抗体制剂和方法
抗体制剂和方法
【专利说明】抗体制剂和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年7月4日提交的美国临时专利申请号61/843,011和于2014年4 月15日提交的美国临时专利申请号61/979,886的权益，为了所有目的，二者均通过引用整 体并入本文。
[0003] 序列表的引用
[0004] 为"抗体制剂和方法'于2014年7月旧创建的文件446257SEQLIST.txt中所写的序 列表为37.9千字节。该文件中包含的信息通过引用并入本文。
[0005] 背景
[0006] 共核蛋白病（synucleinopathy)也被称为路易体疾病化抓），W多己胺能系统退 化、运动性改变(motor alteration)、认知障碍和形成路易体(LB)和/或路易神经突为特征 (McKeith等，Neurology(1996)47:1113-24)。共核蛋白病包括帕金森氏病(包括自发性帕金 森氏病）、弥散性路易体病化LBD)(也称为路易体痴呆化LB)、阿尔茨海默氏病的路易体变型 化BV)、组合的阿尔茨海默氏病和帕金森氏病、单纯性自主神经衰竭和多系统萎缩(MSA;例 如，橄揽体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性和化y-化ager综合征）。疾病前驱阶段（即，症状 前、亚临床、临床前或前运动时期）的多种非运动征象和症状被认为是共核蛋白病的预兆。 此类早期征象包括例如REM睡眠行为障碍(RBD)、失去嗅觉和便秘(Mahowald等,Neurology (2010)75:488-489)。路易体疾病依然是老年人群中运动障碍和认知退化的常见原因 (Galasko等，Arch.Neurol.(1994)51:888-95)。
[0007] a-突触核蛋白是包括e-和丫-突触核蛋白和核突触蛋白（synoretin)在内的蛋白 质大家族的一部分。Q-突触核蛋白在与突触相关的正常状态表达，并且被认为在神经可塑 性、学习和记忆中具有重要作用。多个研究发现Q-突触核蛋白在PD发病机理中的重要作用 有牵连。蛋白在病理状态下可W聚集形成不溶性纤维。例如，突触核蛋白在LB中聚集 (SpiIlantini等，Nature(1997)388:839-40;Takeda等 J.Pathol.(1998)152:367-72; WakabayasM等，Neurosci丄ett.(1997)239:45-8))。日-突触核蛋白基因中的突变与稀有家 族形式的帕金森氏病共分离（co-segregate KKruger等，Nature Gen.(1998) 18:106-8; Polyme ropouIos ,等，Science(1997)276 : 2045-7)。转基因小鼠（MasIiah等，Science (2000)287:1265-9)和果蛹(Feany等，化Uire(2000)404:394-8)中a突触核蛋白的过表达模 拟了路易体病的多个病理学方面。此外，已经发现突触核蛋白的可溶性低聚物可能是神经 毒性的（Con way KA等，Proc 化tl Acad Sci USA(2000)97:571-576;VollesMJ，Lansbu巧 PT, Jr Biochemist巧(2003)42:7871-7878)。物种和动物模型中a-突触核蛋白的积累W及 类似的形态和神经变化与人、小鼠和蛹类中一样多种多样，表明运种分子促使了路易体病 的发展。
[000引要求保护的发明的概述
[0009]本发明提供了可用于预防和治疗共核蛋白病的抗体制剂，本发明提供了药物制 剂，其包含：（a)抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰(veneered)或人源化形式或者 与9E4特异性竞争结合和/或针对a-突触核蛋白的氨基酸残基118-126内的表位的其片段， 其中抗体W约Img/mL至约IOOmg/mL的浓度存在；（b) W约IOmM至约30mM范围内的浓度存在 的巧樣酸盐缓冲剂；（C) W约21 OmM至约250mM范围内的浓度存在的海藻糖；W及(d) W按重 量计约0.005%至约0.05%范围内的浓度存在的聚山梨醇醋20;其中制剂的特征在于pH在 约5.5至约7内。一些制剂例如包含抗体，该抗体包括与SEQ ID NO: 11至少90%同一并且包 括沈Q ID NO: 11的S个Kabat CDR的成熟人源化重链可变区，W及与沈Q ID NO:4至少90% 同一并且包括沈Q ID N0:4的S个Kabat CDR的人源化轻链。
[0010] 在本发明的一些实施方案中，抗体W约5-1 OOmg/ml，例如5mg/mL至约15mg/mL范围 内（例如约1 Omg/mU的浓度存在，或者W约25-75mg/mL范围内（例如，约50mg/mU的浓度存 在。在本发明的一些制剂中，抗体W约36mg/mL至约44mg/mL范围内（例如，约40mg/mL)的浓 度存在。
[0011]在本发明的一些制剂中，巧樣酸盐缓冲剂W约20mM的浓度存在。
[001^ 在本发明的一些制剂中，海藻糖从约2301111的浓度存在。
[0013]如本文所述制备的，本发明的一些代表性制剂：（a)特征在于约335m0sm/kg的摩尔 渗透压浓度；（b)包含少于约10%的在制剂中W聚集物存在的抗体；（C)还包含填充剂；（d) 是无菌的；和/或(e)在冻融中稳定。如本文所述制备的，本发明的一些代表性制剂：（a)特征 在于约295m0sm/kg至约375m0sm/kg的摩尔渗透压浓度；（b)包含少于约10%或少于约5%的 在制剂中W聚集物存在的抗体;（C)还包含填充剂；（d)是无菌的;和/或(e)在冻融中稳定。
[0014]在本发明的一个方面中，制剂包括：（a)抗体，该抗体包括轻链和重链，轻链具有包 含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO: 31或32的氨基酸序列，具有或不 具有C-末端赖氨酸，其中该抗体W约40mg/mL的浓度存在；（b) W约20mM的浓度存在的巧樣 酸缓冲剂；（C) W约230mM的浓度存在的海藻糖；（d) W约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇醋 20;和(6)约6.0的抑。
[001引药物制剂可W包括：（a)抗体，其为抗体犯4(ATCC目录号PTA-8221)或者抗体犯4的 嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4特异性竞争结合的其片段，和/或针对a-突触核蛋白的 氨基酸残基118-126内的表位的嵌合、镶饰或人源化抗体，其中抗体W约Img/mL至约1 OOmg/ mL的浓度存在；（b)缓冲剂；（C)糖和/或聚醇;和(d)表面活性剂。在一些特定实施方案中，所 公开制剂的抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，重链具有包 含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸。
[0016]抗体制剂可W是冻干的。例如，代表性冻干制剂可W包括：（a)抗体9E4(ATCC目录 号PTA-8221)的人源化形式或者其抗原结合片段；（b)组氨酸、巧樣酸盐或班巧酸盐；（C)海 藻糖、薦糖或者薦糖和甘露醇的混合物；W及(d)聚山梨醇醋20。冻干制剂在重构时抑可W 在约6至约7之间，例如重构时抑6.0或6.5。冻干制剂通常包含约40mg至约1000 mg抗体。冻 干制剂通常包含浓度在按重量计约0.005 %至约0.05 %范围内的聚山梨醇醋20。在重构后， 冻干制剂产生水溶液。例如，重构的水溶液可W包括：（a) W约40mg/mL的浓度存在的抗体 犯4的人源化形式(例如，抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列， 重链具有包含SEQ ID N0:31或32中的任一个的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸）； (b) W约20mM的浓度存在的巧樣酸盐缓冲剂；（C) W约230mM的浓度存在的海藻糖；（d) W约 0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇醋20; W及(e)约6.0的pH。一种代表性冻干制剂包含约200mg 抗体。
[0017] 还提供了编码用于制备所公开制剂的抗体的核酸。例如，运样的核酸包括含编码 SEQ ID N0:29的抗体轻链的核巧酸序列的核酸，和含编码SEQ ID N0:32的抗体重链的核巧 酸序列的核酸。例如，SEQ ID NO: 17给出的核巧酸序列编码SEQ ID N0:29的人源化9E4轻链 可变区元件。又例如，SEQ ID N0:20给出的核巧酸序列编码SEQ ID N0:32的人源化犯4重链 可变区元件。
[0018] 为了产生抗体，可W将所公开的核酸单独地或者组合地（例如，编码人源化9E4轻 链的核酸和编码人源化94E重链的核酸的组合）引入到载体中。例如，载体可W包括含编码 SEQ ID NO: 15-17中的任一个的核巧酸序列的核酸，含SEQ ID NO: 18-20中的任一个的核巧 酸序列的核酸，或者它们的组合。本发明的代表性载体包括：（a)包含编码SEQ ID NO: 29给 出的人源化9E4轻链和SEQ ID NO: 31给出的人源化9E4重链的核酸序列的载体;和(b)包含 编码SEQ ID NO:29的氨基酸序列的核酸和编码SEQ ID NO:32的氨基酸序列的核酸的载体。
[0019] 还提供了宿主细胞(例如，OlO细胞），宿主细胞具有引入其基因组的一个或更多个 本文所公开核酸。例如，宿主细胞在其基因组中可W包括稳定整合的包含编码SEQ ID NO: 15-17中的任意一个的核巧酸序列的核酸;稳定整合的包含编码SEQ ID NO: 18-20中的任一 个的核巧酸序列的核酸;或者它们的组合。本发明的代表性宿主细胞包括：（a)包含编码SEQ ID N0:29给出的人源化犯4轻链和SEQ ID N0:31给出的人源化犯4重链的核酸序列的宿主 细胞;和(b)包含具有SEQ ID N0:29的核巧酸序列的核酸和具有SEQ ID N0:32的核巧酸序 列的核酸的宿主细胞。
[0020] 本发明还提供了制备药物制剂的方法。在本发明的一个方面，此类方法包括：（a) 培养哺乳动物细胞，哺乳动物细胞具有稳定并入其基因组的编码小鼠、嵌合、镶饰或人源化 9E4抗体的轻链和重链的核酸，W使得细胞将抗体分泌到细胞培养基中，W及从细胞培养基 中纯化抗体；W及(b)制备制剂，该制剂包括：（i)抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶 饰或人源化形式或者与9E4特异性竞争结合的其片段，其中抗体W约lOmg/mL至约50mg/mL 的浓度存在；（i i ) W约20mM至约30mM范围内的浓度存在的巧樣酸盐缓冲剂；（i ii ) W约 210mM至约250mM范围内的浓度存在的海藻糖；W及（iv) W按重量计约0.005%至约0.05% 范围内的浓度存在的聚山梨醇醋20;其中该制剂的特征在于pH在约5.5至约6.5的范围内。 可用于此目的的哺乳动物细胞包括：（a)具有稳定并入其基因组的编码SEQ ID N0:29给出 的人源化9E4轻链和SEQ ID N0:31给出的人源化9E4重链的核酸序列的宿主细胞;和(b)具 有稳定并入其基因组的具有SEQ ID NO: 29的核巧酸序列的核酸和具有SEQ ID NO: 32的核 巧酸序列的核酸的宿主细胞。在本发明的一些方面，所公开的制备药物制剂的方法包括评 估制剂中抗体的至少一种性质如物理稳定、化学稳定性和/或生物学活性的步骤。
[0021] 还提供了治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病或者具有患共核蛋白病的风险的 人患者的方法，该方法包括向患者施用有效剂量的本发明制剂。一些适用于治疗的患者可 能患有帕金森氏病。
[0022] 所公开的治疗性和预防性治疗方法包括联合疗法（即，施用所公开抗体制剂和一 种或更多种额外的药物物质），因此引起了协同效果。两种药物物质同时施用或者W任何顺 序按顺序施用。例如，可W在施用第二药物物质之前、与第二药物物质同时或者在施用第二 药物物质之后施用本发明药剂。本发明制剂可W与例如左旋多己、benzaseride、卡比多己、 多己胺激动剂、COffl'抑制剂、MAO抑制剂、金刚烧胺或抗胆碱能剂同时或相继施用。
[0023] 根据所公开的治疗性或预防性治疗方法，本发明制剂可W W多剂量施用，例如，W 约每日一次至约每年一次范围内的频率，例如W约每隔一周一次至约每S周一次范围内的 频率，或者例如每月一次或者每四周一次的频率。在一个方面，本发明的抗体制剂W约 0.3mg/kg至约30mg/kg药物物质的剂量静脉内施用。示例性给药方案包括约0.3mg/kg、约 1 .Omg/kg、约3.0mg/kg、约lOmg/kg和约30mg/kg的人源化9E4药物作为单剂量或者每四周一 次静脉内施用。
[0024] 例如，治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病（例如，帕金森氏病）或者具有患共核 蛋白病的风险的人患者的方法可W包括向患者施用有效剂量的药物制剂，该药物制剂包 括：（a)抗体，该抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID N0:29的氨基酸序列，重链具有 包含SEQ ID N0:32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，其中抗体W约40mg/mL的浓 度存在；（b) W约20mM的浓度存在的巧樣酸缓冲剂；（C) W约230mM的浓度存在的海藻糖；（d) W约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇醋20;和(e)约6.0的抑。在此类方法中，剂量通常为W约 每周一次至约每28天一次或者约每季度一次的频率静脉内或皮下施用约0.3mg/kg至约 30mg/kg抗体(例如，约0.5mg/kg至约8mg/kg，或者约8mg/kg至约30mg/kg)。
[0025] 本发明还提供了药物产品，该药物产品包括：（a)小瓶，该小瓶包含约200mg粉末形 式抗体；（b)用于重构抗体的说明；和(C)用于制备输注用重构抗体的说明，其中例如，（i)抗 体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸；W及（ii)重构说明需要利用注射用水重构 到约5mL的可提取体积。
[0026] 附图简述
[0027] 图1是人源化9E4抗体的DSC溫谱图，示出了与升高或降低含1.5mg/ml人源化9E4抗 体(形式H3L3)的溶液的溫度相关的能量流(卡路里/°C)。抗体溶液W插入框内示出的顺序 按顺序加热和冷却。对线进行编号W指示与插入框中示出的5个溫度转变中的每一个相关 的线。
[0028] 图2是描绘了作为抑的函数的人源化9E4抗体(形式H3L3)的转变溫度的图。不同符 号示出了通过RALS、IF和DSC确定的转变溫度。在每个抑下观察两个或S个DSC转变溫度，每 个用不同符号表示。
[0029] 图3是描绘了不具有储存期的冻干并且重构的制剂Fl-F4(如表10中所述）的显微 可见的颗粒计数（> 2.0mm、> 10.0 mm和> 25. Omm)的柱状图。
[0030] 图4是描述了冻干、在40°C下储存1个月并且重构后的Fl-F4(如表10中所述）的显 微可见的颗粒计数（> 2.0mm、MO. Omm和> 25. Omm)的柱状图。
[0031] 图5是描述了冻干、在40°C下储存2个月并且重构后的Fl-F4(如表10中所述）的显 微可见的颗粒计数（> 2.0mm、MO. Omm和> 25. Omm)的柱状图。
[0032] 图6是描述了冻干、在40°C下储存3个月并且重构后的Fl-F4(如表10中所述）的显 微可见的颗粒计数（> 2.0mm、MO. Omm和> 25. Omm)的柱状图。
[0033] 图7是描述了作为制剂(F1-F4,如表10中所述)和在40°C下W冻干形式储存时间的 函数的单体人源化9E4抗体(形式H3L3)的损失。
[0034] 序列简述
[0035] 沈Q ID NO: 1是m犯4化可变区的氨基酸序列。
[0036] SEQ ID N0:2是人化受体序列的可变区的氨基酸序列(NCBI目录号AAY33350)。
[0037] 沈Q ID NO:3是化犯4VLvl可变区的氨基酸序列。
[0038] 沈Q ID NO:4是化犯4VLv2可变区的氨基酸序列。
[0039] 沈Q ID NO:5是化犯4VLv3可变区的氨基酸序列。
[0040] 沈Q ID NO:6是m犯4VH可变区的氨基酸序列。
[0041 ] 沈Q ID N0:7是人VH受体序列可变区的氨基酸序列(NCBI目录号AA巧0998)。
[0042] 沈Q ID NO:8是化犯4VHvl可变区的氨基酸序列。
[0043] 沈Q ID NO:9是化犯4VHv2可变区的氨基酸序列。
[0044] 沈Q ID NO: 10是化犯4VHv3可变区的氨基酸序列。
[0045] 沈Q ID NO: 11是化犯4VHv4可变区的氨基酸序列。
[0046] SEQ ID NO: 12是野生型人a-突触核蛋白的氨基酸序列。
[0047] SEQ ID NO: 13是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列，具有N-末端精氨酸。
[004引 SEQ ID NO: 14是人源化犯4重链恒定区的氨基酸序列。
[0049] 沈Q ID NO: 15是编码化犯4VLvl可变区的核巧酸序列。
[(K)加]沈Q ID NO: 16是编码化犯4VLv2可变区的核巧酸序列。
[0化1] 沈Q ID NO: 17是编码化犯4VLv3可变区的核巧酸序列。
[0化2] 沈Q ID NO: 18是编码化犯4VHvl可变区的核巧酸序列。
[0化3] 沈Q ID NO: 19是编码化犯4VHv2可变区的核巧酸序列。
[0化4] 沈Q ID NO:20是编码化犯4VHv3可变区的核巧酸序列。
[0化日]沈Q ID N0:21是编码化犯4VHv4可变区的核巧酸序列。
[0化6] 沈Q ID NO:22是化犯4化信号肤的氨基酸序列。
[0化7] 沈Q ID NO:23是编码化犯4化信号肤的核巧酸序列。
[0化引沈Q ID NO:24是化犯4VH信号肤的氨基酸序列。
[0化9] 沈Q ID NO:25是编码化犯4VH信号肤的核巧酸序列。
[0060] 沈Q ID NO:26是化犯4VL共有氨基酸序列。
[0061 ] 沈Q ID NO:27是化犯4VH共有氨基酸序列。
[0062] SEQ ID NO:28是人源化犯4轻链恒定区的氨基酸序列，不具有N-末端精氨酸。
[0063] SEQ ID N0:29是人源化9E4轻链的氨基酸序列，其包括(a)可变区（形式3)和(b)具 有N-末端精氨酸的恒定区。
[0064] SEQ ID N0:30是人源化9E4轻链的氨基酸序列，其包括(a)可变区（形式3)和(b)不 具有N-末端精氨酸的恒定区。
[0065] SEQ ID N0:31是人源化9E4重链的氨基酸序列，其包括(a)可变区（形式3)和(b)恒 定区。
[0066] SEQ ID NO: 32是人源化9E4重链的氨基酸序列，其包括(a)可变区（形式3)和（b) BIP形式重链Glm3同种型恒定区。
[0067] SEQ ID NO:33是BIP形式重链GlmS同种型恒定区的氨基酸序列。
[006引 定义
[0069]术语"抗体"包括完整抗体及其结合片段。通常，片段与得到它们的完整抗体竞争 同祀标的特异性结合。片段包括单独重链、单独轻链、Fab、Fab'、F(ab'）2、F(ab)c、Fv、单链 抗体和单结构域抗体。术语"抗体"还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两 个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人造杂交抗体（参见，例如Songsi Vi Iai和 Lachmann,Cl in.Exp.Immunol.,79:315-321(1990);Kostelny等,J.Immunol148:1547-53 (1992))。
[0070] 基础抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两个相同多肤链对，每对具 有一个"轻"链(约25kDa)和一个"重链"（约50-70W)a)。每个链的氨基末端部分包括主要负 责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。当最初表达时，可变区通常与可切割 信号肤连接。不具有信号肤的可变区有时候称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区 意指不具有轻链信号肤的轻链可变区。每个链的簇基末端部分限定了主要负责效应子功能 的恒定区。恒定区可W包括CHl区、较链区、C肥区和C册区中任一个或全部。
[0071] 轻链被分类为K或A。重链被分类为丫、y、a、S或e，并且分别定义了抗体同种型IgG、 IgM、IgA、I曲和IgE。在轻链和重链内，可变区 和恒定区通过约12或更多个氨基酸的区连 接，重链还包括约10或更多个氨基酸的"D"区（一般地参见，Fundamental Immunology (Paul，W.编辑，第2版.Raven Press，N.Y. ,1989)，第7章）（为了所有目的，其通过引用整体 并入本文）。
[0072] 每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合 位点。除双功能或双特异性抗体外，两个结合位点相同。所有链表现出相同的一般结构:通 过=个超变区连接的相对保守的框架区(FR),也称为互补决定区或CDR。来自每一对的两个 链的CDR通过框架区比对，能够与特异性表位结合。从N-末端到C-末端，重链和轻链均包括 FR 1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区。每个区域氨基酸的分配根据W下文献的定义： Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Heal化，Bethesda,MD，1987and 1991)，或Chothia化esk，J.Mol. Biol.196:901-917(1987); ChotMa等，化Uire 342:878-883( 1989) eKabat还提供了广泛使用编号惯例化abat编号）， 其中不同重链之间或不同轻链之间的相应残基分配相同编号。
[0073] 百分比序列同一性通过Kabat编号惯例最大比对的抗体序列确定。在比对后，如果 主题抗体区（例如，重链或轻链的整个成熟可变区）与参考抗体的相同区比较，则主题抗体 区域和参考抗体区域之间的百分比序列同一性是由主题抗体区域和参考抗体区域二者中 的相同氨基酸占据的位置的数目除W两个区域比对位置的总数(缺口不计数)乘WlOOW转 换成百分比。
[0074] 为了将氨基酸置换分类为保守的或非保守的，将氨基酸如下分组：组1(疏水侧 链）：正亮氨酸、1日*、41日、￥日1、1^日11、11日；组11(中性亲水侧链:〔73、5日'、化'；组111(酸性侧 链）：Asp、Glu;组1八碱性侧链）:4311、6111、化3、1^73、4'旨;组￥(影响链方向的残基）:617、口'〇; 和组VI(芳香族侧链）：T巧、Tyr、化e。保守置换设及同一类氨基酸之间的置换。
[0075] 非保守置换构成了运些类别中一类的成员与另一类的成员的交换。
[0076] 本发明抗体通常W至少106、107、108、109或1〇1>-1的亲和常数^其指定祀标结合。 运样的结合是特异性结合，因为可检测到更高的量级，并且可W与至少一种不相干祀标的 非特异性结合区分开。特异性结合可W是由于在特定官能团或特定空间配合(例如，锁和钥 型)之间形成了键的结果，而非特异性结合通常是由于范德华力的结果。但是特异性结合并 未必然意味着单克隆抗体结合一种并且仅一种祀标。
[0077] 术语"症状"是指由对象感知到的疾病的主观证据，例如步态改变、"征象"是指由 医生观察的疾病的客观证据。
[0078] 如果对象具有至少一种已知的风险因子(例如，遗传的、生物化学的、家族史的或 环境暴露），则处于增加的疾病风险之下，与不具有风险因子的个体相比，风险因子使具有 该风险因子的个体处于统计学上显著更大的形成疾病的风险之下。统计学上显著意指P < 0.05〇
[0079] 除非从上下文另外明显地，否则术语"约"包括设定值的平均值的标准偏差和/或 设定值的+/-5 %之内的值，无论是哪一个更大。
[0080] 术语巧E4抗体'是指其中每个CDR基本上未犯4的CDR的任何抗体，因此包括小鼠、 嵌合、镶饰和人源化9E4。
[0081] 除非从上下文另外明显地，否则对范围的参考包括范围内的任何整数。
[0082] 详述
[0083] I.概括
[0084] 9E4是与人a-突触核蛋白的氨基酸残基118-126内的表位结合的抗体。抗体的人源 化形成描述在W0/2013/063516中，为了所有目的，其通过引用整体并入本文。本申请提供并 入了 9E4的嵌合、镶饰或人源化形式(有时候也称为9E4抗体）的液体或冻干制剂。制剂被设 计为具有赋予抗体W稳定性的组分的组合，如下文将详细描述的。
[00化]II.勒!分子
[0086] 天然人野生型a-突触核蛋白是具有W下氨基酸序列的140个氨基酸的肤：
[0087] MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
[0088] GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
[0089] GK肥EGAP犯 GILEDMPVDP DNEAYEMP沈 EGYQDYEPEA (沈Q ID N0:12)
[0090] (Ueda等，Proc.化tl .Acad. Sci .USA( 1993)90:11282-6) ;GenBank目录号：P37840。 该蛋白质具有S个公认的结构域:覆盖氨基酸1-61的KTKE重复结构域;氨基酸60-95的NAC (非淀粉样蛋白组成分)结构域;和约氨基酸98至140的C-末端酸性结构域。
[0091] 除非从上下文另外明显地，否则提到a-突触核蛋白或其片段包括上文指出的天然 人野生型氨基酸序列及其人等位基因变体，特别是与路易体疾病相关的那些（例如，变体 ￡461(、430口和4531'，第一个字母指示569 10^:12中的氨基酸，数字指示569 10^:12中的 密码子位置，第二个字母指示等位基因变体中的氨基酸）。此类变体可W任选地单独存在或 者与本发明下文所述的任何方面任意组合。增强O-突触核蛋白聚集的诱发突变E8%、A90V、 A76T也可W单独存在或者与彼此和/或与人等位基因变体E46K、A30P和A53T组合。
[0092] III.路易体疾病
[0093] 路易体疾病化抓）W多己胺能系统退化、运动性改变、认知障碍和形成路易体化B) 为特征(McKeith等,Neurology(1996)47:1113-24)。路易体是在神经细胞中发现的球形蛋 白质沉积物。其在脑中的存在破坏脑的正常功能，妨碍化学信使(包括乙酷胆碱和多己胺） 的作用。路易体疾病包括帕金森氏病(包括自发性帕金森氏病）、弥散性路易体病(DLBD)(也 称为路易体痴呆，DLB)、阿兹海默病的路易体变型化BV)、组合的阿兹海默病和帕金森氏病 和多系统萎缩(MSA;例如，橄揽体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性和化y-化ager综合征）。 化BD具有阿兹海默病和帕金森氏病二者的症状。DL抓不同于帕金森氏病主要在于路易体的 位置。在DLBD中，路易体主要在皮质中形成。在帕金森氏病中，其主要在黑质中形成。其他路 易体疾病包括单纯性自主神经衰竭、路易体吞咽困难、偶发性L抓和遗传性LBD(例如，a-突 触核蛋白基因、PARK3和PARK4的突变）。
[0094] IV.人源化犯4抗体
[00巧]A.结合特异性和功能性质
[0096] 本发明的人源化抗体与人a突触核蛋白特异性结合。一些人源化抗体的亲和力 (即，Ka)优选地在小鼠抗体9E4的亲和力的5或2倍之内。一些人源化抗体的亲和力与小鼠 9E4抗体相同（在实验误差内）或大于后者。优选的人源化抗体与小鼠抗体9E4结合于相同表 位或者与小鼠抗体9E4竞争同人a突触核蛋白的结合。
[0097] 在一些方面，人源化9E4形成双特异性抗体的一个臂，双特异性抗体的另一个臂是 与血脑屏障上表达的受体(例如，膜岛素受体、膜岛素样生长因子(IGF)受体、瘦素受体或脂 蛋白受体或优选地运铁蛋白受体）结合的抗体（Friden等，PNAS 88:4771-4775,1991; 化iden等，Science 259:373-377，1993)。此类双特异性抗体可W通过受体介导的转胞吞作 用转移穿过血脑屏障。可W通过改造双特异性抗体W降低其与血脑屏障受体的亲和力来进 一步增强双特异性受体的脑摄取。降低的受体亲和力导致脑中更广的分布（参见，例如 Atwal等.Sci . Trans.Med. 3,84ra43,2011;化等Sci . Trans.Med. 3,84ra44,2011)。
[0098] 示例性双特异性抗体还可W是例如：（1)双可变域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和 重链包括两个通过短肤键串联的可变域(Wu等，Generation and Qiaracterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig?)Molecule,于:Antibody Engineering, Springer Berlin Heide化e;rg(2010)); (2)Tandab，其为两个单链抗体的融合，得到对每种 革己抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体；（3)f Iexibody，其为scFv与双体抗体的组 合，得到多价分子；（4)基于"蛋白激酶A"中的"二聚化和对接结构域(docking domain)"的 所谓的"对接锁定(dock and lock)"分子，其当应用于化b时，可W产生由与一个不同的化b 片段连接的两个相同的Fab片段组成的S价双特异性结合蛋白；（5)所谓的蜗形分子 (Sco巧ion molecule)，其包括与人化区域的两端融合的两个scFv。可用于制备双特异性抗 体的平台的实例包括但不限于BiTE(Micromet) ,DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-s1:a;r)、Fc-改造的IgGl(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。
[0099] B.人源化抗体
[0100] 人源化抗体是一种基因工程化抗体，其中来自非人"供体"抗体的CDR被嫁接到人 。受体"抗体序列中（参见，例如，Queen等，US5，530，101 和5，585，089; Winter等，US 5，225， 539，Cader，US 6,407,213，Adair，US 5,859,205 6,881，557，Foote，US 6,881，557)。受体 抗体序列可W是例如成熟人抗体可变区序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列 (例如，Kabat, 1991的轻链和重链可变区共有序列，同上)或者种系可变区序列。重链的优选 受体序列是NCBI目录号AA巧0998(GI :1791009)的人成熟重链可变区或来源于种系IGHV3-7'01或IGHV3-7'02的其他成熟重链可变区（克隆名V3-7或VH3-ll)(Glas等，ClinExp Immunol. 107:372-80,1997)，或者并入运些种系序列中的一个中的成熟重链可变区序列。 对于轻链，优选的受体序列是NCBI目录号AAY33350(GI :63102889)的轻链成熟可变区或来 源于种系IGKV1D-39或IGKV1-39的其他成熟轻链序列（克隆名02或012KKramer等，Eur J Immunol. 35:2131-45,2005)，或者并入运些种系序列中的一个中的成熟轻链可变区序列。 因此，本发明的人源化抗体包括运样的抗体，其具有Kabat定义的来自小鼠9E4抗体(供体抗 体)的=个轻链和=个重链CDR，W及完全地或基本上来自人抗体序列的成熟可变区框架序 列和恒定区（如果存在的话）。同样地，人源化重链包括运样的重链，其具有Kabat定义的来 自小鼠9E4抗体的重链的S个重链CDR，W及完全地或基本上来自人抗体重链序列的成熟重 链可变区序列和重链恒定区序列（如果存在的话）。同样地，人源化轻链包括运样的轻链，其 具有Kabat定义的来自小鼠9E4抗体的轻链的S个轻链CDR，W及完全地或基本上来自人抗 体轻链序列的成熟轻链可变区序列和轻链恒定区序列(如果存在的话）。当至少85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%的Kabat定义的相应残基相同时，抗体链的成熟可变区 框架序列或抗体链的恒定区序列分别基本上来自人成熟可变区框架序列或者人恒定区序 列。
[0101] 根据其对CD財勾象和/或抗原结合的可能影响，可W选择人成熟可变区框架序列的 某些氨基酸用于置换。通过建立模型、检查特定位置的氨基酸的特征或者对特定氨基酸的 置换或突变的影响进行经验观察，来研究此类可能的影响。
[0102] 例如，当小鼠成熟可变区框架残基和选择的人成熟可变区框架残基之间的氨基酸 不同时，在合理预测到小鼠氨基酸如下时，可W将人框架氨基酸替换成来自小鼠抗体的等 同框架氨基酸：
[0103] (1)与抗原直接非公价结合，
[0104] (2)与CDR 区相邻，
[0105] (3)与CDR区其他相互作用（例如，在CDR区的约6 A之内），
[0106] (4)介导重链和轻链之间的相互作用。
