阳离子神经毒素的制作方法
阳离子神经毒素的制作方法
【专利说明】阳离子神经毒轰
[0001] 本发明设及包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，W及运样的工程化的 梭菌毒素在医学和治疗中的用途。
[0002] 梭菌属中的细菌产生高度强大的并且特异性的蛋白毒素，它们能够毒害它们被递 送之处的神经元和其它细胞。运样的梭菌毒素的例子包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌 (BoNT)血清型A-G产生的神经毒素 W及由己氏梭菌和下酸梭菌产生的那些神经毒素。
[0003] 在所述的梭菌毒素中有一些是已知最强大的毒素。例如，肉毒杆菌神经毒素对于 小鼠的半数致死剂量化化0)值范围从0.5到5ng/kg，取决于血清型。破伤风梭菌毒素和肉毒 杆菌毒素两者都通过抑制受影响的神经元的功能(特别是神经递质的释放)而起作用。虽然 肉毒杆菌毒素在神经肌肉连接处起作用并且抑制周围神经系统中胆碱能的传导，但是破伤 风梭菌毒素却在中央神经系统中起作用。
[0004] 在自然界，梭菌毒素是W单链多肤形式被合成的，通过一种蛋白酶解切割事件对 该多肤进行翻译后的修饰而形成通过二硫键连接在一起的两条多肤链。切割发生在特异性 的切割位点（常常被称为活化位点）处，即位于提供链间二硫键的半脫氨酸残基之间。正是 运种二链形式成为了所述毒素的活性形式。运两条链被称为重链化-链）（具有大约l〇〇W)a 的分子量)和轻链化-链）（具有大约50kDa的分子量）。所述的H-链包含N-末端易位元件化N 结构域)和C-末端祀向元件化e结构域）。所述的切割位点位于所述的k链和所述的易位结 构域元件之间。在所述也结构域与它的祀标神经元结合W及所结合的毒素经由内体内化到 细胞中W后，所述的化结构域使所述的k链易位跨越内体膜并且进入胞质溶胶中，并且所 述的心链提供一种蛋白酶功能(也被称为一种无细胞毒性的蛋白酶）。
[000引无细胞毒性的蛋白酶通过蛋白酶解切割被称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白（例 如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白）而起作用-参见Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology"(第4版)John Wil巧& Sons, Inc。首字母缩略词SNARE源于术语可溶性的NSF连接 受体，其中NSF意指N-乙基马来酷亚胺-敏感因子。SNARE蛋白是细胞内的小泡融合体所必需 的，因此是经由小泡转运的来自细胞的分子分泌所必需的。所述的蛋白酶功能是一种锋依 赖性的内肤酶活性并且展示对SNARE蛋白的高度底物特异性。因此，一旦被递送到所要的祀 细胞，所述的无细胞毒性的蛋白酶能够抑制来自所述祀细胞的细胞分泌。梭菌毒素的所述 心链蛋白酶是切割SNARE蛋白的无细胞毒性的蛋白酶。
[0006] 鉴于SNARE蛋白的遍在本性，梭菌毒素例如肉毒杆菌毒素已经被成功地应用在广 泛的治疗中。
[0007] 举例来说，我们参考William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack, Inc. ,2004)，它描述了梭菌毒素，例如肉毒杆菌神经毒素 (BoNTs)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Ci、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G W 及破伤风神经毒素 (TeNT)的用途，用于在广泛种类的治疗和化妆应用中抑制神经元传导-例如，BOTOX?目前被 批准作为下列适应症的治疗剂:弛缓不能、成年人疫李、肛裂、背痛、眼险疫李、夜磨牙症、颈 肌张力障碍、特发性震颤、眉间线或运动机能亢奋的面线、头疼、半面疫李、膀脫活动过度、 多汗症、青少年大脑性擁痕、多发性硬化症、肌阵李症、鼻唇线、疫李性发声困难、斜视和第 屯神经障碍。另外，描述了梭菌毒素治疗用于治疗神经肌肉病症(参见US 6,872,397);用于 治疗子宫病症（参见US 2004/0175399);用于治疗溃瘍和胃食管反流病（参见US 2004/ 0086531);用于治疗张力失常（参见US 6,319,505);用于治疗眼病（参见US 2004/ 0234532);用于治疗眼险疫李（参见US 2004/0151740);用于治疗斜视（参见US 2004/ 0126396);用于治疗疼痛（参见 US 6,869,610，US 6,641，820、US 6,464,986 和 US 6,113， 915);用于治疗纤维肌痛(参见US 6，623，742、US 2004/0062776);用于治疗下背痛(参见US 2004/0037852);用于治疗肌肉损伤（参见US 6，423,319);用于治疗窦性头疼（参见US 6， 838，434);用于治疗紧张性头疼(参见US 6，776，992);用于治疗头疼(参见US 6，458，365); 用于减少偏头疼性疼痛(参见US 5,714,469);用于治疗屯、血管疾病（参见US 6,767,544); 用于治疗神经性病症例如帕金森氏病（参见US 6，620，415、US 6,306,403);用于治疗神经 精神病(参见US 2004/018006UUS 2003/0211121);用于治疗内分泌素乱(参见US 6,827， 931);用于治疗甲状腺疾病(参见US 6，740，321);用于治疗胆碱能影响的汗腺疾病(参见US 6，683，049);用于治疗糖尿病(参见US 6，337，075、US 6，416，765);用于治疗一种膜腺疾病 (参见 US 6,261，572、US 6,143,306);用于治疗癌症例如骨瘤（参见 US 6,565,870、US 6， 368,605、US 6，139,845、US 2005/0031648);用于治疗耳病（参见 US 6,358,926、US 6,265， 379);用于治疗自主性疾病例如胃肠肌肉疾病和其它平滑肌机能失常（参见US 5，437， 291);用于与皮肤细胞增生性疾病相关的皮肤损伤的治疗(参见US 5,670,484);用于控制 神经原性炎性病症（参见US 6，063，768);用于减少脱发和刺激毛发生长(参见US 6，299， 893);用于治疗嘴角朝下（参见US 6，358，917);用于减少食欲(参见US 2004/40253274);用 于牙齿的治疗和牙科手术(参见US 2004/0115139);用于治疗神经肌肉疾病和状况(参见US 2002/0010138);用于治疗多种疾病和状况W及相关的疼痛(参见US 2004/0013692);用于 治疗由粘液分泌过多引起的状况例如哮喘和COPD(参见WO 00/10598); W及用于治疗非神 经元状况例如炎症、内分泌状况、外分泌状况、免疫状况、屯、血管状况、骨状况(参见WO 01/ 21213)。在此通过引用将所有上述出版物整体并入。
[0008] 预期无细胞毒性的蛋白酶例如梭菌毒素（例如BoNT和TeNT)在治疗性和化妆性治 疗人和其它哺乳动物中的用途将要扩大到范围日益宽广的能够受益于运些毒素性质的疾 病和不适。
[0009] 为了避免系统性的神经效果，许多梭菌毒素治疗利用向给定的祀位点（例如一种 祀组织)直接施用所述的梭菌毒素治疗剂。当W运种方式施用基于梭菌毒素的治疗剂时的 一个问题是毒素远离所述的施用位点而进入周围组织或系统性循环的传播。毒素远离祀组 织的扩散被认为对不受欢迎的副作用负责，运些副作用在极端情况下可能会是威胁生命 的。当W高的剂量、浓度和注射体积使用梭菌毒素治疗剂(例如BoNT治疗剂)时，运可能是一 个特别的关注。对于商业化的BoNT/A治疗剂，已经报道的与运个问题相关的副作用包括:无 力、广泛性肌肉虚弱、复视、下垂、吞咽困难、发声困难、构音困难、尿失禁和呼吸困难。吞咽 和呼吸困难可能是威胁生命的并且已经报道了与毒素效应的传播相关的死亡。
[0010] 因此，在本领域中存在对运样的梭菌毒素的需要:与已知的梭菌毒素相比，它在施 用位点具有增大的组织保留性质并且因此展示远离施用位点的扩散的减少。
[0011] 本发明通过提供工程化的梭菌毒素解决了上述问题，正如权利要求书中具体说明 的那样。
[0012] 在一个方面中，本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，其中 所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个值，该值比 缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.2个(例如至少 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1个)91单位。在一个实施方式中，所述的至少一个氨 基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸 修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.4个Pl单位。在一个实施方式中，所述的至少 一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个 氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.5个Pl单位。在一个实施方式中，所述 的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至 少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.6个Pl单位。在一个实施方式 中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏 所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.8个Pl单位。在一个实 施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值 比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单位。
[0013] 在一个方面中，本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，其中 所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个值，该值比 缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单位。
[0014] 在某些实施方式中，所述工程化的梭菌毒素包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 氨基酸修饰。
[0015] 在某些实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增 大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至 少2、3、4或5个Pl单位。
[0016] 本发明人已经发现，通过增大梭菌毒素的Pl，例如增大至少0.2个Pl单位或0.5个 Pl单位或1个Pl单位(通过向所述的梭菌毒素蛋白中引入至少一个氨基酸修饰），所得的工 程化的梭菌毒素有利地显示了增大的组织保留性质和减少的远离施用位点的扩散，同时保 留了祀细胞结合、易位W及祀SNARE蛋白切割的能力。因此，与缺乏所述的至少一个氨基酸 修饰、其它方面相同的梭菌毒素相比，所述的来自施用位点的梭菌毒素的传播被显著地减 少了。
[0017] 本发明所述的工程化的梭菌毒素适用于任何上述的治疗，并且与使用已知的梭菌 毒素治疗剂相比，可W有利地显示副作用的减少或不存在。
[0018] 本发明所述的工程化的梭菌毒素的增大的组织保留性质还提供增大的作用效力 和/或持续时间，并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比，能够允许使用减少的剂量(或增大的 剂量而没有任何额外的副作用），从而提供了更多的优点。
[0019] 正如下面更详细地论述的那样，由所述的至少一个氨基酸修饰所提供的Pl的增大 意思是本发明的工程化的梭菌毒素在给定的抑下具有净电荷，该净电荷比缺乏所述的至少 一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素上的净电荷更正。不希望受任何一种理论限制， 本发明人相信，运种增大的正电荷允许本发明所述的工程化的梭菌毒素在施用位点处展示 更长的组织保留时间，运归因于在施用位点处，在所述工程化的梭菌毒素与阴离子细胞外 组分(例如细胞膜和硫酸肝素蛋白聚糖)之间有利的静电相互作用。运些改善的静电相互作 用用于减少所述工程化的梭菌毒素远离所述施用位点的扩散，从而改善组织保留。
[0020] 举例来说，本发明所述的工程化的梭菌毒素的改善的组织保留性质可W允许（i) 更高的剂量进入个别的肌肉，例如胸锁乳突肌，不会传播到附近的颈部肌肉中而引起吞咽 困难，W及（ii)在单次治疗中更高的总剂量(对于所有的肌肉），不会传播到所述的循环中 而引起系统性的效应例如呼吸困难。对于患者的益处可W包括对大肌肉（例如所述的胸锁 乳突肌)的更有效的治疗，增大的在每次治疗期间注射几块不同的肌肉的机会，W及由于更 高的定量给药而导致的可能更长的有效治疗持续时间(再次治疗之前更长的持续时间是必 要的）。
[0021] 在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素在使用中具有正的净电荷(例如 当所述工程化的梭菌毒素在使用中位于组织中的所要施用位点时）。
[0022] 等电点（Pl)是一种给定的蛋白质的特性。正如本领域中熟知的那样，蛋白质是由 特定的氨基酸（当在一种蛋白质中时，也被称为氨基酸残基)序列制成的。20种氨基酸的标 准集合中的每一种氨基酸都具有不同的侧链(或R基团），意味着在一种蛋白质中，每一种氨 基酸残基显示不同的化学性质例如电荷和疏水性。运些性质可W受周围化学环境(例如溫 度和抑)的影响。一种蛋白质的总的化学特征将会取决于运些多种因素的总和。
[0023] 某些氨基酸残基（下面详述)具有能够电离的侧链，该侧链可能显示电荷，取决于 周围的抑。在给定的抑下，运样的侧链是否带电取决于相关的能够电离的部分的地a,其中 PKa是所述酸的一个指定质子从一个共辆碱分离的解离常数化a)的负对数。
[0024] 例如酸性的残基例如天冬氨酸和谷氨酸具有地a值大约为4.1(精确的地a值可能 取决于溫度、离子强度和所述能够电离的基团的微环境）的侧链簇酸基团。因此，运些侧链 在7.4的pH下(经常被称为"生理抑")展示负的电荷。在低抑值下，运些侧链将会变成质子化 的并且失去它们的电荷。
[0025] 相反地，碱性的残基例如赖氨酸和精氨酸具有地a值大约为10-12的含氮的侧链基 团。运些侧链因此在7.4的抑下展示正的电荷。在高pH值下，运些侧链将会变成去质子化的 并且失去它们的电荷。
[0026] 因此，蛋白质分子的总的（净）电荷取决于存在于所述蛋白质中的酸性残基和碱性 残基的数目（W及它们的表面暴露程度)和环境的pH。改变环境的pH，就改变了所述蛋白质 上的总的电荷。因此，对于每一种蛋白质，存在着一个给定的抑，在该pH下正电荷和负电荷 的数目是相等的并且所述蛋白质显示总体上无净电荷。已知运个点与等电点（Pl)-样。等 电点是蛋白质生物化学中的一个标准的概念，技术人员将会对它很熟悉。
[0027] 因此，等电点(Pl)被定义为一种蛋白质显示零净电荷时的抑值。Pl的增大意味着 所述蛋白质展示零净电荷需要更高的pH值。因此，Pl的增大表示在给定的抑下，一种蛋白质 的净正电荷的增大。相反地，Pl的减小意味着所述蛋白质展示零净电荷需要更低的pH值。因 此，PI的减小表示在给定的抑下，一种蛋白质的净正电荷的减小。
[0028] 在本领域中测定一种蛋白质的Pl的方法是已知的并且对于技术人员来说将会是 熟悉的。举例来说，从存在于所述蛋白质中的每一种氨基酸的平均地a值能够把蛋白质的Pl 计算出来。备选地，使用等电点聚焦技术能够把一种蛋白质的Pl实验测定出来。运种技术根 据蛋白质的Pl使用电泳来分离它们。典型地使用一种具有固定化pH梯度的凝胶来进行等电 点聚焦。当应用电场时，所述蛋白质迁移穿过所述的抑梯度，直到它达到它具有零净电荷时 的抑，运个点就是所述蛋白质的PI。
[0029] 通过改变显示在蛋白质表面上的碱性基团和/或酸性基团的数目，可W增大或减 小一种蛋白质的pl。运能够通过修饰所述蛋白质的一个或更多个氨基酸来实现。例如可W 通过减少酸性残基的数目或通过增大碱性残基的数目来提供Pl的增大。下面更详细地讨论 运样的氨基酸修饰。
[0030] 天然(未修饰的)梭菌毒素具有大约5-6的pi。因此，在7.4的抑下，天然肉毒杆菌毒 素具有负净电荷。举例来说，BoNT/A的Pl是6.4，并且BoNT/A分子在7.4的抑下具有-8的净电 荷。如上所述计算出了运些Pl值。
[0031] 表1:
[0033] 如上所述，在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸 修饰，其中所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个 值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.2个Pl 单位。
[0034] 因此，在本发明的上下文中，Pl增大0.2个单位在工程化的BoNT/A梭菌毒素的上下 文中将会是Pl从6.4增大到6.6。
[0035] 如上所述，在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸 修饰，其中所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个 值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单 位。
[0036] 因此，在本发明的上下文中，Pl增大1个单位在工程化的BoNT/A梭菌毒素的上下文 中将会是Pl从6.4增大到7.4。
[0037] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电 点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素 的Pl高至少2个Pl单位。
[0038] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电 点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素 的Pl高2至5个Pl单位。
[0039] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有至少为6(例如至少6、至少7、至少 8或至少9)的pi。
[0040] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有至少为7的pi。
[0041] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有6至10的Pl(例如7至9的Pl或8至9 的 pl)。
[0042] 如上所述，本发明的所述工程化的梭菌毒素具有增大的组织保留性质，该性质也 提供增大的效力和/或作用持续时间，并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比能够允许减少使 用的剂量(或者允许增大的剂量而没有任何额外的效应）。其中可W定义运些有利的性质 (它们代表治疗指数的增大）的一种方式是根据所述工程化的梭菌毒素的安全比。在运个方 面，通过测量一种相关的动物模型中体重减少的百分数(例如一种小鼠，其中体重减少是在 7天的施用内检测的），能够从实验上估计梭菌毒素的不受欢迎的效应（由所述毒素远离所 述施用位点的扩散引起的）。相反地，通过趾外展评分(DAS)分析一一一种肌肉擁痕量度，能 够从实验上估计梭菌毒素的理想的中祀效应。可W通过把20化配制在明胶憐酸缓冲液中的 梭菌毒素注射到小鼠脾肠肌/比目鱼肌复合体中，然后通过使用Aoki的方法估计趾外展评 分(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820:2001)来进行所述的DAS分析。在所述的DAS分析中，通 过尾部短暂地悬挂小鼠 W便引出一种特征性的吃惊反应，其中所述的小鼠伸展它的后肢并 且外展它的后趾。在注射梭菌毒素后，按照五点评分尺度(0 =正常至4 =趾外展和腿伸展减 少最大)对不同程度的趾外展进行打分。
[0043] 然后可W把一种梭菌毒素的安全比表示成在体重下降10%所需的毒素的量(在小 鼠中定量给药后第一个7天内在峰值效应下测得的）与DAS得分为2所需的毒素的量之间的 比率。因此，高安全比得分是理想的，并且指示一种能够有效地使一种祀肌肉擁痕并且具有 微小的不希望的脱祀效应的毒素。本发明的工程化的毒素具有的安全比高于对等的未修饰 的(天然）肉毒杆菌毒素具有的安全比。
[0044] 因此在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为8(例如至少8、9、 10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比，其中安全比是运样计算的：体重变化-10%所需 的毒素的剂量(pg/小鼠）除WDASEDso(pg/小鼠）[抓50 =产生一个为2的DAS得分所需的剂 量]。
[004引在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为10的安全比。在一个 实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为15的安全比。
[0046] 本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸修饰。所述的至少一个氨基酸修 饰增大所述梭菌毒素的Pl，如上所述。在本发明的上下文中，一种氨基酸修饰是一种梭菌毒 素的氨基酸序列的修饰。运样的一种修饰可W通过把所述序列中的一个氨基酸替换为另一 个氨基酸（即取代）、通过把一个新的氨基酸插入所述的序列中或者通过缺失所述序列的一 个氨基酸来实施。被插入蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸也被称为氨基酸残基。
[0047] 在蛋白质中发现的20种标准氨基酸如下所示：
[004引 表2:
[0049]
[0051 ]下列氨基酸被认为是带电荷的氨基酸：天冬氨酸（负的）、谷氨酸（负的）、精氨酸 (正的）和赖氨酸(正的）。
[00划在7.4的抑下，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链具有负电荷，同时精 氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链具有正电荷。天冬氨酸和谷氨酸被称为酸性的 氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸被称为碱性的氨基酸残基。
[0053] 下列氨基酸被认为是不带电荷的极性的（意思是它们能够参与氨键结合)氨基酸： 天冬酷胺、谷氨酷胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。
[0054] 下列氨基酸被认为是不带电荷的疏水的氨基酸：丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
[0055] 通过向梭菌毒素中引入一个或更多个增大所述梭菌毒素中正电荷与负电荷的比 率的氨基酸修饰，能够实现所述的梭菌毒素的Pl的增大。
[0056] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰选自：氨基酸替换、氨基酸插入和 氨基酸缺失。
[0057] 在一种氨基酸替换中，形成所述梭菌毒素氨基酸序列的一部分的一个氨基酸残基 被一个不同的氨基酸残基所替代。所述的替代氨基酸残基可W是如上所述的20种标准氨基 酸中的一种。
[0058] 备选地，在一种氨基酸替换中，所述的替代氨基酸可W是一种非标准氨基酸(不是 上述20种氨基酸的标准组的一部分的一种氨基酸）。举例来说，所述的替代氨基酸可W是一 种碱性的非标准氨基酸，例如心鸟氨酸、L-2-氨基-3-脈基丙酸或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸 的D-异构体）。把非标准氨基酸引入蛋白质中的方法是本领域中已知的，并且包括使用大肠 杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。
[0059] 在一种氨基酸插入中，把另外一个氨基酸残基(正常不存在的一个氨基酸)渗入所 述的梭菌毒素的氨基酸序列中，从而增大了所述的序列中氨基酸残基的总 数。在一种氨基 酸缺失中，从所述的梭菌毒素氨基酸序列中除去一个氨基酸残基，从而减少了所述的序列 中氨基酸残基的总数。
[0060] 通过替换、插入或缺失氨基酸残基来修饰蛋白质的方法是本领域中已知的。举例 来说，可W通过对编码梭菌毒素的DNA序列的修饰来引入氨基酸修饰。运能够使用标准的分 子克隆技术来实现，例如通过定点诱变，其中采用一种聚合酶，使用为所要的氨基酸编码的 DNA的短链(寡核巧酸)来替代原编码序列，或者通过采用多种酶(例如连接酶和限制内切核 酸酶)插入/缺失所述基因的部分。备选地，能够化学合成修饰的基因序列。
[0061] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰选自：酸性的氨基酸残基被碱性 的氨基酸残基替代;酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代;不带电荷的氨基酸 残基被碱性的氨基酸残基替代;插入碱性的氨基酸残基；W及缺失酸性的氨基酸残基。
[0062] 在一种优选的实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰是替换，该替换有利地保 持所述梭菌毒素中氨基酸残基数相同。在一个实施方式中，所述的替换选自：酸性的氨基酸 残基被碱性的氨基酸残基替代、酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代W及不带 电荷的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代。在一个实施方式中，所述的碱性氨基酸残基 是赖氨酸残基或精氨酸残基。在一个实施方式中，所述的碱性氨基酸残基是赖氨酸残基。在 一个实施方式中，所述的碱性的氨基酸残基是精氨酸残基。在一个实施方式中，其中所述的 替换是酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代，所述的酸性的氨基酸残基被它的 相应的不带电荷的酷胺氨基酸残基替代（即天冬氨酸被天冬酷胺替代，W及谷氨酸被谷氨 酷胺替代）。
[0063] 本发明的工程化的梭菌毒素可W包含多于一个的氨基酸修饰。因此，在一个实施 方式中，所述工程化的梭菌毒素（如上所述)包含1至80个氨基酸修饰(例如1至70个、1至60 个、1至50个、4至40个、4至30个、5至40个、5至30个或10至25个氨基酸修饰）。在一个实施方 式中，所述工程化的梭菌毒素（如上所述)包含4至40个氨基酸修饰。在一个实施方式中，所 述工程化的梭菌毒素包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个氨基酸修饰。在 一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素包含至少4个氨基酸修饰(例如至少4个氨基酸替 换）。每一个所述的氨基酸修饰是如上所述的一个氨基酸修饰。因此，每一个所述的氨基酸 修饰都有助于所述工程化的梭菌毒素的Pl的增大(与缺乏所述的氨基酸修饰而其它方面相 同的梭菌毒素的Pl相比）。
[0064] 如上所述，任何梭菌毒素的氨基酸（即氨基酸残基)都能够被修饰，只要所述的修 饰的结果是增大所述梭菌毒素的Pl(如上所述）。然而，本发明人已经鉴定了特别适合用于 修饰的祀的梭菌毒素氨基酸的亚组。
[0065] 优选的祀氨基酸可W具有某些品质。举例来说，优选的祀氨基酸可W :(i)是表面 暴露的氨基酸；（ii)位于梭菌毒素蛋白二级结构的外面；（iii)位于梭菌毒素蛋白的区域 中，该区域不是蛋白质功能所必需的；（iv)是其同一性在梭菌毒素的类型、亚型或血清型之 间没有被保留的氨基酸；（iv)是其修饰没有产生预期的泛蛋白化位点的氨基酸;或(V)是前 述的任意组合。
[0066] 如上所述，梭菌毒素是由两条多肤链一具有大约IOOkDa的分子量的重链化-链)和 具有大约SOkDa的分子量的轻链化-链)形成的。所述的H-链包含C-末端祀向元件(受体结合 结构域或化结构域)和N-末端易位元件化N结构域）。
[0067] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)位于所述梭菌毒素受 体结合结构域化C结构域）中。
[0068] 轻链参考序列的例子包括：
[0069] 肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基1-448
[0070] 肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基1-440 [0071 ]肉毒杆菌Cl型神经毒素:氨基酸残基1-441
[0072] 肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基1-445
[0073] 肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基1-422
[0074] 肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基1-439
[0075] 肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基1-441
[0076] 破伤风神经毒素:氨基酸残基1-457
[oow]应当把上面鉴定的参考序列看作是一个指南，根据亚血清型（的不同），可W存在 轻微的变化。举例来说，US 2007/0166332(在此通过引用将其全文引入）引述了稍微不同的 梭菌序列：
[0078] 肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基Ml-K448
[0079] 肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基M1-K441
[0080] 肉毒杆菌Cl型神经毒素:氨基酸残基M1-K449
[0081 ]肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基Ml-R445
[0082] 肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基M1-R422
[0083] 肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基M1-K439
[0084] 肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基M1-K446 [00化]破伤风神经毒素:氨基酸残基M1-A457
[0086] 梭菌毒素出结构域参考序列的例子包括：
[0087] BONT/A-N872-L1296 [008引 BONT/B-E859-E1291
[0089] BoNT/C 广 N867-E1291
[0090] BONT/D-S863-E1276
[0091] BONT/E-R846-K1252
[0092] BONT/F-K865-E1274
[0093] BONT/G-N864-E1297
[0094] l'eNT-I880-D1315
[0095] 所述的梭菌毒素（例如BoNT)的H。结构域包含两个不同的结构特征，它们被称为 Hcc和出N结构域。在受体结合中所设及的氨基酸残基被认为主要位于所述的Hcc结构域中。
[0096] 在一个实施方式中，其中所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)位于所述梭菌毒 素受体结合结构域化C结构域）中，所述的至少一个氨基酸修饰位于所述梭菌毒素出N结构域 (也被称为一种便于易位的结构域）中。在一个实施方式中，其中所述的至少一个氨基酸修 饰(如上所述)位于所述梭菌毒素受体结合结构域化C结构域）中，所述的至少一个氨基酸修 饰位于所述梭菌毒素 H CC结构域中。
[0097] 梭菌毒素出N结构域参考序列的例子包括：
[0098] 肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基872-1110
[0099] 肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基859-1097
[0100] 肉毒杆菌Cl型神经毒素:氨基酸残基867-1111 [0101 ]肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基863-1098
[0102] 肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基846-1085
[0103] 肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基865-1105
[0104] 肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基864-1105
[0105] 破伤风神经毒素:氨基酸残基880-1127
[0106] 上述序列的位置可W根据血清型/亚型而稍微变化，并且合适的（参考)梭菌毒素 Hcn结构域的另外的例子包括：
[0107] 肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基874-1110
[0108] 肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基861-1097
[0109] 肉毒杆菌Cl型神经毒素:氨基酸残基869-1111
[0110] 肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基865-1098
[0111] 肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基848-1085
[0112] 肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基867-1105
