锰基磁共振造影剂的制作方法
锰基磁共振造影剂的制作方法
【专利说明】猛基磁共振造影剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月7日提交的美国专利申请第61 /749，614号的优先权。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明经政府支持在国家癌症研究所(National Cancer Institute)和国家研究 资源中心（National Center for Research Resources)授予的基金号CA161221 和RR14075 的资助下完成。政府对本发明拥有某些权利。
[0005] 发明背景 1 .发明领域
[0006] 本发明涉及用于磁共振成像的造影剂。本发明还涉及用于制备所述造影剂的方 法。 2.【背景技术】
[0007] 当基质（例如人类组织)受到均匀磁场(极化场Bo)作用时，该组织中的激发核的各 磁矩会趋于沿着该极化场排列，但是以它们的特征拉莫尔频率(Larmor frequency)以随机 次序围绕该极化场进动。如果该基质，或组织，受到位于χ-y平面内并且具有接近拉莫尔频 率的磁场（激励场以）作用时，则沿着磁场方向的净磁矩（Mz)，可能会旋转或"翻转 (tipped)〃进入该x-y平面，以产生横向的净磁矩Mt。由所述激发核或〃自旋（spin) 〃发出信 号，在该激发信号出结束之后，该信号可被接收并处理以形成图像。
[0008]在磁共振成像(MRI)系统中，激发的自旋诱导接收线圈中的振荡正弦波信号。该信 号的频率接近拉莫尔频率，并且其初始振幅通过横向磁矩Mt的大小来确定。发出的NMR信号 的振幅(A)随时间（t)以指数形式衰变。衰变常数1/T* 2取决于磁场的均匀性和!^，其被称为" 自旋-自旋弛豫"常数，或"横向弛豫"常数。该Τ2常数与，从完全均匀磁场去除激发信号出之 后，所述自旋沿磁场进动将会发生的去相位的指数速率成反比。Τ 2常数的实际价值是:不同 组织会具有不同的^值，而这可被用作提高所述不同组织之间的对比度的手段。
[0009]对NMR信号的振幅Α产生作用的另一个重要因素被称作：自旋-晶格弛豫过程，其用 时间常数!^来表征。其描述:净磁矩Μ沿着磁性极化的轴(z)朝向其平衡值的恢复弛豫与 自旋相干性的减小相关联，而h弛豫的出现归因于探测位点的顺磁性迀移，以及结合的质 子与周围的体相水(bulk water)的后续交换。^时间常数(其被称作"自旋-晶格弛豫"常数 或"纵向弛豫"常数)比T2*，在医学领域感兴趣的大多数基质中要长得多。如同T 2常数，可利 用不同组织之间的h的差异来提供图像对比度。
[0010] 这些弛豫时间常数的倒数被称作弛豫速率，并且表示为办和此，其中R! = 1/h，而R2 =I/T2 ο
[0011] 造影剂是能够改变组织的弛豫性质，并且诱导图像对比度的外源性分子或物质。 造影剂通常是顺磁性、超顺磁性或铁磁性物质。造影剂有时也被称为成像探针。
[0012] 所给造影剂能够改变弛豫速率的程度被称为弛豫度(relaxivity)。弛豫度定义为 采用造影剂和不采用造影剂检测的样品的弛豫速率差异。然后，使该弛豫速率差异对于造 影剂的浓度进行标准化。弛豫度表示为小写字母"r"，所带下标"Γ或"2"分别指的是纵向或 横向弛豫度。例如，纵向弛豫度(η)定义为其中心是存在造影剂时检测到 的弛豫速率（以?Γ 1计hR，是不存在造影剂时检测到的弛豫速率（以?Γ1计），而C是造影剂的 浓度（以mM计）。弛豫度的单位是:πιΜΛ'对于包含多于一种金属离子的造影剂，弛豫度可 以金属离子浓度的方式（7离子或'离子弛豫度'）表达，或者以分子浓度的方式（7分子'或 '分子弛豫度'）表达。弛豫度是造影剂的固有性质。
[0013] 为了引发临床上希望的对比度，已经开发出了经设计以影响弛豫时长的MRI造影 剂。意料之中的是，存在临床上用于调节^对比度的造影剂，和临床上用于调节^对比度的 造影剂。
[0014] Tr加权的（T1W)成像提供这样的图像对比度：当水在某一组织或区域中具有短h 时，图像中的该组织或区域是明亮的（信号强度增加）。增加图像对比度的一种方式是给予 基于钆(Gd)、锰(Μη)或铁的顺磁性络合物或物质。这种顺磁性造影剂使水分子所对应的h 变短，从而导致正性图像对比。如上所述，所给造影剂的浓度能够改变!^的程度代表弛豫 度。弛豫度较高的化合物提供的Tw信号增强大于弛豫度低的化合物;或者，高弛豫度化合 物可以提供与低弛豫度化合物等同的信号强度，而在该情况下，其所需浓度低于低弛豫度 化合物。因此，高弛豫度化合物是人们希望的，因为它们能够提供病灶出的较大增强，从而 提高诊断置信度;或者，它们可以较低剂量使用，从而改善造影剂的安全系数。
[0015] 临床应用中主要采用的磁共振造影剂是+3氧化态的钆离子。+2氧化态的锰离子也 可被用作1'1弛豫剂。猛福地吡(13]^3；1；'〇(1丨口；[1')(冠以商标名称16 81380311，以猛福地吡三钠 (mangafodipir trisodium)销售)是一种造影剂，其经静脉内递送以增强肝的磁共振成像 (MRI)中的对比度。它包含顺磁性锰(II)离子和螯合剂福地吡(二磷酸二吡哆盐）。锰缩短纵 向弛豫时间（??，从而使正常组织在磁共振图像中显得更加明亮。弛豫度与Gd基造影剂一 样高的Μη基试剂已被描述(参见例如，Inorg Chem 43:6313-23,2004)。
[0016] 钆磁共振造影剂的一个缺点是，生理学条件下，钆离子仅在+3氧化态状态下稳定。 此外，钆基造影剂在肾功能受损患者中的应用与被称为肾源性系统性纤维化(NSF)的罕见 但严重的纤维化疾病之间存在成熟建立的联系。
[0017] 锰基磁共振造影剂的进一步改进在增强对比度的应用中将有巨大可用性。在生理 学条件下，锰能评估多种氧化态，其中+2氧化态最适于TjPT 2对比度。这可被用于非侵入性 的组织氧化还原动力学研究。对于NSF风险较高的患者群体，锰基造影剂还可作为钆的可行 替代物。
[0018] 发明概述
[0019] 在健康组织中，胞内和胞外氧化还原环境是经严格调控的，并且与细胞的生理学 状态紧密相关。然而，在细胞应激、损伤或细胞死亡期间，该调控常被扰乱。虽然局部氧化还 原状态的动力学在介导各种生物过程(例如细胞周期进程、免疫应答和创伤愈合）中起重要 作用，但已将胞外氧化还原环境的持续失调与多种病理学(包括慢性炎症、肿瘤生长和癌细 胞侵袭)联系起来。事实上，氧化还原在肿瘤生物学中所起的作用始终是一大活跃研究领 域，并且是当前开发中的多种氧化还原活化的前药的聚焦点。新成像方法必然会促进这些 努力，同时进一步增进我们对于氧化还原动力学与疾病的关系的基础理解。
[0020] 已经报道了若干氧化还原活化的分子成像探针，其各自利用独特的活化机制以针 对氧化还原环境的特定方面。这些探针中的一些靶向缺氧(低氧压）的组织，该缺氧状况可 因肿瘤中有时出现的对受影响区域的血液供应中断或血管形成不充分所致。正电子发射断 层扫描探针 18F-氟咪索硝唑(18F-MIS0)和64Cu-二乙酰-双(N4-甲基氨硫脲）（ 64CU-ATSM)已在 临床上应用以对肿瘤缺氧区域成像。已证实电子顺磁共振(EPR)成像和基于氧化还原敏感 性的氮氧自由基的光谱探针有效于检测巯基化合物以及其它还原性物质的相对丰度。磁共 振(MR)探针也已有报道。示例包括Gd(III)络合物，其中配体能够形成可逆二硫键，由此胞 外蛋白质的半胱氨酸侧链提供局部氧化还原状况的间接视图，Mn(III)-卟啉，其经历还原 作用成为在缺氧条件下具有较高弛豫度的Mn(II)物质，以及最近报道的，Eu(III)络合物 对，其可在β-NADH存在时通过配体侧臂的还原而被活化。
[0021] MR是一种图像氧化还原动力学的具有吸引力的疗法，因为其允许对完整、不透明 的有机体进行三维检测，其在高场系统上具有细胞分辨率(约?〇μπι)，且在临床扫描仪上具 有亚毫米分辨率。MRI的深组织穿透力和高分辨率使其能够直接翻译从细胞到小鼠到人类 的结果。
[0022] 采用氧化还原敏感性MR探针的一个方式是采用氧化还原活性金属离子。用于大多 数MR探针中的Gd(III)在水性介质中仅具有一种稳定的氧化态。然而，锰能够根据配位场以 多种氧化态稳定存在。高自旋Mn(II)络合物还能产生与最佳Gd(III)络合物相当的弛豫度， 并且，近期已有尝试采用Mn(II)络合物作为MR探针。本文中，我们提出基于Mn(II)/Mn(III) 氧化还原对的一类新型氧化还原活化的MR探针。
[0023] 锰离子能够稳定地或亚稳定地以不同的氧化态存在。我们已确认了锰以不同氧化 态存在的能力的优势。我们显示，能够制出结合至锰的配体，并使其稳定在+2和+3氧化态。 Mn(II)络合物的弛豫度远高于Mn(III)类似物。我们还显示，能够以导致一种氧化态被优选 的方式来修饰该Μη结合配体。该氧化还原活性络合物的好处在于，它们能够起到传感器的 作用。例如，我们显示，Μη(ΙΙΙ)络合物可通过谷胱甘肽的生理学浓度被还原成Μη(ΙΙ)络合 物，这进而导致磁共振信号增加。因此，这些络合物能够作为谷胱甘肽或其他生物学还原剂 的传感器。
[0024] 我们还显示，某些锰络合物能够随pH变化而改变其弛豫度。酚盐-0和磺酰胺-Ν配 体均为酸可分离的，并且调节锰和体相水的相互作用，这影响弛豫度。在我们的实施例中， 弛豫度随pH降低而增加，从而这些化合物能够作为pH和酸中毒的传感器。酚盐和磺酰胺供 体的pK a值是高度模块化的，并且经得起合成性微调的检验。低胞外pH是组织局部缺血（例 如，中风、缺血性心脏病、肾缺血)和许多肿瘤的标志。
[0025]我们还开发了一种新型配体，称为CyP3A。该配体被设计为以热力学稳定和动力学 惰性的方式与Mn(II)螯合，同时允许Mn(II)与水发生直接相互作用。动力学数据指示， CyP3A的锰络合物对Zn (II)金属转移的惰性高于⑶TA (环己二胺四乙酸）的Μη (II)络合物， 其显示出优于文献的前述特征的最佳平衡。CyP3A的吡啶基-Ν供体是模块化的，并且提供附 加另一个配体供体的简易方式，其能够可逆地占据由水占据的配位点。该支架对于可能的 pH-传感应用而言是理想的。
[0026]此外，我们制备了包含六个Mn(II)螯合剂的高分子量O2000MW)的多聚体。高分子 量使分子在溶液中的翻转更为缓慢，并且显著提高了 Mn(II)弛豫度。
[0027] Μη基造影剂的另一个好处在于，存在发出正电子的锰同位素(Mn-51和Mn-52)，这 使将这些络合物作为正电子发射断层摄影(PET)剂的应用成为可能。此外，通过用PET同位 素交换天然Mn-55,能够简易地制备双重MR-PET探针。此类探针能够用于新型复合型MR-PET 扫描仪，其中这两种方式均可用于检测该探针。该方法的一个好处在于，能够对生理学参数 (例如pH、还原电位或离子流量)进行更加准确、定量的检测。
[0028]通过以下详述、附图和所附权利要求书可以更好地理解本发明的这些特征、方面 和优点，以及其他的特征、方面和优点。
[0029]附图简要说明
[0030] 图1显示配体结构强力影响Μηπι/Μηπ对的氧化还原电位。羧酸供体向酚供体的转 化使半电池电位迀移了有利于较高氧化态的649mV。
[0031] 图 2 显示：图（a)中，内含 Mnn-HBET(25mM)的 25mM TRIS 缓冲液（pH = 7.4)以 500mM KN〇3作为支持电解质的100mV/s下的循环伏安图。电位是对比K4Fe(CN)6/K 3Fe(CN)6;而图（b) 中，是Mn2+/Mn3+对-i a(递减线）和(递增线）对比，v(其中v =扫描速率）的科特雷尔 (Cottrell)图。
[0032] 图3显示：左图：以4.7T的内含纯水、pH 7.4TRIS缓冲液中的0.5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ和 0.5mM Μηη-ΗΒΕΤ的管记录的IV加权的MR图像。右图：以室温和4.7Τ检测的弛豫度。
[0033]图4显示(a)经375nm处处的特征紫外吸光度测定，在TRIS缓冲液(pH7.4,37°C)中， 通过10mM GSH从0.5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ还原成Μηπ-ΗΒΕΤ导致增加的质子弛豫速率（1/T!，左轴） 和随之减少的Mn m-HBET的摩尔分数(右轴）。（b)由LC-MS在26°C监测，通过ImM GSH的0 · 5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的还原。在还原过程中没有观察到长久存在的中间体物质。
[0034] 图5显示氧化环境和还原环境中的Μη2+/Μη3+造影剂。
[0035]图6显示2'-((2-((羧甲基）（2_羟基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸（IfflET) (3) 、2'-((2-((羧甲基）（2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸(HBET-0Me) (8)和2'-((2-((羧甲基）（2-羟基-5-硝基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸(HBET-N02) (12)的完整合成方案。
[0036]图7显示(a)配体HBET⑶的分析LC-MS痕迹，其中在220nm处的痕迹（黑线A)指示高 样品纯度，并且对于m/z = 341的萃取离子以红线B显示，其与上述痕迹叠加;和(b)3的ESI-MS显示对应于[M+H]+的m/z = 341。
[0037] 图8显示C18反相柱上的（a)MnnHBET(4)和(b)MnniHBET(5)的分析LC-MS痕迹；其中 220nm处的痕迹(黑线A)指示高样品纯度，m/z = 394和393的萃取离子以红线B显示。
[0038] 图9显示（a)MnnHBET(4)在水中的紫外光谱；和（b)MnnHBET(4)的ESI-MS，显示对 应于[M+3H]+的 m/z = 394。
[0039] 图 10 显示（a)MnmHBET(5)在水中的 UV 光谱；和（b)MnmHBET(5)的 ESI-MS，显示对 应于[M+2H]+的 m/z = 393。
[0040] 图 11 显示(a)Na[MnmHBET](5)和(b)Na2[MnnHBET](4)在 TRIS 缓冲液中的弛豫度。 (4) 和(5)的[Μη]在37°C于pH 7.4的TRIS缓冲液中检测。线的斜率表示弛豫度。
[0041 ] 图12显示：包含KN〇3作为支持电解质的内含MnnHBET(25mM)的TRIS缓冲液(pH = 7.4)在50-600mV/s范围内的不同扫描速率下的循环伏安图。
[0042]图13显示:通过375nm处吸光度的下降（点线）检测到的在谷胱甘肽存在下，ΜηΠΙ- HBET向Μηπ-ΗΒΕΤ的转化。实线显示观测数据与Mnm在伪一级条件下的一级速率方程(参见 下方等式S1)的拟合。
[0043]图14显示：在大幅过量的还原的谷胱甘肽的存在下，氧化还原反应表现为对应于 [ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ]的伪一级。各线的斜率等于-k · [GSH](参见下方等式Slha.)谷胱甘肽的浓度 随各反应变化，但ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的初始浓度(0.6mM)不变。b.)初始Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ浓度变化，而谷胱 甘肽浓度(10mM)维持恒定。
[0044] 图15显示：在三种不同的谷胱甘肽浓度下，ΜηΠΙΗΒΕΤ还原的初始速率与Μη ΠΙΗΒΕΤ 浓度的关系图。各线的斜率(ki察)等于-k· [GSH](参见下方等式S1)。
[0045]图16显示:采用还原剂(GSH)和氧化剂(H202)时在两种氧化态之间的相互转化。 [0046]图17显示：（a)图，采用内含ImM H2〇2的TRIS缓冲液(pH 7.4,37°C)，然后进行弛豫 度检测（左轴）和UV-ViS光谱检测的，0.5mM Μηπ-ΗΒΕΤ向ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的氧化，其中375nm处的 紫外吸光度的增加指示随时间（右轴)推移形成Μη ΠΙΗΒΕΤ的变化关系;和(b)图，由LC-MS，通 过ImM H2〇2在26°C监测的0.5mM Μηπ-ΗΒΕΤ。
[0047]图 18显示：内含(a)0.5mM ΜηπΗΒΕΤ和（b)0.5mM ΜηΠΙΗΒΕΤ的TRIS缓冲液(ρΗ=7.4) 的信号强度对比反转时间（ΤΙ)的代表性的图。注意:Μηπ-ΗΒΕΤ的较快信号恢复指示，相较于 ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ具有较短TdP较高弛豫度。
[0048]图19显示本发明的cycHBET系列化合物的合成途径。
[0049] 图20A显示37°C下pH 7·4的内含（a)Na2[MnπHBET](4)和（b)Na[MnΠIHBET](5)的 TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0050] 图20B显示37°C下pH 7.4的内含Na2[MnπHBET-0Me](9)的TRIS缓冲液的弛豫度。线 的斜率表示弛豫度。
[0051 ]图20C显示37°C下pH 7·4的内含Na2[MnπHBET-N02](13)和Na[MnΠIHBET-N02](14) 的TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0052] 图20D显示37°C下pH 7.4的内含Na2[MnπcycHBET](30)的TRIS缓冲液的弛豫度。线 的斜率表示弛豫度。
[0053] 图20E显示37°C下pH 7·4的内含Na2[MnπcycHBET](2)和Na[MnπcycHBET-N02](25) 的TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0054] 图21显示配体及其对应的锰络合物：（a)HBET、（b)HBET-0Me和（c)HBET-N02的pH-滴定曲线。
[0055] 图22显示：（a)监测的Na2[MnnHBET](4)的UV光谱与pH的关系。（b)288nm处的吸光 度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定pKa 7.64拟合。
[0056] 图23显示：（a)监测的Na2[MnnHBET-0Me](9)的UV光谱与pH的关系。（b)308nm处的 吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定 口17.91拟合。
[0057] 图24显示：（a)监测的1:1Μηπ:ΗΒΕΤ-Ν02的UV光谱与pH的关系。（b)396nm处的吸光 度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定pKa 4.84拟合。
[0058]图 25 显示：对于(a)HBET，（b)HBET-〇Me 和（c)HBET-N02，l:lMn2+:配体滴定的弛豫度 的变化与pH的关系。
[0059] 图26显示：（a)内含Μηπ-ΗΒΕΤ的25mM TRIS缓冲液(ρΗ=7·4)，以500mM KN〇3作为支 持电解质的l〇〇mV/s的循环伏安图。电位是对比K4Fe(CN)6/K3Fe(CN) 6<3(b)Mn27Mn3+对-ia(递 减线)和i。(递增线)对比，v(其中v =扫描速率)的科特雷尔图。
[0060] 图27显示(a)监测的Na2[MnncycHBET](20)的UV光谱与pH的关系；和(b)296nm处的 吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定 口17.95拟合。
[0061 ]图 28 显示（a)监测的 Na[Mn(cycHBET-N02)](26)的 UV 光谱与 pH 的关系；和（b)396nm 处的吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的 给定?15.01拟合。
[0062] 图29显示:pH 7.4下的Na2[MnnHBET] (4)的循环伏安图；半电池电位是379mV对比 常规氢电极(NHE)。
[0063] 图30显示：pH 7.4下的Na2[MnnHBET-0Me](9)的循环伏安图；半电池电位是344mV 对比NHE。
[0064] 图31显示：pH 7.4下的Na[Mn(HBET-N02)(14)的循环伏安图；半电池电位是476mV 对比NHE。
[0065] 图32显示:pH 7.4下的Na[Mn(CycBET)](21)的循环伏安图；半电池电位是365mV对 比歷。
[0066] 图33显示：pH 7.4下的Na[Mn(cycHBET-N02)](31)的循环伏安图；半电池电位是 488mV 对比 NHE。
[0067] 图34显示:N-Tos_DTTA( 33)的合成方案。
[0068] 图35显示:pH 7.40下T2与33:Mn2+比例的关系图。
[0069]图36显示:pH触发351-和352-之间的相互转化。
[0070] 图37显示:37°C下20MHz(A)和60MHz(B)下的342-/34卜的^值的pH依赖性。
[0071]图38显示:本发明的Mn(II)螯合剂(40)的合成。
[0072]图39显示:本发明的Mn(II)螯合剂(45)的合成。
[0073]图40显示:本发明的六聚体配体(55)的合成。
[0074]图41的框图是采用本发明的造影剂的示例性磁共振成像(MRI)系统。
[0075] 图42的框图是适用于本发明的造影剂的示例性发射断层摄影系统。
【具体实施方式】
[0076] 对于可用的氧化还原活化的MR探针的一些要求：（1)生物学相关的还原剂(如谷胱 甘肽(GSH))可得到的氧化还原半电池电位；（2)使两种氧化态稳定的配体，从而还原或氧化 不导致分解；（3)活化时的强力信号增强；（4)病理存在下增强的信号变化，即，开启的探针； 和(5)就成像时程而言表现迅速的动力学。
[0077]氧化还原活性探针的一个关键设计特征是：鉴定使两种氧化态稳定的配体。EDTA (乙二胺四乙酸)与一个配位的水共同配体形成非常稳定的7-配位Mn(II)络合物，而2+氧化 态是非常有利的，参见图1。相比之下，如ΗΒΗ)(Ν，Ν'_二(2-羟基苄基)亚乙基二胺-N，N'_二 乙酸)或EHPG(N，Y -亚乙基双[2 (0-羟基苯基）]甘氨酸）中的两个羧酸供体向酚供体的变化 非常有利于具有6号配位的Mn(III)络合物，参见图1。
[0078]我们假设具有配体结构的HBET(羟基苄基亚乙基二胺三乙酸）（图1)(是介于EDTA 和HBED之间的中间体)-仅包含一个酚供体-可能对于各氧化态显示亚稳定性。因此，该物质 的氧 化态将对氧化还原环境的变化高度敏感。为验证该假设，我们制备了ΗΒΗ)、HBET和EDTA 的锰络合物，以测试有多少酚盐基团造成Mn(III)/Mn(II)氧化还原对的半电池电位。内含 Μηπ-ΗΒΕΤ的TRIS缓冲液的循环伏安法（参见图2)显示位于0.356V处的可逆氧化峰（对比 K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6)，指示该分子用作氧化还原探针的电位。在50-600mV/s范围内，阳极 (i a)和阴极电流(U与扫描速率(v)的平方根呈线性关系(参见图2b)，指示这是一个扩散控 制过程。另一方面，Mn n-EDTA和Mnm-HBED显示不可逆氧化和准可逆还原峰，半电池电位 (Μηπ/Μη πι)分别为 0 · 633V和 0 · 016V。
[0079] ΗΒΕΤ(羟基苄基亚乙基二胺三乙酸）如下合成:单B0C-保护的亚乙基二胺与水杨醛 的还原胺化，随后用叔丁基溴乙酸烷基化，然后进行酸去保护以产生总体产率为45%的游 离配体。一当量配体与MnCl2的反应导致分离产率为84%的Μη π-ΗΒΕΤ。合成的ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ络 合物产率为38%，通过MnCl2在一当量配体在碱性条件下空气氧化，然后通过RP-HPLC纯化 得到。HBET配体使两种氧化态稳定至如下程度:Μη π-ΗΒΕΤ和ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ能够通过标准RP-HPLC系统以其纯形式被简易地分开并分离。两种络合物在磷酸盐和碳酸盐缓冲液中均稳 定。
[0080]在1.4Τ的TRIS缓冲盐水（TBS:pH 7.4,37。〇中独立检测Μη Π -ΗΒΕΤ和Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ 络合物的!^弛豫度，检测值分别是2.76111^1^1和Ι.Οδ??Μ??Γ1。该弛豫度的差异很大程度上考 虑到Mn m态仍具有四个未成对的电子。图3中，我们显示了包含纯水或等摩尔Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ或 Μηπ-ΗΒΕΤ的测试管在4.7Τ下的IV加权的MR图像。顺磁性络合物的存在导致高于纯水的信 号强度。Μη Π -ΗΒΕΤ的较高弛豫度以其更加明亮的图像而显见。4.7T下的^检测结果显示还 原的Μηπ-ΗΒΕΤ形式的弛豫度高出3.3倍，参见图3。
[0081 ]在谷胱甘肽的存在下，ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ络合物容易被还原成Μη11态。该转化似乎直接转 到产物，而没有任何长久反应中间体累积或副产物形成。这通过图4b中所示的时程实验证 明，其中Μηπ-ΗΒΕΤ络合物的出现与Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ的消耗同时发生。该反应的进程也可利用临 床成像相关的条件（1.4T，37°C)通过弛豫计(relaxometry)来实时跟进(参见图4a)。鉴于Μη (II)络合物的弛豫度大于Μη (III)络合物，水质子（1 /Τ!)的纵向弛豫速率将与反应中的Μη Π -ΗΒΕΤ的浓度成比例增加。Mn(IIl)络合物向Μη(ΙΙ)络合物的直接转化通过如下观察结果 得到进一步证实:通过紫外吸光度检测，Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ物质的形成速率有效地等于氧化形式 的消耗速率(参见图4a)。
[0082] 在37°C(pH 7.4)进行了一系列动力学实验来确定用谷胱甘肽还原MnΠI-HBET的经 验速率方程。ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ络合物在水中于375nm处具有强吸收谱带（ε = 1.38x 103M-Vm-1)，但 Μη n-HBET络合物的紫外光谱中不存在该谱带。该特征允许我们容易地监测ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ随时 间的还原。我们检测了三种不同的谷胱甘肽浓度(5mM、10mM和20mM)下的初始反应速率。对 于各谷胱甘肽浓度，反应以四种不同的Μ ΠΙ-ΗΒΕΤ初始浓度(0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM)进 行。基于这些实验，我们确定[GSH]和[Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ]均为一级反应，其中总体二级速率常数为 (3·8±0·3)χ 10-、
[0083] 考虑到其在生物学成像中的应用，任何可活化的探针的动力学性质都极为重要。 氧化还原活化的探针的情况中，向活化态的转化必须在生理学相关的氧化还原范围中有效 发生，并且还应相对于探针的洗出速率而言表现迅速。细胞中还原谷胱甘肽的浓度通常是 Ι-lOmM。在该范围中，ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ络合物的半衰期约为3~30分钟。相比之下，血浆中（其中谷 胱甘肽水平约低三个数量级）的半衰期将大于一周。因此，我们预期探针活化将主要限制在 负责调节胞外氧化还原的正常机制已被严重受损或被破坏的区域。
[0084]总而言之，Μηπι/Μηπ-ΗΒΕΤ氧化还原对满足了用于氧化还原成像的探针所需的多 个关键标准。生物学相关的还原剂(如谷胱甘肽)可获得氧化还原半电池电位;其在转化成 MR活性态之后显示良好的信号增强;并且活化动力学相对于成像时程而言表现迅速。谷胱 甘肽动力学研究证实，该还原在生理学谷胱甘肽浓度的存在下进行迅速。该系统表现极优， 并且两种氧化态之间的相互转化通过简单、可逆的单电子进程发生。循环伏安法证实，这是 可逆进程。此外，我们注意到，该HBET配体能够容易地被合适的芳基取代基修饰，以调整氧 化还原电位，或纳入具有特定生物学靶向的部分，在分子MR成像中开辟新途径。
[0085] 本发明的一个示例性实施方式中，所述造影剂用于诊断成像技术，例如磁共振成 像(MRI)，和/或并行MRI和正电子发射断层摄影(PET)。〃对象〃是哺乳动物，优选人类。
[0086] 造影剂给予对象时的形式并不关键。例如，本发明的造影剂可直接给予诊断成像 的组织，给予与该组织接触的体液，或给予该造影剂能够扩散或传递给所述诊断成像的组 织的身体部位。
[0087] 该造影剂可单独给予，或者作为药学上可接受组合物的部分给予。本发明药物组 合物中，本发明的造影剂、药学上可接受的运载体和任何其它活性成分的相对的量将根据 治疗对象的特性、体型和身体状况而变化，并且也根据所述造影剂的给予途径而变化。所述 造影剂可包含能够靶向对象中感兴趣区域的靶向部分。所述靶向部分可选自：蛋白质、酶、 肽、抗体和药物。任选包含其它药物活性化合物的本发明的造影剂可通过胃肠外方式给予 对象，例如，静脉内、肌内、皮下、脑内或鞘内给予。
[0088] 本发明的一个非限制性示例性实施方式是用于磁共振成像的造影剂。所述造影剂 包含式(I)的化合物：
[0089]
坱所还化贫物的约字上~按艾的盐，坱所还化贫物的怔置并构怀，兵甲1Γ迕按至 苯环上的不同的碳，其中R1选自下组：取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、 取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基 芳烃，和二亚烷基杂芳烃，其中R2选自下组:氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、 杂芳基、卤素、氰基、硝基、羟基和烷氧基，其中η是2或3,并且其中，当η是2时，所述化合物任 选地包含与Μη配位的水。
[0091 ]在的所述造影剂一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(II):
[0092] 'W'
:〇
[0093] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(III):
[0094
[0095]在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(IV):
[0096]
ο
[0097] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(V):
[0098]
〇
[0099] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(Va):
[0100] ο
[0101] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(Vb):
[0102]
[0103]在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，R1是亚乙基。在所述造影剂的另一个 示例性实施方式中，R2是甲氧基。在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，R2是硝基。在所 述造影剂的另一个示例性实施方式中，R 1是环亚己基。在所述造影剂的另一个示例性实施 方式中，R1和R2中至少一个包含能够靶向对象中的感兴趣区域的靶向部分。所述靶向部分可 选自：蛋白质、酶、肽、抗体和药物。在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，Μη是发射正 电子的锰同位素。在所述造影剂的一个示例性实施方式中，所述造影剂在η = 2时具有较高 的弛豫度。所述化合物在体内可通过生物学还原剂(例如，谷胱甘肽)从式(1)(其中η = 3)转 化成式（1)(其中ri = 2)。或者，所述造影剂可被包含在药学上可接受的运载体中，所述运载 体还包含还原剂，以将所述化合物从式(I)(其中η = 3)转化成式(I)(其中η = 2).
[0104] 本发明的另一个非限制性示例性实施方式是用于磁共振成像的造影剂。所述造影 剂包含式(VI)的化合物：
[0105]
[0106] 或所述化合物的药学上可接受的盐，或所述化合物的位置异构体，其中R4连接至 苯环上的不同的碳，其中R 1选自下组：取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、 取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基 芳烃，和二亚烷基杂芳烃，其中R 3选自下组：取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚 烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二 亚烷基芳烃，和二亚烷基杂芳烃，其中R 4选自下组:氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、 芳基、杂芳基、卤素、氰基、硝基、羟基，和烷氧基，其中X是N或NH，其中当X是NH时，所述化合 物任选地包含与Μη配位的水，并且其中当X是N时，X与Μη配位。
[0107] 在所述造影剂的一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(VII):
[0108]
[0109]在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(VIII):
[0110
[0111] 当所述造影剂暴露至pH变化的环境中时，pH下降时，弛豫度增加。在所述造影剂的 另一个示例性实施方式中，R1和R 4中至少一个包含能够靶向对象中的感兴趣区域的靶向部 分。所述靶向部分可选自：蛋白质、酶、肽、抗体和药物。Μη可以是发射正电子的锰同位素。
[0112] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(IX):
[0113
[0114」 Mnn」以是友射止电于的锍问位索。
[0115]在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(X):
[0116]
[0117] 或所述化合物的药学上可接受的盐，其中R5是核结构，并且其中η是1~12的整数。 核结构可以是能够与式(X)的（）（括号）中的结构形成一个或多个醚基团的任何原子或原子 团。R 5可以是环状主链。R5可以是磷腈。在一个实施方式中，R5是Ν3Ρ 3。在一个实施方式中，η是 6 Jn可以是发射正电子的锰同位素。
[0118] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(XI):
[0119]
〇
[0120] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(XII):
[01 ?