[0107] 本发明提供了包括小鼠9E4抗体的人源化形式的制剂，抗体包括S个示例的人源 化轻链成熟可变区化u9E4VLvl-v3;SEQ ID N0:3-5)和四个示例的人源化重链成熟可变区 (Hu9E4VHvl-v4;SEQIDN0:8-ll)。SEQIDN0:4包括小鼠9E4轻链的S个KabatCDR和 AAY33350的成熟可变区框架。SEQ ID NO.3和5包括表2中所示回复突变。SEQ ID NO: 11包括 小鼠犯4轻链的S个Kabat CDR和AA巧0998的成熟可变区框架。沈Q ID NO:8-10包括表3中 所示回复突变。
[0108] 本发明提供了包含本文所公开的多种人源化9E4抗体的制剂，其中人源化重链成 熟可变区表现出与SEQ ID N0:8-ll至少90%、95%或99%的同一性，人源化轻链成熟可变 区表现出与沈Q ID N0:3-5至少90%、95%或99%的同一性，但是其中指定SEQ ID NO:的任 何变化发生在成熟可变区框架，而非Kabat CDR。在一些此类抗体中，位置L36被Y或F占据， 和/或位置L83被F或L占据，和/或位置H73被嗯郎占据，和/或位置H93被A或化据(运里W及 本申请别处的所有位置通过Kabat编号）。在一些此类抗体中，保留了化9E4VLvl-v3和 化9E4VHvl-v4中的一些或所有回复突变。换言之，重链位置H73和H93之一或其二者分别被D 和A占据。同样地，在一些抗体中，轻链位置L36和L83之一或其二者分别被F和L占据。在一些 抗体中，位置H73、朋3、L36和L83中的1、2、3或全部4个分别被D、A、F和L占据。在一些抗体中， 重链成熟可变区框架中的〇、1或2个位置相对于SEQ ID NO: 11而改变，轻链成熟可变区框架 中的0、1或2个位置相对于SEQ ID N0:4而改变。
[0109] 本发明提供了制剂，其中一些抗体包括含SEQ ID NO: 11的S个Kabat CDR的人源 化重链和含SEQ ID N0:4的S个Kabat CDR的人源化轻链，前提是位置L36化abat编号）被F 或Y占据和/或L83化abat编号）被L或F占据和/或位置H73化abat编号)被D或N占据和/或位 置H93化abat编号)被S或A占据。在一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占据。在一些 此类抗体中，位置L36化abat编号被F占据并且位置L83化abat编号)被L占据。在一些此类抗 体中，位置L36化abat编号)被F占据并且位置H73化abat编号)被D占据。在一些此类抗体中， 位置L36化abat编号）被F占据并且位置朋3化abat编号）被S。在一些此类抗体中，位置L36 化abat编号）被F占据并且位置H93化abat编号）被A占据。在一些此类抗体中，位置L36 化abat编号)被F占据，位置L83化abat编号)被L占据，并且位置H73 (Kabat编号)被D占据。在 一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占据，位置L83化abat编号）被L占据，并且位置 H93化abat编号）被S占据。在一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占据，位置L83 化abat编号）被L占据，并且位置H93化abat编号被A占据。在一些此类抗体中，位置L36 化abat编号)被F占据，位置H73化abat编号)被D占据，并且位置H93化abat编号)被S占据。在 一些此类抗体中，位置L36化abat编号)被F占据，位置L83被F占据，位置H73化abat编号)被D 占据，并且位置朋3化abat编号）被化据。在一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占 据，位置H73化abat编号）被占据D，并且位置朋3化abat编号)被A占据。在一些此类抗体中， 位置L36化abat编号）被F占据，位置L83化abat编号）被L占据，位置H73化abat编号）被D占 据，并且位置朋3化abat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占据， 位置L83化abat编号）被L占据，位置H73化abat编号）被D占据，并且位置H93 (Kabat编号）被A 占据。在一些此类抗体中，位置L83(Kabat编号）被L占据。在一些此类抗体中，位置L83 化abat编号）被L占据并且位置H73化abat编号）被D占据。在一些此类抗体中，位置L83 化abat编号）被L占据并且位置H93化abat编号）被S占据。在一些此类抗体中，位置L83 化abat编号）被占据L并且位置H93化abat编号）被A占据。在一些此类抗体中，位置L83 化abat编号）被L占据，位置H73化abat编号）被D占据，并且位置H93 (Kabat编号）被化据。在 一些此类抗体中，位置L83化abat编号）被L占据，位置H73化abat编号）被D占据，并且位置 H93化abat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置H73化abat编号)被D占据。在一些此类抗 体中，位置H73化abat编号)被D占据并且位置H93化abat编号)被化据。在一些此类抗体中， 位置H73化abat编号)被D占据并且位置朋3化abat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置 H93化abat编号)被化据。在一些此类抗体中，位置朋3化abat编号)被A占据。在一些此类抗 体中，位置L36被Y占据，位置L83被F占据，位置H73被N占据，并且位置朋3被化据。表1中列 出了一些在位置L36、L83、H73和H93及其组合处具有期望残基的示例性抗体。
[0110] 表1:在位置L36、L83、H73和H93化abat编号)处具有期望残基的示例性抗体
[0112] 表2:Vh回复突变体
[0115] 表3:化回复突变体
[0117] 在一些抗体中，重链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。在一些 抗体中，轻链成熟可变区具有命名为SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:3的氨基酸序列。在一些此 类抗体中，重链成熟可变区具有命名为SEQ ID N0:10的氨基酸序列，并且轻链成熟可变区 具有命名为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些此类抗体中，重链成熟可变 区具有命名为SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，并且轻链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO: 5 的氨基酸序列。
[0118] 可W在成熟可变区框架中，例如，在不与CDR接触的残基中进行其他氨基酸置换。 通常在变体人源化序列中进行的替换相对于被替换氨基酸是保守的。在一些抗体中，相对 于化9E4VLvl-v3和化犯4VHvl-v4的替换(无论是否为保守的）对于所得抗体的结合亲和力 或效力（相对于化9E4VLvl-v3和化9E4VHvl-v4)没有显著影响，即，其能够与人a突触核蛋白 结合。
[0119] 变体通常由于少量(例如，通常为轻链或重链成熟可变区框架或者其二者中的不 超过1、2、3、5或10个)替换、缺失或插入而不同于化犯4VLvl-v3和化犯4VHvl-v4的重链和轻 链成熟可变区序列。
[0120] 下文所述的制剂可W包含上文、或者在本申请的序列表或别处描述的任何人源化 犯4链，其轻链和重链任意组合，形成与人a-突触核蛋白特异性结合的人源化9E4抗体。
[0121] C.嵌合抗体和镶饰抗体
[0122] 本发明还提供了非人抗体(特别是9E4)的嵌合形式和镶饰形式。
[0123] 嵌合抗体是运样的抗体，其中非人抗体(例如，小鼠）的轻链和重链成熟可变区与 不同物种的抗体的轻链和重链恒定区组合。通常，轻链和重链恒定区是人源的，但是恒定区 根据需要可W来源于不同的非人物种，例如大鼠（例如，W有利于在适当的动物模型中测试 非人抗体）。此类抗体基本上或者完全保留了由可变区提供的非人(例如，小鼠）抗体的结合 特异性，并且为约=分之二的人(或不同非人物种)序列。
[0124]镶饰抗体是人源化抗体的一种类型，其保留了非人抗体的一些并且通常全部的 CDR和一些非人可变区框架残基，但是将 可能有助于B-或T-细胞表位的其他可变区框架残 基(例如，暴露残基(Padlan，Mo 1. Immuno 1.28:489，1991))替换成了来自人抗体序列的相应 位置的残基。得到运样的抗体，其中CDR完全或者基本上来自非人抗体，并且非人抗体的可 变区框架被通过置换变得更像人的。本发明包括9E4的镶饰形式。
[01巧]D.恒定区的选择
[0126] 嵌合、镶饰或人源化抗体的重链和轻链可变区可W与人恒定区的至少一部分连 接。恒定区的选择部分地取决于是否期望抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细 胞吞隧作用和/或不提依赖性细胞毒性。例如，人同位素 IgGl和IgG3具有补体依赖性细胞毒 性，而人同种型IgG2和IgG4不具有。人IgGl和IgG3还诱导比人IgG2和IgG4更强的细胞介导 的效应子功能。轻链恒定区可W是A或K。示例性人轻链K恒定区具有SEQ ID NO: 13的氨基酸 序列。一些此类轻链K恒定区可W由核酸序列编码。SEQ ID NO: 13的N-末端精氨酸可W省 略，在运种情况下，轻链K恒定区具有EQ ID N0:28的氨基酸序列。一些此类轻链K恒定区可 W由核酸序列编码。示例性人IgGl重链恒定区具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列（具有或不 具有C-末端赖氨酸）或者SEQ ID N0:31的重链恒定区元件。一些此类重链恒定区可W有核 酸序列编码。抗体可W表达为包含两个重链和两个轻链的四聚体，表达为独立地重链、轻 链，表达为化b Jab '、F(ab '）2和Fv，或者表达为单链抗体，其中重链和轻链成熟可变区间隔 区连接。
[0127] 人恒定区在不同个体之间表现出同种异型变异和同族同种异型变异，即，不同个 体的恒定区可能在一个或更多个多态性位置不同。同族同种异型和同种异型的区别在于识 别同族同种异型的血清与一个或更多个其他同种型的的非多态性区域结合。因此，例如，另 一个重链恒定区是IgGlGlmS同种型并且具有编码SEQ ID NO:32的恒定区的氨基酸序列。另 一个重链恒定区具有SEQ ID N0:33的氨基酸序列。另一个重链恒定区具有编码SEQ ID NO: 32的恒定区的氨基酸序列，只是其缺少C-末端赖氨酸。另一个重链恒定区具有SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，只是其缺少C-末端赖氨酸。
[0128] 在一部分或全部分子中，轻链和/或重链的氨基酸或簇基端的一个或多个氨基酸 (例如，重链的C-末端赖氨酸)可W失去和/或衍生化。可W在恒定区进行置换W降低或增加 效应子功能，例如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见，例如，Winter等，美国专利号5，624， 821; Tso等，美国专利号5，834，597;和Lazar等，Proc.化tl. Acad. Sci . USA103:4005，2006)， 火焰延长人中的半衰期（参见，例如化nton等J. Biol.化em. 279:6213,2004)。示例性置换 包括250位的Gln和/或428位的Leu(本段中对于恒定区使用抓编号）W增加抗体的半衰期。 位置234、235、236和/或237中的任意或者全部位置处的置换降低对于化丫受体(特别是化 丫 RI受体)的亲和力（参见，例如US 6,624,821)。一些抗体在人1旨61的234、235和237位处具 有丙氨酸置换，W降低效应子功能任选地，将人IgG2的234、236和237位置换成丙氨酸，将 235位置换成谷氨酷胺(参见，例如US 5，624，821)。
[0129] E.重组抗体的表达
[0130] 抗体可W通过重组表达产生。可W对编码抗体的核酸进行密码子优化W用于在期 望细胞类型（例如，CHO或Sp2/0)中表达。重组核酸构建体通常包括与抗体链的编码序列可 操作地连接的表达控制序列，包括天然相关的或异源启动子区。表达控制序列可W是能够 转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体导入了合适的宿主细胞， 将宿主保持在适于高水平表达核巧酸序列的条件下，并且收集和纯化交叉反应抗体。编码 抗体的一个或多个载体还可W包含选择基因，例如二氨叶酸还原酶，W允许放大编码抗体 链的核酸的拷贝数。
[0131] 大肠杆菌是对于表达抗体(特别是抗体片段)特别有用的原核宿主。微生物如酵母 也可用于表达。酵母属是优选的酵母宿主，合适的载体根据需要具有表达控制序列、复制起 点、终止序列等。典型的启动子包括3-憐酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子 包括来自醇脱氨酶、异细胞色素 CW及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。
[0132] 哺乳动物细胞可用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核巧酸片段。参见， Winnacker,From Genes to Clones, (VCH Publishers,NY, 1987)。本领域中已经开发了若 干能够分泌完整异源蛋白质的合适的宿主细胞系，包括C册细胞系、各种COS细胞系、HeLa细 胞、HEK293细胞、L细胞和非抗体产生骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0。可能有利的是使用非人细 胞。用于运些细胞的表达载体可W包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强地 (Queen等，Immunol. Rev. 89:49( 1986) )，W及必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、 RNA剪接位点、多腺巧酸化位点和转录终止子序列。合适的表达控制序列是来源于内源基 因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等，J. Immunol. 148:1149 (1992)。
[0133] 在将编码抗体重链和轻链的载体导入到细胞培养物中后，可W在无血清培养基中 筛选细胞群的生长生产率和产物质量。然后对最高生产细胞群进行FACS基单细胞克隆W产 生单克隆系。高于50pg/细胞/天或I(K)Pg/细胞/天(其相当于大于7.5g/L培养物的滴度）的 单位生产率可能是有利的。可W测试单细胞克隆产生的抗体的浊度、过滤特性、PAGE、IEF、 UV扫描、HP-SEC、碳水化合物-寡糖作图、质谱和结合测定，例如化ISA或Biacore。可W将选 择的克隆保存在多个小瓶中并且冰冻储存用于随后使用。
[0134] -旦表达，可W根据本领域的标准方法对抗体纯化，包括蛋白A捕获、柱色谱（例 如，疏水作用或离子交换）、用于病毒灭活的低pH等（一般参见，Scopes ,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。
[0135] 用于商业性生产抗体的方法包括密码子优化，选择启动子、转录元件和终止子，无 血清单细胞克隆、细胞保存、使用选择标记用于放大拷贝数、CHO终止子、无血清单细胞克 隆、改善蛋白质滴度（参见，例如US 5,786,464、US 6，114，148、US 6,063,598、US 7,569， 339、胖02004/050884、胖02008/012142、胖02008/012142、胖02005/019442、胖02008/107388、和 W02009/027471和US 5,888,809)。
[0136] V.核酸
[0137] 本发明还提供了编码任何上文所述的重链和轻链的核酸。通常，核酸还编码与成 熟重链和轻链融合的信号肤(例如，具有SEQ ID NO: 22或24的氨基酸序列的细胞肤，其可通 过SEQ ID N0:23和25编码）。核酸的编码序列可W与调控序列可操作地连接W确保编码序 列的表达，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸 可W W分离的形式存在或者可W克隆到一个或更多个载体中。核酸可W通过例如重叠核巧 酸的固相合成或PCR合成。编码重链和轻链的核酸可W在例如表达载体内连接成一个连续 核酸，或者可W分开，例如各自克隆到其自身的表达载体中。
[013引 VI.治疗应用
[0139] 本发明提供了多种治疗或影响预防患有路易体病或者具有患路易体病的风险的 患者中的路易体病的方法。适合于治疗的患者包括具有LBD疾病的风险但是未表现出症状 的个体，W及目前表现出共核蛋白病的症状或早期警报征象的患者，例如，EEG减慢、神经精 神病临床表现(沮丧、痴呆、幻觉、焦虑、冷漠、性感缺乏）、自律变化(直立性低血压、膀脫素 乱、便秘、大便失禁、流诞、吞咽苦难、性功能障碍、脑血流量变化）、感觉变化(嗅觉、疼痛、辨 色能力异常感觉）、睡眠障碍（REM睡眠行为障碍（RBD)、多动腿综合征/周期性末端运动 (periodic extremity movements)、嗜睡症、失眠）W及各种其他征象和症状(疲劳、复视、 视力模糊、皮脂溢出、体重减轻/增加）。因此，本发明可W向具有已知的LBD的遗传风险的个 体预防性实施。此类个体包括具有经历改进并的亲戚的那些人W及通过分析基因标记或生 物化学标记确定了风险的那些人。PD风险的基因标记包括a-突触核蛋白或化rkin、UCHLI和 CYP2D6基因中的突变;特别是a-突触核蛋白基因的位置30和53处的突变。目前患有帕金森 氏病的个体可W有其临床表现鉴定，包括静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓和姿势不稳定。
[0140] 在无症状患者中，治疗可W在任何年龄(例如，10、20、30岁）开始。但是，在患者达 到40、50、60或70岁之前通常不需要开始治疗。治疗通常需要一段时间的多个阶段。可W通 过分析随着时间的抗体或者对于治疗剂(例如，O-突触核蛋白肤的截短形式）的活化的T细 胞或B细胞应答来监测治疗。如果未能应答，则指示更高剂量。
[0141] 在患者中产生有益治疗响应(例如，减少神经炎和/或轴突a突触核蛋白积累、降低 神经炎营养不良、改善认知功能，和/或逆转、治疗或防止认知减退）的条件下，可W通过向 患者施用来将该抗体用于治疗或影响预防患者中的路易体病。在一些方法中，与对照群体 相比，经治疗患者中新皮质和/或基地神经节的神经纤维网中的神经炎营养不良的面积平 均可W降低至少10%、20%、30%或40%。
[0142] 在患有路易体病或者具有患路易体病的风险的患者中，通常观察到认知障碍、认 知功能的进行性减退、脑形态的变化和脑血管功能的变化。施用本发明抗体可W抑制或延 迟此类患者中认知功能的减退。
[0143] 本发明还提供了保留或增加突触密度和/或树突密度的方法。突触或树突密度的 变化指数可W通过突触形成(突触泡蛋白）和/或树突(MP2)的标记测量。在一些方法中，突 触密度或树突密度可W恢复到健康对象中的突触密度或树突密度水平。在一些方法中，与 未治疗的对照患者群相比，经治疗患者中的突触密度或树突密度的平均水平可W提高5%、 10%、15%、20%、25%、30% 或更多。
[0144] VII.治疗方法
[0145] 在预防性应用中，W有效降低疾病的风险、减轻疾病的严重程度或者延迟疾病的 至少一种征象或症状的发作的方案(施用的剂量、频率和途径），向易感于疾病或者W其他 方式而具有疾病风险的患者施用抗体、诱导抗体的药剂或者包含抗体的制剂。在一些预防 性应用中，方案有效抑制或延迟a突触核蛋白和截短片段在脑中的积累，和/或抑制或延迟 其毒性效应和/或抑制或延迟行为缺陷的出现。在治疗性应用中，W有效改善疾病的至少一 种征象或症状或至少抑制其进一步恶化的方案(施用的剂量、频率和途径），向被怀疑患有 或者已经患有路易体病的患者施用抗体或诱导抗体的药剂。在一些治疗性应用中，方案有 效降低a突触核蛋白和截短片段的水平、相关毒性和/或行为缺陷，或者至少抑制其进一步 增加。
[0146] 如果与未用本发明方法治疗的可比较患者的对照群的平均结果相比被治疗患者 个体取得了更有利的结果，或者如果在控制的临床试验(例如，阶段II、阶段II/III或阶段 III试验）中经治疗患者相比于对照患者表现出了更有利的结果（p<0.05或0.01或甚至 0.001水平），则认为方案是治疗或预防有效的。
[0147] 有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、祀位点、患者的生理状态(包 括路易体疾病的类似）、患者是否是ApoE携带者、或者是人还是动物、施用的其他药物、W及 治疗是预防性的还是治疗性的。
[0148]抗体的示例性剂量范围为约0.1至50mg/kg患者体重。抗体可W每天一次、隔天一 次、每周一次、隔周一次、每月一次、每季度一次、每年一次或根据经验分析确定的其他方案 施用运样的剂量。示例性的治疗需要在长时期(例如，致死后6个月）施用多个剂量。额外的 示例性治疗方案需要每两周一次或者每月一次或者每3至6个月一次施用。
[0149] 抗体可W通过外周途径施用，即，其中施用的抗体穿过血脑屏障到达脑中的预期 位点。施用途径包括局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、烦内、銷内、腹膜内、鼻内或肌内。抗 体的一些施用途径是静脉内和皮下。运种注射最典型地在手臂或腿肌肉中进行。在一些方 法中，药剂直接注射到积累了沉积物的特定组织中，例如烦内注射。
[0150] 本方案可W与有效治疗或预防被治疗疾病的另外的药剂组合来实施。例如，在帕 金森氏病的情况下，对于a突触核蛋白的免疫治疗（W0/2008/103472)、左旋多己、 benzaseride、卡比多己、多己胺激动剂、非麦角多己胺激动剂、儿茶酪-0-甲基TCOMr )抑 制剂如安他可朋（6111日(3〇9〇]16)或1：〇1(3〇9〇]16、单胺氧化酶（"]^0")抑制剂如雷沙吉兰 (rasagaline)、金刚烧胺或抗胆碱能剂可与本方案组合使用。
[0151] 可W施用有效剂量的将在下文极详细描述的任何药物制剂，W治疗性或预防性治 疗患有共核蛋白病或者具有患共核蛋白病的风险的人患者。下文描述的一些制剂可W添加 到适合向患者静脉内施用的输液袋中，例如每四周一次施用。一些患者被诊断患有帕金森 氏病。本文所述制剂可W W约0.3mg/kg、约Img/kg、约3mg/kg、约1 Omg/kg或约30mg/kg人源 化9E4药物物质的剂量施用。在一些患者中，可W根据耐受性、安全性、药代动力学、效力和 其他可W凭经验确定的参数来进一步调节剂量。
[0152] VIII.制剂
[01对本发明的制剂（也称为药物组合物）包含抗体（例如，小鼠9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰或人源化形式)或其抗原结合片段、缓冲剂、一种或更多种糖和/或多元 醇和表面活性剂，并且抑未约5至约7.5。制剂可W配置成W液体形式或冻干形式储存。当W 冻干形式储存时，可W将制剂用液体(例如，无菌水)重构到本文所述浓度和性能。当说冻干 组合物可W通过添加水重构W产生特定组分浓高度和抑的制剂时，意指冻干制剂可W通常 添加水简单重构（即，不提供额外量的组分或添加酸或碱W改变pH)。冻干前 (prelyophilized)液体制剂的浓度和特性也可W根据下文描述的那些，如果冻干制剂被重 构到与冻干前制剂相同的体积的话。如果体积不同，制剂的浓度应按比例调节。如果重构体 积是冻干前体积的一半，则冻干前制剂的组分浓度应该是重构制剂的浓度的一半。
[0154]任选地，将从CHO细胞培养物中纯化的9E4抗体再悬浮在下文所述制剂中、临时冰 冻用于冻干前储存、冻干并且用水重构到与冻干前相同的浓度。此类制剂应当优选地通过 冰冻、冻干、储存和重构来稳定抗体并且适合于胃肠外施用。在示例性的工作流程中，使纯 化抗体W约40mg/ml再悬浮在制剂3 (表10)中并存在袋中于-40C储存。将袋在室溫解冻3小 时并且合并内容物。将制剂通过0.2为微米无菌过滤器进行无菌过滤。向小瓶中填充5.4ml 制剂并且冻干。冻干小瓶储存在2-8C下。通过添加无菌水(例如，约5.0至5.4ml无菌水，取决 于制剂)来对冻干小瓶进行重构。然后将5ml重构产物加入到含有20-100ml生理盐水、乳酸 林格氏溶液或5%葡萄糖溶液等的静脉注射袋的端口中用于向患者静脉内注射。
[01W] -些制剂包含填充剂，其可W与糖/多元醇组分相同或不同。通常，溶液是无菌的， 例如通过使用0.2皿或0.22邮的过滤器无菌过滤来实现。一些制剂的生物负载 < 约3〔尸11/ 30mL。一些制剂含有 <约0.化U/mg的细菌内毒素。本发明的制剂一般还是稳定的，如下文进 一步限定的，在冻融时低至不可检测水平的片段和/或聚集。另一些制剂在冻干饼重构后在 40°C下稳定至少3个月。在一些制剂中，小于约10%的抗体W聚集物存在于制剂中。在一些 实施方案中，小于或等于约5%的抗体W聚集物存在于制剂中。
[0156] 在一些制剂中，抗体W约Smg/血至约lOOmg/mL的浓度存在。在一些制剂中，抗体W 约5mg/mL至约50mg/mL的浓度存在。抗体W约25mg/血至50mg/mL的浓度存在。例如，抗体可 W W约35-45mg/ml或约40mg/mL的浓度存在。抗体可W W约50mg/小瓶至约500mg/小瓶或更 大的无菌液体剂型存在。坑提可W与约40mg/小瓶至约500mg/小瓶的冻干剂型存在。例如， 抗体可WW约250-350mg/小瓶或约200mg/小瓶的无菌液体或冻干剂型存在。
[0157] 所公开制剂中使用的抗体可W与治疗剂部分偶联，例如，细胞毒素剂、放射治疗 剂、免疫调节剂、第二抗体(例如，形成抗体异源缀合物)或有利于或增强配制抗体(例如，嵌 合、镶饰或人源化9E4)的活性的任何其他生物活性剂。代表性治疗剂部分已知可用于治疗、 控制或缓解路易体病或者共核蛋白病的症状的药剂。
[0158] 配制抗体可W包括上述抗体9E4的嵌合、镶饰或人源化形式中的任意一种。例如， 抗体可W包括含SEQ ID N0:4之S个Kabat CDR的轻链可变区和含SEQ ID NO: 11之S个 Kabat CDR的重链可变区。制剂可W包括抗体，抗体包括轻链可变区和/或重链可变区，轻链 可变区具有包含SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5中的任意一个的氨基酸序列，重 链可变区具有包含沈〇1〇^:8、569 10^:9、569 10顯：10或56〇10顯：11中的任意一 个的氨基酸序列。一些制剂包括抗体，抗体包括轻链可变区，轻链可变区具有包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列。一些制剂包括抗体，抗体包括重链可变区，重链可变区具有包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。例如，配制抗体可W包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:5的氨 基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。
[0159] 所公开制剂中使用缓冲剂W取得合适的抗体抑，例如，组氨酸、班巧酸盐和巧樣酸 盐缓冲剂。一些制剂的PH在约5.5至约7的范围内，例如抑5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、 6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。一些制剂的9出％约5.5至约6.5。一些制剂的抑 为约6.0,另一些制剂的pH为约6.5。在一些制剂中，巧樣酸盐缓冲剂或班巧酸盐缓冲剂W约 IOmM至约30mM范围内的浓度存在，例如约15-25mM或约20mM的浓度。一些巧樣酸缓冲剂包含 分布为约15mM至约20mM范围内内W及约2mM至约6mM范围内的浓度的脱水巧樣酸钢和巧樣 酸钢一水合物。
[0160] 用于制剂的合适的糖和/或多元醇包括海藻糖、薦糖、甘露醇或其组合。糖/多元醇 充当填充剂、冻干保护剂和/或张力调节剂。例如，一些制剂包含W约220mM至约260mM范围 内的浓度存在的海藻糖、W约220mM至约260mM范围内的浓度存在的薦糖或者浓度为20mM至 约40mM的薦糖和W约200mM至约220mM范围内的浓度存在的甘露醇的混合物。一些制剂包含 W约230mM或约240mM的浓度存在的海藻糖。另一些制剂包含W约230mM或约240mM的浓度存 在的薦糖。另一些制剂包含W约50mM的浓度存在的薦糖和W200mM范围内的浓度存在的甘 露醇的混合物。另一个制剂包含衣约28mM的浓度存在的薦糖和W约212mM的浓度存在的甘 露醇的混合物。一些运样的制剂的特征为摩尔渗透压浓度为约250-400、300-400或300-350m0sm/kg，例如，335m0sm/kg。
[0161] 制剂优选地包含表面活性剂W降低抗体在表面的聚集和吸附。合适的表面活性剂 包括按重量计W约0.005%至约0.05 %范围内的浓度存在的聚山梨醇醋20(PS20) dPS20保 护免于显著增加的聚集或浊度，否则运些现象将在9E4抗体的制剂中发生。聚山梨醇醋20可 W W约0.01 %至约0.05 %的浓度存在。例如，浓度可W为0.005 %、0.0 l %、0.015 %、 0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045% 或 0.05%。或者，在一些制剂中，聚山梨 醇醋 20W 约 0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L 或0.5g/L的浓度存在。一些制剂包含浓度为0.2g/L(即，0.163mmol/L)的聚山梨醇醋20。
[0162] -种示例性制剂(液体、冻干前或者冻干后重构的）的特征在于从约5.5到约7范围 内的抑，并且包括：（a)抗体9E4的嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4竞争和抗原的特异性 结合的其片段，浓度在约lOmg/ml至约50mg/ml的范围内；（b) W从约IOmM至约30mM的范围内 的浓度存在的巧樣酸盐或班巧酸盐；（C)糖和多元醇（"糖/多元醇"），其选自W约220mM至约 260mM的范围内的浓度存在的海藻糖、W约约220mM至约260mM的范围内的浓度存在的薦糖、 W及W约20mM至约40mM的范围内的浓度存在的薦糖和W约200mM至约220mM的范围内的浓 度存在的甘露醇的混合物；W及(d)按重量计W约0.005 %至约0.05 %的范围内的浓度存在 的聚山梨醇制20。例如，制剂包括：（a)抗体，抗体包括轻链和重链，轻链具有SEQ ID NO: 29 给出的氨基酸序列，重链包含SEQ ID NO: 32给出的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨 酸，其W约40mg/mL的浓度存在；（b)浓度为约20mM的巧樣酸盐缓冲液；（C)浓度为约230mM的 海藻糖；（d)浓度为约0.02%的聚山梨醇醋20; W及约6.0的pH。
[0163] -些冻干制剂包含：（a)抗体9E4的人源化形式或者其抗原结合片段；（b)巧樣酸 盐；（C)海藻糖;和聚山梨醇醋20。冻干制剂可W包含约200mg的抗体。一些冻干制剂能够用 无菌水重构。一些冻干制剂包含100-300或150-250mg犯4抗体、15-35或20-25mg脱水巧樣 酸钢、1.65-2.75或2-2.3mg巧樣酸一水合物、360-500或400-470mg脱水海藻糖、W及0.5至 1.5mg或0.75至1.25mg聚山梨醇醋20。示例性冻干制剂包含200mg犯4抗体（例如，人源化 犯4抗体）、25mg脱水巧樣酸钢、2.15mg巧樣酸一水合物、435mg脱水海藻糖和Img聚山梨醇醋 20。另一种示例性冻干制剂包含200mg犯4抗体（例如，人源化9E4抗体）、25mg脱水巧樣酸 钢、3.15mg巧樣酸一水合物、435mg脱水海藻糖和Img聚山梨醇醋20。此类制剂优选地重构到 约5ml的体积。其他冻干制剂包含与本段落任何地方的公开相同比例但是不同的量的相同 组分(例如，例如，400mg抗体、50mg脱水巧樣酸钢、4.3mg巧樣酸一水合物、870mg脱水海藻糖 和2mg聚山梨醇醋20)。
[0164] 冻干制剂优选地重构到约30-50或35-45mg/mL、优选地约40mg/mL的抗体浓度；（b) W约10-30或15-25mM、优选地约20mM的浓度存在的巧樣酸盐缓冲剂；（C) W约160-330或 200-260mM、优选地约230mM的浓度存在的海藻糖；（d) W约0.1-0.3或约0.15至0.25g/L、优 选地约0.2g/L存在的聚山梨醇醋20; W及(e)约5.5-6.5、优选地约6.0的pH。
[0165] 液体制剂或重构冻干制剂优选地为基本上等张的，意味着约250-350m0sm/kg水的 张力。一些制剂的张力为约335m0sm/kg。一些制剂的张力为270-300m0sm/kg。液体制剂或重 构冻干制剂还可W为〉350m0sm/kg水的高张的或低张的（<250m0sm/kg水）。
[0166] -些冻干制剂表现为白色至微黄色粉末。一些液体制剂或重构冻干制剂表现为溶 液，其几乎不含外来颗粒并且可W包含少量半透明的白色至微黄色的产物典型的颗粒。一 些液体制剂或重构冻干制剂具有每小瓶(体积= 5ml) <约6,000个> 10皿的显微可见（SUb-visible)颗粒和/或每小瓶^约600个^ 25]im的显微可见颗粒。一些液体制剂或重构冻干制 剂表现为无色至浅黄色（^参考溶液BY3)。一些液体制剂或重构冻干制剂表现为透明至稍 微乳白色(参考悬液III).
