用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法
用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法
【专利说明】用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法
[0001] 本发明设及包含聚合抗原、甘露聚糖和二醒的免疫原性复合物，包含该免疫原性 复合物的组合物，W及其作为免疫应答刺激物和疫苗的用途。同样地，本发明设及使用二 醒，基于抗原和甘露聚糖同时进行聚合和缀合而获得所述的免疫原性复合物的方法。因此， 本发明属于免疫学和疫苗生产领域的范围内，W及治疗和预防过敏反应的领域范围内。
【背景技术】
[0002] 树突状细胞(DC)是专口高效地刺激T细胞的抗原呈递细胞，并且鉴于此，它们基本 用于诱导特异性免疫应答。未成熟的DC策略性地分布于组织和器官中，其中它们作为哨兵， 在它们的微环境中不断地取得抗原样品。作为对不同刺激(包括抗原本身、微生物有机体的 产物W及组织危险物信号）的应答，DC开始成熟过程，运使得DC在周围携带由它们本身所负 载的抗原迁移至次级淋己器官的T区。在此，显示HLA-II和共刺激分子表达增多的成熟DC与 T细胞相互作用，将抗原性的肤(经DC加工后）呈递给T细胞，并刺激T细胞开始特异性的应 答。
[0003] 未成熟的DC通过受体介导的内吞作用、微胞钦作用和吞隧作用捕获抗原。有多种 不同的受体与内吞摄入有关，其中发现了甘露糖受体(MRKCD206和CD209)。它们通过碳水 化合物识别结构域而识别末端甘露糖残基、海藻糖和/或N-乙酷氨基葡萄糖。天然配体包括 细菌来源的产物(糖蛋白和糖脂），W及具有高的甘露糖含量的哺乳动物糖蛋白。MR在巨隧 细胞和未成熟的DC中表达，与甘露糖基化的抗原的内吞作用有关，用于其加工和T细胞呈 递。
[0004] 在I巧抗体介导的过敏状况中，免疫治疗是W给予治疗疫苗为基础的，运些疫苗抗 原与过敏患者所敏感的那些为相同的变应原。变应原为得自于花粉、尘蛾、上皮细胞等的蛋 白质，它们是患者所呼吸(环境吸入器)的空气中所携带的超级结构。广泛接受的是，运些疫 苗的临床功效与所传递的变应原的剂量有关，运样WHO和得自于科学社会的共同指导原则 建议应该使用足够的变应原浓度来制备疫苗。运种要求意味着患者对疫苗剂量的过敏反应 设及不利作用的风险，而根据规定所述的作用应该受到限制。避免运种风险的方式在于基 于改性的变应原(类变应原）来制备疫苗，其中所述的变应原显示出针对I巧抗原的较低的 反应能力(较低的变应原性）。
[0005] 基于使用甲醒和/或戊二醒来处理变应原的化学修饰在疫苗制造商中最广泛地使 用。醒基(R-CHO)与存在于变应原氨基酸中的氨基(R-NH2)(例如赖氨酸）的反应是此类修饰 的基础。与甲醒(其为单醒)相反，戊二醒为具有2个R-C册基的二醒，其中所述的R-CHO基能 够与不同分子中存在的赖氨酸R-NH2反应。运导致变应原聚合，W及与特异性I巧抗体(通过 甲醒形成的类变应原是基于蛋白质的结构修饰，而不是基于它们的聚合)的反应性受损。由 于I巧抗体失去了与它们的抗原决定簇(变应原结合位点)反应的可及度，并减少了 I巧致敏 的肥大细胞(其被I巧所活化)的数量，所W认为运种聚合确定了类变应原较低的变应原性。 聚合的变应原的变应原性损失可W意味着免疫原性损失，运可W降低运些制备物的临床功 效。已经表明聚合会降低DC中MR与变应原甘露糖残基的接近，W及运对于聚合的变应原的 免疫原性损失而言是决定性的。运由W下事实所支持:就变应原摄入而言，甘露糖残基为DC 所用的主要配体之一，并且运些细胞在将变应原呈递给应答T细胞中起重要的作用。
[0006] 用于将糖与蛋白质缀合的方法主要基于通过氧化过程来活化糖，从而通过Cis-乙 二醇基的转化而生成反应性醒基(R-CHO)。在使用例如高舰酸盐处理后在氧化的糖中生成 的R-C册可W与赖氨酸的E-氨基反应，从而形成Schiff碱。由于它们的碳水化合物残基用于 缀合并避免了与其生物学活性有关的蛋白质部分，所W运种方法学非常适用于缀合糖蛋白 (例如酶、抗体）。
[0007] 尽管使用高舰酸盐的糖氧化也已经报告为对蛋白质(包括变应原(Weinberger et al.2013.J Control Release,165:101-109))进行甘露糖基化的方式（Masarova et al. 2002. Int .J.Polymer .Anal .Qiaract. ,7:106-116)，但是将聚合的抗原进行甘露糖基化 的使用具有2个主要的缺点：
[0008] a)糖的氧化使得相邻的碳原子之间的键产生了断裂，其中所述的碳原子包含径基 (OH)并且为反应性醒生成的基础。所述的断裂影响了甘露糖的结构（Shibuya，N.，et al. 1988. J. Biol. Chem.，263: 728-7:34)，从而改变了其结合识别甘露糖的凝集素的能力 (Masarova et al.2001,Chem.化P.55:130-135)，及其DC活化能力（Sheng et al, 2006. Immunology, 118:372-383)。尽管甘露糖结构整体性的损失可W通过降低氧化程度而 减小至最低(Masarova et al.2001 ,Chem.Pap.55:130-135)，但是在轻度条件下的缀合效 率服从于待甘露糖基化的蛋白质的本性(Weinberger et al. 2013, J.Conhol Release, 165:101-109)。为了保护天然形式的甘露糖，已经试图在高溫下通过糖基化来实施蛋白质 的甘露糖基化，但是在氧气缺乏下，结果为阴性（K a n S k a e t al.2008.Biotechnol.Appl.Biochem.49:57-64)。
[0009] b)在氧化后活化的甘露糖生成了反应性醒，其必须与待甘露糖基化的蛋白质的游 离氨基反应。但是，蛋白质与戊二醒的聚合使得运些氨基急剧减少，因为它们已经用于它们 与戊二醒本身的反应中。在运些条件下，经活化用于将蛋白质（之前使用戊二醒处理过)甘 露糖基化的甘露糖的效率可能极低，运是因为当缺乏甘露糖可W结合的氨基时，其为戊二 醒的聚合能力（Silva et al.2004.Food Technol.Biotechnol.42:51-56)。运种不便性不 仅影响聚合的变应原的甘露糖基化，而且影响与戊二醒(最终认为其可W被甘露糖基化)聚 合的任何蛋白质的甘露糖基化。
[0010] Patterson等人 1977Q Allergy Clinical Immunology 59:314-319)描述了变应 原与戊二醒的聚合(禾本科花粉）。由于聚合的变应原显示I姐抗体致敏的肥大细胞的活化 能力降低，所W聚合的变应原是低变应原的。
[0011] Subiza等人2008(Clinical and Experimental Allergy,39:987-994)描述了用 于过敏中免疫治疗的戊二醒（也称为类变应原）修饰的变应原（禾本科花粉、Trisetum paniceum和喜马拉雅鸭茅(喜马拉雅鸭茅））的用途。研究者报告使用通过与戊二醒聚合而 得到的禾本科类变应原的接种疫苗是有效的。
[0012] fleydenreich 等人2012 (Immunology, 136:208-217)描述 了在由梯牧草(梯牧草)和 垂枝枠 (Betula verrucosa)物种的完整花粉得到的变应原提取物与它们相应的戊二醒或 甲醒修饰的类变应原之间，免疫原性和变应原性的差异比较研究。报告，使用戊二醒进行修 饰比使用甲醒进行修饰会使得类变应原的变应原性和免疫原性降低更多，并且DC不会高效 地捕获运种类型的修饰的变应原。
[0013] Weinberger等人2013(Journal of Control Release, 165:101-109)描述了变应 原蛋白质（卵清蛋白和木瓜蛋白酶)与甘露糖的缀合，其中通过使用高舰酸盐进行轻度氧化 而活化糖。根据待甘露糖基化的蛋白质而得到不同的效率程度。报告，甘露糖基化的缀合物 在体内被DC所捕获，并且在小鼠中产生免疫应答，因此它们可W用于免疫治疗。
[0014] 因此，在本领域的水平下，需要提供基于聚合的且甘露糖基化的抗原而获得疫苗 的方法，该方法为目前本领域水平下所使用的那些方法的备选方法，并且其允许抗原聚合 W及W高效的方式与甘露糖缀合，而不会使糖损失它们的结构完整性并且不会使聚合性质 (较低的变应原性)受到影响，因此基于聚合的且甘露糖基化的蛋白质的疫苗通过改善它们 被DC的摄入而增加其免疫原性。
[001引发明概述
[0016] 本发明的发明人发现向天然蛋白质抗原与甘露聚糖的混合物中加入二醒允许抗 原聚合，同时使抗原与甘露聚糖缀合，运可W获得免疫原性复合物或疫苗，该免疫原性复合 物或疫苗在个体中能够刺激或降低免疫应答的，而不会引发对该复合物的过敏反应，并且 能够被树突状细胞(DC)所识别并捕获。
[0017] 基于上述发现，已经研发了本发明的一系列的方面，在下文中将详细描述运些方 面。
[001引本发明的免疫复合物
[0019] 如之前所提及，向蛋白质(抗原)和甘露聚糖的混合物中加入二醒(特别是戊二醒） 允许抗原聚合，同时抗原与甘露聚糖缀合，运可W获得免疫原性复合物或疫苗。
[0020] 因此，在本发明的一个方面中，设及免疫原性复合物，下文称为"本发明的免疫原 性复合物"，其包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醒。
[0021] 在本发明中，"免疫原性复合物"可理解为一个或两个单元的结合，其中所述的单 元通过化学键(化学缀合)和通过物理诱捕(物理缀合)而保持彼此缀合，所述的多个单元为 聚合的抗原、甘露聚糖和二醒。
[0022] "聚合的抗原"是指抗原单体彼此键合而形成的聚合物，其中所述的抗原单体可W 不同或相同。因此，在具体的实施方案中，聚合物的抗原包含彼此相同或不同的至少2个抗 原。"抗原"是指在受试对象(人类或动物）的有机体中在体液和细胞水平下能够诱导免疫应 答的，或者在与免疫细胞接触时能够诱导细胞免疫应答(免疫细胞扩增、活化和/或成熟、产 生细胞因子或抗体）的任何物质。具体而言，抗原为可W为变应原的蛋白质，由感染试剂衍 生的蛋白质，肿瘤细胞，所述的蛋白质的肤或片段，由所述的蛋白质得到的重组蛋白质，或 者甚至能够诱导指定的应答的合成肤。在具体的实施方案中，所述的抗原为变应原。
[0023] "变应原"是指在个体中能够引起过敏的物质，换言之，是指被个体的免疫系统识 别为外来的，导致免疫应答(主要是产生E型免疫球蛋白（I巧））的物质。变应原的实例包括 但不限于花粉变应原提取物，由节肢动物得到的变应原提取物，由食物或食物产品得到的 变应原提取物，在昆虫的唾液、爪或刺上存在的成分(在受试对象中会诱导敏感反应)等。因 此，可W使用花粉蛋白质提取物，例如禾本科花粉（多年生黑麦草化olium perenne)，草地 早熟禾(Poa pratense),梯牧草（Phleum pratense),狗牙根（切nodon dactylon),高羊茅 草地早熟禾（Festuca pratensis),喜马拉雅鸭茅（Dactylis glomerata),黑麦（Secale cereale),大麦（Hordeum vulgare),燕麦（Avena sativa) ,Triticum sativa)，其他草花粉 (例如艾草（Al" temisia vulgaris),襲（加 enopodium album),长叶车前（Plantago Ianceolata),蒲公英茵香（Taraxacum vulgare) ,Parietaria judaica,刺沙蓬（Salsola kali),异株等麻(U;rtica dioica))，或者树花粉(例如橄揽(Olea europaea),悬铃木属， Cuppresus SPP)等。此外，还可W使用由节肢动物得到的蛋白质提取物，例如尘蛾(例如欧 妍怪尘蛾（Dermstophsgoides pteronyssinus),美妍|尘蛾（Dermstophsgoides f曰rin曰e), Acaro siro,Blomia tropicalis,梅氏嗜霉蛾化 uroglyphus maynei),家甜食蛾 (Glyciphagus domesticus),害嗜鱗蛾化epidoglyphus destructor),腐食酸蛾 (Tyrophagus PUtrescentiae))等。其他变应原提取物可W得自真菌抱子(烟草赤星病菌 (Alternaria alternate),蜡叶芽枝霉（Cladosporium herbarum),特异青霉（Penicilium notatum))和动物上皮细胞(狗上皮细胞、猫上皮细胞、马上皮细胞、羽毛混合物），W及得自 食物成分等。如本领域专业人员所理解的那样，皮肤和皮肤上的附属物(例如头发)包含在 术语"上皮细胞"内。实际上，任何变应原都可W用于免疫原性复合物中，然而，在具体的实 施方案中，变应原选自花粉、充满、上皮细胞、真菌抱子和它们的组合。
[0024] 在另一个具体的实施方案中，得自物种梯牧草，喜马拉雅鸭茅，狗牙根，多年生黑 麦草，S毛草属，橄揽，Cuppresus spp.，豚草属，枠木属，悬铃木属，欧棲（Corylus avellana)或欧洲档木(Alnus glutinosa)。
[0025] 在另一个具体的实施方案中，虫蛾术语物种欧洲室尘蛾，美洲尘蛾或Blomia tropicalis。
[00%]在另一个具体的实施方案中，上皮细胞属于物种化Iis domesticus或家犬(Canis familiaris)。
[0027] 在另一个具体的实施方案中，真菌抱子属于物种烟草赤星病菌或细链格抱 (Alternaria tenuis)。
[0028] 在本发明中，"甘露聚糖"是指碳水化合物聚合物，其由甘露糖和W下类型的糖巧 键组成:a-1，6-糖巧，a-1，2-糖巧，a-1，3-糖巧或0-1，3-糖巧。甘露糖是指由6个碳原子形成 的单一的糖或单糖，并且其功能化学基团在碳1或异头碳中为醒。甘露聚糖可W包含得自甘 露糖蛋白的肤残基（其与甘露糖蛋白天然结合）。任何甘露聚糖都可W用于本发明的内容 中。甘露聚糖的实例包括但不限于聚甘露糖，半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖，乙酷化甘露聚 糖和芦苔多糖(aloeride)。
[0029] 甘露聚糖可W理解为甘露糖通过Q-D-(I^e)键结合而形成的线性结构，其具有主 要通过a-D-(1^2)键(而且还通过a-D-(1^3)键)形成的不同单元的常见的短的支链。
[0030] "半乳甘露聚糖"可W理解为甘露糖链彼此通过0(1^4)键结合而形成的化合物， 在多数情况下，其具有半乳糖单元通过0(1^6)键与甘露糖结合而形成的支链。根据提取半 乳甘露聚糖的植物，半乳甘露聚糖具有不同的支化程度。
[0031] "葡萄甘露聚糖"应该理解为W下化合物，其化学结构通过e(i^4)键连接的比例 分别为8: 5的D-甘露糖和D-葡萄糖。例如葡萄甘露聚糖在植物魔芋（Amorphophal Ius konjac)的块茎中发现。
[0032] "乙酷化甘露聚糖"应该理解为(6(1-4)-甘露聚糖型的0-乙酷化复合多糖的混合 物。例如乙酷化甘露聚糖在植物(Aloe vera)中发现。
[0033] "芦苔多糖"可W理解为由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖构成的具有高分子 量的多糖。例如芦苔多糖在植物真芦苔中发现。
[0034] 甘露聚糖(聚甘露糖，半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖等)可W得自天然来源，例如得 自真菌、酵母菌和植物，或者使用本领域的专业人员普遍已知的技术通过化学合成而获得。 在具体的实施方案中，作为本发明的免疫原性复合物的一部分的甘露聚糖得自酵母菌、植 物或真菌。在另一个具体的实施方案中，酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属和假丝酵母属。 [00巧]酵母属的实例。酵母菌包括但不限于S. bayanus ,布拉迪酵母（S. boulardii ), S . bulderi , S . cariocanus , S . cariocus ,酉良酒酉奉母（S . cerevisiae) , S. cheval ieri , S.d曰irenensis,S. elIipsoideus,S.eub曰y曰nus,S.exiguus,S.fIorentinus,S.kluyveri, S . martiniae , S . monacensis ,S.norbensis,奇异酉奉母（S. paradoxus ),己其if 德酉奉母 (S.P曰Stori曰nus),S.spencerorum,S.turicensis,S.unisporus,S.UV曰rum和S.zon曰tus。在 更具体的实施方案中，酵母菌为酿酒酵母。
[0036] 毕赤酵母属的实例。酵母菌包括但不限于己斯德毕赤酵母（P.pastoris), P.anomola,P.heedii,P.guilli ermondi i,P.kluyveri,P.membranifaciens, P.norvegensis ,P.ohmeri ,己斯德毕赤酵母和P. subpelliculosa。
[0037] 假丝酵母属的实例。酵母菌包括但不限于白色念珠菌（C. albicans )， C . ascalaphidarum , C . amphixiae ,南极假丝酵母（C . Antarct ica) , C . W沪;幻,C . 姑磁巧瓶媒 C.atmosphaerica,C.blattae,C.carpophila,C.cerambycidarum, C.ch曰uliodes,C.coryd曰li,C.dosseyi,C.dubliniensis,C.erg曰tensis,C.fructus,光滑 念王朱菌（C.邑labrata) ,C.fermentati ,C.邑uilliermondii ,C.haemulonii ,C. insectamens, C. insecto;rum,C. interm自dia,C. jef打esii ,乳酒念珠菌（C.kefyr) ,C.krusei ,葡萄牙念珠 菌（C.Iusitaniae),C.lyxosophila,C.maltosa,C.marina ,C.membranifaciens, C.milleri,C.oleophila,C.oregonensis,C.parapsilosis,橡树假丝酉奉母 (C.quercitrus曰），C.rugos曰，C.s曰ke,C.sheh曰te曰，C.temnochiI曰e,C.tenuis, C.tropical is,C.tsuchiyae,C.sinolaborantium,C.sojae,C.subhashii,C.viswanathii, C.utilis。
[0038] 可W提取甘露聚糖的植物的实例包括但不限于豆科（例如角豆树Ceratonia 3；111911日,瓜尔豆胶切日]1日9〇313 1日化日旨〇]1〇1〇13113等），块茎（例如魔芋等），由得到的植物种 子，其中甘露聚糖用作能量储备和绿藻类(例如伞藻属，松藻属，海棍藻属等)和红藻类(厮 形紫菜(Por地yra umb i 1 i Ca 1 i S))的植物细胞壁。
[0039] 可W提取甘露聚糖的真菌的实例包括但不限于拟青霉属和多孔藍科真菌灵芝 (Ganoderma Iucidum)(reishi)。
[0040] 如本领域的技术人员所理解的那样，如果甘露聚糖由真菌或酵母菌获得，则其为 真菌和酵母菌细胞壁的一部分，因此其可W包含有机体合成细胞壁所使用的蛋白质的残 基。由此，甘露聚糖的结构中可W包含由存在的氨基酸残基得到的氨基。因此，在另一个更 具体的实施方案中，所述的氨基得自赖氨酸的氨基酸。
[0041 ]在本发明中，"二醒"可W理解为是指包含2个醒基的化合物。二醒的实例包括但不 限于戊二醒，乙二醒，丙二醒，下二醒和己二醒。在优选的实施方案中，二醒为戊二醒。
[0042]如上所述，本发明的免疫原性复合物包含聚合物的抗原、甘露聚糖和二醒。因此， 本发明的免疫原性复合物的成分的结合可W通过化学缀合、物理缀合或同时种方式缀 合来生成。
[0043] 在本发明中，"化学缀合"可W理解为本发明的免疫原性复合物的成分通过化学键 的方式而结合。如上述说明，由于甘露聚糖的结构中存在氨基酸，例如赖氨酸，所W甘露聚 糖可W包含氨基。不希望被理论所束缚，认为免疫原性复合物的成分之间的结合可W通过 甘露聚糖中存在的氨基与反应中存在的二醒之间的键而生成。因此，在具体的实施方案中， 聚合的抗原通过二醒与甘露聚糖结合。在水性介质中的二醒W-定比例W聚合形式存在， 因此，多种种类具有2个或多个醒官能团，该醒官能团与甘露聚糖中和抗原蛋白质中存在的 氨基反应，从而在反应混合物中存在的多种成分中形成共价交联。醒与氨基之间的一级反 应使得所谓的ScMff碱形成，根据抑的条件，该ScMff碱可W是可逆的。但是，在醒基属于 二醒或多醒化合物(例如戊二醒)并且其聚合形式存在于水性溶液中的情况下，发生了下间 醇醒型的缩合和脱水的其他反应，运生成了多官能聚合本性的a-e不饱和幾基系统。此外， 已经显示ScMff碱还可W与反应介质中存在的醒形成径醒缩合。另一方面，由径醒缩合衍 生得到的幾基和a-e不饱和亚胺可W通过氨基发生缀合物加成反应，从而形成新的稳定的 共价键。与原始二醒的多官能本性及其在反应介质中存在的聚合形式一起描述的化学反应 性是甘露聚糖与抗原之间化学共价且稳定交联从而形成最终的聚合化学缀合物的基础。
[0044] 在本发明中，"物理缀合"可W理解为本发明的免疫原性复合物的成分通过物理诱 捕而结合。不希望被理论所束缚，认为当抗原聚合时，甘露聚糖处在被诱捕于聚合物织物 (刚性且其结构是高水平支化的是有利的）中。因此，在具体的实施方案中，变应原通过聚合 物的物理诱捕而与甘露聚糖结合。
[0045] -旦形成免疫原性复合物，则所述的成分的比例可W根据介质中存在的甘露聚糖 的浓度而改变。因此，在具体的实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例范围为1:10至1 :〇. 1，优 选为1:4至1:0.15,更优选为1:3至1:0.3,更优选为1:4至1:0.5。在具体的实施方案中，抗 原:甘露聚糖的比例为1:0.3或1:0.5。
[OOW 本发明的方法
[0047] 本发明的发明人发现将二醒加入至抗原和甘露聚糖的混合物中允许抗原聚合，同 时抗原与甘露聚糖缀合，运可W获得W下免疫原性复合物或疫苗，其在个体中能够刺激和/ 或诱导免疫应答，而不会引发对该复合物的过敏反应，并且其可W被树突状细胞(DC)识别 并捕获。
[0048] 因此，在另一个方面中，本发明设及获得本发明的免疫原性复合物的方法，下文称 为"本发明的方法"，其包括：（i)制备包含抗原和甘露聚糖的溶解液，W及（ii)将二醒加入 至所述的溶解液中。
[0049] 在第一步骤[步骤（i)]中，本发明的方法由制备包含抗原和甘露聚糖的溶解液组 成。
[0050] 术语抗原如之前所定义。在具体的实施方案中，抗原为变应原。变应原的实例包括 但不限于花粉变应原提取物，由节肢动物得到的变应原提取物，由食物或食物产品得到的 变应原提取物，在昆虫的唾液、爪或刺上存在的成分(在受试对象中会诱导敏感反应)等。在 具体的实施方案中，变应原选自花粉，优选为梯牧草，喜马拉雅鸭茅，狗牙根，多年生黑麦 草，S毛草属，橄揽，Cuppresus SPP .，豚草属，枠木属，悬铃木属，欧棲或欧洲档木;虫蛾，优 选为属于物种欧洲室尘蛾，美洲尘蛾或Blomia化opicalis的虫蛾;上皮细胞，优选为属于 物种Felis domesticus或家犬的上皮细胞;真菌抱子，优选为属于物种烟草赤星病菌或细 链格抱的真菌抱子；W及它们的组合。
[0051] 如本领域的技术人员所理解的那样，步骤(i)的溶解液可W包含多于一种的抗原， 其可W是彼此不同的或相同的。因此，在具体的实施方案中，溶解液包含至少巧巾抗原，其可 W是彼此相同的或不同的。
[0052] 用于获得抗原和变应原提取物的技术和方法学是本领域技术人员普通已知的，但 是运些抗原和变应原提取物可W是市售可得的，或者W重组蛋白质的形式发现。在运种情 况下，抗原或变应原提取物是冻干的，其必须例如使用憐酸盐缓冲剂来重新构成，运样其可 W用于本发明的方法中。
[0053] 另一方面，步骤（i)的溶解液还具有甘露聚糖。术语甘露聚糖如之前所定义，并且 可W用于本发明的方面中。甘露聚糖的实例包括但不限于聚甘露糖，半乳甘露聚糖和葡萄 甘露聚糖。在本发明的方法的具体的实施方案中，用于本发明的方法中的甘露聚糖得自酵 母菌、植物或真菌。在另一个更具体的实施方案中，酵母菌选自酵母属，具体为酿酒酵母、毕 赤酵母属和假丝酵母属。可W获得甘露聚糖的酵母菌、真菌和植物的实例在本公开之前的 部分中进行了描述。此外，如上文所述，在甘露聚糖的结构中可W包含由甘露糖蛋白中存在 的氨基酸残基得到的氨基。因此，在另一个甚至更具体的实施方案中，甘露聚糖包含氨基， 在另一个更具体的实施方案中，所述的氨基得自赖氨酸的氨基酸。
[0054] 加入至溶解液中的甘露聚糖的量可W根据预期在本发明的免疫原性复合物中获 得的抗原:甘露聚糖比例而改变。因此，在具体的实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例范围为 1:10至1:0.1，优选为1:4至1:0.15,更优选为1:3至1:0.3,更优选为1:4至1:0.5。在具体的 实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例为1:0.3或1:0.5。