[0122] 或所述化合物的药学上可接受的盐。Μη可以是发射正电子的锰同位素。
[0123] 以pH 7.4，37°C和1.4特斯拉的条件检测，式(I)~(XII)的化合物中的任一种的每 个-猛离子ri弛豫度可以是大于Ο.βη?Γ、'或大于0.5ηιΜ?、或大于1 .Οη?Γ、'或大于 1. SmM^s^1、或大于2. OmM^s^1、或大于2 . SmM^s^1、或大于SmM^s^1、或大于AmM^s^1、或大于 δπΛΓ、^1、或大于 、或大于 、或大于 βπΛΓ、^1、或大于 θπΛΓ^^1，或大于 lOmirS^1。
[0124] 本发明还提供一种用于对象体内成像的方法。给予所述对象式（I)~(XII)的任一 造影剂。等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点累积的一段时间；和，采用非 侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。给予所述造影剂的对象中的分子具有的改良的纵 向弛豫时间，这在图像中得以反映。所述非侵入性成像技术可以是磁共振成像，或采用磁共 振成像的正电子发射断层摄影。若所述非侵入性成像技术是采用磁共振成像的正电子发射 断层摄影，给予具有发射正电子的锰同位素的造影剂。
[0125] 本发明提供对对象的感兴趣区域成像的方法。给予所述对象式（I)~(XII)中的任 一种造影剂。使所述对象置于磁系统中，该磁系统被设置以产生围绕对象的至少部分的极 化磁场。对设置以向该极化磁场施加梯度场的多个梯度线圈通电。控制经设置以向该对象 施加激励场的射频(RF)系统来从中获得磁共振(MR)图像数据，并且从该MR图像数据重建感 兴趣区域的图像。若所述造影剂具有发射正电子的锰同位素，还可采用多个检测器来检测 从对象发出的γ射线，并传达该检测到的γ射线所对应的信号。从所述信号重建该对象的 感兴趣区域的一系列医学图像。
[0126] 本发明还提供一种感测对象中生物学还原剂的方法。给予所述对象式（I)~(Vb) 的任何造影剂，其中η是3(即，Μη处于氧化态3+)。等待足以允许所述造影剂在待成像的组织 或细胞位点累积的一段时间；和，采用非侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。受到所述 造影剂作用的包含所述生物还原剂(例如，谷胱甘肽)的细胞或组织具有改良的纵向弛豫纵 向弛豫时间，这在图像中得以反映。
[0127] 本发明还提供一种检测对象中具有不同pH水平的感兴趣区域的方法。给予所述对 象式（I)~（IX)的任何造影剂。等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点累积 的一段时间；和，采用非侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。受到所述造影剂作用的对 象中具有不同pH水平的感兴趣区域具有改良的纵向弛豫时间，这在图像中得以反映。若所 述造影剂接触pH变化的环境，pH降低时，弛豫度增高。
[0128] 参考图41，式（I)~(XII)的任何造影剂可用于磁共振成像（"MRI"）系统100。该MRI 系统100包含工作站102,该工作站102具有显示器104和键盘106。工作站102包含处理器 108,例如市售可得的可编程机器，其中运行市售可得的操作系统。工作站102提供操作界 面，该操作界面使扫描方式能够被输入MRI系统100。工作站102耦联至四个服务器:脉冲序 列服务器110;数据采集服务器112;数据处理服务器114,和数据存储服务器116。工作站102 和各服务器11 〇、112、114和116彼此通讯连接。
[0129] 脉冲序列服务器110响应下载自工作站102的指令来行使功能，以操作梯度系统 118和射频（"RF"）系统120。进行规定扫描的梯度波形经产生并施加至梯度系统118,其引发 组件122中的梯度线圈产生磁场梯度Gx、Gy和Gz，用于位置编码MR信号。梯度线圈组件122形 成磁体组件124的部分，磁体组件124延伸到通过其中形成的孔125处，并且梯度线圈组件 122包含极化磁体126和全身RF线圈128。
[0130] RF激励波形通过RF系统120被施加至RF线圈128,或分开的局部线圈（未显示），以 进行规定的磁共振脉冲序列。被RF线圈128或分开的局部线圈（未显示)检测到的响应的MR 信号被RF系统120接收，在由脉冲序列服务器110产生的指令指示下放大、解调、过滤并数字 化。RF系统120包含RF发射器，该RF发射器用于产生MR脉冲序列中所用的广泛多样的RF脉 冲。RF发射器对于扫描方式和来自脉冲序列服务器110的指示具有响应性，以产生具有所需 频率、相和脉冲振幅波形的RF脉冲。生成的RF脉冲可被施加至全身RF线圈128或施加至一个 或多个局部线圈或线圈阵列。
[0131] RF系统120还包括一个或多个RF接收器通道。各RF接收器通道包含RF放大器，其将 与其相连的线圈128接收的MR信号放大，还包含检测器，其检测并将接收到的MR信号的正交 分量I和Q数字化。因此，可通过取分量I和Q的平方之和的平方根来确定任何取样点处接收 到的MR信号的量级：
[0132]
等式(1);并且还可确定接收到的MR信号的相：
[0133]
[0134] 脉冲序列服务器110还任选地从生理学采集控制器130接收患者数据。控制器130 接收来自与所述患者连接的多个不同传感器的信号，例如来自电极的心电图（"ECG"）信号， 或者来自风箱或其它呼吸监测装置的呼吸信号。此类信号通常被脉冲序列服务器110利用， 以随该对象的心率或呼吸对扫描的执行进行同步化或"门控(gate)"。
[0135] 由RF系统120产生的数字化的MR信号样品被数据采集服务器112接收。数据采集服 务器112响应下载自工作站102的指令来执行操作，以接收实时MR数据并提供缓冲存储器， 从而不会有数据因数据溢出而丢失。在一些扫描中，数据采集服务器112所做的仅仅是将采 集的MR数据传递至数据处理器服务器114。然而，在需要来自采集的MR数据的信息以控制扫 描的进一步执行的扫描中，数据采集服务器112经编程以产生所述信息，并将其输送至脉冲 序列服务器110。例如，在预扫描期间，MR数据被采集并用于校正脉冲序列服务器110执行的 脉冲序列。
[0136] 数据处理服务器114接收来自数据采集服务器112的MR数据，并按照下载自工作站 102的指令来处理该数据。通过数据处理服务器114重建的图像被传输回工作站102,并存储 在那。实时图像储存在数据库存储缓存器(未显示）中，其由此被输出至位于磁体组件124附 近的操作显示器112或显示器136,以供主治医师使用。批处理模式图像或选定的实时图像 存储在盘存储器138上的主数据库。当所述图像已经重建并被转移至存储器时，数据处理服 务器114通知工作站102上的数据存储服务器116。操作者可使用工作站102来将图像存档， 生成影片，或通过网络将所述图像传送至其它设备。
[0137] 图42描述了可与MRI系统100-同用于本发明方法的PET系统200 JET系统200包含 成像硬件系统210,该成像硬件系统210包含中心轴或孔214周围的检测器环组件212。包含 运行市售可得的操作系统的市售可得的处理器的操作者工作站216通过通信连接218与构 台控制器220通信，以控制对成像硬件系统210的操作。
[0138] 检测器环组件212由多个辐射检测器单元222构成，事件发生时，其响应通信连接 224上对光子的检测来产生信号。一组采集电路226接收所述信号，并产生指示事件坐标(X， y)和与造成该事件的光子相关联的总能量的信号。这些信号通过电缆228传送至事件定位 器电路230。各采集电路226还产生事件检测脉冲，其指示相互作用发生的确切时刻。其它系 统利用同样能够从相同信号获得该信息（关于该事件发生的准确瞬间）的精密数字电子器 件，所述信号用以获得能量和事件坐标。
[0139]在一些实施方式中，事件定位器电路230形成数据采集处理系统232的部分，对由 采集电路226产生的信号进行定期取样。数据采集处理系统232包含通用控制器234,其控制 底板总线236上和通用通信网络218上的通信。事件定位器电路230将关于各有效事件的信 息集合成数字集，该数字集准确指示事件何时发生，以及该事件被检测到的位置。该事件数 据包被传达至重合检测器238,重合检测器238也是数据采集处理系统232的一部分。
[0140]重合检测器238从事件定位器电路230接收多个事件数据包，并确定其中是否有任 何两个是重合的。通过多个因素确定重合。首先，各事件数据包中的时标必须落在预定的时 窗（time window)中，例如，0.5纳秒或甚至小到皮秒。第二，由这两个事件数据包指示的位 置必须处于贯穿通过扫描仪孔214中视场的一条直线上。无法成对的事件被重合检测器238 弃而不计，但重合事件对被定位并记录为重合数据包。这些重合数据包被提供至分类器 240。许多传统PET成像系统中，分类器的功能是接收重合数据包并从该重合数据包生成存 储地址，供于该重合数据的高效存储。在该情况中，指向相同方向（Θ)并通过扫描仪视场 (F0V)的所有投射射线的集是一个完整的投射，或"视野"。具体投射射线与F0V中心之间的 距离(R)定位了 F0V中的投射射线。在通过分类出指示位于该投射射线上的两个检测器处的 重合数据包的扫描过程中，分类器240对在给定投射射线(R，0)上发生的所有事件计数。组 织重合计数，例如，作为二维阵列集，每一个对应各轴向图像平面，并且各以其维度之一标 出投射角Θ的尺寸，而另一个标出距离R的尺寸。检测的事件的RX9称为直方图，或更常见 地，称为正弦图阵列。正是这些经处理以重建图像的正弦图指示了在扫描过程中于各图像 像素位置发生的事件数量。分类器240对沿各投射射线(R，0)发生的所有事件计数，并将其 组织成图像数据阵列。
[0141]分类器240向图像处理/重建系统242提供提供图像数据集，例如，通过通信连接 244被存储在图像阵列246中。图像阵列246保留相应数据集，供于图像处理器248以重建图 像。图像处理/重建系统242可与工作站216或其它遥控工作站通信和/或与工作站216或其 它遥控工作站整合在一起。
[0142] 本发明在以下实施例中进行进一步说明，所述实施例仅用于说明而非限制目的。
[0143] 实施例
[0144] 实施例1
[0145] 实验 [0146] 概述
[0147] 材料与设备。所有化学品和溶剂均经商业途径购得，并且不经进一步纯化直接使 用。匪R谱在500MHz或400MHz Varian光谱仪上记录。化学位移以δ(ρρπ〇报告。对于咕和13C NMR谱，采用剩余溶剂峰作为内参，除了配体的 13C NMR以外，后者当中采用叔丁醇作为内参。
[0148] 液相色谱-电喷雾质谱(LC-MS)采用Agilent 1100系列设备进行，使用LC/MSD阱和 在220、254和280nm进行紫外检测的Daly转换打拿极检测器。用于该系统的方法如下：（a) Luna Cl8柱（lOOx 2mm);洗脱剂A:Η20/0· 1 %甲酸，B:MeCN/0· 1 %甲酸;梯度:在9分钟时间 内从5%B变化至95%B;流速0.8mL/分钟（用于表征有机化合物），和（b)Kromasil C18柱 (250x 4.6111111);洗脱剂(：:95%]\^0~/5%1〇111]\1乙酸铵，0 :1〇111]\1乙酸铵;梯度:在14分钟时间内 从5%C变化至8%C;流速0.8ml/分钟（用于表征锰络合物）。反相半制备型纯化在Rainin Dynamax HPLC系统上采用254nm的紫外检测，使 用Polaris C18柱进行。用于纯化的方法如 下：流动相A是：50mM乙酸铵缓冲液，pH 6.5，而流动相B是5 % 50mM乙酸铵缓冲液，pH 6.5/ 95 %MeCN的混合物。从5 %B开始，B部分经23分钟增加至8%。柱用100 %B清洗2分钟，然后变 化至5%B。该系统在5%B重新平衡3分钟。弛豫度检测在Bruker mq60Miniispec上以1.4T和 37°C进行。锰浓度用Agilent 7500a ICP-MS系统检测。所有样品用内含0.1%曲通X-100的 5%硝酸(包含20ppb的Lu(作为内标））稀释。采用Mn(54.94)/Lu(174.97)比来定量锰浓度。 每天生成0. lppb~200ppb的线性标准曲线，用于定量。UV-Vis光谱采用路径长度为lcm的石 英比色皿在SpectraMax M2光谱仪上记录。MnnHBET、MnnEDTA和ΜηΠΙΗΒΕΤ的循环伏安法采 用内含Nuvant EZstat正稳压器的TRIS缓冲液(ρΗ=7.4)(包含0.5Μ ΚΝ〇3作为支持电解 质），以lOOmVs-1扫描速率记录。采用玻璃态碳作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，而Pt 线作为辅助电极。采用K4FeCN6/K3FeCN6对作为内标。
[0149] 弛豫研究.1\采用10次反转次数的反转回复脉冲序列检测。弛豫度由1/h对比37°C 下TRIS缓冲液(pH=7.4)浓度的曲线图的斜率确定。各储液中的锰浓度采用ICP-MS测定。
[0150] Μη:配体化学计量学:与溶液中的全部Mn(I I)完全螯合所需的配体物质的TFA组成 和配体的量按如下示例确定：向内含0.9111^111(：12的？!17.40的缓冲液(2511^了1?13)(分别 0.45μπιο1)的500yL样品添加递增份的1.45mM 34(增量75yL，0~675yL;各75yL份中含有 1.09μπιο1)。随后检测各样品的T2值，并绘制弛豫度为配体与金属之比（图35) Jn的完全消 耗点由^停止随添加的配体而下降的点确定。
[0151] 为了探测溶液中锰络合物的形态，采用1N似0!1在犯气氛下进行1: 1Μη2+:配体的pH 滴定(图21)。
[0152]为测定这两个pH范围中存在的物质，监测紫外光谱与pH的关系(参见图22-24)。酚 部分的去质子化以形成酸盐离子导致特征紫外谱带，所述特征紫外谱带指示Mn-HBET和Mn-HBET-OMe在较低pH下质子化，以及在酚处出现的质子化。由于pH升高，酸去质子并配位至锰 中心。
[0153] 溶液中的形态还通过在1.4T下检测水质子的弛豫度来监测。图24显示三种配体系 统的弛豫度对比pH的变化。弛豫度的变化与紫外研究中观察到的pH依赖性形态一致。
[0154] 还原反应的动力学实验.这一系列的动力学实验在37°C(pH 7.4)下进行以测定通 过谷胱甘肽进行的ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ还原的经验速率方程。ΜηΠΙΗΒΕΤ络合物在水中于375nm处（ε = 1.38Χ103Μ-Vm-4具有强吸光谱带，该谱带并不存在于Μηπ-ΗΒΕΤ络合物的紫外光谱中。利 用该特征来监测Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ随时间的还原。检测三种不同谷胱甘肽浓度(5mM、10mM和20mM) 下的初始反应速率。此外，对于各谷胱甘肽浓度，反应以四种不同的Mnm-mET初始浓度 (0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM)进行。通过在这些实验中采用大幅过量的谷胱甘肽，我们发 现所述反应关于Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ络合物表现为伪一级，如下方等式S1表示。
[0155] ΙΜ^ΗΒΒΤ^ ^ (公式si)
[0156]其中，观察到的速率常数(ki察)简单地是实际速率常数(k)与[GSH]的乘积，t是时 间，而下标't'和'〇'分别表示时间't'时的浓度或初始浓度。图14显示两组动力学实验，其 中我们绘制了 [Mnm-HBET]t的自然对数与时间的函数关系。以该方式，各线的斜率等于-k · [GSH]，并且截距是ln[Mnm-HBET]。。基于这些实验，我们确定[GSH]和[ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ]中为 一级反应，其总体二级速率常数是(3.8 ±0.3) X 10-W1。
[0157] ΜηπΗΒΕΤ采用过氧化氢的氧化.用内含H2〇2(lmM)的TRIS缓冲液(pH = 7.4)进行 MnnHBET的氧化，随后进行UV-Vis光谱检测、弛豫度检测和LC-MS。与采用谷胱甘肽的 ΜηΠΙΗΒΕΤ的还原不同，由LC-MS数据计算，氧化反应似乎在70%转化成ΜηΠΙΗΒΕΤ之后达到了 平衡。
[0158] MR成像.MR成像采用Bruker Biospec 4.7Τ系统进行。将三种样品（约500yL)置于 自制样品座上，并采用容积线圈成像。对于0.234x0.312mm2平面内分辨率，采集矩阵= 64x256;层厚度= 5111111。!^-加权的图像采用快速小角度激发(FLASH)梯度回波序列获得:TR/ TE/FA = 20/5.44/40(8个取平均hTi采用2D快速获取再聚焦回波(RARE)反转回复序列确 定：TR = 3200ms，TE = 9·7ms。反转时间（TI):5、45、85、165、325、645、1285、1925和3205msoTl 由信号强度(SI(t))对比TI曲线的非线性最小二乘拟合获得，其中T1、SI(0)和a是可调节参 数，等式S2。
[0159] SI(t)=SI(0)[l-a,eTI/T1](等式 S2)
[0160] ΜηπΗΒΕΤ和ΜηΠΙΗΒΕΤ络合物的稳定性锰络合物的稳定性在不同缓冲液（lmM磷酸盐 缓冲液，25mM碳酸氢钠缓冲液和0.1 mM柠檬酸盐缓冲液）中以与血浆中相似的浓度检测。使 0.5mM的所述锰络合物在对应缓冲液中于37°C(pH = 7.4)孵育，然后在LC-MS上采用前述方 法对物质定量。所述锰络合物(〇. 5mM)还用内含EDTA(0.5mM)的TRIS缓冲液(pH=7.4)处理， 并在37°C孵育1小时。然后在LC-MS上，采用前述方法对物质定量。
[0161] Zn (II)金属转移动力学。由Zn (II)对Μη (II)的替代通过由T2-弛豫计监测游离Μη (Π )浓度的演变来检测。ImM Μη(ΙΙ)络合物用内含25mM Zn(0Tf)2的50mM MES缓冲液(pH 6.00)考验。将r2数据拟合至如下等式
[0162] Γ2 = Γ2 (??Μη)* ( 1 -e^** ) +Γ2ο
[0163] 佥座
[0164] 材料与设备.所有化学品和溶剂均经商业途径购得，并且不经进一步纯化直接使 用。匪R谱在500MHz或400MHz Varian波谱仪上记录。化学位移以δ(ρρπ〇报告。对于咕和13C NMR谱，采用剩余溶剂峰作为内参，除了配体的 13C NMR以外，其中采用叔丁醇作为内参。液相 色谱-电喷雾质谱(LC-MS)采用Agilent 1100系列设备进行，使用LC/MSD阱和在220、254和 280nm进行紫外检测的Daly转换打拿极检测器。用于该系统的方法如下：（a)Luna C18柱 (lOOx 2mm);洗脱剂A:Η20/0· 1 %甲酸，B:MeCN/Ο · 1 %甲酸；梯度:在9分钟时间内从5%B变 化至95%B;流速0.8mL/分钟（用于表征有机化合物），和(b)Kromasil C18柱(250x 4.6mm); 洗脱剂C: 95 %MeCN/5 % 10mM乙酸铵，D: 10mM乙酸铵;梯度:在14分钟内从5 % C变化至8 % C; 流速0.8ml/分钟（用于表征猛络合物）。反相半制备型纯化在Rainin Dynamax HPLC系统上 采用254nm的紫外检测，使用Polaris C18柱进行。用于纯化的方法如下:流动相A是:50mM乙 酸铵缓冲液，pH 6.5，而流动相B是5 % 50mM乙酸铵缓冲液，pH 6.5/95 %MeCN的混合物。从 5%B开始，B部分经23分钟增加至8%。柱用100%8清洗2分钟，然后变化至5%8。该系统在 5%B重新平衡3分钟。弛豫度检测在Bruker mq60Miniispec上以1.4T和37°C进行。猛浓度用 Agilent 7500a ICP-MS系统检测。所有样品用内含0.1%曲通X-100的5%硝酸（包含20ppb 的1^1(作为内标））稀释。采用1]1(54.94)/1^1(174.97)比来定量猛浓度。每天生成0.]^口13~ 200ppb的线性标准曲线，用于定量。UV-Vis光谱采用路径长度为lcm的石英比色皿在 SpectraMax M2光谱仪上记录。pH采用连接至VWR Symphony玻璃电极的ThermoOrion pH计 检测。
[0165] 2'-( (2-((羧甲基）（2-羟基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸(ΗΒΕΤ) (3)的合成 示于图6。
[0166] (2-((2-羟基苄基）氨基）乙基）氨基甲酸叔丁基酯（1):向内含水杨醛（12mmol， 1.465g)的90mL甲醇的溶液添加内含N-(2-氨基乙基）氨基甲酸叔丁基酯（12mm 〇l，1.923g) 的甲醇（30mL)的溶液，并使所述溶液搅拌1小时。向该搅拌中的溶液添加固体NaBH 4 (24mmol，0.908g)。观察到快速产气，并且溶液从浅黄色变为无色。搅拌3小时后，减压下移 除所有挥发物，之后获得白色固体。使残留物溶解于200mL CH2C12，用200mL饱和NaHC03溶液 萃取。使用CH 2C12(2x 100mL)萃取水性层。合并全部有机物，用盐水(200mL)清洗并用无水 1^5〇4干燥。减压蒸发溶剂以获得浅黄色固体1(2.116 8,97%)。1!1匪1?(50(^他，0(：13)6 (ppm) :7.16(t，J = 7.65Hz，lH)，6.99(d，J = 7.48Hz，lH)6.83(d，J = 8.13Hz，lH)，6.77(t，J = 7·41Ηz，1Η)，4.01(s，2H)，3.30(m，2H2.79(t，J = 5.82Hz，2H)，1.44(s，9H) ,13。!：1!!}匪R (100MHz，CDC13)S(ppm): 157.9,156.2,128.5,128.3,122.4,118.9,116.1，79·2,52· 1， 48 · 2，39 · 8，28 · 3.&此办2〇3的分子量：266 · S^MSUSI )m/z :计算值：267 · 17(M+H) +，观察值： 267.1〇
[0167] 2,2'（2-((2-(叔丁氧基）-2-氧代乙基）（2-((叔丁基二甲基甲硅烷基）氧基）_苄 基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸二叔丁基酯（2):将1(7.94111111 〇1，21168)溶解于012(：12 (100mL)，然后添加50mL三氟乙酸。使所述反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留物 溶解在水(40mL)中并用乙醚(3x 1 OOmL)清洗。将水部分冷冻干燥，以定量获得白色固体状 的游离胺，其无需进一步纯化即可用于后续反应。
[0168] 包含所述胺的圆底烧瓶用氮气吹扫，添加无水CH2Cl2(80mL)并在冰浴中冷却。在相 反的氩气气流下，添加 N，N-二异丙基乙基胺(39.7〇111111〇1，6.91 1^)，然后添加叔丁基二甲基 甲硅烷基氯(8.73mmol，1.315g)作为CH2C1 2溶液（10mL)。允许该溶液升温至室温并搅拌5小 时。使该反应冷却回〇°C，并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯（24.61111111〇1，3.631^)，然后使该反应 在氮气气氛下搅拌18小时。所述溶液用CH 2Cl2(200mL)稀释，并用饱和NaHC03(3x 200mL)、盐 水（lx 200mL)清洗。合并全部有机物并用无水硫酸镁干燥，然后在然后在减压下蒸发以获 得粗制黄色油状物。采用柱色谱将产物纯化成无色油状物（1.234g，25%)(洗脱剂-己烷/乙 酸乙酯，9:1)</H MMR(400MHz，CDCl2)S(ppm) :7.43(dd，Ji = 1.31Hz，j2 = 7.57，lH)，7.04 (dt ,Ji = 1.71Hz J2 = 7.80,1H) ,6.88(t ,J = 7.51Hz , 1H), 6.72(d ,J = 7.93Hz , 1H), 3.76(s, 2H),3.40(s,4H),3.29(s,2H),2.81(m,4H),1.41(s,9H),1.40(s,18H),0.98(s,9H),0.18 (8,611),3(:1:?}匪R(100MHz，CDCl2)S(ppm): 171.1，170.7,153.7,130.1，129.8,127.4， 121.1，118.4,80.6,80.4,56.1，55.9,52,52.4,28.2,25.9，18.3,4.1<X 33H58SN2〇7Si的分子 量:622 · 91JSUSI )m/z:计算值:623 · 41 (M+H)+观察值:623 · 4。
[0169] 2，2'-( (2-((羧甲基）（2-羟基苄基)氨基）乙基)氮烷二基）二乙酸(ΗΒΕΤ) (3):将2 (1.98mmol，1.234g)溶解于三氟乙酸(40mL)，然后添加三异丙基硅烷(2.35mL)、1-十二硫醇 (2.3 5 m L)和水（2.3 5 m L)。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。残留物溶解于水 (40mL)并用乙醚（3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成（3)白色固体。1H NMR (500MHz,D2〇)5(ppm) :7.44(m,2H,Ar-H),7.03(m,2H)4.57(s,2H),4.04(s,2H),3.66(s, 4H) ,3.54( t,J = 6.09Hz,2H) ,3.35( t,J = 5.匪 R(125MHz，D20) δ (ppm): 174·1，169·9，156·3，133·6，133·0，121·5，116·6，116·3,55·6,54·8,52·0,49·9<Χ?5Η2()Ν2〇7 的分子量:340.33. MS(ESI )m/z:计算值:341.13(Μ+Η)+观察值:341.1。
[0170] Na2[MnnHBET](4):将 3(0.26111111〇1，0.0898)溶解于511^水。采用謂氢氧化钠溶液将 pH调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2.4H20(0.26mm〇l，0.051g)，然后仔细将pH调节至5。使反 应搅拌1小时，过滤并冷冻干燥以产生白色固体。然后将该络合物注射进入反相C18 (Polaris)柱并采用前述方法脱盐。收集分级分离部分并冻干以产出白色固体状的4 (0 · 095g，84 % )。Ci5Hi8MnN2〇7的分子量：393 · 25 JSUSI )m/z :计算值：394 · 26 (M+3H) + 观察 值：394.1。
[0171] Na[MnmHBET](5):将3(0.15臟〇1，0.058)溶解于511^水。采用謂氢氧化钠溶液将口!1 调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2.4H20(0.15mmol，0.030g)并将pH调节至12。使该溶液搅拌 1小时.然后使该溶液过滤通过〇 . 45μπι滤器以去除Mn02，pH调节至11，并使该溶液搅拌18小 时。该反应之后进行分析LC-MS，并且观察到该反应在70 %转化成Mnm物质时停止。将该混 合物注射进入反相C18(Polaris)柱并采用前述方法纯化。收集分级分离部分并冻干以产出 棕色固态的5(0 ·023g，38% ) <Χ?5Η?7ΜηΝ2〇7的分子量:392 · 24 ·MS(ESI)m/z :计算值:393 · 25(M +2H)+观察值:393.1。
[0172] (2-((2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯(6):向内含2-羟基-5-甲氧基苯甲醛（12mm〇l，1.826g)的90mL甲醇的溶液添加内含N-(2-氨基乙基)氨基甲叔丁基 酯（12mmo 1，1.923g)的甲醇(30mL)的溶液并使该溶液搅拌1小时。向该搅拌中的溶液添加固 体NaBH4(24mmol，0.908g)。观察到快速产气，并且溶液由浅黄色变为无色。搅拌3小时后，减 压下移除所有挥发物，之后获得白色固体。使残留物溶解于200mL CH2C12,用200mL饱和 NaHC03溶液萃取。使用CH2C12(2x 100mL)萃取水层。合并全部有机物，用盐水(200mL)清洗并 用无水185〇4干燥。减压下蒸发溶剂以获得浅黄色固体6(3.4858,98%)。 1!1匪1?(50冊他， CDCl3)S(ppm):6 ·76(ι?，lH)6.72(m，lH)，6.57(d，J = 2.91Hz，lH)，5.30(s，lH)，3.97(s，2H)， δ(ppm):156.2,152.3,151.7,123.1,116.5,114.2,113.5,79.3,55.6,52.2,48.3,39.9, 28 · C15H24N2〇4 的分子量296 · 36 JSCESI )m/z:计算值：297 · 37(M+H)+观察值：297 · 4。
[0173] 2,2'-((2-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基）（2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-甲氧基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸二叔丁基酯（7) :将6(8.00mmOl，2.371g)溶解于 CH2Cl2(100mL)，然后添加50mL三氟乙酸。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留 物溶解在水(40mL)中并使用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为浅黄色 固体的游离胺，其无需进一步纯化即可用于后续反应。
[0174]包含所述胺的圆底烧瓶充入氮气，添加无水CH2Cl2(80mL)并在冰浴中冷却。在相反 的氩气气流下，添加 N，N-二异丙基乙基胺(40.00mmol，6.97mL)，然后添加叔丁基二甲基甲 硅烷基氯(8.80mmol，1.326g)作为CH 2C12溶液（10mL)。使该溶液升温至室温并搅拌5小时。使 该反应冷却回〇°C并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯（24. SOmmol，3.66mL)，然后使该反应在氮气 气氛下搅拌18小时。溶液用CH2Cl2(200mL)稀释，并用饱和NaHC0 3(3x 200mL)、盐水（lx 200mL)清洗。合并全部有机物并用无水硫酸镁干燥然后在减压下蒸发以获得粗制黄色油状 物。采用柱色谱(洗脱剂-己烷/乙酸乙酯，9:1)将产物纯化成无色油状物（1.462g，28% )。咕 Mffi(400MHz，CDCl3)S(ppm):7.04(d，J=3.26Hz，lH)，6.62(m，lH)，6.57(m，lH)，3.71(s， 2H)，3.70(s，3H)，3.40(s，4H，），3.27(s，2H)，2.79(m，4H)，1.40(s，9H)，1.37(s，18H),0.94 (s，9H)，0.13(s，6H).13C{1H}NMR(100MHz，CDCl2)S(ppm):171.，170·8，154·1，147·4，130·8， 119.2,114.7,113.0,80.8,80.6,56.3,56.1,55.6,53.1,52.8,52.7,28.3,28.2,26.0, 18 · 4。C34H6〇N2〇8Si 的分子量:652 · 93 · MS(ESI )m/z:计算值:653 · 94(M+H) + 观察值:653 · 9。
[0175] 2,2'-(2_((羧甲基）（2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸(HBET-0Me)(8):使7(2.24111111 〇1，1.4628)溶解于三氟乙酸（4〇11^)，然后添加三异丙基硅烷 (2.35mL)、1-十二硫醇（2.35mL)和水(2.35mL)。使该反应搅拌5小时，然后在减压条件下除 去挥发物。将残留物溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定 量生成为白色固体的8</H NMR(500MHz，D2〇)S(ppm): 7.02(m，2H)6 ·95(ι?，1Η)4· 52(5,2H)， 4.09(s,2H),3.80(s,3H),3.58(s,4H),3.48(m,2H),3.26(m,2H)o^Ct^jNMRC125MHz,? 20)δ (ppm):173.6,169.0,152.5,149.6,117.9,117.6,117.0,116.4,55.9,54.8,51·5,49·0。 C16H22N2〇8 的分子量:370 · 35 JSUSI )m/z:计算值:37136(M+H)+观察值:371 · 4。
[0176] Na2[MnnHBET-0Me] (9):将8(0.23mmo 1，0.085g)溶解于5mL水。采用IN氢氧化钠溶 液将pH调节至8。然后向溶液添加 MnCl2.4H20(0.23mmol，0.046g)，并将pH仔细调节至5。使该 反应搅拌1小时，过滤并冷冻干燥以产生白色固体。将络合物注射进入反相C18(Polaris)柱 并采用前述方法脱盐。收集分级分离部分并冻干以产出白色固态的9(0.090g，81%)。 Ci6H22MnN2〇8 的分子量:423 · 28 · MS(ESI )m/z:计算值:424 · 28(M+3H) +;观察值:424 · 3。
[0177] (2_( (2-羟基-5-硝基苄基)氨基）乙基)氨基甲酸叔丁基酯（10):向内含2-羟基-5-硝基苯甲醛(3.51mmol，0.587g)的60mL甲醇的溶液添加内含N-(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁 基酯(3.5 lmmo 1，0.562g)的甲醇(30mL)的溶液并使该溶液搅拌1小时。向该搅拌中的溶液添 加固体NaBH4(7.02mm〇l，0.266g)。观察到快速产气，并且溶液由浅黄色变为无色。搅拌3小 时后，减压下移除所有挥发物，之后获得白色固体。使残留物溶解于10mL甲醇和200mL CH 2C12的溶剂混合物，并用200mL饱和NaHC03溶液萃取。使用CH 2C12(2x 100mL)萃取水性层。 合并全部有机物，用盐水(200mL)清洗并用无水MgS04干燥。减压下蒸发溶剂以获得黄色固 体10(1.01 8,93%)。1!1匪1?(5001抱，（0)3)230)3(??111) :8.01((1，了 = 3.0抱，1!〇7.92((1(1，了1 = 3.00Hz，j2 = 9.2Hz，lH)，6.92(t，J = 5.8Hz，lH)，6.46(d，J = 9.2Hz，lH)，3.93(s，2H)，3.14 (m，2H)，2.75(t，J = 6.3Hz，2H)，1.38 (s，9H).13C{1H}MMR(100MHz，CDCl3)S(pp m):172.1， 155·7，133·6，126·1，126·0，121·9，117·3,77·9,48·7,46·7,37·9,28·2<Χ?4Η2?Ν 3〇5 的分子 量:311.33.]\^"31)111/2:计算值:312.34(]\1+!〇 +观察值:312.4。
