作为生物标记物的电中性金属配合物的制作方法
作为生物标记物的电中性金属配合物的制作方法
【专利说明】作为生物标记物的电中性金属配合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年6月18日提交的题目为"作为生物标记物的电中性金属配合物" 美国临时申请No. 61 /956，810的权益，将该申请的内容并入本文作为参考。 发明领域
[0003] 本发明涉及可生物偶联的发光金属配合物，以及它们作为新型标记分子在化学、 生物化学和生物分析领域中的应用，如免疫检测和DNA探针。更具体的说，本发明涉及电中 性的电化学发光标记分子以及它们在电化学发光免疫分析中的应用。
[0004] 发明背景
[0005] 基于生物亲和性（即两种生物活性物质，如抗体/抗原，的选择性结合)的生物分析 方法在很大程度上依赖生物标记分子，标记技术以及对产生于标记分子的信号的检测。生 物标记分子是能够自身，或者在与其它试剂发生物理/化学相互作用时，发出能与被测物质 的量相关的可检测的信号的化学或生物化学物质。生物标记分子包括，但不仅限于:含放射 性原子的分子(放射性），发光化合物(在光激发或化学反应中发光），电活性化合物(通过氧 化还原反应产生电信号），磁性颗粒(磁信号）和酶(通过与底物的反应，生成可检测的物质 或者光信号）。生物标记分子包含一个或多个信号产生单元以及一个或多个反应性基团。后 者与待标记的生物分子易于形成共价键。标记过程是将一个或多个标记分子和生物活性物 质结合形成复合物，该复合物保持对特定待检测物质的生物亲和性。
[0006] 通过一系列的电化学氧化还原反应以及与共反应剂（诸如专利US 6451225和US 6702986中披露的三丙胺)发生的后续化学反应，电化学发光(ECL)已经发展成为一种成熟 的生物分析技术，在此技术中，一种金属配位化合物，如舒（Π )多二亚胺(polydiimine)复 合物，被用作ECL标记分子的信号产生单元。美国专利（5221605,5238808,5310687， 5714089,5731147,6140138,6316607)和许多研究论文披露了ECL标记分子以及它们在免疫 分析和 DNA 探针领域的应用 Η^Ι^η:6·Ρ·Β1α^Λι?Γηθ?Β?·，(：Ηη·αιθπκ1991，37/9，1534-1539;J.H.Kenten et al.，Clin.Chem.l991,37/9,1626-1632·)。
[0007] 对ECL标记分子的改进是一个长期持续的努力方向。一方面，有大量的工作试图通 过在一个或多个与钌（II)离子配位的配体上连接上功能基团而重新设计钌（II)配合物。另 一方面，把ECL发光体从钌（II)配合物扩展到其它金属配合物的努力也进行了很多，其中一 些在专利中有所披露。比如美国专利5858676和6468741分别公开了稀土金属配合物和铼配 合物的 ECL。专利申请 W02012107420，US2013/0323719，US2013/0323857，W02014019707， W02014019708和W02014019711则公开了用作ECL标记分子的基于铱的新型配合物。
[0008] 在基于钌（II)的ECL发光体的改进方面，美国专利US 5981286公开了带有亲水性 双齿配体的钌（II)配合物。W0 99/15694公开了一种分子设计，其中金属配合物发光体通过 共价键与共反应剂（即三丙胺或其类似物)相连接。不过，由于在ECL过程中，共反应剂是要 被消耗的（而不是循环使用），所以它的浓度在实际的生物测定中须比发光体的浓度高很多 倍。这种方案不能帮助提高ECL的强度。为了提高ECL生物检测的灵敏度，美国专利US 5679519公开了一种多标记的探针复合物，它包含有生物素化的牛血清白蛋白分子作为平 台，以及大量被该平台结合的电化学发光标记分子。另外，美国专利申请US 2005/0059834 中也提出了构造担载有多个ECL发光体的树枝状构架从而实现在生物分子的单个位点上进 行多标记（也见M.Zhou et al.，Anal.Chem.2003,75,6708-6717)。
[0009] 进一步地，双齿配体的的选择也已经超越了以2，2 联吡啶和1，10-菲咯啉的基础 类型。美国专利7750157 B2(EP1759204 A1)公开了一种钌（II)标记物设计，其中生物偶联 臂连接在一个既非2，2 联吡啶也非1，10-菲咯啉的双齿配体上。
[0010] 以上专利和研究论文中所披露的这些钌（II)ECL发光体（没有生物偶联基团）和 ECL标记分子(带有生物偶联基团）的一个共同特点是它们都有一个带正电荷的金属配合物 发光体(见图1A)，和不发光的反离子，如氯离子Cr或六氟磷酸根离子PFf等。用这些发光体 标记的物质的生物活性或者选择性亲和能力会由于带正电的金属配合物的引入而降低。降 低了的生物活性在基于生物亲和性的生物检测中会提升非特异性结合，从而降低生物分析 的灵敏度和重复性。针对带有正电性ECL发光体的标记物的这一缺点，美国专利5958783 (CN1134154，EP0720614 B1)公开了一类ECL标记分子(见图1B)，其特征在于，在带正电的发 光体和反应基团（即生物偶联基团）之间有一个带电荷的连接体。据其披露，由于降低了对 蛋白的非特异性结合，这类标记物改进了ECL免疫分析的性能。不过在这个标记物中，信号 产生单元(ECL发光体)本身还是带正电荷的金属配合物，需要反离子来中和其正电荷。
[0011] 同样为了降低有害的非特异性结合，美国专利6808939B2(CN1612861A)公开了一 类带电荷(尤其是负电荷)功能基团的双齿配体（即联吡啶和菲咯啉）以及含有这些带电荷 配体的钌（II)配合物标记分子(见图1C)。这些结构为M(L'）（L"） 2的二杂配标记分子具有负 电荷以及可离解的阳离子。结果显示，一些带负电荷的发光体标记在抗体上后，非特异性的 ECL信号显著降低。然而，在降低非特异性信号的同时，没有显示对特异性信号水平的改进。
[0012] 这些ECL发光体或含这些发光体的标记分子或者带正电荷（绝大多数情况），或者 带负电荷，都需要有反离子来中和电荷。它们都是离子性化合物，在电解液溶液中均会分开 或电离成阳离子和阴离子。此外，已经合成的这些金属配合物或者是二杂配，或者是均配金 属配合物，即配合物中至少有两个二齿配体是相同的。
[0013] L.Della Ciana等（J.Phys.Chem.C 2010,114,3653-3658)描述了一个二杂配两性 离子钌(II)发光体，其含有两个相同的2,2'_联吡啶配体和一个苯磺酸化的菲咯啉配体，该 发光体在水相中的ECL强度与三联吡啶钌（II)配合物相比要高。不过，和其它一些不具有生 物偶联基团的、报道所称的高强度ECL发光体一样，该发光体用于ECL免疫分析不可行，而且 在该金属配合物上引入反应性生物偶联基团的合成方法也未建立。