[0113] 肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基866-1105
[0114] 破伤风神经毒素:氨基酸残基882-1127
[0115] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)是表面暴露的氨基酸 残基的修饰。表面暴露的氨基酸残基是存在于折叠的蛋白质的外部上的那些氨基酸，并且 因此易于接近周围溶剂，与位于所述的折叠的蛋白质内部中的那些氨基酸残基相反。一种 氨基酸残基的表面暴露程度W及因此它暴露于周围溶剂的程度取决于它在所述折叠的蛋 白质中的位置，也取决于所述蛋白质采用的构象。因此，与具有低表面暴露程度的氨基酸残 基的修饰相比，具有高表面暴露程度的氨基酸残基的修饰可能对所述蛋白质的等电点具有 更大的影响。测定氨基酸残基的表面暴露程度的方法是本领域中已知的。举例来说，能够使 用计算机程序ArealMol (CCP4计算机程序套件的一部分)来计算一种给定的蛋白质中氨基 酸残基的表面暴露程度。也可W通过检视蛋白质晶体结构(例如由X射线晶体学提供的）来 鉴定表面暴露的氨基酸残基。在一个实施方式中，表面暴露的氨基酸残基具有至少40的总 ArealMol值。
[0116] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰包括选自下列的氨基酸残基的修 饰:天冬氨酸残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酷胺残基、谷氨 酷胺残基、半脫氨酸残基或酪氨酸残基。本发明人已经鉴定了来自运个组的氨基酸残基(带 负电荷的残基和极性的残基)代表根据本发明用于修饰的特别合适的祀。不希望受任何一 种理论限制，本发明人相信，与没有列出的疏水的残基相比，运个组中的氨基酸残基W更大 的频率出现在梭菌毒素的表面上。
[0117] 在一个实施方式中，其中所述的氨基酸修饰包括选自下列的氨基酸残基的修饰： 天冬氨酸残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酷胺残基、谷氨酷 胺残基、半脫氨酸残基或酪氨酸残基(如上所述），所述的氨基酸残基被赖氨酸残基或精氨 酸残基替代。因此，在一个实施方式中，带负电荷的残基或极性的残基被带正电荷的残基替 代，从而增大了正电荷与负电荷的比率，并且增大了所述梭菌毒素的Pl。
[011引在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)包含天冬酷胺氨基酸 残基或谷氨酷胺氨基酸残基(两者都是不带电荷的极性的残基）的修饰。在一个实施方式 中，所述的天冬酷胺或谷氨酷胺氨基酸残基被赖氨酸残基或精氨酸残基(两者都是带正电 荷的残基)替代。在一个实施方式中，所述的天冬酷胺或谷氨酷胺氨基酸残基被赖氨酸残基 替代。在一个实施方式中，所述的天冬酷胺或谷氨酷胺氨基酸残基被精氨酸残基替代。
[0119] 天冬酷胺和谷氨酷胺残基有利地适用于修饰，因为它们是极性的，只与其它残基 形成弱的偶极相互作用，并且构成典型的梭菌毒素分子(例如BoNT/A)的14%。
[0120] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A。一种参考BoNT/A序列具有 UniProtKB 检索号 P10845。
[0121] 本发明人已经鉴定了代表BoNT/A梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的祀的某些氨基 酸。
[0122] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 886、 ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、 HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086 和 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的 BoNT/A 的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个口1单 位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0123] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 886、 ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、 HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086 和 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0124] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述的工程化的BoNT/ A包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个）氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、 GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086 和化 N 1229;并且所述的氨基酸 修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、 其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述 的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨 基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基 替代。
[0125] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、GLN 995、 ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083和ASP 1086;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/ A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基 或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。 在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0126] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、 GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、 ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、沈R 1274和 T皿 1277;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的 BoNT/A 的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个口1单 位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0127] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、 GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、 ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、沈R 1274和 T皿 1277;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0128] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、 GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、 ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、沈R 1274和 T皿 1277;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的BoNT/A的Pl高至少1个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸 被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖 氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0129] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0130] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的pi高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中， 所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述 的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的 氨基酸被精氨酸残基替代。
[0131] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0132] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述 的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基 酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0133] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0134] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施 方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括 所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0135] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0136] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中， 所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述 的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的 氨基酸被精氨酸残基替代。
[0137] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一种（例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0138] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基 酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0139] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0140] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施 方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括 所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0141] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、 GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0142] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、 GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比一个缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同 的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述 的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0143] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/ A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基 或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。 在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0144] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基 酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0145] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0146] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施 方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括 所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0147] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、6或7个）氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、沈 R 1274、T皿 1277;并且所述的氨基酸修 饰把所述工程化的BoNT/A的等电点（pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其 它方面相同的BoNT/A的Pl高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个 Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0148] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、6或7个）氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、沈 R 1274、T皿 1277;并且所述的氨基酸修 饰把所述工程化的BoNT/A的等电点（pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其 它方面相同的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0149] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、6或7个）氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、沈 R 1274、T皿 1277;并且所述的氨基酸修 饰把所述工程化的BoNT/A的等电点（pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其 它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的 氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。
[0150] 在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0151] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列 8 个氨基酸的修饰：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增 大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少0.2(例如 至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所 述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨 酸残基替代。
[0152] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列 8 个氨基酸的修饰：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增 大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如 至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或I)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基 酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0153] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列 8 个氨基酸的修饰：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增 大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单 位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0154] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6或所有7个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1026、ASN 1052、HIS 1064和GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工 程化的BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同 的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖 氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸 残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0155] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或所有11个)氨基酸的修饰： ASN 886、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UASN 1026、ASN 1052、HIS 1064、ASN 1080、 ASN 1147和GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到 一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个 实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的 修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0156] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或所有13个)氨基酸的 修饰：ASN 886、ASN 905、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、HIS 1064、ASN 1080、ASN 1147和化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/ A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基 或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。 在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0157] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B。一种参考BoNT/B序列具有 UniProtKB 检索号 P10844。
[0158] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/B梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0159] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B，所述工程化的BoNT/B 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、 ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、化 U 1189、化 U 1252 和 ASN 1273;并且所述的氨基酸 修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、 其它方面相同的BoNT/B的Pl高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1) 个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基 替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0160] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B，所述工程化的BoNT/B 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、 ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、化 U 1189、化 U 1252 和 ASN 1273;并且所述的氨基酸 修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、 其它方面相同的BoNT/B的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个 实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的 修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0161] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B，所述工程化的BoNT/B 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、 ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、化 U 1189、化 U 1252 和 ASN 127 3;并且所述的氨基酸 修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、 其它方面相同的BoNT/B的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述 的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨 基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基 替代。
[0162] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/Ci。一种参考BoNT/Ci序列具有 UniProtKB 检索号 P18640。
[0163] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/Ci梭菌毒素中氨基酸修饰 的优选的祀。
[0164] 因此，在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/Ci，所述工程化的 BoNT/Ci包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个）氨基酸的修饰:ASN 88UASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、 ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 104UASP 1062、ASP 1064、GLU 1079和ASP 1081;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/Ci的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述 的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/Ci的Pl高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0165] 因此，在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/Ci，所述工程化的 BoNT/Ci包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个）氨基酸的修饰:ASN 88UASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、 ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 104UASP 1062、ASP 1064、GLU 1079和ASP 1081;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/Ci的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述 的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/Ci的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或 1)个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残 基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施 方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0166] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/Ci，所述工程化的BoNT/Ci 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN881、ASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、ASP 996、 ASN 1000、GLU 1036、ASN 1041、ASP 1062、ASP 1064、GLU 1079 和 ASP 1081;并且所述的氨 基酸修饰把所述工程化的BoNT/Ci的等电点（pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸 修饰、其它方面相同的BoNT/Ci的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所 述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨 酸残基替代。
[0167] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D。一种参考BoNT/D序列具有 UniProtKB 检索号 P19321。
[0168] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/D梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0169] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D，所述工程化的BoNT/D 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、 ASN 979、GLU 1030、ASP 103UASP 1033、化U 1047、化U 105UASN 1052、化U 1066和化N 1122;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0170] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D，所述工程化的BoNT/D 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、 ASN 979、GLU 1030、ASP 103UASP 1033、化U 1047、化U 105UASN 1052、化U 1066和化N 1122;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9或I)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或 精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0171] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D，所述工程化的BoNT/D 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、 ASN 979、GLU 1030、ASP 103UASP 1033、化U 1047、化U 105UASN 1052、化U 1066和化N 1122;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中所述的修饰包括所述的 氨基酸被精氨酸残基替代。
[0172] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E。一种参考BoNT/E序列具有 UniProtKB 检索号 Q00496。
[0173] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/E梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0174] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E，所述工程化的BoNT/E 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、 ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 98UASP 985、GLN 1014、 ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140;并且所述的氨基酸修饰把所述工程 化的BoNT/E的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/E 的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0175] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E，所述工程化的BoNT/E 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、 ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 98UASP 985、GLN 1014、 ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140;并且所述的氨基酸修饰把所述工程 化的BoNT/E的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/E的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中， 所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述 的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的 氨基酸被精氨酸残基替代。