[0178] 2,2'-((2-((2_(叔丁氧基)-2_氧代乙基）（2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5_ 硝基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸二叔丁基酯（11):使10(3.24mmol，1.01g)溶解于 CH2Cl2(100mL)，然后添加50mL三氟乙酸。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留 物溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为浅黄色固 体的胺，其无需进一步纯化即可用于后续反应。
[0179] 包含所述胺的圆底烧瓶充入氮气，添加无水二甲基甲酰胺(40mL)，并在冰浴中冷 却。在相反的氩气气流下，添加 N，N-二异丙基乙基胺（16.2mmol，2.82mL)，然后添加叔丁基 二苯基甲硅烷基氯(3.56mm〇l，0.979g)作为二甲基甲酰胺溶液(5mL)。随后将溶液升温至室 温并搅拌5小时。使该反应冷却回0°C，并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯（10.04mmol，1.48mL)，然 后使反应在氮气气氛下搅拌18小时。该溶液用CH 2Cl2(200mL)稀释并用饱和NaHC03(3x 200mL)、盐水（lx 200mL)清洗。合并全部有机物并用无水硫酸镁干燥然后在减压下蒸发以 获得粗制黄色油状物.采用柱色谱(洗脱剂-己烷/乙酸乙酯，9:1)将产物纯化成无色油状物 (0·615g，24% ) </H NMR(400MHz，CDCl3)S(ppm):8.50(d，J = 2.9Hz，lH)，7 ·67(ι?，5Η)，7·45 (m，lH)，7.39(m，5H)，6.40(d，2H，J=2.9Hz，lH)，4.08(s，2H)，3.48(s，4H)，3.44(s，2H)， 170.8,159.0,142.1，135.3,131.4,130.5,128.2,125.6,123.3,118·7,81·1，81·0,56·5， 56 · 2，53 · 0，52 · 8，52 · 7，28 · 2，26 · 5，19 · 7<X43H6iN3〇9Si的分子量：792 · 04 JSUSI )m/z :计算 值:793.05(]?+!〇+观察值:793.1。
[0180] 2,2-((2-((羧甲基）（2-羟基-5-硝基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸(HBET-觀 2)(12):将11(0.776111111〇1，0.6158)溶解于三氟乙酸（4011^)，然后添加三异丙基硅烷 (2 · 35mL)、1-十二硫醇(2 · 35mL)和水(2 · 35mL)。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。 将残留物溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为白 色固体的 12</H NMR(500MHz，D2〇)S(ppm):8.33(m，lH)，8.22(m，lH)，7.06(d，J = 9.0Hz，lH)， 4.57(s,2H),4.07(s,2H),3.60(s,4H),3.49(m,2H),3.27(m,2H)〇 13C{1H}NMR(125MHz,D2〇)5 (ppm):173.5,169.1,162.2,140.1,129.1,128.0,116.7,116.0,54.8,54.0,51.9,49.2〇 C15H19N3〇9 的分子量:385 · 33 JSUSI )m/z:计算值:386 · 33(Μ+Η)+观察值:386 · 4。
[0181] Na2[MnI1HBET-N02](13):将12(0·25mmol，0·096g)溶解于5mL水。采用lN氢氧化钠 溶液将pH调节至8。然后向溶液添加 MnCl2.4H20(0.25mmol，0.049g)，并将pH仔细调节至5。使 该反应搅拌1小时，过滤并冷冻干燥以产生白色固体。将络合物注射进入反相C18(Polaris) 柱并采用前述方法脱盐。收集分级分离部分冻干以产出浅黄色固态的13(0.102g，82%)。 CbHnMnNsOg 的分子量:438 · 25 JSUSI )m/z:计算值:439 · 26(M+3H) +;观察值:439 · 4。
[0182] Na[MnmHBET-N02] (14) :]?1^3(0.0068,0.054111111〇1)添加至搅拌中的内含12 (0.021g，0.054mmol)的5mL Η20(ρΗ 8)。将所得橙红色溶液注射进入反相C18(Polaris)柱 并采用前述方法纯化。收集分级分离部分并冻干以产生棕色固态的14(0.012g，0.026mmol， 48% ) <X19H21MnN3〇9的分子量:436 · 23 JSUSI)m/z:计算值:436 · 02(M) -;观察值:436 [0183]氯化反_1，2二氨基环己铵（15):在反相氮气气流下，向内含反_1，2二氨基环己烷 (48mmol，5.523g)的200mL乙醚逐滴添加内含20.4mL的2M HC1的乙醚溶液。使反应搅拌2小 时，这期间形成白色沉淀物状的产物。收集沉淀物并用足量乙醚清洗。产率:97% (7.05g)。 4 Mffi(500MHz，CD0D)S(ppm):2.67(m)，2.04(m，2H1.78(m，2H)，1.35(m，4H)<X6Hi4N2的分子 量：114.19 JSCESDm/z:计算值：115.2(M+H) +。观察值：115.4. UcpHlNMRdSSMHzADsODM (口口111):56.1，33.7,25.6。〇61114吣的分子量：114.19。]\^江31)111/2:计算值 ：115.2(]\1+!〇 +;观察 值:115.4〇
[0184]氯化反-2-((叔丁氧基羰基)氨基)环己铵（16)(参见图19):在1小时中，向内含15 (lOmmol，1.507g)的90mL甲醇的溶液逐滴添加内含碳酸氢二叔丁基酯(9. lmmol，1.986g)的 甲醇(30mL)的溶液。搅拌18小时后，减压下移除所有挥发物，并获得淡黄-白色固态的产物。 该固体用足量的二氯甲烷清洗，以去除任何未反应的起始物质。产率:97% (2.218)^11 NMR (500MHz，CD0D)S(ppm):3.07(s，lH)，2.40(s，lH)，1.91(m，2H)，1.70((m，2H)，1.44(s，9H)， 1.28(m，2H)，1 · 19(m，匪 R( 125MHz，CD30D)S(ppm): 156.7，79·3,54·3,52.4， 31·6,29·7,27·4,24·，23·6<ΧιιΗ22Ν2〇2的分子量：214.30.]\^^51)111/2:计算值 ：215.3(]\1+!1 )+ ;观察值：215.4<XnH22N2〇2的分子量：214.30 .MS(ESI)m/z:计算值：215.3(M+H) + ;观察值： 215.4〇
[0185] (反-2-( (2-羟基苄基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁基酯（17):向内含16 (3 ·99mmol，1 ·001g)的90mL MeOH的溶液添加 NEt3(4· 39_〇1，0·6mL)，并使该反应搅拌30分 钟。向上述混合物添加内含水杨醛(3.99mmo 1，0.487g)的甲醇(30mL)的溶液。搅拌1小时后， 添加固体NaBH4(8.38mmol，0.317g)，并使该反应搅拌3小时。减压去除所有挥发物，以产出 浅黄色固体。使残留物溶解于200mL CH2C12，用200mL饱和NaHC03溶液萃取。使用CH 2C12(2x 100mL)萃取水性层。合并全部有机物，用盐水(200mL)清洗并用无水MgS〇4干燥。减压蒸发溶 剂以获得浅黄色固体17(1.231 8,96%)。1!1匪1?(50010^，0)(：13)3(??111):7.15(111，1!〇,6.96 (m，lH)，6.81(m，lH)，6.75(m，lH)，4.43(s，lH)，4.05(d，lH)，3.93(d，lH)，3.41(s，lH)，2.31 (m，lH)2.17(m，lH)，1.99(m，lH)，1.70(m，2H)，1.46(s，9H)，1.31(m，lH)，1.17(m，2H) 〇13C {^田匪以 125MHz，CDCl3)S(ppm) :158.3,156.0,128.4,128.0,123.1，118.7,116 ·3,79·4， 60.9,53.9,49.8,33.0,31.2,28.3,24.9,24.5。(：181128吣〇3的分子量：320.43。]^化51)111/2:计 算值:321.43(1+!〇 +;观察值:321.5。
[0186] 2,2'_((反-2-( (2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基）（2-羟基苄基)氨基)环己基)氮烷二 基）二乙酸二叔丁基酯（18)将 17(3.15111111〇1，1.018)溶解于〇12(：12(1001^)，然后添加501^三 氟乙酸。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留物溶解在水(40mL)中，并用乙醚 (3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为浅黄色固体的游离胺，其无需进一步纯化 即可用于后续反应。
[0187] 向包含该胺的圆底烧瓶添加1(1(6.3111111〇1，1.048)，并用氮气吹扫该系统。在反向氮 气气流下，添加无水二甲基甲酰胺（2mL)，然后添加 N，N二异丙基乙基胺（15.75mmol， 2.74mL)，并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯(9.765mmol，1.90g)。使该反应搅拌18小时，然后在饱 和NaHC0 3(撒)和Et20之间萃取分离。Et20经分离并用H20更换清洗数次以去除DMF，然后用 Na2S〇4干燥，并浓缩成1 · 0g的黄色油状物。C31H5QN2〇7的分子量：562 · 74KESI )m/z :计算值： 563.75(M+H) + ;观察值:563.8。该粗产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。
[0188] 2,2'_((反-2-((羧甲基）（2_羟基苄基)氨基)环己基)氮烷二基)二乙酸（19):将来 自前述步骤的粗产物（17)溶解于三氟乙酸(40mL)，然后添加三异丙基硅烷(2.35mL)、1-十 二硫醇(2.35mL)和水(2.35mL)。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留物溶解 在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以生成粗制物料19。然后通过 制备型HPLC纯化产物，采用Polaris C18柱;洗脱剂A:Η20/0 · 1 %TFA，B:MeCN/Ο · 1 % TFA:梯 度5 %~50 % B，25分钟；流速：15mL/分钟。收集分级分离部分并冻干以产出白色固态的19 (0.5108,72%)〇^ NMR(500MHz,D2〇)5(ppm):7.45(maH),7.37(maH),6.98(m,2H),4.42 (s，2H)，4.17(d，lH)，3.90(d，lH)，3.51(br，2H)，3.35(br，lH)，3.24(br，lH)，3.00(br，lH)， 2.91(br，lH)，2· 33-1.12 匪 R(125MHz，D20) δ (ppm): 174.5,170.4,156.1， 133·3，132·9，121·9，117·1，116·6,62·0,59·6,53·8,52·3,51·0,48·3,24·4<Χ?9Η26Ν2〇7 的分 子量：394 · 42 JSUSI )m/z:计算值：395 · 43(Μ+Η) +;观察值：395 · 5。
[0189] Na2[MnncycHBET](20):将 19(0.26_〇1，0.1038)溶解于511^水。采用謂氢氧化钠溶 液将pH调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2.4H20(0.26mmol，0.051g)，并将pH仔细调节至5。使 该反应搅拌1小时，过滤并冻干以产出白色固体。将络合物注射进入反相C18(Polaris)柱， 并采用上述方法脱盐。收集分级分离部分并冻干以产出白色固态的20(0.106g，80%)。 Ci9H24MnN2〇7 的分子量:447 · S^MSUSI )m/z:计算值:448 · 35(M+3H) +;观察值:448 · 4。
[0190] Na[MnmcycHBET](21):将18(0.15111111〇1，0.068)溶解于511^水。采用謂的氢氧化钠 溶液将pH调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2.4H20(0.15mmol，0.030g)，并将pH调节至12。使 该溶液搅拌1小时。然后使该溶液过滤通过〇. 45μπι过滤器以去除Μη02，pH调节至11并使该溶 液搅拌18小时。该反应后，进行分析型LC-MS，并且观察到该反应在70 %转化成Mnm物质时 停止。所述混合物如上所述经制备型-HPLC纯化。收集分级分离部分并冻干以产出棕色固态 的21(0.023 8,31%)。(：191123]?1^2〇7的分子量：446.33。]\^化51)111/2:计算值 ：447.34(]\1+2!〇 +; 观察值:447.4。
[0191] (2-((2-羟基-5-甲氧基苯亚甲基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁基酯（22):反Ια 叔丁氧基羰基) 氨基) 环己烷 （1.30mmol，0.279g) 和 2-羟基-5-甲氧基苯甲醛 （1.35mm〇l， 0.206g)在12mL MeOH中一起室温搅拌。数分钟内，亮黄色溶液中沉淀出大量沉淀物。搅拌90 分钟后，向该混合物添加3011^!120，并通过过滤分离0.3428(0.98111111〇1，76%)22。 1!1匪1? (500MHz，CDCl3)S(ppm):12.78(s，lH)，8.28(s，lH)，6.90(d，lH)，6.76(d)，4.63(s，lH)， 3.73(s，3H)3.57(s，lH)，3.03(s，lH)，2.06(m，lH)，1.90(m，3H)，1.76(t，2H)，1.68(q，lH)， 1.41 (m，2H)，1.30(8,911),3(:1:?}匪 R( 125.7MHz，CDCl3)S(ppm): 163.3,155.4，155.3， 151.9,119.3,118.5,117.8,115.0,79.3,72.7,56.1,54.2,33.3,31.6,28.2,24.8,24.0〇 C19H28N2〇4 的分子量:348 · 44 · MS(ESI )m/z:计算值:349 · 21 (M+H) +;观察值:349 · 2。
[0192] 反（2-( (2-羟基-5-甲氧基苄基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁基酯（23)(参见图 19):将NaBH4(5lmg，1 · 35mmo 1)分批添加至室温搅拌中的内含22(0 · 342g，0 · 98mmo 1)的20mL MeOH中。数分钟内，溶液的黄色被漂白成浅米黄色。2小时后，溶液被浓缩至干，加入CH2C1 2并 用H20和盐水彻底清洗。有机部分经清洗并用MgS04干燥，然后浓缩成23,分离为米色固体 (0·179 8,0·51ι?πιο1，52%)<31Η Mffi(500MHz，CDCl3)S(ppm):6.72(m，2H)，6.54(s，lH)，4.53 (br s，lH)，3.94(dd，2H)，3.38(br s，lH)，2.30(m，lH)，2.13(m，lH)，1.97(m，lH)，1.69(m， 2H)，1.45(s，9H)，1.31-1.15(m，4H) X19H3QN2O4的分子量：350.22.MS(ESI)m/z:计算值： 351.23(]?+!〇 +;观察值:351.3。
[0193] 2-(((反-2-氨基环己基）氨基）甲基）-4-甲氧基酚（24) :5小时内，将23(0.179g， 0.51mmol)溶解于5mL的各CH2C12/TFA。然后使该溶液浓缩至干，溶解于50mL CH2C12并在过 量K2C03個)存在下搅拌12小时。K 2C0通过过滤移除，并使母液浓缩从而以定量产率获得浅黄 色油状物的24</H NMR(500MHz，CDCl3)S(ppm):6.70(m，2H)，6.56(s，lH)，3.91(dd，2H)，3.72 (s,3H) ,2.39(br t ,ΙΗ), 2.10(m, 2H) ,1.79(m,lH) ,1.66(m, 2H) ,1.28-1.06(111,^)130{^} NMR(125.7MHz，CDCl3)S(ppm):152.4，152.0，124.5，116.7，114.0，113.3,63.8,55.9,55.8， 50 · 3，37 · 0，30 · 9，25 · 3，24 · 9X14H22N2O2的分子量：250 · 34 JSUSI )m/z :计算值：251 · 37(M+ H) + ;观察值:251.1。
[0194] 2,2'_((反-2-((2-(叔丁氧基)- 2-氧代乙基）（2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基)环己 基)氮烷二基)二乙酸酯（25) :向内含24(0.1618,0.64111111〇1)的搅拌中的31^01^(含有碘化 钾(0.078 8,0.47111111〇1)和二异丙基乙基胺(0.4328,3.34111111〇1))室温添加溴乙酸叔丁基酯 (0.399g，2.05mmol)。浅棕色溶液快速产生白色沉淀物。搅拌4小时之后，该溶液用100mL Et 20稀释，用Na2C03(7搬)、足量H20和盐水清洗。有机层被浓缩至干，并用反相C18(Polaris)柱 纯化：洗脱剂 A: H20/0 · 1 % TFA，B: MeCN/O · 1 % TFA;梯度 60 % ~95 % B，25 分钟；流速：20mL/分 钟。分级分离部分经冻干，加入50mL CH2C12并在K2C03個)存在下搅拌6小时。滤液浓缩至产出 25。（0.095 8,0.17臟〇1，26%)。1!1 NMR(500MHz，CDCl3)S(ppm):9.53(br s，lH)，6.73(m，2H)， 6.57(d，lH)，4.21(d，lH)，3.72(s，3H)，3.67(d，lH)，3.44(m，5H)，3.24(d，lH)，2.77(t，lH)， 2·59(?，1Η)，2·03(πι，2Η)，1·68(πι，2Η)，1·44(28，18!^Ρ9Η)，1·23(πι，1Η)，1·03(πι，3Η)。 13。 81.4,80.8,63.7,59.6,55.8,55.5,52.8,28.2,28.1，25.8,25.6(该光谱中无法发现一个(：， 它可能与其它峰重合）<Χ32Η52Ν2〇8的分子量:592.76。]\^化31)111/2 :计算值：593.4(]\?〇 +;观 察值:593.5。
[0195] 2,2'-((2-((羧甲基）（2_羟基-5-甲氧基苄基）氨基）环己基）氮烷二基）二乙酸 (26):将25(0.095g，0.224mmol)溶解于3mL各CH2C12:TFA。搅拌6小时后，使反应混合物浓缩 以产出白色固态的26X-的分子量:424.44]\^化31)111/2:计算值:425.19(]\1+!〇 +;观察 值:425.2。
[0196] (反-2-( (2-硝基苄基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁基酯（27):向内含16 (3 ·99mmol，1 ·001g)的90mL MeOH的溶液添加 NEt3(4· 39_〇1，0·6mL)，并使该反应搅拌30分 钟。向上述混合物添加内含2-羟基-5-硝基苯甲醛(3.99mmol，0.667g)的甲醇（30mL)的溶 液。搅拌1小时后，添加固体NaBH4 (8.38mmo 1，0.317g)并使该反应搅拌3小时。减压去除所有 挥发物，以产出浅黄色固体。使残留物溶解于200mL CH2C12,用200mL饱和NaHC03溶液萃取。 水层用CH 2Cl2(2X100mL)萃取。合并所有有机物，用盐水(200mL)清洗并用无水MgS〇4干燥。 减压蒸发溶剂以获得浅黄色固体27(1.231 8,96%)。1!1匪1?(5001抱，0)300)5(??111) :8.05(111， lH)，7.91(m，lH)，6.81(m，lH)，4.48(d，lH)，4.08(m，2H)，3.42(d，lH)，2.31(m，lH)，2.13(m， 1!1)，1.98(111，1!1)，1.75(111，2!1)，1.45(8,9!1)，1.17(111，3!1)。(：181127吣〇5的分子量 ：365.42。]\^ (ESI )m/z:计算值：366 · 42 (M+H) +;观察值：366 · 5。
[0197] 2,2'_((反-2-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基）（2-羟基- 5-硝基苄基)氨基)环己基） 氮烷二基）二乙酸二叔丁基酯（28)(参见图19):将27(3.15111111〇1，1.158)溶解于(^ 2(：12 (100mL)然后添加50mL三氟乙酸。搅拌该反应5小时，然后减压下去除挥发性物质。将残留物 溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为浅黄色固体 的胺，其无需进一步纯化即可用于后续反应。
[0198] 向包含该胺的圆底烧瓶添加1(1(6.3111111〇1，1.048)，并用氮气吹扫该体系。在反向氮 气气流下，添加无水二甲基甲酰胺（2mL)，然后添加 N，N-二异丙基乙基胺（15.75mmol， 2.74mL)，并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯(9.765mmol，1.90g)。使该反应搅拌18小时，然后在饱 和NaHC0 3 (水性)和Et20之间进行萃取分离。分离Et20层并用H20更换数次清洗以去除DMF，然 后用Na 2S〇4干燥并浓缩成0.73g黄色油状物。C31H49N3〇9的分子量:607. TLMSUSI )m/z :计算 值:608.74(M+H) +;观察值:608.9。该粗产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。
[0199] 2.2'-((反-2-((羧甲基）（2_羟基-5-硝基苄基)氨基)环己基)氮烷-二基）二乙酸 (29):将来自前述步骤的粗产物（28)溶解于三氟乙酸（40mL)，然后添加三异丙基硅烷 (2.35mL)、1-十二硫醇（2.35mL)和水(2.35mL)。搅拌该反应5小时，然后减压下去除挥发性 物质。将残留物溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将 水部分冷冻干燥以生成粗 制物料29。然后通过制备型HPLC纯化产物，采用Polaris C18柱;洗脱剂A:H20/0.1%TFA，B: MeCN/0.1 % TFA;梯度5 %~50 % B，25分钟;流速：15mL/分钟。收集分级分离部分并冻干以产 出白色固态的24(0.4978,70%)。1!1匪1?(5001抱，〇2〇)3(??111):8.37((1，了 = 2.58抱，1!〇,8.20 (m，lH)，7.06(d，J=9.10Hz，lH)，4.40(s，2H)，4.10(d，lH)，3.84(d，lH)，（d，lH)，3.56(br， lH)，3.44(br，lH)，3.19(br，2H)，3.04(br，2H)，2.35(m，lH)，1.89(m，lH)，1.78(m，lH)，1.53 (m,lH),1.24(br,4H)〇 13C{1H}NMR(125MHz,D20)5(ppm) :173.8,171.4,162.8,141.1,129.8, 128.5,119.0,117.1，72·1，71·7,63 ·3,60·0,55·0,43·2,24·7,24·5,24·3<Χ?9Η25Ν3〇9 的分子 量:439 · 42 JSUSI )m/z:计算值:440 · 42(M+H) +;观察值:440 · 5。
[0200] Na2 [MnncycHBET-N02) ] (30): 29 (0 · 26mmo 1，0 · 114g)溶解于5mL水。采用 IN氢氧化 钠溶液将pH调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2'4H20(0.26mm〇l，0.051g)，并将pH仔细调节至 5。使该反应搅拌1小时，过滤并冻干以产出白色固体。将络合物注射进入反相C18(Polaris) 柱并采用上述方法脱盐。收集分级分离部分并冻干以产出白色固态的30(0.102g，80%)。 Ci9H23MnN3〇9 的分子量:493 · 35 JSUSI )m/z:计算值:494 · 35(M+3H) +;观察值:494 · 4。
[0201] Na[MnmcycHBET-N02](31):将11^3(0.0118,0.08111111〇1)添加至搅拌中的内含24 (0 · 043g，0 · 08mmo 1)的5mL H20(pH 8)。所得橘红色溶液用反相Cl8(Polaris)柱纯化:洗脱 剂A: H20(10mM乙酸铵），B:MeCN;梯度5 %~60 %B，25分钟;流速:20mL/分钟。收集分级分离 部分并冻干以产出棕色固态的26(0.024g，0.05mmo 1，62 % )。C19H21MnN3〇9的分子量:490.32。 MS(ESI )m/z:计算值:490 · 07 (M) -;观察值:490 · 2。
[0202]表1·ρΗ 7.4、37°0、1.4特斯拉下的锰络合物的弛豫度。
[0203]
[0204] 实施例2
[0205]
[0206]实施例2的合成方案可见图34。
[0207] N-甲苯磺酰基二亚乙基三胺(32)。0°(3下向内含8.480g(81.71mmol)二亚乙基三胺 的搅拌中的120mL MeCN添加1.768g(9.27mmo 1)对甲苯磺酰氯。立即形成白色非均相溶液， 并使该溶液升温至室温并继续搅拌16小时。然后使该溶液浓缩成白色油状物，加入30mL H 20,并将pH调节至>10,然后用Et20清洗两次。然后，通过冻干将水层浓缩成白色残留物。所 得残留物加入30mL H20,并通过小心添加三氟乙酸（TFA)将pH调节至7。然后通过制备型 HPLC纯化产物，米用Restek Ultra Aqueous C18柱（10mm X 250mm);洗脱剂Α:Η2〇/0·1% TFA，Β: MeCN/Ο. 1 % TFA;梯度5 %~95 % Β，23分钟;流速:5mL/分钟。汇集包含产物的分级分 离部分，并通过旋转蒸发去除MeCN和TFA。然后通过小心滴定1M NaOH(7W4)调节所得水性溶液 至pH 9,进行该步骤以产生二亚乙基三胺(大幅过量，无紫外检测）的小量游离胺，其可随产 物洗脱，预期残留的痕量在冻干期间蒸发。水性溶液通过冻干浓缩成3.142g(5.94mm 〇l， 64%)的黄色油状物，其由32+2当量的三氟乙酸钠组成。所述产物无需进一步纯化即可进行 后续反应。 1H NMR(500MHZ，D20，S来自溶剂部分）：7.78(d，2H)，7.59(d，2H)，3.08-2.02(m， 4H)，2.87(t，2H)，2.73(t，2H)，2.45(s 125.7MHz，? 20，δ来自 tBuOH) :145.77， 135.60，130.77，127.40,47.84,45.92,42.27,39.10,21.32儿〇]\^:111/2 = 258.1(]\?〇 +;计 算值:258.4。
[0208] N-甲苯磺酰基-Ν'，N〃，N〃-二亚乙基三胺三叔丁基乙酸酯（33):在20分钟内，向一 批内含2.876g(5.43mmol)的21+2当量的三氟乙酸钠、6.615g(51.18mmol)二异丙基乙基胺 和1.739g(10.48mmol)碘化钾的搅拌中的20mL DMF室温逐滴添加内含5.038g(23.83mmol) 溴乙酸叔丁基酯的5mL DMF。该反应混合物另搅拌16小时，然后在饱和的NaHC03(7搬)和Et20 之间萃取分离。分离Et 20层，并用H20更替数次清洗以去除DMF，然后用Na2S〇4干燥，并浓缩成 4.535g棕色油状物。硅胶色谱4: 1己烷：乙酸乙酯~2: 1己烷：乙酸乙酯产出2.346g (3.91mmol，72%)浅黄色油状的33</H NMR(500MHZ，CD3C1，S来自TMS):7.80(d，2H)，7.27((1, 2H)，6.63(br，t，NH)，3.42(s，4H)，3.16(s，H)，2.91(q，2H)，2.75-2.70(m，6H)，2.41(s，3H)， 1.46(s，18H)，1.43(8,911),3(:1:?}匪R(125.7MHZ，CD 3C1，δ来自 TMS) :171.17,170.69， 142·79，137·63，129·53，127·44,81·35,81·16,55·73,52·61，52·12,5177,41·41，28·32， 28 · 28，21 · 60，20 · 80 iSI-MS: m/z600 · 8 [M+H] + 计算值：600 · 3。
[0209] N-甲苯磺酰基-Ν'，N〃，N〃-二亚乙基三胺三乙酸酯2TFA(N-tos-DTTA · 2TFA)(34) · 一批0.957g(l.60mmol)33在40mL的85:5:5:5TFA:正十二硫醇：三异丙基硅烷:H2O中搅拌16 小时。然后使反应混合物浓缩至干，加入H 20，并用Et20清洗。水性层通过制备型HPLC分批纯 化，该册1^：采用&〇1^8丨1100-10-04反相柱（21.2111111叉 250111111);洗脱剂4:!120/0.1%了?八，8: MeCN/0.1 % TFA;梯度5 %~70 % B，17分钟；流速:20mL/分钟。汇集包含产物的分级分离部 分，并浓缩至0.8948(1.29臟〇1，81%)白色固态的23。 1!1匪1?(5001取，0204来自溶剂部分）： 7.80(d，2H)，7.50(d，2H)，3.98(s，2H)，3.82(s，4H)，3.51(t，2H)，3.43(t，2H)，3.36(t，2H)， 3.31(t，2H)，2.46(s，.7MHz，D 20,δ来自 tBuOH): 173.98,170.31，146.48， 135.05,131.10,127.76,56.27,55.54,54.80,53.31,50.78,38.62,21.37〇LC-MS:m/z= 432.2[]?+!1] +;计算值:432.5。
[0210] 恥[]^0-切8-〇7^)](35)。一批81.511^(〇.12111111〇1)34溶解于211^!12〇，并通过小心 添加1M NaOH将pH调节至6.40。向其中添加23.5mg(0.12mmo 1)的固体MnC 12，并小心调节pH 至6.60。所得溶液冻干成白色粉末，然后通过制备型HPLC纯化，采用Restek Ultra Aqueous C18柱（10mm x 250mm);洗脱剂A:内含50mM乙酸铵的水，B:MeCN;梯度5%~95，20分钟； 流速:5mL/分钟。包含产物的部分经重复冻干以去除任何残留的乙酸铵，最终产出白色固态 的35为631^(0.12臟〇1，100%)儿(：-]^:111/2 484.0[]\1-恥-!120)-;计算值：483.4。
[0211] 1:1的合并比例的34和Mn2+如下确定：向内含0.91mM MnCh的pH 7.30缓冲液（25mM TRIS)(各为0.45μπιο1)的500yL样品，添加递增份的1.45mM 34(增量为75yL，0~675yL;各75 yL份中有1.09μπι〇1)。随后检测各样品的^值，并绘制弛豫度与配体/金属之比的关系图（参 见图28) Jn的完全消耗点由^停止随添加的配体而下降的点确定。各样品的浓度由ICP-MS 测定。
[0212]实施例3 [0213]合成
[0214]实施例3的合成方案可见图38和39。
[0215] N-苄基-1，2_二氨基环己烷（36)。室温下，在1小时时程中，向一批内含7.113g (62.29111111〇1)1，2-二氨基环己烷的5011^]\^0~逐滴添加内含1.0938(6.39111111〇1)苄基溴的 lOmL MeCN。16小时后，将所得的白色、非均相溶液浓缩至干，并在CH2C12和饱和的Na 2C03(撒） 之间萃取分离。分离各层，有机相再次用饱和Na2C03 (7搬)清洗，随后用盐水清洗，用Na2S04干 燥并浓缩成1.28(^(6.26臟〇1，98%)的浅黄色油状的36。 1!1匪1?(5001取{0(：13^来自了]\^): 7.36-7.22(m,5H),3.94(d,lH),3.69(d,lH),2.38(m,lH),2.09(m,2H),1.90(m,lH),1.73 (m，2H), 1 · 32 · -1 · 09(m, 4H) oESI-MS:m/z = 205[M+H] + 计算值：205 · 3。
[0216] Ν'-苄基-Ν'，N〃，N〃-三丁基乙酸酯-1，2-环亚己基二胺（37):向内含1.133g (5.55111111〇1)36、4.1948(32.35_〇1)二异丙基乙基胺和0.9668(5.82_〇1)碘化钾的511^01^ 室温添加5.340g(27.38mm 〇l)溴乙酸叔丁基酯。使所得褐色、非均相溶液搅拌6小时，然后用 Et20稀释，随后用饱和的K<03(水I?、更换数次的水和盐水洗涤，用Na2S〇4干燥并浓缩成 5 · 468g棕色油状物。快速色谱（硅胶，19:1~4:1己烷:EtOAc)产出1 · 949g(3 · 57mmol，64 % ) 的浅黄色油状的纯 36</H NMR(500MHZ，CDCl3j来自TMS) :7.45((1, lH)，7.30(t，lH)，7.23((1, 1H),4.0(d,lH),3.69(d,lH),3.47-3.38(m,5H),3.28(d,lH),2.71(t,lH),2.55(t,lH), 2.04(t,2H),1,68(m,2H),1,44(s,18H),1,42(s,9H),1.31-1.25(m,4H)o^Ct^jNMR (125.7]\012,0)3(：1，3来自了]\^):171.95，171.66，139.91，129.35，128.05，126.82,80.30， 63.39,59.95,54.79,53.18,52.62,29.41,28.14,28.12,25.83,25.68〇ESI:m/z=547.0[M+ H]+计算值:547.4。
