用于治疗糖尿病的修饰的ingap肽的制作方法
用于治疗糖尿病的修饰的ingap肽的制作方法
【专利说明】
[0001 ] 优先权要求
[0002] 本申请要求2013年2月15日提交的美国临时专利申请第61/765,203号的优先权， 其内容被明确地引作参考。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于治疗和预防糖尿病的具有胰岛辟田胞新生或再生活性的INGAP肽 及其组合物和方法。
【背景技术】
[0004] 糖尿病影响了全世界超过1亿的个体。在美国，那些被糖尿病影响的患者的估计的 医疗费用为大约每年1360亿美元。糖尿病为新陈代谢紊乱，其具有胰腺不能分泌足够量的 胰岛素的特点，其引起血糖水平的大波动并且既具有短期又具有长期的生理后果。在患有1 型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病或IDDM)的患者中起因于升高的血糖水平(高血糖症）的长 期并发症包括视网膜病、神经病、肾病和其他血管并发症。低的血糖水平(低血糖症)会导致 糖尿病昏迷、癫痫发作、意外事件(accidents)、缺氧、脑损害、认知功能下降和死亡。
[0005] 2型糖尿病，也已知为非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM，是一种进行性疾病，其具有 受损的葡萄糖代谢的特点，该受损的葡萄糖代谢引起升高的血糖水平。患有2型糖尿病的患 者呈现出受损的胰腺β细胞功能，该受损的胰腺β细胞功能引起在对高血糖信号做出响应 时，胰腺辟田胞不能分泌合适量的胰岛素；以及在它的靶组织中对胰岛素作用的抵抗(胰岛 素抵抗）。
[0006] 现在2型糖尿病的治疗目的在于逆转胰岛素抵抗，控制肠葡萄糖的吸收，正常化肝 脏葡萄糖的生产和提高辟田胞葡萄糖感知以及胰岛素分泌。因为现在糖尿病治疗的缺点，1 型和2型糖尿病的新疗法以及新的诊断和预后方法是亟需的。
[0007] 越来越多的证据表明不足的辟田胞团构成1型和2型糖尿病的起因。因此，在糖尿病 患者中细胞的再生是糖尿病研究的重要目标。近些年，有越来越多的兴趣在开发诱导辟田 胞再生和新的胰岛原位形成的新策略上（Baggio，L. L.和Drucker，D. J .，2006，Annu Rev Med ,57:265-281 )。因此，具有刺激剩余的β细胞团扩大的能力或具有胰岛新生活性的生物 活性分子的鉴定对于控制原生胰腺(native pancreas)的再生潜能是关键性的。
[0008] 胰岛新生相关蛋白（INGAP)是最初在部分阻塞的仓鼠胰腺的粗提物中发现的一种 16.8kDa蛋白（Rosenberg，L.等人，1988，Diabetes,37:334-341;美国专利第5,834,590号）。 INGAP在胰腺和十二指肠中表达，并且在几个物种中已经表现出诱导胰岛新生(Rosenberg, L.等人，1996 ,Diabetologia,39: 256-262 ;Rosenberg,L.等人，2004,Ann Surg 240 :875-884)。在结构上，INGAP是分泌的C型外源凝集素 Reg家族的一员，该家族含有多于25个成员， 基于一级序列被分为4个亚家族（21^1^，￥.￥.等人，2003，￥〇1'1(116381：1'〇611丨61'〇1，9:2635-2641;0kamoto，H.，1999，J Hepatobiliary Pancreat Surg 6:254-262)。
[0009] INGAP属于大的Reg 3亚家族，其已经在大鼠、小鼠、仓鼠和人的主要胃肠组织(胰 腺、胃、肝脏）中被识别（Rafaeloff，R.等人，1997，J Clin Invest 99:2100-2109)。尽管Reg 蛋白普遍存在，但是关于它们的功能或作用机制知道的不太多。虽然Reg 1被认为是辟田胞 促分裂原，但是关于Reg 3家族的功能知之甚少。
[0010]大量研究提示Regs可以结合特异性细胞表面受体并激活多个信号通路。支持这个 受体假说的一个论点是INGAP的生物活性看起来是由该蛋白的一个15个氨基酸片段(氨基 酸104-118)介导的，即INGAP肽（INGAP-P)，其由高度保守的IGLHDP基序和在Reg家族的其它 成员中没有被发现的单一序列SHGTLPNGS组成(Rafaeloff，R.等人，1997, J Clin Invest 99:2100-2109)。合成的INGAP肽已经被证明在仓鼠和小鼠中诱导新的胰岛形成和逆转链脲 霉素诱导的糖尿病上如所述蛋白质一样有效(Rosenberg，L.等人，1996, Diabetologia, 39: 256-262;Rosenberg，L·等人，2004，Ann Surg 240:875-884)，并且因此是所述受体的可能 配体。合成的INGAP-P的生物效应在体外和体内均被广泛研究。至今，已经显示INGAP-P: 1) 在从去分化的、胰岛来源的导管样结构诱导功能性的人胰岛的体外再生(Jamal，A.M.等人， 2005，Cell Death Differ ,12:702-712); 2)剂量依赖地刺激啮齿目动物、狗和食蟹猴中β细 胞团的扩大（Lipsett，M.等人，2007，Cell Biochem Biophys，48:127-137;Pittenger，G.L. 等人，2007，Pancreas，34:103-111)和3)增加胰岛素的分泌和β细胞尺寸以及在体外上调大 鼠新生胰岛中与β细胞功能相关的几种基因的表达(Barbosa，Η.等人，2006，Regul Pept， 136:78-84 ;Borelli，M. I ·等人，2005，Regul Pept, 13 1:97-102)。这些重要的结果跟随有 临床试验以研究它在人中的功效和安全性，其中INGAP-P被发现有改善葡萄糖动态平衡的 信号效果，其被在患有2型糖尿病的患者中在90天中糖基化血红蛋白（HbAlC或A1C)减少和 在患有1型糖尿病的患者中C-肽分泌的显著增加所证实(Dungan，K.M.等人，2009，Diabete S Metab Res Rev,25:558-565)〇
[0011]尽管这些数据提示INGAP-P既具有胰岛新生活性又具有促胰岛素活性，从动物研 究和人类实验显而易见INGAP(INGAP-P)的15-mer缺乏稳定性。相应地，为了达到所要求的 血清和组织阈值水平，必须以非常大的剂量给药。不良的稳定性也导致(比如)药物制剂、局 部注射部位反应的患者接受和高费用的问题。因此，存在与INGAP-P相比具有可比的或更大 的体内生物活性和/或更大的稳定性或更长的半衰期的INGAP类似物的需要。
【发明内容】
[0012]以前我们识别了一种叫做胰岛新生相关蛋白（INGAP)的胰腺蛋白，该蛋白是REG3 蛋白的跨种哺乳动物家族的一员（参见图19)，并且可以诱导胰岛再生仓鼠模型中的导管细 胞分化为β胰岛细胞(Rosenberg，L·等人，J Surg Res，1983，35:63-72;Rosenberg，L·等人， Diabetes，1988，37: 334-341 ;Rosenberg，L.等人，Diabetologia, 1996，39: 256-262)。一种 含有氨基酸104-118的INGAP蛋白的15-mer肽片段(INGAP-P)被确定为INGAP的生物活性中 心。
[0013] INGAP和INGAP-P均被证明能诱导导管细胞分化为胰岛。在人的胰岛再生体外模型 中，INGAP-P诱导胰腺发育转录因子PDX-1的增强表达和新的胰岛的同时形成(Jamal，A.M. 等人，Cell Death Differ.，2003，10:987-996;Jamal, Α·Μ·等人，Cell Death Differ·, 2005，12:702-712)。在动物模型中，INGAP-P诱导导管细胞体外增殖和胰岛细胞从与导管上 皮相关的细胞的再生，导致在正常成年小鼠、仓鼠和狗的胰腺中新的胰岛形成。在STZ(链脲 佐菌素)处理的糖尿病C57BL/6J小鼠模型中，INGAP-P逆转了糖尿病症状(Pittenger，G.L. 等人，Pancreas ,2007,34:103-111; Rosenberg，L ·等人，Ann · Surg ·，2004，240 :875-884 (2004) ;Kapur，R.等人，INGAP Induces Duct Cell Proliferation In Vitro and beta Cell Formation in Normal Non Diabetic Mice,71st ADA Meeting,圣地亚哥，2011)。在 已建立的（不是新开始的）自身免疫的1型糖尿病(T1DM)的NOD小鼠模型中，与免疫调节剂 IL-12抑制剂利索茶碱结合的INGAP-P诱导高血糖症的减轻并根除了对胰岛素颗粒的需要 (Tersey，S.A.等人，Unique Drug Combination for Reversal of Type IDiabetes,68th Scientific Sessions American Diabetes Association(ed.ADA)，旧金山，加利福尼亚， 2008;Tersey，S.A.等人，Journal of Diabetes Mellitus,2012,已付印）。组织学检查证实 了新的胰岛的证据。
[0014] 在人类实验中，INGAP-P已经在1型糖尿病(T1DM)患者和2型糖尿病(T2DM)患者的1 期和2期研究中被评价(Dungan，K.M.等人，Diabetes Metab Res Rev,2009,25:558-565)。 每日一次INGAP-P注射3个月引起在T1DM患者中所刺激的C-肽分泌在统计学上的显著增加 以及在T2DM患者中增加的C-肽水平的趋势。糖基化血红蛋白（HbA lc)在T2DM患者中-0.6 % (p 〈0.0125)的减少并在T1DM患者中-0.4% (p〈0.06)的减少。
[0015]尽管这些高度有希望的结果，INGAP-P的相对短的血浆半衰期继续表现出对于 INGAP-P作为治疗药的用途的挑战。
[0016] 相应地，本文提供保留INGAP-P的一种或多种生物活性并且适于作为治疗药开发 的INGAP肽。在一个实施方式中，本发明的肽具有与INGAP-P相比可比的或更大的体内生物 活性和/或更大的稳定性或更长的半衰期。
[0017] 在一个实施方式中，本文提供包含SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列的肽。 [0018]在另一个实施方式中，本文提供由SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列组成的 肽。
[0019] 在一些实施方式中，本发明的肽诱导胰腺辟田胞新生，诱导胰腺辟田胞再生，提高葡 萄糖动态平衡和/或逆转个体中的高血糖症。
[0020] 本文还提供本发明的肽的类似物、同系物、片段或变体，其中所述类似物、同系物、 片段或变体具有所述肽的生物活性。类似物、同系物、片段或变体可以具有与本发明所述肽 的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。所述生物 活性可以是(比如)所述肽的细胞或受体结合特异性、诱导胰腺β细胞新生的能力、诱导胰岛 细胞再生的能力、改善葡萄糖动态平衡的能力和/或逆转个体中高血糖症的能力。
[0021] 也提供含有编码本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体的核酸序列的核酸 分子。核酸分子可以可操作地连接到一个表达控制序列以形成一个表达载体，其中所述表 达载体在合适的细胞中增殖。
[0022] 也提供包含本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体以及药学上可接受的载 体或赋形剂的药物组合物。在一个实施方式中，组合物被改为适于口服。在另一个实施方式 中，组合物被改为适于通过注射给药。
[0023] 在另一个实施方式中，提供包括对需要其的个体给药本发明的肽或其类似物、同 系物、片段或变体或组合物的预防或治疗胰腺症状或疾病的方法。在一个实施方式中，所述 症状或疾病为新陈代谢紊乱。在另一个实施方式中，所述症状或疾病为细胞相关的紊乱。 在更进一步的实施方式中，所述症状或疾病为1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病的并发症。
[0024] 在一些实施方式中，由凋亡或坏死引起的辟田胞死亡在个体中通过给药本发明的 肽或其类似物、同系物、片段或变体或组合物被阻止或抑制。在其他实施方式中，个体中的 胰腺细胞的功能被改善或恢复，个体中的血浆胰岛素水平是增加的，个体中的胰腺β细胞的 量或尺寸是增加的，个体中胰腺导管细胞来源的β细胞再生是被刺激的，个体中的葡萄糖动 态平衡被恢复或改善和/或个体中的高血糖被逆转。
[0025] 本发明的肽和组合物可以通过注射、口服、静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给药。在 一个实施方式中，肽和组合物是口服给药的，每天一次。
[0026] 在一个特别的实施方式中，个体为人。
[0027] 在一些实施方式中，本发明的肽是与第二治疗剂给药的。第二治疗剂可以与本发 明的肽伴随给药，或第二治疗剂和肽可被顺序给药。在一个实施方式中，第二治疗剂对于1 型或2型糖尿病是治疗性的。在另一个实施方式中，第二治疗剂为阿那白滞素。
[0028] 还提供了用于治疗胰功能不全的药物组合物，该组合物含有本发明的肽和药学上 可接受的载体或赋形剂。在一个实施方式中，肽或组合物能刺激胰腺导管细胞来源的β细胞 再生。在另一个实施方式中，肽或组合物具有哺乳动物INGAP蛋白的生物活性。在一个实施 方式中，生物活性是刺激胰腺导管样细胞或导管相关的细胞生长和增殖的能力。
[0029] 还提供了编码本文描述的本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体的核酸分 子。核酸分子可以（比如)被连接到一个表达控制序列以形成一个表达载体，其中所述表达 载体在合适的细胞中增殖。
[0030] 在又一个实施方式中，本发明提供含有本文描述的肽或其类似物、同系物、片段或 变体以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
[0031] 本文还提供用于预防或治疗胰腺症状或疾病的方法，该方法包括对需要其的个体 给药本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体。在本文提供的方法中，个体可以是（比 如)啮齿目动物、犬科动物、猪、灵长目动物或人。
[0032] 在一个实施方式中，症状或疾病为新陈代谢紊乱，比如细胞相关的紊乱。症状或 疾病可以是1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病的并发症。
[0033] 在另外的实施方式中，个体中的β细胞凋亡被阻止或抑制;个体中的胰腺细胞的功 能被改善或恢复;个体中的血浆胰岛素水平增加;和/或个体中的胰腺细胞的数量或尺寸增 加。在一个具体的实施方式中，所述胰腺细胞为β细胞。
[0034] 在又一个实施方式中，辟田胞新生被刺激和/或个体中的葡萄糖动态平衡改善和/ 或个体中的胰岛素是增效的。
[0035] 附图简述
[0036] 本发明的【具体实施方式】现在会通过实施例和参考随附的附图的方式被解释。
[0037]图1显示了RIN-m5F细胞中INGAP在增殖上的效果。（A):INGAP增加了溴脱氧核苷尿 嘧啶(BrdU)掺入。在小室载玻片上用指示量的INGAP-P或r-INGAP处理RIN-m5F细胞24小时。 Exendin 4(Ex4)和表皮生长因子(EGF)用作对照。在处理的最后三小时加入50μΜ BrdU，接 着在甲醇中固定和进行BrdU免疫染色。数据以INGAP处理的比未处理的对照中BrdU( + )细胞 的比例（％)进行表示。结果是3个独立实验的平均值土标准误差（S.E.)(*:p〈0.05，§:p〈 0.001，与未处理的对照相比）。（B): INGAP诱导RIN-m5F中Erk 1 /2的磷酸化。用INGAP处理接 种在60mm组织培养板上的RIN-m5F细胞（1 X 106)，持续指示的时间。用抗Erkl/2磷酸 (Thr202/Tyr204)抗体探测印迹（30yg蛋白质），接着清除/用抗总Erkl/2抗体（Cell Signaling)再探测，并使用ImageJ软件通过密度计量学定量。（C):量化相对的Erkl/2磷酸 化，该相对的Erkl/2磷酸化作为磷酸Erkl/2对总Erkl/2的比例被测定，并表示为相对于 Omin时间点的倍数变化。结果是3至8个独立实验的平均值土标准误差: p〈0.05，§ : p〈 0.01，1: P〈〇. 〇〇 1; t:仅针对所示的时间点，进行两个实验）。
[0038]图2显示了荧光标记的rINGAP在细胞表面形成帽（cap)。接种在小室载玻片上的 RIN-m5F细胞在37°C或在冰上用50nM经DyLight 488活性染料标记的rINGAP孵育所示的时 间，并于冰上在4%多聚甲醛中固定。（A):在冰上预冷细胞15min，并与rINGAP和CTB (AlexaFluor-594，5μg/ml，Invitrogen)孵育30min。（B):同样地用转铁球蛋白（25μg/ml， Texas Red, Invitrogen)。（C)、（D) :37°C下分别用CTB和转铁球蛋白孵育lh。（E)、（F):用标 记的rINGAP将细胞孵育5h或24h，并在最后一小时用50nM LysoTracker Red DND99(LT, Invitrogen)共染色。细胞核用包含在封固剂(Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI复染。 用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。标尺为20μπι。
[0039] 图3显示了荧光标记的rINGAP的结合和内化被100ηΜ的渥曼青霉素和细胞松弛素 D 部分抑制，提示巨胞饮(macropinocytosis)。在渥曼青霉素（100nM)或细胞松弛素 D(25yg/ ml)存在下，接种在小室载玻片上的RIN-m5F细胞用50nM经DyLight 488活性染料标记的r-INGAP孵育5h，并在4%多聚甲醛中固定。(A) :rINGAP，没有抑制；（B):阴性对照；（C):渥曼青 霉素；（D):细胞松弛素 D。细胞核用包含在封固剂(Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI复 染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。
[0040] 图4显示了 FAM标记的INGAP-P被快速地内化到RIN-H15F细胞的细胞质。用FAM标记 的INGAP-P将生长在小室载玻片中的细胞处理指示的时间，并用4%PFA固定。(A)、（B)、(D)、 (F):细胞用Lysotracker染色lh，如图2中。（C)、（E):固定的细胞用0· 1 %Triton_X100渗透 10min，4°C下在5%羊血清中封闭并用抗EEAl兔第一抗体(Abcam，l:200)探测过夜，接着在 室温下用第二驴抗兔DyLight594结合的抗体（1:500)探测111。细胞核用包含在封固剂 (Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI复染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。 [0041 ]图5显示了 FAM-INGAP-P的内化被细胞松弛素 D抑制，但不被渥曼青霉素抑制。在细 胞松弛素 D(25μg/ml)或渥曼青霉素（ΙΟΟηΜ)存在下，用FAM标记的INGAP-P(16.7yM)将生长 在小室载玻片中的细胞处理lh，并固定和如本文所描述的照相。（A):FAM-INGAP-P;(B): DMS0对照；（C):细胞松弛素 D; (D):渥曼青霉素。
[0042]图6显示了对荧光标记的rINGAP和INGAP-P的结合和内化的摩尔过量竞争分析 (molar excess competition assay)。接种在小室载玻片上的RIN_m5F细胞用FAM-INGAP-P 孵育lh(左列）或用DyLight-488rINGAP孵育5h(右列）（A、B):无抑制；（C、D):用 167μΜ(10倍 摩尔过量)的INGAP-P; (E、F):用1μΜ(20倍摩尔过量)的rINGAP。
[0043] 图7显示了被INGAP-P和r-INGAP诱导的信号事件中Ras-Raf活化的参与。（A):用 Ras-GTP ELISA测量Ras活化。1 X 106个细胞接种在60mm板上48h，接着在无血清培养基中饥 饿2处。371下用生长因子将细胞处理指示的时间。然后将板放在冰上，并在用150μ1含有蛋 白酶抑制剂混合物(ΝΕΒ)的Mg+裂解缓冲液裂解细胞之前用冰冷的PBS清洗。10μ1细胞裂解 物用于Ras-GTP ELISA，并且读数用蛋白质的量标准化(DC蛋白质分析，Biorad)。结果显示 为相对于Omin时间点的倍数变化(Omin时间点为1)并且显示虚线水平线。结果为至少3个独 立实验的平均值土标准误差: P〈〇 . 05，§: p〈0.01，H : p〈0.001，与Omin对照相比）。（B): c-Raf磷酸化的倍数变化，其用蛋白质印迹(Western blot)/密度计量学（ImageJ)测定，作为 磷酸与总的cRaf的比例并且相对于Omin时间点进行计算，显示为虚线水平线（ = 1)。结果为 至少3个独立实验的平均值土标准误差(*: p〈0.05，§: p〈0.01，: p〈0.001)。
[0044] 图8显示了药理学抑制剂对INGAP、EGF和Ex-4引起的Erkl/2磷酸化的效应。将IX 1 〇6个细胞接种在60mm板上48h，接着在无血清培养基中饥饿24h。加入生长因子之前，除百 日咳毒素(Ptx)(预处理24h)之外，细胞用指示的抑制剂预处理30-40min。用生长因子处理 l〇min之后，将细胞置于冰上并裂解，如在实验步骤中所描述的。用磷酸Erkl/2抗体(或在清 除后用总Erk抗体)孵育印迹(30yg蛋白质），并用ECL试剂显色。如上文所描述的进行相对于 总的Erk和时间Omin对照（ = 1，显示为有点的线）的Erk磷酸化的量化。（A) :GPCR(Ptx， 100ng/ml)、腺苷酸环化酶（SQ22536，250μΜ)和PKA(PKi，100ηΜ;Η89，ΙμΜ)的抑制剂。（B):PKC (Bis，ΙμΜ)、PI3K(Wm, lOOnM)、Src(PP2，lOOnM)、EGFR(AG1478，ΙΟΟηΜ)的抑制剂和Raf抑制剂 1 (R-l，ΙΟΟηΜ)或DMSO作为溶剂(*:p〈0 · 05)。
[0045]图9显示了 GPCR信号传递的抑制引起减少的Ras活化。在加入生长因子处理1、3、5 和lOmin之前用Ptx将生长在60mm板上的RIN-m5F细胞预处理24h。收获Mg+裂解缓冲液中的 细胞并经受Ras-GTP ELISA，如图4中所描述。结果为至少3个独立实验的平均值土标准误差 (*:ρ〈0·05，§:ρ〈0·01，H:ρ〈0·001)。
[0046] 图10显示了 rINGAP结合的活体成像。时间进程如下所示：（A) :0min; (B) :2min; (C) :5min; (D): 15min; (E) :20min和(F) :30min;白色粗箭头指示膜结合的INGAP;细箭头指 示细胞内的INGAP以及红箭头指示死亡的细胞。用蔡司LSM-510META共聚焦显微镜获取图 像。·
[0047]图11显示了rINGAP既不与网格蛋白（A)共定位也不与小窝蛋白（B、C)共定位。用 DyLight-594-rINGAP孵育细胞l、15min(A、B)或3h(C)，在4%PFA中固定并在4°C用兔抗网格 蛋白或抗小窝蛋白抗体探测，接着用FITC标记的羊抗兔第二抗体检测。细胞核用包含在封 固剂(VECTASHIELD HardSet封固剂）中的DAPI复染。用蔡司LSM-510META共聚焦显微镜获取 图像。箭头尖指示膜结合的rINGAP，并且箭头指示细胞内的rINGAP。
[0048]图12显示了暴露lh后的DyLight 488标记的rINGAP的内化，接着清洗并在标记的 INGAP不存在下经历5h(A)或24h(B)的追踪期(chase period)。在4%PFA中固定之前lh加入 LysoTracker Red DND99(50nM)。细胞核用包含在封固剂（VECTASHIELD HardSet封固剂，载 体)中的DAPI复染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。
[0049] 图13显示了在孵育lh后连续暴露24h的FAM-INGAP-P的内化(A)或24h追踪(B)。在 4%PFA中，在固定前lh加入LysoTracker Red DND99(50nM)。细胞核用包含在封固剂 (VECTASHIELD HardSet封固剂载体）中的DAPI复染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图 像。
[0050] 图14显示了在冰上和在脂筏抑制剂菲律宾菌素 (Calbiochem)存在下INGAP-P的内 化被抑制。在37°C(A)或在冰上(B)或在lμg/ml菲律宾菌素存在下用FAM-INGAP-P处理在8孔 小室载玻片上生长的RIN-m5F细胞lhdNGAP-P显示为绿色。细胞核用包含在封固剂 (VECTASHIELD HardSet封固剂）中的DAPI(蓝色)复染。用蔡司LSM-510META共聚焦显微镜获 取图像。
[0051 ] 图15显示了用INGAP、EGF和Ex-4处理的RIN-m5F细胞中Akt磷酸化的量化。根据制 造商的用法说明，来自用于Ras-GTP ELI SA的在Mg+裂解缓冲液中制备的样品的细胞裂解物 通过Akt ELISA(微孔过滤器(Millipore))分析，并用蛋白质的量标准化，如本文所描述。结 果显示相对于时间0( = 1，显示为虚线）的倍数变化，并且为至少3个独立实验的平均值土标 准误差(*:?〈0.05，§:?〈0.01，1:?〈0.001)。
[0052]图16显示了药理学抑制剂对RIN-m5F细胞增殖上的效应。细胞接种在小室载玻片 上，并且在加入生长因子之前经受用所示的抑制剂预处理30至40min并孵育24h。在处理的 最后3小时加入50mM BrdU，接着在甲醇中固定并免疫染色BrdU。将数据以处理的BrdU( + )细 胞比未处理的对照中BrdU( + )细胞的比例（％ )进行表示。结果是3个独立实验的平均值土标 准误差(*:P〈〇.〇5, t :ρ〈0·001)。
[0053] 图17显示了 INGAP蛋白的序列和3D结构。(Α)显示了氨基酸(aa)序列；INGAP-P是黑 色和加下划线的，并且保守的侧翼aa是绿色的；（B)显示了 INGAP-P定位在rINGAP的外环上 (黑色；相邻的IW和GW为绿色）；（C)显示了 INGAP-P和跨物种的Reg3蛋白中相应肽序列的同 源性。箭头指示被认为包含在延长的INGAP-P肽中的保守的aa。
[0054] 图18显示了三个延长的INGAP-P类似物在RINm5F细胞中对Erkl/2激活的效应。用 1 nM和 1 OnM的 r INGAP蛋白、INGAP-P (15mer)或 19mer类似物（以 1 X -167nM或 10 X -1 · 67μΜ)处 理RIN-m5F细胞（lX 106/60mm盘）10min。使用ImageJ软件在蛋白质印迹上进行Erkl/2激活 的量化，并确定为磷酸Erkl/2(Thr202/Tyr204)对总的Erkl/2的比值。数据表示为处理过的 细胞相对于对照(PBS)的倍数变化，并表示为rINGAP和INGAP-P(15mer)的6个独立实验和 19mer类似物的2个独立实验的平均值土标准误差。在每个实验中，对于每个处理用2-3个单 独的板（*:Ρ〈0·05，**:ρ〈0·01，1Ι:ρ〈0·001)。
