新型吡咯衍生物的制作方法
新型吡咯衍生物的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及为溶细胞素抑制剂的化合物、其前药及其在治疗中的应用，包括在药 物组合物中的应用，尤其是在治疗细菌感染例如肺炎球菌感染中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)是最有威胁的人类病原体 之一，全世界感染超过一千万的所有年龄组的人，特别是幼儿、老年人和免疫力低下的人。 其是严重且经常致命的疾病如肺炎、菌血症和脑膜炎的主要致病病因。其也是导致其他较 轻但使人虚弱的疾病如中耳炎和角膜炎的原因。
[0003] 甚至在使用抗生素和作为抗生素佐剂的类固醇数十年之后，肺炎球菌病的死亡率 和发病率在发达国家仍然很高并且在发展中国家惊人地高。尽管抗生素杀灭肺炎球菌，但 几乎20%的住院患者仍然死亡，同时许多肺炎球菌性脑膜炎幸存者患重度神经障碍，包括 认知损害、视力和听力丧失，因此给患者及其家庭施加巨大痛苦并且是医疗保健系统的非 常重要的成本。如今，肺炎球菌感染仍然是该领域内的主导者以及包括WHO的卫生组织广泛 认可的主要的全球公共卫生问题。
[0004] 当前标准治疗未解决的始终高的死亡率和发病率的主导因素之一是由毒性肺炎 球菌产物的释放引起的毒血症，最重要的毒性肺炎球菌产物是肺炎球菌毒素溶血素。该毒 素是肺炎球菌毒力的主要参与者并且是毒血症的主要的直接和间接诱因。
[0005] 肺炎球菌溶血素属于胆固醇依赖性溶细胞素(CDC)家族，CDC结合到含有胆固醇的 膜并生成对感染的细胞具有致死和亚致死作用的大孔。在细菌中，毒素肺炎球菌溶血素是 细胞质的并且主要由肺炎球菌在其溶解之后释放。结果，在溶解性抗生素的作用下，释放大 量毒素，加重毒血症。因此，即使使用抗生素在从患者清除细菌方面是成功的，但随后的毒 素释放是有害的，并且可以致命或引起长期障碍。
[0006] 该毒血症构成国际上认可的实质未满足的医学需要。当前，主要为地塞米松的皮 质类固醇用作肺炎球菌性脑膜炎的抗生素治疗的佐剂。然而，甚至在使用地塞米松时，观察 到显著的死亡率和发病率，由于地塞米松的非特异性作用、有限的临床效果以及在一些情 况下其在增加脑膜炎中的神经元细胞凋亡中的有害作用，地塞米松的广泛使用仍然有争议 [Lancet(2002)360 211-218]。因此，目前的技术水平对于有效治疗侵袭性肺炎球菌病是不 够的。
[0007] 存在证明将肺炎球菌溶血素作为治疗靶的有效性的大量证据。在发明人的实验室 中已经证实了 ：使用小鼠肺炎模型，不产生肺炎球菌溶血素的肺炎链球菌(PLN-A)突变菌株 不再是致死的，引起大体上很少的菌血症并表现出肺部炎症严重程度的显著降低。大鼠脑 膜炎模型中获得的其他证据显示出，肺炎球菌溶血素-负性突变体感染明显不如野生型肺 炎球菌感染严重，并且没有观察到对脑的纤毛上皮的损伤以及上皮周围的细胞没有发生细 胞凋亡[J. Inf ect，（2007)55 394-399]。在豚鼠的肺炎球菌性脑膜炎中，野生型肺炎球菌诱 导重度耳蜗损伤和听力丧失，而PLN-A感染保留螺旋器完整无损[Infect. Immun. (1997)逆 4411-4418]。使用培养的有纤毛脑上皮细胞的体外模型使体内条件的再创造成为可能，其 中脑室的衬细胞暴露于肺炎链球菌中。完整无损和抗生素杀灭的野生型肺炎球菌两者均诱 导培养中的上皮细胞的损伤并显著损害纤毛摆动；使用PLN-A未观察到影响 [Infect. Immun. (2000)逆1557-1562]。抗生素溶解的肺炎球菌对培养的室管膜细胞的损 伤作用明显地是由从抗生素溶解的细菌释放的毒素肺炎球菌溶血素引起的，因为该损伤在 抗肺炎球菌溶血素抗体的存在下消除[Infect. Immun.(2004)g 6694-6698]。该发现支持 以下策略，即抗生素诱导的毒血症通过与抗肺炎球菌溶血素试剂组合来预防。
[0008] 肺炎球菌感染中肺炎球菌溶血素的显著参与以及在没有肺炎球菌溶血素存在下 疾病预后的大体改善的证据得出以下结论:肺炎球菌溶血素构成针对肺炎球菌病开发新治 疗的潜在治疗靶。之前的研究已经显示出胆固醇抑制肺炎球菌溶血素的能力[Biochem.J. (1974)@ 95-98]，然而，该抑制仅仅是由于以下的事实:胆固醇是在靶细胞膜中形成孔所 需要的肺炎球菌溶血素的天然细胞受体。胆固醇在兔角膜上的局部应用证实了在肺炎球菌 性角膜炎中的正面治疗作用[Invest .Ophtalmol.Vis. Sci.(2007)|^ 2661-2666]。这表明 肺炎球菌溶血素在肺炎球菌性角膜炎中的参与以及在其抑制之后获得的治疗益处。然而， 胆固醇不被认为是治疗肺炎球菌病的治疗试剂并且在临床上尚未用于患者。之前已经发现 另一种肺炎球菌溶血素抑制剂，蒜素(大蒜提取物中的一种组分)在体内抑制肺炎球菌溶血 素的溶血活性[Toxicon(2011)丑540-545]。该化合物是不可逆地结合到毒素的反应性硫 醇基的半胱氨酸抑制剂。抑制这样的特性的化合物由于其潜在非特异性结合于体内其他含 半胱氨酸的蛋白质上，因此作为药物候选者是不利的。
[0009] 仍有需要提供适用于治疗细菌感染的溶细胞素如肺炎球菌溶血素的抑制剂。
[0010] 国际专利申请PCT/GB2012/053022在本申请的优先权日之后公布，通过引用以其 整体并入本文中，其公开了作为溶细胞素抑制剂的N-苯基取代的吡咯衍生物，该N-苯基取 代的吡咯衍生物特异性地抑制肺炎球菌溶血素和在其各自宿主的毒力中关键的其他胆固 醇依赖性溶细胞素的直接毒性作用，包括化合物2,5_双(二甲基氨基甲酰基)-1-(4-甲氧基 苯基)-1Η-吡咯-3,4-二基双(4-((膦酰基氧基)-甲基）苯甲酸酯）。这些化合物与蒜素没有 结构相似性并且不会共价结合到毒素的反应性硫醇基上。
[0011] 本发明提供了新型N-苯基取代的吡咯溶细胞素抑制剂，其显示出例如就溶解性而 言特别有利的特性、和使其特别适于非胃肠递送的物理化学特性。本发明的化合物还阻止 由肺炎球菌溶血素以及可以假设的其他胆固醇依赖性溶细胞素诱导的宿主衍生的毒性作 用的刺激。因此，该化合物可以用作单独试剂或抗生素的佐剂，用于阻止或衰减肺炎球菌溶 血素诱导的毒性以及在例如由肺炎链球菌引起的感染过程中观察到的其抗宿主作用。
【发明内容】
[0012]根据本发明，提供了一种式⑴的化合物：
[0013]
[0014] 现共约子工κι ?安叉η、」則约m 土似j，现共约学上可接受的盐或溶剂化物。
[0015] 在另外的方面，本发明提供了用作药物的式（I)的化合物或其药学上可接受的前 药衍生物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物（以下称为本发明的化合物）。
【具体实施方式】
[0016] 本发明的化合物的前药衍生物在体内给药于受试者之后会分解，形成式（I)的活 性化合物(本文有时称为"母体活性化合物"）。本发明的化合物的前药衍生物可以具有一些 内在生物活性(例如，作为肺炎球菌溶血素抑制剂），然而其通常具有很小或没有这样的内 在活性。
[0017] 式(I)的化合物的前药衍生物包括酯前药衍生物。酯前药衍生物包括羧酸酯、氨基 磺酸酯、磷酸酯和氨基甲酸酯衍生物，优选为羧酸酯、氨基磺酸酯或磷酸酯衍生物，更优选 为羧酸酯或磷酸酯衍生物，甚至更优选为羧酸酯衍生物。
[0018] 酯前药衍生物的实例包括式(la)的化合物：
[0019]
[0022] (b)芳基、杂芳基、Q-C3烷基芳基和-Q-C3烷基杂芳基，所述芳基和杂芳基任选地 被取代；
[0023] 或R18、R19和R2。可以独立地表示氢；
[0024] 并且当R4^R4b之一独立地选自以上定义的基团时，另一个为氢。
[0025] 在1?16、1?17、1?18、1?19和1? 2()的定义范围内的苯基、芳基和杂芳基的任选取代基适合地 选自羟基；卤素;氰基;-(CHR26) q_0P0 (OR19) (0R2())，其中q表示0或1 (所述基团不被另一个含 有R19或R2()的基团取代烷氧基或心-以氟烷氧基，例如A-Cs烷氧基或&_(： 3氟烷氧基 如甲氧基、乙氧基或二氣甲氧基;Cl_C6烷基或Cl_C6氣烷基，例如，Cl_C3烷基或Cl_C3氣烷基如 甲基或三氟甲基;和-C(0)NR aRb，其中RlPRb独立地选自氢和&-〇5烷基，例如，&-C3烷基如甲 基;而且当存在两个相邻的羟基取代基时，其可以通过亚甲基连接以形成缩醛。另一种可能 的任选取代基是_SF 5。如果所述芳基和杂芳基被取代，则其可以被1、2或3个，优选地1或2 个，更优选地1个取代基取代。
[0026 ] R16、R17、R18、R19 和妒〇的 Ci-Cs 烷基、C2_C6 链烯基、C2_C6 炔基、C3-C1()环烷基、C5_C10 环 烯基、杂环基、-Cl-C3烷基-C3_ClQ环烷基、 -Cl-C3烷基-C5_ClQ环烯基、-Cl -C3烷基杂环基或杂 环基的任选取代基包括选自以下的取代基:氰基;-〇P〇(〇R19)(〇R2<))(所述基团不被另一个 含有R 19或R2()的基团取代hCi-Cs烷氧基或&-〇5氟烷氧基，例如?3烷氧基或&-(：3氟烷氧 基如甲氧基、乙氧基或二氣甲氧基;Cl_C6烷基或Cl_C6氣烷基，例如，Cl_C3烷基或Cl_C3氣烷基 如甲基或三氟甲基;和-C(0)NR aRb，其中RlPRb独立地选自氢和&-〇5烷基，例如，&-C3烷基如 甲基。基团R 5、R6和R7的任选取代基还包括一种或多种(例如，1、2或3种）卤素原子，例如，F或 C1原子(尤其是F原子）。
[0027] R16优选表示心-以烷基或C3-C1Q环烷基，其中上述基团中的任一个可以任选地被 (以及优选地被)选自-〇P〇(〇R 19)(〇R2°)和_(〇(CH2)z)r〇R 24的基团取代，其中每个z可以相同 或不同，每个z表示2或3，r表示选自1至20的整数，例如，7至12，且R 24为氢、&-C3烷基或-P0 (OR19)(OR20)〇
[0028] 可选择地，R16优选表示任选地被（以及优选地被)-(CHR26)q-0P0(0R 19)(0R2Q)取代 的苯基，其中q表示0或1。
[0029] R17优选表示&_〇5烷基，例如，甲基。R18优选表示&_〇5烷基，例如，甲基。可选择地， R17和R18与它们连接的N-起可以形成任选地包含选自0、S和NR25aR 25b的另外的杂原子的5元 或6元杂环，其中R25a为氢、&-C6烷基、-CH 2-0P0(0R19)(0R2<))或5元或6元杂环。
[0030] R19优选为氢、甲基或乙基，尤其为氢。
[0031 ] R2()优选为氢、甲基或乙基，尤其为氢。
[0032] R25a优选为氢或甲基。
[0033] R25b优选不存在。
[0034] R26优选为氢或甲基，更优选为甲基。
[0035] 在一种实施方式中，q表不0。在另一种实施方式中，q表不1。
[0036] 在一种实施方式中，R4lPR4b之一表示如上所定义的前药衍生物基团。在另一种实 施方式中，R 4lPR4b两者表示如上所定义的前药基团。
[0037] 在一种实施方式中，心和心两者独立地选自-C(0)R16、-S02NH 2、-P0(0R19)(0R2Q)、-CHR26-0P0(0R 19)(0R2Q)和-C(0)NR17R18，其中R 2 6为氢或C1-C6烷基。在进一步的实施方式中， R4mR4b2-选自-C(0)R16、-S02NH2、-P0(0R 19)(0R2<))、-CHR26-0P0(0R19)(0R 2()WP-C(0) NR1 V8，其中R26为氢或&-C6烷基;且R4lPR4b中的另一个为氢。
[0038] 胙和心之一或两者优选地独立地选自-C (0) R16。
[0039] 当前药为羧酸酯前药，例如，其中R4lPR4b之一或两者为-C(0)R16时，与C(0)部分相 邻的碳原子优选为叔或季碳原子。
[0040] 前药衍生物的具体实例包括式（la)的化合物，其中R4lPR4b之一或两者独立地选 自-SO2NH2、-P0(OH) 2、-CH2-PO (OH) 2、-P0(OEt) 2、-CON-(4-N-哌啶基-哌啶）、-⑶叔丁基、-C0 异丙基、-CON- (N-甲基）哌嗪、-C0N-哌嗪、-CON (CH3) 2、COCH3、-CO- (CH2) 2-0Me、-CO (CH2) 2_ (0 (CH2)2)POMe (其中p为1至12)、-C0-CMe2-CH2-(0(CH2)3)P0Me (其中p为1至12)、-C0-CMe2-CH2-(0(CH2)2) p0-P0(0H)2(其中p为1 至12)、-⑶-CMe2-CH2-(0(CH2)2) P0-P0(0H)2(其中p为1至 12)、-⑶-(4-膦酰氧基甲苯)和-C0-(4-膦酰氧基甲基环己烷）；其中当仅炉和心之一表示 如上所定义的前药衍生物基团时，R 4lPR4b*的另一个为氢。前药衍生物的一组具体实例包 括式（la)的化合物，其中R 4lPR4b独立地选自-S02NH2、-P0(0H) 2、-⑶N-(4-N-哌啶基-哌 啶）、-C0叔丁基、-C0异丙基、-CON-(N-甲基）哌嗪、-C0N( CH3)2和C0CH3 〇
[0041] 可能提及的式（la)的特定前药是1-(4-甲氧基苯基)-2,5_双(4-甲基哌嗪-1-羰 基MH-吡咯-3,4-二基双（2-甲基丙酸酯），即式（1 &)的化合物，其中1^和1?4|3为-(：(0)〇1 (CH3) 2;或其盐或溶剂化物，例如，其二盐酸盐。
[0042] 虽然以上针对每个变量分别一般地列出了每个变量的优选基团，但本发明的优选 化合物包括其中式(la)中的几个或每个变量选自每个变量的优选、更优选或特别地列出的 基团的那些。因此，本发明意在包括优选、更优选或特别地列出的基团的所有组合。
[0043]本发明的化合物的分子量优选为小于2000,更优选为小于1000,甚至更优选为小 于800,例如小于600。
[0044]本发明的化合物的盐的实例包括由药学上可接受的无毒性碱或酸制备的所有药 学上可接受的盐。衍生自碱的盐包括，例如，钾和钠盐等。衍生自酸的盐包括衍生自无机和 有机酸，例如，盐酸、甲基磺酸、硫酸和对甲苯磺酸等的那些盐。
[0045] 本发明的化合物的溶剂化物的实例包括水合物。
[0046] 本文所述的化合物包括一个或多个手性中心，并且公开内容扩展至包括由其产生 的外消旋物、对映异构体和立体异构体。在一种实施方式中，一种对映异构体形式以基本上 不含相对应的对映异构体形式的基本上纯的形式存在。
[0047] 本发明还扩展至所有多晶形式的本发明的化合物。
[0048] 本发明还扩展至同位素标记的本发明的化合物，其中一个或多个原子被原子质量 或质量数不同于自然界中最常见的原子质量或质量数的原子取代。可以掺入到本发明的化 合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮和磷的同位素，如1 3!1、11(：、14(：、1力、3￥和 3￥。同位素 标记的式（I)的化合物可以通过进行以下所述的合成方法并用同位素标记的试剂或中间体 取代非同位素标记的试剂或中间体来制备。
[0049]本发明扩展至本文说明的所有互变异构形式的化合物(特别是烯醇-酮基互变异 构体)。
[0050] 本发明的化合物可以如实施例和以下一般方法中所述进行制备。
[0051] 式（I)的化合物可以通过如下步骤来制备:使式（II)的化合物或其受保护的衍生 物与1-甲基哌嗪反应，以及
[0052]
[0053] 如果需要，使所生成的化合物去保护。该反应可以，例如，在异丙基氯化镁的存在 下且在溶剂如THF中进行。
[0054] 用于制备式（la)的化合物的方法显示于以下方案A中，其中R4lPR4b之一或两者表 示除了氢以外的基团：
[0055]
[0056]方案 A
[0057] 其中，当与适合的偶联剂如：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺）（EDC)、N，-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1，Γ-羰基二咪唑(CDI)组合使用时，X是离去基团，例如，卤素、 酯(-0C0R'，提供混合的酸酐)或氢。适当地，X是卤素。
[0058] 根据使用的摩尔过量的试剂(或多种试剂），可以使方案A适合于将一个或两个羟 基转化为0R41P/或〇R 4b。当R4lPR4b不同时，可能有必要使用保护策略，先引入一个基团，然 后引入另个基团。
[0059] 因此，根据本发明的进一步的方面，提供了用于制备式（la)的化合物的方法，其包 括使式(I)的化合物或其受保护的衍生物与式R 4aX的化合物和/或式R4bX的化合物反应，
[0060]
[0061 ]其中X独立地为离去基团，如以上所提及的离去基团。
[0062]任何新的中间体，如以上定义的那些中间体，可以用于本发明的化合物的合成中， 因此也包括在本发明的范围内。
[0063] 因此，根据本发明的进一步的方面，提供了式（I)的化合物的受保护的衍生物，例 如，化合物(3，4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2,5-二基)双（（4-甲基哌嗪-1-基）甲酮）。
[0064] 在本发明的化合物的合成过程中，可能需要保护基来保护化学上敏感的基团，以 确保该方法是有效的。因此，如果需要或必要，可以通过使用常规的保护基来保护中间体化 合物。保护基和用于去除保护基的手段描述于由John Wiley&Sons Inc出版的Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts的"有机合成中的保护基（Protective Groups in Organic Synthesis)" ；4th Rev Ed.，2006，ISBN-10:0471697540中。