[0217] ^1^'-反-1，2-二氨基环己烷-三-叔丁基乙酸酯（38)37(0.7578，1.38111111〇1)和 Pd/C(96mg，13重量％)在MeOH中于1个大气压H2(气)下搅拌。16小时后，通过过滤移除Pd/C，并 使母液浓缩成米色油状的38(60111^，1.321]11]1〇1，95%)。该产物无需进一步纯化即用于接下 来的步骤。 1H NMR(500MHZ，CDC13，S来自TMS) :3.49-3.23(m，7H)，2.35(m，2H)，2.00(m，lH), 1,93(m,1H),1,72(m,lH),1,65(m,1H),1,44(s,27H),1.18-1.00(m,4H)o^Ct^jNMR (125.7MHZ,CD3C1，S来自TMS) :171.7(两个重合的C) ,80.6,80.5,67.3,57.6,52.8,48.7, 31.4,28.3,28.2,27.1,25.9,24.5<^51:111/2 = 457.3[]\1+!1]+计算值:457.3。
[0218] N'-(2-吡啶甲基)-Ν'，N〃，N〃-三叔丁基乙酸酯-1，2-环亚己基二胺(39):将盐酸吡 啶甲基氯（0.0798,0.48111111〇1)添加至内含38(0.25(^，0.55111111〇1)、碘化钾（0.076 8， 0.48mmol)和二异丙基乙基胺(0.320g，2.48mmol)的搅拌中的3mL DMF。搅拌16小时之后，浅 黄色浑浊溶液用50mL Et20稀释，用饱和KA03(7撤)、足量水和盐水清洗，用Na2S〇4干燥并浓缩 成0.303g褐色油状物。粗产物用快速色谱(硅胶，9:1己烷:EtOAc w/l%TEA)纯化以产出无 色油状的39(0.15(^，0.27臟〇1，50%)。1!1匪1?(5001取，0)(：13,3来自了]^):8.46((1，1!〇,7.86 (d,lH),7.64(t,lH),7.11(m,lH),4.11(d,1H),3.79(d,1H),3.48-3.32(m,5H),3.29(d, lH),2.71(m,lH),2.61-2.52(m,2H),2.06(m,2H),1.69(m,2H),1.40(s,27H),1.32-1.24(m, 3H) ^CpH}匪R(125.7MHZ,CD3C1 ,δ来自TMS): 171.8,166.2,162.5,146.8,137.3,127.0, 123.5,80.4(两个重合的信号），66.6,63.3,62.8,59.0,37.4,291,28.3,28.1,26.0,24.9, 22.7<^51:111/2 = 548.4[]\1+!1]+计算值:548.4。
[0219] Ν'-吡啶甲基-Ν'，N〃，N〃-反-1,2-环亚己基二胺三乙酸酯（40):使39(150mg， 0.27mmol)在5mL各CH2C12/TFA中搅拌。12小时后，将溶液浓缩成104mg白色固态的40 · 3TFA (Ο.?δπιπιο?,δθ%)。1!! NMR(500MHZ，D2〇j来自部分溶剂）：8.80(br s，1H)，8.59(s，1H)，8.07 (br s，lH)，8.02(br s，lH)，4.49-2.94(m，10H),2.32-2.19(m，2H)，1.91(m，2H),1.53-1.28 (m，4H) <^51:111/2 = 380 ·2[Μ+Η] + ;计算值:379.2。
[0220] [Mn(CyP3A)] (41):将40以1:1比例结合Μη11。制备该络合物并对其进行原位表征。 Μη11小心滴定至40，并且如上所述通过LC-MS或Τ2-弛豫计监测Μη: 40化学计量学。41的溶液 在室温无限稳定。m/z = 433.1[Μ+2Η] + ;计算值:433.1。
[0221] 1^'-((6-(亚甲基）吡啶-2-基）甲基）异吲哚啉-1，3-二酮)4'少〃少〃-三叔丁基乙 酸酯 _1，2-环亚己基二胺（42)。一批46811^(0.861]11]1〇1)37和6211^的10%钯碳（13重量％)在1 个大气压的H2(气)下搅拌16小时，之后通过LC-MS分析确定Ν' '，N〃，N〃-叔丁基乙酸酯-1,2-环 亚己基二胺(42)的完全转化^51:111/2 = 457.0[1+!1] + ;计算值:457.3)。通过过滤移除钯催 化剂，并真空浓缩母液。所得残留物立刻加入3mL DMF并向其添加18611^(15.2〇1111]1〇1)二异丙 基乙基胺，随后添加27511^(0.83111111 〇1)2-((6-(溴甲基）吡啶-2-基）甲基）异吲哚啉-1，3-二 酮（参见J.0rg.Chem.l997,62,5156)。6小时后，反应混合物用Et 20稀释，然后用饱和 NaHC03(7搬)，数次更换的水和盐水清洗，并用Na2S〇4干燥。过滤移除Na2S〇4后，将溶液浓缩至 干，并用己烷研碎，留下241mg的浅黄色油状物。快速色谱(硅胶，100%CH 2C12~100%Me0H) 产出77mg(0. llmmol，13%)白色纯42残留物。1H Mffi(500MHZ，CDCl3，S来自TMS) :7.88(m, 2H),7.72(m,3H),7.58(t,lH),7.03(d,br,1H),4.98(s,2H)3.97(d,1H),3.70(d,1H),3.41 (m,5H),3.24(d,lH),2.65(t,br,lH),2.53(t,br,lH),1.99(m,2H),1.636(m,2H),1.40(s, 27H) ,1.37(m,7MHZ，CD3C1J来自TMS) :171.87,171.79,168.21， 161.15,153.97,137.15,134.12,132.36,123.53122.71,118.99,80.48,80.34,77.36， 63 · 50，61 · 57，56 · 18，53.77,53.26,43.11,28.22(两个重合），25.97,25= 707.0[]?+!1]+计算值 ：707.4。
[0222] N'-6_(氨基甲基）吡啶-2-基）甲基-Ν'，N〃，N〃-三叔丁基乙酸酯-1，2_环亚己基二 胺（43)。一批77mg(0 · llmmol )42和68mg的一水合餅（1 · 70mmol)在8mL EtOH中一起回流。90 分钟后，反应混合物被浓缩至干，加入CH2C12，并用NaHC0 3(撒)和盐水清洗，用Na2S〇4干燥并 浓缩成65mg(0 · 1 lmmol，100% )的暗无色油状物43。4 NMR(500MHZ，CDC13，δ来自 TMS): 7 · 67 (d,2H),7.60(t,lH),7.08(d,lH,4.09(d,lH)3.92(s,2H),3.81(d,1H),3.54-3.43(m,5H), 3.30(d,lH),2.71(t,br,lH),2.60(t,br,lH),2.17(d,2H),1.89(m,2H),1.43(s,18H),1.43 (s,9H) ,1.26(111,411),3(:1:?}匪R( 125.7MHZ，CD3C1，δ来自TMS) :172.0(两个重合的信号）， 171.8,160.7,137.0,122.0,119.3,80.51,80.50,63.6,61.6,56.5,53.7,53.3,47.9,28.3 (两个重合的信号），26 · 0，25 · 89iSI :m/z = 577 · 0[Μ+Η]+计算值:577 · 4。
[0223] 16-((4-硝基苯基磺酰胺基）甲基)吡啶-2-基）甲基4'，^〃-三叔丁基乙酸酯-1，2-环亚己基二胺（44)。在0°C于30分钟内向内含65mg(0 · 1 lmmol)的43和33mg(0 · 32mmol) 三乙基胺的搅拌中的5mL CH2C12添加28mg (0.13mmo 1)的4-硝基苯磺酰氯。16小时后，反应混 合物用NaHC03_)和盐水清洗，用Na2S〇4干燥并浓缩至干。LC-MS分析显示对应的氨基二砜是 主要产物。经制备型HPLC之后，纯44分离为4mg(0.05mmol，5%)油状残留物，该制备型HPLC 采用Phenomenex C18柱（10mm X 250mm);洗脱剂A:H2〇/0.1%TFA，B:MeCN/0.1%TFA;梯度 5 % ~70 %B，27分钟;流速:5mL/分钟。ESI:m/z = 762 · 0[M+H] + 计算值:762 · 4。
[0224] N-6_( (4-硝基苯基磺酰氨基）甲基)吡啶-2-基）甲基-N'，N〃，N〃-三乙酸酯-1，2-环 己基二胺(45)。使2mg(2.63ymol)的44在TFA中搅拌显示45的完全转化，LC-MS分析没有检测 出副产物<^51:111/2 = 594.0[]\1+!1]+计算值:594.2。
[0225] 表2.式(IX)化合物在37°C下于pH 7.4Tris缓冲液中的弛豫度(r^mT1。计）
[0226]
[0227] 表3.在37°C于pH 6.0MES缓冲液中，Mn(II)(lmM)被来自式（IX)和[Mn(CDTA)]2-化 合物的25mM Zn(II)替代的（s-4，速率(s-〇和t1/2。
[0228] Luzzv」 头施例4
[0230] 合成
[0231] 实施例4的合成方案可见图40.
[0232] Fmoc-Ty(0Bn)_C0NH2: (46):在0°C，将异丁基氯仿（1 · 52g，11 · 2mmol)添加至处于 1'册（10011^)中的卩111〇。-丁7(0821)-(：00!1(4.938，10.0111111〇1)、1甲基吗啉（《1，2.1(^，20111111〇1) 的混合物中，并在〇°C搅拌0.5小时。添加氨水(30%，1.2mL)，并使该反应混合物在0°C搅拌1 小时（反应溶液浑浊）。滤出沉淀物(产物和NMM · HC1盐），并向滤出物另添加1.2mL的水性 氨，室温下另搅拌0.5小时。使收集的固体悬浮于Et0Ac(200mL)，并回流10分钟。过滤不溶性 固体，并使滤液真空浓缩直至溶液变得浑浊。然后，将正己烷(50mL)添加至2.48g白色固态 沉淀物40。然后向滤液添加正己烷（8011^)以另沉淀2.048的产物（共4.528,92%)。 1!1匪1? (5001取，0)3(：1，3来自丁]\^):7.76((1，了 = 7.5!^，2!〇,7.54(^ = 8.1!^，2!〇,7.4卜7.36(111， 5H),7.35-7.29( m,3H),7.12(s,br,2H),6.91(d,J=7.7Hz,2H),5.56(s,br,lH),5.29(s, br,2H),5.02(s,2H) ,4.45-4.39(m, 2H) ,4.19(t ,J = 6.4Hz , 1H), 3.07-2.99(m, 2H) 〇130{^} 匪尺（125.7]\012，。〇3(：1，3来自丁]\^):172.96，157.93，143.69，143.64，141.32，136.86， 130.36，128.58，128.00，127.75，127.48，127.09，124.98，120.00,115.12，77.26，77.00， 76.75,70.02,66.91，53.61，47.19,37.54』51:111/2 493.4[]\1+!1]+计算值：493.2。
[0233] NH2_Ty (OBn) -CONH2 (47):将46(3.60g，7.3mmo 1)溶解于内含20 % 哌啶的DMF (40mL) 的溶液中，并室温搅拌2小时。真空去除溶剂，并使残留物重新溶解于EtOAc，并通过添加正 己烷来沉淀，以获得白色固体：1 · 9g (99 % )。咕MMR( 500MHZ，CD3C1，δ来自TMS): 7 · 43-7 · 31 (m，5H)，7.15(d，J = 8.5Hz，2H)，7.08(s，lH)，6.94(d，J = 8.5Hz，2H)，5.37(s，lH)，5.05(s， lH),3.58(dd ,J = 9.3,4.1Hz,lH),3.19(dd ,J=13.9,4.0Hz,lH),2.69(dd ,J=13.9,9.3Hz, 1H) ^CpH}匪R( 125.7MHZ，CD3C1, δ来自 TMS) :177.33,157.82,136.98,130.32,129.95， 128·60，127·99，127·46，115· 12,70.05,56.56,40.07』51 :m/z 271 ·3[Μ+Η]+计算值： 271.1。
[0234] 順2-了7((?11)-胺（48):使47(1.868,6.88臟〇1)悬浮于无水1'册（1〇1^)，并添加冊3· THF(1.0M，26mL)。该反应溶液在氮气气氛下回流12小时。该溶液于冰浴中冷却，并缓慢添加 甲醇以猝灭该反应。蒸发去除溶剂后，使黄色残留物重新溶解于HCl(1.0M，40mLWPEt 20 (50mL)，并室温搅拌1小时。移出有机层后，将水性溶液置于冰浴中，并通过添加 NaOH将pH上 调至12。该基础溶液用CH2Cl2(3X50mL)萃取，然后蒸发CH 2C12以获得浅黄色固体（1.39g， 79%)</H NMR(500MHZ，CD3C1，S来自TMS) :7.44-7.31(m，5H) ,7.11 (d，J = 8.5Hz，2H) ,6.92 (d J = 8.5Hz,2H),5.05(s,2H),2.96-2.88(m,lH),2.80-2.72(m,2H),2.53-2.43(m,2H)〇 13C {1田匪1?(125.7]\〇2,〇)3(：1，3来自丁]\^):157.36，137.10，131.51，130.14，128.56，127.92， 127.45，114.87,70.05,55.25,48.21，41.41』51:111/2 257.3[]\1+!1]+计算值：257.4。
[0235] N，N，N'，N'-3-(4-(苄氧基)苯基）丙烷-1，2-二胺-四-叔丁基乙酸酯（49):向内含 48 (1 · 39g，5 · 46mmo 1)、KI (906mg，5 · 46mmo 1)和DI PEA (5 · 64g，43 · 7mmo 1)的无水DMF (30mL)的 混合物添加溴乙酸叔丁基酯（8.52g，43.7mmol)，然后在50°C搅拌42小时，反应由LC-MS监 测。冷却后，真空移除DMF，并向残留物添加 H20(40mL)和Et0Ac(80mL)。分离有机层，用水和 盐水清洗，然后蒸发。残留物通过柱色谱(Si0 2，l%Et3N内含于己烷/Et0Ac = 2/l)纯化以获 得浅黄色油状产物（3MMR(500MHZ，CD3C1，δ来自 TMS) :7.41-7 ·22(ι?，5H)， 7.06(d,J=7.6Hz,2H),6.80(m,2H),4.95(s,2H),4.66(s,1H),4.52(m,1H),3.43(s,4H), 3.36(s,4H),3.23(m,lH),3.02(m,lH),2.78(m,lH),2.51(m,lH),1.44-1.27(m,36H), 13C pH}匪以125.7]\02，〇〇3(：1，3来自丁]\^):171.72，170.80，154.25，131.20，130.1，115.35， 81.20,81.05,63.40,56.30,55.20,53.65,35.65,28.20』51:111/2 713.5[]?+!1]+计算值： 713.4〇
[0236] Ν，Ν，Ν'，Ν'-4-(2,3-二氨基丙基）苯酚-四-叔丁基乙酸酯（50):将Pd/C(10%， 250mg)添加至内含49(60011^，0.84111111〇1)的160!1(201^)的溶液。反应混合物用!12气囊脱气三 次，并在室温下搅拌2小时，反应由LC-MS监测。混合物经过滤，并使滤液浓缩以获得浅黄色 油状物，其通过柱色谱进一步纯化:DCM/EtOAc(1 %Et3N，0-20 %，v/v)。无色油状物:460mg (74%)</H NMR(500MHZ，CD3C1，S来自TMS):7.07((1,J = 8.3Hz，2H) ,6.71 (d，J = 8.3Hz，2H)， 4.02(s,lH),3.49(d,J = 3.1Hz,4H) ,3.43(d,J = 3.3Hz,4H) ,3.12-3.03(m,zH) ,2.89(dd,J = 13.4,7.2Hz,2H) ,2.82(dd,J=13.8,5.6Hz,2H) ,2.62-2.51(m,2H),1.45(s,18H) ,1.41 (s, 18H) .WcpHlNMRUSS.TMHZ.CDsCl，δ来自 TMS): 171 ·39，170·95，153·78,132.35， 130.31,115.07,82.56,80.69,63.38,56.27,55.20,53.59,35.97,28.14〇ESI:m/z 623.4[M +扣+计算值：623.4。
[0237] N，N，N'，N'-4-(2,3-二氨基丙基）苯酚-四乙酸酯（51):将50(200mg，0.32mmol)溶 解于92.5 :2.5: 5比例的TFA、水和三异丙基硅烷(TIPS)的混合物中，然后使反应在LC-MS监 测下搅拌2小时。减压去除溶剂，残留物通过制备型HPLC纯化以获得白色固体（100mg， 78% )〇^ NMR(500MHZ,D2〇,5)：7.02(d ,J = 7.2Hz,2H), 6.73(d,J = 7.6Hz,2H) ,3.78-3.42 170.85,154.43,130.40,128.09,115.72,60.83,55.29,54.46,52.54,31.64〇ESI:m/z 399.3 [M+H] + 计算值：399.2。
[0238] Na [Μη (TyOH-EDTA) ] (52):该络合物原位制备。首先，将内含51 (8 · 3mg)的 2 · OmL HEPES缓冲液（100mM，pH = 7.4)与4.19mM MnCl2的HEPES溶液一同制备。这些溶液以不同比 例混合，并且在在1.4T检测溶剂水的T2。由1/T2对比[Μη]的曲线，确定准确配体浓度。在该 曲线中，1/Τ 2随[Μη]线性增加，直至[Μη]=[配体]，然后斜率以因子10增加。就该实施例而 言，[配体]是2.16mM。然后，使一等份的该配体溶液与内含0.95当量MnCl 2的HEPES缓冲液混 合，并用ICP-MS检测浓度。
[0239] 叔丁基保护的N3P3-(Ty0H-EDTA)6(53):于0°〇，在％下，向内含六氯环三磷腈 (4?5 · 6mg，0 · nimmol)的新鲜无水乙腈（2〇mL)添加 f51 (547mg，0 · 83mmol)和碳酸铯（3l8mg， 0.97mmol)。反应混合物在45°C搅拌两天，然后采用1H NMR(产物在δ = 6.90处有正Η峰，对比 起始物质在δ = 6.73处)和31P NMR(存在δ = 7.81峰)监测该反应。在混合物冷却至室温后，离 心去除盐，并使澄清溶液在减压下浓缩并经快速色谱（l%Et3N，DCM/EtOAc)以获得浅黄色 油状的六聚体_叔丁基醚（42011^，82%)。 1!1匪1?(50冊!12,03(：1，3来自1]\^):7.07((1，了 = 8.3Hz,12H) ,6.90(d,J = 8.6Hz,12H) ,3.47(d,J = 8.3Hz,24H) ,3.43(d,J = 4.9Hz,24H), 3.11-3.07(m,6H),2.93-2.83(m,12H),2.63-2.53(m,12H),1.43(s,108H),1.39(s,108H)〇 UcpH}匪R( 125.7MHZ，CD3C1, δ来自 TMS) :171.31,170.94,130.15,120.69,80.66,80.56， 63.42,56.35,55.40,53.65,28.26,28.24。 3^ 匪R(202MHZ，CD3C1，δ) UUESIzm/z 1934 · 0 [M+2H]2+计算值：1933 · 6。
[0240] N3P3-(Ty0H-EDTA)6(54):使53(410mg，0 · 1 lmmol)溶解于比例为82 · 5: 5: 5的TFA、 水、茴香硫醚、苯酚和乙二硫醇的混合物中，并使反应溶液室温搅拌12小时，反应由LC-MS监 测。该溶液于冰浴中冷却，然后添加二乙基醚(50mL)以使产物沉淀。沉淀的产物通过离心分 离，并用醚清洗三次以获得白色固体（19511^，77%)。 1!1匪1?(5001012,020,6):7.15((1，1 = 8.2Hz,12H),6.84(d,J = 8.2Hz,12H) ,3.69(d,J=16.7Hz,12H),3.55(m,24H) ,3.45(d,J = 174.12,171.36,163.06,162.78,148.66,133.63,130.78,121.30,117.43,115.11,61.16， 57.08,54.88,54.61，31.71。3中 NMR(202MHZ，D2〇j):8.57。
[0241] Mn6[N3P3-(Ty0H-EDTA)6](55):该络合物原位制备。首先，将内含54(11.3mg)的 2 · OmL HEPES缓冲液（100mM，pH = 7 · 4)的溶液与4 · 19mM MnCl2的HEPES溶液一同制备。这些 溶液以不同比例混合，并在1.4T检测水溶剂的Τ2&如关于化合物48所述确定六聚体配体的 浓度。因为该六聚体配体包含6个EDTA部分，一个六聚体配体将结合6个当量的Μη。基于该结 果，随后使6〇11^的六聚体配体与24.311^的111(]12*4!12〇在2.〇1111^去离子水中混合，并通过添加 0.2Μ NaOH小心调节pH至7.4。这代表着MnCl2的小幅（2 % )过量以确保全部螯合。通过使溶 液通过阳离子交换柱以11仏(*，1(：-似），从阴离子六聚体络合物分离过量的此2+，以去除过 量的Mn 2+。通过冻干获得终产物为白色固体(60mg，85 % )。
[0242] 式(XI)和(XII)的化合物的弛豫度在37°C下于pH 7.4HEPES缓冲液中以不同场强 度测定。对于不同的Μη浓度，从Ι/h对比[Μη]的曲线的斜率获得弛豫度。因为式(XI)包含6 个Μη/分子，离子(/Μη)和分子(/分子)弛豫度如下所示。
[0243] 表4.在37°C于pH 7.4HEPES缓冲液中检测的不同场强度的式(XI)和(XII)化合物 的弛豫度(ri以rnirY1计）。
[02441
ND =未检测到
[0246] 因此，本发明提供用于磁共振成像的造影剂，以及用于制备所述造影剂的方法。
[0247] 尽管已经参考某些实施方式相当详细地描述了本发明，但是本领域技术人员应理 解，可以通过不同于所述实施方式的方式实施本发明，本文所述的实施方式是为了举例说 明，而没有限制的作用。因此，所附权利要求书的范围不应限于本文包含的实施方式所述的 内容。
【主权项】
1. 一种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(I)的化合物：或所述化合物的药学上可接受的盐，或所述化合物的位置异构体，其中R2连接至苯环上 的不同的碳， 其中R1选自下组:取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的 杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基芳烃，和二亚烷 基杂芳烃， 其中R2选自下组:氣、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、卤素、氛基、硝 基、羟基和烷氧基， 其中η是2或3,和 其中，当η是2时，所述化合物任选地包含配位至Mn的水。2. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(II):.〇3. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(III):O4. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(IV):Q5. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(V):'66. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(Va):〇7. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(Vb):b8. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R1是亚乙基。9. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R2是甲氧基。10. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R2是硝基。11. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R1是环亚己基。12. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R1和R2中至少一个包含能够靶向对象中的感兴趣区域的靶向部分。13. 如权利要求12所述的造影剂，其特征在于： 所述靶向部分选自蛋白质、酶、肽、抗体和药物。14. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。15. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： 当η = 2时，所述造影剂具有较高弛豫度。16. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： 所述化合物能在体内从其中η = 3的式(I)转化成其中η = 2的式(I)。17. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： 所述化合物能在体内通过生物学还原剂从其中η = 3的式(I)转化成其中η = 2的式(I)。18. 如权利要求17所述的造影剂，其特征在于： 所述生物学还原剂是谷胱甘肽。19. 如权利要求1所述的造影剂，其还包含： 药学上可接受的运载体，所述药学上可接受的运载体包括用于使所述化合物从其中η =3的式(I)还原成其中η = 2的式(I)的还原剂。20. -种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(VI)的化合物：或所述化合物的药学上可接受的盐，或所述化合物的位置异构体，其中R4连接至苯环上 的不同的碳， 其中R1选自下组:取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的 杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基芳烃，和二亚烷 基杂芳烃， 其中R3选自下组:取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的 杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基芳烃，和二亚烷 基杂芳烃， 其中R4选自下组:氣、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、卤素、氛基、硝 基、羟基和烷氧基， 其中X是N或NH， 其中，当X是NH时，所述化合物任选地包含配位至Mn的水，和 其中，当X是N时，X配位至Mn。21. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(VII):〇22. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(VIII):323. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于： 当所述造影剂暴露至pH变化的环境时，pH降低时，弛豫度增高。24. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于： R1和R4中至少一个包含能够靶向对象中的感兴趣区域的靶向部分。25. 如权利要求24所述的造影剂，其特征在于： 所述靶向部分选自蛋白质、酶、肽、抗体和药物。26. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。27. -种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(IX)的化合物：〇28. 如权利要求27所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。29. -种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(X)的化合物：或所述化合物的药学上可接受的盐， 其中R5是核结构，和 其中η是1~12的整数。30. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： R5是环状主链。31. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： R5是磷臆。32. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： R5 是 Ν3Ρ3。33. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： η是6 〇34. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。35. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(XI):Q36. -种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(XII)的化合物：或所述化合物的药学上可接受的盐。37. 如权利要求36所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。38. 如权利要求1~37中任一项所述的造影剂，其特征在于： 所述化合物的每个-锰离子η弛豫度大于O . SmiT1iT1，或大于O . SmiT1iT1，或大于1.0 miT 1S-1，或大于 1 · 5mM-1S-1，或大于 2 · OmM-1S-1，或大于 2 · 5mM-1S-1，或大于 3mM-1S-1，或大于 4mM-1S -1，或大于5mM-V1，或大于6mM- 1，或大于7mM-1S-1，或大于8mM-V1，或大于9mM- 1S-1，或大于 10mM-V、39. -种用于对象的体内成像的方法，所述方法包括： (a) 给予所述对象权利要求1~37中任一项所述的造影剂； (b) 等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点处累积的一段时间;和 (c) 采用非侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。40. 如权利要求39所述的方法，其特征在于： 所述非侵入性成像技术选自：磁共振成像，或采用磁共振成像的正电子发射断层摄影。41. 如权利要求39所述的方法，其特征在于： 所述非侵入性成像技术是采用磁共振成像的正电子发射断层摄影，且 步骤(a)包括给予所述对象权利要求14、26、28、34或37中任一项所述的造影剂。42. -种对对象中的感兴趣区域成像的方法，所述方法包括： (a) 给予所述对象权利要求1~37中任一项所述的造影剂； (b) 使所述对象置于磁系统中，该磁系统被设置以产生围绕对象的至少部分的极化磁 场； (c) 对设置以向该极化磁场施加梯度场的多个梯度线圈通电； (d) 控制射频(RF)系统，该射频(RF)系统被设置以向所述对象施加激励场，并从所述对 象采集磁共振(MR)图像数据;和 (e) 由所述MR图像数据重构所述感兴趣区域的图像。43. 如权利要求42所述的方法，所述方法还包括 (f) 采用多个检测器检测由所述对象发出的γ射线，并对应于检测到的γ射线进行信 号通信;和 (g) 由所述信号重建所述对象的感兴趣区域的一系列医学图像， 其中步骤(a)包括，给予所述对象权利要求14、26、28、34或37中任一项所述的造影剂。44. 一种对已经给予一个剂量的造影剂的对象成像的方法，所述方法包括： 使所述对象置于磁系统中，该磁系统被设置以产生围绕对象的至少部分的极化磁场； 对设置以向该极化磁场施加梯度场的多个梯度线圈通电； 控制射频(RF)系统，该射频(RF)系统被设置以向所述对象施加激励场，并由所述对象 采集磁共振(MR)图像数据;和 由所述MR图像数据重构所述对象的图像， 其中所述造影剂包括权利要求1~37中任一项所述的造影剂，和 其中，给予所述造影剂的对象中的分子具有的改良的纵向弛豫时间，这在图像中得以 反映。45. -种用于感测对象中生物学还原剂的方法，所述方法包括： (a) 给予所述对象权利要求1~19中任一项所述的造影剂，其中η是3; (b) 等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点处累积的一段时间;和 (c) 用磁共振成像对所述细胞或组织成像， 其中，给予了所述造影剂的所述对象中的包含生物学还原剂的细胞或组织具有改良的 纵向弛豫时间，这在图像中得以反映。46. 如权利要求45所述的方法，其特征在于： 所述生物学还原剂是谷胱甘肽。47. -种检测对象中具有不同pH水平的感兴趣区域的方法，所述方法包括： (a) 给予所述对象权利要求1~28中任一项所述的造影剂； (b) 等待足以允许所述造影剂在待成像的感兴趣区域处累积的一段时间;和 (c) 用磁共振成像对所述感兴趣区域成像， 其中，给予了所述造影剂的所述对象中具有不同pH水平的感兴趣区域具有改良的纵向 弛豫时间，这在图像得以反映。48. 如权利要求47所述的方法，其特征在于： 当所述造影剂暴露至pH变化的环境时，pH降低时，弛豫度增高。
【专利摘要】公开了作为磁共振探针和生物学还原剂传感器的锰配位络合物。在一个实施方式中，配体可使Mn2+和Mn3+氧化态稳定化。在还原剂例如谷胱甘肽的存在下，低弛豫度MnIII-HBET被快速转化成高弛豫度MnII-HBET，其弛豫度增加3倍，并且伴随磁共振信号的增强。在另一个实施方式中，设计配体以使其以热力学稳定和动力学惰性方式螯合Mn(II)，同时允许Mn(II)与水直接相互作用。而在另一个实施方式中，制备包含六个Mn(II)螯合剂的高分子量多聚体。该高分子量导致分子在溶液中的翻转较慢，并且显著增强Mn(II)弛豫度。
【IPC分类】A61K49/06, A61K49/00, C07F13/00
【公开号】CN105492449
【申请号】CN201480012793
【发明人】P·卡拉文, E·M·盖尔, G·S·洛文, S·慕克吉, 朱江
【申请人】通用医疗公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年1月7日
【公告号】EP2941434A1, US20150336996, US20150336997, WO2014107722A1
【专利说明】猛基磁共振造影剂