[0055] 图19显示了 INGAP-19结合到RINm5F细胞，类似于rINGAP的结合。生长在8孔玻璃小 室载玻片中的RIN-m5F细胞用50nM DyLight488标记的rINGAP(A)、8.35yM INGAP-P(B)或 8.35μΜ INGAP-19(C)孵育30min，用PBS清洗并在冰上用4%多聚甲醛固定。载玻片用含DAPI 的卩1'〇1〇即6〇1(1(111￥；[1：1'(^611)封固（1]1〇11111:)用于复染细胞核，并在共聚焦显微镜蔡司1^1 510下检查。箭头指示膜结合的rINGAP和INGAP-19,而箭头尖指向内化的INGAP-P JD)显示 了只用FAM染色（阴性对照）。
[0056] 图20显示了在血清存在下INGAP-P的降解曲线（上）和INGAP-19的降解曲线（下）。 50μΜ的肽在含有25%FBS的RPMI-1640培养基中孵育指示的时间。接着在血清蛋白的乙醇沉 淀后，用HPLC分析样品。为了比较肽降解的动态，HPLC曲线如所示的被叠加。
[0057]图21显示了在FBS中体外孵育肽的时间进程研究，其中（上）显示了 INGAP-PC肽和 (下）显示了 INGAP-19C 肽。用含有 25 %FBS 的 RPMI-1640 培养基将 50μΜ 的 INGAP-PC 和 INGAP 19C孵育指示的时间。在血清蛋白的乙醇沉淀之后，用HPLC分析样品。为了比较肽降解的动 力学，如所示的叠加 HPLC曲线。从(B)中可以看出在血清存在下INGAP-19C于48h中未见降 解。
[0058] 图22显示了在RINm5F细胞中INGAP类似肽对Erk 1/2激活的效应。（A)显示了在与 INGAP-P相同浓度下比较类似物的初步研究结果（167nM;n = 2); (B)显示了更低和更高剂量 的INGAP-P、INGAP-19和INGAP-19C的比较。如对图11所描述地进行RINm5F细胞的处理和 Erkl/2激活的量化。
[0059] 图23显示了 rINGAP和INGAP 15-mer肽（INGAP-P)在诱导来自人胰岛衍生的导管样 结构(DLS)的胰岛再生中的相对效力。将胰岛特征变化;胰岛素阳性结构的数量/处理后 结构的总数量)与预处理水平进行比较(*P〈〇.05)。
[0060] 图24显示了糖尿病小鼠中rINGAP和INGAP-P处理对血糖水平的效应。用rINGAP(5y g)、INGAP-P(500yg)或roS处理通过单次腹腔注射STZ(150mg/kg)造成慢性糖尿病（大约 27mM的高血糖）的C57B1/6J小鼠7周。数据以mmol/L表示，并且是平均值土标准误差。STZ-PBS(n = 5);STZ-rINGAP(n = 6)和 5丁2-1呢厶?-卩(11 = 7);*?〈0.05，**?〈0.01，处理的比？85。 [0061 ] 图25显示了INGAP诱导人成熟导管细胞中Pdx-Ι表达。（A)显示了用167nM INGAP-P 处理的HPDE细胞中Pdx-lmRNA表达随时间的变化，表示为时间匹配的未处理的对照的倍数 变化。（B)显示了用不同剂量的rINGAP处理15min的HPDE细胞中Pdx-lmRNA表达变化，表示为 时间匹配的未处理的对照的倍数变化。（C)显示了 Η P D E未处理的细胞（C T L)和用16 7 η Μ INGAP-P处理的细胞24小时后的Pdx-1表达的代表性蛋白质印迹。等量的总蛋白上样到每个 泳道(如与β-肌动蛋白所示）。（〇)显示了Pdx-Ι蛋白中增加％的图表代表，如在(C)中所见， 用ImageJ软件定量。数据表示为平均值土标准误差，*p〈0.05，η = 3独立测量值。
[0062]图26显示了 INGAP-P诱导发育过程中内分泌分化中涉及的发育转录因子的协同表 达。NeuroD 1 (A)，I A-1 (B)和Maf A (C) mRNA表达变化超时，表示为时间匹配的未处理的对照的 倍数变化(*P < 0.05)，如所示。
[0063]图27显示了 INGAP诱导24h后HPDE细胞中胰岛素和葡萄糖激酶的表达。（A)显示了 在不存在(对照)或存在（1XINGAP)的167nM INGAP-P下，24h后胰岛素表达；（B)显示了在不 存在(对照)或存在5nM rlNGAP(rlNGAP)下，24h后用RT-PCR检测的葡萄糖激酶的表达(所示 为代表性的凝胶）；（C)显示了在不存在（对照）或存在167nM INGAP-P(1 X INGAP)或5nM rlNGAP(rlNGAP)下，通过ELISA检测的培养24h后的HDPE细胞裂解物中的C肽的水平（*p〈 0.05，标准化到总蛋白）。
[0064]图28显示了成簇的HPDE细胞模拟胰岛-DLS-ILS模型，并提高了由INGAP触发的内 分泌分化。（A)培养5天后，嵌入基质胶的HPDE细胞形成簇。10天后，簇变为囊状。当用167nM INGAP-P处理7天后，HPDE囊状结构恢复为固体胰岛素样簇(相差显微术，代表性图片）。（B) 显示了用 167nM INGAP-P(INGAP-P)或5nM rlNGAP(rlNGAP)处理7天的HPDE簇中胰岛素、胰 高血糖素和PPY mRNA的表达的变化，表示为时间匹配的未处理的对照的倍数变化（*p < 0.05)〇
[0065]图29显示了经INGAP处理牢牢嵌入基质胶的HPDE细胞加强了内分泌分化。显示了 没有(对照）或用167nM INGAP-P(INGAP)培养7天的HDPE簇的免疫荧光分析:细胞角蛋白19 (CK19)、PDX-1、C肽和Glut-2的免疫检测(代表性图片）。经过INGAP处理，CK19被废除，PDX-1 被转移到细胞核(箭头），并且C肽(箭头)和Glut-2出现。
[0066]图30显示了胰岛到DLS转变：1形态学和免疫荧光。倒置(A-C)和免疫荧光(D-F)显 微术显示胰岛为主要由胰岛素和辟田胞(D)组成的固体球形结构(A)。经过8天培养期，DLS形 成中心形成并扩展(B、E)，最终取代了胰岛。这些DLS为空的、囊状结构(C)，是CK+导管上皮 细胞(F)的成分混杂群。DLS形成的形态学评价与导管(绿色:CK+)细胞频率(r2 = 0.74，p〈 0.001)正相关，并且与内分泌(红色:胰岛素/胰高血糖素/生长激素抑制素/PP+)细胞频率 &2 = 0.64，？〈0.001)负相关(6)。11细胞凋亡。早期01^形成的特点在于显著的凋亡，如由 ELISA评价的（（4):*?〈0.05，**?〈0.01与第0天相比）。第1天培养物的基于原位末端标记 (TUNEL)的研究显示凋亡的细胞主要为β细胞(BhIII DLS增殖。BrdU掺入的免疫组织化学 (A)和定量评价(B)表明，相对于相对静态的胰岛细胞，DLS细胞是高度增殖的(*p〈0.05，**p 〈0.01，***ρ〈0·001)。
[0067] 图31显示了胰岛到DLS转变:祖细胞标记表达。免疫组织化学和免疫荧光分析表明 DLS细胞表达与胰岛祖细胞相关的标记，包括roxi、巢蛋白和波形蛋白。
[0068] 图32显示了 INGAP-P处理后DLS到ILS再生：形态学和免疫组织化学。用167nM INGAP-P处理DLS 4天诱导ILS的形成，ILS表达合适水平的成熟胰岛功能标记并下调了相对 于DLS的CK表达。
[0069]图33显示了 DLS到ILS再生:功能。胰岛素含量的评价(A)和葡萄糖诱导的胰岛素分 泌(B)表明ILS具有与它们所源于的初始胰岛等价的胰岛素贮存和分泌能力(*p〈0.01，与胰 岛相比）。
[0070] 图34显示了INGAP增加 HPDE细胞增殖。用167nM INGAP肽（IX)处理单层HPDE细胞 (A)或基质胶中成簇培养的HPDE细胞(B)7天。然后对细胞进行增殖标记(PCNA)的染色，并计 算PCNA+/细胞核总数的百分比（*p < 0.05) XTRL为未处理的对照。
[0071 ]图35显不了米用Kinetworks?Broad Signaling Pathway Screen(KPPS 1 · 3， Kinexus Bioinformatics)的INGAP对HPDE细胞的蛋白激酶激活的效应。(A-C)，来自分别用 PBS(对照）、835nM INGAP-P和InM rINGAP处理20分钟的HPDE细胞的各种磷酸化蛋白激酶的 Kinetworks蛋白质印迹结果；（D)，20分钟后来自对照（空条）、INGAP-P-处理的（灰条）和 rINGAP处理的（黑条)细胞的各种蛋白激酶激活的0D统计条形图；€，分别在(A-D)中以数量 描述的蛋白激酶的简称和相应的倍数变化。只表示出显著的变化;至少25%的0D变化被认 为是显著的。
[0072]从以下详细的描述，本发明的其他特征和优势会变得明显。然而应该被理解的是， 表明本发明的【具体实施方式】的详细描述和具体实施例仅通过例证的方式给出。从该详细的 描述，本公开的主旨和范围内的各种变化和变型对于本领域普通技术人员来说会是显而易 见的。
【具体实施方式】
[0073]作为诱导新的导管相关的胰岛形成的因子，胰岛新生相关蛋白（INGAP)在部 分导 管阻塞的仓鼠胰腺中被发现。之前我们已经说明INGAP的生物活性部分，INGAP^118肽(本 文也称作"INGAP-P"、"15-mer"或SEQ ID NO: 1)，其具有β细胞新生和胰岛素增效活性。最近 2期临床试验已经显示所产生的INGAP-P提高了在1型和2型糖尿病患者中的葡萄糖动态平 衡，因此支持了 INGAP作为针对糖尿病的药物疗法的可能。然而，差的稳定性和/或短的血浆 半衰期妨碍了将INGAP-P开发为治疗药物的能力。
[0074]我们在此报道，为了提高INGAP-P作为治疗或预防糖尿病的药物的功效以及为了 理解它的作用机制，我们研究了全长INGAP蛋白（也称作"rINGAP"和"r-INGAP"）寻求线索。 我们克隆了rINGAP，并用它研究RIN-m5F细胞中由蛋白质和INGAP-P肽诱导的信号事件。 RIN-m5F细胞为对增殖中INGAP的增加做出应答的大鼠胰岛瘤细胞系。所述全长重组蛋白 (r-INGAP)比15-mer肽稳定得多（在细胞培养中达5天），并且是带有6His标记的。数据显示 在刺激大鼠胰岛瘤RIN-m5F细胞的增殖上以摩尔为基础rINGAP至少比INGAP-P有效100倍， 并且虽然它们都通过Ras-Raf-Erk途径的激活传递信号，但是上游信号事件可以不同。我们 也说明了荧光标记的rINGAP的结合限制于细胞表面并且以与受体结合和聚类一致的方式 在细胞表面形成斑，然而INGAP-P迅速被内化。对于rINGAP和所述15-mer，INGAP诱导的 Erkl/2(MAPK42/44)激活被百日咳毒素(Ptx)显著降低，提示rINGAP和所述肽均通过G蛋白 偶联受体起作用。因此，所述数据显示，无论在体外还是在体内，与INGAP-P相比rINGAP具有 大得多的稳定性(在细胞培养物中达5天)并且在胰岛再生中具有至少100倍高的摩尔效能 (参见图23、24)。
[0075]采用X-射线晶体学，生成了 r INGAP的3D重建。重建显示生物活性的15-mer肽 (INGAP-P)是从分子的核心延伸出的环的一部分（图17B)。值得注意的是所述15-mer (INGAP-P)是一个小的线性化的肽。我们猜测所述rINGAP蛋白质的所述环可以促进所述蛋 白质与它的靶细胞/受体相互作用，并且保护所述环结构，因此所述环结构可能是INGAP肽 的生物活性和稳定性的关键。蛋白序列的分析(图17A)显示INGAP-P侧翼具有形成蛋白质核 心的高度疏水的氨基酸序列。显著地，三个色氨酸残基(W)处于直接接近于INGAP-P的位置 (氨基酸1〇3、120和122)(图17C)，并且甘氨酸 119(G)在跨物种(包括人)的Reg3蛋白中高度保 守。
[0076]因此我们设计并制备了 INGAP-P的三个延长的类似物，这三个INGAP-P的延长的类 似物包括位于所述肽的任一边或两边的保守氨基酸(参见表1，图18)。为了不牺牲溶解度， 延长被限制在获得19-mer肽的4个氨基酸。延长的INGAP肽可能保存INGAP的本身3D环状结 构。不期望受限于理论，相信在19-mer的任一端的两个疏水性色氨酸(trytophan)残基可以 稳定所述肽的环状结构。19-mer肽因此保留了 rINGAP蛋白的生物活性(可能甚至显示出增 强的活性），并且具有与INGAP-P 15-mer相比增加的稳定性和/或血浆半衰期。
[0077] 19-mer肽的结构示于表1中。为了制备延长的19-mer INGAP肽，INGAP蛋白序列中 的INGAP-P 15-mer肽侧翼的4个氨基酸被添加到INGAP-P 15-mer，如表1所示（添加到所述 15-mer的侧翼氨基酸是加下划线的，也参见图17、18)。
[0078] 表1. INGAP肽序列
[0079]
[0080」 研％19-mer相比十INGAP-P 15-mer
和rINGAP的生物沽性。如本文所不，在所培养 的 RIN-m5F 细胞中 INGAP1Q2-12Q 诱导的 Erkl/2(MAPK42/44)激活比 INGAP1Q4-118 产生的大 3 倍，并 且是rINGAP产生的大约2倍（图18)。此外，我们证实荧光标记的19-mer(INGAP1(^ 12())的结合 被限制于细胞表面，并且以类似于rINGAP可见的方式相似于受体聚类，并且明显不同于 INGAP1(^118，INGAP1(^118看似不结合到细胞表面(图19)。
[0081 ] FBS中可比较的肽稳定性分析没有显示出INGAP-19超过INGAP-P的优势，因为两种 肽以相似的速率降解(图20)。
[0082] 为了探究INGAP-19的效能是否可以通过增加其稳定性而进一步增强，选择环化作 用(通过加入末端半胱氨酸，二硫化物，头到尾(head-to-tai 1))，因为这是一个广泛采用的 增加肽稳定性的方法(Adessi，C·和Soto，C ·，Curr Med Chem，2002，9:963-978)。INGAP-P进 行相似的环化，并且新的类似物被称作INGAP-19C和INGAP-PC( "C"代表环化的）。
[0083] 在FBS体外孵育的时间进程研究中比较INGAP-P、INGAP-PC、INGAP-1^PINGAP-19C 的稳定性。数据显示INGAP-19C似乎比线性的15-mer(INGAP-P)或19-mer(INGAP-19)肽更加 稳定（图20、21)。重要地，1如六?-19(：与线性的191^(1如4?-19)均等，并且基于1?1^1^细胞 中Erkl/2激活的研究，其具有比INGAP-P更高的摩尔效能（图22)。另外，我们证实单独的环 化不增加 INGAP-P的活性(图22A)。
[0084] 因此，结果表明rINGAP的 19-mer(INGAP1Q2-12Q(SEQ ID N0:4))和rINGAP的环化的 19-mer的（环化的INGAPH12Q)比INGAP-P 15-mer更具有生物活性。环化的INGAPH12Q显示 出比INGAP-P更大的稳定性。
[0085] 相应地，本文提供INGAP的 19-mer肽，INGAP1Q2-12Q，（本文也称作 "INGAP-19"、"19-mer"、"19-mer序列3" 和SEQ ID N0:4)。本文还提供INGAP的环化的 19-mer肽，INGAP1。2-120， (本文也称作"INGAP-19C"和SEQ ID勵:6)。本文显示19-1^4太具有1如4?的0细胞新生和胰 岛素增效活性和/或与INGAP-P相比提高的稳定性，这表明19-mer INGAP肽为糖尿病的潜在 的新的治疗药物。
[0086] 在一个实施方式中，本文提供包括SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列的 INGAP肽。在另一个实施方式中，本文提供由SEQ ID N0:4或6所示的序列组成的INGAP肽。也 提供其组合物和使用方法。
[0087]如本文所使用，"细胞"指胰腺中胰岛的完全分化的生成胰岛素的细胞。胰腺辟田 胞的特点在于它们分泌胰岛素并且典型地在于它们的细胞表面表达胰岛淀粉样多肽 (ΙΑΡΡ)。
[0088]也应该被理解的是，保留INGAP的生物活性的本发明的19-mer肽的类似物、同系 物、片段和变体包括在本发明的肽中。在一个实施方式中，提供与SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:6具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6的变体。在另一个实施方式中，变体具有与SEQ ID N0:4和SEQ ID NO :6至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少98%或至少99%的同一性，并且保留 INGAP103位和120位上的色氨酸残基(换句话说，在INGAP 103位和120位上的色氨酸残基没 有被移除、取代或改变）。在另一些实施方式中，变体保留103和120位上的至少一个色氨酸 残基或保留两个色氨酸残基。
[0089] 本发明的多肽和组合物可以用于治疗或预防胰腺的症状或疾病。这样的症状或疾 病的非限制性实例包括新陈代谢紊乱或比如1型和2型糖尿病的症状、糖尿病的并发症（比 如视网膜病、肾病或神经病、糖尿病足、溃疡、大血管病变）、代谢性酸中毒或酮症、反应性低 血糖症、高胰岛素血症、葡萄糖代谢紊乱、胰岛素抵抗、代谢综合征、不同起因的血脂异常、 动脉粥样硬化和相关疾病、肥胖、高血压、慢性心力衰竭、水肿和高尿酸血症。
[0090] 细胞团的扩大可能与几种过程相关，包括存在的胰岛细胞的增殖、来自导管相关 的前体细胞的新生或来自去分化的内分泌细胞的胰岛细胞的再生。在本文中，我们说明示 出INGAP-P诱导：（1)正常人胰腺导管细胞(HPDE)的增殖和内分泌分化（图25-29、34); (2)来 自去分化的人胰岛来源的导管样结构(DLS)的功能性胰岛样结构的再生（图23、30-33);和 (3)-种产生胰岛素的大鼠细胞系，RINm5F细胞的增殖（图1、8、18、22)。还显示了在动物模 型中，INGAP-P可以导致胰腺胰岛细胞的量的显著增加，并且导致更多的胰岛素的产生(美 国专利申请公布号2004/0132644)。新形成的辟田胞出现在胰腺导管的壁和出的芽上。这些 由导管上皮细胞分化和胰岛细胞生长获得的胰岛素阳性细胞以及它们的出现与用INGAP-P 处理的剂量和持续的时间成比例。经过更长的处理时期，这些细胞迀移出导管，并且在胰腺 的实质(parenchyma)中形成胰岛。经过连续10天的INGAP-P给药，胰岛数量有30%的增加， 并且经过30天在组织中有双倍的胰岛数量。预期本文公开的肽有类似的效应。
[0091] 相应地，在一个实施方式中，本发明的肽和组合物促进、提高或诱导辟田胞新生。比 如，本发明的肽和组合物提高或恢复胰腺细胞的功能，和/或可以增加胰腺β细胞的数量或 尺寸。在另一个实施方式中，本发明的肽和组合物促进、提高或诱导胰腺辟田胞的再生。在另 一个实施方式中，本发明的肽和组合物促进、提高或诱导胰腺β细胞的增殖。在另一个实施 方式中，本发明的肽和组合物具有胰岛素增效活性。在进一步的实施方式中，本发明的肽和 组合物提高有1型或2型糖尿病的个体中葡萄糖的动态平衡。
[0092] 如本文使用地，"胰岛素增效活性"和"胰岛素增效"是指与单独给药胰岛素相比， 当胰岛素与本发明的肽或组合物联合给药时，在低剂量的胰岛素下获得治疗性结果的能 力。换句话说，当胰岛素与本发明的肽或组合物联合给药时，要获得一定的治疗性结果需要 更少的外部提供的胰岛素;在本发明的肽或组合物存在下，用更低剂量的胰岛素获得与单 独的更高剂量的胰岛素相似的治疗性结果。
[0093]在进一步的实施方式中，本发明的肽和组合物阻止通过比如胰腺细胞的凋亡或 坏死引起的β细胞死亡;诱导从源自去分化的成熟胰岛的原始导管样结构(DLS)来的新的功 能性胰岛的分化;提高内分泌分化;诱导来自与导管上皮相关的细胞的胰岛细胞再生，导致 新的胰岛形成;和/或导致高血糖症的逆转。在一个特定的实施方式中，本发明的肽和组合 物诱导胰腺导管细胞的分化，和/或允许这样的细胞避开凋亡途径。
[0094]在更进一步的实施方式中，本发明的肽具有与INGAP-P 15-mer肽相比更好的体外 稳定性、更好的循环中的稳定性和/或更长的体内半衰期。
[0095] 在一个实施方式中，通过本发明的肽和组合物治疗或预防辟田胞相关的紊乱。在一 个特别的实施方式中，通过本发明的肽和组合物治疗或预防糖尿病，特别是1型糖尿病、2型 糖尿病、潜伏期的1型糖尿病和/或糖尿病并发症。
[0096] 因此，在一个方面本文提供有用于治疗或预防需要其的个体中的新陈代谢紊乱的 方法，所述方法包括对所述个体给药治疗有效量的本发明的肽或组合物。在另一个方面，本 发明提供有用于治疗或预防需要其的个体中的糖尿病的方法，所述方法包括对所述个体给 药治疗有效量的本发明的肽或组合物，比如SEQ ID N0:4。
[0097] 在另一个方面，在需要其的个体中提供用于预防胰腺细胞的退化和/或提高和/ 或恢复胰腺细胞的功能的方法，所述方法包括对所述个体给药治疗有效量的本发明的肽 或组合物。在一个方面，胰腺细胞(比如β细胞)的数量或尺寸在所述个体中增加，和/或所述 个体中血浆胰岛素水平增加，和/或所述个体中葡萄糖动态平衡恢复或提高。
[0098] 在一个进一步的方面，提供体外和/或体内保护胰岛细胞抵抗致糖尿病剂的方法， 所述方法包括将真核细胞接触或对个体给药本发明的肽和组合物。在一个实施方式中，在 给药本发明的肽或组合物后个体中的胰岛活力提高，和/或胰岛功能障碍被阻断，和/或β细 胞团被保护。
[0099] 根据本发明的另一个实施方式，提供诱导辟田胞祖细胞分化的方法，包括:将含有β 细胞祖细胞的胰腺导管细胞的培养物接触本发明的肽制剂以诱导所述β细胞祖细胞的分 化。在一个实施方式中，具有胰腺内分泌不足的哺乳动物的胰腺导管细胞可以从机体中移 除并在体外处理。导管细胞典型地含有细胞祖细胞。这种用本发明的肽制剂的处理会诱导 所述辟田胞祖细胞的分化。用本发明的肽处理的细胞然后可以用作自体移植到它们来源的 哺乳动物中。这种自体移植处理最小化了移植中涉及的不利的宿主抗移植物反应。
[0100] 在一个实施方式中，所述个体可以是啮齿目动物、犬科、猪、灵长目动物或人。虽然 本发明的方法可以用在任何动物中，但所述个体优选为人。
[0101] 术语"同系物"用于表示与本文描述的所述肽的序列具有微小或不重要的序列变 化的那些氨基酸或核酸序列，这样同系物序列以如所述原始序列实质相同的方式起作用。 序列变化可能归因于原位突变或结构修饰。具有实质的序列同一性的序列包括与编码如本 文提供的肽的序列具有至少80 %、至少85%、至少90%、至少95%、至少98 %或至少99 %序 列同一性的核酸序列，或与本文提供的肽（比如SEQ ID Ν0:4或SEQ ID Ν0:6)具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。序列 同一性可以根据本领域已知的方法计算。核酸序列同一性最优选地通过BLAST 2.1版高等 研究的运算法则评价。在http: //www. ncbi . nlm. nih. gov/BLAST上可获得一系列的程序。
[0102] 术语"类似物"用来表示与本文描述的肽的序列相比已被修饰的氨基酸或核酸序 列，其中所述修饰不改变本文描述的序列的生物活性(比如:诱导胰腺细胞新生，诱导胰腺 β细胞再生、提高葡萄糖动态平衡或逆转高血糖症）。修饰的序列或类似物可能具有与本文 描述的肽（比如SEQ ID Ν0:4或SEQ ID Ν0:6)相比改进的性能。
[0103] 也包括与编码本发明的肽的核苷酸序列的互补序列杂交的序列，以及与编码保留 有SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的生物活性（比如:β细胞新生活性、体内稳定性等）的肽的核 苷酸序列的互补序列杂交的序列。术语"杂交序列"表示在严格杂交条件下可以杂交至序列 的核酸序列。促进DNA杂交的合适的"严格杂交条件"对于本领域普通技术人员来说是已知 的，并且在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons,Ν.Υ. (1989)， 6.3.1-6.3.6中可以找到实例。如本文所用的术语"严格杂交条件"表示被选择的促进溶液 中的两个互补核酸分子之间选择性杂交的条件。杂交可以发生在一个核酸序列分子的所有 或部分中。对于编码多肽的多聚核苷酸序列中的一种来说，杂交部分至少为50%的长度。在 这点上，核酸双链体或杂交体的稳定性通过Tm确定，Tm在含钠的缓冲液中是钠离子浓度、标 记的核酸的G/C含量、核酸探针的长度（1)和温度(Tm=81.5°C-16.6(L 〇gl0[Na+])+0.41(% (G+C) -600/1)的函数。相应地，确定杂交稳定性的清洗条件中的参数为钠离子浓度和温度。 为了识别与已知的核酸分子相似但不相等的分子，1%的错配可以假设引起Tm大约1°C的下 降，比如如果寻找具有大于95%同一性的核酸分子，最后的清洗会下降5°C。基于这些考虑， 在一个实施方式中严格杂交条件被定义为:在Tm(基于上述方程式)-5°C下5 X氯化钠/柠檬 酸钠(SSC) /5 X Denhardt ' s溶液/1 · 0 % SDS下杂交，接着在 60°C 用0 · 2 X SSC/0 · 1 % SDS清洗。
[0104] 肽可被修饰为含有不改变所述肽的生物活性的氨基酸取代、插入和/或删除。保守 的氨基酸取代包括用具有类似的电荷、尺寸和/或疏水性特点的氨基酸替换肽的一个或多 个氨基酸。当只进行了保守的取代时，预期所获得的类似物会在功能上等同于未取代的肽。 非保守的取代包括用具有不同电荷、尺寸和/或疏水性特点的一个或多个氨基酸替换肽的 一个或多个氨基酸。
[0105] 肽可被修饰为使其更加治疗有效或合适(比如，稳定）。比如，本发明的肽可以通过 与比如无机酸（比如：盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸等）或有机酸（比如：甲酸、乙酸、丙酸、乙醇 酸、乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、水杨酸、苯磺酸和甲苯磺 酸）反应转化为药学上可接受的盐。药学上可接受的盐为本领域所熟知，并且肽和其类似 物、同系物、片段和变体的药学上可接受的盐包含在本文中。
[0106] 另外，肽可以进行化学修饰，比如通过共价结合到肽以增加它的循环半衰期。典型 的聚合物和将它们结合至肽上的方法在美国专利第4，766，106、4，179，337、4，495，285和4， 609,546号中示出。聚合物的非限制性实例为聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG) 1EG室温下 在水中可溶并且具有通式:R(〇--CH2-CH2)n--R，其中R可以为氢或保护基（比如烷基或烷醇 基团）。在一个实施方式中，所述保护基具有1至8个之间的碳原子，或为甲基。符号η为正整 数，比如：1和1000之间或2和500之间。在一个实施方式中，所述PEG具有1000和40000之间、 2000和20000之间或3000和12000之间的平均分子量。PEG可以有至少一个羟基基团或末端 羟基基团。这个羟基基团可以被激活以与抑制剂上自由的氨基基团反应。
[0107] 本发明也提供包含编码本发明的肽或其 片段或类似物的核酸序列的表达载体。
[0108] 可能的表达载体包括但不限于:粘粒、质粒、人工染色体、病毒载体或修饰的病毒 (比如:复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒），只要所述载体与使用的宿主细胞相 容。所述表达载体是"适于宿主细胞转化的"，这是指所述表达载体含有本发明的核酸分子 和在所述宿主细胞的基础上选择的用于表达的调节序列，该调节序列操作性地连接到本发 明的核酸分子上。"操作性地连接"意为表示所述核酸分子以允许所述核酸分子表达的方式 连接到调节序列。
