结合人类补体因子c2的结合分子及其应用
结合人类补体因子c2的结合分子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫/生物化学领域。本发明涉及用于抑制补体系统的经典激活途径 和凝集素激活途径的活化的手段和方法，及其在治疗人类病症中的应用。本发明涉及补体 因子的抑制因子及其应用。本发明具体涉及与人类补体因子C2结合的结合分子，及其在治 疗或预防补体活化介导的疾病或障碍(诸如抗体介导的炎症性疾病和缺血性病症中的缺 血-再灌注(I/R)损伤）中的应用。
【背景技术】
[0002] 补体系统包括在血液中循环的蛋白。补体因子作为无活性的前体蛋白进行循环。 所述系统的活化导致活化级联，其中，通过级联中进一步下游的补体蛋白的特异性蛋白水 解作用，一个因子活化随后的因子。补体系统属于所谓的血浆级联系统。补体系统参与宿主 针对入侵微生物的防御。
[0003] 可经由三种途径发生补体系统的活化:经典激活途径、凝集素激活途径和替代激 活途径。每一条途径都活化核芯组分C3或第三补体因子，这使得引起膜攻击复合体的形成 的常见末端途径活化(]^111161^&61'11&1(1，41111111^￥13;[001161111988,57:321)。在补体活化过 程中，生成几种炎症性肽(如过敏毒素 C3a和C5a)，以及膜攻击复合体C5b-9。这些活化产物 激发多效的生物效果，诸如白细胞的趋化性，吞噬细胞、肥大细胞和嗜碱粒细胞的脱粒，平 滑肌收缩，脉管渗透性升高，和细胞裂解(Hugl i，Complement 1986，3:111)。补体活化产物 尤其通过吞噬细胞，还诱导有毒的氧自由基的生成，以及花生四烯酸代谢物和细胞因子的 合成和释放，这进一步放大炎症应答。
[0004] 尽管补体是针对病原微生物的防御的重要线路，它的活化也可能伤害其他健康的 宿主细胞。补体介导的组织损害在很多炎症性疾病中都起作用，这些炎症性疾病包括败血 症、免疫复合体病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和脉管炎、多发性创伤、几种神经病 (诸如多灶性运动神经病）、缺血-再灌注（I/R)损伤(诸如在心肌梗塞等的过程中出现的缺 血-再灌注（I/R)损伤）。补体活化在这些病症中的致病作用是它的活化产物的上述一种或 多种生物效果的结果。因此，抑制补体活化在这些病症中是有利的。
[0005] 可通过天然抑制因子，抑制补体的活化，其中天然抑制因子在上述级联的几个水 平上控制活化。这些抑制因子包括:C1_抑制因子，其抑制经典激活途径和凝集素激活途径 的活化的早期步骤;Η因子和C4结合蛋白，其分别使C3-转化酶和C4-转化酶解离，并且充当 降解C4b和C3b的I因子的辅因子;发挥与Η类似功能的调节膜蛋白CR1、DAF和MCP;以及，抑制 MAC的血衆蛋白玻连蛋白和凝聚素（clusterin)和膜蛋白CD59(Sahu et al.，Immunol Resl998，17:109;Campbell et al.，Annu Rev Immunoll988,6:161)。
[0006] 抑制补体活化是一有吸引力的治疗选择。实际上，已经生产出几种作为重组蛋白 的内源性可溶的补体抑制因子(C1-抑制因子;可溶的补体受体1或sCRl)，并且在临床研究 中进行了评价。另外，还评价了抑制级联反应中诸如C5的关键蛋白（Thomas et al.，Mol Immuno 1 1 996，33 : 1 389 )的抗体的给药。一种这样的抗体，Solirisg).或依库丽单抗 (eculizumab)，是抗C5的抗体。目前已批准使用所述抗体来治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿 症和非典型溶血性尿毒综合征。
[0007] 补体的作用是促进对入侵微生物的吞噬作用。因此，抑制炎症性疾病中的补体具 有提高感染风险的固有缺点。凝集素激活途径和替代激活途径的补体活化可通过微生物直 接活化，而经典激活途径通过与诸如微生物的抗原结合的IgG或IgM抗体活化。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种与人类补体因子C2结合的结合分子。在一个实施方式中，所述 结合分子包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区：
[0009] (a)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序 列：SEQIDN0:2和SEQIDN0:3 ;SEQIDN0:2和SEQIDN0:96;SEQIDN0:10和SEQID N0:11 ;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQIDN0:27;SEQIDN0:97和SEQ ID N0:27; SEQ ID N0:34和SEQ ID N0:35;或者，SEQ ID N0:98和SEQ ID N0:35;或者
[0010] (b)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序 列：SEQIDN0:99和SEQIDN0:103 ;SEQIDN0:99和SEQIDN0:104;SEQIDN0:99和SEQ IDN0:105 ;SEQIDN0:9^PSEQIDN0:106;SEQIDN0:10(^PSEQIDN0:103;SEQIDN0: 100和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106; SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:103;SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:101和SEQ IDN0:105;SEQIDN0:101和SEQIDN0:106;SEQIDN0:102和SEQIDN0:103 ;SEQID NO:102和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105;或SEQ ID NO:102和SEQ ID NO: 106;或者
[0011] (c)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区包括在(a)和/或(b)中 具体限定的氨基酸序列，但是其中，所述序列中的一个或两者包括1~5个氨基酸替换。
[0012] Olglesby等人(J Immunol 1988,2:926)描述了一种C2特异性抗体。使用去糖基化 且变性的C2免疫小鼠，来鉴定出抗体。使用天然糖基化的C2进行免疫不产生适当的C2特异 性抗体。US2001/0026928中也记载了一种C2特异性抗体。其中开发的抗体针对C2的C2a亚组 分。其中没有公开所述抗体所识别的表位的进一步细节。
[0013] 本发明的结合分子在结合在C2上的表位是不同的。在本发明之前，并不知晓在C2 上存在更多失活表位。
[0014] 本发明的结合分子抑制补体活化，并且可用于治疗多种疾病。本发明提供了一种 预防或治疗由补体活化介导的疾病，所述方法包括将本发明的结合分子对有需要的个体给 药。本发明进一步提供本发明的结合分子，用于预防或治疗由经由经典激活途径和/或凝集 素激活途径的补体活化介导的疾病或障碍。
[0015] 这样的疾病的实例是炎症性疾病、神经疾病或缺血-再灌注（I/R)损伤。在本发明 的上下文中，优选的神经疾病是神经-炎症性疾病。本发明的结合分子不完全抑制补体。它 至少留下补体系统的一些能力，以抵御微生物入侵。本发明的结合分子至少使替代的补体 活化途径保持基本完整。本发明的结合分子这一特征普遍改善了本发明的补体抑制因子， 尤其是基于补体抑制因子的抗体的治疗适用性。根据本发明的治疗的优选实例是肾同种异 体移植的抗体介导的排斥、特发性膜性肾病、免疫溶血性贫血、免疫复合体病、缺血-再灌注 病症(诸如缺血-再灌注损伤）。本发明的结合分子是用于多种治疗性干预的有吸引力的选 择，因为它们有效限制体内补体系统的活性的结果，同时降低由于对微生物感染和/或增殖 的敏感性而产生的副作用的风险。
[0016] 在一个实施方式中，本发明的结合分子与C2a结构域的表位结合。本发明的C2a结 合分子有效抑制C2。尽管事实是这样的结合分子不完全抑制C1的剪切，但令人惊奇地是，它 们仍然是有效的。本发明的C2a结合分子使C2b与C4b的结合保持完整。尽管如此，本发明的 C2a结合分子显著抑制了 C2的活性。
[0017] 在一个实施方式中，本发明的结合分子与C2b结构域的表位结合。尽管事实是这样 的结合分子不完全抑制C1的剪切，但它们仍然是有效的。本发明的C2b结合分子使C2a与C4b 的结合保持完整。尽管如此，本发明的C2b结合分子显著抑制了 C2的活性
[0018] 在优选的实施方式中，本发明的结合分子与部分存在于C2a结构域上且部分存在 于C2b结构域上的表位结合。本发明的结合分子与单独的C2a和C2b结构域可检测地结合。尽 管事实是本发明的这样的C2a/C2b结合分子不完全抑制C1剪切，但令人惊奇地是，它们仍然 是有效的。尽管如此，本发明的C2a/C2b结合分子显著抑制了 C2的活性。
[0019] 本发明的结合分子优选是Fab片段、单链Fv(SCFv)片段，或抗体或其抗原结合片 段。
[0020] 如本文所使用的，术语"包括重链可变区和轻链可变区的结合分子"涵盖但并不限 于，抗体及其抗原结合片段。优选片段是Fab片段、scFv片段、单价抗体(unibody )、双价抗 体、三价抗体等。
[0021] 本发明的结合分子与人类C2结合。在SEQ ID:N0 1中给出了优选的人类C2的氨基 酸序列。结合分子优选与人类C2特异性结合。这意味着，在天然人的样品中，优选在人类血 浆的样品中，结合分子结合超过95 %、优选超过99%的人类C2，并且与血浆中的其他的人类 蛋白相比，对C2具有20nM或更小的亲和性。
[0022] C2的活化涉及蛋白剪切成较小的片段。通常将这些片段称为C2a片段和C2b片段。 在本发明中使用的术语是，C2a片段是较大的约70kDa的片段。C2a片段与C4b形成复合体，从 而形成C3-转化酶C4bC2a。这一复合体典型地是表面结合的。较小的约30kDa的N-末端C2b释 放到流体相中。
[0023] 如在本文中使用的，术语"C2活性"或诸如此类的描述指C2蛋白在补体活化级联中 的作用。当C2蛋白通过被C1进行蛋白剪切而活化，从无活性的前体酶转变成有活性的丝氨 酸蛋白酶时，C2蛋白是"有活性的"。有活性的C2与C4b作为辅因子能活化C3,而与C4b和C3b 作为辅因子能活化C5。
[0024] 如在本文中使用的，术语"C2抑制"或诸如此类的描述也指其在补体活化级联中的 作用。当C2活化信号（即C1)存在于它的环境中时，C2蛋白不执行其在级联中的作用以活化 补体时，C2蛋白被"抑制"。
[0025] 术语"抗体"指单克隆抗体和多克隆抗体。可从动物的血液制备抗体。目前，更普遍 是通过细胞来制备抗体，其中由所述细胞中的核酸表达该抗体。有可使用的多种细胞和细 胞系。杂交瘤细胞系普遍用于生产鼠类的单克隆抗体。随着重组DNA方式的到来，现今普遍 使用细胞系。优选的细胞系是PER. C6细胞系、CH0细胞系和NS0细胞系。上述抗体可以是单价 抗体、四价抗体或其他的多价抗体。典型地，上述抗体是如上所示的包括C2抗原结合位点的 单价抗体。
[0026] 在一个实施方式中，本发明的抗体是多特异性抗体。原型多特异性抗体是双特异 性抗体。多特异性抗体包括两个或更多个不同的抗原结合位点。在这样的多特异性抗体中， 本发明的结合分子提供抗原结合位点中的至少一个。至少一个其他的抗原结合位点是直接 针对C2上的不同表位的抗原结合位点，或者优选地，直接针对不同分子上的表位的抗原结 合位点。其他抗原结合位点优选是抗体可变区。本发明的双特异性抗体包括本发明的结合 分子，和对C2上的另一表位或不同分子上的表位具有特异性的至少一个其他的抗体可变区 (重链和轻链）。
[0027] 抗原结合片段(Fab片段)是抗体的与抗原结合的片段。它由所重链和轻链的每一 个的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。这些结构域形成抗原结合位点。两个可变结 构域与其特异性抗原上的表位结合。可在实验室中生成Fab片段。目前，可提供的有多种酶， 从抗体上切出所述片段。在本发明中，术语Fab片段涉及单一的可变结构域Fab片段和含有 两个可变结构域的F(ab'）2片段。术语Fab片段用于表示抗体分裂时的片段，以及由细胞表 达，从一个或多个编码区直接产生类似的片段。
[0028] 如本文所使用的，术语"单链Fv"（也称为scFv)指，通过分离结合抗体的结合结构 域(重链和轻链），并且补充允许保持结合功能的连接部分的经改造的抗体。这基本上形成 极端缩小的抗体，仅具有结合抗原所需的超变结构域的一部分。在例如US专利号4，946，778 (Ladner et al)中记载了单链抗体的测定和构建。
[0029] 如本文所使用的，术语"KD" (M)用于指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0030] 分别具体为SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的重链可变区和轻链可变区，是抗体 5F2.4的重链可变区和轻链可变区。分别具体为SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11的重链可变 区和轻链可变区，是抗体13的重链可变区和轻链可变区。分别具体为SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的重链可变区和轻链可变区，是抗体32的重链可变区和轻链可变区。分别具体为 SEQ ID N0:26和SEQ ID N0:27的重链可变区和轻链可变区，是抗体35的重链可变区和轻链 可变区。分别具体为SEQ ID N0:34和SEQ ID N0:35的重链可变区和轻链可变区，是抗体60 的重链可变区和轻链可变区。具体为SEQ ID N0:96的轻链可变区，是抗体5F2.4的轻链可变 区的小鼠共有氨基酸序列。具体为SEQ ID N0:97的重链可变区，是抗体35的重链可变区的 小鼠共有氨基酸序列。具体为SEQ ID N0:98的重链可变区，是抗体60的重链可变区的小鼠 共有氨基酸序列。SEQ ID N0:99-102是5F2.4的人源化轻链可变区VL1-4的氨基酸序列。SEQ ID N0:103-106是5F2.4的人源化重链可变区VH1-4的氨基酸序列。SEQ ID N0:107-110是编 码含人源化￥1^1，1^4的人源化1〇轻链5?2.4的〇0嫩序列(^〇10勵 ：111-114是编码含人源化 VH1-VH4的人源化IgG4链5F2.4的cDNA序列。SEQ ID N0:115-118是编码含人源化VL1-VL4的 人源化κ轻链5F2.4的氨基酸序列。SEQ ID N0:119-122是编码含人源化VH1-VH4的人源化 IgG4链5F2.4的氨基酸序列。
[0031] 本发明的结合分子中的免疫球蛋白的轻链可变区或重链可变区可具有:有1~5个 氨基酸替换的SEQ ID 勵：2、3、10、11、18、19、26、27、34、35、96-106和115-122的氨基酸序 列。具有上述经替换的重链可变区、经替换的轻链可变区或两者的本发明的结合分子，在种 类上(但不必在数量上)具有相同的C2抗原结合特征。所述结合分子结合至与原始结合分子 相同的表位。1~5个氨基酸替换能生成结合分子的去免疫化形式。典型地，可通过对重链的 最多5个位置、轻链的最多5个位置或两者进行改变，来实现用于人类受试者的去免疫化。鼠 类可变区的去免疫化是已建立好的技术，总是产生在人体内诱导免疫应答的可能性减小的 结合分子。实现这一结果所需的氨基酸替换的数量典型地在每一条链中小于5。与未经改变 的序列相比，每一条链中1、2或3个氨基酸替换常常就足以获得本发明在人体内诱导免疫应 答的可能性减小的结合分子。
[0032]在优选的实施方式中，本发明的抗体是人类抗体或人源化抗体。如本文所使用的， 术语"人类抗体"用于包括，具有来源于人种系的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗 体。人类抗体可包括，不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外的随 机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入突变。
[0033] 如本文所使用的，术语"人源化抗体"指免疫球蛋白或经改造的抗体构建体的构架 区的至少一部分来源于人类免疫球蛋白序列。应当清楚的是，可使用使抗体或抗体构建体 人源化的任意方法，例如通过可变结构域的表面重塑(resurfacing) (Roguska et al.， Proc Natl Acad Sci U S A1994,91:969)或CDR嫁接或重构（Hurle et al.，Curr Opin Biotechnol 1994，5 :428)。在别的人类抗体构架背景中，人源化抗体优选包括抗体5F2.4、 13、32、35或60的⑶R区。因此，本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID N0:4-6的CDRl-3序列的人类重链可变区，和具有SEQIDN0:7-9的CDRl-3序列的人类轻链 可变区。当然嫁接的⑶R序列被适当放置，即SEQ ID NO:4的重链可变区的⑶R1区代替人类 抗体的重链可变区的⑶R1区，用于嫁接加工。SEQ ID N0:5的⑶R2区代替所述人类抗体的重 链可变区的CDR2区，等等。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID N0: 12-14的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID勵:15-17的0?1-3序列的人类轻链 可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID NO:20-22的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID NO:23-25的CDR1-3序列的人 类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具 有SEQ ID N0:28-30的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID N0:31-33的CDR1-3序 列的人类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体 包括具有SEQ ID NO:36-38的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID NO:39-41的 CDR1-3序列的人类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。
[0034] 在优选的实施方式中，在包括抗体5F2.4的CDR的人类抗体中，人源化轻链可变区 包括任选经1~5个氨基酸替换的SEQ ID N0:99、100、101或102的序列。在优选的实施方式 中，在包括抗体5F2.4的CDR的人类抗体中，人源化重链可变区包括任选经1~5个氨基酸替 换的SEQ ID从):10 3、104、105或106的序列。如果有的话，氨基酸替换不在0)1?区内。
[0035]在优选的实施方式中，包括抗体5F2.4的⑶R的人类抗体包括，任选经1~5个氨基 酸替换的SEQ ID勵：115、116、117或118的人源化1〇轻链。所述氨基酸替换，如果有的话，不 在CDR区内。在优选的实施方式中，包括抗体5F2.4的CDR的人类抗体包括，任选经1~5个氨 基酸替换的SEQ ID勵：119、120、121或122的人源化1864链。所述氨基酸替换，如果有的话， 不在⑶R区内。
[0036]如本文所使用的，术语"嵌合抗体"指经改造的抗体构建体，由可以是经去免疫化 的、人源化的或非人源化的一种物种的可变结构域(诸如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、羊驼 (lama)或骆驼的可变结构域），和另一物种的恒定结构域(诸如非人灵长类恒定结构域或人 类恒定结构域)构成(综述参见Hurle et al.，Curr Opin Biotechnoll994,5:428)。应当清 楚的是，可使用本领域已知的开发嵌合抗体或抗体构建体的任意方法。
[0037]如本文所使用的，术语"去免疫化的"或"去免疫化"指本发明的结合分子中T细胞 表位的鉴定及随后的去除。典型地，尽管不一定必要，但在本发明的抗体的可变区中进行。 经常，但不总是必要，在构架区中进行，因此在⑶R区外进行。典型地，通过替换编码T细胞表 位的一个或多个氨基酸，来实现T细胞表位的去除。从而使序列变成与T细胞表位不同的序 列。去免疫化的可变区典型地包含1~5个氨基酸替换。选择替换的氨基酸，以便可变区的三 级结构不发生显著改变。因此，替换的氨基酸典型地选自相同组的氨基酸（即中性氨基酸、 带正电荷氨基酸、带负电荷氨基酸、亲脂性氨基酸）。当在相同组中可用时，氨基酸被替换成 在结构上接近的人类抗体的可变区中相同或类似位置处的氨基酸。
[0038]本发明的结合分子优选是人源化或去免疫化的抗体。
[0039] 本发明的抗体优选是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体，诸如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗 体。
[0040]在优选的实施方式中，本发明的抗体的恒定区是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体，诸 如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体的恒定区。上述恒定区可包括改变，诸如氨基酸替换，以赋予 恒定区特定的特性。例如，IgG4铰链区的突变使得抗体更稳定，有助于半分子的交换。其他 改变影响抗体的半衰期，添加或去除糖基化位点，提高生产，改善在大规模发酵罐中产生的 抗体产物的均一性，等等。
[0041 ]与天然存在的抗体相比，抗体的轻链或重链的整个恒定部分可包括0~5个氨基酸 替换。在一些实施方式中，重链或轻链的恒定部分含有1~3个氨基酸替换。恒定区中的氨基 酸替换优选不使用相同组（即中性氨基酸、带正电荷氨基酸、带负电荷氨基酸、亲脂性氨基 酸)的氨基酸进行。
[0042]在优选的实施方式中，抗体的恒定区是人类抗体的恒定区。在优选的实施方式中， 本发明的抗体包括以下氨基酸序列：SEQIDN0:53和SEQIDN0:54;SEQIDN0:55和SEQ IDN0:56 ;SEQIDN0:57和SEQIDN0:58;SEQIDN0:57和SEQIDN0:59;SEQIDN0:60和 SEQ ID N0:61;或者，SEQ ID N0:62和SEQ ID N0:63;其中，当被替换时，所述序列之一或二 者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换。如本文的其他部分所示，氨基酸替换 优选在恒定区或可变区的构架区内。
[0043]在优选的实施方式中，上述抗体是人类抗体或人源化抗体。在优选的实施方式中， 本发明的抗体包括以下氨基酸序列：
[0044] -SEQ ID N0:99,和氨基酸序列SEQ ID N0:103、104、105或106中的一条，其中所述 序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换；
[0045] -SEQIDN0:100，和氨基酸序列SEQIDN0:103、104、105或106中的一条，其中所 述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换；
[0046] -SEQIDN0:101，和氨基酸序列SEQIDN0:103、104、105或106中的一条，其中当 被替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换;或者
[0047] SEQIDN0:102，和氨基酸序列SEQIDN0:103、104、105或106中的一条，其中当被 替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换。所述氨基 酸替换，如果有的话，不在CDR区内。
[0048] 在优选的实施方式中，本发明的抗体包括以下氨基酸序列：
[0049] -SEQIDN0:115，和氨基酸序列SEQIDN0:119、120、121或122中的一条，其中当 被替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换；
[0050] -SEQIDN0:116，和氨基酸序列SEQIDN0:119、120、121或122中的一条，其中当 被替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换；
[0051 ] SEQ ID N0:117,，和氨基酸序列SEQ ID N0:119、120、121 或 122中的一条，其中当 被替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换;或者
[0052] SEQIDN0:118，和氨基酸序列SEQIDN0:119、120、121或122中的一条，其中当被 替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换。如果有的 话，氨基酸替换不在CDR区内。如本文的其他部分所示，氨基酸替换优选在恒定区或可变区 的构架区内。
[0053] 本发明进一步提供了一种包括以下氨基酸序列的抗体：（b)SEQ ID N0:115和SEQ IDN0:119;SEQIDN0:115和SEQIDN0:120;SEQIDN0:115和SEQIDN0:121 ;SEQID NO:115和SEQ ID NO:122;
[0054] SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:119;SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:120;SEQ ID NO: 116和SEQ ID NO:121;SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:122;
[0055] SEQIDN0:117和SEQIDN0:119;SEQIDN0:117和SEQIDN0:120;SEQIDN0: 117和SEQ ID NO:121;SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:122;
[0056] SEQIDN0:118和SEQIDN0:119;SEQIDN0:118和SEQIDN0:120;SEQIDN0: 118和SEQ ID N0:121;或者SEQ ID N0:118和SEQ ID N0:122;或者在（b)中指定的氨基酸序 列，但是其中所述序列之一或二者包括1~5个氨基酸替换。所述氨基酸替换（如果有的话） 不在⑶R内。
[0057]本发明的抗体优选是：鼠类IgGl或IgG2a;人类IgGl，在恒定区中发生突变，以降低 或防止补体活化或Fc受体的相互作用;或者人类IgG4;或者人类IgG4，发生突变以防止与其 他IgG4分子的半分子交换，和/或在恒定区中发生突变以降低或防止Fc受体的相互作用。
[0058] 在一些实施方式中，本发明的抗体包括两个不同的重链恒定区和或不同的轻链恒 定区。典型地，尽管不是必要的，不同的恒定区彼此在不超过5个氨基酸位置，优选在不超过 1~3个氨基酸位置上是不同。这是在本领域中使用的特性，以产生例如双特异性抗体，和/ 或为抗体提供进一步特性。