[0065]如上所表明的，本发明的化合物对于治疗由产生成孔毒素(pore-forming toxin) 如胆固醇依赖性溶细胞素的细菌引起的细菌感染是有用的。
[0066] 特别地，本发明的化合物对于治疗与细菌感染相关的毒血症是有用的。
[0067] 对于这样的使用，本发明的化合物一般会以药物组合物的形式给药。
[0068] 另外，本发明提供了包含本发明的化合物，所述化合物任选地与一种或多种药学 上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。
[0069] 稀释剂和载体可以包括适于非胃肠给药、口服给药、局部给药、粘膜给药和直肠给 药的那些。
[0070] 如以上所提及的，这样的组合物可以制备用于例如以下给药方式:非胃肠给药、皮 下给药、肌内给药、静脉内给药、关节内给药或关节周围给药，特别地为液体溶液或悬液的 形式；口服给药，特别地为片剂或胶囊剂的形式;局部给药，例如，玻璃体内给药、肺部给药 或鼻腔给药，特别地为滴眼剂、粉剂、滴鼻剂或气溶胶的形式，和透皮给药;粘膜给药，例如， 给药到颊部、舌下或阴道粘膜;以及直肠给药，例如，为栓剂的形式。
[0071] 所述组合物可以便利地以单位剂量形式给药，并且可以通过制药领域中众所周知 的任何方法制备，如在Remington的 Pharmaceut i cal Sciences, 17th ed·，Mack Publishing Company，Easton，PA.，（1985)中描述的。非胃肠给药的制剂可以包含作为赋形 剂的无菌水或盐水、烷撑二醇如丙二醇、聚烷撑二醇如聚乙二醇、植物来源的油、和氢化萘 等。非胃肠给药的制剂可以以固体形式提供，如冻干组合物，该冻干组合物可以复原，优选 地恰好在给药之前复原。复原可以包括将冻干组合物溶解于水或一些其他药学上可接受的 溶剂中，例如，生理盐水;药学上可接受的醇，例如，乙醇、丙二醇、聚乙二醇如聚乙二醇300 的含水溶液等;或溶解于一些其他无菌注射剂中。
[0072] 用于鼻腔给药的制剂可以是固体并且可以包含赋形剂，例如，乳糖或右旋糖酐，或 可以为用于滴鼻剂或计量喷雾形式的含水或含油溶液。针对颊部给药，典型的赋形剂包括 糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁和预胶化淀粉等。
[0073] 适于口服给药的组合物可以包含一种或多种生理上相容的载体和/或赋形剂并且 可以为固体或液体形式。片剂和胶囊剂可以使用以下制备:粘合剂，例如，糖浆、阿拉伯树 胶、明胶、山梨糖醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮;填充剂，例如，乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸 钙、山梨糖醇或甘氨酸；润滑剂，例如，硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；以及表面活性 剂，例如，十二烷基硫酸钠。液体组合物可以包含常规的添加剂如悬浮剂，例如，山梨糖醇 浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基纤维素或食用脂肪；乳化剂，例如，卵磷脂或阿拉伯树 胶；植物油，例如，杏仁油、椰子油、鳕鱼肝油或花生油；防腐剂，例如，丁基化羟基苯甲醚 (BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT)。液体组合物可以包封在例如明胶中以提供单位剂量形式。
[0074]固体口服剂型包括片剂、两片硬壳胶囊剂和软弹性明胶(SEG)胶囊剂。
[0075] 干燥的壳制剂典型地由约40 %至60 %浓度的明胶、约20 %至30 %浓度的增塑剂 (如甘油、山梨糖醇或丙二醇）和约30%至40%浓度的水组成。也可以存在其他物质如防腐 剂、染料、遮光剂和调味剂。液体填充物质包含已经溶解、增溶或分散(使用悬浮剂如蜂蜡、 氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)的固体药物或在载体或载体组合中的液体药物，所述载体为 例如矿物油、植物油、甘油三酯、1，2-乙二醇、多元醇和表面活性剂。
[0076] 本发明的药物组合物可以任选地包含一种或多种抗氧化剂(例如，抗坏血酸或偏 亚硫酸氢盐(metabisulfate)及其盐）。
[0077] 可能被提及的根据本发明的特定药物组合物包括以下组合物：
[0078] -用于非胃肠给药，例如，静脉内给药的药物组合物。
[0079]-用于口服给药的药物组合物。
[0080] -用于非胃肠给药，例如，静脉内给药或以单位剂量形式口服给药的药物组合物。
[0081] -用于以在给药之前使用液体复原的固体形式非胃肠给药，例如，静脉内给药的药 物组合物。
[0082] -用于以液体形式，例如，溶液形式非胃肠给药(例如，静脉内给药)的药物组合物。
[0083] 本发明的化合物是由细菌肺炎链球菌产生的胆固醇依赖性溶细胞素，肺炎球菌溶 血素的抑制剂。其还抑制由A链球菌群产生的链球菌溶血素0(SL0)和由产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)产生的产气荚膜梭菌素0(PF0)。还预期抑制紧密相关的胆固 醇依赖性溶细胞素的其他成员，其实例包括但不限于由单核细胞增生性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)产生的李斯特菌溶胞素0(LL0)、由炭疽杆菌（Bacillus anthracis)产生的炭疽杆菌溶细胞素 (Anthroly sin )0(AL0)和由猪链球菌（Strep tococcus suis)产生的猪链球菌溶血素(Suilysin)(SLY)。
[0084] 本发明的化合物对于治疗细菌感染，例如，肺炎球菌感染(包括相关的毒血症)是 有用的，其中肺炎球菌溶血素毒素已被证实在产生的疾病中发挥关键作用。这样的疾病包 括但不限于肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、肺炎球菌性败血症/菌血症、肺炎球菌性 角膜炎和肺炎球菌性中耳炎。本发明的化合物对于治疗与其他病症相关的肺炎球菌性感染 也是有用的。这样的病症包括(但不限于)囊性纤维化和慢性阻塞性肺病(C0PD)。例如，肺炎 链球菌(S · pneumon i ae)已经从C(PD患者中分离并认为是该疾病的加重因素。
[0085] 本发明的化合物对治疗由A链球菌群(GAS)引起的感染是有用的，包括但不限于侵 袭性A链球菌群性疾病，其中毒素链球菌溶血素0(SL0)已被证实在全身性GAS疾病的发病机 理中发挥关键作用。
[0086] 本发明的化合物对于治疗由产气荚膜梭菌引起的感染是有用的，包括但不限于表 征为肌坏死、感染性休克和死亡的气性坏疽，其中毒素产气荚膜梭菌素0已被证实为该病发 病机理中的主要毒力因素。
[0087] 本发明的化合物对于治疗由炭疽杆菌引起的感染是有用的，其中胆固醇依赖性溶 细胞素，炭疽杆菌溶细胞素〇(ALO)在胃肠(GI)炭疽中发挥必要作用，并且有助于吸入性炭 疽的发病。
[0088] 本发明的化合物对于治疗由产生胆固醇依赖性溶细胞素的革兰氏阳性菌引起的 其他疾病是有用的，其实例包括但不限于：
[0089] 由产生在猪链球菌病的发病机理中涉及的胆固醇依赖性溶细胞素，猪链球菌溶血 素的猪链球菌引起的猪脑膜炎、败血症/菌血症和感染性休克。
[0090] 由单核细胞增生性李斯特菌引起的脑炎、肠炎、脑膜炎、败血症/菌血症和肺炎，其 中胆固醇依赖性溶细胞素，李斯特菌溶胞素0(LL0)在上述疾病的发病机理中发挥重要作 用。
[0091] 本发明的化合物对抑制其他细菌性成孔毒素如RTX家族的毒素也很可能是有用 的，RTX家族的毒素在其宿主的毒力中是必要的。实例包括但不限于，由产生成孔毒素葡萄 球菌性α溶血作用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的肺炎和败血症/菌血 症，以及由产生成孔毒素 α溶血素的致病性大肠杆菌(Escherichia coli)引起的腹膜炎。 [0092]因此，本发明提供了：
[0093] -用于治疗由产生成孔毒素的细菌引起的细菌感染的本发明的化合物，其中所述 细菌感染由链球菌属（Streptococcus spp.)(例如，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)、A链球菌群（Group A Streptococci)或猪链球菌（Streptococcus suis))、梭 菌属(Clostridium spp.)(例如，产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens))、李斯特菌属 (Listeria spp.)(例如，单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes))或芽孢杆 菌属(Bacillus spp.)(例如，炭疽杆菌(Bacillus anthracis));
[0094] -用于治疗由肺炎链球菌引起的细菌感染的本发明的化合物；
[0095]-用于治疗肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、肺炎球菌性败血症/菌血症、肺炎 球菌性角膜炎或肺炎球菌性中耳炎的本发明的化合物;和
[0096] -用于治疗选自以下的、由除了肺炎球菌以外的细菌引起的病症的本发明的化合 物:气性坏疽、胃肠炭疽、吸入性炭疽、猪脑膜炎、脑炎、败血症/菌血症和肺炎。
[0097] 本发明的化合物可以用于治疗人或动物，如驯养动物(domestic animal)或家畜 (livestock)，例如，猪、牛、绵羊、马等，并且药物组合物的引用应解释为覆盖适于人或动物 使用的组合物。
[0098] 因此，在另一方面，本发明提供了用于治疗上述病症的本发明的化合物。
[0099] 在再一方面，本发明提供了用于制备治疗上述病症的药物的本发明的化合物。
[0100] 在又一方面，本发明提供了治疗上述病症的方法，其包括将有效量的本发明的化 合物或其药物组合物给药于有需要的受试者。
[0101]术语"治疗"意图包括预防以及治疗性治疗。
[0102]本发明的化合物可以单独使用或与另外的治疗活性成分联合使用。因此，本发明 的化合物可以与另外的治疗活性成分在相同的制剂中一起、或在单独的制剂中并通过相同 或不同的给药途径，同时、顺序或单独地联合给药。因此，本发明的化合物可以与适于治疗 上述病症的一种或多种其他活性成分联合给药。例如，用于治疗的可能组合包括与抗微生 物剂，例如，抗生素试剂，包括天然、合成和半合成抗微生物剂的组合。抗生素试剂的实例包 括:内酰胺类，包括但不限于青霉素、苄青霉素、阿莫西林及其所有代的产品；与内酰胺 酶抑制剂组合的内酰胺类，包括但不限于，克拉维酸和舒巴坦;头孢菌素类，包括但不限 于，头孢呋辛、头孢噻肟和头孢曲松;氟喹诺酮类，包括但不限于，左氧氟沙星和莫西沙星； 四环素类，包括但不限于，多西环素；大环内酯类，包括但不限于，红霉素和克拉霉素；脂肽 抗生素，包括但不限于，达托霉素;氨基糖甙类，包括但不限于，卡那霉素和庆大霉素;糖肽 抗生素，包括但不限于，万古霉素;林可酰胺类，包括但不限于，克林霉素和林可霉素;利福 霉素类，包括但不限于，利福平;和氯霉素。
[0103] 另外的组合包括与免疫调节剂如抗炎剂的组合。
[0104] 免疫调节剂可以包括，例如通过刺激或抑制免疫系统细胞，例如T细胞、B细胞、巨 噬细胞或抗原呈递细胞的细胞活性直接或间接地作用于免疫系统的试剂;或通过作用于免 疫系统外面的组分例如激素、受体激动剂或拮抗剂以及神经递质，进而刺激、抑制或调解免 疫系统的试剂，其他免疫调节剂可以包括免疫抑制剂或免疫刺激剂。抗炎剂包括，例如治疗 炎症反应、损伤的组织反应的试剂，治疗免疫系统、血管系统或淋巴系统或其组合的试剂。 抗炎剂和免疫调节剂的实例包括但不限于:干扰素衍生物如重组干扰素 β-lMbetaseron)、 β干扰素，前列腺(prostane)衍生物如伊洛前列素和西卡前列素，皮质类固醇如强的松龙、 甲基强的松龙、地塞米松和氟替卡松，⑶X2抑制剂，免疫抑制剂如环孢霉素 A、FK-506、8-甲 氧基补骨脂素、沙利度胺、柳氮磺胺吡啶、咪唑硫嘌呤和氨甲喋呤，脂氧合酶抑制剂，白三烯 拮抗剂，肽衍生物如ACTH及类似物，可溶性TNF (肿瘤坏死因子)受体，TNF抗体，白细胞介素 的可溶性受体，其他细胞因子和T细胞蛋白质，抗白细胞介素受体的抗体，其他细胞因子和T 细胞蛋白质。另外的抗炎剂包括非留体抗炎药(NSAID ' s) ASAID ' s的实例包括色甘酸钠、奈 多罗米钠、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂如茶碱，PDE4抑制剂或混合的TOE3/PDE4抑制剂，白三烯 拮抗剂，白三烯合成抑制剂如孟鲁司特，iNOS抑制剂，类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂，β-2 整合素拮抗剂以及腺苷受体激动剂或拮抗剂如腺苷2a激动剂，细胞因子拮抗剂如趋化因子 拮抗剂，如CCR3拮抗剂，或细胞因子合成抑制剂，以及5-脂氧合酶抑制剂。
[0105] 因此，本发明的一方面提供了与一种或多种另外的活性成分，例如，上述活性成分 中的一种或多种组合的本发明的化合物。
[0106] 本发明的另一方面提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的化合物，所述 化合物任选地与一种或多种药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体，并且包含一种或多种其 他治疗活性成分。
[0107] 类似地，本发明的另一方面提供了组合产品，其包含：
[0108] (A)本发明的化合物;和
[0109] (B)另一种治疗剂，
[0110] 其中组分(A)和(B)中的每一种与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合配制。
[0111] 在本发明的该方面，所述组合产品可以是单独(组合)药物制剂或成套试剂盒。
[0112] 因此，本发明的该方面包括药物制剂，该药物制剂包含与药学上可接受的佐剂、稀 释剂或载体混合的本发明的化合物和另一种治疗剂(其中所述制剂以下称为"组合制剂"）。
[0113] 本发明其还包括成套试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
[0114] (i)药物制剂，其包含与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的本发明的化合 物;和
[0115] (ii)药物制剂，其包含与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的另一种治疗 剂；
[0116] 其中组分（i)和（ii)各自以适合于与另一种组分组合给药的形式提供。
[0117]成套试剂盒的组分（i)因此是与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的上述 组分(A)。类似地，组分（ii)是与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的上述组分(B)。
[0118] 其他治疗剂（即上述组分(B))可以是，例如，上述任何试剂，如抗微生物剂或免疫 调节剂。
[0119] 本发明的该方面的组合产品（组合制剂或成套试剂盒)可以用于治疗或预防任何 上述病症。
[0120] 本发明的化合物也可以与一种或多种另外的活性成分组合提供，与例如使用说明 书一起使用。
[0121] 因此，本发明的再一方面提供了与一种或多种另外的活性成分，例如与上述活性 成分中的一种或多种组合使用的本发明的化合物。
[0122] 本发明的化合物在本发明的该方面的使用可以用于治疗或预防上述任何病症。
[0123] 现将通过参考以下实施例来描述本发明，所述实施例用于说明目的并且不应解释 为本发明范围的限制。
[0124] 实施例
[0125] 缩略语
[0126] AcOH 冰醋酸
[0127] aq. 含水的
[0128] Bn 苄基
[0129] Br 宽的
[0130] Boc 叔丁氧羰基
[0131] C0PD 慢性阻塞性肺病
[0132] d 双峰
[0133] DCM 二氯甲烷
[0134] DIPEA N，N-二异丙基乙胺
[0135] DMAP 4-二甲氨基吡啶
[0136] DMF N，N-二甲基甲酰胺
[0137] DMS0 二甲亚砜
[0138] EDC 1_乙基_3_(3_二甲氛基丙基)碳二亚胺
[0139] EtOAc 乙酸乙酯
[0140] h 小时(或多个小时）
[0141] HATU Ν,Ν,Υ ,Υ-四甲基-0-(7-偶氮苯并三唑-1-基)脲PF6
[0142] HPLC 高效液相色谱法
[0143] m 多重峰
[0144] MeCN 乙腈
[0145] MeOH 甲醇
[0146] min 分钟(或多分钟）
[0147] NMR 核磁共振
[0148] PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0149] quin.五重峰
[0150] RT 室温
[0151] s 单峰
[0152] sat.饱和的
