能对于维持冻干后的粒径和完整性所必需的缓冲剂。
[0054] 在另一实施方式中，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸分子和冷冻干燥保护 剂（f reeZe-化y ing proteC化nt)。正如本文中所用，短语"冷冻干燥保护剂"是指保护冻干 材料的分子。冷冻干燥保护剂包括，例如，低溫保护剂和冻干保护剂（lyoprotectant)。已知 的冻干保护剂包括，但不限于，多径基化合物，如糖（单糖、二糖和多糖）、多元醇及其衍生 物。海藻糖和薦糖是天然的冻干保护剂。海藻糖是由多种植物(例如卷柏和拟南芥），真菌和 在干旱期间处于滞生状态(也称为低湿休眠）的无脊椎动物中生产。在运些实施方式的一些 实践中，冻干保护剂是二糖、=糖、寡糖/多糖、多元醇、聚合物、高分子量赋形剂、氨基酸分 子或它们的任何组合中的一种或多种。二糖可W是薦糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖和 蜜二糖中的一种或多种。二糖可W按照约0.1%(w/v)至约10%(w/v)之间、优选约0.5%(w/ V)至约5 % (w/v)之间、而更优选约0.5 % (w/v)至约2 % (w/v)之间的浓度存在于本发明的组 合物中。S糖可W是麦芽S糖和棉子糖中的一种或多种。S糖可W按照约0.1 % (w/v)至约 10%(>八)之间、优选约0.5%(>八)至约5%(>八)之间、而更优选约0.5%(￥八)至约2%(*/ V)之间的浓度存在。寡糖/多糖可W是葡聚糖、环糊精、麦芽糊精、径乙基淀粉、聚薦糖、纤维 素、径丙基甲基纤维素和菊粉中的一种或多种。寡糖/多糖可W按照约0.1% (w/v)至约10% (w/v)之间、优选约0.5% (w/v)至约5% (w/v)之间、而更优选约0.5% (w/v)至约2% (w/v)之 间的浓度存在于本发明的组合物中。葡聚糖可W用于对生物分子施加等渗压力。在一些实 施方式中，葡聚糖具有1至701d)a之间、优选1至化Da之间的平均分子量(Mn)。多元醇可W是 甘露醇和肌醇中的一种或多种。多元醇可W按照约0.1%(w/v)至约10%(w/v)之间、优选约 0.5%(w/v)至约5%(w/v)之间、而更优选约2%(w/v)至约3%(w/v)之间的浓度存在于本发 明的组合物中。氨基酸分子可W是赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，丙氨酸和苯丙氨酸中的至少一 种。氨基酸分子可W按照约ImM至约IOOmM之间、优选约SmM至约14mM之间、而更优选约SmM至 约4mM之间的浓度存在于本发明的组合物中。高分子量赋形剂可W是聚乙二醇(PEG)、明胶、 聚葡萄糖和聚乙締化咯烧酬(PVP)中的一种或多种。
[0055] 在一些其他实施方式中，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸分子、冷冻干燥保 护剂和缓冲剂。用于本发明组合物的缓冲剂可W包含巧樣酸钢、组氨酸、苹果酸钢、酒石酸 钢和碳酸氨钢中的至少一种。缓冲剂可W按照约ImM至约IOOmM之间、优选约3mM至约14mM之 间、优选约SmM至约SmM之间、而更优选约SmM至约4mM之间的浓度存在于本文中限定的组合 物中。
[0056] 在运些实施方式的一些情况下，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸、海藻糖和 组氨酸。
[0057] 在运些实施方式的一些情况下、聚电解质复合组合物包含壳聚糖、核酸、海藻糖和 组氨酸。
[0058] 在运些实施方式的其他情况下、聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸、含量为约 0.5% (w/v)至约2% (w/v)的海藻糖和含量为约3mM至约SmM的组氨酸。
[0059] 在运些实施方式的其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖、核酸、含量为约 0.5% (w/v)至约2% (w/v)的海藻糖和含量为约3mM至约SmM的组氨酸。
[0060] 在运些实施方式的其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖、含量为约50iig/ mL的脱氧核糖核酸、含量为约0.5 % (w/V)至约1 % (w/V)的海藻糖和含量为约3mM至约4mM的 组氨酸。
[0061] 在运些实施方式的其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖，含量为约10化 g/mL的核糖核酸、含量为约l%(w/v)至约2%(w/v)的海藻糖和含量为约6mM至约SmM的组氨 酸。
[0062] 在其他情况下，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸、薦糖和组氨酸。
[0063] 在其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖、核酸、薦糖和组氨酸。
[0064] 在其他情况下，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸、含量为约0.5(w/v)至约 2%(*八)的薦糖和含量为约311^至约411^的组氨酸。
[0065] 在其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖、核酸、含量为约0.5(w/v)至约 2%(*八)的薦糖和含量为约311^至约411^的组氨酸。
[0066] 根据本实施方式的某些实践中，聚电解质复合组合物是冷冻干燥的。正如将要理 解，冷冻干燥（freeze-化ying)，也已知为冻干Qyo地i Ii sat ion)、冷干Qyo地i Iizat ion) 或冻干(cryodesiccation)，是用来保存易腐物质或使材料运输更方便的脱水工艺方法。冷 冻干燥通过冷冻材料并随后降低周围的压力而使材料中的冻水直接从固相升华到气相发 挥作用。
[0067] 冷冻干燥的工艺过程可能设及包括在冷冻之前处理产品的任何方法的预处理步 骤。运个步骤可能设及诸如但不限于，加入组分而增加稳定性和/或改善加工处理、降低高 蒸汽压溶剂或增加表面积的操作。前处理的方法包括:冷冻浓缩、溶液相浓缩、制剂W保存 产品外观、制剂W稳定反应性的产物、制剂W增加表面面积W及降低高蒸气压溶剂。
[0068] 在小规模上，通常通过将材料放置于冷冻干燥烧瓶中并旋转烧瓶于浴中进行冷 冻，冷却浴称为壳式冷冻机，由机械制冷、干冰和甲醇或液氮冷却。在较大规模上，通常使用 冷冻干燥机完成冷冻。在运个步骤中，将物质冷却至低于其=相点、也就是材料的固相和液 相能够共存的最低溫度是很重要的。运确保了接着的步骤中将发生升华而不是烙化。更大 的晶体更易于冷冻干燥。
[0069] 在初级干燥阶段，压力降低，并向物质供给足够的热量而供水升华。可W使用升华 分子的升华"潜热"计算必要的热量。在运初始干燥阶段，材料中的水约95%升华。在此阶段 中，通过施加部分真空控制压力。真空加快升华作用，使其可用作精屯、设计的干燥工艺过 程。此外，冷的冷凝室和/或冷凝板提供水蒸汽再固化于其上的一个或多个表面。第二干燥 阶段旨在去除未冻的水分子，因为冰会在初级干燥阶段中去除。冷冻干燥过程的运一部分 是由材料的吸附等溫线控制的。在运个阶段中，溫度比初级干燥阶段升高更高，甚至能够超 过0°C，W打破水分子和冷冻物质之间已经形成的任何物理化学相互作用。
[0070] 合适的冷冻干燥机包括但不限于歧管冷冻干燥机、旋转冷冻干燥机和盘式冷冻干 燥机。
[0071] 在另一实施方式中，本发明还提供了制备聚电解质复合物的方法和本文中限定的 聚电解质复合组合物。在运个实施方式的一种实践中，方法包括制备聚合物组合物和核酸 组合物;将聚合物和核酸组合物混合在一起W形成聚电解质复合组合物。所得的聚电解质 复合组合物随后可W进行冷冻干燥。
[0072] 在运些实施方式的一些实践中，方法包括其中溶解聚合物的步骤和其中溶解的聚 合物与合适的冷冻干燥保护剂和合适的缓冲剂混合而使之形成聚合物组合物的步骤。方法 还包括其中核酸分子与合适的冷冻干燥保护剂和合适的缓冲剂混合而使之形成核酸组合 物的步骤。聚合物和核酸组合物随后混合在一起W形成聚电解质复合组合物。所得的聚电 解质复合组合物随后可W进行冷冻干燥。
[0073] 在另一实践中，方法包括其中壳聚糖溶解的步骤和其中溶解的壳聚糖与合适的冻 干保护剂和合适的缓冲剂混合而使之形成壳聚糖组合物的步骤。方法还包括其中核酸分子 与合适的冻干保护剂和合适的缓冲剂混合而使之形成核酸组合物的步骤。壳聚糖和核酸组 合物然后混合在一起W形成聚电解质复合组合物。获得的聚电解质复合组合物
[0074] 本发明还提供了制造制品或商业包装或试剂盒，包括一个或多个容器、容器上的 标签、如本文所限定的聚电解质复合组合物和使用说明书。除了如本文所限定的聚电解质 复合组合物外，制造制品或商业包装或试剂盒还可W包括在使用之前重构聚电解质复合组 合物的水。
[0075] 本发明还提供了制造制品或商业包装或试剂盒，包括一个或多个容器、容器上的 标签、如本文所限定的冷冻干燥的聚电解质复合组合物和使用说明书。除了如本文所限定 的冷冻干燥的聚电解质复合组合物外，制造制品或商业包装或试剂盒还可W包括在使用之 前重构聚电解质复合组合物的水。合适的
[0076] 在运些实施方式的一些实践中，水适合于向受试者注射。聚电解质复合组合物可 W按照5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或 20倍初始浓度的浓度重构于水中。聚电解质复合组合物可W按照25倍、30倍、35倍、40倍、45 倍、50倍、55倍或60倍初始浓度的浓度通过执行一个W上的重构循环，如例如，通过执行2个 重构循环而重构于水中。
[0077]可从在稀释条件(如，例如但不限于，约IOOyg核酸/mL,特异于每种组合物）下制备 如本文所限定的聚电解质复合组合物W产生小而尺寸均匀的纳米颗粒用于核酸递送。冷冻 干燥的并再水化的组合物可W具有有小的纳米颗粒尺寸和低的多分散性指数。
[0078] 正如本文中所用的，术语"多分散性"或"多分散性指数"（PDI)是指分子质量在给 定聚合物样品中的分布的量度。计算的PDI是重均分子量除W数均分子量。它表示各个分子 质量在一批聚合物中的分布。PDI具有值等于1或大于1，但由于聚合物链接近均匀的链长 度，PDI趋于一（1)。
[0079] 在运些实施方式的某些实践中，新鲜制备的、冷冻干燥的和/或再水化的如本文所 限定的组合物具有W下属性中的一个或多个：
[0080] A)它们有正C电位而促进转染期间的细胞摄取。C电位足够高W确保复合物形成和 冷冻干燥W及复合物再水化和注射之间的短期稳定性。
[0081] B)它们表现出纳米颗粒的均匀冻干而使在冷冻干燥和再水化之后组合物中检测 到最低或没有检测到聚结。
[0082] C)它们在冷冻干燥和再水化之后保持了聚电解质复合物的生物学活性。
[0083] 正如本文中限定的聚电解质复合物提到的如本文中所用的短语"生物学活性"是 指正如本文中限定的聚电解质复合物的生物学、细胞学或药学的能力，特别是在递送质粒 DNA时它们表达蛋白质的能力(转染效率)和在递送SiRNA时通过RNAi沉默基因表达的能力， 运两种情况下都不会引起不良的毒性或免疫反应。运些生物学活性应当优选连同属性A-G 中的一种或多种一起保留。
[0084] D)为了在诊所中的易用性，正如本文中限定的冷冻干燥的组合物在方便注射入受 试者内的有限时间内完全重构。
[0085] E)为了其在诊所中使用时用有限的注射体积W达到在其治疗剂量，正如本文中限 定的再水化的聚电解质复合组合物具有最大的核酸浓度。
[0086] F)它们具有最小量的赋形剂W在在再水化至较高的最终核酸浓度时接近等渗。具 体而言，再水化的制剂是近等渗而在注射时最小化细胞损伤、患者不适感或疼痛。
[0087 ] G)正如本文中限定的再水化的聚电解质复合组合物具有接近中性pH值W在注射 时最小化细胞损伤、患者不适感或疼痛。具体而言，正如本文中限定的组合物可W是微酸性 的W防止溶液中聚阳离子或纳米颗粒沉淀。
[008引在运些实施方式的某些实践中，正如本文中限定的新鲜的、冻融的和/或冷冻干燥 的和再水化的组合物表现出W下纳米颗粒的物理化学性质中的一个或多个：
[0089] A)纳米颗粒Z-平均低于75化m、优选低于500皿、更优选低于25化m。例如可W由化S 测定纳米颗粒Z-平均。
[0090] B)纳米颗粒平均多分散性指数(PDI)为至多0.5、优选至多0.35、最优选至多0.25。 例如可W由化S评价纳米颗粒平均PDI。
[0091] C)纳米颗粒平均C电位为正而足W确保组合物的短期稳定性。例如可W由LDV评价 纳米颗粒平均C电位。
[0092] D)本发明的组合物基本上无聚结。例如可W由ESEM评价聚结的存在。
[0093] 正如本文中限定的组合物的纳米颗粒还表现出W下体外效率标准中的一种或多 种：
[0094] A)它们表现出的转染水平大于约10%、优选大于约25%、最优选大于约50%的无 赋形剂的新聚电解质颗粒的转染水平。例如可W由流式细胞仪评价转染水平。
[0095] B)它们表现出的巧光素酶表达水平大于10%、优选大于25 %、而最优选大于50% 的无赋形剂新鲜CS/DNA颗粒的表达水平。例如可W通过发光法评价巧光素酶表达水平。
[0096] C)它们表现出的沉默效率大于10%、优选大于25%、最优选大于50%的新鲜聚电 解质颗粒的沉默效率。例如可W由流式细胞仪评价沉默效率。
[0097] 本文中限定的组合物再水化后表现出W下性质标准中的一种或多种而使它们适 合于临床使用：
[0098] A)冷冻干燥的饼于约lOmin、更优选约9min、更优选约8min、更优选约7min、更优选 约6min而最优选约5分钟内完全重构。可W在重构时通过视觉检视评价重构的水平。
[0099] B)最终核酸浓度为至少0.1 mg/mL、优选至少0.2mg/mL、更优选至少0.3mg/mL、更优 选至少0.4mg/mL、而最优选至少0.5mg/mL。可W由初始DNA含量和所用的再水化系数测定最 终DNA浓度。在一些情况下，最终DNA浓度为至少0.1 mg/mL、优选至少0.2mg/mL、更优选至少 0.3mg/mL、更优选至少0.4mg/mL、而最优选至少0.5mg/mL。可W由初始DNA含量和所用的再 水化系数而测定最终RNA浓度。在一些其他情况下，最终RNA浓度为至少O.lmg/mL、优选至少 0.2mg/血、更优选至少0.3mg/mL、更优选至少0.4mg/mL、而最优选至少0.5mg/mL。可W由初 始RNA含量和所用的再水化系数测定最终RNA浓度。
[0100] C)正如本文中限定的再水化的组合物是近等渗的。在一些情况下，正如本文中限 定的再水化的组合物具有的同渗重摩，其为约100至750m0sm之间、优选约150至SOOmOsm之 间、而最优选约200至约400m0sm。可W用组合物的同渗重摩模型测定再水化的组合物的同 渗重摩。
[0101] D)正如本文中限定的再水化的组合物具有近中性抑。在具体的方面中，正如本文 中限定的再水化的组合物具有抑5至8之间、更优选5.5至7.5之间、最优选6至7之间。可W 使用抑计测定再水化的组合物的抑。
[0102] 在本发明的一些实施方式中，正如本文中限定的组合物在受试者中在病症或疾病 的治疗中使用，其中受试者是动物或人类。正如本文中所用，"治疗（treatment)"和"处置 (treating)"包括预防、抑制、W及缓解与病症或疾病有关的病症和症状。可W进行通过给 予治疗有效量的本文描述的组合物而实施治疗。在一些情况下，正如本文中限定的组合物 适合于注射入受试者如动物或人类中。注射可W是皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹膜内、 銷内、硬膜外、屯、内、关节内、海绵体内或玻璃体内。
[0103] 在一些情况下，正如本文中限定的组合物可W用于基因疗法。正如本文中所用的 术语"基因疗法"是指使用核酸如DNA作为药物，通过将治疗性核酸递送进入受试者细胞中 来治疗疾病。基因疗法的最常见形式设及使用编码功能性、治疗性基因的核酸来替换突变 基因。其他形式设及直接校正突变，或使用编码治疗性蛋白质药物(而不是天然人类基因） 的DNA提供治疗。
[0104] 本发明的描述将通过参照W下实施例更易于理解，运些实施例提供用于举例说明 本发明而非限制其范围。
[0105] 实验和数据分析
[0106] 聚电解质复合组合物的制备
[0107] 室溫壳聚糖（Mn IOkDa,92%孤A)称重于4-mL Lab File玻璃小瓶并且将Milli-Q 水和HCl IN加入每个小瓶。最终壳聚糖浓度为5mg/mL，其中HCl最终浓度为28mM。小瓶置于 旋转器上并在室溫下揽拌过夜W确保完全溶解。过滤消毒壳聚糖原液。
[0108] 在W下情况下将赋形剂加入到组合物中：1)在复合物形成之后；或2)在复合物形 成之前，当稀释壳聚糖和DNA时或3) SiRNA原液：
[0109] 1)在层流罩之下，用Milli-Q水稀释壳聚糖原液至27化g/mL，而随后按照10化g/mL 将10化L与I(K)化的质粒DNA(pEGFPLuc)混合W形成N/P比为5的复合物。通过在加入壳聚糖 之后立即将抽吸溶液约10次进行混合。样品室溫放置稳定30分钟，而随后样品体积用W下 定容至40化L:Mi 11 i-Q水;和/或无菌2 %、4%或20% (w/v)甘露醇，薦糖，葡聚糖化化或海藻 糖二水合物;和/或抑4.5或6.5的70mM巧樣酸/巧樣酸S钢缓冲剂;或pH 6.5的13.75、27.5 或55mM心组氨酸。
[0110] 2)在层流罩之下，按照相同的方法壳聚糖原溶液按需要用W下稀释到27化g/mL: Mi 11 i-Q水;和/或无菌2%、4%或20% (w/v)薦糖，葡聚糖化化或海藻糖二水合物;和/或pH 6.5的13.75或55mM k组氨酸。根据相同方法将20化g/mL DNA原液稀释至10化g/mL。然后， 将10化L的壳聚糖组合物与I(K)化的DNA组合物混合，W形成N/巧k为5的复合物。通过在加入 壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次而进行混合。样品室溫放置而稳定30分钟。
[0111] 3)在层流罩之下，壳聚糖原溶液按需要用W下稀释到271或54化g/mL:无核糖核酸 酶(RNase)水;无菌8% (w/v)葡聚糖化化和/或海藻糖二水合物；和抑6.5的14mM k组氨 酸。按照相同的方法将Img/mL SiRNA原液稀释至100或200iig/mL。然后，将100化的壳聚糖组 合物与10化L的SiRNA组合物混合，W形成N/巧k为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即 将 溶液抽吸约10次而进行混合。样品室溫放置而稳定30分钟。
[0112] 将待冻融的样品转移至1.5mL冷冻管中，并W-1 °C/min的速率冷冻至-80°C，持续 至少2小时。样品在使用前室溫解冻30分钟。
[0113] 将待冷冻干燥的样品转移至2mL的血清瓶中并用13mm下基冻干塞子冷冻干燥并且 将水渗透性膜放置于盛装所有样品的浅盘上W防止灰尘或细菌污染。在Mi Ilrock Laboratcxry Series冷冻干燥机PC/PLC上使用W下两个循环之一实施冷冻干燥：
[0114] 1)在1小时内从室溫梯度冷却至-40°C，然后保持恒溫于-40°C下持续2小时;在-40 °C，100毫托下初步干燥48小时；和在100毫托下进行二次干燥，在12小时内升溫至30°C，而 随后30°C保持恒溫6小时。
[0115] 2)步冷至5°C并保持等溫30分钟，步冷却至-5°C并保持等溫30分钟，然后在35分钟 内梯度冷却至-40°C，并保持等溫2小时;在-40°C，100毫托下初步干燥48小时;和在100毫托 下二次干燥，在12小时内溫度升高至30°C，并随后保持恒溫30°C长达6小时。
[0116] 样品塞住、压成小權子(crimp)并储存于4°C直至使用。使用前15至30分钟，根据需 要将样品用等当于其原始体积的100%、20%、10%或5%的Mi 11 i-Q水的体积再水化。
[0117] 通过动态光散射(DLS)对40化或4(K)化样品测定粒径和多分散性(PDI)。用Milli-Q 水或赋形剂稀释整个样本或样品的部分用于测定。在粒径分析期间根据赋形剂的类型及其 最终浓度在仪器上调节稀释剂粘度。对于每个样品，在25°C下完成至少两次连续尺寸分析， 由12至20次连续读数（IOs光子计数/读数)获得的每次分析经过平均W获得数据集。由装置 优化每次分析所需的连续读数的数目。由相关函数推导Z-平均直径、粒径分布强度和PDI。
[0118] 通过激光多普勒测速测定颗粒C电位或表面电荷。用Milli-Q水和NaCl溶液稀释整 个样品W具有80化L包含1 OmM化Cl的样品。根据赋形剂的类型及其最终浓度在仪器中调节 稀释剂粘度。对于每个样品，在25°C下完成连续=次C电位分析，10至20次连续读数获得的 每次分析经过平均W获得数据集。由装置优化每次分析所需的连续读数的数目。
[0119] 通过环境扫描电子显微镜巧SEM)成像评价纳米颗粒的形态。使用气体喷雾方法在 抛光的晶片上粉碎小体积的样品，并随后用金瓣射涂层。对于更大的分辨率使用ESBl的高 真空模式进行观察。真空观察参数如下:加速电压= 20kV;光斑尺寸=3;工作距离~5mm。
[0120] 使用微电极测定不同组合物的抑，要求至少10化L的样品才能获得测量结果。
[0121] 鉴于大体积样品设及测定按照其初始浓度20倍再水化的冷冻干燥的样品的渗透 压浓度，并且纳米颗粒对新鲜溶液的渗透性的影响明显可忽略，仅使用赋形剂开发模型W 估算组合物同渗重摩。薦糖、葡聚糖化化、海藻糖二水合物和k组氨酸的系列稀释液的同渗 重摩用于建立添加剂模型，其随后用包含5% (w/v)葡聚糖、5% (w/v)海藻糖二水合物和pH 6.5的35mM k组氨酸的组合物进行验证。随后用包含3.44mM组氨酸pH 6.5和0.5% (w/v)薦 糖、葡聚糖或海藻糖的组合物、冷冻干燥和再水化5倍W上浓度验证在估计具有50iig的DNA/ mL纳米颗粒的组合物中模型的精度。对于包含薦糖或海藻糖的上述组合物模型是可接受 的，渗透压分别低估6和8%，但对于含葡聚糖的组合物不足，低估同渗重摩57%。
[0122] 使用人胚肾293化EK293)细胞评估组合物的转染效率和基因表达水平。皿K293细 胞在补充有10%胎牛血清(FBS)的pH 7.4的DMEM高葡萄糖中生长，并在37°C、5%C02中培 养。转染前24小时，将60,000个细胞/孔接种于24-井孔孔板，并且转染当天达到约50%汇合 (约每孔150000个细胞）。每个样品用于转染24-井孔孔板的两个井孔:一个用于流式细胞仪 中转染效率分析，另一方用于巧光素酶表达定量。在每个孔中，连同转染培养基（补充有 10%FBS的抑6.5的DMEM高葡萄糖)一起，加入精确体积的纳米颗粒组合物，W具有总计500 化的包含2.化g DNA的转染培养基和样品。细胞然后在37°C、5 % C〇2下培养24小时，并随后 用50化L的生长培养基代替转染培养基。在分析之前在37°C、5%C02下另外培养细胞24小 时。
[0123] 在流式细胞仪中测定转染效率。每个样品收集20,000个事件，并且通过具有光电 倍增管的510/20nm带通滤波器在使用488nm氣激光激发转染细胞中增强的绿色巧光蛋白 化GFP)之后测定巧光。使用非转染细胞测定皿K293细胞系自发巧光，并相应调节巧光检测 n。正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)也用于从记录的事件中排除死细胞和碎片。最后，当使 用数据分析转染效率时，FSC用于从事件中识别并排除双峰。
[0124] 通过使用化ight-Glo?巧光素酶测定法定量样品中巧光素酶蛋白含量，并基于在 每个样品的总蛋白含量归一化来评估基因表达，如用二哇嘟甲酸(BCA)分析法测定的。从包 含转染的待分析样品的每孔中除去生长培养基;用10化L pH 7.4的PBS洗涂细胞两次;室溫 下每孔使用I(K)化格洛溶胞(Glo Lysis)缓冲剂溶解细胞5分钟;并且随后将细胞裂解物胆 存于-20°C下直至分析。在室溫下解冻裂解物。在白色96-井孔孔板中测定巧光素酶的表达： 25化的化ight-PL?巧光素酶试剂与25化的细胞裂解物混合，并随后测定发光。巧光素酶含 量按照相对光单位/min(化U/min)表达或使用由已知浓度的重组巧光素酶标准的系列稀释 液制成的标准曲线转换成yg。在透明96-井孔孔板中测定蛋白含量:200化的BCA工作试剂与 25化的细胞裂解物混合；样品在37°C、5 %C〇2中培养30分钟，并随后冷却至室溫；测定在 56化m处的吸光度。制备标准曲线，其是使用20化g/mL牛血清白蛋白（BSA)标准的系列稀释 液制备的，并沿着样品分析W将吸光度读数转换为蛋白浓度。