[0055] -旦制备抗原和甘露聚糖的溶解液，便将二醒作为聚合试剂加入[本发明的方法 的步骤Qi)]。将二醒逐渐加入至溶解液中，直至达到足W取得抗原聚合W及甘露聚糖与抗 原缀合的浓度。使用二醒制备聚合物的技术和方法学是本领域现有技术所公知的，并且是 本领域的专业人员的惯例（Silva et al. 2004. Chemical Modifications on蛋白质S Using Glutaraldehyde.Food Technol.Biotechnol.42:51-56)。
[0056] 在将二醒加入至抗原和甘露聚糖分散液中之后，使混合物处于合适的条件下，并 且在4°C下在揽拌下发生聚合反应的足够时间为例如大约15小时。
[0057] 在具体的实施方案中，二醒选自戊二醒，乙二醒，丙二醒，下二醒和己二醒。优选 地，二醒为戊二醒。
[0058] 在发生聚合反应所需的时间结束时，通过将混合物中加入能够中和（中和试剂)游 离醒基的试剂来终止反应，其中所述的试剂例如为包含氨基的试剂(例如氨基酸、E-氨基-n-己酸等)或者与醒反应的其他反应试剂(例如焦亚硫酸钢、锭等），但排除氧化试剂(例如 过氧化氨、过氧化钢等），因为它们作用于甘露糖。在本发明的方法的具体的实施方案中，所 述的方法具有额外的步骤(iii)，其包括加入中和试剂，例如氨基酸、特别是甘氨酸，来终止 聚合反应。加入至反应混合物中W终止聚合的甘氨酸的量可W根据反应条件而改变，而且 计算必须加入W终止聚合的甘氨酸的量是本领域的专业人员的惯例。通常，甘氨酸相对于 醒的加入量而言必须是过量的，例如二醒:甘氨酸的比例为1:50。
[0059]在终止聚合反应后，可W分离免疫原性复合物，运是本领域的技术人员的惯例。因 此，在具体的实施方案中，本发明的方法包括分离免疫原性复合物的步骤(iv)。实际上，分 离蛋白质复合物的任何方法都可W用于本发明的内容中。所述的方法的实例包括但不限于 低压或高压液相色谱柱，基于结合甘露糖的凝集素（例如Concanavalin A)的亲和色谱，沉 淀技术(例如硫酸锭），密度梯度分离和差示离屯、。例如包含本发明的免疫原性复合物(已经 形成）的混合物可W被透析，从而消除盐和可能的未聚合的残基，此后例如通过切向超滤 (具有孔径为IOOK化的膜)对聚合的混合物进行过滤。
[00側本发明的免疫原性复合物的用途
[0061] 本发明的免疫原性复合物具有某些技术特征，运些特征使得其在个体中能够刺激 和/或诱导免疫应答，并且在变应原的情况下对所述的复合物具有低的过敏反应。运种性质 得W使用本发明的免疫原性复合物来精制药物组合物，当将该药物组合物给予受试对象 时，其能够刺激和/或诱导所述的受试对象的免疫应答，并且使得其在治疗例如过敏、感染 疾病或瘤形成中合适地用作疫苗。
[0062] 因此，在一个方面中，本发明设及本发明的免疫原性复合物在药物组合物的精制 中的用途。
[0063] 因此，在另一个方面中，本发明设及药物组合物，下文中称为"本发明的药物组合 物"，其包含本发明的免疫原性复合物W及药物可接受的载体。药物可接受的载体的实例是 本领域现有技术已知的，并且包括憐酸盐缓冲的生理盐水溶液，水，乳液(例如油/水），不同 类型的润湿剂，无菌溶解液等。可W通过本领域现有技术已知的常规过程来配制包含所述 的载体的组合物。用于说明本发明的免疫原性复合物的所有具体的实施方案都可W用于本 发明的方面中。此外，本发明的药物组合物还可W具有药物可接受的赋形剂，稀释剂，佐剂 (例如氨氧化侣、憐酸巧、单憐酷脂质A、壳聚糖等），和/或稳定剂(例如甘油）。如本领域的专 业人员应该理解的那样，本发明的免疫原性复合物W治疗有效量存在于本发明的组合物 中，换言之，所述的量为足W在受试对象中发挥刺激和/或诱导免疫应答的作用的量。
[0064] 术语药物组合物包含在人类或动物护理(兽用组合物）中使用的组合物。
[0065] 在具体的实施方案中，本发明的药物组合物还包含额外的物质。实际上，潜在地用 于对症治疗疾病或过敏的任何物质都可W作为额外的活性物质而引入。所述的额外的活性 物质的示意性而非限定性的实例包括抗组织胺药S，酱类激素 S，色甘酸二钢，氣替卡松，卢 帕他定，依己斯汀，氯雷他定，地氯雷他定，组氨受体的其他括抗剂，白细胞=締等，W及它 们的混合物。
[0066] 本发明的药物组合物可W通过任何合适的途径(例如口服、舌下、口周、鼻内、肠胃 夕F、经皮、局部给予途径等)给予，对于运些途径，可W使用所选给予途径的配制物所需的药 物可接受的赋形剂和载体。给予和制备药品的不同药物方式是本领域的技术人员公知的。 在示意性而非限定性的方式中，本发明的药物组合物可W为大颗粒、纳米颗粒或脂质体形 式的配制物的一部分，并且其可W W固体药物给予形式、液体药物给予形式或包含分散系 统的药物给予形式给予。更具体而言，本发明的药物组合物可W为注射溶液形式，适用于舌 下传递的药物形式，粉末，小丸，小珠，片剂，胶囊，糖浆，乳液，栓剂，滴眼液，雾化，气雾剂， 乳膏，凝胶等。根据医生和临床因素来测定本发明的组合物的剂量方案。如医药领域所公知 的那样，剂量取决于多种因素，包括患者的身体特征(年龄，高度，性别），所采用的传递过 程，疾病的严重性，所采用的具体的化合物W及个体的药代动力学性质。
[0067] 在具体的实施方案中，所述的药物组合物用于刺激和/或诱导免疫应答。在另一个 具体的实施方案中，所述的药物组合物用作疫苗。在另一个具体的实施方案中，所述的药物 组合物用于治疗受试对象中的过敏、感染性疾病和瘤形成。
[0068] 在本发明中，"过敏"可W理解为颗粒或物质(所谓的"变应原"）的超敏性，其中所 述的颗粒或物质如果被吸入、消化或触摸，则会在受试对象中产生特征性的临床现象并引 入免疫应答，主要是I巧应答。术语"变应原"已经在本公开的上文中进行了描述。
[0069] 在本发明中，"感染性疾病"是指符合微生物有机体(例如细菌、真菌、病毒、原生动 物等)或航病毒引起的感染的临床表现。感染性疾病的实例包括但不限于布鲁氏菌病(布鲁 菌属），炭痘（炭痘杆菌（Bacillus an1:hracis)),霍乱（霍乱弧菌(V;Lb;rio cholerae)),白喉 (白喉棒状杆菌(Corynebacterium di曲theriae))，丹毒(链球菌属），Q热（贝纳特氏立克次 体（Coxiella burneti)),伤寒（伤寒沙口氏杆菌（Salmonella typhi),副伤寒沙口氏菌 (S.paraty地i)) ,Legionnaires病（嗜肺性军团病杆菌(Xegionella pneumophila)),肺炎 (肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae),金黄色酿脈葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，克雷白氏杆菌化IebsielIa pneumoniae)，支原体属，衣原体属），肺结核（结核分 枝杆菌(Mycobacterium 1:ube;rculosis))和破伤风（破伤风杆菌（Clostridium tetani))。 病毒感染性疾病的实例包括但不限于登革热(黄病毒），黄热病(黄病毒），埃博拉出血热(线 状病毒），流感(流感病毒），甲型肝炎(肠道病毒(VHA))，乙型肝炎(正肝去氧核糖核酸病毒 (VHB))，丙型肝炎(丙型肝炎病毒(VHC))，瘤疹(瘤疹病毒），单核细胞增多症化B病毒），腮腺 炎（己拉米哥病毒），猪攝（鼠疫病毒），脊髓灰质炎（肠道病毒），感冒（鼻病毒，冠状病毒， Ecovirus,柯萨基病毒），狂犬病(棒状病毒），风疹(风疹病毒），麻疹(麻疹病毒），水痘(水 痘-带状瘤疹)和天花(正痘病毒）。真菌感染的实例包括但不限于曲霉病，念珠菌病，广色霉 菌病，隐球菌病，脚癖，抱子丝菌病，组织胞浆菌病，环状瘤疹，耳癖，花斑癖，角膜真菌病和 接合菌病。原生动物引起的疾病的实例包括但不限于利什曼病，追疾，隐抱子 虫病，弓形体 病，阿米己病，贾第鞭毛虫病和化agas病。航病毒引起的感染性疾病的实例包括但不限于 Creutzfeldt-Jakob病，牛脑海绵状病r疯牛病"），痒病（或颤抖病），致死性家族失眠病 (FFI)和苦鲁病。
[0070] 在本发明中，"瘤形成"可W理解为通过改变细胞增殖并多次改变细胞分化而引起 的疾病，其由团块或肿瘤的形成组成，在恶性的情况下，称为癌症。良性瘤形成的实例包括 但不限于纤维瘤(纤维结缔组织），粘液瘤(疏松结缔组织），脂肪瘤(脂肪组织），软骨瘤(软 骨组织），骨瘤(骨组织），血管瘤(血管），淋己管瘤(淋己管），脑膜瘤(脑膜），血管球瘤(支持 神经组织），平滑肌瘤(平滑肌组织），横纹肌瘤(横纹肌组织），乳突淋瘤(形成乳头的上皮组 织），腺瘤(腺组织)和崎胎瘤(全能细胞）。恶性肿瘤的实例包括但不限于肉瘤(例如纤维肉 瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，血管皮内细胞瘤，淋己管肉瘤，滑膜肉瘤，平滑 肌肉瘤，横纹肌肉瘤等），癌(例如表皮或鱗状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，囊腺癌，绒毛膜癌， 阴茎癌，肺癌，乳癌，结肠癌等），神经胶质瘤，淋己瘤，白血病，黑素瘤，肝细胞瘤，精原细胞 瘤，脊索瘤和间皮瘤。另一方面，癌症的实例包括但不限于肺癌，乳癌，结肠直肠癌，膜腺癌， 卵巢癌，白血病，前列腺癌，肝癌和膀脫癌。
[0071] 在本发明中，个体或受试对象是指动物物种的成员，优选为哺乳动物，并且包括但 不限于宠物、灵长动物和人类，在本发明的内容中，所述的个体优选为任何种族或年龄的雄 性或雌性人类。
[0072] "疫苗"是指一旦处于有机体中，便引起特定的淋己细胞活化和抗原产生并由此产 生针对外源物质或致病微生物有机体的防御应答的抗原制备物。运种应答可W生成免疫记 忆，产生针对相应的病原体攻击的短暂或长期的免疫力。
[0073] 因此，本发明允许针对受试对象进行疫苗定制，换言之，可W根据受试对象的需要 来选择抗原，从而产生本发明的免疫原性复合物，其可W用作疫苗。待治疗/预防的疾病取 决于用于制备本发明的免疫原性复合物而选择的抗原。因此，任何过敏、感染性或抗肿瘤疾 病都可W使用本发明的免疫原性复合物来治疗。例如在了解受试对象对其过敏的变应原之 后，可W根据本发明来制备包含所选的变应原（多种）的免疫原性复合物，并且可W将其给 予受试对象，从而产生免疫应答，由此治疗过敏。
[0074] 因此，在另一个方面中，本发明设及包含本发明的免疫原性复合物的疫苗。
[00对本发明的治疗方法
[0076] 在另一个方面中，本发明设及用于预防和/或治疗受试对象中由变应原引起的感 染性疾病、肿瘤或过敏反应的方法，其中所述的方法包括将本发明的免疫原性复合物或本 发明的药物组合物给予所述的受试对象。
[0077] 在整个说明书和权利要求书中，术语"包含"及其变体不排除其他技术特征、添加 剂、成分或步骤。对于本领域的专业人员而言，本发明的其他目的、优点和特征可W部分由 说明书、部分由本发明的实践推导得到。提供W下实施例和附图是为了说明的目的，其无意 于限定本发明。
[007引附图简述
[0079] 图1.其示出甘露聚糖与高舰酸盐的氧化反应的图示。方案显示在由酵母菌衍生得 到的甘露聚糖中的巧巾类型的糖巧键0(1-2)和0(1-6)。使用高舰酸盐的氧化会破坏巧巾情况 下的化喃糖环。
[0080] 图2.其示出使用高舰酸盐预处理的和未使用高舰酸盐处理的甘露聚糖的一维光 谱的图示。
[0081] 图3.其显示4福图，代表了在多种聚合的变应原（黑柱）中的游离氨基占天然未聚 合形式的变应原值（白柱)的百分率。所示的数据为至少4种不同批次的平均值。
[0082] 图4.其为显示在使用事先氧化的甘露聚糖处理牛血清白蛋白（BSA)之后在变性条 件下的电泳（PAGE)结果的图像。泳道对应于缀合物的混合物粗品（缀合的BSA) W及在 AMICON YMl 00中过滤的巧巾样品(BSA小于1 OOkDa，和BSA大于1 OOkDa)。
[0083] 图5.其为显示通过气相色谱由梯牧草(Phleum pratense)的天然提取物或梯牧草 的聚合物得到的氨基酸的分析图。在聚合的样品中观察到游离赖氨酸显著减少。
[0084] 图6.其为显示由酿酒酵母得到的甘露聚糖原液样品的氨基酸的分析图。
[0085] 图7.其为显示使用甘露聚糖W不同的比例(蛋白质:碳水化合物)聚合的样品的一 维光谱的图。未使用甘露聚糖聚合的样品用作对照。
[0086] 图8.其为显示使用甘露聚糖W不同的比例(蛋白质:碳水化合物)聚合的样品的二 维光谱(DOSY)"扩散序谱Y(扩散序谱Y)"的图。未使用甘露聚糖聚合的样品用作对照。
[0087] 图9.其为显示通过梯牧草的气相色谱而分析的不同样品单糖百分率的图示。
[0088] 图10.其为显示一维光谱的图，其比较了梯牧草天然提取物（未聚合的）、聚合的 (未使用甘露聚糖）W及W-定比例（1:0.5)共同聚合的样品。
[0089] 图11.其为显示由梯牧草、未聚合的W及使用和未使用甘露聚糖聚合的样品得到 的二维光谱(DOSY)"扩散序谱r的图。
[0090] 图12.其为显示二维光谱HSQ(XH-C)的图，其中比较了梯牧草的不同样品。非单体 区的放大区域。
[0091] 图13.其为显示由使用甘露聚糖W不同的比例（蛋白质：碳水化合物）聚合的 (D.化rinae)的虫蛾提取物样品得到的二维光谱(DOSY)"扩散序谱r的图。未使用甘露聚糖 聚合的样品用作对照。
[0092] 图14.其为显示叠加一维光谱的图，其中所述的光谱得自D.farinae的天然提取 物、聚合的(未使用甘露聚糖)和W-定比例（1:0.3)共同聚合的样品。
[0093] 图15.其为显示通过D.化rinae的气相色谱所分析的不同样品单糖百分率的图示。
[0094] 图16.其为显示由D.化rinae、未聚合的W及使用或未使用甘露聚糖聚合的样品得 到的二维光谱(DOSY)"扩散序谱r的图。
[00M]图17.其为a)天然提取物，b)聚合的和C)只用甘露聚糖聚合（1:0.3)的D.farinae 样品的电子显微图像。
[0096] 图18.其为显示在不同时间下梯牧草的一维质子光谱的一组图。
[0097] 图19.图19A为图，其显示对梯牧草的天然提取物进行I巧结合抑制的化ISA检验的 结果，其中所述的梯牧草具有天然的变应原（未聚合的），聚合的非甘露糖基化的变应原和 使用戊二醒进行甘露糖基化的变应原。图19B为相当于SDS(SDS-PAGE)存在下的聚丙締酷氨 凝胶电泳和免疫检测(免疫印迹)的图像，其中所述的电泳和免疫检测使用了由过敏患者得 到的血清、梯牧草的提取物(与PAGE分离的蛋白质具有I巧反应性）。化=分子量模型；1 =天 然变应原;2 =聚合的未甘露糖基化的变应原;3 =使用戊二醒进行甘露糖基化的变应原。
[0098] 图20.图20A为图，其显示对欧洲室尘蛾和D.化rinae的天然提取物进行I巧结合抑 制的化ISA检验的结果，其中所述的天然提取物分别具有天然变应原(未聚合的）、聚合的未 甘露糖基化的变应原和使用戊二醒进行甘露糖基化的变应原。图20B为相当于SDS(SDS-PAGE)存在下的聚丙締酷氨凝胶电泳和免疫检测(免疫印迹）的图像，其中所述的电泳和免 疫检测使用了由过敏患者得到的血清、欧洲室尘蛾和D.化rinae的提取物(与PAGE分离的蛋 白质具有I扣反应性KPm=分子量模型；1 =天然变应原；2 =聚合的未甘露糖基化的变应 原;3 =使用戊二醒进行甘露糖基化的变应原。
[0099] 图21.其为一组图，其显示出在对梯牧草或D.farinae过敏的患者中体外嗜碱细胞 活性检验的结果，其中所述的对梯牧草或D.farinae为未聚合的提取物（天然）、聚合的 (Pol)或与甘露聚糖聚合的（Pol甘露聚糖），并具有相同的蛋白质浓度。使用 BASOT臨式剂盒，通过流式细胞仪来分析嗜碱细胞的活性。
[0100] 图22.其为显示在对梯牧草过敏的患者中对体内应答(刺痛检验）的测试的结果， 其中所述的梯牧草为未聚合的提取物(天然）、聚合的（Pol)或与甘露聚糖聚合的（Pol甘露 聚糖），并具有相同的蛋白质浓度。
[0101] 图23.其为显示在对D.farinae过敏的患者中对体内应答(刺痛检验）的测试结果 的值的箱线图，其中所述的D.farinae为未聚合的提取物(天然）、聚合的（Pol)或与甘露聚 糖聚合的(Pol甘露聚糖），并具有相同的蛋白质浓度。
[0102] 图24.图24A为显示使用得自聚合物的(Pol)梯牧草(Pol)、或者聚合的且甘露糖基 化的（Pol甘露聚糖)梯牧草得到的变应原，在对由人类单核细胞衍生的树突状细胞(DC)摄 入的测试中所获得的结果的图示。利用与运种禾本科提取物有关的颜料的自发巧光，通过 流式细胞仪进行测试。图24B为显示使用得自未聚合物的(天然)梯牧草、聚合的（聚合物)或 者使用甘露聚糖聚合的(Pol甘露聚糖）（使用Alexa 488在半脫氨酸处进行标记)得到的变 应原，在对由人类单核细胞衍生的树突状细胞(DC)摄入中所获得的结果的图示。在2个溫育 时间（1和5min)下进行测试，并通过流式细胞仪进行分析。顶部显示双阳性细胞(右上方象 限），其中捕获了Alexa 488的DCXHLADR+)被浓缩。下侧显示根据与DC溫育的制备物的DC的 平均巧光强度。图24C为代表微管区域的共聚焦显微镜样品，W便理解在溫育30min后在不 同的巧光素化制备物(Alexa 488)中被DC摄入的差异。与不同复合物有关的巧光可W在附 图中W细胞内小白点的形式可见(为了更好地识别被捕获的巧光染料，上方面板为阳性，下 方面板为阴性，W黑点表示）。
[0103] 图25.其为一组图，其显示在24小时中，使用天然(N)梯牧草的提取物、聚合的(P) 梯牧草(P)和使用甘露聚糖聚合的梯牧草(PM)来刺激的树突状细胞(DC)上清液中细胞因子 的产生。
[0104] 图26.其为显示在使用由未聚合的（天然)梯牧草，聚合的且未甘露糖基化的(Pol) 梯牧草，或者聚合的甘露糖基化的(Pol-Man)梯牧草得到的变应原所刺激的树突状细胞中 成熟标志物的表达。
[0105] 图27.其为显示在使用由未聚合的（天然)D.farinae，聚合的且未甘露糖基化的 (Pol),或者聚合的且甘露糖基化的(Pol-Man)而得到的变应原所刺激的树突状细胞中成熟 标志物的表达。
[0106] 图28.其为显示在使用由梯牧草得到的聚合的（Pol)或者聚合的且甘露糖基化的 (Pol Man)变应原进行体外免疫测定后，对产生特异性IFN丫，比-10和IL-4的细胞的诱导的 图。通过化ISPOT测定产生细胞的量。
[0107] 图29.其为显示在使用由D.化rinae得到的聚合的(Pol)或者聚合的且甘露糖基化 的(Pol Man)变应原进行体外免疫测定后，对产生特异性IFN 丫，比-10和化-4的细胞的诱导 的图。通过化ISPOT测定产生细胞的量。
[0108] 图30.其为用于Ba化/c小鼠的免疫方案。
[0109] 图31.其为在淋己细胞增殖测试中随后进行的方案。
[0110] 图32.其为显示在使用由梯牧草得到的扣g变应原而免疫的小鼠中增殖应答的图， 其中所述的变应原为聚合的但为甘露糖基化的（聚合物），或者聚合的且甘露糖基化的（聚 合物甘露聚糖）。使用CSFE进行增殖测定。
[011U 图33.其为显示在使用由D. farinae得到的20yg变应原而免疫的小鼠中增殖应答 的图，其中所述的变应原为聚合的但为甘露糖基化的（聚合物），或者聚合的且甘露糖基化 的（聚合物甘露聚糖）。使用CSFE进行增殖测定。
[0112]图34.其为一组图（图34A和34B)，其显示在使用由梯牧草得到的聚合物来免疫的 小鼠的脾细胞所产生的细胞因子，其作为对由梯牧草的天然(未聚合的）变应原的应答。柱 表示由相同的组得到的小鼠的平均值。灰色的柱:未甘露糖基化的聚合物；黑色的柱:甘露 糖基化的聚合物。
[0113] 图35.其为一组图（图35A和35B)，其显示在使用由D.化rinae得到的聚合物来免疫 的小鼠的脾细胞所产生的细胞因子，其作为对由D.farinae的天然（未聚合的）变应原的应 答。柱表示由相同的组得到的小鼠的平均值。灰色的柱:未甘露糖基化的聚合物;黑色的柱： 甘露糖基化的聚合物。
[0114] 图36.其为一组图（图36A和36B)，其显示针对由梯牧草得到的天然(未聚合的）形 式的变应原的、特异性抗体的水平，其是在使用变应原来免疫小鼠而得到的血清中检测的， 其中所述的变应原为聚合的但未甘露糖基化的（聚合物），或者聚合的且甘露糖基化的（聚 合物甘露聚糖）。下方的图表示在使用IgG2a和I姐的各类免疫原诱导的特异性抗原的水平 之间的比例。
[011引图37.其为一组图（图37A和37B)，其显示针对由D. farinae得到的天然(未聚合的） 形式的变应原的、特异性抗体的水平，其是在使用变应原来免疫小鼠而得到的血清中检测 的，其中所述的变应原为聚合的但未甘露糖基化的（聚合物），或者聚合的且甘露糖基化的 (聚合物甘露聚糖）。下方的图表示在使用IgG2a和I巧的各类免疫原诱导的特异性抗原的水 平之间的比例。 实施例
[0116] 实施例1:通过使用变应原（聚合物的或未聚合的）与氧化的甘露聚糖缀合而生产 疫苗
[0117] 1-甘露聚糖的氧化
[011引事先，使用IOOKDa截留膜，通过超滤将由酿酒酵母得到的甘露聚糖分级。收集低分 子量的过滤级份，并经历高舰酸盐的氧化。图1示出了高舰酸盐对甘露糖整体性和醒基生成 的理论作用。在图2中，凭经验证明在甘露聚糖氧化后运些基团的生成。
[0119] 2-变应原的聚合
[0120] 使用戊二醒使得自不同来源(梯牧草、橄揽、欧洲室尘蛾和欧洲档木）的变应原聚 合。图3示出了聚合的变应原中的氨基比天然的未聚合形式的变应原的值减少。根据欧洲药 典(2.2.56部分，氨基酸分析），通过与巧=酬反应来测定氨基的存在。
[0121] 3-使用BSA(牛血清白蛋白）氧化的甘露聚糖的缀合
[0122] 所得的结果显示BSA与氧化的甘露聚糖之间的缀合，运可W通过聚丙締酷氨凝胶 电泳来证明[图4,（缀合的BSA)]。相同的图示出了缀合的BSA级份(通过超滤而保留最大 100W)a的级份)显示成BSA单体的方式。运意味着在变性环境下，很高百分率的可W形成的 缀合物返回至初始状况，运说明与预氧化的甘露聚糖的缀合反应不会生成具有足够稳定性 的产物。可W通过化学方法(称为还原胺化作用）来稳定运些缀合物，其中所述的方法设及 使用氯基棚氨化钢使缀合反应中形成的ScMff碱发生化学还原，从而得到相应的更稳定的 仲胺。但是，该反应意味着在初始底物上的新的化学转化，其中所述的底物生成了在任何起 始试剂(甘露聚糖和蛋白质）中均不存在的并且因此必需要定义和表征的官能团和化学实 体(仲胺）。
[0123] 4-使用由事先用戊二醒聚合的梯牧草变应原得到的蛋白质提取物，使氧化的甘露 聚糖发生甘露聚糖缀合
[0124] 尽管由于聚合物中游离的氨基显著减少而取得成功的缀合是不明显的（图3)，但 是根据用于白蛋白所述的方案来检验过氧化的甘露聚糖与由梯牧草得到的变应原聚合物 的缀合（Mas紅OV自，J.and MiSIovicov自，D. 2002. Int .J.PoIymer .Anal. Qiaract. ,7 :106-116)。如预期的那样，在与戊二醒聚合后，游离赖氨酸的量相当于天然未聚合的提取物的总 氨基酸％减少4.5折(图5)。
[0125] 氧化的甘露聚糖与由聚合的梯牧草的提取物(分子大小大于100邸a的材料)缀合。 此外，再次通过100邸a膜将反应产物分级。在该步骤中，收集大于IOOKda的保留的级份，其 中发现已经缀合的初始的聚合的提取物和甘露聚糖。
[0126] 使用蔥酬，通过比色分析来分析由保留的样品得到的全部碳水化合物的含量，并 且与未使用甘露聚糖处理的聚合的提取物的初始含量相比，未观察到样品中碳水化合物的 量显著增加。另一方面，核磁共振研究(一维和二维研究)未显示巧巾化合物之间具有共价结 合，也未显示分子水平下的结构差异，表明使用运种缀合方案，在巧巾成分之间未得到分子 相互作用，因此，在巧巾产物之间未得到结合或缀合。不希望被理论所束缚，运可能是由于游 离氨基(主要由赖氨酸提供)减少，W及游离残基的赖氨酸（由于蛋白质材料为聚合物)的可 及性 低，由此形成的具有较低晓性的刚性结构。运种可能性得到W下事实的支持:使用事先 用戊二醒聚合的其他变应原得到了相同的阴性结果，W及由此游离氨基减少，如图3所示。
[0127] 5-结论
[0128] 运些结果表明在梯牧草的聚合的样品（W及其他聚合的变应原）与氧化的甘露聚 糖之间缺乏缀合。该事实，W及甘露糖在氧化后发生转化的缺点（图l)(Shibuya，N.，et al. 1988.Journal of Biological 化emishy,263:728-734)和所形成的缀合物缺乏稳定 性（即使使用富集赖氨酸的蛋白质，例如BSA，图4)可W废除运种方法学用于生产聚合的变 应原疫苗。
[0129] 实施例2
[0130] 使用戊二醒，通过用甘露糖聚合的变应原的缀合来精制疫苗
[0131] 材料和方法
[0132] 用于蛋白质提取物聚合和缀合的方法由W下步骤组成：
[0133] 1.所述的过程起始于由梯牧草得到的冻干的提取物，其在所需体积的憐酸盐缓冲 生理盐水(PBS)中重新构成，从而达到2mg/mL的最终蛋白质浓度。此后，使用憐酸钟或憐酸 钢缓冲液将pH调节至7.2,其需要降低或升高提取物的抑，并且考虑调节抑所用的缓冲液的 体积来计算蛋白质的浓度。
[0134] Ex.:起始蛋白质的定量：由P.pratense得到的300mg蛋白质
[0135] PBS 需要量：150mL
[0136] 将抑调节至7.2的需要量:ImL缓冲液
[0137] 样品的最终浓度：1.986mg/mL
[0138] 2.提取物的聚合和缀合反应：
[0139] 在揽拌条件下在提取物上滴加聚合试剂，在本实施例中为戊二醒，直至达到最终 浓度为0.025M。此外，在此时，还W比例1:0.5(蛋白质质量:甘露聚糖质量)加入用于样品缀 合的甘露聚糖。在15小时中，在4°C下在揽拌下保持反应。
[0140] Ex.:戊二醒的初始浓度:2.5M.
