化合物、医药品、抗炎剂、化妆品、饮食品及化合物的制造方法
化合物、医药品、抗炎剂、化妆品、饮食品及化合物的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于化合物、医药品、抗炎剂、化妆品、饮食品以及化合物的制造方法。
【背景技术】
[0002] 近年，异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症等过敏性疾病的患者正在增加当中。 其治疗方法大多依赖症状治疗法，以抑制过敏引起的发炎为目的，一般而言，是使用抗炎药 等。
[0003] 紫苏(Perilla frutescens Britton)为属于紫苏科的一年生草本植物，原产于中 国南部，广泛栽植于东洋的温带地区。在东洋，自古以来用于民间疗法，也调制作为汉药。在 日本，也从平安时代左右开始供应于食用中作为调味料。
[0004] 报告指出紫苏科植物或来自紫苏科植物的成分具有抑制过敏或发炎的作用。
[0005] 专利文献1揭示一种含有油脂与紫苏叶萃取物作为有效成分的抗过敏食品。此外， 专利文献2揭示一种调配有紫苏科植物的茎叶萃取物的抗过敏化妆原料组成物。此外，专利 文献3揭示一种含有多元不饱和脂肪酸与紫苏叶萃取物作为有效成分的发炎性肠疾病患者 用食品。此外，专利文献4揭示一种具有抑制TNF产生的作用、有效改善过敏的紫苏萃取液。 此外，非专利文献1记载萃取紫苏叶获得的迷迭香酸、叶黄酮、芹黄素(apigenin)对紫苏叶 萃取物的抗发炎作用提供贡献。此外，非专利文献2及非专利文献3揭示来自绿紫苏萃取物 的迷迭香酸甲酯及7-甲氧基黄芩素(Negletein)具有抑制N0产生的作用。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] (专利文献1)日本特开平6-62795号公报 [0009](专利文献2)日本特开平6-293652号公报 [0010](专利文献3)日本特开平9-201号公报 [0011](专利文献4)日本特开平7-215884号公报 [0012]非专利文献
[0013] (非专利文献1)三浦健人、北馆健太郎；AROMA RESEARCH Νο·42(ν〇1·11/Νο·2 2010)ρ28-31
[0014] (非专利文献2)池谷幸信等、绿紫苏中含有多量抑制一氧化氮诱导的成分;第20 回统合医疗机能性食品国际会议(ICN頂2012) (2012年7月举行)摘要集
[0015] (非专利文献3)芳中奈生等、关于绿紫苏中的Ν0产生抑制活性成分的研究；日本 生药学会第59回年会(2012年9月举行)摘要集
【发明内容】
[0016] 发明所欲解决的课题
[0017] 现状为正在等待紫苏科植物中具有更强效抗发炎作用的新颖成分的鉴定。
[0018] 本案发明者等发现紫苏科植物中的新颖化合物具有抗发炎作用，遂完成本发明。 本发明的目的为提供一种具有优良抗发炎作用的化合物、医药品、抗炎剂、化妆品及及饮食 品，以及所述化合物的制造方法。
[0019] 用以解决课题的手段
[0020] 为了达成上述目的，本发明第1观点的化合物为下述式(I)或式（Π )所示。
[0021]
[0022] 本发明第2观点的医药品是以下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物作为有效 成分。
[0024]本发明第3观点的抗炎剂是以下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物作为有效 成分。
[0023]
[0025]
[0026] 本发明第4观点的化妆品含有下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物。
[0027]
[0028]本发明第5观点的饮食品含有下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物。
[0029]
[0030] 本发明第6观点的下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物是由萃取处理紫苏科 植物所制得。
[0031]
[0032] 本发明第7观点的下述式（I)、式（Π )或式（ΙΠ )所示的化合物的制造方法，包含萃 取处理紫苏科植物的步骤。
[0033]
[0034]发明效果
[0035]依照本发明可提供一种具有优良抗发炎作用的化合物、医药品、抗炎剂、化妆品及 饮食品，以及所述化合物的制造方法。
【附图说明】
[0036]图1是表示Ν0产生量的测定结果。
[0037]图2是表示IC5Q值的测定结果。
[0038]图3是表示LDH活性的测定结果。
[0039] 图4是表示细胞素（cytokine)/趋化素（chemokine)数组(生物体外，in vitro)的 结果。
[0040] 图5是表示N0产生量的测定结果。
[00411图6是表示IC5Q值的测定结果。
【具体实施方式】
[0042]以下，详细说明关于本发明的实施例。
[0043]本说明书中的结构式，若无特别标示立体构造等，本说明书中结构式所示的化合 物包含互变异构物、几何异构物、光学异构物等各种立体异构物、及这些的混合物(包含消 旋体）。
[0044]首先，说明有关本发明的化合物。
[0045]本发明的新颖化合物为类黄酮(flavonoid)化合物，是由下述式（I)或式（Π )所 不。
[0046]
(I _) 8-&蓽-6.7-二_甲氧幕黄烷B (:P_a.5) C ?? ). 5,8-二羟棊-_7_-甲氧苺黄klilPiS )
[0047] 式（I)所示的化合物为8-羟基-6,7_二甲氧基黄烷酮，是新颖的类黄酮化合物。本 说明书中，式（I)所示化合物也称为Pa5。
[0048] 式（Π )所示化合物为5,8_二羟基-7-甲氧基黄烷酮，是新颖的类黄酮化合物。本说 明书中，式（Π )所示化合物也称为Pa5'。
[0049] Pa5及Pa5'如以下实施例所述般具有优良的抗发炎作用。因此，如下述般，作为抗 炎剂，可用于治疗异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症、风湿免疫疾病(Rheumatism)、发炎 性肠疾病等发炎性疾病外，也可作为化妆品及饮食品使用。
[0050] 接着，根据本发明，说明关于将紫苏科植物萃取处理所得的化合物。
[0051] 根据本发明，将紫苏科植物萃取处理所得的化合物是以下述式（I)、式（Π )或式 (m)表 7
[0052] 1:1 μ-R.基 _-為7:-二_甲:氧基黄 K 爾.( II. ) 二.羟基-7:-'甲:氧基黄 κ 爾叶树.苷
[0053] 关于紫苏科植物的萃取处理的详细情况如下述。
[0054]式(I)及式（Π )所示的化合物(Pa5及Pa5'）如前所述。本案发明者等首次发现将紫 苏科植物萃取处理可获得Pa5及Pa5'。
[0055] 式（ΙΠ )所示化合物为七叶树苷(Esculetin)，本案发明者等首次发现七叶树苷可 由紫苏科植物萃取处理而获得以及具有抗发炎作用。本说明书中，式（m)所示化合物也称 为 Pa9。
[0056] 推测Pa5、Pa5'及Pa9是以称为葡萄糖苷（glucoside)或葡萄糖醛酸苷 (8111(3111'0111(16)的配糖体(815^0 81(16)存在紫苏科植物中。推测?35、？35'及?39的配糖体经 口摄取时，藉由酵素（β-葡萄糖苷酵素（β-glucosidase)、葡萄糖醛酸苷酵素 (glucuronidase)等）切断糖成分，Pa5、Pa5'及Pa9以配质（aglycone)的状态进入血液中，在 体内产生作用。
[0057] Pa5、Pa5 '及Pa9如以下实施例所述般，具有优良的抗发炎作用。因此，如下述般，作 为抗炎剂，可用于治疗异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症、风湿免疫疾病、发炎性肠疾病 等发炎症性疾病外，也可作为化妆品及饮食品使用。
[0058] 接着，说明关于本发明的化合物Pa5、Pa5 '及Pa9的制造方法。
[0059] 本发明的化合物Pa5、Pa5'及Pa9的制造方法，其特征是包含将紫苏科植物萃取处 理的步骤。
[0060] 可使用的紫苏科植物的学名为紫苏(Perilla flutescens Britton var.crispa 及var .acta Kuto)，也可为其近缘植物(Labiatae)。例如，栽种于日本的绿紫苏、缩緬青紫 苏、红紫苏、缩緬紫苏、片面紫苏等也适用。只要是能够达到本发明功效的紫苏科植物皆适 合选用。并且，并无特别限定紫苏科植物的使用部位，全草、叶、叶柄、花、果实、枝根、种子等 皆可利用。可将其直接或干燥后使用，也可将其粉碎、进一步将其作成萃取物使用。
[0061] 萃取处理是指将紫苏科植物作为原料，进行以溶剂萃取、浓缩、分馏、精制等一般 化学分离精制手段。
[0062] 作为萃取方法，可列举例如将植物的部分或全部的粉碎物，通常在3至121°C，以水 或有机溶剂萃取的方法。本文中，萃取所使用的有机溶剂并无特别限定，可列举例如石油 醚、环己烷、甲苯、苯等烃类；四氯化碳、二氯甲烷、三氯甲烷等卤化烃；乙醚类、乙酸乙酯等 酯类;丙酮等酮类；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、聚乙二醇、丙二醇、丁二醇等醇类;吡啶等。萃取 溶剂可单独使用，也可混合2种以上使用。以使用含水乙醇、含水甲醇等含水醇为优选。从对 人体的安全性的观点，更优选的方法可列举如将紫苏科植物的干燥粉碎物，使用10至20倍 量的水或10至20倍量的60%乙醇，在室温至121°C， 搅拌萃取2至24小时的方法，更优选的方 法可列举如热水萃取(例如:30分钟至10小时的加热回流萃取）。又，所得的萃取物虽然可直 接使用，但必要时，也可经浓缩、过滤、冷冻干燥等处理后使用。又，萃取物或紫苏科植物可 单独使用，也可组合2种以上使用。只要可达到本发明的功效的萃取方法皆适合选用。
[0063] 用以获得Pa5及Pa5'的分馏方法如以下所例示。将紫苏科植物的溶剂萃取液减压 浓缩，使所得的残留物悬浮于水中，使用乙酸乙酯进行分层萃取，并将乙酸乙酯萃取液减压 浓缩。将所得的乙酸乙酯可溶部分进行硅胶管柱层析（Silica Gel Column Chromatography)，以正己烧与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己 烷:丙酮= 60:40的混合溶剂所溶出的部分再度进行硅胶管柱层析，以三氯甲烷与甲醇的混 合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的部 分进行制备型薄层层析（Preparative Thin-Layer Chromatography)，以三氯甲烧：甲醇= 24:1的混合溶剂展开。在此，取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲醇=1:1的混合溶剂进行萃 取。将所得的萃取液减压浓缩，进行制备型薄层层析，以正己烷:丙酮= 1:1的混合溶剂进行 展开。在此，若欲获得Pa5取Rf = 0.44的部分，若欲Pa5 '则取Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷： 甲醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。只要可达到本发明的功效的Pa5及Pa5'的分馏方法皆适合 选用。
[0064]用以获得Pa9的分馏方法如以下所例示。将紫苏科植物的溶剂萃取液减压浓缩，所 得的残留物悬浮水中，使用乙酸乙酯进行分层萃取，并将乙酸乙酯萃取液减压浓缩。将所得 的乙酸乙酯可溶部分进行硅胶管柱层析，以正己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率 进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶剂所溶出的部分再度进行硅胶管柱层析，以 三氯甲烷与甲醇的混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 96:4的 混合溶剂所溶出的部分进行十八基硅胶的管柱层析，以水与甲醇的混合溶剂依序提高甲醇 的比率进行溶出。将以水：甲醇= 70:30的混合溶剂所溶出的部分进行制备型薄层层析，以 三氯甲烷：甲醇= 10:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的 混合溶剂进行萃取。只要可达到本发明的功效的Pa9的分馏方法皆适合选用。