[0059] 本发明的抗体的恒定区优选是人类恒定区，优选是一种天然存在的人类抗体的恒 定区。
[0060] 本发明进一步提供了编码本发明所述的结合分子或抗体的核酸分子。本发明进一 步提供了编码本发明的CDR的核酸。优选编码抗体5F2.4、抗体13、抗体32、抗体35或抗体60 的可变轻链或可变重链的所有⑶R。所述核酸优选包括以下核酸序列：SEQ ID N0:42;SEQ ID N0:43；SEQ ID N0:44；SEQ ID N0:45；SEQ ID N0:46；SEQ ID N0:47；SEQ ID N0:48；SEQ ID N0:49；SEQ ID N0:50；SEQ ID N0:51；SEQ ID N0:52；SEQ ID N0:107；SEQ ID N0:108； SEQ ID N0:109;SEQ ID N0:110;SEQ ID N0:111;SEQ ID N0:112;SEQ ID N0:113;或者SEQ ID NO: 114。上述核酸分子可用于产生本发明的结合分子。提供有上述核酸的细胞系可在实 验室或生产工厂中生产结合分子/抗体。或者，将上述核酸转染到有需要的动物体内的细胞 中，并且由被转化的细胞体内产生结合分子/抗体。典型地，向本发明的核酸分子提供调节 序列，以在细胞中表达所述结合分子。但是，现今，同源重组技术的效率已经提高了很多。这 些技术包括例如使用诱导核酸酶(诸如TALEN)的位点特异性双链断裂的，双链断裂辅助的 同源重组。这样的或类似的同源重组系统可将核酸分子插入到提供一条或多条所需的顺式 调节序列的区域内。
[0061] 本发明进一步提供了包括根据本发明的核酸分子的基因递送剂或载体。所述基因 递送剂或载体可以是质粒，或其他细菌复制的核酸。这样的基因递送剂或载体可被容易地 转染至例如生产细胞中。上述基因递送剂或载体也可以是病毒载体。优选的病毒载体是腺 病毒载体、慢病毒载体、腺相关的病毒载体和逆转录病毒载体。
[0062] 本发明进一步提供了一种分离或重组的细胞，或体外细胞培养物，该细胞包括本 发明的核酸分子或载体。本发明进一步提供了一种分离或重组的细胞，或体外细胞培养物， 该细胞包括本发明的结合分子，并且优选包括本发明的抗体。优选地，所述细胞产生所述结 合分子或抗体。在优选的实施方式中，所述细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、 NS0细胞或PER-C6?细胞。在特别优选的实施方式中，上述细胞是CH0细胞。本发明进一步提 供了一种包括本发明细胞的细胞培养物。多家机构和公司已经开发出用于大规模生产抗 体，例如用于临床应用的细胞系。这样的细胞系的非限制性实例是CH0细胞、NS0细胞或 PER. C6?细胞。这些细胞还用于其他目的，诸如生产蛋白。本文中，将针对蛋白和抗体的工业 规模生产所开发的细胞系进一步称为工业细胞系。本发明提供了一种包括本发明所述的核 酸分子、结合分子和/或抗体的工业细胞系。本发明还提供了一种针对包括本发明的结合分 子或抗体的蛋白和/或抗体的大规模生产所开发的细胞系。本发明还提供了针对本发明的 结合分子和/或抗体的大规模生产所开发的细胞系的应用。
[0063] 本发明进一步提供了一种产生本发明的结合分子或抗体的方法，该方法包括培养 本发明的细胞，并且从所述培养物中收获所述抗体。优选地，将所述细胞培养在无血清的培 养基中。优选地，所述细胞适于悬浮生长。进一步提供了一种通过用于生产本发明的抗体的 方法获得的抗体。优选从培养物的培养基中纯化抗体。优选对抗体进行亲和纯化。
[0064]本发明的细胞例如是杂交瘤细胞系、CH0细胞、NS0细胞或另一已知适用于临床目 的的抗体生产的细胞类型。在特别优选的实施方式中，所述细胞是人类细胞。优选地，通过 腺病毒E1区或其功能等价物，转化细胞。这样的细胞系的优选实例是PER.C6?细胞系或其等 价物。在特别优选的实施方式中，上述细胞是CH0细胞或其变体。优选地，该变体使用谷氨酰 氨合成酶(GS)载体细胞来表达抗体。
[0065] 因此，本发明进一步提供了一种产生结合分子的方法，其特征在于，产生本发明的 结合分子或本发明的抗体。优选地，上述方法进一步包括收集所述结合分子和/或抗体。
[0066] 本发明进一步提供了本发明的结合分子或抗体，用于治疗患补体活性过量或过度 活跃的个体。该治疗能减轻所述个体的与补体活性过量或过度活跃相关的至少一种症状。
[0067] 当在本文中使用时，术语"个体"指动物，优选指哺乳动物。在优选的实施方式中， 所述个体是灵长目动物，所述个体更优选是人。
[0068] 本发明进一步提供了本发明的结合分子或抗体，用于治疗患炎症性疾病、神经疾 病或缺血-再灌注(I/R)损伤，或有患这些疾病的风险的个体。这样的治疗能减轻与炎症、神 经-炎症性疾病或缺血-再灌注损伤相关的至少一种症状，诸如肾功能障碍或心肌功能障 碍、溶血危象和肌无力。
[0069] 本发明进一步提供了用于本发明的应用的结合分子或抗体，其中，所述个体患抗 体介导的炎症或缺血-再灌注损伤，诸如急性心肌梗塞、中风、败血症、免疫复合体病如类风 湿性关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、多发性创伤、多灶性运动神经病、肾同种异体移植的 抗体介导的排斥、（自体)免疫溶血性贫血、心肺转流术和其他脉管手术、特发性膜性肾病、 肺出血性肾炎综合征，等等。
[0070] 本发明还提供了一种包括本发明的结合分子或抗体，以及药学上可接受的载剂的 药物组合物。
[0071] 人类补体的第二组分(C2)是参与补体活化的经典激活途径和凝集素激活途径的 90~1 OOkDa的糖蛋白。可通过经典激活途径的Cls或凝集素激活途径的MASP2，使C2活化。C2 与表面结合的C4b(在Mg2+的存在下)结合，以形成C4bC2复合体，然后C4bC2复合体被活化的 Cls或MASP2剪切成两个片段:较大的70kDa片段C2a，该C2a与C4b保持连接以形成C3-转化酶 C4bC2a;较小的30kDa N-末端片段C2b，该C2b被释放到流体相中。C2a-旦被活化并且与C4b 结合，则构成能分别剪切C3和C5的C3/C5转化酶的催化亚基。
[0072] 和很多其他的血衆蛋白一样，C2具有模块结构(modular structure)。从它的N末 端开始，C2由三个补体控制蛋白（CCP1-3)模块(也被称为为短共有重复序列（SCR)或苏氏-结构域重复序列（sushi-domain repeats))，含有金属离子依赖性粘附位点的A型血管假性 血友病因子（vWFA)结构域，和丝氨酸蛋白酶（SP)结构域构成（Arlaud et al.，Adv Immunoll998，69:249)。电子显微镜研究显示，C2由三个结构域组成。三个CCP模块(CCP1-3) 一起形成N-末端结构域，这对应于C2b。vWFA结构域构成第二结构域，并且SP结构域组成第 三结构域。第二结构域和第三结构域一起构成所述分子的较大的C2a部分。
[0073] CCP模块是在许多蛋白中都出现的常见的结构基元。这些球状单元由大约60个氨 基酸残基组成，并且折叠成围绕四个不变的二硫键结合的半胱氨酸残基形成的、紧凑的6~ 8股的β-片状结构(Norman et al.，J Mol Biol 1991，219:717)。邻近的CCP模块通过保守 性差的接头共价连接。
[0074] 通过两个低亲和性位点，一个在C2b(Xu&Volanakis，J Immunol 1997，158:5958)并 且另一个在C2a的vWFA结构域上（Horiuchi et al ·，J Immunoll991,47: 584)，介导C2与表 面结合的C4b的初始结合。尽管将C2b和C2a的晶体结构确定至Lgl的分辨率(Milder et al.,Structure2006,14:1587；Krishnan et al.,J Mol Biol 2007,367:224；Krishnan et al.，Acta Cristallogr D Biol 0^8七&11〇8『2009,065:266)，但构成〇2上的〇4和〇3接触位 点的氨基酸的精确拓扑学和结构还是未知的。因此，仍然需要确立C2中参与与C4相互作用 的氨基酸残基（Krishnan et al.，Acta Cristallogr D Biol Crystallogr2009，D65: 266)。
[0075] 针对位于C2b上的表位的单克隆抗体3A3.3，抑制C2与C4b的结合（Oglesby et al.，J Immunol 1988，2:926)，这表明在C2b上存在C4b-结合位点。US2011/0165169A1 中公 开了抑制C2活性的针对C2的C2a部分的mAb。公共领域中还没有报道，这些mAb的表位的氨基 酸序列。因此，仍然需要鉴定出人类C2中参与C2与C4b结合的氨基酸序列。
[0076] 本发明提供了能通过阻断C2的活性，经由经典激活途径和/或凝集素激活途径来 抑制补体活化的结合分子。所述结合分子优选是与C2上的特定表位特异性结合的，人类或 人源化的mAb或其结合片段。在优选的实施方式中，所述表位是功能性表位。本发明的结合 分子防止生成C2下游的C3a、C3b和其他补体活化产物。本发明的结合分子抑制性抗体诱导 的补体膜攻击复合体的形成，从而保护被这些抗体敏化的细胞不会受到补体介导的损害 (诸如裂解）。因此，本发明的结合分子适用于治疗个体，该个体中，需要抵制给药的抗体或 自体抗体的补体活化介导的效果。在本上下文中，自体抗体是由个体自身生成和产生的抗 体。
[0077] 本发明的结合分子抑制至少50%的通过（自体)抗体所引起的经典激活途径的活 化。优选地，经典激活途径的活化被抑制70%、更优选90%、更优选至少95%。对于经典激活 途径的活性的计算，参考在Palarasay et al · (Clin Exp Immunol 2011，164:388)中记载 的补体活性测定，或参考确定CH50滴度的测量。将不存在本发明的结合分子的情况下的，经 典激活途径的活性设定为100%。
[0078] 本发明的结合分子通过CRP或识别与损害相关的分子模式的其他分子抑制至少 50%的补体的活化。优选地，凝集素激活途径的活化被抑制70%、更优选90%、更优选至少 95%。对于凝集素激活途径的活性的计算，参考Palarasay et al. (Clin Exp Immunol 2011，164: 388)。将不存在本发明的结合分子的情况下的，凝集素激活途径的活性设定为 100%〇
[0079] 本发明的结合分子不显著抑制补体活化的替代激活途径的活化。对于替代激活途 径的活性的计算，参考如在Palarasay et al · (Clin Exp Immunol 2011，164:388)中记载 的活性测定，或参考AP50活性的确定。将不存在本发明的结合分子的情况下的，替代激活途 径的活性设定为100%。如果在存在饱和量的结合分子的情况下，替代激活途径的活性降低 不超过20%，则C2结合分子不显著抑制或基本不抑制该途径。
[0080] 因为本发明示出了本发明的结合分子的有利性质，因此本领域技术人员能够开发 出与同一表位结合的其他结合分子。因此，本发明还提供了与C2结合的且阻断抗体结合的 结合分子，所述结合分子包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，分别包括 以下氨基酸序列：SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3;SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:96;SEQ ID N0: 10和SEQIDN0:11;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQIDN0:27 ;SEQID N0:97和SEQIDN0:27;SEQIDN0:34和SEQIDN0:35 ;或者，SEQIDN0:98和SEQIDN0: 35。本发明进一步提供了本发明的结合分子的应用，优选用于在许多结合分子中鉴定出本 发明的结合分子的抗体的应用，该抗体包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变 区，分别包括以下氨基酸序列：SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3;SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:96; SEQIDN0:10和SEQIDN0:11;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQID N0:27 ;SEQIDN0:97和SEQIDN0:27;SEQIDN0:34和SEQIDN0:35;或者，SEQIDN0:98 和SEQ ID N0:35。被鉴定的结合分子的特征优选是，序列是由结合分子和/或编码所述结合 分子的核酸序列决定。这样能进行结合分子的生产，并且进一步使用所述结合分子。
[0081] 本发明还提供了一种鉴定根据本发明的结合分子的方法，该方法包括以下步骤： 在本发明的已知结合分子存在和不存在的情况下，测试包括重链和轻链可变区的测试结合 分子与C2的结合能力。当不存在本发明的已知结合分子的情况下，测试结合分子与C2结合， 而当C2与本发明的已知结合分子预孵育时，结合至少50%或更少的C2,则鉴定该测试结合 分子为本发明的结合分子。
[0082]本发明进一步提供了与C2结合，且识别C2a上的表位和C2b上的表位的结合分子。 所述抗体优选包括相同的抗原结合可变区。本发明进一步提供了与C2结合，且单独与C2a和 C2b结合的结合分子。为了这一实施方式的目的，通过凝胶电泳查看经Cls消化的C2的大小 成分，其中足以使两个片段彼此分离，以查看泳道中分别代表C2a和C2b片段的条带。
[0083]本发明的结合分子、优选二价单克隆抗体与C2结合的解离常数(KD)小于10e_7M， 优选小于l〇e_8M，优选小于10e_9M，更优选小于10e-10M，并且更优选小于10e-llM。
[0084] 本发明的结合分子可用于抑制经典激活途径和/或凝集素激活途径的活化。这反 过来抑制个体血浆或体内或其他补体功能性系统中，具有生物活性的补体来源的肽(诸如 C4a和0仙、03&、0313、05&等等）的生成。上述结合分子至少部分防止在细胞和组织上的这些 补体来源的肽的损害影响。本发明的结合分子可用于制备药剂，该药剂用于通过抑制体内 补体活化，来减轻人类疾病的临床征象和症状。mAb分子可单独使用或与另一药物组合，用 于治疗补体介导的疾病或症状。
[0085] 本发明的方法或结合分子可治疗或预防的疾病优选是自体免疫疾病，诸如实验性 变态神经炎、II型胶原诱导型关节炎、重症肌无力、溶血性贫血、血管球性肾炎、特发性膜性 肾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、免疫复合体诱导的脉管炎、成人呼吸窘迫综合征、 中风、异种器官移植、多发性硬化症、烧伤、体外透析和血氧合、炎症性障碍(包括败血症和 感染性休克）、由体内给药细胞因子或mAb而引起的毒性、同种异体移植(诸如肾同种异体移 植)的抗体介导的排斥、多发性创伤、缺血-再灌注损伤、心肌梗塞。
[0086] 将本发明的结合分子对有需要的个体给药，可治疗患有涉及补体介导的损害的疾 病或具有发展出这样的补体介导的损害的风险的个体。因此，在该个体中降低生物活性的 补体来源的肽，并且减轻或防止补体对细胞和组织的溶胞作用和其他有害影响。"有效量" 指本发明的结合分子能够抑制个体内的补体活化的量。
[0087] 治疗（treatment)(预防（prophylactic)或治疗（therapeutic))通常由肠道外给 药，优选静脉或皮下给药本发明的结合分子与药学载剂组成。本发明的结合分子的剂量和 给药方案应依赖于所针对的补体活化的抑制程度。典型地，本发明的为抗体的结合分子的 量应在每千克体重2mg~20mg的范围内。对于肠道外给药，应将上述结合分子与药学上可接 受的肠道外递送剂组合，配制成可注射的形式。这样的递送剂是本领域公知的，并且实例包 括盐水、葡萄糖溶液、林格氏溶液和含少量人血清白蛋白的溶液。
[0088] 典型地，本发明的结合分子应被配制为约20mg/ml~约100mg/ml的浓度。在本发明 的一个实施方式中，所述结合分子通过静脉注射给药。
[0089] 应理解的是，在本发明的范围内，包括给药如在本发明所述的mAb或其片段的几乎 所有方法，以在循环中或局部产生足够高的水平。
[0090] 根据常规技术，诸如在（Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co·,Easton,PA, 1995)中公开的技术，可将 本发明的药物组合物与药学上可接受的载剂或稀释剂，以及任何其他已知的佐剂和赋形剂 配制在一起。
[0091] 术语"药学上可接受的载剂"涉及自身没有毒性的载剂或赋形剂。这样的赋形剂的 实例是，但并不限于，盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液(Ha n k ' s s ο 1 u t i ο η)。也 可使用无水赋形剂，诸如固定油和油酸乙酯。
[0092]上述药物组合物优选肠道外给药，优选通过静脉注射或皮下注射或输注的方式给 药。
[0093]如本文所使用的，词语"肠道外给药"或"肠道外给药的"指除了肠内和局部给药之 外的给药模式，通常指注射给药，包括但并不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内 (intrathecal)、囊内（intracapsular)、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮 下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内的注射和输注。
[0094] 药物组合物典型地必须是无菌的，并且在制造和储存条件下是稳定的。上述组合 物可被配制成溶液、微乳液、脂质体，或其他适于高药物浓度的有序结构。可在本发明的药 物组合物中使用的适当的水性载剂和无水载剂的实例包括，水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙 二醇、聚乙二醇等），及其适当的混合物，植物油，诸如橄榄油，以及可注射的有机酯，诸如油 酸乙酯。可例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂）、通过在分散剂的情况中维持所需的粒径、 以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。
[0095] 药物组合物还可包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过消毒程序， 以及包含有各种抗菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可确 保防止微生物的存在。在该组合物中，也可期望包括等渗性试剂(诸如糖），多元醇(诸如甘 露醇、山梨醇、甘油或氯化钠）。也可包括药学上可接受的抗氧化剂，例如：（1)水溶性抗氧化 剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；（2)油溶性抗氧化 剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁基羟基茴香醚(BHA)、丁羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸 丙酯、生育酚等；以及（3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石 酸、磷酸等。
[0096] 可通过将所需量的mAb并入到具有例如如上枚举的成分的一种或组合的合适的溶 剂中，如果需要，再进行消毒微过滤，来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物并入 到，含基础分散介质和所需其他成分(例如来自上述成分)的无菌递送剂中，来制备分散剂。 在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥 (冻干法），这些方法产生活性成分加上来自预先进行了无菌过滤的溶液的任何额外期望成 分的粉末。
[0097] 可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，从而延长可注 射性抗-C2的mAb或其片段的吸收。
[0098] 可使用能保护化合物不会快速释放的载剂，诸如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂 和微囊化的递送系统，来制备mAb或其片段。可使用可生物降解的、生物相容性的聚合物，诸 如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的方法对 于本领域技术人员来说通常是已知的。参见例如持久的和控释药物递送系统（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，J.R.Robinson编辑，马塞尔·德克公 司（Marcel Dekker, Inc.)，纽约（New York)，1978。
[0099] 上述药物组合物可使用本领域已知的医疗装置进行给药。
[0100] 对给药方案进行调节，以提供最优化的期望应答(例如治疗反应）。例如，可给药单 一的大丸药，可在一段时间中给药几个分开的剂量，或根据治疗状态的紧迫性所示，可成比 例地降低或增加剂量。
[0101] 在本发明的药物组合物中的mAb或其片段的实际剂量水平可能是有变化的，以获 得能对特定患者有效实现期望的治疗反应，而不会为该患者带来毒性的一定量的活性成 分。
[0102] 在一个实施方式中，本发明的结合分子，尤其是抗体，可以10~500mg/m2,诸如200 ~400mg/m 2的周剂量，通过输注进行给药。这样的给药可重复如1~8次，诸如3~5次。可在2 ~24小时，诸如2~12小时的时间段中，通过持续输注进行给药。
[0103] 在又一实施方式中，mAb或其片段或任何其他在本发明中公开的结合分子，可通过 维持治疗进行给药，例如在6个月或更长的时间段中一周给药一次。
[0104] 现在，将参考下面给出了特别有利的实施方式的实施例，来对本发明进行说明。但 是，应注意，这些实施方式仅是说明，并不构成对本发明的任何限制。
【附图说明】
[0105] 图1:野生型重组人类C2(泳道1)和去糖基化的重组人类C2(泳道2)、Cls剪切的C2 (泳道3)和去糖基化的Cls剪切的C2(泳道4)的非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳（SDS-PAGE)。以Cls与C2的比率为1:25,进行Cls剪切。使用考马斯亮蓝，使未经处理和经 处理的C2可视化。箭头指示了糖基化C2( ? lOOkDa)、糖基化C2a( ? 70kDa)和糖基化C2b( ? 30kDa)。还示出了MW标记物的位置。*表示PNGase酶。
[0106] 图2:筛选抗-C2的mAb的抑制活性的ELISA的原理。注意，抑制mAb对C4结合没有影 响，但是会减少C3与固相上的凝集的IgG的结合。
[0107] 图3:抗-C2的杂交瘤上清液的抑制活性的筛选结果的实例。阳性对照是没有杂交 瘤上清液的稀释的血清。阴性对照是具有EDTA，但没有杂交瘤上清液的稀释的血清。X轴上 的数字指杂交瘤的编号。箭头指示在抗-C2的ELISA中为阴性，且作为对照测试的杂交瘤上 清液。
[0108] 图4:小鼠抗人类补体C2的抗体，与低包被(25ng/孔，灰色符号）或高包被(200ng/ 孔，黑色符号）的重组人类补体C2的结合。结果(在450nm处的吸光度)是平均值土SD，n = 2。
[0109] 图5:小鼠抗-C2的mAb与野生型重组人类C2(A)或Cls剪切的重组人类C2(B)的结 合。将蛋白混合物包被在ELISA板上，并且与多种浓度的抗-C2的mAb孵育。结果(在450nm处 的吸光度)是平均值土 SD，η = 2。
[0110]图6:纯化的小鼠抗-C2的mAb，对C3固定至固相凝集的IgG的抑制。一个体积的新鲜 人类血清与一个体积的具有所示浓度的mAb孵育，稀释并且进行测试。虚线表示在不存在 mAb(上线)和存在EDTA(下线）的情况下的固定水平。
[0111] 图7 :抗-C2的mAb对C3被人类血清中的凝集IgG活化的影响。一个体积的血清与一 个体积的mAb (0.48mg/ml)混合，然后与lmg/ml的凝集的I gG孵育。使用如在方法中所述，使 用ELISA测量活化的C3。将结果表示为任意单位(AU)/ml。
[0112] 图8:在同种异体移植排斥的人类离体模型中，抗-C2的mAb对抗-HLA的抗体的补体 依赖性细胞毒性的影响。具有抗-HLA的抗体的ΙμL血清，与ΙμL PBMC悬浮液（2-5xl06个细 胞/ml)在室温孵育1小时。同时，5μ1新鲜的正常血清，与15μ1 VB和5μ1含抗-C2的mAb的VB在 室温孵育20分钟。各10μ1样品与PBMC混合物在室温孵育2小时。使用Fluoroquench测量细胞 毒性，并且通过显微镜测定细胞毒性。细胞毒性分数"0"指细胞没有裂解，而当>80 %的细胞 被裂解时，则给出分数8。使用没有抗-C2的mAb的新鲜血清作为阳性对照，EDTA作为阴性对 照。在该图中没有示出MAb 5F2.4，但MAb 5F2.4在该测定中也具有抑制效果。MAB抗-C2-79 在该测定中也降低细胞毒性，但在其他测定中没有抑制效果。
[0113] 图9:使用野生型重组人类C2和Cls剪切的重组人类C2进行蛋白印记，定位C2a或 C2b上由抗-C2的mAb识别的表位。箭头指示C2( ? 100kDa)、C2a( ? 70kDa)和C2b( ? 30kDa)。 使用 lOOng/ml (抗-C2-5F2 · 4和-35)或 200ng/mL(抗-C2-13、-32和-60)抗-C2 的mAb，进行检 测。
[0114] 图10:如在ELISA中测定的，抗-C2的mAb与经大小排阻层析纯化的重组人类C2a的 结合(A)，抗-C2的mAb5F2.4与去糖基化的（非变性/非还原)重组C2的结合(B)，与变性(非还 原）或还原(变性）的重组人类C2的结合(C)。结果(在450nm处的吸光度)是平均值±30，11 = 2〇
[0115] 图11:抑制性抗-C2的mAb防止C2在补体活化过程中的剪切。具有10μ1抗-C2的mAb (0·48mg/ml)的10μ1血清，与10μ1凝集IgG(lmg/ml)孵育，并且在7· 5%SDS-PAGE上进行分 离。对样品进行印记，并且与生物素化的抗-C2-5F2.4(与天然C2和C2b结合)孵育，以测定C2 的剪切。指示分子量标记物(M)的位置。如通过抗-C25F2.4mAb进行可视化，箭头指示C2和 C2b的位置。C指示与凝集IgG孵育的血清，其中没有添加抗42。以6指示在多克隆人类IgG (0.48mg/ml)的存在下，与凝集IgG孵育的血清。
[0116] 图12:抑制性抗-C2的mAb不防止流体相野生型重组人类C2被Cls剪切。在抗-C2的 mAb的存在下，C2与Cls孵育。使用非还原SDS-PAGE分析混合物，并且使用考马斯亮蓝进行可 视化。箭头指示小鼠 IgG( ? 150kDa)、C2( ? 100kDa)、C2a( ? 70kDa)和C2b( ? 30kDa)。
[0117] 图13:嵌合小鼠-人类补体C2抗体，与低包被（25ng/孔，灰色符号）或高包被 (200ng/孔，黑色符号）的重组人类补体C2的结合。结果（在450nm处的吸光度）是平均值土 SD，n = 2〇
[0118] 图14:小鼠-人类IgG4嵌合抗-C2的mAb，对C3被人类血清中凝集的IgG活化的影响。 实验设计与图6中的相同，区别在于将抗-C2的mAb的重组小鼠-人类IgG4类型添加到人类血 清中，而不是mAb的鼠类类型。抗-C2-63是针对人类C2的鼠类非抑制性mAb，作为测试对照。 对照mAb是针对人类因子XI的mAb。对照IgG是作为对照测试的人类IgG。