[0153] SAX 固体支持的强阳离子交换树脂
[0154] sept.七重峰
[0155] sext.六重峰
[0156] t 三重峰
[0157] TFAA 三氟乙酸酐
[0158] THF 四氢呋喃 [0159] UV 紫外线
[0160] -般过程
[0161 ]所有的起始材料和溶剂均从商业来源获得或根据文献条件制备。
[0162] 氢化在Thales H-cube流动反应器上进行或使用催化剂的悬液在氢气球下进行。
[0163] 柱色谱在预装填二氧化硅(230-400目，40_63μπι)柱筒上进行。
[0164] 用于溶解性和稳定性研究的PBS溶液通过将1片Oxoid?(得自Thermo Scientific) 溶解于去离子水(lOOmL)中来制备。
[0165] 稳定性研究通过如下方式来进行，即：将l-2mg的化合物溶解于DMSO(lmL)中，然后 将0.4mL所生成的溶液加入在37.5°C下搅拌的PBS溶液(9.6mL)中。立即取样(大约0.5mL)进 行HPLC分析。然后在此后的各个时间点取另外的样品进行分析。由化合物的浓度相对于时 间的减少来确定半衰期。
[0166]分析方法
[0167] 分析HPLC使用Agilent Zorbax Extend C18，Rapid Resolution HT 1 ·8μηι柱进 行，该柱使用5-95 %梯度的在0.1 %甲酸水溶液中的0.1 %甲酸的MeCN溶液或5-95%梯度的 在50mM乙酸铵水溶液中的MeCN进行洗脱。可选择地，使用Waters Xselect CSH C18 3.5μηι 柱进行，该柱使用5-95 %梯度的在0.1 %甲酸水溶液中的0.1 %甲酸的MeCN溶液洗脱。在 Agilent 1100系统上使用二极管阵列或可变波长检测器测量洗脱峰的紫外光谱。
[0168] 分析LCMS使用Agilent Zorbax Extend C18，Rapid Resolution HT 1 ·8μηι柱进 行，该柱使用5-95 %梯度的在0.1 %甲酸水溶液中的0.1 %甲酸的MeCN溶液或5-95%梯度的 在50mM乙酸铵水溶液中的MeCN进行洗脱。供选择地，使用Waters Xselect CSH C18 3.5μηι 柱进行，该柱使用5-95%梯度的在0.1 %甲酸水溶液中的0.1 %甲酸的MeCN溶液进行洗脱。 在具有使用正负离子电喷雾的6120四极质谱仪的Agilent 1100上或Agilent Infinity 1260LC上，使用可变波长检测器测量洗脱峰的紫外光谱和质谱。
[0169] 4 NMR光谱法：
[0170] 匪R光谱使用Bruker Avance III 400MHz仪器记录，以残留未氖化溶剂或四甲基 硅烷作为参比。
[0171]化学合成：
[0172] 本发明的化合物使用以下一般方法制备：
[0173] 实施例A1:(3,4-二羟基4-(4-甲氧基苯基）-1H-吡咯-2,5-二基）双（（4-甲基哌 嗪-1-基）甲酮）（UL7_001)
[0174]
[0175] 步骤(i):2,2'-((4_甲氧基苯基)氮烷二基)二乙酸二乙酯（1)
[0176] 将2-溴乙酸乙酯（146mL，1.30mol)逐滴加入搅拌的4-甲氧基苯胺（75.0g， 0.6lOmol)和DIPEA(265mL，1.50mol)的MeCN(300mL)溶液中。反应混合物在60°C下搅拌16h， 然后分配在2M HCl(aq.)(500mL)和Et0Ac(300mL)之间，水相使用Et0Ac(300mL)萃取，并且合 并的有机物依次使用2M HC1 (aq.) (2 X 300mL)、水(500mL)和盐水(500mL)清洗，干燥(MgS〇4)， 过滤并在真空中去除溶剂，以得到紫色油2,2'-((4_甲氧基苯基)氮烷二基)二乙酸二乙酯 (l)(180g, 100% ):m/z 296(1+10 + ^5+)0? NMR(400MHz,ΟΧη3)δ:6.82-6.78(m，2H),6.64-6.59(m,2H),4.19(q ,J = 7.1Hz,4H),4.10(s,4H),3.74(s,3H),1.27(t ,J = 7.1Hz,6H)〇
[0177] 步骤(ii): 3，4-二羟基-1 _(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2，5-二甲酸二乙酯(2)
[0178] 将草酸二乙酯(83.0mL，0.610mol)逐滴加入搅拌的2,2'-((4-甲氧基苯基)氮烷二 基）二乙酸二乙酯（1) (180g，0 · 61 Omo 1)的NaOEt (2 lwt % 的EtOH 溶液）（506mL，1 · 30mo 1)溶液 中，混合物在1 〇〇°C下搅拌lh。使用乙酸（21 OmL，3.70mo 1)使反应猝灭并将所生成的悬浮液 倒入冰水（1L)中，所生成的灰白色固体通过真空过滤收集。从热Et0H(3.50L)中重结晶粗产 物，以得到白色固体3,4-二羟基-1-(4-甲氧基苯基）-1Η-吡咯-2,5-二甲酸二乙酯（2) (152g，71%):m/z 350(]?+!〇 + "5+)。348(]\1-!〇 -(ES-)</H NMR(400MHz，DMS0-d6)S:8.64(s， 2H)，7.13-7.01(m，2H)，6.92-6.81(m，2H)，3.99(q，J = 7.1Hz，4H)，3.78(s，3H)，0.99(t，J = 7.1Hz，6H)〇
[0179] 步骤(iii):3,4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-lH_吡咯-2,5_二甲酸二乙酯(3)
[0180] 将苄基溴(42.6mL，358mmol)逐滴加入搅拌的3，4_二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2，5-二甲酸(2) (50 · 0g，143mmol)和K2CO3(49 · 5g，358mmol)的DMF( 1L)溶液中，反应混 合物在60°C下搅拌4h。在冷却至室温之后，将反应混合物倒入醚(500mL)中并使用盐水(3 X 250mL)清洗，干燥(MgS〇4)，过滤并在真空中浓缩，以提供亮黄色固体。粗产物使用异己烷磨 碎，以得到白色固体3，4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2，5_二甲酸二乙酯(3) (64.8g，85%):m/z 530(Μ+Η) + (Ε5+)</Η NMR(400MHz，DMS〇-d6)S :7.48-7 ·29(ι?，10H) ,7.17-7.09(m，2H),6.95-6.87(m，2H)，5.09(s，4H)，3.99(q，J=7.1Hz，4H)，3.80(s，3H)，0.99(t，J = 7.1Hz,6H)〇
[0181] 步骤(iv) :(3,4-双(苄氧基)4-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2，5-二基)双（（4-甲基 哌嗪-1-基）甲酮）（4)
[0182] 向0°C的搅拌的3,4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2,5_二甲酸二乙酯 (3)(2.368,4.46臟〇1)和1-甲基哌嗪（2.471^，22.3臟〇1)的1'册(501^)溶液中加入异丙基氯 化镁（11. lmL，22.3mmol)。使反应混合物温热至室温并搅拌2h。使用NH4CI (aq.) (10mL)使反应 混合物猝灭并使用盐水(50mL)清洗，然后使用NaHC03(aq.)(50mL)清洗。干燥(MgS〇4)有机层， 过滤并在真空中浓缩。使用二乙醚(50mL)将残渣磨碎并过滤所生成的固体，用二乙醚冲洗， 以提供灰白色固体(3，4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2，5_二基)双（（4-甲基 哌嗪-1-基）甲酮）（4)(2.02g, 69% ) :m/z 638(1+11) + ^5+)0? 匪R(400MHz，DMS0-d6)S: 7.41-7.30(m,10H),7.03-6.98(m,2H),6.97-6.92(m,2H),5.00(s,4H),3.76(s,3H),3.42-3.26(br m,4H),3.20-3.06(br m,4H),2.16-1,84(br m,14H)〇
[0183] 步骤(v) :(3,4-二羟基4-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2,5-二基)双（（4-甲基哌嗪-1-基）甲酮）（UL7_001)
[0184] 使(3，4-双(苄氧基)4-(4-甲氧基苯基)- 1H-吡咯-2，5-二基)双（（4-甲基哌嗪-1-基）甲酮）（4)(2.018,3.16111111〇1)的甲醇（5011^)溶液在!1-(：油6(10%?(1/(：，55\4臟，全氢，40 °〇，111117 1^11)中氢化并在真空中浓缩，以提供黄色固体(3,4-二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-111-吡咯-2,5-二基)双（（4-甲基哌嗪-1-基）甲酮）（皿7-001)(1.42 8,96%):111/2 458(]\1+!〇 + (ES^o^ NMR(400MHz,DMS0-d6)5：8.44(s,2H),6.96-6.84(m,4H),3.74(s,3H),3.46-3.28 (br m,8H),2.23-2.07(br m,14H)〇
[0185] 实施例A2: (3,4-二羟基-1-(4-甲氧基苯基）-lH_吡咯-2,5-二基）双（（4-甲基哌 嗪-1-基）甲酮）（UL7-001)的供选择的潜在合成
[0186]
[0187] 实施例b: 1-(4-甲氧基苯基)-2,5-双(4-甲基哌嗪-1-羰基)-1Η-吡咯-3，4-二基双 (2-甲基丙酸酯)二盐酸化物(UL7-002)
[0188]
[ui?9j 步骤u) :H4-中氧垂本垂
中垂哪μ奈-_L-規垂一垂双 (2-甲基丙酸酯)二盐酸化物(UL7-002)
[0190] 向0°C的（3，4-二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2，5-二基)双（（4-甲基哌嗪- 1-基）甲酮）（UL7-001) (1.25g，2.73mmol)和2-叔丁基亚氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基全 氢-1，3，2-二氮杂磷(聚合物键合型，2.2mmol/g) (3.73g，8.20mmol)的 DCM( 20mL)溶液 / 悬浮 液中，加入异丁酰氯(0.716mL，6.83mmol)。使混合物温热至室温并摇动30分钟，之后过滤， 用DCM清洗，滤液在真空中浓缩。将残渣溶解于DCM(4mL)中并逐滴加入盐酸（1.37mL， 5.46mmo 1)(在4M1，4-二噁烷中）。搅拌混合物20分钟，然后在真空中干燥。残渣使用二乙醚 (10mL)磨碎。过滤生成的固体，使用二乙醚冲洗，并在真空中干燥，以提供灰白色固体1-(4-甲氧基苯基)-2,5_双(4-甲基哌嗪-1-羰基)-1Η-吡咯-3,4-二基双（2-甲基丙酸酯）二盐酸 化物（UL7-002)(0.408g，22%):m/z 598(1+10 + ^5+)0? NMR(400MHz，D2〇)S:7.39-3.30(br m,2H),7.27-7.18(br m,2H),4.60-4.36(br m,2H),4.03-3.78(br m,5H),3.68-3.29(br m，6H)，3.22-2.60(br m，14H), 1.28((1,J = 7.0Hz，12H)。
[0191 ]表1中的以下化合物使用以上提供的方法制备：
[0192] 表1
[0193]
[0194] 生物测试
[0195] 以下提供了使用本发明的化合物进行的生物测定的概要。
[0196] A.体外初级测定:肺炎球菌溶血素的溶血活性的抑制
[0197] 基本原理
[0198] 该测定的基础是，当肺炎球菌溶血素加入红细胞时，其诱导红细胞溶解并导致血 红蛋白的释放。在抑制性化合物的存在下，肺炎球菌溶血素诱导的溶解消除，微滴定板孔底 部的红细胞沉淀和上清液清澈。然而，如果化合物不是抑制性的，则红细胞溶解，血红蛋白 释放到上清液中。
[0199] 实验过程
[0200] 测试化合物溶液(通常以在DMS0中5mM)用100%DMS0 1:1稀释。然后用100%DMS0 将化合物2倍系列稀释到96孔圆底微滴定板的11个孔中。然后，向所有孔中加入PBS以实现 将化合物用PBS以1:10稀释。然后以等于其LD100的浓度加入肺炎球菌溶血素。随后使板在 37°C下孵育30-40分钟。在孵育时间之后，向每个孔中加入等体积的4% (v/v)绵羊红细胞悬 液，并且在37°C下再次孵育所述板30分钟。根据相同的过程制备仅有红细胞的PBS溶液(对 于没有溶解的对照)或红细胞加肺炎球菌溶血素(对于溶解的对照）。在与红细胞孵育之后， 测量每个孔在595nm下的吸光度，数据用于确定每种测试化合物的IC 5Q(JC5Q值使用非线性 回归曲线拟合确定。为此，将测试化合物的浓度的Log相对于抑制百分比作图，由A 595值进行 估计，然后将Hi 11 Slope拟合到数据。
[0201 ] 结果
[0202]该测定对于确定母体活性化合物UL7-001的抑制性活性是主要相关的。一般地，在 前药的情况下，由于前药需要存在血浆酶来水解前药部分并使得形成母体活性化合物，因 此预期抑制活性在体外不存在。然而，在我们的体外初级测定中，血液是测定的组分并用于 评估由肺炎球菌溶血素诱导的溶血的抑制。因此，我们观察了在前药UL7-002存在下的一些 抑制活性，这是因为在血液中孵育40分钟期间发生的一定程度的前药部分的酶裂解，导致 母体活性化合物UL7-001的释放。总之，该测定证实了母体活性化合物UL7-001的体外活性 并表明了在血液存在下前药转化为母体活性化合物。向母体活性化合物的转化在F小节中 进一步证实。
[0203] 表1中显示的实施例的IC5Q值如下：母体活性化合物UL7-001:IC5Q 0.3μΜ;前药 UL7-〇02:IC5〇6.8yM。
[0204] B.用于确定适于静脉内给药的制剂的溶解性和化学稳定性测试
[0205] 基本原理
[0206]非胃肠递送是本发明化合物的一个优选给药途径。因此，前药UL7-002设计为改进 母体活性化合物UL7-001在含水缓冲液中的溶解性和化学稳定性，以获得容易溶解的制剂， 该制剂与静脉内给药相容，且具有在安全盐水溶液中、在高浓度下以及在床侧可以复原的 增强的化学稳定性。
[0207]实验过程 [0208]-溶解性测试
[0209] 通过向小瓶中充填5-10mg化合物，然后加入roS溶液以实现100mg/ml的浓度进行 溶解性研究。如果未观察到溶解，则将溶液连续稀释到50mg/ml、25mg/ml和4mg/ml的浓度， 直到观察到完全溶解。
[0210] -化学稳定性评估
[0211] 稳定性研究通过在37.5°C下将l_2mg化合物溶解于DMS0(lml)中，然后将0.4ml所 生成的溶液加入搅拌的PBS(9.6ml)来进行。立即取样(~0.5ml)进行HPLC分析。然后在此后 多个时间点取另外的样品进行分析。由化合物的浓度相对于时间的减少确定半衰期。
[0212] 结果
[0213] 用实施例UL7-001和UL7-002获得的制剂显示于表2。两种化合物被证实在与以希 望浓度的安全静脉内给药相容的含水制剂中容易溶解。此外，前药UL7-002在含水制剂中， 相对于母体活性化合物UL7-001表现出改进的化学稳定性，t 1/2为47h。
[0214] 表2本发明的化合物的制剂的特性
[0215]
[0216] *PBS:磷酸盐缓冲盐水
[0217] C.体外次级测定:肺炎球菌溶血素诱导的乳酸脱氢酶释放的抑制
[0218] 基本原理
[0219]肺炎球菌溶血素诱导乳酸脱氢酶(LDH)从人单核细胞和肺上皮细胞的释放:指示 血衆膜损伤或破坏的现象[Infect. Immun. (2002)70 1017-1022] IDH测定可以用于证实公 开化合物抑制肺炎球菌溶血素对培养中的人肺上皮细胞的细胞毒性作用的能力。使用该测 定可以提供关于以下的两条主要的信息片段，（1)活性，用于证实从暴露于抑制性化合物存 在下的肺炎球菌溶血素的细胞中释放的LDH相对于从单独暴露于肺炎球菌溶血素的LDH释 放的抑制；（2)化合物毒性，测定形式设计为使得在对照孔内，测试从仅暴露于化合物的细 胞中释放的LDH。
[0220] 实验过程
[0221]将人肺上皮细胞(A549)接种在平底96孔组织培养板中并在补充谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中，在37°C下，5 % C02中生长24h。在使用前，用PBS清洗细胞。如在A小节中所述， 使测试化合物稀释液与肺炎球菌溶血素孵育，然后转移到含有人肺上皮细胞的孔中并在37 °C下，5%C0 2中孵育板30分钟。在板上包括以下对照：⑴阴性对照，称为低对照(仅PBS)，用 于测定LDH从培养的细胞中的自然释放，⑵阳性对照（1 % (v/v)Triton-X的PBS溶液），用于 测定LDH从细胞中的最大释放，（3)仅肺炎球菌溶血素溶液，用于测定肺炎球菌溶血素诱导 的LDH释放，（4)测试化合物溶液，用于评估单独化合物的毒性。在孵育之后，将上清液转移 到含有根据制造商的说明制备的二倍体积的乳酸脱氢酶测定混合物(T0X7，Sigma)的圆底 96孔微滴定板中。在不透光室内，室温下孵育5-10分钟之后，向所有孔中加入IN HC1。然后 测量在490nm和655nm下的吸光度。在测试化合物的存在和不存在下由肺炎球菌溶血素诱导 的LDH释放的百分比相对于化合物浓度的Log作图，并且如以上在A小节中的溶血测定抑制 中所述，确定IC50。