[0014] 钌(II)配合物在包含有共反应剂和溶剂的特定电解质溶液中的ECL强度随着配体 的结构和配体的组合方式不同而差别巨大。由于ECL产生过程的复杂性(W.Miao et al， JACS，2002，124，14478-14485)，一般共识是，任何单一的性质，诸如光量子效率，氧化还原 电势，发光波长以及发光体的电荷状态与ECL强度没有相关性（M.Zhou et al， Inorg. Chem. 2005，44，8317-8325)。不过，用电中性的发光体标记一个生物物质不会改变该 物质的电荷状态。因此，在大小相近或分子量类似的标记物中，电中性的标记分子对于待标 记生物物质的生物活性的影响最小。鉴于此，本发明注重设计配体的结合方式，以使金属配 合物(例如钌（II)配合物)成为电中性的ECL标记物，其在水性缓冲溶液或任何其它溶剂中 不解离成阳离子和阴离子。
[0015] 在我们通过使用电中性标记物降低标记物对被标记物活性的影响的同时，我们惊 奇地发现电中性的ECL标记物不仅降低了非特异性信号，一部分电中性ECL标记分子还产生 了更高的ECL强度。
[0016] 过去公开的钌（II)配合物标记分子的合成主要遵循一种方法(见下面反应式）。在 这种方法中，首先合成顺式I了二亚胺二氯化物(cis-ruthenium diimine(L)dicholoride)， 即cis-RU(L)2Cl 2)，然后再将具有生物偶联功能的二亚胺配体与金属离子配位。
[0017] RuCl3\xH2〇+L-cis-Ru(L)2Cl2(l)
[0018] cis-Ru(L)2Cl2+L'-Ru(L)2(L'）C12(2)
[0019] 美国专利US 6808929B2公开了另一种合成方法(专利中的实施例2)。其中，一个具 有生物偶联功能的二亚胺配体，即4-甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_联吡啶，先和氯化钌（II) 发生配位，而后再引入另外两个相同的配体，形成ECL标记物。
[0020] 这些合成方法产生二杂配配合物标记分子，它们具有两个不具有生物偶联功能的 相同配体和一个具有生物偶联功能的配体。合成三杂配金属配合物ECL标记分子的工作在 现有技术中还未见报道。
[0021] 不同于图1A-C中那些具有带正电荷或者带负电荷的钌（II)发光体，图1D所示的电 中性ECL标记分子具有三个不同的配体，不能套用二杂配配合物标记分子的合成方法来进 行合成。所以，本发明中除了披露配体组合模式外，该发明也涉及一种将三个不同的二亚胺 配体依次与金属离子配位形成三杂配ECL标记分子的合成方法。
[0022]本发明进一步公开了用这类中性ECL发光体标记的生物物质以及它们在ECL免疫 分析中的应用。
[0023] 本发明的一个目的是提供具有电中性金属配合物发光体的发光生物标记物。
[0024] 本发明的另一个目的是提供导致金属配合物发光体呈电中性的不同的配体组合 模式。
[0025] 本发明的又一个目的是提供具有电中性金属配合物发光体的三杂配标记物的合 成方法。
[0026] 本发明的再一个目的是提供标记有电中性金属配合物发光体的物质。
[0027] 本发明还有一个目的是提供用于开展化学物质、生物化学物质和生物活性物质的 ECL定量分析的生物标记分子。
[0028] 发明概述
[0029]本发明涉及生物分析方法的改进，具体来说是利用金属配合物的电产生化学发光 或电化学发光(ECL)的免疫分析和核酸检测。本发明所描述的金属配合物以钌（II)配合物 作为实例。但是，能生成与金属钌(II)多二亚胺配合物类似的金属螯合物的其它过渡金属， 如金属锇、铂、铼、铱等，也在本发明的涵盖范围内。
【附图说明】
[0030]图1展不现有技术公开的(A-C)和本发明披露的(D)ECL标记分子。
[0031] 图2是化合物3的1H NMR图谱。
[0032] 图3是化合物6的1H NMR图谱。
[0033] 图4是化合物10的1H NMR图谱。
[0034] 图5是化合物15的1H NMR图谱。
[0035] 图6是化合物16的1H NMR图谱。
[0036] 图7是标记分子17的1H NMR图谱（图谱左边:芳香环区；图谱右边:脂肪链区）。
[0037] 图8是标记分子18的1H NMR图谱。
[0038] 图9是标记分子19的1H NMR图谱。
[0039] 图10是标记分子20的1H NMR图谱。
[0040] 图11是标记分子16，19,27和Ru(2,2'_联吡啶)2[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (标识为Ru-Ref)的吸收光谱。
[0041 ] 图12是标记分子16，19,27和Ru(2,2'_联吡啶)2[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (标识为Ru-Ref)的光致发光光谱。
[0042]图13比较不同标记分子在含有三丙胺的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中以1.4V vs.Ag/AgCl阶跃电势激发所得到的电化学发光强度。钌（II)配合物的浓度均为:0.1μπι〇1 L-、
[0043] 图14比较标记分子16和Ru-Ref在含有三丙胺的pH值为6.8的磷酸缓冲溶液中以 1.4V vs.Ag/AgCl电阶跃电势激发所得到的电化学发光强度。钌(II)配合物的浓度分别为： 10-7，10- 8，10-9mol L-、
[0044] 图15比较使用标记分子16和Ru-Ref在免疫分析测试中的ECL信号强度。
[0045] 发明详述
[0046] 本文中所用到的术语"金属配合物"，"配位金属配合物"，"发光金属配合物"，"ECL 金属配合物"，"钌（II)配合物"，"金属钌（II)配合物"和"金属螯合物"有时可交替使用。在 本发明的范围里，金属配合物或者ECL金属配合物包含"发光体"或"ECL发光体"以及"标记 分子"或"ECL标记分子"。前者是没有生物偶联基团的金属配合物，而后者则指的是具有生 物偶联基团的金属配合物。生物偶联基团是一类功能化的或能进行反应的反应性基团，它 可以在温和的条件下，如处于室温的生理缓冲溶液中，和其它化学、生物化学和生物物质发 生反应，形成高度稳定的共价键。
[0047] 在本发明的范围内，被称作"标记物"，"标记物分子"，"钌(II)标记物"和"ECL标记 物"的物质可与其它物质形成共价键，这些其它物质诸如，具有生物活性的被测物或其类似 物，基于亲和性的被测物的识别性配对物或 其类似物，前述识别性配对物的结合配对物，或 者能与被测物形成共价键的反应性化学物质，其类似物或结合配对物。上述物质也可以与 一个或多个结合配对物和/或一个或多个反应性组分形成的组合相连接。另外，上述物质也 可连接与结合配对物、反应性组分、或者一个或多个结合配对物和/或一个或多个反应性组 分形成的组合相连接的被测物或其类似物。落入本发明范围的还包括多个有待直接、或通 过如上述的其它分子连接到被测物或其类似物的上述物质。