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年1月7日提交的美国专利申请第61 /749，614号的优先权。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明经政府支持在国家癌症研究所(National Cancer Institute)和国家研究 资源中心（National Center for Research Resources)授予的基金号CA161221 和RR14075 的资助下完成。政府对本发明拥有某些权利。
[0005] 发明背景 1 .发明领域
[0006] 本发明涉及用于磁共振成像的造影剂。本发明还涉及用于制备所述造影剂的方 法。 2.【背景技术】
[0007] 当基质（例如人类组织)受到均匀磁场(极化场Bo)作用时，该组织中的激发核的各 磁矩会趋于沿着该极化场排列，但是以它们的特征拉莫尔频率(Larmor frequency)以随机 次序围绕该极化场进动。如果该基质，或组织，受到位于χ-y平面内并且具有接近拉莫尔频 率的磁场（激励场以）作用时，则沿着磁场方向的净磁矩（Mz)，可能会旋转或"翻转 (tipped)〃进入该x-y平面，以产生横向的净磁矩Mt。由所述激发核或〃自旋（spin) 〃发出信 号，在该激发信号出结束之后，该信号可被接收并处理以形成图像。
[0008]在磁共振成像(MRI)系统中，激发的自旋诱导接收线圈中的振荡正弦波信号。该信 号的频率接近拉莫尔频率，并且其初始振幅通过横向磁矩Mt的大小来确定。发出的NMR信号 的振幅(A)随时间（t)以指数形式衰变。衰变常数1/T* 2取决于磁场的均匀性和!^，其被称为" 自旋-自旋弛豫"常数，或"横向弛豫"常数。该Τ2常数与，从完全均匀磁场去除激发信号出之 后，所述自旋沿磁场进动将会发生的去相位的指数速率成反比。Τ 2常数的实际价值是:不同 组织会具有不同的^值，而这可被用作提高所述不同组织之间的对比度的手段。
[0009]对NMR信号的振幅Α产生作用的另一个重要因素被称作：自旋-晶格弛豫过程，其用 时间常数!^来表征。其描述:净磁矩Μ沿着磁性极化的轴(z)朝向其平衡值的恢复弛豫与 自旋相干性的减小相关联，而h弛豫的出现归因于探测位点的顺磁性迀移，以及结合的质 子与周围的体相水(bulk water)的后续交换。^时间常数(其被称作"自旋-晶格弛豫"常数 或"纵向弛豫"常数)比T2*，在医学领域感兴趣的大多数基质中要长得多。如同T 2常数，可利 用不同组织之间的h的差异来提供图像对比度。
[0010] 这些弛豫时间常数的倒数被称作弛豫速率，并且表示为办和此，其中R! = 1/h，而R2 =I/T2 ο
[0011] 造影剂是能够改变组织的弛豫性质，并且诱导图像对比度的外源性分子或物质。 造影剂通常是顺磁性、超顺磁性或铁磁性物质。造影剂有时也被称为成像探针。
[0012] 所给造影剂能够改变弛豫速率的程度被称为弛豫度(relaxivity)。弛豫度定义为 采用造影剂和不采用造影剂检测的样品的弛豫速率差异。然后，使该弛豫速率差异对于造 影剂的浓度进行标准化。弛豫度表示为小写字母"r"，所带下标"Γ或"2"分别指的是纵向或 横向弛豫度。例如，纵向弛豫度(η)定义为其中心是存在造影剂时检测到 的弛豫速率（以?Γ 1计hR，是不存在造影剂时检测到的弛豫速率（以?Γ1计），而C是造影剂的 浓度（以mM计）。弛豫度的单位是:πιΜΛ'对于包含多于一种金属离子的造影剂，弛豫度可 以金属离子浓度的方式（7离子或'离子弛豫度'）表达，或者以分子浓度的方式（7分子'或 '分子弛豫度'）表达。弛豫度是造影剂的固有性质。
[0013] 为了引发临床上希望的对比度，已经开发出了经设计以影响弛豫时长的MRI造影 剂。意料之中的是，存在临床上用于调节^对比度的造影剂，和临床上用于调节^对比度的 造影剂。
[0014] Tr加权的（T1W)成像提供这样的图像对比度：当水在某一组织或区域中具有短h 时，图像中的该组织或区域是明亮的（信号强度增加）。增加图像对比度的一种方式是给予 基于钆(Gd)、锰(Μη)或铁的顺磁性络合物或物质。这种顺磁性造影剂使水分子所对应的h 变短，从而导致正性图像对比。如上所述，所给造影剂的浓度能够改变!^的程度代表弛豫 度。弛豫度较高的化合物提供的Tw信号增强大于弛豫度低的化合物;或者，高弛豫度化合 物可以提供与低弛豫度化合物等同的信号强度，而在该情况下，其所需浓度低于低弛豫度 化合物。因此，高弛豫度化合物是人们希望的，因为它们能够提供病灶出的较大增强，从而 提高诊断置信度;或者，它们可以较低剂量使用，从而改善造影剂的安全系数。
[0015] 临床应用中主要采用的磁共振造影剂是+3氧化态的钆离子。+2氧化态的锰离子也 可被用作1'1弛豫剂。猛福地吡(13]^3；1；'〇(1丨口；[1')(冠以商标名称16 81380311，以猛福地吡三钠 (mangafodipir trisodium)销售)是一种造影剂，其经静脉内递送以增强肝的磁共振成像 (MRI)中的对比度。它包含顺磁性锰(II)离子和螯合剂福地吡(二磷酸二吡哆盐）。锰缩短纵 向弛豫时间（??，从而使正常组织在磁共振图像中显得更加明亮。弛豫度与Gd基造影剂一 样高的Μη基试剂已被描述(参见例如，Inorg Chem 43:6313-23,2004)。
[0016] 钆磁共振造影剂的一个缺点是，生理学条件下，钆离子仅在+3氧化态状态下稳定。 此外，钆基造影剂在肾功能受损患者中的应用与被称为肾源性系统性纤维化(NSF)的罕见 但严重的纤维化疾病之间存在成熟建立的联系。
[0017] 锰基磁共振造影剂的进一步改进在增强对比度的应用中将有巨大可用性。在生理 学条件下，锰能评估多种氧化态，其中+2氧化态最适于TjPT 2对比度。这可被用于非侵入性 的组织氧化还原动力学研究。对于NSF风险较高的患者群体，锰基造影剂还可作为钆的可行 替代物。
[0018] 发明概述
[0019] 在健康组织中，胞内和胞外氧化还原环境是经严格调控的，并且与细胞的生理学 状态紧密相关。然而，在细胞应激、损伤或细胞死亡期间，该调控常被扰乱。虽然局部氧化还 原状态的动力学在介导各种生物过程(例如细胞周期进程、免疫应答和创伤愈合）中起重要 作用，但已将胞外氧化还原环境的持续失调与多种病理学(包括慢性炎症、肿瘤生长和癌细 胞侵袭)联系起来。事实上，氧化还原在肿瘤生物学中所起的作用始终是一大活跃研究领 域，并且是当前开发中的多种氧化还原活化的前药的聚焦点。新成像方法必然会促进这些 努力，同时进一步增进我们对于氧化还原动力学与疾病的关系的基础理解。
[0020] 已经报道了若干氧化还原活化的分子成像探针，其各自利用独特的活化机制以针 对氧化还原环境的特定方面。这些探针中的一些靶向缺氧(低氧压）的组织，该缺氧状况可 因肿瘤中有时出现的对受影响区域的血液供应中断或血管形成不充分所致。正电子发射断 层扫描探针 18F-氟咪索硝唑(18F-MIS0)和64Cu-二乙酰-双(N4-甲基氨硫脲）（ 64CU-ATSM)已在 临床上应用以对肿瘤缺氧区域成像。已证实电子顺磁共振(EPR)成像和基于氧化还原敏感 性的氮氧自由基的光谱探针有效于检测巯基化合物以及其它还原性物质的相对丰度。磁共 振(MR)探针也已有报道。示例包括Gd(III)络合物，其中配体能够形成可逆二硫键，由此胞 外蛋白质的半胱氨酸侧链提供局部氧化还原状况的间接视图，Mn(III)-卟啉，其经历还原 作用成为在缺氧条件下具有较高弛豫度的Mn(II)物质，以及最近报道的，Eu(III)络合物 对，其可在β-NADH存在时通过配体侧臂的还原而被活化。
[0021] MR是一种图像氧化还原动力学的具有吸引力的疗法，因为其允许对完整、不透明 的有机体进行三维检测，其在高场系统上具有细胞分辨率(约?〇μπι)，且在临床扫描仪上具 有亚毫米分辨率。MRI的深组织穿透力和高分辨率使其能够直接翻译从细胞到小鼠到人类 的结果。
[0022] 采用氧化还原敏感性MR探针的一个方式是采用氧化还原活性金属离子。用于大多 数MR探针中的Gd(III)在水性介质中仅具有一种稳定的氧化态。然而，锰能够根据配位场以 多种氧化态稳定存在。高自旋Mn(II)络合物还能产生与最佳Gd(III)络合物相当的弛豫度， 并且，近期已有尝试采用Mn(II)络合物作为MR探针。本文中，我们提出基于Mn(II)/Mn(III) 氧化还原对的一类新型氧化还原活化的MR探针。
[0023] 锰离子能够稳定地或亚稳定地以不同的氧化态存在。我们已确认了锰以不同氧化 态存在的能力的优势。我们显示，能够制出结合至锰的配体，并使其稳定在+2和+3氧化态。 Mn(II)络合物的弛豫度远高于Mn(III)类似物。我们还显示，能够以导致一种氧化态被优选 的方式来修饰该Μη结合配体。该氧化还原活性络合物的好处在于，它们能够起到传感器的 作用。例如，我们显示，Μη(ΙΙΙ)络合物可通过谷胱甘肽的生理学浓度被还原成Μη(ΙΙ)络合 物，这进而导致磁共振信号增加。因此，这些络合物能够作为谷胱甘肽或其他生物学还原剂 的传感器。
[0024] 我们还显示，某些锰络合物能够随pH变化而改变其弛豫度。酚盐-0和磺酰胺-Ν配 体均为酸可分离的，并且调节锰和体相水的相互作用，这影响弛豫度。在我们的实施例中， 弛豫度随pH降低而增加，从而这些化合物能够作为pH和酸中毒的传感器。酚盐和磺酰胺供 体的pK a值是高度模块化的，并且经得起合成性微调的检验。低胞外pH是组织局部缺血（例 如，中风、缺血性心脏病、肾缺血)和许多肿瘤的标志。
[0025]我们还开发了一种新型配体，称为CyP3A。该配体被设计为以热力学稳定和动力学 惰性的方式与Mn(II)螯合，同时允许Mn(II)与水发生直接相互作用。动力学数据指示， CyP3A的锰络合物对Zn (II)金属转移的惰性高于⑶TA (环己二胺四乙酸）的Μη (II)络合物， 其显示出优于文献的前述特征的最佳平衡。CyP3A的吡啶基-Ν供体是模块化的，并且提供附 加另一个配体供体的简易方式，其能够可逆地占据由水占据的配位点。该支架对于可能的 pH-传感应用而言是理想的。
[0026]此外，我们制备了包含六个Mn(II)螯合剂的高分子量O2000MW)的多聚体。高分子 量使分子在溶液中的翻转更为缓慢，并且显著提高了 Mn(II)弛豫度。
[0027] Μη基造影剂的另一个好处在于，存在发出正电子的锰同位素(Mn-51和Mn-52)，这 使将这些络合物作为正电子发射断层摄影(PET)剂的应用成为可能。此外，通过用PET同位 素交换天然Mn-55,能够简易地制备双重MR-PET探针。此类探针能够用于新型复合型MR-PET 扫描仪，其中这两种方式均可用于检测该探针。该方法的一个好处在于，能够对生理学参数 (例如pH、还原电位或离子流量)进行更加准确、定量的检测。
[0028]通过以下详述、附图和所附权利要求书可以更好地理解本发明的这些特征、方面 和优点，以及其他的特征、方面和优点。
[0029]附图简要说明
[0030] 图1显示配体结构强力影响Μηπι/Μηπ对的氧化还原电位。羧酸供体向酚供体的转 化使半电池电位迀移了有利于较高氧化态的649mV。
[0031] 图 2 显示：图（a)中，内含 Mnn-HBET(25mM)的 25mM TRIS 缓冲液（pH = 7.4)以 500mM KN〇3作为支持电解质的100mV/s下的循环伏安图。电位是对比K4Fe(CN)6/K 3Fe(CN)6;而图（b) 中，是Mn2+/Mn3+对-i a(递减线）和(递增线）对比，v(其中v =扫描速率）的科特雷尔 (Cottrell)图。
[0032] 图3显示：左图：以4.7T的内含纯水、pH 7.4TRIS缓冲液中的0.5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ和 0.5mM Μηη-ΗΒΕΤ的管记录的IV加权的MR图像。右图：以室温和4.7Τ检测的弛豫度。
[0033]图4显示(a)经375nm处处的特征紫外吸光度测定，在TRIS缓冲液(pH7.4,37°C)中， 通过10mM GSH从0.5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ还原成Μηπ-ΗΒΕΤ导致增加的质子弛豫速率（1/T!，左轴） 和随之减少的Mn m-HBET的摩尔分数(右轴）。（b)由LC-MS在26°C监测，通过ImM GSH的0 · 5mM ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的还原。在还原过程中没有观察到长久存在的中间体物质。
[0034] 图5显示氧化环境和还原环境中的Μη2+/Μη3+造影剂。
[0035]图6显示2'-((2-((羧甲基）（2_羟基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸（IfflET) (3) 、2'-((2-((羧甲基）（2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸(HBET-0Me) (8)和2'-((2-((羧甲基）（2-羟基-5-硝基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸(HBET-N02) (12)的完整合成方案。
[0036]图7显示(a)配体HBET⑶的分析LC-MS痕迹，其中在220nm处的痕迹（黑线A)指示高 样品纯度，并且对于m/z = 341的萃取离子以红线B显示，其与上述痕迹叠加;和(b)3的ESI-MS显示对应于[M+H]+的m/z = 341。
[0037] 图8显示C18反相柱上的（a)MnnHBET(4)和(b)MnniHBET(5)的分析LC-MS痕迹；其中 220nm处的痕迹(黑线A)指示高样品纯度，m/z = 394和393的萃取离子以红线B显示。
[0038] 图9显示（a)MnnHBET(4)在水中的紫外光谱；和（b)MnnHBET(4)的ESI-MS，显示对 应于[M+3H]+的 m/z = 394。
[0039] 图 10 显示（a)MnmHBET(5)在水中的 UV 光谱；和（b)MnmHBET(5)的 ESI-MS，显示对 应于[M+2H]+的 m/z = 393。
[0040] 图 11 显示(a)Na[MnmHBET](5)和(b)Na2[MnnHBET](4)在 TRIS 缓冲液中的弛豫度。 (4) 和(5)的[Μη]在37°C于pH 7.4的TRIS缓冲液中检测。线的斜率表示弛豫度。
[0041 ] 图12显示：包含KN〇3作为支持电解质的内含MnnHBET(25mM)的TRIS缓冲液(pH = 7.4)在50-600mV/s范围内的不同扫描速率下的循环伏安图。
[0042]图13显示:通过375nm处吸光度的下降（点线）检测到的在谷胱甘肽存在下，ΜηΠΙ- HBET向Μηπ-ΗΒΕΤ的转化。实线显示观测数据与Mnm在伪一级条件下的一级速率方程(参见 下方等式S1)的拟合。
[0043]图14显示：在大幅过量的还原的谷胱甘肽的存在下，氧化还原反应表现为对应于 [ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ]的伪一级。各线的斜率等于-k · [GSH](参见下方等式Slha.)谷胱甘肽的浓度 随各反应变化，但ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的初始浓度(0.6mM)不变。b.)初始Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ浓度变化，而谷胱 甘肽浓度(10mM)维持恒定。
[0044] 图15显示：在三种不同的谷胱甘肽浓度下，ΜηΠΙΗΒΕΤ还原的初始速率与Μη ΠΙΗΒΕΤ 浓度的关系图。各线的斜率(ki察)等于-k· [GSH](参见下方等式S1)。
[0045]图16显示:采用还原剂(GSH)和氧化剂(H202)时在两种氧化态之间的相互转化。 [0046]图17显示：（a)图，采用内含ImM H2〇2的TRIS缓冲液(pH 7.4,37°C)，然后进行弛豫 度检测（左轴）和UV-ViS光谱检测的，0.5mM Μηπ-ΗΒΕΤ向ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ的氧化，其中375nm处的 紫外吸光度的增加指示随时间（右轴)推移形成Μη ΠΙΗΒΕΤ的变化关系;和(b)图，由LC-MS，通 过ImM H2〇2在26°C监测的0.5mM Μηπ-ΗΒΕΤ。
[0047]图 18显示：内含(a)0.5mM ΜηπΗΒΕΤ和（b)0.5mM ΜηΠΙΗΒΕΤ的TRIS缓冲液(ρΗ=7.4) 的信号强度对比反转时间（ΤΙ)的代表性的图。注意:Μηπ-ΗΒΕΤ的较快信号恢复指示，相较于 ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ具有较短TdP较高弛豫度。
[0048]图19显示本发明的cycHBET系列化合物的合成途径。
[0049] 图20A显示37°C下pH 7·4的内含（a)Na2[MnπHBET](4)和（b)Na[MnΠIHBET](5)的 TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0050] 图20B显示37°C下pH 7.4的内含Na2[MnπHBET-0Me](9)的TRIS缓冲液的弛豫度。线 的斜率表示弛豫度。
[0051 ]图20C显示37°C下pH 7·4的内含Na2[MnπHBET-N02](13)和Na[MnΠIHBET-N02](14) 的TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0052] 图20D显示37°C下pH 7.4的内含Na2[MnπcycHBET](30)的TRIS缓冲液的弛豫度。线 的斜率表示弛豫度。
[0053] 图20E显示37°C下pH 7·4的内含Na2[MnπcycHBET](2)和Na[MnπcycHBET-N02](25) 的TRIS缓冲液的弛豫度。线的斜率表示弛豫度。
[0054] 图21显示配体及其对应的锰络合物：（a)HBET、（b)HBET-0Me和（c)HBET-N02的pH-滴定曲线。
[0055] 图22显示：（a)监测的Na2[MnnHBET](4)的UV光谱与pH的关系。（b)288nm处的吸光 度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定pKa 7.64拟合。
[0056] 图23显示：（a)监测的Na2[MnnHBET-0Me](9)的UV光谱与pH的关系。（b)308nm处的 吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定 口17.91拟合。
[0057] 图24显示：（a)监测的1:1Μηπ:ΗΒΕΤ-Ν02的UV光谱与pH的关系。（b)396nm处的吸光 度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定pKa 4.84拟合。
[0058]图 25 显示：对于(a)HBET，（b)HBET-〇Me 和（c)HBET-N02，l:lMn2+:配体滴定的弛豫度 的变化与pH的关系。
[0059] 图26显示：（a)内含Μηπ-ΗΒΕΤ的25mM TRIS缓冲液(ρΗ=7·4)，以500mM KN〇3作为支 持电解质的l〇〇mV/s的循环伏安图。电位是对比K4Fe(CN)6/K3Fe(CN) 6<3(b)Mn27Mn3+对-ia(递 减线)和i。(递增线)对比，v(其中v =扫描速率)的科特雷尔图。
[0060] 图27显示(a)监测的Na2[MnncycHBET](20)的UV光谱与pH的关系；和(b)296nm处的 吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的给定 口17.95拟合。
[0061 ]图 28 显示（a)监测的 Na[Mn(cycHBET-N02)](26)的 UV 光谱与 pH 的关系；和（b)396nm 处的吸光度与pH的关系图。吸光度的增加对应于酚去质子化，并且这可与所述酚离子化的 给定?15.01拟合。
[0062] 图29显示:pH 7.4下的Na2[MnnHBET] (4)的循环伏安图；半电池电位是379mV对比 常规氢电极(NHE)。
[0063] 图30显示：pH 7.4下的Na2[MnnHBET-0Me](9)的循环伏安图；半电池电位是344mV 对比NHE。
[0064] 图31显示：pH 7.4下的Na[Mn(HBET-N02)(14)的循环伏安图；半电池电位是476mV 对比NHE。
[0065] 图32显示:pH 7.4下的Na[Mn(CycBET)](21)的循环伏安图；半电池电位是365mV对 比歷。
[0066] 图33显示：pH 7.4下的Na[Mn(cycHBET-N02)](31)的循环伏安图；半电池电位是 488mV 对比 NHE。
[0067] 图34显示:N-Tos_DTTA( 33)的合成方案。
[0068] 图35显示:pH 7.40下T2与33:Mn2+比例的关系图。
[0069]图36显示:pH触发351-和352-之间的相互转化。
[0070] 图37显示:37°C下20MHz(A)和60MHz(B)下的342-/34卜的^值的pH依赖性。
[0071]图38显示:本发明的Mn(II)螯合剂(40)的合成。
[0072]图39显示:本发明的Mn(II)螯合剂(45)的合成。
[0073]图40显示:本发明的六聚体配体(55)的合成。
[0074]图41的框图是采用本发明的造影剂的示例性磁共振成像(MRI)系统。
[0075] 图42的框图是适用于本发明的造影剂的示例性发射断层摄影系统。
【具体实施方式】
[0076] 对于可用的氧化还原活化的MR探针的一些要求：（1)生物学相关的还原剂(如谷胱 甘肽(GSH))可得到的氧化还原半电池电位；（2)使两种氧化态稳定的配体，从而还原或氧化 不导致分解；（3)活化时的强力信号增强；（4)病理存在下增强的信号变化，即，开启的探针； 和(5)就成像时程而言表现迅速的动力学。
[0077]氧化还原活性探针的一个关键设计特征是：鉴定使两种氧化态稳定的配体。EDTA (乙二胺四乙酸)与一个配位的水共同配体形成非常稳定的7-配位Mn(II)络合物，而2+氧化 态是非常有利的，参见图1。相比之下，如ΗΒΗ)(Ν，Ν'_二(2-羟基苄基)亚乙基二胺-N，N'_二 乙酸)或EHPG(N，Y -亚乙基双[2 (0-羟基苯基）]甘氨酸）中的两个羧酸供体向酚供体的变化 非常有利于具有6号配位的Mn(III)络合物，参见图1。
[0078]我们假设具有配体结构的HBET(羟基苄基亚乙基二胺三乙酸）（图1)(是介于EDTA 和HBED之间的中间体)-仅包含一个酚供体-可能对于各氧化态显示亚稳定性。因此，该物质 的氧 化态将对氧化还原环境的变化高度敏感。为验证该假设，我们制备了ΗΒΗ)、HBET和EDTA 的锰络合物，以测试有多少酚盐基团造成Mn(III)/Mn(II)氧化还原对的半电池电位。内含 Μηπ-ΗΒΕΤ的TRIS缓冲液的循环伏安法（参见图2)显示位于0.356V处的可逆氧化峰（对比 K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6)，指示该分子用作氧化还原探针的电位。在50-600mV/s范围内，阳极 (i a)和阴极电流(U与扫描速率(v)的平方根呈线性关系(参见图2b)，指示这是一个扩散控 制过程。另一方面，Mn n-EDTA和Mnm-HBED显示不可逆氧化和准可逆还原峰，半电池电位 (Μηπ/Μη πι)分别为 0 · 633V和 0 · 016V。
[0079] ΗΒΕΤ(羟基苄基亚乙基二胺三乙酸）如下合成:单B0C-保护的亚乙基二胺与水杨醛 的还原胺化，随后用叔丁基溴乙酸烷基化，然后进行酸去保护以产生总体产率为45%的游 离配体。一当量配体与MnCl2的反应导致分离产率为84%的Μη π-ΗΒΕΤ。合成的ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ络 合物产率为38%，通过MnCl2在一当量配体在碱性条件下空气氧化，然后通过RP-HPLC纯化 得到。HBET配体使两种氧化态稳定至如下程度:Μη π-ΗΒΕΤ和ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ能够通过标准RP-HPLC系统以其纯形式被简易地分开并分离。两种络合物在磷酸盐和碳酸盐缓冲液中均稳 定。
[0080]在1.4Τ的TRIS缓冲盐水（TBS:pH 7.4,37。〇中独立检测Μη Π -ΗΒΕΤ和Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ 络合物的!^弛豫度，检测值分别是2.76111^1^1和Ι.Οδ??Μ??Γ1。该弛豫度的差异很大程度上考 虑到Mn m态仍具有四个未成对的电子。图3中，我们显示了包含纯水或等摩尔Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ或 Μηπ-ΗΒΕΤ的测试管在4.7Τ下的IV加权的MR图像。顺磁性络合物的存在导致高于纯水的信 号强度。Μη Π -ΗΒΕΤ的较高弛豫度以其更加明亮的图像而显见。4.7T下的^检测结果显示还 原的Μηπ-ΗΒΕΤ形式的弛豫度高出3.3倍，参见图3。
[0081 ]在谷胱甘肽的存在下，ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ络合物容易被还原成Μη11态。该转化似乎直接转 到产物，而没有任何长久反应中间体累积或副产物形成。这通过图4b中所示的时程实验证 明，其中Μηπ-ΗΒΕΤ络合物的出现与Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ的消耗同时发生。该反应的进程也可利用临 床成像相关的条件（1.4T，37°C)通过弛豫计(relaxometry)来实时跟进(参见图4a)。鉴于Μη (II)络合物的弛豫度大于Μη (III)络合物，水质子（1 /Τ!)的纵向弛豫速率将与反应中的Μη Π -ΗΒΕΤ的浓度成比例增加。Mn(IIl)络合物向Μη(ΙΙ)络合物的直接转化通过如下观察结果 得到进一步证实:通过紫外吸光度检测，Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ物质的形成速率有效地等于氧化形式 的消耗速率(参见图4a)。
[0082] 在37°C(pH 7.4)进行了一系列动力学实验来确定用谷胱甘肽还原MnΠI-HBET的经 验速率方程。ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ络合物在水中于375nm处具有强吸收谱带（ε = 1.38x 103M-Vm-1)，但 Μη n-HBET络合物的紫外光谱中不存在该谱带。该特征允许我们容易地监测ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ随时 间的还原。我们检测了三种不同的谷胱甘肽浓度(5mM、10mM和20mM)下的初始反应速率。对 于各谷胱甘肽浓度，反应以四种不同的Μ ΠΙ-ΗΒΕΤ初始浓度(0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM)进 行。基于这些实验，我们确定[GSH]和[Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ]均为一级反应，其中总体二级速率常数为 (3·8±0·3)χ 10-、
[0083] 考虑到其在生物学成像中的应用，任何可活化的探针的动力学性质都极为重要。 氧化还原活化的探针的情况中，向活化态的转化必须在生理学相关的氧化还原范围中有效 发生，并且还应相对于探针的洗出速率而言表现迅速。细胞中还原谷胱甘肽的浓度通常是 Ι-lOmM。在该范围中，ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ络合物的半衰期约为3~30分钟。相比之下，血浆中（其中谷 胱甘肽水平约低三个数量级）的半衰期将大于一周。因此，我们预期探针活化将主要限制在 负责调节胞外氧化还原的正常机制已被严重受损或被破坏的区域。
[0084]总而言之，Μηπι/Μηπ-ΗΒΕΤ氧化还原对满足了用于氧化还原成像的探针所需的多 个关键标准。生物学相关的还原剂(如谷胱甘肽)可获得氧化还原半电池电位;其在转化成 MR活性态之后显示良好的信号增强;并且活化动力学相对于成像时程而言表现迅速。谷胱 甘肽动力学研究证实，该还原在生理学谷胱甘肽浓度的存在下进行迅速。该系统表现极优， 并且两种氧化态之间的相互转化通过简单、可逆的单电子进程发生。循环伏安法证实，这是 可逆进程。此外，我们注意到，该HBET配体能够容易地被合适的芳基取代基修饰，以调整氧 化还原电位，或纳入具有特定生物学靶向的部分，在分子MR成像中开辟新途径。
[0085] 本发明的一个示例性实施方式中，所述造影剂用于诊断成像技术，例如磁共振成 像(MRI)，和/或并行MRI和正电子发射断层摄影(PET)。〃对象〃是哺乳动物，优选人类。
[0086] 造影剂给予对象时的形式并不关键。例如，本发明的造影剂可直接给予诊断成像 的组织，给予与该组织接触的体液，或给予该造影剂能够扩散或传递给所述诊断成像的组 织的身体部位。
[0087] 该造影剂可单独给予，或者作为药学上可接受组合物的部分给予。本发明药物组 合物中，本发明的造影剂、药学上可接受的运载体和任何其它活性成分的相对的量将根据 治疗对象的特性、体型和身体状况而变化，并且也根据所述造影剂的给予途径而变化。所述 造影剂可包含能够靶向对象中感兴趣区域的靶向部分。所述靶向部分可选自：蛋白质、酶、 肽、抗体和药物。任选包含其它药物活性化合物的本发明的造影剂可通过胃肠外方式给予 对象，例如，静脉内、肌内、皮下、脑内或鞘内给予。
[0088] 本发明的一个非限制性示例性实施方式是用于磁共振成像的造影剂。所述造影剂 包含式(I)的化合物：
[0089]
坱所还化贫物的约字上~按艾的盐，坱所还化贫物的怔置并构怀，兵甲1Γ迕按至 苯环上的不同的碳，其中R1选自下组：取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、 取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基 芳烃，和二亚烷基杂芳烃，其中R2选自下组:氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、 杂芳基、卤素、氰基、硝基、羟基和烷氧基，其中η是2或3,并且其中，当η是2时，所述化合物任 选地包含与Μη配位的水。
[0091 ]在的所述造影剂一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(II):
[0092] 'W'
:〇
[0093] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(III):
[0094
[0095]在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(IV):
[0096]
ο
[0097] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(V):
[0098]
〇
[0099] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(Va):
[0100] ο
[0101] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(Vb):
[0102]
[0103]在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，R1是亚乙基。在所述造影剂的另一个 示例性实施方式中，R2是甲氧基。在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，R2是硝基。在所 述造影剂的另一个示例性实施方式中，R 1是环亚己基。在所述造影剂的另一个示例性实施 方式中，R1和R2中至少一个包含能够靶向对象中的感兴趣区域的靶向部分。所述靶向部分可 选自：蛋白质、酶、肽、抗体和药物。在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，Μη是发射正 电子的锰同位素。在所述造影剂的一个示例性实施方式中，所述造影剂在η = 2时具有较高 的弛豫度。所述化合物在体内可通过生物学还原剂(例如，谷胱甘肽)从式(1)(其中η = 3)转 化成式（1)(其中ri = 2)。或者，所述造影剂可被包含在药学上可接受的运载体中，所述运载 体还包含还原剂，以将所述化合物从式(I)(其中η = 3)转化成式(I)(其中η = 2).
[0104] 本发明的另一个非限制性示例性实施方式是用于磁共振成像的造影剂。所述造影 剂包含式(VI)的化合物：
[0105]
[0106] 或所述化合物的药学上可接受的盐，或所述化合物的位置异构体，其中R4连接至 苯环上的不同的碳，其中R 1选自下组：取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、 取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基 芳烃，和二亚烷基杂芳烃，其中R 3选自下组：取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚 烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二 亚烷基芳烃，和二亚烷基杂芳烃，其中R 4选自下组:氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、 芳基、杂芳基、卤素、氰基、硝基、羟基，和烷氧基，其中X是N或NH，其中当X是NH时，所述化合 物任选地包含与Μη配位的水，并且其中当X是N时，X与Μη配位。
[0107] 在所述造影剂的一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(VII):
[0108]
[0109]在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(VIII):
[0110
[0111] 当所述造影剂暴露至pH变化的环境中时，pH下降时，弛豫度增加。在所述造影剂的 另一个示例性实施方式中，R1和R 4中至少一个包含能够靶向对象中的感兴趣区域的靶向部 分。所述靶向部分可选自：蛋白质、酶、肽、抗体和药物。Μη可以是发射正电子的锰同位素。
[0112] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(IX):
[0113
[0114」 Mnn」以是友射止电于的锍问位索。
[0115]在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(X):
[0116]
[0117] 或所述化合物的药学上可接受的盐，其中R5是核结构，并且其中η是1~12的整数。 核结构可以是能够与式(X)的（）（括号）中的结构形成一个或多个醚基团的任何原子或原子 团。R 5可以是环状主链。R5可以是磷腈。在一个实施方式中，R5是Ν3Ρ 3。在一个实施方式中，η是 6 Jn可以是发射正电子的锰同位素。
[0118] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(XI):
[0119]
〇
[0120] 在所述造影剂的另一个示例性实施方式中，所述化合物具有式(XII):
[01 ?
