乳铁蛋白和儿童的记忆和学习速度的制作方法
乳铁蛋白和儿童的记忆和学习速度的制作方法
【专利说明】乳铁蛋白和儿童的巧忆和学习速度
[0001] 本发明整体设及婴幼儿认知功能的发育。更具体地讲，本发明提供了使用乳铁蛋 白来改善生理状况（即非病理状况)下婴幼儿的记忆和/或学习速度，和/或用于促进其大脑 的成熟。在一个方面，本发明示出了乳铁蛋白具有改善健康婴幼儿长期记忆(例如长期地点 记忆)的效用。
【背景技术】
[0002] 乳铁蛋白化F)是乳清级分中的一种分子量为SOkDa的糖蛋白，它由703个氨基酸残 基W及位于其N-端低聚糖链上的一到四分子的末端唾液酸（Sia)残基组成。乳铁蛋白最初 分离自乳汁，但也存在于其他体液(包括泪液、唾液、阴道分泌液、精液、鼻和支气管分泌物、 胆汁、胃肠液、尿液）中，并且乳铁蛋白在人的初乳和成熟乳中特别丰富，分别为6g/L和2g/L [1-4]。它属于转铁蛋白家族，又称乳转铁蛋白化TF)。乳铁蛋白对于婴幼儿展现出许多生物 学功能，例如调节肠道铁的吸收、调节免疫反应、抗氧化、抗癌、抗炎症、W及保护机体免受 微生物感染[5,6]。
[0003] 建议所有婴儿采用母乳喂养。然而，在一些情况下，母乳喂养并不够，或者不成功， 或者出于医学原因而不可取，或者母亲根本不选择母乳喂养或仅母乳喂养几个星期。鉴于 运些情况已经开发出了婴幼儿喂养配方。如今即食喂养配方已得到普遍使用，它在生命早 期为婴幼儿提供营养补充或唯一的营养来源。可用它们代替母乳或将它们同母乳一起用于 喂养婴幼儿。因此，如今婴幼儿喂养配方在组成和功能上的设计一般都尽可能类似母乳。
[0004] 最近，越来越多证据已经证实母乳喂养可提供长期的认知优势。然而，解释母乳喂 养和认知发育之间的关系的内在机制仍不清楚。乳铁蛋白是人乳中第二丰富的蛋白质，仅 少于酪蛋白[7]。有趣的是，每个乳铁蛋白分子含有一至四个唾液酸残基，并且动物实验表 明，唾液酸可能参与了学习和记忆[8，9 ]。
[0005] 因此本发明人认为，乳铁蛋白可在大脑快速生长时作为婴幼儿大脑发育和认知功 能的条件营养素起作用。如果是运样，乳铁蛋白的早期摄入应该在从胎儿时期到之后的生 命过程中均对脑的结构和功能产生显著影响。
[0006] 认知是指信息处理能力，包括感知、学习、记忆、判断和解决问题的能力。认知功能 的评价是机制和功能之间关系的神经科学研究的中屯、环节。一般来讲，我们认为学习和记 忆需要更高级的脑功能，而不是获取简单的神经元响应[10，11]。
[0007] 具体而言，记忆是生物体存储、保留和回忆信息的智力能力。可被测试的记忆现象 包括：（1)认识(记住了什么），（2)理解(运是什么意思）；（3)语境/功能(为什么要记住）；（4) 策略（如何记住）。记忆是一种复杂的屯、理过程，该屯、理过程与单个记忆领域过程并不是相 互独立的。记忆与其他若干个认知领域有关，包括感觉记忆、声音记忆和视觉记忆。
[000引记忆方面包括:
[0009]记忆是编码、存储和提取信息的过程。编码允许来自外部世界的信息W化学和物 理刺激的形式传递到动物的感官。存储是记忆的第二阶段或过程。运需要动物(例如人)将 信息保持一段时间。最后，第=过程是提取存储的信息。运些信息必须被定位，并将其返回 到意识中。
[0010] 短期记忆（STM)允许在无复述情况下回忆几秒到一分钟时间内的东西。短期记忆 编码(例如)声学信息，由神经元通信的瞬态模式支持，并依赖于额叶(尤其是背外侧前额叶 皮层)和顶叶区域，顶叶仅存储项目几秒钟。
[0011] 工作记忆与短期记忆在一定程度上重叠。其概念是指在执行复杂的认知任务时 (例如，学习，推理和理解），对所需信息进行临时存储、处理和操作的主动系统。
[0012] 动物工作记忆是指对一个测试阶段中使用的对象、刺激或位置的短期记忆，但运 些对象、刺激或位置通常不处于各阶段之间。
[0013] 长期记忆化TM)通过神经连接中更稳定和持久的变化而保持，所述神经连接的变 化广泛扩散到整个大脑，可W持续少至几日，长至数十年。长期记忆可存储更为大量的信 息。没有海马体，新的记忆就不能存储为长期记忆。
[0014] 空间记忆。在认知屯、理学和神经科学中，空间记是记忆的一部分，负责记录有关动 物的环境及其空间定向的信息。通常认为，在人类和其他动物中，空间记忆被概括为认知地 图。空间记忆表现在工作记忆、短期记忆和长期记忆之中。研究表明，大脑中存在与空间记 忆相关的特定区域。
[001引位置化区，也称为物体位置化区，是空间记忆的重要形式，包括不同的子组件，每 个子组件处理记忆中特定类型的信息，即记忆物体、记忆位置、记忆物体相互之间的位置W 及在记忆中结合运些特征。
[0016] 学习是获取新的知识、行为、技能、价值观或偏好，或者修改和加强现有的知识、行 为、技能、价值观或偏好，并且可能设及综合不同类型的信息。
[0017] 在评价用来研究认知功能(例如学习和记忆)的动物模型的效用时，有必要评估哪 些物种最为合适。早在40多年前就已认识到用猪来进行小儿大脑研究的可能性，运是由于 猪与人在出生时期的全脑生长、大体解剖W及新生儿大脑生长模式都具有相似性。猪消化 系统与人类婴幼儿具有相似的生理和解剖结构，并且猪具有与人相当的营养需求。运些使 得小猪非常适合用于协同营养、代谢和分子研究[引。猪具有弥补晒齿动物临床前研究和人 类临床试验之间的空白的潜力[11，12]。
[0018] -些研究提出了乳铁蛋白作为膳食补充剂的潜在益处：
[0019] WO 2010/130641设及婴幼儿肠道中神经元的健康和发育。含有乳铁蛋白的组合物 被证明可用于改善肠神经系统、修复受损肠神经系统，W及治疗或预防与肠神经系统发育 迟缓相关的疾病。
[0020] WO 2010/130643设及婴幼儿的大脑健康和发育。补充有乳铁蛋白的组合物被证明 可用于治疗或预防大脑或神经系统的发育迟缓，特别是IUGR(宫内生长受限）的婴幼儿(如 地塞米松诱发的早产的模型所示）。
[0021] WO 2010/130646设及成人的大脑健康和大脑保护。补充有乳铁蛋白的组合物被证 明可用于维持认知功能W及预防认知衰退和认知障碍。
[0022] WO 2013/076101设及白质。含有乳铁蛋白的组合物被证明可用于促进白质的发 育，治疗或预防白质的发育迟缓，W及治疗或预防白质的损失。
[0023] US 2013/0150306设及含有乳铁蛋白的基于乳的营养组合物。该专利特别地公开 了，为了调节屯、理压力，向孩子施用非人源的乳铁蛋白。
[0024] 运些研究都没有解决健康婴幼儿记忆和学习的问题。
[0025] 因此，本发明的目的在于提供乳铁蛋白的其他有益用途。
【发明内容】
[0026] 本发明的目的可通过独立权利要求指定的主题实现。本发明的具体实施例在从属 权利要求中指定。
[0027] 本发明的目的可通过使用乳铁蛋白改善健康婴幼儿记忆来实现。
[002引在一个实施例中，所述记忆为空间记忆，优选地为位置记忆。
[0029] 在一个实施例中，所述记忆为长期记忆，优选地为长期空间记忆，更优选地为长期 位置记忆。
[0030] 本发明的目的还可通过使用乳铁蛋白提高健康婴幼儿学习速度来实现。
[0031] 本发明的目的还可通过使用乳铁蛋白促进健康婴幼儿大脑成熟来实现。
[0032] 在一个实施例中，被^100至400111肖/1^体重/天或105至350111肖/1^体重/天或125至 350mg/kg体重/天或110至300mg/kg体重/天，优选140至290mg/kg体重/天或120至270mg/kg 体重/天或145至285mg/kg体重/天范围内的日摄入剂量施用给健康婴幼儿。
[0033] 在优选的实施例中，乳铁蛋白的日摄入剂量为中等剂量，例如在100至200mg/kg体 重/天或100至175mg/kg体重/天或110至160mg/kg体重/天或120至150mg/kg体重/天范围 内，优选128mg/kg体重/天或145mg/kg体重/天。运里，"中等剂量"还可W称为"中间剂量"或 "足够剂量"。
[0034] 在一个特别优选的实施例中，乳铁蛋白W中等的日摄入剂量(例如在前面段落中 所指定)施用给健康婴幼儿，用于提高学习速度和/或改善长期记忆。
[0035] 在另一个优选的实施例中，乳铁蛋白的日摄入剂量为高剂量，例如在220至320mg/ kg体重/天或225至325mg/kg体重/天或250至350mg/kg体重/天或230至310mg/kg体重/天或 240至300mg/kg体重/天的范围内，优选252mg/kg体重/天或285mg/kg体重/天。
[0036] 在一个特别优选的实施例中，乳铁蛋白W高的日摄入剂量(例如在前面段落中所 指定的)施用给健康婴幼儿，用于改善长期记忆，特别是长期位置记忆。
[0037] 在一个实施例中，乳铁蛋白的日摄入剂量被分为至少两份、优选至少=份、最优选 四份。
[0038] 在一个实施例中，乳铁蛋白被提供于可摄入的组合物中，此组合物优选地为可摄 入的液体组合物，此组合物选自：人类食品、孕产妇营养组合物、第一阶段奶 (startermUk)、成长奶(growing up mUk)、婴幼儿喂养配方和婴儿食品及饮料。
[0039] 在一个实施例中，乳铁蛋白Wo. 1至2g/L、优选0.25至1.5g/L、最优选0.5至1. Og/L 范围内的浓度存在于液体可摄入组合物中。
[0040] 在优选的实施例中，乳铁蛋白浓度Wo. 3至0.7g/L范围内的浓度、优选Wo. 5g/L的 浓度存在于液体可摄入组合物中。优选地，将此类液体可摄入组合物施用给健康婴幼儿，用 于提高学习速度和/或改善长期记忆。
[0041] 在可供选择的优选实施例中，乳铁蛋白WO. 8至1.2g/L范围内的浓度，优选W l.Og/L的浓度存在于液体可摄入组合物中。优选地，将此类液体可摄入组合物施用给健康 婴幼儿，用于改善长期记忆，特别是长期位置记忆。
[0042] 在一个实施例中，乳铁蛋白W富集乳铁蛋白的乳或乳清级分的形式被提供给健康 婴幼儿。
[0043] 在乳铁蛋白的用于改善健康婴幼儿记忆的上述用途中，乳铁蛋白可W通过富集乳 铁蛋白的可摄入组合物形式使用。富集意味着将乳铁蛋白添加到组合物中，使所得组合物 的乳铁蛋白含量比没有添加乳铁蛋白的组合物的乳铁蛋白含量高，或者采用某种方式对组 合物进行处理，浓缩组合物中的天然乳铁蛋白含量。
[0044] 乳铁蛋白也可作为纯的化合物提供。
[0045] 或者，乳铁蛋白可作为富集乳铁蛋白的级分被提供，例如富集乳铁蛋白的乳类或 乳清级分。
[0046] 例如可W使用牛乳、人乳、山羊乳、骆驼乳、马乳和/或驴乳作为乳或乳清源。也可 使用初乳。
[0047] 组合物W足够有效的量施用。足W实现运一点的量被定义为"有效剂量"。有效的 量将取决于本领域技术人员已知的多个因素。精确用量取决于若干个体因素，例如婴幼儿 的发育阶段或体重。
[004引典型的富集乳铁蛋白的组合物可包含至少1.6g/L的乳铁蛋白。
[0049]例如，本发明中所用的组合物含有乳铁蛋白的浓度可至少为0.75% (重量比），优 选地至少含有1% (重量比）的乳铁蛋白。在一个实施例中，待施用的组合物的量对应于如下 乳铁蛋白摄入量:至少0 .25g乳铁蛋白/天Ag体重，优选至少0.5g乳铁蛋白/天Ag体重，更 优选至少Ig乳铁蛋白/天Ag体重。
[(K)加]乳铁蛋白可W至少O.Olg/lOOkcal，优选至少O.lg/lOOkcal的浓度存在于组合物 中。例如，乳铁蛋白可W约O.Olg/lOOkcal组合物至lOOg/lOOkcal组合物、优选0.1 g/ IOOkcal组合物至50g/100kcal组合物、甚至更优选2g/100kcal组合物至25g/100kcal组合 物的范围存在于组合物中。
[0051] 乳铁蛋白也可结合其他化合物一起使用，例如唾液酸和/或铁。