[0065]接着，说明关于本发明的医药品。
[0066]关于本发明的医药品是含有本发明的化合物Pa5、Pa5'或Pa9作为有效成分。
[0067] 本发明的医药品是Pa5、Pa5'或Pa9以其自体或与1种以上药学可容许的赋形剂或 载体组合的型态用户。又，本发明的医药品中，可适当含有通常可使用的结合剂、崩解剂、增 黏剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、界面活性剂、溶解辅助剂、保存剂、乳化剂、等 张化剂、安定化剂、pH调制剂等。又，本发明的医药品中也可适当含有其他活性成分。
[0068] 作为本发明的医药品的剂型，可依疾病的种类或程度等选定，例如可列举适合经 口、非经口或经鼻内投予者、锭剂或糖衣锭、舌下锭、明胶胶囊剂、片剂、塞剂、乳剂、软膏剂、 皮肤用凝胶剂等。
[0069] 本发明的医药品的投药量虽然依患者的年龄及体重、疾病的种类及严重程度以及 投药的路径而变化，然而，例如成人经口投药时，Pa5、Pa5 '或Pa9以1次0.1至500mg，1日1至3 次投药。
[0070] 接着，说明关于本发明的抗炎剂。
[0071] 本发明的抗炎剂含有本发明的化合物Pa5、Pa5'或Pa9作为有效成分。
[0072] Pa5、Pa5 '及Pa9如以下实施例所述般，具有优良的抗发炎作用。因此，可作为抗炎 剂用于治疗异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症、风湿免疫疾病、发炎性肠疾病等发炎性 疾病。
[0073] 关于本发明的抗炎剂的剂型、投药量等如上所述。
[0074] 接着，说明关于本发明的化妆品及饮食品。
[0075]本发明的化妆品及饮食品含有本发明的化合物Pa5、Pa5'或Pa9。
[0076] 本发明的化妆品以缓和或预防异位性皮肤炎或接触性皮肤炎等症状的目的，可于 护肤制品、粉底或化妆制品等添加 Pa5、Pa5 '或Pa9外，也可添加上述紫苏科植物的干燥粉末 或萃取物。
[0077] 本发明的饮食品可用于缓和或预防异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症等症状 的目的，为了充分活用此种作为食品的机能，可于一般食品、补充品、特定保健用食品、特殊 营养食品、营养补助食品、健康食品等调配Pa5、Pa5 '或Pa9。不仅是添加 Pa5、Pa5 '或Pa9，也 可使用上述紫苏科植物的干燥粉末或萃取物。可于各种食品中添加这些。饮料可列举如作 为特定保健用食品、特殊营养食品、营养补助食品的饮料或其他营养饮料、健康饮料、各种 健康茶等。其他食品可列举如点心类、面包、面类、练制品、油脂、调味料等。
[0078] 关于本发明的化妆品及饮食品，Pa5、Pa5'或Pa9的调配量并无特别限定，然而，一 般以干燥固形分换算为0.001至1〇〇重量％，特别是〇.〇1至50重量％为优选。
[0079] 实施例
[0080] 以下，列举实施例以具体说明本发明。然而，本发明并不限定于这些实施例。
[0081] (实施例1)
[0082]萃取来自紫苏叶片的8-羟基_6,7_二甲氧基黄烷酮(Pa5)，加以精制。
[0083](以甲醇萃取）
[0084]使用绿紫苏（Perilla frutescens f.viridis)的叶片4.40kg，以甲醇44.3L进行2 次回流萃取（1小时）。将2次回流萃取所得的甲醇萃取液减压浓缩，得到甲醇萃取物772g (17.5%)。将甲醇萃取物772g悬浮于水3.9L中，使用乙酸乙酯3.9L进行3次分层萃取。将3次 分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并，进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分254.7g。
[0085] 将所得的乙酸乙酯可溶部分87.7g进行硅胶管柱层析(7.5cm i.d. X 49cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分4.24g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的 部分 383.2mg 进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)，以三氯甲烷：甲醇= 24:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲 醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将所得的萃取液减压浓缩，获得淡褐色残留物195.7mg。将这 些再度进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以 正己烷:丙酮=1:1的混合溶剂进行展开。将Rf = 0.44的部分，以三氯甲烷：甲醇=1:1的混 合溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，所得的白色粉末以三氯甲烷及甲醇的混合溶剂进 行结晶化，获得无色棱柱结晶82.3mg。
[0086] 上述所得的无色棱柱结晶的分析数据如以下所示。
[0087] mp 166-168〇C
[0088] [a]23D〇(cl.〇3，MeOH)
[0089] 11^(1^001^:3290(011),1672(0 = 0), 1605(芳香环）
[0090] UVAmax(MeOH)nm(e):201(27074),244(11253),288(13489),349(5085)
[0091] ESI-MS m/z:301[M+H]+，197
[0092] 正型 HR-ESI-MS m/z 301.1068[M+H] +，理论值Ci7Hi7〇5:301.1076。
[0093] CD(c = 0.00114，Me0H) Δ ε(ηπι) :0(220-400)
[0094] 咕-匪1^〇)(：13:2.85(1!1，(1(1，了=16.5,2.8泡），3.08(1!1，(1(1，了=16.5，12.8抱），3.92 (3H，s，0CH 3)，4.02(3H，s，0CH3)，5.03(lH，s，随D20消失），5.46(lH，dd，J=12.8,2.8Hz)， 6.19(lH，s，H-5)，7.41-7.49(5H，m)。
[0095] 13C-NMRSCDC13:45 · 8(C-3)，56 · 2(0CH3)，56 · 3(0CH3)，80 · 0(C-2)，89 · 6(C-5)，105 · 7 (C-4a)，126.3(C-2'，C-5'），127.6(C-8a)，128.85(C-3'，C-5'），128.89(C-4'），138.3(C-l'），149.4(C-8)，152.5(C-7)，155.0(C-6)，189.4(C-4)。
[0096] 由上可知，上述所得的无色棱柱结晶含有8-羟基-6,7_二甲氧基黄烷酮(Pa5)。
[0097]
8 -:?:基-.6,7 -二甲氧基黄焼酮（P a 5)
[0098] (以热水萃取）
[0099] 将绿紫苏(Perill a frutescens f.viridis)的叶片0.6kg以水1L加热回流萃取（1 小时）。待冷却后，将萃取液以滤纸(ADVANTEC定性滤纸No. 2)过滤。藉此所得的热水萃取液 9.5L，使用乙酸乙酯9.5L，进行3次分层萃取。将3次分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并， 进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分8.78g。
[0100] 将所得的乙酸乙酯可溶部分8.78g进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X 30cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分〇.425g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的 部分39. lmg进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)，以三氯甲烷：甲醇= 24:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲 醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将所得的萃取液减压浓缩，获得淡褐色残留物20.5mg。将其 再度进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以正 己烷:丙酮= 1:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.44的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合 溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，所得的白色粉末以三氯甲烷及甲醇的混合溶剂进行 结晶化，获得无色棱柱结晶9. lmg。由分析的结果可知，此无色棱柱结晶中含有与上述相同 的8-羟基-6，7-二甲氧基黄烷酮(Pa5)。
[0101] (实施例2)
[0102] 萃取来自紫苏叶片的5，8-二羟基-7-甲氧基黄烷酮(Pa5 '），加以精制。
[0103](以甲醇萃取）
[0104] 使用绿紫苏（Perilla frutescens f.viridis)的叶片4.40kg，以甲醇44.3L进行2 次回流萃取（1小时）。将2次回流萃取所得的甲醇萃取液减压浓缩，获得甲醇萃取物772g (17.5%)。将甲醇萃取物772g悬浮于水3.9L中，使用乙酸乙酯3.9L进行3次分层萃取。将3次 分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并，进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分254.7g。
[0105] 将所得的乙酸乙酯可溶部分87.7g进行硅胶管柱层析(7.5cm i.d. X 49cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分4.24g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的 部分 383.2mg 进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)，以三氯甲烷：甲醇= 24:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲 醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将所得的萃取液减压浓缩，获得淡褐色残留物195.7mg。将其 再度进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以正 己烷:丙酮= 1:1的混合溶剂进行展开。将Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合 溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，所得的黄色粉末由甲醇进行结晶化，获得结晶粉末 14.4mg(收率0.00095%)。
[0106] 上述所得的结晶粉末的分析数据如以下所示。
[0107] 黄色针状(MeOH).mp 220_225°C。