[0167] 除了本文描述为组分的那些外，可W不需要任何药物赋形剂、载体等就能制备本 文描述的任何制剂。如果存在不显著量的不影响制剂的性质的其他组分，则此类制剂可W 描述为由列举的组分组成，或者基本上有列举的组分组成。优选地在用于向人施用的药物 制备的FD A批准或审核的良好生产规范(GMP)下制备该制剂。
[0168] 所公开制剂中使用的抗体还可W可检测标记偶联，例如用于诊断共核蛋白病、用 于检测共核蛋白病的进展，和/或用于评估治疗的效力。如本文所述配制的抗体通常可用于 在患有或怀疑患有共核蛋白病(例如，帕金森氏病）的对象中或者在获自此类对象的合适的 生物样品中进行运样的测定。可W与人源化9E4抗体偶联或连接的代表性可检测标记包括 多种酶，例如辣根过氧化物酶、碱性憐酸酶、e-半乳糖巧酶或者乙酷胆碱醋酶;辅基，例如 Streptavidin Aiotin和抗生物素蛋白/生物素；巧光材料，例如伞形酬、巧光素、异硫氯酸 巧光素、若丹明、二氯=嗦基胺巧光素、丹横酷氯或藻红蛋白；发光材料，例如鲁米诺;生物 发光材料，例如巧光素酶、巧光素和水母素;放射性物质，例如但不限于舰(i 3il、i25I、i23I、 1211，）、碳(1化）、硫巧）、気州）、铜(115111、113111、112111、111111)、个得(991'。）、巧(2。11'1)、嫁(686曰 、 67Ga)、钮(ID3Pd)、钢("Mo)、氣("3Xe)、氣("F)、" 3Sm、"7Lu、"9Gd、I49Pm、MDLa、"Syb、I 66Ho、 WY、"Sc、"6Re、i88Re、i42Pr、iD5Rh、 97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、 32P、i53Gd、i69Yb、5iCr、54Mn、 75Se 、ii3Sn和i"Tin;使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射材料，非放射性顺磁性金属离 子，W及用特定放射性同位素放射性标记或缀合的分子。
[0169] 可W使用本领域的已知技术将治疗部分和/或可检测物质直接地或者或者通过中 间物（例如接头）间接地与小鼠嵌合、镶饰或人源化9E4抗体直接偶联或缀合。参见，例如， Monoclonal Antibodies And Cancer !"Iierapy,Reisfeld等（编辑），第243-56页（Alan R 丄 iss,Inc. 1985)中的 Arnon 等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In (Mincer HierapyWiControlled Drug Delivery(第二版），Robinson等（编辑），第 623-53 页（Marcel Dekker,Inc. 1987)中的Hellstrom 等，"Antibodies For Drug Delivery";Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications , Pinchera等（编辑），第475-506页（1985)中的Hiorpe,"Antibody Carriers Of 切totoxic Agents In Cancer Therapy:A Review";Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin 等（编辑）第303-16 页（Academic Press 1985)中的"Analysis, Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"?及Thorpe等，Immunol .Rev. , 1982,62:119-58。
[0170] 所公开制剂中使用的抗体还包括经修饰小鼠、嵌合、镶饰或人源化9E4抗体，其相 对于相应地未经修饰抗体在体内具有延长的半衰期。此类经修饰形式可W通过例如通过已 知的保护/阻断基的糖基化、乙酷化、聚乙二醇化、憐酸化、酷胺化、衍生化、蛋白水解切割、 与细胞配体或其他蛋白质连接来制备。作为一个例子，用于抗体半衰期延长的代表性方法 描述在WO 02/060919中。
[0171] 本发明包括在38°C-42°C稳定(例如，通过高效尺寸排阻色谱化PSEC)评估)至少约 30天的抗体制剂，在20°C-24°C稳定至少约1年的抗体制剂，W及在2°C-4°C稳定至少约3年 的抗体制剂评估冻干制剂在冻干状态储存的稳定性。如果在一个或更多个运些指定的时间 和溫度组合下解育之后制剂满足W下对于低至不可检测的片段化和/或低至不可检测的聚 集的定义，则认为制剂是稳定的。更具体地，所公开制剂表现出低至不可检测水平的抗体聚 集和/或片段化，或者抗体片段化和/或聚集相对于初始水平(例如小于约10%的聚集)低的 或不可检测的增加。一些制剂表现出含约5%的组合的聚集和/或片段化。具有低至不可检 测水平的片段化的制剂在例如通过高效尺寸排阻色谱化PSEC)确定的单峰中或者在通过还 原型毛细管凝胶电泳(rCGE)确定的双峰(一个对应于抗体重链和抗体重链中的每一个）（代 表未降解抗体）中包含总蛋白质的至少约80%、85%、90%、95%、98%或99%，并且不包含 具有每种总蛋白质的超过5 %、超过4 %、超过3 %、超过2 %、超过1 %或超过0.5 %的其他单 峰。具有低至不可检测水平的聚集的制剂包含按蛋白质的重量计不超过约15%、不超过约 10%、不超过约5%、不超过约4%、不超过约3%、不超过约2%、不超过约1 %或不超过约 0.5 %的聚集，如通过高效尺寸排阻色谱化PSEC)确定的。例如，在一些制剂中，少于约10 % 的抗突触核蛋白抗体W聚集物存在。本发明的稳定制剂还表现出很少或不具有嵌合、镶饰 或人源化9E4的生物活性（例如通过ELISA和/或其他功能测定可测量的结合亲和力）的损 失，即，初始可测量值的至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 98%或99%。一些制剂的结合亲和力为参考材料的初始初始可测量值的约60%至约140%。
[0172] IX.药物制剂的制备
[0173] 本发明还提供了制备药物制剂的方法。在本发明的一个方面，此类方法包括：（a) 培养哺乳动物细胞，哺乳动物细胞具有稳定整合入其基因组的编码小鼠抗体9E4(ATCC目录 号PTA-8221)或者其嵌合、镶饰或人源化形式的核酸，使得细胞分泌抗体到细胞培养基中； (b)从细胞培养基中纯化抗体;W及(C)制备任意上述制剂。
[0174] 药物制剂的制备可W包括评估制剂中抗体的至少一种性质的额外步骤，性质选自 由物理稳定性、化学稳定和生物活性组成的组。
[0175] 例如，可W培养哺乳动物细胞W产生抗体，其中哺乳动物细胞具有稳定整合如其 基因组的编码人源化9E4抗体的轻链和重链的核酸。可用于该目的的哺乳动物细胞包括具 有稳定整合入其基因组的编码SEQ ID NO: 29给出的抗体轻链和SEQ ID NO: 31或32给出的 抗体重链的核酸序列。
[0176] 为了产生抗体，将所公开核酸引入载体。在一些实例中，载体包含与能够导致在宿 主细胞中表达DM的合适控制序列可操作地连接的编码小鼠9E4抗体或者其嵌合、镶饰或人 源化形式的核酸。此类控制序列包括导致转录的启动子(例如，本领域中已知的组成型启动 子或诱导型启动子）、终止此类转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA结合位点的序列、 增强子、多聚腺巧酸化信号W及控制转录和翻译的终止的序列。载体可W是质粒、隧菌体颗 粒(例如，病毒载体，如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、瘤疹病毒、痘苗病毒、慢病毒、痘病 毒和巨细胞病毒载体)或者简单的基因插入物。一旦转化到合适的宿主细胞中，抗体核酸可 W整合到宿主基因组中，或者载体可W独立于宿主基因组复制和发挥功能。
[0177] 所公开的核酸单独地或组合地(例如，编码抗体轻链的核酸和编码抗体重链的核 酸的组合）引入到载体中。
[0178] 可用于制备本发明抗体制剂的宿主细胞包括哺乳动物细胞，包括人来源的细胞、 人胚肾细胞、猴肾细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(C册)细胞、小鼠塞尔托利细胞、 人宫颈癌化eLa)细胞、犬肾细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺瘤细胞和NSO细胞。
[0179] 或者，可W通过化学合成制备嵌合、镶饰或人源化9E4抗体然后用在所公开制剂 中。
[0180] 用于制备所公开制剂的抗体通常是分离的或纯化的，即，基本上不含细胞物质或 者来自产生抗体之细胞的其他污染物蛋白质，或者基本上不含或者化学合成时的化学前体 或其他化学物质。例如，基本上不含细胞物质的抗体包含具有少于约30 %、25 %、20%、 15%、10%、8%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%或更少(按干重计）的污染蛋白质的抗体制备 物。当重组产生抗体时，其还基本上不含细胞培养基，使得培养基表现为蛋白质制备物体积 的约 30%、25%、20%、15%、10%、8%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%或更少。当通过化学合成 产生抗体时，优选地基本上不含参与蛋白质合成的化学前体或其他化学物质或者与后者分 离。因此，此类抗体制备物具有类此抗体制剂具有少于约30%、25%、20%、15%、10%、8%、 5%、2%、1%、0.5%、0.1%或更少(按干重计）的化学前体或者抗体药物物质之外的其他化 合物。例如，一些抗体药物物质的制剂具有通过W下测定确定的W下纯度:蛋白质A ELISA ( < 约2511邑/111邑）、(：册P 化ISA( < 约10011^111邑）、16尸-化LISA( < 约111邑/111邑）、膜岛素化ISA( < 约Ing/mg)和DNA qPCR( <约3口邑/111邑蛋白质）。一些抗体药物物质制剂的生物负载 < 约 IOC即/mL。一些抗体药物物质制剂含含约0.祀U/mg的细菌内毒素。重组表达载体的纯化可 W使用本领域已知的若干方法中的任意一种，例如，亲和色谱、酸处理、深层过滤、阴离子交 换色谱、阳离子交换色谱、纳滤、超滤、透析和渗滤。
[0181] 可W将纯化的抗体药物物质调节成包含本文所述的任何制剂的溶液，稀释到期望 浓度并且储存直到准备使用。任选地，制剂可WW浓缩形式储存直到准备使用。
[0182] 液体制剂可W根据稳定性特性在冷冻下W冰冻形式储存或者在室溫下储存，稳定 性特性可W通过经验确定。在一些情况下，使用进一步过滤步骤。一些本文所述的制剂可W 冻干并且W粉末形式储存。冻干制剂可W根据稳定性特性在冷冻下W冰冻形式储存或者在 室溫下储存，稳定性特性可W通过经验确定。例如，冻干制剂可W储存在约2°C至约8°C的溫 度下。在运种情况下，可W在向患者施用前将制剂重构成具有W本文所述的浓度存在的抗 体和赋形剂的液体制剂。在一些情况下，制剂用无菌水重构。在一些情况下，将制剂重构并 且添加到输液袋中用于向患者施用。重构制剂在向患者施用前可W在冷冻下或室溫下储存 符合稳定性特定的一段时间。冻干和重构技术是本领域中已知的并且描述在实施例中。
[0183] 可W将液体制剂或重构冻干制剂在向患者施用前添加到含有稀释剂(例如生理盐 水或林格氏溶液）的输液袋中。输液袋的体积与液体制剂或重构冻干制剂的体积(例如，1-IOml)相比通常相对较大（例如，50ml至1L，或者IOO-SOOml)。多种液体可W用在输液袋中， 例如生理盐水、乳酸林格氏溶液或5%葡萄糖溶液，其各自是基本上等张的。在一个示例性 方案中，将约5ml液体制剂或冻干制剂通过生理盐水的100-ml袋的端口注射并且通过W约 1.75ml/分钟的流速静脉内输注约1小时的一段时间来施用。
[0184] 因此，本发明还包括包含冻干抗体药物物质和用于重构和使用的说明的药物产 品。一些药物产品包括：（a)小瓶，其包含约40至约200mg的粉末形式的抗体;和(b)用于重构 抗体的说明。一种示例性药物产品包括：（a)小瓶，其包含粉末形式的约200mg抗体、约25mg 脱水巧樣酸钢、约3.15mg巧樣酸一水合物、约435mg脱水海藻糖和约Img聚山梨醇醋20; (b) 用于重构的说明；和（C)用于制备输注用重构制剂的说明，其中（i)抗体包括含SEQ ID NO: 29给出的氨基酸序列的轻链和含SEQ ID N0:32给出的氨基酸序列的重链，具有或不具有C-末端赖氨酸；W及(ii)重构说明需要用注射用水重构到5mL的可提取体积。 实施例
[0185] 引入W下实施例W说明本发明的模式。W下实施例的某些方面是关于本共同发明 人发现或预期在本发明的实践中运作良好的技术和方法描述的。根据本公开内容W及本领 域的一般技术水平，本领域技术人员将理解W下实施例仅旨在举例说明，并且可W使用多 种改变、修改和变更而脱离本发明的范围。
[01化]实施例1:表达载体的制备
[0187] 将人源化犯4的重链和轻链二者可变区的特定序列（分别（SEQ ID N0:32和29)亚 克隆到表达载体中，表达载体包含允许富集高生产细胞的元件(例如，转录增强元件(TS)、 多聚腺巧酸化信号、新霉素憐酸转移酶突变体）。
[0188] 使用质粒pCET化犯4VLv3.hCK作为模板，通过PCR分离轻链可变区，在片段的5'端 引入EcoRV限制位点和3'端KpnI显著位点用于利用相同限制酶的消化亚克隆到载体地1-60 和pBI-90中。运些载体包含人K链的基因恒定区。此外，载体pBI-60和地1-90编码减弱的选 择标记新霉素憐酸转移酶，用于在选择期间富集高生产细胞。地1-60编码新霉素憐酸转移 酶的F240I突变体，pBI-90编码D227V突变体。
[0189] 使用质粒pCET Hu9E4VHv3.hlgGl作为模板，通过PCR分离人源化犯4重链的可变 区，引入5 '端Mf eI限制位点和3 '端BIpI限制位点用于亚克隆。将可变区克隆到Mf eI和BamHI 消化的含有Glm(3)同种型的人IgGl的基因恒定区的真核表达载体地1-61中。载体编码来自 仓鼠的可选择标记二氨叶酸还原酶(DHFR)。
[0190] 实施例2:人源化9E4抗体的产生
[0191] 将质粒pBI-61/犯4HC和pBI-60/犯化C共转化到在无血清培养基中预适应的中国 仓鼠卵巢(C册)细胞中。使细胞生长在不具有任何牛来源的组分的化学物确定的培养基中。 用于建立细胞系的培养基如下：
[0192] 预接种培养基
[0194] 接种前(Preinocculation)培养基的制备：
[0195] 1)WFI初始体积为总体积80%，初始溫度28°C至35°C。
[0196] 2)在每一种之前的组分完全溶解之后，立即按照列表(上文)依次加入组分。
[0197] 3)剩余体积的WFI，0.17化/L培养基。
[019引 4)过滤前，将抑调解到7.00至7.20。
[0199] 5)过滤前，摩尔渗透压浓度为280至320m0smol/kg。
[0200] 接种后加入：
[0201] 营养物补料培养基
[0202] 3%谷氨酷胺溶液
[0203] 葡萄糖溶液(500g/L)
[0204] IM碳酸钢溶液
[0205] 2 %消泡剂。
[0206] 营养物补料培养基
[0209] 营养物补料培养基的制备：
[0210] 1)WFI初始体积为总体积的70%，初始溫度30°C至40°C。
[0211] 2)在每一种之前的组分完全溶解之后，立即按照列表(上文)依次加入组分。
[0212] 3)剩余体积的WFI，0.179L/L培养基。
[0213] 4)过滤前，将抑调解到6.90至7.10。
[0214] 5)过滤前，摩尔渗透压浓度为1185至1585m0smol/kg。
[0215] 培养基过滤：
[0216] 初过滤器-0.2皿过滤器
[0217] 终过滤器-0.1皿过滤器
[0218] 从稳定转染的细胞合并抗体，由细胞得到最终生产细胞系。通过蛋白质A亲和色谱 和下文所述其他纯化技术纯化合并得到的物质。
[0219] 实施例3:抗体纯化
[0220] 蛋白质A是用于人源化、镶饰或嵌合9E4抗体的亲和纯化的细菌蛋白质。蛋白质A色 谱通常设及在抗体结合并且不需要组分(例如，宿主细胞蛋白质、细胞培养基组分和推测的 病毒)流过柱的条件下，在pH 6-8下使澄清化细胞培上清液通过柱。可W进行任选的中间洗 涂步骤W从柱中除去非特异性结合的杂质，然后在抑2.5-4下洗脱产物。根据其树脂骨架 组合物分类的蛋白质A树脂的类型包括：玻璃或二氧化娃基，例如Prosep vAJrosep vA 叫tra(Millipore);琼脂糖基，例如蛋白质A琼脂糖快速流动，MabSelect(GE Heal化care); W及有机聚合物基，例如聚苯乙締二乙締基苯 Poros A和MabCapture(Applied Biosystems)。可W使用多种洗脱缓冲剂组分，例如乙酸、巧樣酸、憐酸、精氨酸肥1和谷氨酸 HCl。
[0221] 可W通过在低抑下处理或者过滤W及其他方法除去病毒。当前的病毒截留过滤器 是具有非常小的孔的超过滤器或微过滤器。病毒滤膜由亲水聚酸讽(PES)、亲水聚偏二乙締 (PVD巧和再生纤维素制备。
[0222] 深层过滤器用于细胞培养肉汤的澄清化，W保持膜过滤器的能力或者保护色谱柱 或病毒过滤器。深层过滤器通常由纤维素、多孔助滤剂(例如娃藻±)和离子电荷树脂粘合 剂制备。深层过滤器可W使用尺寸排阻和吸附结合二者来有效分离。
[0223] 离子交换色谱使用带正电荷或带负电荷的树脂与蛋白质(基于其在跟定缓冲剂系 统中的静电荷)结合。可W确定W高度特异性结合和释放祀抗体的条件条件(例如，pH和离 子强度）。反过来，可W发现几乎与除抗体外的所有样品组分结合的条件。阴离子交换色谱 使用带正电荷的基团（弱碱性，例如二乙基氨基乙基DEAE或二甲基氨基乙基DMAE;或者强碱 性，例如季锭乙基Q或S甲基锭乙基TMAE或季锭乙基QAE)。
[0224] 阳离子交换色谱使用带负电荷的官能团修饰的树脂。其可W是强酸配体，例如横 基丙基、横基乙基和横基下基，或者弱酸性配体，例如簇基。阳离子交换色谱已经用于许多 Pl值在中性至碱性范围的mAb的纯化过程。抗体在加样步骤中结合在树脂上，并且通过洗脱 缓冲剂中增加的导电性或增加的抑而被洗脱。从加样级分和洗涂级分中除去电负电荷的过 程相关杂质例如DNA、一些宿主细胞蛋白质、浸提的蛋白质A和内毒素。阳离子交换色谱还可 W从期望抗体中分离脱酷胺基产物、氧化物质和N末端截短的形式W及高分子量物质。抗体 与阳离子交换树脂的结合取决于抑和导电性W及树脂类型。SP琼脂糖FF和SP琼脂糖XL是两 种常见的市售树脂。
[0225]超滤是用于抗体浓缩和缓冲剂交换的一种压力驱动的膜过程。超滤是基于尺寸的 分离，其中比膜孔大的物质被截留，而较小物质自由通过。超滤的通过在给定压力驱动力下 不同组分穿过膜的过滤速度的差异实现分离。缓冲剂交换使用渗滤模式实现，其中最终期 望组合物的缓冲剂W与滤液移除相同的速度加入到渗余物系统中，因此保持恒定的渗余物 体积。孔范围为1至20nm的超滤可W提供分子量为500道尔顿至1，000千道尔顿范围的物质 的分离。
[0。6] 可W使用来自GE Healthcare的MabSelect树脂通过重组蛋白质AbProtein-A)亲 和色谱从收获的滤液中捕获9E4抗体产物。产物在中性抑下与蛋白质A树脂结合并且在等度 模式下利用pH 3.0的IOOmM醋酸钢洗脱。通过该步骤大部分宿主细胞杂质和细胞培养基组 分减少。用一半PAIN缓冲剂（500mM 化Cl、1.34mM KCl、4mM Na2HP〇4X 2H2〇、0.735mM KH2P04x2H20、0.125%PVP = 科利当17、7.5%异丙醇、4.3mM化0H、250mMレ精氨酸-肥L，pH 7.4,导电率45mS/cm)进行独立的分离步骤W除去依然保留在柱上的组分并且使中性AT合 并产物的浊度尽可能小。通过W类似加样量将收获的合并物分开来进行蛋白质A步骤最多 S个循环。用 1.47mM KH2P04X 2肥0、8.03mM 化2HP04X 2H20 137mM NaCl、2.68mM KCl将将 柱平衡到pH 7.4±0.2并且导电率16±3mS/cm移除去储存的溶液并且将柱为加样做好准 备。然后W最大30g/L收获滤液对柱加样、洗涂(3份缓冲剂，各自为3个柱体积)并且洗脱。洗 脱后，将柱用0.1 M憐酸对剥离并且平衡用于下一循环，或者如果次日进行随后的循环，则完 全再生并且储存。在最后一次循环后利用0.1 M憐酸(剥离）、6M脈和IM乙酸进行完全再生。
[0227] 将合并的并且0.2皿过滤的MabSelect合并产物用IM乙酸(揽拌）调节到抑3.5并 且在室溫下解育60-70分钟用于病毒灭活(不揽拌）。在揽拌下通过添加 IM tris碱中和到抑 5.50±0.20。
[0228] 立即使酸处理产物通过W下深层过滤步骤。通过化no Ze化P1US60ZA的深层过滤 步骤是用于除去浑浊的步骤。将病毒灭活的合并产物通过由无菌的上述深层过滤器材料和 0.2WI1 PES膜过滤器组成的二阶段过滤过程过滤。
[0229] 将深层过滤的合并产物使用来自GE化althcare的Q-琼脂糖快速流动树脂通过阴 离子交换色谱(AEX)W流通方式(flow-through mode)进一步纯化。AEX步骤减少了残余的 宿主细胞DNA并且除去病毒。将柱用Q平衡缓冲剂(42.SmM氨基下S醇-HCl、7.2mM化is碱、 39mM化Cl)平衡到pH 7.50 ±0.20和导电率8.0 ± 1. OmS/cmW除去储存的溶液并且将柱为 加样做好准备。在加样期间，产物流过柱而杂质与柱结合。在加样/洗脱后，将柱用Q平衡缓 冲剂洗涂W除去保留在柱的流动相中的产物。在产物回收后，将柱再生并且最终储存。
[0230] 将调节的Q-琼脂糖合并产物使用来自Applied Biosystems的化ros HS50通过阳 离子交换色谱（CEX)进一步纯化。产物在低盐调节（36.2mM CHsCOO化X 3出0,13. SmM CH3C00H，58.5mM化Cl，pH5.1，导电率8mS/cm)下与柱结合，然后在高盐条件（38mM CH3C00化x3H20，12mMCH3C00H，228mM化Cl，pH5.1，导电率25.5mS/cm)下W等度模式洗 脱。利用中等盐量（37.2mM OfeCOONa X 3此0,12.SmM OfeCOOH,102.5mM 化Cl，pH 5.1，导电 率13.5mS/cm)进行额外的洗涂步骤W除去污染物，例如宿主细胞蛋白质、高分子量产物变 体和浸提的蛋白质AXEX步骤进行最大2个循环。在运种情况下，将调解的AEX合并物分成2 个相等体积并且单独在CEX柱上处理。
[0231] 病毒过滤(VF)提供了特异性用于除去病毒颗粒的第二种正交方法，并且被设计成 除去大于20nm的颗粒(例如，细小病毒）。病毒过滤通过在1.化ar的跨纳米过滤器压降下使 Poros HS50合并产物在压力下转移通过串联的0.1 ym初过滤器和病毒过滤器（Planova 20N，As址i Kasei)来实现。在使用前(泄漏测试)和使用后(泄漏测试和金颗粒测试)进行病 毒过滤器的完整性测试。
[0232] 将纳米过滤的合并产物浓缩到约20g/L(UFl)，然后用>6倍体积的渗滤缓冲剂 (17mM Cs曲Na3〇7X 2此0,3mMC6H8〇7X此0，pH 6,导电率4mS/cm)的恒定体积进行渗滤。渗滤 后，将合并物浓缩到约75g/L(UF2)。最后，通过用渗滤缓冲剂冲洗来从UF/DF系统中除去渗 余物至约52g/L的浓度（="30kD合并产物"）。
[0233] 将30kD合并产物与4+1的比率与5倍海藻糖/Tween20(聚山梨醇醋20)spike缓冲剂 ((17mM C油日Na3〇7X 2此0,3mMC6H8〇7X 出0，1150mM海藻糖X 2此0，lg/L聚山梨醇醋20，pH 5.9，导电率1.〇1115八111)混合并且用制剂缓冲剂（17111]\1〔6化化3〇7义2出0,3111]\1(：抽8〇7义此0， 230mM海藻糖X 2此0，0.2g/L聚山梨醇醋20，pH 6.0，导电率3.30mS/cm)稀释W得到40.0 ± 2.0g/L的蛋白质浓度。
[0234] 将本体材料(bu化material)通过串联的0.2皿合并过滤器(pool filter)和0.化 m袋过滤器(bag fi 1 ter)过滤。可W进行额外的初过滤器至0.2皿过滤器W除去颗粒。测试 0.2WI1合并过滤器的完整性。如果位测试合并过滤器，则单独测试每个袋过滤器。
[0端]实施例4:制剂开发
[0236] 贯穿本实施例，使用具有SEQ ID NO:29的轻链序列和SEQ ID NO:32的重链序列的 人源化9E4抗体。
[0237] 物理化学特征。为了有助于选择潜在的制剂组分，确定人源化9E4抗体的热特性。 测定中使用差示扫描量热法（"DSC'）、直角光散射（"RALS")和固有巧光（"ir )技术。首先将 纯化抗体从l〇°C加热到7rc，然后从71°C冷却到10°C，然后再次从10°C加热到83°C，然后再 次从83°C冷却到10°C，最后再次从10°C加热到95°CdDSC热谱图掲示了两个转变，71°C处的 第一个和83°C处的第二个。参见图1。在实验条件下71°C的转变是可逆的。RALS和IF热谱图 掲示了中间溫度处的单转变。
[023引pH优化。接下来在pH值范围为3.5至8.0的混合缓冲系统中分析人源化犯4的稳定 性。再次，在测定中使用DSC、RALS和IF技术。如前，在DSC热谱图中检测了两个转变(除了在 pH 3.5检测到第S个转变W外）W及在RALS和IF热谱图中检测到单个中间转变。当在约71 °0下趋平时DSC分析中的第一热转变在pH 6.5之前随着抑的增加而增加(表4,下文W及图 2)。在抑5.0和6.5之间，DSC分析中的第二热转变在83°C附近出现峰值。在4.5-8.0的抑范 围下，RALS分析中的热转变保持在约77°C，在相同抑范围下IF热转变在75°C至77°C之间变 化(图2)。基于该结果，确定5.5至7.0的抑范围提供为人源化9E4抗体提供最大稳定性。 [0239] 表4:人源化犯4的作为pH函数的DSC热转变峰
[0241] 缓冲剂选择。基于人源化9E4抗体的抑依赖性稳定性结果，鉴定对于胃肠外使用来 说药学上可接受的并且可W在5.5至7.0之间的抑范围内提供足够的缓冲能力的缓冲系统。 缓冲剂体系包括20mM巧樣酸盐缓冲剂(pH 5.5;6.0)、20mM组氨酸缓冲剂(pH 6.0;6.5;7.0) 和20mM班巧酸盐缓冲剂(pH 6.5)。通过05(：、1?41^5和^测定2〇1111班巧酸盐和2〇1111组氨酸缓冲 剂中人源化9E4抗体的热稳定性。如通过DSC确定的，pH 5.5至6.0的巧樣酸盐缓冲剂中的人 源化9E4抗体表现出比组氨酸缓冲剂中的人源化9E4抗体显著更高的第二热转变(Tm2)(下 表5)。相反地，pH 6.5至7.0的组氨酸缓冲剂中的人源化9E4抗体表现出比巧樣酸盐缓冲剂 中的人源化9E4抗体更高的第一热转变(Tml)(表5)。使用RALS技术未检测到组氨酸缓冲的 抗体的转变。但是巧樣酸盐缓冲的抗体在pH 5.5和6.0表现出78°C的热转变。
[0242] 还通过DSC和RALS分析了班巧酸盐缓冲的人源化犯4抗体(pH 6.5)并且将结果与 巧樣酸盐缓冲的(pH 6.5)和组氨酸缓冲的(pH 6.5)抗体进行了比较。对于DSC分析，巧樣酸 盐缓冲剂和班巧酸盐缓冲剂中的第二热转变(Tm2)比组氨酸缓冲剂中的高约rC，表明在测 试条件下蛋白质稍高的稳定性。通过RALS检测到了pH 6.5的班巧酸盐缓冲剂和巧樣酸盐缓 冲剂的可比较的转变溫度。
[0243] 基于运些发现，选择20mM巧樣酸盐(pH 6.0)和20mM班巧酸盐(pH 6.5)缓冲剂来用 于产生冻干产品并且测试其长期稳定性。
[0244] 表5:人源化犯4的作为缓冲剂的函数的DSC热转变峰
[0246]糖/多元醇选择。为了提高冻干制剂中人源化9E4抗体的稳定性，分析了糖好多元 醇对抗体热稳定性的影响。评估的糖/多元醇包括海藻糖、薦糖或者薦糖和甘露醇的混合 物。将240mM海藻糖、240mM薦糖W及50mM薦糖/200mM甘露醇分别加入到20mM班巧酸盐(pH 6.5)、20mM组氨酸(pH 6.5)和20mM巧樣酸盐(pH 6.5)缓冲剂中。然后通过DSC评估每一种制 剂的人源化9E4抗体的稳定性。DSC结果表明，多种糖/多元醇使第一和第二热转变向更高稳 定转移，指示了稳定效果(下表6)。但是，海藻糖制剂始终具有最高的热转变(表6)。此外，组 氨酸制剂中的第二转变溫度(化2)低于巧樣酸盐和班巧酸盐制剂中的(表6)。
[0247]表6:作为缓冲剂和糖/多元醇的函数的人源化犯4的DSC热转变溫峰
[0249] 还在班巧酸盐或巧樣酸盐缓冲剂(pH 6.50中对具有多种糖/多元醇的人源化9E4 抗体进行了RALS测量。对于班巧酸盐缓冲剂，240mM海藻糖制剂具有最高转变溫度(77°C)， 240mM薦糖制剂具有中等转变溫度(76°C)，50mM薦糖/200mM甘露醇制剂具有最低转变溫度 (75°C)。对于巧樣酸盐缓冲剂，240mM海藻糖制剂和50mM薦糖/200mM甘露醇制剂具有相同的 转变溫度(78°C)，240mM薦糖制剂就有较低转变溫度(77°C)。巧樣酸盐制剂中转变溫度仅1 °C的差异在测试可变性之内。
[0250] 表面活性剂。使用DSC测试聚山梨醇醋2〇rPS20")对热稳定性的影响，并且确定为 对人源化9E4抗体的转变溫度没有影响。但是，关于震荡应力，观察到了 PS20的积极效果。测 试了两种制剂对于震荡应力的反应：（A)20mM pH 6.0巧樣酸盐，230mM海藻糖，0.02% (w/w) PS20; (B)25mM pH 6.0巧樣酸盐，230mM海藻糖。即使震荡24小时，具有PS20的制剂(制剂A) 提供了较低的泡沫形成程度和恒定的浊度。震荡3小时后，制剂B具有强泡沫形成增加的浊 度。没有制剂在震荡研究中导致产生可见颗粒。
[0251] 接下来，评估了 PS20对于震荡诱导的浊度的影响。即使震荡24小时后，制剂A的浊 度未增加。相比之下，制剂B的浊度几乎加倍，从震荡前的17FNU(Formazin Ne地elome化ic 化it)增加到了震荡24小时后的32FNU(表7)。
[0252] 表7:震荡前和震荡后人源化9E4抗体制剂的浊度（(FNU)
[0254] 震荡前和后抗体聚集的测量同样地证明了PS20的稳定效应。在震荡前和震荡3、6 和24小时后通过高效尺寸排阻色谱化PSEC)评估制剂A和制剂B中单体抗体和聚集抗体的 量。制剂A中PS20的存在与聚集抗体量的稍微增加(0.2 % )(表8)和单体抗体量的相应降低 (0.2% )(表9)相关联。相比之下，制剂B(无 PS20)表现出聚集抗体4倍增加(表8)和单体抗体 的量相应高降低(0.9%)(表9)。
[0255] 表8:震荡前和后人源化9E4抗体聚集（％ )
[0257]表9:震荡前和后人源化9E4抗体单体水平（％ )
[0259] ~因此，震荡研究的结果表明，PS20组织人源化9E4抗体制剂中不期望的浊度和抗体 聚集的增加。
[0260] 冻干可行性研究。基于之前分析，选择制剂1-4(下表10)来评估^冻干形式储存人 源化9E4抗体的可行性。
[0261] 表10:人源化9E4抗体测试制剂
[0263] 作为开始冻干循环的初始步骤，研究冰冻F1-F4制剂的热特性。使用Mettler Toledo DSC 821仪器来确定每一种制剂的玻璃化转变(Tg'）溫度。在W下冰冻/解冻循环下 进行测量：
[0264] 冰冻：W5K/分钟从5°C到70°C。
[0265] 保持:-7(TC下3分钟。
[0%6]加热：W5K/分钟从-70°C到25°C。
[0267]表11列出了 W该方式确认的玻璃化转变溫度。制剂2和4(其包含班巧酸盐和甘露 醇)表现出与海藻糖制剂相比较低的Tg'，而使用不同缓冲剂并不显著影响Tg'。尤其其更高 的Tg'，海藻糖制剂(制剂1和3)在初始干燥期间可W禁受更高产物溫度，运对于冻干过程有 利。
[026引表11:制剂Fl至F4的玻璃化转变溫度
[0270] ~基于确定的玻璃化转变溫度，开发并且测试了两种不同的冻干循环。第一种循环 包括在-10°c(搁板溫度)下进行的初级干燥步骤(表12)。第二种循环中的初级干燥步骤在-20°C下进行(表13)。