[0176] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E，所述工程化的BoNT/E 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、 ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 98UASP 985、GLN 1014、 ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140;并且所述的氨基酸修饰把所述工程 化的BoNT/E的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/E的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0^7]在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F。一种参考BoNT/F序列具有 UniProtKB 检索号 YP_001390123。
[0178] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/F梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0179] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F，所述工程化的BoNT/F 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、 ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP 1056;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0180] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F，所述工程化的BoNT/F 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、 ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP 1056;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或 精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0181] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F，所述工程化的BoNT/F 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、 ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP 1056;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述 的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0182] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G。一种参考BoNT/G序列具有 UniProtKB 检索号 Q60393。
[0183] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/G梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0184] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G，所述工程化的BoNT/G 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、 ASN IOOUASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的 氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的Pl高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或 精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0185] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G，所述工程化的BoNT/G 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、 ASN IOOUASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的 氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1) 个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基 替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0186] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G，所述工程化的BoNT/G 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、 ASN IOOUASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的 氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 精氨酸残基替代。
[0187] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是TeNT。一种参考TeNT序列具有 UniProtKB 检索号 P04958。
[0188] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表TeNT梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的 祀。
[0189] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含 选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、 ASP 91UASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 TeNT的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的 Pl高至少〇.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中， 所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所 述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0190] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含 选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、 ASP 91UASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 TeNT的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的 Pl高至少〇.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 精氨酸残基替代。
[0191] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含 选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、 ASP 91UASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 TeNT的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的 Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或 精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0192] 本发明适用于许多不同的种类的梭菌毒素。因此，在本发明的上下文中，术语"梭 菌毒素"包括由肉毒梭菌（肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、Ci、D、E、F和G)、破伤风梭菌(破伤 风神经毒素）、下酸梭菌（肉毒杆菌神经毒素血清型E)和己氏梭菌（肉毒杆菌神经毒素血清 型F) W及修饰的梭菌毒素或源于任何前述的衍生物生产的毒素。术语"梭菌毒素"也包括肉 毒杆菌神经毒素血清型H。
[0193] 肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是由肉毒梭菌W-种大的蛋白质复合物的形式生产的， 该复合物由自身与多个辅助蛋白复合的BoNT组成成。目前有8种不同的类别的肉毒杆菌神 经毒素，即：肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、Ci、D、E、F、G和H，所有运些共有相似的结构和作 用模式。基于被特异性的中和抗血清失活能够区分不同的BoNT血清型，运种通过血清型的 分类与在所述的氨基酸水平上序列同一性百分比相关。基于氨基酸的序列同一性百分比， 进一步把给定的血清型BoNT蛋白质划分成不同的亚型。 [0194] BoNTs被吸收到胃肠道中，并且在进入大循环W后，与胆碱能神经末端的突出前膜 结合并且阻止它们的神经递质乙酷胆碱的释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割突触 小泡蛋白/与小泡缔合的膜蛋白（VAMP) ;BoNT/Ci、BoNT/A和BoNT/E切割与突触小体缔合的 25kDa的蛋白（SNAP-25);而BoNT/Ci切割突触融合蛋白。
[0195] 破伤风毒素是由破伤风梭菌W单一的血清型生产。下酸梭菌生产BoNT/E，同时己 氏梭菌生产BoNT/F。
[0196] 术语"梭菌毒素"也意图包括修饰的梭菌毒素及其衍生物，包括但不限于下面描述 的那些。一种修饰的梭菌毒素或衍生物可W包含与梭菌毒素的天然(未修饰的)形式相比已 经被修饰的一个或更多个氨基酸，或可W包含不存在于所述梭菌毒素的天然(未修饰的）形 式中的插入的一个或更多个氨基酸。举例来说，与天然(未修饰的)梭菌毒素序列相比，一种 修饰的梭菌毒素可W在一个或更多个结构域中含有修饰的氨基酸序列。运样的修饰可W改 变所述毒素的功能方面，例如生物学活性或持久性。因此，在一个实施方式中，本发明所述 的工程化的梭菌毒素是工程化的修饰的梭菌毒素，或工程化的修饰的梭菌毒素衍生物，或 工程化的梭菌毒素衍生物。
[0197] 修饰的梭菌毒素可W在所述重链的氨基酸序列（例如一种修饰的化结构域）中具 有一个或更多个修饰，其中所述修饰的重链W比所述的天然(未修饰的)梭菌毒素更高或更 低的亲和性与祀神经细胞结合。在所述化结构域中运样的修饰能够包括修饰所述化结构域 的神经节巧脂结合位点中或所述蛋白质（SV2或突触结合蛋白）结合位点中的残基，该修饰 改变了与所述的祀神经细胞的神经节巧脂受体和/或所述蛋白质受体的结合。运样的修饰 的梭菌毒素的例子被描述在WO 2006/027207和WO 2006/114308中，在此通过引文全文引入 它们两者。
[0198] 修饰的梭菌毒素可W在所述的轻链的氨基酸序列中具有一个或更多个修饰，例如 在底物结合或催化结构域中的修饰，该修饰可W改变或修饰所述修饰的LC的SNARE蛋白特 异性。运样的修饰的梭菌毒素的例子被描述在WO 2010/120766和US 2011/0318385,在此通 过引文全文引入它们两者。
[0199] 修饰的梭菌毒素可W包含增大或减小所述的修饰的梭菌毒素的生物学活性和/或 生物学持久性的一个或更多个修饰。例如一种修饰的梭菌毒素可W包含一个基于亮氨酸或 酪氨酸的基序，其中所述的基序增大或减小所述的修饰的梭菌毒素的生物学活性和/或生 物学持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括址xxxLL、xExxxLL、xExxxIL和xExxxLM(其中X是 任何氨基酸）。合适的基于酪氨酸的基序包括Y-X-X-Hy (其中Hy是一种疏水的氨基酸）。包含 基于亮氨酸和酪氨酸的基序的修饰的梭菌毒素的例子被描述在WO 2002/08268,在此通过 引文将其全文引入。
[0200] 术语"梭菌毒素"意图包括杂合体和嵌合体梭菌毒素。一种杂合体梭菌毒素包含来 自一种梭菌毒素或其亚型的一条轻链的至少一部分和来自另一种梭菌毒素或梭菌毒素亚 型的一条重链的至少一部分。在一个实施方式中，所述的杂合体梭菌毒素可W包含来自一 种梭菌毒素亚型的一条轻链的整条轻链和来自另一种梭菌毒素亚型的重链。在另一个实施 方式中，一种嵌合体梭菌毒素可W包含一种梭菌毒素亚型的重链的一部分(例如所述的结 合结构域），所述重链的另一部分来自另一种梭菌毒素亚型。类似地或备选地，所述的治疗 性元素可W包含来自不同的梭菌毒素的轻链部分。运样的杂合体或嵌合体梭菌毒素是有用 的，例如作为一种递送手段，把运样的梭菌毒素的治疗益处递送到对一种给定的梭菌毒素 亚型有免疫抗性的患者，递送到可W具有低于平均的一种给定的梭菌毒素重链结合结构域 的受体浓度的患者，或递送到可W具有所述膜或小泡毒素底物的抗蛋白酶的变体（例如 SNAP-25、VAMP和突触融合蛋白）的患者。杂合体和嵌合体梭菌毒素被描述在US 8，071，110 中，在此通过引文将该文献全文引入。因此，在一个实施方式中，本发明所述的工程化的梭 菌毒素是工程化的杂合体梭菌毒素或工程化的嵌合体梭菌毒素。
[0201] 术语"梭菌毒素"意图包括再祀向的梭菌毒素。在一种再祀向的梭菌毒素中，所述 的梭菌毒素被修饰而包含已知作为祀向部分(TM)的外源配体。选择所述的TMW提供对一种 所要的祀细胞的结合特异性，并且作为所述的再祀向过程的一部分，所述的梭菌毒素的天 然结合部分(例如所述的出结构域或所述的出C结构域)可W被除去。再祀向技术例如被描述 在：EP-B-0689459;W01994/021300;EP-B-0939818;US6，461,617;US7，192，596;WO 1998/ 007864；EP-B-0826051；US5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；W0 1996/033273；EP-B-0996468；US7,052,702；W01999/017806；EP-B-1107794；US6,632,440；W02000/010598；WO 2001/21213；W0 2006/059093；WO 2000/62814；W0 2000/04926；W0 1993/15766；W0 2000/ 61192;和WO 1999/58571中，在此通过引文把所有运些文献全文引入。因此，在一个实施方 式中，本发明所述的工程化的梭菌毒素是工程化的再祀向的梭菌毒素。
[0202] 本发明也包括具有非天然蛋白酶切割位点的梭菌毒素。在运样的梭菌毒素中，天 然的蛋白酶切割位点（也被称为活化位点，如上所述)被修饰或被一个蛋白酶切割位点替 代，该切割位点不是该梭菌毒素天然有的（即一个外源性切割位点）。运样的位点将会需要 外源性蛋白酶进行切割，运允许改善的对切割事件的时机和位置的控制。可W被用在梭菌 毒素中的非天然蛋白酶切割位点包括：
[0203] 肠激酶 （孤孤K丄）
[0204] 因子 Xa (IEGR 丄/IDGR 丄）
[020引 TEV(烟草蚀刻病毒） 化NLYFQ丄G)
[0206] 凝血酶 （LVPRiGS)
[0207] PreScission (LEVLFQiGP)〇
[0208] 另外的蛋白酶切割位点包括被无细胞毒性的蛋白酶(例如被所述的梭菌神经毒素 的轻链)切割的识别序列。运些包括被无细胞毒性的蛋白酶(例如所述的梭菌神经毒素的轻 链)切割的所述SNARE(例如SNAP-25、突触融合蛋白、VAMP)蛋白质识别序列。包含非天然蛋 白酶切割位点的梭菌毒素被描述在US 7,132，259、EP 1206554-B2和US 2007/0166332中， 在此通过引文把所有运些文献全文引入。术语蛋白酶切割位点也包括一种内含肤，它是一 种自切割序列。自剪接反应是能够控制的，例如通过改变存在的还原剂的浓度。
[0209] 本发明也包括包含"毁灭性切割位点"的梭菌毒素。在所述的梭菌毒素中，在一个 选定的位置，非天然的蛋白酶切割位点被渗入所述的梭菌毒素中，使得在所述位点的切割 将会减小所述梭菌毒素的活性或失活它如果在施用后，所述的梭菌毒素迁移到非祀向的位 置，那么所述破坏性的蛋白酶切割位点可能易受局部蛋白酶切割。合适的非天然蛋白酶切 割位点包括上述的那些。包含破坏性切割位点的梭菌毒素被描述在WO 2010/094905和WO 2002/044199中，在此通过引文全文引入它们两者。
[0210] 本发明所述的工程化的梭菌毒素，尤其是其轻链组分，可W是聚乙二醇化的一一 运可W帮助增大稳定性，例如所述的轻链组分的作用持续时间。当所述的轻链包含BoNT/A、 B或Cl蛋白酶时，聚乙二醇化是特别优选的。聚乙二醇化优选地包括把PEG添加到所述的轻 链组分的N-末端。举例来说，一条轻链的N-末端可W是被一个或更多个氨基酸(例如半脫氨 酸)残基延长，该残基可W是相同的或不同的。一个或更多个所述的氨基酸残基可W具有它 自己的与其相连的（例如共价连接的）PEG分子。运种技术的一个例子被描述在W02007/ 104567中，在此通过引文将其全文引入。
[0211] 本发明所述的工程化的梭菌毒素可W没有所述的复合蛋白，该复合蛋白存在于天 然存在的梭菌毒素复合物中。
[0212]本发明的工程化的梭菌毒素也可W包含数量有限的非标准氨基酸。因此，除了所 述的20种标准氨基酸W外，也可W用非标准氨基酸(例如4-径基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、 2-氨基异下酸、异鄉氨酸和a-甲基丝氨酸)来替代本发明所述的工程化的梭菌毒素的氨基 酸残基。数量有限的非保守性的氨基酸、没有被遗传密码编码的氨基酸和非天然的氨基酸 可W被用来替代梭菌多肤的氨基酸残基。本发明所述的工程化的梭菌毒素也能够包含非天 然存在的氨基酸残基。
[021引非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺 式-4-径基脯氨酸、反式-4-径基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基-苏氨酸、径基-乙 基半脫氨酸、径基乙基高半脫氨酸、硝基谷氨酷胺、高谷氨酷胺、派可酸、叔亮氨酸、正鄉氨 酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯基-丙氨酸、4-氮杂苯基-丙氨酸和4-氣苯丙氨酸。本领域中 已知有几种方法用于把非天然存在的氨基酸残基渗入蛋白质中。例如可W采用一种体外系 统，其中使用W化学方法氨酷化的抑制子tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨酷化 tRNA的方法是本领域中已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译是在包含大肠杆菌S30 提取液和可商业得到的酶和其它试剂的不含有细胞的体系中进行的。通过层析法纯化蛋白 质。参见，例如R0be;rt son 等人，J .Am.畑 em. Soc .113:2722.1991; El Iman 等人，Methods Enzymol .202:301,1991; Chung 等人，Science 259:806-9,1993;和 Chung 等人， Proc .Natl .Acad. Sci .USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，翻译是通过显微注射突变 的mRNA和W化学方法氨酷化的抑制子tRNAs在非洲爪赡卵母细胞中进行的（Turcatti等人， J. Biol. Chem. 271:19991-8,1996)。在第S种方法中，在不存在将要被替换的天然氨基酸 (例如苯丙氨酸)并且存在所要的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙 氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氣苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将所述的非天然存在 的氨基酸渗入所述的多肤中，替代它的天然对应物。参见，Koide等人，Biochem. 33:7470-6， 1994。
[0214] 使用重组核酸技术能够生产本发明所述的工程化的梭菌毒素。因此，在一个实施 方式中，工程化的梭菌毒素(如上所述)是重组的工程化的梭菌毒素。
[0215] 在另一个方面中，本发明提供一种核酸(例如DNA)，其包含编码如上所述的工程化 的梭菌毒素的核酸序列。在一个实施方式中，所述的核酸序列是作为包含启动子和终止子 的DNA载体的一部分而被制备的。
[0216] 一种优选的实施方式，所述的载体具有选自下列的启动子：
[0217] 启动子 诱导剂 典型的诱导条件
[021 引 化。（杂合体） IPTG 0.2mM( 0.05-2. OmM)
[0219] AraBAD 心阿拉伯糖 0.2% (0.002_0.4%)
[0220] T7-lac 操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2. OmM)
[0221] 在另一种优选的实施方式中，所述的载体具有选自下列的启动子：
[0222] 启动子 诱导剂 典型的诱导条件
[0223] 化。（杂合体） IPTG 0.2mM( 0.05-2. OmM)
[0224] AraBAD 心阿拉伯糖 0.2% (0.002_0.4%)
[022引 T7-lac 操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2. OmM)
[0226] 巧-iac 操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2. OmM)
[0227] 可W使用本领域中已知的任何合适的方法来制备本发明所述的核酸分子。因此， 可W使用化学合成技术来制备所述的核酸分子。备选地，可W使用分子生物学技术来制备 本发明所述的核酸分子。
[0228] 本发明所述的DNA构建物优选地是在电脑中被设计，然后通过常规的DNA合成技术 被合成的。
[0229] 根据将要被采用的最终的宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，任选地针对密码子 偏倚修饰上述的核酸序列信息。
[0230] 在一个实施方式中，编码如上所述的工程化的梭菌毒素的所述核酸序列是一种核 酸序列，它与选自SEQ ID NOs: 3、5、7和9的一种核酸序列具有至少70% (例如至少75、80、 85、90、95、97、98或99%)的序列同一性。
[0231] 在一个方面中，本发明提供一种核酸序列，它与选自SEQ ID N0s:3、5、7和9的一种 核酸序列具有至少70% (例如至少75、80、85、90、95、97、98或99%)的序列同一性。在一个实 施方式中，所述的核酸序列与选自SEQ ID N0s:3、5、7和9的核酸序列具有至少90%的序列 同一性。
[0232] 本发明也提供由如上所述的核酸序列编码的多肤。因此，在一个方面中，本发明提 供包含氨基酸序列的多肤，该氨基酸序列与选自SEQ ID N0s:4、6、8和10的氨基酸序列具有 至少70 % (例如至少75、80、85、90、95、97、98或99 % )的序列同一性。在一个实施方式中，所 述的氨基酸序列与选自SEQ ID N0s:4、6、8和10的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
[0233] 在一个实施方式中，本发明所述的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的 BoNT/A，并且所述的工程化的BoNT/A包含氨基酸序列（或由其组成），该氨基酸序列与选自 SEQ ID N0s:4、6、8和10的一种氨基酸序列具有至少70% (例如至少75、80、85、90、95、97、 98、99、99.5或99.9%)的序列同一性。
[0234] 在一个实施方式中，本发明所述的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的 BoNT/A，并且所述的工程化的BoNT/A包含SEQ ID N0:4、6、8或10的氨基酸序列（或由其组 成)。
[0235] 在一个方面中，本发明提供一种多肤，它包含SEQ ID N0:4、6、8或10的氨基酸序列 (或由组成）。
[0236] 在一个方面中，本发明提供一种编码如上所述的工程化的梭菌毒素的核酸，其中 所述的核酸包含一种核酸序列，该核酸序列与选自SEQ ID NOs :3、5、7和9的核酸序列具有 至少70% (例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%)的序列同一性。在一个实施 方式中，所述的核酸包含SEQ ID N0:3、5、7或9的核酸序列(或由其组成）。
[0237] 在一个方面中，本发明提供一种核酸，它包含SEQ ID N0:3、5、7或9的核酸序列(或 由其组成）。
[0238] 在两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的"序列同一性百分数"是所述序列共有 的相同位置的数量的函数。因此可W运样计算同一性％:相同的核巧酸/氨基酸的数量除W 核巧酸/氨基酸的总数，乘W100。计算序列同一性％也可W考虑需要引入W优化两个或更 多个序列的比对的空位的数量W及每个空位的长度。在两个或更多个序列之间的序列比较 和同一性百分比的确定可W使用特定的数学算法(例如BLAST)来进行，该算法对于技术人 员来说是熟悉的。
[0239] 在一个方面中，本发明提供一种生产单链工程化的梭菌毒素蛋白的方法，该蛋白 具有一条轻链和一条重链，所述的方法包括在一种合适的宿主细胞中表达一种核酸(所述 的核酸如上所述），裂解所述的宿主细胞W提供包含所述的单链工程化的梭菌毒素蛋白的 宿主细胞匀浆液，并且分离所述的单链工程化的梭菌毒素蛋白。
[0240] 在另一个方面中，本发明提供一种活化工程化的梭菌毒素的方法，所述的方法包 括提供一种能够通过如上所述的生产单链工程化的梭菌毒素蛋白的方法得到的单链工程 化的梭菌毒素蛋白，使所述的多肤与切割所述多肤的蛋白酶在位于所述的轻链和重链之间 的识别位点（切割位点）处接触，从而把所述的多肤转化为一种双链多肤，其中通过二硫键 把所述的轻链和重链连接在一起。
[0241] 本发明所述的工程化的梭菌毒素可W被用来预防或治疗某些医学或美容性疾病 和状况。因此，在另一个方面中，本发明提供如上所述的工程化的梭菌毒素，其用于医药中。
[0242] 在一个相关的方面中，本发明提供如上所述的工程化的梭菌毒素，其用于预防或 治疗选自下列的一种疾病或状况:斜视、眼险疫李、斜眼、张力失常(例如疫李性张力失常、 口飄肌张力失常、病灶性张力失常、迟发性张力失常、喉部张力失常、四肢张力失常、颈肌张 力失常）、斜颈（例如疫李性斜颈）、受益于细胞/肌肉无能的美容治疗（美容性)应用（经由 SNARE下调或失活）、神经肌肉病症或眼能动性状况(例如共同性斜视、垂直斜视、外直肌擁 痕、眼球震颤、甲状腺机能障碍性肌病）、指疫李、眼险疫李、夜磨牙症、肝豆状核变性、震颤、 抽摇、节段性肌阵李、疫李、由慢性多发性硬化症引起的疫李状态、导致异常的膀脫控制的 疫李状态、男性意像、背部疫李、四头肌僵痛、紧张性头疼、提肌骨盆综合征、脊柱裂、迟发性 运动障碍、帕金森氏病、口吃、半面疫李、眼险病、脑性擁痕、病灶性疫李状态、疫李性结肠 炎、神经源性膀脫、肛口疫李、四肢疫李状态、抽摇、震颤、夜磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困 难、流泪、多汗症、过度流诞、过度胃肠分泌、肌肉疼痛(例如来自肌肉疫李的疼痛）、头疼疼 痛(例如紧张性头疼）、额沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器-神经 疾病、慢性神经原性炎症和平滑肌病症。
[0243] 在使用中，本发明使用一种药物组合物，其包含工程化的梭菌毒素与至少一种选 自下列的组分:药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐。
[0244] 可W配制本发明所述的工程化的梭菌毒素使其用于口、胃肠外、连续的输注、吸入 或局部应用。适用于注射的组合物可W呈溶液、混悬液或乳液的形式或呈干粉形式，在使用 前把所述干粉溶解或混悬在合适的赋形剂中。
[0245] 在将要被局部递送的所述工程化的梭菌毒素的情形中，所述工程化的梭菌毒素可 W被配制成乳膏(例如用于局部应用），或用于皮下注射。
[0246] 局部递送手段可W包括气溶胶或其它喷雾剂(例如喷雾器）。在运个方面，工程化 的梭菌毒素的气溶胶制剂确保递送到肺和/或其它鼻的和/或支气管的或气道的通道。
[0247] 可W在参与受影响的器官的神经支配的脊髓节段的水平，通过銷内或硬膜外注射 到脊柱中，来给患者施用本发明的工程化的梭菌毒素。
[0248] 优选的施用途径是经由腹腔镜检查和/或局部化的，特别肌肉内注射。
[0249] 施用本发明所述的工程化的梭菌毒素的剂量范围是将要产生所要的治疗效果的 那些剂量范围。应当理解所需的剂量范围取决于所述工程化的梭菌毒素或组合物的精确本 性、施用途径、所述制剂的本性、患者的年龄、患者状况的本性、程度或严重程度、禁忌症(如 果有的话)和主治医师的判断。能够使用用于最优化的标准经验途径来调节运些剂量水平 的变化。
[0250] 合适的每日剂量(每kg患者的体重）在0.0001-lng/kg,优选地在0.0001-0.5ng/ kg，更优选地在0.002-0.5ng/kg，特别优选地在0.004-0.5ng/kg范围内。所述的单位剂量能 够在少于1皮克(Pg)至30ng剂量内变化，但是典型地将会在0.01至Ing/剂量的范围内，可W 每日一次地施用该剂量或优选地不那么频繁地，例如每星期一次地或6个月一次地施用。
[0251] 一种特别优选的定量给药方案基于0.05ng工程化的梭菌毒素作为所述的IX剂量。 在运个方面，优选的剂量在1X-100X(即0.05-5ng)范围内。
[0252] 流体剂型典型地是利用所述工程化的梭菌毒素和不含热原的无菌载体制备的。取 决于所用的载体和浓度，能够把所述工程化的梭菌毒素溶解或混悬在载体中。在制备溶液 时，载体，如果必要的话，通过添加氯化钢把所述溶液制成等渗的，并且通过使用无菌技术 通过无菌过滤器过滤来灭菌，然后填充到合适的无菌小瓶或安飯中并且密封。备选地，如果 溶液稳定性是足够的，则可W通过高压灭菌法把所述的处于密封容器中的溶液灭菌。有利 地，可W把添加剂例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、混悬剂或乳化剂和或局部 麻醉剂溶解在载体中。
[0253] 干粉(在使用前将其溶解或混悬在一种合适的载体中）可W通过在无菌区使用无 菌技术把预先灭菌的组分填充在无菌容器中来制备。备选地，可W在无菌区使用无菌技术 把所述的组分溶解在合适的容器中。然后把产品冷冻干燥，并且把容器无菌密封。
[0254] 除了把无菌组分混悬而不是溶解在无菌载体中并且灭菌不能够通过过滤完成外， W实质上相同的方式制备适用于肌肉内、皮下或皮内注射的胃肠外混悬剂。可W W无菌状 态分离所述的组分或备选地，可W在分离后把组分灭菌，例如通过伽马照射。
[0255] 有利地，把混悬剂例如聚乙締化咯烧酬包含在所述组合物中W促进所述组分的均 匀分布。
[0256] 根据本发明的施用可W利用多种递送技术，包括微粒包裹、病毒递送体系或高压 气溶胶冲击。
[0巧7] 附图描述 [0巧引 图1
[0259] 阳离子构建体的等电点聚焦(IEF)凝胶。
[0260] 图2
[0261] 在大鼠胚胎脊髓神经元（eSCN)中，Cat5v2化 1064H/N954K) (A)、Cat5v2化 1064H/ N88 服）（B)和 Cat5v2 化 1064H/N1025KKC)的 SNAP-25 切割百分数 W 及相对于 nBoNT/Al 的 PEC50的汇总表。把(A、B、C)大鼠胚胎脊髓神经元培养S个星期并且用化巧v4处理2地，然后 用SNAP-25特异性的抗体进行蛋白质印迹分析。数据是来自S个独立实验的一式S份的平 均值±SEMd(D)在大鼠 eSCN SNAP-25切割效力分析中，Cat5v2化 1064H/N88服），Cat5v2 (K1064H/N954K)和Cat5v2(K1064H/N1025K)相对于nBoNT/AU Li St Biological Laboratories)的效力。基于一个8-点浓度响应曲线（CRC)，每一个点对应于单一批次并且 是3次独立的祀巧0测定的平均值。一式S份评估所述CRC中的每一个浓度。把效力比较制成 目录批、合并的数据n = 24的平均值。数据是每种化巧v4的n = 3批的平均值±SEM。
[0262] 图3
[026引在小鼠隔神经偏侧隔分析(mPNHD)中，nBoNT/A巧日化巧v4的效力(tso)。按照所指示 的那样，把小鼠隔神经偏侧隔组织与化巧v4或天然BoNT/Al-起溫育。记录隔膜的收缩力， 直到不再能检测到收缩或140分钟W后为止。每一个点对应于独立的测定。tso值是把小鼠偏 侧隔的收缩力抑制50%所需要的时间。
[0264] 序列
[026引 沈Q ID NO:1.B0NT/A1 核酸序列。
实施例
[0655]下列实施例用于举例说明本发明的【具体实施方式】，并且不W任何方式限定权利要 求书中所定义的本发明的保护范围。
[0化6] 实施例1
[0657] 生产了根据本发明的工程化的BoNT/Al分子的3个不同实例。
[0658] 使用多个不同的标准筛选了被选择用于修饰的氨基酸(突变位点）。
[0659] 残基替换的标准如下：
[0660] 1.残基的类型；
[0661] 2.表面暴露程度；
[0662] 3.关于二级/S级结构的位置；
[0663] 4.关于BoNT的已知功能性结构域的位置；
[0664] 5.遍及所述BoNT/A或BoNT/E亚型的序列保守度；
[066引6.引入另外一个遍在蛋白化位点的概率。
[0666] 在运个实施例中，选择天冬酷胺(Asn，N)和谷氨酷胺(Gin, Q)用于突变因为它们是 极性的，尺寸与Lys相似，仅仅与其它残基形成较弱的偶极相互作用，并且所述分子的14% 是由运两种残基构成的。
[0667] 从BoNT/Al(PDB ID:3BTA)的晶体结构中鉴定了在所述分子的表面上可见的Asn和 Gln残基。运确保所有被替换的残基将能够在外面上展示它们的电荷。通过应用上述筛选标 准(迭代法）的3-5点，可能从运个目录中排除掉不太适用于替换的那些残基.