[0108] UVAmax(MeOH)nm(loge):246(3.97)，292(4·16)，364(3.62)nm〇
[0109] [a]23D0(c0.253，Me0H)CD(c = 0.00172，Me0H) Δ ε(ηπι) :0(220-400)
[0110] 正型MALDI-T0F-MS(基质：已二酸）：m/z(%) :287·30([Μ+Η] +，100)，288·30(17)， 289.31(3)。
[0111] 1H-NMR(DMS0-d6)52.78(lH,ddJ=16.9,3.2Hz),3.19(lH,dd,J=16.9a2.4Hz) (H-3)，3.77(3H，s，0CH 3)，5.51(lH，dd，J=12.4,3.2Hz，H-2)，6.15(lH，s，H-7)，7.35(2H，m， H-3'，-5'），7.36(lH，m，H-4'），7.48(2H，m，H-2'，-6'），8.15(lH，s，0H)，11.74(lH，s，0H)。
[0112] 13C-NMR(DMS0-d6)S42.7(C-3) .56.4(00?)，78.6(C-2)，92.8(C-6)，102.6(C-4)， 126.9(C-2'，6'），128.66(C-3'，-5'，128.72(C-4'），139.1(C-l'），148.3(C-8a)，156.0(C-5)，157.5(C-8)，197.2(C-4)。
[0113] 由上可知，上述所得的结晶粉末中含有8-二羟基-7-甲氧基黄烷酮(Pa5'）。
[0114]
3,8.-二羟基-7 -甲氧基黄烷酮_(P
[0115] (以热水萃取）
[0116] 将绿紫苏(Perilla frutescens f.viridis)的叶片0.6kg以水1L加热回流萃取（1 小时）。待冷却后，将萃取液以滤纸(ADVANTEC定性滤纸No. 2)过滤。藉此所得的热水萃取液 9.5L，使用乙酸乙酯9.5L，进行3次分层萃取。将3次分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并， 进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分8.78g。
[0117] 将所得的乙酸乙酯可溶部分8.78g进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X 30cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分〇.425g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的 部分39. lmg进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)，以三氯甲烷：甲醇= 24:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲 醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将所得的萃取液减压浓缩，获得淡褐色残留物20.5mg。将其 再度进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以正 己烷:丙酮= 1:1的混合溶剂进行展开。将Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合 溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，所得的黄色粉末由甲醇进行结晶化，获得结晶粉末 2.Omg。由分析的结果可知，此结晶粉末中含有与上述相同的8-二羟基-7-甲氧基黄烷酮 (Pa5，） 。
[0118] (实施例3)
[0119] 从紫苏叶片萃取七叶树苷(Pa9)并加以精制。
[0120] (以甲醇萃取）
[0121 ]使用绿紫苏(Perilla frutescens f.viridis)的叶片4.40kg，以甲醇44.3L进行2 次回流萃取（1小时）。将2次回流萃取所得的甲醇萃取液减压浓缩，获得甲醇萃取物772g (17.5%)。将甲醇萃取物772g悬浮于水3.9L中，使用乙酸乙酯3.9L进行3次分层萃取。将3次 分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并，进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分254.7g。
[0122] 将所得的乙酸乙酯可溶部分87.7g进行硅胶管柱层析(7.5cm i.d. X 49cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分4.24g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 96:4的混合溶剂所溶出的 部分1167mg进行十八基硅胶的管柱层析，以水与甲醇的混合溶剂依序提高甲醇的比率进行 溶出。将以水：甲醇= 70:30的混合溶剂所溶出的部分82mg进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以三氯甲烧：甲醇= 10:1的混合溶剂进 行展开。取Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将此萃取液减压 浓缩，所得的残留物由甲醇进行结晶化，获得淡褐色针状结晶9.7mg。
[0123] 上述所得的淡褐色针状结晶的分析数据如以下所示。
[0124] mp 255-258〇C
[0125] UVAmax(MeOH)nm(loge):228(4.00),259(3.61),299(3.65),347(3.81)
[0126] 负型MALDI-TOF-MS m/z(%) :177.24([M-H] -，100)，178.24( 15)。
[0127] 1H-NMR 5Me0H-d4：6.17(lH,dJ = 9.6Hz),6.75(lH,s),6.93(lH,s),7.78(lH,dJ = 9.6Hz)〇
[0128] 由上可知，上述所得的淡褐色针状结晶中含有七叶树苷(Pa9)。
[0129]
七叶树苷（Pa9)
[0130] (以热水萃取）
[0131] 将绿紫苏(Perilla frutescens f.viridis)的叶片0.66kg以水11L加热回流萃取 (1小时）。待冷却后，将萃取液以滤纸(ADVANTEC定性滤纸No. 2)过滤。藉此所得的热水萃取 液9.5L，使用乙酸乙酯9.5L，进行3次分层萃取。将3次分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合 并，进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分8.78g。
[0132] 将所得的乙酸乙酯可溶部分8.78g进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X30cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分〇.425g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 96:4的混合溶剂所溶出的 部分117.7mg进行十八基硅胶的管柱层析，以水与甲醇的混合溶剂依序提高甲醇的比率进 行溶出。将以水：甲醇= 70:30所溶出的部分9.5mg进行制备型薄层层析（silica gel 70、 Wako Pure Chemical Industries,Ltd·)，以三氯甲烧：甲醇= 10:1的混合溶剂进行展开。 取Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，将 所得的残留物以甲醇进行结晶化，获得淡褐色针状结晶l.lmg。由分析的结果可知，此结晶 粉末中含有与上述相同的七叶树苷(Pa9)。
[0133](实施例4)
[0134]为了检验Pa5的抗发炎作用，调查抑制一氧化氮(N0)产生的作用。
[0135]已知一氧化氮(N0)为由间质素（interleukin，ID-Ιβ所诱发的发炎媒介的一，因 此，N0产生的抑制作用可作为抗发炎作用的指标。本实施例藉由检查Pa5的N0产生抑制作用 验证Pa5是否具有抗发炎作用。并且，作为比较例，使用报告指出存在于绿紫苏中具有N0产 生抑制作用的7-甲氧基黄苳素(negletein)。
[0136] 从雄性威斯特(Wistar)系大鼠（200_250g、Charles River)，以胶原蛋白酵素 (collagenase)灌流法(胶原蛋白酵素 :Wako Pure Chemicals)进行肝细胞分离。将分离的 肝细胞以6X 105cells/mL的浓度悬浮于培养皿中，播植于35mm塑料培养皿（Falcon Plastic)中（2mL/皿），培养于37°C、5%C02的培养箱。使用含有10%初生小牛血清(newborn calf serum)、HEPES(5mM)、青霉素（100U/mL)、链霉素（0 · lmg/mL)、迪皮质醇 (dexamethasone) (10nM)及膜岛素（10nM)的威廉斯培养皿E(Williams 'Medium E，以下称 WE)作为培养皿。5小时后，以不含血清及荷尔蒙的新WE置换，在用于实验前先培养一晚。
[0137] 在培养开始后第1天，将细胞移入不含血清及荷尔蒙的新WE，于培养皿中，添加重 组的大鼠 IL-lf3(纯度为97%以上）（PeproTech公司、Rocky Hill、NJ、USA)及由实施例1以甲 醇萃取的Pa5或比较例的7-甲氧基黄芩素。各个培养皿中浓度分别为IL-li3:lnM、Pa5:5、10 及20mM、7_甲氧基黄芩素：10、20及40μΜ(图1)。自添加 IL-Ιβ及Pa5或7-甲氧基黄芩素起8小 时后，使用Griess法(Green LC et al,Anal Biochem 1982; 126:131-138)测定各培养皿中 NO的量。更具体而言，测定培养皿中亚硝酸盐(NO的安定代谢物）的量。
[0138]又，为了检验Pa5的细胞伤害性，测定乳酸脱氢酵素（LDH)活性。使用LDH Cytotoxicity Detection Kits(Takara_bio公司），测定培养皿的乳酸脱氢酵素(LDH)活 性。由于LDH为存在于细胞内的酵素，随着细胞伤害，而释放至培养皿中。自添加 IL-Ιβ及Pa5 或7-甲氧基黄芩素起8小时后，取培养皿用于活性测定。实际上，各试样(50μ1的培养皿)与 试剂套组中的溶液C( 50μ1)混合，在室温放置30分钟，添加1Μ盐酸（25μ1)使反应停止，测定 490nm的吸亮度，与使用已知浓度的LDH的检量线比较，求得LDH活性。并且，以1枚培养皿上 全体细胞的LDH活性（亦即全细胞萃取液）当作正对照（图3中的正对照（pos i t i ve control))，视为100%。从存在有肝细胞的培养皿将培养皿移除，将细胞以磷酸缓冲生理食 盐水(PBS)清洗3次并用超音波破碎，取在10000 Xg离心3分钟后的上清液作为全细胞萃取 液使用，测定LDH活性。
[0139]图1中大鼠肝细胞的N0产生量测定的结果，于图2中表示IC5Q値(N0产生50%时的药 剂浓度）。图1中，「（_)」表示无添加 IL-li3，「（ + )」表示添加 IL-Ιβ。虽然，Pa5、7-甲氧基黄芩素 (比较例）皆依用量而抑制因 IL-Ιβ而起的N0产生，然而，当Pa5与7-甲氧基黄芩素（比较例） 以相同添加浓度（1〇μΜ)进行比较时，Pa5相较于7-甲氧基黄芩素（比较例），N0产生抑制作用 的程度高（图1)。又，相对于Pa5的IC 5Q值为9. ΟμΜ，7-甲氧基黄芩素（比较例）的IC50値为16.3 μΜ(图2)，表示Pa5的NO产生抑制作用比7-甲氧基黄芩素(比较例)高。
[0140]图3表示LDH活性的测定结果。图3中，「（-)」表示无添加 IL-Ιβ，「（ + )」表示添加 IL-1 β。添加 Pa5时的LDH活性与添加 IL-Ιβ时相同，显示Pa5不具有细胞伤害性。