[0125] 使用增强的绿色巧光蛋白阳性人体非小细胞肺肿瘤(eGFP阳性H1299)细胞评估组 合物的沉默效率。
[0126] 细胞生长于pH 7.4的RPMI-1640中，其补充有10%胎牛血清(FBS)，并在37°C、5% 0)2中培养。转染前24小时，将45，000个细胞/孔接种于24-井孔孔板中，而使之转染当天达 到约75%至85%汇合。在每个井孔中，加入精确体积的纳米颗粒组合物，连同pH 6.5的DMEM 高葡萄糖(无 FBS)-起，W具有总计5(K)化包含l(K)nM的SiRNA的培养基和样品。然后将细胞 在37°C、5%C〇2中培养4小时，补充55化FBS，并随后在分析之前在37°C、5%C〇2中再培养44 小时。通过流式测细胞仪测定沉默效率。每个样品收集10,000个事件，并且通过具有光电倍 增管的510/20nm带通滤波器在使用488nm氣激光激发转染细胞中增强的绿色巧光蛋白 化GFP)之后测定巧光。计算相对于未处理的细胞的eGFP强度的平均降低值。正向散射(FSC) 和侧向散射(SSC)也用于从记录的事件中排除死细胞和碎片。最后，当使用数据分析转染效 率时，FSC用于从事件中识别并排除双峰。
[0127]实施例 [012引实施例1
[0129] 冻干保护剂防止在冻融循环之后纳米颗粒聚结并保持了转染效率
[0130] 1-壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物的制备
[0131] 壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)在室溫下溶解于肥1中过夜W获得5mg/mL的最终壳聚 糖浓度。原液稀释至27化g/mL，并随后10化L与100化的质粒DNA(pEGFPLuc)按照lOOiig/mL混 合，W形成N/巧k为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次实施混合。样 品室溫放置稳定30分钟，并随后按照表1，将样品体积用无菌的Milli-Q水和/或无菌的20% (w/v)甘露醇、20%(w/v)薦糖、20%(w/v)葡聚糖化Da或20%(w/v)海藻糖二水合物定容至 400化。
[0132] 表1.在冻融前后待分析的包含冻干保护剂的组合物
[0134] 2-样品冻融(无干燥）
[01巧]将要冻融的样品转移至1.5mL冷冻管中并按照-l°C/min冷冻至-80°C至少2小时。 样品在使用前室溫解冻30分钟。
[0136] 3-DLS 测定
[0137] 按照0.1 %至10% (w/v)的浓度范围，用甘露醇、薦糖和葡聚糖化化开始进行冻干 保护剂的筛选。随后测试海藻糖二水合物，但浓度范围仅为0.1%至3% (w/v)，因为对前S 个冻干保护剂测定的粒径高于上限保持不变，因此在筛选期间加入更多的冻干保护剂被认 为是不必要的。每个组合物分析四个样品：两个新鲜制备的和两个经过一个冻融循环的。对 于每个样品，完成两次连续化S尺寸分析，每个获取自12至20个连续读数(10秒光子计数/读 数)经过平均W获得数据集。由仪器优化每次分析所需的连续读数的数目。由数据集中获得 的相关函数推导平均尺寸强度(mean size in intensity)。不包含冻干保护剂的组合物表 明冻融时发生聚结，其中粒径增加约5倍。包含至少1 % (w/v)甘露醇、0.5% (w/v)薦糖、 0.5 % (w/v)葡聚糖化化或0.1 % (w/v)海藻糖二水合物的组合物在冻融后维持纳米颗粒粒 径强度低于15化m。在较高的冻干保护剂含量下，在运些样品（±125nm)之间没观察到粒径 变化。甘露醇是最不有效的冻干保护剂，WO. 1或0.5% (w/v)的浓度冻融之后颗粒大于 SOOnm(图 1A)。
[013 引 4-ESEM 成像
[0139] 在冻融前后观察无冻干保护剂的组合物，同时观察冻融后的包含低（l%(w/v))和 高（10% (w/v))甘露醇、薦糖或葡聚糖5的样品。使用气体喷雾方法在抛光晶片上粉碎小体 积的样品，并再瓣射涂覆金。对于更大分辨率，使用环境扫描电子显微镜化沈^o的高真空模 式进行观察。高真空观察参数如下:加速电压= 20kV，光斑尺寸=3;工作距离~5mm。无冻干 保护剂存在下新鲜制备的复合物尺寸小于200nm并具有不同的形态(球形、棒状或环形），同 时它们在冻融之后大多形成大的球形聚集体(大于500nm)a或10%冻干保护剂中冻融的样 品更接近球形并保持小于200nm(图2A-H)。在l%w/v甘露醇中制备的复合物似乎稍大于薦 糖或葡聚糖5中制备的复合物，如先前在化S中所见。
[0140] 5-体外转染
[0141] 没有在体外测试包含甘露醇的组合物，因为它们在冻融后在保持粒径方面最不有 效，正如先前所见。只有证实在冻融后粒径保持低于200nm，并且包含至多3% (w/v)冻干保 护剂的组合物进行了体外测试。它们是:0.5%至3%(w/v)薦糖;0.5%至3%(w/v)葡聚糖5; 和0.1 %至3 % (w/v)海藻糖二水合物。皿K293细胞，生长于补充有10 %胎牛血清(FBS)的pH 7.4的DMEM高葡萄糖中，并在37°C、5%C〇2中培养，被用于体外研究。转染之前将60，000个细 胞24小时接种于24孔板的每个井孔中，W达到约50%汇合用于转染(约150000个细胞/孔）。 用每个样品转染24-井孔孔板的两个井孔:一个用于流式细胞仪中转染效率分析，另一方用 于巧光素酶表达定量。在每个孔中，连同转染培养基(补充有10%FBS的抑6.5的DMM高葡 萄糖)一起，加入精确体积的纳米颗粒组合物，W具有总计50化L的包含2.扣g DNA的转染培 养基和样品。细胞然后在37°C、5%C02下培养24小时，并随后用5(K)化生长培养基代替转染 培养基。在分析之前细胞在37°C、5 % C〇2下另外培养24小时。
[0142] 6-转染效率
[0143] 使用流式细胞仪测定转染效率。样品制备：从包含待分析样品的每个孔中除去生 长培养基;细胞用10化L pH 7.4的憐酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗；它们使用100化膜蛋白酶/ 抓TA/孔在37°C进行膜蛋白酶处理5分钟；然后加入10化L生长培养基并将整个样品转移至 细胞计数管中。流式细胞仪测定:每个样品收集20000个事件，并且通过具有光电倍增管的 510/20皿带通滤波器在绿色巧光蛋白化GFP)激发之后使用488皿氣激光在转染的细胞中测 定巧光。使用非转染细胞测定皿K293细胞系自发巧光，并相应调节巧光检测口。正向散射 (FSC)和侧向散射(SSC)也用于从记录的事件中排除死细胞和碎片。最后，当使用数据分析 转染效率时，FSC用于从事件中识别并排除双峰。相对于用无冻干保护剂(OFT)的新鲜制备 的复合物获得的转染细胞的百分率(其具有总细胞43%的转染效率)表达在冻融组合物中 转染细胞的百分率。体外测试的所有包含冻干保护剂的组合物冻融后都保持了转染效率， 其中新鲜制备的复合物的转染水平至少87%。无冻干保护剂存在下冻融的纳米颗粒具有为 仅新配制的复合物的转染水平的25%的转染水平(图1B)。
[0144] 7-巧光素酶表达
[0145] 使用化i曲t-Glo?巧光素酶测定法测定巧光素酶表达（W相对光单位每分钟(化U/ min)计），并基于每个样品的总蛋白含量归一化，运用二哇嘟甲酸(BCA)分析法测定。样品制 备:从包含待分析的样品的每孔中除去生长培养基；用10化L pH 7.4的PBS洗涂两次细胞； 室溫下每孔使用10化L Glo Lysis缓冲剂溶解细胞5分钟；和随后将细胞裂解物胆存于-20 °C下直至分析。在使用前在室溫下解冻裂解物。巧光素酶的表达定量:在白色96-井孔孔板 中，25化的Bri曲t-PL?巧光素酶试剂与25化细胞裂解物混合，并随后测定发光。蛋白含量定 量:在透明96-井孔孔板中，将20化L的BCA工作试剂与25化细胞裂解物混合;样品在37°C、 5 % C〇2中培养30分钟，并随后冷却至室溫;测定在562nm处的吸光度。制备标准曲线，其是使 用20化g/mL牛血清白蛋白（BSA)标准的系列稀释液制备的，并沿着样品分析W将吸光度读 数转换为蛋白浓度。对于在不存在冻干保护剂(OFT)之下基于新鲜壳聚糖/DNA复合物获得 的值(其具有8.03E10RLU/min mg蛋白质的表达水平)归一化巧光素酶表达水平。巧光素酶 的表达在新鲜复合物和无冻干保护剂下冻融的复合物之间是相似的，除了用1%和3% (w/ V)海藻糖配制的样品之外，其分别具有比新鲜对照物低40%至60%的表达水平。无冻干保 护剂冻融的样品比新鲜对照物表达的巧光素酶少75% (图1C)。
[0146] 表2实施例1中测试的22种不同组合物的性能。
[0147]
[014引实施例2
[0149] 防止纳米颗粒冻融后聚结的低冻干保护剂含量组合物不能防止在冻干期间聚结。
[0150] 1-壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物的制备
[0151] 按照实施例1中的描述制备不含冻干保护剂（组合物#1)或包含0.5% (w/v)薦糖 (组合物#9),0.5% (w/v)葡聚糖5(组合物#15)或0.5% (w/v)海藻糖二水合物(组合物#21) 的纳米颗粒组合物。将待冷冻干燥的样品转移至2mL血清小瓶中并用13mm下基冻干塞子冷 冻干燥，并且将水可渗透膜放置于装有所有样品的浅盘上防止灰尘或细菌污染。
[0152] 2-样品冷冻干燥
[0153] 在Millrock LaboratoiT Series冷冻干燥机PC/PLC上使用W下循环实施冷冻干 燥:在1小时内从室溫梯度冷却至-40°C，然后保持恒溫于-40°C下2小时;在-40°C，100毫托 下初步干燥48小时；和在100毫托下进行二次干燥，在12小时内升溫至30°C，并且随后30°C 保持恒溫6小时。样品塞住、压成小權子并储存于4°C直至使用。使用前15至30分钟，将样品 用等当于其原始体积的Milli-Q水的体积再水化之后进行冻干。尽管所有样品都在5分钟内 再水化;但用冻干保护剂再水化是瞬间的而不用任何冻干保护剂稍微较慢。
[0154] 3-DLS 测定
[0155] 每个组合物分析四个样品：两个新鲜制备的和两个冷冻干燥后并且再水化至初始 体积的。对于每个样品，进行两次或=次连续的尺寸分析，获取自12至20个连续读数（10秒 光子计数/读数)的每次分析经过平均W获得数据集。由仪器优化每次分析所需的连续读数 的数目。由数据集中获得的相关函数推导Z-平均直径、平均尺寸强度和PDI。相比于新鲜制 备的纳米颗粒，所有冷冻干燥和再水化的组合物产生大聚结：Z-平均增高最高达24倍（图 3A)，平均尺寸强度增大最高达9.5倍(图3B)，并且PDI值超过0.7,平均增长约4倍(图3C)。
[0156] 4-C电位测定
[0157]每个组合物分析四个样品：两个新鲜制备的和两个经过冷冻干燥和再水化至初始 体积的。冷冻干燥样品在冷冻干燥之前用等于其体积的Milli-Q水的体积进行再水化，并随 后将其放置稳定15至30分钟。新鲜样品和再水化的样品用40化L 20mM化Q补充，并在必要 时将其体积用Milli-Q水定容至800化才进行C电位分析。通过激光多普勒测速化DV)测定C 电位。对于每个样品，完成连续=次C电位分析，由10至20次连续读数获得的每次分析经过 平均W获得数据集。由装置优化每次分析所需的连续读数的数目。所有新鲜制备的组合物 具有为30至32mV之间的C电位，因此冻干保护剂对纳米颗粒的表面电荷没有影响。冷冻干燥 的和再水化的组合物具有为0至-5mV的C电位(图3D)。
[015引表3. 4种不同组合物的性能
[0160] 实施例3
[0161] 巧樣酸/巧樣酸=钢缓冲剂系统与基于壳聚糖的组合物-巧樣酸=钢促进壳聚糖 胶凝
[0162] 1-壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物的制备
[0163] 壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)室溫溶解于肥1中过夜W获得5mg/mL的最终壳聚糖浓 度。原液稀释至271iig/mL，并随后100化与100化质粒DNA(祀GF化UC)按照lOOiig/mL混合，W 形成N/巧k为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次而实施混合。样品 室溫放置稳定30分钟，并随后按照表4,将样品体积用无菌的2% (w/v)薦糖、2% (w/v)葡聚 糖化化或2% (w/v)海藻糖二水合物和抑4.5或6.5的无菌70mM巧樣酸/巧樣酸S钢缓冲剂 定容至40化L。
[0164] 表4.包含冻干保护剂和巧樣酸/巧樣酸=钢缓冲剂的组合物。
[0167] 2-样品冻融
[0168] 按照实施例1中的描述冻融样品。
[0169] 3-DLS 测定
[0170] 按照实施例2中的描述对尺寸和PDI分析制备的新鲜和冻融的样品。包含巧樣酸/ 巧樣酸=钢的组合物在冻融之前形成了大颗粒，具有大于9(K)nm的平均尺寸强度（图4B)。经 过冻融之后，样品完全聚结，并且不适合化S分析，Z-平均超过3500nm(图4A)并且PDI值高于 0.66(图 4C)。
[0171 ] 4-巧樣酸/巧樣酸S钢不相容性
[0172] 根据表5,将壳聚糖、薦糖或海藻糖二水合物与pH 6.2的巧樣酸/巧樣酸=钢缓冲 剂混合，或壳聚糖仅与巧樣酸或巧樣酸=钢混合。
[0173] 表5.制备用于评价巧樣酸/巧樣酸=钢与组合物的不相容性的样品。
[0175] 在缓冲剂或=巧樣酸钢存在下，壳聚糖溶液变得浑浊，但在巧樣酸的存在下却不 浑浊(数据未示出）。在=巧樣酸钢的存在下浊度最大，在壳聚糖/巧樣酸=钢混合物发生胶 凝后在溶液中形成白云状结构(数据未示出）。可W通过由带负电荷的=价=巧樣酸钢交联 正电壳聚糖链引起凝胶化(数据未示出）。
[0176] 表6. 6种不同组合物的性能
[0179] 实施例4
[0180] k组氨酸与基于壳聚糖的组合物是相容的并获得具有低多分散指数的纳米颗粒 悬浮液
[0181] 1-制备壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物用于ESEM成像
[0182] 按照实施例3中的描述制备壳聚糖/DNA复合物。在复合物室溫下稳定30分钟之后， 根据表7,用无菌4%(w/v)薦糖、4%(w/v)葡聚糖f5kDa或4%(w/v)海藻糖二水合物，pH 6.5 的无菌55mM心组氨酸缓冲剂或MiIli-Q水将样品体积定容至40化L。
[0183] 表7.用于ESEM成像的具有冻干保护剂和k组氨酸的组合物。
[018 引 2-ESEM 成像
[0186] 如实施例1种的描述实施ESBl样品制备和成像。在无冻干保护剂或组氨酸存在下 配制的新鲜纳米颗粒具有球形、棒状或环形形态（图5A)，并且它们在加入pH 6.5的并且最 终浓度13.75mM的レ组氨酸之后更加呈球形（图5B)。按照l%(w/v)冻干保护剂，用和不用 13.75mM组氨酸配制的复合物，对观察的纳米颗粒具有类似的影响。
[0187] 3-制备壳聚糖/DNA的纳米颗粒组合物用于冻融后的化S分析
[0188] 按照实施例3中的描述制备壳聚糖/DNA复合物。在复合物室溫稳定30分钟之后，按 照表8,用无菌2% (w/v)薦糖、2% (w/v)葡聚糖化Da或2% (w/v)海藻糖二水合物，和无菌 55mM pH 6.5的心组氨酸缓冲剂或Milli-Q水样品体积定容至40化L。样品如实施例1中冻 融。
[0189] 表8冻融研究的含冻干保护剂和k组氨酸的组合物。
[0190]
[0191] 4-DLS 测定
[0192] 无组氨酸的各组合物(组合物#9至11)复制品新鲜制备分析;含组氨酸的每种组合 物(组合物#12至14)复制品新鲜制备和冻融后分析。按照实施例巧巾的描述进行尺寸和PDI 分析。加入组氨酸对新鲜的组合物几乎没有影响（图6A-C):Z-平均在薦糖和海藻糖的存在 下分别增加了 30nm和13nm，并在葡聚糖存在下减少34nm;平均尺寸强度在薦糖和海藻糖的 存在增加了分别12和29nm，并且在葡聚糖存在下降了 48nm;和PDI在所有冻干保护剂存在下 降了 0.05。在组氨酸的存在下在冻融之后在组合物中没有观察到不良反应（图6A-C):Z-平 均和平均尺寸强度低于200nm并且平均PDI值低于0.35。
[0193] 表9. 14种不同组合物的性能。
[0196] 实施例5
[0197] 当加入包含冻干保护剂的组合中时k组氨酸在冷冻干燥之后防止纳米颗粒聚结
[ 0198] 组合物可W浓缩至20倍而不会显著改变纳米颗粒的尺寸和PDI;并且
[0199] 心组氨酸能够最小化于组合物中，同时防止在冷冻干燥之后颗粒聚结。
[0200] 1-制备壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物用于冷冻干燥并再水化至更高的浓度
[0201] 如实施例3中的描述制备壳聚糖/DNA复合物。复合物在室溫稳定30分钟之后，按表 10，用无菌的2%(w/v)薦糖、2或4%(w/v)葡聚糖化化或海藻糖二水合物，和55mMpH6.5的 k组氨酸缓冲剂将样品体积定容至40化L。
[0202]表10.待冷冻干燥和W更高浓度再水化的组合物。
[0204] 对于化IX、化5X和化10X:按照实施例2的描述制备组合物#3至5(见表10)的六个样 品并冷冻干燥;对于每种组合物，两个样品用40化L Mi 11 i-Q(RhlX)再水化至其原始体积， 两个用80化MiIli-Q再水化5倍浓的浓度(化5X)，并且两个用40化MiIli-Q再水化10倍更 浓的浓度(化10X)。对于化IX和化20X:如实施例2中的描述制备组合物#1，2和4的四个样品 (见表10)并冷冻干燥;对于每种组合物，两个样品用40化L Mi 11 i-Q再水化至其原始体积 (化IX)而两个用20化Milli-Q再水化20倍更浓的浓度(化20X)。再水化的样品在分析前放 置而稳定15至30分钟。所有样品5分钟内再水化，但化20X更难W实现，因为相对饼体积的小 的再水化体积。
[020引2-再水化至更高浓度的组合物的化S测定
[0206] 按照实施例2中的描述完成尺寸和PDI分析。再水化组合物#3至5(13.75mM组氨酸， 连同1 % (w/v)葡聚糖，或0.5或1 % (w/v)海藻糖二水合物)至最高达10倍更浓的浓度(化IX 至RhlOX)对颗粒Z-平均或平均尺寸强度没有影响，颗粒Z-平均从120nm到155nm变化（图 7A)，，平均尺寸强度从131nm至165nm变化（图7B)。纳米颗粒PDI值随着浓度系数的升高从 0.18降低至0.05(图7C)。包含0.5%薦糖或海藻糖的组合物，与13.75mM组氨酸合并，按照20 倍其初始浓度再水化，产生小于250nm(Z-平均，图7D)或200nm(平均尺寸强度，图7E)的颗 粒;包含葡聚糖的组合物和化20X具有305nm的Z-平均（图7D)和324nm的平均尺寸强度（图 7E)。除了0.5%葡聚糖的化IX具有为0.37的PDI外，所有的组合物具有低于0.2的PDI;组合 物化20X中的纳米颗粒具有低于组合物畑IX中的那些的PDI值(图7F)。
[0207] 3-制备壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物用于W较低的组氨酸含量冷冻干燥
[0208] 按照实施例3中的描述制备壳聚糖/DNA复合物。在室溫下稳定复合物30分钟之后， 根据表11，用无菌2 % (w/v)薦糖、葡聚糖化Da或海藻糖二水合物，和pH 6.5的55、27.5或 13.75mM k组氨酸缓冲剂将样品体积定容至40化L。
[0209] 表11.待冷冻干燥和W更高浓度再水化的组合物。
[0212] 按照实施例2中的描述制备每种组合物复制品并冻干，然后用40化L MilIi-Q再水 化至其初始体积(化IX)。
[0213] 4-W较低组氨酸含量冻干的组合物的化S测定
[0214] 如实施例2中的描述进行尺寸和PDI的分析。组氨酸含量降低并未对包含0.5% (w/ V)薦糖或海藻糖二水合物的再水化组合物的粒径产生影响，并且颗粒的直径小于160nm(图 7G-H)。当组氨酸含量从13.75mM降低至3.44mM时运些两种组合物的PDI仍小于或等于0.25 (图71)。葡聚糖组合物RhlX的Z-平均和平均尺寸强度在组氨酸浓度从13.75mM降低至 3.44mM时分别从151nm降低至71nm和从477nm降低至157nm(图7G-H)。在组氨酸含量从 13.75mM降低至6.88mM后，运些组合物的平均PDI从0.37下降到0.25，并且在组氨酸为 3.44mM时最终PDI为0.24(图71)。
[0215] 5-同渗重摩模型和估算
[0216] 开发模型W估算组合物同渗重摩，因为大体积的新鲜样品需要测定再水化在20倍 更小的体积(20倍浓缩）中的冷冻干燥的样品的同渗重摩。假设纳米颗粒同渗重摩可W忽略 不计，仅使用赋形剂(薦糖、葡聚糖化化、海藻糖二水合物和k组氨酸）的连续稀释液建立模 型。得到的模型预测包含5%(w/v)葡聚糖、5%(w/v)海藻糖二水合物和35mM pH 6.5的心组 氨酸的组合物的同渗重摩，并且精度为1.8%。基于模型，取决于冻干保护剂、组氨酸含量和 再水化时的浓度系数，同渗重摩在4至570m0sm之间变化。对于含薦糖的组合物，同渗重摩较 高，并且对于包含葡聚糖化化的那些，同渗重摩较低。两种组合物接近等渗:〇.5%dex-Ms (13.75) -Rh20X为 279m0sm而0.5 % dex-hi S (13.75) -Rhl OX为 268m0sm。
[0217]表12. 14种不同组合物的性能
[0220] 实施例6
[0221] 可W通过在形成复合物之前将冻干保护剂和缓冲剂加入核酸和壳聚糖中将新鲜 组合物中的纳米颗粒浓度最大化；
[0222] 使运些组合物中的冻干保护剂和缓冲剂含量最小化容许滤饼重构至更高浓度而 同时维持近等渗性;和
[0223] 运些组合物可W浓缩至最高达20倍而不显著改变纳米颗粒的物理化学性质和转 染效率；
[0224] 1-制备包含13.75mM组氨酸的浓缩壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物
[022引壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)室溫溶解于肥1中过夜W得到5mg/mL的最终壳聚糖浓 度。按表13，使用无菌冻干保护剂溶液(2或4% (w/v)薦糖、葡聚糖5kDa或海藻糖二水合物）， 无菌55mM pH 6.5的心组氨酸缓冲剂和^111-9水将壳聚糖原液稀释至27化肖/1111^。
[0226] 表13.形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[0229] 按照表14,使用无菌冻干保护剂溶液(2或4% (w/v)薦糖、葡聚糖化化或海藻糖二 水合物）、55mMpH6.5的レ组氨酸缓冲剂和/或Milli-Q水将DNA(祀GFPLuc，20化g/mL)原液 稀释至lOOug/mL。
[0230] 表14.在形成复合物之前用赋形剂稀释DM。
[0232] 制备每种组合物复制品。对于每个复制品，将I(K)化壳聚糖溶液与I(K)化的其互补 DNA溶液(例如，壳聚糖组合物#1与DNA组合物# 1)混合，使之形成N作比率为5的复合物。通过 在加入壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次而进行混合。在分析前，样品室溫放置而稳定30 分钟。
[0233] 2-包含13.75mM组氨酸的浓缩组合物的化S测定
[0234] 如实施例2中所描述的在进行尺寸和PDI的分析。在形成复合物之前而非之后向壳 聚糖或DNA中加入冻干保护剂和^组氨酸容许生产两倍浓缩的组合物，其中Z-平均低于 200nm，平均尺寸强度低于250nm，并且PDI值低于0.3(图8A-D)。不用k组氨酸制备的组合物 具有在115至176皿之间变化的颗粒Z-平均，并且平均尺寸强度处于144至214nm之间，并且 PDI值为0.21至0.26;用心组氨酸制备的组合物尺寸稍大，其中Z-平均为143至187皿之间， 平均尺寸强度为165至237皿之间，但具有更小的PDI值(0.13至0.18)(图8A-C)。虽然形成复 合物之前向壳聚糖和DNA中加入赋形剂产生了比先前在形成纳米颗粒之后才将其加入时所 见的稍微更大的颗粒，但是PDI值仍保持相似（参见"0FT，无化S"和"0FT，13.75mMHis，pH 6.5"，图8C-E)。
[0235] 3-制备用于再水化至更高浓度的包含3.44mM组氨酸的浓缩壳聚糖/DNA纳米颗粒 组合物
[0236] 按表15和16,如第1部分中制备壳聚糖/DNA复合物，但使用了13.75mM而不是55mM 的组氨酸原液来稀释壳聚糖和DM。