[0052] 特别优选的含有乳铁蛋白的组合物可另外包含唾液酸，其量在IOOmg唾液酸/100g 组合物（重量比）至1000 mg唾液酸/100g组合物（重量比）的范围内，例如500mg唾液酸/100g 组合物(重量比）至650mg唾液酸/100g组合物(重量比）的范围内。
[0053] 例如本发明所用的组合物可包含至少约0.001%的唾液酸(按重量计）。在本发明 的其他实施例中，该组合物可包含至少约0.005%或至少约0.0 l %的唾液酸(按重量计）。
[0054] 作为另外一种选择或除此之外，含有乳铁蛋白的组合物可包含铁，其量在约Img 铁/100g组合物(重量比）至50mg铁/100g组合物(重量比）的范围内，例如IOmg铁/100g组合 物(重量比）至30mg铁/1 OOg组合物(重量比）。
[0055] 例如一种含有乳铁蛋白的组合物可包含约852mg/100g(重量比）的唾液酸和22mg/ 100g(重量比）的铁。
[0化6] 本发明的含有乳铁蛋白的组合物可具有30kcal/100g组合物至lOOOkcal/lOOg组 合物，优选50kcal/100g组合物至450kcal/100g组合物范围内的热量密度。例如组合物可具 有约400kcal/100g的热量密度。
[0057] 该组合物的性质没有特别限制。它优选为口服或经肠施用的组合物。
[0058] 该组合物例如可选自食品、动物食品、药物组合物、营养制剂、保健营养品、饮料、 食品添加剂和婴幼儿喂养配方。
[0059] 在一个典型的实施例中，该组合物将包含蛋白质源、脂质源和碳水化合物源。
[0060] 例如，此类组合物可包含在约2至6g/100kcal的范围内的蛋白质，在约1.5至3g/ IOOkcal范围内的脂质和/或在约1.7至12g/100kcal范围内的碳水化合物。如果该组合物是 液体，其能量密度可在60至75kcal/100ml之间。
[0061 ] 如果该组合物是固体，其能量密度可在60至75kcal/100g之间。
[0062] 蛋白质的类型被认为对本发明无关紧要。因此，可使用例如基于乳清、酪蛋白及其 混合物的蛋白质源。就乳清蛋白而言，可使用酸乳清或甜乳清或其混合物，W及W任何所需 比例混合的O-乳白蛋白和e-乳球蛋白。乳清蛋白可为经改性的甜乳清。甜乳清是较易获得 的奶酪制作过程的副产品，常用于制取基于牛乳的婴幼儿配方。然而，甜乳清中包含一种名 为酪蛋白糖巨肤(CGMP)的组分，该组分不期望地富含苏氨酸，而色氨酸含量很少。将CGMP从 甜乳清中去除可使得蛋白质中苏氨酸的含量更接近于人乳中苏氨酸的含量。然后可在运种 经改性的甜乳清中补充那些有关的含量低的氨基酸(主要是组氨酸和色氨酸）dEP 880902 中描述了将CGMP从甜乳清中除去的方法，WO 01/11990中描述了基于此类经改性的甜乳清 的婴幼儿配方。所述蛋白质可为完整的或水解的蛋白，或为完整蛋白和水解蛋白的混合物。 例如，对于被认为处于发生牛乳过敏风险的受试者而言，提供部分水解的蛋白质(水解程度 在2%与20%之间）可能是可取的。如果需要水解的蛋白质，则可根据需要并且如本领域已 知的那样进行水解过程。例如，可通过如在EP 322589中所述的两个步骤对乳清级分进行酶 法水解，W制备乳清蛋白水解物。对于深度水解蛋白，所述乳清蛋白可进行先使用碱性蛋白 酶Alcalase 2.化化C 940459)，再使用中性蛋白酶化UtraseO.化(可得自诺和诺德股份公 司（Novo Nordisk Ferment AG))，最后使用膜酶在55°C下的S重水解。如果用作原料的乳 清级分基本上不含乳糖，则发现该蛋白质在水解过程中经受少得多的赖氨酸阻断。运使得 能够将赖氨酸阻断的程度从总赖氨酸的约15重量％降低至不到赖氨酸的约10重量％，例如 赖氨酸的约7重量％，运大大地提高了蛋白质源的营养质量。
[0063] 本发明中所用的组合物可包含碳水化合物源。可使用任何碳水化合物源，例如乳 糖、薦糖、麦芽糖糊精、淀粉及它们的混合物。
[0064] 本发明中所用的组合物可包含脂质源。脂质源可W是任何脂质。优选的脂肪源包 括乳脂肪、栋桐油精、高油酸向日葵油和高油酸红花油。可添加必需脂肪酸亚油酸和Q-亚麻 酸，也可添加含有丰富初加工的花生四締酸和二十二碳六締酸的少量油，例如鱼油或微生 物油。在脂质源中，n-6和n-3脂肪酸的比例优选地约为5:1至15:1;例如约8:1至10:1。
[0065] 本发明的组合物也可包含据悉为日常饮食所必不可少并且在营养上大量需求的 所有维生素和矿物质。某些维生素和矿物质的最小需要量已被确定。矿物质、维生素和任选 地存在于婴幼儿配方中的其他营养物质的例子包括维生素 A、维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、维生素 B12、维生素 E、维生素 K、维生素 C、维生素 D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、 巧、憐、舰、铁、儀、铜、锋、儘、氯化物、钟、钢、砸、铭、钢、牛横酸和左旋肉碱。矿物质通常W盐 的形式加入。特定矿物质和其他维生素的存在及其量将根据许多因素而变化，例如，待施用 组合物的人或动物的年龄、体重和状况。
[0066] 组合物还可包含至少一种益生菌菌株。益生菌是指对宿主的健康或良好状态具有 有益效果的微生物细胞制剂或微生物细胞成分。如果存在益生菌的话，它的量同样优选地 根据人或动物的年龄而变化。一般来讲，益生菌含量可随婴幼儿年龄增大而增加，例如从10 <3〉cfu/g配方(干重)增大到10<12〉cfu/g配方(干重），更优选10<4〉cfu/g配方(干重)增大 到10<8〉cfu/g配方(干重）。
[0067] 该组合物还可包含至少一种益生元，其含量为0.3%至10%。益生元是不可消化的 食品成分，其通过选择性地刺激结肠中一种或有限数量的细菌的生长和/或活性对宿主产 生有益地影响，从而改善宿主健康状况。运些成分是不可消化的，在运个意义上来讲，它们 在胃或小肠中是不能被分解和吸收的，因而它们可W完整地通过胃和小肠到达结肠，在结 肠处通过有益细菌选择性地发酵。益生元的例子包括某些寡糖，例如低聚果糖(FOS)和低聚 半乳糖(G0S)。可使用益生元的组合，例如90%的GOS与10%的短链低聚果糖的组合(例如W 商标Raf t i Io Se (R)销售的产品），或90 %的GOS与10 %的菊粉的组合(例如W商标Raf t i 1 ine (R)销售的产品）。
[0068] 该组合物可选择性地包含可具有有益效果的其他物质，如核巧酸、核巧等。
[0069] 本发明所用的组合物例如婴幼儿配方，可W通过任何合适的方式制备得到。例如， 婴幼儿配方可通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源W合适的比例混合在一起制备得 到。如果使用乳化剂，则可将其包含在混合物中。此时可加入维生素和矿物质，但为了避免 热降解，通常在稍晚一点的时候加入。任何亲脂性维生素、乳化剂等可在混合之前先溶解在 脂肪源内。然后可加入水混合形成液体混合物，优选地是经过反渗透处理的水。随后可对液 体混合物进行热处理W降低细菌量。例如，可将液体混合物迅速加热到约80°C至110°C范围 内的溫度，保持约5秒至约5分钟。运可通过蒸汽喷射或热交换器例如板式换热器进行。然后 可将液体混合物冷却到约60°C至约85°C，例如通过急速冷却的方法。接着可将液体混合物 进行均质处理;例如分两个阶段进行，第一阶段在约7M化至约40M化下进行，第二阶段在约 2M化至约14M化下进行。然后可进一步冷却均质的混合物W加入任何热敏感组分，如维生素 和矿物质。此刻顺便将均质的混合物的pH和固形物含量标准化。将均质的混合物转移至合 适的干燥装置(例如喷雾干燥器或冷冻干燥器），并将其转化成粉末。该粉末应具有小于约5 重量％的含水量。如果需要增加一种或多种益生菌，可根据任何合适的方法培养所述益生 菌，然后例如通过冷冻干燥或喷雾干燥方式制成，W供添加到婴幼儿配方中。或者，可从专 业供应商如科汉森公司（化ristian化nsen)和森永制果公司（Morinaga)购买已经制成合 适形式的细菌制品W供添加到食品如婴幼儿配方中。此类细菌制品可通过干混方式添加到 粉状的婴幼儿配方中。
[0070] 乳铁蛋白可在该过程中的任何阶段加入，但优选地在加热步骤之后添加。
[0071 ] 该组合物包含蛋白质源，所述蛋白质源可在1.4g/100kcal组合物至lOOg/lOOkcal 组合物，优选在1.4g/100kcal组合物至6.0g/100kcal组合物之间的范围内存在。由于乳铁 蛋白是蛋白质，因此应当认为它是蛋白质源的一部分。
[0072] 已知乳清蛋白提供多个健康益处。例如它易于消化。乳清的蛋白级分（占乳清内总 干物质的大约10 %)包括几种蛋白级分，如e-乳球蛋白、a-乳白蛋白、牛血清白蛋白和免疫 球蛋白。在一个实施例中，乳清蛋白占蛋白源的重量百分比至少50%，优选地至少75%，甚 至更优选地至少85 %。
[0073] 如果存在脂质源的话，它可贡献组合物总能量的30%至55%。碳水化合物源可贡 献组合物总能量的35%至65%。
[0074] 也可在本发明的组合物中加入唾液酸。唾液酸是神经氨酸的N端或0端被取代的衍 生物的通用名称，它是具有九碳主链的单糖。
【具体实施方式】
[0075] 研究发现在生理条件下，乳铁蛋白膳食补充剂改善了小猪的位置记忆和长期记 忆，提高了小猪的学习速度，基于此提出了本发明。
[0076] 在第一组实验中，乳铁蛋白经证实改善了36至38日龄小猪的位置记忆。具体地讲， 喂养高剂量乳铁蛋白（约225至325mg/kg体重/天）的小猪比对照组小猪表现出明显更好的 30分钟长期位置记忆。
[0077] 第二组实验数据表明，乳铁蛋白膳食补充剂大大改善了在八臂迷宫中测试的22至 32日龄小猪的记忆并提高了其学习速度。实验结果表明，喂养中等剂量（约100至175mg/kg 体重/天)和高剂量乳铁蛋白的小猪的40分钟长期记忆和3小时长期记忆都得到改善。有趣 的是，学习速度提高得最多的是喂养中等剂量乳铁蛋白的小猪。
[0078] 另一组实验表明，乳铁蛋白补充剂上调了海马体中脑源性神经营养因子(抓NF)的 mRNA表达，并且激活了抓NF信号通路。
[0079] 可通过上调该通路中的关键基因（例如Trk3、IRSl、GRB2、CAMKl、MAPK、SPdP CREBl)观察到抓NF信号通路的激活。
[0080] 实验还表明乳铁蛋白补充剂增加了海马体中憐酸化CREB(pCREB)的水平。
[0081 ]可W确定，BDNF信号通路的激活会加强CR邸的憐酸化和核转位。还可W确定，CREB 在133位丝氨酸处的憐酸化(pCREB)可诱导基因转录，并在开始学习和记忆的过程中起关键 作用。
[0082] 另一组实验数据表明，乳铁蛋 白膳食补充剂提高了海马体和前额叶皮层中多聚唾 液酸神经细胞黏附分子(NCAM)的表达水平。运表明，乳铁蛋白的唾液酸部分可能是提高神 经可塑性和促进LTM巩固的关键因素。
[0083] 根据本发明所用的乳铁蛋白可从各种来源获得。它可W纯化得到，例如从乳或乳 清中纯化，也可W重组产生。从天然来源纯化得到的乳铁蛋白具有W下优点：它是一种天然 成分，大都从食品级组合物中获得，并且可经过或不经过进一步纯化而用作食品组合物的 富集级分。作为天然来源，可考虑人乳(母乳)或非人源的乳，例如牛乳、山羊乳、骆驼乳、马 乳或驴乳。还可考虑初乳。重组获得的乳铁蛋白具有如下优点：能够轻松制备高浓度的乳铁 蛋白。
[0084] 可将乳铁蛋白添加到组合物中，W使得所得的组合物的乳铁蛋白含量比未添加乳 铁蛋白的组合物的乳铁蛋白含量更高。或者，可对天然包含乳铁蛋白的组合物进行处理W 浓缩组合物中天然乳铁蛋白的含量，例如制得富集乳铁蛋白的乳或乳清级分。乳铁蛋白也 可作为纯的化合物提供。