[0141]如上所示，Pa5具有高N0产生抑制作用。因此，可知Pa5具有优良的抗发炎作用。
[0142] (实施例5)
[0143] 关于Pa5及Pa5'对各种发炎性细胞素/趋化素产生的影响，藉由细胞素/趋化素数 组(生物体外)进行验证。
[0144] 在发炎初期，由受到伤害的组织释放数种白血球趋化因子，白血球渗入发炎部位。 白血球趋化因子包含如白三烯（leuk〇trien e)B4(LTB4)的类特异性低的因子以及特异性高 的蛋白质性趋化因子的趋化素家族。趋化素分为2大类:4个保存的Cys残基中前2个Cys残基 之间夹有1残基的CXC趋化素，以及Cys残基为连续的CC趋化素，前者主要具有嗜中性球的趋 化活性，后者具有单核球的趋化活性。已知发炎性疾病患者表现过剩的特定趋化素，趋化素 及其受体的讯息传达的抑制，可期待成为抗炎药的目标。
[0145] 本实施例是以细胞素/趋化素数组(生物体外)验证Pa5及Pa5'对于添加 IL-Ιβ而引 发的各种发炎性细胞素/趋化素的产生有何影响。
[0146] 与实施例4同样，以胶原蛋白酵素灌流法由雄性威斯特系大鼠分离肝细胞。将分离 的肝细胞以1.2 X 106cells/mL的浓度悬浮培养皿(与实施例4相同），播植于35mm塑料培养 皿(与实施例4相同）（lmL/皿），培养于37°C、5%C0 2的培养箱。5小时后，以不含血清及荷尔 蒙的新的WE置换，在用于实验前先培养一晚。
[0147]培养开始后第1天，将细胞移入不含血清及荷尔蒙的新WE，于培养皿中添加 IL-Ιβ (与实施例4相同）及实施例1中以甲醇萃取的Pa5或实施例2中以甲醇萃取的Pa5'。各个培养 皿中的浓度分别为11-10 :11^、？&5:2(^1、？&5' ：1〇(^1(表1)。然后，培养于37°(3，自培养开始 3小时后将培养皿取出。取出的培养皿在5,000rpm离心1分钟，去除细胞残渣，将上清液用于 分析。在進行分析前，上清液保存于_80°C。
[0148]关于各种炎症性细胞素/趋化素的产生量，使用Proteome Profiler(注册商标)抗 体数组(Antibody Array)当中，可检出29种细胞素/趋化素的大鼠细胞素抗体数组（Rat Cytokine Antibody Array,R&D Systems公司）（http://www. rndsystems · com/product_ detail_ob jectname_ratcytokinearray .aspx)，遵照随附的操作方式进行测定。此测定是 使用lmL上述所得的培养皿的上清液。
[0149]上述方法可同时检出29种细胞素/趋化素，各细胞素/趋化素量依比例在Proteome Profiler Antibody Array的过滤上的化学发光增加。在此，Proteome Profiler Antibody Array的过滤器的化学发光是以LAS3000mini(GE Healthcare)检出，进行密度测定解析后， 加以数值化。关于密度测定解析是使用111^61软件，参照111^://\￥￥￥.111116』；^；[.116^/~ maxcat/imagej/technique·html#gels(「Analyzing ElectrophoreticGels~电气泳动胶 体的解析」的项目）进 行。
[0150] 各种炎症性细胞素/趋化素详述如下。
[0151] (1)(ΠΝ02α/β 及（2)CINC_3
[0152] CINC(cytokine_induced neutrophil chemoattractant)(细胞素诱导性嗜中性 球趋化性因子）属于趋化素的a(CXC)次家族。以CINC-1为首，3个大鼠 CXC趋化素(CINC_2a、 CINC-2i3、CINC-3/MIP-2)已被鉴定。嗜中性球渗入为代表性的急性期发炎反应，嗜中性球受 到CINCs的刺激而快速发生形态变化。在生物体外研究的结果，各CINC的趋化性活性本质并 无差异，在生物体内（in vivo)显示对嗜中性球特别强的趋化性活性。期待以抑制CINC的表 现，使局部发炎中嗜中性球的渗入受到抑制，而缓和发炎症状。
[0153] (3)分形素（Fractalkine)(CX3CLl)
[0154] 表现于活性化血管内皮细胞、神经细胞、树状细胞及肠管上皮细胞。由发炎系细胞 素的TNFa、IL-l或IFNy等发炎性刺激，诱导CX3CL1的表现。在生物体内存在有膜结合型及 分泌型两种形态，不仅是作为趋化素，也表现整合素(integrin)非依存的细胞接着能力，可 作为细胞接着分子发挥功能。分泌型趋化素对于NK细胞、T细胞及单核球显示细胞趋化活 性。CX3CL1也具有血管新生作用。已知分形素-CX3CR1的表现与关节风湿免疫疾病或动脉硬 化等各种疾病相关。期待藉由阻碍CX3CL1，可抑制对滑膜组织的发炎细胞的渗入，以抑制关 节风湿免疫疾病等以关节炎为首的发炎。
[0155] (4)sICAM_l(CD54)
[0156] CD54(ICAM-1: Intercellular Adhesion Molecule 1)属于免疫球蛋白超级家族 的接着分子，为膜穿透型糖蛋白质，常见于许多细胞中。CD54与细胞接着分子LFA-1(淋巴球 机能相关抗原1)结合，在发炎或免疫反应的细胞间相互作用担任重要角色。已知ICAM当中， sICAM(soluble Intercellular Adhesion Molecule)经由ICAM控制免疫反应，在自体免疫 疾病、内分泌疾病、胃癌、胰脏癌、乳癌等的表现上升，推测因此抑制细胞伤害性T细胞、自然 杀手细胞对癌细胞的攻撃，而促进癌转移。
[0157] (5)MIG(CXCL9)
[0158] CXCL9为14kDa的趋化素，且是CXC趋化素家族的一员。CXCL9在巨噬细胞或单核球、 嗜中性球、APC、B细胞或嗜酸性球中被特异的诱导，其诱导机制是经由IFN γ -JAK、STAT讯息 传达路径。因此，被干扰素 γ所诱导的单核球性细胞素，也称为干扰素 γ诱导单核细胞因子 (Monokine induced by gamma interferon，MIG)。又，在静脉内皮细胞或皮肤纤维母细胞 中，TNFa所引起的CXCL9的诱导被促进。CXCL9于肠管上皮也进行构成性表现。若干研究报告 指出此趋化素的主要机能为召集针对感染或发炎处的白血球，藉由格兰氏阴性或阳性细菌 的感染活化CXCL9XXCL9与关节风湿免疫疾病等免疫反应或慢性发炎有密切的相关。推测 CXCL9的表现也作为T细胞的召集与活化的媒介，对干癣或肺疾病也可能具有作用。也表现 于皮肤移植数日后、排斥反应发生前。
[0159] (6)VEGF(VEGF_A/血管内皮生长因子(vasculotropin))
[0160] 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)为与血管新生 相关的因子之一，在固态癌的增殖中担任重要角色。VEGF-A具有对于血管内皮细胞的增殖 因子及血管穿透性的亢进因子等2种性质。VEGF-A的遗传基因表现受到增殖因子或动情素、 低氧等而被诱导。VEGF的阻碍为实质固态癌治疗的正确战略的事实，可由对VEGF特异结合， 以阻碍其机能的抗体药癌思停(Bevacizumab)显示优良的延命效果获得证明。再者，关节风 湿免疫疾病的小鼠模型或动脉硬化模型等也显示与VEGF相关。VEGFR经由发炎细胞的动员 或机能活化而与发炎深切相关，可谓其表现的抑制与抗发炎作用连结。
[0161] (7)IL-17
[0162] IL-17(IL-17A)为从小鼠活性化T细胞cDNA库被鉴定的细胞素 CTLA-8。已知IL-17 的作用为与IL-6、G-CSF、CXCL1、CXCL8 (仅人类)等主要嗜中性球的活化、趋化相关的细胞 素/趋化素及防御素(β-Defensin)或S100家族等抗菌胜肽的表现诱导。对胶原蛋白诱导 关节炎或自体免疫性脑脊髓炎等自体免疫疾病，相对于IFN- γ或IL-12缺陷小鼠并无抑制 反而恶化，IL-17缺陷小鼠有更强的抑制，在使用抗IL-17抗体的人类临床试验中，显示对于 关节风湿免疫疾病或干癣的有效性，表示IL-17表现的抑制对于发炎性疾病的改善有效。
[0163] (8)胸腺趋化素 (Thymus Chemokine)(CXCL7)
[0164] CXCL7主要伴随着源自血小板的活化而产生，促进嗜中性球或嗜碱性球、纤维母细 胞、单核球的趋化，促进纤维母细胞的增殖或玻尿酸、葡萄胺聚醣、PGE2等的分泌。或促进来 自嗜碱性球的组织胺的释放。CXCL7表现的抑制会抑制嗜中性球等的渗入，由于防止组织胺 的释放促进，表示抗发炎性的作用。
[0165] 细胞素/趋化素数组（生物体外）的结果表示于表1及图4。表1及图4中，「（_)」表示 无添加 IL-li3，「（ + )」表示添加 IL-lKPa5对各种细胞素/趋化素的诱导显示强的抑制。又， Pa5'对分形素(CX3CL1)、IL-17及胸线趋化素(CXCL7)的诱导显示强的抑制。
[0166] [表 1]
[0167]
[0168] 由上可知，Pa5及Pa5'可抑制许多发炎性趋化素/细胞素的诱导，具有优良的抗发 炎作用。
[0169] (实施例6)
[0170]为了检验Pa9的抗发炎作用，调查一氧化氮(N0)产生的抑制作用。
[0171] 培养与实施例4相同的取自大鼠的肝细胞，培养开始后第1天，将细胞移入不含血 清及荷尔蒙的新WE，于培养皿中添加重组的大鼠 IL-Ιβ(与实施例4相同）及实施例3中以甲 醇萃取的Pa9。各个培养皿中的浓度分别为IL-Ιβ: lnM、Pa9:10μΜ、50μΜ及100μΜ(图5)。自添 加 IL-Ιβ及Pa9起8小时后，与实施例4相同测定各培养皿中Ν0量。
[0172] 图5中大鼠肝细胞的N0产生量测定的结果，于图6表示IC5Q値(N0产生50%时的药剂 浓度）。图5中，「（_)」表示无添加 IL-Ιβ，「（ + )」表示添加 IL-li^Pa9依用量会抑制因 IL-Ιβ所 弓丨起的NO产生（图5)。又，Pa9的IC5Q値为32μΜ(图6)。
[0173] 如上所示，Pa9显示具有高NO产生抑制作用。因此，可知Pa9具有优良的抗发炎作 用。
[0174] 此外，在未超出本发明的广义精神和范围下，本发明可作成各种实施例及进行变 化。此外，上述实施例仅用来说明本发明，并非是用来限定本发明的范围。换句话说，本发明 的范围不是由实施例的记载来解释，而是由权利要求书的记载来解释。并且，在权利要求书 内以及与权利要求书同等的发明意义的范围内所实施的各种变化也涵盖在本发明的范围 内。
[0175] 本发明的优先权基础案为2013年9月2日于日本申请的日本特愿2013-181052号申 请案。本说明书中援用了日本特愿2013-181052号申请案的说明书、权利要求书及附图的所 有记载。
【主权项】
1. 一种化合物，其特征在于，是以下述式(I)或式（Π)表示，2. -种医药品，其特征在于，是以下述式（I)、式（Π)或式（ΙΠ)表示的化合物作为有效 成分，3. -种抗炎剂，其特征在于，是以下述式（I)、式（Π)或式（ΙΠ)所示的化合物作为有效 成分，4. 一种化妆品，其特征在于，是含有下述式(I)、式（Π)或式(ΙΠ)所示的化合物，5. -种饮食品，其特征在于，是含有下述式(I)、式（Π)或式(ΙΠ)表示的化合物，6. -种化合物，其特征在于，是由紫苏科植物经由萃取处理制得，以下述式（I)、式（Π) 或式（ΙΠ)表示，7.-种下述式（I)、式（Π)或式（ΙΠ)所示的化合物的制造方法，其特征在于，是包含将 紫苏科植物萃取处理的步骤，
【专利摘要】本发明提供一种具有优良抗发炎作用的化合物、医药品、抗炎剂、化妆品及饮食品，以及所述化合物的制造方法。解决上述问题的手段为以下述式(I)或式(Ⅱ)表示的化合物。医药品是以下述式(I)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)表示的化合物作为有效成分。
【IPC分类】A61P29/00, A61K31/37, C07D311/32, A61Q19/00, A61K8/49, A61K36/53, A23L33/10, A61K31/352
【公开号】CN105492431
【申请号】CN201480048324
【发明人】池谷幸信, 西泽干雄, 三浦健人
【申请人】株式会社日本阿明诺化学, 学校法人立命馆