[0222] D.体外测定:肺炎球菌溶血素对培养的室管膜细胞的纤毛功能作用的抑制
[0223] 基本原理
[0224] 脑的大脑室和脊髓的中央管的室管膜纤毛细胞系覆盖有使脑脊液(CSF)在中枢神 经系统周围循环的纤毛。该层充当往返脑脊液的选择性脑屏障并在控制CSF体积方面发挥 作用。为了研究抑制剂是否阻止在室管膜层上由肺炎球菌溶血素引起的损伤，可以使用脑 膜炎的大鼠体外模型。该模型基于培养和分化来自新生大鼠脑的有纤毛室管膜细胞，该培 养和分化再创造其中使脑室内衬细胞暴露于肺炎链球菌及其毒性产物的体内环境。
[0225] 脑膜炎体外模型的使用构成了预测化合物阻止肺炎球菌溶血素引起体内损伤的 能力的强有力手段。
[0226] 实验过程
[0227] 室管膜细胞培养物通过先前所述的方法制备[1丨(^013.?&让(^.(1999)丑303-309]。组织培养盘用牛纤连蛋白涂覆，并且在使用前在5%(v/v)C0 2中、于37°C下孵育2小 时。生长培养基是添加青霉素（100 IU/mL)、链霉素（100yg/mL)、两性霉素 B (2.5yg/mL)、BSA (5yg/mL)、胰岛素(5μg/ml)、转铁蛋白（10yg/mL)和硒(5yg/mL)的极限必需培养基(MEM)。新 生(0-1日龄)大鼠通过颈脱位法杀死，并将其脑去除。小脑连同左右皮质半球和额皮质的边 缘区域一起去除。剩余的脑区域机械地离解在4mL生长培养基中。将来自一个或两个脑的离 解组织加入组织培养盘的孔(500μ1/孔）中，每个孔包含2.5mL生长培养基。细胞随后在5% (v/v)C0 2中、于37°C下孵育。培养基在三天之后用2mL补充凝血酶的新鲜生长培养基替换并 在此后每隔一天用2mL补充凝血酶的新鲜生长培养基喂养室管膜细胞。
[0228] 在大约两周之后，细胞完全有纤毛并准备实验。为了进行实验，用lmL包含25mM HEPES的培养基(pH 7.4)替换生长培养基。组织培养盘放置在围绕倒置光学显微镜台，恒温 控制的孵育室内侧。在测定培养基的温度为37°C之前使细胞培养物平衡。在这个点，使在37 °C下，lml培养基MEM中预孵育40分钟的有和没有测试化合物的重组纯化的肺炎球菌溶血素 加入包含有纤毛细胞的孔中。向对照细胞中加入lmL MEM培养基。在30min的暴露之前和之 后，用高速摄像机以500帧/s的速率记录摆动纤毛。以降低的帧速率回放记录的视频序列并 通过以下公式确定纤毛摆动频率(CBF):
[0229]
0
[0230] E.使用小鼠肺炎模型的体内有效性测定 [0231] 基本原理
[0232]该模型已经在发明人的实验室良好建立并适合于在该领域内工作的其他研究小 组。使用该模型，肺炎球菌溶血素显示为对于肺炎链球菌的发病机理及其在体内的存活是 必要的。使用该疾病模型，感染肺炎球菌溶血素(PLN-A)缺陷的肺炎链球菌突变体菌株的小 鼠表现出（1)存活率显著增加，（2)疾病体征显著延迟和衰减，以及(3)肺部炎症和少量菌血 症显著减少(细菌从肺部渗透到循环）。因此，该体内疾病模型构成了研究感染野生型肺炎 球菌(S.pneumoniae)并使用肺炎球菌溶血素抑制剂治疗的小鼠的疾病进展。存活率用作研 究的终点参数。
[0233] 实验过程:感染、治疗和疾病体征评分
[0234] 使用8周龄或更大，体重25_30g的远系繁殖MF1雌性小鼠。使动物保持在控制温度、 湿度和日长的条件下。动物自由饮用自来水并进食颗粒状食物。使用两个对照组:对照1 (感 染且未治疗的）、对照2(未感染和未治疗的）和一个治疗组(感染且治疗的）进行体内实验。 对照组1和治疗组小鼠用肺炎链球菌菌株D39经鼻感染(过程描述如下）。在完成感染之后， 确定给定剂量的活菌计数(如以下所述）。随后，每六个小时，治疗组和对照组1的动物经静 脉接收测试化合物，同时将单独赋形剂给予对照组1。基于Morton和Griff iths的方案 [Veterinary Record. (1985)111,431-436]每6小时评估疾病体征的进展(表3)。如果动物 变为2+昏睡，则被杀死并记录时间。使用时序检验比较对照组和测试组的存活率。
[0235]表3疾病体征的评分方案
[0236]
[0237] 上述可以用于肺炎链球菌感染、治疗递送和用于确定活菌计数的过程详细描述如 下：
[0238]-感染的鼻内滴注
[0239] 用2.5% (v/v)异氟烷，以1.6-1.8L 02/min轻微麻醉小鼠。有效麻醉的确认通过观 察不到足底反射来进行。通过颈背将小鼠垂直固定就位，并使其鼻子向上。然后用无菌PBS 给予感染剂量，逐滴给药到鼻孔内，使得动物在各滴之间的时间将其吸入。一旦给药完毕， 将小鼠送回其笼内，背部朝下放置以从麻醉的作用中恢复。
[0240] -治疗的静脉内给药
[0241] 在37°C下使小鼠在保温箱内放置10分钟，以扩张其静脉。然后将每只小鼠单独放 置在限制器内，使动物尾部暴露。用抗菌擦拭巾对尾部消毒。药物治疗使用小心地插入一个 尾侧静脉内的〇.5ml胰岛素注射器每6h经静脉内给药。药物新鲜制备并经静脉内给药到动 物。
[0242]-感染剂量的活菌计数的确定
[0243] 活菌计数通过Miles和Misra的方法进行[J.Hyg. (1938)逆732-749)。在圆底96孔 微滴定板中用180yL PBS系列稀释20yL样品，直到106的稀释度。将血琼脂平板分成六个区 块，每个稀释液60此平铺到单独区块上。使平板在37°C下，在C0 2气罐中孵育过夜。次日，计 数其中可看到30-3 00个菌落的区块中的菌落。菌落形成单位(CFU)/ml的浓度通过使用以下 公式确定：
[0244]
[0245] F.小鼠血浆中前药UL7-002向活性抑制剂的转化
[0246] 基本原理
[0247] 为了证实前药在血浆酶的存在下转化为母体活性化合物，将前药衍生物与小鼠血 浆在2小时的5个时间点，在37°C下孵育。然后通过LC-MS/MS分析样品以获得随时间变化出 现的活性化合物的量和随时间变化保留的前药衍生物的量。
[0248] 实验过程
[0249] 在小鼠血浆稳定性测定中以ΙΟμΜ的浓度评估本发明的前药衍生物。测试化合物用 DMS0稀释至10mM的最终储备浓度。出于测定的目的，制备的储备液进一步用DMS0稀释至400 μΜ的浓度并取5yL加入195yL的小鼠血浆(pH 7.4)中，然后在37°C下孵育。DMS0在平板中的 终浓度为2.5% (v/v)。在孵育之后0、15、30、60和120分钟，通过加入400yL包含0.55μΜ美托 洛尔和1 % (v/v)甲酸的乙腈使反应终止。然后使平板在4°C下，以3000rpm离心45分钟。将80 yL上清液转移到锥形底96孔玻璃包被的平板中。在通过LC-MS/MS分析前药衍生物和活性物 质之前加入40yL水。该测定应位于Leicester的发明人的要求，由合同研究组织Cyprotex Discovery Limited,UK进行。
[0250] 结果
[0251 ]保留的前药化合物和出现的母体活性化合物的定量进行如下：
[0252] (1)母体活性化合物使用以去活化小鼠血浆生成的6点校正曲线定量。（2)在每个 时间点保留的前药化合物的百分比由LC-MS/MS峰面积比（化合物峰面积/内标峰面积)计 算。该百分比随后用于确定前药化合物相对于在时间Omin的起始浓度（ΙΟμΜ)，在每个时间 点的浓度。前药UL7-002向其母体活性化合物UL7-001的转化显示于表4。
[0253] 结论
[0254] 表4中提供的结果清楚地表明了本发明的前药的治疗效果，该效果通过本发明的 前药在血浆中向母体活性化合物的快速转化来证实。除了治疗效果以外，UL7-002的理化性 质对于制备适于非胃肠递送的制剂是有利的。
[0255] 表 4
[0256]
[0257] 在整个说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另外要求，术语"包含 (comprise)"、和变型如"包含(comprises)"和"包含(comprising)"将被理解为意指包含规 定的整数、步骤、整数的组或步骤的组但不排除任何其他整数、步骤、整数的组或步骤的组。
[0258] 本文参考的所有专利和专利申请通过引用以其整体并入。
[0259] 由该说明书和权利要求书形成构成部分的申请可以用作关于任何随后申请的优 先权的基础。这样的随后申请的权利要求可以针对本文所述的任何特征或特征的组合。其 可以为产品、组合物、方法或用途权利要求的形式并且可以通过举例的方式包括而不限于 该权利要求。
【主权项】
1. 一种化合物，其为式(I)的化合物、或其药学上可接受的前药衍生物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。2. 根据权利要求1所述的化合物，其为前药衍生物形式。3. 根据权利要求2所述的化合物，其中，所述前药衍生物选自羧酸酯衍生物、氨基磺酸 酯衍生物、磷酸酯衍生物和氨基甲酸酯衍生物。4. 根据权利要求3所述的化合物，其中，所述前药衍生物是羧酸酯衍生物。5. 根据权利要求3或4所述的化合物，其为式(Ia)的化合物：其中，R4IPR41^-或两者独立地选自-C (O) R16、-SO2NH2、-PO (OR19)( OR2q )、-CHR26-OPO (OR19)( OR2q )和-C (0) NR17R18，其中，R26 为氢或 C1-C6 烷基，R16、R17、R18、R19 和 R2q 独立地选自： (c) C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C 6炔基、C3-Ciq环烷基、C5-Ciq环烯基、杂环基、-C 1-C3烷基-C3-Ciq环烷基、-C1-C 3烷基-C5-Ciq环烯基或-C1-C3烷基杂环基，或R 17和R18与它们连接的N-起 可以形成任选地包含选自0、S和NR25aR 25b中的另外的杂原子的5元或6元杂环，其中R25a为氢、 C1-C6烷基、-CH2-OPO(ORis) (OR2t3)或5元或6元杂环，且R25b不存在或为C1-C 6烷基;并且其中上 述R16、R17或R18基团中的任意基团可以任选地被选自以下基团中的一个或多个基团取代:氰 基、-OPO (OR19)(OR2t3 )、- (0 (CH2) z) r0R24、C1-C6 烷氧基、C1-C6 氟烷氧基、C1-C6 烷基、C1-C6 氟烷基 和-C(O)NRaRb，其中每个z可以相同或不同，表示2或3，r表示选自1至20的整数，且R 24为氢、 C1-C3烷基或-PO (OR19)( OR2q )，其中俨和妒独立地选自氢和&-(：6烷基，以及上述R16、R17或R 18 基团中的任意基团可以任选地被一个或多个卤素原子取代;和 (d) 芳基、杂芳基、C1-C3烷基芳基和-C1-C3烷基杂芳基，所述芳基和杂芳基任选地被取 代； 或R18、R19和R2t3可以独立地表示氢。6. 根据权利要求5所述的化合物，其中，1?43和1?4|3之一或两者独立地选自-(：(0)1? 16、-SO2NH2、-PO (OR19)( OR2q )和-C (0) NR17R18，其中 R16、R17、R18、R19 和 R2q 独立地选自： (a) C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C 6炔基、C3-Ciq环烷基、C5-Ciq环烯基、杂环基、-C 1-C3烷基-C3_ClQ环烷基、-Cl-C3烷基 -C5_ClQ环烯基或-Cl-C3烷基杂环基，其中上述R 16、R17或R18基团中 的任意基团可以任选地被选自氰基、C1-C6烷氧基、C1-C6氟烷氧基、C 1-C6烷基、C1-C6氟烷基 和-C(O)NRaRb中的基团取代，其中RlPRb独立地选自氢和&-〇5烷基，并且上述R 16、R17或R18基 团中的任何基团可以任选地被一个或多个卤素原子取代，和 (b)芳基、杂芳基、C1-C3烷基芳基和-C1-C3烷基杂芳基，所述芳基和杂芳基任选地被取 代； 或R18、R19和R2t3可以独立地表示氢； 并且当R4IPR4b之一独立地选自以上定义的基团时，另一个为氢。7. 根据权利要求5或6所述的化合物，其中，R4，R4bW者独立地选自-以0)1?16、-30 2順2、-PO (OR19)( OR2q )、-CHR26-OPO (OR19)( OR2q )和-C (0) NR17R18，其中 R26 为氢或 Ci-C6 烷基。8. 根据权利要求5或6所述的化合物，其中，R4lPR4b2-选自-C(0)R16、-S0 2NH2、-P0 (OR19)( OR2q )、-CHR26-OPO (OR19)( OR2q )和-C (0) NR17R18，其中 R26 为氢或 Ci-C6 烷基;并且 R4IP R4b中的另一个为氢。9. 根据权利要求5至8中任一项所述的化合物，其中，R4IPR41^-或两者独立地选自-C (O)R 16010. 根据权利要求9所述的化合物，其中，R1^C1-C6烷基或C3-C iq环烷基，其中上述基团 中的任一基团可以任选地被选自-OPO (OR19)( OR2q )和-(0 (CH2) z) r〇R24的基团取代，其中每个 z可以相同或不同，表示2或3，r表示选自1至20的整数，且R 24为氢、C1-C3烷基或-P0(0R19) (OR 2t3)，或R16是任选地被-(CHR26)q-0P0(OR 19) (OR2t3)取代的苯基，其中q表示0或1。11. 根据权利要求10所述的化合物，其中，R16是C1-C6烷基。12. 根据权利要求11所述的化合物，其中，R4IPR41^-C(O)CH(CH3) 2t313. 根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其是二盐酸盐。14. 一种药物组合物，包含根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，所述化合物任 选地与一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体组合。15. 根据权利要求14所述的药物组合物，包含一种或多种其它治疗活性成分。16. 根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其用作药物。17. 根据权利要求1至13或16中任一项所述的化合物，用于与一种或多种其他治疗活性 成分组合使用。18. 根据权利要求1至13、16或17中任一项所述的化合物，用于治疗由产生成孔毒素如 胆固醇依赖性溶细胞素的细菌引起的细菌感染。19. 根据权利要求18所述用途的化合物，其中，所述细菌感染由链球菌属 (Streptococcus spp ·)(例如，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae )、A链球菌群 (Group A Streptococci )或猪链球菌（Streptococcus suis))、梭菌属（Clostridium spp ·)(例如，产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens))、李斯特菌属（Listeria spp ·) (例如，单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes))或芽孢杆菌属(BaciIlus spp.)(例如，炭疽杆菌(Bacillus anthracis))引起D20. 根据权利要求19所述用途的化合物，用于治疗由肺炎链球菌引起的细菌感染。21. 根据权利要求20所述用途的化合物，用于治疗肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性脑膜 炎、肺炎球菌性败血症/菌血症、肺炎球菌性角膜炎或肺炎球菌性中耳炎。22. 根据权利要求18所述用途的化合物，其用于治疗选自以下的、由除了肺炎球菌以外 的细菌引起的病症:气性坏疽、胃肠炭疽、吸入性炭疽、猪脑膜炎、脑炎、败血症/菌血症和肺 炎。23. 根据权利要求16至22中任一项所述用途的化合物，其中，所述化合物与一种或多种 其他治疗活性成分(例如，一种或多种抗微生物剂或免疫调节剂)组合给药。24. -种治疗由产生成孔毒素如胆固醇依赖性溶细胞素的细菌引起的细菌感染的方 法，其包括将有效量的根据权利要求1至13、15或16中任一项所述的化合物给药于有需要的 受试者。25. -种如权利要求1中所定义的式(I)的化合物的受保护的衍生物。26. -种制备如权利要求1中所定义的式（I)化合物的方法，其包括使式（II)的化合物 或其受保护的衍生物与1-甲基哌嗪反应；以及如果需要，使所生成的化合物去保护。27. -种制备如权利要求5至13中任一项所定义的式（I a)化合物的方法，其包括使式 (I)的化合物或其受保护的衍生物与式R4aX的化合物和/或式R4bX的化合物反应，其中X为离去基团。
【专利摘要】本发明尤其提供了新颖N-苯基取代的吡咯衍生物及其在治疗中的用途，尤其是在治疗细菌(例如，肺炎球菌)感染中的用途。
【IPC分类】C07F9/09, C07D207/36
【公开号】CN105492422
【申请号】CN201480044335
【发明人】彼得·威廉·安德鲁, 马法尔达·皮雷斯·达马索, 马克·威廉·戴维斯, 弗里茨-弗里德尔·弗里克尔, 拉娜·伦内恩, 丹尼尔·哈姆扎, 西蒙·克里斯多夫·伊尔斯特
