靶向经修饰的tnf家族成员的制作方法
靶向经修饰的tnf家族成员的制作方法
【专利说明】祀向经修饰的TNF家族成员
[0001] 本发明设及TNF超家族的一种对它的受体具有降低的活性的经修饰的细胞因子， 其中所述经修饰的细胞因子被特异性递送至祀细胞。优选地，所述经修饰的细胞因子是TNF 超家族的成员的单链变体，甚至更优选地，一个或多个链携带一种或多种突变，从而导致对 受体具有低亲和力，其中所述突变细胞因子被特异性递送至祀细胞。祀向通过使TNF超家族 的经修饰的细胞因子融合于祀向部分，优选是抗体或抗体样分子来实现。本发明进一步设 及TNF超家族的所述祀向经修饰的细胞因子治疗疾病的用途。
[0002] TNF超家族由通过调控细胞死亡、增殖和分化而在免疫系统中具有至关重要功能 的促炎性细胞因子组成。此外，所述家族的成员被描述为对骨代谢、神经系统、新血管系统 和癌发生施加作用。它含有W自我装配性非共价结合的同=聚体形式具有生物活性的19种 配体，即n型(细胞内N末端和细胞外C末端)跨膜蛋白。尽管大多数TNF超家族配体W膜结合 的蛋白质形式合成，但可通过蛋白水解裂解来产生可溶性形式。它们全都通过它们的C末端 TNF同源性结构域来结合一种或多种来自TNF受体超家族的分子，所述结构域在家族成员之 间展现约20-30%序列同源性。迄今为止，已在人中鉴定了 29种TNF超家族受体。运些主要是 在配体结合细胞外结构域中具有富含半脫胺酸的基序的I型(细胞外N末端、细胞内C末端） 跨膜糖蛋白。然而，存在一些例外，如通过共价连接的C末端糖脂连接于膜的TRAIL-R3。可溶 性受体可通过蛋白水解裂解(例如TNF-Rl和TNF-R2)或通过选择性剪接编码跨膜结构域的 外显子来产生。运个超家族的受体可基于它们的信号传导性质而被划分在3个组中：诱导调 亡的具有细胞质死亡结构域的受体;诱导如^-邮、1服、938、6服和？131(的若干信号传导路 径的具有TRAF相互作用基序的受体;和缺乏细胞内信号传导结构域的诱巧受体。TNF通过与 TNF-Rl (p55)相互作用来诱导调亡，而与TNF-R2(p75，主要在免疫细胞上表达)结合会促进 增殖。TRAIL信号传导更复杂，因为它可结合两种死亡受体（TRA化-RUDR4)和TRA^-R2 (0尺5))、两种诱巧受体（了1^化-1?3(0〔1?1)和了1?4化-1?4(0〔1?2))^及可溶性骨保护素 (OSteoprotegerin) (OPG)。与后S种受体中的一种结合抑制TRAIL介导的调亡，因为运栓系 TRAIL而远离死亡受体（Gaul"和Aggerwal, 2003; Hehlgan巧日Pfeffer, 2005; Huang和化eiWi, 2007)O
[0003] 死亡诱导性TNF超家族成员TNF、CD9化(FasL)和TRAIL是针对表达它们的相应受体 TNF-Rl、〔095^1?4比-1?巧町1?4比-1?2的癌症的潜在治疗剂。实际上^^最初在超过25年前被 发现为一种通过在体内导致某些肿瘤的出血性坏死而具有卓越抗肿瘤活性的因子。稍后， 变得明确的是归因于TNF的对肿瘤新血管系统的选择性损害也确定它的抗肿瘤潜力 化e jeune等，2006; van化rssen等，2006)。不幸的是，在癌症治疗中全身性使用TNF仍然受 阻于它的休克诱发性质。它当前在临床上仅与化学疗法组合用于隔离肢体灌注的环境中来 治疗软组织肉瘤和处于转变中的黑素瘤(Robeds等，2011)。此外，CD%L在全身性施用时是 有毒的，因为它导致归因于大量肝细胞调亡的致死性肝细胞毒性(Galle等，1995)。然而，已 显示TRAIL会诱导癌细胞的调亡，针对非转化细胞具有少许或不具有细胞毒性，并且在各种 晚期癌症中进行的临床试验报道在许多情况下疾病稳定。然而，为获得足够总体治疗活性， 需要组合治疗，此暗示归因于正常细胞对TRAIL诱导的调亡敏感的可能的副作用 (Ashkenaz巧日Herbst ,2008;hlschlehner等，2009)。已进行不同方法来使全身性施用死亡 诱导性TNF超家族成员后的毒性减至最小，如具有较低毒性和较高效率的突变TNF化i等， 2012)，通过肿瘤特异性部分来递送通常呈单链构建体形式的TNF或TRAIUde Bruyn等， 2013 ;Gregorc等，2009;Liu等，2006; Siegemund等，2012;Wang等，2006)，嵌合可溶性CD95L (Daburon等，2013)或激动性TRAIkRl、TRAIkR2或CD95特异性抗体（Johnstone等，2008; Ogasawara等，1993;化X等，2010)。它们中的一些可增加治疗指数，但从未达到它显著改进 临床结果的程度。
[0004]惊人地，我们发现有可能制备包含TNF超家族的细胞因子的构建体，其中所述细胞 因子被修饰W降低对受体的亲和力，其中所述细胞因子被连接于祀向部分，并且其中所述 构建体具有强烈降低的全身性毒性，并且仅对由祀向部分祀向的细胞显示显著生物活性。 [000引本发明的第一方面是一种构建体，其包含（i)TNF超家族的细胞因子链的S个拷 贝，其中所得细胞因子被修饰(被称为"经修饰的细胞因子"）W使对它的受体的亲和力降 低，（ii)连接子序列和(iii)祀向部分，其中所述连接子序列使细胞因子拷贝连接于所述祀 向部分。如此处所用的构建体可为本领域技术人员已知的任何蛋白质构建体，包括但不限 于经化学修饰的蛋白质、蛋白质复合物和融合蛋白。在一个优选实施方案中，使用个别自我 =聚化细胞因子链，其中一个或多个链可被连接于祀向部分。在另一优选实施方案中，=个 拷贝呈现为单链细胞因子;在一优选实施方案中，拷贝由连接子序列分隔W有助于W=聚 形式呈现细胞因子。对于本领域技术人员明确的是具有一个游离细胞因子链和两个彼此连 接的细胞因子拷贝的混合形式也是可能的。所得=聚细胞因子携带相较于野生型细胞因子 使它的生物活性降低的修饰。所述修饰可为降低正常野生型细胞因子的活性的修饰，或它 可为增加同源性、非内源性TNF家族细胞因子(如但不限于另一物种的不结合人TNF家族细 胞因子受体的TNF家族细胞因子)的活性的修饰。修饰可为本领域技术人员已知的降低或增 加活性的任何修饰，包括但不限于化学和/或酶修饰，如聚乙二醇化和糖基化、融合于其它 蛋白质W及突变。在细胞因子的两个或更多个拷贝被呈现为单链的情况下，可使连接子的 长度适合于扰乱正常=聚结构，从而导致对受体的活性较低。或者，可将特殊氨基酸并入连 接子中W修饰结构;所述氨基酸可进一步被修饰。作为一非限制性实例，可将赖氨酸并入连 接子中W允许达成聚乙二醇化。优选地，所述修饰是突变，甚至更优选地，它是降低细胞因 子对它的受体的亲和力的突变。如此处所用的降低的亲和力和随之发生的降低的生物活性 意指相较于正常结合受体的野生型细胞因子，经修饰的细胞因子具有的生物活性小于野生 型细胞因子的生物活性的70%，甚至更优选小于野生型细胞因子的生物活性的60%，更优 选小于野生型细胞因子的生物活性的50%，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的 40%，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的30%，更优选小于野生型细胞因子的生物 活性的20%，最优选小于野生型细胞因子的生物活性的10%。优选地，TNF超家族的经修饰 的细胞因子是TNF超家族的野生型细胞因子的突变体，并且将活性与TNF超家族的野生型细 胞因子进行比较。可通过为本领域技术人员所知的任何方法测量亲和力和/或活性。可通过 Scatchard作图分析和计算机拟合结合数据（例如Scatchard, 1949)，或通过如由Rrecht等 (1993)所述在流通条件下进行反射干设光谱法来测量相较于野生型TNF对受体的亲和力的 突变TNF对受体的亲和力。
[0006]优选地，所述细胞因子选自由FasUTRAIU TNF、CD30L、CD40L、0X40L、RANKL、 T 肥AKL、LTa、L邱、LIGHT、CD2 化、41B化、G 口化、APRIL、EDA、VEG 巧邮AFF组成的组。优选地，所 述细胞因子呈现为单链，其中各链由连接子序列连接。
[0007] 使经修饰的细胞因子连接于祀向部分。如此处所用的"连接"可通过共价结合达 成，或它可通过亲和力结合达成。在一非限制性实例中，所述祀向部分可为对于一种特异性 来说针对祀细胞上的结合位点，W及对于另一特异性来说针对经修饰的细胞因子或融合于 所述细胞因子的标签的双特异性抗体。在另一非限制性实例中，祀向部分可被W化学方式 连接于经修饰的细胞因子，或它可为重组融合蛋白。优选地，所述祀向构建体是重组融合蛋 白。优选地，所述祀向部分使细胞因子祀向肿瘤环境，特别是祀向肿瘤血管系统(例如祀向 肿瘤的内皮细胞，通常是新内皮细胞）。甚至更优选地，祀向部分是可通过结合位点与结合 分子之间的特异性相互作用将融合蛋白向表达TNF超家族的细胞因子的受体，优选是能够 与经修饰的细胞因子相互作用的受体的细胞上的结合位点引导的结合分子。在一个优选实 施方案中，所述结合分子是特异性结合位于细胞的外部上的分子的小化合物。在另一优选 实施方案中，所述结合分子是针对在细胞壁上表达的凝集素（lectin)样分子的糖结构。在 另一优选实施方案中，所述结合分子是祀向肿瘤环境，优选祀向肿瘤血管系统的肤。所述肤 为本领域技术人员所知，并且包括但不限于NGR(祀向在肿瘤血管中表达的CD13亚型）和RGD 肤(化ng等，2011;W02005054293)。优选地，所述肤是祀向Qv抗整联蛋白（integrin)的RGD-4C 肤(Arap等，1998)。在另一优选实施方案中，所述结合分子是包含结合结构域的蛋白质。结 合结构域为本领域技术人员所知。所述结合结构域的非限制性实例是碳水化合物结合结构 域(C抓）（Blake等，2006)、重链抗体化cAb)、单结构域抗体(sdAb)、微抗体(Tramontane)等， 1994)、骆驼科重链抗体的可变结构域（VHH)、新抗原受体的可变结构域(VNAR)、亲和体 (Nygren等，2008)、a体(alphabody) (W02010066740)、设计的错蛋白（ankyrin)重复结构域 (DARPin) (Stumpp等，2008)、抗运载蛋白（antical in) (Skerra等，2008)、打结素化nott in) 化0Imar等，2008)和工程改造的CH2结构域(纳米抗体;Dimitrov，2009)。优选地，所述祀向 部分是纳米抗体。
[0008] 在一优选实施方案中，在重组融合蛋白中，使祀向部分连接于经修饰的细胞因子。 可使祀向部分直接融合于突变细胞因子，或它可借助于连接子片段进行融合。优选地，所述 连接子是GGS连接子。甚至更优选地，所述连接子由至少5个GGS重复，更优选至少10个GGS重 复，更优选至少15个GGS重复组成，更优选地，所述连接子是由17-23个GGS重复组成的连接 子，最优选地，所述连接子由20个GGS重复组成。祀向部分可被融合在突变细胞因子的氨基 末端或簇基末端;优选地，所述祀向部分被融合在突变细胞因子分子的氨基末端。除突变细 胞因子和祀向部分之外，构建体可进一步包含其它结构域，如但不限于标签序列、信号序 列、另一细胞因子或抗体。
[0009] 优选地，祀向部分针对选自由W下组成的组的祀标:CD20、CD33、CD47、CD70、PSCA、 PSMA、Her2、c-Met、EGFR、Axl、腫生蛋白C、av03整联蛋白、纤连蛋白（f ibronectirOEDA末端 EDB结构域、III型纤连蛋白（FNIII)重复(Al-D)、腫生蛋白-C和CD13及其肿瘤细胞特异性剪 接变体。当祀向部分祀向肿瘤血管系统时，具体来说，设想的祀标包括但不限于CD13、av抗整 联蛋白、纤连蛋白邸A末端邸B结构域、III型纤连蛋白（FNIII)重复(Al-D)和腫生蛋白-C。根 据替代性特定实施方案，所述祀向部分针对CD20。特别设想的是祀向部分是抗体(或纳米抗 体），因为针对运些祀标的抗体可易于获得和/或可易于产生。
[0010] 细胞因子链中的突变可为本领域技术人员已知的任何突变，如缺失、插入或点突 变。至少一个链具有至少一种突变;然而，若干种突变可被组合在一个链中。=个链可携带 相同突变或不同突变。优选地，所述突变使细胞因子对它的受体或它的一种受体的亲和力 降低。优选地，所述突变是点突变。
[0011] 在一个优选实施方案中，细胞因子是TNF，并且使构建体祀向在TNFRl和/或TNFR2 表达细胞上表达的标志物。在另一优选实施方案中，所述标志物是组织特异性标志物，甚至 更优选地，所述标志物是新血管系统组织或癌组织特异性标志物。最优选地，所述标志物选 自由〔020、化^、(3-]\161、66尸1?、腫生蛋白(：、曰麻整联蛋白和〔013组成的组。
[0012] 优选地，经修饰的细胞因子是突变TNF，其中突变选自由在位置R32、N34、Q67、H73、 1^75^77、586、￥87、￥91、197、1'105、口106、4109、口113、￥115、6127、化37、0143、4145上的突变 组成的组。甚至更优选地，所述突变选自由TNF R32G、N34G、Q67G、H73G、L75G、L75A、L75S、 T77A、S86G、Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F、V91G、V91A、I97A、I97Q、I97S、T105G、P106G、A109Y、 P113G、Y115G、Y115A、E127G、N137G、D143N、A145G和A145T组成的组。甚至更优选地，所述突 变选自由Y87X、I97X和Y115X组成的组。 最优选地，所述突变选自由TNF Y87Q、Y87F、I97A、 I97S、Y115A 和 Y115G(根据人 TNF 序列（genbank 登记号 BAG70306,版本 BAG70306.1GI: 197692685)进行编号)组成的组。突变可存在于S聚TNF的一个、两个或全部S个拷贝中。S 聚构建体内的不同拷贝可携带不同突变;若干突变可被组合在一个或多个链中。除所述的 突变之外，其它突变也可存在于一个或多个链中。
[0013] TRAIL 中优选用于突变的区域是 T127-R132、E144-R149、E155-H161、Y189-Y209、 1214-1220、1(224-4226、胖231、6236-1^239、6249-1(251^261-肥64和肥70-6271(基于人序列 (genbank登记号NP_003801，版本NP_003801.1，GI :4507593)进行编号）。
[0014] 本发明的另一方面是一种用作药剂的根据本发明的融合蛋白。在一个优选实施方 案中，根据本发明的融合蛋白用于治疗癌症。
[0015] 运与陈述提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用如本 文所述的融合蛋白等效。癌症由此得W治疗。运可例如如实施例中所示通过评估肿瘤大小 加 W评估(也参见图16)。
[0016] 适于治疗的受试者通常是哺乳动物，最通常是人。然而，本文也设想治疗非人动 物。可被治疗的非人动物的实例包括但不限于马、牛、绵羊、猪、山羊、猫、狗和其它驯养动 物。如果非人动物被设想用于治疗，那么特别设想的是经修饰的细胞因子来自待治疗的物 种。那么通过突变达成的修饰是对相较于人序列的同源位置中的残基的修饰。非限制性地 举例来说，如实施例章节中所示，在小鼠 TNF中，作为人TNF中的Y87的同源物的残基在位置 86处(Y86)。运可如上所详述加 W突变(例如Y86F或Y86Q)。
[0017] 可使用运个策略治疗不同形式的癌症。基本上，可用祀向部分祀向（直接或通过肿 瘤环境间接），由此再活化经修饰的TNF家族细胞因子，W及因此诱导肿瘤细胞死亡的任何 肿瘤都适于治疗。