[0119] 图15:在同种异体移植排斥的人类离体模型中，小鼠-人类IgG4嵌合抗-C2的mAb对 抗-HLA的抗体的补体依赖性细胞毒性的影响。实验设计与图8中的相同，但区别是将抗-C2 的mAb的重组小鼠-人类IgG4类型添加到人类血清中，而不是mAb的鼠类类型。使用程序 "Leica Q WIN"分析细胞毒性，并且表示为％裂解。抗-C2-63是针对人类C2的鼠类非抑制性 mAb，作为对照测试。对照mAb是针对人类因子XI的mAb。对照IgG是作为对照测试的人类IgG。
[0120] 图16:序列列表。
[0121] 图17:使用ELISA测定人源化抗-人类补体C2的抗体与重组人类补体C2的结合。结 果(在450nm处的吸光度)是平均值土 SD，η = 2。
[0122] 图18:在同种异体移植排斥的人类离体模型中，人源化抗-C2的mAb对抗-人类HLA-A、B、C(克隆W6/32)抗体的补体依赖性细胞毒性的影响。ΙμL W6/32抗体溶液(31.25μg/ml) 与ΙμL PBMC悬浮液(5xl06个细胞/ml)，在37°C孵育30分钟。同时，10μ1新鲜的正常血清与10 μL含抗-C2的mAb的VB，在室温孵育30分钟。各5μ1样品与PBMC混合物在37°C孵育1小时。向每 一孔中都添加5μ1 Fluoroquench，并且样品在黑暗中孵育30分钟。之后，通过自动显微镜 (Leica Micro Systems)，测量细胞毒性。通过Leica Q WIN软件，计算裂解百分比。没有抗-C2的mAb的新鲜血清用作阳性对照，EDTA和EGTA用作阴 性对照。其他对照是不相关的人类 IgG4的mAb和C2-缺乏血清。结果是平均值土 SEM，η = 2。
[0123] 图19:在同种异体移植排斥的人类离体模型中，人源化抗-C2的mAb对血清抗-HLA 的抗体的补体依赖性细胞毒性的影响。ΙμL血清抗-HLA的抗体与ΙμL TOMC悬浮液(5xl06个 细胞/ml)，在37°C孵育30分钟。同时，10μ1新鲜的正常血清与10μ1含抗-C2的mAb的VB，在室 温孵育30分钟。各5μ1样品与PBMC混合物在37°C孵育1小时。向每一孔中都添加5μ1 Fluoroquench，并且样品在黑暗中孵育30分钟。之后，通过自动显微镜（Leica Micro Systems)，测量细胞毒性。通过Leica Q WIN软件，计算裂解百分比。没有抗-C2的mAb的新鲜 血清用作阳性对照，EDTA用作阴性对照。结果是平均值土SD，n = 2。
【具体实施方式】
[0124] 实施例
[0125] 使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定，本文中所描述的本发明的 特定实施方式的很多等价物。这样的等价物应被涵盖在所附权利要求书中。在从属权利要 求中公开的实施方式的任意组合都被认为在本发明的范围内。
[0126] 本文所参考的所有专利、专利申请和科学出版物（其讨论材料和方法的各方面用 以认识本发明），通过引用而整体并入本文中。
[0127] 材料
[0128] 通过在63°C，将在PBS中的80mg/ml纯化的人类IgG(Gammaquin，Sanquin，阿姆斯特 丹，荷兰）加热20分钟，制备凝集IgG(agglgG)。然后将制备产物稀释至10mg/ml，并且储存 在-80°C，直至使用。
[0129]通过静脉穿刺，从人类志愿者获得新鲜的人类血清，等分后储存在-80°C。通过将 正常新鲜的血清在37°C孵育一周，制备正常老化的血清。从Sigma-Aldrich购买缺乏C2的血 清。
[0130] 分别从Mybiosource·com和Thermo Scientific，购买亲和纯化的鸡多克隆抗-C3 的抗体和山羊抗-C4的抗体。按照制造商的方案，使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Scientific)对抗体进行生物素化。简单来讲，将20M倍数过量的生物素添加到抗 体中，并且在室温孵育30分钟。接下来，抗体针roS透析过夜，并且储存在4°C，直至进一步的 使用。
[0131 ] 通过Ficol 1-Paque(浮力密度1 ·077g/mL;GE Healthcare)离心，从肝素血中分离 出外周血单个核细胞(PBMC)。在室温，使用磷酸盐缓冲盐水UBS)冲洗分离的细胞，并且保 持在4°C的RPMI培养基中直至进一步使用。
[0132] 实施例1:小鼠抗-人类补体C2的抗体的生成
[0133] (a)重组人类补体C2的生成
[0134] 通过U-Protein Express(乌特勒支，荷兰），生成带N末端his标签的重组人类补体 蛋白C2。简单来讲，克隆编码人类补体蛋白C2(GenBank序列:NM_000063;参见SEQ ID N0.1) 的cDNA，随后在HEK293细胞中进行表达。通过亲和色谱法纯化C2,并且使用预制凝胶 NuPage? Novex?系统（Invi trogen)的SDS-PAGE进行分析。使用考马斯亮蓝，对蛋白进行 染色。
[0135] 如在图1 (泳道1)中所示，C2制备物示出>95%的纯度，即观察到分子量》lOOkDa的 一条带，与糖基化的人类C2的预期分子量一致。
[0136] (b)重组人类补体C2的生物化学特征
[0137] 通过将C2(100yL 400yg/mL的溶液)与血浆来源的活化的Cls(100yL 16yg/mL的溶 液;Calbiochem)在PBS中（Cls与C2的比率为1:25)，在37°C孵育1小时，来生成重组的C2a和 C 2 b。为了确定在C 2上是否存在N连接的多糖，按照制造商的说明书（N e w E n g 1 a n d Biolabs)，在反应缓冲液中，在37°C，使用肽-N-糖苷酶F(PNGase F;New England Biolabs)，对1.8yg未经剪切的重组C2或经Cls剪切的重组C2处理1小时。使用预制凝胶 NuPagc? Novex?系统（Invitrogen)的SDS-PAGE对蛋白进行分析，使用考马斯亮蓝进行染 色。
[0138] 如在图1(泳道1对泳道3)中所示，Cls将重组C2剪切成亚组分C2a( ? 70kDa)和C2b (? 30kDa)，分别与C2a和C2b的预期分子量一致。野生型重组C2,以及经Cls剪切的重组C2a 和C2b，都携带N连接的多糖，这从与PNGase F孵育之后的明显的较小分子量可以明显看出 (参见图1中的泳道1对泳道2,和泳道3对泳道4)。这些结果符合以下观点：人类C2a和C2b分 别具有6和2个推定的N连接糖基化的位点（Martini et al.，BMC Immunol 2010,11:43; Krishnan et al.,J Mol Biol 2007，367:224;Krishnan et al.,Acta Cristallogr D Biol Crystallogr 2009,D65:266)〇
[0139] (c)针对糖基化的人类补体C2的抗体的免疫和生成
[0140] 根据现有技术，针对糖基化人类C2的抑制性抗体仅可通过使用去糖基化的纯化人 类C(0glesby et al.，J Immunol 1988,2:926)或使用纯化的人类亚组分C2a(US 2001/ 0026928 A1)免疫小鼠获得，而不能通过使用完整的糖基化纯化的人类C2来获得。
[0141] 与Oglesby的免疫途径（参见上文；J Immunol 1988,2:926)相反，在第0天，对 BALB/c小鼠（雌性;6~8周龄;查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))皮下注射 在完全弗式佐剂中的《 500yL糖基化的重组人类补体C2(每一小鼠注射在250yL PBS-5mM苄 脒盐酸盐(U-Protein Express)中，与250yL完全弗式佐剂（Sigma)混合的25yg糖基化的重 组人类C2)。然后在第21天和第42天，对于通过皮下注射在不完全弗氏佐剂中的糖基化的重 组C2(每一小鼠注射在250yL PBS-5mM苄脒盐酸盐中，与250yL不完全弗式佐剂(Sigma)混合 的25yg糖基化的重组人类C2)的小鼠，抗体应答提高了，并且腹膜内注射没有佐剂(每一小 鼠注射在250yL PBS-5mM苄脒盐酸盐中的25yg重组C2)的糖基化的重组C2的小鼠，在第63天 和第64天抗体应答提高了。在第67天，使用反611.161*和組18丨6丨11(似丨1^6 1975,256:495)最初 描述的标准的杂交瘤技术，使来自免疫小鼠的脾细胞与SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞(DSMZ)融 合。简单来讲，处死免疫小鼠。从脾脏中切出脾细胞，并且在具有GlutaMax培养基的 serum-rrceopU'-ME：M3d (SF培养基；Invitrogen)中进行冲洗。在SF培养基中冲洗对数生长 的SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞，然后添加到脾细胞中，得到脾细胞对骨髓瘤细胞的比率为5:1。 然后使细胞沉积成细胞团，并且去除上清液。然后在60秒的时间段中，逐滴添加 lml 37% (v/v)的聚乙二醇4000溶液(Merck)，之后将细胞在37°C再孵育60秒。然后，随着缓慢搅拌， 添加8ml SF培养基，再添加具有GlutaMax/10% (v/v)胎牛血清（FCS ;Bodinco)的5ml opli-M￡M? h在室温下30分钟之后，细胞沉积成细胞团，在具有GlutaMax/10%FCS的 opli-MEM? I中进行冲洗，以去除残留的聚乙二醇，最后以每孔1〇5个细胞/200μ1的浓度铺 板在氨基蝶呤选择培养基中，即补充有50x Hybri-Max?氨基蝶呤（从头DNA合成抑制剂 (Sigma))的具有GlutaMax/10%FCS的(叩丨」-1^1^$1。从第7天开始，每2~3天重新补充一次 氨基蝶呤选择培养基，在第13天，将氨基蝶呤选择培养基替换成具有GlutaMax/10%FCS的 opti-MEM 1〇
[0142] 从第13天开始，在融合之后，使用包被在96孔板上的具有糖基化的重组人类02〇]_ Protein Express)进行ELISA，来筛选杂交瘤上清液的抗-C2抗体的产生。筛选ELISA如下进 行。糖基化的人类重组C2用于包被(在PBS中250ng/ml;25ng/100yl/孔）。在使用roS/0.05% Tween 20(w/v)彻底冲洗之后，在室温（RT)，使用roS/0.05%Tween 20/1%牛血清白蛋白 (BSA)(w/V)(R〇Che)对板子封闭1小时。随后，在室温，将板子与100μΙ未稀释的杂交瘤细胞 上清液/孔孵育1小时。在PBS/0.05 % Tween 20中彻底冲洗之后，在室温，使用1:5000稀释的 辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 Fc γ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)孵育1小 时，然后通过即用型TMB底物溶液（Invitrogen)进行比色检测，来确定抗体的结合。在添加 了 1M H2S〇4之后，使用酶标仪(BioRad)，测量波长450nm(655nm的参考波长)处的光密度。扩 增在该ELISA中呈阳性的杂交瘤，并且进行冷冻储藏。
[0143] 正如刚刚描述过的使用筛选ELISA所测定的几个融合实验得到36个产生针对糖基 化人类C2的抗体的杂交瘤。如下面实施例所描述，测试这些杂交瘤的上清液对糖基化C2的 抑制活性。
[0144] 实施例2:筛选抗-C2杂交瘤上清液的抑制活性的ELISA
[0145] 在ELISA系统中，初始筛选产生抗-C2抗体的杂交瘤的培养物上清液对C2的抑制效 果（图2)。在本ELISA中，将凝集的人类IgG包被在微量滴定板(Greiner-Bio-One)中，然后与 稀释的新鲜血清孵育，该稀释的新鲜血清与或未与含抗-C2的杂交瘤上清液进行了预孵育。 然后使用生物素化的多克隆亲和纯化的抗-C3和抗C4的抗体，测量C4和C3在板子上的固定， 这指示补体活化。然后，使用链霉亲和素-HRP测量抗-C3和抗-C4与板子的结合，所述结合使 用3'，5'_四甲基联苯胺（tetratmethylbenzidine)顺序进行可视化。简单来讲，在室温，使 用在 PBS 中的 10μg/ml 凝集 IgG 以 100μ1/孔对 ELISA 板(Greiner-Bio-One)包被过夜。在 ELISA 中，这一步骤和所有随后步骤的终体积都是1〇〇μ1。在使用之前，使用Mi 11 iQ冲洗5次板子。 按如下方法制备要进行测试的样品。将新鲜人类血清以1:100稀释在佛罗拿(veronal)缓冲 盐水中，该佛罗拿缓冲盐水pH 7.4(Lonza)，含有ImM MgCl2、0.15mM CaCl2和0.1%(w/v) Tween 20(VB-T)。1体积稀释血清与1体积杂交瘤上清液和1体积VB-T，在室温孵育30分钟。 通过混合1〇〇μ1稀释的新鲜正常血清与1〇〇μ1 EDTA(0.1M)和100μ1 VB-T，来制备阴性对照 样品。作为阳性对照，使用稀释血清和VB-T(而不是培养物上清液），来制备混合物。然后，将 这些几百微升的混合物在凝集IgG包被的板子中，在37°C孵育30分钟。冲洗板子，并且与针 对人类C4和C3的、在PBST中以1:50稀释的生物素化的抗体孵育。通过在室温，与以1:7500稀 释在PBS-T中的100链霉亲和素-HRP(Bi 〇Legend)孵育1小时，来检测结合的抗-C4或抗-C3的 鼠类抗体。最后，使用蒸馏水冲洗5次板子，使用3，5,3'，5'-四甲基联苯胺（TMB底物， Invitrogen)进行显影。通过向每一孔中添加100μ1 2M H2SO4,来终止反应。然后在 Multiskan EX酶标仪（Thermo Scientific)上，读出450nm处每一孔的吸光度。使用 Graphpad Prism 5分析数据。
[0146] 来自几次融合实验的9个杂交瘤，示出对C3结合具有实质的抑制活性，而它们并不 影响C4的固定（图3A和图3B)，排除了以下可能性：它们对C3活化的影响是因为在样品加工 过程中补体的非特异性活化和消耗。这些杂交瘤的编号是:抗-C2-7、抗-C2-13、抗-C2-23、 抗-C2-24、抗-C2-26、抗-C2-27、抗-C2-32、抗-C2-5F2和抗-C2-5G2。此外，鉴定出抑制杂交 瘤的少量临界线（杂交瘤19、35、60和65)。对重链可变区和轻链可变区的测序，显示出单克 隆抗体抗-C2-24和抗-C2-32是相同的，与单克隆抗体抗-C2-5F4和抗-C2-5G2-样。
[0147] 实施例3:纯化的鼠类抗-C2抗体13、32、35、60和5F2.4的结合特征
[0148] (a)单克隆抗体抗42-13、-32、-35、-60和-5?2.4与糖基化的重组人类02的结合
[0149] 使用蛋白G亲和色谱法(GE Healthcare)，纯化抑制性和非抑制性的抗_C2mAb。使 用小鼠单克隆同型化的IsoQuick?试剂盒(Sigma)，将重链和轻链类型化为同型种类(表1)。
[0150] 表1、针对人类C2的一些鼠类mAb的抗体类型
[0151]
[0153] 使用如在上面实施例1(c)中所述的程序，通过测定与量高（200ng/孔）和量低 (25ng/孔）的糖基化重组C2(U-protein Express)的结合，对纯化的单克隆抗体抗-C2-5F2 · 4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35 和抗-C2-60 进行进一步表征。
[0154] 如在图4中所示，抗体抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60剂 量依赖性地与糖基化的重组人类补体C2结合。抗体抗-C2-5F2.4、抗-C2-35和抗-C2-60的结 合，示出对以25ng/孔和200ng/孔包被的C2的结合仅略有差异，而与以200ng/孔包被的C2相 比，抗体抗-C2-13和抗-C2-32与以25ng/孔包被的C2的结合显著降低（图4)。因此，小鼠抗人 类补体C2-13(mIgGlK)和抗-C2-32(mIgGlK)的（相对）亲和性，低于抗体抗-C2-5F2.4 (mIgG2aK)、抗-C2-35(mIgGlK)和抗-C2-60(mIgGlK)的（相对)亲和性。
[0155] (b)单克隆抗体抗42-13、-32、-35、-60和-5?2.4与经(：18剪切的糖基化重组人类 C2的结合
[0156] 使用如在上面实施例1(c)中所述的程序，测定纯化的单克隆抗体抗-C2-5F2.4、 抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60与糖基化重组C2(200ng/孔；U-protein Express)或与经Cls剪切的糖基化的重组C2(200ng/孔)的结合。
[0157] 抗体抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60剂量依赖性地与糖 基化的重组C2(图5A)和经Cls剪切的糖基化的重组C2(图5B)结合。对后者的观察证明，抗体 抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60不识别糖基化的重组人类补体C2 的Cls剪切位点上的表位（即Arg 243- | -Lys244键，http : //www · uniprot · org/uniprot/ P09871)。
[0158] 实施例4:纯化的鼠类抗C2的mAb对C3在固体相凝集IgG上的固定的抑制活性
[0159] 为了证实抗-C2的mAb的抑制活性，使用与在实施例2中相同的测定，除了对要进行 测试的样品进行不同的制备以增强测定的稳健性。通过使Ι0μ1正常新鲜血清与Ι0μ1在PBS 中纯化的抗-C2的mAb混合，来制备样品。通过使10μ1正常新鲜血清与10μ1 VB混合，来制备 阳性对照样品。作为阴性对照样品，使1〇μ1正常新鲜血清与1〇μ1 EDTA(O.IM)混合。所有样 品都在室温孵育30分钟。接着，将所有样品都以1:100稀释在roS/0. l%Tween 20中，然后按 照在之前实施例中所述的方案，来进行相同的方案。如在图6中所示，对照mAb和非抑制性 mAb抗-C2-63,都不影响C3固定至固体相IgG。与此相对，抗-C的抗体32、5F2.4和13抑制C3固 定在板子上，而抗C2的mAb 35和60在这一测定中没有显示出显著活性。
[0160] 实施例5:通过流体相凝集IgG，纯化的鼠类抗-C2的mAb对新鲜血清中的C3的活化 的抑制活性
[0161 ]在与抗-C2的mAb预孵育的新鲜人类血清与凝集IgG孵育的测定中，测量抗-C2的 mAb-13、32、35、60和5F2对流体相C3活化的影响。然后，使用之前所述的ELISA(WolbinkGJ et al.，J Immunol Methodsl993,63:67)，测量样品中的C3的活化。通过使30μ1正常新鲜血 清与30μ1含抗-C2的mAb混合，来制备样品，并且在室温孵育20分钟。接着，将在VB中的30μ1 凝集IgG(lmg/ml)添加到所有样品中，以活化补体，阴性对照除外（其补充有30μ1 VB)。随 后，样品在37°C孵育30分钟。然后向所有样品中添加60μ1 EDTA(O.IM)，来终止补体活化。在 室温15分钟后，使用补充了 10mM EDTA的roS/0.1%Tween 20,稀释所有样品(血清最终稀释 是1:4000)，并且在ELISA中测试活化的C3。作为阳性对照，新鲜的人类血清与30μ1不含mAb 的VB预孵育。作为阴性对照，新鲜血清仅与VB孵育，而不与mAb或凝集IgG孵育。这一对照制 作两次，其中一次在所有孵育过程中都保持在融化的冰上。将结果表示为任意单位的活化 的C3,这是通过与标准曲线进行对比来计算，其中标准曲线由正常老化的血清的系列稀释 组成。因为活化的C3的测定不能在C3b、C3bi或C3c之间进行区分，将活化的 C3指示为C3b/c。 图7示出，在向人类血清中添加凝集IgG时，生成C3b/c(图7中的阳性对照）。添加 IgG(图中的 γ -醌式(Qu i n) I gG)、不相关的对照mAb (图6中的(抗-FXI))或非抑制性抗-C2的mAb-63，通 过凝集IgG对血清中的C3b/c生成没有影响。与此相对，抗-C2的mAb 7、13、32、35、60和5?2.4 都通过凝集I gG抑制C3b/c的生成（图7)。
[0162]实施例6:纯化的鼠类抗-C2的mAb对抗-HLA抗体的细胞毒性的影响
[0163] 作为人类移植的抗体介导的排斥的离体模型，对诊断性交叉配血试验进行了修 改，其中诊断性交叉配血试验测试候选移植受体中补体依赖性抗体的存在。在正常试验中， 在兔补体的存在下，供体细胞或具有与供体相同的HLA分子的细胞，与受体的热失活的血清 混合。如果受体具有针对供体HLA分子的抗体，会使细胞裂解。使用显微镜进行测定，并且表 示为细胞毒性分数(从1-没有裂解-至8_>80%裂解）。为了测试抗-C2的mAb的效果，用兔血 清代替新鲜的人类血清，来对该测定进行修改。此外，使用具有针对多HLA分子的高滴度抗-HLA抗体的患者的血清。
[0164] 修改的交叉配血试验如下进行。寺崎托盘(Terasaki tray) (Greiner)的孔填充1μ 1具有HLA抗体的高度免疫化的血清和ΙμL PBMC悬浮液(2~5 X 106个细胞/ml)，并且在室温 孵育1小时。同时，通过混合5μ1新鲜的正常血清、15μ1 VB和5μ1含抗-C2的mAb的VB，来制备 要进行测试的样品。通过向20ul没有抗-C2的mAb的佛罗拿缓冲液中添加5μ1正常新鲜血清， 来制备阳性对照样品；并且，通过混合5μ1正常新鲜血清、15μ1佛罗拿缓冲液和5μ1 lOOmM EDTA，来制备阴性对照样品。随后，所有样品在室温孵育20分钟。接着，一式两份地向孔中添 加10以1各样品，并且在室温孵育2小时。最后，向孔中添加5以]^111〇1'〇911611(311(331113；[0)。30分 钟之后，使用自动显微镜(Leica)读出寺崎托盘，在一些实验中，使用被称为"Leica Q WIN" 的特定程序计算出细胞裂解，而在其他实验中，由有经验的技术人员得出裂解的分数。细胞 毒性分数"0"指细胞没有裂解，而当>80 %的细胞被裂解时，得到分数"8"。
[0165] 测试浓度在0.6mg/ml~1.5mg/ml范围内的抗-C2的抗体。抗-C2的mAb 18、19、23、 31和63,对经抗-HLA的抗体敏化的细胞的补体依赖性杀伤没有影响（参见图8)。与此相对， 在这一抗体介导的同种异体移植排斥的模型中，抗-C2的mAb 13、32、35、60、7、24、79，都抑 制补体依赖性的细胞毒性。
[0166] 实施例7:在人类补体C2上由小鼠抗人类补体C2的抗体13、32、35、60和5F2.4识别 的结构域的特征
[0167] (a)使用蛋白印记，对糖基化重组人类亚组分C2a和C2b上由mAb抗-C2-13、-32、_ 35、-60和-5F2 · 4识别的表位进行制图
[0168] 在非还原条件下，在预制SDS-PAGE( NuPage? Novex?系统）中，使用4~12% Tris-Bis凝胶和MOPS跑胶缓冲液（Invitrogen)，对糖基化的重组人类C2(范围125~500ng/ 泳道，参见图9;U-protein Express)或经Cls剪切的糖基化的重组人类C2(范围62.5-1000ng/泳道，参见图9;对于C2剪切程序，参见实施例1(b))进行电泳。然后，将C2蛋白电印 记到聚偏二氟乙烯（PDVF)转移膜（Millipore)上。经PBS/0.05%Tween 20/l%BSA组分V (Roche)在室温封闭 20 分钟之后，PDVF 膜与抗-C2 的 mAb 抗-C2-C2-5F2.4(100ng/mL)、抗-C2-13(200ng/mL)、抗-C2-32(200ng/mL)、抗-C2-35(100ng/mL)和抗-C2-60(200ng/mL)在室温 孵育1小时。在PBS/0.05 % Tween 20中彻底冲洗之后，使用1:10，000稀释的辣根过氧化物酶 缀合的山羊抗小鼠 Fc γ的特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)在室温孵育1小时，然后 通过即用型TMB底物溶液(S i gma)进行比色检测，来确定抗-C2的mAb的结合。
[0169] 如图9中所示，所有检验的抗-C2的mAb都与未剪切的糖基化的重组人类C2( ? 100kDa)结合。此外，mAb抗-C2-5F2.4和抗-C2-35特异性识别糖基化亚组分C2b( ? 30kDa)， 而mAb抗-C2-13和抗-C2-32特异性识别糖基化亚组分C2a( ? 70kDa)。滅13抗-C2-60似乎与糖 基化亚组分C2a和C2b都结合。
[0170] (b)使用ELISA，检测mAb抗气2-13、-32、-35、-60和-5?2.4与糖基化的重组人类亚 组分C2a的结合
[0171] 通过大小排阻层析(Yarra?3U sec 2000300x 4.60柱），从经Cls剪切的C2(对于C2 剪切程序，参见实施例1(b))中纯化糖基化的重组人类C2a。在使用预制凝胶NuPage? Novex?系统（Invitrogen)的SDS-PAGE上，C2a制备物是>95%均一的（未示出）。随后，使用 在实施例1(c)中描述的ELISA程序，进一步分析纯化的抗-C2的mAb与纯化的C2a(200ng/孔） 的结合。
[0172] 如在图10A中所示，并且与蛋白印记数据(参见实施例7(a)))相符，mAb抗-C2-13和 抗-C2-32证明剂量依赖地结合（即在0 . lyg/mL达到饱和）纯化的糖基化的重组C2a，而mAb 抗-C2-60示出与C2a中等程度地结合，mAb抗-C2-5F2.4和抗-C2-35几乎不与C2a结合。痕量 的未剪切的糖基化重组C2，解释了观察到的mAb抗-C2-5F2.4和抗-C2-35的结合。
[0173] (c)使用ELISA，检测mAb抗-C2-5F2.4与糖基化的、变性和还原的重组人类C2的结 合
[0174] 使用在上面实施例1(b)中所述的程序，进行重组C2的去糖基化，但反应缓冲液没 有变性/还原试剂，而且使用肽-N-糖苷酶F(PNGase F;New England Biolabs)的处理在37 °(3进行过夜。分别使用有NuMGE政还原试剂lOX(Invitogen)或没有NiuPAGE?还原试剂 lOX(Invitogen)的NuPAGE? LDS样品缓冲液4X(Invitogen)，进行重组C2的变性和还原。随 后，使用在上面实施例1 (c)中所述的ELISA程序，进一步分析纯化的mAb抗-C2-5F2.4与未经 处理的重组C2 (200ng/孔）、去糖基化的重组C(100ng/孔）、变性的重组C2 (200ng/孔)和还原 的重组C2(200ng/孔）的结合。
[0175] 如在图10B中所示，mAb抗-C2-5F2.4证明剂量依赖性地与去糖基化的（非-变性/ 非-还原)重组C2结合。如在图10C中所示，mAb抗-C2-5F2.4证明剂量依赖性地与变性的重组 C2结合，并且示出不与还原的(变性)重组C2结合。
[0176] 总之(参见表2)，11^13抗-02-5?2.4似乎识别人类02的亚组分0213上的表位，而不识 别人类C2的亚组分C2a上的表位(参见实施例7(a)和7(13))。11^13抗-02-5?2.4在亚组分0213上 的结合似乎对人类C2的Cl s剪切(参见实施例3 (b ))、去糖基化和变性不敏感。但是，内部的 半胱氨酸桥键似乎对mAb抗-C2-5F2.4在亚组分C2b上的结合起到关键作用。
[0177] 表2、mAb抗-C2-5F2.4的结合特征
[0178]
[0179] 实施例8:抗-C2的mAb 13、32、35、60和5?2通过流体相凝集186抑制新鲜人类血清 中的C2