[0141] 加入到提取物中的体积：1.5mL
[0142] 甘露聚糖(蛋白质:碳水化合物的比例为1:0.5) :90mg
[0143] 3.终止反应：
[0144] 将提取物溫暖至室溫(25°C)，并加入甘氨酸粉末W终止聚合反应。甘氨酸必需是 过量的，例如与戊二醒的比例为1:50。将甘氨酸溶解于样品中，并在揽拌下在4°C下保持2小 时。
[0145] Ex.:甘氨酸的初始浓度(分子量:75.07): 1.25M
[0146] 戊二醒浓度:〇.〇25M
[0147] 提取物的体积：152.5mL(初始151mL+l. 5mL戊二醒）
[014引待加入的甘氨酸的定量:14.31g
[0149] 4.随后，将提取物针对7个体积的蒸馈水进行透析，W便除去盐和可能未聚合的残 基。使用交流过滤系统(Pellicon，Merck Millipore)，其具有IOOkDa多孔膜。
[0150] Ex.:提取物的体积：152.5mL
[0151] 水的体积：1.525mL
[0152] 5.最后，与甘露聚糖聚合的并缀合的提取物过滤通过0.22WH，等分，并冷冻于-60 °C并冻干用于保存。
[0153] ^
[0154] 使用所述的方法的结果是，得到了在免疫学方面比原始变应原改善的甘露糖基化 的聚合物。使用戊二醒进行处理允许结合巧巾结构(变应原和甘露聚糖），从而同时发生聚合 和缀合，运可W通过W下实施例中所示的结果来证明（实施例3)。
[0155] 所述的甘露糖基化的聚合物具有结构和免疫学性质，运些性质优于天然的或者聚 合的和非甘露糖基化的变应原的性质，分别如实施例4和实施例5-10中所示。
[0156] 因此，建立一种方法，用于在单一的步骤中，使用戊二醒，用甘露聚糖聚合的抗原 的缀合，其中甘露糖结构的整体性得到保持。为了达到此目的，另一方面利用了 W下事实： 由自然来源得到的（例如由酿酒酵母)甘露聚糖具有原始甘露糖蛋白的肤残基，在该肤残基 上，在包含赖氨酸的酵母菌中合成甘露聚糖（图6)，从而得到化学缀合。另一方面，在具有蛋 白质聚合物的溶液中，甘露聚糖的聚合、支化和刚性结构得到良好地利用，其中甘露聚糖被 通过戊二醒聚合的蛋白质所诱捕，得到物理缀合。在两种情况的任意一种中，在互不排斥的 情况下，使用戊二醒处理天然形式的（未聚合的）蛋白质与甘露聚糖的混合物允许结合巧中 结构，运会同时产生缀合和聚合。
[0157] 实施例3
[0158] 通过与戊二醒发生反应，关于变应原(禾本科和虫蛾)与甘露聚糖的聚合和缀合的 证据
[0159] 材料和方法
[0160] 将在实施例2中获得的2mg等分的冻干样品溶解于0.5mL重水中，并在SOOM^ Bruker Advance光谱仪或装配有冷冻探针的600MHz Bruker Advance中通过核磁共振 (NRM)来分析。根据制造商（Bruker Biospin Corporation(Billerica)Massachusetts , USA))标准化且实施的方案，在光谱采集和处理软件TOPSPIN中，由不同的样品获得一维质 子共振光谱、二维质子碳13RNA异核核糖核酸化etronuclear)相关光谱化SQC;Zwahlen et al.，1997. J. Am.化em. Soc. 119:6711-6721)和通过平移扩散排序的二维光谱(DOSY，Wu et 曰1.1995.J.Ma即.Reson.A.115:260-264)。
[0161] 使用用于分子总碳水化合物的蔥酬方法（S h i e 1 d S，R . a n d W.Burnett. 1960.Analytical Qiemistry 32:885-886)W及用于分析蛋白质的化日壯ord方 法（Bra壯ord,M.M. 1976.Anal}ftical Biochemistiy 72:248-254)，通过比色技术来分析样 品的碳水化合物和蛋白质含量。
[0162] 通过对W糖醇乙酸醋形式释放的单糖进行总酸水解和气相色谱分析 (M.F.Chaplin&J.F.Kennedy editors,Carbohydrate Analysis:a practical approach. (1986)0xford IRL PRESS)，对由样品的碳水化合物部分得到的不同的单糖速率进行分析。
[0163] 通过样品的总酸水解对样品的蛋白质部分中的不同的氨基酸进行分析，并在 Bioc虹om Aminoacid Anlyzer仪器中通过对所释放的氨基酸实施液相色谱来进行分析。
[0164] ^
[0165] 3.1-梯牧草与不同比例的甘露聚糖的共同聚合的研究，从而建立能够使用甘露聚 糖聚合的提取物发生充分缀合的更合适的比例。
[0166] 使用不具有甘露聚糖的聚合物样品，通过核磁共振(NMR)，对在该方法中获得的具 有不同蛋白质：甘露聚糖比例的样品的结构进行分析。自身聚合的蛋白质提取物具有属于 样品本身的寡糖残基（12-20%)，运可W通过气相色谱来证明（单糖分析）。通过增加介质中 的糖的量，光谱中多糖的信号也增强，如所预期的那样（图7)。进行平移扩散研究，该研究根 据扩散系数对化合物进行排序，并相应地取决于分子大小(通过NMR的二维光谱;二维光谱 (DOSY)"扩散序谱r)。在本研究中，可W观察到在使用甘露聚糖聚合的样品中，颗粒比未聚 合的样品更大，运表明在所有情况下蛋白质提取物与甘露聚糖之间的结合（图8)。具体而 言，在比例为1:4的情况下，观察到更大量的寡糖部分，运可能是由于反应介质中过量的碳 水化合物的原因。
[0167] 另一方面，对蛋白质和糖的量进行定量，从而尝试并建立(大致而言）已经发生聚 合过程的样品的蛋白质:糖的比例，并将其与原始比例比较(表1)。
[0168] 表1:在聚合前和聚合后蛋白质:甘露聚糖的比例的比较
[0170] 在聚合的样品中比例为1:4的情况下，正常的是在所得过程后得到较低比例的糖 的量，运是由于在反应介质中发现大幅的初始过量，此后在洗涂步骤中除去未反应的部分。 在剩余的样品中，发现多糖的比例比初始比例升高，运是由于提取物本身具有共价键合的 多糖残基。
[0171] 一旦获得所有的数据，便选择比例（1:0.5)，因为其证明了碳水化合物被引入至样 品中并最少地使用了甘露聚糖。
[0172] 3.2-在蛋白质-碳水化合物的比例下对梯牧草的共同聚合分析
[0173] 3.2.1通过气相色谱的碳水化合物分析
[0174] 由冻干材料的溶解开始，通过酸水解(糖醇分析)使用气相色谱来定量碳水化合物 相对于全部样品的百分率（W干重计）（I^ukuda ,M. &Kobata ,A. 1993. Glycobiology. A Practical Approach . The practical Approach Series . Oxford University Press Inc.,New York.)。
[0175] 分析巧中样品（图9):
[0176] -梯牧草天然提取物
[0177] -聚合的梯牧草
[0178] -使用甘露聚糖聚合的梯牧草(1:0.5)
[0179] 所得的结果显示相对于聚合的样品（不具有甘露聚糖)和天然提取物而言，在经历 共同聚合的样品中甘露聚糖显著升高。
[0180] 3.2.2 NMR(核磁共振)研究
[0181] 通过NMR的结构研究显示聚合的样品中的信号变宽，表明大小增加，运得到了由平 移扩散DOSY(扩散序谱Y)得到的二维光谱的证实（图10和11)。在该二维试验中，可W观察到 在未聚合的蛋白质提取物的情况下，具有不同尺寸的材料，因此其为极其混杂的样品，当其 聚合时，增加其平均分子大小。另一方面，当提取物在甘露聚糖存在下聚合时，还获得比所 述的聚合物（由于多糖为高分子量)具有甚至更低的扩散系数(表明了更大的大小）的材料， 说明多糖与蛋白质提取物之间的结合或相互作用，运是因为光谱的2个部分(碳水化合物区 和蛋白质区）具有相同的扩散系数，说明2种成分的相互作用。运些核磁共振试验证实了在 甘露聚糖存在下，在使用戊二醒使蛋白质提取物聚合后，缀合的蛋白质:甘露聚糖。
[0182] 另一方面，根据碳13与质子之间的（13C-1H)RM异核核糖核酸（HSQC， 巧eteronuclear Single如antum Coeherence")，通过NMR进行另一个二维研究。运些研究 显示，在原子水平下，氨与碳之间形成键，并且运些键的每一个都相当于牢固的关系信号 (concrete correlation Signal)(峰）（由光谱得到）和位置(坐标:横坐标，Ih的化学位移； 纵坐标:1?的化学位移）（其根据化合物的类型而不同）。该组信号化-C键)得到二维图案，其 对每种化合物而言是特异性的并且是排他的，类似于"指纹"的方式（Claridge, T.D.W.1999.High-resolution NMR techniques in Organic Chemistry.Tetrahedron Organic Chemistry Series.Elsevier)。
[0183] 进行3个服Q村式验来区分各种类型的样品的特征图案：
[0184] -游离的甘露聚糖
[0185] -由梯牧草得到的聚合物
[0186] -在甘露聚糖存在下由梯牧草得到的聚合物(1:0.5)
[0187] 在甘露聚糖存在下聚合的样品呈现出甘露聚糖的特征信号，W及样品本身的固有 碳水化合物的特征信号，表明蛋白质提取物与多糖之间的相互作用（图12)。
[0188] 3.3-在不同甘露聚糖比例下，D.farinae的共同聚合过程的研究。
[0189] 由使用梯牧草获得的结果开始，在蛋白质:碳水化合物的比例为（1:0.5)下进行初 步试验，然而，所得的结果对于各种情况下的梯牧草提取物而言是不令人满意的，运是因为 观察到未与蛋白质材料结合的过量的甘露聚糖残基（图13,通过黑色圆圈限定的信号）。在 介质中，在较低的碳水化合物比例（1: O . 3和1:0.15)下实施新的聚合。所选的比例为（1: 0.3)，因为观察到在样品中引入了主要与蛋白质结合的形式（图13,盒b)的而非游离形式 (图13,盒C，黑色圆圈）的甘露聚糖，并且甘露聚糖的运种引入高于所述的比例（1:0.15)，而 且对于1:0.3的比例而言，在相当于蛋白质部分的光谱区中，观察到最大的干扰(图13)。
[0190] 3.3.1在蛋白质:碳水化合物的比例为（1:0.3)下，D.farinae的共同聚合的分析。
[0191] 图14显示在甘露聚糖Wl :0.3的比例存在下由聚合的D.farinae提取物得到的样 品相对于在甘露聚糖缺乏下聚合的相应W及未聚合的提取物样品的、一维质子光谱的定量 比较。所述的光谱表明在使用甘露聚糖聚合的样品中甘露聚糖的特异性信号，W及在蛋白 质特异性光谱区中通过聚合引起的光谱图案改变。
[0192] 3.3.1.1通过气相色谱对碳水化合物的分析
[0193] 由冻干材料的溶解开始，通过气相色谱对碳水化合物相对于全部样品的百分率 (W干重计）进行定量（Fukuda ,M. &Kobata,A. 1993 .Glycobiology. Oxford 加 iversity Press Inc.,New York)。
[0194] 分析巧中样品（图15):
[01巧]-D.farinae天然提取物
[0196] -聚合的D.farinae
[0197] -使用甘露聚糖聚合的D. farinae (1:0.3)
[0198] D.farinae的提取物和聚合物包含样品本身固有的寡糖残基(在存在更多的葡萄 糖、甘露糖和半乳糖下通过气相色谱测定为大约17-20%)。与甘露聚糖共同聚合的产物的 结果显示相对于未使用甘露聚糖聚合的样品和天然提取物而言，甘露糖显著增多。
[0199] 3.3.1.2 NMR(核磁共振)研究
[0200] 通过NMR来分析在（1:0.3)(蛋白质:甘露聚糖)的比例下同时聚合和缀合所获得的 样品。运些结果显示在聚合的样品中，信号变宽，表明分子的大小增加，运可W在二维光谱 DSY中证实（图16)。与梯牧草的情况类似，使用甘露聚糖聚合的样品是均匀的，并且大小比 未使用甘露聚糖聚合的样品更大，表明多糖与D.化rinae的蛋白质提取物之间的结合，由此 证明巧巾成分之间的缀合。
[0201] 3.3.1.3透射电子显微镜
[0202] 由D.farinae的不同样品的透射电子显微镜得到的图像允许我们观察在天然的和 聚合的提取物之间，结构水平的差异。在所述的聚合提供了更高密度的颗粒并且与甘露聚 糖的缀合还会在形态学和结构水平上产生变化的情况下(在所述的聚合物中清楚可见），进 一步证明了多糖与蛋白质提取物之间的结合(图17)。
[0203] 实施例4
[0204] 通过与戊二醒的反应而产生的聚合和甘露糖基化生成了比未甘露糖基化的聚合 物更稳定的聚合物
[0205] 在水性介质中经过长期储存，比较梯牧草3种样品的稳定性，其中一种是在甘露聚 糖存在下聚合的（蛋白质/甘露聚糖的比例为1:0.5)，另一种为在甘露聚糖缺乏下聚合的， W及未聚合的变应原本身。将与实施例3中分析的那些相等的样品等分物溶解于重水中，并 通过NMR分析，接着储存在4°C下。未由NMR管中取出样品，也未进行操作。在储存后的4个月， 根据相同的采集参数来重复NI时式验，从而检查在运些溶解条件(4°C下的重水)下样品的稳 定性。结果W初始时和4个月后光谱的差异呈现(通过光谱仪自身的TOPSPIN软件进行光谱 的差减），显示聚合的样品比天然提取物更稳定(信号损失40% )，并且与甘露聚糖缀合甚至 更增强了稳定性，运是因为仅4%的样品信号损失，表明样品降解/沉淀的指数较低（图18)。
[0206] 实施例5
[0207] 关于变应原性的损失，使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物与非甘露糖基化的聚 合物相当
[020引5.1-使用特异性I巧抗体的反应性测试
[0209] 材料和方法
[0210] 通过抑制化ISA技术来实施I姐反应性测试。Wliig天然提取物/孔(稀释于0.05M 碳/重碳酸盐缓冲液，pH = 9.6中）平板接种96孔板 (Microlon,M曲binding capacity， Greiner bio-one ,Germany)。将平板在4°C下放置过夜。第二天，使用PBS-t缓冲液(憐酸盐 缓冲液，具有〇.25%Tween-20)洗涂平板，并在各种情况下将它们加入至由过敏患者(对禾 本科或虫蛾过敏)得到的相应的血清池中，并加入抑制剂(天然提取物、聚合的提取物和甘 露糖基化的聚合的提取物）（通过1/2系列稀释，由IOOiig/血稀释至0.0 liig/血）。将具有混合 物的平板过夜溫育，第二条，在使用PBS-t洗涂后，将它们与过氧化物酶缀合的抗人I巧单克 隆抗体（Southern Biotech,USAK Wl :2000稀释)溫育。使用OPD系统（Sigma Al化ich,USA) 将平板显色30分钟。使用盐酸（1/10在水中稀释)终止反应，并在492nm下读取平板。
[0211] 此外，还通过电泳和免疫检测来分析天然提取物、聚合的W及聚合的且甘露糖基 化的I巧的反应性。在变性条件下，在聚丙締酷胺凝胶(SDS-PAGE)中进行提取物的蛋白质的 分离。实施免疫测试，从而将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(Bio Rad,Germany) 上。使用具有5 % BSA (牛血清白蛋白）的PBS-t来封闭膜，并与得自过敏患者的血清溫育。此 后，将它们与过氧化物酶缀合的抗人I巧单克隆抗体(Southern Biotech,USA) (Wl :2000稀 释)溫育。使用E化化学发光系统用于显色(GE-Healthcare，USA)。
[0212] ^
[0213] 5.1.1将I巧与梯牧草的聚合物(使用戊二醒进行甘露糖基化)的反应性损失与非 甘露糖基化的聚合物的反应性比较。
[0214]图19A显示抑制ELISA，其中可W理解的是P.pratense的聚合的变应原（甘露糖基 化的或未甘露糖基化的）显示I巧的反应性比天然变应原降低。图19B显示在凝胶电泳和免 疫检测（使用由过敏患者得到的血清来实施的）中对应于P.pratense的变应原蛋白质的条 带，而在对应于聚合的变应原W及聚合的且甘露糖基化的变应原的泳道中，未观察到条带 (PAGE-SDS)和I巧结合(免疫检测）。
[0215] 5.1.2将I姐与欧洲室尘蛾和D.farinae的聚合物(使用戊二醒进行甘露糖基化） 的反应性损失与非甘露糖基化的聚合物的反应性比较
[0216] 图20A显示抑制化ISA，其中可W理解的是欧洲室尘蛾和D.farinae的聚合的变应 原（与甘露聚糖缀合的或缀合的）具有相似的I姐反应性，其低于在天然变应原中所观察到 的反应性。图20B显示在凝胶电泳和免疫检测(使用由过敏患者得到的血清来实施的）中对 应于虫蛾物种的变应原蛋白质的条带，而在对应于聚合的变应原W及聚合的且甘露糖基化 的变应原的泳道中，未观察到条带(PAGE-SDS)和I巧结合(免疫检测）。
[0217] 5.2-体外人类嗜碱细胞活化的检验
[0218] 对梯牧草与D.farinae的不同制备物活化患者嗜碱细胞的能力进行评估，其中所 述的患者对那些变应原过敏。
[0219] 材料和方法
[0220] 使用市售的试剂盒 BASOTEST ? (ORPEGEN Pharma,胎 ide 化 erg ,Germany)对 嗜碱细胞的活化进行评估，其中所述的试剂盒允许通过流式细胞仪测量外周血中嗜碱细胞 活化的百分率。过程：
[0221 ] 1-将外周静脉血提取至具有肝素钢的管中。
[0222] 2-将所述的血液与刺激缓冲液(包含IL-3)溫育。
[0223] 3-使用由P. pratense和D. f arinae得到的变应原（天然的，聚合物W及聚合物-甘 露聚糖)进行刺激。此外，还包括阴性对照(仅具有洗涂缓冲液)和阳性对照(趋化肤N-甲酯 基-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLP))。
[0224] 4-使用巧光染料缀合的单克隆抗体(抗CD203C和抗CD63.FITC)来标记细胞。双阳 性细胞(CD203c/CD63)反应了活化的嗜碱细胞。
[0225] 5-使用低渗缓冲液使红细胞裂解。
[0226] 6-在FC500血细胞计数仪(Beckman Coulter)中进行分析。用于测定活化的嗜碱细 胞的特异性标记:CD203C+和CD63+。
[0227] ^
[0228] 在与各种未聚合的变应原(天然的）溫育后，活化的嗜碱细胞(CD203C+CD63+)的百 分率如所预计的那样，高于并类似于使用测试的阳性对照所获得的百分率。另一方面，当进 行与梯牧草和D.farinae的聚合的变应原的溫育时，活化程度降低。聚合物活化嗜碱细胞的 能力的运种损失反映了它们变应原性的损失，并其如图21中所示，所述的损失与未甘露糖 基化的和甘露糖基化的聚合物相当。所有运些表明甘露糖基化的聚合物保持它们对巧中变 应原的变应原性降低至与常规聚合的变应原(未甘露糖基化的)所显示的相同的程度。
[0229] 5.3-在过敏患者中的皮肤检验(刺痛检验）
[0230] 对梯牧草和D.farinae的不同制备物在患者中产生阳性皮肤检验的能力进行评 估，其中所述的患者对那些变应原过敏。
[0231] 材料和方法 [02创刺痛检验
[0233] 刺痛检验由W下组成:将P.pratense和D.farinae的一滴各种变应原（天然的，聚 合物或者聚合物-甘露聚糖）（2个重复)分别置于对P.pratense和D.farinae过敏的患者的 前臂皮肤上。将运些变应原(按照之前所述来制备)在50%缓冲的甘油盐水溶液中调节至相 同的蛋白质浓度。使用Imm刺血针穿过液滴来刺痛皮肤而向真皮中引入变应原。变应原通过 其特异性的I巧与肥大细胞致敏的患者反映，所述的肥大细胞在活化后释放组胺。释放的组 胺增加了毛细管渗透性，从而产生了液体溢出物，运导致在刺痛后20分钟出现皮肤丘疹。
[0234] 丘疹的大小(mm2)被认为是制备物的变应原性指数，该指数越高，所产生的丘疹的 表面越大。
[0235] 统计学
[0236] 对于描述性统计而言，使用各置信界限为95%的平均值、标准偏差、相应的第一四 分位数和第=四分位数的中值、变异系数和值的范围（最大值和最小值）。
[0237] 对于比较性统计而言，在使用虫蛾(D.farinae)的皮肤检验而得到的数据中使用 方差分析(ANOVA)和Bonferroni校正（用于成对的值之间的比较），运是因为运些符合正态 分布。在使用梯牧草的皮肤检验而得到的数据的情况下，使用非参数检验，运是因为运些数 据不符合正态分布。使用化iedman检验来比较巧巾制备物，并使用Wi Icoxon检验进行成对比 较。
[0238] 对于图示而言，使用箱线图，其表示各个25%和75%四分位数的中值。
[0239] 缉里
[0240] 5.3.1在使用梯牧草的聚合物(使用戊二醒进行甘露糖基化)的刺痛检验中，变应 原性的损失高于未甘露糖基化的聚合物的变应原性损失。
[0241] 研究12名患者，5名男性，7名女性，在临床上均为对禾本科花粉过敏。平均年龄为 41岁，年龄范围为11至78岁。由梯牧草的天然提取物(未修饰的）诱导的丘疹的面积大小的 中值为28.4mm 2，25和75%四分位数的值分别为23.0和43. Imm2。对应于聚合的提取物的值为 8.0mm2,四分位数的中值分别为8.0和19.7。对于聚合的且甘露糖基化的提取物而言，中值 为0.0,并且四分位数分别为0.0和5.4(表3)。
[0242] 使用3种类型的制备物所得到的丘疹大小的差异极为显著（Friedman检验，P< 0.0001)，在制备物对之间（天然的-聚合物，天然的-甘露糖基化的聚合物W及聚合物-甘露 糖基化的聚合物)也极为显著(Wilcoxon检验，P<0.0001)。在体内显示变应原性较低的制备 物为甘露糖基化的聚合物。
[0243] 表2和3显示使用各制备物所获得的各丘疹面积的个体值，W及运些值的描述性统 计和患者的流行病学数据(年龄和性别）。
[0244] 表2:患者的流行病学数据(年龄和性别）、W及通过各制备物诱导的各丘疹的面积 值
[0246] 表3:图2中所示的数据的描述性统计
[0247]
[0248] 图22通过箱线图显示使用各种梯牧草的制备物所获得的丘疹的面积值。如可W观 察到的那样，使用甘露糖基化的聚合物进行的皮肤检验实际上是阴性的，其相对于未甘露 糖基化的聚合物有所降低，而未甘露糖基化的聚合物相应地比天然抗原(未聚合的）更低。 所有运些表明梯牧草的甘露糖基化的聚合物的变应原性降低至与常规聚合物(未甘露糖基 化的)相同或更高的程度。
[0249] 5.3.2在使用D.化rinae的聚合物(使用戊二醒进行甘露糖基化)进行的刺痛检验 中，反应性损失与为甘露糖基化的聚合物相当。
[0250] 研究22名患者，14名男性，8名女性，在临床上均为对美洲尘蛾过敏。平均年龄为32 岁，年龄范围为12至82岁。由美洲尘蛾的天然提取物(未修饰的）诱导的丘疹的面积大小的 中值为64.2mm 2,25和75%四分位数的值分别为54.2和72.3mm2。对应于聚合的提取物的值为 32.5mm 2,四分位数的中值分别为1.0和45.7。对于聚合的且甘露糖基化的提取物而言，中值 为24.1，并且四分位数分别为16.3和33.8。
[025。 使用3种类型的制备物所得到的丘疹大小的差异极为显著（AN0VA检验，P< 0.0001)，在制备物对之间（天然的-聚合物，天然的-甘露糖基化的聚合物）也极为显著 (Bonferroni校正,P<0.0001)。巧巾制备物显示在体内，变应原性比未聚合的变应原性极为 重要地降低。
[0252] 表4和5显示使用各制备物所获得的各丘疹面积的个体值，W及运些值的描述性统 计和患者的流行病学数据(年龄和性别）。
[0253] 表4:患者的流行病学数据(年龄和性别）、W及通过各制备物诱导的各丘疹的面积 值
[0256]表5:表4中所示的数据的描述性统计
[0258]图23通过箱线图显示使用各种D.farinae的制备物所获得的丘疹的面积值。如可 W观察到的那样，使用甘露糖基化的聚合物进行的皮肤检验与使用未甘露糖基化的聚合物 的皮肤检验类似，同时比天然抗原(未聚合的)那些低更多。所有运些表明D.farinae的甘露 糖基化的聚合物的变应原性降低至与常规聚合物(未甘露糖基化的)相同的程度。
[0巧9] 实施例6
[0260] 使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物比未甘露糖基化的聚合物更好地被树突状 细胞捕获
[0261] 材料和方法
[0262] 由健康供者的外周血单核细胞诱导树突状细胞(DC)，并使用GM-CSF和化-4培养5 天。由此获得的的DC(未成熟)暴露于按照之前所述而制备的梯牧草聚合物(具有或不具有 缀合的甘露聚糖）中，从而评估运些细胞的摄入。通过流式细胞仪，利用由梯牧草得到的提 取物的自发巧光（由于其染料），在DC与制备物之间接触2小时后，进行摄入测试。评估2个参 数:a)被DC捕获的变应原的定量(摄入速率）；b)显示内化能力的细胞的百分率。此外，使用 事先用巧光染料(Alexa M 488)通过半脫氨酸而标记的梯牧草的变应原来进行摄入测定。 通过流式细胞仪和共聚焦显微镜来分析结果。
[0263]