[0271] 表12:用于冻干可行性研究的冻干循环1
[0273] 表13:用于冻干可行性研究的冻干循环2
[0276] 使用化Silon 2-12D，GT-12-B冻干器(化rist)进行小规模的冻干可行研究。在0.2 Mi过滤后，将制剂抗体的5.4ml ±0.2ml等分试样加入到20ml小瓶（I型透明玻璃小瓶，20/ 25mL，Blow Back,来自Schott)。所得小瓶具有5.〇1111的标称填充体积和20〇111旨/小瓶的标称 剂量。冻干后的预期重构体积为5.Oml水。将小瓶手动输入到冻干器中并且根据循环1或循 环2冻干。使用放置在小瓶中的PTlOO传感器监测产物溫度。没有任何偏差的情况下进行循 环。在水结晶之前将制剂过冷到-6.5°C的最小溫度，之后将制剂冰冻到-50°C。对于初级干 燥阶段，在-l〇°C(循环1)或-20°C(循环2)的搁板溫度下应用0.1 OmbaH电容真空计）的真 空。对于循环1，运些参数导致升华期间-28°C至-25°C的平均产物溫度。对于循环2,运些参 数导致升华期间低于-30°C的平均产物溫度。对于两个循环，初级干燥的实际持续时间为40 个小时。在初级干燥后，将搁板溫度升高到30C(第二干燥）W允许吸收解冻的水。次级干燥 设置为8小时的周期，目的是冻干制剂的最终水分含量为约1 %。在冻干后，将小瓶塞上塞子 (Stelmi C1404 6720GC 6TP3,20mm)并且密封(侣flip-off密封，20mm)。
[0277] 含海藻糖的制剂在冻干后为完全的无定形并且表现出一些收缩。相比之下，含甘 露醇的制剂部分结晶并且不表现出收缩。所有制剂的饼高为约11mm。饼质量为约685mg (Fl)、516mg(F2)、700mg(F3)和520mg(F4)。对于所有制剂，饼具有浅黄色颜色。
[0278] 分析并且比较通过循环1和循环2产生的冻干制剂的特征，包括水分含量、重构时 间、显微可见颗粒的数目。见表14(下文）。此外，将冻干制剂的质量与冻干前的产品治疗相 比较。额外的特性测试包括澄清度、pH、摩尔渗透压浓度、单体相对于聚集物的量、密度、HIC 图案和活性(数据未示出）。总的来说，在冻干和重构后未发现对产品质量造成的不利影响： 冻干过程未显著改变产物外观、颜色、可见颗粒水平、澄清度、pH、摩尔渗透压浓度、蛋白质 含量、单体含量、HIC图案和活性。此外，通过循环1冻干的制剂的重构时间（100-140秒)和通 过循环2冻干的制剂的重构时间（100-170秒)可接受，测量的显微可见颗粒水平低于药典规 格。
[0279] 表14:冻干可行研究的结果，冻干后产品测试
[0281] 由于冻干循环2导致含甘露醇和薦糖的制剂更长的重构时间和稍微升高的显微可 见颗粒水平(2-10WI1)的趋势，选择基于修改的循环1的冻干循环用于加速稳定性研究。该修 改的冻干循环包括更短的40个小时而非60个小时的初级干燥阶段(步骤8)和12个小时而非 8个小时的延长的次级干燥阶段(阶段10)。包括更长的次级干燥阶段W进一步减少冻干制 剂中的水分含量。
[0282] 冻干制剂的加快的稳定研究。将制剂Fl-F4(如上表10所述)如上所述冻干，只是使 用表15(下）中示出的冻干循环。对于加速稳定性研究，将冻干制剂储存在40°C、75%相对湿 度(畑)下I、2或3个月的一段时间。储存后，将制剂用水(5. Oml)重构，检查重构制剂的特性 并且与冻干后立即重构的制剂的特性（"初始值"）相比较。
[0283]表15:加速稳定性研究的冻干循环
[0285] 冻干制剂的饼颜色为浅黄色，与冻干可行性研究中观察的一致。所有情况下饼外 观均可接受，海藻糖制剂(Fl和F3)由于冻干产物的无定形特性(通过X射线粉末衍射确认） 而倾向于收缩。含甘露醇的冻干制剂(F2和F4)部分结晶并且基本上未表现出收缩。在40°C 下储存S个月的过程后，制剂的饼外观和颜色未改变。
[0286] 在40°C下3个月后，冻干制剂在重构前的水分含量未显著改变。紧接冻干的制剂的 水分含量为0.90%至1.36%，3个月后，为0.84%至1.47%。参见表16(下文）。同一制剂的不 同样品观察的水分含量的差异是由于测试方法的变化。但是，含薦糖和甘露醇的制剂始终 比含海藻糖的制剂包含更高的水分含量。
[0287] 表16:冻干制剂在40°C下储存后的水分含量
[0289] 所有冻干制剂的重构时间均可接受，在49秒和97秒之间变化。所有冻干制剂的外 观均可接受，即使在40°C下3个月后也未观察到可见颗粒。此外，与冻干前制剂相比，制剂的 颜色在经过相同时间段后保持未改变(<BY5)。
[0290] 在40°C下3个月后，对于任何制剂均未观察到蛋白质浓度、摩尔渗透压浓度和抑中 的相关变化(数据未示出）。但是，观察 到了浊度的不同的增加。如表17(下文）中所示，含甘 露醇的制剂(F2和F4)的浊度表现的较大增加(S个月后6-7FNU)，而含海藻糖的制剂(Fl和 F3)表现出较少增加(仅2FNU)。
[0291]表17:冻干后制剂在40°C下储存后的浊度
[0293] 通过微流成像(MFI)法测量重构制剂中的显微可见颗粒。每个制剂每个时间点测 量两个单独样品。对于冻干后立即重构的制剂（即，未在40°C下储存），显微可见颗粒的水平 示出在表18(下文）中，相应柱状图示出在图帥。在40°C下储存1个月、2个月和3个月的制剂 检测的显微可见颗粒的水平分别示出在表19-21中（参见下文），相应柱状图分别示出在图 4-6 中。
[0294] 表18 :MFI数据，冻干后的初始值
[0296]表19:MFI数据，在40°C下储存1个月后的值
[0298]表20 :MFI数据，在40°C下储存2个月后的值
[0300]表21:MFI数据，在40°C下储存3个月后的值
[0302] MFI分析表明，受试制剂中的显微可见颗粒水平与刚冻干之后类似，但是含甘露醇 和薦糖的制剂(F2和F4)中的水平在一个月后急剧增加，并且之后持续增加。结果，制剂2超 过药典对于大于或等于10微米（含10.OOwiO的显微可见颗粒和正好一个月后的大于或等于 25微米（含25.OOwn)的显微可见颗粒的极限，制剂4超过了药典对于在40°C下储存2个月后 的显微可见颗粒的极限。相比之下，含海藻糖的制剂(Fl和F3)未表现出显著增加的颗粒形 成，并且低于药典对于40°C下至少3个月的显微可见颗粒的极限。
[0303] 还在40°C下储存2个月后通过不透光度测量了四种制剂中的显微可见颗粒。不透 光度是一种已知技术，其得到与MFI测量不同的结果，通常倾向于更低。如表22(下文）中所 示，通过不透光度检测，制剂2具有最高的显微可见颗粒水平，而其他制剂具有较低更加类 似的显微可见颗粒水平。
[0304] 表22:不透光度数据，在40°C下储存2个月后的值
[0306] 还通过高效尺寸排阻色谱化P-SEC)分析制剂W确定W冻干状态在40°C下储存后 聚集和单体形式的抗体的百分比。如表23(下文)所示，含甘露醇和薦糖的制剂中聚集抗体 的百分比从2.5%增加到4.4%，而含海藻糖的制剂中仅从1.0%增加到1.1 %。随着制剂中 聚集抗体水平的增加，单体抗体的百分比相应减少。参见表24。图7中示出了作为制剂和在 40°C下储存时间的函数的单体抗体的量的图示。
[0307] 表23:在40°C下储存后的抗体聚集(百分比）
[0309]表24:在40°C下储存后的单体抗体(百分比）
[0312] 经过40°C的储存历程后通过疏水相互作用色谱化IC)表征制剂。对于每一种制剂， 可W通过HIC检测前峰(相对亲水性）、主峰和后峰(相对疏水）。可W通过出现的每个峰的面 积的变化来监测蛋白质结构随时间的变化。HIC分析的结果示出在表25-27(下文）中。每一 种制剂的前锋面积的变化类似。主峰和后峰面积的变化更显著，含海藻糖的制剂和含甘露 醇/薦糖的制剂不同。具体地，在经过3个月的储存期后，含甘露醇/薦糖的制剂(F2和F4)的 主峰面积分别表现出8.4%和5.4%的降低。相比之下，经过相同的时期后，含海藻糖的制剂 (Fl和F3)的主峰面积分别表现出4.7%和4.5%的降低。含甘露醇/薦糖制剂的主峰中大部 分之前的蛋白质转移到疏水后峰，制剂F2和F4的后峰面积分别增加6.4%和4.6%。
[0313] 表25: HIC数据，在40°C储存后的前峰面积(百分比）
[0315]表26:HIC数据，在40°C储存后的主峰面积(百分比）
[031引表27:HIC数据，在40°C储存后的后峰面积巧分比）
[0320] 还通过等电点聚焦和毛细管成像（iCE)表征制剂。每一种制剂表现出=峰图形，包 括酸性峰、主峰和碱性峰。如表28中所示，制剂1在40°C储存的S个月期间表现出最小的峰 图形变化，而制剂2-4表现出碱性峰面积随时间的大的增加。
[0321] 表28:在40°C储存后的iCE数据
[0323] 还检查了每一种制剂中抗体的抗原结合活性。无论哪种制剂，抗体在40°C =个月 储存期间表现出高抗原结合活性。
[0324] 还测试了制剂在超滤/渗滤(UF/DF处理)期间的聚集制剂。试剂3表现出最少量的 聚集制剂，而制剂2表现出最多；制剂1和4表现出中等的聚集量(数据未示出）。
[0325] 考虑所有的加速稳定性数据，与制剂F2和F4相比，制剂Fl和F3在S个月储存后表 现出最佳稳定。运反映了 W下事实：如通过浊度、册-SEC、显微可见颗粒、HIC和iCE检测的， 制剂F2和F4(含甘露醇/薦糖的制剂)表现出相对差的稳定性。制剂Fl与F3相比，一个显著差 异在于Fl倾向于在超滤/渗滤处理期间产生比F3稍多的聚集物。因此，选择制剂F3作为最优 选制剂。
[03%]关于冻融的制剂稳定性。接下来测试制剂F3使人源化9E4抗体关于冻融稳定的能 力。为此，将人源化9E4抗体纯化并且再悬浮在制剂F3中。然后将20ml含人源化9E4的F3 W 40mg/ml填充到Sa;rto;rius Stedim Flexboy 30ml袋中，并且将袋在-40°C冰冻。每个袋进行 最多5次冻/融循环。在冰冻前和1、3和5次冻/融循环后对制剂F3中的人源化9E4抗体进行分 析检验。在至多=次冻-融循环后，未检测到显著变化。在五次冻-融循环后，检测到聚集抗 体的水平显著增加(0.2%)并且观察到HIC和iCE图像的小的变化。虽有其他分析结果，包括 对颜色和可见颗粒的视觉检查、澄清度、UV扫描、HP-SEC、摩尔渗透压浓度、pH、显微可见颗 粒数目和抗体活性，在五次冻-融循环后没有变化。
[0327]可W对本文进行多种形式和细节的改变而不脱离本发明的精神和范围。除非从上 下文明显地，否则任何实施方案、方面、要素、特征、步骤等可W与任何其他结合使用。与引 用相关的信息可能随时间改变，与最早有效申请日的引用相关信息是指，引用的最早有效 申请日意味着本申请的申请日或者最早优先权申请公开了引用。为了所有目的，本说明书 主体中引用的所有参考文献、颁布的专利和专利申请通过引用全部并入在此。任何实施方 案、方面、特征、要素、步骤等可W与任何其他的组合，除非上下文另外明确指出。当记载了 组合物包含某些指定的成分时，除非上下文另外要求，否则本申请应被解释为在替选方案 中公开了可能由或基本上由指定成分组成的组合物。例如，当记载抗体链具有包含指定SEQ ID NO.的氨基酸序列时，应该理解的是，除非上下文另外要求，否则替选地抗体可W由或基 本上由沈Q ID NO.组成。
【主权项】
1. 一种药物制剂，其包含： (a) 抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4特异性竞争 与抗原结合的其片段，其中所述抗体以约1Omg/mL至约50mg/mL范围内的浓度存在； (b) 以约10mM至约30mM范围内的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂或琥珀酸盐缓冲剂； (c) 一种或更多种糖和多元醇（"糖/多元醇"），其选自： (i)以约220mM至约260mM范围内的浓度存在的海藻糖， (ii)以约220mM至约260mM范围内的浓度存在的蔗糖， (iii)以及以约20mM至约40mM范围内的浓度存在的蔗糖和以约约200mM至约220mM范围 内的浓度存在的甘露醇的混合物；以及 (d) 以按重量计约0.005 %至约0.05 %范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20; 其中所述制剂的特征在于pH在约5.5至约7的范围内。2. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体是抗体9E4的人源化形式。3. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有包 含SEQIDNO:5的氨基酸序列。4. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有包 含SEQIDNO: 10的氨基酸序列。5. 根据权利要求2所述的制剂，其中所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链 可变区具有包含SEQIDNO: 3-5中的任一个的氨基酸序列，所述重链可变区具有包含SEQ IDNO:8-10中的任一个的氨基酸序列。6. 根据权利要求2所述的制剂，其中所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQ IDNO: 5的氨基酸序列，所述重链具有包含SEQIDNO: 10的氨基酸序列。7. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链 可变区包含SEQIDN0:4的三个KabatCDR，所述重链可变区包含SEQIDN0:ll的三个 RabatCDR〇8. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体以约40mg/mL的浓度存在。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其中所述缓冲剂是以约20mM的浓度存在的 柠檬酸盐缓冲剂。10. 根据权利要求9所述的制剂，其中pH为约6.0。11. 根据权利要求9所述的制剂，其中所述柠檬酸盐缓冲剂包含柠檬酸钠二水合物和柠 檬酸一水合物。12. 根据权利要求11所述的制剂，其中所述柠檬酸钠二水合物以约15mM至约20mM范围 内的浓度存在，并且所述柠檬酸一水合物以约2mM至约6mM范围内的浓度存在。13. 根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其中所述缓冲剂是琥珀酸盐缓冲剂并且 以约20mM的浓度存在。14. 根据权利要求13所述的制剂，其中pH为约6.5。15. 根据权利要求1至14中任一项所述的制剂，其中所述糖/多元醇是以约230mM的浓度 存在的海藻糖。16. 根据权利要求1至14中任一项所述的制剂，其中所述糖/多元醇是以约28mM的浓度 存在的蔗糖和以约212mM的浓度存在的甘露醇的混合物。17. 根据权利要求1至16或60中任一项所述的制剂，其特征在于摩尔渗透压浓度为约 335mOsm/kg〇18. 根据权利要求1至17或60中任一项所述的制剂，其中小于约10%的所述抗体在所述 制剂中以聚集物存在。19. 根据权利要求1至18、60或64中任一项所述的制剂，其还包含填充剂。20. 根据权利要求1至19、60或64中任一项所述的制剂，其为无菌的。21. 根据权利要求1至20、60或64中任一项所述的制剂，其在冻融后是稳定的。22. 根据权利要求1至20、60或64中任一项所述的制剂，其中在38-42°C下储存至少30 天，在20-24°C下储存至少一年和/或在2-4°C下储存至少三年后，至少80 %的蛋白质在高效 尺寸排阻色谱中表现为单峰。23. 根据权利要求1至20、60或64中任一项所述的制剂，其在38-42°C下储存至少30天， 在20-24°C下储存至少一年和/或在2-4°C下储存至少三年后在高效尺寸排阻色谱上具有不 超过15%的聚集蛋白质。24. 根据权利要求1所述的制剂，其中： (a) 所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列，所述重 链具有包含SEQIDN0:32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，并且所述抗体以约 40mg/mL的浓度存在； (b) 以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂； (c) 以约230mM的浓度存在的海藻糖； (d) 以约0.02%的浓度存在的聚山梨醇酯20;以及 (e) 约 6.0 的pH。25. -种抗体的冻干制剂，其包含 (a) 抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的人源化形式或者其抗原结合片段； (b) 柠檬酸盐； (c) 海藻糖;和 (d) 聚山梨醇酯20。26. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其中其通过添加水重构成pH在约5.5至约6.5之 间的制剂。27. 根据权利要求26所述的冻干制剂，其中所述制剂在重构时pH为约6.0。28. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其包含约10mg至约40mg的所述抗体。29. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其中所述聚山梨醇酯20以按重量计约0.01%至 约0.05 %范围内的量存在。30. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其可通过添加水重构成水溶液，所述水溶液包 括： (a) 抗体，所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列， 所述重链具有包含SEQIDNO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，并且所述抗 体以约40mg/mL的浓度存在。 (b) 以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂； (c) 以约230mM的浓度存在的海藻糖； (d) 以约0.02%的浓度存在的聚山梨醇酯20;以及 (e) 约 6.0 的pH。31. 根据权利要求30所述的冻干制剂，其中所述冻干制剂包含约200mg的所述抗体并且 能够用无菌水重构。32. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其包含： (a) 200mg的所述抗体； (b) 25mg柠檬酸钠二水合物； (c) 2.15mg梓檬酸一水合物； (d) 435mg海藻糖二水合物;和 (e)lmg聚山梨醇酯20。33. -种治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病或者具有患共核蛋白病的风险的人患者 的方法，所述方法包括向所述患者施用有效剂量的根据权利要求1_24、60或64中任一项所 述的制剂。34. 根据权利要求33所述的方法，其中将所述制剂加入到用于向患者静脉内施用的袋 中。35. 根据权利要求33所述的方法，其中所述人患者被诊断患有帕金森氏病。36. 根据权利要求35所述的方法，其中还用左旋多巴、benzaseride、卡比多巴、儿茶酸-〇-甲基转移酶（"COMT"）抑制剂、非麦角多巴胺激动剂、单胺氧化酶（"MAO"）抑制剂和金刚烷 胺中的一种或更多种来治疗所述患者。37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述⑶MT抑制剂是安他可朋或tolcopone，并且 所述ΜΑ0抑制剂是雷沙吉兰。38. 根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中以多剂量施用所述制剂。39. 根据权利要求38所述的方法，其中以约每日一次至约每年一次范围内的频率施用 所述制剂。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述频率在约每隔一周一次至约每三个月一次 的范围内。41. 根据权利要求39所述的方法，其中所述频率为约每四周一次。42. 根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中以约0 .lmg/kg至约50mg/kg人源化 9E4药物物质的范围内的剂量施用所述制剂。43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约0.3mg/kg人源化9E44药物物质。44. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约lmg/kg人源化9E4药物物质。45. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约3mg/kg人源化9E4药物物质。46. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约10mg/kg人源化9E4药物物质。47. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约30mg/kg人源化9E4药物物质。48. 一种药物产品，其包括： (a)小瓶，所述小瓶包含粉末形式的以下物质： (i)约200mg抗体； (ii)约25mg脱水柠檬酸钠； (iii)约2 · 15mg柠檬酸一水合物； (iv)约435mg脱水海藻糖;和 (v)约lmg聚山梨醇酯20; (b) 用于重构所述抗体的说明；和 (c) 用于制备输注用重构抗体的说明， 其中： (i) 所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列，所述重 链具有包含SEQIDNO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸；以及 (ii) 所述重构说明需要初始用水重构到约5mL的体积。49. 一种纯化CH0细胞表达的人源化、镶饰或嵌合9E4抗体的方法，其包括： (a) 进行蛋白质-A固相色谱，其中所述9E4抗体相对于杂质优先与所述固相结合； (b) 进行阴离子交换固相色谱，其中所述9E4抗体相对于杂质优先从所述固相洗脱； (c) 进行阳离子交换固相色谱，其中所述9E4抗体相对于杂质优先与所述固相结合； (d) 进行病毒灭活和/或消除步骤； (c) 进行过滤步骤；以及 (d) 进行浓缩和再悬浮步骤。50. 根据权利要求49所述的方法，其中按顺序进行所述蛋白质-A、阴离子交换和阳离子 交换步骤。51. 根据权利要求50所述的方法，其中在步骤(a)和(b)之间进行病毒灭活步骤并且在 步骤(c)之后进行病毒消除步骤。52. 根据权利要求51所述的方法，其中在所述病毒灭活步骤和所述阴离子交换步骤之 间以及在所述阳离子交换步骤之后进行过滤步骤。53. -种纯化CH0细胞表达的人源化、镶饰或嵌合9E4抗体的方法，其包括： (a) 将表达所述9E4抗体的细胞的培养基加样到蛋白质A柱上，其中人源化9E4抗体与所 述柱结合，以及降低pH以洗脱包含所述9E4抗体的级分； (b) 在酸性条件下孵育来自步骤(a)的所述级分以将病毒灭活； (c) 对步骤(b)后的所述级分进行深层过滤以减少颗粒； (d) 对步骤(c)获得的含有所述9E4抗体的滤液进行阴离子交换固相色谱，其中所述级 分中的杂质与柱结合，并且所述9E4抗体从所述柱上洗脱； (e) 对来自步骤(d)的含有所述9E4抗体的级分进行阳离子交换固相色谱，其中所述9E4 抗体与柱结合并且通过升高盐浓度来洗脱； (f) 对来自步骤(e)的含有所述9E4抗体的级分进行病毒过滤；以及 (g)对来自步骤(f)的含有所述9E4抗体的级分进行超滤/渗滤以浓缩并且再悬浮所述 9E4抗体。54. 根据权利要求53所述的方法，其中阴离子交换柱是Q-琼脂糖快速流动树脂。55. 根据权利要求53所述的方法，其中在步骤(a)中将pH从6-8降低到2.5-3.556. 根据权利要求53所述的方法，其中在pH3.5下进行步骤(b)。57. 根据权利要求53所述的方法，其中步骤(f)的过滤器是0.1微米过滤器。58. 根据权利要求1所述的制剂，其中： (a)所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列，所述重 链具有包含SEQIDN0:31的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，并且所述抗体以约 40mg/mL的浓度存在； (b) 以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂； (c) 以约230mM的浓度存在的海藻糖； (d) 以约0.02%的浓度存在的聚山梨醇酯20;以及 (e) 约 6.0 的pH。59. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其通过添加水重构成水溶液，所述水溶液包含： (a) 抗体，所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列， 所述重链具有包含SEQIDNO: 31的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，并且所述抗 体以约40mg/mL的浓度存在； (b) 以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂； (c) 以约230mM的浓度存在的海藻糖； (d) 以约0.02%的浓度存在的聚山梨醇酯20;以及 (e) 约 6.0 的pH。60. 根据权利要求1-16中任一项所述的制剂，其特征在于摩尔渗透压浓度为约 295m0sm/kg至约 375m0sm/kg〇61. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其包含约40mg至约1OOOmg的所述抗体。62. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其包含： (a) 200mg的所述抗体； (b) 25mg柠檬酸钠二水合物； (c) 3.15mg梓檬酸一水合物； (d) 435mg海藻糖二水合物;和 (e)lmg聚山梨醇酯20。63. -种药物产品，其包括： (a) 小瓶，其包含粉末形式的以下物质： (i)约200mg抗体； (ii)约25mg脱水柠檬酸钠； (iii)约3.15mg梓檬酸一水合物； (iv)约435mg脱水海藻糖;和 (v)约lmg聚山梨醇酯20; (b) 用于重构所述抗体的说明；和 (c) 用于制备输注用重构抗体的说明， 其中： (i) 所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列，所述重 链具有包含SEQIDNO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸；以及 (ii) 所述重构说明需要初始用水重构到约5mL的体积。64. 根据权利要求1-17或60中任一项所述的制剂，其中小于约5%的所述抗体在所述制 剂中以聚集物存在。
【专利摘要】本发明提供了可用于预防或治疗共核蛋白病(包括帕金森氏病)的抗体制剂和方法。PTA-822120070226
【IPC分类】A61K39/39, C07K1/22, A61K45/06, C07K16/18, A61K39/00
【公开号】CN105492019
【申请号】CN201480047476
【发明人】P·加里代尔, A·兰格, M·格伦德曼
【申请人】普罗塞纳生物科学有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月3日
【公告号】CA2917097A1, EP3016677A2, US20150079074, WO2015001504A2, WO2015001504A3
【专利说明】抗体制剂和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年7月4日提交的美国临时专利申请号61/843,011和于2014年4 月15日提交的美国临时专利申请号61/979,886的权益，为了所有目的，二者均通过引用整 体并入本文。
[0003] 序列表的引用
[0004] 为"抗体制剂和方法'于2014年7月旧创建的文件446257SEQLIST.txt中所写的序 列表为37.9千字节。该文件中包含的信息通过引用并入本文。
[0005] 背景
[0006] 共核蛋白病（synucleinopathy)也被称为路易体疾病化抓），W多己胺能系统退 化、运动性改变(motor alteration)、认知障碍和形成路易体(LB)和/或路易神经突为特征 (McKeith等，Neurology(1996)47:1113-24)。共核蛋白病包括帕金森氏病(包括自发性帕金 森氏病）、弥散性路易体病化LBD)(也称为路易体痴呆化LB)、阿尔茨海默氏病的路易体变型 化BV)、组合的阿尔茨海默氏病和帕金森氏病、单纯性自主神经衰竭和多系统萎缩(MSA;例 如，橄揽体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性和化y-化ager综合征）。疾病前驱阶段（即，症状 前、亚临床、临床前或前运动时期）的多种非运动征象和症状被认为是共核蛋白病的预兆。 此类早期征象包括例如REM睡眠行为障碍(RBD)、失去嗅觉和便秘(Mahowald等,Neurology (2010)75:488-489)。路易体疾病依然是老年人群中运动障碍和认知退化的常见原因 (Galasko等，Arch.Neurol.(1994)51:888-95)。
[0007] a-突触核蛋白是包括e-和丫-突触核蛋白和核突触蛋白（synoretin)在内的蛋白 质大家族的一部分。Q-突触核蛋白在与突触相关的正常状态表达，并且被认为在神经可塑 性、学习和记忆中具有重要作用。多个研究发现Q-突触核蛋白在PD发病机理中的重要作用 有牵连。蛋白在病理状态下可W聚集形成不溶性纤维。例如，突触核蛋白在LB中聚集 (SpiIlantini等，Nature(1997)388:839-40;Takeda等 J.Pathol.(1998)152:367-72; WakabayasM等，Neurosci丄ett.(1997)239:45-8))。日-突触核蛋白基因中的突变与稀有家 族形式的帕金森氏病共分离（co-segregate KKruger等，Nature Gen.(1998) 18:106-8; Polyme ropouIos ,等，Science(1997)276 : 2045-7)。转基因小鼠（MasIiah等，Science (2000)287:1265-9)和果蛹(Feany等，化Uire(2000)404:394-8)中a突触核蛋白的过表达模 拟了路易体病的多个病理学方面。此外，已经发现突触核蛋白的可溶性低聚物可能是神经 毒性的（Con way KA等，Proc 化tl Acad Sci USA(2000)97:571-576;VollesMJ，Lansbu巧 PT, Jr Biochemist巧(2003)42:7871-7878)。物种和动物模型中a-突触核蛋白的积累W及 类似的形态和神经变化与人、小鼠和蛹类中一样多种多样，表明运种分子促使了路易体病 的发展。
[000引要求保护的发明的概述