[0085] 可将乳铁蛋白作为可摄入组合物的成分提供，即口服组合物。也可考虑经肠施用 的组合物。
[0086] 优选地将乳铁蛋白，或包含乳铁蛋白的可摄入组合物施用于婴幼儿。也可考虑将 乳铁蛋白或包含乳铁蛋白的可摄入组合物施用于妊娠期和/或哺乳期母亲。
[0087] 乳铁蛋白也可结合其他化合物(例如唾液酸和/或铁)一起提供。
[0088] 权利要求中所用术语"记忆"及其多个方面的定义如前言部分所概述。
[0089] "学习速度"是指学习一项学习任务所需的持续时间或试验的次数。
[0090] "大脑成熟"主要是指大脑发育的过程，包括从最早期的胚胎形成到生命的最后几 年，中枢神经系统的生成、塑造和重塑。
[0091] "健康婴幼儿"是指为足月新生儿(就人类新生儿而言，是指怀孕37周后出生的新 生儿）的婴幼儿，即与早产儿相比，足月出生的新生儿在出生时体重正常，没有任何认知功 能障碍或大脑发育迟缓，并且出生时没有经历过宫内生长受限（IUGR)或低氧血症缺血。因 此，从更广泛的意义上来讲，"健康"是指婴幼儿正常的发育或生理的发育，即非病理性发 育，特别是就认知功能而言的非病理性发育。
[0092] 婴幼儿可W是新生儿、婴儿、幼儿、学龄前儿童或学龄儿童，是指从出生到14岁年 龄的孩子。
[0093] 新生儿通常定义为从大约出生到1个月的宝宝。婴儿通常是指6到12个月的宝宝。 幼儿是指12到36个月的儿童。学龄前儿童是指36个月至5岁的儿童。学龄儿童是指5岁至14 岁的儿童。
[0094] 虽然优选的是人类健康婴幼儿，但也可考虑相应年龄的非人类哺乳动物。
[0095] 根据下面的实例和附图，本发明的其他优点和特征对本领域的技术人员来说是显 而易见的。
[0096] M所示为四个隔板中的一个，其上放置着装有乳的碗。
[0097] 圏兰所示为小猪不能触及乳（即装有乳的碗被盖子覆盖）的情况（图2A)，W及与此 相反，小猪能够触及乳(即碗未被盖住)的情况(图2B)。
[0098] 圏^所示为位置记忆测试安排。
[0099] 圏兰所示为错误（图4A)或成功（图4B)情况下的位置记忆测试安排。当小猪首先访 问在前次试验中装有可触及乳的碗时，表示成功。
[0100] 圏互所示为用于位置记忆测试安排的时间表。
[0101] 图些所示为整个研究中各组的平均（±SE)增重。基于一般线性模型(单变量方差分 析)和Bonferroni调整的多重比较显示各组间没有显著差异(P〉0.05)。
[0102] 圏互所示为四个不同年龄段的小猪的促肾上腺皮质激素(ACTH)(图7A)或皮质醇 (图7B)在血液中的浓度。ACTH的浓度Wpg/ml为单位，皮质醇的浓度Wiig/ml为单位。
[0103] 图查所示为关于位置记忆的总成功次数(10次试验）。
[0104] 图马所示为不同测试阶段中关于位置记忆的成功次数。
[0105] 图10所示为短期（STO)和长期化!￥)位置记忆的平均成功次数(平均值±55)。标记 30分钟LTM相关误差条的不同字母(a, ab，b)表示，使用单因素方差分析和最小显著性差异 (LSD)调整进行多重比较的各组间具有统计意义上的显著性差异(P = O.046)。
[010W 图11所示为不同时间间隔的工作巧区(冲= 0.026，<0.05;双因素方差分析）。
[0107] 图12所示为八臂迷宫^及用于简单任务和困难任务的视觉提示。
[0108] 图13所示为八臂迷宫中简单和困难任务的流程。LTM:长期记忆，STM:短期记忆。
[0109] 图14分别显示了小猪在简单任务和困难任务中的学习速度曲线，该学习速度曲线 用错误和成功作为使用Cox回归分析方法分析的协方差。
[0110] 图15所示为海马体中脑源性神经营养因子(BDNF)的相对mRNA水平(平均值± SE)。 乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中的抓NF表达水平(P<0.05)。
[0111] 图16所示为海马体中抓NF的蛋白水平(平均值±55)。中等剂量的乳铁蛋白补充剂 显著提高了海马体中抓NF蛋白的水平(P<0.05)。
[0112] 图17所示为抓NF信号通路。
[0113] 图18显示乳铁蛋白补充剂提高了海马体中pCR邸的水平(平均值±55)。
[0114] 图19显示乳铁蛋白补充剂提高了海马体和前额叶皮层中POlySia-NCAM的水平(平 均值±SE)。
[0115] ^ I^lJ
[0116] 实例1:动物处理
[0117] 1.1.动物
[0118] 由于小猪在生理学、解剖学和遗传学方面与人类婴幼儿高度相似，故将小猪用作 动物模型。
[0119] 购买来自16窝的六十屯只3日龄雄性家养小猪(长白猪与大白猪杂交所得子一代 (Sus SCOrfa LarKlraceXLa;rge White F1))，并根据重量和窝随机分成4组。分组和饮食信 息概述于表1中。将所有动物成对圈养在溫控环境下，经历12小时光照(08:00-20:00)和黑 暗(20:00-08:00)周期。每个住处栏圈包含"窝"（覆盖有干净毛巾的橡胶轮胎）、窝上方的加 热灯W及相同的木制玩具。行为实验室对小猪的最大容量为16只。因此进行了5次试验，每 次试验10至16只小猪，W达到每组16只小猪。用摄像监控系统监视小猪。在每次试验中，对 两只3日龄小猪实施安乐死，用作基线对照(n = 10)。该研究方案经厦口大学动物伦理委员 会(Xiamen University Animal Ethics Committee)批准。
[0120] 表1动物分组的细节
[01。] 1.2.乳铁蛋白喂食方案
[0123]牛乳乳铁蛋白（0乳铁蛋白）购自DMV国际公司（DMV International)。用包含大豆 蛋白/乳清蛋白/酪蛋白（50:38:12)的标准猪乳代用品喂养每只小猪(3日龄到38日龄）。最 终乳中的乳铁蛋白量根据组别而不同（参见表1):0.05g/L(组1，未添加乳铁蛋白的对照组， 11=16)、0.5邑/1(组2，中等剂量组，11 = 17)、1邑/1(组3，高剂量组，11=15)。组1至组3中的所有 小猪都经过学习测试。组4(n=16)接受与组3(lg/L)剂量相同的乳铁蛋白，但未经过学习测 试(作为假处理组）。运些浓度表示，在对照组、中等剂量组和高剂量组中，乳铁蛋白的近似 摄入量分别为15、145和285mg/kg体重/天。猪乳代用品被配制成使得总蛋白质摄入量，在不 考虑添加的乳铁蛋白的量时保持相同。为了维持正常的生长速率，小猪在研究的最初2周里 接受的乳量为285ml乳Ag体重/天，剩下几周里为230ml乳Ag体重/天。喂养时间为08:00、 13:00、18:00和22:30，在最后一次喂养中向每只猪额外提供了 50ml乳。每天记录小猪的体 重、乳摄入量和健康状态。
[0124] 1.3.体重
[0125] 每天早上喂食前测量小猪的体重。结果显示，各个组中的平均（±SE)初始体重相 同（1.908±0.044kg)，并且运些动物体重增加的速率相似（图6)。虽然在研究终点第3组比 其他组体重增加得更快，但第23天(P = 0.937)、第29天(P = 0.899)和第36天(P = 0.888)的 组间差异不显著。我们的结果与之前的报道不同，根据之前的报道，用乳铁蛋白和铁补充剂 配方喂养的婴幼儿比W单独铁补充剂配方喂养的婴幼儿体重增加更多[13]。
[01%] 1.4.应激激素
[0127]众所周知，压力经历可影响学习和记忆过程。压力通常被定义为干扰生物体生理 或屯、理内稳态的任何状况[14]。多种不同类型实验证据表明，在情绪唤醒经历期间或之后 释放的肾上腺应激激素在巩固持久记忆中起关键作用。压力事件激活下丘脑-垂体-肾上腺 化PA巧由，引起血浆中皮质酬或皮质醇水平缓慢升高[15]。大量实验研究了肾上腺应激激素 对记忆的影响，运些实验提供了大量证据，证明了在动物和人类受试者中，肾上腺素和糖皮 质素调节长期记忆巩固[16]。在运一背景下，我们监测了小猪血液中的应激激素水平。
[012引从每只3日龄、17日龄、28日龄和39日龄的小猪身上采集血样。在4°C下W3000巧m 离屯、样品15分钟，然后将血浆保存在-80°C下，至分析才取出。使用罗氏电化学发光免疫分 析仪（Roche electrochemical luminescence immune 曰n曰Iyzer)(罗氏E601 (Roche E601)，中山市医院（Zhongshan Hospital))，通过电化学发光免疫测定法测量血浆中的两 种应激激素，即促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇。由经验丰富的技术人员根据制造商在 各方面的说明来处理所有分析。使用各制造商提供的质控品对所有分析运行进行质量控 审IJ。结果未发现对血液中应激激素水平的影响（图7;P〉0.05,双因素方差分析）。
[0129] 1.5.统计分析
[0130] 如有必要，使用一般线性模型（单变量方差分析)和Bonferroni调整多重比较来分 析组间的记忆差异。借助适用于WINDOWS的SPSS 19(伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司（SPSS Inc，化icago，IL))完成所有统计分析。使用0.05显著性水平。
[01引]实例2:乳铁蛋白对小猪位置记忆的影响 [0。。2.1.位置记忆测试
[0133] 对36日龄的小猪进行了位置记忆测试。允许小猪自己熟悉测试区域。组1(对照，n =16 )、组2(中等剂量，n = 17)和组3(高剂量，n = 18)的小猪进行位置记忆测试。测试中，将 四个固定的隔板(0.3 XO. 35 XO. 50m)(图1)放置在左前方(位置1)、左角(位置2)、巧聯区域 中央前方(位置3) W及右后角（位置4)，其中位置1、2和4的隔板面向口，分别离侧壁0.7m、 0.8m和0.9m(图3)。在任务区中，有四个碗隐藏在所述四个隔板中，但只有一个碗里的乳是 可触及的（图2B)，其他=个碗中的乳不可触及（图2A)。当待在隔板前面时，小猪不能看到运 些碗。它们必须绕到隔板背面，才能找到可触及或不可触及的乳。在每次试验中随机改变装 有可触及乳的碗。对每只小猪进行了 10次试验，包括早上4次试验，下午4次试验，W及次日 早上2次试验。预期"更聪明"的 小猪将更快找到可触及的乳，而不需要再次访问任何不可触 及乳碗。当小猪再次访问任何不可触及乳的位置时，则记录为错误。通过直接观察来记录小 猪在测试区域中的行为，并用录像带记录W用于进一步分析。所有测试由训练有素的工作 人员进行。
[0134] 当小猪进入测试区，然后首先访问在前次试验中发现可触及乳碗的位置（图4B) 时，记录位置记忆。测试了两种类型的位置记忆:短期记忆(STM)和长期记忆化TM)。在本研 究中，我们将STM定义为对间隔时间为5分钟或更短的2次连续试验的记忆。将所有持续时长 超过5分钟的位置记忆视为LTM。本研究中有S种类型的LTM: (1)30分钟LTM(早上）；（2)4小 时LTM(下午第一次试验）；（3) 16小时LTM(次日早上第一次试验）。位置记忆测试的计划表如 图5所示。
[0。引 2.2.结果
[0136]各组间位置记忆的整体差异如表2所示。中等剂量组和高剂量组具有比对照组更 好的位置记忆，但差异未达到统计显著性(P〉〇. 05)。然而，当我们基于成功率分析数据时， 中等剂量组和高剂量组取得的成功比对照组多30%，其中成功率为小猪取得的实际成功数 比总理论成功数的比值(表2)。
[0。7] 表2位置记忆成功率
[0139] *1.成功率=(实际成功数/理论成功数）X 100%
[0140] 9次位置记忆试验的平均成功数如图8所示。虽然乳铁蛋白处理组在位置记忆方面 的表现比对照组好，但统计分析结果未达到显著性(P〉〇.05)。