[0264] 如图24A中可W观察的那样，根据MFK平均巧光指数，其反映了摄入速率)被DC捕 获的梯牧草自发巧光的甘露糖基化聚合物的量是常规聚合物(未甘露糖基化的）所捕获的 量的7倍W上。在同一图的左上方，呈现了具有捕获巧巾制备物(梯牧草的聚合物，甘露糖基 化的和未甘露糖基化的）的能力的细胞的量。如可W观察到的那样，显示较强巧光的阳性细 胞的百分率对应于与甘露糖基化的聚合物溫育的那些。运些结果可W使用巧光染料(Alexa M488)通过半脫氨酸进行标记来证明。如图24B中可W观察到的那样，将当所述的细胞与具 有甘露聚糖的聚合物溫育时，双阳性细胞(识别为HLA-DR和Alexa 488)的量更高，运意味着 运种制备物的摄入更高。在同一图的下方，呈现了平均巧光值。如可W观察到的那样，在与 甘露糖基化的聚合物溫育的DC中，巧光强度也更高。图24C显示共聚焦巧光显微镜的图像， 其中可W看见，与未甘露糖基化的聚合物或天然变应原溫育的DC相比，与具有甘露聚糖的 聚合物溫育（30min)的DC的摄入更高。运些试验的结论为甘露糖基化的聚合物被更大量的 DC所捕获，并且运些DC也W更大的量捕获运些聚合物。
[02化]实施例7
[0266] 与未甘露糖基化的聚合物相比，使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物诱导人类树 突状细胞更多地产生IL-IO和IL-6。
[0267] 7.1树突状细胞产生细胞因子的测试 [026引材料和方法
[0269] 使用IL-4和GM-CSF使由健康供者得到的经分离的外周血单核细胞分化成树突状 细胞(DC)。将运些DC(未成熟的）与50iig/mL聚合的且甘露糖基化的（PM) W及未甘露糖基化 的(P)变应原(梯牧草)溫育。在使用不同的制备物进行刺激后的24小时，在运些细胞的培养 物上清液中测定细胞因子的浓度。用于定量细胞因子的技术为流式细胞仪Multiplex。
[0270] ^
[0271] 图25显示3个独立试验的平均值。
[0272] 如可W观察到的那样，与梯牧草的甘露糖基化的聚合物溫育的树突状细胞(DC)比 聚合的未甘露糖基化的变应原或天然的变应原（未聚合的）产生更多量的IL-6和IL-10。相 反，3种制备物诱导了相似的IL-8的产生。运些结果表明人类骨髓DC对甘露糖基化的聚合物 产生差异性地应答。使用甘露糖基化的聚合物观察到IL-IO增加的事实是免疫调控性强阳 性的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0273] 实施例8
[0274] 关于诱导人类树突状细胞成熟的能力，将使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物与 未甘露糖基化的聚合物比较
[0275] 8.1-树突状细胞的成熟测试 脚引材料和方法
[0277] 由健康供者的外周血（白细胞层)单核细胞诱导树突状细胞(DC)，并使用GM-CSF和 IL-4培养5天。由此获得的的DC(未成熟)暴露于不同的变应原制备物(天然的、聚合物W及 聚合物-甘露聚糖）中，从而评估在对运些变应原的应答在DC的成熟情况。在培养48小时后， 通过流式细胞仪来分析成熟测试，从而评估与DC成熟有关的分子的表达化LA-II (DR)， CD80，CD83和CD86)。
[0278] 细胞标记过程:每次标记使用SxlO5个细胞。将细胞再次悬浮于PBS中，并加入化g 直接抗体(1:100)(与巧光染料缀合的)或间接抗体(未缀合的）。在4°c下在黑暗中将它们溫 育20分子，随后用PBS洗涂。在间接抗体的情况下，加入与所关注的巧光染料缀合的化g( W 1:100稀释)小鼠抗IgG二级抗体。在使用PBS将它们洗涂2次后，将细胞再次悬浮于300-40化 L体积的PBS中，并最终通过流式细胞仪(FC SOOBeckman Coultek)进行分析。
[0279] 缉里
[0280] 8.1.1通过梯牧草变应原(根据它们的聚合和/或甘露糖基化）由人类衍生的树突 状细胞(DC)的成熟。
[0281] 如图26中可W观察到的那样，在骨髓未成熟的DC与聚合的变应原溫育后，所述的 变应原会诱导骨髓未成熟的DC成熟。根据图中所反映的标志物在DC表面的表达来评估成熟 的程度。相对于未聚合的变应原，在与聚合的变应原溫育的DC中，与成熟有关的所有标志物 均增多，根据聚合物为甘露糖基化的或未甘露糖基化的，所述的标志物不具有显著的差异。
[0282] 运些结果表明，由DC成熟的观点来看，梯牧草的甘露糖基化的聚合物表现与常规 聚合物(未聚合的)相似，因此显示成熟指数高于常规的变应原(未聚合的）。
[0283] 8.1.2通过D.farinae变应原（根据它们的聚合和/或甘露糖基化）由人类单核细 胞衍生的树突状细胞的成熟。
[0284] 如图27中可W观察到的那样，在骨髓未成熟的DC与聚合的变应原溫育后，所述的 变应原会诱导骨髓未成熟的DC成熟。根据图中所反映的标志物在DC表面的表达来评估成熟 的程度。相对于未聚合的变应原，在与聚合的变应原溫育的DC中，与成熟有关的所有标志物 均增多，根据聚合物为甘露糖基化的或未甘露糖基化的，所述的标志物不具有显著的差异。 运些结果表明，由DC成熟的观点来看，D.farinae的甘露糖基化的聚合物表现与常规聚合物 (未聚合的)相似，因此显示成熟指数高于常规的变应原(未聚合的）。
[0285] 实施例9
[0286] 与未甘露糖基化的聚合物相比，在体外免疫测试中，使用戊二醒进行甘露糖基化 的聚合物改善了产生IFN 丫和IL-IO的T细胞的诱导。
[0巧7] 材料和方法
[028引使用外周血人类细胞进行体外免疫测试
[0289] 免疫方案
[0290] 在使用自体成熟的DC(负载由相应的变应原提取物)进行3轮刺激后，由健康个体 的PBMC获得变应原特异性效应器T细胞。简言之，将iDC(l(yVmL)与具有相应提取物（lOOiig/ mL)的完全DMEM培养基溫育8小时，然后通过与肤聚糖（liil/mL)溫育而成熟。将事先洗涂的 成熟的树突状细胞(HiDC)与相应的提取物在完全DMEM培养基中再次溫育6小时（在ImL中， IO6个细胞），此后立即进行福射(300化ad)。然后，将经过福射并负载变应原的血C分布于48 孔平板（1〇6/血)中，并在比-7(化1/血席在下与PBMC( IO7个细胞/血)一起共培养。在第一次 刺激后的5天，向培养物中补充化-2(10U/mL)。使用负载变应原提取物的DC重复3次相同 PBMC的刺激和扩增过程。通过化ISPOT测试来测量细胞产生的变应原特异性WN丫，化-10和 比-4。
[0291] 缉里
[0292] 9.1.1使用戊二醒进行甘露糖基化的梯牧草聚合物会改善未甘露糖基化的聚合 物的IFN-丫和IL-IO应答，而不增加 IL-4应答。
[0293] 如图28中可W看见，与在常规的聚合物(未甘露糖基化的）中免疫的那些培养物相 比，在使用聚合物的且甘露糖基化的变应原免疫的培养物中，在特异性应答中，增加了产生 IFN-丫和化-10的细胞的数量。运种增加与产生IL-4的细胞的更多的数量不一致，表明对 TH2表现型不具有极化作用。使用甘露糖基化的聚合物所观察到的IFN-丫和IL-IO增加而 IL-4不增加的事实是免疫调控性强阳性的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0294] 9.1.2使用戊二醒进行甘露糖基化的D.化rinae变应原会改善未甘露糖基化的聚 合物的IFN-丫和IL-IO应答，而不增加 IL-4的应答。
[0295] 如图29中可W看见，与在常规的聚合物(未甘露糖基化的）中免疫的那些培养物相 比，在使用聚合物的且甘露糖基化的变应原免疫的培养物中，在特异性应答中，增加了产生 IFN-丫和化-10的细胞的数量。运种增加与产生IL-4的细胞的更多的数量不一致，表明对 TH2表现型不具有极化作用。使用甘露糖基化的聚合物所观察到的IFN-丫和IL-IO增加而 IL-4不增加的事实是免疫调控性强阳性的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0巧6] 实施例10
[0297] 与未甘露糖基化的聚合物相比，使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物会改善体内 的免疫应答
[0298] 在小鼠中的体内免疫测定
[0299] 材料和方法
[0300] 使用梯牧草和D.化rinae变应原(具有甘露糖基化的和未甘露糖基化的聚合物)实 施免疫，从而评估它们在体内的免疫能力。使用图30中所示的方案在Ba化/c小鼠中进行免 疫。
[0301] 在脾中通过使用CFSE标记实施响应于变应原(天然形式)的特异性淋己增殖测试， 来评估对免疫的应答。使用植物凝血素(PHA)作为阳性对照。在培养的第6天和第7天来测定 增殖。此外，在刺激48小时后，使用Multipler流式细胞仪技术在培养物上清液中进行细胞 因子的定量（图31)。使用植物凝血素(PHA)作为阳性对照。此外，通过化ISA来评估特异性 I巧水平(P.pratense或D. farinae)，W及IgGl (作为TH2应答标志物）和IgG2a(THl应答标志 物)的水平。
[0302] ^
[0303] 10.1与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用梯牧草的甘露糖基化的聚合物进 行免疫会对抗原刺激产生更高的增殖应答。
[0304] 如图32中可W观察到的那样，与由小鼠（使用常规的聚合的变应原（未聚合的）来 免疫）的脾所取得的细胞相比，当应答的细胞取自使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免 疫的小鼠的脾时，反映了对抗原产生应答的T细胞数量的增殖百分率显著较高。运表明与未 甘露糖基化的聚合物相比，聚合的且甘露糖基化的梯牧草变应原的免疫原性性质显著较 局。
[0305] 10.2与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用D.farinae的甘露糖基化的聚合物 进行免疫会对抗原刺激产生更高的增殖应答。
[0306] 如图33中可W观察到的那样，与由小鼠（使用常规的聚合的变应原（未聚合的）来 免疫）的脾所取得的细胞相比，当应答的细胞取自使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免 疫的小鼠的脾时，反映了对抗原产生应答的T细胞数量的增殖百分率显著较高。运表明与未 甘露糖基化的聚合物相比，聚合的且甘露糖基化的D.farinae变应原的免疫原性性质显著 较高。
[0307] 10.3相对于未甘露糖基化的聚合物而言，使用甘露糖基化的梯牧草聚合物所免 疫的小鼠的脾会改变细胞因子的模式。
[0308] 图34(图34A和34B)表示在脾细胞(使用P.pratense变应原刺激的）的培养物上清 液中所获得的不同细胞因子的产生，其中所述的脾细胞得自使用甘露糖基化的和未甘露糖 基化的聚合的变应原所免疫的小鼠。如可W观察到的那样，根据脾细胞的来源，所产生的细 胞因子的模式很多都不同。由淋己细胞产生的变化W定量的方式示于表6中。
[0309] 10.4与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用化Ieum的甘露糖基化的聚合物所 免疫的小鼠的淋己细胞会增加 IL-IO的产生。
[0310] 表6.在使用化Ieum聚合物所免疫的小鼠中，由其淋己细胞在体外相对产生的细胞 因子
[0312] **与使用未甘露糖基化的聚合物所免疫的小鼠中获得的值相比，相对增加100倍 W上。
[0313] 如表6中可W观察到的那样，相对于图34(图34A和34B)中所示的淋己来源的细胞 因子的产生而言，可W获得的最大的改变对应于IL-10,其在聚合的且甘露糖基化的变应原 所刺激的小鼠中比使用未甘露糖基化的聚合物所免疫的小鼠中所获得的生产高出300倍W 上。比-10的运种增加是免疫调控性强阳性的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0314] 10.5相对于未甘露糖基化的聚合物而言，由使用甘露糖基化的D.化rinae的聚合 物所免疫的小鼠而得到的脾细胞会改变细胞因子的模式。
[0315] 图35(图35A和35B)表示在脾细胞(使用D.farinae变应原刺激的）的培养物上清液 中所获得的不同细胞因子的产生，其中所述的脾细胞得自使用甘露糖基化的和未甘露糖基 化的聚合的变应原所免疫的小鼠。如可W观察到的那样，根据脾细胞的来源，所产生的细胞 因子的模式很多都不同。由淋己细胞产生的变化W定量的方式示于表7中。
[0316] 10.6与使用未甘露糖基化的聚合物所产生的因子相比，由使用D.化rinae的甘露 糖基化聚合物所免疫的小鼠而得到的脾细胞会增加 IL-IO ,IFN 丫和IL-2(作为对抗原刺激 的应答）
[0317]表7.在使用D.farinae聚合物所免疫的小鼠中，由其淋己细胞在体外相对产生的 细胞因子
[0319] **与使用聚合物(不具有甘露聚糖)所免疫的小鼠中获得的值相比，相对增加100 倍W上。
[0320] 如表7中可W观察到的那样，相对于图35(图35A和35B)中所示的淋己来源的细胞 因子的产生而言，可W获得的最大的改变对应于化-2,化-10和IFN-丫，其在未甘露糖基化 的聚合物所免疫的小鼠中所获得的生产相比，使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的 小鼠中增加300,145和125倍W上。运种增加(特别是IL-IO和IFN-丫）是免疫调控性强阳性 的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0321] 10.7与未甘露糖基化的聚合物相比，使用高剂量的聚合物的且甘露糖基化的梯 牧草聚合物所免疫的小鼠中，特异性抗体的应答有利于IgG/I巧比例。
[0322] 如图36(图36A和36B)中可W观察到的那样，与常规的聚合的变应原(未甘露糖基 化的）相比，在使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠而得到的血清中，响应于梯 牧草变应原的特异性IgG抗体较高。相反，特异性I巧抗体应答低于常规的聚合物。如图中可 W看见的那样，当使用聚合的且甘露糖基化的梯牧草变应原进行免疫时，IgG2a/I巧的比例 较高。比例的运种增加是免疫调控性强阳性的（运是使用运种类型的制备物所寻求的），因 为其表明了所得应答的抗过敏极性。
[0323] 10.8与未甘露糖基化的聚合物相比，使用高剂量的甘露糖基化的D.化rinae聚合 物所免疫的小鼠中，特异性抗体的应答有利于IgG^^比例。
[0324] 如图37(图37A和37B)中可W观察到的那样，与常规的聚合的变应原(未甘露糖基 化的）相比，在使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠而得到的血清中，响应于 D. far inae变应原的特异性IgG抗体较高。相反，特异性I巧抗体应答低于常规的聚合物。如 图中可W看见的那样，当使用聚合的且甘露糖基化的D. farinae变应原进行免疫时，IgG2a/ I巧的比例较高。比例的运种增加是免疫调控性强阳性的(运是使用运种类型的制备物所寻 求的），因为其表明了所得应答的抗过敏极性。
【主权项】
1. 一种包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物。2. 根据权利要求1所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖得自植物、真菌或酵母 菌。3. 根据权利要求2所述的免疫原性复合物，其中所述的酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属 和假丝酵母属。4. 根据权利要求3所述的免疫原性复合物，其中所述的酵母属物种为酿酒酵母。5. 根据权利要求1至4的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖包含氨 基。6. 根据权利要求5所述的免疫原性复合物，其中所述的氨基存在于赖氨酸氨基酸中。7. 根据权利要求1至6的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的聚合的抗原包含 至少2个抗原，它们是彼此相同的或不同的。8. 根据权利要求1至7的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的二醛选自戊二 醛，乙二醛，丙二醛，丁二醛和己二醛。9. 根据权利要求8所述的免疫原性复合物，其中所述的二醛为戊二醛。10. 根据权利要求1至9的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的聚合的抗原通 过所述的戊二醛与所述的甘露聚糖结合。11. 根据权利要求1至9的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原通过所述 的聚合的抗原通过物理诱捕而与所述的甘露聚糖结合。12. 根据权利要求1至11的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原为变应 原。13. 根据权利要求12所述的免疫原性复合物，其中所述的变应原选自花粉、虫螨、上皮 细胞、真菌孢子和它们的组合。14. 根据权利要求13所述的免疫原性复合物，其中所述的花粉选自物种梯牧草、喜马拉 雅鸭茅、狗牙根、多年生黑麦草、三毛草属、橄榄、Cuppresusspp.、豚草属、桦木属、悬铃木 属、欧榛或欧洲桤木。15. 根据权利要求13或14所述的免疫原性复合物，其中所述的虫螨属于物种欧洲室尘 螨、美洲尘螨或Blomiatropicalis。16. 根据权利要求13至15的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的上皮细胞属 于物种Felisdomesticus或家犬。17. 根据权利要求13至16的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的真菌孢子属 于物种烟草赤星病菌或细链格孢。18. 根据权利要求1至17的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原:甘露聚 糖的比例范围为1:10至1:0.1，优选为1:0.3或1:0.5。19. 根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物，其包括（i)制备包含抗原 和甘露聚糖的溶解物；以及(ii)将所述的二醛加入至所述的溶解物中。20. 权利要求19所述的方法，其包括步骤（iii):包括加入中和试剂，优选为甘氨酸，从 而终止所述的聚合反应。21. 根据权利要求19或20所述的方法，其还包括步骤（iv):分离所述的免疫原性复合 物。22. 根据权利要求19至21的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖得 自植物、真菌或酵母菌。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述的酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属和假丝酵 母属。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述的酵母属物种为酿酒酵母。25. 根据权利要求19至24的任意一项所述的方法，其中所述的甘露聚糖包含氨基。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述的氨基存在于赖氨酸氨基酸中。27. 根据权利要求19至26的任意一项所述的方法，其中所述的聚合的抗原包含至少2个 抗原，它们是彼此相同的或不同的。28. 根据权利要求19至27的任意一项所述的方法，其中所述的二醛选自戊二醛，乙二 醛，丙二醛，丁二醛和己二醛。29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述的二醛为戊二醛。30. 根据权利要求19至29的任意一项所述的方法，其中所述的抗原为变应原。31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述的变应原选自花粉、虫螨、上皮细胞、真菌孢 子和它们的组合。32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述的花粉选自物种梯牧草、喜马拉雅鸭茅、狗 牙根、多年生黑麦草、三毛草属、橄榄、Cuppresusspp.、豚草属、桦木属、悬铃木属、欧榛或 欧洲桤木。33. 根据权利要求31或32所述的方法，其中所述的虫螨属于物种欧洲室尘螨、美洲尘螨 或Blomiatropicalis。34. 根据权利要求31至33的任意一项所述的方法，其中所述的上皮细胞属于物种Felis domesticus或家犬。35. 根据权利要求31至34的任意一项所述的方法，其中所述的真菌孢子属于物种烟草 赤星病菌或细链格孢。36. 根据权利要求19至35的任意一项所述的方法，其中所述的抗原:甘露聚糖的比例范 围为1:10至1:0.1，优选为1:0.3或1:0.5。37. -种药物组合物，其包含根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物以 及药物可接受的载体。38. 根据权利要求37所述的药物组合物，其还包含佐剂。39. 根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述的佐剂选自氢氧化铝、磷酸钙、酪氨 酸、单磷酰脂质A和壳聚糖。40. 根据权利要求37至39的任意一项所述的药物组合物，其还包含额外的活性物质。41. 根据权利要求40所述的组合物，其中所述的额外的活性物质包括抗组胺试剂、甾类 激素、组胺受体的拮抗剂、白细胞三烯或它们的混合物。42. 根据权利要求37至41的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物配制成大颗粒、 纳米颗粒或脂质体。43. 根据权利要求37至42的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物为固体药物给 予形式、液体药物给予形式或包含分散系统的药物传递形式。44. 根据权利要求37至43的任意一项所述的组合物，其中所述的药物组合物为使用肠 胃外、鼻内、口周、舌下、口服、经皮或局部给予的药物形式。45. 根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物用于制备药物组合物的用 途。46. 根据权利要求45所述的用途，用于在受试对象中刺激和/或诱导所述的免疫应答。47. 根据权利要求45的用途，所述的用途为作为疫苗。48. 根据权利要求45至47的任意一项所述的用于治疗受试对象的感染性疾病、肿瘤或 过敏的用途。
【专利摘要】本发明提供了包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物，包含该免疫原性复合物的组合物，以及其作为免疫应答刺激剂和疫苗用于治疗感染性疾病、肿瘤和过敏的用途。同样地，本发明涉及基于通过使用二醛而使得抗原和甘露聚糖同时聚合和缀合来获得所述的免疫原性复合物的方法。
【IPC分类】A61P37/08, A61K39/35, A61K39/39
【公开号】CN105492022
【申请号】CN201480030171
【发明人】J·L·苏维萨加里多-莱斯塔切, J·卡那达维西奈, I·索里亚卡斯特罗, E·费尔南德斯-卡尔达斯罗德里格斯, A·曼扎诺佩雷斯, B·卡瑟斯奥尔特加, J·吉梅内斯巴贝罗, M·卡萨诺瓦斯弗格斯
【申请人】尹姆诺泰克公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年4月3日
【公告号】EP2982381A1, US20160058859, WO2014162036A1
【专利说明】用于接种疫苗的免疫原性络合物及其获得方法
[0001] 本发明设及包含聚合抗原、甘露聚糖和二醒的免疫原性复合物，包含该免疫原性 复合物的组合物，W及其作为免疫应答刺激物和疫苗的用途。同样地，本发明设及使用二 醒，基于抗原和甘露聚糖同时进行聚合和缀合而获得所述的免疫原性复合物的方法。因此， 本发明属于免疫学和疫苗生产领域的范围内，W及治疗和预防过敏反应的领域范围内。
【背景技术】
[0002] 树突状细胞(DC)是专口高效地刺激T细胞的抗原呈递细胞，并且鉴于此，它们基本 用于诱导特异性免疫应答。未成熟的DC策略性地分布于组织和器官中，其中它们作为哨兵， 在它们的微环境中不断地取得抗原样品。作为对不同刺激(包括抗原本身、微生物有机体的 产物W及组织危险物信号）的应答，DC开始成熟过程，运使得DC在周围携带由它们本身所负 载的抗原迁移至次级淋己器官的T区。在此，显示HLA-II和共刺激分子表达增多的成熟DC与 T细胞相互作用，将抗原性的肤(经DC加工后）呈递给T细胞，并刺激T细胞开始特异性的应 答。