[0668] 从与BoNT/A和功能上相似的BoNT/E血清型的其它亚型的比对中鉴定了 BoNT/Al内 的非保守残基。把在其它序列中表现为碱性残基的那些残基选择作为用于替换的头等候选 者。
[0669] 在通过上述章节提到的筛选标准的连续反复多轮后，鉴定了最终的候选残基目 录。筛选运些用于潜在产生另外的遍在蛋白化共有序列（利用CKSAAP_UbSite服务器）。通过 把所述的替代赖氨酸改变为精氨酸，把被鉴定出来的很少几个残基除去了。
[0670] 合成的用于BoNT/Al序列的最终实例的阳离子构建体被列于下面，命名为化t-A、 化t-B和化t-C。每种构建体具有149,637道尔顿的分子量。
[0671 ] Cat-A:N930K，S955K，Q991K，N1026K，N1052K，Ql229K，N886K。
[0672] Cat-B:N930K，S955K，Q991K，N1026K，N1052K，Ql229K，N954K。
[0673] Cat-C:N930K，S955K，Q991K，N1026K，N1052K，Ql229K，N1025K。
[0674] 实施例2
[0675] 针对能够被Lys或Arg替代的潜在的残基，评估了所述的BoNT/B、F和E的氨基酸序 列。运种初始的评估鉴定了能够被替换而产生具有增大的Pl的BoNT/B、E或F蛋白质的残基。
[0676] 分析了 BoNT/B(Ac:P10844)、BoNT/E(Ac:Q00496)和 BoNT/F(Ac:P30996)的一级序 列，并且将氨基酸组成汇总在下表中：
[0677] 表3:
[0679] 从该表中，根据对BoNT/Al的观察，类似地有大量极性的Asn/Gln残基存在于所述 的氨基酸序列中。也有相对大量的酸性的(Asp/Glu)残基，运些残基潜在地能够被改变成它 们相应的中性残基(Asn/Gln)或碱性残基(LyS或Arg)。
[0680] 实施例3
[0681 ]用于修饰的优选的梭菌毒素氨基酸的鉴定。
[0682] BoNT/A、BoNT/B和BoNT/E的全长结构数据是可W得到的；然而对于其余的四种血 清型，基于序列和相关的结构同源性，使用LOOPP计算机程序产生了理论模型。
[0683] 通过ArealMol(CCP4套件)分析了每一种结构，并且把暴露的残基鉴定为具有大于 40的总值。具有极性侧链的残基选自运个目录，并且从运个目录中优选酸性的残基(Asp和 Glu)或具有H-键受体侧链的残基(Asn和Gin)。最后的计算步骤设及基于来自所述的Stride 服务器的分析数据，选择在a-螺旋和e-链的之间的残基。检视每一个分子的结构W鉴定位 于界面区域内的残基-避开运些残基。
[0684] 对于BoNT/Al，给优选的残基目录补充了在至少90%的所有比对的序列中功能上 非保守的残基[大的非极性的侧链(16*、？'0、？116、1'巧)被认为是等同的，小的非极性的侧链 (Gly、Ala、化l、Leu、化)被认为是等同的，酸性的侧链(Asp、Glu)被认为是等同的，并且碱性 的侧链(Arg、Lys)被认为是等同的]。更具体地，在至少10%的所述序列中表现为碱性的残 基的那些非保守残基W及所述参考序列中的非保守的Asn、Gln、Asp或Glu被选择作为候选 者。
[0685] 对于其余的血清型，在亚型之间进行多重的序列比对W鉴定在至少10%的所述序 列中表现为碱性残基的功能上非保守的残基。
[0686] 优选的用于修饰的梭菌毒素氨基酸：
[0687] BoNT/A:
[0688] ASN 886,ASN 905,GLN 915,ASN 918,GLU 920,ASN 930,ASN 954,SER 955,GLN 991，GLU 992，GLN 995,ASN 1006,ASN 10化，ASN 1026,ASN 1032,ASN 1043,ASN 1046,ASN 1052,ASP 1058,HIS 1064,ASN 1080,GLU 1081,GLU 1083,ASP 1086.
[0689] BoNT/B:
[0690] ASN 873，ASN 874,化U 892，ASP 895，ASN 906，ASP 940，ASN 948，GLU 949，ASN 958,ASN 959,ASN 979,ASN 990,GLU 993,ASP 994,GLU 997,ASN 1012,ASN 1019,ASP 1030,ASP 1047,ASP 1049,GLU 1065,GLU 1072,GLN 1176,GLU 1189,GLU 1252,ASN 1273.
[0691] ASN 881,ASP 898,GLU 916,GLU 927,ASN 952,ASN 964,ASN 965,ASN 984,GLU 985,ASP 986,ASP 996,ASN 1000,GLU 1036,ASN 1041,ASP 1062,ASP 1064,GLU 1079,ASP 1081.
[0692] BoNT/D:
[0693] ASN 877,ASP 893,ASN 894,ASN 898,ASN 920,ASN 945,ASN 948,GLU 957,GLN 958,ASN 959,ASN 968,ASN 979,GLU 1030,ASP 1031,ASP 1033,GLU 1047,GLU 1051,ASN 1052,GLU 1066,GLN 1122.
[0694] BoNT/E:
[069引 ASN 859,ASP 860,ASN 892,ASP 893,ASP 904,ASP 909,ASN 928,ASN 932,ASN 934,ASN 935,GLU 936,ASP 945,ASN 946,ASN 947,ASN 966,ASN 976,ASN 979,ASN 981, ASP 985,GLN 1014,ASN 1019,ASN 1022,ASP 1027,ASN 1035,and ASN 1140.
[0696] BoNT/F:
[0697] ASN 879,ASP 896,ASN 922,ASN 923,ASN 928,ASN 947,ASN 950,ASN 952,ASN 953,GLU 954,ASN 963,ASN 964,ASN 965,ASN 987,GLN 997,ASN 1037,ASP 1040,ASP 1045,ASN 1055,ASP 1056.
[069引 BoNT/G:
[0699] ASP 900,ASN 909,ASN 910,GLU 912,ASN 913,ASN 945,ASN 947,GLU 956,ASN 965,ASP 966,ASN 986,ASN 1001,ASN 1038,ASP 1040,ASN 1046,ASP 1057,GLU 1073,ASN 1075,ASN 1090.
[0700] ^NT:
[0701] ASN 893,ASP 894,ASP 911,ASN 919,ASN 927,ASN 928,GLU 929,GLN 968,ASN 972,GLU 973,GLU 1010,ASP 1018,ASN 1079,ASN 1080,ASN 1081,ASN 1097.
[0702] 所用的序列检索号：
[0703] B〇NT/A:P10845
[0704] B〇NT/B:PI0844
[070引 B0NT/C1:P18640
[0706] BoNT/D:P19321
[0707] B〇NT/E:Q00496
[070引 B0NT/F:YP_001390123
[0709] B〇NT/G:Q60393
[0710] 化肥口04958
[0711] 结构数据源
[0712] BoNT/A(3BTA.p化）、BoNT/B(lEPW)和BoNT/E(3FFZ.p化）的晶体结构是从 RCSB 获得 的。
[0713] 分别使用LOOPP和下列序列来进行8〇肿/(：1、8〇肿/0、8〇饥'/。、8〇饥'/6和16^的同源 性建模:？18640、口19321、￥口_001390123、960393，和口04958。
[0714] 结构分析
[0715] 使用AreaIMol从所述的CCP4套件确定暴露的残基。
[0716] 使用Stride确定了二级结构的分配。
[0717] 通过采用RasMol检视确定了界面残基。
[0718] 序列分析
[0719] 全长BoNT序列是从NCBI获得的。
[0720] 用 Clus1:alX 进行比对。
[0721 ] 实施例4
[0722] 克隆、表达和纯化
[0723] 合成了实施例1中描述的编码所述工程化的BoNT/A分子的DNA构建体，把它们克隆 到所述的PJ401表达载体中并且然后转化到化21 (DE3)大肠杆菌中。运允许所述重组的化t-A、&t-B和化t-C蛋白质在化21 (DE3)大肠杆菌中可溶的过度表达。
[0724] 使用经典的层析法技术从所述的大肠杆菌裂解液中纯化所述重组的工程化的 BoNT。采用一个使用阳离子交换树脂的初始纯化步骤，然后通过使用疏水相互作用树脂进 行中间纯化步骤。然后通过蛋白酶水解切割所述重组的工程化的BoNT单链，产生活化的双 链工程化的BoNT。然后采用最后的纯化步骤来除去剩余的污染物。
[07巧]实施例5
[0726] 纯化的工程化的BoNT的表征
[0727] 按照下述W实验方式对上述实施例1中描述的工程化的BoNT进行了表征。
[0728] 对所述Pl的测定显示:所述工程化的BoNT的等电点大于未修饰的（天然)BoNT/Al 的等电点-参见图1和下表。
[0729] 表4:
[0731] 使用大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)评估了所述工程化的BoNT进入神经元并且切割 SNAP-25 (BoNT/A 1的祀)的能力。图2显示所述工程化的BoNT保留了与天然BoNT/Al相同的进 入所述的神经元并且切割SNAP-25的能力。
[07创使用小鼠隔神经偏侦顯分析(mPN皿)进一步评估了所述工程化的BoNT的效力。图3 显示所述工程化的BoNT保留了与天然BoNT/Al相同的抑制所述小鼠偏侧隔的收缩能力的能 力。
[0733] 使用体内小鼠趾外展评分(DAS)分析来评估相对于天然BoNT/Al的效力或安全性。 相对于天然BoNT/Al，两种分子都展示了更高的安全比并且效力稍微更强一些。运些数据被 呈现在下面(表4)。
[0734] 表4:
[0735]
[0736] -DAS邸日0:计算的引发DAS 2的剂量
[0737] -剂量DAS 4:引发DAS 4的实验剂量
[073引 -BW:体重
[0739] -10% ABW的剂量:计算的引发BW与在Do下BW相比减小10%的剂量
[0740] -安全比：-10% A BW的剂量/DAS邸50
[0741] 所述的安全比是BoNT处理的不利效应(体重减少)相对于效力（半最大趾外展评分 (DAS))的量度。它被计算成-10%体重(BW)与所述DAS EDso的比率，其中-10%BW是指10%的 体重减小所需的BoNT的量(pg/动物），而抓50是指将会产生一个为2的DAS的BoNT的量(pg/动 物)。
[0742] 所述的DAS分析是通过把20化配制在明胶憐酸缓冲液中的工程化的梭菌毒素注射 到小鼠脾肠肌/比目鱼肌复合体中，然后通过像Aoki先前报道的那样(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820; 2001)评估趾外展来进行的。
[0743] 实施例6
[0744] 使用上述实施例1中提出的标准设计了根据本发明的进一步工程化的梭菌毒素。 [074引运种阳离子构建体也源于BoNT/Al并且具有7.4的计算的Pl W及149,859的分子 量。所述的构建体被命名为化t-D。虽然构建体化t-AXat-B和化t-C包含突变为赖氨酸的残 基，但是化t-D包含突变为精氨酸的残基。
[0746] Cat-D:N1188R，D1213R，G1215R，N1216R，N1242R，N1243R，S1274R，T1277R。
[0747] 实施例7
[0748] 治疗患有颈肌张力失常的患者
[0749] -位患有疫李性斜颈的50岁的妇女在诊室中陈述先前曾经接受过治疗有效量的 一种标准BoNT/A制剂进入颈部肌肉中的治疗;然而，该患者经受了由于所述毒素传播到口 咽中而引起的吞咽困难。采用大约1.5ng(或更多）本发明的工程化的BoNT/A在颈部肌肉中 注射来治疗该患者。在3-7天W后，在没有发生吞咽困难的情况下，该患者的斜颈得到了显 著的改善，并且该患者能够将她的头和肩膀保持在正常的状态持续至少5个月。由于所述工 程化的BoNT/A分子的增强的组织保留和减少的传播，医生能够注射更多的药物而不用担屯、 副作用;所述的增大的剂量导致延长的持续作用时间。
[0750] 实施例8
[0巧1] 治疗患有眼险疫李的患者
[0752] 一位47岁的男人在诊室中陈述患有眼险疫李。通过把5pg至25pg本发明的工程化 的BoNT/A注射到上眼险的外侧险板前眼轮应肌肌肉和下眼险的外侧险板前眼轮应肌肌肉 中来治疗该患者。在大约一个星期内，该患者的症状发生了减轻并且持续了至少5个月，没 有眼下垂。本发明所述的多肤的增大的安全性允许医生增大剂量，并且因此延长了临床效 果的持续时间。
[0巧引实施例9
[0754] -位患有脑性擁痕的27岁男人在诊室中陈述患有衰弱的马蹄足并且患有行走困 难。该患者先前曾经接受过治疗有效量的BoNT/A的治疗，其中他的步态缓解改善伴随着他 四肢的肌肉虚弱和疼痛。通过把大约20pg/kg本发明的工程化的BoNT/A注射到所述受影响 的下肢的脾肠肌肌肉的内侧头和外侧头的两个位点中的每一个中来治疗该患者。在一个星 期内，该患者的步态改善了，没有先前见到的副作用并且所述的症状减轻持续了至少4个 月。给药更高量的药物的能力导致产生延长的作用时间的治疗。
【主权项】
1. 包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把 所述工程化的梭菌毒素的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修 饰、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.2个pi单位。2. 权利要求1所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程 化的梭菌毒素的等电点(Pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它 方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.5个pi单位。3.权利要求1所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程 化的梭菌毒素的等电点(Pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它 方面相同的梭菌毒素的pi高至少1个pi单位。4.权利要求1所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程 化的梭菌毒素的等电点(Pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它 方面相同的梭菌毒素的pi高至少2个pi单位。5.权利要求1所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程 化的梭菌毒素的等电点(Pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它 方面相同的梭菌毒素的pi高2至5个pi单位。6. 前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素具有 至少为6的pi。7. 前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素具有 6至10的pi。8.权利要求7所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素具有7至9,优选8 至9的pi。9. 前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰 选自：氨基酸替换、氨基酸插入和氨基酸缺失。10. 权利要求9所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一种氨基酸替换选自：酸性 的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代、酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代 和不带电荷的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代。11. 前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素包 含1至80个氨基酸修饰。12. 权利要求11所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素包含4至40个氨 基酸修饰。13.前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修 饰位于所述梭菌毒素的受体结合结构域(HC结构域）中。14.权利要求13所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰位于所述 梭菌毒素的H?结构域中。15.前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修 饰是表面暴露的氨基酸残基的修饰。16.前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修 饰包括选自下列的氨基酸残基的修饰:天冬氨酸残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残 基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、半胱氨酸残基或酪氨酸残基。17. 权利要求16所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的氨基酸残基被赖氨酸残基或精 氨酸残基替代。18. -种核酸，其包含编码根据权利要求1-17中任意一项所述的工程化的梭菌毒素的 核酸序列。19. 一种生产单链工程化的梭菌毒素蛋白质的方法，该蛋白质具有一条轻链和一条重 链，所述的方法包括在合适的宿主细胞中表达根据权利要求18的核酸，裂解所述的宿主细 胞以提供包含所述的单链工程化的梭菌毒素蛋白质的宿主细胞匀浆，并且分离所述的单链 工程化的梭菌毒素蛋白质。20. -种活化工程化的梭菌毒素的方法，所述方法包括提供能够通过权利要求19所述 的方法得到的单链工程化的梭菌毒素蛋白质，使所述的多肽与在位于所述的轻链和重链之 间的识别位点（切割位点)处切割所述多肽的蛋白酶接触，并且把所述的多肽转化为双链多 肽，其中所述的轻链和重链通过二硫键连接在一起。21. 根据权利要求1-17中任意一项所述的工程化的梭菌毒素，用于医药中。22. 根据权利要求1-17中任意一项所述的工程化的梭菌毒素，用于预防或治疗选自下 列的疾病或状况:斜视、眼睑痉挛、斜眼、张力失常(例如痉挛性张力失常、口颚肌张力失常、 病灶性张力失常、迟发性张力失常、喉部张力失常、四肢张力失常、颈肌张力失常）、斜颈(例 如痉挛性斜颈）、受益于细胞/肌肉无能的美容治疗(美容性)应用(经由SNARE下调或失活）、 神经肌肉病症或眼能动性状况(例如共同性斜视、垂直斜视、外直肌瘫痪、眼球震颤、甲状腺 机能障碍性肌病）、指痉挛、眼睑痉挛、夜磨牙症、肝豆状核变性、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、 痉挛、由慢性多发性硬化症引起的痉挛状态、导致异常的膀胱控制的痉挛状态、男性意像、 背部痉挛、四头肌僵痛、紧张性头疼、提肌骨盆综合征、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森氏 病、口吃、半面痉挛、眼睑病、脑性瘫痪、病灶性痉挛状态、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、肛 门痉挛、四肢痉挛状态、抽搐、震颤、夜磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难、流泪、多汗症、过 度流涎、过度胃肠分泌、肌肉疼痛（例如来自肌肉痉挛的疼痛）、头疼疼痛（例如紧张性头 疼）、额沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器-神经疾病、慢性神经原 性炎症和平滑肌病症。23. 基本上如本文中并且参考附图描述的工程化的梭菌毒素。
【专利摘要】本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素,其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.2个pI单位。也提供了所述工程化的梭菌毒素在治疗中的相应用途。
【IPC分类】C07K14/33, A61K39/08
【公开号】CN105492020
【申请号】CN201480043806
【发明人】D·B·安德森, G·S·哈克特, S·M·刘
【申请人】益普生生物创新有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月9日
【公告号】CA2917009A1, EP3019190A1, WO2015004461A1
【专利说明】阳离子神经毒轰
[0001] 本发明设及包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，W及运样的工程化的 梭菌毒素在医学和治疗中的用途。
[0002] 梭菌属中的细菌产生高度强大的并且特异性的蛋白毒素，它们能够毒害它们被递 送之处的神经元和其它细胞。运样的梭菌毒素的例子包括由破伤风梭菌(TeNT)和肉毒梭菌 (BoNT)血清型A-G产生的神经毒素 W及由己氏梭菌和下酸梭菌产生的那些神经毒素。
[0003] 在所述的梭菌毒素中有一些是已知最强大的毒素。例如，肉毒杆菌神经毒素对于 小鼠的半数致死剂量化化0)值范围从0.5到5ng/kg，取决于血清型。破伤风梭菌毒素和肉毒 杆菌毒素两者都通过抑制受影响的神经元的功能(特别是神经递质的释放)而起作用。虽然 肉毒杆菌毒素在神经肌肉连接处起作用并且抑制周围神经系统中胆碱能的传导，但是破伤 风梭菌毒素却在中央神经系统中起作用。
[0004] 在自然界，梭菌毒素是W单链多肤形式被合成的，通过一种蛋白酶解切割事件对 该多肤进行翻译后的修饰而形成通过二硫键连接在一起的两条多肤链。切割发生在特异性 的切割位点（常常被称为活化位点）处，即位于提供链间二硫键的半脫氨酸残基之间。正是 运种二链形式成为了所述毒素的活性形式。运两条链被称为重链化-链）（具有大约l〇〇W)a 的分子量)和轻链化-链）（具有大约50kDa的分子量）。所述的H-链包含N-末端易位元件化N 结构域)和C-末端祀向元件化e结构域）。所述的切割位点位于所述的k链和所述的易位结 构域元件之间。在所述也结构域与它的祀标神经元结合W及所结合的毒素经由内体内化到 细胞中W后，所述的化结构域使所述的k链易位跨越内体膜并且进入胞质溶胶中，并且所 述的心链提供一种蛋白酶功能(也被称为一种无细胞毒性的蛋白酶）。
[000引无细胞毒性的蛋白酶通过蛋白酶解切割被称为SNARE蛋白的细胞内转运蛋白（例 如SNAP-25、VAMP或突触融合蛋白）而起作用-参见Gerald K(2002)"Cell and Molecular Biology"(第4版)John Wil巧& Sons, Inc。首字母缩略词SNARE源于术语可溶性的NSF连接 受体，其中NSF意指N-乙基马来酷亚胺-敏感因子。SNARE蛋白是细胞内的小泡融合体所必需 的，因此是经由小泡转运的来自细胞的分子分泌所必需的。所述的蛋白酶功能是一种锋依 赖性的内肤酶活性并且展示对SNARE蛋白的高度底物特异性。因此，一旦被递送到所要的祀 细胞，所述的无细胞毒性的蛋白酶能够抑制来自所述祀细胞的细胞分泌。梭菌毒素的所述 心链蛋白酶是切割SNARE蛋白的无细胞毒性的蛋白酶。
[0006] 鉴于SNARE蛋白的遍在本性，梭菌毒素例如肉毒杆菌毒素已经被成功地应用在广 泛的治疗中。
[0007] 举例来说，我们参考William J.Lipham,Cosmetic and Clinical Applications of Botulinum Toxin(Slack, Inc. ,2004)，它描述了梭菌毒素，例如肉毒杆菌神经毒素 (BoNTs)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Ci、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G W 及破伤风神经毒素 (TeNT)的用途，用于在广泛种类的治疗和化妆应用中抑制神经元传导-例如，BOTOX?目前被 批准作为下列适应症的治疗剂:弛缓不能、成年人疫李、肛裂、背痛、眼险疫李、夜磨牙症、颈 肌张力障碍、特发性震颤、眉间线或运动机能亢奋的面线、头疼、半面疫李、膀脫活动过度、 多汗症、青少年大脑性擁痕、多发性硬化症、肌阵李症、鼻唇线、疫李性发声困难、斜视和第 屯神经障碍。另外，描述了梭菌毒素治疗用于治疗神经肌肉病症(参见US 6,872,397);用于 治疗子宫病症（参见US 2004/0175399);用于治疗溃瘍和胃食管反流病（参见US 2004/ 0086531);用于治疗张力失常（参见US 6,319,505);用于治疗眼病（参见US 2004/ 0234532);用于治疗眼险疫李（参见US 2004/0151740);用于治疗斜视（参见US 2004/ 0126396);用于治疗疼痛（参见 US 6,869,610，US 6,641，820、US 6,464,986 和 US 6,113， 915);用于治疗纤维肌痛(参见US 6，623，742、US 2004/0062776);用于治疗下背痛(参见US 2004/0037852);用于治疗肌肉损伤（参见US 6，423,319);用于治疗窦性头疼（参见US 6， 838，434);用于治疗紧张性头疼(参见US 6，776，992);用于治疗头疼(参见US 6，458，365); 用于减少偏头疼性疼痛(参见US 5,714,469);用于治疗屯、血管疾病（参见US 6,767,544); 用于治疗神经性病症例如帕金森氏病（参见US 6，620，415、US 6,306,403);用于治疗神经 精神病(参见US 2004/018006UUS 2003/0211121);用于治疗内分泌素乱(参见US 6,827， 931);用于治疗甲状腺疾病(参见US 6，740，321);用于治疗胆碱能影响的汗腺疾病(参见US 6，683，049);用于治疗糖尿病(参见US 6，337，075、US 6，416，765);用于治疗一种膜腺疾病 (参见 US 6,261，572、US 6,143,306);用于治疗癌症例如骨瘤（参见 US 6,565,870、US 6， 368,605、US 6，139,845、US 2005/0031648);用于治疗耳病（参见 US 6,358,926、US 6,265， 379);用于治疗自主性疾病例如胃肠肌肉疾病和其它平滑肌机能失常（参见US 5，437， 291);用于与皮肤细胞增生性疾病相关的皮肤损伤的治疗(参见US 5,670,484);用于控制 神经原性炎性病症（参见US 6，063，768);用于减少脱发和刺激毛发生长(参见US 6，299， 893);用于治疗嘴角朝下（参见US 6，358，917);用于减少食欲(参见US 2004/40253274);用 于牙齿的治疗和牙科手术(参见US 2004/0115139);用于治疗神经肌肉疾病和状况(参见US 2002/0010138);用于治疗多种疾病和状况W及相关的疼痛(参见US 2004/0013692);用于 治疗由粘液分泌过多引起的状况例如哮喘和COPD(参见WO 00/10598); W及用于治疗非神 经元状况例如炎症、内分泌状况、外分泌状况、免疫状况、屯、血管状况、骨状况(参见WO 01/ 21213)。在此通过引用将所有上述出版物整体并入。
[0008] 预期无细胞毒性的蛋白酶例如梭菌毒素（例如BoNT和TeNT)在治疗性和化妆性治 疗人和其它哺乳动物中的用途将要扩大到范围日益宽广的能够受益于运些毒素性质的疾 病和不适。
[0009] 为了避免系统性的神经效果，许多梭菌毒素治疗利用向给定的祀位点（例如一种 祀组织)直接施用所述的梭菌毒素治疗剂。当W运种方式施用基于梭菌毒素的治疗剂时的 一个问题是毒素远离所述的施用位点而进入周围组织或系统性循环的传播。毒素远离祀组 织的扩散被认为对不受欢迎的副作用负责，运些副作用在极端情况下可能会是威胁生命 的。当W高的剂量、浓度和注射体积使用梭菌毒素治疗剂(例如BoNT治疗剂)时，运可能是一 个特别的关注。对于商业化的BoNT/A治疗剂，已经报道的与运个问题相关的副作用包括:无 力、广泛性肌肉虚弱、复视、下垂、吞咽困难、发声困难、构音困难、尿失禁和呼吸困难。吞咽 和呼吸困难可能是威胁生命的并且已经报道了与毒素效应的传播相关的死亡。
[0010] 因此，在本领域中存在对运样的梭菌毒素的需要:与已知的梭菌毒素相比，它在施 用位点具有增大的组织保留性质并且因此展示远离施用位点的扩散的减少。
[0011] 本发明通过提供工程化的梭菌毒素解决了上述问题，正如权利要求书中具体说明 的那样。
[0012] 在一个方面中，本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，其中 所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个值，该值比 缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.2个(例如至少 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1个)91单位。在一个实施方式中，所述的至少一个氨 基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸 修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.4个Pl单位。在一个实施方式中，所述的至少 一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个 氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.5个Pl单位。在一个实施方式中，所述 的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏所述的至 少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.6个Pl单位。在一个实施方式 中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值比缺乏 所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.8个Pl单位。在一个实 施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增大到一个值，该值 比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单位。
[0013] 在一个方面中，本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，其中 所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个值，该值比 缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单位。
[0014] 在某些实施方式中，所述工程化的梭菌毒素包含至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 氨基酸修饰。
[0015] 在某些实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的Pl增 大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至 少2、3、4或5个Pl单位。
[0016] 本发明人已经发现，通过增大梭菌毒素的Pl，例如增大至少0.2个Pl单位或0.5个 Pl单位或1个Pl单位(通过向所述的梭菌毒素蛋白中引入至少一个氨基酸修饰），所得的工 程化的梭菌毒素有利地显示了增大的组织保留性质和减少的远离施用位点的扩散，同时保 留了祀细胞结合、易位W及祀SNARE蛋白切割的能力。因此，与缺乏所述的至少一个氨基酸 修饰、其它方面相同的梭菌毒素相比，所述的来自施用位点的梭菌毒素的传播被显著地减 少了。
[0017] 本发明所述的工程化的梭菌毒素适用于任何上述的治疗，并且与使用已知的梭菌 毒素治疗剂相比，可W有利地显示副作用的减少或不存在。