[0141] 我们还发现，当我们把前5次试验视为习得阶段学习，而把后5次视为提取阶段学 习时，乳铁蛋白处理组在位置记忆方面的表现比对照组好(图9)。
[0142] 将任何时间间隔不超过5分钟的位置记忆定义为短期位置记忆。将时间间隔超过5 分钟的记忆定义为长期位置巧区。短期位置记忆和长期位置记忆的总成功数汇总于表3中。 [01创表3短期记忆和长期记忆成功率
[0145] *1.成功率=(实际成功数/理论成功数）X 100%
[0146] P = O.026
[0147] 运些结果表明，用乳铁蛋白处理的组在短期记忆测试和长期记忆测试中均表现得 更好。具体地讲，高剂量组比对照组表现出明显更好的30分钟长期记忆(P = O.046)(图10)。 [014引此外，除了试验5和试验6 W外，用乳铁蛋白处理的组在位置记忆试验中比对照组 表现得更好（图11)。具体地讲，在试验7中，处理组明显比对照组表现得更好(P = O.026,双 因素方差分析）。
[0149] 实例3:乳铁蛋白对小猪学习速度和记忆的影响
[0150] 3.1.学习和记忆测试
[0151] 使用八臂迷宫法[引测试学习和记忆能力的认知功能。将小猪逐一引入八臂迷宫 中。进行了两种测试："简单任务"（任务1)和更"困难的任务"（任务2)(图12)。两种测试均在 一个臂中放有可触及的乳，而在其余7个臂中放有不可触及的乳，从而所有臂都具有相同的 气味，防止嗅觉学习（图12)。在两种测试中，将由3个黑点组成的视觉提示随机放置在臂中 有可触及的乳(与该组的乳相对应）的口上。在简单任务中，将一个黑点的视觉提示放置在 具有不可触及乳（与可触及乳的量和类型相同）的其余7个口上。在困难任务中，将有2个黑 点的视觉提示放置在其余7个口上。3个黑点的视觉提示的位置在不同试验之间按预定的随 机顺序变化。从第22天(22日龄的小猪)起，在为期10天的周期里对任务1和任务2各进行了 四十次试验。
[0152] 根据成功学会识别视觉提示所用的试验次数来确定对学习能力的评估。使用在各 次试验中寻找可触及乳臂时的错误数和成功数来量化学习。每当小猪进入错误的口或者将 其整个头部穿过错误的口时，即记录为错误。当小猪进入正确的口时则记录为成功。学会识 别视觉提示的标准是：（A)3次连续试验中最多出现1次错误，（B)3次连续试验中未出现错 误，（C)4次连续试验中最多出现1次错误，（D)4次连续试验中未出现错误，化)5次连续试验 中最多出现1次错误，（F)在5次连续试验中未出现错误。在学习和记忆测试期间，头顶摄像 机连续进行记录，同时，训练有素的观察者手动记录结果。由训练有素的工作人员进行所有 测试，运些工作人员对乳铁蛋白摄入水平不知情。通过对视频资料进行独立分析来证实结 果。为了减轻压力并使小猪熟悉测试规程，我们允许来自同一窝的两只小猪进入迷宫，W在 学习巧聯前学习如何开口和关口（ 8次试验）。
[0153] 每天早上4次试验，下午4次试验。对一只小猪进行两次连续试验。两次试验的意向 间隔时间（改变视觉提示并放置新鲜乳)为5分钟巧分钟短期记忆），在运5分钟内，小猪位于 等待区（在测试区外）。40分钟后(40分钟长期记忆），再次将小猪引入八臂迷宫，进行另外2 次连续试验。下午，对小猪重复进行上午的测试。早上和下午测试之间的意向间隔时间为3 小时（3小时长期记忆）。16小时后的第二天，我们重复了与前一天测试相同的任务（16小时 长期记忆）。简单任务和困难任务的试验总次数为40次。完成简单和困难试验四十八小时 后，让已达到学会标准的小猪再次进行相同模式的任务，作为"48小时长期记忆"。将寻找可 触及乳时的错误数记录为记忆指标。简单和困难任务安排的过程如图13所示。
[0154] 在图14所示的简单学习任务中，当我们将前20次试验(学习习得阶段)的错误总数 视为协变量kovariaes)用于分析时，乳铁蛋白补充剂显著提高了学习速度(P<0.05)。在困 难学习任务中，当我们将所有40次试验(强化)的总成功数视为共变量(covaries)用于分析 时，bLF补充剂显著提高了学习速度。
[01巧]3.2结果
[0156]与高剂量组和对照组相比，中等剂量组的学习速度(基于学会识别视觉提示所用 的试验次数)是最快的。当把每天的错误数用作学习的度量时，结果表明，对照组的小猪在 困难任务测试中出错更多。第4天的组间差异显著(P<0.05,一般线性模型），运天可视为学 习过程的提取阶段。在保留间隔时间为5分钟、40分钟和3小时时，用乳铁蛋白处理的组存在 记忆改善的趋势。显著的记忆改善出现在间隔时间为40分钟和3小时时，但未出现在间隔时 间为16小时和48小时时。结果说明，对于38日龄的小猪而言，回忆起视觉提示的最大保留间 隔时间（记忆能力）为3小时。然而，不同保留间隔时长下的记忆测试中没有剂量响应。
[0157] 实例4:海马体中抓NF基因表达
[015引对38日龄小猪的海马体组织进行定量逆转录PCR分析(qRT-PCR)，来测定脑源性神 经营养因子(抓N巧的基因表达。
[0159] 如图15所示，乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中抓NF的相对mRNA水平。此外，中 等剂量乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中的抓NF蛋白水平(图16)。
[0160] 由此发现了行为数据和抓NF基因表达结果之间的相关性，运种相关性暗示，乳铁 蛋白膳食可能通过提高抓NF的表达来起作用。
[0161] 实例5:抓NF信号通路中关键基因的表达
[0162] 通过对38日龄小猪的海马体组织进行Affymetrix基因微阵列分析，来测定抓NF信 号通路中关键基因的表达。分析的关键基因在表4中列出。
[0163] 从表4所示的结果可W看出，乳铁蛋白补充剂提高了海马体中抓NF、GRB2、IRS1、 Tr k3、RAPGEF1 (C3G )、CAMK、MAPK11、MAPK12、CREB1、SP1、MYC 和 ESR1 的表达。运些都是抓 NF 信 号通路中的关键基因。BDNF信号通路如图17所示。
[0164] 如上所述，可W确定抓NF信号通路的激活会加强CR邸的憐酸化和核转位。还可W 确定，CREB在133位丝氨酸处的憐酸化(pCREB)诱导基因转录，并在开始学习和记忆的过程 中起关键作用。
[0165] 由乳铁蛋白膳食补充剂上调或下调的抓N巧申经营养因子信号通路的有关基因汇 总
[0166]
[0167]塾
[01側 实例6:海马体中pCREB水平
[0169] 对38日龄小猪的海马体组织进行蛋白质印迹分析，W此测定pCR邸水平。
[0170] 如图18所示，乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中pCR邸的水平。
[0171] 基于实例4至实例6的结果推测，乳铁蛋白补充剂对认知和记忆的影响可至少部分 地来自其对BDNF水平的正面影响，W及BDNF对BDNF信号转导级联和pCR邸水平的后续影响。 [01。] 实例7:海马体和前额叶皮层中的化IySia-NCAM水平。
[0173] 对38日龄小猪的海马体和前额叶皮层组织进行蛋白质印迹分析，W此测定 PolySia-NCAM 水平。
[0174] 如图19所示，乳铁蛋白补充剂提高了海马体和前额叶皮层中PolySia-NCAM的水 平。
[0175] 由此发现了行为数据和PolySia-NCAM水平之间的相关性，运种相关性暗示，乳铁 蛋白膳食可能，至少部分地通过提高POlySia-NCAM水平来起作用。运表明，乳铁蛋白的唾液 酸部分可能在提高神经可塑性和LTM中起关键作用。
[0176] 对由乳铁蛋白补充剂提高的总polySia-NCAM水平进行定量评估的潜在缺陷在于， 运种多糖能够与其他神经营养因子形成络合物，因此可能难W用标准的SDS-PAGE电泳进行 定量。因此，本文所公开的有关海马体和前额叶皮层中poly-Sia-NCAM水平升高的结果，很 可能表示该多糖的较低水平，运一水平实际上已被乳铁蛋白上调。
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[0193] [16].van Liempt S,Vermetten E,Lentjes E,Arends J,Westenberg H: Decreased nocturnal growth hormone secretion and sleep fragmentation in combat-related posttraumatic stress disorder；potential predictors of impaired memory consolidation.Psychoneuroendocrino 2011(van Liempt S^Vermetten E、 Lentjes E、Arends J、Westenberg H，"夜间生长激素分泌减少和战争相关创伤后应激障碍 中的断裂性睡眠;记忆巩固受损的潜在预测因子"，《精神神经内分泌学〉〉,2011年）。
【主权项】
1. 乳铁蛋白用于在健康婴幼儿中改善记忆和/或学习速度以及/或者用于促进大脑成 熟的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述记忆为空间记忆，优选地为位置记忆。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述记忆为长期记忆，并且优选地为长期位置 记忆。4. 根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述乳铁蛋白被以100至400mg/kg体 重/天、优选125至350mg/kg体重/天、最优选145至285mg/kg体重/天范围内的日摄入剂量施 用给健康婴幼儿。5. 根据权利要求4所述的用途，其中所述乳铁蛋白的日摄入剂量在100至200mg/kg体 重/天范围内，优选地所述日摄入剂量为145mg/kg体重/天。6. 根据权利要求4所述的用途，其中所述乳铁蛋白的日摄入剂量在250至350mg/kg体 重/天范围内，优选地所述日摄入剂量为285mg/kg体重/天。7. 根据权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述乳铁蛋白的日摄入剂量被分为至 少两份、优选至少三份、最优选四份。8. 根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述乳铁蛋白在可摄入组合物中被提 供，所述可摄入组合物选自人类食品、第一阶段奶（startermilk)、成长奶(growingup milk)、婴幼儿喂养配方、婴儿食品及饮料，以及孕产妇营养食品(maternalnutritional food)〇9. 根据权利要求8所述的用途，其中所述乳铁蛋白以0.1至2g/L、优选0.25至1.5g/L、最 优选0.5至1.0g/L范围内的浓度存在于液体可摄入组合物中。10. 根据权利要求9所述的用途，其中所述乳铁蛋白以0.3至0.7g/L范围内的浓度、优选 以0.5g/L的浓度存在于液体可摄入组合物中。11. 根据权利要求9所述的用途，其中所述乳铁蛋白以0.8至1.2g/L范围内的浓度、优选 以1. 〇g/L的浓度存在于液体可摄入组合物中。12. 根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述乳铁蛋白以富集乳铁蛋白的乳 或乳清级分的形式被提供。
【专利摘要】本发明整体涉及婴幼儿认知功能的发育。更具体地讲，本发明提供了使用乳铁蛋白来改善生理状况(即非病理状况)下婴幼儿的记忆和/或学习速度，和/或用于促进其大脑的成熟。在一个方面，本发明展示出了乳铁蛋白具有改善健康婴幼儿的长期记忆例如长期地点记忆的效用。