[0003] 未成熟的DC通过受体介导的内吞作用、微胞钦作用和吞隧作用捕获抗原。有多种 不同的受体与内吞摄入有关，其中发现了甘露糖受体(MRKCD206和CD209)。它们通过碳水 化合物识别结构域而识别末端甘露糖残基、海藻糖和/或N-乙酷氨基葡萄糖。天然配体包括 细菌来源的产物(糖蛋白和糖脂），W及具有高的甘露糖含量的哺乳动物糖蛋白。MR在巨隧 细胞和未成熟的DC中表达，与甘露糖基化的抗原的内吞作用有关，用于其加工和T细胞呈 递。
[0004] 在I巧抗体介导的过敏状况中，免疫治疗是W给予治疗疫苗为基础的，运些疫苗抗 原与过敏患者所敏感的那些为相同的变应原。变应原为得自于花粉、尘蛾、上皮细胞等的蛋 白质，它们是患者所呼吸(环境吸入器)的空气中所携带的超级结构。广泛接受的是，运些疫 苗的临床功效与所传递的变应原的剂量有关，运样WHO和得自于科学社会的共同指导原则 建议应该使用足够的变应原浓度来制备疫苗。运种要求意味着患者对疫苗剂量的过敏反应 设及不利作用的风险，而根据规定所述的作用应该受到限制。避免运种风险的方式在于基 于改性的变应原(类变应原）来制备疫苗，其中所述的变应原显示出针对I巧抗原的较低的 反应能力(较低的变应原性）。
[0005] 基于使用甲醒和/或戊二醒来处理变应原的化学修饰在疫苗制造商中最广泛地使 用。醒基(R-CHO)与存在于变应原氨基酸中的氨基(R-NH2)(例如赖氨酸）的反应是此类修饰 的基础。与甲醒(其为单醒)相反，戊二醒为具有2个R-C册基的二醒，其中所述的R-CHO基能 够与不同分子中存在的赖氨酸R-NH2反应。运导致变应原聚合，W及与特异性I巧抗体(通过 甲醒形成的类变应原是基于蛋白质的结构修饰，而不是基于它们的聚合)的反应性受损。由 于I巧抗体失去了与它们的抗原决定簇(变应原结合位点)反应的可及度，并减少了 I巧致敏 的肥大细胞(其被I巧所活化)的数量，所W认为运种聚合确定了类变应原较低的变应原性。 聚合的变应原的变应原性损失可W意味着免疫原性损失，运可W降低运些制备物的临床功 效。已经表明聚合会降低DC中MR与变应原甘露糖残基的接近，W及运对于聚合的变应原的 免疫原性损失而言是决定性的。运由W下事实所支持:就变应原摄入而言，甘露糖残基为DC 所用的主要配体之一，并且运些细胞在将变应原呈递给应答T细胞中起重要的作用。
[0006] 用于将糖与蛋白质缀合的方法主要基于通过氧化过程来活化糖，从而通过Cis-乙 二醇基的转化而生成反应性醒基(R-CHO)。在使用例如高舰酸盐处理后在氧化的糖中生成 的R-C册可W与赖氨酸的E-氨基反应，从而形成Schiff碱。由于它们的碳水化合物残基用于 缀合并避免了与其生物学活性有关的蛋白质部分，所W运种方法学非常适用于缀合糖蛋白 (例如酶、抗体）。
[0007] 尽管使用高舰酸盐的糖氧化也已经报告为对蛋白质(包括变应原(Weinberger et al.2013.J Control Release,165:101-109))进行甘露糖基化的方式（Masarova et al. 2002. Int .J.Polymer .Anal .Qiaract. ,7:106-116)，但是将聚合的抗原进行甘露糖基化 的使用具有2个主要的缺点：
[0008] a)糖的氧化使得相邻的碳原子之间的键产生了断裂，其中所述的碳原子包含径基 (OH)并且为反应性醒生成的基础。所述的断裂影响了甘露糖的结构（Shibuya，N.，et al. 1988. J. Biol. Chem.，263: 728-7:34)，从而改变了其结合识别甘露糖的凝集素的能力 (Masarova et al.2001,Chem.化P.55:130-135)，及其DC活化能力（Sheng et al, 2006. Immunology, 118:372-383)。尽管甘露糖结构整体性的损失可W通过降低氧化程度而 减小至最低(Masarova et al.2001 ,Chem.Pap.55:130-135)，但是在轻度条件下的缀合效 率服从于待甘露糖基化的蛋白质的本性(Weinberger et al. 2013, J.Conhol Release, 165:101-109)。为了保护天然形式的甘露糖，已经试图在高溫下通过糖基化来实施蛋白质 的甘露糖基化，但是在氧气缺乏下，结果为阴性（K a n S k a e t al.2008.Biotechnol.Appl.Biochem.49:57-64)。
[0009] b)在氧化后活化的甘露糖生成了反应性醒，其必须与待甘露糖基化的蛋白质的游 离氨基反应。但是，蛋白质与戊二醒的聚合使得运些氨基急剧减少，因为它们已经用于它们 与戊二醒本身的反应中。在运些条件下，经活化用于将蛋白质（之前使用戊二醒处理过)甘 露糖基化的甘露糖的效率可能极低，运是因为当缺乏甘露糖可W结合的氨基时，其为戊二 醒的聚合能力（Silva et al.2004.Food Technol.Biotechnol.42:51-56)。运种不便性不 仅影响聚合的变应原的甘露糖基化，而且影响与戊二醒(最终认为其可W被甘露糖基化)聚 合的任何蛋白质的甘露糖基化。
[0010] Patterson等人 1977Q Allergy Clinical Immunology 59:314-319)描述了变应 原与戊二醒的聚合(禾本科花粉）。由于聚合的变应原显示I姐抗体致敏的肥大细胞的活化 能力降低，所W聚合的变应原是低变应原的。
[0011] Subiza等人2008(Clinical and Experimental Allergy,39:987-994)描述了用 于过敏中免疫治疗的戊二醒（也称为类变应原）修饰的变应原（禾本科花粉、Trisetum paniceum和喜马拉雅鸭茅(喜马拉雅鸭茅））的用途。研究者报告使用通过与戊二醒聚合而 得到的禾本科类变应原的接种疫苗是有效的。
[0012] fleydenreich 等人2012 (Immunology, 136:208-217)描述 了在由梯牧草(梯牧草)和 垂枝枠 (Betula verrucosa)物种的完整花粉得到的变应原提取物与它们相应的戊二醒或 甲醒修饰的类变应原之间，免疫原性和变应原性的差异比较研究。报告，使用戊二醒进行修 饰比使用甲醒进行修饰会使得类变应原的变应原性和免疫原性降低更多，并且DC不会高效 地捕获运种类型的修饰的变应原。
[0013] Weinberger等人2013(Journal of Control Release, 165:101-109)描述了变应 原蛋白质（卵清蛋白和木瓜蛋白酶)与甘露糖的缀合，其中通过使用高舰酸盐进行轻度氧化 而活化糖。根据待甘露糖基化的蛋白质而得到不同的效率程度。报告，甘露糖基化的缀合物 在体内被DC所捕获，并且在小鼠中产生免疫应答，因此它们可W用于免疫治疗。
[0014] 因此，在本领域的水平下，需要提供基于聚合的且甘露糖基化的抗原而获得疫苗 的方法，该方法为目前本领域水平下所使用的那些方法的备选方法，并且其允许抗原聚合 W及W高效的方式与甘露糖缀合，而不会使糖损失它们的结构完整性并且不会使聚合性质 (较低的变应原性)受到影响，因此基于聚合的且甘露糖基化的蛋白质的疫苗通过改善它们 被DC的摄入而增加其免疫原性。
[001引发明概述
[0016] 本发明的发明人发现向天然蛋白质抗原与甘露聚糖的混合物中加入二醒允许抗 原聚合，同时使抗原与甘露聚糖缀合，运可W获得免疫原性复合物或疫苗，该免疫原性复合 物或疫苗在个体中能够刺激或降低免疫应答的，而不会引发对该复合物的过敏反应，并且 能够被树突状细胞(DC)所识别并捕获。
[0017] 基于上述发现，已经研发了本发明的一系列的方面，在下文中将详细描述运些方 面。
[001引本发明的免疫复合物
[0019] 如之前所提及，向蛋白质(抗原)和甘露聚糖的混合物中加入二醒(特别是戊二醒） 允许抗原聚合，同时抗原与甘露聚糖缀合，运可W获得免疫原性复合物或疫苗。
[0020] 因此，在本发明的一个方面中，设及免疫原性复合物，下文称为"本发明的免疫原 性复合物"，其包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醒。
[0021] 在本发明中，"免疫原性复合物"可理解为一个或两个单元的结合，其中所述的单 元通过化学键(化学缀合)和通过物理诱捕(物理缀合)而保持彼此缀合，所述的多个单元为 聚合的抗原、甘露聚糖和二醒。
[0022] "聚合的抗原"是指抗原单体彼此键合而形成的聚合物，其中所述的抗原单体可W 不同或相同。因此，在具体的实施方案中，聚合物的抗原包含彼此相同或不同的至少2个抗 原。"抗原"是指在受试对象(人类或动物）的有机体中在体液和细胞水平下能够诱导免疫应 答的，或者在与免疫细胞接触时能够诱导细胞免疫应答(免疫细胞扩增、活化和/或成熟、产 生细胞因子或抗体）的任何物质。具体而言，抗原为可W为变应原的蛋白质，由感染试剂衍 生的蛋白质，肿瘤细胞，所述的蛋白质的肤或片段，由所述的蛋白质得到的重组蛋白质，或 者甚至能够诱导指定的应答的合成肤。在具体的实施方案中，所述的抗原为变应原。
[0023] "变应原"是指在个体中能够引起过敏的物质，换言之，是指被个体的免疫系统识 别为外来的，导致免疫应答(主要是产生E型免疫球蛋白（I巧））的物质。变应原的实例包括 但不限于花粉变应原提取物，由节肢动物得到的变应原提取物，由食物或食物产品得到的 变应原提取物，在昆虫的唾液、爪或刺上存在的成分(在受试对象中会诱导敏感反应)等。因 此，可W使用花粉蛋白质提取物，例如禾本科花粉（多年生黑麦草化olium perenne)，草地 早熟禾(Poa pratense),梯牧草（Phleum pratense),狗牙根（切nodon dactylon),高羊茅 草地早熟禾（Festuca pratensis),喜马拉雅鸭茅（Dactylis glomerata),黑麦（Secale cereale),大麦（Hordeum vulgare),燕麦（Avena sativa) ,Triticum sativa)，其他草花粉 (例如艾草（Al" temisia vulgaris),襲（加 enopodium album),长叶车前（Plantago Ianceolata),蒲公英茵香（Taraxacum vulgare) ,Parietaria judaica,刺沙蓬（Salsola kali),异株等麻(U;rtica dioica))，或者树花粉(例如橄揽(Olea europaea),悬铃木属， Cuppresus SPP)等。此外，还可W使用由节肢动物得到的蛋白质提取物，例如尘蛾(例如欧 妍怪尘蛾（Dermstophsgoides pteronyssinus),美妍|尘蛾（Dermstophsgoides f曰rin曰e), Acaro siro,Blomia tropicalis,梅氏嗜霉蛾化 uroglyphus maynei),家甜食蛾 (Glyciphagus domesticus),害嗜鱗蛾化epidoglyphus destructor),腐食酸蛾 (Tyrophagus PUtrescentiae))等。其他变应原提取物可W得自真菌抱子(烟草赤星病菌 (Alternaria alternate),蜡叶芽枝霉（Cladosporium herbarum),特异青霉（Penicilium notatum))和动物上皮细胞(狗上皮细胞、猫上皮细胞、马上皮细胞、羽毛混合物），W及得自 食物成分等。如本领域专业人员所理解的那样，皮肤和皮肤上的附属物(例如头发)包含在 术语"上皮细胞"内。实际上，任何变应原都可W用于免疫原性复合物中，然而，在具体的实 施方案中，变应原选自花粉、充满、上皮细胞、真菌抱子和它们的组合。
[0024] 在另一个具体的实施方案中，得自物种梯牧草，喜马拉雅鸭茅，狗牙根，多年生黑 麦草，S毛草属，橄揽，Cuppresus spp.，豚草属，枠木属，悬铃木属，欧棲（Corylus avellana)或欧洲档木(Alnus glutinosa)。
[0025] 在另一个具体的实施方案中，虫蛾术语物种欧洲室尘蛾，美洲尘蛾或Blomia tropicalis。
[00%]在另一个具体的实施方案中，上皮细胞属于物种化Iis domesticus或家犬(Canis familiaris)。
[0027] 在另一个具体的实施方案中，真菌抱子属于物种烟草赤星病菌或细链格抱 (Alternaria tenuis)。
[0028] 在本发明中，"甘露聚糖"是指碳水化合物聚合物，其由甘露糖和W下类型的糖巧 键组成:a-1，6-糖巧，a-1，2-糖巧，a-1，3-糖巧或0-1，3-糖巧。甘露糖是指由6个碳原子形成 的单一的糖或单糖，并且其功能化学基团在碳1或异头碳中为醒。甘露聚糖可W包含得自甘 露糖蛋白的肤残基（其与甘露糖蛋白天然结合）。任何甘露聚糖都可W用于本发明的内容 中。甘露聚糖的实例包括但不限于聚甘露糖，半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖，乙酷化甘露聚 糖和芦苔多糖(aloeride)。
[0029] 甘露聚糖可W理解为甘露糖通过Q-D-(I^e)键结合而形成的线性结构，其具有主 要通过a-D-(1^2)键(而且还通过a-D-(1^3)键)形成的不同单元的常见的短的支链。
[0030] "半乳甘露聚糖"可W理解为甘露糖链彼此通过0(1^4)键结合而形成的化合物， 在多数情况下，其具有半乳糖单元通过0(1^6)键与甘露糖结合而形成的支链。根据提取半 乳甘露聚糖的植物，半乳甘露聚糖具有不同的支化程度。
[0031] "葡萄甘露聚糖"应该理解为W下化合物，其化学结构通过e(i^4)键连接的比例 分别为8: 5的D-甘露糖和D-葡萄糖。例如葡萄甘露聚糖在植物魔芋（Amorphophal Ius konjac)的块茎中发现。
[0032] "乙酷化甘露聚糖"应该理解为(6(1-4)-甘露聚糖型的0-乙酷化复合多糖的混合 物。例如乙酷化甘露聚糖在植物(Aloe vera)中发现。
[0033] "芦苔多糖"可W理解为由葡萄糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖构成的具有高分子 量的多糖。例如芦苔多糖在植物真芦苔中发现。
[0034] 甘露聚糖(聚甘露糖，半乳甘露聚糖，葡萄甘露聚糖等)可W得自天然来源，例如得 自真菌、酵母菌和植物，或者使用本领域的专业人员普遍已知的技术通过化学合成而获得。 在具体的实施方案中，作为本发明的免疫原性复合物的一部分的甘露聚糖得自酵母菌、植 物或真菌。在另一个具体的实施方案中，酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属和假丝酵母属。 [00巧]酵母属的实例。酵母菌包括但不限于S. bayanus ,布拉迪酵母（S. boulardii ), S . bulderi , S . cariocanus , S . cariocus ,酉良酒酉奉母（S . cerevisiae) , S. cheval ieri , S.d曰irenensis,S. elIipsoideus,S.eub曰y曰nus,S.exiguus,S.fIorentinus,S.kluyveri, S . martiniae , S . monacensis ,S.norbensis,奇异酉奉母（S. paradoxus ),己其if 德酉奉母 (S.P曰Stori曰nus),S.spencerorum,S.turicensis,S.unisporus,S.UV曰rum和S.zon曰tus。在 更具体的实施方案中，酵母菌为酿酒酵母。
[0036] 毕赤酵母属的实例。酵母菌包括但不限于己斯德毕赤酵母（P.pastoris), P.anomola,P.heedii,P.guilli ermondi i,P.kluyveri,P.membranifaciens, P.norvegensis ,P.ohmeri ,己斯德毕赤酵母和P. subpelliculosa。
[0037] 假丝酵母属的实例。酵母菌包括但不限于白色念珠菌（C. albicans )， C . ascalaphidarum , C . amphixiae ,南极假丝酵母（C . Antarct ica) , C . W沪;幻,C . 姑磁巧瓶媒 C.atmosphaerica,C.blattae,C.carpophila,C.cerambycidarum, C.ch曰uliodes,C.coryd曰li,C.dosseyi,C.dubliniensis,C.erg曰tensis,C.fructus,光滑 念王朱菌（C.邑labrata) ,C.fermentati ,C.邑uilliermondii ,C.haemulonii ,C. insectamens, C. insecto;rum,C. interm自dia,C. jef打esii ,乳酒念珠菌（C.kefyr) ,C.krusei ,葡萄牙念珠 菌（C.Iusitaniae),C.lyxosophila,C.maltosa,C.marina ,C.membranifaciens, C.milleri,C.oleophila,C.oregonensis,C.parapsilosis,橡树假丝酉奉母 (C.quercitrus曰），C.rugos曰，C.s曰ke,C.sheh曰te曰，C.temnochiI曰e,C.tenuis, C.tropical is,C.tsuchiyae,C.sinolaborantium,C.sojae,C.subhashii,C.viswanathii, C.utilis。
[0038] 可W提取甘露聚糖的植物的实例包括但不限于豆科（例如角豆树Ceratonia 3；111911日,瓜尔豆胶切日]1日9〇313 1日化日旨〇]1〇1〇13113等），块茎（例如魔芋等），由得到的植物种 子，其中甘露聚糖用作能量储备和绿藻类(例如伞藻属，松藻属，海棍藻属等)和红藻类(厮 形紫菜(Por地yra umb i 1 i Ca 1 i S))的植物细胞壁。
[0039] 可W提取甘露聚糖的真菌的实例包括但不限于拟青霉属和多孔藍科真菌灵芝 (Ganoderma Iucidum)(reishi)。
[0040] 如本领域的技术人员所理解的那样，如果甘露聚糖由真菌或酵母菌获得，则其为 真菌和酵母菌细胞壁的一部分，因此其可W包含有机体合成细胞壁所使用的蛋白质的残 基。由此，甘露聚糖的结构中可W包含由存在的氨基酸残基得到的氨基。因此，在另一个更 具体的实施方案中，所述的氨基得自赖氨酸的氨基酸。
[0041 ]在本发明中，"二醒"可W理解为是指包含2个醒基的化合物。二醒的实例包括但不 限于戊二醒，乙二醒，丙二醒，下二醒和己二醒。在优选的实施方案中，二醒为戊二醒。
[0042]如上所述，本发明的免疫原性复合物包含聚合物的抗原、甘露聚糖和二醒。因此， 本发明的免疫原性复合物的成分的结合可W通过化学缀合、物理缀合或同时种方式缀 合来生成。
[0043] 在本发明中，"化学缀合"可W理解为本发明的免疫原性复合物的成分通过化学键 的方式而结合。如上述说明，由于甘露聚糖的结构中存在氨基酸，例如赖氨酸，所W甘露聚 糖可W包含氨基。不希望被理论所束缚，认为免疫原性复合物的成分之间的结合可W通过 甘露聚糖中存在的氨基与反应中存在的二醒之间的键而生成。因此，在具体的实施方案中， 聚合的抗原通过二醒与甘露聚糖结合。在水性介质中的二醒W-定比例W聚合形式存在， 因此，多种种类具有2个或多个醒官能团，该醒官能团与甘露聚糖中和抗原蛋白质中存在的 氨基反应，从而在反应混合物中存在的多种成分中形成共价交联。醒与氨基之间的一级反 应使得所谓的ScMff碱形成，根据抑的条件，该ScMff碱可W是可逆的。但是，在醒基属于 二醒或多醒化合物(例如戊二醒)并且其聚合形式存在于水性溶液中的情况下，发生了下间 醇醒型的缩合和脱水的其他反应，运生成了多官能聚合本性的a-e不饱和幾基系统。此外， 已经显示ScMff碱还可W与反应介质中存在的醒形成径醒缩合。另一方面，由径醒缩合衍 生得到的幾基和a-e不饱和亚胺可W通过氨基发生缀合物加成反应，从而形成新的稳定的 共价键。与原始二醒的多官能本性及其在反应介质中存在的聚合形式一起描述的化学反应 性是甘露聚糖与抗原之间化学共价且稳定交联从而形成最终的聚合化学缀合物的基础。
[0044] 在本发明中，"物理缀合"可W理解为本发明的免疫原性复合物的成分通过物理诱 捕而结合。不希望被理论所束缚，认为当抗原聚合时，甘露聚糖处在被诱捕于聚合物织物 (刚性且其结构是高水平支化的是有利的）中。因此，在具体的实施方案中，变应原通过聚合 物的物理诱捕而与甘露聚糖结合。
[0045] -旦形成免疫原性复合物，则所述的成分的比例可W根据介质中存在的甘露聚糖 的浓度而改变。因此，在具体的实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例范围为1:10至1 :〇. 1，优 选为1:4至1:0.15,更优选为1:3至1:0.3,更优选为1:4至1:0.5。在具体的实施方案中，抗 原:甘露聚糖的比例为1:0.3或1:0.5。
[OOW 本发明的方法
[0047] 本发明的发明人发现将二醒加入至抗原和甘露聚糖的混合物中允许抗原聚合，同 时抗原与甘露聚糖缀合，运可W获得W下免疫原性复合物或疫苗，其在个体中能够刺激和/ 或诱导免疫应答，而不会引发对该复合物的过敏反应，并且其可W被树突状细胞(DC)识别 并捕获。
[0048] 因此，在另一个方面中，本发明设及获得本发明的免疫原性复合物的方法，下文称 为"本发明的方法"，其包括：（i)制备包含抗原和甘露聚糖的溶解液，W及（ii)将二醒加入 至所述的溶解液中。
[0049] 在第一步骤[步骤（i)]中，本发明的方法由制备包含抗原和甘露聚糖的溶解液组 成。
[0050] 术语抗原如之前所定义。在具体的实施方案中，抗原为变应原。变应原的实例包括 但不限于花粉变应原提取物，由节肢动物得到的变应原提取物，由食物或食物产品得到的 变应原提取物，在昆虫的唾液、爪或刺上存在的成分(在受试对象中会诱导敏感反应)等。在 具体的实施方案中，变应原选自花粉，优选为梯牧草，喜马拉雅鸭茅，狗牙根，多年生黑麦 草，S毛草属，橄揽，Cuppresus SPP .，豚草属，枠木属，悬铃木属，欧棲或欧洲档木;虫蛾，优 选为属于物种欧洲室尘蛾，美洲尘蛾或Blomia化opicalis的虫蛾;上皮细胞，优选为属于 物种Felis domesticus或家犬的上皮细胞;真菌抱子，优选为属于物种烟草赤星病菌或细 链格抱的真菌抱子；W及它们的组合。
[0051] 如本领域的技术人员所理解的那样，步骤(i)的溶解液可W包含多于一种的抗原， 其可W是彼此不同的或相同的。因此，在具体的实施方案中，溶解液包含至少巧巾抗原，其可 W是彼此相同的或不同的。
[0052] 用于获得抗原和变应原提取物的技术和方法学是本领域技术人员普通已知的，但 是运些抗原和变应原提取物可W是市售可得的，或者W重组蛋白质的形式发现。在运种情 况下，抗原或变应原提取物是冻干的，其必须例如使用憐酸盐缓冲剂来重新构成，运样其可 W用于本发明的方法中。
[0053] 另一方面，步骤（i)的溶解液还具有甘露聚糖。术语甘露聚糖如之前所定义，并且 可W用于本发明的方面中。甘露聚糖的实例包括但不限于聚甘露糖，半乳甘露聚糖和葡萄 甘露聚糖。在本发明的方法的具体的实施方案中，用于本发明的方法中的甘露聚糖得自酵 母菌、植物或真菌。在另一个更具体的实施方案中，酵母菌选自酵母属，具体为酿酒酵母、毕 赤酵母属和假丝酵母属。可W获得甘露聚糖的酵母菌、真菌和植物的实例在本公开之前的 部分中进行了描述。此外，如上文所述，在甘露聚糖的结构中可W包含由甘露糖蛋白中存在 的氨基酸残基得到的氨基。因此，在另一个甚至更具体的实施方案中，甘露聚糖包含氨基， 在另一个更具体的实施方案中，所述的氨基得自赖氨酸的氨基酸。
[0054] 加入至溶解液中的甘露聚糖的量可W根据预期在本发明的免疫原性复合物中获 得的抗原:甘露聚糖比例而改变。因此，在具体的实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例范围为 1:10至1:0.1，优选为1:4至1:0.15,更优选为1:3至1:0.3,更优选为1:4至1:0.5。在具体的 实施方案中，抗原:甘露聚糖的比例为1:0.3或1:0.5。
[0055] -旦制备抗原和甘露聚糖的溶解液，便将二醒作为聚合试剂加入[本发明的方法 的步骤Qi)]。将二醒逐渐加入至溶解液中，直至达到足W取得抗原聚合W及甘露聚糖与抗 原缀合的浓度。使用二醒制备聚合物的技术和方法学是本领域现有技术所公知的，并且是 本领域的专业人员的惯例（Silva et al. 2004. Chemical Modifications on蛋白质S Using Glutaraldehyde.Food Technol.Biotechnol.42:51-56)。
[0056] 在将二醒加入至抗原和甘露聚糖分散液中之后，使混合物处于合适的条件下，并 且在4°C下在揽拌下发生聚合反应的足够时间为例如大约15小时。