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年3月5日
【公告号】EP3042897A1, US20160207901, WO2015029473A1
【技术领域】
[0001] 本发明是关于化合物、医药品、抗炎剂、化妆品、饮食品以及化合物的制造方法。
【背景技术】
[0002] 近年，异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症等过敏性疾病的患者正在增加当中。 其治疗方法大多依赖症状治疗法，以抑制过敏引起的发炎为目的，一般而言，是使用抗炎药 等。
[0003] 紫苏(Perilla frutescens Britton)为属于紫苏科的一年生草本植物，原产于中 国南部，广泛栽植于东洋的温带地区。在东洋，自古以来用于民间疗法，也调制作为汉药。在 日本，也从平安时代左右开始供应于食用中作为调味料。
[0004] 报告指出紫苏科植物或来自紫苏科植物的成分具有抑制过敏或发炎的作用。
[0005] 专利文献1揭示一种含有油脂与紫苏叶萃取物作为有效成分的抗过敏食品。此外， 专利文献2揭示一种调配有紫苏科植物的茎叶萃取物的抗过敏化妆原料组成物。此外，专利 文献3揭示一种含有多元不饱和脂肪酸与紫苏叶萃取物作为有效成分的发炎性肠疾病患者 用食品。此外，专利文献4揭示一种具有抑制TNF产生的作用、有效改善过敏的紫苏萃取液。 此外，非专利文献1记载萃取紫苏叶获得的迷迭香酸、叶黄酮、芹黄素(apigenin)对紫苏叶 萃取物的抗发炎作用提供贡献。此外，非专利文献2及非专利文献3揭示来自绿紫苏萃取物 的迷迭香酸甲酯及7-甲氧基黄芩素(Negletein)具有抑制N0产生的作用。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] (专利文献1)日本特开平6-62795号公报 [0009](专利文献2)日本特开平6-293652号公报 [0010](专利文献3)日本特开平9-201号公报 [0011](专利文献4)日本特开平7-215884号公报 [0012]非专利文献
[0013] (非专利文献1)三浦健人、北馆健太郎；AROMA RESEARCH Νο·42(ν〇1·11/Νο·2 2010)ρ28-31
[0014] (非专利文献2)池谷幸信等、绿紫苏中含有多量抑制一氧化氮诱导的成分;第20 回统合医疗机能性食品国际会议(ICN頂2012) (2012年7月举行)摘要集
[0015] (非专利文献3)芳中奈生等、关于绿紫苏中的Ν0产生抑制活性成分的研究；日本 生药学会第59回年会(2012年9月举行)摘要集
【发明内容】
[0016] 发明所欲解决的课题
[0017] 现状为正在等待紫苏科植物中具有更强效抗发炎作用的新颖成分的鉴定。
[0018] 本案发明者等发现紫苏科植物中的新颖化合物具有抗发炎作用，遂完成本发明。 本发明的目的为提供一种具有优良抗发炎作用的化合物、医药品、抗炎剂、化妆品及及饮食 品，以及所述化合物的制造方法。
[0019] 用以解决课题的手段
[0020] 为了达成上述目的，本发明第1观点的化合物为下述式(I)或式（Π )所示。
[0021]
[0022] 本发明第2观点的医药品是以下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物作为有效 成分。
[0024]本发明第3观点的抗炎剂是以下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物作为有效 成分。
[0023]
[0025]
[0026] 本发明第4观点的化妆品含有下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物。
[0027]
[0028]本发明第5观点的饮食品含有下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物。
[0029]
[0030] 本发明第6观点的下述式(I)、式（Π )或式(ΙΠ )所示的化合物是由萃取处理紫苏科 植物所制得。
[0031]
[0032] 本发明第7观点的下述式（I)、式（Π )或式（ΙΠ )所示的化合物的制造方法，包含萃 取处理紫苏科植物的步骤。
[0033]
[0034]发明效果
[0035]依照本发明可提供一种具有优良抗发炎作用的化合物、医药品、抗炎剂、化妆品及 饮食品，以及所述化合物的制造方法。
【附图说明】
[0036]图1是表示Ν0产生量的测定结果。
[0037]图2是表示IC5Q值的测定结果。
[0038]图3是表示LDH活性的测定结果。
[0039] 图4是表示细胞素（cytokine)/趋化素（chemokine)数组(生物体外，in vitro)的 结果。
[0040] 图5是表示N0产生量的测定结果。
[00411图6是表示IC5Q值的测定结果。
【具体实施方式】
[0042]以下，详细说明关于本发明的实施例。
[0043]本说明书中的结构式，若无特别标示立体构造等，本说明书中结构式所示的化合 物包含互变异构物、几何异构物、光学异构物等各种立体异构物、及这些的混合物(包含消 旋体）。
[0044]首先，说明有关本发明的化合物。
[0045]本发明的新颖化合物为类黄酮(flavonoid)化合物，是由下述式（I)或式（Π )所 不。
[0046]
(I _) 8-&蓽-6.7-二_甲氧幕黄烷B (:P_a.5) C ?? ). 5,8-二羟棊-_7_-甲氧苺黄klilPiS )
[0047] 式（I)所示的化合物为8-羟基-6,7_二甲氧基黄烷酮，是新颖的类黄酮化合物。本 说明书中，式（I)所示化合物也称为Pa5。
[0048] 式（Π )所示化合物为5,8_二羟基-7-甲氧基黄烷酮，是新颖的类黄酮化合物。本说 明书中，式（Π )所示化合物也称为Pa5'。
[0049] Pa5及Pa5'如以下实施例所述般具有优良的抗发炎作用。因此，如下述般，作为抗 炎剂，可用于治疗异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症、风湿免疫疾病(Rheumatism)、发炎 性肠疾病等发炎性疾病外，也可作为化妆品及饮食品使用。
[0050] 接着，根据本发明，说明关于将紫苏科植物萃取处理所得的化合物。
[0051] 根据本发明，将紫苏科植物萃取处理所得的化合物是以下述式（I)、式（Π )或式 (m)表 7
[0052] 1:1 μ-R.基 _-為7:-二_甲:氧基黄 K 爾.( II. ) 二.羟基-7:-'甲:氧基黄 κ 爾叶树.苷
[0053] 关于紫苏科植物的萃取处理的详细情况如下述。
[0054]式(I)及式（Π )所示的化合物(Pa5及Pa5'）如前所述。本案发明者等首次发现将紫 苏科植物萃取处理可获得Pa5及Pa5'。
[0055] 式（ΙΠ )所示化合物为七叶树苷(Esculetin)，本案发明者等首次发现七叶树苷可 由紫苏科植物萃取处理而获得以及具有抗发炎作用。本说明书中，式（m)所示化合物也称 为 Pa9。
[0056] 推测Pa5、Pa5'及Pa9是以称为葡萄糖苷（glucoside)或葡萄糖醛酸苷 (8111(3111'0111(16)的配糖体(815^0 81(16)存在紫苏科植物中。推测?35、？35'及?39的配糖体经 口摄取时，藉由酵素（β-葡萄糖苷酵素（β-glucosidase)、葡萄糖醛酸苷酵素 (glucuronidase)等）切断糖成分，Pa5、Pa5'及Pa9以配质（aglycone)的状态进入血液中，在 体内产生作用。
[0057] Pa5、Pa5 '及Pa9如以下实施例所述般，具有优良的抗发炎作用。因此，如下述般，作 为抗炎剂，可用于治疗异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症、风湿免疫疾病、发炎性肠疾病 等发炎症性疾病外，也可作为化妆品及饮食品使用。
[0058] 接着，说明关于本发明的化合物Pa5、Pa5 '及Pa9的制造方法。
[0059] 本发明的化合物Pa5、Pa5'及Pa9的制造方法，其特征是包含将紫苏科植物萃取处 理的步骤。
[0060] 可使用的紫苏科植物的学名为紫苏(Perilla flutescens Britton var.crispa 及var .acta Kuto)，也可为其近缘植物(Labiatae)。例如，栽种于日本的绿紫苏、缩緬青紫 苏、红紫苏、缩緬紫苏、片面紫苏等也适用。只要是能够达到本发明功效的紫苏科植物皆适 合选用。并且，并无特别限定紫苏科植物的使用部位，全草、叶、叶柄、花、果实、枝根、种子等 皆可利用。可将其直接或干燥后使用，也可将其粉碎、进一步将其作成萃取物使用。
[0061] 萃取处理是指将紫苏科植物作为原料，进行以溶剂萃取、浓缩、分馏、精制等一般 化学分离精制手段。
[0062] 作为萃取方法，可列举例如将植物的部分或全部的粉碎物，通常在3至121°C，以水 或有机溶剂萃取的方法。本文中，萃取所使用的有机溶剂并无特别限定，可列举例如石油 醚、环己烷、甲苯、苯等烃类；四氯化碳、二氯甲烷、三氯甲烷等卤化烃；乙醚类、乙酸乙酯等 酯类;丙酮等酮类；甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、聚乙二醇、丙二醇、丁二醇等醇类;吡啶等。萃取 溶剂可单独使用，也可混合2种以上使用。以使用含水乙醇、含水甲醇等含水醇为优选。从对 人体的安全性的观点，更优选的方法可列举如将紫苏科植物的干燥粉碎物，使用10至20倍 量的水或10至20倍量的60%乙醇，在室温至121°C， 搅拌萃取2至24小时的方法，更优选的方 法可列举如热水萃取(例如:30分钟至10小时的加热回流萃取）。又，所得的萃取物虽然可直 接使用，但必要时，也可经浓缩、过滤、冷冻干燥等处理后使用。又，萃取物或紫苏科植物可 单独使用，也可组合2种以上使用。只要可达到本发明的功效的萃取方法皆适合选用。
[0063] 用以获得Pa5及Pa5'的分馏方法如以下所例示。将紫苏科植物的溶剂萃取液减压 浓缩，使所得的残留物悬浮于水中，使用乙酸乙酯进行分层萃取，并将乙酸乙酯萃取液减压 浓缩。将所得的乙酸乙酯可溶部分进行硅胶管柱层析（Silica Gel Column Chromatography)，以正己烧与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己 烷:丙酮= 60:40的混合溶剂所溶出的部分再度进行硅胶管柱层析，以三氯甲烷与甲醇的混 合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的部 分进行制备型薄层层析（Preparative Thin-Layer Chromatography)，以三氯甲烧：甲醇= 24:1的混合溶剂展开。在此，取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲醇=1:1的混合溶剂进行萃 取。将所得的萃取液减压浓缩，进行制备型薄层层析，以正己烷:丙酮= 1:1的混合溶剂进行 展开。在此，若欲获得Pa5取Rf = 0.44的部分，若欲Pa5 '则取Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷： 甲醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。只要可达到本发明的功效的Pa5及Pa5'的分馏方法皆适合 选用。
[0064]用以获得Pa9的分馏方法如以下所例示。将紫苏科植物的溶剂萃取液减压浓缩，所 得的残留物悬浮水中，使用乙酸乙酯进行分层萃取，并将乙酸乙酯萃取液减压浓缩。将所得 的乙酸乙酯可溶部分进行硅胶管柱层析，以正己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率 进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶剂所溶出的部分再度进行硅胶管柱层析，以 三氯甲烷与甲醇的混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 96:4的 混合溶剂所溶出的部分进行十八基硅胶的管柱层析，以水与甲醇的混合溶剂依序提高甲醇 的比率进行溶出。将以水：甲醇= 70:30的混合溶剂所溶出的部分进行制备型薄层层析，以 三氯甲烷：甲醇= 10:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的 混合溶剂进行萃取。只要可达到本发明的功效的Pa9的分馏方法皆适合选用。