【IPC分类】A61P25/00, A61K38/40, A23L33/19, A61P25/28
【公开号】CN105492018
【申请号】CN201480047830
【发明人】B·王, Z·郑, 王军宽, Z·董
【申请人】雀巢产品技术援助有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月27日
【专利说明】乳铁蛋白和儿童的巧忆和学习速度
[0001] 本发明整体设及婴幼儿认知功能的发育。更具体地讲，本发明提供了使用乳铁蛋 白来改善生理状况（即非病理状况)下婴幼儿的记忆和/或学习速度，和/或用于促进其大脑 的成熟。在一个方面，本发明示出了乳铁蛋白具有改善健康婴幼儿长期记忆(例如长期地点 记忆)的效用。
【背景技术】
[0002] 乳铁蛋白化F)是乳清级分中的一种分子量为SOkDa的糖蛋白，它由703个氨基酸残 基W及位于其N-端低聚糖链上的一到四分子的末端唾液酸（Sia)残基组成。乳铁蛋白最初 分离自乳汁，但也存在于其他体液(包括泪液、唾液、阴道分泌液、精液、鼻和支气管分泌物、 胆汁、胃肠液、尿液）中，并且乳铁蛋白在人的初乳和成熟乳中特别丰富，分别为6g/L和2g/L [1-4]。它属于转铁蛋白家族，又称乳转铁蛋白化TF)。乳铁蛋白对于婴幼儿展现出许多生物 学功能，例如调节肠道铁的吸收、调节免疫反应、抗氧化、抗癌、抗炎症、W及保护机体免受 微生物感染[5,6]。
[0003] 建议所有婴儿采用母乳喂养。然而，在一些情况下，母乳喂养并不够，或者不成功， 或者出于医学原因而不可取，或者母亲根本不选择母乳喂养或仅母乳喂养几个星期。鉴于 运些情况已经开发出了婴幼儿喂养配方。如今即食喂养配方已得到普遍使用，它在生命早 期为婴幼儿提供营养补充或唯一的营养来源。可用它们代替母乳或将它们同母乳一起用于 喂养婴幼儿。因此，如今婴幼儿喂养配方在组成和功能上的设计一般都尽可能类似母乳。
[0004] 最近，越来越多证据已经证实母乳喂养可提供长期的认知优势。然而，解释母乳喂 养和认知发育之间的关系的内在机制仍不清楚。乳铁蛋白是人乳中第二丰富的蛋白质，仅 少于酪蛋白[7]。有趣的是，每个乳铁蛋白分子含有一至四个唾液酸残基，并且动物实验表 明，唾液酸可能参与了学习和记忆[8，9 ]。
[0005] 因此本发明人认为，乳铁蛋白可在大脑快速生长时作为婴幼儿大脑发育和认知功 能的条件营养素起作用。如果是运样，乳铁蛋白的早期摄入应该在从胎儿时期到之后的生 命过程中均对脑的结构和功能产生显著影响。
[0006] 认知是指信息处理能力，包括感知、学习、记忆、判断和解决问题的能力。认知功能 的评价是机制和功能之间关系的神经科学研究的中屯、环节。一般来讲，我们认为学习和记 忆需要更高级的脑功能，而不是获取简单的神经元响应[10，11]。
[0007] 具体而言，记忆是生物体存储、保留和回忆信息的智力能力。可被测试的记忆现象 包括：（1)认识(记住了什么），（2)理解(运是什么意思）；（3)语境/功能(为什么要记住）；（4) 策略（如何记住）。记忆是一种复杂的屯、理过程，该屯、理过程与单个记忆领域过程并不是相 互独立的。记忆与其他若干个认知领域有关，包括感觉记忆、声音记忆和视觉记忆。
[000引记忆方面包括:
[0009]记忆是编码、存储和提取信息的过程。编码允许来自外部世界的信息W化学和物 理刺激的形式传递到动物的感官。存储是记忆的第二阶段或过程。运需要动物(例如人)将 信息保持一段时间。最后，第=过程是提取存储的信息。运些信息必须被定位，并将其返回 到意识中。
[0010] 短期记忆（STM)允许在无复述情况下回忆几秒到一分钟时间内的东西。短期记忆 编码(例如)声学信息，由神经元通信的瞬态模式支持，并依赖于额叶(尤其是背外侧前额叶 皮层)和顶叶区域，顶叶仅存储项目几秒钟。
[0011] 工作记忆与短期记忆在一定程度上重叠。其概念是指在执行复杂的认知任务时 (例如，学习，推理和理解），对所需信息进行临时存储、处理和操作的主动系统。
[0012] 动物工作记忆是指对一个测试阶段中使用的对象、刺激或位置的短期记忆，但运 些对象、刺激或位置通常不处于各阶段之间。
[0013] 长期记忆化TM)通过神经连接中更稳定和持久的变化而保持，所述神经连接的变 化广泛扩散到整个大脑，可W持续少至几日，长至数十年。长期记忆可存储更为大量的信 息。没有海马体，新的记忆就不能存储为长期记忆。
[0014] 空间记忆。在认知屯、理学和神经科学中，空间记是记忆的一部分，负责记录有关动 物的环境及其空间定向的信息。通常认为，在人类和其他动物中，空间记忆被概括为认知地 图。空间记忆表现在工作记忆、短期记忆和长期记忆之中。研究表明，大脑中存在与空间记 忆相关的特定区域。
[001引位置化区，也称为物体位置化区，是空间记忆的重要形式，包括不同的子组件，每 个子组件处理记忆中特定类型的信息，即记忆物体、记忆位置、记忆物体相互之间的位置W 及在记忆中结合运些特征。
[0016] 学习是获取新的知识、行为、技能、价值观或偏好，或者修改和加强现有的知识、行 为、技能、价值观或偏好，并且可能设及综合不同类型的信息。
[0017] 在评价用来研究认知功能(例如学习和记忆)的动物模型的效用时，有必要评估哪 些物种最为合适。早在40多年前就已认识到用猪来进行小儿大脑研究的可能性，运是由于 猪与人在出生时期的全脑生长、大体解剖W及新生儿大脑生长模式都具有相似性。猪消化 系统与人类婴幼儿具有相似的生理和解剖结构，并且猪具有与人相当的营养需求。运些使 得小猪非常适合用于协同营养、代谢和分子研究[引。猪具有弥补晒齿动物临床前研究和人 类临床试验之间的空白的潜力[11，12]。
[0018] -些研究提出了乳铁蛋白作为膳食补充剂的潜在益处：
[0019] WO 2010/130641设及婴幼儿肠道中神经元的健康和发育。含有乳铁蛋白的组合物 被证明可用于改善肠神经系统、修复受损肠神经系统，W及治疗或预防与肠神经系统发育 迟缓相关的疾病。
[0020] WO 2010/130643设及婴幼儿的大脑健康和发育。补充有乳铁蛋白的组合物被证明 可用于治疗或预防大脑或神经系统的发育迟缓，特别是IUGR(宫内生长受限）的婴幼儿(如 地塞米松诱发的早产的模型所示）。
[0021] WO 2010/130646设及成人的大脑健康和大脑保护。补充有乳铁蛋白的组合物被证 明可用于维持认知功能W及预防认知衰退和认知障碍。
[0022] WO 2013/076101设及白质。含有乳铁蛋白的组合物被证明可用于促进白质的发 育，治疗或预防白质的发育迟缓，W及治疗或预防白质的损失。
[0023] US 2013/0150306设及含有乳铁蛋白的基于乳的营养组合物。该专利特别地公开 了，为了调节屯、理压力，向孩子施用非人源的乳铁蛋白。
[0024] 运些研究都没有解决健康婴幼儿记忆和学习的问题。
[0025] 因此，本发明的目的在于提供乳铁蛋白的其他有益用途。
【发明内容】
[0026] 本发明的目的可通过独立权利要求指定的主题实现。本发明的具体实施例在从属 权利要求中指定。
[0027] 本发明的目的可通过使用乳铁蛋白改善健康婴幼儿记忆来实现。
[002引在一个实施例中，所述记忆为空间记忆，优选地为位置记忆。
[0029] 在一个实施例中，所述记忆为长期记忆，优选地为长期空间记忆，更优选地为长期 位置记忆。
[0030] 本发明的目的还可通过使用乳铁蛋白提高健康婴幼儿学习速度来实现。
[0031] 本发明的目的还可通过使用乳铁蛋白促进健康婴幼儿大脑成熟来实现。
[0032] 在一个实施例中，被^100至400111肖/1^体重/天或105至350111肖/1^体重/天或125至 350mg/kg体重/天或110至300mg/kg体重/天，优选140至290mg/kg体重/天或120至270mg/kg 体重/天或145至285mg/kg体重/天范围内的日摄入剂量施用给健康婴幼儿。
[0033] 在优选的实施例中，乳铁蛋白的日摄入剂量为中等剂量，例如在100至200mg/kg体 重/天或100至175mg/kg体重/天或110至160mg/kg体重/天或120至150mg/kg体重/天范围 内，优选128mg/kg体重/天或145mg/kg体重/天。运里，"中等剂量"还可W称为"中间剂量"或 "足够剂量"。
[0034] 在一个特别优选的实施例中，乳铁蛋白W中等的日摄入剂量(例如在前面段落中 所指定)施用给健康婴幼儿，用于提高学习速度和/或改善长期记忆。
[0035] 在另一个优选的实施例中，乳铁蛋白的日摄入剂量为高剂量，例如在220至320mg/ kg体重/天或225至325mg/kg体重/天或250至350mg/kg体重/天或230至310mg/kg体重/天或 240至300mg/kg体重/天的范围内，优选252mg/kg体重/天或285mg/kg体重/天。
[0036] 在一个特别优选的实施例中，乳铁蛋白W高的日摄入剂量(例如在前面段落中所 指定的)施用给健康婴幼儿，用于改善长期记忆，特别是长期位置记忆。
[0037] 在一个实施例中，乳铁蛋白的日摄入剂量被分为至少两份、优选至少=份、最优选 四份。
[0038] 在一个实施例中，乳铁蛋白被提供于可摄入的组合物中，此组合物优选地为可摄 入的液体组合物，此组合物选自：人类食品、孕产妇营养组合物、第一阶段奶 (startermUk)、成长奶(growing up mUk)、婴幼儿喂养配方和婴儿食品及饮料。
[0039] 在一个实施例中，乳铁蛋白Wo. 1至2g/L、优选0.25至1.5g/L、最优选0.5至1. Og/L 范围内的浓度存在于液体可摄入组合物中。
[0040] 在优选的实施例中，乳铁蛋白浓度Wo. 3至0.7g/L范围内的浓度、优选Wo. 5g/L的 浓度存在于液体可摄入组合物中。优选地，将此类液体可摄入组合物施用给健康婴幼儿，用 于提高学习速度和/或改善长期记忆。
[0041] 在可供选择的优选实施例中，乳铁蛋白WO. 8至1.2g/L范围内的浓度，优选W l.Og/L的浓度存在于液体可摄入组合物中。优选地，将此类液体可摄入组合物施用给健康 婴幼儿，用于改善长期记忆，特别是长期位置记忆。
[0042] 在一个实施例中，乳铁蛋白W富集乳铁蛋白的乳或乳清级分的形式被提供给健康 婴幼儿。
[0043] 在乳铁蛋白的用于改善健康婴幼儿记忆的上述用途中，乳铁蛋白可W通过富集乳 铁蛋白的可摄入组合物形式使用。富集意味着将乳铁蛋白添加到组合物中，使所得组合物 的乳铁蛋白含量比没有添加乳铁蛋白的组合物的乳铁蛋白含量高，或者采用某种方式对组 合物进行处理，浓缩组合物中的天然乳铁蛋白含量。
[0044] 乳铁蛋白也可作为纯的化合物提供。
[0045] 或者，乳铁蛋白可作为富集乳铁蛋白的级分被提供，例如富集乳铁蛋白的乳类或 乳清级分。
[0046] 例如可W使用牛乳、人乳、山羊乳、骆驼乳、马乳和/或驴乳作为乳或乳清源。也可 使用初乳。
[0047] 组合物W足够有效的量施用。足W实现运一点的量被定义为"有效剂量"。有效的 量将取决于本领域技术人员已知的多个因素。精确用量取决于若干个体因素，例如婴幼儿 的发育阶段或体重。
[004引典型的富集乳铁蛋白的组合物可包含至少1.6g/L的乳铁蛋白。
[0049]例如，本发明中所用的组合物含有乳铁蛋白的浓度可至少为0.75% (重量比），优 选地至少含有1% (重量比）的乳铁蛋白。在一个实施例中，待施用的组合物的量对应于如下 乳铁蛋白摄入量:至少0 .25g乳铁蛋白/天Ag体重，优选至少0.5g乳铁蛋白/天Ag体重，更 优选至少Ig乳铁蛋白/天Ag体重。