[0018] 因此，特别设想的癌症是可易于祀向的那些。根据特定实施方案，祀向针对肿瘤血 管系统。因此，高度血管化肿瘤是特别设想的。所述肿瘤的实例是可用抗血管生成方法，如 抗VEGF药物或抗促血管生成素/Tie2药剂治疗的那些。运些包括但不限于乳腺癌、肾细胞 癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌、膜腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、胃癌、前 列腺癌、黑素瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、神经内分泌肿瘤、软组织肉瘤、骨髓甲状腺癌和子宫 内膜癌(参见例如Welti等，2013,特别是其中表1和补充表1)。
[0019] 根据特定实施方案，癌症是实体肿瘤。然而，应注意如白血病(例如CMUAML)、多发 性骨髓瘤和淋己瘤的血液癌症也可用抗血管生成剂治疗（Schmidt和Carmeliet ,2011; Roccaro等，2006)。因此，根据替代性实施方案，癌症是造血和/或淋己组织的肿瘤(也参见 实施例12)。
[0020] 因为血管生成在肿瘤转移中W及在活化转移性病变（Iestion)方面起主要作用， 所W根据特定实施方案，癌症是转移性癌症。新内皮细胞的存在增加将使得运些癌症对祀 向运些细胞的标志物(上述肿瘤血管系统标志物)的分子更敏感。
[0021 ] 附图简述
[0022] 图1:不同设置的SC hTNF-纳米抗体融合蛋白的结构元件的表示。
[0023] 图2:相较于WT hTNF,对于HekT细胞（图A)或Hek-mLR细胞（图B)，由指示的SC hTNF 制剂诱导的巧光虫巧光素酶活性。两者均用NF-KB巧光素酶报告基因短暂转染。
[0024] 图3:对于HekT细胞（图A)或胎k-mLR细胞（图B)，由指示的携带具有6个GGS重复的 连接子的SC hTNF制剂诱导的巧光虫巧光素酶活性。两者均用NF-KB巧光素酶报告基因短暂 转染。
[002引图4:对于HekT细胞（图A)或Hek-血R细胞（图B)，由指示的携带具有13个GGS重复的 连接子的SC hTNF制剂诱导的巧光虫巧光素酶活性。两者均用NF-KB巧光素酶报告基因短暂 转染。
[0026] 图5:对于HekT细胞（图A)或Hek-血R细胞（图B)，由指示的携带具有19个GGS重复的 连接子的SC hTNF制剂诱导的巧光虫巧光素酶活性。两者均用NF-KB巧光素酶报告基因短暂 转染。
[0027] 图6:相较于未处理细胞和用化r2纳米抗体刺激的细胞中的水平，在用50化g/ml的 指示的SC hTNF制剂处理SK-BR-3细胞后对IL-SmRNA水平的诱导倍数。数据代表2次独立实 验的平均值±SD(n = 4)。
[002引图7:hTNF突变体相较于WT hTNF的活性％，如通过对MCF7细胞(乳腺癌细胞系）的 毒性所度量。
[0029] 图8:偶联于mLR NB的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的C末端）对MCF7(图A)或MCF7-mLR(图B)细胞的毒性。
[0030] 图9偶联于hCD20NB的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的C末端）对MCF7(图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
[0031 ] 图10:偶联于hCD20或对照BcIIIONB的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7 (图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
[0032] 图11:含有具有组合突变的SC hTNF的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7 (图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
[0033] 图12:个别S聚化链偶联于mLR NB的祀向经修饰的TNF (NB在TNF的C末端)对MCF7 (图A)或MCF7-mLR (图B)细胞的毒性。
[0034] 图13:个别S聚化链偶联于hCD20NB的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7 (图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
[003引图14:WThTNF相对于偶联于hCD20或对照BcII10NB的祀向WT和经修饰的schTNF (NB在TNF的N末端)的体内毒性比较。(A)低体溫症(B)致命性。
[0036] 图15:偶联于对照BcIIIONB的WT或经修饰的(Y86F3X)sc小鼠（m)TNF(NB在TNF的N 末端)的体内毒性。(A)低体溫症(B)致命性。
[0037] 图16:偶联于mCD20或对照BcII10NB的WT或经修饰的（Y86F3X)sc小鼠（m)TNF(NB 在TNF的N末端)的体内抗肿瘤作用。(A)肿瘤生长(B)致命性。 实施例
[0038] 实施例的材料和方法
[0039] 纳米抗体
[0040] 针对鼠类瘦素（Ieptin)受体(mLR)的纳米抗体4-10描述于Zabeau等（2012)中。将 它的编码序列与SIgK前导肤、HA标签和白蛋白融合克隆至哺乳动物表达载体PMET7中 (hkebe等，1988)。质粒名称：pMET7 SI化-HA-4.il-白蛋白。抗Her2纳米抗体1R59B描述于 Vane^ycken等（2011)中。使用标准技术产生针对人CD20化CD20)的NB 2HCD25和针对小鼠 CD20(mCD20)的2MC57NB((?aro址di等，1997;化rdon等，2014)。对照NBBcII10描述于De Groeve 等(2010)中。
[0041] scTNF
[00叫由通过GGGGS连接子（SEQ ID NO: 1)偶联的S个hTNF单体组成的scTNF已由 803证6的等(2010)描述。显示hTNF中的Y87Q突变会完全消除与两种受体TNF-R巧日TNF-R2的 结合。使197突变导致hTNF与两种受体的结合降低化oetscher等，1993)。使hTNF内的整个范 围的残基突变（Quik化ange定点诱变试剂盒，S化atagene目录号200518)，并且测试它们对 MCF7细胞的毒性作用（图7)。我们选择W下突变供祀向构建体使用:Y87Q、Y87F、I97S、I97A、 Y115A、Y115G。通过基因合成（GeneAd)产生SC hTNF WT-6XGGS、sc hTNF Y87Q3X-6 X GGS、sc hTNF I97A3X-6XGGS、sc hTNF Y87QlXI97A2X-6XGGS、sc hTNF Y87Q2XI97A1 X-6XGGS、sc hTNF WTlXY87Q2X-6XGGS、sc hTNF WT2XY87QlX-6XGGS、sc hTNF I97S3X-6XGGS、sc hTNF Y115A3X-6XGGS、sc hTNF Y87F3X、sc hTNF Y115G3X、sc mTNFWT和scmTNFY86F3X的编码序列。个别链由GGGGS(沈QIDN0:l)连接子分隔。
[0043] scTNF-纳米抗体融合构建
[0044] 通过PCR，用W下引物从质粒P皿N6-1R59B合成1R59B化r2纳米抗体的编码序列： 正向 5 ' -GTCAAGATCTGGCGGTTCGGCGGCCGCAATGGCCCAGGTGCAGCTGCAG-3 '（沈Q ID NO: 2)，反向 5 '-CAGTTCTAGATTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCGAACCGCCGTCCGGAGAGGAGACGGTGAC-3 '（SEQ ID N0:3)。运种PCR在1R59B纳米抗体的氨基末端将GGS引入在BglII与NotI位点之间，并且 在簇基末端引入FLAG标签。PCR产物用Bg 1II和Xbar消化。pMK-RQ-sC hTNF WT、pMK-RQ-sC hTNF Y87Q3X和pMK-RQ-sc hTNF I97A3X用NdeI和Bgin消化。将消化的PCR产物和合成基 因片段克隆至NdeI-Xbar消化的PMET7 SIgK-HA-瘦素载体中W获得PMET7 SIgK-HA-SC hTNF WT-6XGGS-lR59B-FLAG、pMET7 SI 化-HA-SC hTNF Y87Q3X-6XGGS-1R59B-FLAG和 pMET7 SI巧-HA-SC hTNF I97A3X-6XGGS-1R59B-FLAG。通过在BglII与XbaI之间插入含有 GGS和FLAG标签的W下退火的寡聚物而非PCR产物来获得无1R59B纳米抗体的对照载体:正 向：
[0045] 5 ' GATCTGGCGGTTCGGCGGCCGCAGATTACAAGGATGACGACGATAAGTAAT3 '（沈Q ID NO:4)， 反向：5'CTAGATTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTGCGGCCGCCGAACCGCCA3'（SEQ ID N0:5)。通 过插入W下退火的寡聚物而非NdeI-SC hTNF-Bglll片段来获得仅具有1R59B纳米抗体的对 照载体：正向：5'-TATGATGTGCCCGACTACGCTGGCGGCAGCA-3'（SEQ ID N0:6)，反向5'-6八1'別6押6〇1；〇：46〔61461'〔666〔4〔41'〔4-3'（569 10^:7)。通过在8邑1門与齡《位点之间向 原始6 X GGS添加7 X GGS或13 X GGS重复（由基因合成(GeneArt)制备)来将GGS连接子的长度 调整为具有13个重复和19个重复的GGS连接子。
[0046] 类似方法用于获得pMET7 SI巧-HA-SC hTNF WT-6X/13X/19XGGS-4.10-FLAG、 pMET7 SIgK-HA-SC hTNF Y87Q3X-6XGGS-4.10-FLAG、pMET7 SI^-HA-schTNFI97A3X-6X/13X/19XGGS-4.10-njVG、pMET7SIgK-HA-schTNFY87QlXI97A2X-6X/13X/19X GGS-4.10-njVG、pMET7SIgK-HA-schTNFY87Q2XI97AlX-6X/13X/19XGGS-4.10-FLAG、pMET7 SIgK-HA-SC hTNF WT-6X/13X/19XGGS-2HCD25-FLAG、pMET7 SIgK-HA-SC hTNF I97S3X-6X/13X/19XGGS-2HCD25-FLAG、pMET7 SI化-HA-SC hTNF I97A3X-6X/ 13X/19XGGS-2HCD25-FLAG和pMET7SIgK-HA-schTNFY115A3X-6X/13X/19XGGS-2 肥 D25-化 AG。
[0047] 为获得个别S聚化hTNF构建体，pMet7-SI巧-HA-SC hTNF WT-GGS-4.10-Flag中的 SC hTNF用 W正向引物5 ' -CATATGATGTGCCCGACTACGCTGGCGGCAGCAGCTCTAGAACCCCCAGCGATAA GCCTGTG-3'（沈Q ID N0:8)和反向引物5'-GTCGACCAGGGCAATGATGCCGAAGT-3'（SEQ ID NO: 9)于质粒pMet7-SI巧-His-hTNF WT或pMet7-SI巧-His-hTNF I97A上获得的PCR产物的 NdeI-Sair消化物替换。运产生W下载体：pMet7-SIgK-HA-hTNF WT-6XGGS-4. IO-Flag和 pMet7-SI巧-HA-hTNF I97A-6XGGS-4.10-Flag。
[0048] 在pMet7中制备在个别S聚化或单链人或小鼠 TNF的N末端具有NB的纳米抗体-TNF 融合物表达构建体，并且设计成使得各亚单位可通过独特限制位点互换:AgeI-纳米抗体-Sa 11-GGS连接子-No 11 -TNF-Xho I -Hi S -甜a I。
[0049] P化3-(IL6-kB)3-巧光虫巧光素酶由W.Vanden Berghe(Vanden Berghe等，1998) 友情提供。
[0050] 产生用于体外研究的纳米抗体-TNF融合蛋白
[0051] 使用标准憐酸巧沉淀方法，用蛋白质融合构建体转染化kT细胞。在转染之后48小 时，收集培养基并储存在-20°C下。用商业hTNF ELISA(DY210，R1D systems)测定浓度。
[0052] 产生用于体内研究的纳米抗体-scTNF融合蛋白
[0053] 根据制造商指南，使用阳Ipro?转染试剂(PolyPlus，目录号115-375)用蛋白质融 合构建体转染FreeStyle?293-F细胞。所有制剂中的内毒素含量都低于检测限，如通过显色 整阿米己状细胞溶解产物测定化imulus Ameboc}fte Lysate AssayKLonza,目录号50-647U)所评估。
[0054] 细胞系
[005 引 使化4、化41\胎4-11111?、]\0^7、]\0^7-11〔020、]\?：巧-1111巧邮16816-111〔020细胞在补充有 10%FCS的DMEM中生长。FreeStyle?293-F细胞系从Invitrogen,Life Technologies(目录 号R790-07)获得，并且维持在来自Gibco，Life I'echnologies的FreeStyle?293表达培养基 (目录号12338)中。人乳腺癌SK-BR-3(ATCC:HTB-30)细胞系从ATCC获得，并且维持在补充有 10%FCS的麦考伊氏5A培养基(McCoy'S 5A medium)中。
[0056] 如下产生化k-mLR细胞系：用含有用于获得mEcoR和新霉素抗性的表达盒的质粒W 及用pXP2d2-rPAPl-luci报告基因构建体共同稳定转染Flp-In-293细胞（Invitrogen) 化yckerman等2001)。在含有G418(400ug/ml)的培养基中分离稳定转染的克隆，并且选择具 有高LIF(lng/ml)诱导的巧光素酶活性的克隆。使用Flp-In重组酶反应（Invitrogen) W及 在潮霉素（lOOμg/ml)上选择10天之后，将含有mLR的表达载体PCDNA5/FRT稳定整合在运个 细胞系中。
[0057] 人乳腺癌MCF7 (ATCC: HTB-22)细胞系从ATCC获得。如下产生MCF7-hCD20和MCF7-mLR细胞系：用含有用于获得hCD20或mLR的表达盒的质粒W及用含有新霉素抗性基因的质 粒共同稳定转染MCF7细胞。用含有G418( Img/ml)的培养基选择稳定转染的细胞，随后对 hCD20或mLR表达细胞进行FACS分选。
[0058] 如下产生B16B16-mCD20细胞系：用含有用于获得mCD20的表达盒的质粒W及用含 有新霉素抗性基因的质粒共同稳定转染B16B16细胞。用含有G418(2mg/ml)的培养基选择稳 定转染的细胞。
[0059] 人乳腺癌SK-BR-3(ATCC:HTB-30)细胞系从ATCC获得，并且维持在补充有10%FCS 的麦考伊氏5A培养基中。
[0060] 巧光素酶活性的测量