[0009]本发明提供了可用于预防和治疗共核蛋白病的抗体制剂，本发明提供了药物制 剂，其包含：（a)抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰(veneered)或人源化形式或者 与9E4特异性竞争结合和/或针对a-突触核蛋白的氨基酸残基118-126内的表位的其片段， 其中抗体W约Img/mL至约IOOmg/mL的浓度存在；（b) W约IOmM至约30mM范围内的浓度存在 的巧樣酸盐缓冲剂；（C) W约21 OmM至约250mM范围内的浓度存在的海藻糖；W及(d) W按重 量计约0.005%至约0.05%范围内的浓度存在的聚山梨醇醋20;其中制剂的特征在于pH在 约5.5至约7内。一些制剂例如包含抗体，该抗体包括与SEQ ID NO: 11至少90%同一并且包 括沈Q ID NO: 11的S个Kabat CDR的成熟人源化重链可变区，W及与沈Q ID NO:4至少90% 同一并且包括沈Q ID N0:4的S个Kabat CDR的人源化轻链。
[0010] 在本发明的一些实施方案中，抗体W约5-1 OOmg/ml，例如5mg/mL至约15mg/mL范围 内（例如约1 Omg/mU的浓度存在，或者W约25-75mg/mL范围内（例如，约50mg/mU的浓度存 在。在本发明的一些制剂中，抗体W约36mg/mL至约44mg/mL范围内（例如，约40mg/mL)的浓 度存在。
[0011]在本发明的一些制剂中，巧樣酸盐缓冲剂W约20mM的浓度存在。
[001^ 在本发明的一些制剂中，海藻糖从约2301111的浓度存在。
[0013]如本文所述制备的，本发明的一些代表性制剂：（a)特征在于约335m0sm/kg的摩尔 渗透压浓度；（b)包含少于约10%的在制剂中W聚集物存在的抗体；（C)还包含填充剂；（d) 是无菌的；和/或(e)在冻融中稳定。如本文所述制备的，本发明的一些代表性制剂：（a)特征 在于约295m0sm/kg至约375m0sm/kg的摩尔渗透压浓度；（b)包含少于约10%或少于约5%的 在制剂中W聚集物存在的抗体;（C)还包含填充剂；（d)是无菌的;和/或(e)在冻融中稳定。
[0014]在本发明的一个方面中，制剂包括：（a)抗体，该抗体包括轻链和重链，轻链具有包 含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO: 31或32的氨基酸序列，具有或不 具有C-末端赖氨酸，其中该抗体W约40mg/mL的浓度存在；（b) W约20mM的浓度存在的巧樣 酸缓冲剂；（C) W约230mM的浓度存在的海藻糖；（d) W约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇醋 20;和(6)约6.0的抑。
[001引药物制剂可W包括：（a)抗体，其为抗体犯4(ATCC目录号PTA-8221)或者抗体犯4的 嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4特异性竞争结合的其片段，和/或针对a-突触核蛋白的 氨基酸残基118-126内的表位的嵌合、镶饰或人源化抗体，其中抗体W约Img/mL至约1 OOmg/ mL的浓度存在；（b)缓冲剂；（C)糖和/或聚醇;和(d)表面活性剂。在一些特定实施方案中，所 公开制剂的抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，重链具有包 含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸。
[0016]抗体制剂可W是冻干的。例如，代表性冻干制剂可W包括：（a)抗体9E4(ATCC目录 号PTA-8221)的人源化形式或者其抗原结合片段；（b)组氨酸、巧樣酸盐或班巧酸盐；（C)海 藻糖、薦糖或者薦糖和甘露醇的混合物；W及(d)聚山梨醇醋20。冻干制剂在重构时抑可W 在约6至约7之间，例如重构时抑6.0或6.5。冻干制剂通常包含约40mg至约1000 mg抗体。冻 干制剂通常包含浓度在按重量计约0.005 %至约0.05 %范围内的聚山梨醇醋20。在重构后， 冻干制剂产生水溶液。例如，重构的水溶液可W包括：（a) W约40mg/mL的浓度存在的抗体 犯4的人源化形式(例如，抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列， 重链具有包含SEQ ID N0:31或32中的任一个的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸）； (b) W约20mM的浓度存在的巧樣酸盐缓冲剂；（C) W约230mM的浓度存在的海藻糖；（d) W约 0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇醋20; W及(e)约6.0的pH。一种代表性冻干制剂包含约200mg 抗体。
[0017] 还提供了编码用于制备所公开制剂的抗体的核酸。例如，运样的核酸包括含编码 SEQ ID N0:29的抗体轻链的核巧酸序列的核酸，和含编码SEQ ID N0:32的抗体重链的核巧 酸序列的核酸。例如，SEQ ID NO: 17给出的核巧酸序列编码SEQ ID N0:29的人源化9E4轻链 可变区元件。又例如，SEQ ID N0:20给出的核巧酸序列编码SEQ ID N0:32的人源化犯4重链 可变区元件。
[0018] 为了产生抗体，可W将所公开的核酸单独地或者组合地（例如，编码人源化9E4轻 链的核酸和编码人源化94E重链的核酸的组合）引入到载体中。例如，载体可W包括含编码 SEQ ID NO: 15-17中的任一个的核巧酸序列的核酸，含SEQ ID NO: 18-20中的任一个的核巧 酸序列的核酸，或者它们的组合。本发明的代表性载体包括：（a)包含编码SEQ ID NO: 29给 出的人源化9E4轻链和SEQ ID NO: 31给出的人源化9E4重链的核酸序列的载体;和(b)包含 编码SEQ ID NO:29的氨基酸序列的核酸和编码SEQ ID NO:32的氨基酸序列的核酸的载体。
[0019] 还提供了宿主细胞(例如，OlO细胞），宿主细胞具有引入其基因组的一个或更多个 本文所公开核酸。例如，宿主细胞在其基因组中可W包括稳定整合的包含编码SEQ ID NO: 15-17中的任意一个的核巧酸序列的核酸;稳定整合的包含编码SEQ ID NO: 18-20中的任一 个的核巧酸序列的核酸;或者它们的组合。本发明的代表性宿主细胞包括：（a)包含编码SEQ ID N0:29给出的人源化犯4轻链和SEQ ID N0:31给出的人源化犯4重链的核酸序列的宿主 细胞;和(b)包含具有SEQ ID N0:29的核巧酸序列的核酸和具有SEQ ID N0:32的核巧酸序 列的核酸的宿主细胞。
[0020] 本发明还提供了制备药物制剂的方法。在本发明的一个方面，此类方法包括：（a) 培养哺乳动物细胞，哺乳动物细胞具有稳定并入其基因组的编码小鼠、嵌合、镶饰或人源化 9E4抗体的轻链和重链的核酸，W使得细胞将抗体分泌到细胞培养基中，W及从细胞培养基 中纯化抗体；W及(b)制备制剂，该制剂包括：（i)抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶 饰或人源化形式或者与9E4特异性竞争结合的其片段，其中抗体W约lOmg/mL至约50mg/mL 的浓度存在；（i i ) W约20mM至约30mM范围内的浓度存在的巧樣酸盐缓冲剂；（i ii ) W约 210mM至约250mM范围内的浓度存在的海藻糖；W及（iv) W按重量计约0.005%至约0.05% 范围内的浓度存在的聚山梨醇醋20;其中该制剂的特征在于pH在约5.5至约6.5的范围内。 可用于此目的的哺乳动物细胞包括：（a)具有稳定并入其基因组的编码SEQ ID N0:29给出 的人源化9E4轻链和SEQ ID N0:31给出的人源化9E4重链的核酸序列的宿主细胞;和(b)具 有稳定并入其基因组的具有SEQ ID NO: 29的核巧酸序列的核酸和具有SEQ ID NO: 32的核 巧酸序列的核酸的宿主细胞。在本发明的一些方面，所公开的制备药物制剂的方法包括评 估制剂中抗体的至少一种性质如物理稳定、化学稳定性和/或生物学活性的步骤。
[0021] 还提供了治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病或者具有患共核蛋白病的风险的 人患者的方法，该方法包括向患者施用有效剂量的本发明制剂。一些适用于治疗的患者可 能患有帕金森氏病。
[0022] 所公开的治疗性和预防性治疗方法包括联合疗法（即，施用所公开抗体制剂和一 种或更多种额外的药物物质），因此引起了协同效果。两种药物物质同时施用或者W任何顺 序按顺序施用。例如，可W在施用第二药物物质之前、与第二药物物质同时或者在施用第二 药物物质之后施用本发明药剂。本发明制剂可W与例如左旋多己、benzaseride、卡比多己、 多己胺激动剂、COffl'抑制剂、MAO抑制剂、金刚烧胺或抗胆碱能剂同时或相继施用。
[0023] 根据所公开的治疗性或预防性治疗方法，本发明制剂可W W多剂量施用，例如，W 约每日一次至约每年一次范围内的频率，例如W约每隔一周一次至约每S周一次范围内的 频率，或者例如每月一次或者每四周一次的频率。在一个方面，本发明的抗体制剂W约 0.3mg/kg至约30mg/kg药物物质的剂量静脉内施用。示例性给药方案包括约0.3mg/kg、约 1 .Omg/kg、约3.0mg/kg、约lOmg/kg和约30mg/kg的人源化9E4药物作为单剂量或者每四周一 次静脉内施用。
[0024] 例如，治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病（例如，帕金森氏病）或者具有患共核 蛋白病的风险的人患者的方法可W包括向患者施用有效剂量的药物制剂，该药物制剂包 括：（a)抗体，该抗体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID N0:29的氨基酸序列，重链具有 包含SEQ ID N0:32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，其中抗体W约40mg/mL的浓 度存在；（b) W约20mM的浓度存在的巧樣酸缓冲剂；（C) W约230mM的浓度存在的海藻糖；（d) W约0.2g/L的浓度存在的聚山梨醇醋20;和(e)约6.0的抑。在此类方法中，剂量通常为W约 每周一次至约每28天一次或者约每季度一次的频率静脉内或皮下施用约0.3mg/kg至约 30mg/kg抗体(例如，约0.5mg/kg至约8mg/kg，或者约8mg/kg至约30mg/kg)。
[0025] 本发明还提供了药物产品，该药物产品包括：（a)小瓶，该小瓶包含约200mg粉末形 式抗体；（b)用于重构抗体的说明；和(C)用于制备输注用重构抗体的说明，其中例如，（i)抗 体包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸；W及（ii)重构说明需要利用注射用水重构 到约5mL的可提取体积。
[0026] 附图简述
[0027] 图1是人源化9E4抗体的DSC溫谱图，示出了与升高或降低含1.5mg/ml人源化9E4抗 体(形式H3L3)的溶液的溫度相关的能量流(卡路里/°C)。抗体溶液W插入框内示出的顺序 按顺序加热和冷却。对线进行编号W指示与插入框中示出的5个溫度转变中的每一个相关 的线。
[0028] 图2是描绘了作为抑的函数的人源化9E4抗体(形式H3L3)的转变溫度的图。不同符 号示出了通过RALS、IF和DSC确定的转变溫度。在每个抑下观察两个或S个DSC转变溫度，每 个用不同符号表示。
[0029] 图3是描绘了不具有储存期的冻干并且重构的制剂Fl-F4(如表10中所述）的显微 可见的颗粒计数（> 2.0mm、> 10.0 mm和> 25. Omm)的柱状图。
[0030] 图4是描述了冻干、在40°C下储存1个月并且重构后的Fl-F4(如表10中所述）的显 微可见的颗粒计数（> 2.0mm、MO. Omm和> 25. Omm)的柱状图。
[0031] 图5是描述了冻干、在40°C下储存2个月并且重构后的Fl-F4(如表10中所述）的显 微可见的颗粒计数（> 2.0mm、MO. Omm和> 25. Omm)的柱状图。
[0032] 图6是描述了冻干、在40°C下储存3个月并且重构后的Fl-F4(如表10中所述）的显 微可见的颗粒计数（> 2.0mm、MO. Omm和> 25. Omm)的柱状图。
[0033] 图7是描述了作为制剂(F1-F4,如表10中所述)和在40°C下W冻干形式储存时间的 函数的单体人源化9E4抗体(形式H3L3)的损失。
[0034] 序列简述
[0035] 沈Q ID NO: 1是m犯4化可变区的氨基酸序列。
[0036] SEQ ID N0:2是人化受体序列的可变区的氨基酸序列(NCBI目录号AAY33350)。
[0037] 沈Q ID NO:3是化犯4VLvl可变区的氨基酸序列。
[0038] 沈Q ID NO:4是化犯4VLv2可变区的氨基酸序列。
[0039] 沈Q ID NO:5是化犯4VLv3可变区的氨基酸序列。
[0040] 沈Q ID NO:6是m犯4VH可变区的氨基酸序列。
[0041 ] 沈Q ID N0:7是人VH受体序列可变区的氨基酸序列(NCBI目录号AA巧0998)。
[0042] 沈Q ID NO:8是化犯4VHvl可变区的氨基酸序列。
[0043] 沈Q ID NO:9是化犯4VHv2可变区的氨基酸序列。
[0044] 沈Q ID NO: 10是化犯4VHv3可变区的氨基酸序列。
[0045] 沈Q ID NO: 11是化犯4VHv4可变区的氨基酸序列。
[0046] SEQ ID NO: 12是野生型人a-突触核蛋白的氨基酸序列。
[0047] SEQ ID NO: 13是人源化9E4轻链恒定区的氨基酸序列，具有N-末端精氨酸。
[004引 SEQ ID NO: 14是人源化犯4重链恒定区的氨基酸序列。
[0049] 沈Q ID NO: 15是编码化犯4VLvl可变区的核巧酸序列。
[(K)加]沈Q ID NO: 16是编码化犯4VLv2可变区的核巧酸序列。
[0化1] 沈Q ID NO: 17是编码化犯4VLv3可变区的核巧酸序列。
[0化2] 沈Q ID NO: 18是编码化犯4VHvl可变区的核巧酸序列。
[0化3] 沈Q ID NO: 19是编码化犯4VHv2可变区的核巧酸序列。
[0化4] 沈Q ID NO:20是编码化犯4VHv3可变区的核巧酸序列。
[0化日]沈Q ID N0:21是编码化犯4VHv4可变区的核巧酸序列。
[0化6] 沈Q ID NO:22是化犯4化信号肤的氨基酸序列。
[0化7] 沈Q ID NO:23是编码化犯4化信号肤的核巧酸序列。
[0化引沈Q ID NO:24是化犯4VH信号肤的氨基酸序列。
[0化9] 沈Q ID NO:25是编码化犯4VH信号肤的核巧酸序列。
[0060] 沈Q ID NO:26是化犯4VL共有氨基酸序列。
[0061 ] 沈Q ID NO:27是化犯4VH共有氨基酸序列。
[0062] SEQ ID NO:28是人源化犯4轻链恒定区的氨基酸序列，不具有N-末端精氨酸。
[0063] SEQ ID N0:29是人源化9E4轻链的氨基酸序列，其包括(a)可变区（形式3)和(b)具 有N-末端精氨酸的恒定区。
[0064] SEQ ID N0:30是人源化9E4轻链的氨基酸序列，其包括(a)可变区（形式3)和(b)不 具有N-末端精氨酸的恒定区。
[0065] SEQ ID N0:31是人源化9E4重链的氨基酸序列，其包括(a)可变区（形式3)和(b)恒 定区。
[0066] SEQ ID NO: 32是人源化9E4重链的氨基酸序列，其包括(a)可变区（形式3)和（b) BIP形式重链Glm3同种型恒定区。
[0067] SEQ ID NO:33是BIP形式重链GlmS同种型恒定区的氨基酸序列。
[006引 定义
[0069]术语"抗体"包括完整抗体及其结合片段。通常，片段与得到它们的完整抗体竞争 同祀标的特异性结合。片段包括单独重链、单独轻链、Fab、Fab'、F(ab'）2、F(ab)c、Fv、单链 抗体和单结构域抗体。术语"抗体"还包括双特异性抗体。双特异性或双功能抗体是具有两 个不同的重/轻链对和两个不同结合位点的人造杂交抗体（参见，例如Songsi Vi Iai和 Lachmann,Cl in.Exp.Immunol.,79:315-321(1990);Kostelny等,J.Immunol148:1547-53 (1992))。
[0070] 基础抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两个相同多肤链对，每对具 有一个"轻"链(约25kDa)和一个"重链"（约50-70W)a)。每个链的氨基末端部分包括主要负 责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。当最初表达时，可变区通常与可切割 信号肤连接。不具有信号肤的可变区有时候称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区 意指不具有轻链信号肤的轻链可变区。每个链的簇基末端部分限定了主要负责效应子功能 的恒定区。恒定区可W包括CHl区、较链区、C肥区和C册区中任一个或全部。
[0071] 轻链被分类为K或A。重链被分类为丫、y、a、S或e，并且分别定义了抗体同种型IgG、 IgM、IgA、I曲和IgE。在轻链和重链内，可变区 和恒定区通过约12或更多个氨基酸的区连 接，重链还包括约10或更多个氨基酸的"D"区（一般地参见，Fundamental Immunology (Paul，W.编辑，第2版.Raven Press，N.Y. ,1989)，第7章）（为了所有目的，其通过引用整体 并入本文）。
[0072] 每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合 位点。除双功能或双特异性抗体外，两个结合位点相同。所有链表现出相同的一般结构:通 过=个超变区连接的相对保守的框架区(FR),也称为互补决定区或CDR。来自每一对的两个 链的CDR通过框架区比对，能够与特异性表位结合。从N-末端到C-末端，重链和轻链均包括 FR 1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4区。每个区域氨基酸的分配根据W下文献的定义： Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Heal化，Bethesda,MD，1987and 1991)，或Chothia化esk，J.Mol. Biol.196:901-917(1987); ChotMa等，化Uire 342:878-883( 1989) eKabat还提供了广泛使用编号惯例化abat编号）， 其中不同重链之间或不同轻链之间的相应残基分配相同编号。
[0073] 百分比序列同一性通过Kabat编号惯例最大比对的抗体序列确定。在比对后，如果 主题抗体区（例如，重链或轻链的整个成熟可变区）与参考抗体的相同区比较，则主题抗体 区域和参考抗体区域之间的百分比序列同一性是由主题抗体区域和参考抗体区域二者中 的相同氨基酸占据的位置的数目除W两个区域比对位置的总数(缺口不计数)乘WlOOW转 换成百分比。
[0074] 为了将氨基酸置换分类为保守的或非保守的，将氨基酸如下分组：组1(疏水侧 链）：正亮氨酸、1日*、41日、￥日1、1^日11、11日；组11(中性亲水侧链:〔73、5日'、化'；组111(酸性侧 链）：Asp、Glu;组1八碱性侧链）:4311、6111、化3、1^73、4'旨;组￥(影响链方向的残基）:617、口'〇; 和组VI(芳香族侧链）：T巧、Tyr、化e。保守置换设及同一类氨基酸之间的置换。
[0075] 非保守置换构成了运些类别中一类的成员与另一类的成员的交换。
[0076] 本发明抗体通常W至少106、107、108、109或1〇1>-1的亲和常数^其指定祀标结合。 运样的结合是特异性结合，因为可检测到更高的量级，并且可W与至少一种不相干祀标的 非特异性结合区分开。特异性结合可W是由于在特定官能团或特定空间配合(例如，锁和钥 型)之间形成了键的结果，而非特异性结合通常是由于范德华力的结果。但是特异性结合并 未必然意味着单克隆抗体结合一种并且仅一种祀标。
[0077] 术语"症状"是指由对象感知到的疾病的主观证据，例如步态改变、"征象"是指由 医生观察的疾病的客观证据。
[0078] 如果对象具有至少一种已知的风险因子(例如，遗传的、生物化学的、家族史的或 环境暴露），则处于增加的疾病风险之下，与不具有风险因子的个体相比，风险因子使具有 该风险因子的个体处于统计学上显著更大的形成疾病的风险之下。统计学上显著意指P < 0.05〇
[0079] 除非从上下文另外明显地，否则术语"约"包括设定值的平均值的标准偏差和/或 设定值的+/-5 %之内的值，无论是哪一个更大。
[0080] 术语巧E4抗体'是指其中每个CDR基本上未犯4的CDR的任何抗体，因此包括小鼠、 嵌合、镶饰和人源化9E4。
[0081] 除非从上下文另外明显地，否则对范围的参考包括范围内的任何整数。
[0082] 详述
[0083] I.概括
[0084] 9E4是与人a-突触核蛋白的氨基酸残基118-126内的表位结合的抗体。抗体的人源 化形成描述在W0/2013/063516中，为了所有目的，其通过引用整体并入本文。本申请提供并 入了 9E4的嵌合、镶饰或人源化形式(有时候也称为9E4抗体）的液体或冻干制剂。制剂被设 计为具有赋予抗体W稳定性的组分的组合，如下文将详细描述的。
[00化]II.勒!分子
[0086] 天然人野生型a-突触核蛋白是具有W下氨基酸序列的140个氨基酸的肤：
[0087] MDVFMKGLSK AKEGVVAAAE KTKQGVAEAA GKTKEGVLYV GSKTKEGVVH
[0088] GVATVAEKTK EQVTNVGGAV VTGVTAVAQK TVEGAGSIAA ATGFVKKDQL
[0089] GK肥EGAP犯 GILEDMPVDP DNEAYEMP沈 EGYQDYEPEA (沈Q ID N0:12)
[0090] (Ueda等，Proc.化tl .Acad. Sci .USA( 1993)90:11282-6) ;GenBank目录号：P37840。 该蛋白质具有S个公认的结构域:覆盖氨基酸1-61的KTKE重复结构域;氨基酸60-95的NAC (非淀粉样蛋白组成分)结构域;和约氨基酸98至140的C-末端酸性结构域。
[0091] 除非从上下文另外明显地，否则提到a-突触核蛋白或其片段包括上文指出的天然 人野生型氨基酸序列及其人等位基因变体，特别是与路易体疾病相关的那些（例如，变体 ￡461(、430口和4531'，第一个字母指示569 10^:12中的氨基酸，数字指示569 10^:12中的 密码子位置，第二个字母指示等位基因变体中的氨基酸）。此类变体可W任选地单独存在或 者与本发明下文所述的任何方面任意组合。增强O-突触核蛋白聚集的诱发突变E8%、A90V、 A76T也可W单独存在或者与彼此和/或与人等位基因变体E46K、A30P和A53T组合。
[0092] III.路易体疾病
[0093] 路易体疾病化抓）W多己胺能系统退化、运动性改变、认知障碍和形成路易体化B) 为特征(McKeith等,Neurology(1996)47:1113-24)。路易体是在神经细胞中发现的球形蛋 白质沉积物。其在脑中的存在破坏脑的正常功能，妨碍化学信使(包括乙酷胆碱和多己胺） 的作用。路易体疾病包括帕金森氏病(包括自发性帕金森氏病）、弥散性路易体病(DLBD)(也 称为路易体痴呆，DLB)、阿兹海默病的路易体变型化BV)、组合的阿兹海默病和帕金森氏病 和多系统萎缩(MSA;例如，橄揽体脑桥小脑萎缩、纹状体黑质变性和化y-化ager综合征）。 化BD具有阿兹海默病和帕金森氏病二者的症状。DL抓不同于帕金森氏病主要在于路易体的 位置。在DLBD中，路易体主要在皮质中形成。在帕金森氏病中，其主要在黑质中形成。其他路 易体疾病包括单纯性自主神经衰竭、路易体吞咽困难、偶发性L抓和遗传性LBD(例如，a-突 触核蛋白基因、PARK3和PARK4的突变）。
[0094] IV.人源化犯4抗体
[00巧]A.结合特异性和功能性质
[0096] 本发明的人源化抗体与人a突触核蛋白特异性结合。一些人源化抗体的亲和力 (即，Ka)优选地在小鼠抗体9E4的亲和力的5或2倍之内。一些人源化抗体的亲和力与小鼠 9E4抗体相同（在实验误差内）或大于后者。优选的人源化抗体与小鼠抗体9E4结合于相同表 位或者与小鼠抗体9E4竞争同人a突触核蛋白的结合。
[0097] 在一些方面，人源化9E4形成双特异性抗体的一个臂，双特异性抗体的另一个臂是 与血脑屏障上表达的受体(例如，膜岛素受体、膜岛素样生长因子(IGF)受体、瘦素受体或脂 蛋白受体或优选地运铁蛋白受体）结合的抗体（Friden等，PNAS 88:4771-4775,1991; 化iden等，Science 259:373-377，1993)。此类双特异性抗体可W通过受体介导的转胞吞作 用转移穿过血脑屏障。可W通过改造双特异性抗体W降低其与血脑屏障受体的亲和力来进 一步增强双特异性受体的脑摄取。降低的受体亲和力导致脑中更广的分布（参见，例如 Atwal等.Sci . Trans.Med. 3,84ra43,2011;化等Sci . Trans.Med. 3,84ra44,2011)。
[0098] 示例性双特异性抗体还可W是例如：（1)双可变域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和 重链包括两个通过短肤键串联的可变域(Wu等，Generation and Qiaracterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig?)Molecule,于:Antibody Engineering, Springer Berlin Heide化e;rg(2010)); (2)Tandab，其为两个单链抗体的融合，得到对每种 革己抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体；（3)f Iexibody，其为scFv与双体抗体的组 合，得到多价分子；（4)基于"蛋白激酶A"中的"二聚化和对接结构域(docking domain)"的 所谓的"对接锁定(dock and lock)"分子，其当应用于化b时，可W产生由与一个不同的化b 片段连接的两个相同的Fab片段组成的S价双特异性结合蛋白；（5)所谓的蜗形分子 (Sco巧ion molecule)，其包括与人化区域的两端融合的两个scFv。可用于制备双特异性抗 体的平台的实例包括但不限于BiTE(Micromet) ,DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-s1:a;r)、Fc-改造的IgGl(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。
[0099] B.人源化抗体
[0100] 人源化抗体是一种基因工程化抗体，其中来自非人"供体"抗体的CDR被嫁接到人 。受体"抗体序列中（参见，例如，Queen等，US5，530，101 和5，585，089; Winter等，US 5，225， 539，Cader，US 6,407,213，Adair，US 5,859,205 6,881，557，Foote，US 6,881，557)。受体 抗体序列可W是例如成熟人抗体可变区序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列 (例如，Kabat, 1991的轻链和重链可变区共有序列，同上)或者种系可变区序列。重链的优选 受体序列是NCBI目录号AA巧0998(GI :1791009)的人成熟重链可变区或来源于种系IGHV3-7'01或IGHV3-7'02的其他成熟重链可变区（克隆名V3-7或VH3-ll)(Glas等，ClinExp Immunol. 107:372-80,1997)，或者并入运些种系序列中的一个中的成熟重链可变区序列。 对于轻链，优选的受体序列是NCBI目录号AAY33350(GI :63102889)的轻链成熟可变区或来 源于种系IGKV1D-39或IGKV1-39的其他成熟轻链序列（克隆名02或012KKramer等，Eur J Immunol. 35:2131-45,2005)，或者并入运些种系序列中的一个中的成熟轻链可变区序列。 因此，本发明的人源化抗体包括运样的抗体，其具有Kabat定义的来自小鼠9E4抗体(供体抗 体)的=个轻链和=个重链CDR，W及完全地或基本上来自人抗体序列的成熟可变区框架序 列和恒定区（如果存在的话）。同样地，人源化重链包括运样的重链，其具有Kabat定义的来 自小鼠9E4抗体的重链的S个重链CDR，W及完全地或基本上来自人抗体重链序列的成熟重 链可变区序列和重链恒定区序列（如果存在的话）。同样地，人源化轻链包括运样的轻链，其 具有Kabat定义的来自小鼠9E4抗体的轻链的S个轻链CDR，W及完全地或基本上来自人抗 体轻链序列的成熟轻链可变区序列和轻链恒定区序列(如果存在的话）。当至少85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%的Kabat定义的相应残基相同时，抗体链的成熟可变区 框架序列或抗体链的恒定区序列分别基本上来自人成熟可变区框架序列或者人恒定区序 列。
[0101] 根据其对CD財勾象和/或抗原结合的可能影响，可W选择人成熟可变区框架序列的 某些氨基酸用于置换。通过建立模型、检查特定位置的氨基酸的特征或者对特定氨基酸的 置换或突变的影响进行经验观察，来研究此类可能的影响。
[0102] 例如，当小鼠成熟可变区框架残基和选择的人成熟可变区框架残基之间的氨基酸 不同时，在合理预测到小鼠氨基酸如下时，可W将人框架氨基酸替换成来自小鼠抗体的等 同框架氨基酸：
[0103] (1)与抗原直接非公价结合，
[0104] (2)与CDR 区相邻，
[0105] (3)与CDR区其他相互作用（例如，在CDR区的约6 A之内），
[0106] (4)介导重链和轻链之间的相互作用。
[0107] 本发明提供了包括小鼠9E4抗体的人源化形式的制剂，抗体包括S个示例的人源 化轻链成熟可变区化u9E4VLvl-v3;SEQ ID N0:3-5)和四个示例的人源化重链成熟可变区 (Hu9E4VHvl-v4;SEQIDN0:8-ll)。SEQIDN0:4包括小鼠9E4轻链的S个KabatCDR和 AAY33350的成熟可变区框架。SEQ ID NO.3和5包括表2中所示回复突变。SEQ ID NO: 11包括 小鼠犯4轻链的S个Kabat CDR和AA巧0998的成熟可变区框架。沈Q ID NO:8-10包括表3中 所示回复突变。
[0108] 本发明提供了包含本文所公开的多种人源化9E4抗体的制剂，其中人源化重链成 熟可变区表现出与SEQ ID N0:8-ll至少90%、95%或99%的同一性，人源化轻链成熟可变 区表现出与沈Q ID N0:3-5至少90%、95%或99%的同一性，但是其中指定SEQ ID NO:的任 何变化发生在成熟可变区框架，而非Kabat CDR。在一些此类抗体中，位置L36被Y或F占据， 和/或位置L83被F或L占据，和/或位置H73被嗯郎占据，和/或位置H93被A或化据(运里W及 本申请别处的所有位置通过Kabat编号）。在一些此类抗体中，保留了化9E4VLvl-v3和 化9E4VHvl-v4中的一些或所有回复突变。换言之，重链位置H73和H93之一或其二者分别被D 和A占据。同样地，在一些抗体中，轻链位置L36和L83之一或其二者分别被F和L占据。在一些 抗体中，位置H73、朋3、L36和L83中的1、2、3或全部4个分别被D、A、F和L占据。在一些抗体中， 重链成熟可变区框架中的〇、1或2个位置相对于SEQ ID NO: 11而改变，轻链成熟可变区框架 中的0、1或2个位置相对于SEQ ID N0:4而改变。