[0048]本专利涉及电中性的带有金属配合物发光体的ECL标记物。本文中可能用到的短 语"中性"，"电中性"或者"电子中性"指的是金属阳离子的正电荷被阴离子性的多原子取代 基团所平衡或者中和的状态，这些阴离子性的多原子取代基团直接或者间接地键接于双齿 (优选二亚胺)配体上的一个或多个芳环上。这类配体包括2,2'_联吡啶，1，10-菲咯啉及其 衍生物。
[0049] 由于在配位金属配合物中的金属离子的阳离子本性，现有技术中公开的标记分子 的电中性是由反离子达成的。对于带正电荷发光体的ECL标记物（例如美国专利US 5221605,5238808,5310687,5714089,5731147,6140138,6316607)，反离子是氯离子、六氟 磷酸根离子等。而对于带负电荷发光体的ECL标记物(披露于美国专利US 6808939)，反离子 例如是钠离子或质子。因此，现有技术中公开的ECL发光体和ECL标记物在化学上均为离子 型化合物，其在适宜的电解质溶液中，比如磷酸盐缓冲溶液中，离解为阳离子和阴离子。
[0050] 本发明所公开的带有电中性发光体的ECL标记物是电中性的两性离子。在本发明 所公开的金属配合物发光体结构中，金属阳离子的正电荷被一个或多个双齿配体(优选是 二亚胺）的芳环上的带负电荷的取代基所中和。因此，本发明所公开的ECL发光体和ECL标记 分子在溶解于电解质溶液中时，不会离解为阳离子和阴离子。
[0051] 这类电中性的金属配合物标记物具有以下通式
[0052] Mn+[L，L，，L，，，]n-(I)
[0053] 其中，Μ选自过渡金属，优选是钌或者锇;η是电荷数，等于或者大于2;L'、L"和L"' 独立地选自含氮杂环双齿配体，优选选自2，2联吡啶、1，10-菲咯啉及其取代的同系物。至 少有一个配体具有至少一个可生物偶联的反应基团，如羧基、N-琥珀酰亚胺基羧酸酯(NHS 酯）、N-羟基磺化琥珀酰亚胺基羧酸酯(磺化-NHS酯）、亚磷酰胺、异硫氰基、甲酰基、氨基、肼 基、羟基和马来酰亚氨基等。
[0054]基于三个二亚胺配体是相同还是不同的，三-二亚胺金属配合物可能是均配、二杂 配或三杂配的。对于正二价的金属离子，如钌（II)，不可能形成电中性的均配型三-二亚胺 配合物。因此，本发明只涉及二杂配和三杂配金属配合物，特别是具有以下结构的三杂配金 属配合物：
[0055] Μη+[?ΛΑ3]η-(II)和
[0056] Μη+[?ΛΛ/]η-(III)
[0057] 其中，Μ选自过渡金属，优选是钌或者锇;η是电荷数，等于或者大于2。
[0058] L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2 联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，如 下所示：
[0059]
[0060] L1具有至少一个反应基团（X)，比如羧基、Ν-琥珀酰亚胺基羧酸酯(NHS酯）、Ν-羟基 磺化琥珀酰亚胺基羧酸酯(磺化-NHS酯）、亚磷酰胺、异硫氰基、甲酰基、氨基、肼基、羟基和 马来酰亚氨基，X直接(无需连接体Τ)或者间接(通过连接体Τ)与一个芳环连接。Τ是含碳或 者含杂原子的连接体，包括Ci-Cn)的亚烷基、CrCn)的亚烯基、Q-Cn)的烷氧基、-⑶NH-Q- &0-、-顯(》-(：1-&()-、-(：1-(： 9-〇)順1?1-、取代或非取代的5-或者6-元芳环。1是氢或者任何不带 电荷的取代基团，优选为Ci-Cio的烷基、Ci-Cio的烯基、Ci-Cio的烷氧基、 -CONH-Ci-Cio、-NHCO-Ci-Ciq、-Ci_C9 -C0NHR3、取代或非取代的5_或者6_兀芳环、羟基、氨基、腈、氰基或者卤素。 [0061 ] L2是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2 联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，如
下所示-
[0062]
[0063] 1/具有带电荷的取代基团，它的总负电荷数与η相同（η大于或等于2,优选为2)，其 中Ε是带电荷基团；Α是含碳或者含杂原子的连接体。优选地，Ε是带负电荷的基团，比如_ S03-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ03Η-等;A是含碳或者包含杂原子的连接体，包括CrCw的烷基、&-&〇 的烯基、&-CK)的烷氧基、-CONH-Ci-Cio-、-NHCO-Ci-Cio-、-Ci-Cg-CONHRr、取代或非取代的 5-或者6-元芳环。
[0064] L3是电中性的含氮杂环双齿配体，优选选自不带电荷的2,2'_联吡啶，1，10-菲咯 啉，或者其上至少带有一个取代基团W'。取代基团W'优选是氢或者不带电荷并且在温和水 溶液条件下不具有反应性的取代基团，例如Ci-Cnj的烷基Xi-Cio的烯基、&-&〇的烷氧基、_ CONH-CrCn)、-NH⑶-Ci-Cio、-CrCg-CONHRs、取代或非取代的5-或者6-元芳环、羟基、氨基、 腈、氰基或者卤素。
[0065] L4和L5各自是带有单价阴离子的含氮杂环双齿配体，优选选自取代2,2'_联吡啶和 1，10-菲咯啉，如下所示：
[0066
[0067] L4PL5各自具有带负电荷的取代基，其中E是带电荷基团，A是含碳或者含杂原子的 连接体。优选地，E是带负电荷的基团，比如-S0 3_、-0S03_、-Ρ03Η_、-0Ρ03Η，; A是含碳或者包 含杂原子的连接体，包括Ci-Cn)的烷基Xi-Cn)的烯基Xi-Cn)的烷氧基、-⑶NH-Ci-Cn)-、-NHCO-Ci-Cio-、-Ci-CVCONHRi-、取代或非取代的5-或者6-元芳环。
[0068] 以二氯(对异丙基甲苯)钌（II)二聚体，即[(对异丙基甲苯)RuC12]2,作为起始原 料，依次用两个二亚胺配体逐步替代其中的两个对异丙基甲苯分子，下面的通用合成方法 使得三个二亚胺配体(相同或者不同）与金属离子逐步配位：
[0069] [(对异丙基甲苯)RuC12]2+L' - (对异丙基甲苯）（L'）RuC12
[0070] (对异丙基甲苯）（L'）RuC12+L"4(L"）（L'）RuC12
[0071] (L"）（ L，）RuC 12+L" ' -（ L，）（ L"）（ L"，）Ru
[0072] (这里，L'、L"和L" '是L\L2和L3,或者L\L4和L5)