[0061] 通过定量受控于NF-KB启动子的巧光素酶活性来测量TNF特异性活性。在通过标准 憐酸巧沉淀方法转染NF-KB巧光素酶报告基因（P化3-(IL6-kB)3-巧光虫巧光素酶)之后两 天，用祀向或对照SC hTNF刺激细胞6小时。制备溶解产物(溶解缓冲液:25mM化is(pH7.8)、 2mM抓TA、2mM二硫苏糖醇、10%甘油、1 %曲通(Triton)X-IOO)，并且每50iU溶解产物添加 35山巧光素酶底物缓冲液(20ml巨(径甲基）甲基甘氨酸(Tricine)、1.07mM(MgC03)4Mg(0H) 2 ? 5H20、2.67mM MgS04 ? 7肥0、0.1mM EDTA、33.3mM二硫苏糖醇、270yM辅酶A、470yM虫巧光 素、530iiM ATP，最终抑7.8)。在TopCount化学发光计数器(Packard)中测量光发射5秒。
[0062] 定量 RT-PCR
[0063] 通过RT-PCR相对于HPRT定量用500ng/ml祀向或对照SC hTNF处理6小时的SK-BR-3 细胞中的TNF诱导性基因化-6的表达。用RNeasy柱（Qiagen)纯化总RNA，并且等量RNA(0.5y g)用于遵循制造商说明书，使用Primescript RT试剂盒(Takara Bio,Siiga,Japan)进行逆 转录。添加10倍稀释的cDNA至含有IX SYBR Green I主混合物（04 887 352 OOl ,Roche)和 InM基因特异性引物的RT-QPCR混合物中。在Li曲t切Cler 480实时PCR系统热循环仪(Roche Applied Science)上一式S份进行测定，并且使用A A CT方法分析结果。使用W下引物：
[006引对MC巧细胞的毒性分析
[0069] 也通过评估对MCF7细胞的细胞毒性来测量TNF特异性活性。将1000个细胞涂铺在 黑色96孔板中，并且24小时后用不同TNF构建体刺激。在48-72小时之后，根据制造商指南， 使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega目录号G7570)测定活细胞的数目。
[0070] 体内毒性分析
[0071] 为体内评估hTNF毒性，用500ng rhTNF或SC hTNF-纳米抗体融合蛋白与IOmg D-半 乳糖胺组合(于无 LPS PBS中稀释，W50化1的体积注射)腹膜内注射雌性8周龄巧7BL/6J小 鼠（购自化arles River,化ance)。通过测量外周(直肠)体溫来监测致病性。n =每种融合蛋 白 2-4。
[0072] 为评估体内mTNF毒性，用10、35、100或20化g SC mTNF-纳米抗体融合蛋白（注射体 积20化1，于无 LPS PBS中稀释)静脉内注射小鼠。通过测量外周(直肠)体溫来监测致病性。n =每种融合蛋白每种剂量2，例外之处是20化g(n = 1)。
[007引体内抗肿瘤研究
[0074] 将8周龄的雌性巧7BL/6J小鼠剌毛，并且用6X105个B16B16-mCD20肿瘤细胞在背 部皮下接种(第0天）。当最大垂直直径的乘积是约50mm2时（在第10天)开始处理。通过在病 变旁边注射(在肿瘤部位附近但在肿瘤结节外部皮下注射)来连续8天(第10-17天，W灰色 棒条指示在图16A中）施用PBS或35yg纳米抗体-SC mTNF融合蛋白。用测径规每日测量肿瘤， 并且示出为平均值±SEM。通过每日测量体重和体溫来监测致病性。n =每种治疗5。
[007引实施例1: SC hTNF-纳米抗体融合蛋白
[0076]图1显示在SC hTNF的N末端或C末端具有纳米抗体的SC hTNF-纳米抗体融合蛋白 的图示。
[0077] 实施例2:对mLR表达Hek细胞的祀向TNF活性
[007引测试化kT细胞中W及表达鼠类瘦素受体的化k细胞化ek-mLR)中在TNF刺激后对 NF-KB巧光素酶报告基因活性的诱导。如图2A中所示，WT SC hTNF诱导的NF-KB诱导作用因 Y87Q3 X或I97A3 X突变而分别被完全(>1000倍)或部分(100倍)消除。此外，在不表达mLR的 化kT细胞中，所有SC hTNF构建体(WT、Y87Q3 X和I97A3 X )都独立于与mLR纳米抗体的融合 来诱导类似NF-KB活性（图2A)。相反，偶联于mLR纳米抗体能够在与WT SC hTNF类似的程度 上恢复表达mLR的化k细胞中SC hTNF I97A3 X的NF-KB诱导作用（图2B)。我们估计表达mLR 的细胞比亲本化kT细胞对纳米抗体偶联的SC hTNF I97A3 X敏感100倍。相反，相较于化kT 细胞，在化k-mLR细胞中，S重Y87Q突变不显示对TNF应答性的任何挽救作用（图2B)。
[0079] 实施例3:不同突变组合和不同连接子长度的比较
[0080] 为优化构建体，测试在个别链中具有不同突变的SC hTNF构建体W及SC hTNF与祀 向部分之间的不同连接子长度。结果概述于图3、4和5中。SC hTNFI97A3X和SC hTNF Y87Q1 X I97A2 X不显示对不表达瘦素受体的化k细胞的活性，但在祀向瘦素受体时具有明确剂量 依赖性活性。
[0081 ] 实施例4:对表达化r2的化k细胞的祀向TNF活性
[008引我们使用a-Her2纳米抗体 1R59B和SC hTNF WT、sc hTNF Y87Q3X 或SC hTNF I97A3 X产生融合蛋白。纳米抗体与SC hTNF之间的连接子是6 X GGS或19 XGGS。测试运些分 子对过度表达化r2的SK-BR-3乳腺癌细胞系的IL-6TNF诱导性基因的诱导作用，如通过定量 RT-PCR相对于HPRT所测定。
[0083] 图6显示相较于未处理细胞和用化r2纳米抗体刺激的细胞中的IL-SmRNA水平，在 SC hTNF处理（500ng/ml)后对化-6mRNA的诱导倍数。与对NF-KB的转录活化相对应，我们观 察到Y87Q3X突变完全阻止TNF诱导的IL-6产生，而SC hTNF I97A3X可仍然诱导IL-6产生， 但程度小于WT SC hTNF。当使SC hTNF融合于纳米抗体时，产生较少化-6mRNA。运可归因于 空间位阻，因为相较于其中存在可能更大可晓性的较长19XGGS连接子，在6XGGS连接子的 情况下的影响更显著。通过使SC hTNF I97A3X偶联于化r2纳米抗体，可在与WT SC hTNF通 过相应连接子偶联于纳米抗体类似的程度上恢复对IL-6的诱导作用。相反，使更重度Y87Q3 Xsc hTNF突变体特异性祀向化r2表达细胞不能恢复SC hTNF的IL-6诱导性质。
[0084] 实施例5:比较hTNF突变体对MC巧细胞的毒性
[008引由于I97A3X突变SC hTNF具有相对较高残余活性，所W我们通过将不同个别S聚 化hTNF突变体的毒性测量为MCF7细胞中的巧光素酶活性来捜索其它突变。突变体相对于WT 个别立聚化TNF的活性显示于图7中。大多数突变不显著影响TN巧舌性(〉1%的WT)，并且由于 它们的可能剩余实质性毒性而可能具有较小前途用于开发祀向构建体。我们更关注于(几 乎)完全消除TNF功能的突变。使用无效突变(<0，1 %的WT)会产生不具有副作用，但具有在 祀向后的再活化较不易于实现作为可能缺点的祀向构建体。具有一定残余活性(0,02-5% 的WT，特别是的WT)的突变具有更好机会被再活化，同时不具有毒性。选择6种涵 盖在0,02与5%的个别S聚化WT TNF之间的活性范围的不同突变用于开发祀向修饰的细胞 因子:￥879(0,02%)、1975和￥1154(0,2%)、￥87尸(0,5-1%)、￥1156(1-2%)和1974(2-5%)。
[0086] 实施例6:对表达mLR的MCF7细胞的祀向TNF活性
[0087] 评估mLR NB祀向TNF对MCF7和MCF7-mLR细胞的毒性。测试不同突变（I97A3X、 I97S3X 和Y115A3X)W 及SC hTNF 与 mLR NB 之间的不同连接子（6XGGS、13XGGS、19X GGS)。如图8A中所示，毒性因 I97A3X突变而降低20倍，并且因 I97S3X和Y115A3X突变而降 低500倍，运类似于我们对于个别立聚化TNF所观察到的结果（图7)。此外，在不表达mLR的 MCF7细胞中，与mLR NB融合不改变WT或突变SC hTNF的活性（图8A)，而对于MCF7-mLR细胞， 运种融合再活化所有SC hTNF突变体（图8B)。我们估计表达mLR的细胞比亲本MC巧细胞对NB 偶联的I97S3 X和Y115A3 X SC hTNF敏感100倍。然而，运些祀向经修饰的TNF的活性仍然比 WT SC hTNF小约20倍。相反，对于MCF7-mLR细胞，I97A3X祀向经修饰的TNF被恢复至WT活性 水平，此对应于20倍再活化(图8B)。
[008引实施例7:对表达hCD20的MCF7细胞的祀向TNF活性
[0089] 为评估其它祀向部分用于达成经修饰的TNF的祀向的作用，我们用hCD20NB替换实 施例6的构建体中的mLR NB,并且测试它们对MCF7细胞和表达hCD20的MCF7细胞(MCF7-hCD20)的毒性。结果显示于图9中。如所预期，mLR NB和hCD20NB祀向经修饰的TNF对亲本 MCF7细胞的行为类似(图8A和9A)。
[0090] 实施例8:在不同hCD20NB融合物设置的情况下对hCD20表达细胞的祀向TNF活性。
[0091] 我们试图通过将NB放置在S C hTNF之前而非在其之后来改进hCD20NB-TNF构建体。 我们也测试巧巾显著性较小的其它突变(Y87F3 X和Yl 15G3 X，图7)。用运些构建体进行的 MCF7和MCF7-hCD20毒性研究显示于图10中。偶联于hCD20NB的Sc hTNF与偶联于对照 BcIIIONB的相应突变体对MCF7细胞施加相同毒性（图10A)，并且活性水平类似于我们对于 个别S聚化TNF突变体所观察到的结果（图7)。对于MCF7-hCD20细胞，突变体的运个毒性降 低在hCD20祀向后得W(部分)复原:相较于相应BcIIlO对照NB偶联的SC hTNF，hCD20NB偶联 的经修饰TNF获得活性增加10倍(Y115G3 X )、15倍(Y87F3 X )、100倍（I97S3 X、Y115A3 X )或 甚至更高(Y87Q3 X )(图10B)。在运个实验中，当将hCD20NB放置在SC hTNF的簇基末端而非 氨基末端时，再活化较小（图9B)。
[0092] 实施例9:不同突变组合的比较
[0093] 尽管存在祀向经修饰的TNF相对于非祀向经修饰的TNF的差异是至少100倍的事 实，但一些突变显示低于WT活性水平的挽救活性(Y87Q3X)，此可能影响它的抗肿瘤作用。 或者，一些突变仍然具有一定残余活性(I97S3X和Y115A3X)，此在体内使用时可能导致一 定(全身性)毒性。为克服运些潜在缺点，我们通过使SC hTNF的个别链中的不同残基突变来 测试其它构建体W观察活性水平是否可因此被进一步调节。如图11中所示，在单链中组合 不同突变可改变对非祀向细胞的残余活性W及在祀向后的再活化水平。
[0094] 实施例10:祀向个别S聚化TNF相对于单链经修饰的hTNF的比较。
[0095] 为比较祀向个别S聚化TNF相对于单链TNF的效率，使WT或I97A hTNF在C末端与 mLR NB偶联成单体。测试它们对MCF7细胞W及对表达mLR的MCF7细胞(MCF7-mLR)的毒性，并 且显示于图12中。此外，在个别S聚化形式中，I97A突变对MC巧细胞具有毒性，但程度小于 WT hTNF(图8A和图12A)。此外，当在C末端偶联于mLR纳米抗体时，个别S聚化而非单链TNF 对MCF7细胞的毒性变得较小，并且运对于WT和I97A两者均是运样（图8A和图12A)。最可能的 是用个别S聚化TNF-mLR NB构建体形成的hTNFS聚体中存在的3个纳米抗体在空间上阻碍 hTNF结合它的受体。然而，运种活性降低可通过祀向MCF7-mLR细胞上的mLR来复原（图12B)。 引起关注的是，运提供进一步程度的活性调节：可组合不同突变W及使用空间位阻来影响 残余活性和在祀向后的再活化水平。
[0096] 为阐明运是否是一种一般性现象，我们使个别S聚化WT和Y115A hTNF在N末端偶 联于BcII10或hCD20纳米抗体，并且测试它们对MCF7和MCF7-hCD20细胞的毒性。如图13A中 所示，运种偶联不影响个别立聚化WT或Y115A3XhTNF的毒性。此外，在祀向后，个别立聚化 Yl 15A3 X hTNF变得如同非祀向个别S聚化WT hTNF-样具有活性(图13B)。
[0097] 实施例11:评估祀向经修饰的hTNF的体内毒性
[0098] 为评估hTNF突变体的毒性在临床前不明显，因为TNF在小鼠中显示显著物种特异 性。不同于mTNF，hTNF仅在极高剂量下诱导致死性(Brouckaert等1992)。尽管运个物种特异 性的原因长久被认为由hTNF不与鼠类TNF-R2相互作用引起，但药物代谢动力学研究已显示 在小鼠中hTNF比mTNF被快得多地清除，并且随之发生的有限hTNF暴露导致它缺乏致病性 (Ameloot等2002)。
[0099] 然而，当用如D-半乳糖胺的致敏剂处理时，物种特异性被消除，并且极低剂量（< 500ng)的hTNF与mTNF具有同等致死性(Broeckaert等，1992)。为评估各种祀向经修饰的 hTNF的体内毒性，我们因此用500ng的重组(r化TNF、sc hTNF WT或SC突变hTNF(Y87Q3X或 Y115A3X)腹膜内注射小鼠。使SC WT和经修饰的hTNF在N末端偶联于BcIIlO或hCD20NB。如 图14中所示，SC WT hTNF至少如同riiTNF-样具有毒性，从而在注射之后10小时内导致重度 低体溫症和致命性。祀向经修饰的hTNF Y87Q3X和Y115A3X不导致任何致病性征象(竖毛、 震颤、嗜睡、理毛行为丧失或体溫下降;对于后者，参见图14A)。
[0100] 实施例12:评估祀向经修饰的mTNF的体内毒性和抗肿瘤作用。
[0101] 如已提及，不能容易地在小鼠中研究hTNF的体内毒性。因此W及由于预期在免疫 活性同基因小鼠中进行抗肿瘤实验，所W我们决定使mTNF的与我们对于hTNF选择的残基同 源的残基突变（参见实施例5)。如图15中所说明，当W低至IOiig的剂量静脉内注射时， BcIIlONB-sc mTNF WT导致重度致病性（图15A)和100%致命性（图15B)。相反，BcIIlONB-sc mTNFY86F3X不诱导致命性（图15B)，也不导致任何毒性征象(竖毛、震颤、嗜睡、理毛行为丧 失或体温下降；对于后者，参见图15A)，甚至当W200tig的静脉内团注形式注射时也不。然 而，当^35]ig的剂量每日在病变旁边注射于携带B16B16-mCD20肿瘤的小赢中时，纳米抗体 偶联的SC mTNFY86F3X可仍然降化/阻止肿瘤生长，尤其当靴向mCD20时（图16A)。非靴向突 变TNF对肿瘤生长的作用（图16A)归因于所用高剂量(35tig)，因为较化剂量更接近类似于 PBS处理的动物(数据未显示）。每日用NB-SC mTNF Y86F3X处理未导致任何致病性或致命 性征象，而用NB-SC mTNF WT处理的携带肿瘤的小赢在1或2次注射之后死亡（图16B)。
[0102] 参考文献
[0103] -Ameloot，P.,Takahashi N.，Everaerdt，B.,Hostens，J.，Eugster，H.P.，Fiers， W.,and Brouckaert，P.(2002).Bioavailability of recombinant tumor necrosis factor determines its lethality in mice.Eur J Immunol，32,2759-65.