[0065]接着，说明关于本发明的医药品。
[0066]关于本发明的医药品是含有本发明的化合物Pa5、Pa5'或Pa9作为有效成分。
[0067] 本发明的医药品是Pa5、Pa5'或Pa9以其自体或与1种以上药学可容许的赋形剂或 载体组合的型态用户。又，本发明的医药品中，可适当含有通常可使用的结合剂、崩解剂、增 黏剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、界面活性剂、溶解辅助剂、保存剂、乳化剂、等 张化剂、安定化剂、pH调制剂等。又，本发明的医药品中也可适当含有其他活性成分。
[0068] 作为本发明的医药品的剂型，可依疾病的种类或程度等选定，例如可列举适合经 口、非经口或经鼻内投予者、锭剂或糖衣锭、舌下锭、明胶胶囊剂、片剂、塞剂、乳剂、软膏剂、 皮肤用凝胶剂等。
[0069] 本发明的医药品的投药量虽然依患者的年龄及体重、疾病的种类及严重程度以及 投药的路径而变化，然而，例如成人经口投药时，Pa5、Pa5 '或Pa9以1次0.1至500mg，1日1至3 次投药。
[0070] 接着，说明关于本发明的抗炎剂。
[0071] 本发明的抗炎剂含有本发明的化合物Pa5、Pa5'或Pa9作为有效成分。
[0072] Pa5、Pa5 '及Pa9如以下实施例所述般，具有优良的抗发炎作用。因此，可作为抗炎 剂用于治疗异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症、风湿免疫疾病、发炎性肠疾病等发炎性 疾病。
[0073] 关于本发明的抗炎剂的剂型、投药量等如上所述。
[0074] 接着，说明关于本发明的化妆品及饮食品。
[0075]本发明的化妆品及饮食品含有本发明的化合物Pa5、Pa5'或Pa9。
[0076] 本发明的化妆品以缓和或预防异位性皮肤炎或接触性皮肤炎等症状的目的，可于 护肤制品、粉底或化妆制品等添加 Pa5、Pa5 '或Pa9外，也可添加上述紫苏科植物的干燥粉末 或萃取物。
[0077] 本发明的饮食品可用于缓和或预防异位性皮肤炎、接触性皮肤炎、花粉症等症状 的目的，为了充分活用此种作为食品的机能，可于一般食品、补充品、特定保健用食品、特殊 营养食品、营养补助食品、健康食品等调配Pa5、Pa5 '或Pa9。不仅是添加 Pa5、Pa5 '或Pa9，也 可使用上述紫苏科植物的干燥粉末或萃取物。可于各种食品中添加这些。饮料可列举如作 为特定保健用食品、特殊营养食品、营养补助食品的饮料或其他营养饮料、健康饮料、各种 健康茶等。其他食品可列举如点心类、面包、面类、练制品、油脂、调味料等。
[0078] 关于本发明的化妆品及饮食品，Pa5、Pa5'或Pa9的调配量并无特别限定，然而，一 般以干燥固形分换算为0.001至1〇〇重量％，特别是〇.〇1至50重量％为优选。
[0079] 实施例
[0080] 以下，列举实施例以具体说明本发明。然而，本发明并不限定于这些实施例。
[0081] (实施例1)
[0082]萃取来自紫苏叶片的8-羟基_6,7_二甲氧基黄烷酮(Pa5)，加以精制。
[0083](以甲醇萃取）
[0084]使用绿紫苏（Perilla frutescens f.viridis)的叶片4.40kg，以甲醇44.3L进行2 次回流萃取（1小时）。将2次回流萃取所得的甲醇萃取液减压浓缩，得到甲醇萃取物772g (17.5%)。将甲醇萃取物772g悬浮于水3.9L中，使用乙酸乙酯3.9L进行3次分层萃取。将3次 分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并，进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分254.7g。
[0085] 将所得的乙酸乙酯可溶部分87.7g进行硅胶管柱层析(7.5cm i.d. X 49cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分4.24g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的 部分 383.2mg 进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)，以三氯甲烷：甲醇= 24:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲 醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将所得的萃取液减压浓缩，获得淡褐色残留物195.7mg。将这 些再度进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以 正己烷:丙酮=1:1的混合溶剂进行展开。将Rf = 0.44的部分，以三氯甲烷：甲醇=1:1的混 合溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，所得的白色粉末以三氯甲烷及甲醇的混合溶剂进 行结晶化，获得无色棱柱结晶82.3mg。
[0086] 上述所得的无色棱柱结晶的分析数据如以下所示。
[0087] mp 166-168〇C
[0088] [a]23D〇(cl.〇3，MeOH)
[0089] 11^(1^001^:3290(011),1672(0 = 0), 1605(芳香环）
[0090] UVAmax(MeOH)nm(e):201(27074),244(11253),288(13489),349(5085)
[0091] ESI-MS m/z:301[M+H]+，197
[0092] 正型 HR-ESI-MS m/z 301.1068[M+H] +，理论值Ci7Hi7〇5:301.1076。
[0093] CD(c = 0.00114，Me0H) Δ ε(ηπι) :0(220-400)
[0094] 咕-匪1^〇)(：13:2.85(1!1，(1(1，了=16.5,2.8泡），3.08(1!1，(1(1，了=16.5，12.8抱），3.92 (3H，s，0CH 3)，4.02(3H，s，0CH3)，5.03(lH，s，随D20消失），5.46(lH，dd，J=12.8,2.8Hz)， 6.19(lH，s，H-5)，7.41-7.49(5H，m)。
[0095] 13C-NMRSCDC13:45 · 8(C-3)，56 · 2(0CH3)，56 · 3(0CH3)，80 · 0(C-2)，89 · 6(C-5)，105 · 7 (C-4a)，126.3(C-2'，C-5'），127.6(C-8a)，128.85(C-3'，C-5'），128.89(C-4'），138.3(C-l'），149.4(C-8)，152.5(C-7)，155.0(C-6)，189.4(C-4)。
[0096] 由上可知，上述所得的无色棱柱结晶含有8-羟基-6,7_二甲氧基黄烷酮(Pa5)。
[0097]
8 -:?:基-.6,7 -二甲氧基黄焼酮（P a 5)
[0098] (以热水萃取）
[0099] 将绿紫苏(Perill a frutescens f.viridis)的叶片0.6kg以水1L加热回流萃取（1 小时）。待冷却后，将萃取液以滤纸(ADVANTEC定性滤纸No. 2)过滤。藉此所得的热水萃取液 9.5L，使用乙酸乙酯9.5L，进行3次分层萃取。将3次分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并， 进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分8.78g。
[0100] 将所得的乙酸乙酯可溶部分8.78g进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X 30cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分〇.425g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的 部分39. lmg进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)，以三氯甲烷：甲醇= 24:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲 醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将所得的萃取液减压浓缩，获得淡褐色残留物20.5mg。将其 再度进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以正 己烷:丙酮= 1:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.44的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合 溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，所得的白色粉末以三氯甲烷及甲醇的混合溶剂进行 结晶化，获得无色棱柱结晶9. lmg。由分析的结果可知，此无色棱柱结晶中含有与上述相同 的8-羟基-6，7-二甲氧基黄烷酮(Pa5)。
[0101] (实施例2)
[0102] 萃取来自紫苏叶片的5，8-二羟基-7-甲氧基黄烷酮(Pa5 '），加以精制。
[0103](以甲醇萃取）
[0104] 使用绿紫苏（Perilla frutescens f.viridis)的叶片4.40kg，以甲醇44.3L进行2 次回流萃取（1小时）。将2次回流萃取所得的甲醇萃取液减压浓缩，获得甲醇萃取物772g (17.5%)。将甲醇萃取物772g悬浮于水3.9L中，使用乙酸乙酯3.9L进行3次分层萃取。将3次 分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并，进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分254.7g。
[0105] 将所得的乙酸乙酯可溶部分87.7g进行硅胶管柱层析(7.5cm i.d. X 49cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分4.24g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的 部分 383.2mg 进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)，以三氯甲烷：甲醇= 24:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲 醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将所得的萃取液减压浓缩，获得淡褐色残留物195.7mg。将其 再度进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以正 己烷:丙酮= 1:1的混合溶剂进行展开。将Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合 溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，所得的黄色粉末由甲醇进行结晶化，获得结晶粉末 14.4mg(收率0.00095%)。
[0106] 上述所得的结晶粉末的分析数据如以下所示。
[0107] 黄色针状(MeOH).mp 220_225°C。
[0108] UVAmax(MeOH)nm(loge):246(3.97)，292(4·16)，364(3.62)nm〇