[0237] 表15.在3.44mM组氨酸中形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[0239] 表16.在3.44mM组氨酸中形成复合物之前用赋形剂稀释DM。
[0241 ] 如实施例2所描述的冷冻干燥的样品。化IX样品用20化L Milli-Q水再水化，化IOX 样品用20化Mi 11 i-Q水再水化，并且化20X样品用10化Mi 11 i-Q水进行再水化。所有样品都 在5分钟内再水化，但化20X较难W实现，因为相对于饼体积再水化体积较小。
[0242] 4-再水化至更高浓度的包含3.44mM组氨酸的浓缩组合物的化S测定
[0243] 按照第3节中所描述的制备每种其他组合物(#17至19)的六个复制品：2个加1X，2 个化OX和2个加20X。按照实施例2中所描述的完成尺寸和PDI分析。只用3.44mM组氨酸冻干 的纳米颗粒可W再水化至多达20倍而未见颗粒聚结;相比于化IX，颗粒Z-平均增长3至68nm 而平均尺寸强度增加了 7至46nm，运取决于冻干保护剂（图8D-E)。在再水化浓度系数从IX增 加至20X时PDI值发生降低;PDI对于薦糖组合物从0.17降低至0.06，对于葡聚糖组合物从 0.40降低至0.18，并且对于海藻糖二水合物组合物从0.5降低至0.10(图8F)。
[0244] 5-再水化至更高浓度的包含3.44mM组氨酸的浓缩组合物的C电位测定
[024引组合物#15的复制品制备RhlX并如第3节中所描述的制备每一其他组合物(#17至 19)的六个复制品（两个新鲜，两个化IX和两个化20X)。再水化的所有样品放置稳定5至30分 钟。所有样品在5分钟内再水化，但是Rh20X较难W实现，因为相对与饼体积再水化体积较 小。新鲜样品和再水化的样品补充60化L 13mM化Cl并，如果需要，在进行C电位分析之前用 MIlli-Q将它们的体积定容至80化L。按照实施例2中所描述的测定C电位。新鲜制备的组合 物具有24mV的C电位为；冻干并再水化的组合物具有为18至21mV的C电位，并且与它们的冻 干保护剂或再水化体积无关（图8G)。
[0246] 6-再水化至更高浓度的包含3.44mM组氨酸的浓缩组合物的ESEM成像
[0247] 按照第3节中所描述的制备每个其他组合物(#17至19)的6个复制品:两个化IX，两 个化OX和两个化20X。按照实施例1中描述的实施ESEM样品制备和成像。相比于先前对于包 含13.75mM组氨酸的组合物所观察到的，对于包含3.44mM组氨酸的组合物观察到的纳米颗 粒较不呈球形，运与化S中观察的PDI的变化是相一致的。冷冻干燥并且然后化IX或化20X的 组合物之间没有观察到显著差异，但是它们似乎比新鲜制备的组合物具有更多的球形颗 粒。颗粒大多直径低于200nm(数据未示出）。
[024引 7-体外转染
[0249]按照第3节中所描述的制备每个组合物(#15至22)的六个复制品：两个新鲜的，两 个化IX和两个化20X。将基于化gene的脂质复合物用作转染效率的阳性对照物。照实施例1 中所描述的实施体外转染按。
[0 巧 0] 8-pH 值
[0251]在新鲜制备的样品中W及在冷冻干燥并再水化至其初始体积(RhlX)或至二十分 之一的初始体积(化20X)的样品中测定组合物#15至22的pH值。在无心组氨酸的存在下，新 鲜制备的样品具有5.8±0.2的平均抑值，与冻干保护剂的存在或性质无关。其平均抑值在 化IX之后为7.0±0.2而化20X之后为5.1 ±0.2。新鲜制备的包含3.44mM心组氨酸的组合物 具有为6.42±0.05的平均pH，与冻干保护剂的存在或性质无关，并且冷冻干燥的样品在 后抑值为 6.50 ± 0.06 而化 20X 后为 6.48 ± 0.02。
[0巧2] 9-同渗重摩
[0253] 由于上述方法产生具有两倍复合物含量的组合物，对于组合物#17至19,冷冻干燥 和再水化5倍W上浓缩的，验证W前开发的同渗重摩模型的有效性。模型对于包含薦糖(# 17)或海藻糖(#19)的组合物是可接受的，并且同渗重摩分别低估6%和8%，但对于包含葡 聚糖的那些(#18)是不充分的，同渗重摩低估57%。对新鲜或再水化至其初始体积(化IX)， 至其初始体积十分之一(化10X)和初始体积二十分之一(化20X)的冷冻干燥的样品估算组 合物#17和19的同渗重摩。基于模型，同渗重摩对于包含薦糖的样品为19至372m0sm之间，并 且对于包含海藻糖二水合物的样品为17至339m0sm之间。运两种组合物化20X都接近等渗： 0.5%suc-his(3.44)-Rh20X 为 372m0sm 而 0.5%付6-1113(3.44)-加20乂为339111〇3111。
[0254] 10-转染效率
[0255] 按照实施例1中所描述的测定转染效率。基于对于无赋形剂的新鲜复合物获得的 值（图9A，A:无 Lyo-化S(O)-新鲜的）归一化样品转染效率，其具有总细胞的53%的转染效 率。Fugene具有新鲜对照物的116 %的转染效率(图9A和9C)。无组氨酸的新鲜组合物具有新 鲜对照物的90%至100%的转染效率（图9A);具有3.44mM组氨酸的新鲜组合物具有新鲜对 照物的108%至113% (图9C)的转染效率。不存在冻干保护剂冷冻干燥的组合物，有或无 3.44mM组氨酸之下，具有低于对照物的22%的转染效率（图9A和9C)。用0.5% (w/v)冻干保 护剂冷冻干燥的组合物，但无组氨酸，具有对照物的约40%的转染效率(图9A)。用0.5% (w/ V)冻干保护剂和3.44mM组氨酸冷冻干燥的组合物，并再水化1X(化IX)，相对于新鲜对照物 具有的转染效率如下：对于薦糖为100%，对于葡聚糖为85%，并且对于海藻糖为83% (图 9C)。用0.5% (w/v)冻干保护剂和3.44mM组氨酸冷冻干燥的组合物，并再水化20X(化20X)， 相对于新鲜对照物具有的转染效率如下:对于薦糖为48%，对于葡聚糖为53%，并且对于海 藻糖为78% (图9C)。
[0256] 11-巧光素酶表达
[0257] 按照实施例1中所描述的定量巧光素酶表达。使用由已知浓度的重组巧光素酶系 列稀释液制作的标准曲线将测定的巧光素酶相对光单位每分钟(RLU/min)转化成咖。基于 对于无赋形剂的新鲜壳聚糖/DNA复合物(Ctl)获得的值归一化样品巧光素酶表达水平，上 述复合物具有6.76E-扣M的巧光素酶/mg的蛋白的表达水平。在无冻干保护剂，有或无 3.44mM组氨酸冷冻干燥的组合物，表达不到10%对于对照物测定的测得的巧光素酶水平 (图9B和9D)。WO. 5% (w/v)冻干保护剂，但无组氨酸冷冻干燥的组合物表达对于对照物测 定的不到25%的测得的巧光素酶水平（图9B)"W〇.5%(w/v)冻干保护剂和3.44mM组氨酸冷 冻干燥并再水化IX(RhlX)的组合物具有的巧光素酶表达水平类似于薦糖和海藻糖二水合 物的阳性对照物，W及具有对于葡聚糖的阳性对照物的56 %表达水平（图9D)。W0.5 % (w/ V)冻干保护剂和3.44mM组氨酸冷冻干燥并再水化20X(化20X)的组合物具有类似于薦糖的 阳性对照物的的巧光素酶表达水平、对于葡聚糖的阳性对照物的12%的表达水平和对于海 藻糖二水合物的阳性对照物的65%的表达水平(图9D)。
[0258] 表17. 22种不同组合物的性能。
[0260] 实施例7
[0261] 使用两个连续的冷冻干燥/再水化循环组合物可W被浓缩至最高达20倍，由此促 进注射前最终再水化(更高的再水化体积比饼体积），运对于纳米颗粒的物理化学性质和转 染效率没有显著的变化
[0262] 1-制备用于多次冷冻干燥的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM组氨酸的壳 聚糖/DNA-纳米颗粒组合物
[0263] 壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)室溫溶解于肥1中过夜W获得5mg/mL的最终壳聚糖浓 度。按表18,使用无菌2%(w/v)海藻糖二水合物，无菌HmM pH 6.5的レ组氨酸缓冲剂和 Mi 11 i-Q水将壳聚糖原液稀释至27化g/mL。
[0264] 表18.形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[0266] 按照表19,使用无菌2%(w/v)海藻糖二水合物、无菌14mM pH 6.5的心组氨酸缓冲 剂和]?1111-9水将0臟(966。?山(3,400蛇/1111^原液稀释至100蛇/1111^。
[0267] 表19.形成复合物之前用赋形剂稀释DNA。
[0269] 制备21个样品。对于每个样品，625化稀释的壳聚糖溶液(表18)与62扣L稀释的DNA 溶液(表19)混合W形成N/巧k为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次 而进行混合。在分析或冷冻干燥之前，样品室溫放置而稳定30分钟。
[0270] 2-样品冻干
[0271] 冷冻干燥15个样品。按照表20,对于每个样品，将1200化转移至IOmL血清小瓶中， 并用20mm下基冻干塞子冷冻干燥，如实施例2中所描述的。将6个样品用12化L再水化化10X， 并随后按照表20将10化L的各个样品转移到2血血清小瓶中，并用13臟下基冻干塞子冷冻干 燥，如实施例2中所描述的。将3个样品用24化L再水化化5X，并且随后用20化L填充两个具有 100化样品的2mL血清瓶：按照表20, 一个小瓶进行化S分析，并且另一个进行转染。样品用 13皿下基冻干塞子冷冻干燥，如实施例2中所描述的。
[0272] 表20.形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[0274] 3-再水化样品用于化S或转染
[0275] 实验表明，稀释再水化的样品对纳米颗粒性质（大小，C电位，转染效率等)没有影 响，因此，在分析前如下将样品再水化并稀释。
[0276] 在分析前30分钟将样品#1用60化Mi 11 i-Q再水化化20X，然后在分析前15分钟用 1140 化 Mi Ili-Q 稀释。
[0277] 在分析前30分钟将样品#2用50化MiUi-Q再水化加20X(10X+2X)，然后在分析前 15分钟用950化MiIli-Q稀释。
[0278] 在分析前30分钟将样品#3用25化Milli-Q再水化化20X(5X+4X)，然后在分析前15 分钟用47化1 Mi Ili-Q稀释。
[0279]所有样品在5分钟内再水化，但样品#1(化20X)难W实现，因为相对于饼体积再水 化体积较小。样品#2和3容易且快速再水化，并且同时还达到20X最终浓缩系数。
[0280] 4-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mm组氨酸的浓缩组 合物的化S测定
[0281] 按照第1节中所描述的新鲜制备=个复制品，并按照第3节中所描述的再水化每个 组合物的3个冷冻干燥的复制品。如实施例2中所描述的完成尺寸和PDI分析。配制于0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM心组氨酸中的纳米颗粒可W冻干两次W达到20X(化20X)的 最终浓缩系数而未看到颗粒聚结。相比于新鲜制备的颗粒，Z-平均提高了 56至68nm而平均 尺寸强度增加了 54至63皿，运取决于用于达到化20X的冷冻干燥和再水化循环的次数。Z-平 均（180至19化m)和平均尺寸强度(204至213nm)在样品化20X之间是相似的，与实施冷冻干 燥和再水化循环的数目无关（图10A-B) "PDI值在冷冻干燥和再水化之后稍微升高，从新鲜 制备时的0.17升高至化20X之后的0.20至0.25之间（图10C)。
[0282] 5-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM组氨酸的浓缩组 合物的C电位测定
[028引先前由化S(第4节)分析的样品补充40化L 20mM化Cl,然后按照实施例帥所描述 的测定其C电位。新鲜制备的纳米颗粒具有19mV的平均C电位;冷冻干燥和再水化的组合物 具有18至21mV的C电位，并且与用于到达化20X的冷冻干燥循环数目无关（图10D)。
[0284] 6-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mm组氨酸的浓缩组 合物的体外转染
[0285] 如在第1节中所描述的新鲜制备=个复制品，并按照第3节中所描述的再水化每个 组合物的=个冷冻干燥的复制品。按照实施例1中所描述的进行体外转染。
[0286] 7-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM组氨酸的浓缩组 合物的转染效率
[0287] 按照实施例1中所描述的测定转染效率。基于对于制备于0.5% (w/v)海藻糖二水 合物和3.5mM pH 6.5的心组氨酸中的新鲜复合物获得的值归一化样品转染效率(图IOE:新 鲜的），其具有总细胞的44%的转染效率。所有冷冻干燥的组合物具有新鲜对照物85%至 100%的转染效率（图10E):再水化20X的组合物在单个冷冻干燥循环(FD/Rh20X)之后具有 等于（100 % )新鲜样品的转染效率;再水化1OX，然后冷冻干燥并化2X[化（10X+2X)]的组合 物，具有对照物的86 %的转染效率;而再水化5X，然后冷冻干燥和化4X[化(5X+4X)]的组合 物，具有对照物的85 %的转染效率。
[0288] 8-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM组氨酸的浓缩组 合物的巧光素酶表达
[0289] 如实施例1中所描述的定量巧光素酶表达，并W相对光单位每分钟（RLU/min)表 示。基于对于制备于0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM pH 6.5的心组氨酸中的新鲜复合 物获得的值归一化样品巧光素酶表达水平（图IOF:新鲜），其具有5.24E+8RLU/min*mg蛋白 的表达水平。最终化20X的所有冷冻干燥的组合物具有类似的巧光素酶表达水平，具有新鲜 对照物巧光素酶表达水平的64%至69%的值(图10F):再水化20X的组合物单冷冻干燥循环 之后(FD/化20X)具有对照物的64 %的巧光素酶表达水平;再水化IOX，然后冷冻干燥和化2X [化(0X+2X)]的组合物，具有对照物的69 %的巧光素酶表达水平;并且再水化5X，然后冷冻 干燥并化4)([化(5X+4X)]的组合物，具有对照物的66 %的巧光素酶表达水平。
[0290] 表21. 5种不同组合物的性能。
[0292] 实施例8
[0293] 相比于CS/DNA纳米颗粒，可W按照更高的初始核酸浓度制备壳聚糖/siRNA纳米颗 粒，但必须相应增加赋形剂含量；
[0294] 运些组合物可W浓缩至最高达10倍而不会显著改变纳米颗粒的物理化学性质和 沉默效率。
[0295] 1-浓缩壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的制备
[0296] 壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)室溫溶解于肥1中过夜W获得5mg/mL的最终壳聚糖浓 度。按照表22,使用无菌冻干保护剂溶液（8% (w/v)葡聚糖化Da或海藻糖二水合物）、无菌 14mM pH 6.5的心组氨酸缓冲剂和无核糖核酸酶的水将壳聚糖原液稀释至271或542g/mL。
[0297] 表22.形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[029引
[0299] 按照表23，用无菌冻干保护剂溶液（8 % (w/V)葡聚糖5kDa或海藻糖二水合物）、 14mM pH 6.5的^组氨酸缓冲剂和/或无核糖核酸酶水将抗-ApoB SiRM(正义： GUCAUCACACUGAAUACCAAU，反义:AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC，Img/mL)原液稀释至 100或20化 g/mLo
[0300] 表23.形成复合物之前用赋形剂稀释siRNA。
[0302] 对于每个复制品，100化的壳聚糖溶液与I(K)化其互补SiRNA溶液(例如，壳聚糖组 合物#1与SiRNA组合物#1)混合W形成N作比为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即将溶 液抽吸约10次进行混合。在分析之前，样品室溫放置而稳定30分钟。
[0303] 2-冷冻干燥浓缩的壳聚糖/siRNA的纳米颗粒组合物
[0304] 将待冷冻干燥的样品转移至2mL血清小瓶中并用13mm下基冷冻干燥塞子冷冻干 燥。将水可渗透膜放置于装有所有样品的托盘上，W防止灰尘或细菌污染。在Millrock Laborato巧Series冷冻干燥机PC/PLC上，使用W下循环实施冷冻干燥:步冷至5°C并保持 等溫30分钟，步冷至-5°C并保持等溫30分钟，然后在35分钟内梯度冷却至-40°C，并保持等 溫2小时;在-40°C，100毫托下初步干燥48小时;和二次干燥，在100毫托下，在12小时内溫度 升高至30°C，然后保持恒溫30°C长达6小时。样品塞住，卷成小權子并储存于4°C下直至使 用。使用前15至30分钟，化IX样品用20化L无核糖核酸酶水再水化，化1OX样品用20化无核糖 核酸酶水再水化，并且化20X样品用10化无核糖核酸酶水再水化。所有样品都在5分钟内再 水化。
[030引 4-浓缩壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的化S测定
[0306]按照第1和第2节中所描述的制备每种组合物的九个复制品：3个新鲜制备(无 FD)、 3个RhlX和S个Rh20X。按照实施例2中所描述的完成尺寸和PDI分析。尽管所有组合物在 化20X之后都防止了严重聚结，但相比于新鲜组合物，仅组合物#2和4在化IX和/或加20X之 后粒径没有显著变化；它们的Z-平均则分别增长了 21和化m(图11A)。平均PDI值大多低于 0.25(除了组合物#1，化IX)，其中组合物#2和4在化20X后分别具有0.16和0.20的PDI值（图 llB)〇
[0307] 5-浓缩的壳聚糖/s iRNA纳米颗粒组合物的C电位测定
[0308] 按照第1和第2节中的描述制备每种组合物的九个复制品个新鲜制备的（无 FD)、S个化IX和S个化10X。再水化的样品放置W稳定5至30分钟，尽管所有样品都在5分钟 内再水化。用无核糖核酸酶水将新鲜样品和再水化的样品的体积定容至40化L，然后在进行 C电位分析之前加入40化L 20mM NaCl。按照实施例2中所描述的测定C电位。新鲜制备的组 合物具有为21mV的C电位;冷冻干燥并再水化的组合物具有为21至23mV的C电位，与它们再 水化体积无关。
[0309] 6-浓缩的壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的ESEM成像
[0310]按照第1和2节中所描述的制备组合物#2的九个复制品：3个新鲜制备的（无 FD)、S 个化IX和S个化IOX。按照实施例1中所描述的实施ESEM样品制备和成像。所有观察的纳米 颗粒形状都呈球形并大多直径低于10化m。新鲜的、化IX或化IOX组合物的颗粒之间没有观 察到显著差异。
[0311 ] 7-浓缩的壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的体外沉默
[0312] 按照第1和第2节中所描述的制备组合物#2的九个复制品：3个新鲜制备的(无 FD)、 S个化IX和S个化20X。化armaFECT2用作针对沉默效率的阳性对照。将生长于补充10%胎 牛血清(FBS)的抑7.2的RPMI-1640中，并在37°C、5%C02中培养的eGFP阳性化299细胞用于 体外研究。在转染之前24小时，将45,000个细胞接种于24-井孔孔板的每个孔中W达到用于 转染的约75%至85%汇合。在每个孔中，用抑6.5的DMEM高葡萄糖(无 FBS)和纳米颗粒组合 物代替培养基，对于总共50化L的包含IOOnM的SiRNA的溶液。细胞在37°C、5 % C〇2中培养4小 时，然后用55化FB巧h充，并且随后在分析之前培养另44小时。
[0313] 8-浓缩壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的沉默效率
[0314] 使用流式细胞仪测定沉默效率。样品制备：从包含待分析样品的每个孔中除去生 长培养基；用50化L pH 7.4的憐酸盐缓冲剂盐水(PBS)冲洗细胞;使用每孔75化膜蛋白酶/ 抓TA在37°C下将它们进行膜蛋白酶处理5分钟；然后加入32扣L生长培养基，并且整个样品 转移至细胞计数管中。流式细胞仪测定:每个样品收集10000个事件，并且在使用488nm氣激 光在细胞中激发增强的绿色巧光蛋白化GFP)之后通过具有光电倍增管的510/20nm带通滤 波器测定平均巧光强度。正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)也用于从记录的事件中排除死细 胞和碎片。最后，当使用数据分析转染效率时，FSC用于从事件中识别并排除双峰。将平均残 余eGFP强度表示为对于未处理细胞测定的平均eGFP表达的百分率。虽然组合物#2的沉默效 率低于DharmaFECT2，具有5%的残余eGFP表达(数据未示出），但FD对CS/siRNA的沉默效率 没有负面影响。新鲜组合物具有未处理的细胞的52%的残余eGFP表达；RhlX为49%;而 化 IOX 为 47%(图 11C)。
[031引表24.不同组合物的性能 [0316]
[0318] 虽然已经结合其【具体实施方式】描述了本发明，但应当理解的是，它能够进一步修 改，并且总体而言本申请旨在涵盖遵循本发明的原理的本发明的任何变化、用途或调节，并 且包括偏离本公开内容的而在本发明设及的本领域内已知或惯常的实践内并可W应用于 上文所阐述的必要特征，W及如下处于所附权利要求的范围内的那些。
[0319] 本说明书中提到的所有文献都通过引用结合于此。
[0320] 参考文献
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【主权项】