[0104] -Arap，W.,Pasqualini，R.and Ruoslahti，E?51998)?Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model.Science,279,377-380.
[0105] -Ashkenazi，A.feHerbst，民.S.To kill a tumor cell：the potential of proapoptotic receptor agonists.J Clin Invest 118,1979-1990(2008).
[0106] -Blake，A.W.，McCartney，L.,Flint，J.，Bolam，D.N.，Boraston，A.B.,Gilbert， H.J.and Knox ,J.P.(2006)Understanding the biological rationale for the diversity of cellulose-directed carbohydrate-binding molecules in prokaryotic enzymes.J.Biol.Qiem.281,29321-29329.
[0107] -Boschert，V.et al.Single chain TNF derivatives with individually mutated receptor binding sites reveal differential stoichiometry of ligand receptor complex formation for TNFRl and TNFR2.Cell Signal 22,1088-1096 (2010).
[0108] -Brecht et al.,Peptide immobilization and characterization of binding specificity.! Biol Chem 268:15425-15434
[0109] -Brouckaert'P.，Libert，C.，Everaerdt，B.and Fiers W(1992).Selective species specificity of tumor necrosis factor for toxicity in the mouse.Lymphokine Cytokine 民es，11，193-6.
[0110] -Brown,K.C.(2010).Peptidic tumor targeting agents；the road from phagfe display selections to clinical applications .Curr.Pharm.Des.16，1040-1054.
[0111] -Daburon，S.et al.Functional characterization of a chimeric soluble Fas ligand polymer with in vivo anti-tumor activity.PLoS One 8，e54000(2013).
[0112] -de Bruyn，M.，Bremer，E.&Helfrich，W.Antibody-based fusion proteins to target death receptors in cancer.Cancer Lett 332，175-183(2013).
[0113] -Dimitrov'D.S.(2009)Engineered CH2 domains(nanoantibodies).mAbs I，26-28.
[0114] -Eyckerman，S.,Waelput，W.，Verhee，A.,Broekaert，D.，Vandekerckhove，J.，and Tavernier,J.(1999).Eur.Cytok.Netw?10,549-559.
[0115] -Falschlehner，C.，Ganten，T.M.，Koschny，R.,Schaefer，U.&Walczak，H.TRAIL and other T民AIL receptor agonists as novel cancer therapeutics.Adv Exp Med Biol 647,195-206(2009).
[0116] -Fox，N.L.,Humphreys，民.，Luster，T.A.,Klein，J.&Gallant，G.Tumor Necrosis Factor-related apoptosis-inducing Iigand(TRAIL)Receptor-I and 民eceptor-2 agonists for cancer therapy.Expert Opin Biol Ther 10，1-18(2010).
[0117] -Galle'P.R.et al?Involvement of the CD95(AP〇-1/Fas)receptor and ligand in liver damage.J E邱 Med 182,1223-1230(1995)?
[0118] -Gaur，U.feAggarwal，B.B.民egulation of proliferation , survival and apoptosis by members of the TNF superfamily.Biochem Pharmacol 66,1403-1408 (2003).
[0119] -加 ahroudi A.M.，Desm^er，A.，Wyns，L. ,Hamers，R. ,Muyldermans，S. (1997) .Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.FEBS Lett.414,521-6
[0120] -Gregorc'V.et al.Phase lb study of NGR-hTNF，a selective vascular targeting agent,administered at low doses in combination with doxorubicin to patients with advanced solid tumours.Br J Cancer 101,219-224(2009).
[0121] -Hehlgans，T.&Pfeifer，K.The intriguing biology of the tumour necrosis fa ctor/tumour necrosis factor receptor superfamiIy：players,rules and the games. Immunology 115,1-20(2005).
[0122] -Huan g，Y .&Sh e i kh，M . S . T民A I L death receptors and cancer 化erapeutics.Toxicol Appl Pharmacol 224,284-289(2007).
[0123] -Johnstone，R.W.，Frew，A.J.&Smyth，M.J.The TRAIL apoptotic pathway in cancer onset,progression and therapy.Nat 民ev Cancer 8,782-798(2008).
[0124] -Koivunen，E?，Wang，B?and Ruoslahti，E?(1994)?Isolation of a highly specific ligand for theaSSl integrin from a phage library.J.Cell.Biol.124， 373-380.
[0125] -Kolmar，H.(2008)Alternative binding proteins：biological activity and therapeutic potential of cysteine-knot miniproteins.FEBS J.275,2684-2690.
[0126] -Lejeune，F.J.，Lienard，D.,Matter，！.&民uegg，C.Efficiency of recombinant hum过n TNP in human c过ncer ther过py.Csncer Immun 6,6(2006).
[0127] -Li，M.et al.Phase II multicenter,randomized,double-blind study of recombinant mutated human tumor necrosis factor-alpha in combination with chemotherapies in cancer patients.Cancer Sci 103,288-295(2012).
[0128] -Liu,Y.et al. The antimelanoma immunocytokine scFvMEL/TNF shows reduced toxicity and potent antitumor activity against human tumor xenografts?Neoplasia 8,384-393(2006)?
[0129] -Loetscher，H.，Stueber，D.，Banner，D. ,Mackay，F.&Lesslauer，W.Human tumor necrosis factor alpha(TNF alpha)mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75-kDa TNF rec邱tors.J Biol Qiem 268,26350-26357(1993).
[0130] -Nygren,P-A.(2008)Alternative binding proteins：affibody binding proteins developed from a small three-helix bundle scaffold.FEBS J.275,2668-2676.
[0131] -Ogasawara，J.et al.Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice.Na化re 364,806-809(1993).
[0132] -Pardon，E. ,Laeremans，T. ,Triest，S. ,Rasmussen，S.G.F?，辦細浪鞭辣A.，Ruf，A.， Muyldermans，S.，Hol，W.G.J，Kobilka，B.K.and Steyaert，J.(2014).A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.Nature Protocols 9， 674-693
[0133] -Robei'ts'N. J.，Zhou，S.，Diaz，L.A.，Jr.&Holdhoff，M.Systemic use of tumor necrosis f过ctor 过Iph过过s snsnticsncersgent.Oncotsrget 2,739-751(2011).
[0134] -民occaro AM，Hideshima T，民aje N，Kumar S，Ishitsuka K，Yasui H^Shiraishi N，民ibatti D，Nico B，Vacca A，Dammacco F，民ichardson PG，Anderson KC.Bortezomib mediates antiangiogenesis in multiple myeloma via direct and indirect effects on endo化elial cells.Cancer Res.2006:66(1):184-91.
[0135] -Scatchard G.Ann New York Acad Sci 1949:51,660-72.
[0136] -Schmidt T^Carmeliet P.Angiogenesis:a target in solid tumors,also in leukemia?Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2011;2011:1-8.
[0137] -Siegemund，M.et al.Superior antitumoral activity of dimerized targeted single-chain T民AIL fusion proteins under retention of tumor Selectivity-Cell Dea化 Dis 3，e295(2012).
[0138] -Skerra，A.(2008)Alternative binding proteins：antical ins-harnessing the structural plasticity of the Iipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.FEBS J.275,2677-2683.
[0139] -Stump'M.T.，Binz，H.K.，Amstutz，P.(2008)DARPins:a new generation of protein therapeutics.Drug iscov.Today 13,695-701.
[0140] -Tramontane)，A. ,Bianchi，E. ,Venturini，S. ,Mart in，F.，Pessi，A and Sollazzo,M.(1994)The making of the minibody：an engineered beta-protein for the display of confromationally constrained peptides.J.Mol.Recognition 7,9- 24.
[0141] -Vanden Berghe，W.et al.p38 and extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase pathways are required for nuclear factor- kappaB p65 transactivation mediated by tumor necrosis factor.J Biol Chem 273， 3285-3290(1998).
[0142] -Vaneycken，！.et al.Preclinical screening of anti-HE民2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer.FASEB J 25,2433-2446(2011).
[0143] -van Horssen，民.，Ten Hagen，T.L.feEggermont，A.M.TNF-alpha in cancer treatment：molecular insights,antitumor effects，and clinical utility.Oncologist 11,397-408(2006).
[0144] -Wang，H.，Yan，Z.，Shi，J.，Han，W.&Zhang，Y.Expression，purification，and characterization of a neovasculature targeted rmhTNF-alpha in Escherichia coli.Protein Expr Purif 45,60-65(2006).
[0145] -Welti J，Loges S^Dimmeler S^Carmeliet P.民ecent molecular discoveries in 过ngiogenesis 过nd 过nti过ngiogenic therapies in c过ncer.J Clin Invest.2013；123 (8):3190-200.
[0146] -Yang，Y.H.,Rajaiah，R.,Ruoslahti，E.and Moudgil，K.D?(2011).Peptides targeting inflamed synovial v过sul过ture attenuate autoimmune 过rthritis.PBNAS 108,12857-12862.
[0147] -Zabeau，L.et al.Selection of non-competitive Ieptin antagonists using a random nanobody-based approach.Biochem J 441,425-434(2012).