[(K)加]乳铁蛋白可W至少O.Olg/lOOkcal，优选至少O.lg/lOOkcal的浓度存在于组合物 中。例如，乳铁蛋白可W约O.Olg/lOOkcal组合物至lOOg/lOOkcal组合物、优选0.1 g/ IOOkcal组合物至50g/100kcal组合物、甚至更优选2g/100kcal组合物至25g/100kcal组合 物的范围存在于组合物中。
[0051] 乳铁蛋白也可结合其他化合物一起使用，例如唾液酸和/或铁。
[0052] 特别优选的含有乳铁蛋白的组合物可另外包含唾液酸，其量在IOOmg唾液酸/100g 组合物（重量比）至1000 mg唾液酸/100g组合物（重量比）的范围内，例如500mg唾液酸/100g 组合物(重量比）至650mg唾液酸/100g组合物(重量比）的范围内。
[0053] 例如本发明所用的组合物可包含至少约0.001%的唾液酸(按重量计）。在本发明 的其他实施例中，该组合物可包含至少约0.005%或至少约0.0 l %的唾液酸(按重量计）。
[0054] 作为另外一种选择或除此之外，含有乳铁蛋白的组合物可包含铁，其量在约Img 铁/100g组合物(重量比）至50mg铁/100g组合物(重量比）的范围内，例如IOmg铁/100g组合 物(重量比）至30mg铁/1 OOg组合物(重量比）。
[0055] 例如一种含有乳铁蛋白的组合物可包含约852mg/100g(重量比）的唾液酸和22mg/ 100g(重量比）的铁。
[0化6] 本发明的含有乳铁蛋白的组合物可具有30kcal/100g组合物至lOOOkcal/lOOg组 合物，优选50kcal/100g组合物至450kcal/100g组合物范围内的热量密度。例如组合物可具 有约400kcal/100g的热量密度。
[0057] 该组合物的性质没有特别限制。它优选为口服或经肠施用的组合物。
[0058] 该组合物例如可选自食品、动物食品、药物组合物、营养制剂、保健营养品、饮料、 食品添加剂和婴幼儿喂养配方。
[0059] 在一个典型的实施例中，该组合物将包含蛋白质源、脂质源和碳水化合物源。
[0060] 例如，此类组合物可包含在约2至6g/100kcal的范围内的蛋白质，在约1.5至3g/ IOOkcal范围内的脂质和/或在约1.7至12g/100kcal范围内的碳水化合物。如果该组合物是 液体，其能量密度可在60至75kcal/100ml之间。
[0061 ] 如果该组合物是固体，其能量密度可在60至75kcal/100g之间。
[0062] 蛋白质的类型被认为对本发明无关紧要。因此，可使用例如基于乳清、酪蛋白及其 混合物的蛋白质源。就乳清蛋白而言，可使用酸乳清或甜乳清或其混合物，W及W任何所需 比例混合的O-乳白蛋白和e-乳球蛋白。乳清蛋白可为经改性的甜乳清。甜乳清是较易获得 的奶酪制作过程的副产品，常用于制取基于牛乳的婴幼儿配方。然而，甜乳清中包含一种名 为酪蛋白糖巨肤(CGMP)的组分，该组分不期望地富含苏氨酸，而色氨酸含量很少。将CGMP从 甜乳清中去除可使得蛋白质中苏氨酸的含量更接近于人乳中苏氨酸的含量。然后可在运种 经改性的甜乳清中补充那些有关的含量低的氨基酸(主要是组氨酸和色氨酸）dEP 880902 中描述了将CGMP从甜乳清中除去的方法，WO 01/11990中描述了基于此类经改性的甜乳清 的婴幼儿配方。所述蛋白质可为完整的或水解的蛋白，或为完整蛋白和水解蛋白的混合物。 例如，对于被认为处于发生牛乳过敏风险的受试者而言，提供部分水解的蛋白质(水解程度 在2%与20%之间）可能是可取的。如果需要水解的蛋白质，则可根据需要并且如本领域已 知的那样进行水解过程。例如，可通过如在EP 322589中所述的两个步骤对乳清级分进行酶 法水解，W制备乳清蛋白水解物。对于深度水解蛋白，所述乳清蛋白可进行先使用碱性蛋白 酶Alcalase 2.化化C 940459)，再使用中性蛋白酶化UtraseO.化(可得自诺和诺德股份公 司（Novo Nordisk Ferment AG))，最后使用膜酶在55°C下的S重水解。如果用作原料的乳 清级分基本上不含乳糖，则发现该蛋白质在水解过程中经受少得多的赖氨酸阻断。运使得 能够将赖氨酸阻断的程度从总赖氨酸的约15重量％降低至不到赖氨酸的约10重量％，例如 赖氨酸的约7重量％，运大大地提高了蛋白质源的营养质量。
[0063] 本发明中所用的组合物可包含碳水化合物源。可使用任何碳水化合物源，例如乳 糖、薦糖、麦芽糖糊精、淀粉及它们的混合物。
[0064] 本发明中所用的组合物可包含脂质源。脂质源可W是任何脂质。优选的脂肪源包 括乳脂肪、栋桐油精、高油酸向日葵油和高油酸红花油。可添加必需脂肪酸亚油酸和Q-亚麻 酸，也可添加含有丰富初加工的花生四締酸和二十二碳六締酸的少量油，例如鱼油或微生 物油。在脂质源中，n-6和n-3脂肪酸的比例优选地约为5:1至15:1;例如约8:1至10:1。
[0065] 本发明的组合物也可包含据悉为日常饮食所必不可少并且在营养上大量需求的 所有维生素和矿物质。某些维生素和矿物质的最小需要量已被确定。矿物质、维生素和任选 地存在于婴幼儿配方中的其他营养物质的例子包括维生素 A、维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、维生素 B12、维生素 E、维生素 K、维生素 C、维生素 D、叶酸、肌醇、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、 巧、憐、舰、铁、儀、铜、锋、儘、氯化物、钟、钢、砸、铭、钢、牛横酸和左旋肉碱。矿物质通常W盐 的形式加入。特定矿物质和其他维生素的存在及其量将根据许多因素而变化，例如，待施用 组合物的人或动物的年龄、体重和状况。
[0066] 组合物还可包含至少一种益生菌菌株。益生菌是指对宿主的健康或良好状态具有 有益效果的微生物细胞制剂或微生物细胞成分。如果存在益生菌的话，它的量同样优选地 根据人或动物的年龄而变化。一般来讲，益生菌含量可随婴幼儿年龄增大而增加，例如从10 <3〉cfu/g配方(干重)增大到10<12〉cfu/g配方(干重），更优选10<4〉cfu/g配方(干重)增大 到10<8〉cfu/g配方(干重）。
[0067] 该组合物还可包含至少一种益生元，其含量为0.3%至10%。益生元是不可消化的 食品成分，其通过选择性地刺激结肠中一种或有限数量的细菌的生长和/或活性对宿主产 生有益地影响，从而改善宿主健康状况。运些成分是不可消化的，在运个意义上来讲，它们 在胃或小肠中是不能被分解和吸收的，因而它们可W完整地通过胃和小肠到达结肠，在结 肠处通过有益细菌选择性地发酵。益生元的例子包括某些寡糖，例如低聚果糖(FOS)和低聚 半乳糖(G0S)。可使用益生元的组合，例如90%的GOS与10%的短链低聚果糖的组合(例如W 商标Raf t i Io Se (R)销售的产品），或90 %的GOS与10 %的菊粉的组合(例如W商标Raf t i 1 ine (R)销售的产品）。
[0068] 该组合物可选择性地包含可具有有益效果的其他物质，如核巧酸、核巧等。
[0069] 本发明所用的组合物例如婴幼儿配方，可W通过任何合适的方式制备得到。例如， 婴幼儿配方可通过将蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源W合适的比例混合在一起制备得 到。如果使用乳化剂，则可将其包含在混合物中。此时可加入维生素和矿物质，但为了避免 热降解，通常在稍晚一点的时候加入。任何亲脂性维生素、乳化剂等可在混合之前先溶解在 脂肪源内。然后可加入水混合形成液体混合物，优选地是经过反渗透处理的水。随后可对液 体混合物进行热处理W降低细菌量。例如，可将液体混合物迅速加热到约80°C至110°C范围 内的溫度，保持约5秒至约5分钟。运可通过蒸汽喷射或热交换器例如板式换热器进行。然后 可将液体混合物冷却到约60°C至约85°C，例如通过急速冷却的方法。接着可将液体混合物 进行均质处理;例如分两个阶段进行，第一阶段在约7M化至约40M化下进行，第二阶段在约 2M化至约14M化下进行。然后可进一步冷却均质的混合物W加入任何热敏感组分，如维生素 和矿物质。此刻顺便将均质的混合物的pH和固形物含量标准化。将均质的混合物转移至合 适的干燥装置(例如喷雾干燥器或冷冻干燥器），并将其转化成粉末。该粉末应具有小于约5 重量％的含水量。如果需要增加一种或多种益生菌，可根据任何合适的方法培养所述益生 菌，然后例如通过冷冻干燥或喷雾干燥方式制成，W供添加到婴幼儿配方中。或者，可从专 业供应商如科汉森公司（化ristian化nsen)和森永制果公司（Morinaga)购买已经制成合 适形式的细菌制品W供添加到食品如婴幼儿配方中。此类细菌制品可通过干混方式添加到 粉状的婴幼儿配方中。
[0070] 乳铁蛋白可在该过程中的任何阶段加入，但优选地在加热步骤之后添加。
[0071 ] 该组合物包含蛋白质源，所述蛋白质源可在1.4g/100kcal组合物至lOOg/lOOkcal 组合物，优选在1.4g/100kcal组合物至6.0g/100kcal组合物之间的范围内存在。由于乳铁 蛋白是蛋白质，因此应当认为它是蛋白质源的一部分。
[0072] 已知乳清蛋白提供多个健康益处。例如它易于消化。乳清的蛋白级分（占乳清内总 干物质的大约10 %)包括几种蛋白级分，如e-乳球蛋白、a-乳白蛋白、牛血清白蛋白和免疫 球蛋白。在一个实施例中，乳清蛋白占蛋白源的重量百分比至少50%，优选地至少75%，甚 至更优选地至少85 %。
[0073] 如果存在脂质源的话，它可贡献组合物总能量的30%至55%。碳水化合物源可贡 献组合物总能量的35%至65%。
[0074] 也可在本发明的组合物中加入唾液酸。唾液酸是神经氨酸的N端或0端被取代的衍 生物的通用名称，它是具有九碳主链的单糖。
【具体实施方式】
[0075] 研究发现在生理条件下，乳铁蛋白膳食补充剂改善了小猪的位置记忆和长期记 忆，提高了小猪的学习速度，基于此提出了本发明。
[0076] 在第一组实验中，乳铁蛋白经证实改善了36至38日龄小猪的位置记忆。具体地讲， 喂养高剂量乳铁蛋白（约225至325mg/kg体重/天）的小猪比对照组小猪表现出明显更好的 30分钟长期位置记忆。
[0077] 第二组实验数据表明，乳铁蛋白膳食补充剂大大改善了在八臂迷宫中测试的22至 32日龄小猪的记忆并提高了其学习速度。实验结果表明，喂养中等剂量（约100至175mg/kg 体重/天)和高剂量乳铁蛋白的小猪的40分钟长期记忆和3小时长期记忆都得到改善。有趣 的是，学习速度提高得最多的是喂养中等剂量乳铁蛋白的小猪。
[0078] 另一组实验表明，乳铁蛋白补充剂上调了海马体中脑源性神经营养因子(抓NF)的 mRNA表达，并且激活了抓NF信号通路。
[0079] 可通过上调该通路中的关键基因（例如Trk3、IRSl、GRB2、CAMKl、MAPK、SPdP CREBl)观察到抓NF信号通路的激活。
[0080] 实验还表明乳铁蛋白补充剂增加了海马体中憐酸化CREB(pCREB)的水平。
[0081 ]可W确定，BDNF信号通路的激活会加强CR邸的憐酸化和核转位。还可W确定，CREB 在133位丝氨酸处的憐酸化(pCREB)可诱导基因转录，并在开始学习和记忆的过程中起关键 作用。
[0082] 另一组实验数据表明，乳铁蛋 白膳食补充剂提高了海马体和前额叶皮层中多聚唾 液酸神经细胞黏附分子(NCAM)的表达水平。运表明，乳铁蛋白的唾液酸部分可能是提高神 经可塑性和促进LTM巩固的关键因素。
[0083] 根据本发明所用的乳铁蛋白可从各种来源获得。它可W纯化得到，例如从乳或乳 清中纯化，也可W重组产生。从天然来源纯化得到的乳铁蛋白具有W下优点：它是一种天然 成分，大都从食品级组合物中获得，并且可经过或不经过进一步纯化而用作食品组合物的 富集级分。作为天然来源，可考虑人乳(母乳)或非人源的乳，例如牛乳、山羊乳、骆驼乳、马 乳或驴乳。还可考虑初乳。重组获得的乳铁蛋白具有如下优点：能够轻松制备高浓度的乳铁 蛋白。