[0180] 为了研究抗-C2的mAb的抑制机制，将10μ1血清与10μ1 0.48mg/ml的抗-C2的mAb在 室温孵育。然后，添加1〇μ1 lmg/ml的凝集IgG，样品在37°C孵育30分钟。向样品中添加35μ1 水和35μ1样品缓冲液，随后煮沸10分钟。最后，将15μ1混合物在7.5%SDS-PAGE上进行分离。 对样品进行印迹，并且与5yg生物素化的抗-C2-5F2.4孵育。如在之前的实施例中所示，该抗 体结合天然C2和具有Mr ? 30.000的C2b。因此，如果在使用凝集IgG进行活化之前，向血清中 添加非抑制性抗体，则预期在血清样品中大部分C2存在为C2b(和C2a，其在印迹中没有看 到），而小部分存在为完整的Mr ? 90.000的C2。确实，在使用对照人类IgG(图11，标记为IgG 的泳道）、不针对C2的对照mAb (在图11中标记为C的泳道)和非抑制性C2的mAb (在图11中标 记为63的泳道)的情况下，观察到这样的结果，但与使用不针对C2的对照mAb相比，该非抑制 性C2的mAb在某种程度上示出C2的较少的剪切，这很可能是因为一些空间位阻。当使用凝集 IgG活化补体系统时，其他所有mAb都减小血清中的C2的剪切(图11)。
[0181] 实施例9:mAb抗42-13、-32、-35、-60和-5?2.4不抑制人类(：18对无流体相的糖基 化的重组人类C2的剪切
[0182] 为了研究抗-C2的mAb的抑制机制，使糖基化的重组人类C2与mAb抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60(C2与抗体的摩尔比率为1:2)，在室温预孵育30分 钟。并行地，测试作为阴性对照的小鼠 IgGlK和IgG2aK的同型对照（都购自BD Biosciences)。然后，添加人类Cls(Cls与C2的比率为1: 25;Calbiochem)，在37°C孵育1小 时。使用预制凝胶NuPage? Novex?系统（I n v i tr 〇 gen)的SDS-PAGE，并且用考马斯亮蓝染 色，来分析混合物。
[0183] 如图12中所示，抗-C2的mAb都不抑制重组C2被Cls剪切。此外，当使用较高浓度(C2 与抗体的摩尔比率为《 1:3至》1:7)的抗-C2的mAb时，没有观察到对C2被Cls剪切的影响 (数据未示出）。总的来说，这些结果证明，mAb抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35 和抗-C2-60不识别Cls剪切位点上的表位或接近Cls剪切位点的表位（即Arg243-1 -Lys244键； http://www.uniprot.org/uniprot/P09871)。
[0184] 实施例10:使用简并引物对小鼠抗42-5?2.4、-13、-32、-35和-60进行分子遗传表 征
[0185]使用PBS冲洗杂交瘤细胞，等分在含5 X106个细胞的微量管中，并且以细胞团的形 式储存在_80°C。使用RNeasy迷你型分离试剂盒(RNeasy Mini Isolation Kit)(QIAGEN)， 从这些细胞团中分离RNA。测定RNA浓度(A260nm)，并且将RNA储存在-80°C。通过反转录酶， 使用RevertAid?H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(-第一链cDNA合成试剂盒） (Fermentas)，从2yg RNA合成cDNA，并且将合成的cDNA储存在-20°C。基于同型抗体，设计如 在表3中所示的引物，来扩增小鼠抗人类C2-5F2 · 4、-13、-32、-35和-60的乂区。
[0186] 表3、用于克隆抗-C2的mAb的cDNA的PCR引物
[0187]
[0188] s =正向；as =反向，cs =恒定区
[0189] +VL =轻链可变区，VH =重链可变区；*按照Bioceros内部编码系统的编号；**简并 引物:M=C或A;V=G、A或C;N=A、C、G或T;Y = C或T;R=A或G;W=A或T;和S=G或C。
[0190] 引物1是设计以与小鼠的VH区的骨架1(FR1)退火的正向引物，；引物2和204是与小 鼠重链的恒定区退火的反向引物。引物213和265都是与小鼠 VL区（κ)的FR1退火的正向引 物；引物4和201都是设计以与小鼠 κ轻链的恒定区退火的反向引物。最后，引物317被设计 为，识别FR1区上游的小鼠信号肽序列的一部分。
[0191] 使用表3中示出的引物组合，进行多种不同的PCR。扩增小鼠抗-C2-5F2.4、-13、- 32、-35和-60的V区。有吸引力的是，仅使用反向引物201，就扩增出小鼠抗-C2-35和-60的轻 链可变区。
[0192] Accuprime?Pfx DNA聚合酶（Invitrogen)用于扩增小鼠抗-C2-5F2·4、-13、_32、-35和-60的重链和轻链的可变区。在1 %琼脂糖凝胶上分析PCR产物。对PCR反应产物进行凝 胶纯化，并且克隆在pCR-Bluntii-TOPO?:载体中，用于序列分析。从含有PCR插入物的质粒 中，通过DNA测序（通过ServicXS B.V·，（莱顿市，荷兰和麦克根（The Netherlands and Macrogen)，阿姆斯特丹，荷兰)来进行)来分析克隆的插入物，以获得抗-C2的mAb的V区共有 序列。对于所有检验的mAb，获得VH和VL的至少3条信息序列。应注意，因为所使用的正向引 物的性质，几乎所有确定的氨基酸共有序列所使用的简并引物，指示N末端的前6~8个氨基 酸。理论上，原始的小鼠序列可能在这些区域中是不同的。确定小鼠抗-C2-5F2.4、-13、_ 32、-35和-60的VH区和VL区的氨基酸共有序列，即分别为SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3、SEQ IDN0·10和SEQIDN0·11、SEQIDN0·18和SEQIDN0·19、SEQIDN0·26和SEQIDN0·27、 SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35。
[0193] 在本说明书中，没有必要将显然是之前公开的文件的列表或讨论认为是公知的， 即没有必要认为该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
[0194] 实施例11:嵌合人类IgGlK和/或人类IgG4K(即将小鼠 IgGK恒定结构域换成人类 IgGK的恒定结构域)抗-人类补体C2-5F2.4、-13、-32、-35和-60的生成
[0195] 基于鉴定出的鼠类V区序列（参见实施例10)，设计小鼠抗-C2-5F2.4、-13、-32、-35 和-60的嵌合人类抗体形式。为此，从GENEART(雷根斯堡，德国）购买了CH0细胞优化的cDNA 序列SEQ ID N0.47(编码mAb抗-人类C2-32的嵌合人类IgGl的重链)和SEQ ID N0.48(编码 抗-人类C2-32的嵌合人类κ轻链），这编码鼠类信号肽，接着分别是与人类IgGl恒定区连接 的鼠类可变重链，或与人类κ恒定区连接的鼠类可变轻链。
[0196] 此外，生成抗-02-5?2.4、-13、-32、-35和-60的嵌合人类(稳定的）1864形式。为此， 使用表4中示出的引物，通过PCR扩增重链可变区和轻链可变区。为了亚克隆的目的，在编码 V区的cDNA的N末端部分和C末端部分中并入适当的限制性酶切位点。抗人类补体C2的抗体 编号32的κ轻链没有被扩增，因为已经从用于生成嵌合人类IgGlK(参见上文）的嵌合人类κ 构建体中获得构建体。除了抗人类补体C2的抗体编号32的可变重链之外，天然的鼠类cDNA 用作所有PCR反应的模板。对于抗人类补体C2的抗体编号32的可变重链，使用嵌合人类IgGl 构建体的CH0优化的cDNA(参见上文）。
[0197] 表4、用于扩增抗-C2的mAb的重链可变区和轻链可变区的PCR引物
[0198] LUZUU」 ；as =汉pj
[0201 ] +VL =轻链可变区，VH=重链可变区；*按照Bioceros内部编码系统的编号;**简并 引物:M=C或A;V=G、A或C;N=A、C、G或T;Y = C或T;R=A或G;W=A或T;和S=G或C。
[0202] Accuprime?Pfx DNA聚合酶（Invitrogen)用于扩增抗-C2-5F2·4、_13、_35和-60的 重链可变区和轻链可变区，以及抗-C2-32的可变重链。在1%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。对 PCR反应产物进行凝胶纯化，并且克隆在pCR-Blunt ||-TOP()K载体中，用于序列分析。从含有 PCR插入物的质粒中，通过DNA测序(麦克根(Macrogen)，阿姆斯特丹，荷兰)来分析克隆的插 入物，以获得含有适当限制性酶切位点的正确的V区。随后，使用SacII/Nhel，将重链可变区 亚克隆到表达质粒v319中，表达质粒v319是pcDNA3.1衍生物，含有编码鼠类信号肽，接着是 稳定的人类IgG4重链恒定区的cDNA。使用SacII/RsrII，将轻链可变区亚克隆到类似的表达 质粒v322中，而表达质粒v322含有编码鼠类信号肽和人类κ轻链恒定区组合的 CDNA。
[0203] 对于嵌合人类IgG4K抗人类补体C2的抗体的cDNA序列，参见SEQ ID N0.42(编码 抗-C2-5F2.4的嵌合人类IgG4的重链）、SEQ ID N0.43(编码抗-C2-5F2.4的嵌合人类κ轻 链）、SEQ ID N0.44(编码抗-C2-13的嵌合人类IgG4的重链）、SEQ ID N0.45(编码抗-C2-13 的嵌合人类κ轻链）、SEQIDN0.46(编码抗-C2-32的嵌合人类IgG4的重链）、SEQIDN0.48 (编码抗-C2-32的嵌合人类κ轻链）、SEQ ID勵.49(编码抗42-35的嵌合人类1864的重链）、 SEQ ID N0.50(编码抗-C2-35的嵌合人类κ轻链）、SEQ ID N0.51(编码抗-C2-60的嵌合人类 IgG4的重链)和SEQ ID N0.52(编码抗-C2-60的嵌合人类κ轻链）。
[0204] 对于嵌合人类IgGlK和嵌合人类IgG4K的抗人类补体C2的抗体的氨基酸序列，参见 SEQ ID Ν0· 53(抗-C2-5F2.4的嵌合人类IgG4的重链）、SEQ ID Ν0·54(抗-C2-5F2.4的嵌合 人类lc轻链）、SEQIDN0.55(抗-C2-13的嵌合人类IgG4的重链）、SEQIDN0.56(抗-C2-13的 嵌合人类κ轻链）、SEQIDN0.57(抗-C2-32的嵌合人类IgG4的重链）、SEQIDN0.58(抗-C2-32的嵌合人类IgGl的重链）、SEQIDN0.59(抗-C2-32的嵌合人类κ轻链）、SEQIDN0.60 (抗-C2-35的嵌合人类IgG4的重链）、SEQIDN0.61(抗-C2-35的嵌合人类κ轻链）、SEQID N0.62(抗-C2-60的嵌合人类IgG4的重链)和SEQIDN0.63(抗-C2-60的嵌合人类κ轻链）。
[0205] 实施例12:嵌合小鼠-人类IgGlK和/或IgG4K的抗人类补体C2的抗体5F2.4、13、32、 35和60的结合特征
[0206] 使用FreeStyle?MAX CH0(CH0-S细胞）表达系统（Invitrogen)，表达嵌合小鼠-人 类抗体(抗-C2-32的人类IgGlK形式，和抗气2-5?2.4、-13、-32、-35和-60的人类186牡形 式）。使用亲和色谱蛋白A柱子(GE Healthcare)，纯化表达的嵌合小鼠-人类的抗人类补体 C2的抗体。使用与在实施例3中所述的相同的ELI SA程序，测试所有抗-C2的嵌合mAb，与高 (200ng/孔)和低（25ng/孔)重组C2的结合。简单来讲，使用在roS中的所示量的C2,在4°C对 ELISA板（Corning)包被过夜。在roS/0.05%Tween 20中彻底冲洗之后，使用roS/0.05% Tween 20/l%BSA组分V(Roche)对板子在室温封闭1小时。随后，在室温，板子与0、0.00002 ~20.0(在封闭缓冲液中进行10倍稀释步骤)yg/mL蛋白A纯化的嵌合小鼠-人类IgGlK和/或 1区6牡的抗气2-5?2.4、-13、-32、-35和-60孵育1小时。在?85/0.05%了￥661120中彻底冲洗之 后，使用1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人类IgG的特异性(重链和轻链)抗体 (Jackson ImmunoResearch)在室温孵育1小时，然后通过即用型TMB底物溶液（Invitrogen) 进行比色检测，来确定抗体的结合。添加1M H2S04之后，使用酶标仪（BioRad)，测量波长 450nm(参考波长655nm)的光学密度。
[0207]图13 (平均值± SD，η = 2)示出，嵌合抗体的结合特征与纯化的鼠类抗体的结合特 征（图4)完全相同。嵌合抗-C2-13和抗-C2-32与低浓度包被的C2结合不太好，而其他嵌合抗 体与两种浓度的C2的结合都很好。因此，嵌合小鼠-人类的抗-C2-13(chuIgG4K)和抗-C2-32 (〇1111]^641〇和〇1111]^611〇的（相对）亲和性，似乎低于嵌合小鼠-人类（〇1111]^641〇抗-〇2-5F2 · 4、-35和-60的（相对)亲和性。
[0208] 实施例13:嵌合小鼠-人类IgG4K抗人类C2-5F2.4、-13、-32、-35和-60的功能活性
[0209]在与实施例4(C3只固体相IgG的固定）、实施例5(凝集IgG对血清中的流体相C3的 活化)和实施例6(抗-HLA抗体对补体依赖性的细胞毒性)相同的测定中，测试嵌合小鼠-人 类抗-C2的mAb。在这些测定中，5种嵌合小鼠-人类抗体的功能活性与鼠类抗体的功能活性 类似，即它们抑制C3固定至固体相IgG，它们抑制凝集IgG对血清中C3的活化（图14)，并且防 止抗-HLA抗体的补体依赖性的细胞毒性(图15)。
[0210] 实施例14:使用退火在信号肽区域中的引物，确定小鼠抗-C2-5F2.4、-35和-60的 可变区的N末端氨基酸序列
[0211] 如实施例10中所述，理论上，因为使用正向简并引物，因此可变区的小鼠 N末端共 有氨基酸序列可能与确定的序列不同。因此使用在表5中所述的引物（即正向引物退火在鼠 类抗体的信号肽区），再次确定抗-C2-5F2.4、-35和-60的VH区和VL区。
[0212] 表5、用于扩增抗-C2-5F2.4、-35和-60的小鼠共有的重链可变区和轻链可变区的 PCR引物
[0213]
[0215] s =正向；as =反向
[0216] +VL =轻链可变区，VH=重链可变区；*按照Bioceros内部编码系统的编号；**引 物:M=C或A;V=G、A或C;N=A、C、G或T;Y = C或T;R=A或G;W=A或T;和S=G或C.
[0217] 使用RNeasy迷你型分离试剂盒（RNeasy Mini Isolation Kit) (QIAGEN)，从杂交 瘤细胞中分离RNA。测定RNA浓度(A260nm)，并且将RNA储存在-80°C。通过反转录酶，使用 RevertAid?H-第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid?H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit) (Fermentas)，从2yg RNA合成cDNA，并且将合成的cDNA储存在_20°C。
[0218] Accuprime?Pfx DNA聚合酶（Invitrogen)用于扩增小鼠抗-C2-5F2·4、_35和-60的 重链和轻链的可变区。所使用的引物组示于表5中。对PCR反应产物进行凝胶纯化，并且克隆 在pCR-BluntH-TOPO?载体中，用于序列分析。从含有PCR插入物的质粒中，通过DNA测序（由 荷兰阿姆斯特丹的麦克根(Macrogen)进行)来分析克隆的插入物，以获得这三种抗-C2的 mAb的V区的共有序列。对于所有检验的mAb，获得VH和VL的至少3条信息序列。
[0219] 通过使用表5的引物组，发现抗-C2-5F2.4的小鼠共有的可变重链氨基酸序列以及 抗-C2-35和抗-C2-60的小鼠共有的可变轻链氨基酸序列，与在实施例10中发现的氨基酸序 列相同（即分别是SEQ ID N0.2、27和35)。
[0220] 但是，抗-C2-5F2.4的N末端可变轻链氨基酸序列（SEQ ID NO.96)，与在实施例10 中发现的抗-C2-5F2.4的N末端可变轻链氨基酸序列（SEQ ID NO.3)有一个氨基酸是不同的 (I2N)。抗-C2-35的N末端可变重链氨基酸序列（SEQ ID N0.97)，与在实施例10中发现的抗-C2-35的N末端可变重链氨基酸序列（SEQIDN0.26)有一个氨基酸是不同的（Q1E)。抗-C2-60的N末端可变重链氨基酸序列（SEQ ID N0.98)，与在实施例10中发现的抗-C2-60的N末端 可变重链氨基酸序列（SEQ ID N0.34)有三个氨基酸是不同的(Q3A、Q5K和Q6E)。
[0221 ]实施例15:人源化IgG4/K的抗人类补体C2-5F2.4的生成
[0222] 基于确定的小鼠抗-C2-5F2.4的鼠类V区（VH区为SEQ ID N0:2,并且VL区为SEQ ID NO: 96，参见实施例13 )，生成人源化抗体的形式。
[0223] 使用种系人源化（Germline Humanisation) (CDR-嫁接）技术（由英国剑桥的 Antitope Ltd进行），获得小鼠抗-C2-5F2.4的人源化轻链可变序列和人源化重链可变序 列。对于人源化可变轻链和可变重链的氨基酸序列，分别参见SEQ ID NO. 99(5F2.4-VL1)、 SEQ ID N0.100(5F2.4-VL2)、SEQ ID N0.101(5F2.4-VL3)、SEQ ID N0.102(5F2.4-VL4)和 SEQ ID N0.103(5F2.4-VH1)、SEQ ID N0.104(5F2.4VH2)、SEQ ID N0.105(5F2.4-VH3)、SEQ ID N0.106(5F2.4-VH4)〇
[0224] 在该设计之后，从GENEART(雷根斯堡，德国）购买了 cDNA序列（参见SEQ ID NO. 107、108、109和110(编码全长人源化轻链k5F2.4形式，即分别编码VL1、VL2、VL3和VL4)， 和SEQ ID NO. 111、112、113和114(编码全长人源化重链IgG45F2.4形式，即分别编码VH1、 VH2、VH3和VH4))，这些cDNA序列编码后面是与人类κ恒定区连接的人源化可变轻链的信号 肽，和后面是与人类IgG4恒定区连接的人源化可变重链的信号肽。此外，将所有人源化抗体 都表达为稳定化的(Angal et al.，Mol Immunol 1993,30:105)人类]^64分子。使用合适的 限制性内切酶，将生成的cDNA亚克隆到pcDNA3.1来源的表达质粒中。
[0225] 使用FreeStyle?293表达系统（Life Technologies)，表达人源化抗-C2-5F2.4形 式。使用亲和色谱蛋白A柱(GE Healthcare)，纯化生成的人源化抗体。通过这样的方式，生 成抗体5F2.4的8种纯化的人源化形式，即VL1VH1、VL2VH1、VL1VH2、VL2VH2、VL3VH3、VL4VH3、 VL3VH4和VL4VH4。
[0226] 对于全长的人源化抗-C2-5F2.4抗体的氨基酸序列，参见SEQ ID N0.115、116、117 和118(编码人源化轻链K5F2.4形式，即分别编码VL1、VL2、VL3和VL4)，和SEQ ID N0.119、 120、121和122(编码人源化重链18645?2.4形式，即分别编码￥!11、￥!12、￥!13和￥!14)。
[0227] 实施例16:人源化IgG4/K抗人类补体C2-5F2.4的结合特征
[0228] 通过如在上面实施例12中所述的ELISA(将重组人类C2以2μg/ml固定至板子上)测 定人源化抗-C2-5F2.4的mAb形式VL3VH3、VL4VH3、VL3VH4和VL4VH4与C2的结合。如图17中所 示，四种检验的人源化抗-5F2.4的mAb形式，证明与固体相C2的结合与嵌合抗-C2-5F2.4的 mAb类似。
[0229] 实施例17:人源化IgG4/K抗人类补体C2-5F2.4的功能活性
[0230]与在实施例6中对小鼠抗-C抗体所述类似，进行修改的交叉测试实验。
[0231]首先，抗HLA的单克隆抗体(克隆W6/32)用于使细胞敏化。以摩尔Ab:C2比率在5:1 ~0.312:1 (正常血清中的天然C2浓度假定为20g/ml)的范围内，测试嵌合抗-C2-5F2.4和人 源化抗-C2的抗体形式VL3VH3、VL4VH3、VL3 VH4和VL4VH4。所有抗-C2的mAb (嵌合Ab形式和四 种检验的人源化Ab形式），都剂量依赖地抑制经抗HLA抗体W6/32敏化的细胞的补体依赖性 杀伤（参见图18)。含VL3的形式（即VL3VH3和VL3VH4)，在交叉测试中示出与嵌合抗-C2-5F2.4的mAb相当的抑制。此外，含VL3的形式（即VL3VH3和VL3VH4)，似乎好于含VL4的形式 (即 VL4VH3 和 VL4VH4)。
[0232]此外，还使用含有高水平的抗HLA抗体的患者血清(这更加类似于生理状态)使细 胞敏化，来进行交叉测试。测试了 160g/ml的嵌合抗-C2-5F2.4，和人源化抗-C2的抗体形式 VL3VH3、VL4VH3、VL3VH4和VL4VH4。所有抗-C2的mAb (嵌合Ab形式和四种检验的人源化Ab形 式），都抑制经血清抗HLA抗体敏化的细胞的补体依赖性杀伤(参见图19)。
【主权项】
1. 一种与人类补体因子C2结合的结合分子，包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白 轻链可变区， (a) 所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序列： SEQIDN0:2和SEQIDN0:3;SEQIDN0:2和SEQIDN0:96;SEQIDN0:10和SEQIDN0: 11;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQIDN0:27;SEQIDN0:97和SEQID N0:27;SEQIDN0:34和SEQIDN0:35;或者，SEQIDN0:98和SEQIDN0:35;或者 (b) 免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序列：SEQ IDN0:9^PSEQIDN0:103;SEQIDN0:9^PSEQIDN0:104;SEQIDN0:9^PSEQIDN0: 105;SEQIDNO:99和SEQIDNO:106;SEQIDNO:100和SEQIDNO:103;SEQIDNO:100和 SEQIDNO:104;SEQIDNO:100和SEQIDNO:105;SEQIDNO:100和SEQIDNO:106;SEQ IDNO:101和SEQIDNO:103;SEQIDNO:101和SEQIDNO:104;SEQIDNO:101和SEQID N0:105;SEQIDN0:101和SEQIDN0:106;SEQIDN0:102和SEQIDN0:103;SEQIDN0: 102和SEQIDNO:104;SEQIDNO:102和SEQIDNO:105;或SEQIDNO:102和SEQIDNO: 106;或者 (c) 免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区包括在(a)和/或(b)中具体限定 的氨基酸序列，但是其中，所述序列之一或二者包括1~5个氨基酸替换。2. 根据权利要求1所述的结合分子，其中，所述结合分子与人类补体因子C2的C2a结构 域的表位、C2b结构域的表位、或C2a结构域和C2b结构域两者的表位结合。3. 根据权利要求1或2所述的结合分子，所述结合分子是Fab-片段、单链Fv(SCFv)片段 或其抗体抗原结合片段。4. 根据权利要求3所述的抗体，所述抗体是人源化的或去免疫化的IgG、IgA、IgD、IgE或 IgM抗体，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。5. 根据权利要求4所述的抗体， (a) 包括以下氨基酸序列：SEQIDN0:53 和SEQIDN0:54;SEQIDN0:55 和SEQIDNO: 56;SEQIDNO:57和SEQIDNO:58;SEQIDNO:57和SEQIDNO:59;SEQIDNO:60和SEQID NO:61;或者，SEQIDNO:62和SEQIDNO:63;或者 (b) 包括以下氨基酸序列：SEQIDNO: 115和SEQIDNO: 119;SEQIDNO: 115和SEQID N0:120;SEQIDN0:115和SEQIDN0:121;SEQIDN0:115和SEQIDN0:122;SEQIDN0: 116和SEQIDNO:119;SEQIDNO:116和SEQIDNO:120;SEQIDNO:116和SEQIDNO:121; SEQIDNO:116和SEQIDNO:122;SEQIDNO:117和SEQIDNO:119;SEQIDNO:117和SEQ IDN0:120;SEQIDN0:117和SEQIDN0:121;SEQIDN0:117和SEQIDN0:122;SEQID NO:118和SEQIDNO:119;SEQIDNO:118和SEQIDNO:120;SEQIDNO:118和SEQIDNO: 121;或者，SEQIDNO:118和SEQIDNO: 122;或者 (c) 包括在(a)和/或(b)中具体限定的氨基酸序列，但是其中，所述序列之一或二者包 括1~5个氨基酸替换。6. -种编码根据权利要求1~5中任一项限定的结合分子或抗体的核酸分子。7. 根据权利要求6所述的核酸分子，包括以下核酸序列：SEQIDN0:42、SEQIDN0:43、 SEQIDN0:44、SEQIDN0:45、SEQIDN0:46、SEQIDN0:47、SEQIDN0:48、SEQIDNO: 49、SEQIDN0:50、SEQIDN0:51、SEQIDN0:52、SEQIDN0:107、SEQIDN0:108、SEQID N0:109、SEQIDN0:110、SEQIDN0:111、SEQIDN0:112、SEQIDN0:113SSEQIDN0: 114〇8. -种基因递送剂或载体，包括根据权利要求6或7所述的核酸分子。9. 一种分离或重组的细胞，或体外细胞培养物，所述细胞包括根据权利要求6~8中任 一项所述的载体的核酸分子。10. -种产生结合分子的方法，其特征在于，产生根据权利要求1~3中任一项所述的结 合分子，或者根据权利要求4或5所述的抗体。11. 根据权利要求10所述的方法，进一步包括收集所述结合分子。12. 根据权利要求1~5中任一项所述的结合分子或抗体，用于治疗患补体活性过量或 补体活性过度活跃的个体。13. 根据权利要求1~5中任一项所述的结合分子或抗体，用于治疗患炎症性疾病、神经 疾病或缺血-再灌注(I/R)损伤，或有患这些疾病的风险的个体。14. 根据权利要求13的用于所述应用的结合分子或抗体，其中，所述个体患抗体介导的 炎症或缺血-再灌注损伤，诸如急性心肌梗塞、中风、败血症、免疫复合体病如类风湿性关节 炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、多发性创伤、多灶性运动神经病、肾同种异体移植的抗体介导 的排斥、（自体)免疫溶血性贫血、心肺转流术和其他脉管手术、特发性膜性肾病、肺出血性 肾炎综合征。15. -种药物组合物，包括根据权利要求1~5中任一项所述的结合分子或抗体，以及药 学上可接受的载剂。
【专利摘要】本发明涉及与人类补体因子C2结合的结合分子的相关的手段和方法。描述了具体的结合分子具有特异性C2活性抑制特性。这样的结合分子可用于治疗多种人类疾病的症状，该多种人类疾病有炎症性疾病、神经-炎症性疾病或缺血-再灌注(I/R)损伤。疾病。
【IPC分类】C07K16/18, A61K39/395
【公开号】CN105492461
【申请号】CN201480042146
【发明人】C·E·哈克, C·伊尔迪兹, L·波恩, P·J·西蒙斯
【申请人】布罗泰欧制药有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年5月22日