【主权项】
1. 一种构建体，其包含（i)TNF超家族的成员的细胞因子链的三个拷贝，其中所得细胞 因子被修饰以使对它的受体的亲和力降低，（ii)连接子序列和（iii)靶向部分，其中所述连 接子序列使所述细胞因子拷贝连接于所述靶向部分。2. 如权利要求1所述的构建体，其中所述构建体是融合蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的构建体，其中所述TNF超家族的成员的所述细胞因子链的 至少一个拷贝被突变。4. 根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述细胞因子选自由FasUTRAIL、 TNF、CD30L、CD40L、0X40L、RANKL、TWEAKL、LTa、LT0、LIGHT、CD27L、41BBL、GITRL、APRIL、EDA、 VEGI和BAFF组成的组。5. 根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述靶向部分是抗体或纳米抗体。6. 根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述突变的细胞因子拷贝选自由 TNFY87Q、TNFY87F、TNFI97A、TNFI97S、TNFY115A、TNFY115G组成的组。7. 根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述靶向部分针对选自由CD20、 他^、(：-16七』6?1?、腱生蛋白(：、€^3整联蛋白和〇)13组成的组的靶标。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的构建体，其用作药剂。9.根据权利要求1至7中任一项所述的构建体，其用于治疗癌症。
【专利摘要】本发明涉及TNF超家族的一种对它的受体具有降低的活性的经修饰的细胞因子，其中所述经修饰的细胞因子被特异性递送至靶细胞。优选地，所述经修饰的细胞因子是TNF超家族的单链变体，甚至更优选地，一个或多个链携带一种或多种突变，从而导致对受体具有低亲和力，其中所述突变细胞因子被特异性递送至靶细胞。靶向通过使所述TNF超家族的经修饰的细胞因子融合于靶向部分，优选是抗体或抗体样分子来实现。本发明进一步涉及所述TNF超家族的所述靶向经修饰的细胞因子治疗疾病的用途。
【IPC分类】A61K38/19, A61K39/395
【公开号】CN105492017
【申请号】CN201480040645
【发明人】J·塔威尼尔, J·堡丁克, F·皮尔曼, G·尤则
【申请人】弗拉芒区生物技术研究所, 根特大学, 法国国家科学研究中心, 蒙彼利埃第二大学, 蒙彼利埃大学医疗中心
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月18日
【公告号】CA2918363A1, EP3021865A1, US20160159874, WO2015007903A1
【专利说明】祀向经修饰的TNF家族成员
[0001] 本发明设及TNF超家族的一种对它的受体具有降低的活性的经修饰的细胞因子， 其中所述经修饰的细胞因子被特异性递送至祀细胞。优选地，所述经修饰的细胞因子是TNF 超家族的成员的单链变体，甚至更优选地，一个或多个链携带一种或多种突变，从而导致对 受体具有低亲和力，其中所述突变细胞因子被特异性递送至祀细胞。祀向通过使TNF超家族 的经修饰的细胞因子融合于祀向部分，优选是抗体或抗体样分子来实现。本发明进一步设 及TNF超家族的所述祀向经修饰的细胞因子治疗疾病的用途。
[0002] TNF超家族由通过调控细胞死亡、增殖和分化而在免疫系统中具有至关重要功能 的促炎性细胞因子组成。此外，所述家族的成员被描述为对骨代谢、神经系统、新血管系统 和癌发生施加作用。它含有W自我装配性非共价结合的同=聚体形式具有生物活性的19种 配体，即n型(细胞内N末端和细胞外C末端)跨膜蛋白。尽管大多数TNF超家族配体W膜结合 的蛋白质形式合成，但可通过蛋白水解裂解来产生可溶性形式。它们全都通过它们的C末端 TNF同源性结构域来结合一种或多种来自TNF受体超家族的分子，所述结构域在家族成员之 间展现约20-30%序列同源性。迄今为止，已在人中鉴定了 29种TNF超家族受体。运些主要是 在配体结合细胞外结构域中具有富含半脫胺酸的基序的I型(细胞外N末端、细胞内C末端） 跨膜糖蛋白。然而，存在一些例外，如通过共价连接的C末端糖脂连接于膜的TRAIL-R3。可溶 性受体可通过蛋白水解裂解(例如TNF-Rl和TNF-R2)或通过选择性剪接编码跨膜结构域的 外显子来产生。运个超家族的受体可基于它们的信号传导性质而被划分在3个组中：诱导调 亡的具有细胞质死亡结构域的受体;诱导如^-邮、1服、938、6服和？131(的若干信号传导路 径的具有TRAF相互作用基序的受体;和缺乏细胞内信号传导结构域的诱巧受体。TNF通过与 TNF-Rl (p55)相互作用来诱导调亡，而与TNF-R2(p75，主要在免疫细胞上表达)结合会促进 增殖。TRAIL信号传导更复杂，因为它可结合两种死亡受体（TRA化-RUDR4)和TRA^-R2 (0尺5))、两种诱巧受体（了1^化-1?3(0〔1?1)和了1?4化-1?4(0〔1?2))^及可溶性骨保护素 (OSteoprotegerin) (OPG)。与后S种受体中的一种结合抑制TRAIL介导的调亡，因为运栓系 TRAIL而远离死亡受体（Gaul"和Aggerwal, 2003; Hehlgan巧日Pfeffer, 2005; Huang和化eiWi, 2007)O
[0003] 死亡诱导性TNF超家族成员TNF、CD9化(FasL)和TRAIL是针对表达它们的相应受体 TNF-Rl、〔095^1?4比-1?巧町1?4比-1?2的癌症的潜在治疗剂。实际上^^最初在超过25年前被 发现为一种通过在体内导致某些肿瘤的出血性坏死而具有卓越抗肿瘤活性的因子。稍后， 变得明确的是归因于TNF的对肿瘤新血管系统的选择性损害也确定它的抗肿瘤潜力 化e jeune等，2006; van化rssen等，2006)。不幸的是，在癌症治疗中全身性使用TNF仍然受 阻于它的休克诱发性质。它当前在临床上仅与化学疗法组合用于隔离肢体灌注的环境中来 治疗软组织肉瘤和处于转变中的黑素瘤(Robeds等，2011)。此外，CD%L在全身性施用时是 有毒的，因为它导致归因于大量肝细胞调亡的致死性肝细胞毒性(Galle等，1995)。然而，已 显示TRAIL会诱导癌细胞的调亡，针对非转化细胞具有少许或不具有细胞毒性，并且在各种 晚期癌症中进行的临床试验报道在许多情况下疾病稳定。然而，为获得足够总体治疗活性， 需要组合治疗，此暗示归因于正常细胞对TRAIL诱导的调亡敏感的可能的副作用 (Ashkenaz巧日Herbst ,2008;hlschlehner等，2009)。已进行不同方法来使全身性施用死亡 诱导性TNF超家族成员后的毒性减至最小，如具有较低毒性和较高效率的突变TNF化i等， 2012)，通过肿瘤特异性部分来递送通常呈单链构建体形式的TNF或TRAIUde Bruyn等， 2013 ;Gregorc等，2009;Liu等，2006; Siegemund等，2012;Wang等，2006)，嵌合可溶性CD95L (Daburon等，2013)或激动性TRAIkRl、TRAIkR2或CD95特异性抗体（Johnstone等，2008; Ogasawara等，1993;化X等，2010)。它们中的一些可增加治疗指数，但从未达到它显著改进 临床结果的程度。
[0004]惊人地，我们发现有可能制备包含TNF超家族的细胞因子的构建体，其中所述细胞 因子被修饰W降低对受体的亲和力，其中所述细胞因子被连接于祀向部分，并且其中所述 构建体具有强烈降低的全身性毒性，并且仅对由祀向部分祀向的细胞显示显著生物活性。 [000引本发明的第一方面是一种构建体，其包含（i)TNF超家族的细胞因子链的S个拷 贝，其中所得细胞因子被修饰(被称为"经修饰的细胞因子"）W使对它的受体的亲和力降 低，（ii)连接子序列和(iii)祀向部分，其中所述连接子序列使细胞因子拷贝连接于所述祀 向部分。如此处所用的构建体可为本领域技术人员已知的任何蛋白质构建体，包括但不限 于经化学修饰的蛋白质、蛋白质复合物和融合蛋白。在一个优选实施方案中，使用个别自我 =聚化细胞因子链，其中一个或多个链可被连接于祀向部分。在另一优选实施方案中，=个 拷贝呈现为单链细胞因子;在一优选实施方案中，拷贝由连接子序列分隔W有助于W=聚 形式呈现细胞因子。对于本领域技术人员明确的是具有一个游离细胞因子链和两个彼此连 接的细胞因子拷贝的混合形式也是可能的。所得=聚细胞因子携带相较于野生型细胞因子 使它的生物活性降低的修饰。所述修饰可为降低正常野生型细胞因子的活性的修饰，或它 可为增加同源性、非内源性TNF家族细胞因子(如但不限于另一物种的不结合人TNF家族细 胞因子受体的TNF家族细胞因子)的活性的修饰。修饰可为本领域技术人员已知的降低或增 加活性的任何修饰，包括但不限于化学和/或酶修饰，如聚乙二醇化和糖基化、融合于其它 蛋白质W及突变。在细胞因子的两个或更多个拷贝被呈现为单链的情况下，可使连接子的 长度适合于扰乱正常=聚结构，从而导致对受体的活性较低。或者，可将特殊氨基酸并入连 接子中W修饰结构;所述氨基酸可进一步被修饰。作为一非限制性实例，可将赖氨酸并入连 接子中W允许达成聚乙二醇化。优选地，所述修饰是突变，甚至更优选地，它是降低细胞因 子对它的受体的亲和力的突变。如此处所用的降低的亲和力和随之发生的降低的生物活性 意指相较于正常结合受体的野生型细胞因子，经修饰的细胞因子具有的生物活性小于野生 型细胞因子的生物活性的70%，甚至更优选小于野生型细胞因子的生物活性的60%，更优 选小于野生型细胞因子的生物活性的50%，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的 40%，更优选小于野生型细胞因子的生物活性的30%，更优选小于野生型细胞因子的生物 活性的20%，最优选小于野生型细胞因子的生物活性的10%。优选地，TNF超家族的经修饰 的细胞因子是TNF超家族的野生型细胞因子的突变体，并且将活性与TNF超家族的野生型细 胞因子进行比较。可通过为本领域技术人员所知的任何方法测量亲和力和/或活性。可通过 Scatchard作图分析和计算机拟合结合数据（例如Scatchard, 1949)，或通过如由Rrecht等 (1993)所述在流通条件下进行反射干设光谱法来测量相较于野生型TNF对受体的亲和力的 突变TNF对受体的亲和力。
[0006]优选地，所述细胞因子选自由FasUTRAIU TNF、CD30L、CD40L、0X40L、RANKL、 T 肥AKL、LTa、L邱、LIGHT、CD2 化、41B化、G 口化、APRIL、EDA、VEG 巧邮AFF组成的组。优选地，所 述细胞因子呈现为单链，其中各链由连接子序列连接。
[0007] 使经修饰的细胞因子连接于祀向部分。如此处所用的"连接"可通过共价结合达 成，或它可通过亲和力结合达成。在一非限制性实例中，所述祀向部分可为对于一种特异性 来说针对祀细胞上的结合位点，W及对于另一特异性来说针对经修饰的细胞因子或融合于 所述细胞因子的标签的双特异性抗体。在另一非限制性实例中，祀向部分可被W化学方式 连接于经修饰的细胞因子，或它可为重组融合蛋白。优选地，所述祀向构建体是重组融合蛋 白。优选地，所述祀向部分使细胞因子祀向肿瘤环境，特别是祀向肿瘤血管系统(例如祀向 肿瘤的内皮细胞，通常是新内皮细胞）。甚至更优选地，祀向部分是可通过结合位点与结合 分子之间的特异性相互作用将融合蛋白向表达TNF超家族的细胞因子的受体，优选是能够 与经修饰的细胞因子相互作用的受体的细胞上的结合位点引导的结合分子。在一个优选实 施方案中，所述结合分子是特异性结合位于细胞的外部上的分子的小化合物。在另一优选 实施方案中，所述结合分子是针对在细胞壁上表达的凝集素（lectin)样分子的糖结构。在 另一优选实施方案中，所述结合分子是祀向肿瘤环境，优选祀向肿瘤血管系统的肤。所述肤 为本领域技术人员所知，并且包括但不限于NGR(祀向在肿瘤血管中表达的CD13亚型）和RGD 肤(化ng等，2011;W02005054293)。优选地，所述肤是祀向Qv抗整联蛋白（integrin)的RGD-4C 肤(Arap等，1998)。在另一优选实施方案中，所述结合分子是包含结合结构域的蛋白质。结 合结构域为本领域技术人员所知。所述结合结构域的非限制性实例是碳水化合物结合结构 域(C抓）（Blake等，2006)、重链抗体化cAb)、单结构域抗体(sdAb)、微抗体(Tramontane)等， 1994)、骆驼科重链抗体的可变结构域（VHH)、新抗原受体的可变结构域(VNAR)、亲和体 (Nygren等，2008)、a体(alphabody) (W02010066740)、设计的错蛋白（ankyrin)重复结构域 (DARPin) (Stumpp等，2008)、抗运载蛋白（antical in) (Skerra等，2008)、打结素化nott in) 化0Imar等，2008)和工程改造的CH2结构域(纳米抗体;Dimitrov，2009)。优选地，所述祀向 部分是纳米抗体。
[0008] 在一优选实施方案中，在重组融合蛋白中，使祀向部分连接于经修饰的细胞因子。 可使祀向部分直接融合于突变细胞因子，或它可借助于连接子片段进行融合。优选地，所述 连接子是GGS连接子。甚至更优选地，所述连接子由至少5个GGS重复，更优选至少10个GGS重 复，更优选至少15个GGS重复组成，更优选地，所述连接子是由17-23个GGS重复组成的连接 子，最优选地，所述连接子由20个GGS重复组成。祀向部分可被融合在突变细胞因子的氨基 末端或簇基末端;优选地，所述祀向部分被融合在突变细胞因子分子的氨基末端。除突变细 胞因子和祀向部分之外，构建体可进一步包含其它结构域，如但不限于标签序列、信号序 列、另一细胞因子或抗体。
[0009] 优选地，祀向部分针对选自由W下组成的组的祀标:CD20、CD33、CD47、CD70、PSCA、 PSMA、Her2、c-Met、EGFR、Axl、腫生蛋白C、av03整联蛋白、纤连蛋白（f ibronectirOEDA末端 EDB结构域、III型纤连蛋白（FNIII)重复(Al-D)、腫生蛋白-C和CD13及其肿瘤细胞特异性剪 接变体。当祀向部分祀向肿瘤血管系统时，具体来说，设想的祀标包括但不限于CD13、av抗整 联蛋白、纤连蛋白邸A末端邸B结构域、III型纤连蛋白（FNIII)重复(Al-D)和腫生蛋白-C。根 据替代性特定实施方案，所述祀向部分针对CD20。特别设想的是祀向部分是抗体(或纳米抗 体），因为针对运些祀标的抗体可易于获得和/或可易于产生。
[0010] 细胞因子链中的突变可为本领域技术人员已知的任何突变，如缺失、插入或点突 变。至少一个链具有至少一种突变;然而，若干种突变可被组合在一个链中。=个链可携带 相同突变或不同突变。优选地，所述突变使细胞因子对它的受体或它的一种受体的亲和力 降低。优选地，所述突变是点突变。
[0011] 在一个优选实施方案中，细胞因子是TNF，并且使构建体祀向在TNFRl和/或TNFR2 表达细胞上表达的标志物。在另一优选实施方案中，所述标志物是组织特异性标志物，甚至 更优选地，所述标志物是新血管系统组织或癌组织特异性标志物。最优选地，所述标志物选 自由〔020、化^、(3-]\161、66尸1?、腫生蛋白(：、曰麻整联蛋白和〔013组成的组。
[0012] 优选地，经修饰的细胞因子是突变TNF，其中突变选自由在位置R32、N34、Q67、H73、 1^75^77、586、￥87、￥91、197、1'105、口106、4109、口113、￥115、6127、化37、0143、4145上的突变 组成的组。甚至更优选地，所述突变选自由TNF R32G、N34G、Q67G、H73G、L75G、L75A、L75S、 T77A、S86G、Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F、V91G、V91A、I97A、I97Q、I97S、T105G、P106G、A109Y、 P113G、Y115G、Y115A、E127G、N137G、D143N、A145G和A145T组成的组。甚至更优选地，所述突 变选自由Y87X、I97X和Y115X组成的组。 最优选地，所述突变选自由TNF Y87Q、Y87F、I97A、 I97S、Y115A 和 Y115G(根据人 TNF 序列（genbank 登记号 BAG70306,版本 BAG70306.1GI: 197692685)进行编号)组成的组。突变可存在于S聚TNF的一个、两个或全部S个拷贝中。S 聚构建体内的不同拷贝可携带不同突变;若干突变可被组合在一个或多个链中。除所述的 突变之外，其它突变也可存在于一个或多个链中。