[0084] 可将乳铁蛋白添加到组合物中，W使得所得的组合物的乳铁蛋白含量比未添加乳 铁蛋白的组合物的乳铁蛋白含量更高。或者，可对天然包含乳铁蛋白的组合物进行处理W 浓缩组合物中天然乳铁蛋白的含量，例如制得富集乳铁蛋白的乳或乳清级分。乳铁蛋白也 可作为纯的化合物提供。
[0085] 可将乳铁蛋白作为可摄入组合物的成分提供，即口服组合物。也可考虑经肠施用 的组合物。
[0086] 优选地将乳铁蛋白，或包含乳铁蛋白的可摄入组合物施用于婴幼儿。也可考虑将 乳铁蛋白或包含乳铁蛋白的可摄入组合物施用于妊娠期和/或哺乳期母亲。
[0087] 乳铁蛋白也可结合其他化合物(例如唾液酸和/或铁)一起提供。
[0088] 权利要求中所用术语"记忆"及其多个方面的定义如前言部分所概述。
[0089] "学习速度"是指学习一项学习任务所需的持续时间或试验的次数。
[0090] "大脑成熟"主要是指大脑发育的过程，包括从最早期的胚胎形成到生命的最后几 年，中枢神经系统的生成、塑造和重塑。
[0091] "健康婴幼儿"是指为足月新生儿(就人类新生儿而言，是指怀孕37周后出生的新 生儿）的婴幼儿，即与早产儿相比，足月出生的新生儿在出生时体重正常，没有任何认知功 能障碍或大脑发育迟缓，并且出生时没有经历过宫内生长受限（IUGR)或低氧血症缺血。因 此，从更广泛的意义上来讲，"健康"是指婴幼儿正常的发育或生理的发育，即非病理性发 育，特别是就认知功能而言的非病理性发育。
[0092] 婴幼儿可W是新生儿、婴儿、幼儿、学龄前儿童或学龄儿童，是指从出生到14岁年 龄的孩子。
[0093] 新生儿通常定义为从大约出生到1个月的宝宝。婴儿通常是指6到12个月的宝宝。 幼儿是指12到36个月的儿童。学龄前儿童是指36个月至5岁的儿童。学龄儿童是指5岁至14 岁的儿童。
[0094] 虽然优选的是人类健康婴幼儿，但也可考虑相应年龄的非人类哺乳动物。
[0095] 根据下面的实例和附图，本发明的其他优点和特征对本领域的技术人员来说是显 而易见的。
[0096] M所示为四个隔板中的一个，其上放置着装有乳的碗。
[0097] 圏兰所示为小猪不能触及乳（即装有乳的碗被盖子覆盖）的情况（图2A)，W及与此 相反，小猪能够触及乳(即碗未被盖住)的情况(图2B)。
[0098] 圏^所示为位置记忆测试安排。
[0099] 圏兰所示为错误（图4A)或成功（图4B)情况下的位置记忆测试安排。当小猪首先访 问在前次试验中装有可触及乳的碗时，表示成功。
[0100] 圏互所示为用于位置记忆测试安排的时间表。
[0101] 图些所示为整个研究中各组的平均（±SE)增重。基于一般线性模型(单变量方差分 析)和Bonferroni调整的多重比较显示各组间没有显著差异(P〉0.05)。
[0102] 圏互所示为四个不同年龄段的小猪的促肾上腺皮质激素(ACTH)(图7A)或皮质醇 (图7B)在血液中的浓度。ACTH的浓度Wpg/ml为单位，皮质醇的浓度Wiig/ml为单位。
[0103] 图查所示为关于位置记忆的总成功次数(10次试验）。
[0104] 图马所示为不同测试阶段中关于位置记忆的成功次数。
[0105] 图10所示为短期（STO)和长期化!￥)位置记忆的平均成功次数(平均值±55)。标记 30分钟LTM相关误差条的不同字母(a, ab，b)表示，使用单因素方差分析和最小显著性差异 (LSD)调整进行多重比较的各组间具有统计意义上的显著性差异(P = O.046)。
[010W 图11所示为不同时间间隔的工作巧区(冲= 0.026，<0.05;双因素方差分析）。
[0107] 图12所示为八臂迷宫^及用于简单任务和困难任务的视觉提示。
[0108] 图13所示为八臂迷宫中简单和困难任务的流程。LTM:长期记忆，STM:短期记忆。
[0109] 图14分别显示了小猪在简单任务和困难任务中的学习速度曲线，该学习速度曲线 用错误和成功作为使用Cox回归分析方法分析的协方差。
[0110] 图15所示为海马体中脑源性神经营养因子(BDNF)的相对mRNA水平(平均值± SE)。 乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中的抓NF表达水平(P<0.05)。
[0111] 图16所示为海马体中抓NF的蛋白水平(平均值±55)。中等剂量的乳铁蛋白补充剂 显著提高了海马体中抓NF蛋白的水平(P<0.05)。
[0112] 图17所示为抓NF信号通路。
[0113] 图18显示乳铁蛋白补充剂提高了海马体中pCR邸的水平(平均值±55)。
[0114] 图19显示乳铁蛋白补充剂提高了海马体和前额叶皮层中POlySia-NCAM的水平(平 均值±SE)。
[0115] ^ I^lJ
[0116] 实例1:动物处理
[0117] 1.1.动物
[0118] 由于小猪在生理学、解剖学和遗传学方面与人类婴幼儿高度相似，故将小猪用作 动物模型。
[0119] 购买来自16窝的六十屯只3日龄雄性家养小猪(长白猪与大白猪杂交所得子一代 (Sus SCOrfa LarKlraceXLa;rge White F1))，并根据重量和窝随机分成4组。分组和饮食信 息概述于表1中。将所有动物成对圈养在溫控环境下，经历12小时光照(08:00-20:00)和黑 暗(20:00-08:00)周期。每个住处栏圈包含"窝"（覆盖有干净毛巾的橡胶轮胎）、窝上方的加 热灯W及相同的木制玩具。行为实验室对小猪的最大容量为16只。因此进行了5次试验，每 次试验10至16只小猪，W达到每组16只小猪。用摄像监控系统监视小猪。在每次试验中，对 两只3日龄小猪实施安乐死，用作基线对照(n = 10)。该研究方案经厦口大学动物伦理委员 会(Xiamen University Animal Ethics Committee)批准。
[0120] 表1动物分组的细节
[01。] 1.2.乳铁蛋白喂食方案
[0123]牛乳乳铁蛋白（0乳铁蛋白）购自DMV国际公司（DMV International)。用包含大豆 蛋白/乳清蛋白/酪蛋白（50:38:12)的标准猪乳代用品喂养每只小猪(3日龄到38日龄）。最 终乳中的乳铁蛋白量根据组别而不同（参见表1):0.05g/L(组1，未添加乳铁蛋白的对照组， 11=16)、0.5邑/1(组2，中等剂量组，11 = 17)、1邑/1(组3，高剂量组，11=15)。组1至组3中的所有 小猪都经过学习测试。组4(n=16)接受与组3(lg/L)剂量相同的乳铁蛋白，但未经过学习测 试(作为假处理组）。运些浓度表示，在对照组、中等剂量组和高剂量组中，乳铁蛋白的近似 摄入量分别为15、145和285mg/kg体重/天。猪乳代用品被配制成使得总蛋白质摄入量，在不 考虑添加的乳铁蛋白的量时保持相同。为了维持正常的生长速率，小猪在研究的最初2周里 接受的乳量为285ml乳Ag体重/天，剩下几周里为230ml乳Ag体重/天。喂养时间为08:00、 13:00、18:00和22:30，在最后一次喂养中向每只猪额外提供了 50ml乳。每天记录小猪的体 重、乳摄入量和健康状态。
[0124] 1.3.体重
[0125] 每天早上喂食前测量小猪的体重。结果显示，各个组中的平均（±SE)初始体重相 同（1.908±0.044kg)，并且运些动物体重增加的速率相似（图6)。虽然在研究终点第3组比 其他组体重增加得更快，但第23天(P = 0.937)、第29天(P = 0.899)和第36天(P = 0.888)的 组间差异不显著。我们的结果与之前的报道不同，根据之前的报道，用乳铁蛋白和铁补充剂 配方喂养的婴幼儿比W单独铁补充剂配方喂养的婴幼儿体重增加更多[13]。
[01%] 1.4.应激激素
[0127]众所周知，压力经历可影响学习和记忆过程。压力通常被定义为干扰生物体生理 或屯、理内稳态的任何状况[14]。多种不同类型实验证据表明，在情绪唤醒经历期间或之后 释放的肾上腺应激激素在巩固持久记忆中起关键作用。压力事件激活下丘脑-垂体-肾上腺 化PA巧由，引起血浆中皮质酬或皮质醇水平缓慢升高[15]。大量实验研究了肾上腺应激激素 对记忆的影响，运些实验提供了大量证据，证明了在动物和人类受试者中，肾上腺素和糖皮 质素调节长期记忆巩固[16]。在运一背景下，我们监测了小猪血液中的应激激素水平。
[012引从每只3日龄、17日龄、28日龄和39日龄的小猪身上采集血样。在4°C下W3000巧m 离屯、样品15分钟，然后将血浆保存在-80°C下，至分析才取出。使用罗氏电化学发光免疫分 析仪（Roche electrochemical luminescence immune 曰n曰Iyzer)(罗氏E601 (Roche E601)，中山市医院（Zhongshan Hospital))，通过电化学发光免疫测定法测量血浆中的两 种应激激素，即促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇。由经验丰富的技术人员根据制造商在 各方面的说明来处理所有分析。使用各制造商提供的质控品对所有分析运行进行质量控 审IJ。结果未发现对血液中应激激素水平的影响（图7;P〉0.05,双因素方差分析）。
[0129] 1.5.统计分析
[0130] 如有必要，使用一般线性模型（单变量方差分析)和Bonferroni调整多重比较来分 析组间的记忆差异。借助适用于WINDOWS的SPSS 19(伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司（SPSS Inc，化icago，IL))完成所有统计分析。使用0.05显著性水平。
[01引]实例2:乳铁蛋白对小猪位置记忆的影响 [0。。2.1.位置记忆测试
[0133] 对36日龄的小猪进行了位置记忆测试。允许小猪自己熟悉测试区域。组1(对照，n =16 )、组2(中等剂量，n = 17)和组3(高剂量，n = 18)的小猪进行位置记忆测试。测试中，将 四个固定的隔板(0.3 XO. 35 XO. 50m)(图1)放置在左前方(位置1)、左角(位置2)、巧聯区域 中央前方(位置3) W及右后角（位置4)，其中位置1、2和4的隔板面向口，分别离侧壁0.7m、 0.8m和0.9m(图3)。在任务区中，有四个碗隐藏在所述四个隔板中，但只有一个碗里的乳是 可触及的（图2B)，其他=个碗中的乳不可触及（图2A)。当待在隔板前面时，小猪不能看到运 些碗。它们必须绕到隔板背面，才能找到可触及或不可触及的乳。在每次试验中随机改变装 有可触及乳的碗。对每只小猪进行了 10次试验，包括早上4次试验，下午4次试验，W及次日 早上2次试验。预期"更聪明"的 小猪将更快找到可触及的乳，而不需要再次访问任何不可触 及乳碗。当小猪再次访问任何不可触及乳的位置时，则记录为错误。通过直接观察来记录小 猪在测试区域中的行为，并用录像带记录W用于进一步分析。所有测试由训练有素的工作 人员进行。
[0134] 当小猪进入测试区，然后首先访问在前次试验中发现可触及乳碗的位置（图4B) 时，记录位置记忆。测试了两种类型的位置记忆:短期记忆(STM)和长期记忆化TM)。在本研 究中，我们将STM定义为对间隔时间为5分钟或更短的2次连续试验的记忆。将所有持续时长 超过5分钟的位置记忆视为LTM。本研究中有S种类型的LTM: (1)30分钟LTM(早上）；（2)4小 时LTM(下午第一次试验）；（3) 16小时LTM(次日早上第一次试验）。位置记忆测试的计划表如 图5所示。
[0。引 2.2.结果
[0136]各组间位置记忆的整体差异如表2所示。中等剂量组和高剂量组具有比对照组更 好的位置记忆，但差异未达到统计显著性(P〉〇. 05)。然而，当我们基于成功率分析数据时， 中等剂量组和高剂量组取得的成功比对照组多30%，其中成功率为小猪取得的实际成功数 比总理论成功数的比值(表2)。