[0073] 本发明提出了同样的三杂配目标配合物（L'）（L"）（L"'）Ru能够从不同的起始原 料，通过不同的中间体合成出来。在钌（II)中心引入配体的具体顺序并不重要。这种配体置 换循序上的适应性有助于减少在制备供筛选的大量化合物时所需的合成步骤数目，因为不 同的目标化合物可以共用某些通用中间体。
[0074] 例如，改变上述三个反应的配体替换顺序，我们可以有如下的另一个合成路径：
[0075] [(对异丙基甲苯)RuC12]2，+L" ' -(对异丙基甲苯）（L" '）RuC12
[0076] (对异丙基甲苯）（L" '）RuC12+L' -（L'）（L" '）RuC12
[0077] (L，）（L，，，）RuCl2+L，，-（L，）（L，，）（L，，，）Ru
[0078] (这里，L '、L" 和L"，是L1，L2和L3，或者L1，L 4和L5)
[0079] 总之，合成顺序包括以下步骤。首先，使[(对异丙基甲苯)RuC12]2和L'、L"或L"'反 应形成第一中间体(对异丙基甲苯）（1/)此(：1 2、（对异丙基甲苯）（1；'）此(：12或(对异丙基甲 苯）（L" '）RuC12。第二步，通过使(对异丙基甲苯）（L'）RuC12与L"或L" '反应，使(对异丙基甲 苯）（L"）RuC12与L'或L"'反应，或使(对异丙基甲苯）〇；''）此(：1 2与1/或1；'反应，将第一中间 体转化为第二中间体(L'）（L"）RuC12，（L'）（L" '）RuC12或者(L"）（L" '）RuC12。第三步，使(L'） 〇；'）此(：12与1；''反应，或使〇/)〇；''）1^1 2与1；'反应，或者使〇；'）〇；''）1^12与1/反应，将 第二中间体转化为〇/)〇；'）〇；''）此。在以上的合成步骤中，1/、1；'和1；''可以替换为1^儿 2和 L3，或者替换为L1，L4和L5，以保持在钌核的周围布置有三个配体。
[0080] -系列的合成实施例证明了任何配体都可以在上述的通用合成路径中的任何一 个步骤中与钌（II)配位。表1列出了以上和以下定义的1^丄 2丄3丄4和1^配体，它们将被用于 本发明的实施例中。
[0081 ]表1本发明实施例中所用到的双齿二亚胺配体示例
[0082]
[0083]如上所述，L1是生物偶联功能化的含氮杂环双齿配体，优选选自2,2'_联吡啶、1， 10-菲咯啉以及它们的取代的同系物。L1无论是游离态或者与金属离子配位后，都能够与生 物物质在温和的条件下发生反应或者偶联。所述功能基团或者生物偶联基团选自羧基、N-琥珀酰亚胺基羧酸酯(NHS酯）、N-羟基磺化琥珀酰亚胺基羧酸酯(磺化-NHS酯），亚磷酰胺、 异硫氰基、甲酰基、氨基、肼基、羟基和马来酰亚氨基等。除了表1中所列举的本发明中用作 ECL标记物合成实施例的配体外，L1还可以选自以下，但不局限于以下，可生物偶联的二亚 胺配体：
[0084]
[0085]
[0086] L1尤选是具有肉个货电何的ΙΓΜΙ泶朴双齿配怀，1尤选选目m天μκ哫和1，1U-菲 咯啉的衍生物。表1中所示的配体L 2为磺酸化的2,2'_联吡啶和1，10-菲咯啉的衍生物。示例 的配体的荷负电基团是-S03-。不过，该负电基团也可以选自-0S0 3-、-Ρ03Η-、-0Ρ03Η-等。合成 过程中使用的原料或中间体可以盐形式存在，比如钠盐。除了表1中所列举的本发明中用作 ECL标记物合成实施例的配体外，L2还可以选自以下，但不局限于以下的二价阴离子二亚胺 配体：
[00871 一·ι.η η -
[0088] L3是不带任何电荷基团的含氮双齿配体，优选选自2,2'-联吡啶、1，10-菲咯啉以 及它们的取代的同系物。除了表1中所列举的本发明中用作ECL标记物合成实施例的配体 外，L 3还可以选自以下配体，但不局限于以下配体：
[008?
一IN IN- 一IN M- 一IN IN -
[0090] L4和L5优选为一价阴离子型含氮杂环双齿配体，优选选自2，2 联吡啶和1，10-菲 咯啉的衍生物。表1所例示的L4和L5配体为磺酸化的2,2'_联吡啶和1，10-菲咯啉的衍生物。 所示配体中的的负电荷基团是-S03_。但负电荷基团也可选自-0S03_、-Ρ03Η_、-0P0 3Hg。合成 过程中的起始原料或中间体可以盐形式存在，比如钠盐。除了表1中所列举的本发明中用作 ECL标记物合成实施例的配体外，L4和L5还可选自，但不局限于，以下描述的一价阴离子二亚 胺配体：
[0091]
[0092] 表1中所例不的配体Li谷目具有羧酸基团作为生物偶联基团。在形成多二业肢金 属配合物以后，该羧酸基团可以容易地转化为N-琥珀酰亚胺酯(NHS酯）和N-羟基磺化琥珀 酰亚胺酯（磺化-NHS酯）。具体将羧酸基团转化为NHS酯的方法详见文献(M.Zhou et al， Anal. Chem. 2003，75，6708-6717)和专利（如US6808939 B2)。在转化过程中，通常使用N，N-二环己基碳酰二亚胺(DCC，溶于二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，乙腈，四氢呋喃 等有机溶剂)或者1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，用于水溶液）。
[0093] 由于有大量可供选择的配体作为钌（II)的潜在配位伙伴，以及以上描述的合成方 案的灵活性，多种可能的配体组合方案可以导致电中性的钌配合物，即Μ η+α?3]η?ΡΜη+ α?5]η'这些钌配合物的例子如下所示。这些钌标记物的合成在实施例中举例描述。
[0094]
[OUVDJ
[C
[0098]
[0099」
[ο
[0104] 本发明进一步提供了标记的生物分子，它由电中性的金属配合物与生物分子反应 形成，它们具有如下结构：
[0105] {Mn+[L，L，，L，，，]n-}m_B(V)，
[0106] {Μη+[?ΛΑ3]η-} m_B(VI),
[0107] {Mn+ [ LH5 ]n-} m_B (V11)，or
[0108] {Μη+[?ΛΛ]η-}m-B(VIII)
[0109] B是具有化学、生物化学或者生物活性的物质，优选选自半抗原、氨基酸、核酸、核 苷、核苷酸、蛋白质、适配子、抗体和抗原等;m是大于或者等于1的整数。
[0110]经过标记的生物分子被用作生物分析，所述生物分析涉及对金属配合物在光子激 发或电化学激发下产生的发光的测量。进一步的步骤 包括进行电化学发光分析，其中电化 学发光分析是电化学发光免疫分析和电化学发光DNA测定。
[0111] 在电化学发光分析中，电中性的金属配合物受促发光。在一确定时间段内。所发出 的光的强度或者光子数与被测物的浓度相关。 实施例
[0112] 配体合成
[0113] 1.具有生物偶联基团的2,2'_联吡啶配体合成:4-(2,2'_联吡啶-4-基)正丁酸(化 合物3) ^Λ? ? >1 ?