1. 一种聚电解质复合组合物，包含聚合物、核酸分子、冻干保护剂和缓冲剂，所述组合 物保持所述聚电解质复合物在冷冻干燥和再水化之后的生物学活性。2. 根据权利要求1所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和再水化之后 具有低于约750nm的Z-平均。3. 根据权利要求1或2所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和再水化之 后基本上无聚结。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后具有至多0.5的多分散性指数。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述聚电解质复合物在冷 冻干燥和再水化之后实现至少约10%转染水平。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后在约lOmin内重构。7. 根据权利要求1至5中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后在约5分钟内重构。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后是近同渗重摩的。9. 根据权利要求1至7中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后具有约1OOmOsm至约750m0sm之间的同渗重摩。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥 和再水化之后具有近中性的pH。11. 根据权利要求1至9中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥 和再水化之后具有约5至8之间的pH。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的聚电解质复合组合物，是冷冻干燥的。13. 根据权利要求1至12中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述聚合物是壳聚 糖。14. 根据权利要求13所述的聚电解质复合组合物，其中所述壳聚糖数均分子量(Mn)为4 至200kDa之间。15. 根据权利要求13或14所述的聚电解质复合组合物，其中所述壳聚糖Mn为10至80kDa 之间。16. 根据权利要求13至15中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述壳聚糖脱乙 酰度(DDA)为70%至100%之间。17. 根据权利要求13至15中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述壳聚糖DDA为 80 %至95 %之间。18. 根据权利要求13至17中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中壳聚糖/核酸N/P 比为1.2至30之间。19. 根据权利要求13至17中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中壳聚糖/核酸N/P 比为2至10之间。20. 根据权利要求13至17中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中壳聚糖/核酸N/P 比为5。21. 根据权利要求1至20中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述核酸分子是质 粒(pDNA)、微环、寡脱氧核苷酸(ODN)和核糖核酸分子中的至少一种。22. 根据权利要求21所述的聚电解质复合组合物，其中所述核糖核酸分子是小干扰核 糖核酸(siRNA)、小发夹核糖核酸(shRNA)或信使核糖核酸(mRNA)。23. 根据权利要求1至22中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是 二糖、三糖、寡糖/多糖、多元醇、聚合物、高分子量赋形剂、氨基酸分子或它们的任何组合。24. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述二糖是蔗糖、海藻糖、乳糖、 麦芽糖、纤维二糖和蜜二糖中的至少一种。25. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中二糖浓度为0.1%至10% (w/v) 之间。26. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中二糖浓度为0.5%至5% (w/v)之 间。27. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中二糖浓度为0.5%至2% (w/v)之 间。28. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述三糖是麦芽三糖和棉子糖 中的至少一种。29. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中三糖浓度为0.1%至10% (w/v) 之间。30. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中三糖浓度为0.5%至5% (w/v)之 间。31. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中三糖浓度为0.5%至2% (w/v)之 间。32. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述寡糖/多糖是葡聚糖、环糊 精、麦芽糊精、羟乙基淀粉、聚蔗糖、纤维素、羟丙基甲基纤维素和菊粉中的至少一种。33. 根据权利要求32所述的聚电解质复合组合物，其中所述葡聚糖1为1至70kDa之间。34. 根据权利要求32或33所述的聚电解质复合组合物，其中所述葡聚糖1为1至5kDa之 间。35. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中寡糖/多糖浓度为0.1%至10% (w/v)之间。36. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中寡糖/多糖浓度为0.5%至5% (w/v)之间。37. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中寡糖/多糖浓度为0.5%至2% (w/v)之间。38. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述多元醇是甘露醇和肌醇中 的至少一种。39. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述多元醇浓度为0.1%至10% (w/v)之间。40. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述多元醇浓度为0.5%至5% (w/v)之间。41. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述多元醇浓度为2%至3% (w/ v)之间。42. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子是赖氨酸、精氨 酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸中的至少一种。43. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子浓度为1至 lOOmM之间。44. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子浓度为3至14mM 之间。45. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子浓度为3至8mM 之间。46. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子浓度更优选为3 至4mM之间。47. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述高分子量赋形剂是PEG、明 胶、聚葡萄糖和PVP中的至少一种。48. 根据权利要求1至47中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂是柠檬 酸钠、组氨酸、苹果酸钠、酒石酸钠和碳酸氢钠中的至少一种。49. 根据权利要求1至48中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂浓度为 1至lOOmM之间。50. 根据权利要求1至48中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂浓度为 3至14mM之间。51. 根据权利要求1至47中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂浓度为 3至8mM之间。52. 根据权利要求1至48中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂浓度为 3至4mM之间。53. 根据权利要求1至13中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是 海藻糖并且所述缓冲剂是组氨酸。54. 根据权利要求53所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是0.5%至2% (w/v)的海藻糖并且所述缓冲剂是3至4mM的组氨酸。55. 根据权利要求1至13中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是 蔗糖并且所述缓冲剂是组氨酸。56. 根据权利要求55所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是0.5%至2% (w/v)的蔗糖并且所述缓冲剂是3至4mM的组氨酸。57. 根据权利要求1至13和53至56中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述核酸 是DNA。58. -种聚电解质复合组合物，包含壳聚糖、含量为约50yg/mL的脱氧核糖核酸、含量为 约0.5 % (w/v)至约1 % (w/v)之间的海藻糖和含量为约3mM至约4mM之间的组氨酸。59. -种聚电解质复合组合物，包含壳聚糖、含量为约lOOyg/mL的脱氧核糖核酸、含量 为约l%(w/v)至2%(w/v)之间的海藻糖和含量为约6mM至约8mM之间的组氨酸。60. -种制备聚电解质复合组合物的方法，所述聚电解质复合组合物保持其在冷冻干 燥和再水化之后的生物学活性，所述方法包括以下步骤： a) 将壳聚糖与冻干保护剂和缓冲剂混合以形成壳聚糖组合物； b) 独立地将核酸与所述冻干保护剂和所述缓冲剂混合以形成核酸组合物;和 c) 将所述壳聚糖组合物与所述核酸组合物混合以形成所述聚电解质复合组合物。61. 根据权利要求60所述的方法，其中所述壳聚糖是溶解的壳聚糖。62. 根据权利要求60或61所述的方法，其中步骤a)涉及用所述冻干保护剂和所述缓冲 剂稀释所述壳聚糖。63. 根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中步骤b)涉及用所述冻干保护剂和 所述缓冲剂稀释所述壳聚糖。64. 根据权利要求60至62中任一项所述的方法，进一步包括步骤d)，所述步骤d)在于将 在步骤c)中获得的所述组合物冷冻干燥。65. 根据权利要求60至64中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是质粒(pDNA)、寡脱 氧核苷酸(ODN)和核糖核酸分子中的至少一种。66. 根据权利要求60至65中任一项所述的方法，其中所述冻干保护剂是二糖、三糖、寡 糖/多糖、多元醇、聚合物、高分子量赋形剂、氨基酸分子或它们的任何组合。67. 根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂是梓檬酸钠、朽1檬酸、 组氨酸、苹果酸钠、酒石酸钠和碳酸氢钠中的至少一种。68. -种试剂盒，包含如在权利要求1至59中任一项所限定的聚电解质复合组合物；和 用于重构所述组合物的说明书。69. 根据权利要求68所述的试剂盒，进一步包含水。70. 根据权利要求68所述的试剂盒，其中所述水是适合注射到受试者中的水。71. 根据权利要求68至70中任一项所述的试剂盒，进一步包含用于在注射到受试者中 之前重构的说明书。72. 根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述聚电解质复合组合物按照其初始浓度5倍 的浓度重构于水中。73. 根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述聚电解质复合组合物按照其初始浓度10 倍的浓度重构于水。74. 根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述聚电解质复合组合物按照其初始浓度20 倍的浓度重构于水。75. 如在权利要求1至59中任一项中限定的聚电解质复合组合物用于将核酸递送至需 要其的受试者的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种聚电解质复合组合物，包含聚合物、核酸分子、冻干保护剂和缓冲剂。聚电解质复合组合物保持聚电解质复合物在冷冻干燥和再水化之后的生物学活性。
【IPC分类】A61K47/26, A61K31/713, A61K47/36, A61K47/22
【公开号】CN105492014
【申请号】CN201480042301
【发明人】迈克尔·D·布施曼, 马尔科·拉韦尔图, 丹尼尔·韦耶
【申请人】波利威乐赞助有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月9日
【公告号】CA2915131A1, EP3007707A1, US20160130606, WO2014197970A1
【专利说明】
[0001] 相关申请的参考
[0002] 本申请要求要求于2013年6月10日提交的美国临时专利申请号61/833,010的权益 和优先权，其内容W其全部内容通过引用结合于此。
技术领域
[0003] 本发明设及在溶液中具有提高稳定性并对长期存储中的物理或化学降解具有改 善的抗性的聚电解质复合组合物;用于获得运种聚电解质复合组合物的方法W及运些聚电 解质复合组合物用于递送核酸的用途。
【背景技术】
[0004] 近年来已经付诸了大量努力W开发用于递送治疗药物的纳米颗粒组合物，治疗药 物如但不限于蛋白质、肤、脱氧核糖核酸(DNA)、如质粒(pDNA)和寡脱氧核巧酸(0DN)、W及 核糖核酸如小干扰核糖核酸(SiRNA)和小发夹核糖核酸(ShRNA)。然而，显示运些胶态组合 物在溶液中具有有限的稳定性，并长期储存容易发生物理或化学降解[1]。
[000引通过冷冻干燥(freeze-化ying)，也称为冻干Qyo地iIization)，运些组合物的脱 水被用于提高它们的长期稳定性[2-4]。运个过程由3个主要步骤组成:冷冻、初级干燥和二 级干燥。它提供了在减少的体积中使干燥的组合物再水化W增加活性剂的浓度并达到治疗 剂量的可能性。运在自组装聚阳离子和核酸(NA)之间的聚电解质复合组合物的情况下是特 别令人感兴趣的，上述自组装需要在稀释条件下制备W产生小而尺寸均匀的纳米颗粒[1]。
[0006] -般需要向组合物中加入冻干保护剂W防止冻干时不可逆的聚结和溶液中纳米 颗粒的官能度的损失[4,5]。冻融研究允许识别待用于给定的组合物的潜在的冻干保护剂 [6,7]。二糖(如薦糖、海藻糖、乳糖等），寡糖/多糖(如纤维素、葡聚糖等），聚合物(如PEG、 PVP等)等已经用作冻干保护剂W稳定长期存储的组合物[3,4]。海藻糖也将是一个极好的 纳米颗粒冻干保护剂[4,11-13]。然而，据发现在高溫下储存时，冷冻干燥的无定形二糖会 比多糖更容易结晶，增加复合物聚结的风险[14]，但是多糖却被发现由于其蓬松是低效率 的冻干保护剂[15，16]。寡糖可能是优越的稳定剂，因为它们具有二糖和多糖对于复合物最 佳稳定都具有的有利性质[17]。已证明低分子量葡聚糖在冻干和再水化时保留阳离子多聚 物(polyplex)物理化学性质和功能方面是有效的，同时在体内和体外研究中与薦糖相比保 持了更高的细胞活力[1引。
[0007] 缓冲剂可W用于稳定抑和防止在通过冻干过程的冷冻阶段时发生的溶质的低溫 浓缩期间纳米颗粒酸解[2]。必须谨慎选择冻干期间使用的缓冲剂，因为在冷冻期间某些会 结晶或沉淀(憐酸盐、班巧酸盐或酒石酸盐），引起pH值变化最高达4个单位[2，20-23] DTg'， 指的是最大低溫浓缩的溶液的玻璃化转变溫度，是选择用于冷冻干燥的赋形剂时要考虑的 重要参数;它是能够实施初级干燥而不会影响最终产品的最高溫度的良好估计。巧樣酸钢 是非结晶性缓冲剂，因为其在不同pH值的较高1旨'[22]及其接近中性的口1(3(口1(33 = 6.4)
[24]，其适用于冻干的可注射组合物。心组氨酸也能够是适用的，因为它的S个地a值之一 为6.1，它在冷冻干燥时在pH 5.5至6.5下几乎不表现出结晶，并且它具有高的Tg'（-33°C) [12,25]。使用赋形剂，主要是冻干保护剂和一些缓冲剂，对于用聚(D，!^-乳酸-共-乙醇酸） (化GA) (U.S. 2011/262490) [26-28]、聚（1-赖氨酸）。化）[29]、聚乳酸（PLA) (U.S. 2011/ 0275704) [30]、明胶[31]、聚乙締亚胺(PEI) [7,15,17,32-37]形成的冷冻干燥的聚电解质 复合组合物的开发，已经被表征。
[0008] 基于PEI的纳米颗粒系统在冷冻干燥中是最特征化的。已经证实几种二糖在冷冻 干燥期间对于冻干保护PEI/NA纳米颗粒是有效的。现有的冻干保护剂筛选研究表明，需要 相对高浓度的薦糖(对于包含50iig DNA/mL的组合物相当于37.5% (wt/v)) W在冻融时保持 70kDa(重均分子量(Mw))支化PEI/DNA的粒径，但是会尽管导致在C(zeta)电位和转染效率 方面的急剧下降[32]。更近期的工作表明，可W在浓度低得多的薦糖、乳糖或海藻糖(对于 包含50yg DNA/mL的组合物相当于1.25%(巧1八））中冷冻干燥2540曰(1^支化阳1/0魁复合 物而无颗粒聚结或体外转染损失，可接受的C电位增加（10~20mV)，和用乳糖组合物的最高 体内转染效率[33]。甘露醇，W及薦糖或海藻糖，也可W用于防止干燥时PEI/DNA复合物的 聚结和冷冻效率的损失，但对于PEI/0DN或核酶复合物不需待冷冻干燥保护剂[34]。
[0009] 先前的研究证实，需要高薦糖/DNA重量比W在冷冻干燥时稳定纳米颗粒，导致组 合物与用于典型的质粒DM剂量的皮下（SC)或肌内（IM)注射不相容的同渗重摩 (osmolality)[32]。
[0010] 研究了使用葡聚糖（多糖）作为二糖的替代物来稳定冻干的70kDa(Mw)支化PEI/ DNA复合物的可能性。葡聚糖3kDa在保持复合物完整性方面与薦糖一样有效，同时降低了重 构溶液的同渗重摩约40% [15]。葡聚糖3W)a的/薦糖组合物能够浓缩高达10倍再水化到近 同渗重摩时的浓度，提供更适合体内注射的剂量(例如，lmg/mL)，如通过测定时不存在浊度 的变化确定的，在浓缩时不会改变粒径。然而，为了达到十倍浓度之后的那个最终浓度，在 加入冻干保护剂之前，必须W20化g/mL的初始DNA浓度制备颗粒[1引，运超过确保生产小而 尺寸均匀的纳米颗粒的典型最大浓度（IOOyg DNA/mL) [ 1 ]，提示在运些组合物中的颗粒尺 寸和多分散性可W-直较高。
[0011]此外，使用葡聚糖的主要缺点是它们已知的与PEG的不相容性，其稳定效果随着脂 质复合物（Iipoplexes)的PEG化的程度增加而降低[17]。葡聚糖化Da防止聚乙二醇化的 阳I/DNA复合物完全聚结，但是粒径仍会增加170%至240% [7]。菊粉，另一种寡糖，是用于 聚乙二醇化的脂质复合物或阳离子多聚物的有效的冻干保护剂[7]。
[001引最近，向线性PEI/DNA复合物中加入缓冲剂（IOmM k组氨酸pH 6)，W6的氨基/憐 酸醋(N/P)比制备，会引起颗粒流体动力学直径降低(从176至118nm)和多分散性指数(PDI) 减小(从0.18至0.13)，引起C电位增加(从29.6至36.3mV)，但对其体外代谢活性和基因表达 无显著影响[36]。据发现葡聚糖是用于运些复合物的一种很差的冻干保护剂，而薦糖，在至 少2000的冻干保护剂/DNA重量比（对于含50yg DNA/mL的组合物相当于10%(w/v))下，在冷 冻干燥时会对其产生稳定作用。含14 %的乳果糖（Iactosucrose)、10 %径丙基0环糊精/ 6.5%薦糖或10%聚维酬/6.3%薦糖的等渗组合物在40°C下储存6个周的时间是稳定的，其 中颗粒小于170nm。乳果糖或径丙基0环糊精/薦糖组合物的体外最有效的[36]。另一种缓冲 剂，pH 7的S乙醇胺，据发现对于保持PEI -甘露二糖(PE Im) /pDNA复合物在冷冻干燥时与 50%甘油组合是有效的。冷冻干燥的组合物能够存储在-20°C或4°C下长达30天，并仍然保 持200nm的粒径(wo 2010/125544)[37]。
[0013] 使用PEI共价结合至聚乙二醇（PEG)和胆固醇（畑ol)，PEG-PEI-畑ol(0.554mg/ mL)/pDNA(0.15mg/mL)，在乳糖或薦糖（0.3、1.5或3%(巧八））中制备的脂质阳离子多聚物 (Iipopolyplexes)可W被冷冻干燥和再水化成5、1或0.5mg/mL的最终DNA浓度，而无需向组 合物中加入缓冲剂。在-20或-80°C ,60%畑存储冷冻干燥的样品2年后或在重构和在4°C下 存储样品长达3个月之后(WO 2009/021017)，粒径或生物学活性(体外、体内、癌症患者中） 在运些组合物之间几乎没有看到变化[35]。事实上，先前已经报道，脂质阳离子多聚物在低 薦糖含量(对于包含50g DNA/血的组合物相当于0.0625%(w/v))下经过冻融之后便不太易 于降解，而无需对其物理化学性质修饰且对照物的转染效率至少50% [32]。
[0014] 鉴于本领域的当前技术状态，仍然需要一种聚电解质复合组合物，其提供聚电解 质复合物在溶液中增加的稳定性，并改善聚电解质复合物在长时间储存中对物理或化学降 解(设及，例如，冷冻干燥)的抗性，并能够在代表接近等渗的有效剂量的浓度下再水化。
【发明内容】
[0015] 本发明的各个方面设及一种聚电解质复合组合物，包含聚合物、核酸分子、冻干保 护剂和缓冲剂，所述组合物在冷冻干燥和再水化之后保持聚电解质复合物的生物学活性。
[0016] 本发明的各个方面设及一种聚电解质复合组合物，包含壳聚糖、含量为约50iig/mL 的脱氧核糖核酸、含量为约0.5 % (w/V)至约1 % (w/v)的海藻糖和含量为约3mM至约4mM之间 的组氨酸。
[0017] 本发明的各个方面设及一种聚电解质复合组合物，包含壳聚糖、含量为约IO^g/ mL的脱氧核糖核酸、含量为约l%(w/v)至2%(w/v)的海藻糖和含量为约6mM至约SmM之间的 组氨酸。
[0018] 本发明的各个方面设及一种制备聚电解质复合组合物的方法，该聚电解质复合组 合物保持其在冷冻干燥和再水化之后的生物学活性，方法包括W下步骤:将壳聚糖与冻干 保护剂和缓冲剂混合W形成壳聚糖组合物;独立地将核酸与冻干保护剂和缓冲剂混合W形 成核酸组合物;和将壳聚糖组合物与核酸组合物混合W形成聚电解质复合组合物。
[0019] 本发明的各个方面设及一种试剂盒，包含如本文中限定的聚电解质复合组合物； 和重构组合物的说明书。
[0020] 本发明的各个方面设及如本文中限定的聚电解质复合组合物用于向需要其的受 试者递送核酸的用途。
【附图说明】
[0021 ]现在将参考附图。
[0022]图IA，B和C。图IA图示说明了显示在没有冻干保护剂存在下经过冻融(F/T)之后看 到的纳米颗粒聚结(尺寸5倍增加）的曲线图，而向组合物加入至少l%w/v的甘露醇、0.5% (w/v)薦糖、0.5%(w/v)葡聚糖f5kDa或0.1%(w/v)海藻糖二水合物时，防止了聚结(直径< 15化m);图IB图示说明了显示使用最低的所指示的冻干保护剂含量的转染效率的曲线图； 图IC图示说明了显示在冻融之后纳米颗粒维持巧光素酶表达的曲线图，而在无冻干保护剂 时观察到显著降低。转染效率和蛋光素酶表达水平都表示为无赋形剂(OFT)的新鲜对照物 的百分比，而对照物具有43%的总细胞的转染效率和8.03610化1]/111111111旨蛋白的蛋光素酶 表达水平。
[002引图2A-H。图姻示说明了显示在1或10%(w/v)甘露醇（图2A-2B)、薦糖（图2C-2D)或 葡聚糖5kDa(图沈-2F)的存在下冻融的纳米颗粒比不含冻干保护剂（图2G)的新鲜制备的颗 粒组合物更呈球形的图像。在无冻干保护剂之下冻融的纳米颗粒发生严重聚结(图2H)。
[0024]图3A-D。图3A图示说明了显示冷冻干燥和再水化成包含0.5% (w/v)薦糖、葡聚糖 化化或海藻糖二水合物的等体积组合物引起纳米颗粒聚结的曲线图；再水化的颗粒具有 比新鲜制备的复合物更大的最高达24倍的Z-平均；图3B图示说明了显示其强度上的平均尺 寸比新鲜制备的颗粒更大的最高达9.5倍的曲线图；图3C图示说明了显示多分散性指数 (PDI)超过0.35的曲线图；和图3D图示说明了显示C电位为0或负值的曲线图。
[002引图4A-C。图4A-C图示说明了显示向包含0.5%冻干保护剂的组合物中加入pH 4.5 或抑6.5的巧樣酸/巧樣酸S钢缓冲剂引起新鲜样品中形成微观聚集体和冻融之后完全聚 结的曲线图。
[0026] 图5A-B。图5A图示说明了显示新鲜制备的壳聚糖/DNA复合物具有不同形态的图 像；图5B图示说明了显示加入pH 6.5的心组氨酸达到13.75mM的最终浓度，引起形成稍大 的、更接近球形的纳米颗粒的图像。
[0027] 图6A-C。图6A-B图示说明了曲线图，显示了向含0.5%冻干保护剂的组合物中加入 k组氨酸不引起发生聚结的曲线图：在新鲜和冻融的组合物中观察到粒径稍有增加；图6C 图示说明了显示PDI仍然低于0.35的曲线图。
[002引图7A-I。图7A-C的图示说明了显示在0.5或1 % (w/v)赋形剂和13.75mM组氨酸的存 在下冷冻干燥的纳米颗粒可W用低至其原始体积的10%再水化而不影响粒径，但其PDI下 降的曲线图；图7D-F图示说明了显示包含0.5% (w/v)薦糖或海藻糖二水合物和13.75mM组 氨酸的组合物可W被冷冻干燥和再水化成原始体积(化IX)或20倍(化20X)其初始浓度而无 颗粒聚结的曲线图；图7G-I图示说明了显示0.5%(w/v)薦糖或海藻糖二水合物组合物能够 用尽可能少的3.44mM k组氨酸进行冷冻干燥而无其粒径或PDI变化的曲线图。