[0109] [a]23D0(c0.253，Me0H)CD(c = 0.00172，Me0H) Δ ε(ηπι) :0(220-400)
[0110] 正型MALDI-T0F-MS(基质：已二酸）：m/z(%) :287·30([Μ+Η] +，100)，288·30(17)， 289.31(3)。
[0111] 1H-NMR(DMS0-d6)52.78(lH,ddJ=16.9,3.2Hz),3.19(lH,dd,J=16.9a2.4Hz) (H-3)，3.77(3H，s，0CH 3)，5.51(lH，dd，J=12.4,3.2Hz，H-2)，6.15(lH，s，H-7)，7.35(2H，m， H-3'，-5'），7.36(lH，m，H-4'），7.48(2H，m，H-2'，-6'），8.15(lH，s，0H)，11.74(lH，s，0H)。
[0112] 13C-NMR(DMS0-d6)S42.7(C-3) .56.4(00?)，78.6(C-2)，92.8(C-6)，102.6(C-4)， 126.9(C-2'，6'），128.66(C-3'，-5'，128.72(C-4'），139.1(C-l'），148.3(C-8a)，156.0(C-5)，157.5(C-8)，197.2(C-4)。
[0113] 由上可知，上述所得的结晶粉末中含有8-二羟基-7-甲氧基黄烷酮(Pa5'）。
[0114]
3,8.-二羟基-7 -甲氧基黄烷酮_(P
[0115] (以热水萃取）
[0116] 将绿紫苏(Perilla frutescens f.viridis)的叶片0.6kg以水1L加热回流萃取（1 小时）。待冷却后，将萃取液以滤纸(ADVANTEC定性滤纸No. 2)过滤。藉此所得的热水萃取液 9.5L，使用乙酸乙酯9.5L，进行3次分层萃取。将3次分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并， 进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分8.78g。
[0117] 将所得的乙酸乙酯可溶部分8.78g进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X 30cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分〇.425g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 98: 2的混合溶剂所溶出的 部分39. lmg进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries， Ltd.)，以三氯甲烷：甲醇= 24:1的混合溶剂进行展开。取Rf = 0.82的部分，以三氯甲烷：甲 醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将所得的萃取液减压浓缩，获得淡褐色残留物20.5mg。将其 再度进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以正 己烷:丙酮= 1:1的混合溶剂进行展开。将Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合 溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，所得的黄色粉末由甲醇进行结晶化，获得结晶粉末 2.Omg。由分析的结果可知，此结晶粉末中含有与上述相同的8-二羟基-7-甲氧基黄烷酮 (Pa5，） 。
[0118] (实施例3)
[0119] 从紫苏叶片萃取七叶树苷(Pa9)并加以精制。
[0120] (以甲醇萃取）
[0121 ]使用绿紫苏(Perilla frutescens f.viridis)的叶片4.40kg，以甲醇44.3L进行2 次回流萃取（1小时）。将2次回流萃取所得的甲醇萃取液减压浓缩，获得甲醇萃取物772g (17.5%)。将甲醇萃取物772g悬浮于水3.9L中，使用乙酸乙酯3.9L进行3次分层萃取。将3次 分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合并，进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分254.7g。
[0122] 将所得的乙酸乙酯可溶部分87.7g进行硅胶管柱层析(7.5cm i.d. X 49cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分4.24g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 96:4的混合溶剂所溶出的 部分1167mg进行十八基硅胶的管柱层析，以水与甲醇的混合溶剂依序提高甲醇的比率进行 溶出。将以水：甲醇= 70:30的混合溶剂所溶出的部分82mg进行制备型薄层层析（silica gel 70、Wako Pure Chemical Industries，Ltd·)，以三氯甲烧：甲醇= 10:1的混合溶剂进 行展开。取Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将此萃取液减压 浓缩，所得的残留物由甲醇进行结晶化，获得淡褐色针状结晶9.7mg。
[0123] 上述所得的淡褐色针状结晶的分析数据如以下所示。
[0124] mp 255-258〇C
[0125] UVAmax(MeOH)nm(loge):228(4.00),259(3.61),299(3.65),347(3.81)
[0126] 负型MALDI-TOF-MS m/z(%) :177.24([M-H] -，100)，178.24( 15)。
[0127] 1H-NMR 5Me0H-d4：6.17(lH,dJ = 9.6Hz),6.75(lH,s),6.93(lH,s),7.78(lH,dJ = 9.6Hz)〇
[0128] 由上可知，上述所得的淡褐色针状结晶中含有七叶树苷(Pa9)。
[0129]
七叶树苷（Pa9)
[0130] (以热水萃取）
[0131] 将绿紫苏(Perilla frutescens f.viridis)的叶片0.66kg以水11L加热回流萃取 (1小时）。待冷却后，将萃取液以滤纸(ADVANTEC定性滤纸No. 2)过滤。藉此所得的热水萃取 液9.5L，使用乙酸乙酯9.5L，进行3次分层萃取。将3次分层萃取所得的乙酸乙酯萃取液合 并，进行减压浓缩，获得乙酸乙酯可溶部分8.78g。
[0132] 将所得的乙酸乙酯可溶部分8.78g进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X30cm)，以正 己烷与丙酮的混合溶剂依序提高丙酮的比率进行溶出。将以正己烷:丙酮= 60:40的混合溶 剂所溶出的部分〇.425g再度进行硅胶管柱层析(3.0cm i.d. X25cm)，以三氯甲烷与甲醇的 混合溶剂依序提高甲醇的比率进行溶出。将以三氯甲烷：甲醇= 96:4的混合溶剂所溶出的 部分117.7mg进行十八基硅胶的管柱层析，以水与甲醇的混合溶剂依序提高甲醇的比率进 行溶出。将以水：甲醇= 70:30所溶出的部分9.5mg进行制备型薄层层析（silica gel 70、 Wako Pure Chemical Industries,Ltd·)，以三氯甲烧：甲醇= 10:1的混合溶剂进行展开。 取Rf = 0.70的部分，以三氯甲烷：甲醇= 1:1的混合溶剂进行萃取。将此萃取液减压浓缩，将 所得的残留物以甲醇进行结晶化，获得淡褐色针状结晶l.lmg。由分析的结果可知，此结晶 粉末中含有与上述相同的七叶树苷(Pa9)。
[0133](实施例4)
[0134]为了检验Pa5的抗发炎作用，调查抑制一氧化氮(N0)产生的作用。
[0135]已知一氧化氮(N0)为由间质素（interleukin，ID-Ιβ所诱发的发炎媒介的一，因 此，N0产生的抑制作用可作为抗发炎作用的指标。本实施例藉由检查Pa5的N0产生抑制作用 验证Pa5是否具有抗发炎作用。并且，作为比较例，使用报告指出存在于绿紫苏中具有N0产 生抑制作用的7-甲氧基黄苳素(negletein)。
[0136] 从雄性威斯特(Wistar)系大鼠（200_250g、Charles River)，以胶原蛋白酵素 (collagenase)灌流法(胶原蛋白酵素 :Wako Pure Chemicals)进行肝细胞分离。将分离的 肝细胞以6X 105cells/mL的浓度悬浮于培养皿中，播植于35mm塑料培养皿（Falcon Plastic)中（2mL/皿），培养于37°C、5%C02的培养箱。使用含有10%初生小牛血清(newborn calf serum)、HEPES(5mM)、青霉素（100U/mL)、链霉素（0 · lmg/mL)、迪皮质醇 (dexamethasone) (10nM)及膜岛素（10nM)的威廉斯培养皿E(Williams 'Medium E，以下称 WE)作为培养皿。5小时后，以不含血清及荷尔蒙的新WE置换，在用于实验前先培养一晚。
[0137] 在培养开始后第1天，将细胞移入不含血清及荷尔蒙的新WE，于培养皿中，添加重 组的大鼠 IL-lf3(纯度为97%以上）（PeproTech公司、Rocky Hill、NJ、USA)及由实施例1以甲 醇萃取的Pa5或比较例的7-甲氧基黄芩素。各个培养皿中浓度分别为IL-li3:lnM、Pa5:5、10 及20mM、7_甲氧基黄芩素：10、20及40μΜ(图1)。自添加 IL-Ιβ及Pa5或7-甲氧基黄芩素起8小 时后，使用Griess法(Green LC et al,Anal Biochem 1982; 126:131-138)测定各培养皿中 NO的量。更具体而言，测定培养皿中亚硝酸盐(NO的安定代谢物）的量。
[0138]又，为了检验Pa5的细胞伤害性，测定乳酸脱氢酵素（LDH)活性。使用LDH Cytotoxicity Detection Kits(Takara_bio公司），测定培养皿的乳酸脱氢酵素(LDH)活 性。由于LDH为存在于细胞内的酵素，随着细胞伤害，而释放至培养皿中。自添加 IL-Ιβ及Pa5 或7-甲氧基黄芩素起8小时后，取培养皿用于活性测定。实际上，各试样(50μ1的培养皿)与 试剂套组中的溶液C( 50μ1)混合，在室温放置30分钟，添加1Μ盐酸（25μ1)使反应停止，测定 490nm的吸亮度，与使用已知浓度的LDH的检量线比较，求得LDH活性。并且，以1枚培养皿上 全体细胞的LDH活性（亦即全细胞萃取液）当作正对照（图3中的正对照（pos i t i ve control))，视为100%。从存在有肝细胞的培养皿将培养皿移除，将细胞以磷酸缓冲生理食 盐水(PBS)清洗3次并用超音波破碎，取在10000 Xg离心3分钟后的上清液作为全细胞萃取 液使用，测定LDH活性。
[0139]图1中大鼠肝细胞的N0产生量测定的结果，于图2中表示IC5Q値(N0产生50%时的药 剂浓度）。图1中，「（_)」表示无添加 IL-li3，「（ + )」表示添加 IL-Ιβ。虽然，Pa5、7-甲氧基黄芩素 (比较例）皆依用量而抑制因 IL-Ιβ而起的N0产生，然而，当Pa5与7-甲氧基黄芩素（比较例） 以相同添加浓度（1〇μΜ)进行比较时，Pa5相较于7-甲氧基黄芩素（比较例），N0产生抑制作用 的程度高（图1)。又，相对于Pa5的IC 5Q值为9. ΟμΜ，7-甲氧基黄芩素（比较例）的IC50値为16.3 μΜ(图2)，表示Pa5的NO产生抑制作用比7-甲氧基黄芩素(比较例)高。
[0140]图3表示LDH活性的测定结果。图3中，「（-)」表示无添加 IL-Ιβ，「（ + )」表示添加 IL-1 β。添加 Pa5时的LDH活性与添加 IL-Ιβ时相同，显示Pa5不具有细胞伤害性。
[0141]如上所示，Pa5具有高N0产生抑制作用。因此，可知Pa5具有优良的抗发炎作用。
[0142] (实施例5)
[0143] 关于Pa5及Pa5'对各种发炎性细胞素/趋化素产生的影响，藉由细胞素/趋化素数 组(生物体外)进行验证。