[0109] 本发明提供了制剂，其中一些抗体包括含SEQ ID NO: 11的S个Kabat CDR的人源 化重链和含SEQ ID N0:4的S个Kabat CDR的人源化轻链，前提是位置L36化abat编号）被F 或Y占据和/或L83化abat编号）被L或F占据和/或位置H73化abat编号)被D或N占据和/或位 置H93化abat编号)被S或A占据。在一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占据。在一些 此类抗体中，位置L36化abat编号被F占据并且位置L83化abat编号)被L占据。在一些此类抗 体中，位置L36化abat编号)被F占据并且位置H73化abat编号)被D占据。在一些此类抗体中， 位置L36化abat编号）被F占据并且位置朋3化abat编号）被S。在一些此类抗体中，位置L36 化abat编号）被F占据并且位置H93化abat编号）被A占据。在一些此类抗体中，位置L36 化abat编号)被F占据，位置L83化abat编号)被L占据，并且位置H73 (Kabat编号)被D占据。在 一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占据，位置L83化abat编号）被L占据，并且位置 H93化abat编号）被S占据。在一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占据，位置L83 化abat编号）被L占据，并且位置H93化abat编号被A占据。在一些此类抗体中，位置L36 化abat编号)被F占据，位置H73化abat编号)被D占据，并且位置H93化abat编号)被S占据。在 一些此类抗体中，位置L36化abat编号)被F占据，位置L83被F占据，位置H73化abat编号)被D 占据，并且位置朋3化abat编号）被化据。在一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占 据，位置H73化abat编号）被占据D，并且位置朋3化abat编号)被A占据。在一些此类抗体中， 位置L36化abat编号）被F占据，位置L83化abat编号）被L占据，位置H73化abat编号）被D占 据，并且位置朋3化abat编号)被S占据。在一些此类抗体中，位置L36化abat编号）被F占据， 位置L83化abat编号）被L占据，位置H73化abat编号）被D占据，并且位置H93 (Kabat编号）被A 占据。在一些此类抗体中，位置L83(Kabat编号）被L占据。在一些此类抗体中，位置L83 化abat编号）被L占据并且位置H73化abat编号）被D占据。在一些此类抗体中，位置L83 化abat编号）被L占据并且位置H93化abat编号）被S占据。在一些此类抗体中，位置L83 化abat编号）被占据L并且位置H93化abat编号）被A占据。在一些此类抗体中，位置L83 化abat编号）被L占据，位置H73化abat编号）被D占据，并且位置H93 (Kabat编号）被化据。在 一些此类抗体中，位置L83化abat编号）被L占据，位置H73化abat编号）被D占据，并且位置 H93化abat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置H73化abat编号)被D占据。在一些此类抗 体中，位置H73化abat编号)被D占据并且位置H93化abat编号)被化据。在一些此类抗体中， 位置H73化abat编号)被D占据并且位置朋3化abat编号)被A占据。在一些此类抗体中，位置 H93化abat编号)被化据。在一些此类抗体中，位置朋3化abat编号)被A占据。在一些此类抗 体中，位置L36被Y占据，位置L83被F占据，位置H73被N占据，并且位置朋3被化据。表1中列 出了一些在位置L36、L83、H73和H93及其组合处具有期望残基的示例性抗体。
[0110] 表1:在位置L36、L83、H73和H93化abat编号)处具有期望残基的示例性抗体
[0112] 表2:Vh回复突变体
[0115] 表3:化回复突变体
[0117] 在一些抗体中，重链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。在一些 抗体中，轻链成熟可变区具有命名为SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:3的氨基酸序列。在一些此 类抗体中，重链成熟可变区具有命名为SEQ ID N0:10的氨基酸序列，并且轻链成熟可变区 具有命名为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些此类抗体中，重链成熟可变 区具有命名为SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，并且轻链成熟可变区具有命名为SEQ ID NO: 5 的氨基酸序列。
[0118] 可W在成熟可变区框架中，例如，在不与CDR接触的残基中进行其他氨基酸置换。 通常在变体人源化序列中进行的替换相对于被替换氨基酸是保守的。在一些抗体中，相对 于化9E4VLvl-v3和化犯4VHvl-v4的替换(无论是否为保守的）对于所得抗体的结合亲和力 或效力（相对于化9E4VLvl-v3和化9E4VHvl-v4)没有显著影响，即，其能够与人a突触核蛋白 结合。
[0119] 变体通常由于少量(例如，通常为轻链或重链成熟可变区框架或者其二者中的不 超过1、2、3、5或10个)替换、缺失或插入而不同于化犯4VLvl-v3和化犯4VHvl-v4的重链和轻 链成熟可变区序列。
[0120] 下文所述的制剂可W包含上文、或者在本申请的序列表或别处描述的任何人源化 犯4链，其轻链和重链任意组合，形成与人a-突触核蛋白特异性结合的人源化9E4抗体。
[0121] C.嵌合抗体和镶饰抗体
[0122] 本发明还提供了非人抗体(特别是9E4)的嵌合形式和镶饰形式。
[0123] 嵌合抗体是运样的抗体，其中非人抗体(例如，小鼠）的轻链和重链成熟可变区与 不同物种的抗体的轻链和重链恒定区组合。通常，轻链和重链恒定区是人源的，但是恒定区 根据需要可W来源于不同的非人物种，例如大鼠（例如，W有利于在适当的动物模型中测试 非人抗体）。此类抗体基本上或者完全保留了由可变区提供的非人(例如，小鼠）抗体的结合 特异性，并且为约=分之二的人(或不同非人物种)序列。
[0124]镶饰抗体是人源化抗体的一种类型，其保留了非人抗体的一些并且通常全部的 CDR和一些非人可变区框架残基，但是将 可能有助于B-或T-细胞表位的其他可变区框架残 基(例如，暴露残基(Padlan，Mo 1. Immuno 1.28:489，1991))替换成了来自人抗体序列的相应 位置的残基。得到运样的抗体，其中CDR完全或者基本上来自非人抗体，并且非人抗体的可 变区框架被通过置换变得更像人的。本发明包括9E4的镶饰形式。
[01巧]D.恒定区的选择
[0126] 嵌合、镶饰或人源化抗体的重链和轻链可变区可W与人恒定区的至少一部分连 接。恒定区的选择部分地取决于是否期望抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细 胞吞隧作用和/或不提依赖性细胞毒性。例如，人同位素 IgGl和IgG3具有补体依赖性细胞毒 性，而人同种型IgG2和IgG4不具有。人IgGl和IgG3还诱导比人IgG2和IgG4更强的细胞介导 的效应子功能。轻链恒定区可W是A或K。示例性人轻链K恒定区具有SEQ ID NO: 13的氨基酸 序列。一些此类轻链K恒定区可W由核酸序列编码。SEQ ID NO: 13的N-末端精氨酸可W省 略，在运种情况下，轻链K恒定区具有EQ ID N0:28的氨基酸序列。一些此类轻链K恒定区可 W由核酸序列编码。示例性人IgGl重链恒定区具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列（具有或不 具有C-末端赖氨酸）或者SEQ ID N0:31的重链恒定区元件。一些此类重链恒定区可W有核 酸序列编码。抗体可W表达为包含两个重链和两个轻链的四聚体，表达为独立地重链、轻 链，表达为化b Jab '、F(ab '）2和Fv，或者表达为单链抗体，其中重链和轻链成熟可变区间隔 区连接。
[0127] 人恒定区在不同个体之间表现出同种异型变异和同族同种异型变异，即，不同个 体的恒定区可能在一个或更多个多态性位置不同。同族同种异型和同种异型的区别在于识 别同族同种异型的血清与一个或更多个其他同种型的的非多态性区域结合。因此，例如，另 一个重链恒定区是IgGlGlmS同种型并且具有编码SEQ ID NO:32的恒定区的氨基酸序列。另 一个重链恒定区具有SEQ ID N0:33的氨基酸序列。另一个重链恒定区具有编码SEQ ID NO: 32的恒定区的氨基酸序列，只是其缺少C-末端赖氨酸。另一个重链恒定区具有SEQ ID NO: 33的氨基酸序列，只是其缺少C-末端赖氨酸。
[0128] 在一部分或全部分子中，轻链和/或重链的氨基酸或簇基端的一个或多个氨基酸 (例如，重链的C-末端赖氨酸)可W失去和/或衍生化。可W在恒定区进行置换W降低或增加 效应子功能，例如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见，例如，Winter等，美国专利号5，624， 821; Tso等，美国专利号5，834，597;和Lazar等，Proc.化tl. Acad. Sci . USA103:4005，2006)， 火焰延长人中的半衰期（参见，例如化nton等J. Biol.化em. 279:6213,2004)。示例性置换 包括250位的Gln和/或428位的Leu(本段中对于恒定区使用抓编号）W增加抗体的半衰期。 位置234、235、236和/或237中的任意或者全部位置处的置换降低对于化丫受体(特别是化 丫 RI受体)的亲和力（参见，例如US 6,624,821)。一些抗体在人1旨61的234、235和237位处具 有丙氨酸置换，W降低效应子功能任选地，将人IgG2的234、236和237位置换成丙氨酸，将 235位置换成谷氨酷胺(参见，例如US 5，624，821)。
[0129] E.重组抗体的表达
[0130] 抗体可W通过重组表达产生。可W对编码抗体的核酸进行密码子优化W用于在期 望细胞类型（例如，CHO或Sp2/0)中表达。重组核酸构建体通常包括与抗体链的编码序列可 操作地连接的表达控制序列，包括天然相关的或异源启动子区。表达控制序列可W是能够 转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。一旦载体导入了合适的宿主细胞， 将宿主保持在适于高水平表达核巧酸序列的条件下，并且收集和纯化交叉反应抗体。编码 抗体的一个或多个载体还可W包含选择基因，例如二氨叶酸还原酶，W允许放大编码抗体 链的核酸的拷贝数。
[0131] 大肠杆菌是对于表达抗体(特别是抗体片段)特别有用的原核宿主。微生物如酵母 也可用于表达。酵母属是优选的酵母宿主，合适的载体根据需要具有表达控制序列、复制起 点、终止序列等。典型的启动子包括3-憐酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子 包括来自醇脱氨酶、异细胞色素 CW及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。
[0132] 哺乳动物细胞可用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核巧酸片段。参见， Winnacker,From Genes to Clones, (VCH Publishers,NY, 1987)。本领域中已经开发了若 干能够分泌完整异源蛋白质的合适的宿主细胞系，包括C册细胞系、各种COS细胞系、HeLa细 胞、HEK293细胞、L细胞和非抗体产生骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0。可能有利的是使用非人细 胞。用于运些细胞的表达载体可W包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强地 (Queen等，Immunol. Rev. 89:49( 1986) )，W及必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、 RNA剪接位点、多腺巧酸化位点和转录终止子序列。合适的表达控制序列是来源于内源基 因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等，J. Immunol. 148:1149 (1992)。
[0133] 在将编码抗体重链和轻链的载体导入到细胞培养物中后，可W在无血清培养基中 筛选细胞群的生长生产率和产物质量。然后对最高生产细胞群进行FACS基单细胞克隆W产 生单克隆系。高于50pg/细胞/天或I(K)Pg/细胞/天(其相当于大于7.5g/L培养物的滴度）的 单位生产率可能是有利的。可W测试单细胞克隆产生的抗体的浊度、过滤特性、PAGE、IEF、 UV扫描、HP-SEC、碳水化合物-寡糖作图、质谱和结合测定，例如化ISA或Biacore。可W将选 择的克隆保存在多个小瓶中并且冰冻储存用于随后使用。
[0134] -旦表达，可W根据本领域的标准方法对抗体纯化，包括蛋白A捕获、柱色谱（例 如，疏水作用或离子交换）、用于病毒灭活的低pH等（一般参见，Scopes ,Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。
[0135] 用于商业性生产抗体的方法包括密码子优化，选择启动子、转录元件和终止子，无 血清单细胞克隆、细胞保存、使用选择标记用于放大拷贝数、CHO终止子、无血清单细胞克 隆、改善蛋白质滴度（参见，例如US 5,786,464、US 6，114，148、US 6,063,598、US 7,569， 339、胖02004/050884、胖02008/012142、胖02008/012142、胖02005/019442、胖02008/107388、和 W02009/027471和US 5,888,809)。
[0136] V.核酸
[0137] 本发明还提供了编码任何上文所述的重链和轻链的核酸。通常，核酸还编码与成 熟重链和轻链融合的信号肤(例如，具有SEQ ID NO: 22或24的氨基酸序列的细胞肤，其可通 过SEQ ID N0:23和25编码）。核酸的编码序列可W与调控序列可操作地连接W确保编码序 列的表达，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸 可W W分离的形式存在或者可W克隆到一个或更多个载体中。核酸可W通过例如重叠核巧 酸的固相合成或PCR合成。编码重链和轻链的核酸可W在例如表达载体内连接成一个连续 核酸，或者可W分开，例如各自克隆到其自身的表达载体中。
[013引 VI.治疗应用
[0139] 本发明提供了多种治疗或影响预防患有路易体病或者具有患路易体病的风险的 患者中的路易体病的方法。适合于治疗的患者包括具有LBD疾病的风险但是未表现出症状 的个体，W及目前表现出共核蛋白病的症状或早期警报征象的患者，例如，EEG减慢、神经精 神病临床表现(沮丧、痴呆、幻觉、焦虑、冷漠、性感缺乏）、自律变化(直立性低血压、膀脫素 乱、便秘、大便失禁、流诞、吞咽苦难、性功能障碍、脑血流量变化）、感觉变化(嗅觉、疼痛、辨 色能力异常感觉）、睡眠障碍（REM睡眠行为障碍（RBD)、多动腿综合征/周期性末端运动 (periodic extremity movements)、嗜睡症、失眠）W及各种其他征象和症状(疲劳、复视、 视力模糊、皮脂溢出、体重减轻/增加）。因此，本发明可W向具有已知的LBD的遗传风险的个 体预防性实施。此类个体包括具有经历改进并的亲戚的那些人W及通过分析基因标记或生 物化学标记确定了风险的那些人。PD风险的基因标记包括a-突触核蛋白或化rkin、UCHLI和 CYP2D6基因中的突变;特别是a-突触核蛋白基因的位置30和53处的突变。目前患有帕金森 氏病的个体可W有其临床表现鉴定，包括静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓和姿势不稳定。
[0140] 在无症状患者中，治疗可W在任何年龄(例如，10、20、30岁）开始。但是，在患者达 到40、50、60或70岁之前通常不需要开始治疗。治疗通常需要一段时间的多个阶段。可W通 过分析随着时间的抗体或者对于治疗剂(例如，O-突触核蛋白肤的截短形式）的活化的T细 胞或B细胞应答来监测治疗。如果未能应答，则指示更高剂量。
[0141] 在患者中产生有益治疗响应(例如，减少神经炎和/或轴突a突触核蛋白积累、降低 神经炎营养不良、改善认知功能，和/或逆转、治疗或防止认知减退）的条件下，可W通过向 患者施用来将该抗体用于治疗或影响预防患者中的路易体病。在一些方法中，与对照群体 相比，经治疗患者中新皮质和/或基地神经节的神经纤维网中的神经炎营养不良的面积平 均可W降低至少10%、20%、30%或40%。
[0142] 在患有路易体病或者具有患路易体病的风险的患者中，通常观察到认知障碍、认 知功能的进行性减退、脑形态的变化和脑血管功能的变化。施用本发明抗体可W抑制或延 迟此类患者中认知功能的减退。
[0143] 本发明还提供了保留或增加突触密度和/或树突密度的方法。突触或树突密度的 变化指数可W通过突触形成(突触泡蛋白）和/或树突(MP2)的标记测量。在一些方法中，突 触密度或树突密度可W恢复到健康对象中的突触密度或树突密度水平。在一些方法中，与 未治疗的对照患者群相比，经治疗患者中的突触密度或树突密度的平均水平可W提高5%、 10%、15%、20%、25%、30% 或更多。
[0144] VII.治疗方法
[0145] 在预防性应用中，W有效降低疾病的风险、减轻疾病的严重程度或者延迟疾病的 至少一种征象或症状的发作的方案(施用的剂量、频率和途径），向易感于疾病或者W其他 方式而具有疾病风险的患者施用抗体、诱导抗体的药剂或者包含抗体的制剂。在一些预防 性应用中，方案有效抑制或延迟a突触核蛋白和截短片段在脑中的积累，和/或抑制或延迟 其毒性效应和/或抑制或延迟行为缺陷的出现。在治疗性应用中，W有效改善疾病的至少一 种征象或症状或至少抑制其进一步恶化的方案(施用的剂量、频率和途径），向被怀疑患有 或者已经患有路易体病的患者施用抗体或诱导抗体的药剂。在一些治疗性应用中，方案有 效降低a突触核蛋白和截短片段的水平、相关毒性和/或行为缺陷，或者至少抑制其进一步 增加。
[0146] 如果与未用本发明方法治疗的可比较患者的对照群的平均结果相比被治疗患者 个体取得了更有利的结果，或者如果在控制的临床试验(例如，阶段II、阶段II/III或阶段 III试验）中经治疗患者相比于对照患者表现出了更有利的结果（p<0.05或0.01或甚至 0.001水平），则认为方案是治疗或预防有效的。
[0147] 有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、祀位点、患者的生理状态(包 括路易体疾病的类似）、患者是否是ApoE携带者、或者是人还是动物、施用的其他药物、W及 治疗是预防性的还是治疗性的。
[0148]抗体的示例性剂量范围为约0.1至50mg/kg患者体重。抗体可W每天一次、隔天一 次、每周一次、隔周一次、每月一次、每季度一次、每年一次或根据经验分析确定的其他方案 施用运样的剂量。示例性的治疗需要在长时期(例如，致死后6个月）施用多个剂量。额外的 示例性治疗方案需要每两周一次或者每月一次或者每3至6个月一次施用。
[0149] 抗体可W通过外周途径施用，即，其中施用的抗体穿过血脑屏障到达脑中的预期 位点。施用途径包括局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、烦内、銷内、腹膜内、鼻内或肌内。抗 体的一些施用途径是静脉内和皮下。运种注射最典型地在手臂或腿肌肉中进行。在一些方 法中，药剂直接注射到积累了沉积物的特定组织中，例如烦内注射。
[0150] 本方案可W与有效治疗或预防被治疗疾病的另外的药剂组合来实施。例如，在帕 金森氏病的情况下，对于a突触核蛋白的免疫治疗（W0/2008/103472)、左旋多己、 benzaseride、卡比多己、多己胺激动剂、非麦角多己胺激动剂、儿茶酪-0-甲基TCOMr )抑 制剂如安他可朋（6111日(3〇9〇]16)或1：〇1(3〇9〇]16、单胺氧化酶（"]^0")抑制剂如雷沙吉兰 (rasagaline)、金刚烧胺或抗胆碱能剂可与本方案组合使用。
[0151] 可W施用有效剂量的将在下文极详细描述的任何药物制剂，W治疗性或预防性治 疗患有共核蛋白病或者具有患共核蛋白病的风险的人患者。下文描述的一些制剂可W添加 到适合向患者静脉内施用的输液袋中，例如每四周一次施用。一些患者被诊断患有帕金森 氏病。本文所述制剂可W W约0.3mg/kg、约Img/kg、约3mg/kg、约1 Omg/kg或约30mg/kg人源 化9E4药物物质的剂量施用。在一些患者中，可W根据耐受性、安全性、药代动力学、效力和 其他可W凭经验确定的参数来进一步调节剂量。
[0152] VIII.制剂
[01对本发明的制剂（也称为药物组合物）包含抗体（例如，小鼠9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰或人源化形式)或其抗原结合片段、缓冲剂、一种或更多种糖和/或多元 醇和表面活性剂，并且抑未约5至约7.5。制剂可W配置成W液体形式或冻干形式储存。当W 冻干形式储存时，可W将制剂用液体(例如，无菌水)重构到本文所述浓度和性能。当说冻干 组合物可W通过添加水重构W产生特定组分浓高度和抑的制剂时，意指冻干制剂可W通常 添加水简单重构（即，不提供额外量的组分或添加酸或碱W改变pH)。冻干前 (prelyophilized)液体制剂的浓度和特性也可W根据下文描述的那些，如果冻干制剂被重 构到与冻干前制剂相同的体积的话。如果体积不同，制剂的浓度应按比例调节。如果重构体 积是冻干前体积的一半，则冻干前制剂的组分浓度应该是重构制剂的浓度的一半。
[0154]任选地，将从CHO细胞培养物中纯化的9E4抗体再悬浮在下文所述制剂中、临时冰 冻用于冻干前储存、冻干并且用水重构到与冻干前相同的浓度。此类制剂应当优选地通过 冰冻、冻干、储存和重构来稳定抗体并且适合于胃肠外施用。在示例性的工作流程中，使纯 化抗体W约40mg/ml再悬浮在制剂3 (表10)中并存在袋中于-40C储存。将袋在室溫解冻3小 时并且合并内容物。将制剂通过0.2为微米无菌过滤器进行无菌过滤。向小瓶中填充5.4ml 制剂并且冻干。冻干小瓶储存在2-8C下。通过添加无菌水(例如，约5.0至5.4ml无菌水，取决 于制剂)来对冻干小瓶进行重构。然后将5ml重构产物加入到含有20-100ml生理盐水、乳酸 林格氏溶液或5%葡萄糖溶液等的静脉注射袋的端口中用于向患者静脉内注射。
[01W] -些制剂包含填充剂，其可W与糖/多元醇组分相同或不同。通常，溶液是无菌的， 例如通过使用0.2皿或0.22邮的过滤器无菌过滤来实现。一些制剂的生物负载 < 约3〔尸11/ 30mL。一些制剂含有 <约0.化U/mg的细菌内毒素。本发明的制剂一般还是稳定的，如下文进 一步限定的，在冻融时低至不可检测水平的片段和/或聚集。另一些制剂在冻干饼重构后在 40°C下稳定至少3个月。在一些制剂中，小于约10%的抗体W聚集物存在于制剂中。在一些 实施方案中，小于或等于约5%的抗体W聚集物存在于制剂中。
[0156] 在一些制剂中，抗体W约Smg/血至约lOOmg/mL的浓度存在。在一些制剂中，抗体W 约5mg/mL至约50mg/mL的浓度存在。抗体W约25mg/血至50mg/mL的浓度存在。例如，抗体可 W W约35-45mg/ml或约40mg/mL的浓度存在。抗体可W W约50mg/小瓶至约500mg/小瓶或更 大的无菌液体剂型存在。坑提可W与约40mg/小瓶至约500mg/小瓶的冻干剂型存在。例如， 抗体可WW约250-350mg/小瓶或约200mg/小瓶的无菌液体或冻干剂型存在。
[0157] 所公开制剂中使用的抗体可W与治疗剂部分偶联，例如，细胞毒素剂、放射治疗 剂、免疫调节剂、第二抗体(例如，形成抗体异源缀合物)或有利于或增强配制抗体(例如，嵌 合、镶饰或人源化9E4)的活性的任何其他生物活性剂。代表性治疗剂部分已知可用于治疗、 控制或缓解路易体病或者共核蛋白病的症状的药剂。
[0158] 配制抗体可W包括上述抗体9E4的嵌合、镶饰或人源化形式中的任意一种。例如， 抗体可W包括含SEQ ID N0:4之S个Kabat CDR的轻链可变区和含SEQ ID NO: 11之S个 Kabat CDR的重链可变区。制剂可W包括抗体，抗体包括轻链可变区和/或重链可变区，轻链 可变区具有包含SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5中的任意一个的氨基酸序列，重 链可变区具有包含沈〇1〇^:8、569 10^:9、569 10顯：10或56〇10顯：11中的任意一 个的氨基酸序列。一些制剂包括抗体，抗体包括轻链可变区，轻链可变区具有包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列。一些制剂包括抗体，抗体包括重链可变区，重链可变区具有包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。例如，配制抗体可W包括轻链和重链，轻链具有包含SEQ ID NO:5的氨 基酸序列，重链具有包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。
[0159] 所公开制剂中使用缓冲剂W取得合适的抗体抑，例如，组氨酸、班巧酸盐和巧樣酸 盐缓冲剂。一些制剂的PH在约5.5至约7的范围内，例如抑5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、 6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。一些制剂的9出％约5.5至约6.5。一些制剂的抑 为约6.0,另一些制剂的pH为约6.5。在一些制剂中，巧樣酸盐缓冲剂或班巧酸盐缓冲剂W约 IOmM至约30mM范围内的浓度存在，例如约15-25mM或约20mM的浓度。一些巧樣酸缓冲剂包含 分布为约15mM至约20mM范围内内W及约2mM至约6mM范围内的浓度的脱水巧樣酸钢和巧樣 酸钢一水合物。
[0160] 用于制剂的合适的糖和/或多元醇包括海藻糖、薦糖、甘露醇或其组合。糖/多元醇 充当填充剂、冻干保护剂和/或张力调节剂。例如，一些制剂包含W约220mM至约260mM范围 内的浓度存在的海藻糖、W约220mM至约260mM范围内的浓度存在的薦糖或者浓度为20mM至 约40mM的薦糖和W约200mM至约220mM范围内的浓度存在的甘露醇的混合物。一些制剂包含 W约230mM或约240mM的浓度存在的海藻糖。另一些制剂包含W约230mM或约240mM的浓度存 在的薦糖。另一些制剂包含W约50mM的浓度存在的薦糖和W200mM范围内的浓度存在的甘 露醇的混合物。另一个制剂包含衣约28mM的浓度存在的薦糖和W约212mM的浓度存在的甘 露醇的混合物。一些运样的制剂的特征为摩尔渗透压浓度为约250-400、300-400或300-350m0sm/kg，例如，335m0sm/kg。
[0161] 制剂优选地包含表面活性剂W降低抗体在表面的聚集和吸附。合适的表面活性剂 包括按重量计W约0.005%至约0.05 %范围内的浓度存在的聚山梨醇醋20(PS20) dPS20保 护免于显著增加的聚集或浊度，否则运些现象将在9E4抗体的制剂中发生。聚山梨醇醋20可 W W约0.01 %至约0.05 %的浓度存在。例如，浓度可W为0.005 %、0.0 l %、0.015 %、 0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045% 或 0.05%。或者，在一些制剂中，聚山梨 醇醋 20W 约 0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L 或0.5g/L的浓度存在。一些制剂包含浓度为0.2g/L(即，0.163mmol/L)的聚山梨醇醋20。
[0162] -种示例性制剂(液体、冻干前或者冻干后重构的）的特征在于从约5.5到约7范围 内的抑，并且包括：（a)抗体9E4的嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4竞争和抗原的特异性 结合的其片段，浓度在约lOmg/ml至约50mg/ml的范围内；（b) W从约IOmM至约30mM的范围内 的浓度存在的巧樣酸盐或班巧酸盐；（C)糖和多元醇（"糖/多元醇"），其选自W约220mM至约 260mM的范围内的浓度存在的海藻糖、W约约220mM至约260mM的范围内的浓度存在的薦糖、 W及W约20mM至约40mM的范围内的浓度存在的薦糖和W约200mM至约220mM的范围内的浓 度存在的甘露醇的混合物；W及(d)按重量计W约0.005 %至约0.05 %的范围内的浓度存在 的聚山梨醇制20。例如，制剂包括：（a)抗体，抗体包括轻链和重链，轻链具有SEQ ID NO: 29 给出的氨基酸序列，重链包含SEQ ID NO: 32给出的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨 酸，其W约40mg/mL的浓度存在；（b)浓度为约20mM的巧樣酸盐缓冲液；（C)浓度为约230mM的 海藻糖；（d)浓度为约0.02%的聚山梨醇醋20; W及约6.0的pH。
[0163] -些冻干制剂包含：（a)抗体9E4的人源化形式或者其抗原结合片段；（b)巧樣酸 盐；（C)海藻糖;和聚山梨醇醋20。冻干制剂可W包含约200mg的抗体。一些冻干制剂能够用 无菌水重构。一些冻干制剂包含100-300或150-250mg犯4抗体、15-35或20-25mg脱水巧樣 酸钢、1.65-2.75或2-2.3mg巧樣酸一水合物、360-500或400-470mg脱水海藻糖、W及0.5至 1.5mg或0.75至1.25mg聚山梨醇醋20。示例性冻干制剂包含200mg犯4抗体（例如，人源化 犯4抗体）、25mg脱水巧樣酸钢、2.15mg巧樣酸一水合物、435mg脱水海藻糖和Img聚山梨醇醋 20。另一种示例性冻干制剂包含200mg犯4抗体（例如，人源化9E4抗体）、25mg脱水巧樣酸 钢、3.15mg巧樣酸一水合物、435mg脱水海藻糖和Img聚山梨醇醋20。此类制剂优选地重构到 约5ml的体积。其他冻干制剂包含与本段落任何地方的公开相同比例但是不同的量的相同 组分(例如，例如，400mg抗体、50mg脱水巧樣酸钢、4.3mg巧樣酸一水合物、870mg脱水海藻糖 和2mg聚山梨醇醋20)。
[0164] 冻干制剂优选地重构到约30-50或35-45mg/mL、优选地约40mg/mL的抗体浓度；（b) W约10-30或15-25mM、优选地约20mM的浓度存在的巧樣酸盐缓冲剂；（C) W约160-330或 200-260mM、优选地约230mM的浓度存在的海藻糖；（d) W约0.1-0.3或约0.15至0.25g/L、优 选地约0.2g/L存在的聚山梨醇醋20; W及(e)约5.5-6.5、优选地约6.0的pH。
[0165] 液体制剂或重构冻干制剂优选地为基本上等张的，意味着约250-350m0sm/kg水的 张力。一些制剂的张力为约335m0sm/kg。一些制剂的张力为270-300m0sm/kg。液体制剂或重 构冻干制剂还可W为〉350m0sm/kg水的高张的或低张的（<250m0sm/kg水）。
[0166] -些冻干制剂表现为白色至微黄色粉末。一些液体制剂或重构冻干制剂表现为溶 液，其几乎不含外来颗粒并且可W包含少量半透明的白色至微黄色的产物典型的颗粒。一 些液体制剂或重构冻干制剂具有每小瓶(体积= 5ml) <约6,000个> 10皿的显微可见（SUb-visible)颗粒和/或每小瓶^约600个^ 25]im的显微可见颗粒。一些液体制剂或重构冻干制 剂表现为无色至浅黄色（^参考溶液BY3)。一些液体制剂或重构冻干制剂表现为透明至稍 微乳白色(参考悬液III).