[0109] 本文提供有含有本发明的核酸分子，或其片段或类似物，以及用于所插入的肽编 码序列的转录和翻译的必需调节序列的重组表达载体。
[0110]合适的调节序列可以来自各种来源，包括细菌的、真菌的、病毒的、哺乳动物的或 昆虫的基因（比如，参见Goeddel，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185，Academic Press，圣地亚哥，加利福尼亚（1990)中描述的调节序列）。合适的调节序列 的选择取决于所述宿主细胞，并且可以通过本领域的一种普通技术轻易完成。这种调节序 列的实例包括:转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列(包括翻译起 始信号）。另外，取决于所选择的宿主细胞和所采用的载体，其它序列（比如复制起点、额外 的DNA限制位点、增强子和赋予转录的可诱导性的序列)可以包含在所述表达载体中。
[0111] 本发明的重组表达载体也可以包含帮助选择用本公开的肽转化或转染的宿主细 胞的可选择的标记基因。可选择的标记基因的实例为编码蛋白质（比如G418和潮霉素）的基 因，这些蛋白赋予了对特定药物、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶或免 疫球蛋白或其部分(比如:免疫球蛋白的Fc部分，如IgG)的耐药性。可选择的标记基因的转 录通过可选择的标记蛋白（比如:β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫荧光素酶）的 浓度变化监控。如果可选择的标记基因编码赋予抗生素抗性（比如新霉素抗性）的蛋白，转 化体细胞(transformant cell)可以用G418选择。包含有可选择的标记基因的细胞会存活， 而其他细胞死亡。这使得可视化和测定本公开的重组表达载体的表达成为可能，并且特别 是确定突变体在表达和表型上的效应成为可能。如果可选择的标记可被引入独立于有用的 核酸的载体，则会更好。
[0112] 本文提供的重组表达载体也可以包含这样的基因，其编码下述片段:提供肽的增 加表达、重组肽的增加的溶解度和/或通过作为亲和纯化中的配体起作用帮助目标重组肽 纯化。比如，溶蛋白性裂解位点可被加入目标重组肽以允许重组蛋白从融合蛋白纯化后的 融合部分分离。典型的融合表达载体包括分别在重组肽上融合谷胱甘肽硫转移酶(GST)、麦 芽糖E结合蛋白或蛋白A的pGEX(Amrad Corp·，墨尔本，澳大利亚）、pMal(New England Biolabs，Beverly，ΜΑ)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ)〇
[0113] 重组表达载体可以被引入宿主细胞以制备转化的宿主细胞。术语"转化的宿主细 胞"意为包括能用本发明的重组表达载体转化或转染的细胞。术语"被转导"、"用……转 化"、"用……转染"、"转化"和"转染"意为包括将核酸（比如：载体或裸RNA或DNA)通过本领 域已知的许多可能的技术中的一种引入细胞中。原核细胞可以通过比如电穿孔或氯化钙介 导的转化用核酸进行转化。比如，核酸可以通过常规技术（比如：磷酸钙或氯化钙共沉淀、 DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂质体、电穿孔、显微注射、RNA转移、DNA转移、人工染色体、病 毒载体和任何出现的基因转移技术）引入哺乳动物细胞中。合适的用于转化和转染宿主细 胞的方法可以在Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))和其他实验室教科书中找到。
[0114] 合适的宿主细胞包括广泛种类的真核宿主细胞和原核细胞。比如，本公开的肽可 以在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞可以在Goeddel，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,圣地亚哥，加利 福尼亚（1991)中找到。另外，本公开的肽可以在原核细胞中表达，比如大肠杆菌 (Escherichia coli)(Zhang等人，Science 303(5656):371-3(2004)。
[0115] 除其他外，适于在本文描述的方法中使用的哺乳动物细胞包括:C0S(比如，ATCC号 CRL 1650或 1651)、BHK(比如ATCC号CRL 6281)、CH0(ATCC号CCL 61)和HeLa(比如，ATCC号 CCL 2)以及3T3小鼠成纤维细胞(比如ATCC号CCL92)。
[0116] 用于在哺乳动物细胞中定向表达的合适的表达载体一般包括启动子（比如:源自 病毒材料;如:多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40)，以及其他转录和翻译控制序 列。哺乳动物表达载体的实例非限制性的包括pCDM8(Seed，B.，Nature 329:840(1987))、 pMT2PC(Kaufman等人，ΕΜΒ0 J.6:187-195( 1987))和pCMV(Clontech，加利福尼亚，美国）。
[0117] 或者，本发明的肽也可以在非人类的转基因动物(比如:大鼠、小鼠、兔、羊和猪）中 表达（Hammer等人，Nature 315:680-683(1985); Palm iter等人，Science 222 : 809-814 (1983); Brins ter 等人，Proc · Natl .Acad · Sc i · USA 82 :4438-4442( 1985); Pa lmi ter 和 Brinster，Cell41:343-345(1985)和美国专利第4，736，866号）。本发明还包括源自或分离 自这些动物的组织和细胞。
[0118] 除上文描述的类似物和同系物，在特定的实施方式中，本发明的肽可以进一步被 重组融合到异源多肽的N末端或C末端或化学结合(包括共价和非共价结合)到多肽或其他 组合物上。比如，肽可被重组融合或结合到在检测分析中用作标记的分子和效应分子（比 如：异源多肽、组氨酸(HIS)标签、药物、放射性核素或毒素）上。参见比如:PCT公布W0 92/ 08495;W0 91/14438;W0 89/12624;美国专利第5,314,995号；以及EP 396,387。任何类型的 分子都可以共价结合至本发明的肽上，只要它不抑制所述肽的生物活性。举例而非限制，肽 衍生物包括被修饰的肽，比如:经过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酰化(phosphy 1 ation)、 磷酸化化1108口110^1&1：；[011)、酰胺化;通过已知的保护基/阻断基的衍生化、溶蛋白性裂解、 连接到细胞配体或其他蛋白质等。通过已知技术可以进行任意数量的化学修饰，包括但不 限于:特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
[0119] 肽融合到其上的所述异源多肽可以用于比如增加所述肽的体内半衰期，或用于采 用本领域已知方法的免疫分析中。本发明的肽可以融合到标记序列（比如帮助纯化或检测 的多肽）。总的来说，应该被理解的是本发明的肽可按非结合的形式或者可以结合到多种分 子的至少一种上以用于例如提高所述分子的治疗性能，提高所述分子的药代动力学性能， 等。
[0120] 在特定的实施方式中，本发明的肽包括一种额外的氨基酸序列或一个或多个部 分。典型的修饰在下文更详细的描述。比如，肽可被修饰为加入一个额外的功能性部分(比 如:PEG、药物、毒素、显像剂或标签）。
[0121]此外，可以进行导致"非必须"氨基酸区域上保守取代或变化的核苷酸或氨基酸取 代、删除或插入。比如，除了一个或多个个别的氨基酸取代、插入或删除（比如，可以进行1 个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多的个别氨基酸的取代、插入或删除） 之外，肽可以与起始序列相同。在其他实施方式中，除了 1个、2个或更少、3个或更少、4个或 更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少，或10个或更少的个别氨基 酸的取代、插入或删除）之外，源自起始肽的肽可以与所述起始序列相同。在某些实施方式 中，相对于所述起始序列，源自起始肽的肽具有1个、2个、3个、1至2个、1至3个、1至5个或1至 10个个别氨基酸的取代、插入或删除。在一个特定实施方式中，SEQ ID N0:4的第2位和第19 位的色氨酸残基中的至少一个或均在衍生肽中保留，即：第2位和第19位的色氨酸残基中的 至少一个或均被保留。
[0122] 本发明也包括本文描述的肽的片段、衍生物、变型或变体，以及上面描述的类似物 和同系物和其任何结合。当指本发明的肽时，术语"片段"、"变体"、"衍生物"、"变型"、"同系 物"和"类似物"包括保留了所述相应的起始肽序列的至少一些生物活性的任何多肽。术语 "变体"、"衍生物"和"变型"在本文中交替使用。
[0123] 本发明的肽的变体包括片段、由于如本文描述的氨基酸的取代、删除或插入而具 有改变的氨基酸序列的多肽以及如本文描述的变型。变体多肽可以包括如本文描述的保守 或非保守的氨基酸取代、删除或添加。变体也可以具有一个或多个通过官能侧基的反应化 学衍生的残基。还作为变体被包括的是含有一个或多个20个标准氨基酸的天然存在的氨基 酸衍生物的那些肽。比如，4-羟脯氨酸可以取代脯氨酸;5-羟赖氨酸可以取代赖氨酸;3-甲 基组氨酸可以取代组氨酸;高丝氨酸可以取代丝氨酸;并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。另外， 变体可以含有一个或多个非经典的氨基酸。
[0124] 因此，在一个实施方式中，本发明包括本文公开的肽的类似物、同系物、片段或变 体。在一个实施方式中，类似物、同系物、片段或变体保留了所述起始肽的一种或多种生物 活性，比如，β细胞新生活性、胰岛素增效活性、恢复或提高个体中葡萄糖动态平衡的能力、 逆转高血糖症的能力、对细胞受体的结合、稳定性等。肽的一种或多种生物活性可以被类似 物、同系物、片段或变体保留。在一个实施方式中，类似物、同系物、片段或变体保留所述起 始肽的至少一种生物活性或性质。
[0125] 在一个实施方式中，本发明的肽是被纯化的，或基本上是纯的。在另一个实施方式 中，本发明的肽是化学合成的。
[0126] 药物组合物和给药方法
[0127] 本文包括含有本发明的肽的药物组合物。本发明的肽可以根据已知技术通过将本 发明的肽和传统的药学上可接受的载体或稀释剂结合制备的传统剂量形式向个体给药。本 领域普通技术人员公认所述药学上可接受的载体或稀释剂的形式和性状由与它结合到的 活性成分的量、给药途径和其他熟知的变量决定。
[0128] 制备肽或其类似物、同系物、片段或变体的方法以及向个体给药肽或其类似物、同 系物、片段或变体的方法在本领域是熟知的，或是由本领域技术人员容易确定的。本发明的 肽和组合物的给药途径可以是比如:通过吸入或局部的口服、注射用药。如本文所用的术语 注射用药包括比如:静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道给药。在一个特定实施 方式中，本发明的肽或组合物通过注射给药。在一个实施方式中，所述给药途径为静脉注 射。在另一个实施方式中，本发明的肽或组合物经口服给药，比如:每日一次、每日两次或每 日三次。
[0129] 通常，用于注射的合适的药物组合物可以包括缓冲液（比如：乙酸盐、磷酸盐或柠 檬酸盐缓冲液）、表面活性剂(比如:聚山梨醇酯)和任选的稳定剂(比如:人血白蛋白）等。注 射给药的制剂包括无菌水或非水溶液、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二 醇、植物油（比如:橄榄油）以及可注射的有机酯（比如：油酸乙酯）。水性载体包括含盐和缓 冲介质的水、醇/水溶液、乳剂或混悬剂。在所述主题发明中，药学上可接受的载体包括但不 限于:0.01-0.1M并优选为0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8%盐溶液。其他普通的注射载体包括 磷酸钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格试剂或固定油。静脉注射的载体包括 流体和营养补充剂、电解质补充剂，比如基于林格葡萄糖的那些以及类似物。还可以存在防 腐剂和其他添加剂，比如:抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体及其类似物。
[0130] 更具体地，适于注射使用的药物组合物包括用于无菌注射溶液或分散剂的临时制 备的无菌水溶液（当水溶时)或分散剂和无菌粉末。在这种情况下，组合物必须是无菌的，并 且应该是一定程度上流动的以有易注射性。在制备和贮存条件下它应该是稳定的，并且优 选会是防腐的，抵抗微生物（比如细菌和真菌）的污染作用。载体可以是含有比如水、乙醇、 多元醇(如：丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇以及类似物）的溶剂或分散介质，及其合适的混 合物。可以保留合适的流动性，比如:通过使用比如卵磷脂的涂层、通过在分散的情况下保 持所要求的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂。用于本文公开的治疗方法的合适的配方在 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co·,第16版，（1980)中有描 述。
[0131] 可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂(比如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏 血酸、硫柳汞和其类似物)实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选在组合物中包括 等渗剂（比如:糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇)或氯化钠）。可以通过在组合物中包括延迟吸 收的试剂(比如单硬脂酸铝和明胶)带来可注射的组合物的长期吸收。
[0132] 在任何情况下，无菌注射溶液可以如所要求的并且被本领域普通技术人员容易确 定的，通过将本发明的肽(通过它本身或与其他活性试剂结合）以需要的量与一种或多种成 分的结合包含在的合适的溶剂中，接着过滤除菌。一般地，分散剂通过将活性化合物引入无 菌载体中制备，其含有基本的分散介质以及来自上文列举的那些的所要求的其他成分。在 无菌粉末用于制备无菌注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该真 空干燥和冷冻干燥产生活性成分的粉末外加来自之前的其无菌过滤溶液的任意额外的期 望成分。根据本领域已知的方法，用于注射的制剂经过处理、填充到容器（比如：安瓿、袋、 瓶、注射器或小玻璃瓶)中并且在无菌条件下密封。
[0133] 在制备液体药物组合物之后，可以将其冻干以防止降解和保持无菌。用于冻干液 体组合物的方法对于本领域普通技术人员是已知的。临用前，用可能包括额外成分的无菌 稀释液（比如:林格溶液、蒸馏水或无菌盐溶液)复原组合物。经过复原(reconst i tut ion)， 使用本领域技术人员已知的那些方法将组合物向个体给药。
[0134] 进一步地，制品可按试剂盒的形式包装和出售。这种制造的物品优选会提供使用 说明的标签或包装嵌入并且可以有使用制剂所需要的额外组分。
[0135] 本领域的技术人员会领会(比如用于预防或治疗糖尿病的）本发明的肽和组合物 的有效剂量依赖许多不同的因素(包括:给药方式、个体的特点和生理状态(如健康状态）、 其他给予的药物治疗、治疗是否是诊断性的、预后的、预防性的或治疗性的，等等)变化。剂 量可以用本领域普通技术人员已知的常规方法确定以优化安全性和功效。
[0136] 显然，要给药的融合肽的量也会依赖于它要给药的个体。在所述个体是人的情况 下，要给药的肽的量会依赖于大量的因素，包括患者的年龄、症状的严重度和所述患者的既 往病史，并且总是在于所述执行医生的合理判断内。一般地，以单剂量或加倍剂量向人或其 他哺乳动物给药本发明的肽的全天剂量可以是比如：以单剂量或加倍剂量的从〇.lmg/Kg/ 天至30mg/Kg/天的所述肽的量、从0 · lmg/Kg/天至20mg/Kg/天的所述肽的量或从2mg/Kg/天 至1 Omg/Kg/天的所述肽的量。单剂量组合物可以含有这种量或其约数(submu ltiples)以组 成每日剂量。在一个实施方式中，腹膜内（IP)每日给药5mg/kg。
[0137] INGAP肽的剂量方案和配方已经被描述(参见，比如美国专利公布第2004/0132644 号)。
[0138] 在一个实施方式中，本发明的肽以药学上可接受的盐形式配制或使用。在一个特 别的实施方式中，所述药学上可接受的盐为乙酸盐。
[0139] 在一个实施方式中，本发明的肽是基本上纯的。
[0140] 稳定性可以采用本领域已知的方法确定。比如，肽的稳定性通过比较各种参数(包 括但不限于：纯度、杂质的总的百分比、个别杂质的百分比（如由HPLC或其他合适的定量方 法测定的）、外观和样品的含水量来确定。HPLC方法可以用来确定相对于所述治疗性的肽水 平的降解产物的水平的任何增加。
[0141] 在存在或不存在湿度下以及在透光或黑的小玻璃瓶中，肽样品（无论是在溶液中 或冻干的粉末)可以在各种温度下贮存。不同贮存条件期间的降解可以导致杂质的增加和 治疗性肽含量的减少。在一些实施方式中，希望样品制剂的纯度大于80%、大于90%、大于 95%或大于97%。
[0142] 本发明的肽也可以作为药学上可给药的组合物的成分被给予。换句话说，肽可以 出现在用于向需要其的个体给药的配方中。本发明的肽可被用于比如治疗糖尿病的唯一的 活性成分。或者，组合物也可以含有一种或多种额外的化合物（比如，可以用于治疗同样的 或相关症状的第二试剂）。
[0143] 应被理解的是本发明的肽可以任选地与在治疗所述紊乱或需要治疗的症状中有 效的其他试剂组合给药。与本公开的范围一致，本发明的肽和组合物可以与其他的治疗性 或预防性试剂使用。本发明的肽可以与第二试剂伴随或顺序地给药。应被理解的是任何用 于1型或2型糖尿病或相关紊乱的治疗剂被考虑用于与本发明的肽组合。这种治疗性或预防 性试剂的实例包括但不限于:抗糖尿病试剂比如二甲双胍、磺酰脲(如:格列本脲、甲糖宁、 格列美脲）、那格列胺、瑞格列奈、噻唑烷二酮类(如:罗格列酮、匹格列酮）、PPAR_ γ -激动剂 (比如GI 262570)和拮抗剂、PPAR-γ/α调节剂（比如KRP297)、a葡萄糖苷酶抑制剂（比如:阿 卡波糖、伏格列波糖）、DPPIV抑制剂（比如LAF237，MK-431)、a2拮抗剂、降血糖试剂、胆固醇 吸收抑制剂、HMGCoA还原酶抑制剂(比如他汀类）、胰岛素和胰岛素类似物、GLP-1和GLP-1类 似物（比如exendin-4)和/或淀粉不溶素。在一个实施方式中，本发明的肽和组合物与免疫 调节剂阿那白滞素(一种证实用于治疗类风湿性关节炎的IL-1抑制剂，而具有在糖尿病中 有功效的证据)组合使用。
[0144] 在一个实施方式中，第二治疗剂是保持细胞团的试剂，比如通过阻止细胞的细 胞死亡或凋亡，保护胰岛对抗IL-1比如IL-Ιβ的有害功能，保护抵抗致糖尿病的试剂和/或 其他保护或提高胰岛活力和/或功能。第二治疗剂也可以逆转胰岛素抵抗、控制肠葡萄糖的 吸收、正常化肝葡萄糖的产生和/或提高细胞葡萄糖敏感以及胰岛素分泌。在一个实施方 式中，第二治疗剂可以是转录因子NF-κΒ的抑制剂或细胞因子诱导的转录因子NF-κΒ的激活 的抑制剂。在一个实施方式中，第二治疗剂为阿那白滞素。在其他实施方式中，第二治疗剂 为胰岛素、胰岛素类似物、SGLT 2抑制剂、新的胰岛形成诱导、干细胞治疗、Τ淋巴细胞抑制 剂、IL 12激活剂、STAT 4激活剂、免疫调节剂、胰岛移植物、抗炎剂、抗CD3单克隆抗体和/或 白细胞介素 l(IL-l)受体拮抗剂。
[0145] 实施例
[0146] 通过参考以下实施例会更容易理解本发明，以下实施例被提供用来说明本发明， 并且不解释为以任何方式限制其范围。
[0147] 实施例1 INGAP-P和r-INGAP剂量依赖地增加 RIN-m5F细胞的增殖。
[0148] 虽然胰腺导管细胞已经被认为是INGAP的特定靶（Rosenberg，L.等人，1988， Diabetes，37:334-341; PUtenger，G · L ·等人，2007，Pancreas，34:103-111 )，包括临床试验 结果的大量研究提示β细胞也会对INGAP的刺激做出应答。为了研究INGAP对β细胞的效应， 我们使用RIN-m5F，RIN-m5F为一种大鼠胰岛瘤细胞系，通常用作β细胞体外代用品（Cozar-Castellano，I.等人，2008，Diabetes，57: 3056-3068)。虽然在我们的实验中没有观察到在 胰岛素表达上的显著功能，数据显示24小时后INGAP-P和r-INGAP均剂量依赖地诱导BrdU在 RIN-m5F细胞中的掺入（图1A)，对于r-INGAP来说最有效的浓度为InM(相对于阴性对照1.5 倍增加，阴性对照是用PBS处理(等于1))，并且对于INGAP-P来说最有效的浓度为835nM(相 对于阴性对照1.8倍增加）。总的来说，这个倍数变化与在仓鼠导管外植体和ARIP细胞上的 较早数据一致(Rafaeloff，R.等人，1997,J Clin Invest,99:2100-2109)。用用作阳性对照 的EGF( 10ng/ml，1 · 49倍增加)和Exendin 4( 10nM，1 · 56倍增加)观察到了类似的促有丝分裂 功能（图1A)。
[0149] BrdU掺入的增加与Erkl/2快速的暂时性激活一致，在加入r-INGAP或INGAP-P后的 1至15分钟之间观察到（图1B、C)。要注意的是，EGF和Ex-4似乎产生更长的持续的Erkl/2激 活（图1C)，这提示由这些因素和INGAP激活的信号途径中的差异。这些结果显示蛋白质和肽 均以类似的方式起作用，但是具有不同的摩尔效能（至少167倍的差异）。应该注意的是，采 用源自去分化的、胰岛衍生的导管样结构的功能性人胰岛的体外再生模型(Assouline-Thomas，B ·等人，2010，Protein Expr Pur if，69 :1-8)和在 HPDE 细胞中（Beatrice，G ·和 Assouline-Thomas,L.R.,Islet neogenesis associated protein(INGAP)induces endocrine differentiation of human pancreatic ductal cells in vitro.70th American Diabetes Association Meeting. 2009)，在 15-mer肽和所述rINGAP蛋白之间也 观察到了效能上的类似差异。这种现象最可能的解释是INGAP蛋白和INGAP-P与细胞表面不 同的相互作用和/或激活不同的信号途径。
[0150] INGAP-19和INGAP-19C肽也显示诱导RINm5F细胞中Erk 1/2激活，并且均比INGAP-P或 INGAP-PC有效（图 23)。
[0151] 实施例2 r-INGAP和INGAP1()2_12()结合RIN-m5F细胞在细胞表面形成簇样复合体，而 INGAP1(^118快速内化到细胞质。
[0152] 为了确定INGAP怎样结合和内化到RIN-m5F细胞中，我们采用经荧光活性染料 DyLight-488(绿）和-594(红）标记的r-INGAP以及5-FAM标记的INGAP-P。如图10中所示， 50nM DyLight-488r-INGAP在几分钟之内结合RIN-m5F细胞的细胞表面，并且在细胞表面形 成小的簇和斑，类似于对其他配体所描述的膜多蛋白复合体的交联。这在37°C下和冰上均 观察到，提示高的亲和受体结合。这不同于由用作小窝蛋白和网格蛋白介导的胞吞作用的 阳性标记的霍乱毒素 B(CTB、AlexaFluor 594)和转铁球蛋白（Texas Red，均来自 Invitrogen)显示的均匀染色（图2A、B)。虽然内化的第一信号在15分钟后观察到（图10、 11)，该蛋白质出现在细胞表面保持成簇几个小时（图2C-E、图11)，不像转铁球蛋白和CTB在 1小时内内化（图2C、D)。在5小时孵育后，大多数的荧光标记在细胞内可见（图2E)，并且与溶 酶体标记(LysoTracker red)部分共定位。24小时后，所有标记的rINGAP出现内化并且与溶 酶体连接(虽然是部分），并且显示不再进一步结合到细胞表面（图2F)。对于INGAP 1(^12Q结 果类似(图19)。
[0153] 有趣的是，在追踪实验中，当细胞暴露于DyLight488rINGAP仅1小时，接着清洗和 在没有rINGAP下培养5小时或24小时，内化的rINGAP的量与在连续培养之后相比没有显著 下降（图12)。这提示大多数的INGAP受体是配体结合的相当快的，在1小时内，并且受体更新 时间（turnover time)可能超过24小时。
[0154] rINGAP和CTB或转铁球蛋白之间的共迀移的缺乏提示rINGAP不是通过网格蛋白或 小窝蛋白介导的途径的任何一个内化的。这与网格蛋白和小窝蛋白的免疫染色结果一致， 显示不与rINGAP共定位（图11)。由于观察到的这些药物细胞毒性（比rINGAP内化显像 (developing)更快），我们不能用网格蛋白介导的胞吞作用的特异性抑制剂（氯丙嗪、丹 (磺)酰戊二胺)或小窝蛋白介导的胞吞作用的特异性抑制剂(菲律宾菌素和甲基环糊精） 以及Dynasore (发动蛋白抑制剂)核实这些数据。然而，我们示出了 rINGAP的内化被渥曼青 霉素(流体相胞饮作用和PI3K的抑制剂)和细胞松弛素 D(肌动蛋白聚合的抑制剂)抑制，提 示作为rINGAP胞吞作用的主要机制的大胞饮(macropinocytosis)。
[0155] 与r-INGAP和INGAP1()2_12()相比，在细胞表面没有观察到FAM标记的INGAP 1()4_118的积 累或成簇（图4)。这些结果表明一经结合到细胞膜，15-mer肽就被内化。在孵育5分钟后，标 记的肽在RIN-m5F细胞的细胞质中可见，在30分钟后达到稳定水平（图4)。如在图4C中可见， 在30分钟之后INGAP-P显现出与早期的内涵体共定位，并且之后逐渐迀移到溶酶体的隔室， 与LysoTracker red共定位（图4D、F)。
[0156] 除了细胞结合和内化的动力学上的差异，已经观察到蛋白和肽之间的一些其他差 异。比如，内化的INGAP-P出现更快的降解，如在24小时的连续和"追踪"孵育实验中所示（图 13)。并且，INGAP-P内化在冰上或通过与小窝抑制剂菲律宾菌素预孵育被抑制（图14)，这提 示这个过程可能被小窝/脂阀胞吞作用介导。网格蛋白依赖的胞吞作用的抑制剂(氯丙嗪、 丹(磺)酰戊二胺)没有显著的功能(未示出）。另一方面，INGAP-P内化通过与细胞松弛素 D预 孵育15分钟而被抑制，引起细胞表面小簇的形成（图5C)。这提示肌动蛋白丝与INGAP-P内化 过程相关。然而，不像是大胞饮，因为渥曼青霉素没有显现在这个过程上有抑制功能（图 ?) 〇