[0018] 本发明所述的工程化的梭菌毒素的增大的组织保留性质还提供增大的作用效力 和/或持续时间，并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比，能够允许使用减少的剂量(或增大的 剂量而没有任何额外的副作用），从而提供了更多的优点。
[0019] 正如下面更详细地论述的那样，由所述的至少一个氨基酸修饰所提供的Pl的增大 意思是本发明的工程化的梭菌毒素在给定的抑下具有净电荷，该净电荷比缺乏所述的至少 一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素上的净电荷更正。不希望受任何一种理论限制， 本发明人相信，运种增大的正电荷允许本发明所述的工程化的梭菌毒素在施用位点处展示 更长的组织保留时间，运归因于在施用位点处，在所述工程化的梭菌毒素与阴离子细胞外 组分(例如细胞膜和硫酸肝素蛋白聚糖)之间有利的静电相互作用。运些改善的静电相互作 用用于减少所述工程化的梭菌毒素远离所述施用位点的扩散，从而改善组织保留。
[0020] 举例来说，本发明所述的工程化的梭菌毒素的改善的组织保留性质可W允许（i) 更高的剂量进入个别的肌肉，例如胸锁乳突肌，不会传播到附近的颈部肌肉中而引起吞咽 困难，W及（ii)在单次治疗中更高的总剂量(对于所有的肌肉），不会传播到所述的循环中 而引起系统性的效应例如呼吸困难。对于患者的益处可W包括对大肌肉（例如所述的胸锁 乳突肌)的更有效的治疗，增大的在每次治疗期间注射几块不同的肌肉的机会，W及由于更 高的定量给药而导致的可能更长的有效治疗持续时间(再次治疗之前更长的持续时间是必 要的）。
[0021] 在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素在使用中具有正的净电荷(例如 当所述工程化的梭菌毒素在使用中位于组织中的所要施用位点时）。
[0022] 等电点（Pl)是一种给定的蛋白质的特性。正如本领域中熟知的那样，蛋白质是由 特定的氨基酸（当在一种蛋白质中时，也被称为氨基酸残基)序列制成的。20种氨基酸的标 准集合中的每一种氨基酸都具有不同的侧链(或R基团），意味着在一种蛋白质中，每一种氨 基酸残基显示不同的化学性质例如电荷和疏水性。运些性质可W受周围化学环境(例如溫 度和抑)的影响。一种蛋白质的总的化学特征将会取决于运些多种因素的总和。
[0023] 某些氨基酸残基（下面详述)具有能够电离的侧链，该侧链可能显示电荷，取决于 周围的抑。在给定的抑下，运样的侧链是否带电取决于相关的能够电离的部分的地a,其中 PKa是所述酸的一个指定质子从一个共辆碱分离的解离常数化a)的负对数。
[0024] 例如酸性的残基例如天冬氨酸和谷氨酸具有地a值大约为4.1(精确的地a值可能 取决于溫度、离子强度和所述能够电离的基团的微环境）的侧链簇酸基团。因此，运些侧链 在7.4的pH下(经常被称为"生理抑")展示负的电荷。在低抑值下，运些侧链将会变成质子化 的并且失去它们的电荷。
[0025] 相反地，碱性的残基例如赖氨酸和精氨酸具有地a值大约为10-12的含氮的侧链基 团。运些侧链因此在7.4的抑下展示正的电荷。在高pH值下，运些侧链将会变成去质子化的 并且失去它们的电荷。
[0026] 因此，蛋白质分子的总的（净）电荷取决于存在于所述蛋白质中的酸性残基和碱性 残基的数目（W及它们的表面暴露程度)和环境的pH。改变环境的pH，就改变了所述蛋白质 上的总的电荷。因此，对于每一种蛋白质，存在着一个给定的抑，在该pH下正电荷和负电荷 的数目是相等的并且所述蛋白质显示总体上无净电荷。已知运个点与等电点（Pl)-样。等 电点是蛋白质生物化学中的一个标准的概念，技术人员将会对它很熟悉。
[0027] 因此，等电点(Pl)被定义为一种蛋白质显示零净电荷时的抑值。Pl的增大意味着 所述蛋白质展示零净电荷需要更高的pH值。因此，Pl的增大表示在给定的抑下，一种蛋白质 的净正电荷的增大。相反地，Pl的减小意味着所述蛋白质展示零净电荷需要更低的pH值。因 此，PI的减小表示在给定的抑下，一种蛋白质的净正电荷的减小。
[0028] 在本领域中测定一种蛋白质的Pl的方法是已知的并且对于技术人员来说将会是 熟悉的。举例来说，从存在于所述蛋白质中的每一种氨基酸的平均地a值能够把蛋白质的Pl 计算出来。备选地，使用等电点聚焦技术能够把一种蛋白质的Pl实验测定出来。运种技术根 据蛋白质的Pl使用电泳来分离它们。典型地使用一种具有固定化pH梯度的凝胶来进行等电 点聚焦。当应用电场时，所述蛋白质迁移穿过所述的抑梯度，直到它达到它具有零净电荷时 的抑，运个点就是所述蛋白质的PI。
[0029] 通过改变显示在蛋白质表面上的碱性基团和/或酸性基团的数目，可W增大或减 小一种蛋白质的pl。运能够通过修饰所述蛋白质的一个或更多个氨基酸来实现。例如可W 通过减少酸性残基的数目或通过增大碱性残基的数目来提供Pl的增大。下面更详细地讨论 运样的氨基酸修饰。
[0030] 天然(未修饰的)梭菌毒素具有大约5-6的pi。因此，在7.4的抑下，天然肉毒杆菌毒 素具有负净电荷。举例来说，BoNT/A的Pl是6.4，并且BoNT/A分子在7.4的抑下具有-8的净电 荷。如上所述计算出了运些Pl值。
[0031] 表1:
[0033] 如上所述，在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸 修饰，其中所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个 值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少0.2个Pl 单位。
[0034] 因此，在本发明的上下文中，Pl增大0.2个单位在工程化的BoNT/A梭菌毒素的上下 文中将会是Pl从6.4增大到6.6。
[0035] 如上所述，在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸 修饰，其中所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电点(Pl)增大到一个 值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的Pl高至少1个Pl单 位。
[0036] 因此，在本发明的上下文中，Pl增大1个单位在工程化的BoNT/A梭菌毒素的上下文 中将会是Pl从6.4增大到7.4。
[0037] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电 点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素 的Pl高至少2个Pl单位。
[0038] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰将所述工程化的梭菌毒素的等电 点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素 的Pl高2至5个Pl单位。
[0039] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有至少为6(例如至少6、至少7、至少 8或至少9)的pi。
[0040] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有至少为7的pi。
[0041] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素具有6至10的Pl(例如7至9的Pl或8至9 的 pl)。
[0042] 如上所述，本发明的所述工程化的梭菌毒素具有增大的组织保留性质，该性质也 提供增大的效力和/或作用持续时间，并且与已知的梭菌毒素治疗剂相比能够允许减少使 用的剂量(或者允许增大的剂量而没有任何额外的效应）。其中可W定义运些有利的性质 (它们代表治疗指数的增大）的一种方式是根据所述工程化的梭菌毒素的安全比。在运个方 面，通过测量一种相关的动物模型中体重减少的百分数(例如一种小鼠，其中体重减少是在 7天的施用内检测的），能够从实验上估计梭菌毒素的不受欢迎的效应（由所述毒素远离所 述施用位点的扩散引起的）。相反地，通过趾外展评分(DAS)分析一一一种肌肉擁痕量度，能 够从实验上估计梭菌毒素的理想的中祀效应。可W通过把20化配制在明胶憐酸缓冲液中的 梭菌毒素注射到小鼠脾肠肌/比目鱼肌复合体中，然后通过使用Aoki的方法估计趾外展评 分(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820:2001)来进行所述的DAS分析。在所述的DAS分析中，通 过尾部短暂地悬挂小鼠 W便引出一种特征性的吃惊反应，其中所述的小鼠伸展它的后肢并 且外展它的后趾。在注射梭菌毒素后，按照五点评分尺度(0 =正常至4 =趾外展和腿伸展减 少最大)对不同程度的趾外展进行打分。
[0043] 然后可W把一种梭菌毒素的安全比表示成在体重下降10%所需的毒素的量(在小 鼠中定量给药后第一个7天内在峰值效应下测得的）与DAS得分为2所需的毒素的量之间的 比率。因此，高安全比得分是理想的，并且指示一种能够有效地使一种祀肌肉擁痕并且具有 微小的不希望的脱祀效应的毒素。本发明的工程化的毒素具有的安全比高于对等的未修饰 的(天然）肉毒杆菌毒素具有的安全比。
[0044] 因此在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为8(例如至少8、9、 10、15、20、25、30、35、40、45或50)的安全比，其中安全比是运样计算的：体重变化-10%所需 的毒素的剂量(pg/小鼠）除WDASEDso(pg/小鼠）[抓50 =产生一个为2的DAS得分所需的剂 量]。
[004引在一个实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为10的安全比。在一个 实施方式中，本发明的工程化的梭菌毒素具有至少为15的安全比。
[0046] 本发明的工程化的梭菌毒素包含至少一个氨基酸修饰。所述的至少一个氨基酸修 饰增大所述梭菌毒素的Pl，如上所述。在本发明的上下文中，一种氨基酸修饰是一种梭菌毒 素的氨基酸序列的修饰。运样的一种修饰可W通过把所述序列中的一个氨基酸替换为另一 个氨基酸（即取代）、通过把一个新的氨基酸插入所述的序列中或者通过缺失所述序列的一 个氨基酸来实施。被插入蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸也被称为氨基酸残基。
[0047] 在蛋白质中发现的20种标准氨基酸如下所示：
[004引 表2:
[0049]
[0051 ]下列氨基酸被认为是带电荷的氨基酸：天冬氨酸（负的）、谷氨酸（负的）、精氨酸 (正的）和赖氨酸(正的）。
[00划在7.4的抑下，天冬氨酸(pKa 3.1)和谷氨酸(pKa 4.1)的侧链具有负电荷，同时精 氨酸(pKa 12.5)和赖氨酸(pKa 10.8)的侧链具有正电荷。天冬氨酸和谷氨酸被称为酸性的 氨基酸残基。精氨酸和赖氨酸被称为碱性的氨基酸残基。
[0053] 下列氨基酸被认为是不带电荷的极性的（意思是它们能够参与氨键结合)氨基酸： 天冬酷胺、谷氨酷胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半脫氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。
[0054] 下列氨基酸被认为是不带电荷的疏水的氨基酸：丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。
[0055] 通过向梭菌毒素中引入一个或更多个增大所述梭菌毒素中正电荷与负电荷的比 率的氨基酸修饰，能够实现所述的梭菌毒素的Pl的增大。
[0056] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰选自：氨基酸替换、氨基酸插入和 氨基酸缺失。
[0057] 在一种氨基酸替换中，形成所述梭菌毒素氨基酸序列的一部分的一个氨基酸残基 被一个不同的氨基酸残基所替代。所述的替代氨基酸残基可W是如上所述的20种标准氨基 酸中的一种。
[0058] 备选地，在一种氨基酸替换中，所述的替代氨基酸可W是一种非标准氨基酸(不是 上述20种氨基酸的标准组的一部分的一种氨基酸）。举例来说，所述的替代氨基酸可W是一 种碱性的非标准氨基酸，例如心鸟氨酸、L-2-氨基-3-脈基丙酸或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸 的D-异构体）。把非标准氨基酸引入蛋白质中的方法是本领域中已知的，并且包括使用大肠 杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。
[0059] 在一种氨基酸插入中，把另外一个氨基酸残基(正常不存在的一个氨基酸)渗入所 述的梭菌毒素的氨基酸序列中，从而增大了所述的序列中氨基酸残基的总 数。在一种氨基 酸缺失中，从所述的梭菌毒素氨基酸序列中除去一个氨基酸残基，从而减少了所述的序列 中氨基酸残基的总数。
[0060] 通过替换、插入或缺失氨基酸残基来修饰蛋白质的方法是本领域中已知的。举例 来说，可W通过对编码梭菌毒素的DNA序列的修饰来引入氨基酸修饰。运能够使用标准的分 子克隆技术来实现，例如通过定点诱变，其中采用一种聚合酶，使用为所要的氨基酸编码的 DNA的短链(寡核巧酸)来替代原编码序列，或者通过采用多种酶(例如连接酶和限制内切核 酸酶)插入/缺失所述基因的部分。备选地，能够化学合成修饰的基因序列。
[0061] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰选自：酸性的氨基酸残基被碱性 的氨基酸残基替代;酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代;不带电荷的氨基酸 残基被碱性的氨基酸残基替代;插入碱性的氨基酸残基；W及缺失酸性的氨基酸残基。
[0062] 在一种优选的实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰是替换，该替换有利地保 持所述梭菌毒素中氨基酸残基数相同。在一个实施方式中，所述的替换选自：酸性的氨基酸 残基被碱性的氨基酸残基替代、酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代W及不带 电荷的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代。在一个实施方式中，所述的碱性氨基酸残基 是赖氨酸残基或精氨酸残基。在一个实施方式中，所述的碱性氨基酸残基是赖氨酸残基。在 一个实施方式中，所述的碱性的氨基酸残基是精氨酸残基。在一个实施方式中，其中所述的 替换是酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代，所述的酸性的氨基酸残基被它的 相应的不带电荷的酷胺氨基酸残基替代（即天冬氨酸被天冬酷胺替代，W及谷氨酸被谷氨 酷胺替代）。
[0063] 本发明的工程化的梭菌毒素可W包含多于一个的氨基酸修饰。因此，在一个实施 方式中，所述工程化的梭菌毒素（如上所述)包含1至80个氨基酸修饰(例如1至70个、1至60 个、1至50个、4至40个、4至30个、5至40个、5至30个或10至25个氨基酸修饰）。在一个实施方 式中，所述工程化的梭菌毒素（如上所述)包含4至40个氨基酸修饰。在一个实施方式中，所 述工程化的梭菌毒素包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个氨基酸修饰。在 一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素包含至少4个氨基酸修饰(例如至少4个氨基酸替 换）。每一个所述的氨基酸修饰是如上所述的一个氨基酸修饰。因此，每一个所述的氨基酸 修饰都有助于所述工程化的梭菌毒素的Pl的增大(与缺乏所述的氨基酸修饰而其它方面相 同的梭菌毒素的Pl相比）。
[0064] 如上所述，任何梭菌毒素的氨基酸（即氨基酸残基)都能够被修饰，只要所述的修 饰的结果是增大所述梭菌毒素的Pl(如上所述）。然而，本发明人已经鉴定了特别适合用于 修饰的祀的梭菌毒素氨基酸的亚组。
[0065] 优选的祀氨基酸可W具有某些品质。举例来说，优选的祀氨基酸可W :(i)是表面 暴露的氨基酸；（ii)位于梭菌毒素蛋白二级结构的外面；（iii)位于梭菌毒素蛋白的区域 中，该区域不是蛋白质功能所必需的；（iv)是其同一性在梭菌毒素的类型、亚型或血清型之 间没有被保留的氨基酸；（iv)是其修饰没有产生预期的泛蛋白化位点的氨基酸;或(V)是前 述的任意组合。
[0066] 如上所述，梭菌毒素是由两条多肤链一具有大约IOOkDa的分子量的重链化-链)和 具有大约SOkDa的分子量的轻链化-链)形成的。所述的H-链包含C-末端祀向元件(受体结合 结构域或化结构域)和N-末端易位元件化N结构域）。
[0067] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)位于所述梭菌毒素受 体结合结构域化C结构域）中。
[0068] 轻链参考序列的例子包括：
[0069] 肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基1-448
[0070] 肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基1-440 [0071 ]肉毒杆菌Cl型神经毒素:氨基酸残基1-441
[0072] 肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基1-445
[0073] 肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基1-422
[0074] 肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基1-439
[0075] 肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基1-441
[0076] 破伤风神经毒素:氨基酸残基1-457
[oow]应当把上面鉴定的参考序列看作是一个指南，根据亚血清型（的不同），可W存在 轻微的变化。举例来说，US 2007/0166332(在此通过引用将其全文引入）引述了稍微不同的 梭菌序列：
[0078] 肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基Ml-K448
[0079] 肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基M1-K441
[0080] 肉毒杆菌Cl型神经毒素:氨基酸残基M1-K449
[0081 ]肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基Ml-R445
[0082] 肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基M1-R422
[0083] 肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基M1-K439
[0084] 肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基M1-K446 [00化]破伤风神经毒素:氨基酸残基M1-A457
[0086] 梭菌毒素出结构域参考序列的例子包括：
[0087] BONT/A-N872-L1296 [008引 BONT/B-E859-E1291
[0089] BoNT/C 广 N867-E1291
[0090] BONT/D-S863-E1276
[0091] BONT/E-R846-K1252
[0092] BONT/F-K865-E1274
[0093] BONT/G-N864-E1297
[0094] l'eNT-I880-D1315
[0095] 所述的梭菌毒素（例如BoNT)的H。结构域包含两个不同的结构特征，它们被称为 Hcc和出N结构域。在受体结合中所设及的氨基酸残基被认为主要位于所述的Hcc结构域中。
[0096] 在一个实施方式中，其中所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)位于所述梭菌毒 素受体结合结构域化C结构域）中，所述的至少一个氨基酸修饰位于所述梭菌毒素出N结构域 (也被称为一种便于易位的结构域）中。在一个实施方式中，其中所述的至少一个氨基酸修 饰(如上所述)位于所述梭菌毒素受体结合结构域化C结构域）中，所述的至少一个氨基酸修 饰位于所述梭菌毒素 H CC结构域中。
[0097] 梭菌毒素出N结构域参考序列的例子包括：
[0098] 肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基872-1110
[0099] 肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基859-1097
[0100] 肉毒杆菌Cl型神经毒素:氨基酸残基867-1111 [0101 ]肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基863-1098
[0102] 肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基846-1085
[0103] 肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基865-1105
[0104] 肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基864-1105
[0105] 破伤风神经毒素:氨基酸残基880-1127
[0106] 上述序列的位置可W根据血清型/亚型而稍微变化，并且合适的（参考)梭菌毒素 Hcn结构域的另外的例子包括：
[0107] 肉毒杆菌A型神经毒素:氨基酸残基874-1110
[0108] 肉毒杆菌B型神经毒素:氨基酸残基861-1097
[0109] 肉毒杆菌Cl型神经毒素:氨基酸残基869-1111
[0110] 肉毒杆菌D型神经毒素:氨基酸残基865-1098
[0111] 肉毒杆菌E型神经毒素:氨基酸残基848-1085
[0112] 肉毒杆菌F型神经毒素:氨基酸残基867-1105
[0113] 肉毒杆菌G型神经毒素:氨基酸残基866-1105
[0114] 破伤风神经毒素:氨基酸残基882-1127
[0115] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)是表面暴露的氨基酸 残基的修饰。表面暴露的氨基酸残基是存在于折叠的蛋白质的外部上的那些氨基酸，并且 因此易于接近周围溶剂，与位于所述的折叠的蛋白质内部中的那些氨基酸残基相反。一种 氨基酸残基的表面暴露程度W及因此它暴露于周围溶剂的程度取决于它在所述折叠的蛋 白质中的位置，也取决于所述蛋白质采用的构象。因此，与具有低表面暴露程度的氨基酸残 基的修饰相比，具有高表面暴露程度的氨基酸残基的修饰可能对所述蛋白质的等电点具有 更大的影响。测定氨基酸残基的表面暴露程度的方法是本领域中已知的。举例来说，能够使 用计算机程序ArealMol (CCP4计算机程序套件的一部分)来计算一种给定的蛋白质中氨基 酸残基的表面暴露程度。也可W通过检视蛋白质晶体结构(例如由X射线晶体学提供的）来 鉴定表面暴露的氨基酸残基。在一个实施方式中，表面暴露的氨基酸残基具有至少40的总 ArealMol值。
[0116] 在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰包括选自下列的氨基酸残基的修 饰:天冬氨酸残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酷胺残基、谷氨 酷胺残基、半脫氨酸残基或酪氨酸残基。本发明人已经鉴定了来自运个组的氨基酸残基(带 负电荷的残基和极性的残基)代表根据本发明用于修饰的特别合适的祀。不希望受任何一 种理论限制，本发明人相信，与没有列出的疏水的残基相比，运个组中的氨基酸残基W更大 的频率出现在梭菌毒素的表面上。
[0117] 在一个实施方式中，其中所述的氨基酸修饰包括选自下列的氨基酸残基的修饰： 天冬氨酸残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酷胺残基、谷氨酷 胺残基、半脫氨酸残基或酪氨酸残基(如上所述），所述的氨基酸残基被赖氨酸残基或精氨 酸残基替代。因此，在一个实施方式中，带负电荷的残基或极性的残基被带正电荷的残基替 代，从而增大了正电荷与负电荷的比率，并且增大了所述梭菌毒素的Pl。
[011引在一个实施方式中，所述的至少一个氨基酸修饰(如上所述)包含天冬酷胺氨基酸 残基或谷氨酷胺氨基酸残基(两者都是不带电荷的极性的残基）的修饰。在一个实施方式 中，所述的天冬酷胺或谷氨酷胺氨基酸残基被赖氨酸残基或精氨酸残基(两者都是带正电 荷的残基)替代。在一个实施方式中，所述的天冬酷胺或谷氨酷胺氨基酸残基被赖氨酸残基 替代。在一个实施方式中，所述的天冬酷胺或谷氨酷胺氨基酸残基被精氨酸残基替代。
[0119] 天冬酷胺和谷氨酷胺残基有利地适用于修饰，因为它们是极性的，只与其它残基 形成弱的偶极相互作用，并且构成典型的梭菌毒素分子(例如BoNT/A)的14%。
[0120] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A。一种参考BoNT/A序列具有 UniProtKB 检索号 P10845。
[0121] 本发明人已经鉴定了代表BoNT/A梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的祀的某些氨基 酸。
[0122] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 886、 ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、 HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086 和 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的 BoNT/A 的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个口1单 位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0123] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 886、 ASN 905、GLN 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、GLU 992、GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、 HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086 和 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0124] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述的工程化的BoNT/ A包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个）氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、 GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086 和化 N 1229;并且所述的氨基酸 修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、 其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述 的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨 基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基 替代。
[0125] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、GLN 995、 ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083和ASP 1086;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/ A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基 或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。 在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0126] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、 GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、 ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、沈R 1274和 T皿 1277;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的 BoNT/A 的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个口1单 位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0127] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、 GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、 ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、沈R 1274和 T皿 1277;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0128] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 905、化N 915、ASN 918、GLU 920、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UGLU 992、 GLN 995、ASN 1006、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1032、ASN 1043、ASN 1046、ASN 1052、ASP 1058、HIS 1064、ASN 1080、GLU 108UGLU 1083、ASP 1086、ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、 ASN 1216、GLN 1229、ASN 1242、ASN 1243、沈R 1274和 T皿 1277;并且所述的氨基酸修饰把 所述工程化的BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方 面相同的BoNT/A的Pl高至少1个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸 被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖 氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0129] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0130] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的pi高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中， 所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述 的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的 氨基酸被精氨酸残基替代。