[0057] 在具体的实施方案中，二醒选自戊二醒，乙二醒，丙二醒，下二醒和己二醒。优选 地，二醒为戊二醒。
[0058] 在发生聚合反应所需的时间结束时，通过将混合物中加入能够中和（中和试剂)游 离醒基的试剂来终止反应，其中所述的试剂例如为包含氨基的试剂(例如氨基酸、E-氨基-n-己酸等)或者与醒反应的其他反应试剂(例如焦亚硫酸钢、锭等），但排除氧化试剂(例如 过氧化氨、过氧化钢等），因为它们作用于甘露糖。在本发明的方法的具体的实施方案中，所 述的方法具有额外的步骤(iii)，其包括加入中和试剂，例如氨基酸、特别是甘氨酸，来终止 聚合反应。加入至反应混合物中W终止聚合的甘氨酸的量可W根据反应条件而改变，而且 计算必须加入W终止聚合的甘氨酸的量是本领域的专业人员的惯例。通常，甘氨酸相对于 醒的加入量而言必须是过量的，例如二醒:甘氨酸的比例为1:50。
[0059]在终止聚合反应后，可W分离免疫原性复合物，运是本领域的技术人员的惯例。因 此，在具体的实施方案中，本发明的方法包括分离免疫原性复合物的步骤(iv)。实际上，分 离蛋白质复合物的任何方法都可W用于本发明的内容中。所述的方法的实例包括但不限于 低压或高压液相色谱柱，基于结合甘露糖的凝集素（例如Concanavalin A)的亲和色谱，沉 淀技术(例如硫酸锭），密度梯度分离和差示离屯、。例如包含本发明的免疫原性复合物(已经 形成）的混合物可W被透析，从而消除盐和可能的未聚合的残基，此后例如通过切向超滤 (具有孔径为IOOK化的膜)对聚合的混合物进行过滤。
[00側本发明的免疫原性复合物的用途
[0061] 本发明的免疫原性复合物具有某些技术特征，运些特征使得其在个体中能够刺激 和/或诱导免疫应答，并且在变应原的情况下对所述的复合物具有低的过敏反应。运种性质 得W使用本发明的免疫原性复合物来精制药物组合物，当将该药物组合物给予受试对象 时，其能够刺激和/或诱导所述的受试对象的免疫应答，并且使得其在治疗例如过敏、感染 疾病或瘤形成中合适地用作疫苗。
[0062] 因此，在一个方面中，本发明设及本发明的免疫原性复合物在药物组合物的精制 中的用途。
[0063] 因此，在另一个方面中，本发明设及药物组合物，下文中称为"本发明的药物组合 物"，其包含本发明的免疫原性复合物W及药物可接受的载体。药物可接受的载体的实例是 本领域现有技术已知的，并且包括憐酸盐缓冲的生理盐水溶液，水，乳液(例如油/水），不同 类型的润湿剂，无菌溶解液等。可W通过本领域现有技术已知的常规过程来配制包含所述 的载体的组合物。用于说明本发明的免疫原性复合物的所有具体的实施方案都可W用于本 发明的方面中。此外，本发明的药物组合物还可W具有药物可接受的赋形剂，稀释剂，佐剂 (例如氨氧化侣、憐酸巧、单憐酷脂质A、壳聚糖等），和/或稳定剂(例如甘油）。如本领域的专 业人员应该理解的那样，本发明的免疫原性复合物W治疗有效量存在于本发明的组合物 中，换言之，所述的量为足W在受试对象中发挥刺激和/或诱导免疫应答的作用的量。
[0064] 术语药物组合物包含在人类或动物护理(兽用组合物）中使用的组合物。
[0065] 在具体的实施方案中，本发明的药物组合物还包含额外的物质。实际上，潜在地用 于对症治疗疾病或过敏的任何物质都可W作为额外的活性物质而引入。所述的额外的活性 物质的示意性而非限定性的实例包括抗组织胺药S，酱类激素 S，色甘酸二钢，氣替卡松，卢 帕他定，依己斯汀，氯雷他定，地氯雷他定，组氨受体的其他括抗剂，白细胞=締等，W及它 们的混合物。
[0066] 本发明的药物组合物可W通过任何合适的途径(例如口服、舌下、口周、鼻内、肠胃 夕F、经皮、局部给予途径等)给予，对于运些途径，可W使用所选给予途径的配制物所需的药 物可接受的赋形剂和载体。给予和制备药品的不同药物方式是本领域的技术人员公知的。 在示意性而非限定性的方式中，本发明的药物组合物可W为大颗粒、纳米颗粒或脂质体形 式的配制物的一部分，并且其可W W固体药物给予形式、液体药物给予形式或包含分散系 统的药物给予形式给予。更具体而言，本发明的药物组合物可W为注射溶液形式，适用于舌 下传递的药物形式，粉末，小丸，小珠，片剂，胶囊，糖浆，乳液，栓剂，滴眼液，雾化，气雾剂， 乳膏，凝胶等。根据医生和临床因素来测定本发明的组合物的剂量方案。如医药领域所公知 的那样，剂量取决于多种因素，包括患者的身体特征(年龄，高度，性别），所采用的传递过 程，疾病的严重性，所采用的具体的化合物W及个体的药代动力学性质。
[0067] 在具体的实施方案中，所述的药物组合物用于刺激和/或诱导免疫应答。在另一个 具体的实施方案中，所述的药物组合物用作疫苗。在另一个具体的实施方案中，所述的药物 组合物用于治疗受试对象中的过敏、感染性疾病和瘤形成。
[0068] 在本发明中，"过敏"可W理解为颗粒或物质(所谓的"变应原"）的超敏性，其中所 述的颗粒或物质如果被吸入、消化或触摸，则会在受试对象中产生特征性的临床现象并引 入免疫应答，主要是I巧应答。术语"变应原"已经在本公开的上文中进行了描述。
[0069] 在本发明中，"感染性疾病"是指符合微生物有机体(例如细菌、真菌、病毒、原生动 物等)或航病毒引起的感染的临床表现。感染性疾病的实例包括但不限于布鲁氏菌病(布鲁 菌属），炭痘（炭痘杆菌（Bacillus an1:hracis)),霍乱（霍乱弧菌(V;Lb;rio cholerae)),白喉 (白喉棒状杆菌(Corynebacterium di曲theriae))，丹毒(链球菌属），Q热（贝纳特氏立克次 体（Coxiella burneti)),伤寒（伤寒沙口氏杆菌（Salmonella typhi),副伤寒沙口氏菌 (S.paraty地i)) ,Legionnaires病（嗜肺性军团病杆菌(Xegionella pneumophila)),肺炎 (肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae),金黄色酿脈葡萄球菌（Staphylococcus aureus)，克雷白氏杆菌化IebsielIa pneumoniae)，支原体属，衣原体属），肺结核（结核分 枝杆菌(Mycobacterium 1:ube;rculosis))和破伤风（破伤风杆菌（Clostridium tetani))。 病毒感染性疾病的实例包括但不限于登革热(黄病毒），黄热病(黄病毒），埃博拉出血热(线 状病毒），流感(流感病毒），甲型肝炎(肠道病毒(VHA))，乙型肝炎(正肝去氧核糖核酸病毒 (VHB))，丙型肝炎(丙型肝炎病毒(VHC))，瘤疹(瘤疹病毒），单核细胞增多症化B病毒），腮腺 炎（己拉米哥病毒），猪攝（鼠疫病毒），脊髓灰质炎（肠道病毒），感冒（鼻病毒，冠状病毒， Ecovirus,柯萨基病毒），狂犬病(棒状病毒），风疹(风疹病毒），麻疹(麻疹病毒），水痘(水 痘-带状瘤疹)和天花(正痘病毒）。真菌感染的实例包括但不限于曲霉病，念珠菌病，广色霉 菌病，隐球菌病，脚癖，抱子丝菌病，组织胞浆菌病，环状瘤疹，耳癖，花斑癖，角膜真菌病和 接合菌病。原生动物引起的疾病的实例包括但不限于利什曼病，追疾，隐抱子 虫病，弓形体 病，阿米己病，贾第鞭毛虫病和化agas病。航病毒引起的感染性疾病的实例包括但不限于 Creutzfeldt-Jakob病，牛脑海绵状病r疯牛病"），痒病（或颤抖病），致死性家族失眠病 (FFI)和苦鲁病。
[0070] 在本发明中，"瘤形成"可W理解为通过改变细胞增殖并多次改变细胞分化而引起 的疾病，其由团块或肿瘤的形成组成，在恶性的情况下，称为癌症。良性瘤形成的实例包括 但不限于纤维瘤(纤维结缔组织），粘液瘤(疏松结缔组织），脂肪瘤(脂肪组织），软骨瘤(软 骨组织），骨瘤(骨组织），血管瘤(血管），淋己管瘤(淋己管），脑膜瘤(脑膜），血管球瘤(支持 神经组织），平滑肌瘤(平滑肌组织），横纹肌瘤(横纹肌组织），乳突淋瘤(形成乳头的上皮组 织），腺瘤(腺组织)和崎胎瘤(全能细胞）。恶性肿瘤的实例包括但不限于肉瘤(例如纤维肉 瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，血管皮内细胞瘤，淋己管肉瘤，滑膜肉瘤，平滑 肌肉瘤，横纹肌肉瘤等），癌(例如表皮或鱗状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，囊腺癌，绒毛膜癌， 阴茎癌，肺癌，乳癌，结肠癌等），神经胶质瘤，淋己瘤，白血病，黑素瘤，肝细胞瘤，精原细胞 瘤，脊索瘤和间皮瘤。另一方面，癌症的实例包括但不限于肺癌，乳癌，结肠直肠癌，膜腺癌， 卵巢癌，白血病，前列腺癌，肝癌和膀脫癌。
[0071] 在本发明中，个体或受试对象是指动物物种的成员，优选为哺乳动物，并且包括但 不限于宠物、灵长动物和人类，在本发明的内容中，所述的个体优选为任何种族或年龄的雄 性或雌性人类。
[0072] "疫苗"是指一旦处于有机体中，便引起特定的淋己细胞活化和抗原产生并由此产 生针对外源物质或致病微生物有机体的防御应答的抗原制备物。运种应答可W生成免疫记 忆，产生针对相应的病原体攻击的短暂或长期的免疫力。
[0073] 因此，本发明允许针对受试对象进行疫苗定制，换言之，可W根据受试对象的需要 来选择抗原，从而产生本发明的免疫原性复合物，其可W用作疫苗。待治疗/预防的疾病取 决于用于制备本发明的免疫原性复合物而选择的抗原。因此，任何过敏、感染性或抗肿瘤疾 病都可W使用本发明的免疫原性复合物来治疗。例如在了解受试对象对其过敏的变应原之 后，可W根据本发明来制备包含所选的变应原（多种）的免疫原性复合物，并且可W将其给 予受试对象，从而产生免疫应答，由此治疗过敏。
[0074] 因此，在另一个方面中，本发明设及包含本发明的免疫原性复合物的疫苗。
[00对本发明的治疗方法
[0076] 在另一个方面中，本发明设及用于预防和/或治疗受试对象中由变应原引起的感 染性疾病、肿瘤或过敏反应的方法，其中所述的方法包括将本发明的免疫原性复合物或本 发明的药物组合物给予所述的受试对象。
[0077] 在整个说明书和权利要求书中，术语"包含"及其变体不排除其他技术特征、添加 剂、成分或步骤。对于本领域的专业人员而言，本发明的其他目的、优点和特征可W部分由 说明书、部分由本发明的实践推导得到。提供W下实施例和附图是为了说明的目的，其无意 于限定本发明。
[007引附图简述
[0079] 图1.其示出甘露聚糖与高舰酸盐的氧化反应的图示。方案显示在由酵母菌衍生得 到的甘露聚糖中的巧巾类型的糖巧键0(1-2)和0(1-6)。使用高舰酸盐的氧化会破坏巧巾情况 下的化喃糖环。
[0080] 图2.其示出使用高舰酸盐预处理的和未使用高舰酸盐处理的甘露聚糖的一维光 谱的图示。
[0081] 图3.其显示4福图，代表了在多种聚合的变应原（黑柱）中的游离氨基占天然未聚 合形式的变应原值（白柱)的百分率。所示的数据为至少4种不同批次的平均值。
[0082] 图4.其为显示在使用事先氧化的甘露聚糖处理牛血清白蛋白（BSA)之后在变性条 件下的电泳（PAGE)结果的图像。泳道对应于缀合物的混合物粗品（缀合的BSA) W及在 AMICON YMl 00中过滤的巧巾样品(BSA小于1 OOkDa，和BSA大于1 OOkDa)。
[0083] 图5.其为显示通过气相色谱由梯牧草(Phleum pratense)的天然提取物或梯牧草 的聚合物得到的氨基酸的分析图。在聚合的样品中观察到游离赖氨酸显著减少。
[0084] 图6.其为显示由酿酒酵母得到的甘露聚糖原液样品的氨基酸的分析图。
[0085] 图7.其为显示使用甘露聚糖W不同的比例(蛋白质:碳水化合物)聚合的样品的一 维光谱的图。未使用甘露聚糖聚合的样品用作对照。
[0086] 图8.其为显示使用甘露聚糖W不同的比例(蛋白质:碳水化合物)聚合的样品的二 维光谱(DOSY)"扩散序谱Y(扩散序谱Y)"的图。未使用甘露聚糖聚合的样品用作对照。
[0087] 图9.其为显示通过梯牧草的气相色谱而分析的不同样品单糖百分率的图示。
[0088] 图10.其为显示一维光谱的图，其比较了梯牧草天然提取物（未聚合的）、聚合的 (未使用甘露聚糖）W及W-定比例（1:0.5)共同聚合的样品。
[0089] 图11.其为显示由梯牧草、未聚合的W及使用和未使用甘露聚糖聚合的样品得到 的二维光谱(DOSY)"扩散序谱r的图。
[0090] 图12.其为显示二维光谱HSQ(XH-C)的图，其中比较了梯牧草的不同样品。非单体 区的放大区域。
[0091] 图13.其为显示由使用甘露聚糖W不同的比例（蛋白质：碳水化合物）聚合的 (D.化rinae)的虫蛾提取物样品得到的二维光谱(DOSY)"扩散序谱r的图。未使用甘露聚糖 聚合的样品用作对照。
[0092] 图14.其为显示叠加一维光谱的图，其中所述的光谱得自D.farinae的天然提取 物、聚合的(未使用甘露聚糖)和W-定比例（1:0.3)共同聚合的样品。
[0093] 图15.其为显示通过D.化rinae的气相色谱所分析的不同样品单糖百分率的图示。
[0094] 图16.其为显示由D.化rinae、未聚合的W及使用或未使用甘露聚糖聚合的样品得 到的二维光谱(DOSY)"扩散序谱r的图。
[00M]图17.其为a)天然提取物，b)聚合的和C)只用甘露聚糖聚合（1:0.3)的D.farinae 样品的电子显微图像。
[0096] 图18.其为显示在不同时间下梯牧草的一维质子光谱的一组图。
[0097] 图19.图19A为图，其显示对梯牧草的天然提取物进行I巧结合抑制的化ISA检验的 结果，其中所述的梯牧草具有天然的变应原（未聚合的），聚合的非甘露糖基化的变应原和 使用戊二醒进行甘露糖基化的变应原。图19B为相当于SDS(SDS-PAGE)存在下的聚丙締酷氨 凝胶电泳和免疫检测(免疫印迹)的图像，其中所述的电泳和免疫检测使用了由过敏患者得 到的血清、梯牧草的提取物(与PAGE分离的蛋白质具有I巧反应性）。化=分子量模型；1 =天 然变应原;2 =聚合的未甘露糖基化的变应原;3 =使用戊二醒进行甘露糖基化的变应原。
[0098] 图20.图20A为图，其显示对欧洲室尘蛾和D.化rinae的天然提取物进行I巧结合抑 制的化ISA检验的结果，其中所述的天然提取物分别具有天然变应原(未聚合的）、聚合的未 甘露糖基化的变应原和使用戊二醒进行甘露糖基化的变应原。图20B为相当于SDS(SDS-PAGE)存在下的聚丙締酷氨凝胶电泳和免疫检测(免疫印迹）的图像，其中所述的电泳和免 疫检测使用了由过敏患者得到的血清、欧洲室尘蛾和D.化rinae的提取物(与PAGE分离的蛋 白质具有I扣反应性KPm=分子量模型；1 =天然变应原；2 =聚合的未甘露糖基化的变应 原;3 =使用戊二醒进行甘露糖基化的变应原。
[0099] 图21.其为一组图，其显示出在对梯牧草或D.farinae过敏的患者中体外嗜碱细胞 活性检验的结果，其中所述的对梯牧草或D.farinae为未聚合的提取物（天然）、聚合的 (Pol)或与甘露聚糖聚合的（Pol甘露聚糖），并具有相同的蛋白质浓度。使用 BASOT臨式剂盒，通过流式细胞仪来分析嗜碱细胞的活性。
[0100] 图22.其为显示在对梯牧草过敏的患者中对体内应答(刺痛检验）的测试的结果， 其中所述的梯牧草为未聚合的提取物(天然）、聚合的（Pol)或与甘露聚糖聚合的（Pol甘露 聚糖），并具有相同的蛋白质浓度。
[0101] 图23.其为显示在对D.farinae过敏的患者中对体内应答(刺痛检验）的测试结果 的值的箱线图，其中所述的D.farinae为未聚合的提取物(天然）、聚合的（Pol)或与甘露聚 糖聚合的(Pol甘露聚糖），并具有相同的蛋白质浓度。
[0102] 图24.图24A为显示使用得自聚合物的(Pol)梯牧草(Pol)、或者聚合的且甘露糖基 化的（Pol甘露聚糖)梯牧草得到的变应原，在对由人类单核细胞衍生的树突状细胞(DC)摄 入的测试中所获得的结果的图示。利用与运种禾本科提取物有关的颜料的自发巧光，通过 流式细胞仪进行测试。图24B为显示使用得自未聚合物的(天然)梯牧草、聚合的（聚合物)或 者使用甘露聚糖聚合的(Pol甘露聚糖）（使用Alexa 488在半脫氨酸处进行标记)得到的变 应原，在对由人类单核细胞衍生的树突状细胞(DC)摄入中所获得的结果的图示。在2个溫育 时间（1和5min)下进行测试，并通过流式细胞仪进行分析。顶部显示双阳性细胞(右上方象 限），其中捕获了Alexa 488的DCXHLADR+)被浓缩。下侧显示根据与DC溫育的制备物的DC的 平均巧光强度。图24C为代表微管区域的共聚焦显微镜样品，W便理解在溫育30min后在不 同的巧光素化制备物(Alexa 488)中被DC摄入的差异。与不同复合物有关的巧光可W在附 图中W细胞内小白点的形式可见(为了更好地识别被捕获的巧光染料，上方面板为阳性，下 方面板为阴性，W黑点表示）。
[0103] 图25.其为一组图，其显示在24小时中，使用天然(N)梯牧草的提取物、聚合的(P) 梯牧草(P)和使用甘露聚糖聚合的梯牧草(PM)来刺激的树突状细胞(DC)上清液中细胞因子 的产生。
[0104] 图26.其为显示在使用由未聚合的（天然)梯牧草，聚合的且未甘露糖基化的(Pol) 梯牧草，或者聚合的甘露糖基化的(Pol-Man)梯牧草得到的变应原所刺激的树突状细胞中 成熟标志物的表达。
[0105] 图27.其为显示在使用由未聚合的（天然)D.farinae，聚合的且未甘露糖基化的 (Pol),或者聚合的且甘露糖基化的(Pol-Man)而得到的变应原所刺激的树突状细胞中成熟 标志物的表达。
[0106] 图28.其为显示在使用由梯牧草得到的聚合的（Pol)或者聚合的且甘露糖基化的 (Pol Man)变应原进行体外免疫测定后，对产生特异性IFN丫，比-10和IL-4的细胞的诱导的 图。通过化ISPOT测定产生细胞的量。
[0107] 图29.其为显示在使用由D.化rinae得到的聚合的(Pol)或者聚合的且甘露糖基化 的(Pol Man)变应原进行体外免疫测定后，对产生特异性IFN 丫，比-10和化-4的细胞的诱导 的图。通过化ISPOT测定产生细胞的量。
[0108] 图30.其为用于Ba化/c小鼠的免疫方案。
[0109] 图31.其为在淋己细胞增殖测试中随后进行的方案。
[0110] 图32.其为显示在使用由梯牧草得到的扣g变应原而免疫的小鼠中增殖应答的图， 其中所述的变应原为聚合的但为甘露糖基化的（聚合物），或者聚合的且甘露糖基化的（聚 合物甘露聚糖）。使用CSFE进行增殖测定。
[011U 图33.其为显示在使用由D. farinae得到的20yg变应原而免疫的小鼠中增殖应答 的图，其中所述的变应原为聚合的但为甘露糖基化的（聚合物），或者聚合的且甘露糖基化 的（聚合物甘露聚糖）。使用CSFE进行增殖测定。
[0112]图34.其为一组图（图34A和34B)，其显示在使用由梯牧草得到的聚合物来免疫的 小鼠的脾细胞所产生的细胞因子，其作为对由梯牧草的天然(未聚合的）变应原的应答。柱 表示由相同的组得到的小鼠的平均值。灰色的柱:未甘露糖基化的聚合物；黑色的柱:甘露 糖基化的聚合物。
[0113] 图35.其为一组图（图35A和35B)，其显示在使用由D.化rinae得到的聚合物来免疫 的小鼠的脾细胞所产生的细胞因子，其作为对由D.farinae的天然（未聚合的）变应原的应 答。柱表示由相同的组得到的小鼠的平均值。灰色的柱:未甘露糖基化的聚合物;黑色的柱： 甘露糖基化的聚合物。
[0114] 图36.其为一组图（图36A和36B)，其显示针对由梯牧草得到的天然(未聚合的）形 式的变应原的、特异性抗体的水平，其是在使用变应原来免疫小鼠而得到的血清中检测的， 其中所述的变应原为聚合的但未甘露糖基化的（聚合物），或者聚合的且甘露糖基化的（聚 合物甘露聚糖）。下方的图表示在使用IgG2a和I姐的各类免疫原诱导的特异性抗原的水平 之间的比例。
[011引图37.其为一组图（图37A和37B)，其显示针对由D. farinae得到的天然(未聚合的） 形式的变应原的、特异性抗体的水平，其是在使用变应原来免疫小鼠而得到的血清中检测 的，其中所述的变应原为聚合的但未甘露糖基化的（聚合物），或者聚合的且甘露糖基化的 (聚合物甘露聚糖）。下方的图表示在使用IgG2a和I巧的各类免疫原诱导的特异性抗原的水 平之间的比例。 实施例
[0116] 实施例1:通过使用变应原（聚合物的或未聚合的）与氧化的甘露聚糖缀合而生产 疫苗
[0117] 1-甘露聚糖的氧化
[011引事先，使用IOOKDa截留膜，通过超滤将由酿酒酵母得到的甘露聚糖分级。收集低分 子量的过滤级份，并经历高舰酸盐的氧化。图1示出了高舰酸盐对甘露糖整体性和醒基生成 的理论作用。在图2中，凭经验证明在甘露聚糖氧化后运些基团的生成。
[0119] 2-变应原的聚合
[0120] 使用戊二醒使得自不同来源(梯牧草、橄揽、欧洲室尘蛾和欧洲档木）的变应原聚 合。图3示出了聚合的变应原中的氨基比天然的未聚合形式的变应原的值减少。根据欧洲药 典(2.2.56部分，氨基酸分析），通过与巧=酬反应来测定氨基的存在。
[0121] 3-使用BSA(牛血清白蛋白）氧化的甘露聚糖的缀合
[0122] 所得的结果显示BSA与氧化的甘露聚糖之间的缀合，运可W通过聚丙締酷氨凝胶 电泳来证明[图4,（缀合的BSA)]。相同的图示出了缀合的BSA级份(通过超滤而保留最大 100W)a的级份)显示成BSA单体的方式。运意味着在变性环境下，很高百分率的可W形成的 缀合物返回至初始状况，运说明与预氧化的甘露聚糖的缀合反应不会生成具有足够稳定性 的产物。可W通过化学方法(称为还原胺化作用）来稳定运些缀合物，其中所述的方法设及 使用氯基棚氨化钢使缀合反应中形成的ScMff碱发生化学还原，从而得到相应的更稳定的 仲胺。但是，该反应意味着在初始底物上的新的化学转化，其中所述的底物生成了在任何起 始试剂(甘露聚糖和蛋白质）中均不存在的并且因此必需要定义和表征的官能团和化学实 体(仲胺）。
[0123] 4-使用由事先用戊二醒聚合的梯牧草变应原得到的蛋白质提取物，使氧化的甘露 聚糖发生甘露聚糖缀合
[0124] 尽管由于聚合物中游离的氨基显著减少而取得成功的缀合是不明显的（图3)，但 是根据用于白蛋白所述的方案来检验过氧化的甘露聚糖与由梯牧草得到的变应原聚合物 的缀合（Mas紅OV自，J.and MiSIovicov自，D. 2002. Int .J.PoIymer .Anal. Qiaract. ,7 :106-116)。如预期的那样，在与戊二醒聚合后，游离赖氨酸的量相当于天然未聚合的提取物的总 氨基酸％减少4.5折(图5)。
[0125] 氧化的甘露聚糖与由聚合的梯牧草的提取物(分子大小大于100邸a的材料)缀合。 此外，再次通过100邸a膜将反应产物分级。在该步骤中，收集大于IOOKda的保留的级份，其 中发现已经缀合的初始的聚合的提取物和甘露聚糖。
[0126] 使用蔥酬，通过比色分析来分析由保留的样品得到的全部碳水化合物的含量，并 且与未使用甘露聚糖处理的聚合的提取物的初始含量相比，未观察到样品中碳水化合物的 量显著增加。另一方面，核磁共振研究(一维和二维研究)未显示巧巾化合物之间具有共价结 合，也未显示分子水平下的结构差异，表明使用运种缀合方案，在巧巾成分之间未得到分子 相互作用，因此，在巧巾产物之间未得到结合或缀合。不希望被理论所束缚，运可能是由于游 离氨基(主要由赖氨酸提供)减少，W及游离残基的赖氨酸（由于蛋白质材料为聚合物)的可 及性 低，由此形成的具有较低晓性的刚性结构。运种可能性得到W下事实的支持:使用事先 用戊二醒聚合的其他变应原得到了相同的阴性结果，W及由此游离氨基减少，如图3所示。
[0127] 5-结论
[0128] 运些结果表明在梯牧草的聚合的样品（W及其他聚合的变应原）与氧化的甘露聚 糖之间缺乏缀合。该事实，W及甘露糖在氧化后发生转化的缺点（图l)(Shibuya，N.，et al. 1988.Journal of Biological 化emishy,263:728-734)和所形成的缀合物缺乏稳定 性（即使使用富集赖氨酸的蛋白质，例如BSA，图4)可W废除运种方法学用于生产聚合的变 应原疫苗。
[0129] 实施例2
[0130] 使用戊二醒，通过用甘露糖聚合的变应原的缀合来精制疫苗
[0131] 材料和方法
[0132] 用于蛋白质提取物聚合和缀合的方法由W下步骤组成：
[0133] 1.所述的过程起始于由梯牧草得到的冻干的提取物，其在所需体积的憐酸盐缓冲 生理盐水(PBS)中重新构成，从而达到2mg/mL的最终蛋白质浓度。此后，使用憐酸钟或憐酸 钢缓冲液将pH调节至7.2,其需要降低或升高提取物的抑，并且考虑调节抑所用的缓冲液的 体积来计算蛋白质的浓度。
[0134] Ex.:起始蛋白质的定量：由P.pratense得到的300mg蛋白质
[0135] PBS 需要量：150mL
[0136] 将抑调节至7.2的需要量:ImL缓冲液
[0137] 样品的最终浓度：1.986mg/mL
[0138] 2.提取物的聚合和缀合反应：
[0139] 在揽拌条件下在提取物上滴加聚合试剂，在本实施例中为戊二醒，直至达到最终 浓度为0.025M。此外，在此时，还W比例1:0.5(蛋白质质量:甘露聚糖质量)加入用于样品缀 合的甘露聚糖。在15小时中，在4°C下在揽拌下保持反应。
[0140] Ex.:戊二醒的初始浓度:2.5M.