[0013] TRAIL 中优选用于突变的区域是 T127-R132、E144-R149、E155-H161、Y189-Y209、 1214-1220、1(224-4226、胖231、6236-1^239、6249-1(251^261-肥64和肥70-6271(基于人序列 (genbank登记号NP_003801，版本NP_003801.1，GI :4507593)进行编号）。
[0014] 本发明的另一方面是一种用作药剂的根据本发明的融合蛋白。在一个优选实施方 案中，根据本发明的融合蛋白用于治疗癌症。
[0015] 运与陈述提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用如本 文所述的融合蛋白等效。癌症由此得W治疗。运可例如如实施例中所示通过评估肿瘤大小 加 W评估(也参见图16)。
[0016] 适于治疗的受试者通常是哺乳动物，最通常是人。然而，本文也设想治疗非人动 物。可被治疗的非人动物的实例包括但不限于马、牛、绵羊、猪、山羊、猫、狗和其它驯养动 物。如果非人动物被设想用于治疗，那么特别设想的是经修饰的细胞因子来自待治疗的物 种。那么通过突变达成的修饰是对相较于人序列的同源位置中的残基的修饰。非限制性地 举例来说，如实施例章节中所示，在小鼠 TNF中，作为人TNF中的Y87的同源物的残基在位置 86处(Y86)。运可如上所详述加 W突变(例如Y86F或Y86Q)。
[0017] 可使用运个策略治疗不同形式的癌症。基本上，可用祀向部分祀向（直接或通过肿 瘤环境间接），由此再活化经修饰的TNF家族细胞因子，W及因此诱导肿瘤细胞死亡的任何 肿瘤都适于治疗。
[0018] 因此，特别设想的癌症是可易于祀向的那些。根据特定实施方案，祀向针对肿瘤血 管系统。因此，高度血管化肿瘤是特别设想的。所述肿瘤的实例是可用抗血管生成方法，如 抗VEGF药物或抗促血管生成素/Tie2药剂治疗的那些。运些包括但不限于乳腺癌、肾细胞 癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌、膜腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、胃癌、前 列腺癌、黑素瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、神经内分泌肿瘤、软组织肉瘤、骨髓甲状腺癌和子宫 内膜癌(参见例如Welti等，2013,特别是其中表1和补充表1)。
[0019] 根据特定实施方案，癌症是实体肿瘤。然而，应注意如白血病(例如CMUAML)、多发 性骨髓瘤和淋己瘤的血液癌症也可用抗血管生成剂治疗（Schmidt和Carmeliet ,2011; Roccaro等，2006)。因此，根据替代性实施方案，癌症是造血和/或淋己组织的肿瘤(也参见 实施例12)。
[0020] 因为血管生成在肿瘤转移中W及在活化转移性病变（Iestion)方面起主要作用， 所W根据特定实施方案，癌症是转移性癌症。新内皮细胞的存在增加将使得运些癌症对祀 向运些细胞的标志物(上述肿瘤血管系统标志物)的分子更敏感。
[0021 ] 附图简述
[0022] 图1:不同设置的SC hTNF-纳米抗体融合蛋白的结构元件的表示。
[0023] 图2:相较于WT hTNF,对于HekT细胞（图A)或Hek-mLR细胞（图B)，由指示的SC hTNF 制剂诱导的巧光虫巧光素酶活性。两者均用NF-KB巧光素酶报告基因短暂转染。
[0024] 图3:对于HekT细胞（图A)或胎k-mLR细胞（图B)，由指示的携带具有6个GGS重复的 连接子的SC hTNF制剂诱导的巧光虫巧光素酶活性。两者均用NF-KB巧光素酶报告基因短暂 转染。
[002引图4:对于HekT细胞（图A)或Hek-血R细胞（图B)，由指示的携带具有13个GGS重复的 连接子的SC hTNF制剂诱导的巧光虫巧光素酶活性。两者均用NF-KB巧光素酶报告基因短暂 转染。
[0026] 图5:对于HekT细胞（图A)或Hek-血R细胞（图B)，由指示的携带具有19个GGS重复的 连接子的SC hTNF制剂诱导的巧光虫巧光素酶活性。两者均用NF-KB巧光素酶报告基因短暂 转染。
[0027] 图6:相较于未处理细胞和用化r2纳米抗体刺激的细胞中的水平，在用50化g/ml的 指示的SC hTNF制剂处理SK-BR-3细胞后对IL-SmRNA水平的诱导倍数。数据代表2次独立实 验的平均值±SD(n = 4)。
[002引图7:hTNF突变体相较于WT hTNF的活性％，如通过对MCF7细胞(乳腺癌细胞系）的 毒性所度量。
[0029] 图8:偶联于mLR NB的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的C末端）对MCF7(图A)或MCF7-mLR(图B)细胞的毒性。
[0030] 图9偶联于hCD20NB的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的C末端）对MCF7(图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
[0031 ] 图10:偶联于hCD20或对照BcIIIONB的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7 (图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
[0032] 图11:含有具有组合突变的SC hTNF的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7 (图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
[0033] 图12:个别S聚化链偶联于mLR NB的祀向经修饰的TNF (NB在TNF的C末端)对MCF7 (图A)或MCF7-mLR (图B)细胞的毒性。
[0034] 图13:个别S聚化链偶联于hCD20NB的祀向经修饰的TNF(NB在TNF的N末端)对MCF7 (图A)或MCF7-hCD20(图B)细胞的毒性。
[003引图14:WThTNF相对于偶联于hCD20或对照BcII10NB的祀向WT和经修饰的schTNF (NB在TNF的N末端)的体内毒性比较。(A)低体溫症(B)致命性。
[0036] 图15:偶联于对照BcIIIONB的WT或经修饰的(Y86F3X)sc小鼠（m)TNF(NB在TNF的N 末端)的体内毒性。(A)低体溫症(B)致命性。
[0037] 图16:偶联于mCD20或对照BcII10NB的WT或经修饰的（Y86F3X)sc小鼠（m)TNF(NB 在TNF的N末端)的体内抗肿瘤作用。(A)肿瘤生长(B)致命性。 实施例
[0038] 实施例的材料和方法
[0039] 纳米抗体
[0040] 针对鼠类瘦素（Ieptin)受体(mLR)的纳米抗体4-10描述于Zabeau等（2012)中。将 它的编码序列与SIgK前导肤、HA标签和白蛋白融合克隆至哺乳动物表达载体PMET7中 (hkebe等，1988)。质粒名称：pMET7 SI化-HA-4.il-白蛋白。抗Her2纳米抗体1R59B描述于 Vane^ycken等（2011)中。使用标准技术产生针对人CD20化CD20)的NB 2HCD25和针对小鼠 CD20(mCD20)的2MC57NB((?aro址di等，1997;化rdon等，2014)。对照NBBcII10描述于De Groeve 等(2010)中。
[0041] scTNF
[00叫由通过GGGGS连接子（SEQ ID NO: 1)偶联的S个hTNF单体组成的scTNF已由 803证6的等(2010)描述。显示hTNF中的Y87Q突变会完全消除与两种受体TNF-R巧日TNF-R2的 结合。使197突变导致hTNF与两种受体的结合降低化oetscher等，1993)。使hTNF内的整个范 围的残基突变（Quik化ange定点诱变试剂盒，S化atagene目录号200518)，并且测试它们对 MCF7细胞的毒性作用（图7)。我们选择W下突变供祀向构建体使用:Y87Q、Y87F、I97S、I97A、 Y115A、Y115G。通过基因合成（GeneAd)产生SC hTNF WT-6XGGS、sc hTNF Y87Q3X-6 X GGS、sc hTNF I97A3X-6XGGS、sc hTNF Y87QlXI97A2X-6XGGS、sc hTNF Y87Q2XI97A1 X-6XGGS、sc hTNF WTlXY87Q2X-6XGGS、sc hTNF WT2XY87QlX-6XGGS、sc hTNF I97S3X-6XGGS、sc hTNF Y115A3X-6XGGS、sc hTNF Y87F3X、sc hTNF Y115G3X、sc mTNFWT和scmTNFY86F3X的编码序列。个别链由GGGGS(沈QIDN0:l)连接子分隔。
[0043] scTNF-纳米抗体融合构建
[0044] 通过PCR，用W下引物从质粒P皿N6-1R59B合成1R59B化r2纳米抗体的编码序列： 正向 5 ' -GTCAAGATCTGGCGGTTCGGCGGCCGCAATGGCCCAGGTGCAGCTGCAG-3 '（沈Q ID NO: 2)，反向 5 '-CAGTTCTAGATTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCGAACCGCCGTCCGGAGAGGAGACGGTGAC-3 '（SEQ ID N0:3)。运种PCR在1R59B纳米抗体的氨基末端将GGS引入在BglII与NotI位点之间，并且 在簇基末端引入FLAG标签。PCR产物用Bg 1II和Xbar消化。pMK-RQ-sC hTNF WT、pMK-RQ-sC hTNF Y87Q3X和pMK-RQ-sc hTNF I97A3X用NdeI和Bgin消化。将消化的PCR产物和合成基 因片段克隆至NdeI-Xbar消化的PMET7 SIgK-HA-瘦素载体中W获得PMET7 SIgK-HA-SC hTNF WT-6XGGS-lR59B-FLAG、pMET7 SI 化-HA-SC hTNF Y87Q3X-6XGGS-1R59B-FLAG和 pMET7 SI巧-HA-SC hTNF I97A3X-6XGGS-1R59B-FLAG。通过在BglII与XbaI之间插入含有 GGS和FLAG标签的W下退火的寡聚物而非PCR产物来获得无1R59B纳米抗体的对照载体:正 向：
[0045] 5 ' GATCTGGCGGTTCGGCGGCCGCAGATTACAAGGATGACGACGATAAGTAAT3 '（沈Q ID NO:4)， 反向：5'CTAGATTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTGCGGCCGCCGAACCGCCA3'（SEQ ID N0:5)。通 过插入W下退火的寡聚物而非NdeI-SC hTNF-Bglll片段来获得仅具有1R59B纳米抗体的对 照载体：正向：5'-TATGATGTGCCCGACTACGCTGGCGGCAGCA-3'（SEQ ID N0:6)，反向5'-6八1'別6押6〇1；〇：46〔61461'〔666〔4〔41'〔4-3'（569 10^:7)。通过在8邑1門与齡《位点之间向 原始6 X GGS添加7 X GGS或13 X GGS重复（由基因合成(GeneArt)制备)来将GGS连接子的长度 调整为具有13个重复和19个重复的GGS连接子。
[0046] 类似方法用于获得pMET7 SI巧-HA-SC hTNF WT-6X/13X/19XGGS-4.10-FLAG、 pMET7 SIgK-HA-SC hTNF Y87Q3X-6XGGS-4.10-FLAG、pMET7 SI^-HA-schTNFI97A3X-6X/13X/19XGGS-4.10-njVG、pMET7SIgK-HA-schTNFY87QlXI97A2X-6X/13X/19X GGS-4.10-njVG、pMET7SIgK-HA-schTNFY87Q2XI97AlX-6X/13X/19XGGS-4.10-FLAG、pMET7 SIgK-HA-SC hTNF WT-6X/13X/19XGGS-2HCD25-FLAG、pMET7 SIgK-HA-SC hTNF I97S3X-6X/13X/19XGGS-2HCD25-FLAG、pMET7 SI化-HA-SC hTNF I97A3X-6X/ 13X/19XGGS-2HCD25-FLAG和pMET7SIgK-HA-schTNFY115A3X-6X/13X/19XGGS-2 肥 D25-化 AG。
[0047] 为获得个别S聚化hTNF构建体，pMet7-SI巧-HA-SC hTNF WT-GGS-4.10-Flag中的 SC hTNF用 W正向引物5 ' -CATATGATGTGCCCGACTACGCTGGCGGCAGCAGCTCTAGAACCCCCAGCGATAA GCCTGTG-3'（沈Q ID N0:8)和反向引物5'-GTCGACCAGGGCAATGATGCCGAAGT-3'（SEQ ID NO: 9)于质粒pMet7-SI巧-His-hTNF WT或pMet7-SI巧-His-hTNF I97A上获得的PCR产物的 NdeI-Sair消化物替换。运产生W下载体：pMet7-SIgK-HA-hTNF WT-6XGGS-4. IO-Flag和 pMet7-SI巧-HA-hTNF I97A-6XGGS-4.10-Flag。
[0048] 在pMet7中制备在个别S聚化或单链人或小鼠 TNF的N末端具有NB的纳米抗体-TNF 融合物表达构建体，并且设计成使得各亚单位可通过独特限制位点互换:AgeI-纳米抗体-Sa 11-GGS连接子-No 11 -TNF-Xho I -Hi S -甜a I。
[0049] P化3-(IL6-kB)3-巧光虫巧光素酶由W.Vanden Berghe(Vanden Berghe等，1998) 友情提供。
[0050] 产生用于体外研究的纳米抗体-TNF融合蛋白
[0051] 使用标准憐酸巧沉淀方法，用蛋白质融合构建体转染化kT细胞。在转染之后48小 时，收集培养基并储存在-20°C下。用商业hTNF ELISA(DY210，R1D systems)测定浓度。
[0052] 产生用于体内研究的纳米抗体-scTNF融合蛋白
[0053] 根据制造商指南，使用阳Ipro?转染试剂(PolyPlus，目录号115-375)用蛋白质融 合构建体转染FreeStyle?293-F细胞。所有制剂中的内毒素含量都低于检测限，如通过显色 整阿米己状细胞溶解产物测定化imulus Ameboc}fte Lysate AssayKLonza,目录号50-647U)所评估。
[0054] 细胞系
[005 引 使化4、化41\胎4-11111?、]\0^7、]\0^7-11〔020、]\?：巧-1111巧邮16816-111〔020细胞在补充有 10%FCS的DMEM中生长。FreeStyle?293-F细胞系从Invitrogen,Life Technologies(目录 号R790-07)获得，并且维持在来自Gibco，Life I'echnologies的FreeStyle?293表达培养基 (目录号12338)中。人乳腺癌SK-BR-3(ATCC:HTB-30)细胞系从ATCC获得，并且维持在补充有 10%FCS的麦考伊氏5A培养基(McCoy'S 5A medium)中。
[0056] 如下产生化k-mLR细胞系：用含有用于获得mEcoR和新霉素抗性的表达盒的质粒W 及用pXP2d2-rPAPl-luci报告基因构建体共同稳定转染Flp-In-293细胞（Invitrogen) 化yckerman等2001)。在含有G418(400ug/ml)的培养基中分离稳定转染的克隆，并且选择具 有高LIF(lng/ml)诱导的巧光素酶活性的克隆。使用Flp-In重组酶反应（Invitrogen) W及 在潮霉素（lOOμg/ml)上选择10天之后，将含有mLR的表达载体PCDNA5/FRT稳定整合在运个 细胞系中。