[0122] 或所述化合物的药学上可接受的盐。Μη可以是发射正电子的锰同位素。
[0123] 以pH 7.4，37°C和1.4特斯拉的条件检测，式(I)~(XII)的化合物中的任一种的每 个-猛离子ri弛豫度可以是大于Ο.βη?Γ、'或大于0.5ηιΜ?、或大于1 .Οη?Γ、'或大于 1. SmM^s^1、或大于2. OmM^s^1、或大于2 . SmM^s^1、或大于SmM^s^1、或大于AmM^s^1、或大于 δπΛΓ、^1、或大于 、或大于 、或大于 βπΛΓ、^1、或大于 θπΛΓ^^1，或大于 lOmirS^1。
[0124] 本发明还提供一种用于对象体内成像的方法。给予所述对象式（I)~(XII)的任一 造影剂。等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点累积的一段时间；和，采用非 侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。给予所述造影剂的对象中的分子具有的改良的纵 向弛豫时间，这在图像中得以反映。所述非侵入性成像技术可以是磁共振成像，或采用磁共 振成像的正电子发射断层摄影。若所述非侵入性成像技术是采用磁共振成像的正电子发射 断层摄影，给予具有发射正电子的锰同位素的造影剂。
[0125] 本发明提供对对象的感兴趣区域成像的方法。给予所述对象式（I)~(XII)中的任 一种造影剂。使所述对象置于磁系统中，该磁系统被设置以产生围绕对象的至少部分的极 化磁场。对设置以向该极化磁场施加梯度场的多个梯度线圈通电。控制经设置以向该对象 施加激励场的射频(RF)系统来从中获得磁共振(MR)图像数据，并且从该MR图像数据重建感 兴趣区域的图像。若所述造影剂具有发射正电子的锰同位素，还可采用多个检测器来检测 从对象发出的γ射线，并传达该检测到的γ射线所对应的信号。从所述信号重建该对象的 感兴趣区域的一系列医学图像。
[0126] 本发明还提供一种感测对象中生物学还原剂的方法。给予所述对象式（I)~(Vb) 的任何造影剂，其中η是3(即，Μη处于氧化态3+)。等待足以允许所述造影剂在待成像的组织 或细胞位点累积的一段时间；和，采用非侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。受到所述 造影剂作用的包含所述生物还原剂(例如，谷胱甘肽)的细胞或组织具有改良的纵向弛豫纵 向弛豫时间，这在图像中得以反映。
[0127] 本发明还提供一种检测对象中具有不同pH水平的感兴趣区域的方法。给予所述对 象式（I)~（IX)的任何造影剂。等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点累积 的一段时间；和，采用非侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。受到所述造影剂作用的对 象中具有不同pH水平的感兴趣区域具有改良的纵向弛豫时间，这在图像中得以反映。若所 述造影剂接触pH变化的环境，pH降低时，弛豫度增高。
[0128] 参考图41，式（I)~(XII)的任何造影剂可用于磁共振成像（"MRI"）系统100。该MRI 系统100包含工作站102,该工作站102具有显示器104和键盘106。工作站102包含处理器 108,例如市售可得的可编程机器，其中运行市售可得的操作系统。工作站102提供操作界 面，该操作界面使扫描方式能够被输入MRI系统100。工作站102耦联至四个服务器:脉冲序 列服务器110;数据采集服务器112;数据处理服务器114,和数据存储服务器116。工作站102 和各服务器11 〇、112、114和116彼此通讯连接。
[0129] 脉冲序列服务器110响应下载自工作站102的指令来行使功能，以操作梯度系统 118和射频（"RF"）系统120。进行规定扫描的梯度波形经产生并施加至梯度系统118,其引发 组件122中的梯度线圈产生磁场梯度Gx、Gy和Gz，用于位置编码MR信号。梯度线圈组件122形 成磁体组件124的部分，磁体组件124延伸到通过其中形成的孔125处，并且梯度线圈组件 122包含极化磁体126和全身RF线圈128。
[0130] RF激励波形通过RF系统120被施加至RF线圈128,或分开的局部线圈（未显示），以 进行规定的磁共振脉冲序列。被RF线圈128或分开的局部线圈（未显示)检测到的响应的MR 信号被RF系统120接收，在由脉冲序列服务器110产生的指令指示下放大、解调、过滤并数字 化。RF系统120包含RF发射器，该RF发射器用于产生MR脉冲序列中所用的广泛多样的RF脉 冲。RF发射器对于扫描方式和来自脉冲序列服务器110的指示具有响应性，以产生具有所需 频率、相和脉冲振幅波形的RF脉冲。生成的RF脉冲可被施加至全身RF线圈128或施加至一个 或多个局部线圈或线圈阵列。
[0131] RF系统120还包括一个或多个RF接收器通道。各RF接收器通道包含RF放大器，其将 与其相连的线圈128接收的MR信号放大，还包含检测器，其检测并将接收到的MR信号的正交 分量I和Q数字化。因此，可通过取分量I和Q的平方之和的平方根来确定任何取样点处接收 到的MR信号的量级：
[0132]
等式(1);并且还可确定接收到的MR信号的相：
[0133]
[0134] 脉冲序列服务器110还任选地从生理学采集控制器130接收患者数据。控制器130 接收来自与所述患者连接的多个不同传感器的信号，例如来自电极的心电图（"ECG"）信号， 或者来自风箱或其它呼吸监测装置的呼吸信号。此类信号通常被脉冲序列服务器110利用， 以随该对象的心率或呼吸对扫描的执行进行同步化或"门控(gate)"。
[0135] 由RF系统120产生的数字化的MR信号样品被数据采集服务器112接收。数据采集服 务器112响应下载自工作站102的指令来执行操作，以接收实时MR数据并提供缓冲存储器， 从而不会有数据因数据溢出而丢失。在一些扫描中，数据采集服务器112所做的仅仅是将采 集的MR数据传递至数据处理器服务器114。然而，在需要来自采集的MR数据的信息以控制扫 描的进一步执行的扫描中，数据采集服务器112经编程以产生所述信息，并将其输送至脉冲 序列服务器110。例如，在预扫描期间，MR数据被采集并用于校正脉冲序列服务器110执行的 脉冲序列。
[0136] 数据处理服务器114接收来自数据采集服务器112的MR数据，并按照下载自工作站 102的指令来处理该数据。通过数据处理服务器114重建的图像被传输回工作站102,并存储 在那。实时图像储存在数据库存储缓存器(未显示）中，其由此被输出至位于磁体组件124附 近的操作显示器112或显示器136,以供主治医师使用。批处理模式图像或选定的实时图像 存储在盘存储器138上的主数据库。当所述图像已经重建并被转移至存储器时，数据处理服 务器114通知工作站102上的数据存储服务器116。操作者可使用工作站102来将图像存档， 生成影片，或通过网络将所述图像传送至其它设备。
[0137] 图42描述了可与MRI系统100-同用于本发明方法的PET系统200 JET系统200包含 成像硬件系统210,该成像硬件系统210包含中心轴或孔214周围的检测器环组件212。包含 运行市售可得的操作系统的市售可得的处理器的操作者工作站216通过通信连接218与构 台控制器220通信，以控制对成像硬件系统210的操作。
[0138] 检测器环组件212由多个辐射检测器单元222构成，事件发生时，其响应通信连接 224上对光子的检测来产生信号。一组采集电路226接收所述信号，并产生指示事件坐标(X， y)和与造成该事件的光子相关联的总能量的信号。这些信号通过电缆228传送至事件定位 器电路230。各采集电路226还产生事件检测脉冲，其指示相互作用发生的确切时刻。其它系 统利用同样能够从相同信号获得该信息（关于该事件发生的准确瞬间）的精密数字电子器 件，所述信号用以获得能量和事件坐标。
[0139]在一些实施方式中，事件定位器电路230形成数据采集处理系统232的部分，对由 采集电路226产生的信号进行定期取样。数据采集处理系统232包含通用控制器234,其控制 底板总线236上和通用通信网络218上的通信。事件定位器电路230将关于各有效事件的信 息集合成数字集，该数字集准确指示事件何时发生，以及该事件被检测到的位置。该事件数 据包被传达至重合检测器238,重合检测器238也是数据采集处理系统232的一部分。
[0140]重合检测器238从事件定位器电路230接收多个事件数据包，并确定其中是否有任 何两个是重合的。通过多个因素确定重合。首先，各事件数据包中的时标必须落在预定的时 窗（time window)中，例如，0.5纳秒或甚至小到皮秒。第二，由这两个事件数据包指示的位 置必须处于贯穿通过扫描仪孔214中视场的一条直线上。无法成对的事件被重合检测器238 弃而不计，但重合事件对被定位并记录为重合数据包。这些重合数据包被提供至分类器 240。许多传统PET成像系统中，分类器的功能是接收重合数据包并从该重合数据包生成存 储地址，供于该重合数据的高效存储。在该情况中，指向相同方向（Θ)并通过扫描仪视场 (F0V)的所有投射射线的集是一个完整的投射，或"视野"。具体投射射线与F0V中心之间的 距离(R)定位了 F0V中的投射射线。在通过分类出指示位于该投射射线上的两个检测器处的 重合数据包的扫描过程中，分类器240对在给定投射射线(R，0)上发生的所有事件计数。组 织重合计数，例如，作为二维阵列集，每一个对应各轴向图像平面，并且各以其维度之一标 出投射角Θ的尺寸，而另一个标出距离R的尺寸。检测的事件的RX9称为直方图，或更常见 地，称为正弦图阵列。正是这些经处理以重建图像的正弦图指示了在扫描过程中于各图像 像素位置发生的事件数量。分类器240对沿各投射射线(R，0)发生的所有事件计数，并将其 组织成图像数据阵列。
[0141]分类器240向图像处理/重建系统242提供提供图像数据集，例如，通过通信连接 244被存储在图像阵列246中。图像阵列246保留相应数据集，供于图像处理器248以重建图 像。图像处理/重建系统242可与工作站216或其它遥控工作站通信和/或与工作站216或其 它遥控工作站整合在一起。
[0142] 本发明在以下实施例中进行进一步说明，所述实施例仅用于说明而非限制目的。
[0143] 实施例
[0144] 实施例1
[0145] 实验 [0146] 概述
[0147] 材料与设备。所有化学品和溶剂均经商业途径购得，并且不经进一步纯化直接使 用。匪R谱在500MHz或400MHz Varian光谱仪上记录。化学位移以δ(ρρπ〇报告。对于咕和13C NMR谱，采用剩余溶剂峰作为内参，除了配体的 13C NMR以外，后者当中采用叔丁醇作为内参。
[0148] 液相色谱-电喷雾质谱(LC-MS)采用Agilent 1100系列设备进行，使用LC/MSD阱和 在220、254和280nm进行紫外检测的Daly转换打拿极检测器。用于该系统的方法如下：（a) Luna Cl8柱（lOOx 2mm);洗脱剂A:Η20/0· 1 %甲酸，B:MeCN/0· 1 %甲酸;梯度:在9分钟时间 内从5%B变化至95%B;流速0.8mL/分钟（用于表征有机化合物），和（b)Kromasil C18柱 (250x 4.6111111);洗脱剂(：:95%]\^0~/5%1〇111]\1乙酸铵，0 :1〇111]\1乙酸铵;梯度:在14分钟时间内 从5%C变化至8%C;流速0.8ml/分钟（用于表征锰络合物）。反相半制备型纯化在Rainin Dynamax HPLC系统上采用254nm的紫外检测，使 用Polaris C18柱进行。用于纯化的方法如 下：流动相A是：50mM乙酸铵缓冲液，pH 6.5，而流动相B是5 % 50mM乙酸铵缓冲液，pH 6.5/ 95 %MeCN的混合物。从5 %B开始，B部分经23分钟增加至8%。柱用100 %B清洗2分钟，然后变 化至5%B。该系统在5%B重新平衡3分钟。弛豫度检测在Bruker mq60Miniispec上以1.4T和 37°C进行。锰浓度用Agilent 7500a ICP-MS系统检测。所有样品用内含0.1%曲通X-100的 5%硝酸(包含20ppb的Lu(作为内标））稀释。采用Mn(54.94)/Lu(174.97)比来定量锰浓度。 每天生成0. lppb~200ppb的线性标准曲线，用于定量。UV-Vis光谱采用路径长度为lcm的石 英比色皿在SpectraMax M2光谱仪上记录。MnnHBET、MnnEDTA和ΜηΠΙΗΒΕΤ的循环伏安法采 用内含Nuvant EZstat正稳压器的TRIS缓冲液(ρΗ=7.4)(包含0.5Μ ΚΝ〇3作为支持电解 质），以lOOmVs-1扫描速率记录。采用玻璃态碳作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，而Pt 线作为辅助电极。采用K4FeCN6/K3FeCN6对作为内标。
[0149] 弛豫研究.1\采用10次反转次数的反转回复脉冲序列检测。弛豫度由1/h对比37°C 下TRIS缓冲液(pH=7.4)浓度的曲线图的斜率确定。各储液中的锰浓度采用ICP-MS测定。
[0150] Μη:配体化学计量学:与溶液中的全部Mn(I I)完全螯合所需的配体物质的TFA组成 和配体的量按如下示例确定：向内含0.9111^111(：12的？!17.40的缓冲液(2511^了1?13)(分别 0.45μπιο1)的500yL样品添加递增份的1.45mM 34(增量75yL，0~675yL;各75yL份中含有 1.09μπιο1)。随后检测各样品的T2值，并绘制弛豫度为配体与金属之比（图35) Jn的完全消 耗点由^停止随添加的配体而下降的点确定。
[0151] 为了探测溶液中锰络合物的形态，采用1N似0!1在犯气氛下进行1: 1Μη2+:配体的pH 滴定(图21)。
[0152]为测定这两个pH范围中存在的物质，监测紫外光谱与pH的关系(参见图22-24)。酚 部分的去质子化以形成酸盐离子导致特征紫外谱带，所述特征紫外谱带指示Mn-HBET和Mn-HBET-OMe在较低pH下质子化，以及在酚处出现的质子化。由于pH升高，酸去质子并配位至锰 中心。
[0153] 溶液中的形态还通过在1.4T下检测水质子的弛豫度来监测。图24显示三种配体系 统的弛豫度对比pH的变化。弛豫度的变化与紫外研究中观察到的pH依赖性形态一致。
[0154] 还原反应的动力学实验.这一系列的动力学实验在37°C(pH 7.4)下进行以测定通 过谷胱甘肽进行的ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ还原的经验速率方程。ΜηΠΙΗΒΕΤ络合物在水中于375nm处（ε = 1.38Χ103Μ-Vm-4具有强吸光谱带，该谱带并不存在于Μηπ-ΗΒΕΤ络合物的紫外光谱中。利 用该特征来监测Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ随时间的还原。检测三种不同谷胱甘肽浓度(5mM、10mM和20mM) 下的初始反应速率。此外，对于各谷胱甘肽浓度，反应以四种不同的Mnm-mET初始浓度 (0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM)进行。通过在这些实验中采用大幅过量的谷胱甘肽，我们发 现所述反应关于Μη ΠΙ-ΗΒΕΤ络合物表现为伪一级，如下方等式S1表示。
[0155] ΙΜ^ΗΒΒΤ^ ^ (公式si)
[0156]其中，观察到的速率常数(ki察)简单地是实际速率常数(k)与[GSH]的乘积，t是时 间，而下标't'和'〇'分别表示时间't'时的浓度或初始浓度。图14显示两组动力学实验，其 中我们绘制了 [Mnm-HBET]t的自然对数与时间的函数关系。以该方式，各线的斜率等于-k · [GSH]，并且截距是ln[Mnm-HBET]。。基于这些实验，我们确定[GSH]和[ΜηΠΙ-ΗΒΕΤ]中为 一级反应，其总体二级速率常数是(3.8 ±0.3) X 10-W1。
[0157] ΜηπΗΒΕΤ采用过氧化氢的氧化.用内含H2〇2(lmM)的TRIS缓冲液(pH = 7.4)进行 MnnHBET的氧化，随后进行UV-Vis光谱检测、弛豫度检测和LC-MS。与采用谷胱甘肽的 ΜηΠΙΗΒΕΤ的还原不同，由LC-MS数据计算，氧化反应似乎在70%转化成ΜηΠΙΗΒΕΤ之后达到了 平衡。
[0158] MR成像.MR成像采用Bruker Biospec 4.7Τ系统进行。将三种样品（约500yL)置于 自制样品座上，并采用容积线圈成像。对于0.234x0.312mm2平面内分辨率，采集矩阵= 64x256;层厚度= 5111111。!^-加权的图像采用快速小角度激发(FLASH)梯度回波序列获得:TR/ TE/FA = 20/5.44/40(8个取平均hTi采用2D快速获取再聚焦回波(RARE)反转回复序列确 定：TR = 3200ms，TE = 9·7ms。反转时间（TI):5、45、85、165、325、645、1285、1925和3205msoTl 由信号强度(SI(t))对比TI曲线的非线性最小二乘拟合获得，其中T1、SI(0)和a是可调节参 数，等式S2。
[0159] SI(t)=SI(0)[l-a,eTI/T1](等式 S2)
[0160] ΜηπΗΒΕΤ和ΜηΠΙΗΒΕΤ络合物的稳定性锰络合物的稳定性在不同缓冲液（lmM磷酸盐 缓冲液，25mM碳酸氢钠缓冲液和0.1 mM柠檬酸盐缓冲液）中以与血浆中相似的浓度检测。使 0.5mM的所述锰络合物在对应缓冲液中于37°C(pH = 7.4)孵育，然后在LC-MS上采用前述方 法对物质定量。所述锰络合物(〇. 5mM)还用内含EDTA(0.5mM)的TRIS缓冲液(pH=7.4)处理， 并在37°C孵育1小时。然后在LC-MS上，采用前述方法对物质定量。
[0161] Zn (II)金属转移动力学。由Zn (II)对Μη (II)的替代通过由T2-弛豫计监测游离Μη (Π )浓度的演变来检测。ImM Μη(ΙΙ)络合物用内含25mM Zn(0Tf)2的50mM MES缓冲液(pH 6.00)考验。将r2数据拟合至如下等式
[0162] Γ2 = Γ2 (??Μη)* ( 1 -e^** ) +Γ2ο
[0163] 佥座
[0164] 材料与设备.所有化学品和溶剂均经商业途径购得，并且不经进一步纯化直接使 用。匪R谱在500MHz或400MHz Varian波谱仪上记录。化学位移以δ(ρρπ〇报告。对于咕和13C NMR谱，采用剩余溶剂峰作为内参，除了配体的 13C NMR以外，其中采用叔丁醇作为内参。液相 色谱-电喷雾质谱(LC-MS)采用Agilent 1100系列设备进行，使用LC/MSD阱和在220、254和 280nm进行紫外检测的Daly转换打拿极检测器。用于该系统的方法如下：（a)Luna C18柱 (lOOx 2mm);洗脱剂A:Η20/0· 1 %甲酸，B:MeCN/Ο · 1 %甲酸；梯度:在9分钟时间内从5%B变 化至95%B;流速0.8mL/分钟（用于表征有机化合物），和(b)Kromasil C18柱(250x 4.6mm); 洗脱剂C: 95 %MeCN/5 % 10mM乙酸铵，D: 10mM乙酸铵;梯度:在14分钟内从5 % C变化至8 % C; 流速0.8ml/分钟（用于表征猛络合物）。反相半制备型纯化在Rainin Dynamax HPLC系统上 采用254nm的紫外检测，使用Polaris C18柱进行。用于纯化的方法如下:流动相A是:50mM乙 酸铵缓冲液，pH 6.5，而流动相B是5 % 50mM乙酸铵缓冲液，pH 6.5/95 %MeCN的混合物。从 5%B开始，B部分经23分钟增加至8%。柱用100%8清洗2分钟，然后变化至5%8。该系统在 5%B重新平衡3分钟。弛豫度检测在Bruker mq60Miniispec上以1.4T和37°C进行。猛浓度用 Agilent 7500a ICP-MS系统检测。所有样品用内含0.1%曲通X-100的5%硝酸（包含20ppb 的1^1(作为内标））稀释。采用1]1(54.94)/1^1(174.97)比来定量猛浓度。每天生成0.]^口13~ 200ppb的线性标准曲线，用于定量。UV-Vis光谱采用路径长度为lcm的石英比色皿在 SpectraMax M2光谱仪上记录。pH采用连接至VWR Symphony玻璃电极的ThermoOrion pH计 检测。
[0165] 2'-( (2-((羧甲基）（2-羟基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸(ΗΒΕΤ) (3)的合成 示于图6。
[0166] (2-((2-羟基苄基）氨基）乙基）氨基甲酸叔丁基酯（1):向内含水杨醛（12mmol， 1.465g)的90mL甲醇的溶液添加内含N-(2-氨基乙基）氨基甲酸叔丁基酯（12mm 〇l，1.923g) 的甲醇（30mL)的溶液，并使所述溶液搅拌1小时。向该搅拌中的溶液添加固体NaBH 4 (24mmol，0.908g)。观察到快速产气，并且溶液从浅黄色变为无色。搅拌3小时后，减压下移 除所有挥发物，之后获得白色固体。使残留物溶解于200mL CH2C12，用200mL饱和NaHC03溶液 萃取。使用CH 2C12(2x 100mL)萃取水性层。合并全部有机物，用盐水(200mL)清洗并用无水 1^5〇4干燥。减压蒸发溶剂以获得浅黄色固体1(2.116 8,97%)。1!1匪1?(50(^他，0(：13)6 (ppm) :7.16(t，J = 7.65Hz，lH)，6.99(d，J = 7.48Hz，lH)6.83(d，J = 8.13Hz，lH)，6.77(t，J = 7·41Ηz，1Η)，4.01(s，2H)，3.30(m，2H2.79(t，J = 5.82Hz，2H)，1.44(s，9H) ,13。!：1!!}匪R (100MHz，CDC13)S(ppm): 157.9,156.2,128.5,128.3,122.4,118.9,116.1，79·2,52· 1， 48 · 2，39 · 8，28 · 3.&此办2〇3的分子量：266 · S^MSUSI )m/z :计算值：267 · 17(M+H) +，观察值： 267.1〇
[0167] 2,2'（2-((2-(叔丁氧基）-2-氧代乙基）（2-((叔丁基二甲基甲硅烷基）氧基）_苄 基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸二叔丁基酯（2):将1(7.94111111 〇1，21168)溶解于012(：12 (100mL)，然后添加50mL三氟乙酸。使所述反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留物 溶解在水(40mL)中并用乙醚(3x 1 OOmL)清洗。将水部分冷冻干燥，以定量获得白色固体状 的游离胺，其无需进一步纯化即可用于后续反应。
[0168] 包含所述胺的圆底烧瓶用氮气吹扫，添加无水CH2Cl2(80mL)并在冰浴中冷却。在相 反的氩气气流下，添加 N，N-二异丙基乙基胺(39.7〇111111〇1，6.91 1^)，然后添加叔丁基二甲基 甲硅烷基氯(8.73mmol，1.315g)作为CH2C1 2溶液（10mL)。允许该溶液升温至室温并搅拌5小 时。使该反应冷却回〇°C，并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯（24.61111111〇1，3.631^)，然后使该反应 在氮气气氛下搅拌18小时。所述溶液用CH 2Cl2(200mL)稀释，并用饱和NaHC03(3x 200mL)、盐 水（lx 200mL)清洗。合并全部有机物并用无水硫酸镁干燥，然后在然后在减压下蒸发以获 得粗制黄色油状物。采用柱色谱将产物纯化成无色油状物（1.234g，25%)(洗脱剂-己烷/乙 酸乙酯，9:1)</H MMR(400MHz，CDCl2)S(ppm) :7.43(dd，Ji = 1.31Hz，j2 = 7.57，lH)，7.04 (dt ,Ji = 1.71Hz J2 = 7.80,1H) ,6.88(t ,J = 7.51Hz , 1H), 6.72(d ,J = 7.93Hz , 1H), 3.76(s, 2H),3.40(s,4H),3.29(s,2H),2.81(m,4H),1.41(s,9H),1.40(s,18H),0.98(s,9H),0.18 (8,611),3(:1:?}匪R(100MHz，CDCl2)S(ppm): 171.1，170.7,153.7,130.1，129.8,127.4， 121.1，118.4,80.6,80.4,56.1，55.9,52,52.4,28.2,25.9，18.3,4.1<X 33H58SN2〇7Si的分子 量:622 · 91JSUSI )m/z:计算值:623 · 41 (M+H)+观察值:623 · 4。
[0169] 2，2'-( (2-((羧甲基）（2-羟基苄基)氨基）乙基)氮烷二基）二乙酸(ΗΒΕΤ) (3):将2 (1.98mmol，1.234g)溶解于三氟乙酸(40mL)，然后添加三异丙基硅烷(2.35mL)、1-十二硫醇 (2.3 5 m L)和水（2.3 5 m L)。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。残留物溶解于水 (40mL)并用乙醚（3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成（3)白色固体。1H NMR (500MHz,D2〇)5(ppm) :7.44(m,2H,Ar-H),7.03(m,2H)4.57(s,2H),4.04(s,2H),3.66(s, 4H) ,3.54( t,J = 6.09Hz,2H) ,3.35( t,J = 5.匪 R(125MHz，D20) δ (ppm): 174·1，169·9，156·3，133·6，133·0，121·5，116·6，116·3,55·6,54·8,52·0,49·9<Χ?5Η2()Ν2〇7 的分子量:340.33. MS(ESI )m/z:计算值:341.13(Μ+Η)+观察值:341.1。
[0170] Na2[MnnHBET](4):将 3(0.26111111〇1，0.0898)溶解于511^水。采用謂氢氧化钠溶液将 pH调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2.4H20(0.26mm〇l，0.051g)，然后仔细将pH调节至5。使反 应搅拌1小时，过滤并冷冻干燥以产生白色固体。然后将该络合物注射进入反相C18 (Polaris)柱并采用前述方法脱盐。收集分级分离部分并冻干以产出白色固体状的4 (0 · 095g，84 % )。Ci5Hi8MnN2〇7的分子量：393 · 25 JSUSI )m/z :计算值：394 · 26 (M+3H) + 观察 值：394.1。
[0171] Na[MnmHBET](5):将3(0.15臟〇1，0.058)溶解于511^水。采用謂氢氧化钠溶液将口!1 调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2.4H20(0.15mmol，0.030g)并将pH调节至12。使该溶液搅拌 1小时.然后使该溶液过滤通过〇 . 45μπι滤器以去除Mn02，pH调节至11，并使该溶液搅拌18小 时。该反应之后进行分析LC-MS，并且观察到该反应在70 %转化成Mnm物质时停止。将该混 合物注射进入反相C18(Polaris)柱并采用前述方法纯化。收集分级分离部分并冻干以产出 棕色固态的5(0 ·023g，38% ) <Χ?5Η?7ΜηΝ2〇7的分子量:392 · 24 ·MS(ESI)m/z :计算值:393 · 25(M +2H)+观察值:393.1。
[0172] (2-((2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯(6):向内含2-羟基-5-甲氧基苯甲醛（12mm〇l，1.826g)的90mL甲醇的溶液添加内含N-(2-氨基乙基)氨基甲叔丁基 酯（12mmo 1，1.923g)的甲醇(30mL)的溶液并使该溶液搅拌1小时。向该搅拌中的溶液添加固 体NaBH4(24mmol，0.908g)。观察到快速产气，并且溶液由浅黄色变为无色。搅拌3小时后，减 压下移除所有挥发物，之后获得白色固体。使残留物溶解于200mL CH2C12,用200mL饱和 NaHC03溶液萃取。使用CH2C12(2x 100mL)萃取水层。合并全部有机物，用盐水(200mL)清洗并 用无水185〇4干燥。减压下蒸发溶剂以获得浅黄色固体6(3.4858,98%)。 1!1匪1?(50冊他， CDCl3)S(ppm):6 ·76(ι?，lH)6.72(m，lH)，6.57(d，J = 2.91Hz，lH)，5.30(s，lH)，3.97(s，2H)， δ(ppm):156.2,152.3,151.7,123.1,116.5,114.2,113.5,79.3,55.6,52.2,48.3,39.9, 28 · C15H24N2〇4 的分子量296 · 36 JSCESI )m/z:计算值：297 · 37(M+H)+观察值：297 · 4。
[0173] 2,2'-((2-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基）（2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-甲氧基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸二叔丁基酯（7) :将6(8.00mmOl，2.371g)溶解于 CH2Cl2(100mL)，然后添加50mL三氟乙酸。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留 物溶解在水(40mL)中并使用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为浅黄色 固体的游离胺，其无需进一步纯化即可用于后续反应。
[0174]包含所述胺的圆底烧瓶充入氮气，添加无水CH2Cl2(80mL)并在冰浴中冷却。在相反 的氩气气流下，添加 N，N-二异丙基乙基胺(40.00mmol，6.97mL)，然后添加叔丁基二甲基甲 硅烷基氯(8.80mmol，1.326g)作为CH 2C12溶液（10mL)。使该溶液升温至室温并搅拌5小时。使 该反应冷却回〇°C并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯（24. SOmmol，3.66mL)，然后使该反应在氮气 气氛下搅拌18小时。溶液用CH2Cl2(200mL)稀释，并用饱和NaHC0 3(3x 200mL)、盐水（lx 200mL)清洗。合并全部有机物并用无水硫酸镁干燥然后在减压下蒸发以获得粗制黄色油状 物。采用柱色谱(洗脱剂-己烷/乙酸乙酯，9:1)将产物纯化成无色油状物（1.462g，28% )。咕 Mffi(400MHz，CDCl3)S(ppm):7.04(d，J=3.26Hz，lH)，6.62(m，lH)，6.57(m，lH)，3.71(s， 2H)，3.70(s，3H)，3.40(s，4H，），3.27(s，2H)，2.79(m，4H)，1.40(s，9H)，1.37(s，18H),0.94 (s，9H)，0.13(s，6H).13C{1H}NMR(100MHz，CDCl2)S(ppm):171.，170·8，154·1，147·4，130·8， 119.2,114.7,113.0,80.8,80.6,56.3,56.1,55.6,53.1,52.8,52.7,28.3,28.2,26.0, 18 · 4。C34H6〇N2〇8Si 的分子量:652 · 93 · MS(ESI )m/z:计算值:653 · 94(M+H) + 观察值:653 · 9。
[0175] 2,2'-(2_((羧甲基）（2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基）乙基)氮烷二基)二乙酸(HBET-0Me)(8):使7(2.24111111 〇1，1.4628)溶解于三氟乙酸（4〇11^)，然后添加三异丙基硅烷 (2.35mL)、1-十二硫醇（2.35mL)和水(2.35mL)。使该反应搅拌5小时，然后在减压条件下除 去挥发物。将残留物溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定 量生成为白色固体的8</H NMR(500MHz，D2〇)S(ppm): 7.02(m，2H)6 ·95(ι?，1Η)4· 52(5,2H)， 4.09(s,2H),3.80(s,3H),3.58(s,4H),3.48(m,2H),3.26(m,2H)o^Ct^jNMRC125MHz,? 20)δ (ppm):173.6,169.0,152.5,149.6,117.9,117.6,117.0,116.4,55.9,54.8,51·5,49·0。 C16H22N2〇8 的分子量:370 · 35 JSUSI )m/z:计算值:37136(M+H)+观察值:371 · 4。
[0176] Na2[MnnHBET-0Me] (9):将8(0.23mmo 1，0.085g)溶解于5mL水。采用IN氢氧化钠溶 液将pH调节至8。然后向溶液添加 MnCl2.4H20(0.23mmol，0.046g)，并将pH仔细调节至5。使该 反应搅拌1小时，过滤并冷冻干燥以产生白色固体。将络合物注射进入反相C18(Polaris)柱 并采用前述方法脱盐。收集分级分离部分并冻干以产出白色固态的9(0.090g，81%)。 Ci6H22MnN2〇8 的分子量:423 · 28 · MS(ESI )m/z:计算值:424 · 28(M+3H) +;观察值:424 · 3。
[0177] (2_( (2-羟基-5-硝基苄基)氨基）乙基)氨基甲酸叔丁基酯（10):向内含2-羟基-5-硝基苯甲醛(3.51mmol，0.587g)的60mL甲醇的溶液添加内含N-(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁 基酯(3.5 lmmo 1，0.562g)的甲醇(30mL)的溶液并使该溶液搅拌1小时。向该搅拌中的溶液添 加固体NaBH4(7.02mm〇l，0.266g)。观察到快速产气，并且溶液由浅黄色变为无色。搅拌3小 时后，减压下移除所有挥发物，之后获得白色固体。使残留物溶解于10mL甲醇和200mL CH 2C12的溶剂混合物，并用200mL饱和NaHC03溶液萃取。使用CH 2C12(2x 100mL)萃取水性层。 合并全部有机物，用盐水(200mL)清洗并用无水MgS04干燥。减压下蒸发溶剂以获得黄色固 体10(1.01 8,93%)。1!1匪1?(5001抱，（0)3)230)3(??111) :8.01((1，了 = 3.0抱，1!〇7.92((1(1，了1 = 3.00Hz，j2 = 9.2Hz，lH)，6.92(t，J = 5.8Hz，lH)，6.46(d，J = 9.2Hz，lH)，3.93(s，2H)，3.14 (m，2H)，2.75(t，J = 6.3Hz，2H)，1.38 (s，9H).13C{1H}MMR(100MHz，CDCl3)S(pp m):172.1， 155·7，133·6，126·1，126·0，121·9，117·3,77·9,48·7,46·7,37·9,28·2<Χ?4Η2?Ν 3〇5 的分子 量:311.33.]\^"31)111/2:计算值:312.34(]\1+!〇 +观察值:312.4。