【公告号】CA2913318A1, EP2999714A1, US20160108134, WO2014189378A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫/生物化学领域。本发明涉及用于抑制补体系统的经典激活途径 和凝集素激活途径的活化的手段和方法，及其在治疗人类病症中的应用。本发明涉及补体 因子的抑制因子及其应用。本发明具体涉及与人类补体因子C2结合的结合分子，及其在治 疗或预防补体活化介导的疾病或障碍(诸如抗体介导的炎症性疾病和缺血性病症中的缺 血-再灌注(I/R)损伤）中的应用。
【背景技术】
[0002] 补体系统包括在血液中循环的蛋白。补体因子作为无活性的前体蛋白进行循环。 所述系统的活化导致活化级联，其中，通过级联中进一步下游的补体蛋白的特异性蛋白水 解作用，一个因子活化随后的因子。补体系统属于所谓的血浆级联系统。补体系统参与宿主 针对入侵微生物的防御。
[0003] 可经由三种途径发生补体系统的活化:经典激活途径、凝集素激活途径和替代激 活途径。每一条途径都活化核芯组分C3或第三补体因子，这使得引起膜攻击复合体的形成 的常见末端途径活化(]^111161^&61'11&1(1，41111111^￥13;[001161111988,57:321)。在补体活化过 程中，生成几种炎症性肽(如过敏毒素 C3a和C5a)，以及膜攻击复合体C5b-9。这些活化产物 激发多效的生物效果，诸如白细胞的趋化性，吞噬细胞、肥大细胞和嗜碱粒细胞的脱粒，平 滑肌收缩，脉管渗透性升高，和细胞裂解(Hugl i，Complement 1986，3:111)。补体活化产物 尤其通过吞噬细胞，还诱导有毒的氧自由基的生成，以及花生四烯酸代谢物和细胞因子的 合成和释放，这进一步放大炎症应答。
[0004] 尽管补体是针对病原微生物的防御的重要线路，它的活化也可能伤害其他健康的 宿主细胞。补体介导的组织损害在很多炎症性疾病中都起作用，这些炎症性疾病包括败血 症、免疫复合体病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和脉管炎、多发性创伤、几种神经病 (诸如多灶性运动神经病）、缺血-再灌注（I/R)损伤(诸如在心肌梗塞等的过程中出现的缺 血-再灌注（I/R)损伤）。补体活化在这些病症中的致病作用是它的活化产物的上述一种或 多种生物效果的结果。因此，抑制补体活化在这些病症中是有利的。
[0005] 可通过天然抑制因子，抑制补体的活化，其中天然抑制因子在上述级联的几个水 平上控制活化。这些抑制因子包括:C1_抑制因子，其抑制经典激活途径和凝集素激活途径 的活化的早期步骤;Η因子和C4结合蛋白，其分别使C3-转化酶和C4-转化酶解离，并且充当 降解C4b和C3b的I因子的辅因子;发挥与Η类似功能的调节膜蛋白CR1、DAF和MCP;以及，抑制 MAC的血衆蛋白玻连蛋白和凝聚素（clusterin)和膜蛋白CD59(Sahu et al.，Immunol Resl998，17:109;Campbell et al.，Annu Rev Immunoll988,6:161)。
[0006] 抑制补体活化是一有吸引力的治疗选择。实际上，已经生产出几种作为重组蛋白 的内源性可溶的补体抑制因子(C1-抑制因子;可溶的补体受体1或sCRl)，并且在临床研究 中进行了评价。另外，还评价了抑制级联反应中诸如C5的关键蛋白（Thomas et al.，Mol Immuno 1 1 996，33 : 1 389 )的抗体的给药。一种这样的抗体，Solirisg).或依库丽单抗 (eculizumab)，是抗C5的抗体。目前已批准使用所述抗体来治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿 症和非典型溶血性尿毒综合征。
[0007] 补体的作用是促进对入侵微生物的吞噬作用。因此，抑制炎症性疾病中的补体具 有提高感染风险的固有缺点。凝集素激活途径和替代激活途径的补体活化可通过微生物直 接活化，而经典激活途径通过与诸如微生物的抗原结合的IgG或IgM抗体活化。
【发明内容】
[0008] 本发明提供了一种与人类补体因子C2结合的结合分子。在一个实施方式中，所述 结合分子包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区：
[0009] (a)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序 列：SEQIDN0:2和SEQIDN0:3 ;SEQIDN0:2和SEQIDN0:96;SEQIDN0:10和SEQID N0:11 ;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQIDN0:27;SEQIDN0:97和SEQ ID N0:27; SEQ ID N0:34和SEQ ID N0:35;或者，SEQ ID N0:98和SEQ ID N0:35;或者
[0010] (b)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序 列：SEQIDN0:99和SEQIDN0:103 ;SEQIDN0:99和SEQIDN0:104;SEQIDN0:99和SEQ IDN0:105 ;SEQIDN0:9^PSEQIDN0:106;SEQIDN0:10(^PSEQIDN0:103;SEQIDN0: 100和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:105;SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:106; SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:103;SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:101和SEQ IDN0:105;SEQIDN0:101和SEQIDN0:106;SEQIDN0:102和SEQIDN0:103 ;SEQID NO:102和SEQ ID NO:104;SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:105;或SEQ ID NO:102和SEQ ID NO: 106;或者
[0011] (c)所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区包括在(a)和/或(b)中 具体限定的氨基酸序列，但是其中，所述序列中的一个或两者包括1~5个氨基酸替换。
[0012] Olglesby等人(J Immunol 1988,2:926)描述了一种C2特异性抗体。使用去糖基化 且变性的C2免疫小鼠，来鉴定出抗体。使用天然糖基化的C2进行免疫不产生适当的C2特异 性抗体。US2001/0026928中也记载了一种C2特异性抗体。其中开发的抗体针对C2的C2a亚组 分。其中没有公开所述抗体所识别的表位的进一步细节。
[0013] 本发明的结合分子在结合在C2上的表位是不同的。在本发明之前，并不知晓在C2 上存在更多失活表位。
[0014] 本发明的结合分子抑制补体活化，并且可用于治疗多种疾病。本发明提供了一种 预防或治疗由补体活化介导的疾病，所述方法包括将本发明的结合分子对有需要的个体给 药。本发明进一步提供本发明的结合分子，用于预防或治疗由经由经典激活途径和/或凝集 素激活途径的补体活化介导的疾病或障碍。
[0015] 这样的疾病的实例是炎症性疾病、神经疾病或缺血-再灌注（I/R)损伤。在本发明 的上下文中，优选的神经疾病是神经-炎症性疾病。本发明的结合分子不完全抑制补体。它 至少留下补体系统的一些能力，以抵御微生物入侵。本发明的结合分子至少使替代的补体 活化途径保持基本完整。本发明的结合分子这一特征普遍改善了本发明的补体抑制因子， 尤其是基于补体抑制因子的抗体的治疗适用性。根据本发明的治疗的优选实例是肾同种异 体移植的抗体介导的排斥、特发性膜性肾病、免疫溶血性贫血、免疫复合体病、缺血-再灌注 病症(诸如缺血-再灌注损伤）。本发明的结合分子是用于多种治疗性干预的有吸引力的选 择，因为它们有效限制体内补体系统的活性的结果，同时降低由于对微生物感染和/或增殖 的敏感性而产生的副作用的风险。
[0016] 在一个实施方式中，本发明的结合分子与C2a结构域的表位结合。本发明的C2a结 合分子有效抑制C2。尽管事实是这样的结合分子不完全抑制C1的剪切，但令人惊奇地是，它 们仍然是有效的。本发明的C2a结合分子使C2b与C4b的结合保持完整。尽管如此，本发明的 C2a结合分子显著抑制了 C2的活性。
[0017] 在一个实施方式中，本发明的结合分子与C2b结构域的表位结合。尽管事实是这样 的结合分子不完全抑制C1的剪切，但它们仍然是有效的。本发明的C2b结合分子使C2a与C4b 的结合保持完整。尽管如此，本发明的C2b结合分子显著抑制了 C2的活性
[0018] 在优选的实施方式中，本发明的结合分子与部分存在于C2a结构域上且部分存在 于C2b结构域上的表位结合。本发明的结合分子与单独的C2a和C2b结构域可检测地结合。尽 管事实是本发明的这样的C2a/C2b结合分子不完全抑制C1剪切，但令人惊奇地是，它们仍然 是有效的。尽管如此，本发明的C2a/C2b结合分子显著抑制了 C2的活性。
[0019] 本发明的结合分子优选是Fab片段、单链Fv(SCFv)片段，或抗体或其抗原结合片 段。
[0020] 如本文所使用的，术语"包括重链可变区和轻链可变区的结合分子"涵盖但并不限 于，抗体及其抗原结合片段。优选片段是Fab片段、scFv片段、单价抗体(unibody )、双价抗 体、三价抗体等。
[0021] 本发明的结合分子与人类C2结合。在SEQ ID:N0 1中给出了优选的人类C2的氨基 酸序列。结合分子优选与人类C2特异性结合。这意味着，在天然人的样品中，优选在人类血 浆的样品中，结合分子结合超过95 %、优选超过99%的人类C2，并且与血浆中的其他的人类 蛋白相比，对C2具有20nM或更小的亲和性。
[0022] C2的活化涉及蛋白剪切成较小的片段。通常将这些片段称为C2a片段和C2b片段。 在本发明中使用的术语是，C2a片段是较大的约70kDa的片段。C2a片段与C4b形成复合体，从 而形成C3-转化酶C4bC2a。这一复合体典型地是表面结合的。较小的约30kDa的N-末端C2b释 放到流体相中。
[0023] 如在本文中使用的，术语"C2活性"或诸如此类的描述指C2蛋白在补体活化级联中 的作用。当C2蛋白通过被C1进行蛋白剪切而活化，从无活性的前体酶转变成有活性的丝氨 酸蛋白酶时，C2蛋白是"有活性的"。有活性的C2与C4b作为辅因子能活化C3,而与C4b和C3b 作为辅因子能活化C5。
[0024] 如在本文中使用的，术语"C2抑制"或诸如此类的描述也指其在补体活化级联中的 作用。当C2活化信号（即C1)存在于它的环境中时，C2蛋白不执行其在级联中的作用以活化 补体时，C2蛋白被"抑制"。
[0025] 术语"抗体"指单克隆抗体和多克隆抗体。可从动物的血液制备抗体。目前，更普遍 是通过细胞来制备抗体，其中由所述细胞中的核酸表达该抗体。有可使用的多种细胞和细 胞系。杂交瘤细胞系普遍用于生产鼠类的单克隆抗体。随着重组DNA方式的到来，现今普遍 使用细胞系。优选的细胞系是PER. C6细胞系、CH0细胞系和NS0细胞系。上述抗体可以是单价 抗体、四价抗体或其他的多价抗体。典型地，上述抗体是如上所示的包括C2抗原结合位点的 单价抗体。
[0026] 在一个实施方式中，本发明的抗体是多特异性抗体。原型多特异性抗体是双特异 性抗体。多特异性抗体包括两个或更多个不同的抗原结合位点。在这样的多特异性抗体中， 本发明的结合分子提供抗原结合位点中的至少一个。至少一个其他的抗原结合位点是直接 针对C2上的不同表位的抗原结合位点，或者优选地，直接针对不同分子上的表位的抗原结 合位点。其他抗原结合位点优选是抗体可变区。本发明的双特异性抗体包括本发明的结合 分子，和对C2上的另一表位或不同分子上的表位具有特异性的至少一个其他的抗体可变区 (重链和轻链）。
[0027] 抗原结合片段(Fab片段)是抗体的与抗原结合的片段。它由所重链和轻链的每一 个的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。这些结构域形成抗原结合位点。两个可变结 构域与其特异性抗原上的表位结合。可在实验室中生成Fab片段。目前，可提供的有多种酶， 从抗体上切出所述片段。在本发明中，术语Fab片段涉及单一的可变结构域Fab片段和含有 两个可变结构域的F(ab'）2片段。术语Fab片段用于表示抗体分裂时的片段，以及由细胞表 达，从一个或多个编码区直接产生类似的片段。
[0028] 如本文所使用的，术语"单链Fv"（也称为scFv)指，通过分离结合抗体的结合结构 域(重链和轻链），并且补充允许保持结合功能的连接部分的经改造的抗体。这基本上形成 极端缩小的抗体，仅具有结合抗原所需的超变结构域的一部分。在例如US专利号4，946，778 (Ladner et al)中记载了单链抗体的测定和构建。
[0029] 如本文所使用的，术语"KD" (M)用于指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0030] 分别具体为SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3的重链可变区和轻链可变区，是抗体 5F2.4的重链可变区和轻链可变区。分别具体为SEQ ID N0:10和SEQ ID N0:11的重链可变 区和轻链可变区，是抗体13的重链可变区和轻链可变区。分别具体为SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的重链可变区和轻链可变区，是抗体32的重链可变区和轻链可变区。分别具体为 SEQ ID N0:26和SEQ ID N0:27的重链可变区和轻链可变区，是抗体35的重链可变区和轻链 可变区。分别具体为SEQ ID N0:34和SEQ ID N0:35的重链可变区和轻链可变区，是抗体60 的重链可变区和轻链可变区。具体为SEQ ID N0:96的轻链可变区，是抗体5F2.4的轻链可变 区的小鼠共有氨基酸序列。具体为SEQ ID N0:97的重链可变区，是抗体35的重链可变区的 小鼠共有氨基酸序列。具体为SEQ ID N0:98的重链可变区，是抗体60的重链可变区的小鼠 共有氨基酸序列。SEQ ID N0:99-102是5F2.4的人源化轻链可变区VL1-4的氨基酸序列。SEQ ID N0:103-106是5F2.4的人源化重链可变区VH1-4的氨基酸序列。SEQ ID N0:107-110是编 码含人源化￥1^1，1^4的人源化1〇轻链5?2.4的〇0嫩序列(^〇10勵 ：111-114是编码含人源化 VH1-VH4的人源化IgG4链5F2.4的cDNA序列。SEQ ID N0:115-118是编码含人源化VL1-VL4的 人源化κ轻链5F2.4的氨基酸序列。SEQ ID N0:119-122是编码含人源化VH1-VH4的人源化 IgG4链5F2.4的氨基酸序列。
[0031] 本发明的结合分子中的免疫球蛋白的轻链可变区或重链可变区可具有:有1~5个 氨基酸替换的SEQ ID 勵：2、3、10、11、18、19、26、27、34、35、96-106和115-122的氨基酸序 列。具有上述经替换的重链可变区、经替换的轻链可变区或两者的本发明的结合分子，在种 类上(但不必在数量上)具有相同的C2抗原结合特征。所述结合分子结合至与原始结合分子 相同的表位。1~5个氨基酸替换能生成结合分子的去免疫化形式。典型地，可通过对重链的 最多5个位置、轻链的最多5个位置或两者进行改变，来实现用于人类受试者的去免疫化。鼠 类可变区的去免疫化是已建立好的技术，总是产生在人体内诱导免疫应答的可能性减小的 结合分子。实现这一结果所需的氨基酸替换的数量典型地在每一条链中小于5。与未经改变 的序列相比，每一条链中1、2或3个氨基酸替换常常就足以获得本发明在人体内诱导免疫应 答的可能性减小的结合分子。
[0032]在优选的实施方式中，本发明的抗体是人类抗体或人源化抗体。如本文所使用的， 术语"人类抗体"用于包括，具有来源于人种系的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗 体。人类抗体可包括，不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外的随 机或位点特异性诱变或通过体内的体细胞突变引入突变。
[0033] 如本文所使用的，术语"人源化抗体"指免疫球蛋白或经改造的抗体构建体的构架 区的至少一部分来源于人类免疫球蛋白序列。应当清楚的是，可使用使抗体或抗体构建体 人源化的任意方法，例如通过可变结构域的表面重塑(resurfacing) (Roguska et al.， Proc Natl Acad Sci U S A1994,91:969)或CDR嫁接或重构（Hurle et al.，Curr Opin Biotechnol 1994，5 :428)。在别的人类抗体构架背景中，人源化抗体优选包括抗体5F2.4、 13、32、35或60的⑶R区。因此，本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID N0:4-6的CDRl-3序列的人类重链可变区，和具有SEQIDN0:7-9的CDRl-3序列的人类轻链 可变区。当然嫁接的⑶R序列被适当放置，即SEQ ID NO:4的重链可变区的⑶R1区代替人类 抗体的重链可变区的⑶R1区，用于嫁接加工。SEQ ID N0:5的⑶R2区代替所述人类抗体的重 链可变区的CDR2区，等等。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID N0: 12-14的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID勵:15-17的0?1-3序列的人类轻链 可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具有SEQ ID NO:20-22的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID NO:23-25的CDR1-3序列的人 类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体包括具 有SEQ ID N0:28-30的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID N0:31-33的CDR1-3序 列的人类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。本发明还提供了一种人类抗体，该人类抗体 包括具有SEQ ID NO:36-38的CDR1-3序列的人类重链可变区，和具有SEQ ID NO:39-41的 CDR1-3序列的人类轻链可变区。CDR区再次被适当放置。
[0034] 在优选的实施方式中，在包括抗体5F2.4的CDR的人类抗体中，人源化轻链可变区 包括任选经1~5个氨基酸替换的SEQ ID N0:99、100、101或102的序列。在优选的实施方式 中，在包括抗体5F2.4的CDR的人类抗体中，人源化重链可变区包括任选经1~5个氨基酸替 换的SEQ ID从):10 3、104、105或106的序列。如果有的话，氨基酸替换不在0)1?区内。
[0035]在优选的实施方式中，包括抗体5F2.4的⑶R的人类抗体包括，任选经1~5个氨基 酸替换的SEQ ID勵：115、116、117或118的人源化1〇轻链。所述氨基酸替换，如果有的话，不 在CDR区内。在优选的实施方式中，包括抗体5F2.4的CDR的人类抗体包括，任选经1~5个氨 基酸替换的SEQ ID勵：119、120、121或122的人源化1864链。所述氨基酸替换，如果有的话， 不在⑶R区内。
[0036]如本文所使用的，术语"嵌合抗体"指经改造的抗体构建体，由可以是经去免疫化 的、人源化的或非人源化的一种物种的可变结构域(诸如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、羊驼 (lama)或骆驼的可变结构域），和另一物种的恒定结构域(诸如非人灵长类恒定结构域或人 类恒定结构域)构成(综述参见Hurle et al.，Curr Opin Biotechnoll994,5:428)。应当清 楚的是，可使用本领域已知的开发嵌合抗体或抗体构建体的任意方法。
[0037]如本文所使用的，术语"去免疫化的"或"去免疫化"指本发明的结合分子中T细胞 表位的鉴定及随后的去除。典型地，尽管不一定必要，但在本发明的抗体的可变区中进行。 经常，但不总是必要，在构架区中进行，因此在⑶R区外进行。典型地，通过替换编码T细胞表 位的一个或多个氨基酸，来实现T细胞表位的去除。从而使序列变成与T细胞表位不同的序 列。去免疫化的可变区典型地包含1~5个氨基酸替换。选择替换的氨基酸，以便可变区的三 级结构不发生显著改变。因此，替换的氨基酸典型地选自相同组的氨基酸（即中性氨基酸、 带正电荷氨基酸、带负电荷氨基酸、亲脂性氨基酸）。当在相同组中可用时，氨基酸被替换成 在结构上接近的人类抗体的可变区中相同或类似位置处的氨基酸。
[0038]本发明的结合分子优选是人源化或去免疫化的抗体。
[0039] 本发明的抗体优选是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体，诸如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗 体。
[0040]在优选的实施方式中，本发明的抗体的恒定区是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体，诸 如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4抗体的恒定区。上述恒定区可包括改变，诸如氨基酸替换，以赋予 恒定区特定的特性。例如，IgG4铰链区的突变使得抗体更稳定，有助于半分子的交换。其他 改变影响抗体的半衰期，添加或去除糖基化位点，提高生产，改善在大规模发酵罐中产生的 抗体产物的均一性，等等。
[0041 ]与天然存在的抗体相比，抗体的轻链或重链的整个恒定部分可包括0~5个氨基酸 替换。在一些实施方式中，重链或轻链的恒定部分含有1~3个氨基酸替换。恒定区中的氨基 酸替换优选不使用相同组（即中性氨基酸、带正电荷氨基酸、带负电荷氨基酸、亲脂性氨基 酸)的氨基酸进行。
[0042]在优选的实施方式中，抗体的恒定区是人类抗体的恒定区。在优选的实施方式中， 本发明的抗体包括以下氨基酸序列：SEQIDN0:53和SEQIDN0:54;SEQIDN0:55和SEQ IDN0:56 ;SEQIDN0:57和SEQIDN0:58;SEQIDN0:57和SEQIDN0:59;SEQIDN0:60和 SEQ ID N0:61;或者，SEQ ID N0:62和SEQ ID N0:63;其中，当被替换时，所述序列之一或二 者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换。如本文的其他部分所示，氨基酸替换 优选在恒定区或可变区的构架区内。
[0043]在优选的实施方式中，上述抗体是人类抗体或人源化抗体。在优选的实施方式中， 本发明的抗体包括以下氨基酸序列：
[0044] -SEQ ID N0:99,和氨基酸序列SEQ ID N0:103、104、105或106中的一条，其中所述 序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换；
[0045] -SEQIDN0:100，和氨基酸序列SEQIDN0:103、104、105或106中的一条，其中所 述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换；
[0046] -SEQIDN0:101，和氨基酸序列SEQIDN0:103、104、105或106中的一条，其中当 被替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换;或者
[0047] SEQIDN0:102，和氨基酸序列SEQIDN0:103、104、105或106中的一条，其中当被 替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换。所述氨基 酸替换，如果有的话，不在CDR区内。
[0048] 在优选的实施方式中，本发明的抗体包括以下氨基酸序列：
[0049] -SEQIDN0:115，和氨基酸序列SEQIDN0:119、120、121或122中的一条，其中当 被替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换；
[0050] -SEQIDN0:116，和氨基酸序列SEQIDN0:119、120、121或122中的一条，其中当 被替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换；
[0051 ] SEQ ID N0:117,，和氨基酸序列SEQ ID N0:119、120、121 或 122中的一条，其中当 被替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换;或者
[0052] SEQIDN0:118，和氨基酸序列SEQIDN0:119、120、121或122中的一条，其中当被 替换时，所述序列之一或二者包括0~5个氨基酸替换，优选1、2或3个氨基酸替换。如果有的 话，氨基酸替换不在CDR区内。如本文的其他部分所示，氨基酸替换优选在恒定区或可变区 的构架区内。
[0053] 本发明进一步提供了一种包括以下氨基酸序列的抗体：（b)SEQ ID N0:115和SEQ IDN0:119;SEQIDN0:115和SEQIDN0:120;SEQIDN0:115和SEQIDN0:121 ;SEQID NO:115和SEQ ID NO:122;
[0054] SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:119;SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:120;SEQ ID NO: 116和SEQ ID NO:121;SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:122;
[0055] SEQIDN0:117和SEQIDN0:119;SEQIDN0:117和SEQIDN0:120;SEQIDN0: 117和SEQ ID NO:121;SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:122;
[0056] SEQIDN0:118和SEQIDN0:119;SEQIDN0:118和SEQIDN0:120;SEQIDN0: 118和SEQ ID N0:121;或者SEQ ID N0:118和SEQ ID N0:122;或者在（b)中指定的氨基酸序 列，但是其中所述序列之一或二者包括1~5个氨基酸替换。所述氨基酸替换（如果有的话） 不在⑶R内。
[0057]本发明的抗体优选是：鼠类IgGl或IgG2a;人类IgGl，在恒定区中发生突变，以降低 或防止补体活化或Fc受体的相互作用;或者人类IgG4;或者人类IgG4，发生突变以防止与其 他IgG4分子的半分子交换，和/或在恒定区中发生突变以降低或防止Fc受体的相互作用。
[0058] 在一些实施方式中，本发明的抗体包括两个不同的重链恒定区和或不同的轻链恒 定区。典型地，尽管不是必要的，不同的恒定区彼此在不超过5个氨基酸位置，优选在不超过 1~3个氨基酸位置上是不同。这是在本领域中使用的特性，以产生例如双特异性抗体，和/ 或为抗体提供进一步特性。