[0029] 图8A-GH。图8A-C图示说明了显示在复合物形成之前，用赋形剂稀释壳聚糖和DNA 对新鲜制备的纳米颗粒粒径几乎没有影响，但在k组氨酸的存在下产生的颗粒具有较低的 PDI的曲线图，图8D-H图不说明了显不含0.5% (w/v)薦糖或海澡糖和3.44mM组氨酸的组合 物进行RhlX或Rh20X之后未观察到粒径变化(Z-平均或强度上的平均粒径），但在化20X时 PDI小幅降低的曲线图。用0.5% (w/v)葡聚糖，颗粒更大，但仍保持约300nm，并且PDI从在 化1X时的0.4减小降低至化20X时的0.18。
[0030] 图9A-D。图9A-B图示说明了显示转染效率和巧光素酶表达水平的按照无赋形剂的 新鲜对照物(无 Lyo-化S(O)-新鲜）的百分比表示的曲线图，对照物具有53%的总细胞的转 染效率和6.76E-扣M巧光素酶/mg蛋白质的表达水平。含0.5% (w/v)冻干保护剂的组合物 在冷冻干燥之前具有接近对照物的100%的转染效率，并且在冷冻干燥之后低于对照物的 45%，而同时在冷冻干燥后其蛋光素酶表达水平低于对照物的25%。图9C-D图示说明了显 示同时包含0.5%冻干保护剂和3.441111的心组氨酸的组合物在冷冻干燥之前具有接近对照 物的110%的转染效率，在再水化至等体积(化IX)之后超过对照物的80%，并且对于包含海 藻糖的组合物按照20X再水化之后达到高达对照物的77 %。含心组氨酸和薦糖或海藻糖二 水合物的组合物具有类似于对照物的巧光素酶表达水平(对照物的116%至66%)，而对于 包含葡聚糖5kDa的那些则表达为对照物的57 %至12 %。
[0031 ] 图10A-F。图IOA-D图示说明了显示含0.5%海藻糖二水合物和3.5mM心组氨酸的 浓缩纳米颗粒组合物通过20X倍系数再水化之后引起尺寸和PDI的少量增加，但复合物的C 电位没有变化;使用一个或两个连续的冷冻干燥/再水化循环W达到最终20X浓度系数对纳 米颗粒物理化学性质没有影响的曲线图；图IOE-F图示说明了显示在单次冷冻干燥(FD/ 化20x)之后浓缩20X的组合物具有对照物100 %的转染效率，而经过两个连续的冷冻干燥循 环邮（10X+2X)和化(5X+4X)]之后，它们具有对照物的至少85 %的转染效率的曲线图。具有 20X终浓度系数的所有组合物在它们冷冻干燥一次或两次时具有对照物64 %至69 %的巧光 素酶表达水平。
[00创图11A-C。图1IA-B中图示说明了显示在包含1 %或2% (w/v)海藻糖和7或3.5mM组 氨酸的CS/siRNA组合物的化IX或化20X之后，对于在颗粒形成之后10化g/mL的SiRNA浓度， 观察到最低粒径变化(Z-平均）的曲线图。运些组合物的PDI在化IX之后低于0.25而在化20X 之后小于0.20;图IlC图示说明了显示包含1 %海藻糖和7mM k组氨酸的组合物在抑之后保 留沉默效率，而残余eGFP表达水平为未处理细胞的52至47%之间，无论组合物是新鲜的、 化IX或是化IOX的。
【具体实施方式】
[0033] 本发明源于本发明人的W下发现:壳聚糖核酸纳米颗粒能够被冷冻干燥和浓缩， 再水化之后无粒径变化或生物学活性损失或高渗溶液的产生，条件是在待冻干的颗粒悬浮 液中存在合适的冻干保护剂类型和浓度，W及缓冲剂类型和浓度。
[0034] 因此，本发明一个实施方式提供了运样的聚电解质复合组合物，其提供了聚电解 质复合物在溶液中增加的稳定性和/或聚电解质复合物对长期储存中的物理或化学降解的 改善的抗性。
[0035] 本发明的另一个实施方式提供了运样的冷冻干燥的聚电解质复合组合物，其提供 了聚电解质复合物在溶液中的稳定性和/或聚电解质复合物对长期储存中的物理或化学降 解的改善的抗性。
[0036] 在一些运些实施方式中，聚电解质复合物是基于多糖的聚电解质复合物。在一些 情况下，聚电解质复合物是多糖和核酸之间的聚电解质复合物。
[0037] 正如本文中所用，术语"聚电解质"是指其重复单元带有电解质基团的聚合物。因 此，聚电解质包括聚阳离子和聚阴离子。运些基团在水溶液中离解，使得聚合物带电荷。聚 电解质性质因此既类似于电解质又类似于聚合物。
[0038] 如本文所用，术语"多糖"是指由通过糖巧键结合在一起的单糖单元的长链所组成 的、在水解时得到组成单糖或寡糖的分子。
[0039] 在一些情况下，多糖是壳聚糖。正如本文中所用，术语"壳聚糖"是指一种由随机分 布的-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酷单元)和N-乙酷基-D-葡糖胺（乙酷化单元)组成的线 性多糖。它通常通过用碱性氨氧化钢处理邮和其他甲壳类的壳制成。壳聚糖具有广泛的有 益性质，包括生物相容性、生物可降解性、粘膜粘合(mucoaa化esive)性能、抗微生物/抗真 菌活性和非常低毒性。
[0040] 壳聚糖的分子量W及链上的胺基团的量(脱乙酷或孤A的程度)对其生物学和生理 学特性具有重大影响。例如，乙酷基的含量和分布影响生物可降解性，因为不存在乙酷基团 或其均匀分布(无规而不是嵌段)会引起酶降解的速率非常低。
[0041] 在运些实施方式的一些实践中，壳聚糖可W包含化学修饰。包含化学修饰的壳聚 糖的实例包括，但不限于:具有W下的壳聚糖类化合物：（i)可W共价连接至壳多糖和/或壳 聚糖、或离子地或疏水地粘附于与核酸或寡核巧酸复合的壳聚糖类化合物的特异性或非特 异性的细胞祀向部分，和（ii)壳多糖和壳聚糖的各种衍生物或修饰，其用于改变它们的物 理、化学或生理学性质。运种修饰的壳聚糖的实例是具有W下各项的壳聚糖类化合物:特异 性或非特异性祀向配体、膜渗透剂、亚细胞定位组件、溶内吞体(endosomo Iy t i C)(胞溶)剂、 核定位信号、胶体稳定剂、促进血液中长循环半衰期的试剂和化学衍生物(如盐、0-乙酷化 和N-乙酷化衍生物）。用于壳聚糖的化学修饰的一些位点包括:C2(NH-C0-C出或N出）、C3(0H) 或 Cs(OfcOH)D
[0042] 在本文中限定的运些实施方式的某些实践中，壳聚糖具有的特定平均分子量 (Mn)，其为约4W)a至约200W)a之间，优选约化化至约200W)a之间，更优选约化化至约100W)a 之间，更优选约IOkDa至约SOkDa之间。壳聚糖进一步具有的具体脱乙酷度(抓A)为优选约 70%至约100%之间，更优选约80%至95%之间。
[0043] 在运些实施方式的某些实践中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)中的 一种或多种。核酸例如是质粒(pDNA)、微环或寡脱氧核巧酸(ODN)中的一种或多种。核酸还 可W是小干扰核糖核酸(S iRNA)和小发夹核糖核酸(ShRNA)或信使核糖核酸(mRNA)中的一 种或多种。
[0044] 依据聚合物的胺基团与核酸的憐酸醋基团的摩尔比(N/P比）确定进入如本文中所 限定的组合物的聚合物和核酸的比率。在一些实施方式中，如本文中所限定的组合物的N/P 比为约1.2至约30之间，优选N作比为约2至约10之间，更优选N作比为约5。
[004引已经进行用壳聚糖/核酸聚电解质复合物的研究[38-45]。运些研究设及包含核酸 (如，例如，脱氧核糖核酸或核糖核酸）和具有8至200kDa之间的数均分子量(Mn)和72%至 95 %之间的脱乙酷度（DDA)的壳聚糖进行高效率转染的组合物(WO 2009/0075383和WO 2012/159215)。然而，运些研究既没有考虑也没有解决与运些组合物长期稳定化作用相关 的多重挑战。
[0046] 现有工作还没有解决按照治疗浓度通过在减少的体积中再水化冷冻干燥的组合 物而生产等渗壳聚糖/核酸组合物的可能性。二糖(如薦糖或甘露醇)将会防止壳聚糖类多 聚物在冷冻干燥和短期储存（<2个月）时的聚结和官能度损失[8-10]。初始组合物的pH对 于冷冻干燥期间壳聚糖水解的状态是很关键的，一旦溶液pH从6降至4.1，降解速率增加30 倍[2]。为了保证组合物的足够缓冲作用，缓冲剂的摩尔浓度必须至少等于壳聚糖单体的摩 尔浓度，但在注射的最终组合物中要低于0.1 MW防止与生理缓冲剂竞争，和其他不良影响。 壳聚糖水解率会随着HCl浓度增加而增加[1引，并在溶剂的存在下会降低，促进更紧凑的壳 聚糖链构象，糖巧键位于结构的中屯、对于水解作用不太易于接近[19]。
[0047] 视黄醇被封装于水可溶性的壳聚糖（18W)a，96%DDA)中W形成的球形纳米颗粒， 其随后冻干3天，并在无任何冻干保护剂下易于再水化。尽管运些再水化颗粒具有稍小的平 均尺寸和分布广度，但冻干对它们的C电位没有影响，也没有降解封装的视黄醇[46]。用于 口服膜岛素递送的冷冻干燥的壳聚糖(80W)a，85%DDA)/聚(Y-谷氨酸）纳米颗粒被冷冻干 燥在1.5%海藻糖中，而尽管干饼发生强巧塌，却没有改变改尺寸或再水化复合物的形态 (平均粒径<245nm，PDI<0.3)或膜岛素含量的降低[47]。已经证明壳聚糖纳米颗粒在酸性 pH值下对水解敏感：PH= 1.2，颗粒降解；在PH= 2 . O时，它们28 %更大。用S甲基壳聚糖 (TMC; 200kDa，85 %孤A，季锭化程度(DQ) 15 %或30 % )或TMC-半脫氨酸结合物（TMC-切S)和 膜岛素形成的聚电解质复合物W20的薦糖/膜岛素 w/w比率冻干在薦糖中，而在再水化之后 没有改变粒径、C电位或膜岛素封装效率[4引。用于递送加替沙星的海藻酸盐(75-l OOkDa)/ 壳聚糖(65-90kDa，孤A>80%)纳米颗粒配制于5%w/v甘露醇中，冷冻干燥并室溫下储存长 达12个月。按照初始体积再水化后，仅观察到粒径少量增加(从345nm至410nm)，而并未改变 其神位或其体外加替沙星释放曲线[49]。甲氧基聚化二醇)-接枝的壳聚糖（10kDa，97% DDA)共聚合物的引入氨甲蝶岭的聚合物纳米颗粒经过制备，在无冻干保护剂下冻干长达两 天，再水化在去离子水中，并随后进行表征:粒径低于l〇〇nm，C电位值介于+20至+40mV之间， 而负载效率超过65% [50]。
[0048] 正如本文中所用，术语电位"是指胶体体系中的电动电位。它通常使用希腊字母 的Zeta(C)表示，因此是C-电位。C电位是滑动平面相对于本体流体远离界面的点的位置处 的界面双层(DL)中的电位。C电位是分散介质和附连至分散的颗粒的流体静态层之间的电 位差。
[0049] 生产壳聚糖和聚乙醇酸(PGA)、a-PGA、PGA的可溶性盐、PGA的金属盐或肝素的纳米 颗粒用于将核酸递送至祀向位点用于治疗骨质疏松症。纳米颗粒具有266nm的平均尺寸，并 且可W被冷冻干燥和再水化在低至2.5%的海藻糖中，尺寸增加13%，或冷冻干燥和再水化 在2.5%甘露醇中，平均粒径增加57%化8 7,901，711)[51]。？66化的壳聚糖（1101^)曰，87% DDAVpDNA纳米颗粒冻干在1%甘露醇中，并随后4°C或-20°C储存1个月，或冻干在40%薦糖 中，并随后储存于-20°C下，而没有改变其尺寸、C电位和转染效率[引。其他纳米颗粒，DNA: 壳聚糖（901d)a):裂解肤（电荷比1:6:1-/+/-)，冷冻干燥在10%乳糖中之后保留了其尺寸 (300-350nm)，并在口服给予之后72小时于兔子中证明了报告子基因 CMV-CAT的体内表达 (WO 97/42975)[52]O
[0050] 壳聚糖(CS:170kDa，84%孤AVsiRNA复合物(N/P比= 50)的冻干的研究表明，10% 的薦糖对于保持再水化之后的粒径是必需的。新鲜制备的复合物在加入薦糖之后粒径稍微 增加（126至169nm)，而在冷冻干燥和再水化之后为142nm[9]。在没有冻干保护剂的情况下， 再水化的复合物对于在动态光散射化LS)中的粒径测定过大。样品基因敲低效率随SiRNA浓 度升高而增大并依赖于薦糖的存在:对于较低的SiRNA浓度（<25nm)，用10%的薦糖获得最 高敲低率(60% );对于最高SiRNA浓度（50nM) ,5%薦糖足W达到最大敲低效率(70% )。在 5%或更多的薦糖中配制壳聚糖/siRNA(50nm)复合物时，检测到10%的H1299细胞活力下 降。在室溫下胆存长达2个月之后10%的薦糖组合物的沉默活性达到32%[9]。
[0051 ] 已经示出，当冷冻干燥在0.05% (w/v)壳聚糖和1 % (w/v)聚乙締醇(PVA)的溶液中 时，用于递送寡核巧酸和SiRNA的壳聚糖涂覆的PLGA复合物发生聚结[10]。在冷冻干燥在补 充有缓冲剂的更浓组合物:0.25 % (w/v)壳聚糖，10 % (w/v)PVA和0.5M pH 4.4的乙酸缓冲 剂中时也引起产生复合物聚结[53]。可W通过W大于5:1的冻干保护剂:纳米球重量比加入 甘露醇避免冷冻干燥后产生的聚结[10]。在不存在壳聚糖涂层时，仅通过使用大于1:1的冻 干保护剂纳米球重量比就可W避免冷冻干燥后的PLGA/寡核巧酸颗粒的聚结[10]。
[0052] 最后，壳聚糖/DNA复合形成物形成于化is-HCl缓冲剂中，通过在水介质中离屯、而 分离，并在无冻干保护剂冷冻干燥之前填充到模具中QP4354445) [54]。
[0053] 为了保持按照稀释方案制备的聚合物/核酸多聚物冷冻干燥后的物理化学性质和 转染效率，组合物需要包括与再水化成0.5至Img DNA/mL的等渗注射液相容的浓度的冻干 保护剂(二糖、=糖或多元醇）。注射剂的最终剂量因此非常有限，因为冷冻干燥的组合物不 能再水化成更高浓度而不会变得高度高渗。添加缓冲剂至高浓度冻干保护剂对保持冷冻干 燥之后的纳米颗粒性质影响不大。然而，可能需要它的存在是为了控制在注射之前具有较 低冻干保护剂浓度的再水化的组合物的pH值。虽然葡聚糖/薦糖组合物容许冷冻干燥的支 化的基于阳I的组合物的10倍浓度再水化至近同渗重摩，但运些组合物受限于葡聚糖和薦 糖，并且不包括任何可能对于维持冻干后的粒径和完整性所必需的缓冲剂。
[0054] 在另一实施方式中，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸分子和冷冻干燥保护 剂（f reeZe-化y ing proteC化nt)。正如本文中所用，短语"冷冻干燥保护剂"是指保护冻干 材料的分子。冷冻干燥保护剂包括，例如，低溫保护剂和冻干保护剂（lyoprotectant)。已知 的冻干保护剂包括，但不限于，多径基化合物，如糖（单糖、二糖和多糖）、多元醇及其衍生 物。海藻糖和薦糖是天然的冻干保护剂。海藻糖是由多种植物(例如卷柏和拟南芥），真菌和 在干旱期间处于滞生状态(也称为低湿休眠）的无脊椎动物中生产。在运些实施方式的一些 实践中，冻干保护剂是二糖、=糖、寡糖/多糖、多元醇、聚合物、高分子量赋形剂、氨基酸分 子或它们的任何组合中的一种或多种。二糖可W是薦糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、纤维二糖和 蜜二糖中的一种或多种。二糖可W按照约0.1%(w/v)至约10%(w/v)之间、优选约0.5%(w/ V)至约5 % (w/v)之间、而更优选约0.5 % (w/v)至约2 % (w/v)之间的浓度存在于本发明的组 合物中。S糖可W是麦芽S糖和棉子糖中的一种或多种。S糖可W按照约0.1 % (w/v)至约 10%(>八)之间、优选约0.5%(>八)至约5%(>八)之间、而更优选约0.5%(￥八)至约2%(*/ V)之间的浓度存在。寡糖/多糖可W是葡聚糖、环糊精、麦芽糊精、径乙基淀粉、聚薦糖、纤维 素、径丙基甲基纤维素和菊粉中的一种或多种。寡糖/多糖可W按照约0.1% (w/v)至约10% (w/v)之间、优选约0.5% (w/v)至约5% (w/v)之间、而更优选约0.5% (w/v)至约2% (w/v)之 间的浓度存在于本发明的组合物中。葡聚糖可W用于对生物分子施加等渗压力。在一些实 施方式中，葡聚糖具有1至701d)a之间、优选1至化Da之间的平均分子量(Mn)。多元醇可W是 甘露醇和肌醇中的一种或多种。多元醇可W按照约0.1%(w/v)至约10%(w/v)之间、优选约 0.5%(w/v)至约5%(w/v)之间、而更优选约2%(w/v)至约3%(w/v)之间的浓度存在于本发 明的组合物中。氨基酸分子可W是赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，丙氨酸和苯丙氨酸中的至少一 种。氨基酸分子可W按照约ImM至约IOOmM之间、优选约SmM至约14mM之间、而更优选约SmM至 约4mM之间的浓度存在于本发明的组合物中。高分子量赋形剂可W是聚乙二醇(PEG)、明胶、 聚葡萄糖和聚乙締化咯烧酬(PVP)中的一种或多种。
[0055] 在一些其他实施方式中，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸分子、冷冻干燥保 护剂和缓冲剂。用于本发明组合物的缓冲剂可W包含巧樣酸钢、组氨酸、苹果酸钢、酒石酸 钢和碳酸氨钢中的至少一种。缓冲剂可W按照约ImM至约IOOmM之间、优选约3mM至约14mM之 间、优选约SmM至约SmM之间、而更优选约SmM至约4mM之间的浓度存在于本文中限定的组合 物中。
[0056] 在运些实施方式的一些情况下，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸、海藻糖和 组氨酸。
[0057] 在运些实施方式的一些情况下、聚电解质复合组合物包含壳聚糖、核酸、海藻糖和 组氨酸。
[0058] 在运些实施方式的其他情况下、聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸、含量为约 0.5% (w/v)至约2% (w/v)的海藻糖和含量为约3mM至约SmM的组氨酸。
[0059] 在运些实施方式的其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖、核酸、含量为约 0.5% (w/v)至约2% (w/v)的海藻糖和含量为约3mM至约SmM的组氨酸。
[0060] 在运些实施方式的其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖、含量为约50iig/ mL的脱氧核糖核酸、含量为约0.5 % (w/V)至约1 % (w/V)的海藻糖和含量为约3mM至约4mM的 组氨酸。
[0061] 在运些实施方式的其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖，含量为约10化 g/mL的核糖核酸、含量为约l%(w/v)至约2%(w/v)的海藻糖和含量为约6mM至约SmM的组氨 酸。
[0062] 在其他情况下，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸、薦糖和组氨酸。
[0063] 在其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖、核酸、薦糖和组氨酸。
[0064] 在其他情况下，聚电解质复合组合物包含聚合物、核酸、含量为约0.5(w/v)至约 2%(*八)的薦糖和含量为约311^至约411^的组氨酸。
[0065] 在其他情况下，聚电解质复合组合物包含壳聚糖、核酸、含量为约0.5(w/v)至约 2%(*八)的薦糖和含量为约311^至约411^的组氨酸。
[0066] 根据本实施方式的某些实践中，聚电解质复合组合物是冷冻干燥的。正如将要理 解，冷冻干燥（freeze-化ying)，也已知为冻干Qyo地i Ii sat ion)、冷干Qyo地i Iizat ion) 或冻干(cryodesiccation)，是用来保存易腐物质或使材料运输更方便的脱水工艺方法。冷 冻干燥通过冷冻材料并随后降低周围的压力而使材料中的冻水直接从固相升华到气相发 挥作用。
[0067] 冷冻干燥的工艺过程可能设及包括在冷冻之前处理产品的任何方法的预处理步 骤。运个步骤可能设及诸如但不限于，加入组分而增加稳定性和/或改善加工处理、降低高 蒸汽压溶剂或增加表面积的操作。前处理的方法包括:冷冻浓缩、溶液相浓缩、制剂W保存 产品外观、制剂W稳定反应性的产物、制剂W增加表面面积W及降低高蒸气压溶剂。
[0068] 在小规模上，通常通过将材料放置于冷冻干燥烧瓶中并旋转烧瓶于浴中进行冷 冻，冷却浴称为壳式冷冻机，由机械制冷、干冰和甲醇或液氮冷却。在较大规模上，通常使用 冷冻干燥机完成冷冻。在运个步骤中，将物质冷却至低于其=相点、也就是材料的固相和液 相能够共存的最低溫度是很重要的。运确保了接着的步骤中将发生升华而不是烙化。更大 的晶体更易于冷冻干燥。
[0069] 在初级干燥阶段，压力降低，并向物质供给足够的热量而供水升华。可W使用升华 分子的升华"潜热"计算必要的热量。在运初始干燥阶段，材料中的水约95%升华。在此阶段 中，通过施加部分真空控制压力。真空加快升华作用，使其可用作精屯、设计的干燥工艺过 程。此外，冷的冷凝室和/或冷凝板提供水蒸汽再固化于其上的一个或多个表面。第二干燥 阶段旨在去除未冻的水分子，因为冰会在初级干燥阶段中去除。冷冻干燥过程的运一部分 是由材料的吸附等溫线控制的。在运个阶段中，溫度比初级干燥阶段升高更高，甚至能够超 过0°C，W打破水分子和冷冻物质之间已经形成的任何物理化学相互作用。
[0070] 合适的冷冻干燥机包括但不限于歧管冷冻干燥机、旋转冷冻干燥机和盘式冷冻干 燥机。
[0071] 在另一实施方式中，本发明还提供了制备聚电解质复合物的方法和本文中限定的 聚电解质复合组合物。在运个实施方式的一种实践中，方法包括制备聚合物组合物和核酸 组合物;将聚合物和核酸组合物混合在一起W形成聚电解质复合组合物。所得的聚电解质 复合组合物随后可W进行冷冻干燥。
[0072] 在运些实施方式的一些实践中，方法包括其中溶解聚合物的步骤和其中溶解的聚 合物与合适的冷冻干燥保护剂和合适的缓冲剂混合而使之形成聚合物组合物的步骤。方法 还包括其中核酸分子与合适的冷冻干燥保护剂和合适的缓冲剂混合而使之形成核酸组合 物的步骤。聚合物和核酸组合物随后混合在一起W形成聚电解质复合组合物。所得的聚电 解质复合组合物随后可W进行冷冻干燥。
[0073] 在另一实践中，方法包括其中壳聚糖溶解的步骤和其中溶解的壳聚糖与合适的冻 干保护剂和合适的缓冲剂混合而使之形成壳聚糖组合物的步骤。方法还包括其中核酸分子 与合适的冻干保护剂和合适的缓冲剂混合而使之形成核酸组合物的步骤。壳聚糖和核酸组 合物然后混合在一起W形成聚电解质复合组合物。获得的聚电解质复合组合物
[0074] 本发明还提供了制造制品或商业包装或试剂盒，包括一个或多个容器、容器上的 标签、如本文所限定的聚电解质复合组合物和使用说明书。除了如本文所限定的聚电解质 复合组合物外，制造制品或商业包装或试剂盒还可W包括在使用之前重构聚电解质复合组 合物的水。
[0075] 本发明还提供了制造制品或商业包装或试剂盒，包括一个或多个容器、容器上的 标签、如本文所限定的冷冻干燥的聚电解质复合组合物和使用说明书。除了如本文所限定 的冷冻干燥的聚电解质复合组合物外，制造制品或商业包装或试剂盒还可W包括在使用之 前重构聚电解质复合组合物的水。合适的
[0076] 在运些实施方式的一些实践中，水适合于向受试者注射。聚电解质复合组合物可 W按照5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍或 20倍初始浓度的浓度重构于水中。聚电解质复合组合物可W按照25倍、30倍、35倍、40倍、45 倍、50倍、55倍或60倍初始浓度的浓度通过执行一个W上的重构循环，如例如，通过执行2个 重构循环而重构于水中。
[0077]可从在稀释条件(如，例如但不限于，约IOOyg核酸/mL,特异于每种组合物）下制备 如本文所限定的聚电解质复合组合物W产生小而尺寸均匀的纳米颗粒用于核酸递送。冷冻 干燥的并再水化的组合物可W具有有小的纳米颗粒尺寸和低的多分散性指数。
[0078] 正如本文中所用的，术语"多分散性"或"多分散性指数"（PDI)是指分子质量在给 定聚合物样品中的分布的量度。计算的PDI是重均分子量除W数均分子量。它表示各个分子 质量在一批聚合物中的分布。PDI具有值等于1或大于1，但由于聚合物链接近均匀的链长 度，PDI趋于一（1)。
[0079] 在运些实施方式的某些实践中，新鲜制备的、冷冻干燥的和/或再水化的如本文所 限定的组合物具有W下属性中的一个或多个：
[0080] A)它们有正C电位而促进转染期间的细胞摄取。C电位足够高W确保复合物形成和 冷冻干燥W及复合物再水化和注射之间的短期稳定性。
[0081] B)它们表现出纳米颗粒的均匀冻干而使在冷冻干燥和再水化之后组合物中检测 到最低或没有检测到聚结。
[0082] C)它们在冷冻干燥和再水化之后保持了聚电解质复合物的生物学活性。
[0083] 正如本文中限定的聚电解质复合物提到的如本文中所用的短语"生物学活性"是 指正如本文中限定的聚电解质复合物的生物学、细胞学或药学的能力，特别是在递送质粒 DNA时它们表达蛋白质的能力(转染效率)和在递送SiRNA时通过RNAi沉默基因表达的能力， 运两种情况下都不会引起不良的毒性或免疫反应。运些生物学活性应当优选连同属性A-G 中的一种或多种一起保留。