[0157] 为研究rINGAP、INGAP1(^12()和INGAP1^ 118是否通过同样的受体起作用，DyLight-488-rINGAP和FAM-INGAP1()2_ 12()或INGAP1()4_118被用在具有20倍摩尔过量的未标记的蛋白或肽 的竞争实验中。结果显示该蛋白质的内化被未标记的蛋白质部分抑制，并且肽的内化被未 标记的肽部分抑制，但是它们在实验浓度下没有出现相互抑制（图6)。这个结果提示蛋白和 肽可能不结合相同的受体。
[0158] 实施例3Erk 1/2激活
[0159] 为了比较19-mer延长肽(19-mer序列1、序列2和序列3;参见表1)和15-mer INGAP-P肽(参见表1)的效力，在RINm5F细胞中测量Erk 1/2激活。结果在图18中显示。图18中出现 的数据显示，当在相同浓度下检测时，与15-mer INGAP-P肽和其余两种19-mer序列相比，在 RIN细胞的Erk 1/2激活上19-mer序列3具有3倍多的有效性。在1 X浓度下的19-mer序列3的 有效性是在10 X浓度下的15-mer肽的约2.5倍，提示19-mer序列3肽有更高的效能。
[0160] Erk 1/2的激活可能是通过由受体酪氨酸激酶(RTK)或由不同种类的G蛋白偶联受 体(GPCRs)在细胞膜水平上起始的大量信号级联介导的。这些信号级联包括PKC、PKA、P13K 或Ras/Raf依赖途径。因为INGAP受体的性质未知，我们采用磷酸特异性抗体和上述途径的 药理抑制剂筛选RTK和GPCR起始的信号事件。为了比较我们使用EGF(10ng/ml)和Ex-4 (10nM)，发现在所示的浓度下对于RIN-m5F细胞是促有丝分裂的（图1A)。因为EGF信号贯穿 经典的RTK途径并且Ex-4是G蛋白偶联的GLP-1受体的拮抗剂，这种比较可能为INGAP怎样工 作提供重要的线索。
[0161] 低分子量的Ras家族GTP酶的激活是通过RTKs信号传递的首要事件，比如EGFR。然 而，显然由GPCRs引起的MAP激酶激活的机制也可能包括由GPCRs和RTKs之间的通话引起的 Ras激活，比如，对于几种GPCR配体(包括GLP-1)所显示的EGFR的反式激活。与此见解一致的 是，我们的结果显示由INGAP-P和rINGAP引起的快速Ras激活（图7A)，与Erk 1/2磷酸化的时 间轴一致(图IB、C)，并且与c-Raf的时间轴一致(图7B)，因此涉及Ras-Raf-MAPK途径。
[0162] 除了Ras激活，我们观察到用INGAP-P处理30分钟后Akt磷酸化的增加，该增加相对 于Erk 1/2的激活被延迟（图15)。这提示PI3K/Akt信号传导的激活是平行于而不是由 INGAP-P引起的Erk 1/2磷酸化的原因。rINGAP也显现能轻微提高Akt磷酸化，虽然改变不显 著。如在图15中所示，Akt的最强的激活由Ex-4诱导，其在早期的时间点观察到，并且与在另 一个大鼠胰岛瘤细胞系中的GLP-1信号传导上的数据一致（Buteau，J .等人，1999， Diabetologia ,42,856-864)。在EGF处理后也观察到Akt的早期激活，3小时后具有明显的第 二波峰。综合考虑，这些结果表明Ras-Raf-Erk激活的信号传导事件上游可能在INGAP-P和 rINGAP之间变化，并且好像不同于由Ex-4和EGF诱导的那些。值得注意的是，我们没有观察 到由任何蛋白质或肽引起的任何P38MAPK(蛋白质印迹），或PKA(ELISA)，或PKC(蛋白质印迹 和ELISA)的显著激活(数据未显示）。
[0163] 为了研究INGAP诱导的增殖中涉及的信号传导事件，我们采用Raf(Raf抑制剂1)、 PI3K(渥曼青霉素）、PKC(Bis)、PKA(H89、PKi)、腺苷酸环化酶（SQ22536)、Src(PP2)和EGFR (AG1478)的特异性药理学抑制剂。另外，百日咳毒素（Ptx)用于检查INGAP的作用是否由 GPCR介导。这些抑制剂的有效性通过用INGAP或EGF或Ex-4处理10分钟后的Erk 1/2磷酸化 和通过24小时后的BrdU掺入进行判断。
[0164] 如在图8A中所示，INGAP诱导的Erkl/2激活通过暴露于Ptx 24小时后，抑制40%， 但是不受AG1478的影响（图8B)。这提示INGAP可能通过GPCR传递信号，但是这种信号传导不 涉及EGF受体，如对GLP-1 之前已经显示的（Buteau，J·等人，2003，Diabetes，52，124-132)。 Ptx也抑制由INGAP或EGF或Ex4诱导的早期Ras激活（图9)，其进一步支持了 INGAP通过GPCR-Ras途径传递信号的想法。与之前的Ras-Raf信号传递的暗示一致的是，用Raf激酶抑制剂1 预处理减少了下述两者：10分钟后Erk 1/2的激活（图8B)和由测试的所有生长因子诱导的 24小时后BrdU的掺入（图16)。有趣的是，Src抑制剂PP2抑制了由r-INGAP刺激而不是由 INGAP-P刺激的Erk 1/2磷酸化（图8B)以及增殖（图16)，其进一步凸显了蛋白质和肽之间在 信号传导上的不同。
[0165] 除了由TO98059引起的预期的Erk 1/2和BrdU掺入的抑制，没有所测试的其他抑制 剂(针对PKC、PI3K或PKA)显著减少Erk 1/2磷酸化。除了H89(PKA抑制剂）引起rINGAP处理的 细胞在24后BrdU掺入的减少(这在以下讨论），在其他组中没有观察到增殖的抑制（图16)。 我们较早的数据清楚地表明PI 3K/Akt在来自人去分化的导管样结构的INGAP-P诱导的胰岛 新生中信号传导(Jamal，Α·Μ·等人，2005，Cell Death Differ ,12,702-712)。这种途径好像 也介导INGAP-P在大鼠新生胰岛上的效应(Barbosa,H. C.等人，2008, J Endocrinol ,199， 299-306)。此外，PI3K介导的信号传导好像是对于Reg蛋白最常见的途径(Takasawa，S.等 人，2006，FEBS Lett，580，585-591 ;Bishnupuri，K. S.等人，2006，Gastroenterology，130， 137-149)。在这种背景中，我们的数据显示在INGAP-P或rINGAP的促有丝分裂效应中不涉及 PI3K/Akt途径的数据可能看起来是惊奇的。然而，我们确实在用INGAP-P处理30分钟的细胞 中观察到六1^磷酸化，其在1-15分钟时尾随1^18-1^1；1^4激活中的峰。
[0166] 与Erk 1/2数据相比，PKA的抑制剂(H89)减少了rINGAP处理的细胞中BrdU掺入（图 16)。鉴于GPCR信号传导中cAMP依赖的PKA的已知作用，以及之前表明这种途径在INGAP-P在 背根神经节的神经突生长物上的刺激功能中的结果(Tam, J.等人，2006,Neuroreport，17， 189-193)，我们进行额外的实验以检查这种途径在INGAP诱导的增殖上的可能牵连。在Erk 1/2磷酸化上，我们也测试了更多的特异性PKA抑制剂PKi (Murray，A· J ·，2008，Sci Signal， l，re4)以及一种腺苷酸环化酶的特异性抑制剂SQ22536。如在图8A中所示，PKi(lOOnM)没有 作用，并且SQ22536(200nM)不仅没有减少由INGAP-P或rINGAP诱导的Erk 1/2磷酸化甚至也 没有稍微使其增加。
[0167] 我们的结果提示在INGAP信号传导中不涉及cAMP-PKA途径，在这种背景中，如果 INGAP确实通过GPCR传导信号，受体可能不偶联到Gi蛋白，Gi蛋白具有抑制腺苷酸环化酶的 能力（Luttrell，L.M.，2002，Can J Physiol Pharmacol,80,375-382)。
[0168] 综合考虑，本文呈现的数据显示INGAP-P和rINGAP均通过激活Ras-Raf-Erk途径刺 激RIN-m5F细胞的再生。INGAP-P和rINGAP可能均通过不诱导cAMP激活的偶联受体的Gi蛋白 起作用。
[0169] 实施例4 INGAP肽的稳定性检测
[0170] 在血清存在下测定INGAP-P和INGAP-19肽的降解图（图20)。5(^]?肽在含有25%FBS 的RPMI-1640培养基中孵育所示的时间。在血清蛋白的乙醇沉淀后，接着通过HPLC分析样 品。为比较肽降解的动力学HPLC图是如所示的叠加的。
[0171] 还进行FBS中INGAP-PC和INGAP-19C肽的体外孵育的时间进程研究（图21)。50μΜ INGAP-PC和INGAP 19C在含有25%FBS的RPMI-1640培养基中孵育所示的时间。在血清蛋白 的乙醇沉淀后，接着通过HPLC分析样品。为比较肽降解的动力学HPLC图是如所示的叠加的。 可见在血清存在下48小时中，没有观察到INGAP-19C降解（图21B)。在所检测的INGAP肽中， INGAP-19C显示了最高的稳定性。
[0172] 实验步骤
[0173] 重组INGAP蛋白和INGAP肽
[0174] 在Sheldon生物技术中心(麦吉尔大学，蒙特利尔)合成并HPLC纯化INGAP蛋白的15 氨基酸片段(氨基酸104-118)和INGAP蛋白的19氨基酸片段(氨基酸102-120)。通过PCR产物 的定向克隆从仓鼠胰腺组织中克隆含有C末端6-Hi s标签的全长重组INGAP (r -INGAP)(分子 量 17.6kDa)，该PCR产物用将Superscript III RT和Platinum?Pfx DNA聚合酶 (Invitrogen)引入pcDNA3 · lD/V5-His-T0P0?表达质粒（Invitrogen)中产生。这种构造 ((3〇1181：1'11〇1:)用于再克隆到慢病毒载体并在!1293细胞中表达(如在488〇111;[116-1'1101]^8，13.等 人，2010，Protein Expr Purif ,69:1-8中所描述的）。如所描述的（Assouline-Thomas，Β·等 人，2010，Protein Expr Purif,69:1-8)使用Cobalt树脂（BD TAL0N?，BD Biosciences，或 Fractogel EMD螯合物(M)，Merck)进行r-INGAP的纯化。
[0175] 细胞培养
[0176] RIN-m5F细胞（第18代）购自ATCC，并在37°C/5%⑶2下保持在含有25mM葡萄糖、 10 %FBS( Montreal Biotech)和抗生素/抗真菌药（Invitrogen)的 RPMI-1640培养基 (Invitrogen)中。在第25-31代细胞上进行实验。细胞接种在60mm组织培养皿上（每皿1 X 1〇6个细胞)并允许生长24-48小时，随后在用INGAP蛋白或肽处理之前撤出血清24小时。在 无血清培养基中给药INGAP-P(15-mer肽）、INGAP-P2(19-mer肽）、rINGAP和EGF( 10ng/ml， Sigma)所示的时间。
[0177] 通过BrdU免疫染色测定细胞增殖
[0178] 如上面描述的，用INGAP、EGF或Ex4处理接种在8孔或4孔小室载玻片上的细胞(每 孔5X 104或1 X 105个细胞)24小时，并在处理的最后3小时加入50μΜ BrdU。用PBS清洗细胞并 在-20°C下在甲醇中固定10分钟。按照生产商的方案用小鼠抗BrdU抗体(Roche)对BrdU进行 免疫染色。这之后接着用第二、HRP结合的抗体(广谱，HistostairT-Plus)和AEC色原体(均 来自Zymed Laboratories)检测。用苏木精对载玻片进行复染。计数BrdU阳性和阴性细胞核 (每孔总共200个），并且计算BrdU阳性细胞核的百分比（图36)。
[0179] 蛋白质印迹分析
[0180] 接着处理，将细胞放置在冰上，用PBS清洗并溶解在含有2.5mM Na4P2〇7、ImM Na3V〇4 和完全蛋白酶抑制剂混合片(Roche)的裂解液(Cell Signaling，Inc.(细胞信号传导有限 公司），Beverly，MA)中。等量的蛋白质（20-50yg，用DC蛋白质分析(Bio-Rad)测定）由10% SDS-PAGE分解，接着在250mA下向硝化纤维膜(Bio-Rad)转移90分钟并用不同的抗体分析。 抗Erkl/2(MAPK 44/42)和抗磷酸Erkl/2(Thr202/Tyr204)兔多克隆抗体购自Cell Signal ing。接在第一抗体孵育后，清洗印迹并之后在第二、抗小鼠或抗兔HRP结合的抗体 (Cell Signaling)中孵育，并清洗和用ECL系统(GE Healthcare)显色。为分析相同印迹上 的几种蛋白的表达，首先用磷酸抗体孵育膜，接着再用相应的非磷酸第一抗体探测之前进 行清洗(〇.21甘氨酸、0.1%303、0.05%吐温20，？!12.2)。
[0181 ]荧光 rINGAP、INGAP102-120 和 INGAP104-118 的可视化
[0182]如操作指南所详述，用 DyLight-488 或 DyLight_594(ThermoScientific)#E100 y g rINGAP。在Sheldon生物技术中心（麦吉尔大学，蒙特利尔）或Canpeptide (Pointe Claire，魁北克），在合成期间用5-FAM或FITC标记INGAPH12()和INGAP1(^ 118。将荧光rINGAP (50nM)或 INGAP1Q2-12Q 和 INGAP1Q4-118(8·35-16·7μΜ)加入到生长在玻璃室载玻片(Beckton-Dickinson或Lab-Tek)中的RIN-m5F中，在不同间隔后接着用PBS清洗并在4%多聚甲醛中固 定。载玻片用含有DAPI的VectaShieId培养基(Vector)或Prolong Gold(Invitrogen)覆盖 其上，用于细胞核的复染以及在共聚焦显微镜Zeiss LSM 510或Olympus FVlOi下的检查。 为了活体共聚焦成像，将细胞生长在Nunc?分室的盖片载玻片(ThermoScientif ic)中。在用 INGAP孵育之前，用0.01 %DAPI染色细胞核，接着清洗。活体成像在37°C和5%C02下进行。 [0183]统计分析
[0184] 实验重复至少三次。结果表示为平均值土标准误差。用不配对Student ' s t检验进 行统计分析。P值〈〇. 05被认为显著。
[0185] 实施例515L INGAP和 15C INGAP的比较
[0186] 步骤:细胞接种和处理：
[0187] 从RINm5F细胞的板上吸取所有含FBS的培养基，并将10mL PBS移液到板中以洗去 培养基。吸取PBS并将600yL胰蛋白酶移液到板中。倾斜板以保证胰蛋白酶覆盖所有。向板中 加入8mL含有FBS的培养基，并之后收集培养基和细胞的混合物到15mL管中。为确定细胞浓 度，在显微镜下用血球计计数用1:1稀释的细胞和台盼蓝的细胞。计算每板中需要的细胞的 量以得到想要的5X10 5细胞/板的细胞密度，并将细胞接种在16-35mm的板上。在37°C、5% C02下将细胞孵育3天。将培养基从含血清培养基更换为无 FBS培养基，以在处理之前对所述 细胞血清饥饿24小时。处理16板：
[0188] a、用 15C INGAP处理4板
[0189] b、用15L INGAP处理4板
[0190] c、用FBS处理4板
[0191] d、用H20处理4板
[0192] 将板孵育48小时，通过胰蛋白酶消化从每板收集细胞并且将每个样品置于它自己 的微量离心管(Eppendorf tube)中。
[0193] 细胞生活力(Viability)测定
[0194] 通过将5yL来自1个样品的细胞与10mL小玻璃瓶中的细胞计数仪器的盐溶液混合， 进行细胞生活力测定。将小玻璃瓶放置在探测仪内。该仪器会计数活细胞的数量。用所有的 其他细胞样品重复细胞计数，每个样品做两个独立的计数。进行如下所示的Bradford分析 以标准化细胞计数比总蛋白质。结果在下面的表1A-C中示出。
[0195] 表1A通过细胞生活力分析比较15L INGAP和15C INGAP在细胞增殖上的效应
[0196]
表1B细胞生活力单因素方差分析(AN0VA)
[0198]
[0199] 表1C独立T检验后的细胞生活力
[0200]
[0201] Bradford 分析
[0202] 进行Bradford分析以标准化细胞计数比总蛋白质。将样品离心、吸出培养基，并在 每管中用lml PBS更换并再次离心。吸出roS用200yL RIPA裂解缓冲液更换。在4°C空间内再 次离心。溶解在RIPA裂解缓冲液中的5yL 8种不同的"标准"浓度的BSA被移液到96孔板的头 3列中（每个浓度三份），最后的浓度作为空白，其只含有裂解缓冲液。这些之后将用于计算 目的。离心每个蛋白质样品的两份。通过混合2mL来自Bio-Rad蛋白质分析试剂盒的溶液A和 40yL也来自该试剂盒的溶液S，在一起制备大约2mL的Bradford试剂。通过移液管将25yL Bradford试剂置于每孔中。来自试剂盒的200yL的溶液B置于每孔中。将板振荡10分钟以将 溶液混合在一起(确保没有气泡)并放置在读数仪中以计算每个样品的吸光度。所获得的值 输入电子表格程序中。用标准品的已知浓度(X值)和它们的吸光度值(y值)创建标准曲线。 通过代入它们的吸光度值，用最适线的公式用代数方法计算样品的浓度。
[0203] 通过BrdU免疫染色评价细胞增殖
[0204] 将细胞接种在三个8孔小室载玻片中（每孔1X105个细胞），用15C INGAP、15L INGAP、水或FBS处理细胞，并孵育过夜，并在处理的最后3小时期间加入50μΜ BrdU。用roS清 洗细胞并在_20°C下在甲醇中固定10分钟。按照厂商的协议用鼠抗BrdU抗体(Roche)进行 BrdU免疫染色。这之后接着用第二、HRP结合的抗体(广谱，Histostain?-Plus)和AEC色原体 (均来自Zymed实验室）的检测。用苏木精复染载玻片。计数BrdU阳性和阴性细胞核(每孔总 共200个)并计算BrdU阳性细胞核的百分比。结果在下面的表2A-C中示出。
[0205] 表2A通过BrdU染色比较15L INGAP和15C INGAP对细胞增殖上的效应
[0206]
[0207]表2B BrdU单因素 (AN0VA):
[0208]
[0209] 表2C独立T检验后的BrU 「02101
[0211]蛋白质印迹分析
[0212] 磷酸ERK的蛋白质印迹:如下
[0213] 在细胞接种和处理步骤后，用不同的处理和不同的时间处理16板：
[0214] a、2板 10X15C INGAP放置5分钟
[0215] b、2板 10X15C INGAP放置 10分钟
[0216] c、2板 10X15C INGAP放置30分钟
[0217] d、2板 10X15C INGAP放置60分钟
[0218] e、2板 10X15L INGAP放置5分钟
[0219] f、2板 10X15L INGAP放置 10分钟
[0220] g、2板 10X15L INGAP放置30分钟
[0221] h、2板 10X15L INGAP放置60分钟
[0222] 在孵育之后，用冷的PBS清洗板两次以保证所有的INGAP处理从板上除去。通过向 每板加入200yL RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并放置在振荡器上大约20分钟以保证完全裂 解。用移液器将蛋白质样品收集进微量离心管中并在4°C空间在16.1 X1000 rpm下离心20分 钟。所获得的上清转移到新的试管中，并进行Bradford分析以确定每个样品中蛋白质的浓 度。当总共15yg上样到凝胶的每孔中时溶解所需量的蛋白质。样品与上样缓冲液结合，在 100°C下加热5分钟，并和梯（ladder)-起置于具有10孔的2-10%丙烯酰胺凝胶上，在200V 下跑50分钟或直至前面的蓝色蛋白跑出底部。通过在0.3A下运行转移1小时，用双转移夹心 将蛋白质从凝胶转移到带正电荷的硝化纤维膜上。这个转移将已跑蛋白质从凝胶物质转移 到膜上。将该膜放置在干净的容器中，并且让它在这个时间T期间放在振荡器上，通过浸没 在5%BSA TBST中1小时将非特异性蛋白封闭。
[0223] 移除封闭液并允许膜保持在第一抗体溶液（10yL兔抗磷酸ERK抗体，其在10mL的 5%BSA TBST中结合到磷酸化的ERK)中，并且让它在温度为4°C的空间振荡过夜。移除第一 抗体，并用约10mL的1XTBST缓冲液洗膜，让它置于振荡器上10分钟。重复该清洗三次。然后 在室温下在振荡器上将膜置于第二抗体溶液中（l〇yL羊抗兔抗体，在1:1000稀释因子的情 况下，其在10mL5%BSA TBST中结合到第一抗体）1小时。这引起蛋白发出化学发光，因此它 可以用仪器观测。该膜用第二抗体溶液处理两次。该膜用lmL ECL溶液覆盖5分钟，并放置在 能观测磷酸化的ERK的chem-doc仪器中。用计算机程序Image Lab定量凝胶上的磷酸化的 ERK的带。
[0224] 在磷酸化ERK的定量之后，用TBST洗涤膜以除去ECL溶液，并用兔抗ERK代替兔抗磷 酸化ERK作为第一抗体重复抗体过程，目的是定量总的ERK而不是磷酸化的ERK。总共3个蛋 白质印迹实验。结果显示在表3A-C中。
[0225] 表3A通过蛋白质印迹比较15L INGAP和15C INGAP在ERK1/2磷酸化上的效应
[0226]
[0228] 表3B蛋白质印迹双因素 AN0VA
[0229]
[0230] 表3C独立T检验后的蛋白质印迹 12
2 虽然本公开连同其【具体实施方式】已经被描述，应该会理解它能有更多的改变，并 且本申请意在覆盖下述:总的来说，按照本公开的原则和包括如在本公开相关的和如可能 应用于本文的之前所示的和如下在随附的权利要求的范围内的必要特征的领域内已知或 通常实践范围内的本发明的背离的本公开的任何变化、用途或适应性的改变。
[0233] 除非被另外定义或上下文清楚地表明其他，本文所用的所有技术和科学术语具有 与在本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的同样的含义。应被理解的是与本文描述 的那些相似或等价的任何方法和材料可以用在该发明的实践或检测中。
[0234] 本文引用的所有文件和参考以其整体包含在此引作参考。
【主权项】
1. 一种肽，其包含SEQIDN0:4、SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的序列。2. 根据权利要求1所述的肽，其中所述肽诱导个体中胰腺β细胞新生、诱导胰腺β细胞再 生、提高葡萄糖动态平衡和/或逆转高血糖症。3. 权利要求1所示的肽的类似物、同系物、片段或变体，其中所述类似物、同系物、片段 或变体具有所述肽的生物活性。4. 根据权利要求3所述的类似物、同系物、片段或变体，其中所述类似物、同系物、片段 或变体具有与所述肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序 列同一"性。5. 根据权利要求4的融合蛋白的类似物、同系物、片段或变体，所述生物活性为所述肽 的细胞或受体结合特异性。6. 根据权利要求4的融合蛋白的类似物、同系物、片段或变体，其中所述生物活性为诱 导个体中胰腺辟田胞新生的能力、诱导个体中胰岛细胞再生的能力、提高个体中葡萄糖动态 平衡的能力和/或逆转个体中高血糖症的能力。7. -种核酸分子，其包含编码SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的肽或其类似 物、同系物、片段或变体的核酸序列。8. 权利要求7所述的核酸分子可操作地连接到表达控制序列以形成的表达载体，其中 所述表达载体在合适的细胞中是可增殖的。9. 一种药物组合物，其包含权利要求1所述的肽或类似物、同系物、片段或变体以及药 学上可接受的载体或赋形剂。10. 根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述组合物适于口服给药。11. 根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述组合物适于注射给药。12. -种用于预防或治疗胰腺症状或疾病的方法，所述方法包括给药权利要求9所述的 组合物的肽或其类似物、同系物、片段或变体。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述症状或疾病为新陈代谢紊乱。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述症状或疾病为细胞相关的紊乱。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述症状或疾病为1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿 病的并发症。16. 根据权利要求14所述的方法，其中在所述个体中凋亡或坏死引起的辟田胞死亡被阻 止或抑制。17. 根据权利要求12所述的方法，其中在所述个体中胰腺细胞的功能被改善或恢复。18. 根据权利要求12中任一项所述的方法，其中在所述个体中血浆胰岛素水平增加。19. 根据权利要求14中任一项所述的方法，其中在所述个体中胰腺β细胞的数量或尺寸 增加，和/或其中来自胰腺导管细胞的辟田胞再生被刺激。20. 根据权利要求14中任一项所述的方法，其中在所述个体中葡萄糖动态平衡被恢复 或提尚和/或尚血糖症被逆转。21. 根据权利要求12所述的方法，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体通过注 射、口服、静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给药。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体经口服 给药，每日一次。23. 根据权利要求9任一项所述的方法，其中所述个体为人。24. 根据权利要求9任一项所述的方法，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体与 第二治疗剂给药。25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述第二治疗剂伴随所述肽或其类似物、同系 物、片段或变体给药。26. 根据权利要求24所述的方法，其中所述第二治疗剂和所述肽或其类似物、同系物、 片段或变体连续给药。27. 根据权利要求24任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂为用于1型或2型糖尿病 的治疗药。28. 根据权利要求24任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂为阿那白滞素。29. -种用于治疗胰功能不全的药物组合物，所述组合物包含权利要求1所述的肽或其 类似物、同系物、片段或变体以及药学上可接受的载体或赋形剂。30. 根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体 能刺激来自胰腺导管细胞的细胞再生。31. 根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体 具有哺乳动物INGAP蛋白的生物活性。32. 根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述生物活性为刺激胰腺导管样细胞或 导管相关的细胞生长和增殖的能力。
【专利摘要】本文提供用于预防或治疗糖尿病的新的INGAP肽及其组合物和使用方法。特别地，描述了具有β细胞新生和胰岛素增效活性并且对于体内使用足够稳定的19个氨基酸的INGAP肽。
【IPC分类】C12N15/12, A61P3/10, A61K38/17, C07K14/47, C07K7/08
【公开号】CN105492459
【申请号】CN201480021504
【发明人】L·罗森贝格