【申请人】莱斯特大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月4日
【公告号】CA2914262A1, EP3004056A1, US20160120864, WO2014195702A1
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及为溶细胞素抑制剂的化合物、其前药及其在治疗中的应用，包括在药 物组合物中的应用，尤其是在治疗细菌感染例如肺炎球菌感染中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)是最有威胁的人类病原体 之一，全世界感染超过一千万的所有年龄组的人，特别是幼儿、老年人和免疫力低下的人。 其是严重且经常致命的疾病如肺炎、菌血症和脑膜炎的主要致病病因。其也是导致其他较 轻但使人虚弱的疾病如中耳炎和角膜炎的原因。
[0003] 甚至在使用抗生素和作为抗生素佐剂的类固醇数十年之后，肺炎球菌病的死亡率 和发病率在发达国家仍然很高并且在发展中国家惊人地高。尽管抗生素杀灭肺炎球菌，但 几乎20%的住院患者仍然死亡，同时许多肺炎球菌性脑膜炎幸存者患重度神经障碍，包括 认知损害、视力和听力丧失，因此给患者及其家庭施加巨大痛苦并且是医疗保健系统的非 常重要的成本。如今，肺炎球菌感染仍然是该领域内的主导者以及包括WHO的卫生组织广泛 认可的主要的全球公共卫生问题。
[0004] 当前标准治疗未解决的始终高的死亡率和发病率的主导因素之一是由毒性肺炎 球菌产物的释放引起的毒血症，最重要的毒性肺炎球菌产物是肺炎球菌毒素溶血素。该毒 素是肺炎球菌毒力的主要参与者并且是毒血症的主要的直接和间接诱因。
[0005] 肺炎球菌溶血素属于胆固醇依赖性溶细胞素(CDC)家族，CDC结合到含有胆固醇的 膜并生成对感染的细胞具有致死和亚致死作用的大孔。在细菌中，毒素肺炎球菌溶血素是 细胞质的并且主要由肺炎球菌在其溶解之后释放。结果，在溶解性抗生素的作用下，释放大 量毒素，加重毒血症。因此，即使使用抗生素在从患者清除细菌方面是成功的，但随后的毒 素释放是有害的，并且可以致命或引起长期障碍。
[0006] 该毒血症构成国际上认可的实质未满足的医学需要。当前，主要为地塞米松的皮 质类固醇用作肺炎球菌性脑膜炎的抗生素治疗的佐剂。然而，甚至在使用地塞米松时，观察 到显著的死亡率和发病率，由于地塞米松的非特异性作用、有限的临床效果以及在一些情 况下其在增加脑膜炎中的神经元细胞凋亡中的有害作用，地塞米松的广泛使用仍然有争议 [Lancet(2002)360 211-218]。因此，目前的技术水平对于有效治疗侵袭性肺炎球菌病是不 够的。
[0007] 存在证明将肺炎球菌溶血素作为治疗靶的有效性的大量证据。在发明人的实验室 中已经证实了 ：使用小鼠肺炎模型，不产生肺炎球菌溶血素的肺炎链球菌(PLN-A)突变菌株 不再是致死的，引起大体上很少的菌血症并表现出肺部炎症严重程度的显著降低。大鼠脑 膜炎模型中获得的其他证据显示出，肺炎球菌溶血素-负性突变体感染明显不如野生型肺 炎球菌感染严重，并且没有观察到对脑的纤毛上皮的损伤以及上皮周围的细胞没有发生细 胞凋亡[J. Inf ect，（2007)55 394-399]。在豚鼠的肺炎球菌性脑膜炎中，野生型肺炎球菌诱 导重度耳蜗损伤和听力丧失，而PLN-A感染保留螺旋器完整无损[Infect. Immun. (1997)逆 4411-4418]。使用培养的有纤毛脑上皮细胞的体外模型使体内条件的再创造成为可能，其 中脑室的衬细胞暴露于肺炎链球菌中。完整无损和抗生素杀灭的野生型肺炎球菌两者均诱 导培养中的上皮细胞的损伤并显著损害纤毛摆动；使用PLN-A未观察到影响 [Infect. Immun. (2000)逆1557-1562]。抗生素溶解的肺炎球菌对培养的室管膜细胞的损 伤作用明显地是由从抗生素溶解的细菌释放的毒素肺炎球菌溶血素引起的，因为该损伤在 抗肺炎球菌溶血素抗体的存在下消除[Infect. Immun.(2004)g 6694-6698]。该发现支持 以下策略，即抗生素诱导的毒血症通过与抗肺炎球菌溶血素试剂组合来预防。
[0008] 肺炎球菌感染中肺炎球菌溶血素的显著参与以及在没有肺炎球菌溶血素存在下 疾病预后的大体改善的证据得出以下结论:肺炎球菌溶血素构成针对肺炎球菌病开发新治 疗的潜在治疗靶。之前的研究已经显示出胆固醇抑制肺炎球菌溶血素的能力[Biochem.J. (1974)@ 95-98]，然而，该抑制仅仅是由于以下的事实:胆固醇是在靶细胞膜中形成孔所 需要的肺炎球菌溶血素的天然细胞受体。胆固醇在兔角膜上的局部应用证实了在肺炎球菌 性角膜炎中的正面治疗作用[Invest .Ophtalmol.Vis. Sci.(2007)|^ 2661-2666]。这表明 肺炎球菌溶血素在肺炎球菌性角膜炎中的参与以及在其抑制之后获得的治疗益处。然而， 胆固醇不被认为是治疗肺炎球菌病的治疗试剂并且在临床上尚未用于患者。之前已经发现 另一种肺炎球菌溶血素抑制剂，蒜素(大蒜提取物中的一种组分)在体内抑制肺炎球菌溶血 素的溶血活性[Toxicon(2011)丑540-545]。该化合物是不可逆地结合到毒素的反应性硫 醇基的半胱氨酸抑制剂。抑制这样的特性的化合物由于其潜在非特异性结合于体内其他含 半胱氨酸的蛋白质上，因此作为药物候选者是不利的。
[0009] 仍有需要提供适用于治疗细菌感染的溶细胞素如肺炎球菌溶血素的抑制剂。
[0010] 国际专利申请PCT/GB2012/053022在本申请的优先权日之后公布，通过引用以其 整体并入本文中，其公开了作为溶细胞素抑制剂的N-苯基取代的吡咯衍生物，该N-苯基取 代的吡咯衍生物特异性地抑制肺炎球菌溶血素和在其各自宿主的毒力中关键的其他胆固 醇依赖性溶细胞素的直接毒性作用，包括化合物2,5_双(二甲基氨基甲酰基)-1-(4-甲氧基 苯基)-1Η-吡咯-3,4-二基双(4-((膦酰基氧基)-甲基）苯甲酸酯）。这些化合物与蒜素没有 结构相似性并且不会共价结合到毒素的反应性硫醇基上。
[0011] 本发明提供了新型N-苯基取代的吡咯溶细胞素抑制剂，其显示出例如就溶解性而 言特别有利的特性、和使其特别适于非胃肠递送的物理化学特性。本发明的化合物还阻止 由肺炎球菌溶血素以及可以假设的其他胆固醇依赖性溶细胞素诱导的宿主衍生的毒性作 用的刺激。因此，该化合物可以用作单独试剂或抗生素的佐剂，用于阻止或衰减肺炎球菌溶 血素诱导的毒性以及在例如由肺炎链球菌引起的感染过程中观察到的其抗宿主作用。
【发明内容】
[0012]根据本发明，提供了一种式⑴的化合物：
[0013]
[0014] 现共约子工κι ?安叉η、」則约m 土似j，现共约学上可接受的盐或溶剂化物。
[0015] 在另外的方面，本发明提供了用作药物的式（I)的化合物或其药学上可接受的前 药衍生物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物（以下称为本发明的化合物）。
【具体实施方式】
[0016] 本发明的化合物的前药衍生物在体内给药于受试者之后会分解，形成式（I)的活 性化合物(本文有时称为"母体活性化合物"）。本发明的化合物的前药衍生物可以具有一些 内在生物活性(例如，作为肺炎球菌溶血素抑制剂），然而其通常具有很小或没有这样的内 在活性。
[0017] 式(I)的化合物的前药衍生物包括酯前药衍生物。酯前药衍生物包括羧酸酯、氨基 磺酸酯、磷酸酯和氨基甲酸酯衍生物，优选为羧酸酯、氨基磺酸酯或磷酸酯衍生物，更优选 为羧酸酯或磷酸酯衍生物，甚至更优选为羧酸酯衍生物。
[0018] 酯前药衍生物的实例包括式(la)的化合物：
[0019]
[0022] (b)芳基、杂芳基、Q-C3烷基芳基和-Q-C3烷基杂芳基，所述芳基和杂芳基任选地 被取代；
[0023] 或R18、R19和R2。可以独立地表示氢；
[0024] 并且当R4^R4b之一独立地选自以上定义的基团时，另一个为氢。
[0025] 在1?16、1?17、1?18、1?19和1? 2()的定义范围内的苯基、芳基和杂芳基的任选取代基适合地 选自羟基；卤素;氰基;-(CHR26) q_0P0 (OR19) (0R2())，其中q表示0或1 (所述基团不被另一个含 有R19或R2()的基团取代烷氧基或心-以氟烷氧基，例如A-Cs烷氧基或&_(： 3氟烷氧基 如甲氧基、乙氧基或二氣甲氧基;Cl_C6烷基或Cl_C6氣烷基，例如，Cl_C3烷基或Cl_C3氣烷基如 甲基或三氟甲基;和-C(0)NR aRb，其中RlPRb独立地选自氢和&-〇5烷基，例如，&-C3烷基如甲 基;而且当存在两个相邻的羟基取代基时，其可以通过亚甲基连接以形成缩醛。另一种可能 的任选取代基是_SF 5。如果所述芳基和杂芳基被取代，则其可以被1、2或3个，优选地1或2 个，更优选地1个取代基取代。
[0026 ] R16、R17、R18、R19 和妒〇的 Ci-Cs 烷基、C2_C6 链烯基、C2_C6 炔基、C3-C1()环烷基、C5_C10 环 烯基、杂环基、-Cl-C3烷基-C3_ClQ环烷基、 -Cl-C3烷基-C5_ClQ环烯基、-Cl -C3烷基杂环基或杂 环基的任选取代基包括选自以下的取代基:氰基;-〇P〇(〇R19)(〇R2<))(所述基团不被另一个 含有R 19或R2()的基团取代hCi-Cs烷氧基或&-〇5氟烷氧基，例如?3烷氧基或&-(：3氟烷氧 基如甲氧基、乙氧基或二氣甲氧基;Cl_C6烷基或Cl_C6氣烷基，例如，Cl_C3烷基或Cl_C3氣烷基 如甲基或三氟甲基;和-C(0)NR aRb，其中RlPRb独立地选自氢和&-〇5烷基，例如，&-C3烷基如 甲基。基团R 5、R6和R7的任选取代基还包括一种或多种(例如，1、2或3种）卤素原子，例如，F或 C1原子(尤其是F原子）。
[0027] R16优选表示心-以烷基或C3-C1Q环烷基，其中上述基团中的任一个可以任选地被 (以及优选地被)选自-〇P〇(〇R 19)(〇R2°)和_(〇(CH2)z)r〇R 24的基团取代，其中每个z可以相同 或不同，每个z表示2或3，r表示选自1至20的整数，例如，7至12，且R 24为氢、&-C3烷基或-P0 (OR19)(OR20)〇
[0028] 可选择地，R16优选表示任选地被（以及优选地被)-(CHR26)q-0P0(0R 19)(0R2Q)取代 的苯基，其中q表示0或1。
[0029] R17优选表示&_〇5烷基，例如，甲基。R18优选表示&_〇5烷基，例如，甲基。可选择地， R17和R18与它们连接的N-起可以形成任选地包含选自0、S和NR25aR 25b的另外的杂原子的5元 或6元杂环，其中R25a为氢、&-C6烷基、-CH 2-0P0(0R19)(0R2<))或5元或6元杂环。
[0030] R19优选为氢、甲基或乙基，尤其为氢。
[0031 ] R2()优选为氢、甲基或乙基，尤其为氢。
[0032] R25a优选为氢或甲基。
[0033] R25b优选不存在。
[0034] R26优选为氢或甲基，更优选为甲基。
[0035] 在一种实施方式中，q表不0。在另一种实施方式中，q表不1。
[0036] 在一种实施方式中，R4lPR4b之一表示如上所定义的前药衍生物基团。在另一种实 施方式中，R 4lPR4b两者表示如上所定义的前药基团。
[0037] 在一种实施方式中，心和心两者独立地选自-C(0)R16、-S02NH 2、-P0(0R19)(0R2Q)、-CHR26-0P0(0R 19)(0R2Q)和-C(0)NR17R18，其中R 2 6为氢或C1-C6烷基。在进一步的实施方式中， R4mR4b2-选自-C(0)R16、-S02NH2、-P0(0R 19)(0R2<))、-CHR26-0P0(0R19)(0R 2()WP-C(0) NR1 V8，其中R26为氢或&-C6烷基;且R4lPR4b中的另一个为氢。
[0038] 胙和心之一或两者优选地独立地选自-C (0) R16。
[0039] 当前药为羧酸酯前药，例如，其中R4lPR4b之一或两者为-C(0)R16时，与C(0)部分相 邻的碳原子优选为叔或季碳原子。
[0040] 前药衍生物的具体实例包括式（la)的化合物，其中R4lPR4b之一或两者独立地选 自-SO2NH2、-P0(OH) 2、-CH2-PO (OH) 2、-P0(OEt) 2、-CON-(4-N-哌啶基-哌啶）、-⑶叔丁基、-C0 异丙基、-CON- (N-甲基）哌嗪、-C0N-哌嗪、-CON (CH3) 2、COCH3、-CO- (CH2) 2-0Me、-CO (CH2) 2_ (0 (CH2)2)POMe (其中p为1至12)、-C0-CMe2-CH2-(0(CH2)3)P0Me (其中p为1至12)、-C0-CMe2-CH2-(0(CH2)2) p0-P0(0H)2(其中p为1 至12)、-⑶-CMe2-CH2-(0(CH2)2) P0-P0(0H)2(其中p为1至 12)、-⑶-(4-膦酰氧基甲苯)和-C0-(4-膦酰氧基甲基环己烷）；其中当仅炉和心之一表示 如上所定义的前药衍生物基团时，R 4lPR4b*的另一个为氢。前药衍生物的一组具体实例包 括式（la)的化合物，其中R 4lPR4b独立地选自-S02NH2、-P0(0H) 2、-⑶N-(4-N-哌啶基-哌 啶）、-C0叔丁基、-C0异丙基、-CON-(N-甲基）哌嗪、-C0N( CH3)2和C0CH3 〇
[0041] 可能提及的式（la)的特定前药是1-(4-甲氧基苯基)-2,5_双(4-甲基哌嗪-1-羰 基MH-吡咯-3,4-二基双（2-甲基丙酸酯），即式（1 &)的化合物，其中1^和1?4|3为-(：(0)〇1 (CH3) 2;或其盐或溶剂化物，例如，其二盐酸盐。
[0042] 虽然以上针对每个变量分别一般地列出了每个变量的优选基团，但本发明的优选 化合物包括其中式(la)中的几个或每个变量选自每个变量的优选、更优选或特别地列出的 基团的那些。因此，本发明意在包括优选、更优选或特别地列出的基团的所有组合。
[0043]本发明的化合物的分子量优选为小于2000,更优选为小于1000,甚至更优选为小 于800,例如小于600。
[0044]本发明的化合物的盐的实例包括由药学上可接受的无毒性碱或酸制备的所有药 学上可接受的盐。衍生自碱的盐包括，例如，钾和钠盐等。衍生自酸的盐包括衍生自无机和 有机酸，例如，盐酸、甲基磺酸、硫酸和对甲苯磺酸等的那些盐。
[0045] 本发明的化合物的溶剂化物的实例包括水合物。
[0046] 本文所述的化合物包括一个或多个手性中心，并且公开内容扩展至包括由其产生 的外消旋物、对映异构体和立体异构体。在一种实施方式中，一种对映异构体形式以基本上 不含相对应的对映异构体形式的基本上纯的形式存在。
[0047] 本发明还扩展至所有多晶形式的本发明的化合物。
[0048] 本发明还扩展至同位素标记的本发明的化合物，其中一个或多个原子被原子质量 或质量数不同于自然界中最常见的原子质量或质量数的原子取代。可以掺入到本发明的化 合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮和磷的同位素，如1 3!1、11(：、14(：、1力、3￥和 3￥。同位素 标记的式（I)的化合物可以通过进行以下所述的合成方法并用同位素标记的试剂或中间体 取代非同位素标记的试剂或中间体来制备。
[0049]本发明扩展至本文说明的所有互变异构形式的化合物(特别是烯醇-酮基互变异 构体)。
[0050] 本发明的化合物可以如实施例和以下一般方法中所述进行制备。
[0051] 式（I)的化合物可以通过如下步骤来制备:使式（II)的化合物或其受保护的衍生 物与1-甲基哌嗪反应，以及
[0052]
[0053] 如果需要，使所生成的化合物去保护。该反应可以，例如，在异丙基氯化镁的存在 下且在溶剂如THF中进行。
[0054] 用于制备式（la)的化合物的方法显示于以下方案A中，其中R4lPR4b之一或两者表 示除了氢以外的基团：
[0055]
[0056]方案 A
[0057] 其中，当与适合的偶联剂如：1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺）（EDC)、N，-二异丙基碳二亚胺(DIC)或1，Γ-羰基二咪唑(CDI)组合使用时，X是离去基团，例如，卤素、 酯(-0C0R'，提供混合的酸酐)或氢。适当地，X是卤素。
[0058] 根据使用的摩尔过量的试剂(或多种试剂），可以使方案A适合于将一个或两个羟 基转化为0R41P/或〇R 4b。当R4lPR4b不同时，可能有必要使用保护策略，先引入一个基团，然 后引入另个基团。
[0059] 因此，根据本发明的进一步的方面，提供了用于制备式（la)的化合物的方法，其包 括使式(I)的化合物或其受保护的衍生物与式R 4aX的化合物和/或式R4bX的化合物反应，
[0060]
[0061 ]其中X独立地为离去基团，如以上所提及的离去基团。
[0062]任何新的中间体，如以上定义的那些中间体，可以用于本发明的化合物的合成中， 因此也包括在本发明的范围内。
[0063] 因此，根据本发明的进一步的方面，提供了式（I)的化合物的受保护的衍生物，例 如，化合物(3，4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2,5-二基)双（（4-甲基哌嗪-1-基）甲酮）。
[0064] 在本发明的化合物的合成过程中，可能需要保护基来保护化学上敏感的基团，以 确保该方法是有效的。因此，如果需要或必要，可以通过使用常规的保护基来保护中间体化 合物。保护基和用于去除保护基的手段描述于由John Wiley&Sons Inc出版的Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts的"有机合成中的保护基（Protective Groups in Organic Synthesis)" ；4th Rev Ed.，2006，ISBN-10:0471697540中。