[0084] D)为了在诊所中的易用性，正如本文中限定的冷冻干燥的组合物在方便注射入受 试者内的有限时间内完全重构。
[0085] E)为了其在诊所中使用时用有限的注射体积W达到在其治疗剂量，正如本文中限 定的再水化的聚电解质复合组合物具有最大的核酸浓度。
[0086] F)它们具有最小量的赋形剂W在在再水化至较高的最终核酸浓度时接近等渗。具 体而言，再水化的制剂是近等渗而在注射时最小化细胞损伤、患者不适感或疼痛。
[0087 ] G)正如本文中限定的再水化的聚电解质复合组合物具有接近中性pH值W在注射 时最小化细胞损伤、患者不适感或疼痛。具体而言，正如本文中限定的组合物可W是微酸性 的W防止溶液中聚阳离子或纳米颗粒沉淀。
[008引在运些实施方式的某些实践中，正如本文中限定的新鲜的、冻融的和/或冷冻干燥 的和再水化的组合物表现出W下纳米颗粒的物理化学性质中的一个或多个：
[0089] A)纳米颗粒Z-平均低于75化m、优选低于500皿、更优选低于25化m。例如可W由化S 测定纳米颗粒Z-平均。
[0090] B)纳米颗粒平均多分散性指数(PDI)为至多0.5、优选至多0.35、最优选至多0.25。 例如可W由化S评价纳米颗粒平均PDI。
[0091] C)纳米颗粒平均C电位为正而足W确保组合物的短期稳定性。例如可W由LDV评价 纳米颗粒平均C电位。
[0092] D)本发明的组合物基本上无聚结。例如可W由ESEM评价聚结的存在。
[0093] 正如本文中限定的组合物的纳米颗粒还表现出W下体外效率标准中的一种或多 种：
[0094] A)它们表现出的转染水平大于约10%、优选大于约25%、最优选大于约50%的无 赋形剂的新聚电解质颗粒的转染水平。例如可W由流式细胞仪评价转染水平。
[0095] B)它们表现出的巧光素酶表达水平大于10%、优选大于25 %、而最优选大于50% 的无赋形剂新鲜CS/DNA颗粒的表达水平。例如可W通过发光法评价巧光素酶表达水平。
[0096] C)它们表现出的沉默效率大于10%、优选大于25%、最优选大于50%的新鲜聚电 解质颗粒的沉默效率。例如可W由流式细胞仪评价沉默效率。
[0097] 本文中限定的组合物再水化后表现出W下性质标准中的一种或多种而使它们适 合于临床使用：
[0098] A)冷冻干燥的饼于约lOmin、更优选约9min、更优选约8min、更优选约7min、更优选 约6min而最优选约5分钟内完全重构。可W在重构时通过视觉检视评价重构的水平。
[0099] B)最终核酸浓度为至少0.1 mg/mL、优选至少0.2mg/mL、更优选至少0.3mg/mL、更优 选至少0.4mg/mL、而最优选至少0.5mg/mL。可W由初始DNA含量和所用的再水化系数测定最 终DNA浓度。在一些情况下，最终DNA浓度为至少0.1 mg/mL、优选至少0.2mg/mL、更优选至少 0.3mg/mL、更优选至少0.4mg/mL、而最优选至少0.5mg/mL。可W由初始DNA含量和所用的再 水化系数而测定最终RNA浓度。在一些其他情况下，最终RNA浓度为至少O.lmg/mL、优选至少 0.2mg/血、更优选至少0.3mg/mL、更优选至少0.4mg/mL、而最优选至少0.5mg/mL。可W由初 始RNA含量和所用的再水化系数测定最终RNA浓度。
[0100] C)正如本文中限定的再水化的组合物是近等渗的。在一些情况下，正如本文中限 定的再水化的组合物具有的同渗重摩，其为约100至750m0sm之间、优选约150至SOOmOsm之 间、而最优选约200至约400m0sm。可W用组合物的同渗重摩模型测定再水化的组合物的同 渗重摩。
[0101] D)正如本文中限定的再水化的组合物具有近中性抑。在具体的方面中，正如本文 中限定的再水化的组合物具有抑5至8之间、更优选5.5至7.5之间、最优选6至7之间。可W 使用抑计测定再水化的组合物的抑。
[0102] 在本发明的一些实施方式中，正如本文中限定的组合物在受试者中在病症或疾病 的治疗中使用，其中受试者是动物或人类。正如本文中所用，"治疗（treatment)"和"处置 (treating)"包括预防、抑制、W及缓解与病症或疾病有关的病症和症状。可W进行通过给 予治疗有效量的本文描述的组合物而实施治疗。在一些情况下，正如本文中限定的组合物 适合于注射入受试者如动物或人类中。注射可W是皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹膜内、 銷内、硬膜外、屯、内、关节内、海绵体内或玻璃体内。
[0103] 在一些情况下，正如本文中限定的组合物可W用于基因疗法。正如本文中所用的 术语"基因疗法"是指使用核酸如DNA作为药物，通过将治疗性核酸递送进入受试者细胞中 来治疗疾病。基因疗法的最常见形式设及使用编码功能性、治疗性基因的核酸来替换突变 基因。其他形式设及直接校正突变，或使用编码治疗性蛋白质药物(而不是天然人类基因） 的DNA提供治疗。
[0104] 本发明的描述将通过参照W下实施例更易于理解，运些实施例提供用于举例说明 本发明而非限制其范围。
[0105] 实验和数据分析
[0106] 聚电解质复合组合物的制备
[0107] 室溫壳聚糖（Mn IOkDa,92%孤A)称重于4-mL Lab File玻璃小瓶并且将Milli-Q 水和HCl IN加入每个小瓶。最终壳聚糖浓度为5mg/mL，其中HCl最终浓度为28mM。小瓶置于 旋转器上并在室溫下揽拌过夜W确保完全溶解。过滤消毒壳聚糖原液。
[0108] 在W下情况下将赋形剂加入到组合物中：1)在复合物形成之后；或2)在复合物形 成之前，当稀释壳聚糖和DNA时或3) SiRNA原液：
[0109] 1)在层流罩之下，用Milli-Q水稀释壳聚糖原液至27化g/mL，而随后按照10化g/mL 将10化L与I(K)化的质粒DNA(pEGFPLuc)混合W形成N/P比为5的复合物。通过在加入壳聚糖 之后立即将抽吸溶液约10次进行混合。样品室溫放置稳定30分钟，而随后样品体积用W下 定容至40化L:Mi 11 i-Q水;和/或无菌2 %、4%或20% (w/v)甘露醇，薦糖，葡聚糖化化或海藻 糖二水合物;和/或抑4.5或6.5的70mM巧樣酸/巧樣酸S钢缓冲剂;或pH 6.5的13.75、27.5 或55mM心组氨酸。
[0110] 2)在层流罩之下，按照相同的方法壳聚糖原溶液按需要用W下稀释到27化g/mL: Mi 11 i-Q水;和/或无菌2%、4%或20% (w/v)薦糖，葡聚糖化化或海藻糖二水合物;和/或pH 6.5的13.75或55mM k组氨酸。根据相同方法将20化g/mL DNA原液稀释至10化g/mL。然后， 将10化L的壳聚糖组合物与I(K)化的DNA组合物混合，W形成N/巧k为5的复合物。通过在加入 壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次而进行混合。样品室溫放置而稳定30分钟。
[0111] 3)在层流罩之下，壳聚糖原溶液按需要用W下稀释到271或54化g/mL:无核糖核酸 酶(RNase)水;无菌8% (w/v)葡聚糖化化和/或海藻糖二水合物；和抑6.5的14mM k组氨 酸。按照相同的方法将Img/mL SiRNA原液稀释至100或200iig/mL。然后，将100化的壳聚糖组 合物与10化L的SiRNA组合物混合，W形成N/巧k为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即 将 溶液抽吸约10次而进行混合。样品室溫放置而稳定30分钟。
[0112] 将待冻融的样品转移至1.5mL冷冻管中，并W-1 °C/min的速率冷冻至-80°C，持续 至少2小时。样品在使用前室溫解冻30分钟。
[0113] 将待冷冻干燥的样品转移至2mL的血清瓶中并用13mm下基冻干塞子冷冻干燥并且 将水渗透性膜放置于盛装所有样品的浅盘上W防止灰尘或细菌污染。在Mi Ilrock Laboratcxry Series冷冻干燥机PC/PLC上使用W下两个循环之一实施冷冻干燥：
[0114] 1)在1小时内从室溫梯度冷却至-40°C，然后保持恒溫于-40°C下持续2小时;在-40 °C，100毫托下初步干燥48小时；和在100毫托下进行二次干燥，在12小时内升溫至30°C，而 随后30°C保持恒溫6小时。
[0115] 2)步冷至5°C并保持等溫30分钟，步冷却至-5°C并保持等溫30分钟，然后在35分钟 内梯度冷却至-40°C，并保持等溫2小时;在-40°C，100毫托下初步干燥48小时;和在100毫托 下二次干燥，在12小时内溫度升高至30°C，并随后保持恒溫30°C长达6小时。
[0116] 样品塞住、压成小權子(crimp)并储存于4°C直至使用。使用前15至30分钟，根据需 要将样品用等当于其原始体积的100%、20%、10%或5%的Mi 11 i-Q水的体积再水化。
[0117] 通过动态光散射(DLS)对40化或4(K)化样品测定粒径和多分散性(PDI)。用Milli-Q 水或赋形剂稀释整个样本或样品的部分用于测定。在粒径分析期间根据赋形剂的类型及其 最终浓度在仪器上调节稀释剂粘度。对于每个样品，在25°C下完成至少两次连续尺寸分析， 由12至20次连续读数（IOs光子计数/读数)获得的每次分析经过平均W获得数据集。由装置 优化每次分析所需的连续读数的数目。由相关函数推导Z-平均直径、粒径分布强度和PDI。
[0118] 通过激光多普勒测速测定颗粒C电位或表面电荷。用Milli-Q水和NaCl溶液稀释整 个样品W具有80化L包含1 OmM化Cl的样品。根据赋形剂的类型及其最终浓度在仪器中调节 稀释剂粘度。对于每个样品，在25°C下完成连续=次C电位分析，10至20次连续读数获得的 每次分析经过平均W获得数据集。由装置优化每次分析所需的连续读数的数目。
[0119] 通过环境扫描电子显微镜巧SEM)成像评价纳米颗粒的形态。使用气体喷雾方法在 抛光的晶片上粉碎小体积的样品，并随后用金瓣射涂层。对于更大的分辨率使用ESBl的高 真空模式进行观察。真空观察参数如下:加速电压= 20kV;光斑尺寸=3;工作距离~5mm。
[0120] 使用微电极测定不同组合物的抑，要求至少10化L的样品才能获得测量结果。
[0121] 鉴于大体积样品设及测定按照其初始浓度20倍再水化的冷冻干燥的样品的渗透 压浓度，并且纳米颗粒对新鲜溶液的渗透性的影响明显可忽略，仅使用赋形剂开发模型W 估算组合物同渗重摩。薦糖、葡聚糖化化、海藻糖二水合物和k组氨酸的系列稀释液的同渗 重摩用于建立添加剂模型，其随后用包含5% (w/v)葡聚糖、5% (w/v)海藻糖二水合物和pH 6.5的35mM k组氨酸的组合物进行验证。随后用包含3.44mM组氨酸pH 6.5和0.5% (w/v)薦 糖、葡聚糖或海藻糖的组合物、冷冻干燥和再水化5倍W上浓度验证在估计具有50iig的DNA/ mL纳米颗粒的组合物中模型的精度。对于包含薦糖或海藻糖的上述组合物模型是可接受 的，渗透压分别低估6和8%，但对于含葡聚糖的组合物不足，低估同渗重摩57%。
[0122] 使用人胚肾293化EK293)细胞评估组合物的转染效率和基因表达水平。皿K293细 胞在补充有10%胎牛血清(FBS)的pH 7.4的DMEM高葡萄糖中生长，并在37°C、5%C02中培 养。转染前24小时，将60,000个细胞/孔接种于24-井孔孔板，并且转染当天达到约50%汇合 (约每孔150000个细胞）。每个样品用于转染24-井孔孔板的两个井孔:一个用于流式细胞仪 中转染效率分析，另一方用于巧光素酶表达定量。在每个孔中，连同转染培养基（补充有 10%FBS的抑6.5的DMEM高葡萄糖)一起，加入精确体积的纳米颗粒组合物，W具有总计500 化的包含2.化g DNA的转染培养基和样品。细胞然后在37°C、5 % C〇2下培养24小时，并随后 用50化L的生长培养基代替转染培养基。在分析之前在37°C、5%C02下另外培养细胞24小 时。
[0123] 在流式细胞仪中测定转染效率。每个样品收集20,000个事件，并且通过具有光电 倍增管的510/20nm带通滤波器在使用488nm氣激光激发转染细胞中增强的绿色巧光蛋白 化GFP)之后测定巧光。使用非转染细胞测定皿K293细胞系自发巧光，并相应调节巧光检测 n。正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)也用于从记录的事件中排除死细胞和碎片。最后，当使 用数据分析转染效率时，FSC用于从事件中识别并排除双峰。
[0124] 通过使用化ight-Glo?巧光素酶测定法定量样品中巧光素酶蛋白含量，并基于在 每个样品的总蛋白含量归一化来评估基因表达，如用二哇嘟甲酸(BCA)分析法测定的。从包 含转染的待分析样品的每孔中除去生长培养基;用10化L pH 7.4的PBS洗涂细胞两次;室溫 下每孔使用I(K)化格洛溶胞(Glo Lysis)缓冲剂溶解细胞5分钟;并且随后将细胞裂解物胆 存于-20°C下直至分析。在室溫下解冻裂解物。在白色96-井孔孔板中测定巧光素酶的表达： 25化的化ight-PL?巧光素酶试剂与25化的细胞裂解物混合，并随后测定发光。巧光素酶含 量按照相对光单位/min(化U/min)表达或使用由已知浓度的重组巧光素酶标准的系列稀释 液制成的标准曲线转换成yg。在透明96-井孔孔板中测定蛋白含量:200化的BCA工作试剂与 25化的细胞裂解物混合；样品在37°C、5 %C〇2中培养30分钟，并随后冷却至室溫；测定在 56化m处的吸光度。制备标准曲线，其是使用20化g/mL牛血清白蛋白（BSA)标准的系列稀释 液制备的，并沿着样品分析W将吸光度读数转换为蛋白浓度。
[0125] 使用增强的绿色巧光蛋白阳性人体非小细胞肺肿瘤(eGFP阳性H1299)细胞评估组 合物的沉默效率。
[0126] 细胞生长于pH 7.4的RPMI-1640中，其补充有10%胎牛血清(FBS)，并在37°C、5% 0)2中培养。转染前24小时，将45，000个细胞/孔接种于24-井孔孔板中，而使之转染当天达 到约75%至85%汇合。在每个井孔中，加入精确体积的纳米颗粒组合物，连同pH 6.5的DMEM 高葡萄糖(无 FBS)-起，W具有总计5(K)化包含l(K)nM的SiRNA的培养基和样品。然后将细胞 在37°C、5%C〇2中培养4小时，补充55化FBS，并随后在分析之前在37°C、5%C〇2中再培养44 小时。通过流式测细胞仪测定沉默效率。每个样品收集10,000个事件，并且通过具有光电倍 增管的510/20nm带通滤波器在使用488nm氣激光激发转染细胞中增强的绿色巧光蛋白 化GFP)之后测定巧光。计算相对于未处理的细胞的eGFP强度的平均降低值。正向散射(FSC) 和侧向散射(SSC)也用于从记录的事件中排除死细胞和碎片。最后，当使用数据分析转染效 率时，FSC用于从事件中识别并排除双峰。
[0127]实施例 [012引实施例1
[0129] 冻干保护剂防止在冻融循环之后纳米颗粒聚结并保持了转染效率
[0130] 1-壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物的制备
[0131] 壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)在室溫下溶解于肥1中过夜W获得5mg/mL的最终壳聚 糖浓度。原液稀释至27化g/mL，并随后10化L与100化的质粒DNA(pEGFPLuc)按照lOOiig/mL混 合，W形成N/巧k为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次实施混合。样 品室溫放置稳定30分钟，并随后按照表1，将样品体积用无菌的Milli-Q水和/或无菌的20% (w/v)甘露醇、20%(w/v)薦糖、20%(w/v)葡聚糖化Da或20%(w/v)海藻糖二水合物定容至 400化。
[0132] 表1.在冻融前后待分析的包含冻干保护剂的组合物
[0134] 2-样品冻融(无干燥）
[01巧]将要冻融的样品转移至1.5mL冷冻管中并按照-l°C/min冷冻至-80°C至少2小时。 样品在使用前室溫解冻30分钟。
[0136] 3-DLS 测定
[0137] 按照0.1 %至10% (w/v)的浓度范围，用甘露醇、薦糖和葡聚糖化化开始进行冻干 保护剂的筛选。随后测试海藻糖二水合物，但浓度范围仅为0.1%至3% (w/v)，因为对前S 个冻干保护剂测定的粒径高于上限保持不变，因此在筛选期间加入更多的冻干保护剂被认 为是不必要的。每个组合物分析四个样品：两个新鲜制备的和两个经过一个冻融循环的。对 于每个样品，完成两次连续化S尺寸分析，每个获取自12至20个连续读数(10秒光子计数/读 数)经过平均W获得数据集。由仪器优化每次分析所需的连续读数的数目。由数据集中获得 的相关函数推导平均尺寸强度(mean size in intensity)。不包含冻干保护剂的组合物表 明冻融时发生聚结，其中粒径增加约5倍。包含至少1 % (w/v)甘露醇、0.5% (w/v)薦糖、 0.5 % (w/v)葡聚糖化化或0.1 % (w/v)海藻糖二水合物的组合物在冻融后维持纳米颗粒粒 径强度低于15化m。在较高的冻干保护剂含量下，在运些样品（±125nm)之间没观察到粒径 变化。甘露醇是最不有效的冻干保护剂，WO. 1或0.5% (w/v)的浓度冻融之后颗粒大于 SOOnm(图 1A)。
[013 引 4-ESEM 成像
[0139] 在冻融前后观察无冻干保护剂的组合物，同时观察冻融后的包含低（l%(w/v))和 高（10% (w/v))甘露醇、薦糖或葡聚糖5的样品。使用气体喷雾方法在抛光晶片上粉碎小体 积的样品，并再瓣射涂覆金。对于更大分辨率，使用环境扫描电子显微镜化沈^o的高真空模 式进行观察。高真空观察参数如下:加速电压= 20kV，光斑尺寸=3;工作距离~5mm。无冻干 保护剂存在下新鲜制备的复合物尺寸小于200nm并具有不同的形态(球形、棒状或环形），同 时它们在冻融之后大多形成大的球形聚集体(大于500nm)a或10%冻干保护剂中冻融的样 品更接近球形并保持小于200nm(图2A-H)。在l%w/v甘露醇中制备的复合物似乎稍大于薦 糖或葡聚糖5中制备的复合物，如先前在化S中所见。
[0140] 5-体外转染
[0141] 没有在体外测试包含甘露醇的组合物，因为它们在冻融后在保持粒径方面最不有 效，正如先前所见。只有证实在冻融后粒径保持低于200nm，并且包含至多3% (w/v)冻干保 护剂的组合物进行了体外测试。它们是:0.5%至3%(w/v)薦糖;0.5%至3%(w/v)葡聚糖5; 和0.1 %至3 % (w/v)海藻糖二水合物。皿K293细胞，生长于补充有10 %胎牛血清(FBS)的pH 7.4的DMEM高葡萄糖中，并在37°C、5%C〇2中培养，被用于体外研究。转染之前将60，000个细 胞24小时接种于24孔板的每个井孔中，W达到约50%汇合用于转染(约150000个细胞/孔）。 用每个样品转染24-井孔孔板的两个井孔:一个用于流式细胞仪中转染效率分析，另一方用 于巧光素酶表达定量。在每个孔中，连同转染培养基(补充有10%FBS的抑6.5的DMM高葡 萄糖)一起，加入精确体积的纳米颗粒组合物，W具有总计50化L的包含2.扣g DNA的转染培 养基和样品。细胞然后在37°C、5%C02下培养24小时，并随后用5(K)化生长培养基代替转染 培养基。在分析之前细胞在37°C、5 % C〇2下另外培养24小时。
[0142] 6-转染效率
[0143] 使用流式细胞仪测定转染效率。样品制备：从包含待分析样品的每个孔中除去生 长培养基;细胞用10化L pH 7.4的憐酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗；它们使用100化膜蛋白酶/ 抓TA/孔在37°C进行膜蛋白酶处理5分钟；然后加入10化L生长培养基并将整个样品转移至 细胞计数管中。流式细胞仪测定:每个样品收集20000个事件，并且通过具有光电倍增管的 510/20皿带通滤波器在绿色巧光蛋白化GFP)激发之后使用488皿氣激光在转染的细胞中测 定巧光。使用非转染细胞测定皿K293细胞系自发巧光，并相应调节巧光检测口。正向散射 (FSC)和侧向散射(SSC)也用于从记录的事件中排除死细胞和碎片。最后，当使用数据分析 转染效率时，FSC用于从事件中识别并排除双峰。相对于用无冻干保护剂(OFT)的新鲜制备 的复合物获得的转染细胞的百分率(其具有总细胞43%的转染效率)表达在冻融组合物中 转染细胞的百分率。体外测试的所有包含冻干保护剂的组合物冻融后都保持了转染效率， 其中新鲜制备的复合物的转染水平至少87%。无冻干保护剂存在下冻融的纳米颗粒具有为 仅新配制的复合物的转染水平的25%的转染水平(图1B)。
[0144] 7-巧光素酶表达
[0145] 使用化i曲t-Glo?巧光素酶测定法测定巧光素酶表达（W相对光单位每分钟(化U/ min)计），并基于每个样品的总蛋白含量归一化，运用二哇嘟甲酸(BCA)分析法测定。样品制 备:从包含待分析的样品的每孔中除去生长培养基；用10化L pH 7.4的PBS洗涂两次细胞； 室溫下每孔使用10化L Glo Lysis缓冲剂溶解细胞5分钟；和随后将细胞裂解物胆存于-20 °C下直至分析。在使用前在室溫下解冻裂解物。巧光素酶的表达定量:在白色96-井孔孔板 中，25化的Bri曲t-PL?巧光素酶试剂与25化细胞裂解物混合，并随后测定发光。蛋白含量定 量:在透明96-井孔孔板中，将20化L的BCA工作试剂与25化细胞裂解物混合;样品在37°C、 5 % C〇2中培养30分钟，并随后冷却至室溫;测定在562nm处的吸光度。制备标准曲线，其是使 用20化g/mL牛血清白蛋白（BSA)标准的系列稀释液制备的，并沿着样品分析W将吸光度读 数转换为蛋白浓度。对于在不存在冻干保护剂(OFT)之下基于新鲜壳聚糖/DNA复合物获得 的值(其具有8.03E10RLU/min mg蛋白质的表达水平)归一化巧光素酶表达水平。巧光素酶 的表达在新鲜复合物和无冻干保护剂下冻融的复合物之间是相似的，除了用1%和3% (w/ V)海藻糖配制的样品之外，其分别具有比新鲜对照物低40%至60%的表达水平。无冻干保 护剂冻融的样品比新鲜对照物表达的巧光素酶少75% (图1C)。
[0146] 表2实施例1中测试的22种不同组合物的性能。
[0147]
[014引实施例2
[0149] 防止纳米颗粒冻融后聚结的低冻干保护剂含量组合物不能防止在冻干期间聚结。
[0150] 1-壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物的制备
[0151] 按照实施例1中的描述制备不含冻干保护剂（组合物#1)或包含0.5% (w/v)薦糖 (组合物#9),0.5% (w/v)葡聚糖5(组合物#15)或0.5% (w/v)海藻糖二水合物(组合物#21) 的纳米颗粒组合物。将待冷冻干燥的样品转移至2mL血清小瓶中并用13mm下基冻干塞子冷 冻干燥，并且将水可渗透膜放置于装有所有样品的浅盘上防止灰尘或细菌污染。
[0152] 2-样品冷冻干燥
[0153] 在Millrock LaboratoiT Series冷冻干燥机PC/PLC上使用W下循环实施冷冻干 燥:在1小时内从室溫梯度冷却至-40°C，然后保持恒溫于-40°C下2小时;在-40°C，100毫托 下初步干燥48小时；和在100毫托下进行二次干燥，在12小时内升溫至30°C，并且随后30°C 保持恒溫6小时。样品塞住、压成小權子并储存于4°C直至使用。使用前15至30分钟，将样品 用等当于其原始体积的Milli-Q水的体积再水化之后进行冻干。尽管所有样品都在5分钟内 再水化;但用冻干保护剂再水化是瞬间的而不用任何冻干保护剂稍微较慢。
[0154] 3-DLS 测定
[0155] 每个组合物分析四个样品：两个新鲜制备的和两个冷冻干燥后并且再水化至初始 体积的。对于每个样品，进行两次或=次连续的尺寸分析，获取自12至20个连续读数（10秒 光子计数/读数)的每次分析经过平均W获得数据集。由仪器优化每次分析所需的连续读数 的数目。由数据集中获得的相关函数推导Z-平均直径、平均尺寸强度和PDI。相比于新鲜制 备的纳米颗粒，所有冷冻干燥和再水化的组合物产生大聚结：Z-平均增高最高达24倍（图 3A)，平均尺寸强度增大最高达9.5倍(图3B)，并且PDI值超过0.7,平均增长约4倍(图3C)。
[0156] 4-C电位测定
[0157]每个组合物分析四个样品：两个新鲜制备的和两个经过冷冻干燥和再水化至初始 体积的。冷冻干燥样品在冷冻干燥之前用等于其体积的Milli-Q水的体积进行再水化，并随 后将其放置稳定15至30分钟。新鲜样品和再水化的样品用40化L 20mM化Q补充，并在必要 时将其体积用Milli-Q水定容至800化才进行C电位分析。通过激光多普勒测速化DV)测定C 电位。对于每个样品，完成连续=次C电位分析，由10至20次连续读数获得的每次分析经过 平均W获得数据集。由装置优化每次分析所需的连续读数的数目。所有新鲜制备的组合物 具有为30至32mV之间的C电位，因此冻干保护剂对纳米颗粒的表面电荷没有影响。冷冻干燥 的和再水化的组合物具有为0至-5mV的C电位(图3D)。