[0057] 人乳腺癌MCF7 (ATCC: HTB-22)细胞系从ATCC获得。如下产生MCF7-hCD20和MCF7-mLR细胞系：用含有用于获得hCD20或mLR的表达盒的质粒W及用含有新霉素抗性基因的质 粒共同稳定转染MCF7细胞。用含有G418( Img/ml)的培养基选择稳定转染的细胞，随后对 hCD20或mLR表达细胞进行FACS分选。
[0058] 如下产生B16B16-mCD20细胞系：用含有用于获得mCD20的表达盒的质粒W及用含 有新霉素抗性基因的质粒共同稳定转染B16B16细胞。用含有G418(2mg/ml)的培养基选择稳 定转染的细胞。
[0059] 人乳腺癌SK-BR-3(ATCC:HTB-30)细胞系从ATCC获得，并且维持在补充有10%FCS 的麦考伊氏5A培养基中。
[0060] 巧光素酶活性的测量
[0061] 通过定量受控于NF-KB启动子的巧光素酶活性来测量TNF特异性活性。在通过标准 憐酸巧沉淀方法转染NF-KB巧光素酶报告基因（P化3-(IL6-kB)3-巧光虫巧光素酶)之后两 天，用祀向或对照SC hTNF刺激细胞6小时。制备溶解产物(溶解缓冲液:25mM化is(pH7.8)、 2mM抓TA、2mM二硫苏糖醇、10%甘油、1 %曲通(Triton)X-IOO)，并且每50iU溶解产物添加 35山巧光素酶底物缓冲液(20ml巨(径甲基）甲基甘氨酸(Tricine)、1.07mM(MgC03)4Mg(0H) 2 ? 5H20、2.67mM MgS04 ? 7肥0、0.1mM EDTA、33.3mM二硫苏糖醇、270yM辅酶A、470yM虫巧光 素、530iiM ATP，最终抑7.8)。在TopCount化学发光计数器(Packard)中测量光发射5秒。
[0062] 定量 RT-PCR
[0063] 通过RT-PCR相对于HPRT定量用500ng/ml祀向或对照SC hTNF处理6小时的SK-BR-3 细胞中的TNF诱导性基因化-6的表达。用RNeasy柱（Qiagen)纯化总RNA，并且等量RNA(0.5y g)用于遵循制造商说明书，使用Primescript RT试剂盒(Takara Bio,Siiga,Japan)进行逆 转录。添加10倍稀释的cDNA至含有IX SYBR Green I主混合物（04 887 352 OOl ,Roche)和 InM基因特异性引物的RT-QPCR混合物中。在Li曲t切Cler 480实时PCR系统热循环仪(Roche Applied Science)上一式S份进行测定，并且使用A A CT方法分析结果。使用W下引物：
[006引对MC巧细胞的毒性分析
[0069] 也通过评估对MCF7细胞的细胞毒性来测量TNF特异性活性。将1000个细胞涂铺在 黑色96孔板中，并且24小时后用不同TNF构建体刺激。在48-72小时之后，根据制造商指南， 使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(Promega目录号G7570)测定活细胞的数目。
[0070] 体内毒性分析
[0071] 为体内评估hTNF毒性，用500ng rhTNF或SC hTNF-纳米抗体融合蛋白与IOmg D-半 乳糖胺组合(于无 LPS PBS中稀释，W50化1的体积注射)腹膜内注射雌性8周龄巧7BL/6J小 鼠（购自化arles River,化ance)。通过测量外周(直肠)体溫来监测致病性。n =每种融合蛋 白 2-4。
[0072] 为评估体内mTNF毒性，用10、35、100或20化g SC mTNF-纳米抗体融合蛋白（注射体 积20化1，于无 LPS PBS中稀释)静脉内注射小鼠。通过测量外周(直肠)体溫来监测致病性。n =每种融合蛋白每种剂量2，例外之处是20化g(n = 1)。
[007引体内抗肿瘤研究
[0074] 将8周龄的雌性巧7BL/6J小鼠剌毛，并且用6X105个B16B16-mCD20肿瘤细胞在背 部皮下接种(第0天）。当最大垂直直径的乘积是约50mm2时（在第10天)开始处理。通过在病 变旁边注射(在肿瘤部位附近但在肿瘤结节外部皮下注射)来连续8天(第10-17天，W灰色 棒条指示在图16A中）施用PBS或35yg纳米抗体-SC mTNF融合蛋白。用测径规每日测量肿瘤， 并且示出为平均值±SEM。通过每日测量体重和体溫来监测致病性。n =每种治疗5。
[007引实施例1: SC hTNF-纳米抗体融合蛋白
[0076]图1显示在SC hTNF的N末端或C末端具有纳米抗体的SC hTNF-纳米抗体融合蛋白 的图示。
[0077] 实施例2:对mLR表达Hek细胞的祀向TNF活性
[007引测试化kT细胞中W及表达鼠类瘦素受体的化k细胞化ek-mLR)中在TNF刺激后对 NF-KB巧光素酶报告基因活性的诱导。如图2A中所示，WT SC hTNF诱导的NF-KB诱导作用因 Y87Q3 X或I97A3 X突变而分别被完全(>1000倍)或部分(100倍)消除。此外，在不表达mLR的 化kT细胞中，所有SC hTNF构建体(WT、Y87Q3 X和I97A3 X )都独立于与mLR纳米抗体的融合 来诱导类似NF-KB活性（图2A)。相反，偶联于mLR纳米抗体能够在与WT SC hTNF类似的程度 上恢复表达mLR的化k细胞中SC hTNF I97A3 X的NF-KB诱导作用（图2B)。我们估计表达mLR 的细胞比亲本化kT细胞对纳米抗体偶联的SC hTNF I97A3 X敏感100倍。相反，相较于化kT 细胞，在化k-mLR细胞中，S重Y87Q突变不显示对TNF应答性的任何挽救作用（图2B)。
[0079] 实施例3:不同突变组合和不同连接子长度的比较
[0080] 为优化构建体，测试在个别链中具有不同突变的SC hTNF构建体W及SC hTNF与祀 向部分之间的不同连接子长度。结果概述于图3、4和5中。SC hTNFI97A3X和SC hTNF Y87Q1 X I97A2 X不显示对不表达瘦素受体的化k细胞的活性，但在祀向瘦素受体时具有明确剂量 依赖性活性。
[0081 ] 实施例4:对表达化r2的化k细胞的祀向TNF活性
[008引我们使用a-Her2纳米抗体 1R59B和SC hTNF WT、sc hTNF Y87Q3X 或SC hTNF I97A3 X产生融合蛋白。纳米抗体与SC hTNF之间的连接子是6 X GGS或19 XGGS。测试运些分 子对过度表达化r2的SK-BR-3乳腺癌细胞系的IL-6TNF诱导性基因的诱导作用，如通过定量 RT-PCR相对于HPRT所测定。
[0083] 图6显示相较于未处理细胞和用化r2纳米抗体刺激的细胞中的IL-SmRNA水平，在 SC hTNF处理（500ng/ml)后对化-6mRNA的诱导倍数。与对NF-KB的转录活化相对应，我们观 察到Y87Q3X突变完全阻止TNF诱导的IL-6产生，而SC hTNF I97A3X可仍然诱导IL-6产生， 但程度小于WT SC hTNF。当使SC hTNF融合于纳米抗体时，产生较少化-6mRNA。运可归因于 空间位阻，因为相较于其中存在可能更大可晓性的较长19XGGS连接子，在6XGGS连接子的 情况下的影响更显著。通过使SC hTNF I97A3X偶联于化r2纳米抗体，可在与WT SC hTNF通 过相应连接子偶联于纳米抗体类似的程度上恢复对IL-6的诱导作用。相反，使更重度Y87Q3 Xsc hTNF突变体特异性祀向化r2表达细胞不能恢复SC hTNF的IL-6诱导性质。
[0084] 实施例5:比较hTNF突变体对MC巧细胞的毒性
[008引由于I97A3X突变SC hTNF具有相对较高残余活性，所W我们通过将不同个别S聚 化hTNF突变体的毒性测量为MCF7细胞中的巧光素酶活性来捜索其它突变。突变体相对于WT 个别立聚化TNF的活性显示于图7中。大多数突变不显著影响TN巧舌性(〉1%的WT)，并且由于 它们的可能剩余实质性毒性而可能具有较小前途用于开发祀向构建体。我们更关注于(几 乎)完全消除TNF功能的突变。使用无效突变(<0，1 %的WT)会产生不具有副作用，但具有在 祀向后的再活化较不易于实现作为可能缺点的祀向构建体。具有一定残余活性(0,02-5% 的WT，特别是的WT)的突变具有更好机会被再活化，同时不具有毒性。选择6种涵 盖在0,02与5%的个别S聚化WT TNF之间的活性范围的不同突变用于开发祀向修饰的细胞 因子:￥879(0,02%)、1975和￥1154(0,2%)、￥87尸(0,5-1%)、￥1156(1-2%)和1974(2-5%)。
[0086] 实施例6:对表达mLR的MCF7细胞的祀向TNF活性
[0087] 评估mLR NB祀向TNF对MCF7和MCF7-mLR细胞的毒性。测试不同突变（I97A3X、 I97S3X 和Y115A3X)W 及SC hTNF 与 mLR NB 之间的不同连接子（6XGGS、13XGGS、19X GGS)。如图8A中所示，毒性因 I97A3X突变而降低20倍，并且因 I97S3X和Y115A3X突变而降 低500倍，运类似于我们对于个别立聚化TNF所观察到的结果（图7)。此外，在不表达mLR的 MCF7细胞中，与mLR NB融合不改变WT或突变SC hTNF的活性（图8A)，而对于MCF7-mLR细胞， 运种融合再活化所有SC hTNF突变体（图8B)。我们估计表达mLR的细胞比亲本MC巧细胞对NB 偶联的I97S3 X和Y115A3 X SC hTNF敏感100倍。然而，运些祀向经修饰的TNF的活性仍然比 WT SC hTNF小约20倍。相反，对于MCF7-mLR细胞，I97A3X祀向经修饰的TNF被恢复至WT活性 水平，此对应于20倍再活化(图8B)。
[008引实施例7:对表达hCD20的MCF7细胞的祀向TNF活性
[0089] 为评估其它祀向部分用于达成经修饰的TNF的祀向的作用，我们用hCD20NB替换实 施例6的构建体中的mLR NB,并且测试它们对MCF7细胞和表达hCD20的MCF7细胞(MCF7-hCD20)的毒性。结果显示于图9中。如所预期，mLR NB和hCD20NB祀向经修饰的TNF对亲本 MCF7细胞的行为类似(图8A和9A)。
[0090] 实施例8:在不同hCD20NB融合物设置的情况下对hCD20表达细胞的祀向TNF活性。
[0091] 我们试图通过将NB放置在S C hTNF之前而非在其之后来改进hCD20NB-TNF构建体。 我们也测试巧巾显著性较小的其它突变(Y87F3 X和Yl 15G3 X，图7)。用运些构建体进行的 MCF7和MCF7-hCD20毒性研究显示于图10中。偶联于hCD20NB的Sc hTNF与偶联于对照 BcIIIONB的相应突变体对MCF7细胞施加相同毒性（图10A)，并且活性水平类似于我们对于 个别S聚化TNF突变体所观察到的结果（图7)。对于MCF7-hCD20细胞，突变体的运个毒性降 低在hCD20祀向后得W(部分)复原:相较于相应BcIIlO对照NB偶联的SC hTNF，hCD20NB偶联 的经修饰TNF获得活性增加10倍(Y115G3 X )、15倍(Y87F3 X )、100倍（I97S3 X、Y115A3 X )或 甚至更高(Y87Q3 X )(图10B)。在运个实验中，当将hCD20NB放置在SC hTNF的簇基末端而非 氨基末端时，再活化较小（图9B)。
[0092] 实施例9:不同突变组合的比较
[0093] 尽管存在祀向经修饰的TNF相对于非祀向经修饰的TNF的差异是至少100倍的事 实，但一些突变显示低于WT活性水平的挽救活性(Y87Q3X)，此可能影响它的抗肿瘤作用。 或者，一些突变仍然具有一定残余活性(I97S3X和Y115A3X)，此在体内使用时可能导致一 定(全身性)毒性。为克服运些潜在缺点，我们通过使SC hTNF的个别链中的不同残基突变来 测试其它构建体W观察活性水平是否可因此被进一步调节。如图11中所示，在单链中组合 不同突变可改变对非祀向细胞的残余活性W及在祀向后的再活化水平。
[0094] 实施例10:祀向个别S聚化TNF相对于单链经修饰的hTNF的比较。
[0095] 为比较祀向个别S聚化TNF相对于单链TNF的效率，使WT或I97A hTNF在C末端与 mLR NB偶联成单体。测试它们对MCF7细胞W及对表达mLR的MCF7细胞(MCF7-mLR)的毒性，并 且显示于图12中。此外，在个别S聚化形式中，I97A突变对MC巧细胞具有毒性，但程度小于 WT hTNF(图8A和图12A)。此外，当在C末端偶联于mLR纳米抗体时，个别S聚化而非单链TNF 对MCF7细胞的毒性变得较小，并且运对于WT和I97A两者均是运样（图8A和图12A)。最可能的 是用个别S聚化TNF-mLR NB构建体形成的hTNFS聚体中存在的3个纳米抗体在空间上阻碍 hTNF结合它的受体。然而，运种活性降低可通过祀向MCF7-mLR细胞上的mLR来复原（图12B)。 引起关注的是，运提供进一步程度的活性调节：可组合不同突变W及使用空间位阻来影响 残余活性和在祀向后的再活化水平。
[0096] 为阐明运是否是一种一般性现象，我们使个别S聚化WT和Y115A hTNF在N末端偶 联于BcII10或hCD20纳米抗体，并且测试它们对MCF7和MCF7-hCD20细胞的毒性。如图13A中 所示，运种偶联不影响个别立聚化WT或Y115A3XhTNF的毒性。此外，在祀向后，个别立聚化 Yl 15A3 X hTNF变得如同非祀向个别S聚化WT hTNF-样具有活性(图13B)。
[0097] 实施例11:评估祀向经修饰的hTNF的体内毒性
[0098] 为评估hTNF突变体的毒性在临床前不明显，因为TNF在小鼠中显示显著物种特异 性。不同于mTNF，hTNF仅在极高剂量下诱导致死性(Brouckaert等1992)。尽管运个物种特异 性的原因长久被认为由hTNF不与鼠类TNF-R2相互作用引起，但药物代谢动力学研究已显示 在小鼠中hTNF比mTNF被快得多地清除，并且随之发生的有限hTNF暴露导致它缺乏致病性 (Ameloot等2002)。
[0099] 然而，当用如D-半乳糖胺的致敏剂处理时，物种特异性被消除，并且极低剂量（< 500ng)的hTNF与mTNF具有同等致死性(Broeckaert等，1992)。为评估各种祀向经修饰的 hTNF的体内毒性，我们因此用500ng的重组(r化TNF、sc hTNF WT或SC突变hTNF(Y87Q3X或 Y115A3X)腹膜内注射小鼠。使SC WT和经修饰的hTNF在N末端偶联于BcIIlO或hCD20NB。如 图14中所示，SC WT hTNF至少如同riiTNF-样具有毒性，从而在注射之后10小时内导致重度 低体溫症和致命性。祀向经修饰的hTNF Y87Q3X和Y115A3X不导致任何致病性征象(竖毛、 震颤、嗜睡、理毛行为丧失或体溫下降;对于后者，参见图14A)。
[0100] 实施例12:评估祀向经修饰的mTNF的体内毒性和抗肿瘤作用。
[0101] 如已提及，不能容易地在小鼠中研究hTNF的体内毒性。因此W及由于预期在免疫 活性同基因小鼠中进行抗肿瘤实验，所W我们决定使mTNF的与我们对于hTNF选择的残基同 源的残基突变（参见实施例5)。如图15中所说明，当W低至IOiig的剂量静脉内注射时， BcIIlONB-sc mTNF WT导致重度致病性（图15A)和100%致命性（图15B)。相反，BcIIlONB-sc mTNFY86F3X不诱导致命性（图15B)，也不导致任何毒性征象(竖毛、震颤、嗜睡、理毛行为丧 失或体温下降；对于后者，参见图15A)，甚至当W200tig的静脉内团注形式注射时也不。然 而，当^35]ig的剂量每日在病变旁边注射于携带B16B16-mCD20肿瘤的小赢中时，纳米抗体 偶联的SC mTNFY86F3X可仍然降化/阻止肿瘤生长，尤其当靴向mCD20时（图16A)。非靴向突 变TNF对肿瘤生长的作用（图16A)归因于所用高剂量(35tig)，因为较化剂量更接近类似于 PBS处理的动物(数据未显示）。每日用NB-SC mTNF Y86F3X处理未导致任何致病性或致命 性征象，而用NB-SC mTNF WT处理的携带肿瘤的小赢在1或2次注射之后死亡（图16B)。
[0102] 参考文献
[0103] -Ameloot，P.,Takahashi N.，Everaerdt，B.,Hostens，J.，Eugster，H.P.，Fiers， W.,and Brouckaert，P.(2002).Bioavailability of recombinant tumor necrosis factor determines its lethality in mice.Eur J Immunol，32,2759-65.