[0065]如上所表明的，本发明的化合物对于治疗由产生成孔毒素(pore-forming toxin) 如胆固醇依赖性溶细胞素的细菌引起的细菌感染是有用的。
[0066] 特别地，本发明的化合物对于治疗与细菌感染相关的毒血症是有用的。
[0067] 对于这样的使用，本发明的化合物一般会以药物组合物的形式给药。
[0068] 另外，本发明提供了包含本发明的化合物，所述化合物任选地与一种或多种药学 上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。
[0069] 稀释剂和载体可以包括适于非胃肠给药、口服给药、局部给药、粘膜给药和直肠给 药的那些。
[0070] 如以上所提及的，这样的组合物可以制备用于例如以下给药方式:非胃肠给药、皮 下给药、肌内给药、静脉内给药、关节内给药或关节周围给药，特别地为液体溶液或悬液的 形式；口服给药，特别地为片剂或胶囊剂的形式;局部给药，例如，玻璃体内给药、肺部给药 或鼻腔给药，特别地为滴眼剂、粉剂、滴鼻剂或气溶胶的形式，和透皮给药;粘膜给药，例如， 给药到颊部、舌下或阴道粘膜;以及直肠给药，例如，为栓剂的形式。
[0071] 所述组合物可以便利地以单位剂量形式给药，并且可以通过制药领域中众所周知 的任何方法制备，如在Remington的 Pharmaceut i cal Sciences, 17th ed·，Mack Publishing Company，Easton，PA.，（1985)中描述的。非胃肠给药的制剂可以包含作为赋形 剂的无菌水或盐水、烷撑二醇如丙二醇、聚烷撑二醇如聚乙二醇、植物来源的油、和氢化萘 等。非胃肠给药的制剂可以以固体形式提供，如冻干组合物，该冻干组合物可以复原，优选 地恰好在给药之前复原。复原可以包括将冻干组合物溶解于水或一些其他药学上可接受的 溶剂中，例如，生理盐水;药学上可接受的醇，例如，乙醇、丙二醇、聚乙二醇如聚乙二醇300 的含水溶液等;或溶解于一些其他无菌注射剂中。
[0072] 用于鼻腔给药的制剂可以是固体并且可以包含赋形剂，例如，乳糖或右旋糖酐，或 可以为用于滴鼻剂或计量喷雾形式的含水或含油溶液。针对颊部给药，典型的赋形剂包括 糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁和预胶化淀粉等。
[0073] 适于口服给药的组合物可以包含一种或多种生理上相容的载体和/或赋形剂并且 可以为固体或液体形式。片剂和胶囊剂可以使用以下制备:粘合剂，例如，糖浆、阿拉伯树 胶、明胶、山梨糖醇、黄芪胶或聚乙烯吡咯烷酮;填充剂，例如，乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸 钙、山梨糖醇或甘氨酸；润滑剂，例如，硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；以及表面活性 剂，例如，十二烷基硫酸钠。液体组合物可以包含常规的添加剂如悬浮剂，例如，山梨糖醇 浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基纤维素或食用脂肪；乳化剂，例如，卵磷脂或阿拉伯树 胶；植物油，例如，杏仁油、椰子油、鳕鱼肝油或花生油；防腐剂，例如，丁基化羟基苯甲醚 (BHA)和丁基化羟基甲苯(BHT)。液体组合物可以包封在例如明胶中以提供单位剂量形式。
[0074]固体口服剂型包括片剂、两片硬壳胶囊剂和软弹性明胶(SEG)胶囊剂。
[0075] 干燥的壳制剂典型地由约40 %至60 %浓度的明胶、约20 %至30 %浓度的增塑剂 (如甘油、山梨糖醇或丙二醇）和约30%至40%浓度的水组成。也可以存在其他物质如防腐 剂、染料、遮光剂和调味剂。液体填充物质包含已经溶解、增溶或分散(使用悬浮剂如蜂蜡、 氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)的固体药物或在载体或载体组合中的液体药物，所述载体为 例如矿物油、植物油、甘油三酯、1，2-乙二醇、多元醇和表面活性剂。
[0076] 本发明的药物组合物可以任选地包含一种或多种抗氧化剂(例如，抗坏血酸或偏 亚硫酸氢盐(metabisulfate)及其盐）。
[0077] 可能被提及的根据本发明的特定药物组合物包括以下组合物：
[0078] -用于非胃肠给药，例如，静脉内给药的药物组合物。
[0079]-用于口服给药的药物组合物。
[0080] -用于非胃肠给药，例如，静脉内给药或以单位剂量形式口服给药的药物组合物。
[0081] -用于以在给药之前使用液体复原的固体形式非胃肠给药，例如，静脉内给药的药 物组合物。
[0082] -用于以液体形式，例如，溶液形式非胃肠给药(例如，静脉内给药)的药物组合物。
[0083] 本发明的化合物是由细菌肺炎链球菌产生的胆固醇依赖性溶细胞素，肺炎球菌溶 血素的抑制剂。其还抑制由A链球菌群产生的链球菌溶血素0(SL0)和由产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)产生的产气荚膜梭菌素0(PF0)。还预期抑制紧密相关的胆固 醇依赖性溶细胞素的其他成员，其实例包括但不限于由单核细胞增生性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)产生的李斯特菌溶胞素0(LL0)、由炭疽杆菌（Bacillus anthracis)产生的炭疽杆菌溶细胞素 (Anthroly sin )0(AL0)和由猪链球菌（Strep tococcus suis)产生的猪链球菌溶血素(Suilysin)(SLY)。
[0084] 本发明的化合物对于治疗细菌感染，例如，肺炎球菌感染(包括相关的毒血症)是 有用的，其中肺炎球菌溶血素毒素已被证实在产生的疾病中发挥关键作用。这样的疾病包 括但不限于肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、肺炎球菌性败血症/菌血症、肺炎球菌性 角膜炎和肺炎球菌性中耳炎。本发明的化合物对于治疗与其他病症相关的肺炎球菌性感染 也是有用的。这样的病症包括(但不限于)囊性纤维化和慢性阻塞性肺病(C0PD)。例如，肺炎 链球菌(S · pneumon i ae)已经从C(PD患者中分离并认为是该疾病的加重因素。
[0085] 本发明的化合物对治疗由A链球菌群(GAS)引起的感染是有用的，包括但不限于侵 袭性A链球菌群性疾病，其中毒素链球菌溶血素0(SL0)已被证实在全身性GAS疾病的发病机 理中发挥关键作用。
[0086] 本发明的化合物对于治疗由产气荚膜梭菌引起的感染是有用的，包括但不限于表 征为肌坏死、感染性休克和死亡的气性坏疽，其中毒素产气荚膜梭菌素0已被证实为该病发 病机理中的主要毒力因素。
[0087] 本发明的化合物对于治疗由炭疽杆菌引起的感染是有用的，其中胆固醇依赖性溶 细胞素，炭疽杆菌溶细胞素〇(ALO)在胃肠(GI)炭疽中发挥必要作用，并且有助于吸入性炭 疽的发病。
[0088] 本发明的化合物对于治疗由产生胆固醇依赖性溶细胞素的革兰氏阳性菌引起的 其他疾病是有用的，其实例包括但不限于：
[0089] 由产生在猪链球菌病的发病机理中涉及的胆固醇依赖性溶细胞素，猪链球菌溶血 素的猪链球菌引起的猪脑膜炎、败血症/菌血症和感染性休克。
[0090] 由单核细胞增生性李斯特菌引起的脑炎、肠炎、脑膜炎、败血症/菌血症和肺炎，其 中胆固醇依赖性溶细胞素，李斯特菌溶胞素0(LL0)在上述疾病的发病机理中发挥重要作 用。
[0091] 本发明的化合物对抑制其他细菌性成孔毒素如RTX家族的毒素也很可能是有用 的，RTX家族的毒素在其宿主的毒力中是必要的。实例包括但不限于，由产生成孔毒素葡萄 球菌性α溶血作用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)引起的肺炎和败血症/菌血 症，以及由产生成孔毒素 α溶血素的致病性大肠杆菌(Escherichia coli)引起的腹膜炎。 [0092]因此，本发明提供了：
[0093] -用于治疗由产生成孔毒素的细菌引起的细菌感染的本发明的化合物，其中所述 细菌感染由链球菌属（Streptococcus spp.)(例如，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)、A链球菌群（Group A Streptococci)或猪链球菌（Streptococcus suis))、梭 菌属(Clostridium spp.)(例如，产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens))、李斯特菌属 (Listeria spp.)(例如，单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes))或芽孢杆 菌属(Bacillus spp.)(例如，炭疽杆菌(Bacillus anthracis));
[0094] -用于治疗由肺炎链球菌引起的细菌感染的本发明的化合物；
[0095]-用于治疗肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性脑膜炎、肺炎球菌性败血症/菌血症、肺炎 球菌性角膜炎或肺炎球菌性中耳炎的本发明的化合物;和
[0096] -用于治疗选自以下的、由除了肺炎球菌以外的细菌引起的病症的本发明的化合 物:气性坏疽、胃肠炭疽、吸入性炭疽、猪脑膜炎、脑炎、败血症/菌血症和肺炎。
[0097] 本发明的化合物可以用于治疗人或动物，如驯养动物(domestic animal)或家畜 (livestock)，例如，猪、牛、绵羊、马等，并且药物组合物的引用应解释为覆盖适于人或动物 使用的组合物。
[0098] 因此，在另一方面，本发明提供了用于治疗上述病症的本发明的化合物。
[0099] 在再一方面，本发明提供了用于制备治疗上述病症的药物的本发明的化合物。
[0100] 在又一方面，本发明提供了治疗上述病症的方法，其包括将有效量的本发明的化 合物或其药物组合物给药于有需要的受试者。
[0101]术语"治疗"意图包括预防以及治疗性治疗。
[0102]本发明的化合物可以单独使用或与另外的治疗活性成分联合使用。因此，本发明 的化合物可以与另外的治疗活性成分在相同的制剂中一起、或在单独的制剂中并通过相同 或不同的给药途径，同时、顺序或单独地联合给药。因此，本发明的化合物可以与适于治疗 上述病症的一种或多种其他活性成分联合给药。例如，用于治疗的可能组合包括与抗微生 物剂，例如，抗生素试剂，包括天然、合成和半合成抗微生物剂的组合。抗生素试剂的实例包 括:内酰胺类，包括但不限于青霉素、苄青霉素、阿莫西林及其所有代的产品；与内酰胺 酶抑制剂组合的内酰胺类，包括但不限于，克拉维酸和舒巴坦;头孢菌素类，包括但不限 于，头孢呋辛、头孢噻肟和头孢曲松;氟喹诺酮类，包括但不限于，左氧氟沙星和莫西沙星； 四环素类，包括但不限于，多西环素；大环内酯类，包括但不限于，红霉素和克拉霉素；脂肽 抗生素，包括但不限于，达托霉素;氨基糖甙类，包括但不限于，卡那霉素和庆大霉素;糖肽 抗生素，包括但不限于，万古霉素;林可酰胺类，包括但不限于，克林霉素和林可霉素;利福 霉素类，包括但不限于，利福平;和氯霉素。
[0103] 另外的组合包括与免疫调节剂如抗炎剂的组合。
[0104] 免疫调节剂可以包括，例如通过刺激或抑制免疫系统细胞，例如T细胞、B细胞、巨 噬细胞或抗原呈递细胞的细胞活性直接或间接地作用于免疫系统的试剂;或通过作用于免 疫系统外面的组分例如激素、受体激动剂或拮抗剂以及神经递质，进而刺激、抑制或调解免 疫系统的试剂，其他免疫调节剂可以包括免疫抑制剂或免疫刺激剂。抗炎剂包括，例如治疗 炎症反应、损伤的组织反应的试剂，治疗免疫系统、血管系统或淋巴系统或其组合的试剂。 抗炎剂和免疫调节剂的实例包括但不限于:干扰素衍生物如重组干扰素 β-lMbetaseron)、 β干扰素，前列腺(prostane)衍生物如伊洛前列素和西卡前列素，皮质类固醇如强的松龙、 甲基强的松龙、地塞米松和氟替卡松，⑶X2抑制剂，免疫抑制剂如环孢霉素 A、FK-506、8-甲 氧基补骨脂素、沙利度胺、柳氮磺胺吡啶、咪唑硫嘌呤和氨甲喋呤，脂氧合酶抑制剂，白三烯 拮抗剂，肽衍生物如ACTH及类似物，可溶性TNF (肿瘤坏死因子)受体，TNF抗体，白细胞介素 的可溶性受体，其他细胞因子和T细胞蛋白质，抗白细胞介素受体的抗体，其他细胞因子和T 细胞蛋白质。另外的抗炎剂包括非留体抗炎药(NSAID ' s) ASAID ' s的实例包括色甘酸钠、奈 多罗米钠、磷酸二酯酶(PDE)抑制剂如茶碱，PDE4抑制剂或混合的TOE3/PDE4抑制剂，白三烯 拮抗剂，白三烯合成抑制剂如孟鲁司特，iNOS抑制剂，类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂，β-2 整合素拮抗剂以及腺苷受体激动剂或拮抗剂如腺苷2a激动剂，细胞因子拮抗剂如趋化因子 拮抗剂，如CCR3拮抗剂，或细胞因子合成抑制剂，以及5-脂氧合酶抑制剂。
[0105] 因此，本发明的一方面提供了与一种或多种另外的活性成分，例如，上述活性成分 中的一种或多种组合的本发明的化合物。
[0106] 本发明的另一方面提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的化合物，所述 化合物任选地与一种或多种药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体，并且包含一种或多种其 他治疗活性成分。
[0107] 类似地，本发明的另一方面提供了组合产品，其包含：
[0108] (A)本发明的化合物;和
[0109] (B)另一种治疗剂，
[0110] 其中组分(A)和(B)中的每一种与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合配制。
[0111] 在本发明的该方面，所述组合产品可以是单独(组合)药物制剂或成套试剂盒。
[0112] 因此，本发明的该方面包括药物制剂，该药物制剂包含与药学上可接受的佐剂、稀 释剂或载体混合的本发明的化合物和另一种治疗剂(其中所述制剂以下称为"组合制剂"）。
[0113] 本发明其还包括成套试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
[0114] (i)药物制剂，其包含与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的本发明的化合 物;和
[0115] (ii)药物制剂，其包含与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的另一种治疗 剂；
[0116] 其中组分（i)和（ii)各自以适合于与另一种组分组合给药的形式提供。
[0117]成套试剂盒的组分（i)因此是与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的上述 组分(A)。类似地，组分（ii)是与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合的上述组分(B)。
[0118] 其他治疗剂（即上述组分(B))可以是，例如，上述任何试剂，如抗微生物剂或免疫 调节剂。
[0119] 本发明的该方面的组合产品（组合制剂或成套试剂盒)可以用于治疗或预防任何 上述病症。
[0120] 本发明的化合物也可以与一种或多种另外的活性成分组合提供，与例如使用说明 书一起使用。
[0121] 因此，本发明的再一方面提供了与一种或多种另外的活性成分，例如与上述活性 成分中的一种或多种组合使用的本发明的化合物。
[0122] 本发明的化合物在本发明的该方面的使用可以用于治疗或预防上述任何病症。
[0123] 现将通过参考以下实施例来描述本发明，所述实施例用于说明目的并且不应解释 为本发明范围的限制。
[0124] 实施例
[0125] 缩略语
[0126] AcOH 冰醋酸
[0127] aq. 含水的
[0128] Bn 苄基
[0129] Br 宽的
[0130] Boc 叔丁氧羰基
[0131] C0PD 慢性阻塞性肺病
[0132] d 双峰
[0133] DCM 二氯甲烷
[0134] DIPEA N，N-二异丙基乙胺
[0135] DMAP 4-二甲氨基吡啶
[0136] DMF N，N-二甲基甲酰胺
[0137] DMS0 二甲亚砜
[0138] EDC 1_乙基_3_(3_二甲氛基丙基)碳二亚胺
[0139] EtOAc 乙酸乙酯
[0140] h 小时(或多个小时）
[0141] HATU Ν,Ν,Υ ,Υ-四甲基-0-(7-偶氮苯并三唑-1-基)脲PF6
[0142] HPLC 高效液相色谱法
[0143] m 多重峰
[0144] MeCN 乙腈
[0145] MeOH 甲醇
[0146] min 分钟(或多分钟）
[0147] NMR 核磁共振
[0148] PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0149] quin.五重峰
[0150] RT 室温
[0151] s 单峰
[0152] sat.饱和的
[0153] SAX 固体支持的强阳离子交换树脂
[0154] sept.七重峰
[0155] sext.六重峰
[0156] t 三重峰