【申请人】高端学术皇家研究会/麦吉尔大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年2月14日
【公告号】CA2901404A1, EP2956475A1, US20160002310, WO2014124540A1
【专利说明】
[0001 ] 优先权要求
[0002] 本申请要求2013年2月15日提交的美国临时专利申请第61/765,203号的优先权， 其内容被明确地引作参考。
技术领域
[0003] 本发明涉及用于治疗和预防糖尿病的具有胰岛辟田胞新生或再生活性的INGAP肽 及其组合物和方法。
【背景技术】
[0004] 糖尿病影响了全世界超过1亿的个体。在美国，那些被糖尿病影响的患者的估计的 医疗费用为大约每年1360亿美元。糖尿病为新陈代谢紊乱，其具有胰腺不能分泌足够量的 胰岛素的特点，其引起血糖水平的大波动并且既具有短期又具有长期的生理后果。在患有1 型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病或IDDM)的患者中起因于升高的血糖水平(高血糖症）的长 期并发症包括视网膜病、神经病、肾病和其他血管并发症。低的血糖水平(低血糖症)会导致 糖尿病昏迷、癫痫发作、意外事件(accidents)、缺氧、脑损害、认知功能下降和死亡。
[0005] 2型糖尿病，也已知为非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM，是一种进行性疾病，其具有 受损的葡萄糖代谢的特点，该受损的葡萄糖代谢引起升高的血糖水平。患有2型糖尿病的患 者呈现出受损的胰腺β细胞功能，该受损的胰腺β细胞功能引起在对高血糖信号做出响应 时，胰腺辟田胞不能分泌合适量的胰岛素；以及在它的靶组织中对胰岛素作用的抵抗(胰岛 素抵抗）。
[0006] 现在2型糖尿病的治疗目的在于逆转胰岛素抵抗，控制肠葡萄糖的吸收，正常化肝 脏葡萄糖的生产和提高辟田胞葡萄糖感知以及胰岛素分泌。因为现在糖尿病治疗的缺点，1 型和2型糖尿病的新疗法以及新的诊断和预后方法是亟需的。
[0007] 越来越多的证据表明不足的辟田胞团构成1型和2型糖尿病的起因。因此，在糖尿病 患者中细胞的再生是糖尿病研究的重要目标。近些年，有越来越多的兴趣在开发诱导辟田 胞再生和新的胰岛原位形成的新策略上（Baggio，L. L.和Drucker，D. J .，2006，Annu Rev Med ,57:265-281 )。因此，具有刺激剩余的β细胞团扩大的能力或具有胰岛新生活性的生物 活性分子的鉴定对于控制原生胰腺(native pancreas)的再生潜能是关键性的。
[0008] 胰岛新生相关蛋白（INGAP)是最初在部分阻塞的仓鼠胰腺的粗提物中发现的一种 16.8kDa蛋白（Rosenberg，L.等人，1988，Diabetes,37:334-341;美国专利第5,834,590号）。 INGAP在胰腺和十二指肠中表达，并且在几个物种中已经表现出诱导胰岛新生(Rosenberg, L.等人，1996 ,Diabetologia,39: 256-262 ;Rosenberg,L.等人，2004,Ann Surg 240 :875-884)。在结构上，INGAP是分泌的C型外源凝集素 Reg家族的一员，该家族含有多于25个成员， 基于一级序列被分为4个亚家族（21^1^，￥.￥.等人，2003，￥〇1'1(116381：1'〇611丨61'〇1，9:2635-2641;0kamoto，H.，1999，J Hepatobiliary Pancreat Surg 6:254-262)。
[0009] INGAP属于大的Reg 3亚家族，其已经在大鼠、小鼠、仓鼠和人的主要胃肠组织(胰 腺、胃、肝脏）中被识别（Rafaeloff，R.等人，1997，J Clin Invest 99:2100-2109)。尽管Reg 蛋白普遍存在，但是关于它们的功能或作用机制知道的不太多。虽然Reg 1被认为是辟田胞 促分裂原，但是关于Reg 3家族的功能知之甚少。
[0010]大量研究提示Regs可以结合特异性细胞表面受体并激活多个信号通路。支持这个 受体假说的一个论点是INGAP的生物活性看起来是由该蛋白的一个15个氨基酸片段(氨基 酸104-118)介导的，即INGAP肽（INGAP-P)，其由高度保守的IGLHDP基序和在Reg家族的其它 成员中没有被发现的单一序列SHGTLPNGS组成(Rafaeloff，R.等人，1997, J Clin Invest 99:2100-2109)。合成的INGAP肽已经被证明在仓鼠和小鼠中诱导新的胰岛形成和逆转链脲 霉素诱导的糖尿病上如所述蛋白质一样有效(Rosenberg，L.等人，1996, Diabetologia, 39: 256-262;Rosenberg，L·等人，2004，Ann Surg 240:875-884)，并且因此是所述受体的可能 配体。合成的INGAP-P的生物效应在体外和体内均被广泛研究。至今，已经显示INGAP-P: 1) 在从去分化的、胰岛来源的导管样结构诱导功能性的人胰岛的体外再生(Jamal，A.M.等人， 2005，Cell Death Differ ,12:702-712); 2)剂量依赖地刺激啮齿目动物、狗和食蟹猴中β细 胞团的扩大（Lipsett，M.等人，2007，Cell Biochem Biophys，48:127-137;Pittenger，G.L. 等人，2007，Pancreas，34:103-111)和3)增加胰岛素的分泌和β细胞尺寸以及在体外上调大 鼠新生胰岛中与β细胞功能相关的几种基因的表达(Barbosa，Η.等人，2006，Regul Pept， 136:78-84 ;Borelli，M. I ·等人，2005，Regul Pept, 13 1:97-102)。这些重要的结果跟随有 临床试验以研究它在人中的功效和安全性，其中INGAP-P被发现有改善葡萄糖动态平衡的 信号效果，其被在患有2型糖尿病的患者中在90天中糖基化血红蛋白（HbAlC或A1C)减少和 在患有1型糖尿病的患者中C-肽分泌的显著增加所证实(Dungan，K.M.等人，2009，Diabete S Metab Res Rev,25:558-565)〇
[0011]尽管这些数据提示INGAP-P既具有胰岛新生活性又具有促胰岛素活性，从动物研 究和人类实验显而易见INGAP(INGAP-P)的15-mer缺乏稳定性。相应地，为了达到所要求的 血清和组织阈值水平，必须以非常大的剂量给药。不良的稳定性也导致(比如)药物制剂、局 部注射部位反应的患者接受和高费用的问题。因此，存在与INGAP-P相比具有可比的或更大 的体内生物活性和/或更大的稳定性或更长的半衰期的INGAP类似物的需要。
【发明内容】
[0012]以前我们识别了一种叫做胰岛新生相关蛋白（INGAP)的胰腺蛋白，该蛋白是REG3 蛋白的跨种哺乳动物家族的一员（参见图19)，并且可以诱导胰岛再生仓鼠模型中的导管细 胞分化为β胰岛细胞(Rosenberg，L·等人，J Surg Res，1983，35:63-72;Rosenberg，L·等人， Diabetes，1988，37: 334-341 ;Rosenberg，L.等人，Diabetologia, 1996，39: 256-262)。一种 含有氨基酸104-118的INGAP蛋白的15-mer肽片段(INGAP-P)被确定为INGAP的生物活性中 心。
[0013] INGAP和INGAP-P均被证明能诱导导管细胞分化为胰岛。在人的胰岛再生体外模型 中，INGAP-P诱导胰腺发育转录因子PDX-1的增强表达和新的胰岛的同时形成(Jamal，A.M. 等人，Cell Death Differ.，2003，10:987-996;Jamal, Α·Μ·等人，Cell Death Differ·, 2005，12:702-712)。在动物模型中，INGAP-P诱导导管细胞体外增殖和胰岛细胞从与导管上 皮相关的细胞的再生，导致在正常成年小鼠、仓鼠和狗的胰腺中新的胰岛形成。在STZ(链脲 佐菌素)处理的糖尿病C57BL/6J小鼠模型中，INGAP-P逆转了糖尿病症状(Pittenger，G.L. 等人，Pancreas ,2007,34:103-111; Rosenberg，L ·等人，Ann · Surg ·，2004，240 :875-884 (2004) ;Kapur，R.等人，INGAP Induces Duct Cell Proliferation In Vitro and beta Cell Formation in Normal Non Diabetic Mice,71st ADA Meeting,圣地亚哥，2011)。在 已建立的（不是新开始的）自身免疫的1型糖尿病(T1DM)的NOD小鼠模型中，与免疫调节剂 IL-12抑制剂利索茶碱结合的INGAP-P诱导高血糖症的减轻并根除了对胰岛素颗粒的需要 (Tersey，S.A.等人，Unique Drug Combination for Reversal of Type IDiabetes,68th Scientific Sessions American Diabetes Association(ed.ADA)，旧金山，加利福尼亚， 2008;Tersey，S.A.等人，Journal of Diabetes Mellitus,2012,已付印）。组织学检查证实 了新的胰岛的证据。
[0014] 在人类实验中，INGAP-P已经在1型糖尿病(T1DM)患者和2型糖尿病(T2DM)患者的1 期和2期研究中被评价(Dungan，K.M.等人，Diabetes Metab Res Rev,2009,25:558-565)。 每日一次INGAP-P注射3个月引起在T1DM患者中所刺激的C-肽分泌在统计学上的显著增加 以及在T2DM患者中增加的C-肽水平的趋势。糖基化血红蛋白（HbA lc)在T2DM患者中-0.6 % (p 〈0.0125)的减少并在T1DM患者中-0.4% (p〈0.06)的减少。
[0015]尽管这些高度有希望的结果，INGAP-P的相对短的血浆半衰期继续表现出对于 INGAP-P作为治疗药的用途的挑战。
[0016] 相应地，本文提供保留INGAP-P的一种或多种生物活性并且适于作为治疗药开发 的INGAP肽。在一个实施方式中，本发明的肽具有与INGAP-P相比可比的或更大的体内生物 活性和/或更大的稳定性或更长的半衰期。
[0017] 在一个实施方式中，本文提供包含SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列的肽。 [0018]在另一个实施方式中，本文提供由SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列组成的 肽。
[0019] 在一些实施方式中，本发明的肽诱导胰腺辟田胞新生，诱导胰腺辟田胞再生，提高葡 萄糖动态平衡和/或逆转个体中的高血糖症。
[0020] 本文还提供本发明的肽的类似物、同系物、片段或变体，其中所述类似物、同系物、 片段或变体具有所述肽的生物活性。类似物、同系物、片段或变体可以具有与本发明所述肽 的至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。所述生物 活性可以是(比如)所述肽的细胞或受体结合特异性、诱导胰腺β细胞新生的能力、诱导胰岛 细胞再生的能力、改善葡萄糖动态平衡的能力和/或逆转个体中高血糖症的能力。
[0021] 也提供含有编码本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体的核酸序列的核酸 分子。核酸分子可以可操作地连接到一个表达控制序列以形成一个表达载体，其中所述表 达载体在合适的细胞中增殖。
[0022] 也提供包含本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体以及药学上可接受的载 体或赋形剂的药物组合物。在一个实施方式中，组合物被改为适于口服。在另一个实施方式 中，组合物被改为适于通过注射给药。
[0023] 在另一个实施方式中，提供包括对需要其的个体给药本发明的肽或其类似物、同 系物、片段或变体或组合物的预防或治疗胰腺症状或疾病的方法。在一个实施方式中，所述 症状或疾病为新陈代谢紊乱。在另一个实施方式中，所述症状或疾病为细胞相关的紊乱。 在更进一步的实施方式中，所述症状或疾病为1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病的并发症。
[0024] 在一些实施方式中，由凋亡或坏死引起的辟田胞死亡在个体中通过给药本发明的 肽或其类似物、同系物、片段或变体或组合物被阻止或抑制。在其他实施方式中，个体中的 胰腺细胞的功能被改善或恢复，个体中的血浆胰岛素水平是增加的，个体中的胰腺β细胞的 量或尺寸是增加的，个体中胰腺导管细胞来源的β细胞再生是被刺激的，个体中的葡萄糖动 态平衡被恢复或改善和/或个体中的高血糖被逆转。
[0025] 本发明的肽和组合物可以通过注射、口服、静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给药。在 一个实施方式中，肽和组合物是口服给药的，每天一次。
[0026] 在一个特别的实施方式中，个体为人。
[0027] 在一些实施方式中，本发明的肽是与第二治疗剂给药的。第二治疗剂可以与本发 明的肽伴随给药，或第二治疗剂和肽可被顺序给药。在一个实施方式中，第二治疗剂对于1 型或2型糖尿病是治疗性的。在另一个实施方式中，第二治疗剂为阿那白滞素。
[0028] 还提供了用于治疗胰功能不全的药物组合物，该组合物含有本发明的肽和药学上 可接受的载体或赋形剂。在一个实施方式中，肽或组合物能刺激胰腺导管细胞来源的β细胞 再生。在另一个实施方式中，肽或组合物具有哺乳动物INGAP蛋白的生物活性。在一个实施 方式中，生物活性是刺激胰腺导管样细胞或导管相关的细胞生长和增殖的能力。
[0029] 还提供了编码本文描述的本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体的核酸分 子。核酸分子可以（比如)被连接到一个表达控制序列以形成一个表达载体，其中所述表达 载体在合适的细胞中增殖。
[0030] 在又一个实施方式中，本发明提供含有本文描述的肽或其类似物、同系物、片段或 变体以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
[0031] 本文还提供用于预防或治疗胰腺症状或疾病的方法，该方法包括对需要其的个体 给药本发明的肽或其类似物、同系物、片段或变体。在本文提供的方法中，个体可以是（比 如)啮齿目动物、犬科动物、猪、灵长目动物或人。
[0032] 在一个实施方式中，症状或疾病为新陈代谢紊乱，比如细胞相关的紊乱。症状或 疾病可以是1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病的并发症。
[0033] 在另外的实施方式中，个体中的β细胞凋亡被阻止或抑制;个体中的胰腺细胞的功 能被改善或恢复;个体中的血浆胰岛素水平增加;和/或个体中的胰腺细胞的数量或尺寸增 加。在一个具体的实施方式中，所述胰腺细胞为β细胞。
[0034] 在又一个实施方式中，辟田胞新生被刺激和/或个体中的葡萄糖动态平衡改善和/ 或个体中的胰岛素是增效的。
[0035] 附图简述
[0036] 本发明的【具体实施方式】现在会通过实施例和参考随附的附图的方式被解释。
[0037]图1显示了RIN-m5F细胞中INGAP在增殖上的效果。（A):INGAP增加了溴脱氧核苷尿 嘧啶(BrdU)掺入。在小室载玻片上用指示量的INGAP-P或r-INGAP处理RIN-m5F细胞24小时。 Exendin 4(Ex4)和表皮生长因子(EGF)用作对照。在处理的最后三小时加入50μΜ BrdU，接 着在甲醇中固定和进行BrdU免疫染色。数据以INGAP处理的比未处理的对照中BrdU( + )细胞 的比例（％)进行表示。结果是3个独立实验的平均值土标准误差（S.E.)(*:p〈0.05，§:p〈 0.001，与未处理的对照相比）。（B): INGAP诱导RIN-m5F中Erk 1 /2的磷酸化。用INGAP处理接 种在60mm组织培养板上的RIN-m5F细胞（1 X 106)，持续指示的时间。用抗Erkl/2磷酸 (Thr202/Tyr204)抗体探测印迹（30yg蛋白质），接着清除/用抗总Erkl/2抗体（Cell Signaling)再探测，并使用ImageJ软件通过密度计量学定量。（C):量化相对的Erkl/2磷酸 化，该相对的Erkl/2磷酸化作为磷酸Erkl/2对总Erkl/2的比例被测定，并表示为相对于 Omin时间点的倍数变化。结果是3至8个独立实验的平均值土标准误差: p〈0.05，§ : p〈 0.01，1: P〈〇. 〇〇 1; t:仅针对所示的时间点，进行两个实验）。
[0038]图2显示了荧光标记的rINGAP在细胞表面形成帽（cap)。接种在小室载玻片上的 RIN-m5F细胞在37°C或在冰上用50nM经DyLight 488活性染料标记的rINGAP孵育所示的时 间，并于冰上在4%多聚甲醛中固定。（A):在冰上预冷细胞15min，并与rINGAP和CTB (AlexaFluor-594，5μg/ml，Invitrogen)孵育30min。（B):同样地用转铁球蛋白（25μg/ml， Texas Red, Invitrogen)。（C)、（D) :37°C下分别用CTB和转铁球蛋白孵育lh。（E)、（F):用标 记的rINGAP将细胞孵育5h或24h，并在最后一小时用50nM LysoTracker Red DND99(LT, Invitrogen)共染色。细胞核用包含在封固剂(Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI复染。 用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。标尺为20μπι。
[0039] 图3显示了荧光标记的rINGAP的结合和内化被100ηΜ的渥曼青霉素和细胞松弛素 D 部分抑制，提示巨胞饮(macropinocytosis)。在渥曼青霉素（100nM)或细胞松弛素 D(25yg/ ml)存在下，接种在小室载玻片上的RIN-m5F细胞用50nM经DyLight 488活性染料标记的r-INGAP孵育5h，并在4%多聚甲醛中固定。(A) :rINGAP，没有抑制；（B):阴性对照；（C):渥曼青 霉素；（D):细胞松弛素 D。细胞核用包含在封固剂(Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI复 染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。
[0040] 图4显示了 FAM标记的INGAP-P被快速地内化到RIN-H15F细胞的细胞质。用FAM标记 的INGAP-P将生长在小室载玻片中的细胞处理指示的时间，并用4%PFA固定。(A)、（B)、(D)、 (F):细胞用Lysotracker染色lh，如图2中。（C)、（E):固定的细胞用0· 1 %Triton_X100渗透 10min，4°C下在5%羊血清中封闭并用抗EEAl兔第一抗体(Abcam，l:200)探测过夜，接着在 室温下用第二驴抗兔DyLight594结合的抗体（1:500)探测111。细胞核用包含在封固剂 (Prolong Gold, Invitrogen)中的DAPI复染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。 [0041 ]图5显示了 FAM-INGAP-P的内化被细胞松弛素 D抑制，但不被渥曼青霉素抑制。在细 胞松弛素 D(25μg/ml)或渥曼青霉素（ΙΟΟηΜ)存在下，用FAM标记的INGAP-P(16.7yM)将生长 在小室载玻片中的细胞处理lh，并固定和如本文所描述的照相。（A):FAM-INGAP-P;(B): DMS0对照；（C):细胞松弛素 D; (D):渥曼青霉素。
[0042]图6显示了对荧光标记的rINGAP和INGAP-P的结合和内化的摩尔过量竞争分析 (molar excess competition assay)。接种在小室载玻片上的RIN_m5F细胞用FAM-INGAP-P 孵育lh(左列）或用DyLight-488rINGAP孵育5h(右列）（A、B):无抑制；（C、D):用 167μΜ(10倍 摩尔过量)的INGAP-P; (E、F):用1μΜ(20倍摩尔过量)的rINGAP。
[0043] 图7显示了被INGAP-P和r-INGAP诱导的信号事件中Ras-Raf活化的参与。（A):用 Ras-GTP ELISA测量Ras活化。1 X 106个细胞接种在60mm板上48h，接着在无血清培养基中饥 饿2处。371下用生长因子将细胞处理指示的时间。然后将板放在冰上，并在用150μ1含有蛋 白酶抑制剂混合物(ΝΕΒ)的Mg+裂解缓冲液裂解细胞之前用冰冷的PBS清洗。10μ1细胞裂解 物用于Ras-GTP ELISA，并且读数用蛋白质的量标准化(DC蛋白质分析，Biorad)。结果显示 为相对于Omin时间点的倍数变化(Omin时间点为1)并且显示虚线水平线。结果为至少3个独 立实验的平均值土标准误差: P〈〇 . 05，§: p〈0.01，H : p〈0.001，与Omin对照相比）。（B): c-Raf磷酸化的倍数变化，其用蛋白质印迹(Western blot)/密度计量学（ImageJ)测定，作为 磷酸与总的cRaf的比例并且相对于Omin时间点进行计算，显示为虚线水平线（ = 1)。结果为 至少3个独立实验的平均值土标准误差(*: p〈0.05，§: p〈0.01，: p〈0.001)。
[0044] 图8显示了药理学抑制剂对INGAP、EGF和Ex-4引起的Erkl/2磷酸化的效应。将IX 1 〇6个细胞接种在60mm板上48h，接着在无血清培养基中饥饿24h。加入生长因子之前，除百 日咳毒素(Ptx)(预处理24h)之外，细胞用指示的抑制剂预处理30-40min。用生长因子处理 l〇min之后，将细胞置于冰上并裂解，如在实验步骤中所描述的。用磷酸Erkl/2抗体(或在清 除后用总Erk抗体)孵育印迹(30yg蛋白质），并用ECL试剂显色。如上文所描述的进行相对于 总的Erk和时间Omin对照（ = 1，显示为有点的线）的Erk磷酸化的量化。（A) :GPCR(Ptx， 100ng/ml)、腺苷酸环化酶（SQ22536，250μΜ)和PKA(PKi，100ηΜ;Η89，ΙμΜ)的抑制剂。（B):PKC (Bis，ΙμΜ)、PI3K(Wm, lOOnM)、Src(PP2，lOOnM)、EGFR(AG1478，ΙΟΟηΜ)的抑制剂和Raf抑制剂 1 (R-l，ΙΟΟηΜ)或DMSO作为溶剂(*:p〈0 · 05)。
[0045]图9显示了 GPCR信号传递的抑制引起减少的Ras活化。在加入生长因子处理1、3、5 和lOmin之前用Ptx将生长在60mm板上的RIN-m5F细胞预处理24h。收获Mg+裂解缓冲液中的 细胞并经受Ras-GTP ELISA，如图4中所描述。结果为至少3个独立实验的平均值土标准误差 (*:ρ〈0·05，§:ρ〈0·01，H:ρ〈0·001)。
[0046] 图10显示了 rINGAP结合的活体成像。时间进程如下所示：（A) :0min; (B) :2min; (C) :5min; (D): 15min; (E) :20min和(F) :30min;白色粗箭头指示膜结合的INGAP;细箭头指 示细胞内的INGAP以及红箭头指示死亡的细胞。用蔡司LSM-510META共聚焦显微镜获取图 像。·
[0047]图11显示了rINGAP既不与网格蛋白（A)共定位也不与小窝蛋白（B、C)共定位。用 DyLight-594-rINGAP孵育细胞l、15min(A、B)或3h(C)，在4%PFA中固定并在4°C用兔抗网格 蛋白或抗小窝蛋白抗体探测，接着用FITC标记的羊抗兔第二抗体检测。细胞核用包含在封 固剂(VECTASHIELD HardSet封固剂）中的DAPI复染。用蔡司LSM-510META共聚焦显微镜获取 图像。箭头尖指示膜结合的rINGAP，并且箭头指示细胞内的rINGAP。
[0048]图12显示了暴露lh后的DyLight 488标记的rINGAP的内化，接着清洗并在标记的 INGAP不存在下经历5h(A)或24h(B)的追踪期(chase period)。在4%PFA中固定之前lh加入 LysoTracker Red DND99(50nM)。细胞核用包含在封固剂（VECTASHIELD HardSet封固剂，载 体)中的DAPI复染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图像。
[0049] 图13显示了在孵育lh后连续暴露24h的FAM-INGAP-P的内化(A)或24h追踪(B)。在 4%PFA中，在固定前lh加入LysoTracker Red DND99(50nM)。细胞核用包含在封固剂 (VECTASHIELD HardSet封固剂载体）中的DAPI复染。用奥林巴斯FVlOi共聚焦显微镜获取图 像。
[0050] 图14显示了在冰上和在脂筏抑制剂菲律宾菌素 (Calbiochem)存在下INGAP-P的内 化被抑制。在37°C(A)或在冰上(B)或在lμg/ml菲律宾菌素存在下用FAM-INGAP-P处理在8孔 小室载玻片上生长的RIN-m5F细胞lhdNGAP-P显示为绿色。细胞核用包含在封固剂 (VECTASHIELD HardSet封固剂）中的DAPI(蓝色)复染。用蔡司LSM-510META共聚焦显微镜获 取图像。
[0051 ] 图15显示了用INGAP、EGF和Ex-4处理的RIN-m5F细胞中Akt磷酸化的量化。根据制 造商的用法说明，来自用于Ras-GTP ELI SA的在Mg+裂解缓冲液中制备的样品的细胞裂解物 通过Akt ELISA(微孔过滤器(Millipore))分析，并用蛋白质的量标准化，如本文所描述。结 果显示相对于时间0( = 1，显示为虚线）的倍数变化，并且为至少3个独立实验的平均值土标 准误差(*:?〈0.05，§:?〈0.01，1:?〈0.001)。
[0052]图16显示了药理学抑制剂对RIN-m5F细胞增殖上的效应。细胞接种在小室载玻片 上，并且在加入生长因子之前经受用所示的抑制剂预处理30至40min并孵育24h。在处理的 最后3小时加入50mM BrdU，接着在甲醇中固定并免疫染色BrdU。将数据以处理的BrdU( + )细 胞比未处理的对照中BrdU( + )细胞的比例（％ )进行表示。结果是3个独立实验的平均值土标 准误差(*:P〈〇.〇5, t :ρ〈0·001)。
[0053] 图17显示了 INGAP蛋白的序列和3D结构。(Α)显示了氨基酸(aa)序列；INGAP-P是黑 色和加下划线的，并且保守的侧翼aa是绿色的；（B)显示了 INGAP-P定位在rINGAP的外环上 (黑色；相邻的IW和GW为绿色）；（C)显示了 INGAP-P和跨物种的Reg3蛋白中相应肽序列的同 源性。箭头指示被认为包含在延长的INGAP-P肽中的保守的aa。
[0054] 图18显示了三个延长的INGAP-P类似物在RINm5F细胞中对Erkl/2激活的效应。用 1 nM和 1 OnM的 r INGAP蛋白、INGAP-P (15mer)或 19mer类似物（以 1 X -167nM或 10 X -1 · 67μΜ)处 理RIN-m5F细胞（lX 106/60mm盘）10min。使用ImageJ软件在蛋白质印迹上进行Erkl/2激活 的量化，并确定为磷酸Erkl/2(Thr202/Tyr204)对总的Erkl/2的比值。数据表示为处理过的 细胞相对于对照(PBS)的倍数变化，并表示为rINGAP和INGAP-P(15mer)的6个独立实验和 19mer类似物的2个独立实验的平均值土标准误差。在每个实验中，对于每个处理用2-3个单 独的板（*:Ρ〈0·05，**:ρ〈0·01，1Ι:ρ〈0·001)。