[0115] 将35〇111以0.56111〇1)1.61的正丁基锂的己烷溶液加入-78°〇的含二异丙基胺 (82.8mL，0.59mol)的1.5L无水四氢呋喃(THF)中，在-78°C氮气保护条件下搅拌该混合物1 个小时。86.6g(0.50mol )2_溴-4-甲基吡啶溶于200mLTHF中，然后将该溶液加入到二异丙基 氨基锂(LDA)溶液中。反应4小时后，将3-溴丙腈(75g，0.56mo 1)溶于1 OOmL无水THF的溶液滴 加到混合物中，反应温度提升到〇°C，在此温度下继续反应24小时。然后将反应混合物倒入 500mL水中，并用1M的盐酸中和该溶液。产物用乙酸乙酯萃出。合并的乙酸乙酯溶液经盐水 洗涤后，用无水硫酸镁干燥，随后旋转蒸发。粗产品经过柱色谱分离后，得到51.5g化合物1 (收率为46%)</H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ8·30(1Η)，7·35(1Η)，7·11(1Η)，2·78(2Η)，2·40 (2Η)，2·01(2Η) 〇
[0116] 将 18.38(81.3111〇1)化合物1和3(^(81.5111〇1)2-(三正丁基锡）吡啶在40011^甲苯中 用氮气鼓泡10分钟，随后加入5.0g四（三苯基膦）。该混合物在氮气保护下回流60个小时后 冷却至室温。将混合物中的黑色固体滤除，将滤液旋转蒸发，再重新用二氯甲烷溶解。该溶 液通过一个经过三乙胺处理过的硅胶色谱柱，用乙醚/乙酸乙酯（1:1)洗脱。旋转蒸发后，得 至丨Jl5g化合物2(收率为81.5%) </H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ8.67( 1H)，8.59( 1H)，8.40( 1H)， 8·26(1Η)，7·81(1Η)，7·31(1Η)，7·14(1Η)，2·85(2Η)，2·37(2Η)，2·05(2Η)。
[0117] 将1 OOmL浓盐酸（12mo 1L-1)加入15g (67 · 2mmo 1)化合物2中并回流19个小时。往室温 下的酸混合物中加入氨水溶液，调节溶液pH至5。产物用乙酸乙酯萃出，旋蒸得到灰色粉末， 再重新用甲醇溶解后滴入水中。经过滤和真空干燥后收集到白色沉淀物3。得到10.5g(收率 64.5%)。咕 NMR(CD30D，400M Hz，见图2)δ8 ·65( 1Η)，8·53( 1Η)，8 ·27( 1Η)，8 ·17( 1Η)，7·93 (1Η)，7·43(1Η)，7·32(1Η)，2·79(2Η)，2·37(2Η)，2·01(2Η)。
[0118] 2.具有生物偶联基团的1，10-菲咯啉配体的合成:5-((菲咯啉-5-)氨基)-5-戊酮 酸(化合物4)。
[0119]
[0120] 将158(76.8111111〇1)1，10-菲咯啉-5-胺和9.28(80111111〇1)戊二酐在15011^01^中混合。 在氮气保护下，加热反应混合物至50°C持续7小时。反应完成后，将溶剂DMF旋转蒸发，用乙 醇洗涤残余物并过滤。将得到的固体研磨后，再用乙醇洗涤，随后真空干燥，得到llg白色粉 末4(收率46%)</H NMR(CD30D，400M Ηζ)δ12· 13(s，lH)，10.12(s，lH)，9.10-9.00(d，J = 36Hz，2H)，8.58(d，lH)，8.44-8.42(d，J=8Hz，lH)，8.16(s，lH)，7.82-7.79(m，lH)，7.73-7·70(m，1H)，2·56(m，2H)，2·33(m，2H)，1·94-1·86(m，2H)。
[0121] 3. -价阴离子配体(盐形式)合成：（4'_甲基_2,2'_联吡啶-4-基）甲磺酸钠(化合 物6)
[0122]
[0123] 将20g(108.5mmo 1)4，4 ' -二甲基-2，2 ' -联吡啶溶解于400mL无水四氯甲烷中，再加 入19g(106.8mmol )N-溴代琥珀酰亚胺和2.6g过氧化苯甲酰。将混合物回流过夜并冷却至室 温。滤除混合物中的固体，滤液用旋转蒸发仪浓缩。将浓缩液通过经过三乙胺处理的硅胶色 谱柱，得到68的4-(溴甲基)-4'-甲基-2,2'-联吡啶(化合物5)，将其与4.98(38.9_31)亚硫 酸钠和100mL水混合，所得浑浊液回流6小时。趁热将上清液浓缩到30mL并冷却到室温。将析 出的黄色沉淀过滤收集，并用二氯甲烷洗涤，最终得到3.6g(4'_甲基_2,2'_联吡啶-4-基） 甲磺酸钠（化合物6)</H MMR(D2〇,400M Hz，见图3)δ8·81(1Η)，8·67(1Η)，8·44(1Η)，8.30 (1Η)，7·88(1Η)，7·76(1Η)，4·42(2Η)，2·73(3Η)。
[0124] 4.另一个一价阴离子配体(盐形式）的合成：（4'_羟甲基_2,2'_联吡啶-4-基）甲磺 酸钠(化合物8)
[0125]
[0126] 将 3g(23 · 8mmol )Na2S03和 3 · 9g( 13 · 97mmol)化合物 7 混合于 35mL 水中，化合物7 是由 [2,2'_联吡啶]_4,4'_二甲醇制备4,4'_二(溴甲基)-2,2'_联吡啶的副产物。将混合物在氮 气保护下回流5小时。将反应液旋转蒸发，并将溶解在含有10%甲醇的水溶液中。经硅胶色 谱柱后，得到4.1g淡粉色产物。产率97%</Η NMR(D20,400M Ηζ)δ8·53(1Η)，8·48(1Η)，7·92 (1Η)，7·84(1Η)，7·49(1Η)，7·38(1Η)，4·69(2Η)，4·24(2Η)。
[0127] (对异丙基甲苯）（L'）RuC12的合成
[0128] 我们证明，选自表1中1^儿2儿3儿4儿5的任何一个配体1/能用作初始材料与二氯(对 异丙基甲苯)舒（II)二聚体，即[(p-cymeme)RuCl2]2,反应生成一个中间体(对异丙基甲苯） (L，）RuC12〇
[0129] 5.(对异丙基甲苯）（2,2'_联吡啶)RuC12(化合物9)的合成
[0130]
[0131] 将2.(^(3.27臟〇1)[(对异丙基甲苯)1?11(：12]2和1.038(6.59臟〇1)2,2'-联吡啶溶解 于400mL甲醇中，将该溶液回流8小时。在反应过程中，溶液的颜色从红色变为黄色。旋转蒸 发最终反应液后，所得固体经硅胶色谱柱提纯，甲醇/水洗脱剂洗脱得到1.64g黄色粉末(化 合物9)</H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ9·76(2Η)，8·40(2Η)，8·07(2Η)，7·75(2Η)，6·22(2Η)，6·09 (2Η)，2·74(1Η)，2·29(3Η)，1·05(6Η)。
[0132] 6.(对异丙基甲苯）（4,7-二苯基-1，10-菲咯啉)RuC12(化合物10)合成
[0133]
[0134] 将0 · 613g( 1 · Ommol)[(对异丙基甲苯)RuCl2]2和0 · 665g(2mmol )4，7 ' -二苯基-1， 1 〇-菲咯啉溶解于50mL乙醇中，在氩气保护下将溶液回流4小时。旋转蒸发乙醇，黄色固体溶 于二氯甲烷后滴入无水乙醚中。过滤收集黄色沉淀，并真空干燥。得到1.21g产物（收率 95%)</H NMR(CD30D，400M Hz，见图4)δ9.89((1, J = 5.5Hz，2H)，8.13((1, J = 2.5Hz，2H)，8·05 (d，J = 5.4Hz，2H)，7.73-7.57(m，10H)，6.29(d，J = 6.4Hz，2H)，6.06(d，J = 6.3Hz，2H)，2.74 (m，J = 13.6,6.8Hz，lH)，2.30(s，3H)，1.07(t，J = 10.6Hz，6H)。
[0135] 7.(对异丙基甲苯）（红菲咯啉二磺酸钠)RuC12(化合物11)合成
[0136]