[0。7] 表2位置记忆成功率
[0139] *1.成功率=(实际成功数/理论成功数）X 100%
[0140] 9次位置记忆试验的平均成功数如图8所示。虽然乳铁蛋白处理组在位置记忆方面 的表现比对照组好，但统计分析结果未达到显著性(P〉〇.05)。
[0141] 我们还发现，当我们把前5次试验视为习得阶段学习，而把后5次视为提取阶段学 习时，乳铁蛋白处理组在位置记忆方面的表现比对照组好(图9)。
[0142] 将任何时间间隔不超过5分钟的位置记忆定义为短期位置记忆。将时间间隔超过5 分钟的记忆定义为长期位置巧区。短期位置记忆和长期位置记忆的总成功数汇总于表3中。 [01创表3短期记忆和长期记忆成功率
[0145] *1.成功率=(实际成功数/理论成功数）X 100%
[0146] P = O.026
[0147] 运些结果表明，用乳铁蛋白处理的组在短期记忆测试和长期记忆测试中均表现得 更好。具体地讲，高剂量组比对照组表现出明显更好的30分钟长期记忆(P = O.046)(图10)。 [014引此外，除了试验5和试验6 W外，用乳铁蛋白处理的组在位置记忆试验中比对照组 表现得更好（图11)。具体地讲，在试验7中，处理组明显比对照组表现得更好(P = O.026,双 因素方差分析）。
[0149] 实例3:乳铁蛋白对小猪学习速度和记忆的影响
[0150] 3.1.学习和记忆测试
[0151] 使用八臂迷宫法[引测试学习和记忆能力的认知功能。将小猪逐一引入八臂迷宫 中。进行了两种测试："简单任务"（任务1)和更"困难的任务"（任务2)(图12)。两种测试均在 一个臂中放有可触及的乳，而在其余7个臂中放有不可触及的乳，从而所有臂都具有相同的 气味，防止嗅觉学习（图12)。在两种测试中，将由3个黑点组成的视觉提示随机放置在臂中 有可触及的乳(与该组的乳相对应）的口上。在简单任务中，将一个黑点的视觉提示放置在 具有不可触及乳（与可触及乳的量和类型相同）的其余7个口上。在困难任务中，将有2个黑 点的视觉提示放置在其余7个口上。3个黑点的视觉提示的位置在不同试验之间按预定的随 机顺序变化。从第22天(22日龄的小猪)起，在为期10天的周期里对任务1和任务2各进行了 四十次试验。
[0152] 根据成功学会识别视觉提示所用的试验次数来确定对学习能力的评估。使用在各 次试验中寻找可触及乳臂时的错误数和成功数来量化学习。每当小猪进入错误的口或者将 其整个头部穿过错误的口时，即记录为错误。当小猪进入正确的口时则记录为成功。学会识 别视觉提示的标准是：（A)3次连续试验中最多出现1次错误，（B)3次连续试验中未出现错 误，（C)4次连续试验中最多出现1次错误，（D)4次连续试验中未出现错误，化)5次连续试验 中最多出现1次错误，（F)在5次连续试验中未出现错误。在学习和记忆测试期间，头顶摄像 机连续进行记录，同时，训练有素的观察者手动记录结果。由训练有素的工作人员进行所有 测试，运些工作人员对乳铁蛋白摄入水平不知情。通过对视频资料进行独立分析来证实结 果。为了减轻压力并使小猪熟悉测试规程，我们允许来自同一窝的两只小猪进入迷宫，W在 学习巧聯前学习如何开口和关口（ 8次试验）。
[0153] 每天早上4次试验，下午4次试验。对一只小猪进行两次连续试验。两次试验的意向 间隔时间（改变视觉提示并放置新鲜乳)为5分钟巧分钟短期记忆），在运5分钟内，小猪位于 等待区（在测试区外）。40分钟后(40分钟长期记忆），再次将小猪引入八臂迷宫，进行另外2 次连续试验。下午，对小猪重复进行上午的测试。早上和下午测试之间的意向间隔时间为3 小时（3小时长期记忆）。16小时后的第二天，我们重复了与前一天测试相同的任务（16小时 长期记忆）。简单任务和困难任务的试验总次数为40次。完成简单和困难试验四十八小时 后，让已达到学会标准的小猪再次进行相同模式的任务，作为"48小时长期记忆"。将寻找可 触及乳时的错误数记录为记忆指标。简单和困难任务安排的过程如图13所示。
[0154] 在图14所示的简单学习任务中，当我们将前20次试验(学习习得阶段)的错误总数 视为协变量kovariaes)用于分析时，乳铁蛋白补充剂显著提高了学习速度(P<0.05)。在困 难学习任务中，当我们将所有40次试验(强化)的总成功数视为共变量(covaries)用于分析 时，bLF补充剂显著提高了学习速度。
[01巧]3.2结果
[0156]与高剂量组和对照组相比，中等剂量组的学习速度(基于学会识别视觉提示所用 的试验次数)是最快的。当把每天的错误数用作学习的度量时，结果表明，对照组的小猪在 困难任务测试中出错更多。第4天的组间差异显著(P<0.05,一般线性模型），运天可视为学 习过程的提取阶段。在保留间隔时间为5分钟、40分钟和3小时时，用乳铁蛋白处理的组存在 记忆改善的趋势。显著的记忆改善出现在间隔时间为40分钟和3小时时，但未出现在间隔时 间为16小时和48小时时。结果说明，对于38日龄的小猪而言，回忆起视觉提示的最大保留间 隔时间（记忆能力）为3小时。然而，不同保留间隔时长下的记忆测试中没有剂量响应。
[0157] 实例4:海马体中抓NF基因表达
[015引对38日龄小猪的海马体组织进行定量逆转录PCR分析(qRT-PCR)，来测定脑源性神 经营养因子(抓N巧的基因表达。
[0159] 如图15所示，乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中抓NF的相对mRNA水平。此外，中 等剂量乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中的抓NF蛋白水平(图16)。
[0160] 由此发现了行为数据和抓NF基因表达结果之间的相关性，运种相关性暗示，乳铁 蛋白膳食可能通过提高抓NF的表达来起作用。
[0161] 实例5:抓NF信号通路中关键基因的表达
[0162] 通过对38日龄小猪的海马体组织进行Affymetrix基因微阵列分析，来测定抓NF信 号通路中关键基因的表达。分析的关键基因在表4中列出。
[0163] 从表4所示的结果可W看出，乳铁蛋白补充剂提高了海马体中抓NF、GRB2、IRS1、 Tr k3、RAPGEF1 (C3G )、CAMK、MAPK11、MAPK12、CREB1、SP1、MYC 和 ESR1 的表达。运些都是抓 NF 信 号通路中的关键基因。BDNF信号通路如图17所示。
[0164] 如上所述，可W确定抓NF信号通路的激活会加强CR邸的憐酸化和核转位。还可W 确定，CREB在133位丝氨酸处的憐酸化(pCREB)诱导基因转录，并在开始学习和记忆的过程 中起关键作用。
[0165] 由乳铁蛋白膳食补充剂上调或下调的抓N巧申经营养因子信号通路的有关基因汇 总
[0166]
[0167]塾
[01側 实例6:海马体中pCREB水平
[0169] 对38日龄小猪的海马体组织进行蛋白质印迹分析，W此测定pCR邸水平。
[0170] 如图18所示，乳铁蛋白补充剂显著提高了海马体中pCR邸的水平。
[0171] 基于实例4至实例6的结果推测，乳铁蛋白补充剂对认知和记忆的影响可至少部分 地来自其对BDNF水平的正面影响，W及BDNF对BDNF信号转导级联和pCR邸水平的后续影响。 [01。] 实例7:海马体和前额叶皮层中的化IySia-NCAM水平。
[0173] 对38日龄小猪的海马体和前额叶皮层组织进行蛋白质印迹分析，W此测定 PolySia-NCAM 水平。
[0174] 如图19所示，乳铁蛋白补充剂提高了海马体和前额叶皮层中PolySia-NCAM的水 平。
[0175] 由此发现了行为数据和PolySia-NCAM水平之间的相关性，运种相关性暗示，乳铁 蛋白膳食可能，至少部分地通过提高POlySia-NCAM水平来起作用。运表明，乳铁蛋白的唾液 酸部分可能在提高神经可塑性和LTM中起关键作用。
[0176] 对由乳铁蛋白补充剂提高的总polySia-NCAM水平进行定量评估的潜在缺陷在于， 运种多糖能够与其他神经营养因子形成络合物，因此可能难W用标准的SDS-PAGE电泳进行 定量。因此，本文所公开的有关海马体和前额叶皮层中poly-Sia-NCAM水平升高的结果，很 可能表示该多糖的较低水平，运一水平实际上已被乳铁蛋白上调。
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【主权项】
1. 乳铁蛋白用于在健康婴幼儿中改善记忆和/或学习速度以及/或者用于促进大脑成 熟的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述记忆为空间记忆，优选地为位置记忆。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其中所述记忆为长期记忆，并且优选地为长期位置 记忆。4. 根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述乳铁蛋白被以100至400mg/kg体 重/天、优选125至350mg/kg体重/天、最优选145至285mg/kg体重/天范围内的日摄入剂量施 用给健康婴幼儿。5. 根据权利要求4所述的用途，其中所述乳铁蛋白的日摄入剂量在100至200mg/kg体 重/天范围内，优选地所述日摄入剂量为145mg/kg体重/天。6. 根据权利要求4所述的用途，其中所述乳铁蛋白的日摄入剂量在250至350mg/kg体 重/天范围内，优选地所述日摄入剂量为285mg/kg体重/天。7. 根据权利要求4至6中任一项所述的用途，其中所述乳铁蛋白的日摄入剂量被分为至 少两份、优选至少三份、最优选四份。8. 根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述乳铁蛋白在可摄入组合物中被提 供，所述可摄入组合物选自人类食品、第一阶段奶（startermilk)、成长奶(growingup milk)、婴幼儿喂养配方、婴儿食品及饮料，以及孕产妇营养食品(maternalnutritional food)〇9. 根据权利要求8所述的用途，其中所述乳铁蛋白以0.1至2g/L、优选0.25至1.5g/L、最 优选0.5至1.0g/L范围内的浓度存在于液体可摄入组合物中。10. 根据权利要求9所述的用途，其中所述乳铁蛋白以0.3至0.7g/L范围内的浓度、优选 以0.5g/L的浓度存在于液体可摄入组合物中。11. 根据权利要求9所述的用途，其中所述乳铁蛋白以0.8至1.2g/L范围内的浓度、优选 以1. 〇g/L的浓度存在于液体可摄入组合物中。12. 根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述乳铁蛋白以富集乳铁蛋白的乳 或乳清级分的形式被提供。
【专利摘要】本发明整体涉及婴幼儿认知功能的发育。更具体地讲，本发明提供了使用乳铁蛋白来改善生理状况(即非病理状况)下婴幼儿的记忆和/或学习速度，和/或用于促进其大脑的成熟。在一个方面，本发明展示出了乳铁蛋白具有改善健康婴幼儿的长期记忆例如长期地点记忆的效用。
【IPC分类】A61P25/00, A61K38/40, A23L33/19, A61P25/28
【公开号】CN105492018
【申请号】CN201480047830
【发明人】B·王, Z·郑, 王军宽, Z·董
【申请人】雀巢产品技术援助有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月27日
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