[0167] 除了本文描述为组分的那些外，可W不需要任何药物赋形剂、载体等就能制备本 文描述的任何制剂。如果存在不显著量的不影响制剂的性质的其他组分，则此类制剂可W 描述为由列举的组分组成，或者基本上有列举的组分组成。优选地在用于向人施用的药物 制备的FD A批准或审核的良好生产规范(GMP)下制备该制剂。
[0168] 所公开制剂中使用的抗体还可W可检测标记偶联，例如用于诊断共核蛋白病、用 于检测共核蛋白病的进展，和/或用于评估治疗的效力。如本文所述配制的抗体通常可用于 在患有或怀疑患有共核蛋白病(例如，帕金森氏病）的对象中或者在获自此类对象的合适的 生物样品中进行运样的测定。可W与人源化9E4抗体偶联或连接的代表性可检测标记包括 多种酶，例如辣根过氧化物酶、碱性憐酸酶、e-半乳糖巧酶或者乙酷胆碱醋酶;辅基，例如 Streptavidin Aiotin和抗生物素蛋白/生物素；巧光材料，例如伞形酬、巧光素、异硫氯酸 巧光素、若丹明、二氯=嗦基胺巧光素、丹横酷氯或藻红蛋白；发光材料，例如鲁米诺;生物 发光材料，例如巧光素酶、巧光素和水母素;放射性物质，例如但不限于舰(i 3il、i25I、i23I、 1211，）、碳(1化）、硫巧）、気州）、铜(115111、113111、112111、111111)、个得(991'。）、巧(2。11'1)、嫁(686曰 、 67Ga)、钮(ID3Pd)、钢("Mo)、氣("3Xe)、氣("F)、" 3Sm、"7Lu、"9Gd、I49Pm、MDLa、"Syb、I 66Ho、 WY、"Sc、"6Re、i88Re、i42Pr、iD5Rh、 97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、 32P、i53Gd、i69Yb、5iCr、54Mn、 75Se 、ii3Sn和i"Tin;使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射材料，非放射性顺磁性金属离 子，W及用特定放射性同位素放射性标记或缀合的分子。
[0169] 可W使用本领域的已知技术将治疗部分和/或可检测物质直接地或者或者通过中 间物（例如接头）间接地与小鼠嵌合、镶饰或人源化9E4抗体直接偶联或缀合。参见，例如， Monoclonal Antibodies And Cancer !"Iierapy,Reisfeld等（编辑），第243-56页（Alan R 丄 iss,Inc. 1985)中的 Arnon 等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In (Mincer HierapyWiControlled Drug Delivery(第二版），Robinson等（编辑），第 623-53 页（Marcel Dekker,Inc. 1987)中的Hellstrom 等，"Antibodies For Drug Delivery";Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications , Pinchera等（编辑），第475-506页（1985)中的Hiorpe,"Antibody Carriers Of 切totoxic Agents In Cancer Therapy:A Review";Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin 等（编辑）第303-16 页（Academic Press 1985)中的"Analysis, Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"?及Thorpe等，Immunol .Rev. , 1982,62:119-58。
[0170] 所公开制剂中使用的抗体还包括经修饰小鼠、嵌合、镶饰或人源化9E4抗体，其相 对于相应地未经修饰抗体在体内具有延长的半衰期。此类经修饰形式可W通过例如通过已 知的保护/阻断基的糖基化、乙酷化、聚乙二醇化、憐酸化、酷胺化、衍生化、蛋白水解切割、 与细胞配体或其他蛋白质连接来制备。作为一个例子，用于抗体半衰期延长的代表性方法 描述在WO 02/060919中。
[0171] 本发明包括在38°C-42°C稳定(例如，通过高效尺寸排阻色谱化PSEC)评估)至少约 30天的抗体制剂，在20°C-24°C稳定至少约1年的抗体制剂，W及在2°C-4°C稳定至少约3年 的抗体制剂评估冻干制剂在冻干状态储存的稳定性。如果在一个或更多个运些指定的时间 和溫度组合下解育之后制剂满足W下对于低至不可检测的片段化和/或低至不可检测的聚 集的定义，则认为制剂是稳定的。更具体地，所公开制剂表现出低至不可检测水平的抗体聚 集和/或片段化，或者抗体片段化和/或聚集相对于初始水平(例如小于约10%的聚集)低的 或不可检测的增加。一些制剂表现出含约5%的组合的聚集和/或片段化。具有低至不可检 测水平的片段化的制剂在例如通过高效尺寸排阻色谱化PSEC)确定的单峰中或者在通过还 原型毛细管凝胶电泳(rCGE)确定的双峰(一个对应于抗体重链和抗体重链中的每一个）（代 表未降解抗体）中包含总蛋白质的至少约80%、85%、90%、95%、98%或99%，并且不包含 具有每种总蛋白质的超过5 %、超过4 %、超过3 %、超过2 %、超过1 %或超过0.5 %的其他单 峰。具有低至不可检测水平的聚集的制剂包含按蛋白质的重量计不超过约15%、不超过约 10%、不超过约5%、不超过约4%、不超过约3%、不超过约2%、不超过约1 %或不超过约 0.5 %的聚集，如通过高效尺寸排阻色谱化PSEC)确定的。例如，在一些制剂中，少于约10 % 的抗突触核蛋白抗体W聚集物存在。本发明的稳定制剂还表现出很少或不具有嵌合、镶饰 或人源化9E4的生物活性（例如通过ELISA和/或其他功能测定可测量的结合亲和力）的损 失，即，初始可测量值的至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 98%或99%。一些制剂的结合亲和力为参考材料的初始初始可测量值的约60%至约140%。
[0172] IX.药物制剂的制备
[0173] 本发明还提供了制备药物制剂的方法。在本发明的一个方面，此类方法包括：（a) 培养哺乳动物细胞，哺乳动物细胞具有稳定整合入其基因组的编码小鼠抗体9E4(ATCC目录 号PTA-8221)或者其嵌合、镶饰或人源化形式的核酸，使得细胞分泌抗体到细胞培养基中； (b)从细胞培养基中纯化抗体;W及(C)制备任意上述制剂。
[0174] 药物制剂的制备可W包括评估制剂中抗体的至少一种性质的额外步骤，性质选自 由物理稳定性、化学稳定和生物活性组成的组。
[0175] 例如，可W培养哺乳动物细胞W产生抗体，其中哺乳动物细胞具有稳定整合如其 基因组的编码人源化9E4抗体的轻链和重链的核酸。可用于该目的的哺乳动物细胞包括具 有稳定整合入其基因组的编码SEQ ID NO: 29给出的抗体轻链和SEQ ID NO: 31或32给出的 抗体重链的核酸序列。
[0176] 为了产生抗体，将所公开核酸引入载体。在一些实例中，载体包含与能够导致在宿 主细胞中表达DM的合适控制序列可操作地连接的编码小鼠9E4抗体或者其嵌合、镶饰或人 源化形式的核酸。此类控制序列包括导致转录的启动子(例如，本领域中已知的组成型启动 子或诱导型启动子）、终止此类转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA结合位点的序列、 增强子、多聚腺巧酸化信号W及控制转录和翻译的终止的序列。载体可W是质粒、隧菌体颗 粒(例如，病毒载体，如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、瘤疹病毒、痘苗病毒、慢病毒、痘病 毒和巨细胞病毒载体)或者简单的基因插入物。一旦转化到合适的宿主细胞中，抗体核酸可 W整合到宿主基因组中，或者载体可W独立于宿主基因组复制和发挥功能。
[0177] 所公开的核酸单独地或组合地(例如，编码抗体轻链的核酸和编码抗体重链的核 酸的组合）引入到载体中。
[0178] 可用于制备本发明抗体制剂的宿主细胞包括哺乳动物细胞，包括人来源的细胞、 人胚肾细胞、猴肾细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢(C册)细胞、小鼠塞尔托利细胞、 人宫颈癌化eLa)细胞、犬肾细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺瘤细胞和NSO细胞。
[0179] 或者，可W通过化学合成制备嵌合、镶饰或人源化9E4抗体然后用在所公开制剂 中。
[0180] 用于制备所公开制剂的抗体通常是分离的或纯化的，即，基本上不含细胞物质或 者来自产生抗体之细胞的其他污染物蛋白质，或者基本上不含或者化学合成时的化学前体 或其他化学物质。例如，基本上不含细胞物质的抗体包含具有少于约30 %、25 %、20%、 15%、10%、8%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%或更少(按干重计）的污染蛋白质的抗体制备 物。当重组产生抗体时，其还基本上不含细胞培养基，使得培养基表现为蛋白质制备物体积 的约 30%、25%、20%、15%、10%、8%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%或更少。当通过化学合成 产生抗体时，优选地基本上不含参与蛋白质合成的化学前体或其他化学物质或者与后者分 离。因此，此类抗体制备物具有类此抗体制剂具有少于约30%、25%、20%、15%、10%、8%、 5%、2%、1%、0.5%、0.1%或更少(按干重计）的化学前体或者抗体药物物质之外的其他化 合物。例如，一些抗体药物物质的制剂具有通过W下测定确定的W下纯度:蛋白质A ELISA ( < 约2511邑/111邑）、(：册P 化ISA( < 约10011^111邑）、16尸-化LISA( < 约111邑/111邑）、膜岛素化ISA( < 约Ing/mg)和DNA qPCR( <约3口邑/111邑蛋白质）。一些抗体药物物质制剂的生物负载 < 约 IOC即/mL。一些抗体药物物质制剂含含约0.祀U/mg的细菌内毒素。重组表达载体的纯化可 W使用本领域已知的若干方法中的任意一种，例如，亲和色谱、酸处理、深层过滤、阴离子交 换色谱、阳离子交换色谱、纳滤、超滤、透析和渗滤。
[0181] 可W将纯化的抗体药物物质调节成包含本文所述的任何制剂的溶液，稀释到期望 浓度并且储存直到准备使用。任选地，制剂可WW浓缩形式储存直到准备使用。
[0182] 液体制剂可W根据稳定性特性在冷冻下W冰冻形式储存或者在室溫下储存，稳定 性特性可W通过经验确定。在一些情况下，使用进一步过滤步骤。一些本文所述的制剂可W 冻干并且W粉末形式储存。冻干制剂可W根据稳定性特性在冷冻下W冰冻形式储存或者在 室溫下储存，稳定性特性可W通过经验确定。例如，冻干制剂可W储存在约2°C至约8°C的溫 度下。在运种情况下，可W在向患者施用前将制剂重构成具有W本文所述的浓度存在的抗 体和赋形剂的液体制剂。在一些情况下，制剂用无菌水重构。在一些情况下，将制剂重构并 且添加到输液袋中用于向患者施用。重构制剂在向患者施用前可W在冷冻下或室溫下储存 符合稳定性特定的一段时间。冻干和重构技术是本领域中已知的并且描述在实施例中。
[0183] 可W将液体制剂或重构冻干制剂在向患者施用前添加到含有稀释剂(例如生理盐 水或林格氏溶液）的输液袋中。输液袋的体积与液体制剂或重构冻干制剂的体积(例如，1-IOml)相比通常相对较大（例如，50ml至1L，或者IOO-SOOml)。多种液体可W用在输液袋中， 例如生理盐水、乳酸林格氏溶液或5%葡萄糖溶液，其各自是基本上等张的。在一个示例性 方案中，将约5ml液体制剂或冻干制剂通过生理盐水的100-ml袋的端口注射并且通过W约 1.75ml/分钟的流速静脉内输注约1小时的一段时间来施用。
[0184] 因此，本发明还包括包含冻干抗体药物物质和用于重构和使用的说明的药物产 品。一些药物产品包括：（a)小瓶，其包含约40至约200mg的粉末形式的抗体;和(b)用于重构 抗体的说明。一种示例性药物产品包括：（a)小瓶，其包含粉末形式的约200mg抗体、约25mg 脱水巧樣酸钢、约3.15mg巧樣酸一水合物、约435mg脱水海藻糖和约Img聚山梨醇醋20; (b) 用于重构的说明；和（C)用于制备输注用重构制剂的说明，其中（i)抗体包括含SEQ ID NO: 29给出的氨基酸序列的轻链和含SEQ ID N0:32给出的氨基酸序列的重链，具有或不具有C-末端赖氨酸；W及(ii)重构说明需要用注射用水重构到5mL的可提取体积。 实施例
[0185] 引入W下实施例W说明本发明的模式。W下实施例的某些方面是关于本共同发明 人发现或预期在本发明的实践中运作良好的技术和方法描述的。根据本公开内容W及本领 域的一般技术水平，本领域技术人员将理解W下实施例仅旨在举例说明，并且可W使用多 种改变、修改和变更而脱离本发明的范围。
[01化]实施例1:表达载体的制备
[0187] 将人源化犯4的重链和轻链二者可变区的特定序列（分别（SEQ ID N0:32和29)亚 克隆到表达载体中，表达载体包含允许富集高生产细胞的元件(例如，转录增强元件(TS)、 多聚腺巧酸化信号、新霉素憐酸转移酶突变体）。
[0188] 使用质粒pCET化犯4VLv3.hCK作为模板，通过PCR分离轻链可变区，在片段的5'端 引入EcoRV限制位点和3'端KpnI显著位点用于利用相同限制酶的消化亚克隆到载体地1-60 和pBI-90中。运些载体包含人K链的基因恒定区。此外，载体pBI-60和地1-90编码减弱的选 择标记新霉素憐酸转移酶，用于在选择期间富集高生产细胞。地1-60编码新霉素憐酸转移 酶的F240I突变体，pBI-90编码D227V突变体。
[0189] 使用质粒pCET Hu9E4VHv3.hlgGl作为模板，通过PCR分离人源化犯4重链的可变 区，引入5 '端Mf eI限制位点和3 '端BIpI限制位点用于亚克隆。将可变区克隆到Mf eI和BamHI 消化的含有Glm(3)同种型的人IgGl的基因恒定区的真核表达载体地1-61中。载体编码来自 仓鼠的可选择标记二氨叶酸还原酶(DHFR)。
[0190] 实施例2:人源化9E4抗体的产生
[0191] 将质粒pBI-61/犯4HC和pBI-60/犯化C共转化到在无血清培养基中预适应的中国 仓鼠卵巢(C册)细胞中。使细胞生长在不具有任何牛来源的组分的化学物确定的培养基中。 用于建立细胞系的培养基如下：
[0192] 预接种培养基
[0194] 接种前(Preinocculation)培养基的制备：
[0195] 1)WFI初始体积为总体积80%，初始溫度28°C至35°C。
[0196] 2)在每一种之前的组分完全溶解之后，立即按照列表(上文)依次加入组分。
[0197] 3)剩余体积的WFI，0.17化/L培养基。
[019引 4)过滤前，将抑调解到7.00至7.20。
[0199] 5)过滤前，摩尔渗透压浓度为280至320m0smol/kg。
[0200] 接种后加入：
[0201] 营养物补料培养基
[0202] 3%谷氨酷胺溶液
[0203] 葡萄糖溶液(500g/L)
[0204] IM碳酸钢溶液
[0205] 2 %消泡剂。
[0206] 营养物补料培养基
[0209] 营养物补料培养基的制备：
[0210] 1)WFI初始体积为总体积的70%，初始溫度30°C至40°C。
[0211] 2)在每一种之前的组分完全溶解之后，立即按照列表(上文)依次加入组分。
[0212] 3)剩余体积的WFI，0.179L/L培养基。
[0213] 4)过滤前，将抑调解到6.90至7.10。
[0214] 5)过滤前，摩尔渗透压浓度为1185至1585m0smol/kg。
[0215] 培养基过滤：
[0216] 初过滤器-0.2皿过滤器
[0217] 终过滤器-0.1皿过滤器
[0218] 从稳定转染的细胞合并抗体，由细胞得到最终生产细胞系。通过蛋白质A亲和色谱 和下文所述其他纯化技术纯化合并得到的物质。
[0219] 实施例3:抗体纯化
[0220] 蛋白质A是用于人源化、镶饰或嵌合9E4抗体的亲和纯化的细菌蛋白质。蛋白质A色 谱通常设及在抗体结合并且不需要组分(例如，宿主细胞蛋白质、细胞培养基组分和推测的 病毒)流过柱的条件下，在pH 6-8下使澄清化细胞培上清液通过柱。可W进行任选的中间洗 涂步骤W从柱中除去非特异性结合的杂质，然后在抑2.5-4下洗脱产物。根据其树脂骨架 组合物分类的蛋白质A树脂的类型包括：玻璃或二氧化娃基，例如Prosep vAJrosep vA 叫tra(Millipore);琼脂糖基，例如蛋白质A琼脂糖快速流动，MabSelect(GE Heal化care); W及有机聚合物基，例如聚苯乙締二乙締基苯 Poros A和MabCapture(Applied Biosystems)。可W使用多种洗脱缓冲剂组分，例如乙酸、巧樣酸、憐酸、精氨酸肥1和谷氨酸 HCl。
[0221] 可W通过在低抑下处理或者过滤W及其他方法除去病毒。当前的病毒截留过滤器 是具有非常小的孔的超过滤器或微过滤器。病毒滤膜由亲水聚酸讽(PES)、亲水聚偏二乙締 (PVD巧和再生纤维素制备。
[0222] 深层过滤器用于细胞培养肉汤的澄清化，W保持膜过滤器的能力或者保护色谱柱 或病毒过滤器。深层过滤器通常由纤维素、多孔助滤剂(例如娃藻±)和离子电荷树脂粘合 剂制备。深层过滤器可W使用尺寸排阻和吸附结合二者来有效分离。
[0223] 离子交换色谱使用带正电荷或带负电荷的树脂与蛋白质(基于其在跟定缓冲剂系 统中的静电荷)结合。可W确定W高度特异性结合和释放祀抗体的条件条件(例如，pH和离 子强度）。反过来，可W发现几乎与除抗体外的所有样品组分结合的条件。阴离子交换色谱 使用带正电荷的基团（弱碱性，例如二乙基氨基乙基DEAE或二甲基氨基乙基DMAE;或者强碱 性，例如季锭乙基Q或S甲基锭乙基TMAE或季锭乙基QAE)。
[0224] 阳离子交换色谱使用带负电荷的官能团修饰的树脂。其可W是强酸配体，例如横 基丙基、横基乙基和横基下基，或者弱酸性配体，例如簇基。阳离子交换色谱已经用于许多 Pl值在中性至碱性范围的mAb的纯化过程。抗体在加样步骤中结合在树脂上，并且通过洗脱 缓冲剂中增加的导电性或增加的抑而被洗脱。从加样级分和洗涂级分中除去电负电荷的过 程相关杂质例如DNA、一些宿主细胞蛋白质、浸提的蛋白质A和内毒素。阳离子交换色谱还可 W从期望抗体中分离脱酷胺基产物、氧化物质和N末端截短的形式W及高分子量物质。抗体 与阳离子交换树脂的结合取决于抑和导电性W及树脂类型。SP琼脂糖FF和SP琼脂糖XL是两 种常见的市售树脂。
[0225]超滤是用于抗体浓缩和缓冲剂交换的一种压力驱动的膜过程。超滤是基于尺寸的 分离，其中比膜孔大的物质被截留，而较小物质自由通过。超滤的通过在给定压力驱动力下 不同组分穿过膜的过滤速度的差异实现分离。缓冲剂交换使用渗滤模式实现，其中最终期 望组合物的缓冲剂W与滤液移除相同的速度加入到渗余物系统中，因此保持恒定的渗余物 体积。孔范围为1至20nm的超滤可W提供分子量为500道尔顿至1，000千道尔顿范围的物质 的分离。
[0。6] 可W使用来自GE Healthcare的MabSelect树脂通过重组蛋白质AbProtein-A)亲 和色谱从收获的滤液中捕获9E4抗体产物。产物在中性抑下与蛋白质A树脂结合并且在等度 模式下利用pH 3.0的IOOmM醋酸钢洗脱。通过该步骤大部分宿主细胞杂质和细胞培养基组 分减少。用一半PAIN缓冲剂（500mM 化Cl、1.34mM KCl、4mM Na2HP〇4X 2H2〇、0.735mM KH2P04x2H20、0.125%PVP = 科利当17、7.5%异丙醇、4.3mM化0H、250mMレ精氨酸-肥L，pH 7.4,导电率45mS/cm)进行独立的分离步骤W除去依然保留在柱上的组分并且使中性AT合 并产物的浊度尽可能小。通过W类似加样量将收获的合并物分开来进行蛋白质A步骤最多 S个循环。用 1.47mM KH2P04X 2肥0、8.03mM 化2HP04X 2H20 137mM NaCl、2.68mM KCl将将 柱平衡到pH 7.4±0.2并且导电率16±3mS/cm移除去储存的溶液并且将柱为加样做好准 备。然后W最大30g/L收获滤液对柱加样、洗涂(3份缓冲剂，各自为3个柱体积)并且洗脱。洗 脱后，将柱用0.1 M憐酸对剥离并且平衡用于下一循环，或者如果次日进行随后的循环，则完 全再生并且储存。在最后一次循环后利用0.1 M憐酸(剥离）、6M脈和IM乙酸进行完全再生。
[0227] 将合并的并且0.2皿过滤的MabSelect合并产物用IM乙酸(揽拌）调节到抑3.5并 且在室溫下解育60-70分钟用于病毒灭活(不揽拌）。在揽拌下通过添加 IM tris碱中和到抑 5.50±0.20。
[0228] 立即使酸处理产物通过W下深层过滤步骤。通过化no Ze化P1US60ZA的深层过滤 步骤是用于除去浑浊的步骤。将病毒灭活的合并产物通过由无菌的上述深层过滤器材料和 0.2WI1 PES膜过滤器组成的二阶段过滤过程过滤。
[0229] 将深层过滤的合并产物使用来自GE化althcare的Q-琼脂糖快速流动树脂通过阴 离子交换色谱(AEX)W流通方式(flow-through mode)进一步纯化。AEX步骤减少了残余的 宿主细胞DNA并且除去病毒。将柱用Q平衡缓冲剂(42.SmM氨基下S醇-HCl、7.2mM化is碱、 39mM化Cl)平衡到pH 7.50 ±0.20和导电率8.0 ± 1. OmS/cmW除去储存的溶液并且将柱为 加样做好准备。在加样期间，产物流过柱而杂质与柱结合。在加样/洗脱后，将柱用Q平衡缓 冲剂洗涂W除去保留在柱的流动相中的产物。在产物回收后，将柱再生并且最终储存。
[0230] 将调节的Q-琼脂糖合并产物使用来自Applied Biosystems的化ros HS50通过阳 离子交换色谱（CEX)进一步纯化。产物在低盐调节（36.2mM CHsCOO化X 3出0,13. SmM CH3C00H，58.5mM化Cl，pH5.1，导电率8mS/cm)下与柱结合，然后在高盐条件（38mM CH3C00化x3H20，12mMCH3C00H，228mM化Cl，pH5.1，导电率25.5mS/cm)下W等度模式洗 脱。利用中等盐量（37.2mM OfeCOONa X 3此0,12.SmM OfeCOOH,102.5mM 化Cl，pH 5.1，导电 率13.5mS/cm)进行额外的洗涂步骤W除去污染物，例如宿主细胞蛋白质、高分子量产物变 体和浸提的蛋白质AXEX步骤进行最大2个循环。在运种情况下，将调解的AEX合并物分成2 个相等体积并且单独在CEX柱上处理。
[0231] 病毒过滤(VF)提供了特异性用于除去病毒颗粒的第二种正交方法，并且被设计成 除去大于20nm的颗粒(例如，细小病毒）。病毒过滤通过在1.化ar的跨纳米过滤器压降下使 Poros HS50合并产物在压力下转移通过串联的0.1 ym初过滤器和病毒过滤器（Planova 20N，As址i Kasei)来实现。在使用前(泄漏测试)和使用后(泄漏测试和金颗粒测试)进行病 毒过滤器的完整性测试。
[0232] 将纳米过滤的合并产物浓缩到约20g/L(UFl)，然后用>6倍体积的渗滤缓冲剂 (17mM Cs曲Na3〇7X 2此0,3mMC6H8〇7X此0，pH 6,导电率4mS/cm)的恒定体积进行渗滤。渗滤 后，将合并物浓缩到约75g/L(UF2)。最后，通过用渗滤缓冲剂冲洗来从UF/DF系统中除去渗 余物至约52g/L的浓度（="30kD合并产物"）。
[0233] 将30kD合并产物与4+1的比率与5倍海藻糖/Tween20(聚山梨醇醋20)spike缓冲剂 ((17mM C油日Na3〇7X 2此0,3mMC6H8〇7X 出0，1150mM海藻糖X 2此0，lg/L聚山梨醇醋20，pH 5.9，导电率1.〇1115八111)混合并且用制剂缓冲剂（17111]\1〔6化化3〇7义2出0,3111]\1(：抽8〇7义此0， 230mM海藻糖X 2此0，0.2g/L聚山梨醇醋20，pH 6.0，导电率3.30mS/cm)稀释W得到40.0 ± 2.0g/L的蛋白质浓度。
[0234] 将本体材料(bu化material)通过串联的0.2皿合并过滤器(pool filter)和0.化 m袋过滤器(bag fi 1 ter)过滤。可W进行额外的初过滤器至0.2皿过滤器W除去颗粒。测试 0.2WI1合并过滤器的完整性。如果位测试合并过滤器，则单独测试每个袋过滤器。
[0端]实施例4:制剂开发
[0236] 贯穿本实施例，使用具有SEQ ID NO:29的轻链序列和SEQ ID NO:32的重链序列的 人源化9E4抗体。
[0237] 物理化学特征。为了有助于选择潜在的制剂组分，确定人源化9E4抗体的热特性。 测定中使用差示扫描量热法（"DSC'）、直角光散射（"RALS")和固有巧光（"ir )技术。首先将 纯化抗体从l〇°C加热到7rc，然后从71°C冷却到10°C，然后再次从10°C加热到83°C，然后再 次从83°C冷却到10°C，最后再次从10°C加热到95°CdDSC热谱图掲示了两个转变，71°C处的 第一个和83°C处的第二个。参见图1。在实验条件下71°C的转变是可逆的。RALS和IF热谱图 掲示了中间溫度处的单转变。
[023引pH优化。接下来在pH值范围为3.5至8.0的混合缓冲系统中分析人源化犯4的稳定 性。再次，在测定中使用DSC、RALS和IF技术。如前，在DSC热谱图中检测了两个转变(除了在 pH 3.5检测到第S个转变W外）W及在RALS和IF热谱图中检测到单个中间转变。当在约71 °0下趋平时DSC分析中的第一热转变在pH 6.5之前随着抑的增加而增加(表4,下文W及图 2)。在抑5.0和6.5之间，DSC分析中的第二热转变在83°C附近出现峰值。在4.5-8.0的抑范 围下，RALS分析中的热转变保持在约77°C，在相同抑范围下IF热转变在75°C至77°C之间变 化(图2)。基于该结果，确定5.5至7.0的抑范围提供为人源化9E4抗体提供最大稳定性。 [0239] 表4:人源化犯4的作为pH函数的DSC热转变峰
[0241] 缓冲剂选择。基于人源化9E4抗体的抑依赖性稳定性结果，鉴定对于胃肠外使用来 说药学上可接受的并且可W在5.5至7.0之间的抑范围内提供足够的缓冲能力的缓冲系统。 缓冲剂体系包括20mM巧樣酸盐缓冲剂(pH 5.5;6.0)、20mM组氨酸缓冲剂(pH 6.0;6.5;7.0) 和20mM班巧酸盐缓冲剂(pH 6.5)。通过05(：、1?41^5和^测定2〇1111班巧酸盐和2〇1111组氨酸缓冲 剂中人源化9E4抗体的热稳定性。如通过DSC确定的，pH 5.5至6.0的巧樣酸盐缓冲剂中的人 源化9E4抗体表现出比组氨酸缓冲剂中的人源化9E4抗体显著更高的第二热转变(Tm2)(下 表5)。相反地，pH 6.5至7.0的组氨酸缓冲剂中的人源化9E4抗体表现出比巧樣酸盐缓冲剂 中的人源化9E4抗体更高的第一热转变(Tml)(表5)。使用RALS技术未检测到组氨酸缓冲的 抗体的转变。但是巧樣酸盐缓冲的抗体在pH 5.5和6.0表现出78°C的热转变。
[0242] 还通过DSC和RALS分析了班巧酸盐缓冲的人源化犯4抗体(pH 6.5)并且将结果与 巧樣酸盐缓冲的(pH 6.5)和组氨酸缓冲的(pH 6.5)抗体进行了比较。对于DSC分析，巧樣酸 盐缓冲剂和班巧酸盐缓冲剂中的第二热转变(Tm2)比组氨酸缓冲剂中的高约rC，表明在测 试条件下蛋白质稍高的稳定性。通过RALS检测到了pH 6.5的班巧酸盐缓冲剂和巧樣酸盐缓 冲剂的可比较的转变溫度。
[0243] 基于运些发现，选择20mM巧樣酸盐(pH 6.0)和20mM班巧酸盐(pH 6.5)缓冲剂来用 于产生冻干产品并且测试其长期稳定性。
[0244] 表5:人源化犯4的作为缓冲剂的函数的DSC热转变峰
[0246]糖/多元醇选择。为了提高冻干制剂中人源化9E4抗体的稳定性，分析了糖好多元 醇对抗体热稳定性的影响。评估的糖/多元醇包括海藻糖、薦糖或者薦糖和甘露醇的混合 物。将240mM海藻糖、240mM薦糖W及50mM薦糖/200mM甘露醇分别加入到20mM班巧酸盐(pH 6.5)、20mM组氨酸(pH 6.5)和20mM巧樣酸盐(pH 6.5)缓冲剂中。然后通过DSC评估每一种制 剂的人源化9E4抗体的稳定性。DSC结果表明，多种糖/多元醇使第一和第二热转变向更高稳 定转移，指示了稳定效果(下表6)。但是，海藻糖制剂始终具有最高的热转变(表6)。此外，组 氨酸制剂中的第二转变溫度(化2)低于巧樣酸盐和班巧酸盐制剂中的(表6)。
[0247]表6:作为缓冲剂和糖/多元醇的函数的人源化犯4的DSC热转变溫峰
[0249] 还在班巧酸盐或巧樣酸盐缓冲剂(pH 6.50中对具有多种糖/多元醇的人源化9E4 抗体进行了RALS测量。对于班巧酸盐缓冲剂，240mM海藻糖制剂具有最高转变溫度(77°C)， 240mM薦糖制剂具有中等转变溫度(76°C)，50mM薦糖/200mM甘露醇制剂具有最低转变溫度 (75°C)。对于巧樣酸盐缓冲剂，240mM海藻糖制剂和50mM薦糖/200mM甘露醇制剂具有相同的 转变溫度(78°C)，240mM薦糖制剂就有较低转变溫度(77°C)。巧樣酸盐制剂中转变溫度仅1 °C的差异在测试可变性之内。
[0250] 表面活性剂。使用DSC测试聚山梨醇醋2〇rPS20")对热稳定性的影响，并且确定为 对人源化9E4抗体的转变溫度没有影响。但是，关于震荡应力，观察到了 PS20的积极效果。测 试了两种制剂对于震荡应力的反应：（A)20mM pH 6.0巧樣酸盐，230mM海藻糖，0.02% (w/w) PS20; (B)25mM pH 6.0巧樣酸盐，230mM海藻糖。即使震荡24小时，具有PS20的制剂(制剂A) 提供了较低的泡沫形成程度和恒定的浊度。震荡3小时后，制剂B具有强泡沫形成增加的浊 度。没有制剂在震荡研究中导致产生可见颗粒。