[0137] 将浴fl50mL甲醇中的0.8068(1.316臟〇1)[(对弁内基甲苯）此(：12」2和浴亍7511^水 中的1.412g(2.632mmol)红菲咯啉二磺酸钠混合并在氩气保护下溶液回流4小时。旋转蒸发 除去溶剂后得黄色固体2.2g，该化合物无需提纯直接用于后面的反应步骤。
[0138] (L，）（L，，）RuC12 的合成
[0139] 我们证明，选自表1中^2、1^、1>丄5的任何一个配体1；'能替换中间体(对异丙基甲 苯）（L'）RuCl冲的剩余对异丙基甲苯，从而形成〇/)〇；'）1^12。由于立体异构体混合物分 离困难，这些二氯杂配二亚胺配合物未经提纯直接用于制备三杂配ECL标记物。作为示例， 图5给出化合物15在⑶30D中的 1H NMR谱图。
[0140] 8.合成cis-(2,2'-联吡啶）[4-(2,2'_联吡啶-4-基）丁酸]RuC12配合物（化合物 12)〇
[0141]
[0142] 将0 · 44g( 1 · 8mmol )4-(2，2 ' -联吡啶-4-基）丁酸和0 · 83g( 1 · 74mmo1 )(对异丙基甲 苯）（2,2'_联吡啶)RuC12以及0.61g(14.39mmol)氯化锂混合于15mL DMF中。混合物在氮气 保护下回流3小时。反应过程中，溶液颜色从黄色变为深紫色。在混合物冷却至室温后，在搅 拌下，将混合物倒入200mL乙醚中。过滤收集深紫色的沉淀，再以甲醇/水为淋洗剂，用硅胶 色谱柱除去少量带有荧光的副产物。产出产品0.40g(收率40 % )。
[0143] 9.cis-(2,2'-联吡啶）[4_ 甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_联吡啶]Ru(II)C12(化合物 13)的合成。
[014
[0145] 化合物13的合成方法与化合物12相同。
[0146] l〇.cis-(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉）[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸钠]Ru(II)C1 2 (化合物14)的合成
[0147]
[0148] 将1.568(4.02111111〇1)2,2'-联吡啶-4,4'-二甲磺酸钠和2.568(3.92111111〇1)(口-cymeme) (4,7_二苯基-1，10-菲略啉）RuCl2以及 1 · 35g(31.84mmol)氯化裡混合于50mL DMF 中。将该溶液在氮气保护下回流3小时。冷却至室温后，将深紫色混合物倒入400mL丙酮中。 收集深紫色固体。滤液中也发现含有一定量的产物，因此将滤液旋转蒸发。合并后的紫色固 体以甲醇为淋洗剂，用硅胶色谱柱处理。最后将紫色的浓溶液滴入干燥的乙醚中，经过滤和 干燥，得到深紫色固体3.4g(收率97 % )。
[0149] 11. (2，2'-联吡啶）（红菲咯啉二磺酸钠)Ru(II)C12配合物(化合物15)的合成
[0150]
11 1S
[0151] 将0.355g(2.27mmol)2,2'-联吡啶和1.785g(2.12mmol)(对异丙基甲苯)红菲咯啉 二磺酸钠)RuC1 2以及0.772g( 18.2mmol)氯化锂混合于30mL DMF中。该溶液在氮气保护下回 流3.5小时。在冷却至室温后，旋转蒸发深紫色溶液，固体再溶于甲醇中。硅胶色谱柱纯化产 出1.75g深紫色固体(异构体混合物）。图5是化合物15在CD 30D中的1H NMR图谱。
[0152] (L，）（L"）（L" '）Ru标记物的合成
[0153] 12.三杂配金属配合物标记物-Ru(2，2 ' -联吡啶）（红菲咯啉二磺酸盐）[4_(2，2 ' -联吡啶-4-基)丁酸](16)的合成
[0154]
[0155] 标记物16经两种不同的方案进行合成。在方案A中，一个二价阴离子配体，红菲咯 啉磺酸钠盐(在本发明中定义为L2)，替代(Oa^RuCls配合物12中的两个配位氯原子，生 成目标标记物16。在方案B中，一个可生物偶联的配体，即化合物3,4-(2,2'_联吡啶-4-基） 正丁酸(在本发明中，定义为L 1)，替代(L2)(L3)RuC12配合物15中的两个配位氯原子，生成同 样的目标标记物16。两种合成方案的细节如下所示。
[0156] 方案A:将200mg(0.35mol)的化合物12和191.811^(0.36臟〇1)红菲咯啉磺酸钠盐溶 解于25mL甲醇/水(4:1)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3.5小时。在反应过程中，溶液 由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤，滤液浓缩至5mL，再用甲醇/水(2:1)溶液做淋洗 剂，经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发并真空干燥后，得到目标化合物。产量200mg。
[0157] 方案 B:将800mg(0.925mol)化合物 15 和 224mg(0.925mmol)4-(2,2'-联吡啶-4-基） 正丁酸(化合物3)溶解于40mL甲醇/水(3:1)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3小时。在 反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤，滤液浓缩至10mL，再用甲醇/水 (2:1)溶液做淋洗剂，经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发 并真空干燥后，得到目标化合物。产量 650mg，产率65%。图6是其 1H NMR图谱。4 NMR(CD30D，400M Ηζ)δ8·60-8·85(4Η)，7·22-8·35 (25Η)，2·78-2·96(2Η)，2·22-2·36(2Η)，1·90-2·08(2Η)。
[0158] 11.由通用的中间体(L2)(L3)RuC12配合物（15)出发用不同的可生物偶联的配体 (本发明中定义为L 1)合成制备两种三杂配金属配合物标记物:Ru(2,2'_联吡啶）（红菲咯啉 二磺酸盐）[4-甲基-4 ' -(3-羧丙基)-2，2 ' -联吡啶](17)和Ru(2，2 ' -联吡啶）（红菲咯啉二 磺酸盐）[5-( (1，10-菲咯啉-5-基)氨基)-5-戊酮酸](18)。
[0159]
[0160] 化合物17和18便用前?的万案B进仃合成。
[0161] 标记物 17:将 505mg(0.58mol)化合物 15 和 17911^(0.70_〇1)4-[4'-甲基-(2,2'-联 吡啶)-4-基]正丁酸溶解于30mL甲醇/水(3:1)中，在氮气保护条件下将溶液回流3.5小时。 在反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤旋转蒸干。将固体再次溶解于 甲醇/水混合物中，并经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发并真空干燥，得到目标化合物。产量 410mg。图7是其 1HNMR图谱。4 MMR(CD30D，400M Ηζ)δ8·57-8·80(4Η)，7·90-8·34(11Η)， 7·52-7·84(10Η)，7·34-7·45(2Η),7.18-7.29(1Η)，2·77-2.95(2Η)，2·52-2·66(3Η),2.10-2·34(2Η)，1·87-2·08(2Η)〇
[0162] 标记物 18:将 340mg(0.39mmol)化合物 15 和 121·6mg(0·39mmol)5-((l，10-菲咯啉-5-基)氨基)-5-戊酮酸溶解于35mL甲醇/水(6:l)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3.5小 时。在反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤旋转蒸干。将固体重新溶 解于甲醇产/水混合物中，并使用甲醇/水(2:1)作为洗脱剂经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发 并真空干燥，得到目标化合物。产量300mg，产率75 %。图8是其1H NMR图谱。