[0141] 加入到提取物中的体积：1.5mL
[0142] 甘露聚糖(蛋白质:碳水化合物的比例为1:0.5) :90mg
[0143] 3.终止反应：
[0144] 将提取物溫暖至室溫(25°C)，并加入甘氨酸粉末W终止聚合反应。甘氨酸必需是 过量的，例如与戊二醒的比例为1:50。将甘氨酸溶解于样品中，并在揽拌下在4°C下保持2小 时。
[0145] Ex.:甘氨酸的初始浓度(分子量:75.07): 1.25M
[0146] 戊二醒浓度:〇.〇25M
[0147] 提取物的体积：152.5mL(初始151mL+l. 5mL戊二醒）
[014引待加入的甘氨酸的定量:14.31g
[0149] 4.随后，将提取物针对7个体积的蒸馈水进行透析，W便除去盐和可能未聚合的残 基。使用交流过滤系统(Pellicon，Merck Millipore)，其具有IOOkDa多孔膜。
[0150] Ex.:提取物的体积：152.5mL
[0151] 水的体积：1.525mL
[0152] 5.最后，与甘露聚糖聚合的并缀合的提取物过滤通过0.22WH，等分，并冷冻于-60 °C并冻干用于保存。
[0153] ^
[0154] 使用所述的方法的结果是，得到了在免疫学方面比原始变应原改善的甘露糖基化 的聚合物。使用戊二醒进行处理允许结合巧巾结构(变应原和甘露聚糖），从而同时发生聚合 和缀合，运可W通过W下实施例中所示的结果来证明（实施例3)。
[0155] 所述的甘露糖基化的聚合物具有结构和免疫学性质，运些性质优于天然的或者聚 合的和非甘露糖基化的变应原的性质，分别如实施例4和实施例5-10中所示。
[0156] 因此，建立一种方法，用于在单一的步骤中，使用戊二醒，用甘露聚糖聚合的抗原 的缀合，其中甘露糖结构的整体性得到保持。为了达到此目的，另一方面利用了 W下事实： 由自然来源得到的（例如由酿酒酵母)甘露聚糖具有原始甘露糖蛋白的肤残基，在该肤残基 上，在包含赖氨酸的酵母菌中合成甘露聚糖（图6)，从而得到化学缀合。另一方面，在具有蛋 白质聚合物的溶液中，甘露聚糖的聚合、支化和刚性结构得到良好地利用，其中甘露聚糖被 通过戊二醒聚合的蛋白质所诱捕，得到物理缀合。在两种情况的任意一种中，在互不排斥的 情况下，使用戊二醒处理天然形式的（未聚合的）蛋白质与甘露聚糖的混合物允许结合巧中 结构，运会同时产生缀合和聚合。
[0157] 实施例3
[0158] 通过与戊二醒发生反应，关于变应原(禾本科和虫蛾)与甘露聚糖的聚合和缀合的 证据
[0159] 材料和方法
[0160] 将在实施例2中获得的2mg等分的冻干样品溶解于0.5mL重水中，并在SOOM^ Bruker Advance光谱仪或装配有冷冻探针的600MHz Bruker Advance中通过核磁共振 (NRM)来分析。根据制造商（Bruker Biospin Corporation(Billerica)Massachusetts , USA))标准化且实施的方案，在光谱采集和处理软件TOPSPIN中，由不同的样品获得一维质 子共振光谱、二维质子碳13RNA异核核糖核酸化etronuclear)相关光谱化SQC;Zwahlen et al.，1997. J. Am.化em. Soc. 119:6711-6721)和通过平移扩散排序的二维光谱(DOSY，Wu et 曰1.1995.J.Ma即.Reson.A.115:260-264)。
[0161] 使用用于分子总碳水化合物的蔥酬方法（S h i e 1 d S，R . a n d W.Burnett. 1960.Analytical Qiemistry 32:885-886)W及用于分析蛋白质的化日壯ord方 法（Bra壯ord,M.M. 1976.Anal}ftical Biochemistiy 72:248-254)，通过比色技术来分析样 品的碳水化合物和蛋白质含量。
[0162] 通过对W糖醇乙酸醋形式释放的单糖进行总酸水解和气相色谱分析 (M.F.Chaplin&J.F.Kennedy editors,Carbohydrate Analysis:a practical approach. (1986)0xford IRL PRESS)，对由样品的碳水化合物部分得到的不同的单糖速率进行分析。
[0163] 通过样品的总酸水解对样品的蛋白质部分中的不同的氨基酸进行分析，并在 Bioc虹om Aminoacid Anlyzer仪器中通过对所释放的氨基酸实施液相色谱来进行分析。
[0164] ^
[0165] 3.1-梯牧草与不同比例的甘露聚糖的共同聚合的研究，从而建立能够使用甘露聚 糖聚合的提取物发生充分缀合的更合适的比例。
[0166] 使用不具有甘露聚糖的聚合物样品，通过核磁共振(NMR)，对在该方法中获得的具 有不同蛋白质：甘露聚糖比例的样品的结构进行分析。自身聚合的蛋白质提取物具有属于 样品本身的寡糖残基（12-20%)，运可W通过气相色谱来证明（单糖分析）。通过增加介质中 的糖的量，光谱中多糖的信号也增强，如所预期的那样（图7)。进行平移扩散研究，该研究根 据扩散系数对化合物进行排序，并相应地取决于分子大小(通过NMR的二维光谱;二维光谱 (DOSY)"扩散序谱r)。在本研究中，可W观察到在使用甘露聚糖聚合的样品中，颗粒比未聚 合的样品更大，运表明在所有情况下蛋白质提取物与甘露聚糖之间的结合（图8)。具体而 言，在比例为1:4的情况下，观察到更大量的寡糖部分，运可能是由于反应介质中过量的碳 水化合物的原因。
[0167] 另一方面，对蛋白质和糖的量进行定量，从而尝试并建立(大致而言）已经发生聚 合过程的样品的蛋白质:糖的比例，并将其与原始比例比较(表1)。
[0168] 表1:在聚合前和聚合后蛋白质:甘露聚糖的比例的比较
[0170] 在聚合的样品中比例为1:4的情况下，正常的是在所得过程后得到较低比例的糖 的量，运是由于在反应介质中发现大幅的初始过量，此后在洗涂步骤中除去未反应的部分。 在剩余的样品中，发现多糖的比例比初始比例升高，运是由于提取物本身具有共价键合的 多糖残基。
[0171] 一旦获得所有的数据，便选择比例（1:0.5)，因为其证明了碳水化合物被引入至样 品中并最少地使用了甘露聚糖。
[0172] 3.2-在蛋白质-碳水化合物的比例下对梯牧草的共同聚合分析
[0173] 3.2.1通过气相色谱的碳水化合物分析
[0174] 由冻干材料的溶解开始，通过酸水解(糖醇分析)使用气相色谱来定量碳水化合物 相对于全部样品的百分率（W干重计）（I^ukuda ,M. &Kobata ,A. 1993. Glycobiology. A Practical Approach . The practical Approach Series . Oxford University Press Inc.,New York.)。
[0175] 分析巧中样品（图9):
[0176] -梯牧草天然提取物
[0177] -聚合的梯牧草
[0178] -使用甘露聚糖聚合的梯牧草(1:0.5)
[0179] 所得的结果显示相对于聚合的样品（不具有甘露聚糖)和天然提取物而言，在经历 共同聚合的样品中甘露聚糖显著升高。
[0180] 3.2.2 NMR(核磁共振)研究
[0181] 通过NMR的结构研究显示聚合的样品中的信号变宽，表明大小增加，运得到了由平 移扩散DOSY(扩散序谱Y)得到的二维光谱的证实（图10和11)。在该二维试验中，可W观察到 在未聚合的蛋白质提取物的情况下，具有不同尺寸的材料，因此其为极其混杂的样品，当其 聚合时，增加其平均分子大小。另一方面，当提取物在甘露聚糖存在下聚合时，还获得比所 述的聚合物（由于多糖为高分子量)具有甚至更低的扩散系数(表明了更大的大小）的材料， 说明多糖与蛋白质提取物之间的结合或相互作用，运是因为光谱的2个部分(碳水化合物区 和蛋白质区）具有相同的扩散系数，说明2种成分的相互作用。运些核磁共振试验证实了在 甘露聚糖存在下，在使用戊二醒使蛋白质提取物聚合后，缀合的蛋白质:甘露聚糖。
[0182] 另一方面，根据碳13与质子之间的（13C-1H)RM异核核糖核酸（HSQC， 巧eteronuclear Single如antum Coeherence")，通过NMR进行另一个二维研究。运些研究 显示，在原子水平下，氨与碳之间形成键，并且运些键的每一个都相当于牢固的关系信号 (concrete correlation Signal)(峰）（由光谱得到）和位置(坐标:横坐标，Ih的化学位移； 纵坐标:1?的化学位移）（其根据化合物的类型而不同）。该组信号化-C键)得到二维图案，其 对每种化合物而言是特异性的并且是排他的，类似于"指纹"的方式（Claridge, T.D.W.1999.High-resolution NMR techniques in Organic Chemistry.Tetrahedron Organic Chemistry Series.Elsevier)。
[0183] 进行3个服Q村式验来区分各种类型的样品的特征图案：
[0184] -游离的甘露聚糖
[0185] -由梯牧草得到的聚合物
[0186] -在甘露聚糖存在下由梯牧草得到的聚合物(1:0.5)
[0187] 在甘露聚糖存在下聚合的样品呈现出甘露聚糖的特征信号，W及样品本身的固有 碳水化合物的特征信号，表明蛋白质提取物与多糖之间的相互作用（图12)。
[0188] 3.3-在不同甘露聚糖比例下，D.farinae的共同聚合过程的研究。
[0189] 由使用梯牧草获得的结果开始，在蛋白质:碳水化合物的比例为（1:0.5)下进行初 步试验，然而，所得的结果对于各种情况下的梯牧草提取物而言是不令人满意的，运是因为 观察到未与蛋白质材料结合的过量的甘露聚糖残基（图13,通过黑色圆圈限定的信号）。在 介质中，在较低的碳水化合物比例（1: O . 3和1:0.15)下实施新的聚合。所选的比例为（1: 0.3)，因为观察到在样品中引入了主要与蛋白质结合的形式（图13,盒b)的而非游离形式 (图13,盒C，黑色圆圈）的甘露聚糖，并且甘露聚糖的运种引入高于所述的比例（1:0.15)，而 且对于1:0.3的比例而言，在相当于蛋白质部分的光谱区中，观察到最大的干扰(图13)。
[0190] 3.3.1在蛋白质:碳水化合物的比例为（1:0.3)下，D.farinae的共同聚合的分析。
[0191] 图14显示在甘露聚糖Wl :0.3的比例存在下由聚合的D.farinae提取物得到的样 品相对于在甘露聚糖缺乏下聚合的相应W及未聚合的提取物样品的、一维质子光谱的定量 比较。所述的光谱表明在使用甘露聚糖聚合的样品中甘露聚糖的特异性信号，W及在蛋白 质特异性光谱区中通过聚合引起的光谱图案改变。
[0192] 3.3.1.1通过气相色谱对碳水化合物的分析
[0193] 由冻干材料的溶解开始，通过气相色谱对碳水化合物相对于全部样品的百分率 (W干重计）进行定量（Fukuda ,M. &Kobata,A. 1993 .Glycobiology. Oxford 加 iversity Press Inc.,New York)。
[0194] 分析巧中样品（图15):
[01巧]-D.farinae天然提取物
[0196] -聚合的D.farinae
[0197] -使用甘露聚糖聚合的D. farinae (1:0.3)
[0198] D.farinae的提取物和聚合物包含样品本身固有的寡糖残基(在存在更多的葡萄 糖、甘露糖和半乳糖下通过气相色谱测定为大约17-20%)。与甘露聚糖共同聚合的产物的 结果显示相对于未使用甘露聚糖聚合的样品和天然提取物而言，甘露糖显著增多。
[0199] 3.3.1.2 NMR(核磁共振)研究
[0200] 通过NMR来分析在（1:0.3)(蛋白质:甘露聚糖)的比例下同时聚合和缀合所获得的 样品。运些结果显示在聚合的样品中，信号变宽，表明分子的大小增加，运可W在二维光谱 DSY中证实（图16)。与梯牧草的情况类似，使用甘露聚糖聚合的样品是均匀的，并且大小比 未使用甘露聚糖聚合的样品更大，表明多糖与D.化rinae的蛋白质提取物之间的结合，由此 证明巧巾成分之间的缀合。
[0201] 3.3.1.3透射电子显微镜
[0202] 由D.farinae的不同样品的透射电子显微镜得到的图像允许我们观察在天然的和 聚合的提取物之间，结构水平的差异。在所述的聚合提供了更高密度的颗粒并且与甘露聚 糖的缀合还会在形态学和结构水平上产生变化的情况下(在所述的聚合物中清楚可见），进 一步证明了多糖与蛋白质提取物之间的结合(图17)。
[0203] 实施例4
[0204] 通过与戊二醒的反应而产生的聚合和甘露糖基化生成了比未甘露糖基化的聚合 物更稳定的聚合物
[0205] 在水性介质中经过长期储存，比较梯牧草3种样品的稳定性，其中一种是在甘露聚 糖存在下聚合的（蛋白质/甘露聚糖的比例为1:0.5)，另一种为在甘露聚糖缺乏下聚合的， W及未聚合的变应原本身。将与实施例3中分析的那些相等的样品等分物溶解于重水中，并 通过NMR分析，接着储存在4°C下。未由NMR管中取出样品，也未进行操作。在储存后的4个月， 根据相同的采集参数来重复NI时式验，从而检查在运些溶解条件(4°C下的重水)下样品的稳 定性。结果W初始时和4个月后光谱的差异呈现(通过光谱仪自身的TOPSPIN软件进行光谱 的差减），显示聚合的样品比天然提取物更稳定(信号损失40% )，并且与甘露聚糖缀合甚至 更增强了稳定性，运是因为仅4%的样品信号损失，表明样品降解/沉淀的指数较低（图18)。
[0206] 实施例5
[0207] 关于变应原性的损失，使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物与非甘露糖基化的聚 合物相当
[020引5.1-使用特异性I巧抗体的反应性测试
[0209] 材料和方法
[0210] 通过抑制化ISA技术来实施I姐反应性测试。Wliig天然提取物/孔(稀释于0.05M 碳/重碳酸盐缓冲液，pH = 9.6中）平板接种96孔板 (Microlon,M曲binding capacity， Greiner bio-one ,Germany)。将平板在4°C下放置过夜。第二天，使用PBS-t缓冲液(憐酸盐 缓冲液，具有〇.25%Tween-20)洗涂平板，并在各种情况下将它们加入至由过敏患者(对禾 本科或虫蛾过敏)得到的相应的血清池中，并加入抑制剂(天然提取物、聚合的提取物和甘 露糖基化的聚合的提取物）（通过1/2系列稀释，由IOOiig/血稀释至0.0 liig/血）。将具有混合 物的平板过夜溫育，第二条，在使用PBS-t洗涂后，将它们与过氧化物酶缀合的抗人I巧单克 隆抗体（Southern Biotech,USAK Wl :2000稀释)溫育。使用OPD系统（Sigma Al化ich,USA) 将平板显色30分钟。使用盐酸（1/10在水中稀释)终止反应，并在492nm下读取平板。
[0211] 此外，还通过电泳和免疫检测来分析天然提取物、聚合的W及聚合的且甘露糖基 化的I巧的反应性。在变性条件下，在聚丙締酷胺凝胶(SDS-PAGE)中进行提取物的蛋白质的 分离。实施免疫测试，从而将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(Bio Rad,Germany) 上。使用具有5 % BSA (牛血清白蛋白）的PBS-t来封闭膜，并与得自过敏患者的血清溫育。此 后，将它们与过氧化物酶缀合的抗人I巧单克隆抗体(Southern Biotech,USA) (Wl :2000稀 释)溫育。使用E化化学发光系统用于显色(GE-Healthcare，USA)。
[0212] ^
[0213] 5.1.1将I巧与梯牧草的聚合物(使用戊二醒进行甘露糖基化)的反应性损失与非 甘露糖基化的聚合物的反应性比较。
[0214]图19A显示抑制ELISA，其中可W理解的是P.pratense的聚合的变应原（甘露糖基 化的或未甘露糖基化的）显示I巧的反应性比天然变应原降低。图19B显示在凝胶电泳和免 疫检测（使用由过敏患者得到的血清来实施的）中对应于P.pratense的变应原蛋白质的条 带，而在对应于聚合的变应原W及聚合的且甘露糖基化的变应原的泳道中，未观察到条带 (PAGE-SDS)和I巧结合(免疫检测）。
[0215] 5.1.2将I姐与欧洲室尘蛾和D.farinae的聚合物(使用戊二醒进行甘露糖基化） 的反应性损失与非甘露糖基化的聚合物的反应性比较
[0216] 图20A显示抑制化ISA，其中可W理解的是欧洲室尘蛾和D.farinae的聚合的变应 原（与甘露聚糖缀合的或缀合的）具有相似的I姐反应性，其低于在天然变应原中所观察到 的反应性。图20B显示在凝胶电泳和免疫检测(使用由过敏患者得到的血清来实施的）中对 应于虫蛾物种的变应原蛋白质的条带，而在对应于聚合的变应原W及聚合的且甘露糖基化 的变应原的泳道中，未观察到条带(PAGE-SDS)和I巧结合(免疫检测）。
[0217] 5.2-体外人类嗜碱细胞活化的检验
[0218] 对梯牧草与D.farinae的不同制备物活化患者嗜碱细胞的能力进行评估，其中所 述的患者对那些变应原过敏。
[0219] 材料和方法
[0220] 使用市售的试剂盒 BASOTEST ? (ORPEGEN Pharma,胎 ide 化 erg ,Germany)对 嗜碱细胞的活化进行评估，其中所述的试剂盒允许通过流式细胞仪测量外周血中嗜碱细胞 活化的百分率。过程：
[0221 ] 1-将外周静脉血提取至具有肝素钢的管中。
[0222] 2-将所述的血液与刺激缓冲液(包含IL-3)溫育。
[0223] 3-使用由P. pratense和D. f arinae得到的变应原（天然的，聚合物W及聚合物-甘 露聚糖)进行刺激。此外，还包括阴性对照(仅具有洗涂缓冲液)和阳性对照(趋化肤N-甲酯 基-蛋氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(fMLP))。
[0224] 4-使用巧光染料缀合的单克隆抗体(抗CD203C和抗CD63.FITC)来标记细胞。双阳 性细胞(CD203c/CD63)反应了活化的嗜碱细胞。
[0225] 5-使用低渗缓冲液使红细胞裂解。
[0226] 6-在FC500血细胞计数仪(Beckman Coulter)中进行分析。用于测定活化的嗜碱细 胞的特异性标记:CD203C+和CD63+。
[0227] ^
[0228] 在与各种未聚合的变应原(天然的）溫育后，活化的嗜碱细胞(CD203C+CD63+)的百 分率如所预计的那样，高于并类似于使用测试的阳性对照所获得的百分率。另一方面，当进 行与梯牧草和D.farinae的聚合的变应原的溫育时，活化程度降低。聚合物活化嗜碱细胞的 能力的运种损失反映了它们变应原性的损失，并其如图21中所示，所述的损失与未甘露糖 基化的和甘露糖基化的聚合物相当。所有运些表明甘露糖基化的聚合物保持它们对巧中变 应原的变应原性降低至与常规聚合的变应原(未甘露糖基化的)所显示的相同的程度。
[0229] 5.3-在过敏患者中的皮肤检验(刺痛检验）
[0230] 对梯牧草和D.farinae的不同制备物在患者中产生阳性皮肤检验的能力进行评 估，其中所述的患者对那些变应原过敏。
[0231] 材料和方法 [02创刺痛检验
[0233] 刺痛检验由W下组成:将P.pratense和D.farinae的一滴各种变应原（天然的，聚 合物或者聚合物-甘露聚糖）（2个重复)分别置于对P.pratense和D.farinae过敏的患者的 前臂皮肤上。将运些变应原(按照之前所述来制备)在50%缓冲的甘油盐水溶液中调节至相 同的蛋白质浓度。使用Imm刺血针穿过液滴来刺痛皮肤而向真皮中引入变应原。变应原通过 其特异性的I巧与肥大细胞致敏的患者反映，所述的肥大细胞在活化后释放组胺。释放的组 胺增加了毛细管渗透性，从而产生了液体溢出物，运导致在刺痛后20分钟出现皮肤丘疹。
[0234] 丘疹的大小(mm2)被认为是制备物的变应原性指数，该指数越高，所产生的丘疹的 表面越大。
[0235] 统计学
[0236] 对于描述性统计而言，使用各置信界限为95%的平均值、标准偏差、相应的第一四 分位数和第=四分位数的中值、变异系数和值的范围（最大值和最小值）。
[0237] 对于比较性统计而言，在使用虫蛾(D.farinae)的皮肤检验而得到的数据中使用 方差分析(ANOVA)和Bonferroni校正（用于成对的值之间的比较），运是因为运些符合正态 分布。在使用梯牧草的皮肤检验而得到的数据的情况下，使用非参数检验，运是因为运些数 据不符合正态分布。使用化iedman检验来比较巧巾制备物，并使用Wi Icoxon检验进行成对比 较。
[0238] 对于图示而言，使用箱线图，其表示各个25%和75%四分位数的中值。
[0239] 缉里
[0240] 5.3.1在使用梯牧草的聚合物(使用戊二醒进行甘露糖基化)的刺痛检验中，变应 原性的损失高于未甘露糖基化的聚合物的变应原性损失。
[0241] 研究12名患者，5名男性，7名女性，在临床上均为对禾本科花粉过敏。平均年龄为 41岁，年龄范围为11至78岁。由梯牧草的天然提取物(未修饰的）诱导的丘疹的面积大小的 中值为28.4mm 2，25和75%四分位数的值分别为23.0和43. Imm2。对应于聚合的提取物的值为 8.0mm2,四分位数的中值分别为8.0和19.7。对于聚合的且甘露糖基化的提取物而言，中值 为0.0,并且四分位数分别为0.0和5.4(表3)。
[0242] 使用3种类型的制备物所得到的丘疹大小的差异极为显著（Friedman检验，P< 0.0001)，在制备物对之间（天然的-聚合物，天然的-甘露糖基化的聚合物W及聚合物-甘露 糖基化的聚合物)也极为显著(Wilcoxon检验，P<0.0001)。在体内显示变应原性较低的制备 物为甘露糖基化的聚合物。
[0243] 表2和3显示使用各制备物所获得的各丘疹面积的个体值，W及运些值的描述性统 计和患者的流行病学数据(年龄和性别）。
[0244] 表2:患者的流行病学数据(年龄和性别）、W及通过各制备物诱导的各丘疹的面积 值
[0246] 表3:图2中所示的数据的描述性统计
[0247]
[0248] 图22通过箱线图显示使用各种梯牧草的制备物所获得的丘疹的面积值。如可W观 察到的那样，使用甘露糖基化的聚合物进行的皮肤检验实际上是阴性的，其相对于未甘露 糖基化的聚合物有所降低，而未甘露糖基化的聚合物相应地比天然抗原(未聚合的）更低。 所有运些表明梯牧草的甘露糖基化的聚合物的变应原性降低至与常规聚合物(未甘露糖基 化的)相同或更高的程度。
[0249] 5.3.2在使用D.化rinae的聚合物(使用戊二醒进行甘露糖基化)进行的刺痛检验 中，反应性损失与为甘露糖基化的聚合物相当。
[0250] 研究22名患者，14名男性，8名女性，在临床上均为对美洲尘蛾过敏。平均年龄为32 岁，年龄范围为12至82岁。由美洲尘蛾的天然提取物(未修饰的）诱导的丘疹的面积大小的 中值为64.2mm 2,25和75%四分位数的值分别为54.2和72.3mm2。对应于聚合的提取物的值为 32.5mm 2,四分位数的中值分别为1.0和45.7。对于聚合的且甘露糖基化的提取物而言，中值 为24.1，并且四分位数分别为16.3和33.8。
[025。 使用3种类型的制备物所得到的丘疹大小的差异极为显著（AN0VA检验，P< 0.0001)，在制备物对之间（天然的-聚合物，天然的-甘露糖基化的聚合物）也极为显著 (Bonferroni校正,P<0.0001)。巧巾制备物显示在体内，变应原性比未聚合的变应原性极为 重要地降低。
[0252] 表4和5显示使用各制备物所获得的各丘疹面积的个体值，W及运些值的描述性统 计和患者的流行病学数据(年龄和性别）。
[0253] 表4:患者的流行病学数据(年龄和性别）、W及通过各制备物诱导的各丘疹的面积 值
[0256]表5:表4中所示的数据的描述性统计
[0258]图23通过箱线图显示使用各种D.farinae的制备物所获得的丘疹的面积值。如可 W观察到的那样，使用甘露糖基化的聚合物进行的皮肤检验与使用未甘露糖基化的聚合物 的皮肤检验类似，同时比天然抗原(未聚合的)那些低更多。所有运些表明D.farinae的甘露 糖基化的聚合物的变应原性降低至与常规聚合物(未甘露糖基化的)相同的程度。
[0巧9] 实施例6
[0260] 使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物比未甘露糖基化的聚合物更好地被树突状 细胞捕获
[0261] 材料和方法