[0055] 图19显示了 INGAP-19结合到RINm5F细胞，类似于rINGAP的结合。生长在8孔玻璃小 室载玻片中的RIN-m5F细胞用50nM DyLight488标记的rINGAP(A)、8.35yM INGAP-P(B)或 8.35μΜ INGAP-19(C)孵育30min，用PBS清洗并在冰上用4%多聚甲醛固定。载玻片用含DAPI 的卩1'〇1〇即6〇1(1(111￥；[1：1'(^611)封固（1]1〇11111:)用于复染细胞核，并在共聚焦显微镜蔡司1^1 510下检查。箭头指示膜结合的rINGAP和INGAP-19,而箭头尖指向内化的INGAP-P JD)显示 了只用FAM染色（阴性对照）。
[0056] 图20显示了在血清存在下INGAP-P的降解曲线（上）和INGAP-19的降解曲线（下）。 50μΜ的肽在含有25%FBS的RPMI-1640培养基中孵育指示的时间。接着在血清蛋白的乙醇沉 淀后，用HPLC分析样品。为了比较肽降解的动态，HPLC曲线如所示的被叠加。
[0057]图21显示了在FBS中体外孵育肽的时间进程研究，其中（上）显示了 INGAP-PC肽和 (下）显示了 INGAP-19C 肽。用含有 25 %FBS 的 RPMI-1640 培养基将 50μΜ 的 INGAP-PC 和 INGAP 19C孵育指示的时间。在血清蛋白的乙醇沉淀之后，用HPLC分析样品。为了比较肽降解的动 力学，如所示的叠加 HPLC曲线。从(B)中可以看出在血清存在下INGAP-19C于48h中未见降 解。
[0058] 图22显示了在RINm5F细胞中INGAP类似肽对Erk 1/2激活的效应。（A)显示了在与 INGAP-P相同浓度下比较类似物的初步研究结果（167nM;n = 2); (B)显示了更低和更高剂量 的INGAP-P、INGAP-19和INGAP-19C的比较。如对图11所描述地进行RINm5F细胞的处理和 Erkl/2激活的量化。
[0059] 图23显示了 rINGAP和INGAP 15-mer肽（INGAP-P)在诱导来自人胰岛衍生的导管样 结构(DLS)的胰岛再生中的相对效力。将胰岛特征变化;胰岛素阳性结构的数量/处理后 结构的总数量)与预处理水平进行比较(*P〈〇.05)。
[0060] 图24显示了糖尿病小鼠中rINGAP和INGAP-P处理对血糖水平的效应。用rINGAP(5y g)、INGAP-P(500yg)或roS处理通过单次腹腔注射STZ(150mg/kg)造成慢性糖尿病（大约 27mM的高血糖）的C57B1/6J小鼠7周。数据以mmol/L表示，并且是平均值土标准误差。STZ-PBS(n = 5);STZ-rINGAP(n = 6)和 5丁2-1呢厶?-卩(11 = 7);*?〈0.05，**?〈0.01，处理的比？85。 [0061 ] 图25显示了INGAP诱导人成熟导管细胞中Pdx-Ι表达。（A)显示了用167nM INGAP-P 处理的HPDE细胞中Pdx-lmRNA表达随时间的变化，表示为时间匹配的未处理的对照的倍数 变化。（B)显示了用不同剂量的rINGAP处理15min的HPDE细胞中Pdx-lmRNA表达变化，表示为 时间匹配的未处理的对照的倍数变化。（C)显示了 Η P D E未处理的细胞（C T L)和用16 7 η Μ INGAP-P处理的细胞24小时后的Pdx-1表达的代表性蛋白质印迹。等量的总蛋白上样到每个 泳道(如与β-肌动蛋白所示）。（〇)显示了Pdx-Ι蛋白中增加％的图表代表，如在(C)中所见， 用ImageJ软件定量。数据表示为平均值土标准误差，*p〈0.05，η = 3独立测量值。
[0062]图26显示了 INGAP-P诱导发育过程中内分泌分化中涉及的发育转录因子的协同表 达。NeuroD 1 (A)，I A-1 (B)和Maf A (C) mRNA表达变化超时，表示为时间匹配的未处理的对照的 倍数变化(*P < 0.05)，如所示。
[0063]图27显示了 INGAP诱导24h后HPDE细胞中胰岛素和葡萄糖激酶的表达。（A)显示了 在不存在(对照)或存在（1XINGAP)的167nM INGAP-P下，24h后胰岛素表达；（B)显示了在不 存在(对照)或存在5nM rlNGAP(rlNGAP)下，24h后用RT-PCR检测的葡萄糖激酶的表达(所示 为代表性的凝胶）；（C)显示了在不存在（对照）或存在167nM INGAP-P(1 X INGAP)或5nM rlNGAP(rlNGAP)下，通过ELISA检测的培养24h后的HDPE细胞裂解物中的C肽的水平（*p〈 0.05，标准化到总蛋白）。
[0064]图28显示了成簇的HPDE细胞模拟胰岛-DLS-ILS模型，并提高了由INGAP触发的内 分泌分化。（A)培养5天后，嵌入基质胶的HPDE细胞形成簇。10天后，簇变为囊状。当用167nM INGAP-P处理7天后，HPDE囊状结构恢复为固体胰岛素样簇(相差显微术，代表性图片）。（B) 显示了用 167nM INGAP-P(INGAP-P)或5nM rlNGAP(rlNGAP)处理7天的HPDE簇中胰岛素、胰 高血糖素和PPY mRNA的表达的变化，表示为时间匹配的未处理的对照的倍数变化（*p < 0.05)〇
[0065]图29显示了经INGAP处理牢牢嵌入基质胶的HPDE细胞加强了内分泌分化。显示了 没有(对照）或用167nM INGAP-P(INGAP)培养7天的HDPE簇的免疫荧光分析:细胞角蛋白19 (CK19)、PDX-1、C肽和Glut-2的免疫检测(代表性图片）。经过INGAP处理，CK19被废除，PDX-1 被转移到细胞核(箭头），并且C肽(箭头)和Glut-2出现。
[0066]图30显示了胰岛到DLS转变：1形态学和免疫荧光。倒置(A-C)和免疫荧光(D-F)显 微术显示胰岛为主要由胰岛素和辟田胞(D)组成的固体球形结构(A)。经过8天培养期，DLS形 成中心形成并扩展(B、E)，最终取代了胰岛。这些DLS为空的、囊状结构(C)，是CK+导管上皮 细胞(F)的成分混杂群。DLS形成的形态学评价与导管(绿色:CK+)细胞频率(r2 = 0.74，p〈 0.001)正相关，并且与内分泌(红色:胰岛素/胰高血糖素/生长激素抑制素/PP+)细胞频率 &2 = 0.64，？〈0.001)负相关(6)。11细胞凋亡。早期01^形成的特点在于显著的凋亡，如由 ELISA评价的（（4):*?〈0.05，**?〈0.01与第0天相比）。第1天培养物的基于原位末端标记 (TUNEL)的研究显示凋亡的细胞主要为β细胞(BhIII DLS增殖。BrdU掺入的免疫组织化学 (A)和定量评价(B)表明，相对于相对静态的胰岛细胞，DLS细胞是高度增殖的(*p〈0.05，**p 〈0.01，***ρ〈0·001)。
[0067] 图31显示了胰岛到DLS转变:祖细胞标记表达。免疫组织化学和免疫荧光分析表明 DLS细胞表达与胰岛祖细胞相关的标记，包括roxi、巢蛋白和波形蛋白。
[0068] 图32显示了 INGAP-P处理后DLS到ILS再生：形态学和免疫组织化学。用167nM INGAP-P处理DLS 4天诱导ILS的形成，ILS表达合适水平的成熟胰岛功能标记并下调了相对 于DLS的CK表达。
[0069]图33显示了 DLS到ILS再生:功能。胰岛素含量的评价(A)和葡萄糖诱导的胰岛素分 泌(B)表明ILS具有与它们所源于的初始胰岛等价的胰岛素贮存和分泌能力(*p〈0.01，与胰 岛相比）。
[0070] 图34显示了INGAP增加 HPDE细胞增殖。用167nM INGAP肽（IX)处理单层HPDE细胞 (A)或基质胶中成簇培养的HPDE细胞(B)7天。然后对细胞进行增殖标记(PCNA)的染色，并计 算PCNA+/细胞核总数的百分比（*p < 0.05) XTRL为未处理的对照。
[0071 ]图35显不了米用Kinetworks?Broad Signaling Pathway Screen(KPPS 1 · 3， Kinexus Bioinformatics)的INGAP对HPDE细胞的蛋白激酶激活的效应。(A-C)，来自分别用 PBS(对照）、835nM INGAP-P和InM rINGAP处理20分钟的HPDE细胞的各种磷酸化蛋白激酶的 Kinetworks蛋白质印迹结果；（D)，20分钟后来自对照（空条）、INGAP-P-处理的（灰条）和 rINGAP处理的（黑条)细胞的各种蛋白激酶激活的0D统计条形图；€，分别在(A-D)中以数量 描述的蛋白激酶的简称和相应的倍数变化。只表示出显著的变化;至少25%的0D变化被认 为是显著的。
[0072]从以下详细的描述，本发明的其他特征和优势会变得明显。然而应该被理解的是， 表明本发明的【具体实施方式】的详细描述和具体实施例仅通过例证的方式给出。从该详细的 描述，本公开的主旨和范围内的各种变化和变型对于本领域普通技术人员来说会是显而易 见的。
【具体实施方式】
[0073]作为诱导新的导管相关的胰岛形成的因子，胰岛新生相关蛋白（INGAP)在部 分导 管阻塞的仓鼠胰腺中被发现。之前我们已经说明INGAP的生物活性部分，INGAP^118肽(本 文也称作"INGAP-P"、"15-mer"或SEQ ID NO: 1)，其具有β细胞新生和胰岛素增效活性。最近 2期临床试验已经显示所产生的INGAP-P提高了在1型和2型糖尿病患者中的葡萄糖动态平 衡，因此支持了 INGAP作为针对糖尿病的药物疗法的可能。然而，差的稳定性和/或短的血浆 半衰期妨碍了将INGAP-P开发为治疗药物的能力。
[0074]我们在此报道，为了提高INGAP-P作为治疗或预防糖尿病的药物的功效以及为了 理解它的作用机制，我们研究了全长INGAP蛋白（也称作"rINGAP"和"r-INGAP"）寻求线索。 我们克隆了rINGAP，并用它研究RIN-m5F细胞中由蛋白质和INGAP-P肽诱导的信号事件。 RIN-m5F细胞为对增殖中INGAP的增加做出应答的大鼠胰岛瘤细胞系。所述全长重组蛋白 (r-INGAP)比15-mer肽稳定得多（在细胞培养中达5天），并且是带有6His标记的。数据显示 在刺激大鼠胰岛瘤RIN-m5F细胞的增殖上以摩尔为基础rINGAP至少比INGAP-P有效100倍， 并且虽然它们都通过Ras-Raf-Erk途径的激活传递信号，但是上游信号事件可以不同。我们 也说明了荧光标记的rINGAP的结合限制于细胞表面并且以与受体结合和聚类一致的方式 在细胞表面形成斑，然而INGAP-P迅速被内化。对于rINGAP和所述15-mer，INGAP诱导的 Erkl/2(MAPK42/44)激活被百日咳毒素(Ptx)显著降低，提示rINGAP和所述肽均通过G蛋白 偶联受体起作用。因此，所述数据显示，无论在体外还是在体内，与INGAP-P相比rINGAP具有 大得多的稳定性(在细胞培养物中达5天)并且在胰岛再生中具有至少100倍高的摩尔效能 (参见图23、24)。
[0075]采用X-射线晶体学，生成了 r INGAP的3D重建。重建显示生物活性的15-mer肽 (INGAP-P)是从分子的核心延伸出的环的一部分（图17B)。值得注意的是所述15-mer (INGAP-P)是一个小的线性化的肽。我们猜测所述rINGAP蛋白质的所述环可以促进所述蛋 白质与它的靶细胞/受体相互作用，并且保护所述环结构，因此所述环结构可能是INGAP肽 的生物活性和稳定性的关键。蛋白序列的分析(图17A)显示INGAP-P侧翼具有形成蛋白质核 心的高度疏水的氨基酸序列。显著地，三个色氨酸残基(W)处于直接接近于INGAP-P的位置 (氨基酸1〇3、120和122)(图17C)，并且甘氨酸 119(G)在跨物种(包括人)的Reg3蛋白中高度保 守。
[0076]因此我们设计并制备了 INGAP-P的三个延长的类似物，这三个INGAP-P的延长的类 似物包括位于所述肽的任一边或两边的保守氨基酸(参见表1，图18)。为了不牺牲溶解度， 延长被限制在获得19-mer肽的4个氨基酸。延长的INGAP肽可能保存INGAP的本身3D环状结 构。不期望受限于理论，相信在19-mer的任一端的两个疏水性色氨酸(trytophan)残基可以 稳定所述肽的环状结构。19-mer肽因此保留了 rINGAP蛋白的生物活性(可能甚至显示出增 强的活性），并且具有与INGAP-P 15-mer相比增加的稳定性和/或血浆半衰期。
[0077] 19-mer肽的结构示于表1中。为了制备延长的19-mer INGAP肽，INGAP蛋白序列中 的INGAP-P 15-mer肽侧翼的4个氨基酸被添加到INGAP-P 15-mer，如表1所示（添加到所述 15-mer的侧翼氨基酸是加下划线的，也参见图17、18)。
[0078] 表1. INGAP肽序列
[0079]
[0080」 研％19-mer相比十INGAP-P 15-mer
和rINGAP的生物沽性。如本文所不，在所培养 的 RIN-m5F 细胞中 INGAP1Q2-12Q 诱导的 Erkl/2(MAPK42/44)激活比 INGAP1Q4-118 产生的大 3 倍，并 且是rINGAP产生的大约2倍（图18)。此外，我们证实荧光标记的19-mer(INGAP1(^ 12())的结合 被限制于细胞表面，并且以类似于rINGAP可见的方式相似于受体聚类，并且明显不同于 INGAP1(^118，INGAP1(^118看似不结合到细胞表面(图19)。
[0081 ] FBS中可比较的肽稳定性分析没有显示出INGAP-19超过INGAP-P的优势，因为两种 肽以相似的速率降解(图20)。
[0082] 为了探究INGAP-19的效能是否可以通过增加其稳定性而进一步增强，选择环化作 用(通过加入末端半胱氨酸，二硫化物，头到尾(head-to-tai 1))，因为这是一个广泛采用的 增加肽稳定性的方法(Adessi，C·和Soto，C ·，Curr Med Chem，2002，9:963-978)。INGAP-P进 行相似的环化，并且新的类似物被称作INGAP-19C和INGAP-PC( "C"代表环化的）。
[0083] 在FBS体外孵育的时间进程研究中比较INGAP-P、INGAP-PC、INGAP-1^PINGAP-19C 的稳定性。数据显示INGAP-19C似乎比线性的15-mer(INGAP-P)或19-mer(INGAP-19)肽更加 稳定（图20、21)。重要地，1如六?-19(：与线性的191^(1如4?-19)均等，并且基于1?1^1^细胞 中Erkl/2激活的研究，其具有比INGAP-P更高的摩尔效能（图22)。另外，我们证实单独的环 化不增加 INGAP-P的活性(图22A)。
[0084] 因此，结果表明rINGAP的 19-mer(INGAP1Q2-12Q(SEQ ID N0:4))和rINGAP的环化的 19-mer的（环化的INGAPH12Q)比INGAP-P 15-mer更具有生物活性。环化的INGAPH12Q显示 出比INGAP-P更大的稳定性。
[0085] 相应地，本文提供INGAP的 19-mer肽，INGAP1Q2-12Q，（本文也称作 "INGAP-19"、"19-mer"、"19-mer序列3" 和SEQ ID N0:4)。本文还提供INGAP的环化的 19-mer肽，INGAP1。2-120， (本文也称作"INGAP-19C"和SEQ ID勵:6)。本文显示19-1^4太具有1如4?的0细胞新生和胰 岛素增效活性和/或与INGAP-P相比提高的稳定性，这表明19-mer INGAP肽为糖尿病的潜在 的新的治疗药物。
[0086] 在一个实施方式中，本文提供包括SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6所示的序列的 INGAP肽。在另一个实施方式中，本文提供由SEQ ID N0:4或6所示的序列组成的INGAP肽。也 提供其组合物和使用方法。
[0087]如本文所使用，"细胞"指胰腺中胰岛的完全分化的生成胰岛素的细胞。胰腺辟田 胞的特点在于它们分泌胰岛素并且典型地在于它们的细胞表面表达胰岛淀粉样多肽 (ΙΑΡΡ)。
[0088]也应该被理解的是，保留INGAP的生物活性的本发明的19-mer肽的类似物、同系 物、片段和变体包括在本发明的肽中。在一个实施方式中，提供与SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:6具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6的变体。在另一个实施方式中，变体具有与SEQ ID N0:4和SEQ ID NO :6至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95%、至少98%或至少99%的同一性，并且保留 INGAP103位和120位上的色氨酸残基(换句话说，在INGAP 103位和120位上的色氨酸残基没 有被移除、取代或改变）。在另一些实施方式中，变体保留103和120位上的至少一个色氨酸 残基或保留两个色氨酸残基。
[0089] 本发明的多肽和组合物可以用于治疗或预防胰腺的症状或疾病。这样的症状或疾 病的非限制性实例包括新陈代谢紊乱或比如1型和2型糖尿病的症状、糖尿病的并发症（比 如视网膜病、肾病或神经病、糖尿病足、溃疡、大血管病变）、代谢性酸中毒或酮症、反应性低 血糖症、高胰岛素血症、葡萄糖代谢紊乱、胰岛素抵抗、代谢综合征、不同起因的血脂异常、 动脉粥样硬化和相关疾病、肥胖、高血压、慢性心力衰竭、水肿和高尿酸血症。
[0090] 细胞团的扩大可能与几种过程相关，包括存在的胰岛细胞的增殖、来自导管相关 的前体细胞的新生或来自去分化的内分泌细胞的胰岛细胞的再生。在本文中，我们说明示 出INGAP-P诱导：（1)正常人胰腺导管细胞(HPDE)的增殖和内分泌分化（图25-29、34); (2)来 自去分化的人胰岛来源的导管样结构(DLS)的功能性胰岛样结构的再生（图23、30-33);和 (3)-种产生胰岛素的大鼠细胞系，RINm5F细胞的增殖（图1、8、18、22)。还显示了在动物模 型中，INGAP-P可以导致胰腺胰岛细胞的量的显著增加，并且导致更多的胰岛素的产生(美 国专利申请公布号2004/0132644)。新形成的辟田胞出现在胰腺导管的壁和出的芽上。这些 由导管上皮细胞分化和胰岛细胞生长获得的胰岛素阳性细胞以及它们的出现与用INGAP-P 处理的剂量和持续的时间成比例。经过更长的处理时期，这些细胞迀移出导管，并且在胰腺 的实质(parenchyma)中形成胰岛。经过连续10天的INGAP-P给药，胰岛数量有30%的增加， 并且经过30天在组织中有双倍的胰岛数量。预期本文公开的肽有类似的效应。
[0091] 相应地，在一个实施方式中，本发明的肽和组合物促进、提高或诱导辟田胞新生。比 如，本发明的肽和组合物提高或恢复胰腺细胞的功能，和/或可以增加胰腺β细胞的数量或 尺寸。在另一个实施方式中，本发明的肽和组合物促进、提高或诱导胰腺辟田胞的再生。在另 一个实施方式中，本发明的肽和组合物促进、提高或诱导胰腺β细胞的增殖。在另一个实施 方式中，本发明的肽和组合物具有胰岛素增效活性。在进一步的实施方式中，本发明的肽和 组合物提高有1型或2型糖尿病的个体中葡萄糖的动态平衡。
[0092] 如本文使用地，"胰岛素增效活性"和"胰岛素增效"是指与单独给药胰岛素相比， 当胰岛素与本发明的肽或组合物联合给药时，在低剂量的胰岛素下获得治疗性结果的能 力。换句话说，当胰岛素与本发明的肽或组合物联合给药时，要获得一定的治疗性结果需要 更少的外部提供的胰岛素;在本发明的肽或组合物存在下，用更低剂量的胰岛素获得与单 独的更高剂量的胰岛素相似的治疗性结果。
[0093]在进一步的实施方式中，本发明的肽和组合物阻止通过比如胰腺细胞的凋亡或 坏死引起的β细胞死亡;诱导从源自去分化的成熟胰岛的原始导管样结构(DLS)来的新的功 能性胰岛的分化;提高内分泌分化;诱导来自与导管上皮相关的细胞的胰岛细胞再生，导致 新的胰岛形成;和/或导致高血糖症的逆转。在一个特定的实施方式中，本发明的肽和组合 物诱导胰腺导管细胞的分化，和/或允许这样的细胞避开凋亡途径。
[0094]在更进一步的实施方式中，本发明的肽具有与INGAP-P 15-mer肽相比更好的体外 稳定性、更好的循环中的稳定性和/或更长的体内半衰期。
[0095] 在一个实施方式中，通过本发明的肽和组合物治疗或预防辟田胞相关的紊乱。在一 个特别的实施方式中，通过本发明的肽和组合物治疗或预防糖尿病，特别是1型糖尿病、2型 糖尿病、潜伏期的1型糖尿病和/或糖尿病并发症。
[0096] 因此，在一个方面本文提供有用于治疗或预防需要其的个体中的新陈代谢紊乱的 方法，所述方法包括对所述个体给药治疗有效量的本发明的肽或组合物。在另一个方面，本 发明提供有用于治疗或预防需要其的个体中的糖尿病的方法，所述方法包括对所述个体给 药治疗有效量的本发明的肽或组合物，比如SEQ ID N0:4。
[0097] 在另一个方面，在需要其的个体中提供用于预防胰腺细胞的退化和/或提高和/ 或恢复胰腺细胞的功能的方法，所述方法包括对所述个体给药治疗有效量的本发明的肽 或组合物。在一个方面，胰腺细胞(比如β细胞)的数量或尺寸在所述个体中增加，和/或所述 个体中血浆胰岛素水平增加，和/或所述个体中葡萄糖动态平衡恢复或提高。
[0098] 在一个进一步的方面，提供体外和/或体内保护胰岛细胞抵抗致糖尿病剂的方法， 所述方法包括将真核细胞接触或对个体给药本发明的肽和组合物。在一个实施方式中，在 给药本发明的肽或组合物后个体中的胰岛活力提高，和/或胰岛功能障碍被阻断，和/或β细 胞团被保护。
[0099] 根据本发明的另一个实施方式，提供诱导辟田胞祖细胞分化的方法，包括:将含有β 细胞祖细胞的胰腺导管细胞的培养物接触本发明的肽制剂以诱导所述β细胞祖细胞的分 化。在一个实施方式中，具有胰腺内分泌不足的哺乳动物的胰腺导管细胞可以从机体中移 除并在体外处理。导管细胞典型地含有细胞祖细胞。这种用本发明的肽制剂的处理会诱导 所述辟田胞祖细胞的分化。用本发明的肽处理的细胞然后可以用作自体移植到它们来源的 哺乳动物中。这种自体移植处理最小化了移植中涉及的不利的宿主抗移植物反应。
[0100] 在一个实施方式中，所述个体可以是啮齿目动物、犬科、猪、灵长目动物或人。虽然 本发明的方法可以用在任何动物中，但所述个体优选为人。
[0101] 术语"同系物"用于表示与本文描述的所述肽的序列具有微小或不重要的序列变 化的那些氨基酸或核酸序列，这样同系物序列以如所述原始序列实质相同的方式起作用。 序列变化可能归因于原位突变或结构修饰。具有实质的序列同一性的序列包括与编码如本 文提供的肽的序列具有至少80 %、至少85%、至少90%、至少95%、至少98 %或至少99 %序 列同一性的核酸序列，或与本文提供的肽（比如SEQ ID Ν0:4或SEQ ID Ν0:6)具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的氨基酸序列。序列 同一性可以根据本领域已知的方法计算。核酸序列同一性最优选地通过BLAST 2.1版高等 研究的运算法则评价。在http: //www. ncbi . nlm. nih. gov/BLAST上可获得一系列的程序。
[0102] 术语"类似物"用来表示与本文描述的肽的序列相比已被修饰的氨基酸或核酸序 列，其中所述修饰不改变本文描述的序列的生物活性(比如:诱导胰腺细胞新生，诱导胰腺 β细胞再生、提高葡萄糖动态平衡或逆转高血糖症）。修饰的序列或类似物可能具有与本文 描述的肽（比如SEQ ID Ν0:4或SEQ ID Ν0:6)相比改进的性能。
[0103] 也包括与编码本发明的肽的核苷酸序列的互补序列杂交的序列，以及与编码保留 有SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:6的生物活性（比如:β细胞新生活性、体内稳定性等）的肽的核 苷酸序列的互补序列杂交的序列。术语"杂交序列"表示在严格杂交条件下可以杂交至序列 的核酸序列。促进DNA杂交的合适的"严格杂交条件"对于本领域普通技术人员来说是已知 的，并且在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons,Ν.Υ. (1989)， 6.3.1-6.3.6中可以找到实例。如本文所用的术语"严格杂交条件"表示被选择的促进溶液 中的两个互补核酸分子之间选择性杂交的条件。杂交可以发生在一个核酸序列分子的所有 或部分中。对于编码多肽的多聚核苷酸序列中的一种来说，杂交部分至少为50%的长度。在 这点上，核酸双链体或杂交体的稳定性通过Tm确定，Tm在含钠的缓冲液中是钠离子浓度、标 记的核酸的G/C含量、核酸探针的长度（1)和温度(Tm=81.5°C-16.6(L 〇gl0[Na+])+0.41(% (G+C) -600/1)的函数。相应地，确定杂交稳定性的清洗条件中的参数为钠离子浓度和温度。 为了识别与已知的核酸分子相似但不相等的分子，1%的错配可以假设引起Tm大约1°C的下 降，比如如果寻找具有大于95%同一性的核酸分子，最后的清洗会下降5°C。基于这些考虑， 在一个实施方式中严格杂交条件被定义为:在Tm(基于上述方程式)-5°C下5 X氯化钠/柠檬 酸钠(SSC) /5 X Denhardt ' s溶液/1 · 0 % SDS下杂交，接着在 60°C 用0 · 2 X SSC/0 · 1 % SDS清洗。
[0104] 肽可被修饰为含有不改变所述肽的生物活性的氨基酸取代、插入和/或删除。保守 的氨基酸取代包括用具有类似的电荷、尺寸和/或疏水性特点的氨基酸替换肽的一个或多 个氨基酸。当只进行了保守的取代时，预期所获得的类似物会在功能上等同于未取代的肽。 非保守的取代包括用具有不同电荷、尺寸和/或疏水性特点的一个或多个氨基酸替换肽的 一个或多个氨基酸。
[0105] 肽可被修饰为使其更加治疗有效或合适(比如，稳定）。比如，本发明的肽可以通过 与比如无机酸（比如：盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸等）或有机酸（比如：甲酸、乙酸、丙酸、乙醇 酸、乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、水杨酸、苯磺酸和甲苯磺 酸）反应转化为药学上可接受的盐。药学上可接受的盐为本领域所熟知，并且肽和其类似 物、同系物、片段和变体的药学上可接受的盐包含在本文中。
[0106] 另外，肽可以进行化学修饰，比如通过共价结合到肽以增加它的循环半衰期。典型 的聚合物和将它们结合至肽上的方法在美国专利第4，766，106、4，179，337、4，495，285和4， 609,546号中示出。聚合物的非限制性实例为聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG) 1EG室温下 在水中可溶并且具有通式:R(〇--CH2-CH2)n--R，其中R可以为氢或保护基（比如烷基或烷醇 基团）。在一个实施方式中，所述保护基具有1至8个之间的碳原子，或为甲基。符号η为正整 数，比如：1和1000之间或2和500之间。在一个实施方式中，所述PEG具有1000和40000之间、 2000和20000之间或3000和12000之间的平均分子量。PEG可以有至少一个羟基基团或末端 羟基基团。这个羟基基团可以被激活以与抑制剂上自由的氨基基团反应。
[0107] 本发明也提供包含编码本发明的肽或其 片段或类似物的核酸序列的表达载体。
[0108] 可能的表达载体包括但不限于:粘粒、质粒、人工染色体、病毒载体或修饰的病毒 (比如:复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒），只要所述载体与使用的宿主细胞相 容。所述表达载体是"适于宿主细胞转化的"，这是指所述表达载体含有本发明的核酸分子 和在所述宿主细胞的基础上选择的用于表达的调节序列，该调节序列操作性地连接到本发 明的核酸分子上。"操作性地连接"意为表示所述核酸分子以允许所述核酸分子表达的方式 连接到调节序列。