[0157] TFAA 三氟乙酸酐
[0158] THF 四氢呋喃 [0159] UV 紫外线
[0160] -般过程
[0161 ]所有的起始材料和溶剂均从商业来源获得或根据文献条件制备。
[0162] 氢化在Thales H-cube流动反应器上进行或使用催化剂的悬液在氢气球下进行。
[0163] 柱色谱在预装填二氧化硅(230-400目，40_63μπι)柱筒上进行。
[0164] 用于溶解性和稳定性研究的PBS溶液通过将1片Oxoid?(得自Thermo Scientific) 溶解于去离子水(lOOmL)中来制备。
[0165] 稳定性研究通过如下方式来进行，即：将l-2mg的化合物溶解于DMSO(lmL)中，然后 将0.4mL所生成的溶液加入在37.5°C下搅拌的PBS溶液(9.6mL)中。立即取样(大约0.5mL)进 行HPLC分析。然后在此后的各个时间点取另外的样品进行分析。由化合物的浓度相对于时 间的减少来确定半衰期。
[0166]分析方法
[0167] 分析HPLC使用Agilent Zorbax Extend C18，Rapid Resolution HT 1 ·8μηι柱进 行，该柱使用5-95 %梯度的在0.1 %甲酸水溶液中的0.1 %甲酸的MeCN溶液或5-95%梯度的 在50mM乙酸铵水溶液中的MeCN进行洗脱。可选择地，使用Waters Xselect CSH C18 3.5μηι 柱进行，该柱使用5-95 %梯度的在0.1 %甲酸水溶液中的0.1 %甲酸的MeCN溶液洗脱。在 Agilent 1100系统上使用二极管阵列或可变波长检测器测量洗脱峰的紫外光谱。
[0168] 分析LCMS使用Agilent Zorbax Extend C18，Rapid Resolution HT 1 ·8μηι柱进 行，该柱使用5-95 %梯度的在0.1 %甲酸水溶液中的0.1 %甲酸的MeCN溶液或5-95%梯度的 在50mM乙酸铵水溶液中的MeCN进行洗脱。供选择地，使用Waters Xselect CSH C18 3.5μηι 柱进行，该柱使用5-95%梯度的在0.1 %甲酸水溶液中的0.1 %甲酸的MeCN溶液进行洗脱。 在具有使用正负离子电喷雾的6120四极质谱仪的Agilent 1100上或Agilent Infinity 1260LC上，使用可变波长检测器测量洗脱峰的紫外光谱和质谱。
[0169] 4 NMR光谱法：
[0170] 匪R光谱使用Bruker Avance III 400MHz仪器记录，以残留未氖化溶剂或四甲基 硅烷作为参比。
[0171]化学合成：
[0172] 本发明的化合物使用以下一般方法制备：
[0173] 实施例A1:(3,4-二羟基4-(4-甲氧基苯基）-1H-吡咯-2,5-二基）双（（4-甲基哌 嗪-1-基）甲酮）（UL7_001)
[0174]
[0175] 步骤(i):2,2'-((4_甲氧基苯基)氮烷二基)二乙酸二乙酯（1)
[0176] 将2-溴乙酸乙酯（146mL，1.30mol)逐滴加入搅拌的4-甲氧基苯胺（75.0g， 0.6lOmol)和DIPEA(265mL，1.50mol)的MeCN(300mL)溶液中。反应混合物在60°C下搅拌16h， 然后分配在2M HCl(aq.)(500mL)和Et0Ac(300mL)之间，水相使用Et0Ac(300mL)萃取，并且合 并的有机物依次使用2M HC1 (aq.) (2 X 300mL)、水(500mL)和盐水(500mL)清洗，干燥(MgS〇4)， 过滤并在真空中去除溶剂，以得到紫色油2,2'-((4_甲氧基苯基)氮烷二基)二乙酸二乙酯 (l)(180g, 100% ):m/z 296(1+10 + ^5+)0? NMR(400MHz,ΟΧη3)δ:6.82-6.78(m，2H),6.64-6.59(m,2H),4.19(q ,J = 7.1Hz,4H),4.10(s,4H),3.74(s,3H),1.27(t ,J = 7.1Hz,6H)〇
[0177] 步骤(ii): 3，4-二羟基-1 _(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2，5-二甲酸二乙酯(2)
[0178] 将草酸二乙酯(83.0mL，0.610mol)逐滴加入搅拌的2,2'-((4-甲氧基苯基)氮烷二 基）二乙酸二乙酯（1) (180g，0 · 61 Omo 1)的NaOEt (2 lwt % 的EtOH 溶液）（506mL，1 · 30mo 1)溶液 中，混合物在1 〇〇°C下搅拌lh。使用乙酸（21 OmL，3.70mo 1)使反应猝灭并将所生成的悬浮液 倒入冰水（1L)中，所生成的灰白色固体通过真空过滤收集。从热Et0H(3.50L)中重结晶粗产 物，以得到白色固体3,4-二羟基-1-(4-甲氧基苯基）-1Η-吡咯-2,5-二甲酸二乙酯（2) (152g，71%):m/z 350(]?+!〇 + "5+)。348(]\1-!〇 -(ES-)</H NMR(400MHz，DMS0-d6)S:8.64(s， 2H)，7.13-7.01(m，2H)，6.92-6.81(m，2H)，3.99(q，J = 7.1Hz，4H)，3.78(s，3H)，0.99(t，J = 7.1Hz，6H)〇
[0179] 步骤(iii):3,4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-lH_吡咯-2,5_二甲酸二乙酯(3)
[0180] 将苄基溴(42.6mL，358mmol)逐滴加入搅拌的3，4_二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2，5-二甲酸(2) (50 · 0g，143mmol)和K2CO3(49 · 5g，358mmol)的DMF( 1L)溶液中，反应混 合物在60°C下搅拌4h。在冷却至室温之后，将反应混合物倒入醚(500mL)中并使用盐水(3 X 250mL)清洗，干燥(MgS〇4)，过滤并在真空中浓缩，以提供亮黄色固体。粗产物使用异己烷磨 碎，以得到白色固体3，4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2，5_二甲酸二乙酯(3) (64.8g，85%):m/z 530(Μ+Η) + (Ε5+)</Η NMR(400MHz，DMS〇-d6)S :7.48-7 ·29(ι?，10H) ,7.17-7.09(m，2H),6.95-6.87(m，2H)，5.09(s，4H)，3.99(q，J=7.1Hz，4H)，3.80(s，3H)，0.99(t，J = 7.1Hz,6H)〇
[0181] 步骤(iv) :(3,4-双(苄氧基)4-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2，5-二基)双（（4-甲基 哌嗪-1-基）甲酮）（4)
[0182] 向0°C的搅拌的3,4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2,5_二甲酸二乙酯 (3)(2.368,4.46臟〇1)和1-甲基哌嗪（2.471^，22.3臟〇1)的1'册(501^)溶液中加入异丙基氯 化镁（11. lmL，22.3mmol)。使反应混合物温热至室温并搅拌2h。使用NH4CI (aq.) (10mL)使反应 混合物猝灭并使用盐水(50mL)清洗，然后使用NaHC03(aq.)(50mL)清洗。干燥(MgS〇4)有机层， 过滤并在真空中浓缩。使用二乙醚(50mL)将残渣磨碎并过滤所生成的固体，用二乙醚冲洗， 以提供灰白色固体(3，4_双(苄氧基)-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2，5_二基)双（（4-甲基 哌嗪-1-基）甲酮）（4)(2.02g, 69% ) :m/z 638(1+11) + ^5+)0? 匪R(400MHz，DMS0-d6)S: 7.41-7.30(m,10H),7.03-6.98(m,2H),6.97-6.92(m,2H),5.00(s,4H),3.76(s,3H),3.42-3.26(br m,4H),3.20-3.06(br m,4H),2.16-1,84(br m,14H)〇
[0183] 步骤(v) :(3,4-二羟基4-(4-甲氧基苯基)-1H-吡咯-2,5-二基)双（（4-甲基哌嗪-1-基）甲酮）（UL7_001)
[0184] 使(3，4-双(苄氧基)4-(4-甲氧基苯基)- 1H-吡咯-2，5-二基)双（（4-甲基哌嗪-1-基）甲酮）（4)(2.018,3.16111111〇1)的甲醇（5011^)溶液在!1-(：油6(10%?(1/(：，55\4臟，全氢，40 °〇，111117 1^11)中氢化并在真空中浓缩，以提供黄色固体(3,4-二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-111-吡咯-2,5-二基)双（（4-甲基哌嗪-1-基）甲酮）（皿7-001)(1.42 8,96%):111/2 458(]\1+!〇 + (ES^o^ NMR(400MHz,DMS0-d6)5：8.44(s,2H),6.96-6.84(m,4H),3.74(s,3H),3.46-3.28 (br m,8H),2.23-2.07(br m,14H)〇
[0185] 实施例A2: (3,4-二羟基-1-(4-甲氧基苯基）-lH_吡咯-2,5-二基）双（（4-甲基哌 嗪-1-基）甲酮）（UL7-001)的供选择的潜在合成
[0186]
[0187] 实施例b: 1-(4-甲氧基苯基)-2,5-双(4-甲基哌嗪-1-羰基)-1Η-吡咯-3，4-二基双 (2-甲基丙酸酯)二盐酸化物(UL7-002)
[0188]
[ui?9j 步骤u) :H4-中氧垂本垂
中垂哪μ奈-_L-規垂一垂双 (2-甲基丙酸酯)二盐酸化物(UL7-002)
[0190] 向0°C的（3，4-二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-1Η-吡咯-2，5-二基)双（（4-甲基哌嗪- 1-基）甲酮）（UL7-001) (1.25g，2.73mmol)和2-叔丁基亚氨基-2-二乙氨基-1，3-二甲基全 氢-1，3，2-二氮杂磷(聚合物键合型，2.2mmol/g) (3.73g，8.20mmol)的 DCM( 20mL)溶液 / 悬浮 液中，加入异丁酰氯(0.716mL，6.83mmol)。使混合物温热至室温并摇动30分钟，之后过滤， 用DCM清洗，滤液在真空中浓缩。将残渣溶解于DCM(4mL)中并逐滴加入盐酸（1.37mL， 5.46mmo 1)(在4M1，4-二噁烷中）。搅拌混合物20分钟，然后在真空中干燥。残渣使用二乙醚 (10mL)磨碎。过滤生成的固体，使用二乙醚冲洗，并在真空中干燥，以提供灰白色固体1-(4-甲氧基苯基)-2,5_双(4-甲基哌嗪-1-羰基)-1Η-吡咯-3,4-二基双（2-甲基丙酸酯）二盐酸 化物（UL7-002)(0.408g，22%):m/z 598(1+10 + ^5+)0? NMR(400MHz，D2〇)S:7.39-3.30(br m,2H),7.27-7.18(br m,2H),4.60-4.36(br m,2H),4.03-3.78(br m,5H),3.68-3.29(br m，6H)，3.22-2.60(br m，14H), 1.28((1,J = 7.0Hz，12H)。
[0191 ]表1中的以下化合物使用以上提供的方法制备：
[0192] 表1
[0193]
[0194] 生物测试
[0195] 以下提供了使用本发明的化合物进行的生物测定的概要。
[0196] A.体外初级测定:肺炎球菌溶血素的溶血活性的抑制
[0197] 基本原理
[0198] 该测定的基础是，当肺炎球菌溶血素加入红细胞时，其诱导红细胞溶解并导致血 红蛋白的释放。在抑制性化合物的存在下，肺炎球菌溶血素诱导的溶解消除，微滴定板孔底 部的红细胞沉淀和上清液清澈。然而，如果化合物不是抑制性的，则红细胞溶解，血红蛋白 释放到上清液中。
[0199] 实验过程
[0200] 测试化合物溶液(通常以在DMS0中5mM)用100%DMS0 1:1稀释。然后用100%DMS0 将化合物2倍系列稀释到96孔圆底微滴定板的11个孔中。然后，向所有孔中加入PBS以实现 将化合物用PBS以1:10稀释。然后以等于其LD100的浓度加入肺炎球菌溶血素。随后使板在 37°C下孵育30-40分钟。在孵育时间之后，向每个孔中加入等体积的4% (v/v)绵羊红细胞悬 液，并且在37°C下再次孵育所述板30分钟。根据相同的过程制备仅有红细胞的PBS溶液(对 于没有溶解的对照)或红细胞加肺炎球菌溶血素(对于溶解的对照）。在与红细胞孵育之后， 测量每个孔在595nm下的吸光度，数据用于确定每种测试化合物的IC 5Q(JC5Q值使用非线性 回归曲线拟合确定。为此，将测试化合物的浓度的Log相对于抑制百分比作图，由A 595值进行 估计，然后将Hi 11 Slope拟合到数据。
[0201 ] 结果
[0202]该测定对于确定母体活性化合物UL7-001的抑制性活性是主要相关的。一般地，在 前药的情况下，由于前药需要存在血浆酶来水解前药部分并使得形成母体活性化合物，因 此预期抑制活性在体外不存在。然而，在我们的体外初级测定中，血液是测定的组分并用于 评估由肺炎球菌溶血素诱导的溶血的抑制。因此，我们观察了在前药UL7-002存在下的一些 抑制活性，这是因为在血液中孵育40分钟期间发生的一定程度的前药部分的酶裂解，导致 母体活性化合物UL7-001的释放。总之，该测定证实了母体活性化合物UL7-001的体外活性 并表明了在血液存在下前药转化为母体活性化合物。向母体活性化合物的转化在F小节中 进一步证实。
[0203] 表1中显示的实施例的IC5Q值如下：母体活性化合物UL7-001:IC5Q 0.3μΜ;前药 UL7-〇02:IC5〇6.8yM。
[0204] B.用于确定适于静脉内给药的制剂的溶解性和化学稳定性测试
[0205] 基本原理
[0206]非胃肠递送是本发明化合物的一个优选给药途径。因此，前药UL7-002设计为改进 母体活性化合物UL7-001在含水缓冲液中的溶解性和化学稳定性，以获得容易溶解的制剂， 该制剂与静脉内给药相容，且具有在安全盐水溶液中、在高浓度下以及在床侧可以复原的 增强的化学稳定性。
[0207]实验过程 [0208]-溶解性测试
[0209] 通过向小瓶中充填5-10mg化合物，然后加入roS溶液以实现100mg/ml的浓度进行 溶解性研究。如果未观察到溶解，则将溶液连续稀释到50mg/ml、25mg/ml和4mg/ml的浓度， 直到观察到完全溶解。
[0210] -化学稳定性评估
[0211] 稳定性研究通过在37.5°C下将l_2mg化合物溶解于DMS0(lml)中，然后将0.4ml所 生成的溶液加入搅拌的PBS(9.6ml)来进行。立即取样(~0.5ml)进行HPLC分析。然后在此后 多个时间点取另外的样品进行分析。由化合物的浓度相对于时间的减少确定半衰期。
[0212] 结果
[0213] 用实施例UL7-001和UL7-002获得的制剂显示于表2。两种化合物被证实在与以希 望浓度的安全静脉内给药相容的含水制剂中容易溶解。此外，前药UL7-002在含水制剂中， 相对于母体活性化合物UL7-001表现出改进的化学稳定性，t 1/2为47h。
[0214] 表2本发明的化合物的制剂的特性
[0215]
[0216] *PBS:磷酸盐缓冲盐水
[0217] C.体外次级测定:肺炎球菌溶血素诱导的乳酸脱氢酶释放的抑制
[0218] 基本原理
[0219]肺炎球菌溶血素诱导乳酸脱氢酶(LDH)从人单核细胞和肺上皮细胞的释放:指示 血衆膜损伤或破坏的现象[Infect. Immun. (2002)70 1017-1022] IDH测定可以用于证实公 开化合物抑制肺炎球菌溶血素对培养中的人肺上皮细胞的细胞毒性作用的能力。使用该测 定可以提供关于以下的两条主要的信息片段，（1)活性，用于证实从暴露于抑制性化合物存 在下的肺炎球菌溶血素的细胞中释放的LDH相对于从单独暴露于肺炎球菌溶血素的LDH释 放的抑制；（2)化合物毒性，测定形式设计为使得在对照孔内，测试从仅暴露于化合物的细 胞中释放的LDH。
[0220] 实验过程
[0221]将人肺上皮细胞(A549)接种在平底96孔组织培养板中并在补充谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中，在37°C下，5 % C02中生长24h。在使用前，用PBS清洗细胞。如在A小节中所述， 使测试化合物稀释液与肺炎球菌溶血素孵育，然后转移到含有人肺上皮细胞的孔中并在37 °C下，5%C0 2中孵育板30分钟。在板上包括以下对照：⑴阴性对照，称为低对照(仅PBS)，用 于测定LDH从培养的细胞中的自然释放，⑵阳性对照（1 % (v/v)Triton-X的PBS溶液），用于 测定LDH从细胞中的最大释放，（3)仅肺炎球菌溶血素溶液，用于测定肺炎球菌溶血素诱导 的LDH释放，（4)测试化合物溶液，用于评估单独化合物的毒性。在孵育之后，将上清液转移 到含有根据制造商的说明制备的二倍体积的乳酸脱氢酶测定混合物(T0X7，Sigma)的圆底 96孔微滴定板中。在不透光室内，室温下孵育5-10分钟之后，向所有孔中加入IN HC1。然后 测量在490nm和655nm下的吸光度。在测试化合物的存在和不存在下由肺炎球菌溶血素诱导 的LDH释放的百分比相对于化合物浓度的Log作图，并且如以上在A小节中的溶血测定抑制 中所述，确定IC50。