[0059] 本发明的抗体的恒定区优选是人类恒定区，优选是一种天然存在的人类抗体的恒 定区。
[0060] 本发明进一步提供了编码本发明所述的结合分子或抗体的核酸分子。本发明进一 步提供了编码本发明的CDR的核酸。优选编码抗体5F2.4、抗体13、抗体32、抗体35或抗体60 的可变轻链或可变重链的所有⑶R。所述核酸优选包括以下核酸序列：SEQ ID N0:42;SEQ ID N0:43；SEQ ID N0:44；SEQ ID N0:45；SEQ ID N0:46；SEQ ID N0:47；SEQ ID N0:48；SEQ ID N0:49；SEQ ID N0:50；SEQ ID N0:51；SEQ ID N0:52；SEQ ID N0:107；SEQ ID N0:108； SEQ ID N0:109;SEQ ID N0:110;SEQ ID N0:111;SEQ ID N0:112;SEQ ID N0:113;或者SEQ ID NO: 114。上述核酸分子可用于产生本发明的结合分子。提供有上述核酸的细胞系可在实 验室或生产工厂中生产结合分子/抗体。或者，将上述核酸转染到有需要的动物体内的细胞 中，并且由被转化的细胞体内产生结合分子/抗体。典型地，向本发明的核酸分子提供调节 序列，以在细胞中表达所述结合分子。但是，现今，同源重组技术的效率已经提高了很多。这 些技术包括例如使用诱导核酸酶(诸如TALEN)的位点特异性双链断裂的，双链断裂辅助的 同源重组。这样的或类似的同源重组系统可将核酸分子插入到提供一条或多条所需的顺式 调节序列的区域内。
[0061] 本发明进一步提供了包括根据本发明的核酸分子的基因递送剂或载体。所述基因 递送剂或载体可以是质粒，或其他细菌复制的核酸。这样的基因递送剂或载体可被容易地 转染至例如生产细胞中。上述基因递送剂或载体也可以是病毒载体。优选的病毒载体是腺 病毒载体、慢病毒载体、腺相关的病毒载体和逆转录病毒载体。
[0062] 本发明进一步提供了一种分离或重组的细胞，或体外细胞培养物，该细胞包括本 发明的核酸分子或载体。本发明进一步提供了一种分离或重组的细胞，或体外细胞培养物， 该细胞包括本发明的结合分子，并且优选包括本发明的抗体。优选地，所述细胞产生所述结 合分子或抗体。在优选的实施方式中，所述细胞是杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CH0)细胞、 NS0细胞或PER-C6?细胞。在特别优选的实施方式中，上述细胞是CH0细胞。本发明进一步提 供了一种包括本发明细胞的细胞培养物。多家机构和公司已经开发出用于大规模生产抗 体，例如用于临床应用的细胞系。这样的细胞系的非限制性实例是CH0细胞、NS0细胞或 PER. C6?细胞。这些细胞还用于其他目的，诸如生产蛋白。本文中，将针对蛋白和抗体的工业 规模生产所开发的细胞系进一步称为工业细胞系。本发明提供了一种包括本发明所述的核 酸分子、结合分子和/或抗体的工业细胞系。本发明还提供了一种针对包括本发明的结合分 子或抗体的蛋白和/或抗体的大规模生产所开发的细胞系。本发明还提供了针对本发明的 结合分子和/或抗体的大规模生产所开发的细胞系的应用。
[0063] 本发明进一步提供了一种产生本发明的结合分子或抗体的方法，该方法包括培养 本发明的细胞，并且从所述培养物中收获所述抗体。优选地，将所述细胞培养在无血清的培 养基中。优选地，所述细胞适于悬浮生长。进一步提供了一种通过用于生产本发明的抗体的 方法获得的抗体。优选从培养物的培养基中纯化抗体。优选对抗体进行亲和纯化。
[0064]本发明的细胞例如是杂交瘤细胞系、CH0细胞、NS0细胞或另一已知适用于临床目 的的抗体生产的细胞类型。在特别优选的实施方式中，所述细胞是人类细胞。优选地，通过 腺病毒E1区或其功能等价物，转化细胞。这样的细胞系的优选实例是PER.C6?细胞系或其等 价物。在特别优选的实施方式中，上述细胞是CH0细胞或其变体。优选地，该变体使用谷氨酰 氨合成酶(GS)载体细胞来表达抗体。
[0065] 因此，本发明进一步提供了一种产生结合分子的方法，其特征在于，产生本发明的 结合分子或本发明的抗体。优选地，上述方法进一步包括收集所述结合分子和/或抗体。
[0066] 本发明进一步提供了本发明的结合分子或抗体，用于治疗患补体活性过量或过度 活跃的个体。该治疗能减轻所述个体的与补体活性过量或过度活跃相关的至少一种症状。
[0067] 当在本文中使用时，术语"个体"指动物，优选指哺乳动物。在优选的实施方式中， 所述个体是灵长目动物，所述个体更优选是人。
[0068] 本发明进一步提供了本发明的结合分子或抗体，用于治疗患炎症性疾病、神经疾 病或缺血-再灌注(I/R)损伤，或有患这些疾病的风险的个体。这样的治疗能减轻与炎症、神 经-炎症性疾病或缺血-再灌注损伤相关的至少一种症状，诸如肾功能障碍或心肌功能障 碍、溶血危象和肌无力。
[0069] 本发明进一步提供了用于本发明的应用的结合分子或抗体，其中，所述个体患抗 体介导的炎症或缺血-再灌注损伤，诸如急性心肌梗塞、中风、败血症、免疫复合体病如类风 湿性关节炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、多发性创伤、多灶性运动神经病、肾同种异体移植的 抗体介导的排斥、（自体)免疫溶血性贫血、心肺转流术和其他脉管手术、特发性膜性肾病、 肺出血性肾炎综合征，等等。
[0070] 本发明还提供了一种包括本发明的结合分子或抗体，以及药学上可接受的载剂的 药物组合物。
[0071] 人类补体的第二组分(C2)是参与补体活化的经典激活途径和凝集素激活途径的 90~1 OOkDa的糖蛋白。可通过经典激活途径的Cls或凝集素激活途径的MASP2，使C2活化。C2 与表面结合的C4b(在Mg2+的存在下)结合，以形成C4bC2复合体，然后C4bC2复合体被活化的 Cls或MASP2剪切成两个片段:较大的70kDa片段C2a，该C2a与C4b保持连接以形成C3-转化酶 C4bC2a;较小的30kDa N-末端片段C2b，该C2b被释放到流体相中。C2a-旦被活化并且与C4b 结合，则构成能分别剪切C3和C5的C3/C5转化酶的催化亚基。
[0072] 和很多其他的血衆蛋白一样，C2具有模块结构(modular structure)。从它的N末 端开始，C2由三个补体控制蛋白（CCP1-3)模块(也被称为为短共有重复序列（SCR)或苏氏-结构域重复序列（sushi-domain repeats))，含有金属离子依赖性粘附位点的A型血管假性 血友病因子（vWFA)结构域，和丝氨酸蛋白酶（SP)结构域构成（Arlaud et al.，Adv Immunoll998，69:249)。电子显微镜研究显示，C2由三个结构域组成。三个CCP模块(CCP1-3) 一起形成N-末端结构域，这对应于C2b。vWFA结构域构成第二结构域，并且SP结构域组成第 三结构域。第二结构域和第三结构域一起构成所述分子的较大的C2a部分。
[0073] CCP模块是在许多蛋白中都出现的常见的结构基元。这些球状单元由大约60个氨 基酸残基组成，并且折叠成围绕四个不变的二硫键结合的半胱氨酸残基形成的、紧凑的6~ 8股的β-片状结构(Norman et al.，J Mol Biol 1991，219:717)。邻近的CCP模块通过保守 性差的接头共价连接。
[0074] 通过两个低亲和性位点，一个在C2b(Xu&Volanakis，J Immunol 1997，158:5958)并 且另一个在C2a的vWFA结构域上（Horiuchi et al ·，J Immunoll991,47: 584)，介导C2与表 面结合的C4b的初始结合。尽管将C2b和C2a的晶体结构确定至Lgl的分辨率(Milder et al.,Structure2006,14:1587；Krishnan et al.,J Mol Biol 2007,367:224；Krishnan et al.，Acta Cristallogr D Biol 0^8七&11〇8『2009,065:266)，但构成〇2上的〇4和〇3接触位 点的氨基酸的精确拓扑学和结构还是未知的。因此，仍然需要确立C2中参与与C4相互作用 的氨基酸残基（Krishnan et al.，Acta Cristallogr D Biol Crystallogr2009，D65: 266)。
[0075] 针对位于C2b上的表位的单克隆抗体3A3.3，抑制C2与C4b的结合（Oglesby et al.，J Immunol 1988，2:926)，这表明在C2b上存在C4b-结合位点。US2011/0165169A1 中公 开了抑制C2活性的针对C2的C2a部分的mAb。公共领域中还没有报道，这些mAb的表位的氨基 酸序列。因此，仍然需要鉴定出人类C2中参与C2与C4b结合的氨基酸序列。
[0076] 本发明提供了能通过阻断C2的活性，经由经典激活途径和/或凝集素激活途径来 抑制补体活化的结合分子。所述结合分子优选是与C2上的特定表位特异性结合的，人类或 人源化的mAb或其结合片段。在优选的实施方式中，所述表位是功能性表位。本发明的结合 分子防止生成C2下游的C3a、C3b和其他补体活化产物。本发明的结合分子抑制性抗体诱导 的补体膜攻击复合体的形成，从而保护被这些抗体敏化的细胞不会受到补体介导的损害 (诸如裂解）。因此，本发明的结合分子适用于治疗个体，该个体中，需要抵制给药的抗体或 自体抗体的补体活化介导的效果。在本上下文中，自体抗体是由个体自身生成和产生的抗 体。
[0077] 本发明的结合分子抑制至少50%的通过（自体)抗体所引起的经典激活途径的活 化。优选地，经典激活途径的活化被抑制70%、更优选90%、更优选至少95%。对于经典激活 途径的活性的计算，参考在Palarasay et al · (Clin Exp Immunol 2011，164:388)中记载 的补体活性测定，或参考确定CH50滴度的测量。将不存在本发明的结合分子的情况下的，经 典激活途径的活性设定为100%。
[0078] 本发明的结合分子通过CRP或识别与损害相关的分子模式的其他分子抑制至少 50%的补体的活化。优选地，凝集素激活途径的活化被抑制70%、更优选90%、更优选至少 95%。对于凝集素激活途径的活性的计算，参考Palarasay et al. (Clin Exp Immunol 2011，164: 388)。将不存在本发明的结合分子的情况下的，凝集素激活途径的活性设定为 100%〇
[0079] 本发明的结合分子不显著抑制补体活化的替代激活途径的活化。对于替代激活途 径的活性的计算，参考如在Palarasay et al · (Clin Exp Immunol 2011，164:388)中记载 的活性测定，或参考AP50活性的确定。将不存在本发明的结合分子的情况下的，替代激活途 径的活性设定为100%。如果在存在饱和量的结合分子的情况下，替代激活途径的活性降低 不超过20%，则C2结合分子不显著抑制或基本不抑制该途径。
[0080] 因为本发明示出了本发明的结合分子的有利性质，因此本领域技术人员能够开发 出与同一表位结合的其他结合分子。因此，本发明还提供了与C2结合的且阻断抗体结合的 结合分子，所述结合分子包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，分别包括 以下氨基酸序列：SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3;SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:96;SEQ ID N0: 10和SEQIDN0:11;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQIDN0:27 ;SEQID N0:97和SEQIDN0:27;SEQIDN0:34和SEQIDN0:35 ;或者，SEQIDN0:98和SEQIDN0: 35。本发明进一步提供了本发明的结合分子的应用，优选用于在许多结合分子中鉴定出本 发明的结合分子的抗体的应用，该抗体包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变 区，分别包括以下氨基酸序列：SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3;SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:96; SEQIDN0:10和SEQIDN0:11;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQID N0:27 ;SEQIDN0:97和SEQIDN0:27;SEQIDN0:34和SEQIDN0:35;或者，SEQIDN0:98 和SEQ ID N0:35。被鉴定的结合分子的特征优选是，序列是由结合分子和/或编码所述结合 分子的核酸序列决定。这样能进行结合分子的生产，并且进一步使用所述结合分子。
[0081] 本发明还提供了一种鉴定根据本发明的结合分子的方法，该方法包括以下步骤： 在本发明的已知结合分子存在和不存在的情况下，测试包括重链和轻链可变区的测试结合 分子与C2的结合能力。当不存在本发明的已知结合分子的情况下，测试结合分子与C2结合， 而当C2与本发明的已知结合分子预孵育时，结合至少50%或更少的C2,则鉴定该测试结合 分子为本发明的结合分子。
[0082]本发明进一步提供了与C2结合，且识别C2a上的表位和C2b上的表位的结合分子。 所述抗体优选包括相同的抗原结合可变区。本发明进一步提供了与C2结合，且单独与C2a和 C2b结合的结合分子。为了这一实施方式的目的，通过凝胶电泳查看经Cls消化的C2的大小 成分，其中足以使两个片段彼此分离，以查看泳道中分别代表C2a和C2b片段的条带。
[0083]本发明的结合分子、优选二价单克隆抗体与C2结合的解离常数(KD)小于10e_7M， 优选小于l〇e_8M，优选小于10e_9M，更优选小于10e-10M，并且更优选小于10e-llM。
[0084] 本发明的结合分子可用于抑制经典激活途径和/或凝集素激活途径的活化。这反 过来抑制个体血浆或体内或其他补体功能性系统中，具有生物活性的补体来源的肽(诸如 C4a和0仙、03&、0313、05&等等）的生成。上述结合分子至少部分防止在细胞和组织上的这些 补体来源的肽的损害影响。本发明的结合分子可用于制备药剂，该药剂用于通过抑制体内 补体活化，来减轻人类疾病的临床征象和症状。mAb分子可单独使用或与另一药物组合，用 于治疗补体介导的疾病或症状。
[0085] 本发明的方法或结合分子可治疗或预防的疾病优选是自体免疫疾病，诸如实验性 变态神经炎、II型胶原诱导型关节炎、重症肌无力、溶血性贫血、血管球性肾炎、特发性膜性 肾病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、免疫复合体诱导的脉管炎、成人呼吸窘迫综合征、 中风、异种器官移植、多发性硬化症、烧伤、体外透析和血氧合、炎症性障碍(包括败血症和 感染性休克）、由体内给药细胞因子或mAb而引起的毒性、同种异体移植(诸如肾同种异体移 植)的抗体介导的排斥、多发性创伤、缺血-再灌注损伤、心肌梗塞。
[0086] 将本发明的结合分子对有需要的个体给药，可治疗患有涉及补体介导的损害的疾 病或具有发展出这样的补体介导的损害的风险的个体。因此，在该个体中降低生物活性的 补体来源的肽，并且减轻或防止补体对细胞和组织的溶胞作用和其他有害影响。"有效量" 指本发明的结合分子能够抑制个体内的补体活化的量。
[0087] 治疗（treatment)(预防（prophylactic)或治疗（therapeutic))通常由肠道外给 药，优选静脉或皮下给药本发明的结合分子与药学载剂组成。本发明的结合分子的剂量和 给药方案应依赖于所针对的补体活化的抑制程度。典型地，本发明的为抗体的结合分子的 量应在每千克体重2mg~20mg的范围内。对于肠道外给药，应将上述结合分子与药学上可接 受的肠道外递送剂组合，配制成可注射的形式。这样的递送剂是本领域公知的，并且实例包 括盐水、葡萄糖溶液、林格氏溶液和含少量人血清白蛋白的溶液。
[0088] 典型地，本发明的结合分子应被配制为约20mg/ml~约100mg/ml的浓度。在本发明 的一个实施方式中，所述结合分子通过静脉注射给药。
[0089] 应理解的是，在本发明的范围内，包括给药如在本发明所述的mAb或其片段的几乎 所有方法，以在循环中或局部产生足够高的水平。
[0090] 根据常规技术，诸如在（Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co·,Easton,PA, 1995)中公开的技术，可将 本发明的药物组合物与药学上可接受的载剂或稀释剂，以及任何其他已知的佐剂和赋形剂 配制在一起。
[0091] 术语"药学上可接受的载剂"涉及自身没有毒性的载剂或赋形剂。这样的赋形剂的 实例是，但并不限于，盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克氏溶液(Ha n k ' s s ο 1 u t i ο η)。也 可使用无水赋形剂，诸如固定油和油酸乙酯。
[0092]上述药物组合物优选肠道外给药，优选通过静脉注射或皮下注射或输注的方式给 药。
[0093]如本文所使用的，词语"肠道外给药"或"肠道外给药的"指除了肠内和局部给药之 外的给药模式，通常指注射给药，包括但并不限于：静脉内、肌内、动脉内、鞘内 (intrathecal)、囊内（intracapsular)、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮 下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内的注射和输注。
[0094] 药物组合物典型地必须是无菌的，并且在制造和储存条件下是稳定的。上述组合 物可被配制成溶液、微乳液、脂质体，或其他适于高药物浓度的有序结构。可在本发明的药 物组合物中使用的适当的水性载剂和无水载剂的实例包括，水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙 二醇、聚乙二醇等），及其适当的混合物，植物油，诸如橄榄油，以及可注射的有机酯，诸如油 酸乙酯。可例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂）、通过在分散剂的情况中维持所需的粒径、 以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。
[0095] 药物组合物还可包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过消毒程序， 以及包含有各种抗菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金(paraben)、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可确 保防止微生物的存在。在该组合物中，也可期望包括等渗性试剂(诸如糖），多元醇(诸如甘 露醇、山梨醇、甘油或氯化钠）。也可包括药学上可接受的抗氧化剂，例如：（1)水溶性抗氧化 剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；（2)油溶性抗氧化 剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、叔丁基羟基茴香醚(BHA)、丁羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸 丙酯、生育酚等；以及（3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石 酸、磷酸等。
[0096] 可通过将所需量的mAb并入到具有例如如上枚举的成分的一种或组合的合适的溶 剂中，如果需要，再进行消毒微过滤，来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物并入 到，含基础分散介质和所需其他成分(例如来自上述成分)的无菌递送剂中，来制备分散剂。 在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥 (冻干法），这些方法产生活性成分加上来自预先进行了无菌过滤的溶液的任何额外期望成 分的粉末。
[0097] 可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，从而延长可注 射性抗-C2的mAb或其片段的吸收。
[0098] 可使用能保护化合物不会快速释放的载剂，诸如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂 和微囊化的递送系统，来制备mAb或其片段。可使用可生物降解的、生物相容性的聚合物，诸 如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的方法对 于本领域技术人员来说通常是已知的。参见例如持久的和控释药物递送系统（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，J.R.Robinson编辑，马塞尔·德克公 司（Marcel Dekker, Inc.)，纽约（New York)，1978。
[0099] 上述药物组合物可使用本领域已知的医疗装置进行给药。
[0100] 对给药方案进行调节，以提供最优化的期望应答(例如治疗反应）。例如，可给药单 一的大丸药，可在一段时间中给药几个分开的剂量，或根据治疗状态的紧迫性所示，可成比 例地降低或增加剂量。
[0101] 在本发明的药物组合物中的mAb或其片段的实际剂量水平可能是有变化的，以获 得能对特定患者有效实现期望的治疗反应，而不会为该患者带来毒性的一定量的活性成 分。
[0102] 在一个实施方式中，本发明的结合分子，尤其是抗体，可以10~500mg/m2,诸如200 ~400mg/m 2的周剂量，通过输注进行给药。这样的给药可重复如1~8次，诸如3~5次。可在2 ~24小时，诸如2~12小时的时间段中，通过持续输注进行给药。
[0103] 在又一实施方式中，mAb或其片段或任何其他在本发明中公开的结合分子，可通过 维持治疗进行给药，例如在6个月或更长的时间段中一周给药一次。
[0104] 现在，将参考下面给出了特别有利的实施方式的实施例，来对本发明进行说明。但 是，应注意，这些实施方式仅是说明，并不构成对本发明的任何限制。
【附图说明】
[0105] 图1:野生型重组人类C2(泳道1)和去糖基化的重组人类C2(泳道2)、Cls剪切的C2 (泳道3)和去糖基化的Cls剪切的C2(泳道4)的非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳（SDS-PAGE)。以Cls与C2的比率为1:25,进行Cls剪切。使用考马斯亮蓝，使未经处理和经 处理的C2可视化。箭头指示了糖基化C2( ? lOOkDa)、糖基化C2a( ? 70kDa)和糖基化C2b( ? 30kDa)。还示出了MW标记物的位置。*表示PNGase酶。
[0106] 图2:筛选抗-C2的mAb的抑制活性的ELISA的原理。注意，抑制mAb对C4结合没有影 响，但是会减少C3与固相上的凝集的IgG的结合。
[0107] 图3:抗-C2的杂交瘤上清液的抑制活性的筛选结果的实例。阳性对照是没有杂交 瘤上清液的稀释的血清。阴性对照是具有EDTA，但没有杂交瘤上清液的稀释的血清。X轴上 的数字指杂交瘤的编号。箭头指示在抗-C2的ELISA中为阴性，且作为对照测试的杂交瘤上 清液。
[0108] 图4:小鼠抗人类补体C2的抗体，与低包被(25ng/孔，灰色符号）或高包被(200ng/ 孔，黑色符号）的重组人类补体C2的结合。结果(在450nm处的吸光度)是平均值土SD，n = 2。
[0109] 图5:小鼠抗-C2的mAb与野生型重组人类C2(A)或Cls剪切的重组人类C2(B)的结 合。将蛋白混合物包被在ELISA板上，并且与多种浓度的抗-C2的mAb孵育。结果(在450nm处 的吸光度)是平均值土 SD，η = 2。
[0110]图6:纯化的小鼠抗-C2的mAb，对C3固定至固相凝集的IgG的抑制。一个体积的新鲜 人类血清与一个体积的具有所示浓度的mAb孵育，稀释并且进行测试。虚线表示在不存在 mAb(上线)和存在EDTA(下线）的情况下的固定水平。
[0111] 图7 :抗-C2的mAb对C3被人类血清中的凝集IgG活化的影响。一个体积的血清与一 个体积的mAb (0.48mg/ml)混合，然后与lmg/ml的凝集的I gG孵育。使用如在方法中所述，使 用ELISA测量活化的C3。将结果表示为任意单位(AU)/ml。
[0112] 图8:在同种异体移植排斥的人类离体模型中，抗-C2的mAb对抗-HLA的抗体的补体 依赖性细胞毒性的影响。具有抗-HLA的抗体的ΙμL血清，与ΙμL PBMC悬浮液（2-5xl06个细 胞/ml)在室温孵育1小时。同时，5μ1新鲜的正常血清，与15μ1 VB和5μ1含抗-C2的mAb的VB在 室温孵育20分钟。各10μ1样品与PBMC混合物在室温孵育2小时。使用Fluoroquench测量细胞 毒性，并且通过显微镜测定细胞毒性。细胞毒性分数"0"指细胞没有裂解，而当>80 %的细胞 被裂解时，则给出分数8。使用没有抗-C2的mAb的新鲜血清作为阳性对照，EDTA作为阴性对 照。在该图中没有示出MAb 5F2.4，但MAb 5F2.4在该测定中也具有抑制效果。MAB抗-C2-79 在该测定中也降低细胞毒性，但在其他测定中没有抑制效果。
[0113] 图9:使用野生型重组人类C2和Cls剪切的重组人类C2进行蛋白印记，定位C2a或 C2b上由抗-C2的mAb识别的表位。箭头指示C2( ? 100kDa)、C2a( ? 70kDa)和C2b( ? 30kDa)。 使用 lOOng/ml (抗-C2-5F2 · 4和-35)或 200ng/mL(抗-C2-13、-32和-60)抗-C2 的mAb，进行检 测。
[0114] 图10:如在ELISA中测定的，抗-C2的mAb与经大小排阻层析纯化的重组人类C2a的 结合(A)，抗-C2的mAb5F2.4与去糖基化的（非变性/非还原)重组C2的结合(B)，与变性(非还 原）或还原(变性）的重组人类C2的结合(C)。结果(在450nm处的吸光度)是平均值±30，11 = 2〇
[0115] 图11:抑制性抗-C2的mAb防止C2在补体活化过程中的剪切。具有10μ1抗-C2的mAb (0·48mg/ml)的10μ1血清，与10μ1凝集IgG(lmg/ml)孵育，并且在7· 5%SDS-PAGE上进行分 离。对样品进行印记，并且与生物素化的抗-C2-5F2.4(与天然C2和C2b结合)孵育，以测定C2 的剪切。指示分子量标记物(M)的位置。如通过抗-C25F2.4mAb进行可视化，箭头指示C2和 C2b的位置。C指示与凝集IgG孵育的血清，其中没有添加抗42。以6指示在多克隆人类IgG (0.48mg/ml)的存在下，与凝集IgG孵育的血清。
[0116] 图12:抑制性抗-C2的mAb不防止流体相野生型重组人类C2被Cls剪切。在抗-C2的 mAb的存在下，C2与Cls孵育。使用非还原SDS-PAGE分析混合物，并且使用考马斯亮蓝进行可 视化。箭头指示小鼠 IgG( ? 150kDa)、C2( ? 100kDa)、C2a( ? 70kDa)和C2b( ? 30kDa)。
[0117] 图13:嵌合小鼠-人类补体C2抗体，与低包被（25ng/孔，灰色符号）或高包被 (200ng/孔，黑色符号）的重组人类补体C2的结合。结果（在450nm处的吸光度）是平均值土 SD，n = 2〇
[0118] 图14:小鼠-人类IgG4嵌合抗-C2的mAb，对C3被人类血清中凝集的IgG活化的影响。 实验设计与图6中的相同，区别在于将抗-C2的mAb的重组小鼠-人类IgG4类型添加到人类血 清中，而不是mAb的鼠类类型。抗-C2-63是针对人类C2的鼠类非抑制性mAb，作为测试对照。 对照mAb是针对人类因子XI的mAb。对照IgG是作为对照测试的人类IgG。