[0178] 2,2'-((2-((2_(叔丁氧基)-2_氧代乙基）（2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5_ 硝基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸二叔丁基酯（11):使10(3.24mmol，1.01g)溶解于 CH2Cl2(100mL)，然后添加50mL三氟乙酸。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留 物溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为浅黄色固 体的胺，其无需进一步纯化即可用于后续反应。
[0179] 包含所述胺的圆底烧瓶充入氮气，添加无水二甲基甲酰胺(40mL)，并在冰浴中冷 却。在相反的氩气气流下，添加 N，N-二异丙基乙基胺（16.2mmol，2.82mL)，然后添加叔丁基 二苯基甲硅烷基氯(3.56mm〇l，0.979g)作为二甲基甲酰胺溶液(5mL)。随后将溶液升温至室 温并搅拌5小时。使该反应冷却回0°C，并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯（10.04mmol，1.48mL)，然 后使反应在氮气气氛下搅拌18小时。该溶液用CH 2Cl2(200mL)稀释并用饱和NaHC03(3x 200mL)、盐水（lx 200mL)清洗。合并全部有机物并用无水硫酸镁干燥然后在减压下蒸发以 获得粗制黄色油状物.采用柱色谱(洗脱剂-己烷/乙酸乙酯，9:1)将产物纯化成无色油状物 (0·615g，24% ) </H NMR(400MHz，CDCl3)S(ppm):8.50(d，J = 2.9Hz，lH)，7 ·67(ι?，5Η)，7·45 (m，lH)，7.39(m，5H)，6.40(d，2H，J=2.9Hz，lH)，4.08(s，2H)，3.48(s，4H)，3.44(s，2H)， 170.8,159.0,142.1，135.3,131.4,130.5,128.2,125.6,123.3,118·7,81·1，81·0,56·5， 56 · 2，53 · 0，52 · 8，52 · 7，28 · 2，26 · 5，19 · 7<X43H6iN3〇9Si的分子量：792 · 04 JSUSI )m/z :计算 值:793.05(]?+!〇+观察值:793.1。
[0180] 2,2-((2-((羧甲基）（2-羟基-5-硝基苄基）氨基）乙基）氮烷二基）二乙酸(HBET-觀 2)(12):将11(0.776111111〇1，0.6158)溶解于三氟乙酸（4011^)，然后添加三异丙基硅烷 (2 · 35mL)、1-十二硫醇(2 · 35mL)和水(2 · 35mL)。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。 将残留物溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为白 色固体的 12</H NMR(500MHz，D2〇)S(ppm):8.33(m，lH)，8.22(m，lH)，7.06(d，J = 9.0Hz，lH)， 4.57(s,2H),4.07(s,2H),3.60(s,4H),3.49(m,2H),3.27(m,2H)〇 13C{1H}NMR(125MHz,D2〇)5 (ppm):173.5,169.1,162.2,140.1,129.1,128.0,116.7,116.0,54.8,54.0,51.9,49.2〇 C15H19N3〇9 的分子量:385 · 33 JSUSI )m/z:计算值:386 · 33(Μ+Η)+观察值:386 · 4。
[0181] Na2[MnI1HBET-N02](13):将12(0·25mmol，0·096g)溶解于5mL水。采用lN氢氧化钠 溶液将pH调节至8。然后向溶液添加 MnCl2.4H20(0.25mmol，0.049g)，并将pH仔细调节至5。使 该反应搅拌1小时，过滤并冷冻干燥以产生白色固体。将络合物注射进入反相C18(Polaris) 柱并采用前述方法脱盐。收集分级分离部分冻干以产出浅黄色固态的13(0.102g，82%)。 CbHnMnNsOg 的分子量:438 · 25 JSUSI )m/z:计算值:439 · 26(M+3H) +;观察值:439 · 4。
[0182] Na[MnmHBET-N02] (14) :]?1^3(0.0068,0.054111111〇1)添加至搅拌中的内含12 (0.021g，0.054mmol)的5mL Η20(ρΗ 8)。将所得橙红色溶液注射进入反相C18(Polaris)柱 并采用前述方法纯化。收集分级分离部分并冻干以产生棕色固态的14(0.012g，0.026mmol， 48% ) <X19H21MnN3〇9的分子量:436 · 23 JSUSI)m/z:计算值:436 · 02(M) -;观察值:436 [0183]氯化反_1，2二氨基环己铵（15):在反相氮气气流下，向内含反_1，2二氨基环己烷 (48mmol，5.523g)的200mL乙醚逐滴添加内含20.4mL的2M HC1的乙醚溶液。使反应搅拌2小 时，这期间形成白色沉淀物状的产物。收集沉淀物并用足量乙醚清洗。产率:97% (7.05g)。 4 Mffi(500MHz，CD0D)S(ppm):2.67(m)，2.04(m，2H1.78(m，2H)，1.35(m，4H)<X6Hi4N2的分子 量：114.19 JSCESDm/z:计算值：115.2(M+H) +。观察值：115.4. UcpHlNMRdSSMHzADsODM (口口111):56.1，33.7,25.6。〇61114吣的分子量：114.19。]\^江31)111/2:计算值 ：115.2(]\1+!〇 +;观察 值:115.4〇
[0184]氯化反-2-((叔丁氧基羰基)氨基)环己铵（16)(参见图19):在1小时中，向内含15 (lOmmol，1.507g)的90mL甲醇的溶液逐滴添加内含碳酸氢二叔丁基酯(9. lmmol，1.986g)的 甲醇(30mL)的溶液。搅拌18小时后，减压下移除所有挥发物，并获得淡黄-白色固态的产物。 该固体用足量的二氯甲烷清洗，以去除任何未反应的起始物质。产率:97% (2.218)^11 NMR (500MHz，CD0D)S(ppm):3.07(s，lH)，2.40(s，lH)，1.91(m，2H)，1.70((m，2H)，1.44(s，9H)， 1.28(m，2H)，1 · 19(m，匪 R( 125MHz，CD30D)S(ppm): 156.7，79·3,54·3,52.4， 31·6,29·7,27·4,24·，23·6<ΧιιΗ22Ν2〇2的分子量：214.30.]\^^51)111/2:计算值 ：215.3(]\1+!1 )+ ;观察值：215.4<XnH22N2〇2的分子量：214.30 .MS(ESI)m/z:计算值：215.3(M+H) + ;观察值： 215.4〇
[0185] (反-2-( (2-羟基苄基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁基酯（17):向内含16 (3 ·99mmol，1 ·001g)的90mL MeOH的溶液添加 NEt3(4· 39_〇1，0·6mL)，并使该反应搅拌30分 钟。向上述混合物添加内含水杨醛(3.99mmo 1，0.487g)的甲醇(30mL)的溶液。搅拌1小时后， 添加固体NaBH4(8.38mmol，0.317g)，并使该反应搅拌3小时。减压去除所有挥发物，以产出 浅黄色固体。使残留物溶解于200mL CH2C12，用200mL饱和NaHC03溶液萃取。使用CH 2C12(2x 100mL)萃取水性层。合并全部有机物，用盐水(200mL)清洗并用无水MgS〇4干燥。减压蒸发溶 剂以获得浅黄色固体17(1.231 8,96%)。1!1匪1?(50010^，0)(：13)3(??111):7.15(111，1!〇,6.96 (m，lH)，6.81(m，lH)，6.75(m，lH)，4.43(s，lH)，4.05(d，lH)，3.93(d，lH)，3.41(s，lH)，2.31 (m，lH)2.17(m，lH)，1.99(m，lH)，1.70(m，2H)，1.46(s，9H)，1.31(m，lH)，1.17(m，2H) 〇13C {^田匪以 125MHz，CDCl3)S(ppm) :158.3,156.0,128.4,128.0,123.1，118.7,116 ·3,79·4， 60.9,53.9,49.8,33.0,31.2,28.3,24.9,24.5。(：181128吣〇3的分子量：320.43。]^化51)111/2:计 算值:321.43(1+!〇 +;观察值:321.5。
[0186] 2,2'_((反-2-( (2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基）（2-羟基苄基)氨基)环己基)氮烷二 基）二乙酸二叔丁基酯（18)将 17(3.15111111〇1，1.018)溶解于〇12(：12(1001^)，然后添加501^三 氟乙酸。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留物溶解在水(40mL)中，并用乙醚 (3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为浅黄色固体的游离胺，其无需进一步纯化 即可用于后续反应。
[0187] 向包含该胺的圆底烧瓶添加1(1(6.3111111〇1，1.048)，并用氮气吹扫该系统。在反向氮 气气流下，添加无水二甲基甲酰胺（2mL)，然后添加 N，N二异丙基乙基胺（15.75mmol， 2.74mL)，并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯(9.765mmol，1.90g)。使该反应搅拌18小时，然后在饱 和NaHC0 3(撒)和Et20之间萃取分离。Et20经分离并用H20更换清洗数次以去除DMF，然后用 Na2S〇4干燥，并浓缩成1 · 0g的黄色油状物。C31H5QN2〇7的分子量：562 · 74KESI )m/z :计算值： 563.75(M+H) + ;观察值:563.8。该粗产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。
[0188] 2,2'_((反-2-((羧甲基）（2_羟基苄基)氨基)环己基)氮烷二基)二乙酸（19):将来 自前述步骤的粗产物（17)溶解于三氟乙酸(40mL)，然后添加三异丙基硅烷(2.35mL)、1-十 二硫醇(2.35mL)和水(2.35mL)。使该反应搅拌5小时，然后减压除去挥发物。将残留物溶解 在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以生成粗制物料19。然后通过 制备型HPLC纯化产物，采用Polaris C18柱;洗脱剂A:Η20/0 · 1 %TFA，B:MeCN/Ο · 1 % TFA:梯 度5 %~50 % B，25分钟；流速：15mL/分钟。收集分级分离部分并冻干以产出白色固态的19 (0.5108,72%)〇^ NMR(500MHz,D2〇)5(ppm):7.45(maH),7.37(maH),6.98(m,2H),4.42 (s，2H)，4.17(d，lH)，3.90(d，lH)，3.51(br，2H)，3.35(br，lH)，3.24(br，lH)，3.00(br，lH)， 2.91(br，lH)，2· 33-1.12 匪 R(125MHz，D20) δ (ppm): 174.5,170.4,156.1， 133·3，132·9，121·9，117·1，116·6,62·0,59·6,53·8,52·3,51·0,48·3,24·4<Χ?9Η26Ν2〇7 的分 子量：394 · 42 JSUSI )m/z:计算值：395 · 43(Μ+Η) +;观察值：395 · 5。
[0189] Na2[MnncycHBET](20):将 19(0.26_〇1，0.1038)溶解于511^水。采用謂氢氧化钠溶 液将pH调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2.4H20(0.26mmol，0.051g)，并将pH仔细调节至5。使 该反应搅拌1小时，过滤并冻干以产出白色固体。将络合物注射进入反相C18(Polaris)柱， 并采用上述方法脱盐。收集分级分离部分并冻干以产出白色固态的20(0.106g，80%)。 Ci9H24MnN2〇7 的分子量:447 · S^MSUSI )m/z:计算值:448 · 35(M+3H) +;观察值:448 · 4。
[0190] Na[MnmcycHBET](21):将18(0.15111111〇1，0.068)溶解于511^水。采用謂的氢氧化钠 溶液将pH调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2.4H20(0.15mmol，0.030g)，并将pH调节至12。使 该溶液搅拌1小时。然后使该溶液过滤通过〇. 45μπι过滤器以去除Μη02，pH调节至11并使该溶 液搅拌18小时。该反应后，进行分析型LC-MS，并且观察到该反应在70 %转化成Mnm物质时 停止。所述混合物如上所述经制备型-HPLC纯化。收集分级分离部分并冻干以产出棕色固态 的21(0.023 8,31%)。(：191123]?1^2〇7的分子量：446.33。]\^化51)111/2:计算值 ：447.34(]\1+2!〇 +; 观察值:447.4。
[0191] (2-((2-羟基-5-甲氧基苯亚甲基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁基酯（22):反Ια 叔丁氧基羰基) 氨基) 环己烷 （1.30mmol，0.279g) 和 2-羟基-5-甲氧基苯甲醛 （1.35mm〇l， 0.206g)在12mL MeOH中一起室温搅拌。数分钟内，亮黄色溶液中沉淀出大量沉淀物。搅拌90 分钟后，向该混合物添加3011^!120，并通过过滤分离0.3428(0.98111111〇1，76%)22。 1!1匪1? (500MHz，CDCl3)S(ppm):12.78(s，lH)，8.28(s，lH)，6.90(d，lH)，6.76(d)，4.63(s，lH)， 3.73(s，3H)3.57(s，lH)，3.03(s，lH)，2.06(m，lH)，1.90(m，3H)，1.76(t，2H)，1.68(q，lH)， 1.41 (m，2H)，1.30(8,911),3(:1:?}匪 R( 125.7MHz，CDCl3)S(ppm): 163.3,155.4，155.3， 151.9,119.3,118.5,117.8,115.0,79.3,72.7,56.1,54.2,33.3,31.6,28.2,24.8,24.0〇 C19H28N2〇4 的分子量:348 · 44 · MS(ESI )m/z:计算值:349 · 21 (M+H) +;观察值:349 · 2。
[0192] 反（2-( (2-羟基-5-甲氧基苄基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁基酯（23)(参见图 19):将NaBH4(5lmg，1 · 35mmo 1)分批添加至室温搅拌中的内含22(0 · 342g，0 · 98mmo 1)的20mL MeOH中。数分钟内，溶液的黄色被漂白成浅米黄色。2小时后，溶液被浓缩至干，加入CH2C1 2并 用H20和盐水彻底清洗。有机部分经清洗并用MgS04干燥，然后浓缩成23,分离为米色固体 (0·179 8,0·51ι?πιο1，52%)<31Η Mffi(500MHz，CDCl3)S(ppm):6.72(m，2H)，6.54(s，lH)，4.53 (br s，lH)，3.94(dd，2H)，3.38(br s，lH)，2.30(m，lH)，2.13(m，lH)，1.97(m，lH)，1.69(m， 2H)，1.45(s，9H)，1.31-1.15(m，4H) X19H3QN2O4的分子量：350.22.MS(ESI)m/z:计算值： 351.23(]?+!〇 +;观察值:351.3。
[0193] 2-(((反-2-氨基环己基）氨基）甲基）-4-甲氧基酚（24) :5小时内，将23(0.179g， 0.51mmol)溶解于5mL的各CH2C12/TFA。然后使该溶液浓缩至干，溶解于50mL CH2C12并在过 量K2C03個)存在下搅拌12小时。K 2C0通过过滤移除，并使母液浓缩从而以定量产率获得浅黄 色油状物的24</H NMR(500MHz，CDCl3)S(ppm):6.70(m，2H)，6.56(s，lH)，3.91(dd，2H)，3.72 (s,3H) ,2.39(br t ,ΙΗ), 2.10(m, 2H) ,1.79(m,lH) ,1.66(m, 2H) ,1.28-1.06(111,^)130{^} NMR(125.7MHz，CDCl3)S(ppm):152.4，152.0，124.5，116.7，114.0，113.3,63.8,55.9,55.8， 50 · 3，37 · 0，30 · 9，25 · 3，24 · 9X14H22N2O2的分子量：250 · 34 JSUSI )m/z :计算值：251 · 37(M+ H) + ;观察值:251.1。
[0194] 2,2'_((反-2-((2-(叔丁氧基)- 2-氧代乙基）（2-羟基-5-甲氧基苄基)氨基)环己 基)氮烷二基)二乙酸酯（25) :向内含24(0.1618,0.64111111〇1)的搅拌中的31^01^(含有碘化 钾(0.078 8,0.47111111〇1)和二异丙基乙基胺(0.4328,3.34111111〇1))室温添加溴乙酸叔丁基酯 (0.399g，2.05mmol)。浅棕色溶液快速产生白色沉淀物。搅拌4小时之后，该溶液用100mL Et 20稀释，用Na2C03(7搬)、足量H20和盐水清洗。有机层被浓缩至干，并用反相C18(Polaris)柱 纯化：洗脱剂 A: H20/0 · 1 % TFA，B: MeCN/O · 1 % TFA;梯度 60 % ~95 % B，25 分钟；流速：20mL/分 钟。分级分离部分经冻干，加入50mL CH2C12并在K2C03個)存在下搅拌6小时。滤液浓缩至产出 25。（0.095 8,0.17臟〇1，26%)。1!1 NMR(500MHz，CDCl3)S(ppm):9.53(br s，lH)，6.73(m，2H)， 6.57(d，lH)，4.21(d，lH)，3.72(s，3H)，3.67(d，lH)，3.44(m，5H)，3.24(d，lH)，2.77(t，lH)， 2·59(?，1Η)，2·03(πι，2Η)，1·68(πι，2Η)，1·44(28，18!^Ρ9Η)，1·23(πι，1Η)，1·03(πι，3Η)。 13。 81.4,80.8,63.7,59.6,55.8,55.5,52.8,28.2,28.1，25.8,25.6(该光谱中无法发现一个(：， 它可能与其它峰重合）<Χ32Η52Ν2〇8的分子量:592.76。]\^化31)111/2 :计算值：593.4(]\?〇 +;观 察值:593.5。
[0195] 2,2'-((2-((羧甲基）（2_羟基-5-甲氧基苄基）氨基）环己基）氮烷二基）二乙酸 (26):将25(0.095g，0.224mmol)溶解于3mL各CH2C12:TFA。搅拌6小时后，使反应混合物浓缩 以产出白色固态的26X-的分子量:424.44]\^化31)111/2:计算值:425.19(]\1+!〇 +;观察 值:425.2。
[0196] (反-2-( (2-硝基苄基）氨基）环己基）氨基甲酸叔丁基酯（27):向内含16 (3 ·99mmol，1 ·001g)的90mL MeOH的溶液添加 NEt3(4· 39_〇1，0·6mL)，并使该反应搅拌30分 钟。向上述混合物添加内含2-羟基-5-硝基苯甲醛(3.99mmol，0.667g)的甲醇（30mL)的溶 液。搅拌1小时后，添加固体NaBH4 (8.38mmo 1，0.317g)并使该反应搅拌3小时。减压去除所有 挥发物，以产出浅黄色固体。使残留物溶解于200mL CH2C12,用200mL饱和NaHC03溶液萃取。 水层用CH 2Cl2(2X100mL)萃取。合并所有有机物，用盐水(200mL)清洗并用无水MgS〇4干燥。 减压蒸发溶剂以获得浅黄色固体27(1.231 8,96%)。1!1匪1?(5001抱，0)300)5(??111) :8.05(111， lH)，7.91(m，lH)，6.81(m，lH)，4.48(d，lH)，4.08(m，2H)，3.42(d，lH)，2.31(m，lH)，2.13(m， 1!1)，1.98(111，1!1)，1.75(111，2!1)，1.45(8,9!1)，1.17(111，3!1)。(：181127吣〇5的分子量 ：365.42。]\^ (ESI )m/z:计算值：366 · 42 (M+H) +;观察值：366 · 5。
[0197] 2,2'_((反-2-((2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基）（2-羟基- 5-硝基苄基)氨基)环己基） 氮烷二基）二乙酸二叔丁基酯（28)(参见图19):将27(3.15111111〇1，1.158)溶解于(^ 2(：12 (100mL)然后添加50mL三氟乙酸。搅拌该反应5小时，然后减压下去除挥发性物质。将残留物 溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将水部分冷冻干燥以定量生成为浅黄色固体 的胺，其无需进一步纯化即可用于后续反应。
[0198] 向包含该胺的圆底烧瓶添加1(1(6.3111111〇1，1.048)，并用氮气吹扫该体系。在反向氮 气气流下，添加无水二甲基甲酰胺（2mL)，然后添加 N，N-二异丙基乙基胺（15.75mmol， 2.74mL)，并逐滴添加溴乙酸叔丁基酯(9.765mmol，1.90g)。使该反应搅拌18小时，然后在饱 和NaHC0 3 (水性)和Et20之间进行萃取分离。分离Et20层并用H20更换数次清洗以去除DMF，然 后用Na 2S〇4干燥并浓缩成0.73g黄色油状物。C31H49N3〇9的分子量:607. TLMSUSI )m/z :计算 值:608.74(M+H) +;观察值:608.9。该粗产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。
[0199] 2.2'-((反-2-((羧甲基）（2_羟基-5-硝基苄基)氨基)环己基)氮烷-二基）二乙酸 (29):将来自前述步骤的粗产物（28)溶解于三氟乙酸（40mL)，然后添加三异丙基硅烷 (2.35mL)、1-十二硫醇（2.35mL)和水(2.35mL)。搅拌该反应5小时，然后减压下去除挥发性 物质。将残留物溶解在水(40mL)中，并用乙醚(3x 40mL)清洗。将 水部分冷冻干燥以生成粗 制物料29。然后通过制备型HPLC纯化产物，采用Polaris C18柱;洗脱剂A:H20/0.1%TFA，B: MeCN/0.1 % TFA;梯度5 %~50 % B，25分钟;流速：15mL/分钟。收集分级分离部分并冻干以产 出白色固态的24(0.4978,70%)。1!1匪1?(5001抱，〇2〇)3(??111):8.37((1，了 = 2.58抱，1!〇,8.20 (m，lH)，7.06(d，J=9.10Hz，lH)，4.40(s，2H)，4.10(d，lH)，3.84(d，lH)，（d，lH)，3.56(br， lH)，3.44(br，lH)，3.19(br，2H)，3.04(br，2H)，2.35(m，lH)，1.89(m，lH)，1.78(m，lH)，1.53 (m,lH),1.24(br,4H)〇 13C{1H}NMR(125MHz,D20)5(ppm) :173.8,171.4,162.8,141.1,129.8, 128.5,119.0,117.1，72·1，71·7,63 ·3,60·0,55·0,43·2,24·7,24·5,24·3<Χ?9Η25Ν3〇9 的分子 量:439 · 42 JSUSI )m/z:计算值:440 · 42(M+H) +;观察值:440 · 5。
[0200] Na2 [MnncycHBET-N02) ] (30): 29 (0 · 26mmo 1，0 · 114g)溶解于5mL水。采用 IN氢氧化 钠溶液将pH调节至8。然后向该溶液添加 MnCl2'4H20(0.26mm〇l，0.051g)，并将pH仔细调节至 5。使该反应搅拌1小时，过滤并冻干以产出白色固体。将络合物注射进入反相C18(Polaris) 柱并采用上述方法脱盐。收集分级分离部分并冻干以产出白色固态的30(0.102g，80%)。 Ci9H23MnN3〇9 的分子量:493 · 35 JSUSI )m/z:计算值:494 · 35(M+3H) +;观察值:494 · 4。
[0201] Na[MnmcycHBET-N02](31):将11^3(0.0118,0.08111111〇1)添加至搅拌中的内含24 (0 · 043g，0 · 08mmo 1)的5mL H20(pH 8)。所得橘红色溶液用反相Cl8(Polaris)柱纯化:洗脱 剂A: H20(10mM乙酸铵），B:MeCN;梯度5 %~60 %B，25分钟;流速:20mL/分钟。收集分级分离 部分并冻干以产出棕色固态的26(0.024g，0.05mmo 1，62 % )。C19H21MnN3〇9的分子量:490.32。 MS(ESI )m/z:计算值:490 · 07 (M) -;观察值:490 · 2。
[0202]表1·ρΗ 7.4、37°0、1.4特斯拉下的锰络合物的弛豫度。
[0203]
[0204] 实施例2
[0205]
[0206]实施例2的合成方案可见图34。
[0207] N-甲苯磺酰基二亚乙基三胺(32)。0°(3下向内含8.480g(81.71mmol)二亚乙基三胺 的搅拌中的120mL MeCN添加1.768g(9.27mmo 1)对甲苯磺酰氯。立即形成白色非均相溶液， 并使该溶液升温至室温并继续搅拌16小时。然后使该溶液浓缩成白色油状物，加入30mL H 20,并将pH调节至>10,然后用Et20清洗两次。然后，通过冻干将水层浓缩成白色残留物。所 得残留物加入30mL H20,并通过小心添加三氟乙酸（TFA)将pH调节至7。然后通过制备型 HPLC纯化产物，米用Restek Ultra Aqueous C18柱（10mm X 250mm);洗脱剂Α:Η2〇/0·1% TFA，Β: MeCN/Ο. 1 % TFA;梯度5 %~95 % Β，23分钟;流速:5mL/分钟。汇集包含产物的分级分 离部分，并通过旋转蒸发去除MeCN和TFA。然后通过小心滴定1M NaOH(7W4)调节所得水性溶液 至pH 9,进行该步骤以产生二亚乙基三胺(大幅过量，无紫外检测）的小量游离胺，其可随产 物洗脱，预期残留的痕量在冻干期间蒸发。水性溶液通过冻干浓缩成3.142g(5.94mm 〇l， 64%)的黄色油状物，其由32+2当量的三氟乙酸钠组成。所述产物无需进一步纯化即可进行 后续反应。 1H NMR(500MHZ，D20，S来自溶剂部分）：7.78(d，2H)，7.59(d，2H)，3.08-2.02(m， 4H)，2.87(t，2H)，2.73(t，2H)，2.45(s 125.7MHz，? 20，δ来自 tBuOH) :145.77， 135.60，130.77，127.40,47.84,45.92,42.27,39.10,21.32儿〇]\^:111/2 = 258.1(]\?〇 +;计 算值:258.4。
[0208] N-甲苯磺酰基-Ν'，N〃，N〃-二亚乙基三胺三叔丁基乙酸酯（33):在20分钟内，向一 批内含2.876g(5.43mmol)的21+2当量的三氟乙酸钠、6.615g(51.18mmol)二异丙基乙基胺 和1.739g(10.48mmol)碘化钾的搅拌中的20mL DMF室温逐滴添加内含5.038g(23.83mmol) 溴乙酸叔丁基酯的5mL DMF。该反应混合物另搅拌16小时，然后在饱和的NaHC03(7搬)和Et20 之间萃取分离。分离Et 20层，并用H20更替数次清洗以去除DMF，然后用Na2S〇4干燥，并浓缩成 4.535g棕色油状物。硅胶色谱4: 1己烷：乙酸乙酯~2: 1己烷：乙酸乙酯产出2.346g (3.91mmol，72%)浅黄色油状的33</H NMR(500MHZ，CD3C1，S来自TMS):7.80(d，2H)，7.27((1, 2H)，6.63(br，t，NH)，3.42(s，4H)，3.16(s，H)，2.91(q，2H)，2.75-2.70(m，6H)，2.41(s，3H)， 1.46(s，18H)，1.43(8,911),3(:1:?}匪R(125.7MHZ，CD 3C1，δ来自 TMS) :171.17,170.69， 142·79，137·63，129·53，127·44,81·35,81·16,55·73,52·61，52·12,5177,41·41，28·32， 28 · 28，21 · 60，20 · 80 iSI-MS: m/z600 · 8 [M+H] + 计算值：600 · 3。
[0209] N-甲苯磺酰基-Ν'，N〃，N〃-二亚乙基三胺三乙酸酯2TFA(N-tos-DTTA · 2TFA)(34) · 一批0.957g(l.60mmol)33在40mL的85:5:5:5TFA:正十二硫醇：三异丙基硅烷:H2O中搅拌16 小时。然后使反应混合物浓缩至干，加入H 20，并用Et20清洗。水性层通过制备型HPLC分批纯 化，该册1^：采用&〇1^8丨1100-10-04反相柱（21.2111111叉 250111111);洗脱剂4:!120/0.1%了?八，8: MeCN/0.1 % TFA;梯度5 %~70 % B，17分钟；流速:20mL/分钟。汇集包含产物的分级分离部 分，并浓缩至0.8948(1.29臟〇1，81%)白色固态的23。 1!1匪1?(5001取，0204来自溶剂部分）： 7.80(d，2H)，7.50(d，2H)，3.98(s，2H)，3.82(s，4H)，3.51(t，2H)，3.43(t，2H)，3.36(t，2H)， 3.31(t，2H)，2.46(s，.7MHz，D 20,δ来自 tBuOH): 173.98,170.31，146.48， 135.05,131.10,127.76,56.27,55.54,54.80,53.31,50.78,38.62,21.37〇LC-MS:m/z= 432.2[]?+!1] +;计算值:432.5。
[0210] 恥[]^0-切8-〇7^)](35)。一批81.511^(〇.12111111〇1)34溶解于211^!12〇，并通过小心 添加1M NaOH将pH调节至6.40。向其中添加23.5mg(0.12mmo 1)的固体MnC 12，并小心调节pH 至6.60。所得溶液冻干成白色粉末，然后通过制备型HPLC纯化，采用Restek Ultra Aqueous C18柱（10mm x 250mm);洗脱剂A:内含50mM乙酸铵的水，B:MeCN;梯度5%~95，20分钟； 流速:5mL/分钟。包含产物的部分经重复冻干以去除任何残留的乙酸铵，最终产出白色固态 的35为631^(0.12臟〇1，100%)儿(：-]^:111/2 484.0[]\1-恥-!120)-;计算值：483.4。
[0211] 1:1的合并比例的34和Mn2+如下确定：向内含0.91mM MnCh的pH 7.30缓冲液（25mM TRIS)(各为0.45μπιο1)的500yL样品，添加递增份的1.45mM 34(增量为75yL，0~675yL;各75 yL份中有1.09μπι〇1)。随后检测各样品的^值，并绘制弛豫度与配体/金属之比的关系图（参 见图28) Jn的完全消耗点由^停止随添加的配体而下降的点确定。各样品的浓度由ICP-MS 测定。
[0212]实施例3 [0213]合成
[0214]实施例3的合成方案可见图38和39。
[0215] N-苄基-1，2_二氨基环己烷（36)。室温下，在1小时时程中，向一批内含7.113g (62.29111111〇1)1，2-二氨基环己烷的5011^]\^0~逐滴添加内含1.0938(6.39111111〇1)苄基溴的 lOmL MeCN。16小时后，将所得的白色、非均相溶液浓缩至干，并在CH2C12和饱和的Na 2C03(撒） 之间萃取分离。分离各层，有机相再次用饱和Na2C03 (7搬)清洗，随后用盐水清洗，用Na2S04干 燥并浓缩成1.28(^(6.26臟〇1，98%)的浅黄色油状的36。 1!1匪1?(5001取{0(：13^来自了]\^): 7.36-7.22(m,5H),3.94(d,lH),3.69(d,lH),2.38(m,lH),2.09(m,2H),1.90(m,lH),1.73 (m，2H), 1 · 32 · -1 · 09(m, 4H) oESI-MS:m/z = 205[M+H] + 计算值：205 · 3。
[0216] Ν'-苄基-Ν'，N〃，N〃-三丁基乙酸酯-1，2-环亚己基二胺（37):向内含1.133g (5.55111111〇1)36、4.1948(32.35_〇1)二异丙基乙基胺和0.9668(5.82_〇1)碘化钾的511^01^ 室温添加5.340g(27.38mm 〇l)溴乙酸叔丁基酯。使所得褐色、非均相溶液搅拌6小时，然后用 Et20稀释，随后用饱和的K<03(水I?、更换数次的水和盐水洗涤，用Na2S〇4干燥并浓缩成 5 · 468g棕色油状物。快速色谱（硅胶，19:1~4:1己烷:EtOAc)产出1 · 949g(3 · 57mmol，64 % ) 的浅黄色油状的纯 36</H NMR(500MHZ，CDCl3j来自TMS) :7.45((1, lH)，7.30(t，lH)，7.23((1, 1H),4.0(d,lH),3.69(d,lH),3.47-3.38(m,5H),3.28(d,lH),2.71(t,lH),2.55(t,lH), 2.04(t,2H),1,68(m,2H),1,44(s,18H),1,42(s,9H),1.31-1.25(m,4H)o^Ct^jNMR (125.7]\012,0)3(：1，3来自了]\^):171.95，171.66，139.91，129.35，128.05，126.82,80.30， 63.39,59.95,54.79,53.18,52.62,29.41,28.14,28.12,25.83,25.68〇ESI:m/z=547.0[M+ H]+计算值:547.4。