[0109] 本文提供有含有本发明的核酸分子，或其片段或类似物，以及用于所插入的肽编 码序列的转录和翻译的必需调节序列的重组表达载体。
[0110]合适的调节序列可以来自各种来源，包括细菌的、真菌的、病毒的、哺乳动物的或 昆虫的基因（比如，参见Goeddel，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185，Academic Press，圣地亚哥，加利福尼亚（1990)中描述的调节序列）。合适的调节序列 的选择取决于所述宿主细胞，并且可以通过本领域的一种普通技术轻易完成。这种调节序 列的实例包括:转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列(包括翻译起 始信号）。另外，取决于所选择的宿主细胞和所采用的载体，其它序列（比如复制起点、额外 的DNA限制位点、增强子和赋予转录的可诱导性的序列)可以包含在所述表达载体中。
[0111] 本发明的重组表达载体也可以包含帮助选择用本公开的肽转化或转染的宿主细 胞的可选择的标记基因。可选择的标记基因的实例为编码蛋白质（比如G418和潮霉素）的基 因，这些蛋白赋予了对特定药物、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤火虫荧光素酶或免 疫球蛋白或其部分(比如:免疫球蛋白的Fc部分，如IgG)的耐药性。可选择的标记基因的转 录通过可选择的标记蛋白（比如:β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或萤火虫荧光素酶）的 浓度变化监控。如果可选择的标记基因编码赋予抗生素抗性（比如新霉素抗性）的蛋白，转 化体细胞(transformant cell)可以用G418选择。包含有可选择的标记基因的细胞会存活， 而其他细胞死亡。这使得可视化和测定本公开的重组表达载体的表达成为可能，并且特别 是确定突变体在表达和表型上的效应成为可能。如果可选择的标记可被引入独立于有用的 核酸的载体，则会更好。
[0112] 本文提供的重组表达载体也可以包含这样的基因，其编码下述片段:提供肽的增 加表达、重组肽的增加的溶解度和/或通过作为亲和纯化中的配体起作用帮助目标重组肽 纯化。比如，溶蛋白性裂解位点可被加入目标重组肽以允许重组蛋白从融合蛋白纯化后的 融合部分分离。典型的融合表达载体包括分别在重组肽上融合谷胱甘肽硫转移酶(GST)、麦 芽糖E结合蛋白或蛋白A的pGEX(Amrad Corp·，墨尔本，澳大利亚）、pMal(New England Biolabs，Beverly，ΜΑ)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway，NJ)〇
[0113] 重组表达载体可以被引入宿主细胞以制备转化的宿主细胞。术语"转化的宿主细 胞"意为包括能用本发明的重组表达载体转化或转染的细胞。术语"被转导"、"用……转 化"、"用……转染"、"转化"和"转染"意为包括将核酸（比如：载体或裸RNA或DNA)通过本领 域已知的许多可能的技术中的一种引入细胞中。原核细胞可以通过比如电穿孔或氯化钙介 导的转化用核酸进行转化。比如，核酸可以通过常规技术（比如：磷酸钙或氯化钙共沉淀、 DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂质体、电穿孔、显微注射、RNA转移、DNA转移、人工染色体、病 毒载体和任何出现的基因转移技术）引入哺乳动物细胞中。合适的用于转化和转染宿主细 胞的方法可以在Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))和其他实验室教科书中找到。
[0114] 合适的宿主细胞包括广泛种类的真核宿主细胞和原核细胞。比如，本公开的肽可 以在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞可以在Goeddel，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,圣地亚哥，加利 福尼亚（1991)中找到。另外，本公开的肽可以在原核细胞中表达，比如大肠杆菌 (Escherichia coli)(Zhang等人，Science 303(5656):371-3(2004)。
[0115] 除其他外，适于在本文描述的方法中使用的哺乳动物细胞包括:C0S(比如，ATCC号 CRL 1650或 1651)、BHK(比如ATCC号CRL 6281)、CH0(ATCC号CCL 61)和HeLa(比如，ATCC号 CCL 2)以及3T3小鼠成纤维细胞(比如ATCC号CCL92)。
[0116] 用于在哺乳动物细胞中定向表达的合适的表达载体一般包括启动子（比如:源自 病毒材料;如:多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40)，以及其他转录和翻译控制序 列。哺乳动物表达载体的实例非限制性的包括pCDM8(Seed，B.，Nature 329:840(1987))、 pMT2PC(Kaufman等人，ΕΜΒ0 J.6:187-195( 1987))和pCMV(Clontech，加利福尼亚，美国）。
[0117] 或者，本发明的肽也可以在非人类的转基因动物(比如:大鼠、小鼠、兔、羊和猪）中 表达（Hammer等人，Nature 315:680-683(1985); Palm iter等人，Science 222 : 809-814 (1983); Brins ter 等人，Proc · Natl .Acad · Sc i · USA 82 :4438-4442( 1985); Pa lmi ter 和 Brinster，Cell41:343-345(1985)和美国专利第4，736，866号）。本发明还包括源自或分离 自这些动物的组织和细胞。
[0118] 除上文描述的类似物和同系物，在特定的实施方式中，本发明的肽可以进一步被 重组融合到异源多肽的N末端或C末端或化学结合(包括共价和非共价结合)到多肽或其他 组合物上。比如，肽可被重组融合或结合到在检测分析中用作标记的分子和效应分子（比 如：异源多肽、组氨酸(HIS)标签、药物、放射性核素或毒素）上。参见比如:PCT公布W0 92/ 08495;W0 91/14438;W0 89/12624;美国专利第5,314,995号；以及EP 396,387。任何类型的 分子都可以共价结合至本发明的肽上，只要它不抑制所述肽的生物活性。举例而非限制，肽 衍生物包括被修饰的肽，比如:经过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酰化(phosphy 1 ation)、 磷酸化化1108口110^1&1：；[011)、酰胺化;通过已知的保护基/阻断基的衍生化、溶蛋白性裂解、 连接到细胞配体或其他蛋白质等。通过已知技术可以进行任意数量的化学修饰，包括但不 限于:特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
[0119] 肽融合到其上的所述异源多肽可以用于比如增加所述肽的体内半衰期，或用于采 用本领域已知方法的免疫分析中。本发明的肽可以融合到标记序列（比如帮助纯化或检测 的多肽）。总的来说，应该被理解的是本发明的肽可按非结合的形式或者可以结合到多种分 子的至少一种上以用于例如提高所述分子的治疗性能，提高所述分子的药代动力学性能， 等。
[0120] 在特定的实施方式中，本发明的肽包括一种额外的氨基酸序列或一个或多个部 分。典型的修饰在下文更详细的描述。比如，肽可被修饰为加入一个额外的功能性部分(比 如:PEG、药物、毒素、显像剂或标签）。
[0121]此外，可以进行导致"非必须"氨基酸区域上保守取代或变化的核苷酸或氨基酸取 代、删除或插入。比如，除了一个或多个个别的氨基酸取代、插入或删除（比如，可以进行1 个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多的个别氨基酸的取代、插入或删除） 之外，肽可以与起始序列相同。在其他实施方式中，除了 1个、2个或更少、3个或更少、4个或 更少、5个或更少、6个或更少、7个或更少、8个或更少、9个或更少，或10个或更少的个别氨基 酸的取代、插入或删除）之外，源自起始肽的肽可以与所述起始序列相同。在某些实施方式 中，相对于所述起始序列，源自起始肽的肽具有1个、2个、3个、1至2个、1至3个、1至5个或1至 10个个别氨基酸的取代、插入或删除。在一个特定实施方式中，SEQ ID N0:4的第2位和第19 位的色氨酸残基中的至少一个或均在衍生肽中保留，即：第2位和第19位的色氨酸残基中的 至少一个或均被保留。
[0122] 本发明也包括本文描述的肽的片段、衍生物、变型或变体，以及上面描述的类似物 和同系物和其任何结合。当指本发明的肽时，术语"片段"、"变体"、"衍生物"、"变型"、"同系 物"和"类似物"包括保留了所述相应的起始肽序列的至少一些生物活性的任何多肽。术语 "变体"、"衍生物"和"变型"在本文中交替使用。
[0123] 本发明的肽的变体包括片段、由于如本文描述的氨基酸的取代、删除或插入而具 有改变的氨基酸序列的多肽以及如本文描述的变型。变体多肽可以包括如本文描述的保守 或非保守的氨基酸取代、删除或添加。变体也可以具有一个或多个通过官能侧基的反应化 学衍生的残基。还作为变体被包括的是含有一个或多个20个标准氨基酸的天然存在的氨基 酸衍生物的那些肽。比如，4-羟脯氨酸可以取代脯氨酸;5-羟赖氨酸可以取代赖氨酸;3-甲 基组氨酸可以取代组氨酸;高丝氨酸可以取代丝氨酸;并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。另外， 变体可以含有一个或多个非经典的氨基酸。
[0124] 因此，在一个实施方式中，本发明包括本文公开的肽的类似物、同系物、片段或变 体。在一个实施方式中，类似物、同系物、片段或变体保留了所述起始肽的一种或多种生物 活性，比如，β细胞新生活性、胰岛素增效活性、恢复或提高个体中葡萄糖动态平衡的能力、 逆转高血糖症的能力、对细胞受体的结合、稳定性等。肽的一种或多种生物活性可以被类似 物、同系物、片段或变体保留。在一个实施方式中，类似物、同系物、片段或变体保留所述起 始肽的至少一种生物活性或性质。
[0125] 在一个实施方式中，本发明的肽是被纯化的，或基本上是纯的。在另一个实施方式 中，本发明的肽是化学合成的。
[0126] 药物组合物和给药方法
[0127] 本文包括含有本发明的肽的药物组合物。本发明的肽可以根据已知技术通过将本 发明的肽和传统的药学上可接受的载体或稀释剂结合制备的传统剂量形式向个体给药。本 领域普通技术人员公认所述药学上可接受的载体或稀释剂的形式和性状由与它结合到的 活性成分的量、给药途径和其他熟知的变量决定。
[0128] 制备肽或其类似物、同系物、片段或变体的方法以及向个体给药肽或其类似物、同 系物、片段或变体的方法在本领域是熟知的，或是由本领域技术人员容易确定的。本发明的 肽和组合物的给药途径可以是比如:通过吸入或局部的口服、注射用药。如本文所用的术语 注射用药包括比如:静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道给药。在一个特定实施 方式中，本发明的肽或组合物通过注射给药。在一个实施方式中，所述给药途径为静脉注 射。在另一个实施方式中，本发明的肽或组合物经口服给药，比如:每日一次、每日两次或每 日三次。
[0129] 通常，用于注射的合适的药物组合物可以包括缓冲液（比如：乙酸盐、磷酸盐或柠 檬酸盐缓冲液）、表面活性剂(比如:聚山梨醇酯)和任选的稳定剂(比如:人血白蛋白）等。注 射给药的制剂包括无菌水或非水溶液、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二 醇、植物油（比如:橄榄油）以及可注射的有机酯（比如：油酸乙酯）。水性载体包括含盐和缓 冲介质的水、醇/水溶液、乳剂或混悬剂。在所述主题发明中，药学上可接受的载体包括但不 限于:0.01-0.1M并优选为0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8%盐溶液。其他普通的注射载体包括 磷酸钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格试剂或固定油。静脉注射的载体包括 流体和营养补充剂、电解质补充剂，比如基于林格葡萄糖的那些以及类似物。还可以存在防 腐剂和其他添加剂，比如:抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体及其类似物。
[0130] 更具体地，适于注射使用的药物组合物包括用于无菌注射溶液或分散剂的临时制 备的无菌水溶液（当水溶时)或分散剂和无菌粉末。在这种情况下，组合物必须是无菌的，并 且应该是一定程度上流动的以有易注射性。在制备和贮存条件下它应该是稳定的，并且优 选会是防腐的，抵抗微生物（比如细菌和真菌）的污染作用。载体可以是含有比如水、乙醇、 多元醇(如：丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇以及类似物）的溶剂或分散介质，及其合适的混 合物。可以保留合适的流动性，比如:通过使用比如卵磷脂的涂层、通过在分散的情况下保 持所要求的颗粒尺寸和通过使用表面活性剂。用于本文公开的治疗方法的合适的配方在 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co·,第16版，（1980)中有描 述。
[0131] 可以通过各种抗细菌和抗真菌试剂(比如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏 血酸、硫柳汞和其类似物)实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选在组合物中包括 等渗剂（比如:糖、多元醇（如甘露醇、山梨醇)或氯化钠）。可以通过在组合物中包括延迟吸 收的试剂(比如单硬脂酸铝和明胶)带来可注射的组合物的长期吸收。
[0132] 在任何情况下，无菌注射溶液可以如所要求的并且被本领域普通技术人员容易确 定的，通过将本发明的肽(通过它本身或与其他活性试剂结合）以需要的量与一种或多种成 分的结合包含在的合适的溶剂中，接着过滤除菌。一般地，分散剂通过将活性化合物引入无 菌载体中制备，其含有基本的分散介质以及来自上文列举的那些的所要求的其他成分。在 无菌粉末用于制备无菌注射溶液的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该真 空干燥和冷冻干燥产生活性成分的粉末外加来自之前的其无菌过滤溶液的任意额外的期 望成分。根据本领域已知的方法，用于注射的制剂经过处理、填充到容器（比如：安瓿、袋、 瓶、注射器或小玻璃瓶)中并且在无菌条件下密封。
[0133] 在制备液体药物组合物之后，可以将其冻干以防止降解和保持无菌。用于冻干液 体组合物的方法对于本领域普通技术人员是已知的。临用前，用可能包括额外成分的无菌 稀释液（比如:林格溶液、蒸馏水或无菌盐溶液)复原组合物。经过复原(reconst i tut ion)， 使用本领域技术人员已知的那些方法将组合物向个体给药。
[0134] 进一步地，制品可按试剂盒的形式包装和出售。这种制造的物品优选会提供使用 说明的标签或包装嵌入并且可以有使用制剂所需要的额外组分。
[0135] 本领域的技术人员会领会(比如用于预防或治疗糖尿病的）本发明的肽和组合物 的有效剂量依赖许多不同的因素(包括:给药方式、个体的特点和生理状态(如健康状态）、 其他给予的药物治疗、治疗是否是诊断性的、预后的、预防性的或治疗性的，等等)变化。剂 量可以用本领域普通技术人员已知的常规方法确定以优化安全性和功效。
[0136] 显然，要给药的融合肽的量也会依赖于它要给药的个体。在所述个体是人的情况 下，要给药的肽的量会依赖于大量的因素，包括患者的年龄、症状的严重度和所述患者的既 往病史，并且总是在于所述执行医生的合理判断内。一般地，以单剂量或加倍剂量向人或其 他哺乳动物给药本发明的肽的全天剂量可以是比如：以单剂量或加倍剂量的从〇.lmg/Kg/ 天至30mg/Kg/天的所述肽的量、从0 · lmg/Kg/天至20mg/Kg/天的所述肽的量或从2mg/Kg/天 至1 Omg/Kg/天的所述肽的量。单剂量组合物可以含有这种量或其约数(submu ltiples)以组 成每日剂量。在一个实施方式中，腹膜内（IP)每日给药5mg/kg。
[0137] INGAP肽的剂量方案和配方已经被描述(参见，比如美国专利公布第2004/0132644 号)。
[0138] 在一个实施方式中，本发明的肽以药学上可接受的盐形式配制或使用。在一个特 别的实施方式中，所述药学上可接受的盐为乙酸盐。
[0139] 在一个实施方式中，本发明的肽是基本上纯的。
[0140] 稳定性可以采用本领域已知的方法确定。比如，肽的稳定性通过比较各种参数(包 括但不限于：纯度、杂质的总的百分比、个别杂质的百分比（如由HPLC或其他合适的定量方 法测定的）、外观和样品的含水量来确定。HPLC方法可以用来确定相对于所述治疗性的肽水 平的降解产物的水平的任何增加。
[0141] 在存在或不存在湿度下以及在透光或黑的小玻璃瓶中，肽样品（无论是在溶液中 或冻干的粉末)可以在各种温度下贮存。不同贮存条件期间的降解可以导致杂质的增加和 治疗性肽含量的减少。在一些实施方式中，希望样品制剂的纯度大于80%、大于90%、大于 95%或大于97%。
[0142] 本发明的肽也可以作为药学上可给药的组合物的成分被给予。换句话说，肽可以 出现在用于向需要其的个体给药的配方中。本发明的肽可被用于比如治疗糖尿病的唯一的 活性成分。或者，组合物也可以含有一种或多种额外的化合物（比如，可以用于治疗同样的 或相关症状的第二试剂）。
[0143] 应被理解的是本发明的肽可以任选地与在治疗所述紊乱或需要治疗的症状中有 效的其他试剂组合给药。与本公开的范围一致，本发明的肽和组合物可以与其他的治疗性 或预防性试剂使用。本发明的肽可以与第二试剂伴随或顺序地给药。应被理解的是任何用 于1型或2型糖尿病或相关紊乱的治疗剂被考虑用于与本发明的肽组合。这种治疗性或预防 性试剂的实例包括但不限于:抗糖尿病试剂比如二甲双胍、磺酰脲(如:格列本脲、甲糖宁、 格列美脲）、那格列胺、瑞格列奈、噻唑烷二酮类(如:罗格列酮、匹格列酮）、PPAR_ γ -激动剂 (比如GI 262570)和拮抗剂、PPAR-γ/α调节剂（比如KRP297)、a葡萄糖苷酶抑制剂（比如:阿 卡波糖、伏格列波糖）、DPPIV抑制剂（比如LAF237，MK-431)、a2拮抗剂、降血糖试剂、胆固醇 吸收抑制剂、HMGCoA还原酶抑制剂(比如他汀类）、胰岛素和胰岛素类似物、GLP-1和GLP-1类 似物（比如exendin-4)和/或淀粉不溶素。在一个实施方式中，本发明的肽和组合物与免疫 调节剂阿那白滞素(一种证实用于治疗类风湿性关节炎的IL-1抑制剂，而具有在糖尿病中 有功效的证据)组合使用。
[0144] 在一个实施方式中，第二治疗剂是保持细胞团的试剂，比如通过阻止细胞的细 胞死亡或凋亡，保护胰岛对抗IL-1比如IL-Ιβ的有害功能，保护抵抗致糖尿病的试剂和/或 其他保护或提高胰岛活力和/或功能。第二治疗剂也可以逆转胰岛素抵抗、控制肠葡萄糖的 吸收、正常化肝葡萄糖的产生和/或提高细胞葡萄糖敏感以及胰岛素分泌。在一个实施方 式中，第二治疗剂可以是转录因子NF-κΒ的抑制剂或细胞因子诱导的转录因子NF-κΒ的激活 的抑制剂。在一个实施方式中，第二治疗剂为阿那白滞素。在其他实施方式中，第二治疗剂 为胰岛素、胰岛素类似物、SGLT 2抑制剂、新的胰岛形成诱导、干细胞治疗、Τ淋巴细胞抑制 剂、IL 12激活剂、STAT 4激活剂、免疫调节剂、胰岛移植物、抗炎剂、抗CD3单克隆抗体和/或 白细胞介素 l(IL-l)受体拮抗剂。
[0145] 实施例
[0146] 通过参考以下实施例会更容易理解本发明，以下实施例被提供用来说明本发明， 并且不解释为以任何方式限制其范围。
[0147] 实施例1 INGAP-P和r-INGAP剂量依赖地增加 RIN-m5F细胞的增殖。
[0148] 虽然胰腺导管细胞已经被认为是INGAP的特定靶（Rosenberg，L.等人，1988， Diabetes，37:334-341; PUtenger，G · L ·等人，2007，Pancreas，34:103-111 )，包括临床试验 结果的大量研究提示β细胞也会对INGAP的刺激做出应答。为了研究INGAP对β细胞的效应， 我们使用RIN-m5F，RIN-m5F为一种大鼠胰岛瘤细胞系，通常用作β细胞体外代用品（Cozar-Castellano，I.等人，2008，Diabetes，57: 3056-3068)。虽然在我们的实验中没有观察到在 胰岛素表达上的显著功能，数据显示24小时后INGAP-P和r-INGAP均剂量依赖地诱导BrdU在 RIN-m5F细胞中的掺入（图1A)，对于r-INGAP来说最有效的浓度为InM(相对于阴性对照1.5 倍增加，阴性对照是用PBS处理(等于1))，并且对于INGAP-P来说最有效的浓度为835nM(相 对于阴性对照1.8倍增加）。总的来说，这个倍数变化与在仓鼠导管外植体和ARIP细胞上的 较早数据一致(Rafaeloff，R.等人，1997,J Clin Invest,99:2100-2109)。用用作阳性对照 的EGF( 10ng/ml，1 · 49倍增加)和Exendin 4( 10nM，1 · 56倍增加)观察到了类似的促有丝分裂 功能（图1A)。
[0149] BrdU掺入的增加与Erkl/2快速的暂时性激活一致，在加入r-INGAP或INGAP-P后的 1至15分钟之间观察到（图1B、C)。要注意的是，EGF和Ex-4似乎产生更长的持续的Erkl/2激 活（图1C)，这提示由这些因素和INGAP激活的信号途径中的差异。这些结果显示蛋白质和肽 均以类似的方式起作用，但是具有不同的摩尔效能（至少167倍的差异）。应该注意的是，采 用源自去分化的、胰岛衍生的导管样结构的功能性人胰岛的体外再生模型(Assouline-Thomas，B ·等人，2010，Protein Expr Pur if，69 :1-8)和在 HPDE 细胞中（Beatrice，G ·和 Assouline-Thomas,L.R.,Islet neogenesis associated protein(INGAP)induces endocrine differentiation of human pancreatic ductal cells in vitro.70th American Diabetes Association Meeting. 2009)，在 15-mer肽和所述rINGAP蛋白之间也 观察到了效能上的类似差异。这种现象最可能的解释是INGAP蛋白和INGAP-P与细胞表面不 同的相互作用和/或激活不同的信号途径。
[0150] INGAP-19和INGAP-19C肽也显示诱导RINm5F细胞中Erk 1/2激活，并且均比INGAP-P或 INGAP-PC有效（图 23)。
[0151] 实施例2 r-INGAP和INGAP1()2_12()结合RIN-m5F细胞在细胞表面形成簇样复合体，而 INGAP1(^118快速内化到细胞质。
[0152] 为了确定INGAP怎样结合和内化到RIN-m5F细胞中，我们采用经荧光活性染料 DyLight-488(绿）和-594(红）标记的r-INGAP以及5-FAM标记的INGAP-P。如图10中所示， 50nM DyLight-488r-INGAP在几分钟之内结合RIN-m5F细胞的细胞表面，并且在细胞表面形 成小的簇和斑，类似于对其他配体所描述的膜多蛋白复合体的交联。这在37°C下和冰上均 观察到，提示高的亲和受体结合。这不同于由用作小窝蛋白和网格蛋白介导的胞吞作用的 阳性标记的霍乱毒素 B(CTB、AlexaFluor 594)和转铁球蛋白（Texas Red，均来自 Invitrogen)显示的均匀染色（图2A、B)。虽然内化的第一信号在15分钟后观察到（图10、 11)，该蛋白质出现在细胞表面保持成簇几个小时（图2C-E、图11)，不像转铁球蛋白和CTB在 1小时内内化（图2C、D)。在5小时孵育后，大多数的荧光标记在细胞内可见（图2E)，并且与溶 酶体标记(LysoTracker red)部分共定位。24小时后，所有标记的rINGAP出现内化并且与溶 酶体连接(虽然是部分），并且显示不再进一步结合到细胞表面（图2F)。对于INGAP 1(^12Q结 果类似(图19)。
[0153] 有趣的是，在追踪实验中，当细胞暴露于DyLight488rINGAP仅1小时，接着清洗和 在没有rINGAP下培养5小时或24小时，内化的rINGAP的量与在连续培养之后相比没有显著 下降（图12)。这提示大多数的INGAP受体是配体结合的相当快的，在1小时内，并且受体更新 时间（turnover time)可能超过24小时。
[0154] rINGAP和CTB或转铁球蛋白之间的共迀移的缺乏提示rINGAP不是通过网格蛋白或 小窝蛋白介导的途径的任何一个内化的。这与网格蛋白和小窝蛋白的免疫染色结果一致， 显示不与rINGAP共定位（图11)。由于观察到的这些药物细胞毒性（比rINGAP内化显像 (developing)更快），我们不能用网格蛋白介导的胞吞作用的特异性抑制剂（氯丙嗪、丹 (磺)酰戊二胺)或小窝蛋白介导的胞吞作用的特异性抑制剂(菲律宾菌素和甲基环糊精） 以及Dynasore (发动蛋白抑制剂)核实这些数据。然而，我们示出了 rINGAP的内化被渥曼青 霉素(流体相胞饮作用和PI3K的抑制剂)和细胞松弛素 D(肌动蛋白聚合的抑制剂)抑制，提 示作为rINGAP胞吞作用的主要机制的大胞饮(macropinocytosis)。
[0155] 与r-INGAP和INGAP1()2_12()相比，在细胞表面没有观察到FAM标记的INGAP 1()4_118的积 累或成簇（图4)。这些结果表明一经结合到细胞膜，15-mer肽就被内化。在孵育5分钟后，标 记的肽在RIN-m5F细胞的细胞质中可见，在30分钟后达到稳定水平（图4)。如在图4C中可见， 在30分钟之后INGAP-P显现出与早期的内涵体共定位，并且之后逐渐迀移到溶酶体的隔室， 与LysoTracker red共定位（图4D、F)。
[0156] 除了细胞结合和内化的动力学上的差异，已经观察到蛋白和肽之间的一些其他差 异。比如，内化的INGAP-P出现更快的降解，如在24小时的连续和"追踪"孵育实验中所示（图 13)。并且，INGAP-P内化在冰上或通过与小窝抑制剂菲律宾菌素预孵育被抑制（图14)，这提 示这个过程可能被小窝/脂阀胞吞作用介导。网格蛋白依赖的胞吞作用的抑制剂(氯丙嗪、 丹(磺)酰戊二胺)没有显著的功能(未示出）。另一方面，INGAP-P内化通过与细胞松弛素 D预 孵育15分钟而被抑制，引起细胞表面小簇的形成（图5C)。这提示肌动蛋白丝与INGAP-P内化 过程相关。然而，不像是大胞饮，因为渥曼青霉素没有显现在这个过程上有抑制功能（图 ?) 〇
[0157] 为研究rINGAP、INGAP1(^12()和INGAP1^ 118是否通过同样的受体起作用，DyLight-488-rINGAP和FAM-INGAP1()2_ 12()或INGAP1()4_118被用在具有20倍摩尔过量的未标记的蛋白或肽 的竞争实验中。结果显示该蛋白质的内化被未标记的蛋白质部分抑制，并且肽的内化被未 标记的肽部分抑制，但是它们在实验浓度下没有出现相互抑制（图6)。这个结果提示蛋白和 肽可能不结合相同的受体。