[0262] 由健康供者的外周血单核细胞诱导树突状细胞(DC)，并使用GM-CSF和化-4培养5 天。由此获得的的DC(未成熟)暴露于按照之前所述而制备的梯牧草聚合物(具有或不具有 缀合的甘露聚糖）中，从而评估运些细胞的摄入。通过流式细胞仪，利用由梯牧草得到的提 取物的自发巧光（由于其染料），在DC与制备物之间接触2小时后，进行摄入测试。评估2个参 数:a)被DC捕获的变应原的定量(摄入速率）；b)显示内化能力的细胞的百分率。此外，使用 事先用巧光染料(Alexa M 488)通过半脫氨酸而标记的梯牧草的变应原来进行摄入测定。 通过流式细胞仪和共聚焦显微镜来分析结果。
[0263]
[0264] 如图24A中可W观察的那样，根据MFK平均巧光指数，其反映了摄入速率)被DC捕 获的梯牧草自发巧光的甘露糖基化聚合物的量是常规聚合物(未甘露糖基化的）所捕获的 量的7倍W上。在同一图的左上方，呈现了具有捕获巧巾制备物(梯牧草的聚合物，甘露糖基 化的和未甘露糖基化的）的能力的细胞的量。如可W观察到的那样，显示较强巧光的阳性细 胞的百分率对应于与甘露糖基化的聚合物溫育的那些。运些结果可W使用巧光染料(Alexa M488)通过半脫氨酸进行标记来证明。如图24B中可W观察到的那样，将当所述的细胞与具 有甘露聚糖的聚合物溫育时，双阳性细胞(识别为HLA-DR和Alexa 488)的量更高，运意味着 运种制备物的摄入更高。在同一图的下方，呈现了平均巧光值。如可W观察到的那样，在与 甘露糖基化的聚合物溫育的DC中，巧光强度也更高。图24C显示共聚焦巧光显微镜的图像， 其中可W看见，与未甘露糖基化的聚合物或天然变应原溫育的DC相比，与具有甘露聚糖的 聚合物溫育（30min)的DC的摄入更高。运些试验的结论为甘露糖基化的聚合物被更大量的 DC所捕获，并且运些DC也W更大的量捕获运些聚合物。
[02化]实施例7
[0266] 与未甘露糖基化的聚合物相比，使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物诱导人类树 突状细胞更多地产生IL-IO和IL-6。
[0267] 7.1树突状细胞产生细胞因子的测试 [026引材料和方法
[0269] 使用IL-4和GM-CSF使由健康供者得到的经分离的外周血单核细胞分化成树突状 细胞(DC)。将运些DC(未成熟的）与50iig/mL聚合的且甘露糖基化的（PM) W及未甘露糖基化 的(P)变应原(梯牧草)溫育。在使用不同的制备物进行刺激后的24小时，在运些细胞的培养 物上清液中测定细胞因子的浓度。用于定量细胞因子的技术为流式细胞仪Multiplex。
[0270] ^
[0271] 图25显示3个独立试验的平均值。
[0272] 如可W观察到的那样，与梯牧草的甘露糖基化的聚合物溫育的树突状细胞(DC)比 聚合的未甘露糖基化的变应原或天然的变应原（未聚合的）产生更多量的IL-6和IL-10。相 反，3种制备物诱导了相似的IL-8的产生。运些结果表明人类骨髓DC对甘露糖基化的聚合物 产生差异性地应答。使用甘露糖基化的聚合物观察到IL-IO增加的事实是免疫调控性强阳 性的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0273] 实施例8
[0274] 关于诱导人类树突状细胞成熟的能力，将使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物与 未甘露糖基化的聚合物比较
[0275] 8.1-树突状细胞的成熟测试 脚引材料和方法
[0277] 由健康供者的外周血（白细胞层)单核细胞诱导树突状细胞(DC)，并使用GM-CSF和 IL-4培养5天。由此获得的的DC(未成熟)暴露于不同的变应原制备物(天然的、聚合物W及 聚合物-甘露聚糖）中，从而评估在对运些变应原的应答在DC的成熟情况。在培养48小时后， 通过流式细胞仪来分析成熟测试，从而评估与DC成熟有关的分子的表达化LA-II (DR)， CD80，CD83和CD86)。
[0278] 细胞标记过程:每次标记使用SxlO5个细胞。将细胞再次悬浮于PBS中，并加入化g 直接抗体(1:100)(与巧光染料缀合的)或间接抗体(未缀合的）。在4°c下在黑暗中将它们溫 育20分子，随后用PBS洗涂。在间接抗体的情况下，加入与所关注的巧光染料缀合的化g( W 1:100稀释)小鼠抗IgG二级抗体。在使用PBS将它们洗涂2次后，将细胞再次悬浮于300-40化 L体积的PBS中，并最终通过流式细胞仪(FC SOOBeckman Coultek)进行分析。
[0279] 缉里
[0280] 8.1.1通过梯牧草变应原(根据它们的聚合和/或甘露糖基化）由人类衍生的树突 状细胞(DC)的成熟。
[0281] 如图26中可W观察到的那样，在骨髓未成熟的DC与聚合的变应原溫育后，所述的 变应原会诱导骨髓未成熟的DC成熟。根据图中所反映的标志物在DC表面的表达来评估成熟 的程度。相对于未聚合的变应原，在与聚合的变应原溫育的DC中，与成熟有关的所有标志物 均增多，根据聚合物为甘露糖基化的或未甘露糖基化的，所述的标志物不具有显著的差异。
[0282] 运些结果表明，由DC成熟的观点来看，梯牧草的甘露糖基化的聚合物表现与常规 聚合物(未聚合的)相似，因此显示成熟指数高于常规的变应原(未聚合的）。
[0283] 8.1.2通过D.farinae变应原（根据它们的聚合和/或甘露糖基化）由人类单核细 胞衍生的树突状细胞的成熟。
[0284] 如图27中可W观察到的那样，在骨髓未成熟的DC与聚合的变应原溫育后，所述的 变应原会诱导骨髓未成熟的DC成熟。根据图中所反映的标志物在DC表面的表达来评估成熟 的程度。相对于未聚合的变应原，在与聚合的变应原溫育的DC中，与成熟有关的所有标志物 均增多，根据聚合物为甘露糖基化的或未甘露糖基化的，所述的标志物不具有显著的差异。 运些结果表明，由DC成熟的观点来看，D.farinae的甘露糖基化的聚合物表现与常规聚合物 (未聚合的)相似，因此显示成熟指数高于常规的变应原(未聚合的）。
[0285] 实施例9
[0286] 与未甘露糖基化的聚合物相比，在体外免疫测试中，使用戊二醒进行甘露糖基化 的聚合物改善了产生IFN 丫和IL-IO的T细胞的诱导。
[0巧7] 材料和方法
[028引使用外周血人类细胞进行体外免疫测试
[0289] 免疫方案
[0290] 在使用自体成熟的DC(负载由相应的变应原提取物)进行3轮刺激后，由健康个体 的PBMC获得变应原特异性效应器T细胞。简言之，将iDC(l(yVmL)与具有相应提取物（lOOiig/ mL)的完全DMEM培养基溫育8小时，然后通过与肤聚糖（liil/mL)溫育而成熟。将事先洗涂的 成熟的树突状细胞(HiDC)与相应的提取物在完全DMEM培养基中再次溫育6小时（在ImL中， IO6个细胞），此后立即进行福射(300化ad)。然后，将经过福射并负载变应原的血C分布于48 孔平板（1〇6/血)中，并在比-7(化1/血席在下与PBMC( IO7个细胞/血)一起共培养。在第一次 刺激后的5天，向培养物中补充化-2(10U/mL)。使用负载变应原提取物的DC重复3次相同 PBMC的刺激和扩增过程。通过化ISPOT测试来测量细胞产生的变应原特异性WN丫，化-10和 比-4。
[0291] 缉里
[0292] 9.1.1使用戊二醒进行甘露糖基化的梯牧草聚合物会改善未甘露糖基化的聚合 物的IFN-丫和IL-IO应答，而不增加 IL-4应答。
[0293] 如图28中可W看见，与在常规的聚合物(未甘露糖基化的）中免疫的那些培养物相 比，在使用聚合物的且甘露糖基化的变应原免疫的培养物中，在特异性应答中，增加了产生 IFN-丫和化-10的细胞的数量。运种增加与产生IL-4的细胞的更多的数量不一致，表明对 TH2表现型不具有极化作用。使用甘露糖基化的聚合物所观察到的IFN-丫和IL-IO增加而 IL-4不增加的事实是免疫调控性强阳性的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0294] 9.1.2使用戊二醒进行甘露糖基化的D.化rinae变应原会改善未甘露糖基化的聚 合物的IFN-丫和IL-IO应答，而不增加 IL-4的应答。
[0295] 如图29中可W看见，与在常规的聚合物(未甘露糖基化的）中免疫的那些培养物相 比，在使用聚合物的且甘露糖基化的变应原免疫的培养物中，在特异性应答中，增加了产生 IFN-丫和化-10的细胞的数量。运种增加与产生IL-4的细胞的更多的数量不一致，表明对 TH2表现型不具有极化作用。使用甘露糖基化的聚合物所观察到的IFN-丫和IL-IO增加而 IL-4不增加的事实是免疫调控性强阳性的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0巧6] 实施例10
[0297] 与未甘露糖基化的聚合物相比，使用戊二醒进行甘露糖基化的聚合物会改善体内 的免疫应答
[0298] 在小鼠中的体内免疫测定
[0299] 材料和方法
[0300] 使用梯牧草和D.化rinae变应原(具有甘露糖基化的和未甘露糖基化的聚合物)实 施免疫，从而评估它们在体内的免疫能力。使用图30中所示的方案在Ba化/c小鼠中进行免 疫。
[0301] 在脾中通过使用CFSE标记实施响应于变应原(天然形式)的特异性淋己增殖测试， 来评估对免疫的应答。使用植物凝血素(PHA)作为阳性对照。在培养的第6天和第7天来测定 增殖。此外，在刺激48小时后，使用Multipler流式细胞仪技术在培养物上清液中进行细胞 因子的定量（图31)。使用植物凝血素(PHA)作为阳性对照。此外，通过化ISA来评估特异性 I巧水平(P.pratense或D. farinae)，W及IgGl (作为TH2应答标志物）和IgG2a(THl应答标志 物)的水平。
[0302] ^
[0303] 10.1与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用梯牧草的甘露糖基化的聚合物进 行免疫会对抗原刺激产生更高的增殖应答。
[0304] 如图32中可W观察到的那样，与由小鼠（使用常规的聚合的变应原（未聚合的）来 免疫）的脾所取得的细胞相比，当应答的细胞取自使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免 疫的小鼠的脾时，反映了对抗原产生应答的T细胞数量的增殖百分率显著较高。运表明与未 甘露糖基化的聚合物相比，聚合的且甘露糖基化的梯牧草变应原的免疫原性性质显著较 局。
[0305] 10.2与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用D.farinae的甘露糖基化的聚合物 进行免疫会对抗原刺激产生更高的增殖应答。
[0306] 如图33中可W观察到的那样，与由小鼠（使用常规的聚合的变应原（未聚合的）来 免疫）的脾所取得的细胞相比，当应答的细胞取自使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免 疫的小鼠的脾时，反映了对抗原产生应答的T细胞数量的增殖百分率显著较高。运表明与未 甘露糖基化的聚合物相比，聚合的且甘露糖基化的D.farinae变应原的免疫原性性质显著 较高。
[0307] 10.3相对于未甘露糖基化的聚合物而言，使用甘露糖基化的梯牧草聚合物所免 疫的小鼠的脾会改变细胞因子的模式。
[0308] 图34(图34A和34B)表示在脾细胞(使用P.pratense变应原刺激的）的培养物上清 液中所获得的不同细胞因子的产生，其中所述的脾细胞得自使用甘露糖基化的和未甘露糖 基化的聚合的变应原所免疫的小鼠。如可W观察到的那样，根据脾细胞的来源，所产生的细 胞因子的模式很多都不同。由淋己细胞产生的变化W定量的方式示于表6中。
[0309] 10.4与使用未甘露糖基化的聚合物相比，使用化Ieum的甘露糖基化的聚合物所 免疫的小鼠的淋己细胞会增加 IL-IO的产生。
[0310] 表6.在使用化Ieum聚合物所免疫的小鼠中，由其淋己细胞在体外相对产生的细胞 因子
[0312] **与使用未甘露糖基化的聚合物所免疫的小鼠中获得的值相比，相对增加100倍 W上。
[0313] 如表6中可W观察到的那样，相对于图34(图34A和34B)中所示的淋己来源的细胞 因子的产生而言，可W获得的最大的改变对应于IL-10,其在聚合的且甘露糖基化的变应原 所刺激的小鼠中比使用未甘露糖基化的聚合物所免疫的小鼠中所获得的生产高出300倍W 上。比-10的运种增加是免疫调控性强阳性的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0314] 10.5相对于未甘露糖基化的聚合物而言，由使用甘露糖基化的D.化rinae的聚合 物所免疫的小鼠而得到的脾细胞会改变细胞因子的模式。
[0315] 图35(图35A和35B)表示在脾细胞(使用D.farinae变应原刺激的）的培养物上清液 中所获得的不同细胞因子的产生，其中所述的脾细胞得自使用甘露糖基化的和未甘露糖基 化的聚合的变应原所免疫的小鼠。如可W观察到的那样，根据脾细胞的来源，所产生的细胞 因子的模式很多都不同。由淋己细胞产生的变化W定量的方式示于表7中。
[0316] 10.6与使用未甘露糖基化的聚合物所产生的因子相比，由使用D.化rinae的甘露 糖基化聚合物所免疫的小鼠而得到的脾细胞会增加 IL-IO ,IFN 丫和IL-2(作为对抗原刺激 的应答）
[0317]表7.在使用D.farinae聚合物所免疫的小鼠中，由其淋己细胞在体外相对产生的 细胞因子
[0319] **与使用聚合物(不具有甘露聚糖)所免疫的小鼠中获得的值相比，相对增加100 倍W上。
[0320] 如表7中可W观察到的那样，相对于图35(图35A和35B)中所示的淋己来源的细胞 因子的产生而言，可W获得的最大的改变对应于化-2,化-10和IFN-丫，其在未甘露糖基化 的聚合物所免疫的小鼠中所获得的生产相比，使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的 小鼠中增加300,145和125倍W上。运种增加(特别是IL-IO和IFN-丫）是免疫调控性强阳性 的(运是使用运种类型的制备物所寻求的）。
[0321] 10.7与未甘露糖基化的聚合物相比，使用高剂量的聚合物的且甘露糖基化的梯 牧草聚合物所免疫的小鼠中，特异性抗体的应答有利于IgG/I巧比例。
[0322] 如图36(图36A和36B)中可W观察到的那样，与常规的聚合的变应原(未甘露糖基 化的）相比，在使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠而得到的血清中，响应于梯 牧草变应原的特异性IgG抗体较高。相反，特异性I巧抗体应答低于常规的聚合物。如图中可 W看见的那样，当使用聚合的且甘露糖基化的梯牧草变应原进行免疫时，IgG2a/I巧的比例 较高。比例的运种增加是免疫调控性强阳性的（运是使用运种类型的制备物所寻求的），因 为其表明了所得应答的抗过敏极性。
[0323] 10.8与未甘露糖基化的聚合物相比，使用高剂量的甘露糖基化的D.化rinae聚合 物所免疫的小鼠中，特异性抗体的应答有利于IgG^^比例。
[0324] 如图37(图37A和37B)中可W观察到的那样，与常规的聚合的变应原(未甘露糖基 化的）相比，在使用聚合的且甘露糖基化的变应原所免疫的小鼠而得到的血清中，响应于 D. far inae变应原的特异性IgG抗体较高。相反，特异性I巧抗体应答低于常规的聚合物。如 图中可W看见的那样，当使用聚合的且甘露糖基化的D. farinae变应原进行免疫时，IgG2a/ I巧的比例较高。比例的运种增加是免疫调控性强阳性的(运是使用运种类型的制备物所寻 求的），因为其表明了所得应答的抗过敏极性。
【主权项】
1. 一种包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物。2. 根据权利要求1所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖得自植物、真菌或酵母 菌。3. 根据权利要求2所述的免疫原性复合物，其中所述的酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属 和假丝酵母属。4. 根据权利要求3所述的免疫原性复合物，其中所述的酵母属物种为酿酒酵母。5. 根据权利要求1至4的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖包含氨 基。6. 根据权利要求5所述的免疫原性复合物，其中所述的氨基存在于赖氨酸氨基酸中。7. 根据权利要求1至6的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的聚合的抗原包含 至少2个抗原，它们是彼此相同的或不同的。8. 根据权利要求1至7的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的二醛选自戊二 醛，乙二醛，丙二醛，丁二醛和己二醛。9. 根据权利要求8所述的免疫原性复合物，其中所述的二醛为戊二醛。10. 根据权利要求1至9的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的聚合的抗原通 过所述的戊二醛与所述的甘露聚糖结合。11. 根据权利要求1至9的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原通过所述 的聚合的抗原通过物理诱捕而与所述的甘露聚糖结合。12. 根据权利要求1至11的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原为变应 原。13. 根据权利要求12所述的免疫原性复合物，其中所述的变应原选自花粉、虫螨、上皮 细胞、真菌孢子和它们的组合。14. 根据权利要求13所述的免疫原性复合物，其中所述的花粉选自物种梯牧草、喜马拉 雅鸭茅、狗牙根、多年生黑麦草、三毛草属、橄榄、Cuppresusspp.、豚草属、桦木属、悬铃木 属、欧榛或欧洲桤木。15. 根据权利要求13或14所述的免疫原性复合物，其中所述的虫螨属于物种欧洲室尘 螨、美洲尘螨或Blomiatropicalis。16. 根据权利要求13至15的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的上皮细胞属 于物种Felisdomesticus或家犬。17. 根据权利要求13至16的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的真菌孢子属 于物种烟草赤星病菌或细链格孢。18. 根据权利要求1至17的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的抗原:甘露聚 糖的比例范围为1:10至1:0.1，优选为1:0.3或1:0.5。19. 根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物，其包括（i)制备包含抗原 和甘露聚糖的溶解物；以及(ii)将所述的二醛加入至所述的溶解物中。20. 权利要求19所述的方法，其包括步骤（iii):包括加入中和试剂，优选为甘氨酸，从 而终止所述的聚合反应。21. 根据权利要求19或20所述的方法，其还包括步骤（iv):分离所述的免疫原性复合 物。22. 根据权利要求19至21的任意一项所述的免疫原性复合物，其中所述的甘露聚糖得 自植物、真菌或酵母菌。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述的酵母菌选自酵母属、毕赤酵母属和假丝酵 母属。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述的酵母属物种为酿酒酵母。25. 根据权利要求19至24的任意一项所述的方法，其中所述的甘露聚糖包含氨基。26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述的氨基存在于赖氨酸氨基酸中。27. 根据权利要求19至26的任意一项所述的方法，其中所述的聚合的抗原包含至少2个 抗原，它们是彼此相同的或不同的。28. 根据权利要求19至27的任意一项所述的方法，其中所述的二醛选自戊二醛，乙二 醛，丙二醛，丁二醛和己二醛。29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述的二醛为戊二醛。30. 根据权利要求19至29的任意一项所述的方法，其中所述的抗原为变应原。31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述的变应原选自花粉、虫螨、上皮细胞、真菌孢 子和它们的组合。32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述的花粉选自物种梯牧草、喜马拉雅鸭茅、狗 牙根、多年生黑麦草、三毛草属、橄榄、Cuppresusspp.、豚草属、桦木属、悬铃木属、欧榛或 欧洲桤木。33. 根据权利要求31或32所述的方法，其中所述的虫螨属于物种欧洲室尘螨、美洲尘螨 或Blomiatropicalis。34. 根据权利要求31至33的任意一项所述的方法，其中所述的上皮细胞属于物种Felis domesticus或家犬。35. 根据权利要求31至34的任意一项所述的方法，其中所述的真菌孢子属于物种烟草 赤星病菌或细链格孢。36. 根据权利要求19至35的任意一项所述的方法，其中所述的抗原:甘露聚糖的比例范 围为1:10至1:0.1，优选为1:0.3或1:0.5。37. -种药物组合物，其包含根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物以 及药物可接受的载体。38. 根据权利要求37所述的药物组合物，其还包含佐剂。39. 根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述的佐剂选自氢氧化铝、磷酸钙、酪氨 酸、单磷酰脂质A和壳聚糖。40. 根据权利要求37至39的任意一项所述的药物组合物，其还包含额外的活性物质。41. 根据权利要求40所述的组合物，其中所述的额外的活性物质包括抗组胺试剂、甾类 激素、组胺受体的拮抗剂、白细胞三烯或它们的混合物。42. 根据权利要求37至41的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物配制成大颗粒、 纳米颗粒或脂质体。43. 根据权利要求37至42的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物为固体药物给 予形式、液体药物给予形式或包含分散系统的药物传递形式。44. 根据权利要求37至43的任意一项所述的组合物，其中所述的药物组合物为使用肠 胃外、鼻内、口周、舌下、口服、经皮或局部给予的药物形式。45. 根据权利要求1至18的任意一项所述的免疫原性复合物用于制备药物组合物的用 途。46. 根据权利要求45所述的用途，用于在受试对象中刺激和/或诱导所述的免疫应答。47. 根据权利要求45的用途，所述的用途为作为疫苗。48. 根据权利要求45至47的任意一项所述的用于治疗受试对象的感染性疾病、肿瘤或 过敏的用途。
【专利摘要】本发明提供了包含聚合的抗原、甘露聚糖和二醛的免疫原性复合物，包含该免疫原性复合物的组合物，以及其作为免疫应答刺激剂和疫苗用于治疗感染性疾病、肿瘤和过敏的用途。同样地，本发明涉及基于通过使用二醛而使得抗原和甘露聚糖同时聚合和缀合来获得所述的免疫原性复合物的方法。
【IPC分类】A61P37/08, A61K39/35, A61K39/39
【公开号】CN105492022
【申请号】CN201480030171
【发明人】J·L·苏维萨加里多-莱斯塔切, J·卡那达维西奈, I·索里亚卡斯特罗, E·费尔南德斯-卡尔达斯罗德里格斯, A·曼扎诺佩雷斯, B·卡瑟斯奥尔特加, J·吉梅内斯巴贝罗, M·卡萨诺瓦斯弗格斯
【申请人】尹姆诺泰克公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年4月3日
【公告号】EP2982381A1, US20160058859, WO2014162036A1
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