[0131] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6个)氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0132] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述 的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基 酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0133] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0134] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 886、ASN 930、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施 方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括 所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0135] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0136] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中， 所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述 的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的 氨基酸被精氨酸残基替代。
[0137] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一种（例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、 沈R 955、化N 991、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0138] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基 酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0139] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0140] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施 方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括 所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0141] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、 GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/A的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0142] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5或6个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、 GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化 的BoNT/A的等电点（Pl)增大到一个值，该值比一个缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同 的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述 的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0143] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、或6)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/ A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基 或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。 在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0144] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基 酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0145] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0146] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列7个氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1025、ASN 1026、ASN 1052或 GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到一个值，该 值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施 方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括 所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0147] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、6或7个）氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、沈 R 1274、T皿 1277;并且所述的氨基酸修 饰把所述工程化的BoNT/A的等电点（pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其 它方面相同的BoNT/A的Pl高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个 Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0148] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、6或7个）氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、沈 R 1274、T皿 1277;并且所述的氨基酸修 饰把所述工程化的BoNT/A的等电点（pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其 它方面相同的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0149] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、6或7个）氨基酸的修饰:ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、沈 R 1274、T皿 1277;并且所述的氨基酸修 饰把所述工程化的BoNT/A的等电点（pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其 它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的 氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。
[0150] 在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0151] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列 8 个氨基酸的修饰：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增 大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少0.2(例如 至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所 述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨 酸残基替代。
[0152] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列 8 个氨基酸的修饰：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增 大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少0.5(例如 至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或I)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基 酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0153] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含下列 8 个氨基酸的修饰：ASN 1188、ASP 1213、GLY 1215、ASN 1216、ASN 1242、ASN 1243、SER 1274、THR 1277;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增 大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单 位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0154] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6或所有7个)氨基酸的修饰:ASN 930、SER 955、GLN 99UASN 1026、ASN 1052、HIS 1064和GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工 程化的BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同 的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖 氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸 残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0155] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或所有11个)氨基酸的修饰： ASN 886、ASN 930、ASN 954、沈R 955、GLN 99UASN 1026、ASN 1052、HIS 1064、ASN 1080、 ASN 1147和GLN 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/A的等电点(pi)增大到 一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/A的Pl高至少一个Pl单位。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个 实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的 修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0156] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/A，所述工程化的BoNT/A 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、或所有13个)氨基酸的 修饰：ASN 886、ASN 905、ASN 930、ASN 954、SER 955、GLN 991、ASN 1025、ASN 1026、ASN 1052、HIS 1064、ASN 1080、ASN 1147和化N 1229;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 BoNT/A的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/ A的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基 或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。 在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0157] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B。一种参考BoNT/B序列具有 UniProtKB 检索号 P10844。
[0158] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/B梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0159] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B，所述工程化的BoNT/B 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、 ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、化 U 1189、化 U 1252 和 ASN 1273;并且所述的氨基酸 修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、 其它方面相同的BoNT/B的Pl高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1) 个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基 替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0160] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B，所述工程化的BoNT/B 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、 ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、化 U 1189、化 U 1252 和 ASN 1273;并且所述的氨基酸 修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、 其它方面相同的BoNT/B的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个 实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的 修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0161] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/B，所述工程化的BoNT/B 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 873、 ASN 874、GLU 892、ASP 895、ASN 906、ASP 940、ASN 948、GLU 949、ASN 958、ASN 959、ASN 979、ASN 990、GLU 993、ASP 994、GLU 997、ASN 1012、ASN 1019、ASP 1030、ASP 1047、ASP 1049、GLU 1065、GLU 1072、GLN 1176、化 U 1189、化 U 1252 和 ASN 127 3;并且所述的氨基酸 修饰把所述工程化的BoNT/B的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、 其它方面相同的BoNT/B的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述 的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨 基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基 替代。
[0162] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/Ci。一种参考BoNT/Ci序列具有 UniProtKB 检索号 P18640。
[0163] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/Ci梭菌毒素中氨基酸修饰 的优选的祀。
[0164] 因此，在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/Ci，所述工程化的 BoNT/Ci包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个）氨基酸的修饰:ASN 88UASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、 ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 104UASP 1062、ASP 1064、GLU 1079和ASP 1081;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/Ci的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述 的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/Ci的Pl高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替 代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0165] 因此，在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/Ci，所述工程化的 BoNT/Ci包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个）氨基酸的修饰:ASN 88UASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、 ASP 996、ASN 1000、GLU 1036、ASN 104UASP 1062、ASP 1064、GLU 1079和ASP 1081;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/Ci的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述 的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/Ci的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或 1)个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残 基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施 方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0166] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/Ci，所述工程化的BoNT/Ci 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN881、ASP 898、GLU 916、GLU 927、ASN 952、ASN 964、ASN 965、ASN 984、GLU 985、ASP 986、ASP 996、 ASN 1000、GLU 1036、ASN 1041、ASP 1062、ASP 1064、GLU 1079 和 ASP 1081;并且所述的氨 基酸修饰把所述工程化的BoNT/Ci的等电点（pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸 修饰、其它方面相同的BoNT/Ci的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所 述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨 酸残基替代。
[0167] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D。一种参考BoNT/D序列具有 UniProtKB 检索号 P19321。
[0168] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/D梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0169] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D，所述工程化的BoNT/D 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、 ASN 979、GLU 1030、ASP 103UASP 1033、化U 1047、化U 105UASN 1052、化U 1066和化N 1122;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0170] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D，所述工程化的BoNT/D 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、 ASN 979、GLU 1030、ASP 103UASP 1033、化U 1047、化U 105UASN 1052、化U 1066和化N 1122;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9或I)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或 精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0171] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/D，所述工程化的BoNT/D 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 877、ASP 893、ASN 894、ASN 898、ASN 920、ASN 945、ASN 948、GLU 957、GLN 958、ASN 959、ASN 968、 ASN 979、GLU 1030、ASP 103UASP 1033、化U 1047、化U 105UASN 1052、化U 1066和化N 1122;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/D的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/D的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中所述的修饰包括所述的 氨基酸被精氨酸残基替代。
[0172] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E。一种参考BoNT/E序列具有 UniProtKB 检索号 Q00496。
[0173] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/E梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0174] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E，所述工程化的BoNT/E 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、 ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 98UASP 985、GLN 1014、 ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140;并且所述的氨基酸修饰把所述工程 化的BoNT/E的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/E 的 Pl 高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一 个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实 施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0175] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E，所述工程化的BoNT/E 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、 ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 98UASP 985、GLN 1014、 ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140;并且所述的氨基酸修饰把所述工程 化的BoNT/E的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/E的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中， 所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述 的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的 氨基酸被精氨酸残基替代。
[0176] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/E，所述工程化的BoNT/E 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15、20或25个)氨基酸的修饰:ASN 859、 ASP 860、ASN 892、ASP 893、ASP 904、ASP 909、ASN 928、ASN 932、ASN 934、ASN 935、GLU 936、ASP 945、ASN 946、ASN 947、ASN 966、ASN 976、ASN 979、ASN 98UASP 985、GLN 1014、 ASN 1019、ASN 1022、ASP 1027、ASN 1035和ASN 1140;并且所述的氨基酸修饰把所述工程 化的BoNT/E的等电点(Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的 BoNT/E的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残 基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0^7]在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F。一种参考BoNT/F序列具有 UniProtKB 检索号 YP_001390123。
[0178] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/F梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0179] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F，所述工程化的BoNT/F 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、 ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP 1056;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的PI高至少0.2 (例如至少0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨 酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0180] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F，所述工程化的BoNT/F 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、 ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP 1056;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的PI高至少0.5 (例如至少0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或 精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0181] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/F，所述工程化的BoNT/F 包含选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10、15或20个)氨基酸的修饰:ASN 879、ASP 896、ASN 922、ASN 923、ASN 928、ASN 947、ASN 950、ASN 952、ASN 953、GLU 954、ASN 963、 ASN 964、ASN 965、ASN 987、GLN 997、ASN 1037、ASP 1040、ASP 1045、ASN 1055和ASP 1056;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/F的等电点(pi)增大到一个值，该值比 缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/F的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式 中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所 述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述 的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0182] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G。一种参考BoNT/G序列具有 UniProtKB 检索号 Q60393。