[0217] ^1^'-反-1，2-二氨基环己烷-三-叔丁基乙酸酯（38)37(0.7578，1.38111111〇1)和 Pd/C(96mg，13重量％)在MeOH中于1个大气压H2(气)下搅拌。16小时后，通过过滤移除Pd/C，并 使母液浓缩成米色油状的38(60111^，1.321]11]1〇1，95%)。该产物无需进一步纯化即用于接下 来的步骤。 1H NMR(500MHZ，CDC13，S来自TMS) :3.49-3.23(m，7H)，2.35(m，2H)，2.00(m，lH), 1,93(m,1H),1,72(m,lH),1,65(m,1H),1,44(s,27H),1.18-1.00(m,4H)o^Ct^jNMR (125.7MHZ,CD3C1，S来自TMS) :171.7(两个重合的C) ,80.6,80.5,67.3,57.6,52.8,48.7, 31.4,28.3,28.2,27.1,25.9,24.5<^51:111/2 = 457.3[]\1+!1]+计算值:457.3。
[0218] N'-(2-吡啶甲基)-Ν'，N〃，N〃-三叔丁基乙酸酯-1，2-环亚己基二胺(39):将盐酸吡 啶甲基氯（0.0798,0.48111111〇1)添加至内含38(0.25(^，0.55111111〇1)、碘化钾（0.076 8， 0.48mmol)和二异丙基乙基胺(0.320g，2.48mmol)的搅拌中的3mL DMF。搅拌16小时之后，浅 黄色浑浊溶液用50mL Et20稀释，用饱和KA03(7撤)、足量水和盐水清洗，用Na2S〇4干燥并浓缩 成0.303g褐色油状物。粗产物用快速色谱(硅胶，9:1己烷:EtOAc w/l%TEA)纯化以产出无 色油状的39(0.15(^，0.27臟〇1，50%)。1!1匪1?(5001取，0)(：13,3来自了]^):8.46((1，1!〇,7.86 (d,lH),7.64(t,lH),7.11(m,lH),4.11(d,1H),3.79(d,1H),3.48-3.32(m,5H),3.29(d, lH),2.71(m,lH),2.61-2.52(m,2H),2.06(m,2H),1.69(m,2H),1.40(s,27H),1.32-1.24(m, 3H) ^CpH}匪R(125.7MHZ,CD3C1 ,δ来自TMS): 171.8,166.2,162.5,146.8,137.3,127.0, 123.5,80.4(两个重合的信号），66.6,63.3,62.8,59.0,37.4,291,28.3,28.1,26.0,24.9, 22.7<^51:111/2 = 548.4[]\1+!1]+计算值:548.4。
[0219] Ν'-吡啶甲基-Ν'，N〃，N〃-反-1,2-环亚己基二胺三乙酸酯（40):使39(150mg， 0.27mmol)在5mL各CH2C12/TFA中搅拌。12小时后，将溶液浓缩成104mg白色固态的40 · 3TFA (Ο.?δπιπιο?,δθ%)。1!! NMR(500MHZ，D2〇j来自部分溶剂）：8.80(br s，1H)，8.59(s，1H)，8.07 (br s，lH)，8.02(br s，lH)，4.49-2.94(m，10H),2.32-2.19(m，2H)，1.91(m，2H),1.53-1.28 (m，4H) <^51:111/2 = 380 ·2[Μ+Η] + ;计算值:379.2。
[0220] [Mn(CyP3A)] (41):将40以1:1比例结合Μη11。制备该络合物并对其进行原位表征。 Μη11小心滴定至40，并且如上所述通过LC-MS或Τ2-弛豫计监测Μη: 40化学计量学。41的溶液 在室温无限稳定。m/z = 433.1[Μ+2Η] + ;计算值:433.1。
[0221] 1^'-((6-(亚甲基）吡啶-2-基）甲基）异吲哚啉-1，3-二酮)4'少〃少〃-三叔丁基乙 酸酯 _1，2-环亚己基二胺（42)。一批46811^(0.861]11]1〇1)37和6211^的10%钯碳（13重量％)在1 个大气压的H2(气)下搅拌16小时，之后通过LC-MS分析确定Ν' '，N〃，N〃-叔丁基乙酸酯-1,2-环 亚己基二胺(42)的完全转化^51:111/2 = 457.0[1+!1] + ;计算值:457.3)。通过过滤移除钯催 化剂，并真空浓缩母液。所得残留物立刻加入3mL DMF并向其添加18611^(15.2〇1111]1〇1)二异丙 基乙基胺，随后添加27511^(0.83111111 〇1)2-((6-(溴甲基）吡啶-2-基）甲基）异吲哚啉-1，3-二 酮（参见J.0rg.Chem.l997,62,5156)。6小时后，反应混合物用Et 20稀释，然后用饱和 NaHC03(7搬)，数次更换的水和盐水清洗，并用Na2S〇4干燥。过滤移除Na2S〇4后，将溶液浓缩至 干，并用己烷研碎，留下241mg的浅黄色油状物。快速色谱(硅胶，100%CH 2C12~100%Me0H) 产出77mg(0. llmmol，13%)白色纯42残留物。1H Mffi(500MHZ，CDCl3，S来自TMS) :7.88(m, 2H),7.72(m,3H),7.58(t,lH),7.03(d,br,1H),4.98(s,2H)3.97(d,1H),3.70(d,1H),3.41 (m,5H),3.24(d,lH),2.65(t,br,lH),2.53(t,br,lH),1.99(m,2H),1.636(m,2H),1.40(s, 27H) ,1.37(m,7MHZ，CD3C1J来自TMS) :171.87,171.79,168.21， 161.15,153.97,137.15,134.12,132.36,123.53122.71,118.99,80.48,80.34,77.36， 63 · 50，61 · 57，56 · 18，53.77,53.26,43.11,28.22(两个重合），25.97,25= 707.0[]?+!1]+计算值 ：707.4。
[0222] N'-6_(氨基甲基）吡啶-2-基）甲基-Ν'，N〃，N〃-三叔丁基乙酸酯-1，2_环亚己基二 胺（43)。一批77mg(0 · llmmol )42和68mg的一水合餅（1 · 70mmol)在8mL EtOH中一起回流。90 分钟后，反应混合物被浓缩至干，加入CH2C12，并用NaHC0 3(撒)和盐水清洗，用Na2S〇4干燥并 浓缩成65mg(0 · 1 lmmol，100% )的暗无色油状物43。4 NMR(500MHZ，CDC13，δ来自 TMS): 7 · 67 (d,2H),7.60(t,lH),7.08(d,lH,4.09(d,lH)3.92(s,2H),3.81(d,1H),3.54-3.43(m,5H), 3.30(d,lH),2.71(t,br,lH),2.60(t,br,lH),2.17(d,2H),1.89(m,2H),1.43(s,18H),1.43 (s,9H) ,1.26(111,411),3(:1:?}匪R( 125.7MHZ，CD3C1，δ来自TMS) :172.0(两个重合的信号）， 171.8,160.7,137.0,122.0,119.3,80.51,80.50,63.6,61.6,56.5,53.7,53.3,47.9,28.3 (两个重合的信号），26 · 0，25 · 89iSI :m/z = 577 · 0[Μ+Η]+计算值:577 · 4。
[0223] 16-((4-硝基苯基磺酰胺基）甲基)吡啶-2-基）甲基4'，^〃-三叔丁基乙酸酯-1，2-环亚己基二胺（44)。在0°C于30分钟内向内含65mg(0 · 1 lmmol)的43和33mg(0 · 32mmol) 三乙基胺的搅拌中的5mL CH2C12添加28mg (0.13mmo 1)的4-硝基苯磺酰氯。16小时后，反应混 合物用NaHC03_)和盐水清洗，用Na2S〇4干燥并浓缩至干。LC-MS分析显示对应的氨基二砜是 主要产物。经制备型HPLC之后，纯44分离为4mg(0.05mmol，5%)油状残留物，该制备型HPLC 采用Phenomenex C18柱（10mm X 250mm);洗脱剂A:H2〇/0.1%TFA，B:MeCN/0.1%TFA;梯度 5 % ~70 %B，27分钟;流速:5mL/分钟。ESI:m/z = 762 · 0[M+H] + 计算值:762 · 4。
[0224] N-6_( (4-硝基苯基磺酰氨基）甲基)吡啶-2-基）甲基-N'，N〃，N〃-三乙酸酯-1，2-环 己基二胺(45)。使2mg(2.63ymol)的44在TFA中搅拌显示45的完全转化，LC-MS分析没有检测 出副产物<^51:111/2 = 594.0[]\1+!1]+计算值:594.2。
[0225] 表2.式(IX)化合物在37°C下于pH 7.4Tris缓冲液中的弛豫度(r^mT1。计）
[0226]
[0227] 表3.在37°C于pH 6.0MES缓冲液中，Mn(II)(lmM)被来自式（IX)和[Mn(CDTA)]2-化 合物的25mM Zn(II)替代的（s-4，速率(s-〇和t1/2。
[0228] Luzzv」 头施例4
[0230] 合成
[0231] 实施例4的合成方案可见图40.
[0232] Fmoc-Ty(0Bn)_C0NH2: (46):在0°C，将异丁基氯仿（1 · 52g，11 · 2mmol)添加至处于 1'册（10011^)中的卩111〇。-丁7(0821)-(：00!1(4.938，10.0111111〇1)、1甲基吗啉（《1，2.1(^，20111111〇1) 的混合物中，并在〇°C搅拌0.5小时。添加氨水(30%，1.2mL)，并使该反应混合物在0°C搅拌1 小时（反应溶液浑浊）。滤出沉淀物(产物和NMM · HC1盐），并向滤出物另添加1.2mL的水性 氨，室温下另搅拌0.5小时。使收集的固体悬浮于Et0Ac(200mL)，并回流10分钟。过滤不溶性 固体，并使滤液真空浓缩直至溶液变得浑浊。然后，将正己烷(50mL)添加至2.48g白色固态 沉淀物40。然后向滤液添加正己烷（8011^)以另沉淀2.048的产物（共4.528,92%)。 1!1匪1? (5001取，0)3(：1，3来自丁]\^):7.76((1，了 = 7.5!^，2!〇,7.54(^ = 8.1!^，2!〇,7.4卜7.36(111， 5H),7.35-7.29( m,3H),7.12(s,br,2H),6.91(d,J=7.7Hz,2H),5.56(s,br,lH),5.29(s, br,2H),5.02(s,2H) ,4.45-4.39(m, 2H) ,4.19(t ,J = 6.4Hz , 1H), 3.07-2.99(m, 2H) 〇130{^} 匪尺（125.7]\012，。〇3(：1，3来自丁]\^):172.96，157.93，143.69，143.64，141.32，136.86， 130.36，128.58，128.00，127.75，127.48，127.09，124.98，120.00,115.12，77.26，77.00， 76.75,70.02,66.91，53.61，47.19,37.54』51:111/2 493.4[]\1+!1]+计算值：493.2。
[0233] NH2_Ty (OBn) -CONH2 (47):将46(3.60g，7.3mmo 1)溶解于内含20 % 哌啶的DMF (40mL) 的溶液中，并室温搅拌2小时。真空去除溶剂，并使残留物重新溶解于EtOAc，并通过添加正 己烷来沉淀，以获得白色固体：1 · 9g (99 % )。咕MMR( 500MHZ，CD3C1，δ来自TMS): 7 · 43-7 · 31 (m，5H)，7.15(d，J = 8.5Hz，2H)，7.08(s，lH)，6.94(d，J = 8.5Hz，2H)，5.37(s，lH)，5.05(s， lH),3.58(dd ,J = 9.3,4.1Hz,lH),3.19(dd ,J=13.9,4.0Hz,lH),2.69(dd ,J=13.9,9.3Hz, 1H) ^CpH}匪R( 125.7MHZ，CD3C1, δ来自 TMS) :177.33,157.82,136.98,130.32,129.95， 128·60，127·99，127·46，115· 12,70.05,56.56,40.07』51 :m/z 271 ·3[Μ+Η]+计算值： 271.1。
[0234] 順2-了7((?11)-胺（48):使47(1.868,6.88臟〇1)悬浮于无水1'册（1〇1^)，并添加冊3· THF(1.0M，26mL)。该反应溶液在氮气气氛下回流12小时。该溶液于冰浴中冷却，并缓慢添加 甲醇以猝灭该反应。蒸发去除溶剂后，使黄色残留物重新溶解于HCl(1.0M，40mLWPEt 20 (50mL)，并室温搅拌1小时。移出有机层后，将水性溶液置于冰浴中，并通过添加 NaOH将pH上 调至12。该基础溶液用CH2Cl2(3X50mL)萃取，然后蒸发CH 2C12以获得浅黄色固体（1.39g， 79%)</H NMR(500MHZ，CD3C1，S来自TMS) :7.44-7.31(m，5H) ,7.11 (d，J = 8.5Hz，2H) ,6.92 (d J = 8.5Hz,2H),5.05(s,2H),2.96-2.88(m,lH),2.80-2.72(m,2H),2.53-2.43(m,2H)〇 13C {1田匪1?(125.7]\〇2,〇)3(：1，3来自丁]\^):157.36，137.10，131.51，130.14，128.56，127.92， 127.45，114.87,70.05,55.25,48.21，41.41』51:111/2 257.3[]\1+!1]+计算值：257.4。
[0235] N，N，N'，N'-3-(4-(苄氧基)苯基）丙烷-1，2-二胺-四-叔丁基乙酸酯（49):向内含 48 (1 · 39g，5 · 46mmo 1)、KI (906mg，5 · 46mmo 1)和DI PEA (5 · 64g，43 · 7mmo 1)的无水DMF (30mL)的 混合物添加溴乙酸叔丁基酯（8.52g，43.7mmol)，然后在50°C搅拌42小时，反应由LC-MS监 测。冷却后，真空移除DMF，并向残留物添加 H20(40mL)和Et0Ac(80mL)。分离有机层，用水和 盐水清洗，然后蒸发。残留物通过柱色谱(Si0 2，l%Et3N内含于己烷/Et0Ac = 2/l)纯化以获 得浅黄色油状产物（3MMR(500MHZ，CD3C1，δ来自 TMS) :7.41-7 ·22(ι?，5H)， 7.06(d,J=7.6Hz,2H),6.80(m,2H),4.95(s,2H),4.66(s,1H),4.52(m,1H),3.43(s,4H), 3.36(s,4H),3.23(m,lH),3.02(m,lH),2.78(m,lH),2.51(m,lH),1.44-1.27(m,36H), 13C pH}匪以125.7]\02，〇〇3(：1，3来自丁]\^):171.72，170.80，154.25，131.20，130.1，115.35， 81.20,81.05,63.40,56.30,55.20,53.65,35.65,28.20』51:111/2 713.5[]?+!1]+计算值： 713.4〇
[0236] Ν，Ν，Ν'，Ν'-4-(2,3-二氨基丙基）苯酚-四-叔丁基乙酸酯（50):将Pd/C(10%， 250mg)添加至内含49(60011^，0.84111111〇1)的160!1(201^)的溶液。反应混合物用!12气囊脱气三 次，并在室温下搅拌2小时，反应由LC-MS监测。混合物经过滤，并使滤液浓缩以获得浅黄色 油状物，其通过柱色谱进一步纯化:DCM/EtOAc(1 %Et3N，0-20 %，v/v)。无色油状物:460mg (74%)</H NMR(500MHZ，CD3C1，S来自TMS):7.07((1,J = 8.3Hz，2H) ,6.71 (d，J = 8.3Hz，2H)， 4.02(s,lH),3.49(d,J = 3.1Hz,4H) ,3.43(d,J = 3.3Hz,4H) ,3.12-3.03(m,zH) ,2.89(dd,J = 13.4,7.2Hz,2H) ,2.82(dd,J=13.8,5.6Hz,2H) ,2.62-2.51(m,2H),1.45(s,18H) ,1.41 (s, 18H) .WcpHlNMRUSS.TMHZ.CDsCl，δ来自 TMS): 171 ·39，170·95，153·78,132.35， 130.31,115.07,82.56,80.69,63.38,56.27,55.20,53.59,35.97,28.14〇ESI:m/z 623.4[M +扣+计算值：623.4。
[0237] N，N，N'，N'-4-(2,3-二氨基丙基）苯酚-四乙酸酯（51):将50(200mg，0.32mmol)溶 解于92.5 :2.5: 5比例的TFA、水和三异丙基硅烷(TIPS)的混合物中，然后使反应在LC-MS监 测下搅拌2小时。减压去除溶剂，残留物通过制备型HPLC纯化以获得白色固体（100mg， 78% )〇^ NMR(500MHZ,D2〇,5)：7.02(d ,J = 7.2Hz,2H), 6.73(d,J = 7.6Hz,2H) ,3.78-3.42 170.85,154.43,130.40,128.09,115.72,60.83,55.29,54.46,52.54,31.64〇ESI:m/z 399.3 [M+H] + 计算值：399.2。
[0238] Na [Μη (TyOH-EDTA) ] (52):该络合物原位制备。首先，将内含51 (8 · 3mg)的 2 · OmL HEPES缓冲液（100mM，pH = 7.4)与4.19mM MnCl2的HEPES溶液一同制备。这些溶液以不同比 例混合，并且在在1.4T检测溶剂水的T2。由1/T2对比[Μη]的曲线，确定准确配体浓度。在该 曲线中，1/Τ 2随[Μη]线性增加，直至[Μη]=[配体]，然后斜率以因子10增加。就该实施例而 言，[配体]是2.16mM。然后，使一等份的该配体溶液与内含0.95当量MnCl 2的HEPES缓冲液混 合，并用ICP-MS检测浓度。
[0239] 叔丁基保护的N3P3-(Ty0H-EDTA)6(53):于0°〇，在％下，向内含六氯环三磷腈 (4?5 · 6mg，0 · nimmol)的新鲜无水乙腈（2〇mL)添加 f51 (547mg，0 · 83mmol)和碳酸铯（3l8mg， 0.97mmol)。反应混合物在45°C搅拌两天，然后采用1H NMR(产物在δ = 6.90处有正Η峰，对比 起始物质在δ = 6.73处)和31P NMR(存在δ = 7.81峰)监测该反应。在混合物冷却至室温后，离 心去除盐，并使澄清溶液在减压下浓缩并经快速色谱（l%Et3N，DCM/EtOAc)以获得浅黄色 油状的六聚体_叔丁基醚（42011^，82%)。 1!1匪1?(50冊!12,03(：1，3来自1]\^):7.07((1，了 = 8.3Hz,12H) ,6.90(d,J = 8.6Hz,12H) ,3.47(d,J = 8.3Hz,24H) ,3.43(d,J = 4.9Hz,24H), 3.11-3.07(m,6H),2.93-2.83(m,12H),2.63-2.53(m,12H),1.43(s,108H),1.39(s,108H)〇 UcpH}匪R( 125.7MHZ，CD3C1, δ来自 TMS) :171.31,170.94,130.15,120.69,80.66,80.56， 63.42,56.35,55.40,53.65,28.26,28.24。 3^ 匪R(202MHZ，CD3C1，δ) UUESIzm/z 1934 · 0 [M+2H]2+计算值：1933 · 6。
[0240] N3P3-(Ty0H-EDTA)6(54):使53(410mg，0 · 1 lmmol)溶解于比例为82 · 5: 5: 5的TFA、 水、茴香硫醚、苯酚和乙二硫醇的混合物中，并使反应溶液室温搅拌12小时，反应由LC-MS监 测。该溶液于冰浴中冷却，然后添加二乙基醚(50mL)以使产物沉淀。沉淀的产物通过离心分 离，并用醚清洗三次以获得白色固体（19511^，77%)。 1!1匪1?(5001012,020,6):7.15((1，1 = 8.2Hz,12H),6.84(d,J = 8.2Hz,12H) ,3.69(d,J=16.7Hz,12H),3.55(m,24H) ,3.45(d,J = 174.12,171.36,163.06,162.78,148.66,133.63,130.78,121.30,117.43,115.11,61.16， 57.08,54.88,54.61，31.71。3中 NMR(202MHZ，D2〇j):8.57。
[0241] Mn6[N3P3-(Ty0H-EDTA)6](55):该络合物原位制备。首先，将内含54(11.3mg)的 2 · OmL HEPES缓冲液（100mM，pH = 7 · 4)的溶液与4 · 19mM MnCl2的HEPES溶液一同制备。这些 溶液以不同比例混合，并在1.4T检测水溶剂的Τ2&如关于化合物48所述确定六聚体配体的 浓度。因为该六聚体配体包含6个EDTA部分，一个六聚体配体将结合6个当量的Μη。基于该结 果，随后使6〇11^的六聚体配体与24.311^的111(]12*4!12〇在2.〇1111^去离子水中混合，并通过添加 0.2Μ NaOH小心调节pH至7.4。这代表着MnCl2的小幅（2 % )过量以确保全部螯合。通过使溶 液通过阳离子交换柱以11仏(*，1(：-似），从阴离子六聚体络合物分离过量的此2+，以去除过 量的Mn 2+。通过冻干获得终产物为白色固体(60mg，85 % )。
[0242] 式(XI)和(XII)的化合物的弛豫度在37°C下于pH 7.4HEPES缓冲液中以不同场强 度测定。对于不同的Μη浓度，从Ι/h对比[Μη]的曲线的斜率获得弛豫度。因为式(XI)包含6 个Μη/分子，离子(/Μη)和分子(/分子)弛豫度如下所示。
[0243] 表4.在37°C于pH 7.4HEPES缓冲液中检测的不同场强度的式(XI)和(XII)化合物 的弛豫度(ri以rnirY1计）。
[02441
ND =未检测到
[0246] 因此，本发明提供用于磁共振成像的造影剂，以及用于制备所述造影剂的方法。
[0247] 尽管已经参考某些实施方式相当详细地描述了本发明，但是本领域技术人员应理 解，可以通过不同于所述实施方式的方式实施本发明，本文所述的实施方式是为了举例说 明，而没有限制的作用。因此，所附权利要求书的范围不应限于本文包含的实施方式所述的 内容。
【主权项】
1. 一种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(I)的化合物：或所述化合物的药学上可接受的盐，或所述化合物的位置异构体，其中R2连接至苯环上 的不同的碳， 其中R1选自下组:取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的 杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基芳烃，和二亚烷 基杂芳烃， 其中R2选自下组:氣、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、卤素、氛基、硝 基、羟基和烷氧基， 其中η是2或3,和 其中，当η是2时，所述化合物任选地包含配位至Mn的水。2. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(II):.〇3. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(III):O4. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(IV):Q5. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(V):'66. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(Va):〇7. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(Vb):b8. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R1是亚乙基。9. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R2是甲氧基。10. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R2是硝基。11. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R1是环亚己基。12. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： R1和R2中至少一个包含能够靶向对象中的感兴趣区域的靶向部分。13. 如权利要求12所述的造影剂，其特征在于： 所述靶向部分选自蛋白质、酶、肽、抗体和药物。14. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。15. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： 当η = 2时，所述造影剂具有较高弛豫度。16. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： 所述化合物能在体内从其中η = 3的式(I)转化成其中η = 2的式(I)。17. 如权利要求1所述的造影剂，其特征在于： 所述化合物能在体内通过生物学还原剂从其中η = 3的式(I)转化成其中η = 2的式(I)。18. 如权利要求17所述的造影剂，其特征在于： 所述生物学还原剂是谷胱甘肽。19. 如权利要求1所述的造影剂，其还包含： 药学上可接受的运载体，所述药学上可接受的运载体包括用于使所述化合物从其中η =3的式(I)还原成其中η = 2的式(I)的还原剂。20. -种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(VI)的化合物：或所述化合物的药学上可接受的盐，或所述化合物的位置异构体，其中R4连接至苯环上 的不同的碳， 其中R1选自下组:取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的 杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基芳烃，和二亚烷 基杂芳烃， 其中R3选自下组:取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的 杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的杂亚芳基、二亚烷基芳烃，和二亚烷 基杂芳烃， 其中R4选自下组:氣、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、卤素、氛基、硝 基、羟基和烷氧基， 其中X是N或NH， 其中，当X是NH时，所述化合物任选地包含配位至Mn的水，和 其中，当X是N时，X配位至Mn。21. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(VII):〇22. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(VIII):323. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于： 当所述造影剂暴露至pH变化的环境时，pH降低时，弛豫度增高。24. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于： R1和R4中至少一个包含能够靶向对象中的感兴趣区域的靶向部分。25. 如权利要求24所述的造影剂，其特征在于： 所述靶向部分选自蛋白质、酶、肽、抗体和药物。26. 如权利要求20所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。27. -种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(IX)的化合物：〇28. 如权利要求27所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。29. -种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(X)的化合物：或所述化合物的药学上可接受的盐， 其中R5是核结构，和 其中η是1~12的整数。30. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： R5是环状主链。31. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： R5是磷臆。32. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： R5 是 Ν3Ρ3。33. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： η是6 〇34. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。35. 如权利要求29所述的造影剂，其特征在于，所述化合物具有式(XI):Q36. -种用于磁共振成像的造影剂，所述造影剂包含式(XII)的化合物：或所述化合物的药学上可接受的盐。37. 如权利要求36所述的造影剂，其特征在于： Mn是发射正电子的锰同位素。38. 如权利要求1~37中任一项所述的造影剂，其特征在于： 所述化合物的每个-锰离子η弛豫度大于O . SmiT1iT1，或大于O . SmiT1iT1，或大于1.0 miT 1S-1，或大于 1 · 5mM-1S-1，或大于 2 · OmM-1S-1，或大于 2 · 5mM-1S-1，或大于 3mM-1S-1，或大于 4mM-1S -1，或大于5mM-V1，或大于6mM- 1，或大于7mM-1S-1，或大于8mM-V1，或大于9mM- 1S-1，或大于 10mM-V、39. -种用于对象的体内成像的方法，所述方法包括： (a) 给予所述对象权利要求1~37中任一项所述的造影剂； (b) 等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点处累积的一段时间;和 (c) 采用非侵入性成像技术对所述细胞或组织成像。40. 如权利要求39所述的方法，其特征在于： 所述非侵入性成像技术选自：磁共振成像，或采用磁共振成像的正电子发射断层摄影。41. 如权利要求39所述的方法，其特征在于： 所述非侵入性成像技术是采用磁共振成像的正电子发射断层摄影，且 步骤(a)包括给予所述对象权利要求14、26、28、34或37中任一项所述的造影剂。42. -种对对象中的感兴趣区域成像的方法，所述方法包括： (a) 给予所述对象权利要求1~37中任一项所述的造影剂； (b) 使所述对象置于磁系统中，该磁系统被设置以产生围绕对象的至少部分的极化磁 场； (c) 对设置以向该极化磁场施加梯度场的多个梯度线圈通电； (d) 控制射频(RF)系统，该射频(RF)系统被设置以向所述对象施加激励场，并从所述对 象采集磁共振(MR)图像数据;和 (e) 由所述MR图像数据重构所述感兴趣区域的图像。43. 如权利要求42所述的方法，所述方法还包括 (f) 采用多个检测器检测由所述对象发出的γ射线，并对应于检测到的γ射线进行信 号通信;和 (g) 由所述信号重建所述对象的感兴趣区域的一系列医学图像， 其中步骤(a)包括，给予所述对象权利要求14、26、28、34或37中任一项所述的造影剂。44. 一种对已经给予一个剂量的造影剂的对象成像的方法，所述方法包括： 使所述对象置于磁系统中，该磁系统被设置以产生围绕对象的至少部分的极化磁场； 对设置以向该极化磁场施加梯度场的多个梯度线圈通电； 控制射频(RF)系统，该射频(RF)系统被设置以向所述对象施加激励场，并由所述对象 采集磁共振(MR)图像数据;和 由所述MR图像数据重构所述对象的图像， 其中所述造影剂包括权利要求1~37中任一项所述的造影剂，和 其中，给予所述造影剂的对象中的分子具有的改良的纵向弛豫时间，这在图像中得以 反映。45. -种用于感测对象中生物学还原剂的方法，所述方法包括： (a) 给予所述对象权利要求1~19中任一项所述的造影剂，其中η是3; (b) 等待足以允许所述造影剂在待成像的组织或细胞位点处累积的一段时间;和 (c) 用磁共振成像对所述细胞或组织成像， 其中，给予了所述造影剂的所述对象中的包含生物学还原剂的细胞或组织具有改良的 纵向弛豫时间，这在图像中得以反映。46. 如权利要求45所述的方法，其特征在于： 所述生物学还原剂是谷胱甘肽。47. -种检测对象中具有不同pH水平的感兴趣区域的方法，所述方法包括： (a) 给予所述对象权利要求1~28中任一项所述的造影剂； (b) 等待足以允许所述造影剂在待成像的感兴趣区域处累积的一段时间;和 (c) 用磁共振成像对所述感兴趣区域成像， 其中，给予了所述造影剂的所述对象中具有不同pH水平的感兴趣区域具有改良的纵向 弛豫时间，这在图像得以反映。48. 如权利要求47所述的方法，其特征在于： 当所述造影剂暴露至pH变化的环境时，pH降低时，弛豫度增高。
【专利摘要】公开了作为磁共振探针和生物学还原剂传感器的锰配位络合物。在一个实施方式中，配体可使Mn2+和Mn3+氧化态稳定化。在还原剂例如谷胱甘肽的存在下，低弛豫度MnIII-HBET被快速转化成高弛豫度MnII-HBET，其弛豫度增加3倍，并且伴随磁共振信号的增强。在另一个实施方式中，设计配体以使其以热力学稳定和动力学惰性方式螯合Mn(II)，同时允许Mn(II)与水直接相互作用。而在另一个实施方式中，制备包含六个Mn(II)螯合剂的高分子量多聚体。该高分子量导致分子在溶液中的翻转较慢，并且显著增强Mn(II)弛豫度。
【IPC分类】A61K49/06, A61K49/00, C07F13/00
【公开号】CN105492449
【申请号】CN201480012793
【发明人】P·卡拉文, E·M·盖尔, G·S·洛文, S·慕克吉, 朱江
【申请人】通用医疗公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年1月7日
【公告号】EP2941434A1, US20150336996, US20150336997, WO2014107722A1
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