[0163] 12.由通用中间体(L2)(L3)RuC12配合物（14)合成在2,2'_联吡啶上带有荷电基团 的两种三杂配标记物:Ru(2，2 ' -联吡啶-4，4' -二亚甲磺酸盐）（4，7-二苯基-1，10-菲咯啉） [4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸](19)和Ru(2,2'_联吡啶_4,4'_二亚甲磺酸盐）（4,7_二苯基-1，10-韮咯卩林）(? . 1 0-韮咯卩林-5-某）氣某酸? QO) "
[0164]
[0165] 标记物 19:将2.00g(2.24mmol)化合物 14和0·54g(2·23mmol)4-(2,2'-联吡啶-4-基)正丁酸(化合物3)溶解于35mL甲醇/水(6:l)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3.5小 时。在反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤并旋转蒸干。将固体重新 溶解于甲醇/水混合物中，再用甲醇/水(4:1)溶液做淋洗剂，经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸 发后，将浓缩后的溶液滴入无水乙醚中，过滤，得到棕色粉末产物630mg，产率27.6 %。4 NMR(CD30D，400M Hz，见图9)? NMR(CD30D，400M Hz,Figure 9)δ8·60-8·85(4Η) ,7.20-8.40 (25Η)，4·10-4·45(4Η)，2·73-3·00(2Η)，2·12-2.34(2H)，1.83-2.10(2H)。
[0166] 标记物 20:将 500mg(0.56mmol)化合物 14 和 173mg(0·56mmol)5-((l，10-菲咯啉-5-基)氨基)-5-戊酮酸溶解于35mL甲醇/水(6:l)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3小时。 在反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤并旋转蒸干。将固体重新溶解 于甲醇/水混合物中，再用甲醇/水(4:1)溶液做淋洗剂，经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发并 真空干燥后，得到目标化合物。产量180mg，产率29.6%。图10是其 1H NMR图谱。
[0167] 13.三杂配金属配合物的合成-Ru(2,2'_联吡啶）（2,2'_联吡啶_4,4'_二亚甲磺酸 盐）[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸](21)
[0168]
[0169] 将 145 · 5mg(0 · 375mmol )2，2 ' -联吡啶-4，4' -二亚甲磺酸钠和 203 · 4mg(0 · 357mmol) 化合物12混合于15mL水/甲醇(40:60)溶液中。将该深紫色溶液在氮气保护条件下回流3小 时。得到的明亮的橙色溶液经旋转蒸发浓缩并用水/甲醇(30:70)做淋洗剂，经过硅胶色谱 柱提纯，得到 150mg橙色化合物21。4 NMR(CD30D，400M Ηζ)δ8 · 64-8 · 79(5H)，8 · 59(1H)，8 · 10 (3Η),7.67-7·90(6Η),7.41-7·57(5Η),7.32-7.38(lH)，4.26(s，4Η)，2·81-2·90(2Η),2.17-2·28(2Η)，1·93-2·05(2Η)〇
[0170] 14.三杂配标记物的合成-Ru[(4'_甲基-2,2'_联吡啶-4-基）甲磺酸根][(4'_羟甲 基-2，2 ' -联吡啶-4-基）甲磺酸盐）[4-( 2，2 ' -联吡啶-4-基)丁酸](24)
[0171]
[0172] 将1 · 22g(2 · Ommol)[(对异丙基甲苯)RuC12]2和 0 · 969g(4 · Ommol )4-(2，2 ' -吡啶-4-基)丁酸溶解于300mL甲醇中，将该溶液回流6小时。旋转蒸发最终的溶液并使用甲醇用硅胶 色谱柱提纯固体，得到黄色粉末化合物(22)1.6g(产率73%)。咕NMR(CD 30D，400M Ηζ)δ9.5 (d ,J = 4.9Hz,lH) ,9.35(t ,J = 4.9Hz,lH),8.52(d ,J = 8.0Hz,lH) ,8.41 (d, J= 1.2Hz ,H), 8.21(t ,J = 7.4Hz,lH),7.75(dd ,J = 9.7,3.6Hz,lH),7.64(dd ,J = 5.8,1.5Hz,lH),6.11(t, J = 7.5Hz,2H) ,5.87(t,J = 6.3Hz,2H),2.97-2.87(m,2H),2.63(dq,J = 13.8,6.9Hz,lH), 2.40(q ,J = 7.5Hz,2H),2.27(s,3H),2.08-1.97(m,2H)a.04(d ,J = 6.9Hz,6H)〇
[0173] 将607mg(1.10mmol)化合物 22 和 286mg(1.0mmol)4'-甲基-(2,2'-联吡啶）-4-基） 甲磺酸钠以及200mg(4.72mmol)氯化锂混合于30mL DMF中，并在氮气保护下回流3小时。在 冷却至室温后，将反应混合物滴入400mL丙酮中。过滤收集深色沉淀并用丙酮冲洗三遍产出 300mg化合物23，产率42.8 %。
[0174] 将 300mg(0 · 43mmol)化合物 23 和130mg(0 · 43mmol) (3' -轻甲基-(1，1 ' -二苯基)_3_ 基）甲磺酸钠与30mL甲醇混合。在氮气的保护下将该混合物回流3小时。冷却至室温后，将通 过旋转蒸发将该溶液浓缩，并用水/甲醇做淋洗剂，经过硅胶色谱柱提纯，得到300mg化合物 24(产率34%) </H NMR(CD30D，400M Ηζ)δ8· 73-8·65(ι?，3H)，8.63(s，lH)，8.56(s，2Η)，8·07 (t，J=7.8Hz，lH)，7.86-7.56(m，6H)，7.51-7.40(m，4H)，7.32(m，2H)，4.81(s，2H)，4.24(s， 4H)，2.85(d，J = 0.7Hz，2H)，2.56(s，3H)，2.24(dd，J = 6.8,2.5Hz，2H)，1.97(m，2H)。
[0175] 14.从通用中间体配合物25，cis-[(4'-甲基-2,2'_联吡啶-4-基）甲磺酸盐Ru(II) Cl2,制备两种二杂配标记物:Ru[(4'_甲基_2,2'联吡啶-4-基）甲磺酸根M4-甲基-4'-(3- 羧丙基)-2,2'_联吡啶](26)和Ru[(4'_甲基-2,2'-联吡啶-4-基）甲磺酸根] 2[4-(2,2'-联 吡啶-4-基)丁酸](27)
[0176]
[Οι //」 你 ·丄?πιπιουκ，日、
不uz/4mgu ·丄?πιπιου?-?ζ,ζ -狀 基)正丁酸混入35mL甲醇/水(6:1)中。在氮气的保护下将该混合物回流3小时。待到冷却至 室温后，将反应混合物旋转蒸干，用水重新溶解，并过滤。滤液用甲醇/水为淋洗剂过硅胶色 谱柱提纯，产出240mg产物26</H MMR(CD30D，400M Ηζ)δ8·71(3Η)，8·60(3Η)，8· 11(1H)， 7·59-7·92(6Η),7.44-7·57(3Η),7.27-7.42(m，3H)，4·28(4Η)，2·90(2Η)，2·60(6Η),2.35 (2Η),2.04(2Η)0