[0104] -Arap，W.,Pasqualini，R.and Ruoslahti，E?51998)?Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model.Science,279,377-380.
[0105] -Ashkenazi，A.feHerbst，民.S.To kill a tumor cell：the potential of proapoptotic receptor agonists.J Clin Invest 118,1979-1990(2008).
[0106] -Blake，A.W.，McCartney，L.,Flint，J.，Bolam，D.N.，Boraston，A.B.,Gilbert， H.J.and Knox ,J.P.(2006)Understanding the biological rationale for the diversity of cellulose-directed carbohydrate-binding molecules in prokaryotic enzymes.J.Biol.Qiem.281,29321-29329.
[0107] -Boschert，V.et al.Single chain TNF derivatives with individually mutated receptor binding sites reveal differential stoichiometry of ligand receptor complex formation for TNFRl and TNFR2.Cell Signal 22,1088-1096 (2010).
[0108] -Brecht et al.,Peptide immobilization and characterization of binding specificity.! Biol Chem 268:15425-15434
[0109] -Brouckaert'P.，Libert，C.，Everaerdt，B.and Fiers W(1992).Selective species specificity of tumor necrosis factor for toxicity in the mouse.Lymphokine Cytokine 民es，11，193-6.
[0110] -Brown,K.C.(2010).Peptidic tumor targeting agents；the road from phagfe display selections to clinical applications .Curr.Pharm.Des.16，1040-1054.
[0111] -Daburon，S.et al.Functional characterization of a chimeric soluble Fas ligand polymer with in vivo anti-tumor activity.PLoS One 8，e54000(2013).
[0112] -de Bruyn，M.，Bremer，E.&Helfrich，W.Antibody-based fusion proteins to target death receptors in cancer.Cancer Lett 332，175-183(2013).
[0113] -Dimitrov'D.S.(2009)Engineered CH2 domains(nanoantibodies).mAbs I，26-28.
[0114] -Eyckerman，S.,Waelput，W.，Verhee，A.,Broekaert，D.，Vandekerckhove，J.，and Tavernier,J.(1999).Eur.Cytok.Netw?10,549-559.
[0115] -Falschlehner，C.，Ganten，T.M.，Koschny，R.,Schaefer，U.&Walczak，H.TRAIL and other T民AIL receptor agonists as novel cancer therapeutics.Adv Exp Med Biol 647,195-206(2009).
[0116] -Fox，N.L.,Humphreys，民.，Luster，T.A.,Klein，J.&Gallant，G.Tumor Necrosis Factor-related apoptosis-inducing Iigand(TRAIL)Receptor-I and 民eceptor-2 agonists for cancer therapy.Expert Opin Biol Ther 10，1-18(2010).
[0117] -Galle'P.R.et al?Involvement of the CD95(AP〇-1/Fas)receptor and ligand in liver damage.J E邱 Med 182,1223-1230(1995)?
[0118] -Gaur，U.feAggarwal，B.B.民egulation of proliferation , survival and apoptosis by members of the TNF superfamily.Biochem Pharmacol 66,1403-1408 (2003).
[0119] -加 ahroudi A.M.，Desm^er，A.，Wyns，L. ,Hamers，R. ,Muyldermans，S. (1997) .Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.FEBS Lett.414,521-6
[0120] -Gregorc'V.et al.Phase lb study of NGR-hTNF，a selective vascular targeting agent,administered at low doses in combination with doxorubicin to patients with advanced solid tumours.Br J Cancer 101,219-224(2009).
[0121] -Hehlgans，T.&Pfeifer，K.The intriguing biology of the tumour necrosis fa ctor/tumour necrosis factor receptor superfamiIy：players,rules and the games. Immunology 115,1-20(2005).
[0122] -Huan g，Y .&Sh e i kh，M . S . T民A I L death receptors and cancer 化erapeutics.Toxicol Appl Pharmacol 224,284-289(2007).
[0123] -Johnstone，R.W.，Frew，A.J.&Smyth，M.J.The TRAIL apoptotic pathway in cancer onset,progression and therapy.Nat 民ev Cancer 8,782-798(2008).
[0124] -Koivunen，E?，Wang，B?and Ruoslahti，E?(1994)?Isolation of a highly specific ligand for theaSSl integrin from a phage library.J.Cell.Biol.124， 373-380.
[0125] -Kolmar，H.(2008)Alternative binding proteins：biological activity and therapeutic potential of cysteine-knot miniproteins.FEBS J.275,2684-2690.
[0126] -Lejeune，F.J.，Lienard，D.,Matter，！.&民uegg，C.Efficiency of recombinant hum过n TNP in human c过ncer ther过py.Csncer Immun 6,6(2006).
[0127] -Li，M.et al.Phase II multicenter,randomized,double-blind study of recombinant mutated human tumor necrosis factor-alpha in combination with chemotherapies in cancer patients.Cancer Sci 103,288-295(2012).
[0128] -Liu,Y.et al. The antimelanoma immunocytokine scFvMEL/TNF shows reduced toxicity and potent antitumor activity against human tumor xenografts?Neoplasia 8,384-393(2006)?
[0129] -Loetscher，H.，Stueber，D.，Banner，D. ,Mackay，F.&Lesslauer，W.Human tumor necrosis factor alpha(TNF alpha)mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75-kDa TNF rec邱tors.J Biol Qiem 268,26350-26357(1993).
[0130] -Nygren,P-A.(2008)Alternative binding proteins：affibody binding proteins developed from a small three-helix bundle scaffold.FEBS J.275,2668-2676.
[0131] -Ogasawara，J.et al.Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice.Na化re 364,806-809(1993).
[0132] -Pardon，E. ,Laeremans，T. ,Triest，S. ,Rasmussen，S.G.F?，辦細浪鞭辣A.，Ruf，A.， Muyldermans，S.，Hol，W.G.J，Kobilka，B.K.and Steyaert，J.(2014).A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.Nature Protocols 9， 674-693
[0133] -Robei'ts'N. J.，Zhou，S.，Diaz，L.A.，Jr.&Holdhoff，M.Systemic use of tumor necrosis f过ctor 过Iph过过s snsnticsncersgent.Oncotsrget 2,739-751(2011).
[0134] -民occaro AM，Hideshima T，民aje N，Kumar S，Ishitsuka K，Yasui H^Shiraishi N，民ibatti D，Nico B，Vacca A，Dammacco F，民ichardson PG，Anderson KC.Bortezomib mediates antiangiogenesis in multiple myeloma via direct and indirect effects on endo化elial cells.Cancer Res.2006:66(1):184-91.
[0135] -Scatchard G.Ann New York Acad Sci 1949:51,660-72.
[0136] -Schmidt T^Carmeliet P.Angiogenesis:a target in solid tumors,also in leukemia?Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2011;2011:1-8.
[0137] -Siegemund，M.et al.Superior antitumoral activity of dimerized targeted single-chain T民AIL fusion proteins under retention of tumor Selectivity-Cell Dea化 Dis 3，e295(2012).
[0138] -Skerra，A.(2008)Alternative binding proteins：antical ins-harnessing the structural plasticity of the Iipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities.FEBS J.275,2677-2683.
[0139] -Stump'M.T.，Binz，H.K.，Amstutz，P.(2008)DARPins:a new generation of protein therapeutics.Drug iscov.Today 13,695-701.
[0140] -Tramontane)，A. ,Bianchi，E. ,Venturini，S. ,Mart in，F.，Pessi，A and Sollazzo,M.(1994)The making of the minibody：an engineered beta-protein for the display of confromationally constrained peptides.J.Mol.Recognition 7,9- 24.
[0141] -Vanden Berghe，W.et al.p38 and extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase pathways are required for nuclear factor- kappaB p65 transactivation mediated by tumor necrosis factor.J Biol Chem 273， 3285-3290(1998).
[0142] -Vaneycken，！.et al.Preclinical screening of anti-HE民2 nanobodies for molecular imaging of breast cancer.FASEB J 25,2433-2446(2011).
[0143] -van Horssen，民.，Ten Hagen，T.L.feEggermont，A.M.TNF-alpha in cancer treatment：molecular insights,antitumor effects，and clinical utility.Oncologist 11,397-408(2006).
[0144] -Wang，H.，Yan，Z.，Shi，J.，Han，W.&Zhang，Y.Expression，purification，and characterization of a neovasculature targeted rmhTNF-alpha in Escherichia coli.Protein Expr Purif 45,60-65(2006).
[0145] -Welti J，Loges S^Dimmeler S^Carmeliet P.民ecent molecular discoveries in 过ngiogenesis 过nd 过nti过ngiogenic therapies in c过ncer.J Clin Invest.2013；123 (8):3190-200.
[0146] -Yang，Y.H.,Rajaiah，R.,Ruoslahti，E.and Moudgil，K.D?(2011).Peptides targeting inflamed synovial v过sul过ture attenuate autoimmune 过rthritis.PBNAS 108,12857-12862.
[0147] -Zabeau，L.et al.Selection of non-competitive Ieptin antagonists using a random nanobody-based approach.Biochem J 441,425-434(2012).
【主权项】
1. 一种构建体，其包含（i)TNF超家族的成员的细胞因子链的三个拷贝，其中所得细胞 因子被修饰以使对它的受体的亲和力降低，（ii)连接子序列和（iii)靶向部分，其中所述连 接子序列使所述细胞因子拷贝连接于所述靶向部分。2. 如权利要求1所述的构建体，其中所述构建体是融合蛋白。3. 根据权利要求1或2所述的构建体，其中所述TNF超家族的成员的所述细胞因子链的 至少一个拷贝被突变。4. 根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述细胞因子选自由FasUTRAIL、 TNF、CD30L、CD40L、0X40L、RANKL、TWEAKL、LTa、LT0、LIGHT、CD27L、41BBL、GITRL、APRIL、EDA、 VEGI和BAFF组成的组。5. 根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述靶向部分是抗体或纳米抗体。6. 根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述突变的细胞因子拷贝选自由 TNFY87Q、TNFY87F、TNFI97A、TNFI97S、TNFY115A、TNFY115G组成的组。7. 根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述靶向部分针对选自由CD20、 他^、(：-16七』6?1?、腱生蛋白(：、€^3整联蛋白和〇)13组成的组的靶标。8. 根据权利要求1至7中任一项所述的构建体，其用作药剂。9.根据权利要求1至7中任一项所述的构建体，其用于治疗癌症。
【专利摘要】本发明涉及TNF超家族的一种对它的受体具有降低的活性的经修饰的细胞因子，其中所述经修饰的细胞因子被特异性递送至靶细胞。优选地，所述经修饰的细胞因子是TNF超家族的单链变体，甚至更优选地，一个或多个链携带一种或多种突变，从而导致对受体具有低亲和力，其中所述突变细胞因子被特异性递送至靶细胞。靶向通过使所述TNF超家族的经修饰的细胞因子融合于靶向部分，优选是抗体或抗体样分子来实现。本发明进一步涉及所述TNF超家族的所述靶向经修饰的细胞因子治疗疾病的用途。
【IPC分类】A61K38/19, A61K39/395
【公开号】CN105492017
【申请号】CN201480040645
【发明人】J·塔威尼尔, J·堡丁克, F·皮尔曼, G·尤则
【申请人】弗拉芒区生物技术研究所, 根特大学, 法国国家科学研究中心, 蒙彼利埃第二大学, 蒙彼利埃大学医疗中心
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月18日
【公告号】CA2918363A1, EP3021865A1, US20160159874, WO2015007903A1
最新回复(0)