[0158] 实施例3Erk 1/2激活
[0159] 为了比较19-mer延长肽(19-mer序列1、序列2和序列3;参见表1)和15-mer INGAP-P肽(参见表1)的效力，在RINm5F细胞中测量Erk 1/2激活。结果在图18中显示。图18中出现 的数据显示，当在相同浓度下检测时，与15-mer INGAP-P肽和其余两种19-mer序列相比，在 RIN细胞的Erk 1/2激活上19-mer序列3具有3倍多的有效性。在1 X浓度下的19-mer序列3的 有效性是在10 X浓度下的15-mer肽的约2.5倍，提示19-mer序列3肽有更高的效能。
[0160] Erk 1/2的激活可能是通过由受体酪氨酸激酶(RTK)或由不同种类的G蛋白偶联受 体(GPCRs)在细胞膜水平上起始的大量信号级联介导的。这些信号级联包括PKC、PKA、P13K 或Ras/Raf依赖途径。因为INGAP受体的性质未知，我们采用磷酸特异性抗体和上述途径的 药理抑制剂筛选RTK和GPCR起始的信号事件。为了比较我们使用EGF(10ng/ml)和Ex-4 (10nM)，发现在所示的浓度下对于RIN-m5F细胞是促有丝分裂的（图1A)。因为EGF信号贯穿 经典的RTK途径并且Ex-4是G蛋白偶联的GLP-1受体的拮抗剂，这种比较可能为INGAP怎样工 作提供重要的线索。
[0161] 低分子量的Ras家族GTP酶的激活是通过RTKs信号传递的首要事件，比如EGFR。然 而，显然由GPCRs引起的MAP激酶激活的机制也可能包括由GPCRs和RTKs之间的通话引起的 Ras激活，比如，对于几种GPCR配体(包括GLP-1)所显示的EGFR的反式激活。与此见解一致的 是，我们的结果显示由INGAP-P和rINGAP引起的快速Ras激活（图7A)，与Erk 1/2磷酸化的时 间轴一致(图IB、C)，并且与c-Raf的时间轴一致(图7B)，因此涉及Ras-Raf-MAPK途径。
[0162] 除了Ras激活，我们观察到用INGAP-P处理30分钟后Akt磷酸化的增加，该增加相对 于Erk 1/2的激活被延迟（图15)。这提示PI3K/Akt信号传导的激活是平行于而不是由 INGAP-P引起的Erk 1/2磷酸化的原因。rINGAP也显现能轻微提高Akt磷酸化，虽然改变不显 著。如在图15中所示，Akt的最强的激活由Ex-4诱导，其在早期的时间点观察到，并且与在另 一个大鼠胰岛瘤细胞系中的GLP-1信号传导上的数据一致（Buteau，J .等人，1999， Diabetologia ,42,856-864)。在EGF处理后也观察到Akt的早期激活，3小时后具有明显的第 二波峰。综合考虑，这些结果表明Ras-Raf-Erk激活的信号传导事件上游可能在INGAP-P和 rINGAP之间变化，并且好像不同于由Ex-4和EGF诱导的那些。值得注意的是，我们没有观察 到由任何蛋白质或肽引起的任何P38MAPK(蛋白质印迹），或PKA(ELISA)，或PKC(蛋白质印迹 和ELISA)的显著激活(数据未显示）。
[0163] 为了研究INGAP诱导的增殖中涉及的信号传导事件，我们采用Raf(Raf抑制剂1)、 PI3K(渥曼青霉素）、PKC(Bis)、PKA(H89、PKi)、腺苷酸环化酶（SQ22536)、Src(PP2)和EGFR (AG1478)的特异性药理学抑制剂。另外，百日咳毒素（Ptx)用于检查INGAP的作用是否由 GPCR介导。这些抑制剂的有效性通过用INGAP或EGF或Ex-4处理10分钟后的Erk 1/2磷酸化 和通过24小时后的BrdU掺入进行判断。
[0164] 如在图8A中所示，INGAP诱导的Erkl/2激活通过暴露于Ptx 24小时后，抑制40%， 但是不受AG1478的影响（图8B)。这提示INGAP可能通过GPCR传递信号，但是这种信号传导不 涉及EGF受体，如对GLP-1 之前已经显示的（Buteau，J·等人，2003，Diabetes，52，124-132)。 Ptx也抑制由INGAP或EGF或Ex4诱导的早期Ras激活（图9)，其进一步支持了 INGAP通过GPCR-Ras途径传递信号的想法。与之前的Ras-Raf信号传递的暗示一致的是，用Raf激酶抑制剂1 预处理减少了下述两者：10分钟后Erk 1/2的激活（图8B)和由测试的所有生长因子诱导的 24小时后BrdU的掺入（图16)。有趣的是，Src抑制剂PP2抑制了由r-INGAP刺激而不是由 INGAP-P刺激的Erk 1/2磷酸化（图8B)以及增殖（图16)，其进一步凸显了蛋白质和肽之间在 信号传导上的不同。
[0165] 除了由TO98059引起的预期的Erk 1/2和BrdU掺入的抑制，没有所测试的其他抑制 剂(针对PKC、PI3K或PKA)显著减少Erk 1/2磷酸化。除了H89(PKA抑制剂）引起rINGAP处理的 细胞在24后BrdU掺入的减少(这在以下讨论），在其他组中没有观察到增殖的抑制（图16)。 我们较早的数据清楚地表明PI 3K/Akt在来自人去分化的导管样结构的INGAP-P诱导的胰岛 新生中信号传导(Jamal，Α·Μ·等人，2005，Cell Death Differ ,12,702-712)。这种途径好像 也介导INGAP-P在大鼠新生胰岛上的效应(Barbosa,H. C.等人，2008, J Endocrinol ,199， 299-306)。此外，PI3K介导的信号传导好像是对于Reg蛋白最常见的途径(Takasawa，S.等 人，2006，FEBS Lett，580，585-591 ;Bishnupuri，K. S.等人，2006，Gastroenterology，130， 137-149)。在这种背景中，我们的数据显示在INGAP-P或rINGAP的促有丝分裂效应中不涉及 PI3K/Akt途径的数据可能看起来是惊奇的。然而，我们确实在用INGAP-P处理30分钟的细胞 中观察到六1^磷酸化，其在1-15分钟时尾随1^18-1^1；1^4激活中的峰。
[0166] 与Erk 1/2数据相比，PKA的抑制剂(H89)减少了rINGAP处理的细胞中BrdU掺入（图 16)。鉴于GPCR信号传导中cAMP依赖的PKA的已知作用，以及之前表明这种途径在INGAP-P在 背根神经节的神经突生长物上的刺激功能中的结果(Tam, J.等人，2006,Neuroreport，17， 189-193)，我们进行额外的实验以检查这种途径在INGAP诱导的增殖上的可能牵连。在Erk 1/2磷酸化上，我们也测试了更多的特异性PKA抑制剂PKi (Murray，A· J ·，2008，Sci Signal， l，re4)以及一种腺苷酸环化酶的特异性抑制剂SQ22536。如在图8A中所示，PKi(lOOnM)没有 作用，并且SQ22536(200nM)不仅没有减少由INGAP-P或rINGAP诱导的Erk 1/2磷酸化甚至也 没有稍微使其增加。
[0167] 我们的结果提示在INGAP信号传导中不涉及cAMP-PKA途径，在这种背景中，如果 INGAP确实通过GPCR传导信号，受体可能不偶联到Gi蛋白，Gi蛋白具有抑制腺苷酸环化酶的 能力（Luttrell，L.M.，2002，Can J Physiol Pharmacol,80,375-382)。
[0168] 综合考虑，本文呈现的数据显示INGAP-P和rINGAP均通过激活Ras-Raf-Erk途径刺 激RIN-m5F细胞的再生。INGAP-P和rINGAP可能均通过不诱导cAMP激活的偶联受体的Gi蛋白 起作用。
[0169] 实施例4 INGAP肽的稳定性检测
[0170] 在血清存在下测定INGAP-P和INGAP-19肽的降解图（图20)。5(^]?肽在含有25%FBS 的RPMI-1640培养基中孵育所示的时间。在血清蛋白的乙醇沉淀后，接着通过HPLC分析样 品。为比较肽降解的动力学HPLC图是如所示的叠加的。
[0171] 还进行FBS中INGAP-PC和INGAP-19C肽的体外孵育的时间进程研究（图21)。50μΜ INGAP-PC和INGAP 19C在含有25%FBS的RPMI-1640培养基中孵育所示的时间。在血清蛋白 的乙醇沉淀后，接着通过HPLC分析样品。为比较肽降解的动力学HPLC图是如所示的叠加的。 可见在血清存在下48小时中，没有观察到INGAP-19C降解（图21B)。在所检测的INGAP肽中， INGAP-19C显示了最高的稳定性。
[0172] 实验步骤
[0173] 重组INGAP蛋白和INGAP肽
[0174] 在Sheldon生物技术中心(麦吉尔大学，蒙特利尔)合成并HPLC纯化INGAP蛋白的15 氨基酸片段(氨基酸104-118)和INGAP蛋白的19氨基酸片段(氨基酸102-120)。通过PCR产物 的定向克隆从仓鼠胰腺组织中克隆含有C末端6-Hi s标签的全长重组INGAP (r -INGAP)(分子 量 17.6kDa)，该PCR产物用将Superscript III RT和Platinum?Pfx DNA聚合酶 (Invitrogen)引入pcDNA3 · lD/V5-His-T0P0?表达质粒（Invitrogen)中产生。这种构造 ((3〇1181：1'11〇1:)用于再克隆到慢病毒载体并在!1293细胞中表达(如在488〇111;[116-1'1101]^8，13.等 人，2010，Protein Expr Purif ,69:1-8中所描述的）。如所描述的（Assouline-Thomas，Β·等 人，2010，Protein Expr Purif,69:1-8)使用Cobalt树脂（BD TAL0N?，BD Biosciences，或 Fractogel EMD螯合物(M)，Merck)进行r-INGAP的纯化。
[0175] 细胞培养
[0176] RIN-m5F细胞（第18代）购自ATCC，并在37°C/5%⑶2下保持在含有25mM葡萄糖、 10 %FBS( Montreal Biotech)和抗生素/抗真菌药（Invitrogen)的 RPMI-1640培养基 (Invitrogen)中。在第25-31代细胞上进行实验。细胞接种在60mm组织培养皿上（每皿1 X 1〇6个细胞)并允许生长24-48小时，随后在用INGAP蛋白或肽处理之前撤出血清24小时。在 无血清培养基中给药INGAP-P(15-mer肽）、INGAP-P2(19-mer肽）、rINGAP和EGF( 10ng/ml， Sigma)所示的时间。
[0177] 通过BrdU免疫染色测定细胞增殖
[0178] 如上面描述的，用INGAP、EGF或Ex4处理接种在8孔或4孔小室载玻片上的细胞(每 孔5X 104或1 X 105个细胞)24小时，并在处理的最后3小时加入50μΜ BrdU。用PBS清洗细胞并 在-20°C下在甲醇中固定10分钟。按照生产商的方案用小鼠抗BrdU抗体(Roche)对BrdU进行 免疫染色。这之后接着用第二、HRP结合的抗体(广谱，HistostairT-Plus)和AEC色原体(均 来自Zymed Laboratories)检测。用苏木精对载玻片进行复染。计数BrdU阳性和阴性细胞核 (每孔总共200个），并且计算BrdU阳性细胞核的百分比（图36)。
[0179] 蛋白质印迹分析
[0180] 接着处理，将细胞放置在冰上，用PBS清洗并溶解在含有2.5mM Na4P2〇7、ImM Na3V〇4 和完全蛋白酶抑制剂混合片(Roche)的裂解液(Cell Signaling，Inc.(细胞信号传导有限 公司），Beverly，MA)中。等量的蛋白质（20-50yg，用DC蛋白质分析(Bio-Rad)测定）由10% SDS-PAGE分解，接着在250mA下向硝化纤维膜(Bio-Rad)转移90分钟并用不同的抗体分析。 抗Erkl/2(MAPK 44/42)和抗磷酸Erkl/2(Thr202/Tyr204)兔多克隆抗体购自Cell Signal ing。接在第一抗体孵育后，清洗印迹并之后在第二、抗小鼠或抗兔HRP结合的抗体 (Cell Signaling)中孵育，并清洗和用ECL系统(GE Healthcare)显色。为分析相同印迹上 的几种蛋白的表达，首先用磷酸抗体孵育膜，接着再用相应的非磷酸第一抗体探测之前进 行清洗(〇.21甘氨酸、0.1%303、0.05%吐温20，？!12.2)。
[0181 ]荧光 rINGAP、INGAP102-120 和 INGAP104-118 的可视化
[0182]如操作指南所详述，用 DyLight-488 或 DyLight_594(ThermoScientific)#E100 y g rINGAP。在Sheldon生物技术中心（麦吉尔大学，蒙特利尔）或Canpeptide (Pointe Claire，魁北克），在合成期间用5-FAM或FITC标记INGAPH12()和INGAP1(^ 118。将荧光rINGAP (50nM)或 INGAP1Q2-12Q 和 INGAP1Q4-118(8·35-16·7μΜ)加入到生长在玻璃室载玻片(Beckton-Dickinson或Lab-Tek)中的RIN-m5F中，在不同间隔后接着用PBS清洗并在4%多聚甲醛中固 定。载玻片用含有DAPI的VectaShieId培养基(Vector)或Prolong Gold(Invitrogen)覆盖 其上，用于细胞核的复染以及在共聚焦显微镜Zeiss LSM 510或Olympus FVlOi下的检查。 为了活体共聚焦成像，将细胞生长在Nunc?分室的盖片载玻片(ThermoScientif ic)中。在用 INGAP孵育之前，用0.01 %DAPI染色细胞核，接着清洗。活体成像在37°C和5%C02下进行。 [0183]统计分析
[0184] 实验重复至少三次。结果表示为平均值土标准误差。用不配对Student ' s t检验进 行统计分析。P值〈〇. 05被认为显著。
[0185] 实施例515L INGAP和 15C INGAP的比较
[0186] 步骤:细胞接种和处理：
[0187] 从RINm5F细胞的板上吸取所有含FBS的培养基，并将10mL PBS移液到板中以洗去 培养基。吸取PBS并将600yL胰蛋白酶移液到板中。倾斜板以保证胰蛋白酶覆盖所有。向板中 加入8mL含有FBS的培养基，并之后收集培养基和细胞的混合物到15mL管中。为确定细胞浓 度，在显微镜下用血球计计数用1:1稀释的细胞和台盼蓝的细胞。计算每板中需要的细胞的 量以得到想要的5X10 5细胞/板的细胞密度，并将细胞接种在16-35mm的板上。在37°C、5% C02下将细胞孵育3天。将培养基从含血清培养基更换为无 FBS培养基，以在处理之前对所述 细胞血清饥饿24小时。处理16板：
[0188] a、用 15C INGAP处理4板
[0189] b、用15L INGAP处理4板
[0190] c、用FBS处理4板
[0191] d、用H20处理4板
[0192] 将板孵育48小时，通过胰蛋白酶消化从每板收集细胞并且将每个样品置于它自己 的微量离心管(Eppendorf tube)中。
[0193] 细胞生活力(Viability)测定
[0194] 通过将5yL来自1个样品的细胞与10mL小玻璃瓶中的细胞计数仪器的盐溶液混合， 进行细胞生活力测定。将小玻璃瓶放置在探测仪内。该仪器会计数活细胞的数量。用所有的 其他细胞样品重复细胞计数，每个样品做两个独立的计数。进行如下所示的Bradford分析 以标准化细胞计数比总蛋白质。结果在下面的表1A-C中示出。
[0195] 表1A通过细胞生活力分析比较15L INGAP和15C INGAP在细胞增殖上的效应
[0196]
表1B细胞生活力单因素方差分析(AN0VA)
[0198]
[0199] 表1C独立T检验后的细胞生活力
[0200]
[0201] Bradford 分析
[0202] 进行Bradford分析以标准化细胞计数比总蛋白质。将样品离心、吸出培养基，并在 每管中用lml PBS更换并再次离心。吸出roS用200yL RIPA裂解缓冲液更换。在4°C空间内再 次离心。溶解在RIPA裂解缓冲液中的5yL 8种不同的"标准"浓度的BSA被移液到96孔板的头 3列中（每个浓度三份），最后的浓度作为空白，其只含有裂解缓冲液。这些之后将用于计算 目的。离心每个蛋白质样品的两份。通过混合2mL来自Bio-Rad蛋白质分析试剂盒的溶液A和 40yL也来自该试剂盒的溶液S，在一起制备大约2mL的Bradford试剂。通过移液管将25yL Bradford试剂置于每孔中。来自试剂盒的200yL的溶液B置于每孔中。将板振荡10分钟以将 溶液混合在一起(确保没有气泡)并放置在读数仪中以计算每个样品的吸光度。所获得的值 输入电子表格程序中。用标准品的已知浓度(X值)和它们的吸光度值(y值)创建标准曲线。 通过代入它们的吸光度值，用最适线的公式用代数方法计算样品的浓度。
[0203] 通过BrdU免疫染色评价细胞增殖
[0204] 将细胞接种在三个8孔小室载玻片中（每孔1X105个细胞），用15C INGAP、15L INGAP、水或FBS处理细胞，并孵育过夜，并在处理的最后3小时期间加入50μΜ BrdU。用roS清 洗细胞并在_20°C下在甲醇中固定10分钟。按照厂商的协议用鼠抗BrdU抗体(Roche)进行 BrdU免疫染色。这之后接着用第二、HRP结合的抗体(广谱，Histostain?-Plus)和AEC色原体 (均来自Zymed实验室）的检测。用苏木精复染载玻片。计数BrdU阳性和阴性细胞核(每孔总 共200个)并计算BrdU阳性细胞核的百分比。结果在下面的表2A-C中示出。
[0205] 表2A通过BrdU染色比较15L INGAP和15C INGAP对细胞增殖上的效应
[0206]
[0207]表2B BrdU单因素 (AN0VA):
[0208]
[0209] 表2C独立T检验后的BrU 「02101
[0211]蛋白质印迹分析
[0212] 磷酸ERK的蛋白质印迹:如下
[0213] 在细胞接种和处理步骤后，用不同的处理和不同的时间处理16板：
[0214] a、2板 10X15C INGAP放置5分钟
[0215] b、2板 10X15C INGAP放置 10分钟
[0216] c、2板 10X15C INGAP放置30分钟
[0217] d、2板 10X15C INGAP放置60分钟
[0218] e、2板 10X15L INGAP放置5分钟
[0219] f、2板 10X15L INGAP放置 10分钟
[0220] g、2板 10X15L INGAP放置30分钟
[0221] h、2板 10X15L INGAP放置60分钟
[0222] 在孵育之后，用冷的PBS清洗板两次以保证所有的INGAP处理从板上除去。通过向 每板加入200yL RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并放置在振荡器上大约20分钟以保证完全裂 解。用移液器将蛋白质样品收集进微量离心管中并在4°C空间在16.1 X1000 rpm下离心20分 钟。所获得的上清转移到新的试管中，并进行Bradford分析以确定每个样品中蛋白质的浓 度。当总共15yg上样到凝胶的每孔中时溶解所需量的蛋白质。样品与上样缓冲液结合，在 100°C下加热5分钟，并和梯（ladder)-起置于具有10孔的2-10%丙烯酰胺凝胶上，在200V 下跑50分钟或直至前面的蓝色蛋白跑出底部。通过在0.3A下运行转移1小时，用双转移夹心 将蛋白质从凝胶转移到带正电荷的硝化纤维膜上。这个转移将已跑蛋白质从凝胶物质转移 到膜上。将该膜放置在干净的容器中，并且让它在这个时间T期间放在振荡器上，通过浸没 在5%BSA TBST中1小时将非特异性蛋白封闭。
[0223] 移除封闭液并允许膜保持在第一抗体溶液（10yL兔抗磷酸ERK抗体，其在10mL的 5%BSA TBST中结合到磷酸化的ERK)中，并且让它在温度为4°C的空间振荡过夜。移除第一 抗体，并用约10mL的1XTBST缓冲液洗膜，让它置于振荡器上10分钟。重复该清洗三次。然后 在室温下在振荡器上将膜置于第二抗体溶液中（l〇yL羊抗兔抗体，在1:1000稀释因子的情 况下，其在10mL5%BSA TBST中结合到第一抗体）1小时。这引起蛋白发出化学发光，因此它 可以用仪器观测。该膜用第二抗体溶液处理两次。该膜用lmL ECL溶液覆盖5分钟，并放置在 能观测磷酸化的ERK的chem-doc仪器中。用计算机程序Image Lab定量凝胶上的磷酸化的 ERK的带。
[0224] 在磷酸化ERK的定量之后，用TBST洗涤膜以除去ECL溶液，并用兔抗ERK代替兔抗磷 酸化ERK作为第一抗体重复抗体过程，目的是定量总的ERK而不是磷酸化的ERK。总共3个蛋 白质印迹实验。结果显示在表3A-C中。
[0225] 表3A通过蛋白质印迹比较15L INGAP和15C INGAP在ERK1/2磷酸化上的效应
[0226]
[0228] 表3B蛋白质印迹双因素 AN0VA
[0229]
[0230] 表3C独立T检验后的蛋白质印迹 12
2 虽然本公开连同其【具体实施方式】已经被描述，应该会理解它能有更多的改变，并 且本申请意在覆盖下述:总的来说，按照本公开的原则和包括如在本公开相关的和如可能 应用于本文的之前所示的和如下在随附的权利要求的范围内的必要特征的领域内已知或 通常实践范围内的本发明的背离的本公开的任何变化、用途或适应性的改变。
[0233] 除非被另外定义或上下文清楚地表明其他，本文所用的所有技术和科学术语具有 与在本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的同样的含义。应被理解的是与本文描述 的那些相似或等价的任何方法和材料可以用在该发明的实践或检测中。
[0234] 本文引用的所有文件和参考以其整体包含在此引作参考。
【主权项】
1. 一种肽，其包含SEQIDN0:4、SEQIDN0:5或SEQIDN0:6所示的序列。2. 根据权利要求1所述的肽，其中所述肽诱导个体中胰腺β细胞新生、诱导胰腺β细胞再 生、提高葡萄糖动态平衡和/或逆转高血糖症。3. 权利要求1所示的肽的类似物、同系物、片段或变体，其中所述类似物、同系物、片段 或变体具有所述肽的生物活性。4. 根据权利要求3所述的类似物、同系物、片段或变体，其中所述类似物、同系物、片段 或变体具有与所述肽至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序 列同一"性。5. 根据权利要求4的融合蛋白的类似物、同系物、片段或变体，所述生物活性为所述肽 的细胞或受体结合特异性。6. 根据权利要求4的融合蛋白的类似物、同系物、片段或变体，其中所述生物活性为诱 导个体中胰腺辟田胞新生的能力、诱导个体中胰岛细胞再生的能力、提高个体中葡萄糖动态 平衡的能力和/或逆转个体中高血糖症的能力。7. -种核酸分子，其包含编码SEQIDNO:4、SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的肽或其类似 物、同系物、片段或变体的核酸序列。8. 权利要求7所述的核酸分子可操作地连接到表达控制序列以形成的表达载体，其中 所述表达载体在合适的细胞中是可增殖的。9. 一种药物组合物，其包含权利要求1所述的肽或类似物、同系物、片段或变体以及药 学上可接受的载体或赋形剂。10. 根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述组合物适于口服给药。11. 根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述组合物适于注射给药。12. -种用于预防或治疗胰腺症状或疾病的方法，所述方法包括给药权利要求9所述的 组合物的肽或其类似物、同系物、片段或变体。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述症状或疾病为新陈代谢紊乱。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述症状或疾病为细胞相关的紊乱。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述症状或疾病为1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿 病的并发症。16. 根据权利要求14所述的方法，其中在所述个体中凋亡或坏死引起的辟田胞死亡被阻 止或抑制。17. 根据权利要求12所述的方法，其中在所述个体中胰腺细胞的功能被改善或恢复。18. 根据权利要求12中任一项所述的方法，其中在所述个体中血浆胰岛素水平增加。19. 根据权利要求14中任一项所述的方法，其中在所述个体中胰腺β细胞的数量或尺寸 增加，和/或其中来自胰腺导管细胞的辟田胞再生被刺激。20. 根据权利要求14中任一项所述的方法，其中在所述个体中葡萄糖动态平衡被恢复 或提尚和/或尚血糖症被逆转。21. 根据权利要求12所述的方法，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体通过注 射、口服、静脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给药。22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体经口服 给药，每日一次。23. 根据权利要求9任一项所述的方法，其中所述个体为人。24. 根据权利要求9任一项所述的方法，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体与 第二治疗剂给药。25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述第二治疗剂伴随所述肽或其类似物、同系 物、片段或变体给药。26. 根据权利要求24所述的方法，其中所述第二治疗剂和所述肽或其类似物、同系物、 片段或变体连续给药。27. 根据权利要求24任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂为用于1型或2型糖尿病 的治疗药。28. 根据权利要求24任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂为阿那白滞素。29. -种用于治疗胰功能不全的药物组合物，所述组合物包含权利要求1所述的肽或其 类似物、同系物、片段或变体以及药学上可接受的载体或赋形剂。30. 根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体 能刺激来自胰腺导管细胞的细胞再生。31. 根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述肽或其类似物、同系物、片段或变体 具有哺乳动物INGAP蛋白的生物活性。32. 根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述生物活性为刺激胰腺导管样细胞或 导管相关的细胞生长和增殖的能力。
【专利摘要】本文提供用于预防或治疗糖尿病的新的INGAP肽及其组合物和使用方法。特别地，描述了具有β细胞新生和胰岛素增效活性并且对于体内使用足够稳定的19个氨基酸的INGAP肽。
【IPC分类】C12N15/12, A61P3/10, A61K38/17, C07K14/47, C07K7/08
【公开号】CN105492459
【申请号】CN201480021504
【发明人】L·罗森贝格
【申请人】高端学术皇家研究会/麦吉尔大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年2月14日
【公告号】CA2901404A1, EP2956475A1, US20160002310, WO2014124540A1
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