[0144] 在发炎初期，由受到伤害的组织释放数种白血球趋化因子，白血球渗入发炎部位。 白血球趋化因子包含如白三烯（leuk〇trien e)B4(LTB4)的类特异性低的因子以及特异性高 的蛋白质性趋化因子的趋化素家族。趋化素分为2大类:4个保存的Cys残基中前2个Cys残基 之间夹有1残基的CXC趋化素，以及Cys残基为连续的CC趋化素，前者主要具有嗜中性球的趋 化活性，后者具有单核球的趋化活性。已知发炎性疾病患者表现过剩的特定趋化素，趋化素 及其受体的讯息传达的抑制，可期待成为抗炎药的目标。
[0145] 本实施例是以细胞素/趋化素数组(生物体外)验证Pa5及Pa5'对于添加 IL-Ιβ而引 发的各种发炎性细胞素/趋化素的产生有何影响。
[0146] 与实施例4同样，以胶原蛋白酵素灌流法由雄性威斯特系大鼠分离肝细胞。将分离 的肝细胞以1.2 X 106cells/mL的浓度悬浮培养皿(与实施例4相同），播植于35mm塑料培养 皿(与实施例4相同）（lmL/皿），培养于37°C、5%C0 2的培养箱。5小时后，以不含血清及荷尔 蒙的新的WE置换，在用于实验前先培养一晚。
[0147]培养开始后第1天，将细胞移入不含血清及荷尔蒙的新WE，于培养皿中添加 IL-Ιβ (与实施例4相同）及实施例1中以甲醇萃取的Pa5或实施例2中以甲醇萃取的Pa5'。各个培养 皿中的浓度分别为11-10 :11^、？&5:2(^1、？&5' ：1〇(^1(表1)。然后，培养于37°(3，自培养开始 3小时后将培养皿取出。取出的培养皿在5,000rpm离心1分钟，去除细胞残渣，将上清液用于 分析。在進行分析前，上清液保存于_80°C。
[0148]关于各种炎症性细胞素/趋化素的产生量，使用Proteome Profiler(注册商标)抗 体数组(Antibody Array)当中，可检出29种细胞素/趋化素的大鼠细胞素抗体数组（Rat Cytokine Antibody Array,R&D Systems公司）（http://www. rndsystems · com/product_ detail_ob jectname_ratcytokinearray .aspx)，遵照随附的操作方式进行测定。此测定是 使用lmL上述所得的培养皿的上清液。
[0149]上述方法可同时检出29种细胞素/趋化素，各细胞素/趋化素量依比例在Proteome Profiler Antibody Array的过滤上的化学发光增加。在此，Proteome Profiler Antibody Array的过滤器的化学发光是以LAS3000mini(GE Healthcare)检出，进行密度测定解析后， 加以数值化。关于密度测定解析是使用111^61软件，参照111^://\￥￥￥.111116』；^；[.116^/~ maxcat/imagej/technique·html#gels(「Analyzing ElectrophoreticGels~电气泳动胶 体的解析」的项目）进 行。
[0150] 各种炎症性细胞素/趋化素详述如下。
[0151] (1)(ΠΝ02α/β 及（2)CINC_3
[0152] CINC(cytokine_induced neutrophil chemoattractant)(细胞素诱导性嗜中性 球趋化性因子）属于趋化素的a(CXC)次家族。以CINC-1为首，3个大鼠 CXC趋化素(CINC_2a、 CINC-2i3、CINC-3/MIP-2)已被鉴定。嗜中性球渗入为代表性的急性期发炎反应，嗜中性球受 到CINCs的刺激而快速发生形态变化。在生物体外研究的结果，各CINC的趋化性活性本质并 无差异，在生物体内（in vivo)显示对嗜中性球特别强的趋化性活性。期待以抑制CINC的表 现，使局部发炎中嗜中性球的渗入受到抑制，而缓和发炎症状。
[0153] (3)分形素（Fractalkine)(CX3CLl)
[0154] 表现于活性化血管内皮细胞、神经细胞、树状细胞及肠管上皮细胞。由发炎系细胞 素的TNFa、IL-l或IFNy等发炎性刺激，诱导CX3CL1的表现。在生物体内存在有膜结合型及 分泌型两种形态，不仅是作为趋化素，也表现整合素(integrin)非依存的细胞接着能力，可 作为细胞接着分子发挥功能。分泌型趋化素对于NK细胞、T细胞及单核球显示细胞趋化活 性。CX3CL1也具有血管新生作用。已知分形素-CX3CR1的表现与关节风湿免疫疾病或动脉硬 化等各种疾病相关。期待藉由阻碍CX3CL1，可抑制对滑膜组织的发炎细胞的渗入，以抑制关 节风湿免疫疾病等以关节炎为首的发炎。
[0155] (4)sICAM_l(CD54)
[0156] CD54(ICAM-1: Intercellular Adhesion Molecule 1)属于免疫球蛋白超级家族 的接着分子，为膜穿透型糖蛋白质，常见于许多细胞中。CD54与细胞接着分子LFA-1(淋巴球 机能相关抗原1)结合，在发炎或免疫反应的细胞间相互作用担任重要角色。已知ICAM当中， sICAM(soluble Intercellular Adhesion Molecule)经由ICAM控制免疫反应，在自体免疫 疾病、内分泌疾病、胃癌、胰脏癌、乳癌等的表现上升，推测因此抑制细胞伤害性T细胞、自然 杀手细胞对癌细胞的攻撃，而促进癌转移。
[0157] (5)MIG(CXCL9)
[0158] CXCL9为14kDa的趋化素，且是CXC趋化素家族的一员。CXCL9在巨噬细胞或单核球、 嗜中性球、APC、B细胞或嗜酸性球中被特异的诱导，其诱导机制是经由IFN γ -JAK、STAT讯息 传达路径。因此，被干扰素 γ所诱导的单核球性细胞素，也称为干扰素 γ诱导单核细胞因子 (Monokine induced by gamma interferon，MIG)。又，在静脉内皮细胞或皮肤纤维母细胞 中，TNFa所引起的CXCL9的诱导被促进。CXCL9于肠管上皮也进行构成性表现。若干研究报告 指出此趋化素的主要机能为召集针对感染或发炎处的白血球，藉由格兰氏阴性或阳性细菌 的感染活化CXCL9XXCL9与关节风湿免疫疾病等免疫反应或慢性发炎有密切的相关。推测 CXCL9的表现也作为T细胞的召集与活化的媒介，对干癣或肺疾病也可能具有作用。也表现 于皮肤移植数日后、排斥反应发生前。
[0159] (6)VEGF(VEGF_A/血管内皮生长因子(vasculotropin))
[0160] 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)为与血管新生 相关的因子之一，在固态癌的增殖中担任重要角色。VEGF-A具有对于血管内皮细胞的增殖 因子及血管穿透性的亢进因子等2种性质。VEGF-A的遗传基因表现受到增殖因子或动情素、 低氧等而被诱导。VEGF的阻碍为实质固态癌治疗的正确战略的事实，可由对VEGF特异结合， 以阻碍其机能的抗体药癌思停(Bevacizumab)显示优良的延命效果获得证明。再者，关节风 湿免疫疾病的小鼠模型或动脉硬化模型等也显示与VEGF相关。VEGFR经由发炎细胞的动员 或机能活化而与发炎深切相关，可谓其表现的抑制与抗发炎作用连结。
[0161] (7)IL-17
[0162] IL-17(IL-17A)为从小鼠活性化T细胞cDNA库被鉴定的细胞素 CTLA-8。已知IL-17 的作用为与IL-6、G-CSF、CXCL1、CXCL8 (仅人类)等主要嗜中性球的活化、趋化相关的细胞 素/趋化素及防御素(β-Defensin)或S100家族等抗菌胜肽的表现诱导。对胶原蛋白诱导 关节炎或自体免疫性脑脊髓炎等自体免疫疾病，相对于IFN- γ或IL-12缺陷小鼠并无抑制 反而恶化，IL-17缺陷小鼠有更强的抑制，在使用抗IL-17抗体的人类临床试验中，显示对于 关节风湿免疫疾病或干癣的有效性，表示IL-17表现的抑制对于发炎性疾病的改善有效。
[0163] (8)胸腺趋化素 (Thymus Chemokine)(CXCL7)
[0164] CXCL7主要伴随着源自血小板的活化而产生，促进嗜中性球或嗜碱性球、纤维母细 胞、单核球的趋化，促进纤维母细胞的增殖或玻尿酸、葡萄胺聚醣、PGE2等的分泌。或促进来 自嗜碱性球的组织胺的释放。CXCL7表现的抑制会抑制嗜中性球等的渗入，由于防止组织胺 的释放促进，表示抗发炎性的作用。
[0165] 细胞素/趋化素数组（生物体外）的结果表示于表1及图4。表1及图4中，「（_)」表示 无添加 IL-li3，「（ + )」表示添加 IL-lKPa5对各种细胞素/趋化素的诱导显示强的抑制。又， Pa5'对分形素(CX3CL1)、IL-17及胸线趋化素(CXCL7)的诱导显示强的抑制。
[0166] [表 1]
[0167]
[0168] 由上可知，Pa5及Pa5'可抑制许多发炎性趋化素/细胞素的诱导，具有优良的抗发 炎作用。
[0169] (实施例6)
[0170]为了检验Pa9的抗发炎作用，调查一氧化氮(N0)产生的抑制作用。
[0171] 培养与实施例4相同的取自大鼠的肝细胞，培养开始后第1天，将细胞移入不含血 清及荷尔蒙的新WE，于培养皿中添加重组的大鼠 IL-Ιβ(与实施例4相同）及实施例3中以甲 醇萃取的Pa9。各个培养皿中的浓度分别为IL-Ιβ: lnM、Pa9:10μΜ、50μΜ及100μΜ(图5)。自添 加 IL-Ιβ及Pa9起8小时后，与实施例4相同测定各培养皿中Ν0量。
[0172] 图5中大鼠肝细胞的N0产生量测定的结果，于图6表示IC5Q値(N0产生50%时的药剂 浓度）。图5中，「（_)」表示无添加 IL-Ιβ，「（ + )」表示添加 IL-li^Pa9依用量会抑制因 IL-Ιβ所 弓丨起的NO产生（图5)。又，Pa9的IC5Q値为32μΜ(图6)。
[0173] 如上所示，Pa9显示具有高NO产生抑制作用。因此，可知Pa9具有优良的抗发炎作 用。
[0174] 此外，在未超出本发明的广义精神和范围下，本发明可作成各种实施例及进行变 化。此外，上述实施例仅用来说明本发明，并非是用来限定本发明的范围。换句话说，本发明 的范围不是由实施例的记载来解释，而是由权利要求书的记载来解释。并且，在权利要求书 内以及与权利要求书同等的发明意义的范围内所实施的各种变化也涵盖在本发明的范围 内。
[0175] 本发明的优先权基础案为2013年9月2日于日本申请的日本特愿2013-181052号申 请案。本说明书中援用了日本特愿2013-181052号申请案的说明书、权利要求书及附图的所 有记载。
【主权项】
1. 一种化合物，其特征在于，是以下述式(I)或式（Π)表示，2. -种医药品，其特征在于，是以下述式（I)、式（Π)或式（ΙΠ)表示的化合物作为有效 成分，3. -种抗炎剂，其特征在于，是以下述式（I)、式（Π)或式（ΙΠ)所示的化合物作为有效 成分，4. 一种化妆品，其特征在于，是含有下述式(I)、式（Π)或式(ΙΠ)所示的化合物，5. -种饮食品，其特征在于，是含有下述式(I)、式（Π)或式(ΙΠ)表示的化合物，6. -种化合物，其特征在于，是由紫苏科植物经由萃取处理制得，以下述式（I)、式（Π) 或式（ΙΠ)表示，7.-种下述式（I)、式（Π)或式（ΙΠ)所示的化合物的制造方法，其特征在于，是包含将 紫苏科植物萃取处理的步骤，
【专利摘要】本发明提供一种具有优良抗发炎作用的化合物、医药品、抗炎剂、化妆品及饮食品，以及所述化合物的制造方法。解决上述问题的手段为以下述式(I)或式(Ⅱ)表示的化合物。医药品是以下述式(I)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)表示的化合物作为有效成分。
【IPC分类】A61P29/00, A61K31/37, C07D311/32, A61Q19/00, A61K8/49, A61K36/53, A23L33/10, A61K31/352
【公开号】CN105492431
【申请号】CN201480048324
【发明人】池谷幸信, 西泽干雄, 三浦健人
【申请人】株式会社日本阿明诺化学, 学校法人立命馆
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年3月5日
【公告号】EP3042897A1, US20160207901, WO2015029473A1
最新回复(0)