[0183] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表作为BoNT/G梭菌毒素中氨基酸修饰的 优选的祀。
[0184] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G，所述工程化的BoNT/G 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、 ASN IOOUASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的 氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的Pl高至少0.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9或1)个PI单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或 精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0185] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G，所述工程化的BoNT/G 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、 ASN IOOUASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的 氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的Pl高至少0.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1) 个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基 替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0186] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是BoNT/G，所述工程化的BoNT/G 包含选自下列的至少一个（例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASP 900、ASN 909、ASN 910、GLU 912、ASN 913、ASN 945、ASN 947、GLU 956、ASN 965、ASP 966、ASN 986、 ASN IOOUASN 1038、ASP 1040、ASN 1046、ASP 1057、GLU 1073、ASN 1075和ASN 1090;并且 所述的氨基酸修饰把所述工程化的BoNT/G的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的 氨基酸修饰、其它方面相同的BoNT/G的Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 精氨酸残基替代。
[0187] 在一个实施方式中，所述工程化的梭菌毒素是TeNT。一种参考TeNT序列具有 UniProtKB 检索号 P04958。
[0188] 本发明人已经鉴定了某些氨基酸，它们代表TeNT梭菌毒素中氨基酸修饰的优选的 祀。
[0189] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含 选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、 ASP 91UASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 TeNT的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的 Pl高至少〇.2(例如至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方 式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中， 所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所 述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0190] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含 选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、 ASP 91UASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 TeNT的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的 Pl高至少〇.5(例如至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1)个91单位。在一个实施方式中，所述的修 饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包 括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被 精氨酸残基替代。
[0191] 在一个实施方式中，其中所述工程化的梭菌毒素是TeNT,所述工程化的TeNT包含 选自下列的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、10或15个)氨基酸的修饰:ASN 893、ASP 894、 ASP 91UASN 919、ASN 927、ASN 928、GLU 929、GLN 968、ASN 972、GLU 973、GLU 1010、ASP 1018、ASN 1079、ASN 1080、ASN 1081和ASN 1097;并且所述的氨基酸修饰把所述工程化的 TeNT的等电点（Pl)增大到一个值，该值比缺乏所述的氨基酸修饰、其它方面相同的TeNT的 Pl高至少一个Pl单位。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基或 精氨酸残基替代。在一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被赖氨酸残基替代。在 一个实施方式中，所述的修饰包括所述的氨基酸被精氨酸残基替代。
[0192] 本发明适用于许多不同的种类的梭菌毒素。因此，在本发明的上下文中，术语"梭 菌毒素"包括由肉毒梭菌（肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、Ci、D、E、F和G)、破伤风梭菌(破伤 风神经毒素）、下酸梭菌（肉毒杆菌神经毒素血清型E)和己氏梭菌（肉毒杆菌神经毒素血清 型F) W及修饰的梭菌毒素或源于任何前述的衍生物生产的毒素。术语"梭菌毒素"也包括肉 毒杆菌神经毒素血清型H。
[0193] 肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是由肉毒梭菌W-种大的蛋白质复合物的形式生产的， 该复合物由自身与多个辅助蛋白复合的BoNT组成成。目前有8种不同的类别的肉毒杆菌神 经毒素，即：肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、Ci、D、E、F、G和H，所有运些共有相似的结构和作 用模式。基于被特异性的中和抗血清失活能够区分不同的BoNT血清型，运种通过血清型的 分类与在所述的氨基酸水平上序列同一性百分比相关。基于氨基酸的序列同一性百分比， 进一步把给定的血清型BoNT蛋白质划分成不同的亚型。 [0194] BoNTs被吸收到胃肠道中，并且在进入大循环W后，与胆碱能神经末端的突出前膜 结合并且阻止它们的神经递质乙酷胆碱的释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割突触 小泡蛋白/与小泡缔合的膜蛋白（VAMP) ;BoNT/Ci、BoNT/A和BoNT/E切割与突触小体缔合的 25kDa的蛋白（SNAP-25);而BoNT/Ci切割突触融合蛋白。
[0195] 破伤风毒素是由破伤风梭菌W单一的血清型生产。下酸梭菌生产BoNT/E，同时己 氏梭菌生产BoNT/F。
[0196] 术语"梭菌毒素"也意图包括修饰的梭菌毒素及其衍生物，包括但不限于下面描述 的那些。一种修饰的梭菌毒素或衍生物可W包含与梭菌毒素的天然(未修饰的)形式相比已 经被修饰的一个或更多个氨基酸，或可W包含不存在于所述梭菌毒素的天然(未修饰的）形 式中的插入的一个或更多个氨基酸。举例来说，与天然(未修饰的)梭菌毒素序列相比，一种 修饰的梭菌毒素可W在一个或更多个结构域中含有修饰的氨基酸序列。运样的修饰可W改 变所述毒素的功能方面，例如生物学活性或持久性。因此，在一个实施方式中，本发明所述 的工程化的梭菌毒素是工程化的修饰的梭菌毒素，或工程化的修饰的梭菌毒素衍生物，或 工程化的梭菌毒素衍生物。
[0197] 修饰的梭菌毒素可W在所述重链的氨基酸序列（例如一种修饰的化结构域）中具 有一个或更多个修饰，其中所述修饰的重链W比所述的天然(未修饰的)梭菌毒素更高或更 低的亲和性与祀神经细胞结合。在所述化结构域中运样的修饰能够包括修饰所述化结构域 的神经节巧脂结合位点中或所述蛋白质（SV2或突触结合蛋白）结合位点中的残基，该修饰 改变了与所述的祀神经细胞的神经节巧脂受体和/或所述蛋白质受体的结合。运样的修饰 的梭菌毒素的例子被描述在WO 2006/027207和WO 2006/114308中，在此通过引文全文引入 它们两者。
[0198] 修饰的梭菌毒素可W在所述的轻链的氨基酸序列中具有一个或更多个修饰，例如 在底物结合或催化结构域中的修饰，该修饰可W改变或修饰所述修饰的LC的SNARE蛋白特 异性。运样的修饰的梭菌毒素的例子被描述在WO 2010/120766和US 2011/0318385,在此通 过引文全文引入它们两者。
[0199] 修饰的梭菌毒素可W包含增大或减小所述的修饰的梭菌毒素的生物学活性和/或 生物学持久性的一个或更多个修饰。例如一种修饰的梭菌毒素可W包含一个基于亮氨酸或 酪氨酸的基序，其中所述的基序增大或减小所述的修饰的梭菌毒素的生物学活性和/或生 物学持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括址xxxLL、xExxxLL、xExxxIL和xExxxLM(其中X是 任何氨基酸）。合适的基于酪氨酸的基序包括Y-X-X-Hy (其中Hy是一种疏水的氨基酸）。包含 基于亮氨酸和酪氨酸的基序的修饰的梭菌毒素的例子被描述在WO 2002/08268,在此通过 引文将其全文引入。
[0200] 术语"梭菌毒素"意图包括杂合体和嵌合体梭菌毒素。一种杂合体梭菌毒素包含来 自一种梭菌毒素或其亚型的一条轻链的至少一部分和来自另一种梭菌毒素或梭菌毒素亚 型的一条重链的至少一部分。在一个实施方式中，所述的杂合体梭菌毒素可W包含来自一 种梭菌毒素亚型的一条轻链的整条轻链和来自另一种梭菌毒素亚型的重链。在另一个实施 方式中，一种嵌合体梭菌毒素可W包含一种梭菌毒素亚型的重链的一部分(例如所述的结 合结构域），所述重链的另一部分来自另一种梭菌毒素亚型。类似地或备选地，所述的治疗 性元素可W包含来自不同的梭菌毒素的轻链部分。运样的杂合体或嵌合体梭菌毒素是有用 的，例如作为一种递送手段，把运样的梭菌毒素的治疗益处递送到对一种给定的梭菌毒素 亚型有免疫抗性的患者，递送到可W具有低于平均的一种给定的梭菌毒素重链结合结构域 的受体浓度的患者，或递送到可W具有所述膜或小泡毒素底物的抗蛋白酶的变体（例如 SNAP-25、VAMP和突触融合蛋白）的患者。杂合体和嵌合体梭菌毒素被描述在US 8，071，110 中，在此通过引文将该文献全文引入。因此，在一个实施方式中，本发明所述的工程化的梭 菌毒素是工程化的杂合体梭菌毒素或工程化的嵌合体梭菌毒素。
[0201] 术语"梭菌毒素"意图包括再祀向的梭菌毒素。在一种再祀向的梭菌毒素中，所述 的梭菌毒素被修饰而包含已知作为祀向部分(TM)的外源配体。选择所述的TMW提供对一种 所要的祀细胞的结合特异性，并且作为所述的再祀向过程的一部分，所述的梭菌毒素的天 然结合部分(例如所述的出结构域或所述的出C结构域)可W被除去。再祀向技术例如被描述 在：EP-B-0689459;W01994/021300;EP-B-0939818;US6，461,617;US7，192，596;WO 1998/ 007864；EP-B-0826051；US5,989,545；US 6,395,513；US 6,962,703；W0 1996/033273；EP-B-0996468；US7,052,702；W01999/017806；EP-B-1107794；US6,632,440；W02000/010598；WO 2001/21213；W0 2006/059093；WO 2000/62814；W0 2000/04926；W0 1993/15766；W0 2000/ 61192;和WO 1999/58571中，在此通过引文把所有运些文献全文引入。因此，在一个实施方 式中，本发明所述的工程化的梭菌毒素是工程化的再祀向的梭菌毒素。
[0202] 本发明也包括具有非天然蛋白酶切割位点的梭菌毒素。在运样的梭菌毒素中，天 然的蛋白酶切割位点（也被称为活化位点，如上所述)被修饰或被一个蛋白酶切割位点替 代，该切割位点不是该梭菌毒素天然有的（即一个外源性切割位点）。运样的位点将会需要 外源性蛋白酶进行切割，运允许改善的对切割事件的时机和位置的控制。可W被用在梭菌 毒素中的非天然蛋白酶切割位点包括：
[0203] 肠激酶 （孤孤K丄）
[0204] 因子 Xa (IEGR 丄/IDGR 丄）
[020引 TEV(烟草蚀刻病毒） 化NLYFQ丄G)
[0206] 凝血酶 （LVPRiGS)
[0207] PreScission (LEVLFQiGP)〇
[0208] 另外的蛋白酶切割位点包括被无细胞毒性的蛋白酶(例如被所述的梭菌神经毒素 的轻链)切割的识别序列。运些包括被无细胞毒性的蛋白酶(例如所述的梭菌神经毒素的轻 链)切割的所述SNARE(例如SNAP-25、突触融合蛋白、VAMP)蛋白质识别序列。包含非天然蛋 白酶切割位点的梭菌毒素被描述在US 7,132，259、EP 1206554-B2和US 2007/0166332中， 在此通过引文把所有运些文献全文引入。术语蛋白酶切割位点也包括一种内含肤，它是一 种自切割序列。自剪接反应是能够控制的，例如通过改变存在的还原剂的浓度。
[0209] 本发明也包括包含"毁灭性切割位点"的梭菌毒素。在所述的梭菌毒素中，在一个 选定的位置，非天然的蛋白酶切割位点被渗入所述的梭菌毒素中，使得在所述位点的切割 将会减小所述梭菌毒素的活性或失活它如果在施用后，所述的梭菌毒素迁移到非祀向的位 置，那么所述破坏性的蛋白酶切割位点可能易受局部蛋白酶切割。合适的非天然蛋白酶切 割位点包括上述的那些。包含破坏性切割位点的梭菌毒素被描述在WO 2010/094905和WO 2002/044199中，在此通过引文全文引入它们两者。
[0210] 本发明所述的工程化的梭菌毒素，尤其是其轻链组分，可W是聚乙二醇化的一一 运可W帮助增大稳定性，例如所述的轻链组分的作用持续时间。当所述的轻链包含BoNT/A、 B或Cl蛋白酶时，聚乙二醇化是特别优选的。聚乙二醇化优选地包括把PEG添加到所述的轻 链组分的N-末端。举例来说，一条轻链的N-末端可W是被一个或更多个氨基酸(例如半脫氨 酸)残基延长，该残基可W是相同的或不同的。一个或更多个所述的氨基酸残基可W具有它 自己的与其相连的（例如共价连接的）PEG分子。运种技术的一个例子被描述在W02007/ 104567中，在此通过引文将其全文引入。
[0211] 本发明所述的工程化的梭菌毒素可W没有所述的复合蛋白，该复合蛋白存在于天 然存在的梭菌毒素复合物中。
[0212]本发明的工程化的梭菌毒素也可W包含数量有限的非标准氨基酸。因此，除了所 述的20种标准氨基酸W外，也可W用非标准氨基酸(例如4-径基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、 2-氨基异下酸、异鄉氨酸和a-甲基丝氨酸)来替代本发明所述的工程化的梭菌毒素的氨基 酸残基。数量有限的非保守性的氨基酸、没有被遗传密码编码的氨基酸和非天然的氨基酸 可W被用来替代梭菌多肤的氨基酸残基。本发明所述的工程化的梭菌毒素也能够包含非天 然存在的氨基酸残基。
[021引非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺 式-4-径基脯氨酸、反式-4-径基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基-苏氨酸、径基-乙 基半脫氨酸、径基乙基高半脫氨酸、硝基谷氨酷胺、高谷氨酷胺、派可酸、叔亮氨酸、正鄉氨 酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯基-丙氨酸、4-氮杂苯基-丙氨酸和4-氣苯丙氨酸。本领域中 已知有几种方法用于把非天然存在的氨基酸残基渗入蛋白质中。例如可W采用一种体外系 统，其中使用W化学方法氨酷化的抑制子tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨酷化 tRNA的方法是本领域中已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译是在包含大肠杆菌S30 提取液和可商业得到的酶和其它试剂的不含有细胞的体系中进行的。通过层析法纯化蛋白 质。参见，例如R0be;rt son 等人，J .Am.畑 em. Soc .113:2722.1991; El Iman 等人，Methods Enzymol .202:301,1991; Chung 等人，Science 259:806-9,1993;和 Chung 等人， Proc .Natl .Acad. Sci .USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，翻译是通过显微注射突变 的mRNA和W化学方法氨酷化的抑制子tRNAs在非洲爪赡卵母细胞中进行的（Turcatti等人， J. Biol. Chem. 271:19991-8,1996)。在第S种方法中，在不存在将要被替换的天然氨基酸 (例如苯丙氨酸)并且存在所要的非天然存在的氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙 氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氣苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将所述的非天然存在 的氨基酸渗入所述的多肤中，替代它的天然对应物。参见，Koide等人，Biochem. 33:7470-6， 1994。
[0214] 使用重组核酸技术能够生产本发明所述的工程化的梭菌毒素。因此，在一个实施 方式中，工程化的梭菌毒素(如上所述)是重组的工程化的梭菌毒素。
[0215] 在另一个方面中，本发明提供一种核酸(例如DNA)，其包含编码如上所述的工程化 的梭菌毒素的核酸序列。在一个实施方式中，所述的核酸序列是作为包含启动子和终止子 的DNA载体的一部分而被制备的。
[0216] 一种优选的实施方式，所述的载体具有选自下列的启动子：
[0217] 启动子 诱导剂 典型的诱导条件
[021 引 化。（杂合体） IPTG 0.2mM( 0.05-2. OmM)
[0219] AraBAD 心阿拉伯糖 0.2% (0.002_0.4%)
[0220] T7-lac 操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2. OmM)
[0221] 在另一种优选的实施方式中，所述的载体具有选自下列的启动子：
[0222] 启动子 诱导剂 典型的诱导条件
[0223] 化。（杂合体） IPTG 0.2mM( 0.05-2. OmM)
[0224] AraBAD 心阿拉伯糖 0.2% (0.002_0.4%)
[022引 T7-lac 操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2. OmM)
[0226] 巧-iac 操纵基因 IPTG 0.2mM(0.05-2. OmM)
[0227] 可W使用本领域中已知的任何合适的方法来制备本发明所述的核酸分子。因此， 可W使用化学合成技术来制备所述的核酸分子。备选地，可W使用分子生物学技术来制备 本发明所述的核酸分子。
[0228] 本发明所述的DNA构建物优选地是在电脑中被设计，然后通过常规的DNA合成技术 被合成的。
[0229] 根据将要被采用的最终的宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，任选地针对密码子 偏倚修饰上述的核酸序列信息。
[0230] 在一个实施方式中，编码如上所述的工程化的梭菌毒素的所述核酸序列是一种核 酸序列，它与选自SEQ ID NOs: 3、5、7和9的一种核酸序列具有至少70% (例如至少75、80、 85、90、95、97、98或99%)的序列同一性。
[0231] 在一个方面中，本发明提供一种核酸序列，它与选自SEQ ID N0s:3、5、7和9的一种 核酸序列具有至少70% (例如至少75、80、85、90、95、97、98或99%)的序列同一性。在一个实 施方式中，所述的核酸序列与选自SEQ ID N0s:3、5、7和9的核酸序列具有至少90%的序列 同一性。
[0232] 本发明也提供由如上所述的核酸序列编码的多肤。因此，在一个方面中，本发明提 供包含氨基酸序列的多肤，该氨基酸序列与选自SEQ ID N0s:4、6、8和10的氨基酸序列具有 至少70 % (例如至少75、80、85、90、95、97、98或99 % )的序列同一性。在一个实施方式中，所 述的氨基酸序列与选自SEQ ID N0s:4、6、8和10的氨基酸序列具有至少90%的序列同一性。
[0233] 在一个实施方式中，本发明所述的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的 BoNT/A，并且所述的工程化的BoNT/A包含氨基酸序列（或由其组成），该氨基酸序列与选自 SEQ ID N0s:4、6、8和10的一种氨基酸序列具有至少70% (例如至少75、80、85、90、95、97、 98、99、99.5或99.9%)的序列同一性。
[0234] 在一个实施方式中，本发明所述的工程化的梭菌毒素是如上所述的工程化的 BoNT/A，并且所述的工程化的BoNT/A包含SEQ ID N0:4、6、8或10的氨基酸序列（或由其组 成)。
[0235] 在一个方面中，本发明提供一种多肤，它包含SEQ ID N0:4、6、8或10的氨基酸序列 (或由组成）。
[0236] 在一个方面中，本发明提供一种编码如上所述的工程化的梭菌毒素的核酸，其中 所述的核酸包含一种核酸序列，该核酸序列与选自SEQ ID NOs :3、5、7和9的核酸序列具有 至少70% (例如至少75、80、85、90、95、97、98、99、99.5或99.9%)的序列同一性。在一个实施 方式中，所述的核酸包含SEQ ID N0:3、5、7或9的核酸序列(或由其组成）。
[0237] 在一个方面中，本发明提供一种核酸，它包含SEQ ID N0:3、5、7或9的核酸序列(或 由其组成）。
[0238] 在两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的"序列同一性百分数"是所述序列共有 的相同位置的数量的函数。因此可W运样计算同一性％:相同的核巧酸/氨基酸的数量除W 核巧酸/氨基酸的总数，乘W100。计算序列同一性％也可W考虑需要引入W优化两个或更 多个序列的比对的空位的数量W及每个空位的长度。在两个或更多个序列之间的序列比较 和同一性百分比的确定可W使用特定的数学算法(例如BLAST)来进行，该算法对于技术人 员来说是熟悉的。
[0239] 在一个方面中，本发明提供一种生产单链工程化的梭菌毒素蛋白的方法，该蛋白 具有一条轻链和一条重链，所述的方法包括在一种合适的宿主细胞中表达一种核酸(所述 的核酸如上所述），裂解所述的宿主细胞W提供包含所述的单链工程化的梭菌毒素蛋白的 宿主细胞匀浆液，并且分离所述的单链工程化的梭菌毒素蛋白。
[0240] 在另一个方面中，本发明提供一种活化工程化的梭菌毒素的方法，所述的方法包 括提供一种能够通过如上所述的生产单链工程化的梭菌毒素蛋白的方法得到的单链工程 化的梭菌毒素蛋白，使所述的多肤与切割所述多肤的蛋白酶在位于所述的轻链和重链之间 的识别位点（切割位点）处接触，从而把所述的多肤转化为一种双链多肤，其中通过二硫键 把所述的轻链和重链连接在一起。
[0241] 本发明所述的工程化的梭菌毒素可W被用来预防或治疗某些医学或美容性疾病 和状况。因此，在另一个方面中，本发明提供如上所述的工程化的梭菌毒素，其用于医药中。
[0242] 在一个相关的方面中，本发明提供如上所述的工程化的梭菌毒素，其用于预防或 治疗选自下列的一种疾病或状况:斜视、眼险疫李、斜眼、张力失常(例如疫李性张力失常、 口飄肌张力失常、病灶性张力失常、迟发性张力失常、喉部张力失常、四肢张力失常、颈肌张 力失常）、斜颈（例如疫李性斜颈）、受益于细胞/肌肉无能的美容治疗（美容性)应用（经由 SNARE下调或失活）、神经肌肉病症或眼能动性状况(例如共同性斜视、垂直斜视、外直肌擁 痕、眼球震颤、甲状腺机能障碍性肌病）、指疫李、眼险疫李、夜磨牙症、肝豆状核变性、震颤、 抽摇、节段性肌阵李、疫李、由慢性多发性硬化症引起的疫李状态、导致异常的膀脫控制的 疫李状态、男性意像、背部疫李、四头肌僵痛、紧张性头疼、提肌骨盆综合征、脊柱裂、迟发性 运动障碍、帕金森氏病、口吃、半面疫李、眼险病、脑性擁痕、病灶性疫李状态、疫李性结肠 炎、神经源性膀脫、肛口疫李、四肢疫李状态、抽摇、震颤、夜磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困 难、流泪、多汗症、过度流诞、过度胃肠分泌、肌肉疼痛(例如来自肌肉疫李的疼痛）、头疼疼 痛(例如紧张性头疼）、额沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器-神经 疾病、慢性神经原性炎症和平滑肌病症。
[0243] 在使用中，本发明使用一种药物组合物，其包含工程化的梭菌毒素与至少一种选 自下列的组分:药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐。
[0244] 可W配制本发明所述的工程化的梭菌毒素使其用于口、胃肠外、连续的输注、吸入 或局部应用。适用于注射的组合物可W呈溶液、混悬液或乳液的形式或呈干粉形式，在使用 前把所述干粉溶解或混悬在合适的赋形剂中。
[0245] 在将要被局部递送的所述工程化的梭菌毒素的情形中，所述工程化的梭菌毒素可 W被配制成乳膏(例如用于局部应用），或用于皮下注射。
[0246] 局部递送手段可W包括气溶胶或其它喷雾剂(例如喷雾器）。在运个方面，工程化 的梭菌毒素的气溶胶制剂确保递送到肺和/或其它鼻的和/或支气管的或气道的通道。
[0247] 可W在参与受影响的器官的神经支配的脊髓节段的水平，通过銷内或硬膜外注射 到脊柱中，来给患者施用本发明的工程化的梭菌毒素。
[0248] 优选的施用途径是经由腹腔镜检查和/或局部化的，特别肌肉内注射。
[0249] 施用本发明所述的工程化的梭菌毒素的剂量范围是将要产生所要的治疗效果的 那些剂量范围。应当理解所需的剂量范围取决于所述工程化的梭菌毒素或组合物的精确本 性、施用途径、所述制剂的本性、患者的年龄、患者状况的本性、程度或严重程度、禁忌症(如 果有的话)和主治医师的判断。能够使用用于最优化的标准经验途径来调节运些剂量水平 的变化。
[0250] 合适的每日剂量(每kg患者的体重）在0.0001-lng/kg,优选地在0.0001-0.5ng/ kg，更优选地在0.002-0.5ng/kg，特别优选地在0.004-0.5ng/kg范围内。所述的单位剂量能 够在少于1皮克(Pg)至30ng剂量内变化，但是典型地将会在0.01至Ing/剂量的范围内，可W 每日一次地施用该剂量或优选地不那么频繁地，例如每星期一次地或6个月一次地施用。
[0251] 一种特别优选的定量给药方案基于0.05ng工程化的梭菌毒素作为所述的IX剂量。 在运个方面，优选的剂量在1X-100X(即0.05-5ng)范围内。
[0252] 流体剂型典型地是利用所述工程化的梭菌毒素和不含热原的无菌载体制备的。取 决于所用的载体和浓度，能够把所述工程化的梭菌毒素溶解或混悬在载体中。在制备溶液 时，载体，如果必要的话，通过添加氯化钢把所述溶液制成等渗的，并且通过使用无菌技术 通过无菌过滤器过滤来灭菌，然后填充到合适的无菌小瓶或安飯中并且密封。备选地，如果 溶液稳定性是足够的，则可W通过高压灭菌法把所述的处于密封容器中的溶液灭菌。有利 地，可W把添加剂例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、混悬剂或乳化剂和或局部 麻醉剂溶解在载体中。
[0253] 干粉(在使用前将其溶解或混悬在一种合适的载体中）可W通过在无菌区使用无 菌技术把预先灭菌的组分填充在无菌容器中来制备。备选地，可W在无菌区使用无菌技术 把所述的组分溶解在合适的容器中。然后把产品冷冻干燥，并且把容器无菌密封。
[0254] 除了把无菌组分混悬而不是溶解在无菌载体中并且灭菌不能够通过过滤完成外， W实质上相同的方式制备适用于肌肉内、皮下或皮内注射的胃肠外混悬剂。可W W无菌状 态分离所述的组分或备选地，可W在分离后把组分灭菌，例如通过伽马照射。
[0255] 有利地，把混悬剂例如聚乙締化咯烧酬包含在所述组合物中W促进所述组分的均 匀分布。
[0256] 根据本发明的施用可W利用多种递送技术，包括微粒包裹、病毒递送体系或高压 气溶胶冲击。
[0巧7] 附图描述 [0巧引 图1
[0259] 阳离子构建体的等电点聚焦(IEF)凝胶。
[0260] 图2
[0261] 在大鼠胚胎脊髓神经元（eSCN)中，Cat5v2化 1064H/N954K) (A)、Cat5v2化 1064H/ N88 服）（B)和 Cat5v2 化 1064H/N1025KKC)的 SNAP-25 切割百分数 W 及相对于 nBoNT/Al 的 PEC50的汇总表。把(A、B、C)大鼠胚胎脊髓神经元培养S个星期并且用化巧v4处理2地，然后 用SNAP-25特异性的抗体进行蛋白质印迹分析。数据是来自S个独立实验的一式S份的平 均值±SEMd(D)在大鼠 eSCN SNAP-25切割效力分析中，Cat5v2化 1064H/N88服），Cat5v2 (K1064H/N954K)和Cat5v2(K1064H/N1025K)相对于nBoNT/AU Li St Biological Laboratories)的效力。基于一个8-点浓度响应曲线（CRC)，每一个点对应于单一批次并且 是3次独立的祀巧0测定的平均值。一式S份评估所述CRC中的每一个浓度。把效力比较制成 目录批、合并的数据n = 24的平均值。数据是每种化巧v4的n = 3批的平均值±SEM。
[0262] 图3
[026引在小鼠隔神经偏侧隔分析(mPNHD)中，nBoNT/A巧日化巧v4的效力(tso)。按照所指示 的那样，把小鼠隔神经偏侧隔组织与化巧v4或天然BoNT/Al-起溫育。记录隔膜的收缩力， 直到不再能检测到收缩或140分钟W后为止。每一个点对应于独立的测定。tso值是把小鼠偏 侧隔的收缩力抑制50%所需要的时间。
[0264] 序列
[026引 沈Q ID NO:1.B0NT/A1 核酸序列。
实施例
[0655]下列实施例用于举例说明本发明的【具体实施方式】，并且不W任何方式限定权利要 求书中所定义的本发明的保护范围。
[0化6] 实施例1
[0657] 生产了根据本发明的工程化的BoNT/Al分子的3个不同实例。
[0658] 使用多个不同的标准筛选了被选择用于修饰的氨基酸(突变位点）。
[0659] 残基替换的标准如下：
[0660] 1.残基的类型；
[0661] 2.表面暴露程度；
[0662] 3.关于二级/S级结构的位置；
[0663] 4.关于BoNT的已知功能性结构域的位置；
[0664] 5.遍及所述BoNT/A或BoNT/E亚型的序列保守度；
[066引6.引入另外一个遍在蛋白化位点的概率。
[0666] 在运个实施例中，选择天冬酷胺(Asn，N)和谷氨酷胺(Gin, Q)用于突变因为它们是 极性的，尺寸与Lys相似，仅仅与其它残基形成较弱的偶极相互作用，并且所述分子的14% 是由运两种残基构成的。
[0667] 从BoNT/Al(PDB ID:3BTA)的晶体结构中鉴定了在所述分子的表面上可见的Asn和 Gln残基。运确保所有被替换的残基将能够在外面上展示它们的电荷。通过应用上述筛选标 准(迭代法）的3-5点，可能从运个目录中排除掉不太适用于替换的那些残基.