[0119] 图15:在同种异体移植排斥的人类离体模型中，小鼠-人类IgG4嵌合抗-C2的mAb对 抗-HLA的抗体的补体依赖性细胞毒性的影响。实验设计与图8中的相同，但区别是将抗-C2 的mAb的重组小鼠-人类IgG4类型添加到人类血清中，而不是mAb的鼠类类型。使用程序 "Leica Q WIN"分析细胞毒性，并且表示为％裂解。抗-C2-63是针对人类C2的鼠类非抑制性 mAb，作为对照测试。对照mAb是针对人类因子XI的mAb。对照IgG是作为对照测试的人类IgG。
[0120] 图16:序列列表。
[0121] 图17:使用ELISA测定人源化抗-人类补体C2的抗体与重组人类补体C2的结合。结 果(在450nm处的吸光度)是平均值土 SD，η = 2。
[0122] 图18:在同种异体移植排斥的人类离体模型中，人源化抗-C2的mAb对抗-人类HLA-A、B、C(克隆W6/32)抗体的补体依赖性细胞毒性的影响。ΙμL W6/32抗体溶液(31.25μg/ml) 与ΙμL PBMC悬浮液(5xl06个细胞/ml)，在37°C孵育30分钟。同时，10μ1新鲜的正常血清与10 μL含抗-C2的mAb的VB，在室温孵育30分钟。各5μ1样品与PBMC混合物在37°C孵育1小时。向每 一孔中都添加5μ1 Fluoroquench，并且样品在黑暗中孵育30分钟。之后，通过自动显微镜 (Leica Micro Systems)，测量细胞毒性。通过Leica Q WIN软件，计算裂解百分比。没有抗-C2的mAb的新鲜血清用作阳性对照，EDTA和EGTA用作阴 性对照。其他对照是不相关的人类 IgG4的mAb和C2-缺乏血清。结果是平均值土 SEM，η = 2。
[0123] 图19:在同种异体移植排斥的人类离体模型中，人源化抗-C2的mAb对血清抗-HLA 的抗体的补体依赖性细胞毒性的影响。ΙμL血清抗-HLA的抗体与ΙμL TOMC悬浮液(5xl06个 细胞/ml)，在37°C孵育30分钟。同时，10μ1新鲜的正常血清与10μ1含抗-C2的mAb的VB，在室 温孵育30分钟。各5μ1样品与PBMC混合物在37°C孵育1小时。向每一孔中都添加5μ1 Fluoroquench，并且样品在黑暗中孵育30分钟。之后，通过自动显微镜（Leica Micro Systems)，测量细胞毒性。通过Leica Q WIN软件，计算裂解百分比。没有抗-C2的mAb的新鲜 血清用作阳性对照，EDTA用作阴性对照。结果是平均值土SD，n = 2。
【具体实施方式】
[0124] 实施例
[0125] 使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定，本文中所描述的本发明的 特定实施方式的很多等价物。这样的等价物应被涵盖在所附权利要求书中。在从属权利要 求中公开的实施方式的任意组合都被认为在本发明的范围内。
[0126] 本文所参考的所有专利、专利申请和科学出版物（其讨论材料和方法的各方面用 以认识本发明），通过引用而整体并入本文中。
[0127] 材料
[0128] 通过在63°C，将在PBS中的80mg/ml纯化的人类IgG(Gammaquin，Sanquin，阿姆斯特 丹，荷兰）加热20分钟，制备凝集IgG(agglgG)。然后将制备产物稀释至10mg/ml，并且储存 在-80°C，直至使用。
[0129]通过静脉穿刺，从人类志愿者获得新鲜的人类血清，等分后储存在-80°C。通过将 正常新鲜的血清在37°C孵育一周，制备正常老化的血清。从Sigma-Aldrich购买缺乏C2的血 清。
[0130] 分别从Mybiosource·com和Thermo Scientific，购买亲和纯化的鸡多克隆抗-C3 的抗体和山羊抗-C4的抗体。按照制造商的方案，使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo Scientific)对抗体进行生物素化。简单来讲，将20M倍数过量的生物素添加到抗 体中，并且在室温孵育30分钟。接下来，抗体针roS透析过夜，并且储存在4°C，直至进一步的 使用。
[0131 ] 通过Ficol 1-Paque(浮力密度1 ·077g/mL;GE Healthcare)离心，从肝素血中分离 出外周血单个核细胞(PBMC)。在室温，使用磷酸盐缓冲盐水UBS)冲洗分离的细胞，并且保 持在4°C的RPMI培养基中直至进一步使用。
[0132] 实施例1:小鼠抗-人类补体C2的抗体的生成
[0133] (a)重组人类补体C2的生成
[0134] 通过U-Protein Express(乌特勒支，荷兰），生成带N末端his标签的重组人类补体 蛋白C2。简单来讲，克隆编码人类补体蛋白C2(GenBank序列:NM_000063;参见SEQ ID N0.1) 的cDNA，随后在HEK293细胞中进行表达。通过亲和色谱法纯化C2,并且使用预制凝胶 NuPage? Novex?系统（Invi trogen)的SDS-PAGE进行分析。使用考马斯亮蓝，对蛋白进行 染色。
[0135] 如在图1 (泳道1)中所示，C2制备物示出>95%的纯度，即观察到分子量》lOOkDa的 一条带，与糖基化的人类C2的预期分子量一致。
[0136] (b)重组人类补体C2的生物化学特征
[0137] 通过将C2(100yL 400yg/mL的溶液)与血浆来源的活化的Cls(100yL 16yg/mL的溶 液;Calbiochem)在PBS中（Cls与C2的比率为1:25)，在37°C孵育1小时，来生成重组的C2a和 C 2 b。为了确定在C 2上是否存在N连接的多糖，按照制造商的说明书（N e w E n g 1 a n d Biolabs)，在反应缓冲液中，在37°C，使用肽-N-糖苷酶F(PNGase F;New England Biolabs)，对1.8yg未经剪切的重组C2或经Cls剪切的重组C2处理1小时。使用预制凝胶 NuPagc? Novex?系统（Invitrogen)的SDS-PAGE对蛋白进行分析，使用考马斯亮蓝进行染 色。
[0138] 如在图1(泳道1对泳道3)中所示，Cls将重组C2剪切成亚组分C2a( ? 70kDa)和C2b (? 30kDa)，分别与C2a和C2b的预期分子量一致。野生型重组C2,以及经Cls剪切的重组C2a 和C2b，都携带N连接的多糖，这从与PNGase F孵育之后的明显的较小分子量可以明显看出 (参见图1中的泳道1对泳道2,和泳道3对泳道4)。这些结果符合以下观点：人类C2a和C2b分 别具有6和2个推定的N连接糖基化的位点（Martini et al.，BMC Immunol 2010,11:43; Krishnan et al.,J Mol Biol 2007，367:224;Krishnan et al.,Acta Cristallogr D Biol Crystallogr 2009,D65:266)〇
[0139] (c)针对糖基化的人类补体C2的抗体的免疫和生成
[0140] 根据现有技术，针对糖基化人类C2的抑制性抗体仅可通过使用去糖基化的纯化人 类C(0glesby et al.，J Immunol 1988,2:926)或使用纯化的人类亚组分C2a(US 2001/ 0026928 A1)免疫小鼠获得，而不能通过使用完整的糖基化纯化的人类C2来获得。
[0141] 与Oglesby的免疫途径（参见上文；J Immunol 1988,2:926)相反，在第0天，对 BALB/c小鼠（雌性;6~8周龄;查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))皮下注射 在完全弗式佐剂中的《 500yL糖基化的重组人类补体C2(每一小鼠注射在250yL PBS-5mM苄 脒盐酸盐(U-Protein Express)中，与250yL完全弗式佐剂（Sigma)混合的25yg糖基化的重 组人类C2)。然后在第21天和第42天，对于通过皮下注射在不完全弗氏佐剂中的糖基化的重 组C2(每一小鼠注射在250yL PBS-5mM苄脒盐酸盐中，与250yL不完全弗式佐剂(Sigma)混合 的25yg糖基化的重组人类C2)的小鼠，抗体应答提高了，并且腹膜内注射没有佐剂(每一小 鼠注射在250yL PBS-5mM苄脒盐酸盐中的25yg重组C2)的糖基化的重组C2的小鼠，在第63天 和第64天抗体应答提高了。在第67天，使用反611.161*和組18丨6丨11(似丨1^6 1975,256:495)最初 描述的标准的杂交瘤技术，使来自免疫小鼠的脾细胞与SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞(DSMZ)融 合。简单来讲，处死免疫小鼠。从脾脏中切出脾细胞，并且在具有GlutaMax培养基的 serum-rrceopU'-ME：M3d (SF培养基；Invitrogen)中进行冲洗。在SF培养基中冲洗对数生长 的SP2/0-Agl4骨髓瘤细胞，然后添加到脾细胞中，得到脾细胞对骨髓瘤细胞的比率为5:1。 然后使细胞沉积成细胞团，并且去除上清液。然后在60秒的时间段中，逐滴添加 lml 37% (v/v)的聚乙二醇4000溶液(Merck)，之后将细胞在37°C再孵育60秒。然后，随着缓慢搅拌， 添加8ml SF培养基，再添加具有GlutaMax/10% (v/v)胎牛血清（FCS ;Bodinco)的5ml opli-M￡M? h在室温下30分钟之后，细胞沉积成细胞团，在具有GlutaMax/10%FCS的 opli-MEM? I中进行冲洗，以去除残留的聚乙二醇，最后以每孔1〇5个细胞/200μ1的浓度铺 板在氨基蝶呤选择培养基中，即补充有50x Hybri-Max?氨基蝶呤（从头DNA合成抑制剂 (Sigma))的具有GlutaMax/10%FCS的(叩丨」-1^1^$1。从第7天开始，每2~3天重新补充一次 氨基蝶呤选择培养基，在第13天，将氨基蝶呤选择培养基替换成具有GlutaMax/10%FCS的 opti-MEM 1〇
[0142] 从第13天开始，在融合之后，使用包被在96孔板上的具有糖基化的重组人类02〇]_ Protein Express)进行ELISA，来筛选杂交瘤上清液的抗-C2抗体的产生。筛选ELISA如下进 行。糖基化的人类重组C2用于包被(在PBS中250ng/ml;25ng/100yl/孔）。在使用roS/0.05% Tween 20(w/v)彻底冲洗之后，在室温（RT)，使用roS/0.05%Tween 20/1%牛血清白蛋白 (BSA)(w/V)(R〇Che)对板子封闭1小时。随后，在室温，将板子与100μΙ未稀释的杂交瘤细胞 上清液/孔孵育1小时。在PBS/0.05 % Tween 20中彻底冲洗之后，在室温，使用1:5000稀释的 辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠 Fc γ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)孵育1小 时，然后通过即用型TMB底物溶液（Invitrogen)进行比色检测，来确定抗体的结合。在添加 了 1M H2S〇4之后，使用酶标仪(BioRad)，测量波长450nm(655nm的参考波长)处的光密度。扩 增在该ELISA中呈阳性的杂交瘤，并且进行冷冻储藏。
[0143] 正如刚刚描述过的使用筛选ELISA所测定的几个融合实验得到36个产生针对糖基 化人类C2的抗体的杂交瘤。如下面实施例所描述，测试这些杂交瘤的上清液对糖基化C2的 抑制活性。
[0144] 实施例2:筛选抗-C2杂交瘤上清液的抑制活性的ELISA
[0145] 在ELISA系统中，初始筛选产生抗-C2抗体的杂交瘤的培养物上清液对C2的抑制效 果（图2)。在本ELISA中，将凝集的人类IgG包被在微量滴定板(Greiner-Bio-One)中，然后与 稀释的新鲜血清孵育，该稀释的新鲜血清与或未与含抗-C2的杂交瘤上清液进行了预孵育。 然后使用生物素化的多克隆亲和纯化的抗-C3和抗C4的抗体，测量C4和C3在板子上的固定， 这指示补体活化。然后，使用链霉亲和素-HRP测量抗-C3和抗-C4与板子的结合，所述结合使 用3'，5'_四甲基联苯胺（tetratmethylbenzidine)顺序进行可视化。简单来讲，在室温，使 用在 PBS 中的 10μg/ml 凝集 IgG 以 100μ1/孔对 ELISA 板(Greiner-Bio-One)包被过夜。在 ELISA 中，这一步骤和所有随后步骤的终体积都是1〇〇μ1。在使用之前，使用Mi 11 iQ冲洗5次板子。 按如下方法制备要进行测试的样品。将新鲜人类血清以1:100稀释在佛罗拿(veronal)缓冲 盐水中，该佛罗拿缓冲盐水pH 7.4(Lonza)，含有ImM MgCl2、0.15mM CaCl2和0.1%(w/v) Tween 20(VB-T)。1体积稀释血清与1体积杂交瘤上清液和1体积VB-T，在室温孵育30分钟。 通过混合1〇〇μ1稀释的新鲜正常血清与1〇〇μ1 EDTA(0.1M)和100μ1 VB-T，来制备阴性对照 样品。作为阳性对照，使用稀释血清和VB-T(而不是培养物上清液），来制备混合物。然后，将 这些几百微升的混合物在凝集IgG包被的板子中，在37°C孵育30分钟。冲洗板子，并且与针 对人类C4和C3的、在PBST中以1:50稀释的生物素化的抗体孵育。通过在室温，与以1:7500稀 释在PBS-T中的100链霉亲和素-HRP(Bi 〇Legend)孵育1小时，来检测结合的抗-C4或抗-C3的 鼠类抗体。最后，使用蒸馏水冲洗5次板子，使用3，5,3'，5'-四甲基联苯胺（TMB底物， Invitrogen)进行显影。通过向每一孔中添加100μ1 2M H2SO4,来终止反应。然后在 Multiskan EX酶标仪（Thermo Scientific)上，读出450nm处每一孔的吸光度。使用 Graphpad Prism 5分析数据。
[0146] 来自几次融合实验的9个杂交瘤，示出对C3结合具有实质的抑制活性，而它们并不 影响C4的固定（图3A和图3B)，排除了以下可能性：它们对C3活化的影响是因为在样品加工 过程中补体的非特异性活化和消耗。这些杂交瘤的编号是:抗-C2-7、抗-C2-13、抗-C2-23、 抗-C2-24、抗-C2-26、抗-C2-27、抗-C2-32、抗-C2-5F2和抗-C2-5G2。此外，鉴定出抑制杂交 瘤的少量临界线（杂交瘤19、35、60和65)。对重链可变区和轻链可变区的测序，显示出单克 隆抗体抗-C2-24和抗-C2-32是相同的，与单克隆抗体抗-C2-5F4和抗-C2-5G2-样。
[0147] 实施例3:纯化的鼠类抗-C2抗体13、32、35、60和5F2.4的结合特征
[0148] (a)单克隆抗体抗42-13、-32、-35、-60和-5?2.4与糖基化的重组人类02的结合
[0149] 使用蛋白G亲和色谱法(GE Healthcare)，纯化抑制性和非抑制性的抗_C2mAb。使 用小鼠单克隆同型化的IsoQuick?试剂盒(Sigma)，将重链和轻链类型化为同型种类(表1)。
[0150] 表1、针对人类C2的一些鼠类mAb的抗体类型
[0151]
[0153] 使用如在上面实施例1(c)中所述的程序，通过测定与量高（200ng/孔）和量低 (25ng/孔）的糖基化重组C2(U-protein Express)的结合，对纯化的单克隆抗体抗-C2-5F2 · 4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35 和抗-C2-60 进行进一步表征。
[0154] 如在图4中所示，抗体抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60剂 量依赖性地与糖基化的重组人类补体C2结合。抗体抗-C2-5F2.4、抗-C2-35和抗-C2-60的结 合，示出对以25ng/孔和200ng/孔包被的C2的结合仅略有差异，而与以200ng/孔包被的C2相 比，抗体抗-C2-13和抗-C2-32与以25ng/孔包被的C2的结合显著降低（图4)。因此，小鼠抗人 类补体C2-13(mIgGlK)和抗-C2-32(mIgGlK)的（相对）亲和性，低于抗体抗-C2-5F2.4 (mIgG2aK)、抗-C2-35(mIgGlK)和抗-C2-60(mIgGlK)的（相对)亲和性。
[0155] (b)单克隆抗体抗42-13、-32、-35、-60和-5?2.4与经(：18剪切的糖基化重组人类 C2的结合
[0156] 使用如在上面实施例1(c)中所述的程序，测定纯化的单克隆抗体抗-C2-5F2.4、 抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60与糖基化重组C2(200ng/孔；U-protein Express)或与经Cls剪切的糖基化的重组C2(200ng/孔)的结合。
[0157] 抗体抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60剂量依赖性地与糖 基化的重组C2(图5A)和经Cls剪切的糖基化的重组C2(图5B)结合。对后者的观察证明，抗体 抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60不识别糖基化的重组人类补体C2 的Cls剪切位点上的表位（即Arg 243- | -Lys244键，http : //www · uniprot · org/uniprot/ P09871)。
[0158] 实施例4:纯化的鼠类抗C2的mAb对C3在固体相凝集IgG上的固定的抑制活性
[0159] 为了证实抗-C2的mAb的抑制活性，使用与在实施例2中相同的测定，除了对要进行 测试的样品进行不同的制备以增强测定的稳健性。通过使Ι0μ1正常新鲜血清与Ι0μ1在PBS 中纯化的抗-C2的mAb混合，来制备样品。通过使10μ1正常新鲜血清与10μ1 VB混合，来制备 阳性对照样品。作为阴性对照样品，使1〇μ1正常新鲜血清与1〇μ1 EDTA(O.IM)混合。所有样 品都在室温孵育30分钟。接着，将所有样品都以1:100稀释在roS/0. l%Tween 20中，然后按 照在之前实施例中所述的方案，来进行相同的方案。如在图6中所示，对照mAb和非抑制性 mAb抗-C2-63,都不影响C3固定至固体相IgG。与此相对，抗-C的抗体32、5F2.4和13抑制C3固 定在板子上，而抗C2的mAb 35和60在这一测定中没有显示出显著活性。
[0160] 实施例5:通过流体相凝集IgG，纯化的鼠类抗-C2的mAb对新鲜血清中的C3的活化 的抑制活性
[0161 ]在与抗-C2的mAb预孵育的新鲜人类血清与凝集IgG孵育的测定中，测量抗-C2的 mAb-13、32、35、60和5F2对流体相C3活化的影响。然后，使用之前所述的ELISA(WolbinkGJ et al.，J Immunol Methodsl993,63:67)，测量样品中的C3的活化。通过使30μ1正常新鲜血 清与30μ1含抗-C2的mAb混合，来制备样品，并且在室温孵育20分钟。接着，将在VB中的30μ1 凝集IgG(lmg/ml)添加到所有样品中，以活化补体，阴性对照除外（其补充有30μ1 VB)。随 后，样品在37°C孵育30分钟。然后向所有样品中添加60μ1 EDTA(O.IM)，来终止补体活化。在 室温15分钟后，使用补充了 10mM EDTA的roS/0.1%Tween 20,稀释所有样品(血清最终稀释 是1:4000)，并且在ELISA中测试活化的C3。作为阳性对照，新鲜的人类血清与30μ1不含mAb 的VB预孵育。作为阴性对照，新鲜血清仅与VB孵育，而不与mAb或凝集IgG孵育。这一对照制 作两次，其中一次在所有孵育过程中都保持在融化的冰上。将结果表示为任意单位的活化 的C3,这是通过与标准曲线进行对比来计算，其中标准曲线由正常老化的血清的系列稀释 组成。因为活化的C3的测定不能在C3b、C3bi或C3c之间进行区分，将活化的 C3指示为C3b/c。 图7示出，在向人类血清中添加凝集IgG时，生成C3b/c(图7中的阳性对照）。添加 IgG(图中的 γ -醌式(Qu i n) I gG)、不相关的对照mAb (图6中的(抗-FXI))或非抑制性抗-C2的mAb-63，通 过凝集IgG对血清中的C3b/c生成没有影响。与此相对，抗-C2的mAb 7、13、32、35、60和5?2.4 都通过凝集I gG抑制C3b/c的生成（图7)。
[0162]实施例6:纯化的鼠类抗-C2的mAb对抗-HLA抗体的细胞毒性的影响
[0163] 作为人类移植的抗体介导的排斥的离体模型，对诊断性交叉配血试验进行了修 改，其中诊断性交叉配血试验测试候选移植受体中补体依赖性抗体的存在。在正常试验中， 在兔补体的存在下，供体细胞或具有与供体相同的HLA分子的细胞，与受体的热失活的血清 混合。如果受体具有针对供体HLA分子的抗体，会使细胞裂解。使用显微镜进行测定，并且表 示为细胞毒性分数(从1-没有裂解-至8_>80%裂解）。为了测试抗-C2的mAb的效果，用兔血 清代替新鲜的人类血清，来对该测定进行修改。此外，使用具有针对多HLA分子的高滴度抗-HLA抗体的患者的血清。
[0164] 修改的交叉配血试验如下进行。寺崎托盘(Terasaki tray) (Greiner)的孔填充1μ 1具有HLA抗体的高度免疫化的血清和ΙμL PBMC悬浮液(2~5 X 106个细胞/ml)，并且在室温 孵育1小时。同时，通过混合5μ1新鲜的正常血清、15μ1 VB和5μ1含抗-C2的mAb的VB，来制备 要进行测试的样品。通过向20ul没有抗-C2的mAb的佛罗拿缓冲液中添加5μ1正常新鲜血清， 来制备阳性对照样品；并且，通过混合5μ1正常新鲜血清、15μ1佛罗拿缓冲液和5μ1 lOOmM EDTA，来制备阴性对照样品。随后，所有样品在室温孵育20分钟。接着，一式两份地向孔中添 加10以1各样品，并且在室温孵育2小时。最后，向孔中添加5以]^111〇1'〇911611(311(331113；[0)。30分 钟之后，使用自动显微镜(Leica)读出寺崎托盘，在一些实验中，使用被称为"Leica Q WIN" 的特定程序计算出细胞裂解，而在其他实验中，由有经验的技术人员得出裂解的分数。细胞 毒性分数"0"指细胞没有裂解，而当>80 %的细胞被裂解时，得到分数"8"。
[0165] 测试浓度在0.6mg/ml~1.5mg/ml范围内的抗-C2的抗体。抗-C2的mAb 18、19、23、 31和63,对经抗-HLA的抗体敏化的细胞的补体依赖性杀伤没有影响（参见图8)。与此相对， 在这一抗体介导的同种异体移植排斥的模型中，抗-C2的mAb 13、32、35、60、7、24、79，都抑 制补体依赖性的细胞毒性。
[0166] 实施例7:在人类补体C2上由小鼠抗人类补体C2的抗体13、32、35、60和5F2.4识别 的结构域的特征
[0167] (a)使用蛋白印记，对糖基化重组人类亚组分C2a和C2b上由mAb抗-C2-13、-32、_ 35、-60和-5F2 · 4识别的表位进行制图
[0168] 在非还原条件下，在预制SDS-PAGE( NuPage? Novex?系统）中，使用4~12% Tris-Bis凝胶和MOPS跑胶缓冲液（Invitrogen)，对糖基化的重组人类C2(范围125~500ng/ 泳道，参见图9;U-protein Express)或经Cls剪切的糖基化的重组人类C2(范围62.5-1000ng/泳道，参见图9;对于C2剪切程序，参见实施例1(b))进行电泳。然后，将C2蛋白电印 记到聚偏二氟乙烯（PDVF)转移膜（Millipore)上。经PBS/0.05%Tween 20/l%BSA组分V (Roche)在室温封闭 20 分钟之后，PDVF 膜与抗-C2 的 mAb 抗-C2-C2-5F2.4(100ng/mL)、抗-C2-13(200ng/mL)、抗-C2-32(200ng/mL)、抗-C2-35(100ng/mL)和抗-C2-60(200ng/mL)在室温 孵育1小时。在PBS/0.05 % Tween 20中彻底冲洗之后，使用1:10，000稀释的辣根过氧化物酶 缀合的山羊抗小鼠 Fc γ的特异性抗体(Jackson ImmunoResearch)在室温孵育1小时，然后 通过即用型TMB底物溶液(S i gma)进行比色检测，来确定抗-C2的mAb的结合。
[0169] 如图9中所示，所有检验的抗-C2的mAb都与未剪切的糖基化的重组人类C2( ? 100kDa)结合。此外，mAb抗-C2-5F2.4和抗-C2-35特异性识别糖基化亚组分C2b( ? 30kDa)， 而mAb抗-C2-13和抗-C2-32特异性识别糖基化亚组分C2a( ? 70kDa)。滅13抗-C2-60似乎与糖 基化亚组分C2a和C2b都结合。
[0170] (b)使用ELISA，检测mAb抗气2-13、-32、-35、-60和-5?2.4与糖基化的重组人类亚 组分C2a的结合
[0171] 通过大小排阻层析(Yarra?3U sec 2000300x 4.60柱），从经Cls剪切的C2(对于C2 剪切程序，参见实施例1(b))中纯化糖基化的重组人类C2a。在使用预制凝胶NuPage? Novex?系统（Invitrogen)的SDS-PAGE上，C2a制备物是>95%均一的（未示出）。随后，使用 在实施例1(c)中描述的ELISA程序，进一步分析纯化的抗-C2的mAb与纯化的C2a(200ng/孔） 的结合。
[0172] 如在图10A中所示，并且与蛋白印记数据(参见实施例7(a)))相符，mAb抗-C2-13和 抗-C2-32证明剂量依赖地结合（即在0 . lyg/mL达到饱和）纯化的糖基化的重组C2a，而mAb 抗-C2-60示出与C2a中等程度地结合，mAb抗-C2-5F2.4和抗-C2-35几乎不与C2a结合。痕量 的未剪切的糖基化重组C2，解释了观察到的mAb抗-C2-5F2.4和抗-C2-35的结合。
[0173] (c)使用ELISA，检测mAb抗-C2-5F2.4与糖基化的、变性和还原的重组人类C2的结 合
[0174] 使用在上面实施例1(b)中所述的程序，进行重组C2的去糖基化，但反应缓冲液没 有变性/还原试剂，而且使用肽-N-糖苷酶F(PNGase F;New England Biolabs)的处理在37 °(3进行过夜。分别使用有NuMGE政还原试剂lOX(Invitogen)或没有NiuPAGE?还原试剂 lOX(Invitogen)的NuPAGE? LDS样品缓冲液4X(Invitogen)，进行重组C2的变性和还原。随 后，使用在上面实施例1 (c)中所述的ELISA程序，进一步分析纯化的mAb抗-C2-5F2.4与未经 处理的重组C2 (200ng/孔）、去糖基化的重组C(100ng/孔）、变性的重组C2 (200ng/孔)和还原 的重组C2(200ng/孔）的结合。
[0175] 如在图10B中所示，mAb抗-C2-5F2.4证明剂量依赖性地与去糖基化的（非-变性/ 非-还原)重组C2结合。如在图10C中所示，mAb抗-C2-5F2.4证明剂量依赖性地与变性的重组 C2结合，并且示出不与还原的(变性)重组C2结合。
[0176] 总之(参见表2)，11^13抗-02-5?2.4似乎识别人类02的亚组分0213上的表位，而不识 别人类C2的亚组分C2a上的表位(参见实施例7(a)和7(13))。11^13抗-02-5?2.4在亚组分0213上 的结合似乎对人类C2的Cl s剪切(参见实施例3 (b ))、去糖基化和变性不敏感。但是，内部的 半胱氨酸桥键似乎对mAb抗-C2-5F2.4在亚组分C2b上的结合起到关键作用。
[0177] 表2、mAb抗-C2-5F2.4的结合特征
[0178]
[0179] 实施例8:抗-C2的mAb 13、32、35、60和5?2通过流体相凝集186抑制新鲜人类血清 中的C2