[0222] D.体外测定:肺炎球菌溶血素对培养的室管膜细胞的纤毛功能作用的抑制
[0223] 基本原理
[0224] 脑的大脑室和脊髓的中央管的室管膜纤毛细胞系覆盖有使脑脊液(CSF)在中枢神 经系统周围循环的纤毛。该层充当往返脑脊液的选择性脑屏障并在控制CSF体积方面发挥 作用。为了研究抑制剂是否阻止在室管膜层上由肺炎球菌溶血素引起的损伤，可以使用脑 膜炎的大鼠体外模型。该模型基于培养和分化来自新生大鼠脑的有纤毛室管膜细胞，该培 养和分化再创造其中使脑室内衬细胞暴露于肺炎链球菌及其毒性产物的体内环境。
[0225] 脑膜炎体外模型的使用构成了预测化合物阻止肺炎球菌溶血素引起体内损伤的 能力的强有力手段。
[0226] 实验过程
[0227] 室管膜细胞培养物通过先前所述的方法制备[1丨(^013.?&让(^.(1999)丑303-309]。组织培养盘用牛纤连蛋白涂覆，并且在使用前在5%(v/v)C0 2中、于37°C下孵育2小 时。生长培养基是添加青霉素（100 IU/mL)、链霉素（100yg/mL)、两性霉素 B (2.5yg/mL)、BSA (5yg/mL)、胰岛素(5μg/ml)、转铁蛋白（10yg/mL)和硒(5yg/mL)的极限必需培养基(MEM)。新 生(0-1日龄)大鼠通过颈脱位法杀死，并将其脑去除。小脑连同左右皮质半球和额皮质的边 缘区域一起去除。剩余的脑区域机械地离解在4mL生长培养基中。将来自一个或两个脑的离 解组织加入组织培养盘的孔(500μ1/孔）中，每个孔包含2.5mL生长培养基。细胞随后在5% (v/v)C0 2中、于37°C下孵育。培养基在三天之后用2mL补充凝血酶的新鲜生长培养基替换并 在此后每隔一天用2mL补充凝血酶的新鲜生长培养基喂养室管膜细胞。
[0228] 在大约两周之后，细胞完全有纤毛并准备实验。为了进行实验，用lmL包含25mM HEPES的培养基(pH 7.4)替换生长培养基。组织培养盘放置在围绕倒置光学显微镜台，恒温 控制的孵育室内侧。在测定培养基的温度为37°C之前使细胞培养物平衡。在这个点，使在37 °C下，lml培养基MEM中预孵育40分钟的有和没有测试化合物的重组纯化的肺炎球菌溶血素 加入包含有纤毛细胞的孔中。向对照细胞中加入lmL MEM培养基。在30min的暴露之前和之 后，用高速摄像机以500帧/s的速率记录摆动纤毛。以降低的帧速率回放记录的视频序列并 通过以下公式确定纤毛摆动频率(CBF):
[0229]
0
[0230] E.使用小鼠肺炎模型的体内有效性测定 [0231] 基本原理
[0232]该模型已经在发明人的实验室良好建立并适合于在该领域内工作的其他研究小 组。使用该模型，肺炎球菌溶血素显示为对于肺炎链球菌的发病机理及其在体内的存活是 必要的。使用该疾病模型，感染肺炎球菌溶血素(PLN-A)缺陷的肺炎链球菌突变体菌株的小 鼠表现出（1)存活率显著增加，（2)疾病体征显著延迟和衰减，以及(3)肺部炎症和少量菌血 症显著减少(细菌从肺部渗透到循环）。因此，该体内疾病模型构成了研究感染野生型肺炎 球菌(S.pneumoniae)并使用肺炎球菌溶血素抑制剂治疗的小鼠的疾病进展。存活率用作研 究的终点参数。
[0233] 实验过程:感染、治疗和疾病体征评分
[0234] 使用8周龄或更大，体重25_30g的远系繁殖MF1雌性小鼠。使动物保持在控制温度、 湿度和日长的条件下。动物自由饮用自来水并进食颗粒状食物。使用两个对照组:对照1 (感 染且未治疗的）、对照2(未感染和未治疗的）和一个治疗组(感染且治疗的）进行体内实验。 对照组1和治疗组小鼠用肺炎链球菌菌株D39经鼻感染(过程描述如下）。在完成感染之后， 确定给定剂量的活菌计数(如以下所述）。随后，每六个小时，治疗组和对照组1的动物经静 脉接收测试化合物，同时将单独赋形剂给予对照组1。基于Morton和Griff iths的方案 [Veterinary Record. (1985)111,431-436]每6小时评估疾病体征的进展(表3)。如果动物 变为2+昏睡，则被杀死并记录时间。使用时序检验比较对照组和测试组的存活率。
[0235]表3疾病体征的评分方案
[0236]
[0237] 上述可以用于肺炎链球菌感染、治疗递送和用于确定活菌计数的过程详细描述如 下：
[0238]-感染的鼻内滴注
[0239] 用2.5% (v/v)异氟烷，以1.6-1.8L 02/min轻微麻醉小鼠。有效麻醉的确认通过观 察不到足底反射来进行。通过颈背将小鼠垂直固定就位，并使其鼻子向上。然后用无菌PBS 给予感染剂量，逐滴给药到鼻孔内，使得动物在各滴之间的时间将其吸入。一旦给药完毕， 将小鼠送回其笼内，背部朝下放置以从麻醉的作用中恢复。
[0240] -治疗的静脉内给药
[0241] 在37°C下使小鼠在保温箱内放置10分钟，以扩张其静脉。然后将每只小鼠单独放 置在限制器内，使动物尾部暴露。用抗菌擦拭巾对尾部消毒。药物治疗使用小心地插入一个 尾侧静脉内的〇.5ml胰岛素注射器每6h经静脉内给药。药物新鲜制备并经静脉内给药到动 物。
[0242]-感染剂量的活菌计数的确定
[0243] 活菌计数通过Miles和Misra的方法进行[J.Hyg. (1938)逆732-749)。在圆底96孔 微滴定板中用180yL PBS系列稀释20yL样品，直到106的稀释度。将血琼脂平板分成六个区 块，每个稀释液60此平铺到单独区块上。使平板在37°C下，在C0 2气罐中孵育过夜。次日，计 数其中可看到30-3 00个菌落的区块中的菌落。菌落形成单位(CFU)/ml的浓度通过使用以下 公式确定：
[0244]
[0245] F.小鼠血浆中前药UL7-002向活性抑制剂的转化
[0246] 基本原理
[0247] 为了证实前药在血浆酶的存在下转化为母体活性化合物，将前药衍生物与小鼠血 浆在2小时的5个时间点，在37°C下孵育。然后通过LC-MS/MS分析样品以获得随时间变化出 现的活性化合物的量和随时间变化保留的前药衍生物的量。
[0248] 实验过程
[0249] 在小鼠血浆稳定性测定中以ΙΟμΜ的浓度评估本发明的前药衍生物。测试化合物用 DMS0稀释至10mM的最终储备浓度。出于测定的目的，制备的储备液进一步用DMS0稀释至400 μΜ的浓度并取5yL加入195yL的小鼠血浆(pH 7.4)中，然后在37°C下孵育。DMS0在平板中的 终浓度为2.5% (v/v)。在孵育之后0、15、30、60和120分钟，通过加入400yL包含0.55μΜ美托 洛尔和1 % (v/v)甲酸的乙腈使反应终止。然后使平板在4°C下，以3000rpm离心45分钟。将80 yL上清液转移到锥形底96孔玻璃包被的平板中。在通过LC-MS/MS分析前药衍生物和活性物 质之前加入40yL水。该测定应位于Leicester的发明人的要求，由合同研究组织Cyprotex Discovery Limited,UK进行。
[0250] 结果
[0251 ]保留的前药化合物和出现的母体活性化合物的定量进行如下：
[0252] (1)母体活性化合物使用以去活化小鼠血浆生成的6点校正曲线定量。（2)在每个 时间点保留的前药化合物的百分比由LC-MS/MS峰面积比（化合物峰面积/内标峰面积)计 算。该百分比随后用于确定前药化合物相对于在时间Omin的起始浓度（ΙΟμΜ)，在每个时间 点的浓度。前药UL7-002向其母体活性化合物UL7-001的转化显示于表4。
[0253] 结论
[0254] 表4中提供的结果清楚地表明了本发明的前药的治疗效果，该效果通过本发明的 前药在血浆中向母体活性化合物的快速转化来证实。除了治疗效果以外，UL7-002的理化性 质对于制备适于非胃肠递送的制剂是有利的。
[0255] 表 4
[0256]
[0257] 在整个说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另外要求，术语"包含 (comprise)"、和变型如"包含(comprises)"和"包含(comprising)"将被理解为意指包含规 定的整数、步骤、整数的组或步骤的组但不排除任何其他整数、步骤、整数的组或步骤的组。
[0258] 本文参考的所有专利和专利申请通过引用以其整体并入。
[0259] 由该说明书和权利要求书形成构成部分的申请可以用作关于任何随后申请的优 先权的基础。这样的随后申请的权利要求可以针对本文所述的任何特征或特征的组合。其 可以为产品、组合物、方法或用途权利要求的形式并且可以通过举例的方式包括而不限于 该权利要求。
【主权项】
1. 一种化合物，其为式(I)的化合物、或其药学上可接受的前药衍生物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。2. 根据权利要求1所述的化合物，其为前药衍生物形式。3. 根据权利要求2所述的化合物，其中，所述前药衍生物选自羧酸酯衍生物、氨基磺酸 酯衍生物、磷酸酯衍生物和氨基甲酸酯衍生物。4. 根据权利要求3所述的化合物，其中，所述前药衍生物是羧酸酯衍生物。5. 根据权利要求3或4所述的化合物，其为式(Ia)的化合物：其中，R4IPR41^-或两者独立地选自-C (O) R16、-SO2NH2、-PO (OR19)( OR2q )、-CHR26-OPO (OR19)( OR2q )和-C (0) NR17R18，其中，R26 为氢或 C1-C6 烷基，R16、R17、R18、R19 和 R2q 独立地选自： (c) C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C 6炔基、C3-Ciq环烷基、C5-Ciq环烯基、杂环基、-C 1-C3烷基-C3-Ciq环烷基、-C1-C 3烷基-C5-Ciq环烯基或-C1-C3烷基杂环基，或R 17和R18与它们连接的N-起 可以形成任选地包含选自0、S和NR25aR 25b中的另外的杂原子的5元或6元杂环，其中R25a为氢、 C1-C6烷基、-CH2-OPO(ORis) (OR2t3)或5元或6元杂环，且R25b不存在或为C1-C 6烷基;并且其中上 述R16、R17或R18基团中的任意基团可以任选地被选自以下基团中的一个或多个基团取代:氰 基、-OPO (OR19)(OR2t3 )、- (0 (CH2) z) r0R24、C1-C6 烷氧基、C1-C6 氟烷氧基、C1-C6 烷基、C1-C6 氟烷基 和-C(O)NRaRb，其中每个z可以相同或不同，表示2或3，r表示选自1至20的整数，且R 24为氢、 C1-C3烷基或-PO (OR19)( OR2q )，其中俨和妒独立地选自氢和&-(：6烷基，以及上述R16、R17或R 18 基团中的任意基团可以任选地被一个或多个卤素原子取代;和 (d) 芳基、杂芳基、C1-C3烷基芳基和-C1-C3烷基杂芳基，所述芳基和杂芳基任选地被取 代； 或R18、R19和R2t3可以独立地表示氢。6. 根据权利要求5所述的化合物，其中，1?43和1?4|3之一或两者独立地选自-(：(0)1? 16、-SO2NH2、-PO (OR19)( OR2q )和-C (0) NR17R18，其中 R16、R17、R18、R19 和 R2q 独立地选自： (a) C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C 6炔基、C3-Ciq环烷基、C5-Ciq环烯基、杂环基、-C 1-C3烷基-C3_ClQ环烷基、-Cl-C3烷基 -C5_ClQ环烯基或-Cl-C3烷基杂环基，其中上述R 16、R17或R18基团中 的任意基团可以任选地被选自氰基、C1-C6烷氧基、C1-C6氟烷氧基、C 1-C6烷基、C1-C6氟烷基 和-C(O)NRaRb中的基团取代，其中RlPRb独立地选自氢和&-〇5烷基，并且上述R 16、R17或R18基 团中的任何基团可以任选地被一个或多个卤素原子取代，和 (b)芳基、杂芳基、C1-C3烷基芳基和-C1-C3烷基杂芳基，所述芳基和杂芳基任选地被取 代； 或R18、R19和R2t3可以独立地表示氢； 并且当R4IPR4b之一独立地选自以上定义的基团时，另一个为氢。7. 根据权利要求5或6所述的化合物，其中，R4，R4bW者独立地选自-以0)1?16、-30 2順2、-PO (OR19)( OR2q )、-CHR26-OPO (OR19)( OR2q )和-C (0) NR17R18，其中 R26 为氢或 Ci-C6 烷基。8. 根据权利要求5或6所述的化合物，其中，R4lPR4b2-选自-C(0)R16、-S0 2NH2、-P0 (OR19)( OR2q )、-CHR26-OPO (OR19)( OR2q )和-C (0) NR17R18，其中 R26 为氢或 Ci-C6 烷基;并且 R4IP R4b中的另一个为氢。9. 根据权利要求5至8中任一项所述的化合物，其中，R4IPR41^-或两者独立地选自-C (O)R 16010. 根据权利要求9所述的化合物，其中，R1^C1-C6烷基或C3-C iq环烷基，其中上述基团 中的任一基团可以任选地被选自-OPO (OR19)( OR2q )和-(0 (CH2) z) r〇R24的基团取代，其中每个 z可以相同或不同，表示2或3，r表示选自1至20的整数，且R 24为氢、C1-C3烷基或-P0(0R19) (OR 2t3)，或R16是任选地被-(CHR26)q-0P0(OR 19) (OR2t3)取代的苯基，其中q表示0或1。11. 根据权利要求10所述的化合物，其中，R16是C1-C6烷基。12. 根据权利要求11所述的化合物，其中，R4IPR41^-C(O)CH(CH3) 2t313. 根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，其是二盐酸盐。14. 一种药物组合物，包含根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，所述化合物任 选地与一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体组合。15. 根据权利要求14所述的药物组合物，包含一种或多种其它治疗活性成分。16. 根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其用作药物。17. 根据权利要求1至13或16中任一项所述的化合物，用于与一种或多种其他治疗活性 成分组合使用。18. 根据权利要求1至13、16或17中任一项所述的化合物，用于治疗由产生成孔毒素如 胆固醇依赖性溶细胞素的细菌引起的细菌感染。19. 根据权利要求18所述用途的化合物，其中，所述细菌感染由链球菌属 (Streptococcus spp ·)(例如，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae )、A链球菌群 (Group A Streptococci )或猪链球菌（Streptococcus suis))、梭菌属（Clostridium spp ·)(例如，产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens))、李斯特菌属（Listeria spp ·) (例如，单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes))或芽孢杆菌属(BaciIlus spp.)(例如，炭疽杆菌(Bacillus anthracis))引起D20. 根据权利要求19所述用途的化合物，用于治疗由肺炎链球菌引起的细菌感染。21. 根据权利要求20所述用途的化合物，用于治疗肺炎球菌性肺炎、肺炎球菌性脑膜 炎、肺炎球菌性败血症/菌血症、肺炎球菌性角膜炎或肺炎球菌性中耳炎。22. 根据权利要求18所述用途的化合物，其用于治疗选自以下的、由除了肺炎球菌以外 的细菌引起的病症:气性坏疽、胃肠炭疽、吸入性炭疽、猪脑膜炎、脑炎、败血症/菌血症和肺 炎。23. 根据权利要求16至22中任一项所述用途的化合物，其中，所述化合物与一种或多种 其他治疗活性成分(例如，一种或多种抗微生物剂或免疫调节剂)组合给药。24. -种治疗由产生成孔毒素如胆固醇依赖性溶细胞素的细菌引起的细菌感染的方 法，其包括将有效量的根据权利要求1至13、15或16中任一项所述的化合物给药于有需要的 受试者。25. -种如权利要求1中所定义的式(I)的化合物的受保护的衍生物。26. -种制备如权利要求1中所定义的式（I)化合物的方法，其包括使式（II)的化合物 或其受保护的衍生物与1-甲基哌嗪反应；以及如果需要，使所生成的化合物去保护。27. -种制备如权利要求5至13中任一项所定义的式（I a)化合物的方法，其包括使式 (I)的化合物或其受保护的衍生物与式R4aX的化合物和/或式R4bX的化合物反应，其中X为离去基团。
【专利摘要】本发明尤其提供了新颖N-苯基取代的吡咯衍生物及其在治疗中的用途，尤其是在治疗细菌(例如，肺炎球菌)感染中的用途。
【IPC分类】C07F9/09, C07D207/36
【公开号】CN105492422
【申请号】CN201480044335
【发明人】彼得·威廉·安德鲁, 马法尔达·皮雷斯·达马索, 马克·威廉·戴维斯, 弗里茨-弗里德尔·弗里克尔, 拉娜·伦内恩, 丹尼尔·哈姆扎, 西蒙·克里斯多夫·伊尔斯特
【申请人】莱斯特大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月4日
【公告号】CA2914262A1, EP3004056A1, US20160120864, WO2014195702A1
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