[0668] 从与BoNT/A和功能上相似的BoNT/E血清型的其它亚型的比对中鉴定了 BoNT/Al内 的非保守残基。把在其它序列中表现为碱性残基的那些残基选择作为用于替换的头等候选 者。
[0669] 在通过上述章节提到的筛选标准的连续反复多轮后，鉴定了最终的候选残基目 录。筛选运些用于潜在产生另外的遍在蛋白化共有序列（利用CKSAAP_UbSite服务器）。通过 把所述的替代赖氨酸改变为精氨酸，把被鉴定出来的很少几个残基除去了。
[0670] 合成的用于BoNT/Al序列的最终实例的阳离子构建体被列于下面，命名为化t-A、 化t-B和化t-C。每种构建体具有149,637道尔顿的分子量。
[0671 ] Cat-A:N930K，S955K，Q991K，N1026K，N1052K，Ql229K，N886K。
[0672] Cat-B:N930K，S955K，Q991K，N1026K，N1052K，Ql229K，N954K。
[0673] Cat-C:N930K，S955K，Q991K，N1026K，N1052K，Ql229K，N1025K。
[0674] 实施例2
[0675] 针对能够被Lys或Arg替代的潜在的残基，评估了所述的BoNT/B、F和E的氨基酸序 列。运种初始的评估鉴定了能够被替换而产生具有增大的Pl的BoNT/B、E或F蛋白质的残基。
[0676] 分析了 BoNT/B(Ac:P10844)、BoNT/E(Ac:Q00496)和 BoNT/F(Ac:P30996)的一级序 列，并且将氨基酸组成汇总在下表中：
[0677] 表3:
[0679] 从该表中，根据对BoNT/Al的观察，类似地有大量极性的Asn/Gln残基存在于所述 的氨基酸序列中。也有相对大量的酸性的(Asp/Glu)残基，运些残基潜在地能够被改变成它 们相应的中性残基(Asn/Gln)或碱性残基(LyS或Arg)。
[0680] 实施例3
[0681 ]用于修饰的优选的梭菌毒素氨基酸的鉴定。
[0682] BoNT/A、BoNT/B和BoNT/E的全长结构数据是可W得到的；然而对于其余的四种血 清型，基于序列和相关的结构同源性，使用LOOPP计算机程序产生了理论模型。
[0683] 通过ArealMol(CCP4套件)分析了每一种结构，并且把暴露的残基鉴定为具有大于 40的总值。具有极性侧链的残基选自运个目录，并且从运个目录中优选酸性的残基(Asp和 Glu)或具有H-键受体侧链的残基(Asn和Gin)。最后的计算步骤设及基于来自所述的Stride 服务器的分析数据，选择在a-螺旋和e-链的之间的残基。检视每一个分子的结构W鉴定位 于界面区域内的残基-避开运些残基。
[0684] 对于BoNT/Al，给优选的残基目录补充了在至少90%的所有比对的序列中功能上 非保守的残基[大的非极性的侧链(16*、？'0、？116、1'巧)被认为是等同的，小的非极性的侧链 (Gly、Ala、化l、Leu、化)被认为是等同的，酸性的侧链(Asp、Glu)被认为是等同的，并且碱性 的侧链(Arg、Lys)被认为是等同的]。更具体地，在至少10%的所述序列中表现为碱性的残 基的那些非保守残基W及所述参考序列中的非保守的Asn、Gln、Asp或Glu被选择作为候选 者。
[0685] 对于其余的血清型，在亚型之间进行多重的序列比对W鉴定在至少10%的所述序 列中表现为碱性残基的功能上非保守的残基。
[0686] 优选的用于修饰的梭菌毒素氨基酸：
[0687] BoNT/A:
[0688] ASN 886,ASN 905,GLN 915,ASN 918,GLU 920,ASN 930,ASN 954,SER 955,GLN 991，GLU 992，GLN 995,ASN 1006,ASN 10化，ASN 1026,ASN 1032,ASN 1043,ASN 1046,ASN 1052,ASP 1058,HIS 1064,ASN 1080,GLU 1081,GLU 1083,ASP 1086.
[0689] BoNT/B:
[0690] ASN 873，ASN 874,化U 892，ASP 895，ASN 906，ASP 940，ASN 948，GLU 949，ASN 958,ASN 959,ASN 979,ASN 990,GLU 993,ASP 994,GLU 997,ASN 1012,ASN 1019,ASP 1030,ASP 1047,ASP 1049,GLU 1065,GLU 1072,GLN 1176,GLU 1189,GLU 1252,ASN 1273.
[0691] ASN 881,ASP 898,GLU 916,GLU 927,ASN 952,ASN 964,ASN 965,ASN 984,GLU 985,ASP 986,ASP 996,ASN 1000,GLU 1036,ASN 1041,ASP 1062,ASP 1064,GLU 1079,ASP 1081.
[0692] BoNT/D:
[0693] ASN 877,ASP 893,ASN 894,ASN 898,ASN 920,ASN 945,ASN 948,GLU 957,GLN 958,ASN 959,ASN 968,ASN 979,GLU 1030,ASP 1031,ASP 1033,GLU 1047,GLU 1051,ASN 1052,GLU 1066,GLN 1122.
[0694] BoNT/E:
[069引 ASN 859,ASP 860,ASN 892,ASP 893,ASP 904,ASP 909,ASN 928,ASN 932,ASN 934,ASN 935,GLU 936,ASP 945,ASN 946,ASN 947,ASN 966,ASN 976,ASN 979,ASN 981, ASP 985,GLN 1014,ASN 1019,ASN 1022,ASP 1027,ASN 1035,and ASN 1140.
[0696] BoNT/F:
[0697] ASN 879,ASP 896,ASN 922,ASN 923,ASN 928,ASN 947,ASN 950,ASN 952,ASN 953,GLU 954,ASN 963,ASN 964,ASN 965,ASN 987,GLN 997,ASN 1037,ASP 1040,ASP 1045,ASN 1055,ASP 1056.
[069引 BoNT/G:
[0699] ASP 900,ASN 909,ASN 910,GLU 912,ASN 913,ASN 945,ASN 947,GLU 956,ASN 965,ASP 966,ASN 986,ASN 1001,ASN 1038,ASP 1040,ASN 1046,ASP 1057,GLU 1073,ASN 1075,ASN 1090.
[0700] ^NT:
[0701] ASN 893,ASP 894,ASP 911,ASN 919,ASN 927,ASN 928,GLU 929,GLN 968,ASN 972,GLU 973,GLU 1010,ASP 1018,ASN 1079,ASN 1080,ASN 1081,ASN 1097.
[0702] 所用的序列检索号：
[0703] B〇NT/A:P10845
[0704] B〇NT/B:PI0844
[070引 B0NT/C1:P18640
[0706] BoNT/D:P19321
[0707] B〇NT/E:Q00496
[070引 B0NT/F:YP_001390123
[0709] B〇NT/G:Q60393
[0710] 化肥口04958
[0711] 结构数据源
[0712] BoNT/A(3BTA.p化）、BoNT/B(lEPW)和BoNT/E(3FFZ.p化）的晶体结构是从 RCSB 获得 的。
[0713] 分别使用LOOPP和下列序列来进行8〇肿/(：1、8〇肿/0、8〇饥'/。、8〇饥'/6和16^的同源 性建模:？18640、口19321、￥口_001390123、960393，和口04958。
[0714] 结构分析
[0715] 使用AreaIMol从所述的CCP4套件确定暴露的残基。
[0716] 使用Stride确定了二级结构的分配。
[0717] 通过采用RasMol检视确定了界面残基。
[0718] 序列分析
[0719] 全长BoNT序列是从NCBI获得的。
[0720] 用 Clus1:alX 进行比对。
[0721 ] 实施例4
[0722] 克隆、表达和纯化
[0723] 合成了实施例1中描述的编码所述工程化的BoNT/A分子的DNA构建体，把它们克隆 到所述的PJ401表达载体中并且然后转化到化21 (DE3)大肠杆菌中。运允许所述重组的化t-A、&t-B和化t-C蛋白质在化21 (DE3)大肠杆菌中可溶的过度表达。
[0724] 使用经典的层析法技术从所述的大肠杆菌裂解液中纯化所述重组的工程化的 BoNT。采用一个使用阳离子交换树脂的初始纯化步骤，然后通过使用疏水相互作用树脂进 行中间纯化步骤。然后通过蛋白酶水解切割所述重组的工程化的BoNT单链，产生活化的双 链工程化的BoNT。然后采用最后的纯化步骤来除去剩余的污染物。
[07巧]实施例5
[0726] 纯化的工程化的BoNT的表征
[0727] 按照下述W实验方式对上述实施例1中描述的工程化的BoNT进行了表征。
[0728] 对所述Pl的测定显示:所述工程化的BoNT的等电点大于未修饰的（天然)BoNT/Al 的等电点-参见图1和下表。
[0729] 表4:
[0731] 使用大鼠胚胎脊髓神经元(eSCN)评估了所述工程化的BoNT进入神经元并且切割 SNAP-25 (BoNT/A 1的祀)的能力。图2显示所述工程化的BoNT保留了与天然BoNT/Al相同的进 入所述的神经元并且切割SNAP-25的能力。
[07创使用小鼠隔神经偏侦顯分析(mPN皿)进一步评估了所述工程化的BoNT的效力。图3 显示所述工程化的BoNT保留了与天然BoNT/Al相同的抑制所述小鼠偏侧隔的收缩能力的能 力。
[0733] 使用体内小鼠趾外展评分(DAS)分析来评估相对于天然BoNT/Al的效力或安全性。 相对于天然BoNT/Al，两种分子都展示了更高的安全比并且效力稍微更强一些。运些数据被 呈现在下面(表4)。
[0734] 表4:
[0735]
[0736] -DAS邸日0:计算的引发DAS 2的剂量
[0737] -剂量DAS 4:引发DAS 4的实验剂量
[073引 -BW:体重
[0739] -10% ABW的剂量:计算的引发BW与在Do下BW相比减小10%的剂量
[0740] -安全比：-10% A BW的剂量/DAS邸50
[0741] 所述的安全比是BoNT处理的不利效应(体重减少)相对于效力（半最大趾外展评分 (DAS))的量度。它被计算成-10%体重(BW)与所述DAS EDso的比率，其中-10%BW是指10%的 体重减小所需的BoNT的量(pg/动物），而抓50是指将会产生一个为2的DAS的BoNT的量(pg/动 物)。
[0742] 所述的DAS分析是通过把20化配制在明胶憐酸缓冲液中的工程化的梭菌毒素注射 到小鼠脾肠肌/比目鱼肌复合体中，然后通过像Aoki先前报道的那样(Aoki KR,Toxicon 39:1815-1820; 2001)评估趾外展来进行的。
[0743] 实施例6
[0744] 使用上述实施例1中提出的标准设计了根据本发明的进一步工程化的梭菌毒素。 [074引运种阳离子构建体也源于BoNT/Al并且具有7.4的计算的Pl W及149,859的分子 量。所述的构建体被命名为化t-D。虽然构建体化t-AXat-B和化t-C包含突变为赖氨酸的残 基，但是化t-D包含突变为精氨酸的残基。
[0746] Cat-D:N1188R，D1213R，G1215R，N1216R，N1242R，N1243R，S1274R，T1277R。
[0747] 实施例7
[0748] 治疗患有颈肌张力失常的患者
[0749] -位患有疫李性斜颈的50岁的妇女在诊室中陈述先前曾经接受过治疗有效量的 一种标准BoNT/A制剂进入颈部肌肉中的治疗;然而，该患者经受了由于所述毒素传播到口 咽中而引起的吞咽困难。采用大约1.5ng(或更多）本发明的工程化的BoNT/A在颈部肌肉中 注射来治疗该患者。在3-7天W后，在没有发生吞咽困难的情况下，该患者的斜颈得到了显 著的改善，并且该患者能够将她的头和肩膀保持在正常的状态持续至少5个月。由于所述工 程化的BoNT/A分子的增强的组织保留和减少的传播，医生能够注射更多的药物而不用担屯、 副作用;所述的增大的剂量导致延长的持续作用时间。
[0750] 实施例8
[0巧1] 治疗患有眼险疫李的患者
[0752] 一位47岁的男人在诊室中陈述患有眼险疫李。通过把5pg至25pg本发明的工程化 的BoNT/A注射到上眼险的外侧险板前眼轮应肌肌肉和下眼险的外侧险板前眼轮应肌肌肉 中来治疗该患者。在大约一个星期内，该患者的症状发生了减轻并且持续了至少5个月，没 有眼下垂。本发明所述的多肤的增大的安全性允许医生增大剂量，并且因此延长了临床效 果的持续时间。
[0巧引实施例9
[0754] -位患有脑性擁痕的27岁男人在诊室中陈述患有衰弱的马蹄足并且患有行走困 难。该患者先前曾经接受过治疗有效量的BoNT/A的治疗，其中他的步态缓解改善伴随着他 四肢的肌肉虚弱和疼痛。通过把大约20pg/kg本发明的工程化的BoNT/A注射到所述受影响 的下肢的脾肠肌肌肉的内侧头和外侧头的两个位点中的每一个中来治疗该患者。在一个星 期内，该患者的步态改善了，没有先前见到的副作用并且所述的症状减轻持续了至少4个 月。给药更高量的药物的能力导致产生延长的作用时间的治疗。
【主权项】
1. 包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把 所述工程化的梭菌毒素的等电点(pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修 饰、其它方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.2个pi单位。2. 权利要求1所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程 化的梭菌毒素的等电点(Pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它 方面相同的梭菌毒素的pi高至少0.5个pi单位。3.权利要求1所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程 化的梭菌毒素的等电点(Pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它 方面相同的梭菌毒素的pi高至少1个pi单位。4.权利要求1所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程 化的梭菌毒素的等电点(Pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它 方面相同的梭菌毒素的pi高至少2个pi单位。5.权利要求1所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程 化的梭菌毒素的等电点(Pi)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它 方面相同的梭菌毒素的pi高2至5个pi单位。6. 前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素具有 至少为6的pi。7. 前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素具有 6至10的pi。8.权利要求7所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素具有7至9,优选8 至9的pi。9. 前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰 选自：氨基酸替换、氨基酸插入和氨基酸缺失。10. 权利要求9所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一种氨基酸替换选自：酸性 的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代、酸性的氨基酸残基被不带电荷的氨基酸残基替代 和不带电荷的氨基酸残基被碱性的氨基酸残基替代。11. 前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素包 含1至80个氨基酸修饰。12. 权利要求11所述的工程化的梭菌毒素，其中所述工程化的梭菌毒素包含4至40个氨 基酸修饰。13.前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修 饰位于所述梭菌毒素的受体结合结构域(HC结构域）中。14.权利要求13所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修饰位于所述 梭菌毒素的H?结构域中。15.前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修 饰是表面暴露的氨基酸残基的修饰。16.前面权利要求任意一项所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的至少一个氨基酸修 饰包括选自下列的氨基酸残基的修饰:天冬氨酸残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、丝氨酸残 基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、半胱氨酸残基或酪氨酸残基。17. 权利要求16所述的工程化的梭菌毒素，其中所述的氨基酸残基被赖氨酸残基或精 氨酸残基替代。18. -种核酸，其包含编码根据权利要求1-17中任意一项所述的工程化的梭菌毒素的 核酸序列。19. 一种生产单链工程化的梭菌毒素蛋白质的方法，该蛋白质具有一条轻链和一条重 链，所述的方法包括在合适的宿主细胞中表达根据权利要求18的核酸，裂解所述的宿主细 胞以提供包含所述的单链工程化的梭菌毒素蛋白质的宿主细胞匀浆，并且分离所述的单链 工程化的梭菌毒素蛋白质。20. -种活化工程化的梭菌毒素的方法，所述方法包括提供能够通过权利要求19所述 的方法得到的单链工程化的梭菌毒素蛋白质，使所述的多肽与在位于所述的轻链和重链之 间的识别位点（切割位点)处切割所述多肽的蛋白酶接触，并且把所述的多肽转化为双链多 肽，其中所述的轻链和重链通过二硫键连接在一起。21. 根据权利要求1-17中任意一项所述的工程化的梭菌毒素，用于医药中。22. 根据权利要求1-17中任意一项所述的工程化的梭菌毒素，用于预防或治疗选自下 列的疾病或状况:斜视、眼睑痉挛、斜眼、张力失常(例如痉挛性张力失常、口颚肌张力失常、 病灶性张力失常、迟发性张力失常、喉部张力失常、四肢张力失常、颈肌张力失常）、斜颈(例 如痉挛性斜颈）、受益于细胞/肌肉无能的美容治疗(美容性)应用(经由SNARE下调或失活）、 神经肌肉病症或眼能动性状况(例如共同性斜视、垂直斜视、外直肌瘫痪、眼球震颤、甲状腺 机能障碍性肌病）、指痉挛、眼睑痉挛、夜磨牙症、肝豆状核变性、震颤、抽搐、节段性肌阵挛、 痉挛、由慢性多发性硬化症引起的痉挛状态、导致异常的膀胱控制的痉挛状态、男性意像、 背部痉挛、四头肌僵痛、紧张性头疼、提肌骨盆综合征、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森氏 病、口吃、半面痉挛、眼睑病、脑性瘫痪、病灶性痉挛状态、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱、肛 门痉挛、四肢痉挛状态、抽搐、震颤、夜磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难、流泪、多汗症、过 度流涎、过度胃肠分泌、肌肉疼痛（例如来自肌肉痉挛的疼痛）、头疼疼痛（例如紧张性头 疼）、额沟、皮肤皱纹、癌症、子宫疾病、泌尿生殖器疾病、泌尿生殖器-神经疾病、慢性神经原 性炎症和平滑肌病症。23. 基本上如本文中并且参考附图描述的工程化的梭菌毒素。
【专利摘要】本发明提供包含至少一个氨基酸修饰的工程化的梭菌毒素,其中所述的至少一个氨基酸修饰把所述工程化的梭菌毒素的等电点(pI)增大到一个值，该值比缺乏所述的至少一个氨基酸修饰、其它方面相同的梭菌毒素的pI高至少0.2个pI单位。也提供了所述工程化的梭菌毒素在治疗中的相应用途。
【IPC分类】C07K14/33, A61K39/08
【公开号】CN105492020
【申请号】CN201480043806
【发明人】D·B·安德森, G·S·哈克特, S·M·刘
【申请人】益普生生物创新有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月9日
【公告号】CA2917009A1, EP3019190A1, WO2015004461A1
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