[0180] 为了研究抗-C2的mAb的抑制机制，将10μ1血清与10μ1 0.48mg/ml的抗-C2的mAb在 室温孵育。然后，添加1〇μ1 lmg/ml的凝集IgG，样品在37°C孵育30分钟。向样品中添加35μ1 水和35μ1样品缓冲液，随后煮沸10分钟。最后，将15μ1混合物在7.5%SDS-PAGE上进行分离。 对样品进行印迹，并且与5yg生物素化的抗-C2-5F2.4孵育。如在之前的实施例中所示，该抗 体结合天然C2和具有Mr ? 30.000的C2b。因此，如果在使用凝集IgG进行活化之前，向血清中 添加非抑制性抗体，则预期在血清样品中大部分C2存在为C2b(和C2a，其在印迹中没有看 到），而小部分存在为完整的Mr ? 90.000的C2。确实，在使用对照人类IgG(图11，标记为IgG 的泳道）、不针对C2的对照mAb (在图11中标记为C的泳道)和非抑制性C2的mAb (在图11中标 记为63的泳道)的情况下，观察到这样的结果，但与使用不针对C2的对照mAb相比，该非抑制 性C2的mAb在某种程度上示出C2的较少的剪切，这很可能是因为一些空间位阻。当使用凝集 IgG活化补体系统时，其他所有mAb都减小血清中的C2的剪切(图11)。
[0181] 实施例9:mAb抗42-13、-32、-35、-60和-5?2.4不抑制人类(：18对无流体相的糖基 化的重组人类C2的剪切
[0182] 为了研究抗-C2的mAb的抑制机制，使糖基化的重组人类C2与mAb抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35和抗-C2-60(C2与抗体的摩尔比率为1:2)，在室温预孵育30分 钟。并行地，测试作为阴性对照的小鼠 IgGlK和IgG2aK的同型对照（都购自BD Biosciences)。然后，添加人类Cls(Cls与C2的比率为1: 25;Calbiochem)，在37°C孵育1小 时。使用预制凝胶NuPage? Novex?系统（I n v i tr 〇 gen)的SDS-PAGE，并且用考马斯亮蓝染 色，来分析混合物。
[0183] 如图12中所示，抗-C2的mAb都不抑制重组C2被Cls剪切。此外，当使用较高浓度(C2 与抗体的摩尔比率为《 1:3至》1:7)的抗-C2的mAb时，没有观察到对C2被Cls剪切的影响 (数据未示出）。总的来说，这些结果证明，mAb抗-C2-5F2.4、抗-C2-13、抗-C2-32、抗-C2-35 和抗-C2-60不识别Cls剪切位点上的表位或接近Cls剪切位点的表位（即Arg243-1 -Lys244键； http://www.uniprot.org/uniprot/P09871)。
[0184] 实施例10:使用简并引物对小鼠抗42-5?2.4、-13、-32、-35和-60进行分子遗传表 征
[0185]使用PBS冲洗杂交瘤细胞，等分在含5 X106个细胞的微量管中，并且以细胞团的形 式储存在_80°C。使用RNeasy迷你型分离试剂盒(RNeasy Mini Isolation Kit)(QIAGEN)， 从这些细胞团中分离RNA。测定RNA浓度(A260nm)，并且将RNA储存在-80°C。通过反转录酶， 使用RevertAid?H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(-第一链cDNA合成试剂盒） (Fermentas)，从2yg RNA合成cDNA，并且将合成的cDNA储存在-20°C。基于同型抗体，设计如 在表3中所示的引物，来扩增小鼠抗人类C2-5F2 · 4、-13、-32、-35和-60的乂区。
[0186] 表3、用于克隆抗-C2的mAb的cDNA的PCR引物
[0187]
[0188] s =正向；as =反向，cs =恒定区
[0189] +VL =轻链可变区，VH =重链可变区；*按照Bioceros内部编码系统的编号；**简并 引物:M=C或A;V=G、A或C;N=A、C、G或T;Y = C或T;R=A或G;W=A或T;和S=G或C。
[0190] 引物1是设计以与小鼠的VH区的骨架1(FR1)退火的正向引物，；引物2和204是与小 鼠重链的恒定区退火的反向引物。引物213和265都是与小鼠 VL区（κ)的FR1退火的正向引 物；引物4和201都是设计以与小鼠 κ轻链的恒定区退火的反向引物。最后，引物317被设计 为，识别FR1区上游的小鼠信号肽序列的一部分。
[0191] 使用表3中示出的引物组合，进行多种不同的PCR。扩增小鼠抗-C2-5F2.4、-13、- 32、-35和-60的V区。有吸引力的是，仅使用反向引物201，就扩增出小鼠抗-C2-35和-60的轻 链可变区。
[0192] Accuprime?Pfx DNA聚合酶（Invitrogen)用于扩增小鼠抗-C2-5F2·4、-13、_32、-35和-60的重链和轻链的可变区。在1 %琼脂糖凝胶上分析PCR产物。对PCR反应产物进行凝 胶纯化，并且克隆在pCR-Bluntii-TOPO?:载体中，用于序列分析。从含有PCR插入物的质粒 中，通过DNA测序（通过ServicXS B.V·，（莱顿市，荷兰和麦克根（The Netherlands and Macrogen)，阿姆斯特丹，荷兰)来进行)来分析克隆的插入物，以获得抗-C2的mAb的V区共有 序列。对于所有检验的mAb，获得VH和VL的至少3条信息序列。应注意，因为所使用的正向引 物的性质，几乎所有确定的氨基酸共有序列所使用的简并引物，指示N末端的前6~8个氨基 酸。理论上，原始的小鼠序列可能在这些区域中是不同的。确定小鼠抗-C2-5F2.4、-13、_ 32、-35和-60的VH区和VL区的氨基酸共有序列，即分别为SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3、SEQ IDN0·10和SEQIDN0·11、SEQIDN0·18和SEQIDN0·19、SEQIDN0·26和SEQIDN0·27、 SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35。
[0193] 在本说明书中，没有必要将显然是之前公开的文件的列表或讨论认为是公知的， 即没有必要认为该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
[0194] 实施例11:嵌合人类IgGlK和/或人类IgG4K(即将小鼠 IgGK恒定结构域换成人类 IgGK的恒定结构域)抗-人类补体C2-5F2.4、-13、-32、-35和-60的生成
[0195] 基于鉴定出的鼠类V区序列（参见实施例10)，设计小鼠抗-C2-5F2.4、-13、-32、-35 和-60的嵌合人类抗体形式。为此，从GENEART(雷根斯堡，德国）购买了CH0细胞优化的cDNA 序列SEQ ID N0.47(编码mAb抗-人类C2-32的嵌合人类IgGl的重链)和SEQ ID N0.48(编码 抗-人类C2-32的嵌合人类κ轻链），这编码鼠类信号肽，接着分别是与人类IgGl恒定区连接 的鼠类可变重链，或与人类κ恒定区连接的鼠类可变轻链。
[0196] 此外，生成抗-02-5?2.4、-13、-32、-35和-60的嵌合人类(稳定的）1864形式。为此， 使用表4中示出的引物，通过PCR扩增重链可变区和轻链可变区。为了亚克隆的目的，在编码 V区的cDNA的N末端部分和C末端部分中并入适当的限制性酶切位点。抗人类补体C2的抗体 编号32的κ轻链没有被扩增，因为已经从用于生成嵌合人类IgGlK(参见上文）的嵌合人类κ 构建体中获得构建体。除了抗人类补体C2的抗体编号32的可变重链之外，天然的鼠类cDNA 用作所有PCR反应的模板。对于抗人类补体C2的抗体编号32的可变重链，使用嵌合人类IgGl 构建体的CH0优化的cDNA(参见上文）。
[0197] 表4、用于扩增抗-C2的mAb的重链可变区和轻链可变区的PCR引物
[0198] LUZUU」 ；as =汉pj
[0201 ] +VL =轻链可变区，VH=重链可变区；*按照Bioceros内部编码系统的编号;**简并 引物:M=C或A;V=G、A或C;N=A、C、G或T;Y = C或T;R=A或G;W=A或T;和S=G或C。
[0202] Accuprime?Pfx DNA聚合酶（Invitrogen)用于扩增抗-C2-5F2·4、_13、_35和-60的 重链可变区和轻链可变区，以及抗-C2-32的可变重链。在1%琼脂糖凝胶上分析PCR产物。对 PCR反应产物进行凝胶纯化，并且克隆在pCR-Blunt ||-TOP()K载体中，用于序列分析。从含有 PCR插入物的质粒中，通过DNA测序(麦克根(Macrogen)，阿姆斯特丹，荷兰)来分析克隆的插 入物，以获得含有适当限制性酶切位点的正确的V区。随后，使用SacII/Nhel，将重链可变区 亚克隆到表达质粒v319中，表达质粒v319是pcDNA3.1衍生物，含有编码鼠类信号肽，接着是 稳定的人类IgG4重链恒定区的cDNA。使用SacII/RsrII，将轻链可变区亚克隆到类似的表达 质粒v322中，而表达质粒v322含有编码鼠类信号肽和人类κ轻链恒定区组合的 CDNA。
[0203] 对于嵌合人类IgG4K抗人类补体C2的抗体的cDNA序列，参见SEQ ID N0.42(编码 抗-C2-5F2.4的嵌合人类IgG4的重链）、SEQ ID N0.43(编码抗-C2-5F2.4的嵌合人类κ轻 链）、SEQ ID N0.44(编码抗-C2-13的嵌合人类IgG4的重链）、SEQ ID N0.45(编码抗-C2-13 的嵌合人类κ轻链）、SEQIDN0.46(编码抗-C2-32的嵌合人类IgG4的重链）、SEQIDN0.48 (编码抗-C2-32的嵌合人类κ轻链）、SEQ ID勵.49(编码抗42-35的嵌合人类1864的重链）、 SEQ ID N0.50(编码抗-C2-35的嵌合人类κ轻链）、SEQ ID N0.51(编码抗-C2-60的嵌合人类 IgG4的重链)和SEQ ID N0.52(编码抗-C2-60的嵌合人类κ轻链）。
[0204] 对于嵌合人类IgGlK和嵌合人类IgG4K的抗人类补体C2的抗体的氨基酸序列，参见 SEQ ID Ν0· 53(抗-C2-5F2.4的嵌合人类IgG4的重链）、SEQ ID Ν0·54(抗-C2-5F2.4的嵌合 人类lc轻链）、SEQIDN0.55(抗-C2-13的嵌合人类IgG4的重链）、SEQIDN0.56(抗-C2-13的 嵌合人类κ轻链）、SEQIDN0.57(抗-C2-32的嵌合人类IgG4的重链）、SEQIDN0.58(抗-C2-32的嵌合人类IgGl的重链）、SEQIDN0.59(抗-C2-32的嵌合人类κ轻链）、SEQIDN0.60 (抗-C2-35的嵌合人类IgG4的重链）、SEQIDN0.61(抗-C2-35的嵌合人类κ轻链）、SEQID N0.62(抗-C2-60的嵌合人类IgG4的重链)和SEQIDN0.63(抗-C2-60的嵌合人类κ轻链）。
[0205] 实施例12:嵌合小鼠-人类IgGlK和/或IgG4K的抗人类补体C2的抗体5F2.4、13、32、 35和60的结合特征
[0206] 使用FreeStyle?MAX CH0(CH0-S细胞）表达系统（Invitrogen)，表达嵌合小鼠-人 类抗体(抗-C2-32的人类IgGlK形式，和抗气2-5?2.4、-13、-32、-35和-60的人类186牡形 式）。使用亲和色谱蛋白A柱子(GE Healthcare)，纯化表达的嵌合小鼠-人类的抗人类补体 C2的抗体。使用与在实施例3中所述的相同的ELI SA程序，测试所有抗-C2的嵌合mAb，与高 (200ng/孔)和低（25ng/孔)重组C2的结合。简单来讲，使用在roS中的所示量的C2,在4°C对 ELISA板（Corning)包被过夜。在roS/0.05%Tween 20中彻底冲洗之后，使用roS/0.05% Tween 20/l%BSA组分V(Roche)对板子在室温封闭1小时。随后，在室温，板子与0、0.00002 ~20.0(在封闭缓冲液中进行10倍稀释步骤)yg/mL蛋白A纯化的嵌合小鼠-人类IgGlK和/或 1区6牡的抗气2-5?2.4、-13、-32、-35和-60孵育1小时。在?85/0.05%了￥661120中彻底冲洗之 后，使用1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗人类IgG的特异性(重链和轻链)抗体 (Jackson ImmunoResearch)在室温孵育1小时，然后通过即用型TMB底物溶液（Invitrogen) 进行比色检测，来确定抗体的结合。添加1M H2S04之后，使用酶标仪（BioRad)，测量波长 450nm(参考波长655nm)的光学密度。
[0207]图13 (平均值± SD，η = 2)示出，嵌合抗体的结合特征与纯化的鼠类抗体的结合特 征（图4)完全相同。嵌合抗-C2-13和抗-C2-32与低浓度包被的C2结合不太好，而其他嵌合抗 体与两种浓度的C2的结合都很好。因此，嵌合小鼠-人类的抗-C2-13(chuIgG4K)和抗-C2-32 (〇1111]^641〇和〇1111]^611〇的（相对）亲和性，似乎低于嵌合小鼠-人类（〇1111]^641〇抗-〇2-5F2 · 4、-35和-60的（相对)亲和性。
[0208] 实施例13:嵌合小鼠-人类IgG4K抗人类C2-5F2.4、-13、-32、-35和-60的功能活性
[0209]在与实施例4(C3只固体相IgG的固定）、实施例5(凝集IgG对血清中的流体相C3的 活化)和实施例6(抗-HLA抗体对补体依赖性的细胞毒性)相同的测定中，测试嵌合小鼠-人 类抗-C2的mAb。在这些测定中，5种嵌合小鼠-人类抗体的功能活性与鼠类抗体的功能活性 类似，即它们抑制C3固定至固体相IgG，它们抑制凝集IgG对血清中C3的活化（图14)，并且防 止抗-HLA抗体的补体依赖性的细胞毒性(图15)。
[0210] 实施例14:使用退火在信号肽区域中的引物，确定小鼠抗-C2-5F2.4、-35和-60的 可变区的N末端氨基酸序列
[0211] 如实施例10中所述，理论上，因为使用正向简并引物，因此可变区的小鼠 N末端共 有氨基酸序列可能与确定的序列不同。因此使用在表5中所述的引物（即正向引物退火在鼠 类抗体的信号肽区），再次确定抗-C2-5F2.4、-35和-60的VH区和VL区。
[0212] 表5、用于扩增抗-C2-5F2.4、-35和-60的小鼠共有的重链可变区和轻链可变区的 PCR引物
[0213]
[0215] s =正向；as =反向
[0216] +VL =轻链可变区，VH=重链可变区；*按照Bioceros内部编码系统的编号；**引 物:M=C或A;V=G、A或C;N=A、C、G或T;Y = C或T;R=A或G;W=A或T;和S=G或C.
[0217] 使用RNeasy迷你型分离试剂盒（RNeasy Mini Isolation Kit) (QIAGEN)，从杂交 瘤细胞中分离RNA。测定RNA浓度(A260nm)，并且将RNA储存在-80°C。通过反转录酶，使用 RevertAid?H-第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid?H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit) (Fermentas)，从2yg RNA合成cDNA，并且将合成的cDNA储存在_20°C。
[0218] Accuprime?Pfx DNA聚合酶（Invitrogen)用于扩增小鼠抗-C2-5F2·4、_35和-60的 重链和轻链的可变区。所使用的引物组示于表5中。对PCR反应产物进行凝胶纯化，并且克隆 在pCR-BluntH-TOPO?载体中，用于序列分析。从含有PCR插入物的质粒中，通过DNA测序（由 荷兰阿姆斯特丹的麦克根(Macrogen)进行)来分析克隆的插入物，以获得这三种抗-C2的 mAb的V区的共有序列。对于所有检验的mAb，获得VH和VL的至少3条信息序列。
[0219] 通过使用表5的引物组，发现抗-C2-5F2.4的小鼠共有的可变重链氨基酸序列以及 抗-C2-35和抗-C2-60的小鼠共有的可变轻链氨基酸序列，与在实施例10中发现的氨基酸序 列相同（即分别是SEQ ID N0.2、27和35)。
[0220] 但是，抗-C2-5F2.4的N末端可变轻链氨基酸序列（SEQ ID NO.96)，与在实施例10 中发现的抗-C2-5F2.4的N末端可变轻链氨基酸序列（SEQ ID NO.3)有一个氨基酸是不同的 (I2N)。抗-C2-35的N末端可变重链氨基酸序列（SEQ ID N0.97)，与在实施例10中发现的抗-C2-35的N末端可变重链氨基酸序列（SEQIDN0.26)有一个氨基酸是不同的（Q1E)。抗-C2-60的N末端可变重链氨基酸序列（SEQ ID N0.98)，与在实施例10中发现的抗-C2-60的N末端 可变重链氨基酸序列（SEQ ID N0.34)有三个氨基酸是不同的(Q3A、Q5K和Q6E)。
[0221 ]实施例15:人源化IgG4/K的抗人类补体C2-5F2.4的生成
[0222] 基于确定的小鼠抗-C2-5F2.4的鼠类V区（VH区为SEQ ID N0:2,并且VL区为SEQ ID NO: 96，参见实施例13 )，生成人源化抗体的形式。
[0223] 使用种系人源化（Germline Humanisation) (CDR-嫁接）技术（由英国剑桥的 Antitope Ltd进行），获得小鼠抗-C2-5F2.4的人源化轻链可变序列和人源化重链可变序 列。对于人源化可变轻链和可变重链的氨基酸序列，分别参见SEQ ID NO. 99(5F2.4-VL1)、 SEQ ID N0.100(5F2.4-VL2)、SEQ ID N0.101(5F2.4-VL3)、SEQ ID N0.102(5F2.4-VL4)和 SEQ ID N0.103(5F2.4-VH1)、SEQ ID N0.104(5F2.4VH2)、SEQ ID N0.105(5F2.4-VH3)、SEQ ID N0.106(5F2.4-VH4)〇
[0224] 在该设计之后，从GENEART(雷根斯堡，德国）购买了 cDNA序列（参见SEQ ID NO. 107、108、109和110(编码全长人源化轻链k5F2.4形式，即分别编码VL1、VL2、VL3和VL4)， 和SEQ ID NO. 111、112、113和114(编码全长人源化重链IgG45F2.4形式，即分别编码VH1、 VH2、VH3和VH4))，这些cDNA序列编码后面是与人类κ恒定区连接的人源化可变轻链的信号 肽，和后面是与人类IgG4恒定区连接的人源化可变重链的信号肽。此外，将所有人源化抗体 都表达为稳定化的(Angal et al.，Mol Immunol 1993,30:105)人类]^64分子。使用合适的 限制性内切酶，将生成的cDNA亚克隆到pcDNA3.1来源的表达质粒中。
[0225] 使用FreeStyle?293表达系统（Life Technologies)，表达人源化抗-C2-5F2.4形 式。使用亲和色谱蛋白A柱(GE Healthcare)，纯化生成的人源化抗体。通过这样的方式，生 成抗体5F2.4的8种纯化的人源化形式，即VL1VH1、VL2VH1、VL1VH2、VL2VH2、VL3VH3、VL4VH3、 VL3VH4和VL4VH4。
[0226] 对于全长的人源化抗-C2-5F2.4抗体的氨基酸序列，参见SEQ ID N0.115、116、117 和118(编码人源化轻链K5F2.4形式，即分别编码VL1、VL2、VL3和VL4)，和SEQ ID N0.119、 120、121和122(编码人源化重链18645?2.4形式，即分别编码￥!11、￥!12、￥!13和￥!14)。
[0227] 实施例16:人源化IgG4/K抗人类补体C2-5F2.4的结合特征
[0228] 通过如在上面实施例12中所述的ELISA(将重组人类C2以2μg/ml固定至板子上)测 定人源化抗-C2-5F2.4的mAb形式VL3VH3、VL4VH3、VL3VH4和VL4VH4与C2的结合。如图17中所 示，四种检验的人源化抗-5F2.4的mAb形式，证明与固体相C2的结合与嵌合抗-C2-5F2.4的 mAb类似。
[0229] 实施例17:人源化IgG4/K抗人类补体C2-5F2.4的功能活性
[0230]与在实施例6中对小鼠抗-C抗体所述类似，进行修改的交叉测试实验。
[0231]首先，抗HLA的单克隆抗体(克隆W6/32)用于使细胞敏化。以摩尔Ab:C2比率在5:1 ~0.312:1 (正常血清中的天然C2浓度假定为20g/ml)的范围内，测试嵌合抗-C2-5F2.4和人 源化抗-C2的抗体形式VL3VH3、VL4VH3、VL3 VH4和VL4VH4。所有抗-C2的mAb (嵌合Ab形式和四 种检验的人源化Ab形式），都剂量依赖地抑制经抗HLA抗体W6/32敏化的细胞的补体依赖性 杀伤（参见图18)。含VL3的形式（即VL3VH3和VL3VH4)，在交叉测试中示出与嵌合抗-C2-5F2.4的mAb相当的抑制。此外，含VL3的形式（即VL3VH3和VL3VH4)，似乎好于含VL4的形式 (即 VL4VH3 和 VL4VH4)。
[0232]此外，还使用含有高水平的抗HLA抗体的患者血清(这更加类似于生理状态)使细 胞敏化，来进行交叉测试。测试了 160g/ml的嵌合抗-C2-5F2.4，和人源化抗-C2的抗体形式 VL3VH3、VL4VH3、VL3VH4和VL4VH4。所有抗-C2的mAb (嵌合Ab形式和四种检验的人源化Ab形 式），都抑制经血清抗HLA抗体敏化的细胞的补体依赖性杀伤(参见图19)。
【主权项】
1. 一种与人类补体因子C2结合的结合分子，包括免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白 轻链可变区， (a) 所述免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序列： SEQIDN0:2和SEQIDN0:3;SEQIDN0:2和SEQIDN0:96;SEQIDN0:10和SEQIDN0: 11;SEQIDN0:18和SEQIDN0:19;SEQIDN0:26和SEQIDN0:27;SEQIDN0:97和SEQID N0:27;SEQIDN0:34和SEQIDN0:35;或者，SEQIDN0:98和SEQIDN0:35;或者 (b) 免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区分别包括以下氨基酸序列：SEQ IDN0:9^PSEQIDN0:103;SEQIDN0:9^PSEQIDN0:104;SEQIDN0:9^PSEQIDN0: 105;SEQIDNO:99和SEQIDNO:106;SEQIDNO:100和SEQIDNO:103;SEQIDNO:100和 SEQIDNO:104;SEQIDNO:100和SEQIDNO:105;SEQIDNO:100和SEQIDNO:106;SEQ IDNO:101和SEQIDNO:103;SEQIDNO:101和SEQIDNO:104;SEQIDNO:101和SEQID N0:105;SEQIDN0:101和SEQIDN0:106;SEQIDN0:102和SEQIDN0:103;SEQIDN0: 102和SEQIDNO:104;SEQIDNO:102和SEQIDNO:105;或SEQIDNO:102和SEQIDNO: 106;或者 (c) 免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区包括在(a)和/或(b)中具体限定 的氨基酸序列，但是其中，所述序列之一或二者包括1~5个氨基酸替换。2. 根据权利要求1所述的结合分子，其中，所述结合分子与人类补体因子C2的C2a结构 域的表位、C2b结构域的表位、或C2a结构域和C2b结构域两者的表位结合。3. 根据权利要求1或2所述的结合分子，所述结合分子是Fab-片段、单链Fv(SCFv)片段 或其抗体抗原结合片段。4. 根据权利要求3所述的抗体，所述抗体是人源化的或去免疫化的IgG、IgA、IgD、IgE或 IgM抗体，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。5. 根据权利要求4所述的抗体， (a) 包括以下氨基酸序列：SEQIDN0:53 和SEQIDN0:54;SEQIDN0:55 和SEQIDNO: 56;SEQIDNO:57和SEQIDNO:58;SEQIDNO:57和SEQIDNO:59;SEQIDNO:60和SEQID NO:61;或者，SEQIDNO:62和SEQIDNO:63;或者 (b) 包括以下氨基酸序列：SEQIDNO: 115和SEQIDNO: 119;SEQIDNO: 115和SEQID N0:120;SEQIDN0:115和SEQIDN0:121;SEQIDN0:115和SEQIDN0:122;SEQIDN0: 116和SEQIDNO:119;SEQIDNO:116和SEQIDNO:120;SEQIDNO:116和SEQIDNO:121; SEQIDNO:116和SEQIDNO:122;SEQIDNO:117和SEQIDNO:119;SEQIDNO:117和SEQ IDN0:120;SEQIDN0:117和SEQIDN0:121;SEQIDN0:117和SEQIDN0:122;SEQID NO:118和SEQIDNO:119;SEQIDNO:118和SEQIDNO:120;SEQIDNO:118和SEQIDNO: 121;或者，SEQIDNO:118和SEQIDNO: 122;或者 (c) 包括在(a)和/或(b)中具体限定的氨基酸序列，但是其中，所述序列之一或二者包 括1~5个氨基酸替换。6. -种编码根据权利要求1~5中任一项限定的结合分子或抗体的核酸分子。7. 根据权利要求6所述的核酸分子，包括以下核酸序列：SEQIDN0:42、SEQIDN0:43、 SEQIDN0:44、SEQIDN0:45、SEQIDN0:46、SEQIDN0:47、SEQIDN0:48、SEQIDNO: 49、SEQIDN0:50、SEQIDN0:51、SEQIDN0:52、SEQIDN0:107、SEQIDN0:108、SEQID N0:109、SEQIDN0:110、SEQIDN0:111、SEQIDN0:112、SEQIDN0:113SSEQIDN0: 114〇8. -种基因递送剂或载体，包括根据权利要求6或7所述的核酸分子。9. 一种分离或重组的细胞，或体外细胞培养物，所述细胞包括根据权利要求6~8中任 一项所述的载体的核酸分子。10. -种产生结合分子的方法，其特征在于，产生根据权利要求1~3中任一项所述的结 合分子，或者根据权利要求4或5所述的抗体。11. 根据权利要求10所述的方法，进一步包括收集所述结合分子。12. 根据权利要求1~5中任一项所述的结合分子或抗体，用于治疗患补体活性过量或 补体活性过度活跃的个体。13. 根据权利要求1~5中任一项所述的结合分子或抗体，用于治疗患炎症性疾病、神经 疾病或缺血-再灌注(I/R)损伤，或有患这些疾病的风险的个体。14. 根据权利要求13的用于所述应用的结合分子或抗体，其中，所述个体患抗体介导的 炎症或缺血-再灌注损伤，诸如急性心肌梗塞、中风、败血症、免疫复合体病如类风湿性关节 炎、系统性红斑狼疮、脉管炎、多发性创伤、多灶性运动神经病、肾同种异体移植的抗体介导 的排斥、（自体)免疫溶血性贫血、心肺转流术和其他脉管手术、特发性膜性肾病、肺出血性 肾炎综合征。15. -种药物组合物，包括根据权利要求1~5中任一项所述的结合分子或抗体，以及药 学上可接受的载剂。
【专利摘要】本发明涉及与人类补体因子C2结合的结合分子的相关的手段和方法。描述了具体的结合分子具有特异性C2活性抑制特性。这样的结合分子可用于治疗多种人类疾病的症状，该多种人类疾病有炎症性疾病、神经-炎症性疾病或缺血-再灌注(I/R)损伤。疾病。
【IPC分类】C07K16/18, A61K39/395
【公开号】CN105492461
【申请号】CN201480042146
【发明人】C·E·哈克, C·伊尔迪兹, L·波恩, P·J·西蒙斯
【申请人】布罗泰欧制药有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年5月22日
【公告号】CA2913318A1, EP2999714A1, US20160108134, WO2014189378A1
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