[015引表3. 4种不同组合物的性能
[0160] 实施例3
[0161] 巧樣酸/巧樣酸=钢缓冲剂系统与基于壳聚糖的组合物-巧樣酸=钢促进壳聚糖 胶凝
[0162] 1-壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物的制备
[0163] 壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)室溫溶解于肥1中过夜W获得5mg/mL的最终壳聚糖浓 度。原液稀释至271iig/mL，并随后100化与100化质粒DNA(祀GF化UC)按照lOOiig/mL混合，W 形成N/巧k为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次而实施混合。样品 室溫放置稳定30分钟，并随后按照表4,将样品体积用无菌的2% (w/v)薦糖、2% (w/v)葡聚 糖化化或2% (w/v)海藻糖二水合物和抑4.5或6.5的无菌70mM巧樣酸/巧樣酸S钢缓冲剂 定容至40化L。
[0164] 表4.包含冻干保护剂和巧樣酸/巧樣酸=钢缓冲剂的组合物。
[0167] 2-样品冻融
[0168] 按照实施例1中的描述冻融样品。
[0169] 3-DLS 测定
[0170] 按照实施例2中的描述对尺寸和PDI分析制备的新鲜和冻融的样品。包含巧樣酸/ 巧樣酸=钢的组合物在冻融之前形成了大颗粒，具有大于9(K)nm的平均尺寸强度（图4B)。经 过冻融之后，样品完全聚结，并且不适合化S分析，Z-平均超过3500nm(图4A)并且PDI值高于 0.66(图 4C)。
[0171 ] 4-巧樣酸/巧樣酸S钢不相容性
[0172] 根据表5,将壳聚糖、薦糖或海藻糖二水合物与pH 6.2的巧樣酸/巧樣酸=钢缓冲 剂混合，或壳聚糖仅与巧樣酸或巧樣酸=钢混合。
[0173] 表5.制备用于评价巧樣酸/巧樣酸=钢与组合物的不相容性的样品。
[0175] 在缓冲剂或=巧樣酸钢存在下，壳聚糖溶液变得浑浊，但在巧樣酸的存在下却不 浑浊(数据未示出）。在=巧樣酸钢的存在下浊度最大，在壳聚糖/巧樣酸=钢混合物发生胶 凝后在溶液中形成白云状结构(数据未示出）。可W通过由带负电荷的=价=巧樣酸钢交联 正电壳聚糖链引起凝胶化(数据未示出）。
[0176] 表6. 6种不同组合物的性能
[0179] 实施例4
[0180] k组氨酸与基于壳聚糖的组合物是相容的并获得具有低多分散指数的纳米颗粒 悬浮液
[0181] 1-制备壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物用于ESEM成像
[0182] 按照实施例3中的描述制备壳聚糖/DNA复合物。在复合物室溫下稳定30分钟之后， 根据表7,用无菌4%(w/v)薦糖、4%(w/v)葡聚糖f5kDa或4%(w/v)海藻糖二水合物，pH 6.5 的无菌55mM心组氨酸缓冲剂或MiIli-Q水将样品体积定容至40化L。
[0183] 表7.用于ESEM成像的具有冻干保护剂和k组氨酸的组合物。
[018 引 2-ESEM 成像
[0186] 如实施例1种的描述实施ESBl样品制备和成像。在无冻干保护剂或组氨酸存在下 配制的新鲜纳米颗粒具有球形、棒状或环形形态（图5A)，并且它们在加入pH 6.5的并且最 终浓度13.75mM的レ组氨酸之后更加呈球形（图5B)。按照l%(w/v)冻干保护剂，用和不用 13.75mM组氨酸配制的复合物，对观察的纳米颗粒具有类似的影响。
[0187] 3-制备壳聚糖/DNA的纳米颗粒组合物用于冻融后的化S分析
[0188] 按照实施例3中的描述制备壳聚糖/DNA复合物。在复合物室溫稳定30分钟之后，按 照表8,用无菌2% (w/v)薦糖、2% (w/v)葡聚糖化Da或2% (w/v)海藻糖二水合物，和无菌 55mM pH 6.5的心组氨酸缓冲剂或Milli-Q水样品体积定容至40化L。样品如实施例1中冻 融。
[0189] 表8冻融研究的含冻干保护剂和k组氨酸的组合物。
[0190]
[0191] 4-DLS 测定
[0192] 无组氨酸的各组合物(组合物#9至11)复制品新鲜制备分析;含组氨酸的每种组合 物(组合物#12至14)复制品新鲜制备和冻融后分析。按照实施例巧巾的描述进行尺寸和PDI 分析。加入组氨酸对新鲜的组合物几乎没有影响（图6A-C):Z-平均在薦糖和海藻糖的存在 下分别增加了 30nm和13nm，并在葡聚糖存在下减少34nm;平均尺寸强度在薦糖和海藻糖的 存在增加了分别12和29nm，并且在葡聚糖存在下降了 48nm;和PDI在所有冻干保护剂存在下 降了 0.05。在组氨酸的存在下在冻融之后在组合物中没有观察到不良反应（图6A-C):Z-平 均和平均尺寸强度低于200nm并且平均PDI值低于0.35。
[0193] 表9. 14种不同组合物的性能。
[0196] 实施例5
[0197] 当加入包含冻干保护剂的组合中时k组氨酸在冷冻干燥之后防止纳米颗粒聚结
[ 0198] 组合物可W浓缩至20倍而不会显著改变纳米颗粒的尺寸和PDI;并且
[0199] 心组氨酸能够最小化于组合物中，同时防止在冷冻干燥之后颗粒聚结。
[0200] 1-制备壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物用于冷冻干燥并再水化至更高的浓度
[0201] 如实施例3中的描述制备壳聚糖/DNA复合物。复合物在室溫稳定30分钟之后，按表 10，用无菌的2%(w/v)薦糖、2或4%(w/v)葡聚糖化化或海藻糖二水合物，和55mMpH6.5的 k组氨酸缓冲剂将样品体积定容至40化L。
[0202]表10.待冷冻干燥和W更高浓度再水化的组合物。
[0204] 对于化IX、化5X和化10X:按照实施例2的描述制备组合物#3至5(见表10)的六个样 品并冷冻干燥;对于每种组合物，两个样品用40化L Mi 11 i-Q(RhlX)再水化至其原始体积， 两个用80化MiIli-Q再水化5倍浓的浓度(化5X)，并且两个用40化MiIli-Q再水化10倍更 浓的浓度(化10X)。对于化IX和化20X:如实施例2中的描述制备组合物#1，2和4的四个样品 (见表10)并冷冻干燥;对于每种组合物，两个样品用40化L Mi 11 i-Q再水化至其原始体积 (化IX)而两个用20化Milli-Q再水化20倍更浓的浓度(化20X)。再水化的样品在分析前放 置而稳定15至30分钟。所有样品5分钟内再水化，但化20X更难W实现，因为相对饼体积的小 的再水化体积。
[020引2-再水化至更高浓度的组合物的化S测定
[0206] 按照实施例2中的描述完成尺寸和PDI分析。再水化组合物#3至5(13.75mM组氨酸， 连同1 % (w/v)葡聚糖，或0.5或1 % (w/v)海藻糖二水合物)至最高达10倍更浓的浓度(化IX 至RhlOX)对颗粒Z-平均或平均尺寸强度没有影响，颗粒Z-平均从120nm到155nm变化（图 7A)，，平均尺寸强度从131nm至165nm变化（图7B)。纳米颗粒PDI值随着浓度系数的升高从 0.18降低至0.05(图7C)。包含0.5%薦糖或海藻糖的组合物，与13.75mM组氨酸合并，按照20 倍其初始浓度再水化，产生小于250nm(Z-平均，图7D)或200nm(平均尺寸强度，图7E)的颗 粒;包含葡聚糖的组合物和化20X具有305nm的Z-平均（图7D)和324nm的平均尺寸强度（图 7E)。除了0.5%葡聚糖的化IX具有为0.37的PDI外，所有的组合物具有低于0.2的PDI;组合 物化20X中的纳米颗粒具有低于组合物畑IX中的那些的PDI值(图7F)。
[0207] 3-制备壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物用于W较低的组氨酸含量冷冻干燥
[0208] 按照实施例3中的描述制备壳聚糖/DNA复合物。在室溫下稳定复合物30分钟之后， 根据表11，用无菌2 % (w/v)薦糖、葡聚糖化Da或海藻糖二水合物，和pH 6.5的55、27.5或 13.75mM k组氨酸缓冲剂将样品体积定容至40化L。
[0209] 表11.待冷冻干燥和W更高浓度再水化的组合物。
[0212] 按照实施例2中的描述制备每种组合物复制品并冻干，然后用40化L MilIi-Q再水 化至其初始体积(化IX)。
[0213] 4-W较低组氨酸含量冻干的组合物的化S测定
[0214] 如实施例2中的描述进行尺寸和PDI的分析。组氨酸含量降低并未对包含0.5% (w/ V)薦糖或海藻糖二水合物的再水化组合物的粒径产生影响，并且颗粒的直径小于160nm(图 7G-H)。当组氨酸含量从13.75mM降低至3.44mM时运些两种组合物的PDI仍小于或等于0.25 (图71)。葡聚糖组合物RhlX的Z-平均和平均尺寸强度在组氨酸浓度从13.75mM降低至 3.44mM时分别从151nm降低至71nm和从477nm降低至157nm(图7G-H)。在组氨酸含量从 13.75mM降低至6.88mM后，运些组合物的平均PDI从0.37下降到0.25，并且在组氨酸为 3.44mM时最终PDI为0.24(图71)。
[0215] 5-同渗重摩模型和估算
[0216] 开发模型W估算组合物同渗重摩，因为大体积的新鲜样品需要测定再水化在20倍 更小的体积(20倍浓缩）中的冷冻干燥的样品的同渗重摩。假设纳米颗粒同渗重摩可W忽略 不计，仅使用赋形剂(薦糖、葡聚糖化化、海藻糖二水合物和k组氨酸）的连续稀释液建立模 型。得到的模型预测包含5%(w/v)葡聚糖、5%(w/v)海藻糖二水合物和35mM pH 6.5的心组 氨酸的组合物的同渗重摩，并且精度为1.8%。基于模型，取决于冻干保护剂、组氨酸含量和 再水化时的浓度系数，同渗重摩在4至570m0sm之间变化。对于含薦糖的组合物，同渗重摩较 高，并且对于包含葡聚糖化化的那些，同渗重摩较低。两种组合物接近等渗:〇.5%dex-Ms (13.75) -Rh20X为 279m0sm而0.5 % dex-hi S (13.75) -Rhl OX为 268m0sm。
[0217]表12. 14种不同组合物的性能
[0220] 实施例6
[0221] 可W通过在形成复合物之前将冻干保护剂和缓冲剂加入核酸和壳聚糖中将新鲜 组合物中的纳米颗粒浓度最大化；
[0222] 使运些组合物中的冻干保护剂和缓冲剂含量最小化容许滤饼重构至更高浓度而 同时维持近等渗性;和
[0223] 运些组合物可W浓缩至最高达20倍而不显著改变纳米颗粒的物理化学性质和转 染效率；
[0224] 1-制备包含13.75mM组氨酸的浓缩壳聚糖/DNA纳米颗粒组合物
[022引壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)室溫溶解于肥1中过夜W得到5mg/mL的最终壳聚糖浓 度。按表13，使用无菌冻干保护剂溶液(2或4% (w/v)薦糖、葡聚糖5kDa或海藻糖二水合物）， 无菌55mM pH 6.5的心组氨酸缓冲剂和^111-9水将壳聚糖原液稀释至27化肖/1111^。
[0226] 表13.形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[0229] 按照表14,使用无菌冻干保护剂溶液(2或4% (w/v)薦糖、葡聚糖化化或海藻糖二 水合物）、55mMpH6.5的レ组氨酸缓冲剂和/或Milli-Q水将DNA(祀GFPLuc，20化g/mL)原液 稀释至lOOug/mL。
[0230] 表14.在形成复合物之前用赋形剂稀释DM。
[0232] 制备每种组合物复制品。对于每个复制品，将I(K)化壳聚糖溶液与I(K)化的其互补 DNA溶液(例如，壳聚糖组合物#1与DNA组合物# 1)混合，使之形成N作比率为5的复合物。通过 在加入壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次而进行混合。在分析前，样品室溫放置而稳定30 分钟。
[0233] 2-包含13.75mM组氨酸的浓缩组合物的化S测定
[0234] 如实施例2中所描述的在进行尺寸和PDI的分析。在形成复合物之前而非之后向壳 聚糖或DNA中加入冻干保护剂和^组氨酸容许生产两倍浓缩的组合物，其中Z-平均低于 200nm，平均尺寸强度低于250nm，并且PDI值低于0.3(图8A-D)。不用k组氨酸制备的组合物 具有在115至176皿之间变化的颗粒Z-平均，并且平均尺寸强度处于144至214nm之间，并且 PDI值为0.21至0.26;用心组氨酸制备的组合物尺寸稍大，其中Z-平均为143至187皿之间， 平均尺寸强度为165至237皿之间，但具有更小的PDI值(0.13至0.18)(图8A-C)。虽然形成复 合物之前向壳聚糖和DNA中加入赋形剂产生了比先前在形成纳米颗粒之后才将其加入时所 见的稍微更大的颗粒，但是PDI值仍保持相似（参见"0FT，无化S"和"0FT，13.75mMHis，pH 6.5"，图8C-E)。
[0235] 3-制备用于再水化至更高浓度的包含3.44mM组氨酸的浓缩壳聚糖/DNA纳米颗粒 组合物
[0236] 按表15和16,如第1部分中制备壳聚糖/DNA复合物，但使用了13.75mM而不是55mM 的组氨酸原液来稀释壳聚糖和DM。
[0237] 表15.在3.44mM组氨酸中形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[0239] 表16.在3.44mM组氨酸中形成复合物之前用赋形剂稀释DM。
[0241 ] 如实施例2所描述的冷冻干燥的样品。化IX样品用20化L Milli-Q水再水化，化IOX 样品用20化Mi 11 i-Q水再水化，并且化20X样品用10化Mi 11 i-Q水进行再水化。所有样品都 在5分钟内再水化，但化20X较难W实现，因为相对于饼体积再水化体积较小。
[0242] 4-再水化至更高浓度的包含3.44mM组氨酸的浓缩组合物的化S测定
[0243] 按照第3节中所描述的制备每种其他组合物(#17至19)的六个复制品：2个加1X，2 个化OX和2个加20X。按照实施例2中所描述的完成尺寸和PDI分析。只用3.44mM组氨酸冻干 的纳米颗粒可W再水化至多达20倍而未见颗粒聚结;相比于化IX，颗粒Z-平均增长3至68nm 而平均尺寸强度增加了 7至46nm，运取决于冻干保护剂（图8D-E)。在再水化浓度系数从IX增 加至20X时PDI值发生降低;PDI对于薦糖组合物从0.17降低至0.06，对于葡聚糖组合物从 0.40降低至0.18，并且对于海藻糖二水合物组合物从0.5降低至0.10(图8F)。
[0244] 5-再水化至更高浓度的包含3.44mM组氨酸的浓缩组合物的C电位测定
[024引组合物#15的复制品制备RhlX并如第3节中所描述的制备每一其他组合物(#17至 19)的六个复制品（两个新鲜，两个化IX和两个化20X)。再水化的所有样品放置稳定5至30分 钟。所有样品在5分钟内再水化，但是Rh20X较难W实现，因为相对与饼体积再水化体积较 小。新鲜样品和再水化的样品补充60化L 13mM化Cl并，如果需要，在进行C电位分析之前用 MIlli-Q将它们的体积定容至80化L。按照实施例2中所描述的测定C电位。新鲜制备的组合 物具有24mV的C电位为；冻干并再水化的组合物具有为18至21mV的C电位，并且与它们的冻 干保护剂或再水化体积无关（图8G)。
[0246] 6-再水化至更高浓度的包含3.44mM组氨酸的浓缩组合物的ESEM成像
[0247] 按照第3节中所描述的制备每个其他组合物(#17至19)的6个复制品:两个化IX，两 个化OX和两个化20X。按照实施例1中描述的实施ESEM样品制备和成像。相比于先前对于包 含13.75mM组氨酸的组合物所观察到的，对于包含3.44mM组氨酸的组合物观察到的纳米颗 粒较不呈球形，运与化S中观察的PDI的变化是相一致的。冷冻干燥并且然后化IX或化20X的 组合物之间没有观察到显著差异，但是它们似乎比新鲜制备的组合物具有更多的球形颗 粒。颗粒大多直径低于200nm(数据未示出）。
[024引 7-体外转染
[0249]按照第3节中所描述的制备每个组合物(#15至22)的六个复制品：两个新鲜的，两 个化IX和两个化20X。将基于化gene的脂质复合物用作转染效率的阳性对照物。照实施例1 中所描述的实施体外转染按。
[0 巧 0] 8-pH 值
[0251]在新鲜制备的样品中W及在冷冻干燥并再水化至其初始体积(RhlX)或至二十分 之一的初始体积(化20X)的样品中测定组合物#15至22的pH值。在无心组氨酸的存在下，新 鲜制备的样品具有5.8±0.2的平均抑值，与冻干保护剂的存在或性质无关。其平均抑值在 化IX之后为7.0±0.2而化20X之后为5.1 ±0.2。新鲜制备的包含3.44mM心组氨酸的组合物 具有为6.42±0.05的平均pH，与冻干保护剂的存在或性质无关，并且冷冻干燥的样品在 后抑值为 6.50 ± 0.06 而化 20X 后为 6.48 ± 0.02。
[0巧2] 9-同渗重摩
[0253] 由于上述方法产生具有两倍复合物含量的组合物，对于组合物#17至19,冷冻干燥 和再水化5倍W上浓缩的，验证W前开发的同渗重摩模型的有效性。模型对于包含薦糖(# 17)或海藻糖(#19)的组合物是可接受的，并且同渗重摩分别低估6%和8%，但对于包含葡 聚糖的那些(#18)是不充分的，同渗重摩低估57%。对新鲜或再水化至其初始体积(化IX)， 至其初始体积十分之一(化10X)和初始体积二十分之一(化20X)的冷冻干燥的样品估算组 合物#17和19的同渗重摩。基于模型，同渗重摩对于包含薦糖的样品为19至372m0sm之间，并 且对于包含海藻糖二水合物的样品为17至339m0sm之间。运两种组合物化20X都接近等渗： 0.5%suc-his(3.44)-Rh20X 为 372m0sm 而 0.5%付6-1113(3.44)-加20乂为339111〇3111。
[0254] 10-转染效率
[0255] 按照实施例1中所描述的测定转染效率。基于对于无赋形剂的新鲜复合物获得的 值（图9A，A:无 Lyo-化S(O)-新鲜的）归一化样品转染效率，其具有总细胞的53%的转染效 率。Fugene具有新鲜对照物的116 %的转染效率(图9A和9C)。无组氨酸的新鲜组合物具有新 鲜对照物的90%至100%的转染效率（图9A);具有3.44mM组氨酸的新鲜组合物具有新鲜对 照物的108%至113% (图9C)的转染效率。不存在冻干保护剂冷冻干燥的组合物，有或无 3.44mM组氨酸之下，具有低于对照物的22%的转染效率（图9A和9C)。用0.5% (w/v)冻干保 护剂冷冻干燥的组合物，但无组氨酸，具有对照物的约40%的转染效率(图9A)。用0.5% (w/ V)冻干保护剂和3.44mM组氨酸冷冻干燥的组合物，并再水化1X(化IX)，相对于新鲜对照物 具有的转染效率如下：对于薦糖为100%，对于葡聚糖为85%，并且对于海藻糖为83% (图 9C)。用0.5% (w/v)冻干保护剂和3.44mM组氨酸冷冻干燥的组合物，并再水化20X(化20X)， 相对于新鲜对照物具有的转染效率如下:对于薦糖为48%，对于葡聚糖为53%，并且对于海 藻糖为78% (图9C)。
[0256] 11-巧光素酶表达
[0257] 按照实施例1中所描述的定量巧光素酶表达。使用由已知浓度的重组巧光素酶系 列稀释液制作的标准曲线将测定的巧光素酶相对光单位每分钟(RLU/min)转化成咖。基于 对于无赋形剂的新鲜壳聚糖/DNA复合物(Ctl)获得的值归一化样品巧光素酶表达水平，上 述复合物具有6.76E-扣M的巧光素酶/mg的蛋白的表达水平。在无冻干保护剂，有或无 3.44mM组氨酸冷冻干燥的组合物，表达不到10%对于对照物测定的测得的巧光素酶水平 (图9B和9D)。WO. 5% (w/v)冻干保护剂，但无组氨酸冷冻干燥的组合物表达对于对照物测 定的不到25%的测得的巧光素酶水平（图9B)"W〇.5%(w/v)冻干保护剂和3.44mM组氨酸冷 冻干燥并再水化IX(RhlX)的组合物具有的巧光素酶表达水平类似于薦糖和海藻糖二水合 物的阳性对照物，W及具有对于葡聚糖的阳性对照物的56 %表达水平（图9D)。W0.5 % (w/ V)冻干保护剂和3.44mM组氨酸冷冻干燥并再水化20X(化20X)的组合物具有类似于薦糖的 阳性对照物的的巧光素酶表达水平、对于葡聚糖的阳性对照物的12%的表达水平和对于海 藻糖二水合物的阳性对照物的65%的表达水平(图9D)。
[0258] 表17. 22种不同组合物的性能。
[0260] 实施例7
[0261] 使用两个连续的冷冻干燥/再水化循环组合物可W被浓缩至最高达20倍，由此促 进注射前最终再水化(更高的再水化体积比饼体积），运对于纳米颗粒的物理化学性质和转 染效率没有显著的变化
[0262] 1-制备用于多次冷冻干燥的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM组氨酸的壳 聚糖/DNA-纳米颗粒组合物
[0263] 壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)室溫溶解于肥1中过夜W获得5mg/mL的最终壳聚糖浓 度。按表18,使用无菌2%(w/v)海藻糖二水合物，无菌HmM pH 6.5的レ组氨酸缓冲剂和 Mi 11 i-Q水将壳聚糖原液稀释至27化g/mL。
[0264] 表18.形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[0266] 按照表19,使用无菌2%(w/v)海藻糖二水合物、无菌14mM pH 6.5的心组氨酸缓冲 剂和]?1111-9水将0臟(966。?山(3,400蛇/1111^原液稀释至100蛇/1111^。
[0267] 表19.形成复合物之前用赋形剂稀释DNA。
[0269] 制备21个样品。对于每个样品，625化稀释的壳聚糖溶液(表18)与62扣L稀释的DNA 溶液(表19)混合W形成N/巧k为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即将溶液抽吸约10次 而进行混合。在分析或冷冻干燥之前，样品室溫放置而稳定30分钟。
[0270] 2-样品冻干
[0271] 冷冻干燥15个样品。按照表20,对于每个样品，将1200化转移至IOmL血清小瓶中， 并用20mm下基冻干塞子冷冻干燥，如实施例2中所描述的。将6个样品用12化L再水化化10X， 并随后按照表20将10化L的各个样品转移到2血血清小瓶中，并用13臟下基冻干塞子冷冻干 燥，如实施例2中所描述的。将3个样品用24化L再水化化5X，并且随后用20化L填充两个具有 100化样品的2mL血清瓶：按照表20, 一个小瓶进行化S分析，并且另一个进行转染。样品用 13皿下基冻干塞子冷冻干燥，如实施例2中所描述的。
[0272] 表20.形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[0274] 3-再水化样品用于化S或转染
[0275] 实验表明，稀释再水化的样品对纳米颗粒性质（大小，C电位，转染效率等)没有影 响，因此，在分析前如下将样品再水化并稀释。
[0276] 在分析前30分钟将样品#1用60化Mi 11 i-Q再水化化20X，然后在分析前15分钟用 1140 化 Mi Ili-Q 稀释。
[0277] 在分析前30分钟将样品#2用50化MiUi-Q再水化加20X(10X+2X)，然后在分析前 15分钟用950化MiIli-Q稀释。
[0278] 在分析前30分钟将样品#3用25化Milli-Q再水化化20X(5X+4X)，然后在分析前15 分钟用47化1 Mi Ili-Q稀释。
[0279]所有样品在5分钟内再水化，但样品#1(化20X)难W实现，因为相对于饼体积再水 化体积较小。样品#2和3容易且快速再水化，并且同时还达到20X最终浓缩系数。
[0280] 4-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mm组氨酸的浓缩组 合物的化S测定
[0281] 按照第1节中所描述的新鲜制备=个复制品，并按照第3节中所描述的再水化每个 组合物的3个冷冻干燥的复制品。如实施例2中所描述的完成尺寸和PDI分析。配制于0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM心组氨酸中的纳米颗粒可W冻干两次W达到20X(化20X)的 最终浓缩系数而未看到颗粒聚结。相比于新鲜制备的颗粒，Z-平均提高了 56至68nm而平均 尺寸强度增加了 54至63皿，运取决于用于达到化20X的冷冻干燥和再水化循环的次数。Z-平 均（180至19化m)和平均尺寸强度(204至213nm)在样品化20X之间是相似的，与实施冷冻干 燥和再水化循环的数目无关（图10A-B) "PDI值在冷冻干燥和再水化之后稍微升高，从新鲜 制备时的0.17升高至化20X之后的0.20至0.25之间（图10C)。