[0251] 接下来，评估了 PS20对于震荡诱导的浊度的影响。即使震荡24小时后，制剂A的浊 度未增加。相比之下，制剂B的浊度几乎加倍，从震荡前的17FNU(Formazin Ne地elome化ic 化it)增加到了震荡24小时后的32FNU(表7)。
[0252] 表7:震荡前和震荡后人源化9E4抗体制剂的浊度（(FNU)
[0254] 震荡前和后抗体聚集的测量同样地证明了PS20的稳定效应。在震荡前和震荡3、6 和24小时后通过高效尺寸排阻色谱化PSEC)评估制剂A和制剂B中单体抗体和聚集抗体的 量。制剂A中PS20的存在与聚集抗体量的稍微增加(0.2 % )(表8)和单体抗体量的相应降低 (0.2% )(表9)相关联。相比之下，制剂B(无 PS20)表现出聚集抗体4倍增加(表8)和单体抗体 的量相应高降低(0.9%)(表9)。
[0255] 表8:震荡前和后人源化9E4抗体聚集（％ )
[0257]表9:震荡前和后人源化9E4抗体单体水平（％ )
[0259] ~因此，震荡研究的结果表明，PS20组织人源化9E4抗体制剂中不期望的浊度和抗体 聚集的增加。
[0260] 冻干可行性研究。基于之前分析，选择制剂1-4(下表10)来评估^冻干形式储存人 源化9E4抗体的可行性。
[0261] 表10:人源化9E4抗体测试制剂
[0263] 作为开始冻干循环的初始步骤，研究冰冻F1-F4制剂的热特性。使用Mettler Toledo DSC 821仪器来确定每一种制剂的玻璃化转变(Tg'）溫度。在W下冰冻/解冻循环下 进行测量：
[0264] 冰冻：W5K/分钟从5°C到70°C。
[0265] 保持:-7(TC下3分钟。
[0%6]加热：W5K/分钟从-70°C到25°C。
[0267]表11列出了 W该方式确认的玻璃化转变溫度。制剂2和4(其包含班巧酸盐和甘露 醇)表现出与海藻糖制剂相比较低的Tg'，而使用不同缓冲剂并不显著影响Tg'。尤其其更高 的Tg'，海藻糖制剂(制剂1和3)在初始干燥期间可W禁受更高产物溫度，运对于冻干过程有 利。
[026引表11:制剂Fl至F4的玻璃化转变溫度
[0270] ~基于确定的玻璃化转变溫度，开发并且测试了两种不同的冻干循环。第一种循环 包括在-10°c(搁板溫度)下进行的初级干燥步骤(表12)。第二种循环中的初级干燥步骤在-20°C下进行(表13)。
[0271] 表12:用于冻干可行性研究的冻干循环1
[0273] 表13:用于冻干可行性研究的冻干循环2
[0276] 使用化Silon 2-12D，GT-12-B冻干器(化rist)进行小规模的冻干可行研究。在0.2 Mi过滤后，将制剂抗体的5.4ml ±0.2ml等分试样加入到20ml小瓶（I型透明玻璃小瓶，20/ 25mL，Blow Back,来自Schott)。所得小瓶具有5.〇1111的标称填充体积和20〇111旨/小瓶的标称 剂量。冻干后的预期重构体积为5.Oml水。将小瓶手动输入到冻干器中并且根据循环1或循 环2冻干。使用放置在小瓶中的PTlOO传感器监测产物溫度。没有任何偏差的情况下进行循 环。在水结晶之前将制剂过冷到-6.5°C的最小溫度，之后将制剂冰冻到-50°C。对于初级干 燥阶段，在-l〇°C(循环1)或-20°C(循环2)的搁板溫度下应用0.1 OmbaH电容真空计）的真 空。对于循环1，运些参数导致升华期间-28°C至-25°C的平均产物溫度。对于循环2,运些参 数导致升华期间低于-30°C的平均产物溫度。对于两个循环，初级干燥的实际持续时间为40 个小时。在初级干燥后，将搁板溫度升高到30C(第二干燥）W允许吸收解冻的水。次级干燥 设置为8小时的周期，目的是冻干制剂的最终水分含量为约1 %。在冻干后，将小瓶塞上塞子 (Stelmi C1404 6720GC 6TP3,20mm)并且密封(侣flip-off密封，20mm)。
[0277] 含海藻糖的制剂在冻干后为完全的无定形并且表现出一些收缩。相比之下，含甘 露醇的制剂部分结晶并且不表现出收缩。所有制剂的饼高为约11mm。饼质量为约685mg (Fl)、516mg(F2)、700mg(F3)和520mg(F4)。对于所有制剂，饼具有浅黄色颜色。
[0278] 分析并且比较通过循环1和循环2产生的冻干制剂的特征，包括水分含量、重构时 间、显微可见颗粒的数目。见表14(下文）。此外，将冻干制剂的质量与冻干前的产品治疗相 比较。额外的特性测试包括澄清度、pH、摩尔渗透压浓度、单体相对于聚集物的量、密度、HIC 图案和活性(数据未示出）。总的来说，在冻干和重构后未发现对产品质量造成的不利影响： 冻干过程未显著改变产物外观、颜色、可见颗粒水平、澄清度、pH、摩尔渗透压浓度、蛋白质 含量、单体含量、HIC图案和活性。此外，通过循环1冻干的制剂的重构时间（100-140秒)和通 过循环2冻干的制剂的重构时间（100-170秒)可接受，测量的显微可见颗粒水平低于药典规 格。
[0279] 表14:冻干可行研究的结果，冻干后产品测试
[0281] 由于冻干循环2导致含甘露醇和薦糖的制剂更长的重构时间和稍微升高的显微可 见颗粒水平(2-10WI1)的趋势，选择基于修改的循环1的冻干循环用于加速稳定性研究。该修 改的冻干循环包括更短的40个小时而非60个小时的初级干燥阶段(步骤8)和12个小时而非 8个小时的延长的次级干燥阶段(阶段10)。包括更长的次级干燥阶段W进一步减少冻干制 剂中的水分含量。
[0282] 冻干制剂的加快的稳定研究。将制剂Fl-F4(如上表10所述)如上所述冻干，只是使 用表15(下）中示出的冻干循环。对于加速稳定性研究，将冻干制剂储存在40°C、75%相对湿 度(畑)下I、2或3个月的一段时间。储存后，将制剂用水(5. Oml)重构，检查重构制剂的特性 并且与冻干后立即重构的制剂的特性（"初始值"）相比较。
[0283]表15:加速稳定性研究的冻干循环
[0285] 冻干制剂的饼颜色为浅黄色，与冻干可行性研究中观察的一致。所有情况下饼外 观均可接受，海藻糖制剂(Fl和F3)由于冻干产物的无定形特性(通过X射线粉末衍射确认） 而倾向于收缩。含甘露醇的冻干制剂(F2和F4)部分结晶并且基本上未表现出收缩。在40°C 下储存S个月的过程后，制剂的饼外观和颜色未改变。
[0286] 在40°C下3个月后，冻干制剂在重构前的水分含量未显著改变。紧接冻干的制剂的 水分含量为0.90%至1.36%，3个月后，为0.84%至1.47%。参见表16(下文）。同一制剂的不 同样品观察的水分含量的差异是由于测试方法的变化。但是，含薦糖和甘露醇的制剂始终 比含海藻糖的制剂包含更高的水分含量。
[0287] 表16:冻干制剂在40°C下储存后的水分含量
[0289] 所有冻干制剂的重构时间均可接受，在49秒和97秒之间变化。所有冻干制剂的外 观均可接受，即使在40°C下3个月后也未观察到可见颗粒。此外，与冻干前制剂相比，制剂的 颜色在经过相同时间段后保持未改变(<BY5)。
[0290] 在40°C下3个月后，对于任何制剂均未观察到蛋白质浓度、摩尔渗透压浓度和抑中 的相关变化(数据未示出）。但是，观察 到了浊度的不同的增加。如表17(下文）中所示，含甘 露醇的制剂(F2和F4)的浊度表现的较大增加(S个月后6-7FNU)，而含海藻糖的制剂(Fl和 F3)表现出较少增加(仅2FNU)。
[0291]表17:冻干后制剂在40°C下储存后的浊度
[0293] 通过微流成像(MFI)法测量重构制剂中的显微可见颗粒。每个制剂每个时间点测 量两个单独样品。对于冻干后立即重构的制剂（即，未在40°C下储存），显微可见颗粒的水平 示出在表18(下文）中，相应柱状图示出在图帥。在40°C下储存1个月、2个月和3个月的制剂 检测的显微可见颗粒的水平分别示出在表19-21中（参见下文），相应柱状图分别示出在图 4-6 中。
[0294] 表18 :MFI数据，冻干后的初始值
[0296]表19:MFI数据，在40°C下储存1个月后的值
[0298]表20 :MFI数据，在40°C下储存2个月后的值
[0300]表21:MFI数据，在40°C下储存3个月后的值
[0302] MFI分析表明，受试制剂中的显微可见颗粒水平与刚冻干之后类似，但是含甘露醇 和薦糖的制剂(F2和F4)中的水平在一个月后急剧增加，并且之后持续增加。结果，制剂2超 过药典对于大于或等于10微米（含10.OOwiO的显微可见颗粒和正好一个月后的大于或等于 25微米（含25.OOwn)的显微可见颗粒的极限，制剂4超过了药典对于在40°C下储存2个月后 的显微可见颗粒的极限。相比之下，含海藻糖的制剂(Fl和F3)未表现出显著增加的颗粒形 成，并且低于药典对于40°C下至少3个月的显微可见颗粒的极限。
[0303] 还在40°C下储存2个月后通过不透光度测量了四种制剂中的显微可见颗粒。不透 光度是一种已知技术，其得到与MFI测量不同的结果，通常倾向于更低。如表22(下文）中所 示，通过不透光度检测，制剂2具有最高的显微可见颗粒水平，而其他制剂具有较低更加类 似的显微可见颗粒水平。
[0304] 表22:不透光度数据，在40°C下储存2个月后的值
[0306] 还通过高效尺寸排阻色谱化P-SEC)分析制剂W确定W冻干状态在40°C下储存后 聚集和单体形式的抗体的百分比。如表23(下文)所示，含甘露醇和薦糖的制剂中聚集抗体 的百分比从2.5%增加到4.4%，而含海藻糖的制剂中仅从1.0%增加到1.1 %。随着制剂中 聚集抗体水平的增加，单体抗体的百分比相应减少。参见表24。图7中示出了作为制剂和在 40°C下储存时间的函数的单体抗体的量的图示。
[0307] 表23:在40°C下储存后的抗体聚集(百分比）
[0309]表24:在40°C下储存后的单体抗体(百分比）
[0312] 经过40°C的储存历程后通过疏水相互作用色谱化IC)表征制剂。对于每一种制剂， 可W通过HIC检测前峰(相对亲水性）、主峰和后峰(相对疏水）。可W通过出现的每个峰的面 积的变化来监测蛋白质结构随时间的变化。HIC分析的结果示出在表25-27(下文）中。每一 种制剂的前锋面积的变化类似。主峰和后峰面积的变化更显著，含海藻糖的制剂和含甘露 醇/薦糖的制剂不同。具体地，在经过3个月的储存期后，含甘露醇/薦糖的制剂(F2和F4)的 主峰面积分别表现出8.4%和5.4%的降低。相比之下，经过相同的时期后，含海藻糖的制剂 (Fl和F3)的主峰面积分别表现出4.7%和4.5%的降低。含甘露醇/薦糖制剂的主峰中大部 分之前的蛋白质转移到疏水后峰，制剂F2和F4的后峰面积分别增加6.4%和4.6%。
[0313] 表25: HIC数据，在40°C储存后的前峰面积(百分比）
[0315]表26:HIC数据，在40°C储存后的主峰面积(百分比）
[031引表27:HIC数据，在40°C储存后的后峰面积巧分比）
[0320] 还通过等电点聚焦和毛细管成像（iCE)表征制剂。每一种制剂表现出=峰图形，包 括酸性峰、主峰和碱性峰。如表28中所示，制剂1在40°C储存的S个月期间表现出最小的峰 图形变化，而制剂2-4表现出碱性峰面积随时间的大的增加。
[0321] 表28:在40°C储存后的iCE数据
[0323] 还检查了每一种制剂中抗体的抗原结合活性。无论哪种制剂，抗体在40°C =个月 储存期间表现出高抗原结合活性。
[0324] 还测试了制剂在超滤/渗滤(UF/DF处理)期间的聚集制剂。试剂3表现出最少量的 聚集制剂，而制剂2表现出最多；制剂1和4表现出中等的聚集量(数据未示出）。
[0325] 考虑所有的加速稳定性数据，与制剂F2和F4相比，制剂Fl和F3在S个月储存后表 现出最佳稳定。运反映了 W下事实：如通过浊度、册-SEC、显微可见颗粒、HIC和iCE检测的， 制剂F2和F4(含甘露醇/薦糖的制剂)表现出相对差的稳定性。制剂Fl与F3相比，一个显著差 异在于Fl倾向于在超滤/渗滤处理期间产生比F3稍多的聚集物。因此，选择制剂F3作为最优 选制剂。
[03%]关于冻融的制剂稳定性。接下来测试制剂F3使人源化9E4抗体关于冻融稳定的能 力。为此，将人源化9E4抗体纯化并且再悬浮在制剂F3中。然后将20ml含人源化9E4的F3 W 40mg/ml填充到Sa;rto;rius Stedim Flexboy 30ml袋中，并且将袋在-40°C冰冻。每个袋进行 最多5次冻/融循环。在冰冻前和1、3和5次冻/融循环后对制剂F3中的人源化9E4抗体进行分 析检验。在至多=次冻-融循环后，未检测到显著变化。在五次冻-融循环后，检测到聚集抗 体的水平显著增加(0.2%)并且观察到HIC和iCE图像的小的变化。虽有其他分析结果，包括 对颜色和可见颗粒的视觉检查、澄清度、UV扫描、HP-SEC、摩尔渗透压浓度、pH、显微可见颗 粒数目和抗体活性，在五次冻-融循环后没有变化。
[0327]可W对本文进行多种形式和细节的改变而不脱离本发明的精神和范围。除非从上 下文明显地，否则任何实施方案、方面、要素、特征、步骤等可W与任何其他结合使用。与引 用相关的信息可能随时间改变，与最早有效申请日的引用相关信息是指，引用的最早有效 申请日意味着本申请的申请日或者最早优先权申请公开了引用。为了所有目的，本说明书 主体中引用的所有参考文献、颁布的专利和专利申请通过引用全部并入在此。任何实施方 案、方面、特征、要素、步骤等可W与任何其他的组合，除非上下文另外明确指出。当记载了 组合物包含某些指定的成分时，除非上下文另外要求，否则本申请应被解释为在替选方案 中公开了可能由或基本上由指定成分组成的组合物。例如，当记载抗体链具有包含指定SEQ ID NO.的氨基酸序列时，应该理解的是，除非上下文另外要求，否则替选地抗体可W由或基 本上由沈Q ID NO.组成。
【主权项】
1. 一种药物制剂，其包含： (a) 抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的嵌合、镶饰或人源化形式或者与9E4特异性竞争 与抗原结合的其片段，其中所述抗体以约1Omg/mL至约50mg/mL范围内的浓度存在； (b) 以约10mM至约30mM范围内的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂或琥珀酸盐缓冲剂； (c) 一种或更多种糖和多元醇（"糖/多元醇"），其选自： (i)以约220mM至约260mM范围内的浓度存在的海藻糖， (ii)以约220mM至约260mM范围内的浓度存在的蔗糖， (iii)以及以约20mM至约40mM范围内的浓度存在的蔗糖和以约约200mM至约220mM范围 内的浓度存在的甘露醇的混合物；以及 (d) 以按重量计约0.005 %至约0.05 %范围内的浓度存在的聚山梨醇酯20; 其中所述制剂的特征在于pH在约5.5至约7的范围内。2. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体是抗体9E4的人源化形式。3. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体包括轻链可变区，所述轻链可变区具有包 含SEQIDNO:5的氨基酸序列。4. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体包括重链可变区，所述重链可变区具有包 含SEQIDNO: 10的氨基酸序列。5. 根据权利要求2所述的制剂，其中所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链 可变区具有包含SEQIDNO: 3-5中的任一个的氨基酸序列，所述重链可变区具有包含SEQ IDNO:8-10中的任一个的氨基酸序列。6. 根据权利要求2所述的制剂，其中所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQ IDNO: 5的氨基酸序列，所述重链具有包含SEQIDNO: 10的氨基酸序列。7. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链 可变区包含SEQIDN0:4的三个KabatCDR，所述重链可变区包含SEQIDN0:ll的三个 RabatCDR〇8. 根据权利要求1所述的制剂，其中所述抗体以约40mg/mL的浓度存在。9. 根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其中所述缓冲剂是以约20mM的浓度存在的 柠檬酸盐缓冲剂。10. 根据权利要求9所述的制剂，其中pH为约6.0。11. 根据权利要求9所述的制剂，其中所述柠檬酸盐缓冲剂包含柠檬酸钠二水合物和柠 檬酸一水合物。12. 根据权利要求11所述的制剂，其中所述柠檬酸钠二水合物以约15mM至约20mM范围 内的浓度存在，并且所述柠檬酸一水合物以约2mM至约6mM范围内的浓度存在。13. 根据权利要求1至8中任一项所述的制剂，其中所述缓冲剂是琥珀酸盐缓冲剂并且 以约20mM的浓度存在。14. 根据权利要求13所述的制剂，其中pH为约6.5。15. 根据权利要求1至14中任一项所述的制剂，其中所述糖/多元醇是以约230mM的浓度 存在的海藻糖。16. 根据权利要求1至14中任一项所述的制剂，其中所述糖/多元醇是以约28mM的浓度 存在的蔗糖和以约212mM的浓度存在的甘露醇的混合物。17. 根据权利要求1至16或60中任一项所述的制剂，其特征在于摩尔渗透压浓度为约 335mOsm/kg〇18. 根据权利要求1至17或60中任一项所述的制剂，其中小于约10%的所述抗体在所述 制剂中以聚集物存在。19. 根据权利要求1至18、60或64中任一项所述的制剂，其还包含填充剂。20. 根据权利要求1至19、60或64中任一项所述的制剂，其为无菌的。21. 根据权利要求1至20、60或64中任一项所述的制剂，其在冻融后是稳定的。22. 根据权利要求1至20、60或64中任一项所述的制剂，其中在38-42°C下储存至少30 天，在20-24°C下储存至少一年和/或在2-4°C下储存至少三年后，至少80 %的蛋白质在高效 尺寸排阻色谱中表现为单峰。23. 根据权利要求1至20、60或64中任一项所述的制剂，其在38-42°C下储存至少30天， 在20-24°C下储存至少一年和/或在2-4°C下储存至少三年后在高效尺寸排阻色谱上具有不 超过15%的聚集蛋白质。24. 根据权利要求1所述的制剂，其中： (a) 所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列，所述重 链具有包含SEQIDN0:32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，并且所述抗体以约 40mg/mL的浓度存在； (b) 以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂； (c) 以约230mM的浓度存在的海藻糖； (d) 以约0.02%的浓度存在的聚山梨醇酯20;以及 (e) 约 6.0 的pH。25. -种抗体的冻干制剂，其包含 (a) 抗体9E4(ATCC目录号PTA-8221)的人源化形式或者其抗原结合片段； (b) 柠檬酸盐； (c) 海藻糖;和 (d) 聚山梨醇酯20。26. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其中其通过添加水重构成pH在约5.5至约6.5之 间的制剂。27. 根据权利要求26所述的冻干制剂，其中所述制剂在重构时pH为约6.0。28. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其包含约10mg至约40mg的所述抗体。29. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其中所述聚山梨醇酯20以按重量计约0.01%至 约0.05 %范围内的量存在。30. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其可通过添加水重构成水溶液，所述水溶液包 括： (a) 抗体，所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列， 所述重链具有包含SEQIDNO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，并且所述抗 体以约40mg/mL的浓度存在。 (b) 以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂； (c) 以约230mM的浓度存在的海藻糖； (d) 以约0.02%的浓度存在的聚山梨醇酯20;以及 (e) 约 6.0 的pH。31. 根据权利要求30所述的冻干制剂，其中所述冻干制剂包含约200mg的所述抗体并且 能够用无菌水重构。32. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其包含： (a) 200mg的所述抗体； (b) 25mg柠檬酸钠二水合物； (c) 2.15mg梓檬酸一水合物； (d) 435mg海藻糖二水合物;和 (e)lmg聚山梨醇酯20。33. -种治疗性或预防性治疗患有共核蛋白病或者具有患共核蛋白病的风险的人患者 的方法，所述方法包括向所述患者施用有效剂量的根据权利要求1_24、60或64中任一项所 述的制剂。34. 根据权利要求33所述的方法，其中将所述制剂加入到用于向患者静脉内施用的袋 中。35. 根据权利要求33所述的方法，其中所述人患者被诊断患有帕金森氏病。36. 根据权利要求35所述的方法，其中还用左旋多巴、benzaseride、卡比多巴、儿茶酸-〇-甲基转移酶（"COMT"）抑制剂、非麦角多巴胺激动剂、单胺氧化酶（"MAO"）抑制剂和金刚烷 胺中的一种或更多种来治疗所述患者。37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述⑶MT抑制剂是安他可朋或tolcopone，并且 所述ΜΑ0抑制剂是雷沙吉兰。38. 根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中以多剂量施用所述制剂。39. 根据权利要求38所述的方法，其中以约每日一次至约每年一次范围内的频率施用 所述制剂。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述频率在约每隔一周一次至约每三个月一次 的范围内。41. 根据权利要求39所述的方法，其中所述频率为约每四周一次。42. 根据权利要求33-41中任一项所述的方法，其中以约0 .lmg/kg至约50mg/kg人源化 9E4药物物质的范围内的剂量施用所述制剂。43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约0.3mg/kg人源化9E44药物物质。44. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约lmg/kg人源化9E4药物物质。45. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约3mg/kg人源化9E4药物物质。46. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约10mg/kg人源化9E4药物物质。47. 根据权利要求42所述的方法，其中所述剂量为约30mg/kg人源化9E4药物物质。48. 一种药物产品，其包括： (a)小瓶，所述小瓶包含粉末形式的以下物质： (i)约200mg抗体； (ii)约25mg脱水柠檬酸钠； (iii)约2 · 15mg柠檬酸一水合物； (iv)约435mg脱水海藻糖;和 (v)约lmg聚山梨醇酯20; (b) 用于重构所述抗体的说明；和 (c) 用于制备输注用重构抗体的说明， 其中： (i) 所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列，所述重 链具有包含SEQIDNO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸；以及 (ii) 所述重构说明需要初始用水重构到约5mL的体积。49. 一种纯化CH0细胞表达的人源化、镶饰或嵌合9E4抗体的方法，其包括： (a) 进行蛋白质-A固相色谱，其中所述9E4抗体相对于杂质优先与所述固相结合； (b) 进行阴离子交换固相色谱，其中所述9E4抗体相对于杂质优先从所述固相洗脱； (c) 进行阳离子交换固相色谱，其中所述9E4抗体相对于杂质优先与所述固相结合； (d) 进行病毒灭活和/或消除步骤； (c) 进行过滤步骤；以及 (d) 进行浓缩和再悬浮步骤。50. 根据权利要求49所述的方法，其中按顺序进行所述蛋白质-A、阴离子交换和阳离子 交换步骤。51. 根据权利要求50所述的方法，其中在步骤(a)和(b)之间进行病毒灭活步骤并且在 步骤(c)之后进行病毒消除步骤。52. 根据权利要求51所述的方法，其中在所述病毒灭活步骤和所述阴离子交换步骤之 间以及在所述阳离子交换步骤之后进行过滤步骤。53. -种纯化CH0细胞表达的人源化、镶饰或嵌合9E4抗体的方法，其包括： (a) 将表达所述9E4抗体的细胞的培养基加样到蛋白质A柱上，其中人源化9E4抗体与所 述柱结合，以及降低pH以洗脱包含所述9E4抗体的级分； (b) 在酸性条件下孵育来自步骤(a)的所述级分以将病毒灭活； (c) 对步骤(b)后的所述级分进行深层过滤以减少颗粒； (d) 对步骤(c)获得的含有所述9E4抗体的滤液进行阴离子交换固相色谱，其中所述级 分中的杂质与柱结合，并且所述9E4抗体从所述柱上洗脱； (e) 对来自步骤(d)的含有所述9E4抗体的级分进行阳离子交换固相色谱，其中所述9E4 抗体与柱结合并且通过升高盐浓度来洗脱； (f) 对来自步骤(e)的含有所述9E4抗体的级分进行病毒过滤；以及 (g)对来自步骤(f)的含有所述9E4抗体的级分进行超滤/渗滤以浓缩并且再悬浮所述 9E4抗体。54. 根据权利要求53所述的方法，其中阴离子交换柱是Q-琼脂糖快速流动树脂。55. 根据权利要求53所述的方法，其中在步骤(a)中将pH从6-8降低到2.5-3.556. 根据权利要求53所述的方法，其中在pH3.5下进行步骤(b)。57. 根据权利要求53所述的方法，其中步骤(f)的过滤器是0.1微米过滤器。58. 根据权利要求1所述的制剂，其中： (a)所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列，所述重 链具有包含SEQIDN0:31的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，并且所述抗体以约 40mg/mL的浓度存在； (b) 以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂； (c) 以约230mM的浓度存在的海藻糖； (d) 以约0.02%的浓度存在的聚山梨醇酯20;以及 (e) 约 6.0 的pH。59. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其通过添加水重构成水溶液，所述水溶液包含： (a) 抗体，所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列， 所述重链具有包含SEQIDNO: 31的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸，并且所述抗 体以约40mg/mL的浓度存在； (b) 以约20mM的浓度存在的柠檬酸盐缓冲剂； (c) 以约230mM的浓度存在的海藻糖； (d) 以约0.02%的浓度存在的聚山梨醇酯20;以及 (e) 约 6.0 的pH。60. 根据权利要求1-16中任一项所述的制剂，其特征在于摩尔渗透压浓度为约 295m0sm/kg至约 375m0sm/kg〇61. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其包含约40mg至约1OOOmg的所述抗体。62. 根据权利要求25所述的冻干制剂，其包含： (a) 200mg的所述抗体； (b) 25mg柠檬酸钠二水合物； (c) 3.15mg梓檬酸一水合物； (d) 435mg海藻糖二水合物;和 (e)lmg聚山梨醇酯20。63. -种药物产品，其包括： (a) 小瓶，其包含粉末形式的以下物质： (i)约200mg抗体； (ii)约25mg脱水柠檬酸钠； (iii)约3.15mg梓檬酸一水合物； (iv)约435mg脱水海藻糖;和 (v)约lmg聚山梨醇酯20; (b) 用于重构所述抗体的说明；和 (c) 用于制备输注用重构抗体的说明， 其中： (i) 所述抗体包括轻链和重链，所述轻链具有包含SEQIDNO: 29的氨基酸序列，所述重 链具有包含SEQIDNO: 32的氨基酸序列，具有或不具有C-末端赖氨酸；以及 (ii) 所述重构说明需要初始用水重构到约5mL的体积。64. 根据权利要求1-17或60中任一项所述的制剂，其中小于约5%的所述抗体在所述制 剂中以聚集物存在。
【专利摘要】本发明提供了可用于预防或治疗共核蛋白病(包括帕金森氏病)的抗体制剂和方法。PTA-822120070226
【IPC分类】A61K39/39, C07K1/22, A61K45/06, C07K16/18, A61K39/00
【公开号】CN105492019
【申请号】CN201480047476
【发明人】P·加里代尔, A·兰格, M·格伦德曼
【申请人】普罗塞纳生物科学有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月3日
【公告号】CA2917097A1, EP3016677A2, US20150079074, WO2015001504A2, WO2015001504A3
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