[0282] 5-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM组氨酸的浓缩组 合物的C电位测定
[028引先前由化S(第4节)分析的样品补充40化L 20mM化Cl,然后按照实施例帥所描述 的测定其C电位。新鲜制备的纳米颗粒具有19mV的平均C电位;冷冻干燥和再水化的组合物 具有18至21mV的C电位，并且与用于到达化20X的冷冻干燥循环数目无关（图10D)。
[0284] 6-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mm组氨酸的浓缩组 合物的体外转染
[0285] 如在第1节中所描述的新鲜制备=个复制品，并按照第3节中所描述的再水化每个 组合物的=个冷冻干燥的复制品。按照实施例1中所描述的进行体外转染。
[0286] 7-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM组氨酸的浓缩组 合物的转染效率
[0287] 按照实施例1中所描述的测定转染效率。基于对于制备于0.5% (w/v)海藻糖二水 合物和3.5mM pH 6.5的心组氨酸中的新鲜复合物获得的值归一化样品转染效率(图IOE:新 鲜的），其具有总细胞的44%的转染效率。所有冷冻干燥的组合物具有新鲜对照物85%至 100%的转染效率（图10E):再水化20X的组合物在单个冷冻干燥循环(FD/Rh20X)之后具有 等于（100 % )新鲜样品的转染效率;再水化1OX，然后冷冻干燥并化2X[化（10X+2X)]的组合 物，具有对照物的86 %的转染效率;而再水化5X，然后冷冻干燥和化4X[化(5X+4X)]的组合 物，具有对照物的85 %的转染效率。
[0288] 8-再水化至更高浓度的包含0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM组氨酸的浓缩组 合物的巧光素酶表达
[0289] 如实施例1中所描述的定量巧光素酶表达，并W相对光单位每分钟（RLU/min)表 示。基于对于制备于0.5% (w/v)海藻糖二水合物和3.5mM pH 6.5的心组氨酸中的新鲜复合 物获得的值归一化样品巧光素酶表达水平（图IOF:新鲜），其具有5.24E+8RLU/min*mg蛋白 的表达水平。最终化20X的所有冷冻干燥的组合物具有类似的巧光素酶表达水平，具有新鲜 对照物巧光素酶表达水平的64%至69%的值(图10F):再水化20X的组合物单冷冻干燥循环 之后(FD/化20X)具有对照物的64 %的巧光素酶表达水平;再水化IOX，然后冷冻干燥和化2X [化(0X+2X)]的组合物，具有对照物的69 %的巧光素酶表达水平;并且再水化5X，然后冷冻 干燥并化4)([化(5X+4X)]的组合物，具有对照物的66 %的巧光素酶表达水平。
[0290] 表21. 5种不同组合物的性能。
[0292] 实施例8
[0293] 相比于CS/DNA纳米颗粒，可W按照更高的初始核酸浓度制备壳聚糖/siRNA纳米颗 粒，但必须相应增加赋形剂含量；
[0294] 运些组合物可W浓缩至最高达10倍而不会显著改变纳米颗粒的物理化学性质和 沉默效率。
[0295] 1-浓缩壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的制备
[0296] 壳聚糖(Mn IOkDa,92%孤A)室溫溶解于肥1中过夜W获得5mg/mL的最终壳聚糖浓 度。按照表22,使用无菌冻干保护剂溶液（8% (w/v)葡聚糖化Da或海藻糖二水合物）、无菌 14mM pH 6.5的心组氨酸缓冲剂和无核糖核酸酶的水将壳聚糖原液稀释至271或542g/mL。
[0297] 表22.形成复合物之前用赋形剂稀释壳聚糖。
[029引
[0299] 按照表23，用无菌冻干保护剂溶液（8 % (w/V)葡聚糖5kDa或海藻糖二水合物）、 14mM pH 6.5的^组氨酸缓冲剂和/或无核糖核酸酶水将抗-ApoB SiRM(正义： GUCAUCACACUGAAUACCAAU，反义:AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC，Img/mL)原液稀释至 100或20化 g/mLo
[0300] 表23.形成复合物之前用赋形剂稀释siRNA。
[0302] 对于每个复制品，100化的壳聚糖溶液与I(K)化其互补SiRNA溶液(例如，壳聚糖组 合物#1与SiRNA组合物#1)混合W形成N作比为5的复合物。通过在加入壳聚糖之后立即将溶 液抽吸约10次进行混合。在分析之前，样品室溫放置而稳定30分钟。
[0303] 2-冷冻干燥浓缩的壳聚糖/siRNA的纳米颗粒组合物
[0304] 将待冷冻干燥的样品转移至2mL血清小瓶中并用13mm下基冷冻干燥塞子冷冻干 燥。将水可渗透膜放置于装有所有样品的托盘上，W防止灰尘或细菌污染。在Millrock Laborato巧Series冷冻干燥机PC/PLC上，使用W下循环实施冷冻干燥:步冷至5°C并保持 等溫30分钟，步冷至-5°C并保持等溫30分钟，然后在35分钟内梯度冷却至-40°C，并保持等 溫2小时;在-40°C，100毫托下初步干燥48小时;和二次干燥，在100毫托下，在12小时内溫度 升高至30°C，然后保持恒溫30°C长达6小时。样品塞住，卷成小權子并储存于4°C下直至使 用。使用前15至30分钟，化IX样品用20化L无核糖核酸酶水再水化，化1OX样品用20化无核糖 核酸酶水再水化，并且化20X样品用10化无核糖核酸酶水再水化。所有样品都在5分钟内再 水化。
[030引 4-浓缩壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的化S测定
[0306]按照第1和第2节中所描述的制备每种组合物的九个复制品：3个新鲜制备(无 FD)、 3个RhlX和S个Rh20X。按照实施例2中所描述的完成尺寸和PDI分析。尽管所有组合物在 化20X之后都防止了严重聚结，但相比于新鲜组合物，仅组合物#2和4在化IX和/或加20X之 后粒径没有显著变化；它们的Z-平均则分别增长了 21和化m(图11A)。平均PDI值大多低于 0.25(除了组合物#1，化IX)，其中组合物#2和4在化20X后分别具有0.16和0.20的PDI值（图 llB)〇
[0307] 5-浓缩的壳聚糖/s iRNA纳米颗粒组合物的C电位测定
[0308] 按照第1和第2节中的描述制备每种组合物的九个复制品个新鲜制备的（无 FD)、S个化IX和S个化10X。再水化的样品放置W稳定5至30分钟，尽管所有样品都在5分钟 内再水化。用无核糖核酸酶水将新鲜样品和再水化的样品的体积定容至40化L，然后在进行 C电位分析之前加入40化L 20mM NaCl。按照实施例2中所描述的测定C电位。新鲜制备的组 合物具有为21mV的C电位;冷冻干燥并再水化的组合物具有为21至23mV的C电位，与它们再 水化体积无关。
[0309] 6-浓缩的壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的ESEM成像
[0310]按照第1和2节中所描述的制备组合物#2的九个复制品：3个新鲜制备的（无 FD)、S 个化IX和S个化IOX。按照实施例1中所描述的实施ESEM样品制备和成像。所有观察的纳米 颗粒形状都呈球形并大多直径低于10化m。新鲜的、化IX或化IOX组合物的颗粒之间没有观 察到显著差异。
[0311 ] 7-浓缩的壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的体外沉默
[0312] 按照第1和第2节中所描述的制备组合物#2的九个复制品：3个新鲜制备的(无 FD)、 S个化IX和S个化20X。化armaFECT2用作针对沉默效率的阳性对照。将生长于补充10%胎 牛血清(FBS)的抑7.2的RPMI-1640中，并在37°C、5%C02中培养的eGFP阳性化299细胞用于 体外研究。在转染之前24小时，将45,000个细胞接种于24-井孔孔板的每个孔中W达到用于 转染的约75%至85%汇合。在每个孔中，用抑6.5的DMEM高葡萄糖(无 FBS)和纳米颗粒组合 物代替培养基，对于总共50化L的包含IOOnM的SiRNA的溶液。细胞在37°C、5 % C〇2中培养4小 时，然后用55化FB巧h充，并且随后在分析之前培养另44小时。
[0313] 8-浓缩壳聚糖/siRNA纳米颗粒组合物的沉默效率
[0314] 使用流式细胞仪测定沉默效率。样品制备：从包含待分析样品的每个孔中除去生 长培养基；用50化L pH 7.4的憐酸盐缓冲剂盐水(PBS)冲洗细胞;使用每孔75化膜蛋白酶/ 抓TA在37°C下将它们进行膜蛋白酶处理5分钟；然后加入32扣L生长培养基，并且整个样品 转移至细胞计数管中。流式细胞仪测定:每个样品收集10000个事件，并且在使用488nm氣激 光在细胞中激发增强的绿色巧光蛋白化GFP)之后通过具有光电倍增管的510/20nm带通滤 波器测定平均巧光强度。正向散射(FSC)和侧向散射(SSC)也用于从记录的事件中排除死细 胞和碎片。最后，当使用数据分析转染效率时，FSC用于从事件中识别并排除双峰。将平均残 余eGFP强度表示为对于未处理细胞测定的平均eGFP表达的百分率。虽然组合物#2的沉默效 率低于DharmaFECT2，具有5%的残余eGFP表达(数据未示出），但FD对CS/siRNA的沉默效率 没有负面影响。新鲜组合物具有未处理的细胞的52%的残余eGFP表达；RhlX为49%;而 化 IOX 为 47%(图 11C)。
[031引表24.不同组合物的性能 [0316]
[0318] 虽然已经结合其【具体实施方式】描述了本发明，但应当理解的是，它能够进一步修 改，并且总体而言本申请旨在涵盖遵循本发明的原理的本发明的任何变化、用途或调节，并 且包括偏离本公开内容的而在本发明设及的本领域内已知或惯常的实践内并可W应用于 上文所阐述的必要特征，W及如下处于所附权利要求的范围内的那些。
[0319] 本说明书中提到的所有文献都通过引用结合于此。
[0320] 参考文献
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【主权项】
1. 一种聚电解质复合组合物，包含聚合物、核酸分子、冻干保护剂和缓冲剂，所述组合 物保持所述聚电解质复合物在冷冻干燥和再水化之后的生物学活性。2. 根据权利要求1所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和再水化之后 具有低于约750nm的Z-平均。3. 根据权利要求1或2所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和再水化之 后基本上无聚结。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后具有至多0.5的多分散性指数。5. 根据权利要求1至4中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述聚电解质复合物在冷 冻干燥和再水化之后实现至少约10%转染水平。6. 根据权利要求1至5中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后在约lOmin内重构。7. 根据权利要求1至5中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后在约5分钟内重构。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后是近同渗重摩的。9. 根据权利要求1至7中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥和 再水化之后具有约1OOmOsm至约750m0sm之间的同渗重摩。10. 根据权利要求1至9中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥 和再水化之后具有近中性的pH。11. 根据权利要求1至9中任一项所述的聚电解质复合组合物，所述组合物在冷冻干燥 和再水化之后具有约5至8之间的pH。12. 根据权利要求1至11中任一项所述的聚电解质复合组合物，是冷冻干燥的。13. 根据权利要求1至12中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述聚合物是壳聚 糖。14. 根据权利要求13所述的聚电解质复合组合物，其中所述壳聚糖数均分子量(Mn)为4 至200kDa之间。15. 根据权利要求13或14所述的聚电解质复合组合物，其中所述壳聚糖Mn为10至80kDa 之间。16. 根据权利要求13至15中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述壳聚糖脱乙 酰度(DDA)为70%至100%之间。17. 根据权利要求13至15中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述壳聚糖DDA为 80 %至95 %之间。18. 根据权利要求13至17中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中壳聚糖/核酸N/P 比为1.2至30之间。19. 根据权利要求13至17中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中壳聚糖/核酸N/P 比为2至10之间。20. 根据权利要求13至17中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中壳聚糖/核酸N/P 比为5。21. 根据权利要求1至20中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述核酸分子是质 粒(pDNA)、微环、寡脱氧核苷酸(ODN)和核糖核酸分子中的至少一种。22. 根据权利要求21所述的聚电解质复合组合物，其中所述核糖核酸分子是小干扰核 糖核酸(siRNA)、小发夹核糖核酸(shRNA)或信使核糖核酸(mRNA)。23. 根据权利要求1至22中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是 二糖、三糖、寡糖/多糖、多元醇、聚合物、高分子量赋形剂、氨基酸分子或它们的任何组合。24. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述二糖是蔗糖、海藻糖、乳糖、 麦芽糖、纤维二糖和蜜二糖中的至少一种。25. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中二糖浓度为0.1%至10% (w/v) 之间。26. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中二糖浓度为0.5%至5% (w/v)之 间。27. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中二糖浓度为0.5%至2% (w/v)之 间。28. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述三糖是麦芽三糖和棉子糖 中的至少一种。29. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中三糖浓度为0.1%至10% (w/v) 之间。30. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中三糖浓度为0.5%至5% (w/v)之 间。31. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中三糖浓度为0.5%至2% (w/v)之 间。32. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述寡糖/多糖是葡聚糖、环糊 精、麦芽糊精、羟乙基淀粉、聚蔗糖、纤维素、羟丙基甲基纤维素和菊粉中的至少一种。33. 根据权利要求32所述的聚电解质复合组合物，其中所述葡聚糖1为1至70kDa之间。34. 根据权利要求32或33所述的聚电解质复合组合物，其中所述葡聚糖1为1至5kDa之 间。35. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中寡糖/多糖浓度为0.1%至10% (w/v)之间。36. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中寡糖/多糖浓度为0.5%至5% (w/v)之间。37. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中寡糖/多糖浓度为0.5%至2% (w/v)之间。38. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述多元醇是甘露醇和肌醇中 的至少一种。39. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述多元醇浓度为0.1%至10% (w/v)之间。40. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述多元醇浓度为0.5%至5% (w/v)之间。41. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述多元醇浓度为2%至3% (w/ v)之间。42. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子是赖氨酸、精氨 酸、甘氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸中的至少一种。43. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子浓度为1至 lOOmM之间。44. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子浓度为3至14mM 之间。45. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子浓度为3至8mM 之间。46. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述氨基酸分子浓度更优选为3 至4mM之间。47. 根据权利要求23所述的聚电解质复合组合物，其中所述高分子量赋形剂是PEG、明 胶、聚葡萄糖和PVP中的至少一种。48. 根据权利要求1至47中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂是柠檬 酸钠、组氨酸、苹果酸钠、酒石酸钠和碳酸氢钠中的至少一种。49. 根据权利要求1至48中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂浓度为 1至lOOmM之间。50. 根据权利要求1至48中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂浓度为 3至14mM之间。51. 根据权利要求1至47中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂浓度为 3至8mM之间。52. 根据权利要求1至48中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述缓冲剂浓度为 3至4mM之间。53. 根据权利要求1至13中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是 海藻糖并且所述缓冲剂是组氨酸。54. 根据权利要求53所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是0.5%至2% (w/v)的海藻糖并且所述缓冲剂是3至4mM的组氨酸。55. 根据权利要求1至13中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是 蔗糖并且所述缓冲剂是组氨酸。56. 根据权利要求55所述的聚电解质复合组合物，其中所述冻干保护剂是0.5%至2% (w/v)的蔗糖并且所述缓冲剂是3至4mM的组氨酸。57. 根据权利要求1至13和53至56中任一项所述的聚电解质复合组合物，其中所述核酸 是DNA。58. -种聚电解质复合组合物，包含壳聚糖、含量为约50yg/mL的脱氧核糖核酸、含量为 约0.5 % (w/v)至约1 % (w/v)之间的海藻糖和含量为约3mM至约4mM之间的组氨酸。59. -种聚电解质复合组合物，包含壳聚糖、含量为约lOOyg/mL的脱氧核糖核酸、含量 为约l%(w/v)至2%(w/v)之间的海藻糖和含量为约6mM至约8mM之间的组氨酸。60. -种制备聚电解质复合组合物的方法，所述聚电解质复合组合物保持其在冷冻干 燥和再水化之后的生物学活性，所述方法包括以下步骤： a) 将壳聚糖与冻干保护剂和缓冲剂混合以形成壳聚糖组合物； b) 独立地将核酸与所述冻干保护剂和所述缓冲剂混合以形成核酸组合物;和 c) 将所述壳聚糖组合物与所述核酸组合物混合以形成所述聚电解质复合组合物。61. 根据权利要求60所述的方法，其中所述壳聚糖是溶解的壳聚糖。62. 根据权利要求60或61所述的方法，其中步骤a)涉及用所述冻干保护剂和所述缓冲 剂稀释所述壳聚糖。63. 根据权利要求60至62中任一项所述的方法，其中步骤b)涉及用所述冻干保护剂和 所述缓冲剂稀释所述壳聚糖。64. 根据权利要求60至62中任一项所述的方法，进一步包括步骤d)，所述步骤d)在于将 在步骤c)中获得的所述组合物冷冻干燥。65. 根据权利要求60至64中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是质粒(pDNA)、寡脱 氧核苷酸(ODN)和核糖核酸分子中的至少一种。66. 根据权利要求60至65中任一项所述的方法，其中所述冻干保护剂是二糖、三糖、寡 糖/多糖、多元醇、聚合物、高分子量赋形剂、氨基酸分子或它们的任何组合。67. 根据权利要求60至66中任一项所述的方法，其中所述缓冲剂是梓檬酸钠、朽1檬酸、 组氨酸、苹果酸钠、酒石酸钠和碳酸氢钠中的至少一种。68. -种试剂盒，包含如在权利要求1至59中任一项所限定的聚电解质复合组合物；和 用于重构所述组合物的说明书。69. 根据权利要求68所述的试剂盒，进一步包含水。70. 根据权利要求68所述的试剂盒，其中所述水是适合注射到受试者中的水。71. 根据权利要求68至70中任一项所述的试剂盒，进一步包含用于在注射到受试者中 之前重构的说明书。72. 根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述聚电解质复合组合物按照其初始浓度5倍 的浓度重构于水中。73. 根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述聚电解质复合组合物按照其初始浓度10 倍的浓度重构于水。74. 根据权利要求69所述的试剂盒，其中所述聚电解质复合组合物按照其初始浓度20 倍的浓度重构于水。75. 如在权利要求1至59中任一项中限定的聚电解质复合组合物用于将核酸递送至需 要其的受试者的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种聚电解质复合组合物，包含聚合物、核酸分子、冻干保护剂和缓冲剂。聚电解质复合组合物保持聚电解质复合物在冷冻干燥和再水化之后的生物学活性。
【IPC分类】A61K47/26, A61K31/713, A61K47/36, A61K47/22
【公开号】CN105492014
【申请号】CN201480042301
【发明人】迈克尔·D·布施曼, 马尔科·拉韦尔图, 丹尼尔·韦耶
【申请人】波利威乐赞助有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月9日
【公告号】CA2915131A1, EP3007707A1, US20160130606, WO2014197970A1
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