[0178]标记物 27:将 595.611^(0.80111111〇1)化合物25和26411^(1.03111111〇1)4-[4'-甲基-(2， 2 联吡啶)4-基]丁酸混入30mL甲醇/水(4:1)中。在氮气的保护下将该混合物回流3小时。 待到冷却至室温后，将反应混合物旋转蒸干，用水重新溶解并过滤。滤液用甲醇/水为淋洗 剂，经过硅胶色谱柱提纯，得到150mg标记物27。4 MMR(CD30D，400M Ηζ) δ8.67 (2H)，8.55 (4Η),7.55-7·78(6Η),7.42-7·54(2Η),7.25-7·37(4Η)，4·24(4Η)，2·84(2Η)，2·56(9Η)， 2·23(2Η)，1·98(2Η)。
[0179] 15.羧酸转化为其NHS酯
[0180] 上面所描述的ECL标记物能直接用于标记含有一个或者多个氨基基团的化学、生 物化学和生物物质。通常的实验程序涉及到在N-羟基琥珀酰亚胺或者磺化NHS(N-羟基琥珀 酰亚胺)协助下，二环己基碳酰二亚胺(DCC，用于非质子溶剂)或者水溶性的乙基-(二甲基 氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)。实施例18介绍了使用带羧基的标记物标记蛋白的实例。一个 更方便、更直接的标记诸如蛋白、抗体、抗原和氨基修饰的核苷酸等含-NH 2的化学、生物化 学和生物物质的方法是在一个简单反应中使用所谓的活性酯，即NHS酯。
[0181] 合成NHS活性酸的一般方法是在无水非质子溶剂（例如二氯甲烷、DMF、DMS0、乙腈 等）中将过量的N-羟基琥珀酰亚胺与带羧基的标记物混合。一般再加入过量的偶联试剂如 二环己基碳酰二亚胺(DCC)，以形成高度不稳定的活化酸中间体。室温条件下，这种由酸到 NHS酯的转变已经证实在乙腈溶液中需要20个小时来完成（M.Zhou et al， Anal .Chem. 2003,75,6708-6717)。比如，为了将标记物16转变为它的NHS酯28,24.8mg (25mmo 1)的标记物 16 与 8 · 7mg (75 · 6mmo 1) N-羟基琥泊酰亚胺和 16 · 5mg (79 · 9mmo 1) DCC 在 lmL DMF中进行混合。该混合物在氮气保护的条件下保持搅拌20个小时。该反应可以用TLC进行 监测。将反应混合物滴入干燥的乙醚中，然后离心分离，可得到粗产品。
[0182]
过程也能够在水性溶液例如吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中进行，但采用水溶性的1-乙基Ιο-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐 (EDC) 作为偶联剂。 NHS 酯足够稳定，可以被提纯，并 可在低温无水环境储存。它也可以无须从反应混合物中分离，而直接用于标记蛋白。
[0184] 光致发光和电化学发光
[0185] 16.测定吸收光谱和光致发光光谱
[0186] 前面实施例中所合成的钌（II)二亚胺配合物，Mn+aWM+aW广和Μη+ [ιΛΛ]'在受到波长处于它们的吸收波段的光的激发时，都能发光，它们的吸收波段可以 通过测量其在从UV至近红外波长范围的吸收进行确定。图11和12分别示出了吸收光谱和光 致发光光谱。所有这些钌（Π )配合物在350~550nm范围内都具有金属到配体的电荷转移 (MLCT)带。表2列出了MLCT最大值，它们的摩尔吸光系数和最强发光。
[0187] 表2.在298K的水溶液中，关于MLCT吸收和发射的光物理数据。Ru-Ref表示用作参 照的钌（II)二亚胺标记物，Ru( 2，2 ' -联吡啶)2 [4-( 2，2 ' -联吡啶-4-基)丁酸]Cl2。
[0188]
[0189]
[0190] 17.ECL 的测定
[0191] 钌（II)配合物的氧化还原ECL是在含有三丙胺的磷酸盐缓冲溶液(ProCell，得自 Roche Diagnostics，pH6.8,0.18M三丙胺溶液）中，使用电势阶跃技术产生的。所用的电势 为1 · 4V(vsAg/AgCl)，记录ECL随时间的变化。Ru (2，2 ' -联吡啶)2 [4-(2，2 ' -联吡啶- 4-基)丁 酸]Cl2，简写为Ru-Ref，在所有的ECL测试中被用作参照。
[0192] 图13显示了在电势阶跃实验中，不同标记物的ECL强度衰减。相比于Ru-Ref，许多 标记物在保持类似的强度-时间曲线的同时，都显示出了更高的ECL强度。
[0193] 图14是标记物16与Ru-Ref分别在10-7、10-8和1〇Λιο1 I/1浓度下的ECL比较。
[0194] 抗体标记
[0195] 18.使用含羧基的标记物标记抗体
[0196] 将2.511^(2.5以111〇1)16溶解于50(^1^]\^5缓冲溶液（0.1]\14!1 = 4.7)中，浓度为 5mmol/L。向该溶液中加入1.0mg(5.2ymol)l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸 盐（EDC)和3 · Omg(13 · 8μπιο 1)磺化NHS，它们的终浓度分别为1 Ommo 1 /LEDC和27mmo 1 /L磺化 NHS。将该溶液置在室温下震荡10分钟。再向该反应液中加入0.7yL (1 Ομπιο 1) 2-巯基乙醇，其 终浓度为20mmol/L。在室温下静置5分钟后，取该溶液8.0yL(含有40nmol 16)，加入500yL含 有山羊抗鼠 IgG(1.2mg/mL，大约有4nmo 1纯山羊抗鼠 IgG，预设标记比为10)的roS(0. lmo 1 / L，pH=7.4)中。在室温下混合并培育2小时。
[0197] 如上获得的溶液(大约0.5mL)载入预先用PBS平衡的ro-10柱(填充有Sephadex G-25介质，来自GE Healthcare Life Sciences)。在分离过程中形成两个黄色带。收集先洗脱 出来的带溶液，其对应于已经被标记的山羊抗鼠 IgG，大约有0.75mL。
[0198] 采用Bradf ord或者BCA蛋白分析法定量测定山羊抗鼠 I gG的量，以确定实际的标记 物与蛋白的比例（结合比）。基于标记分子的摩尔吸光系数，标记物16在455nm处的吸收可与 标记物的量相关。在以上描述的条件下，标记物16与山羊抗鼠 IgG的结合比大约为6。
[0199] 19.使用NHS酯标记物标记抗体
[0200]本发明所公开的带有-S03-基团的电中性标记物的NHS酯形式可以溶解于水、DMS0 和DMF。为了避免NHS的水解，标记物要么先溶于DMS0作为储备溶液立即使用；要么通过将预 定体积的蛋白缓冲溶液直接加入含预设量的NHS酯标记物的试管中来以固体形式直接使 用。以下详细介绍使用固体NHS酯标记物的程序。
[0201] 将lmL山羊抗鼠 IgG(1.2mg/mL，大约8nmol蛋白）的PBS溶液加入装有8mg标记物28 粉末的试管中。将试管在室温下震荡并孵育该混合物两小时。如上获得的溶液载入预先用 PBS平衡的PD-10柱。在分离过程中，有两个黄色带形成。收集首先洗脱的带，其对应于已被 标记的山羊抗鼠 IgG。
[0202] 通过蛋白定量分析和标记物28在455nm处的吸收测量，测定标记物28与山羊抗鼠 IgG的结合比。该比例为4.5。标记蛋白的效率受很多因素影响。即使在相同的条件下（同样 的缓冲液，相同的反应时间），不同的标记物和不同的蛋白也可能有不同的结合比。因此，标 记物对蛋白的预设标记比必须通过实验来确定，以得到所要求的结合比。
[0203]免疫分析
[0204] 20.在夹心法免疫分析中使用标记有标记物16和Ref-Ru的山羊抗鼠 IgG。
[0205] 在这个示例的ECL免疫分析测试中，鼠 IgG用作被检测物质(抗原），而标记过的山 羊抗鼠 IgG(H+L)和生物素化的兔抗鼠 IgG(H+L)则分别作为显信号抗体和捕获抗体。包覆有 链霉亲和素的?Μ-280被选作磁性介质，用于捕获"生物素化的抗体/抗原/标记过 的抗体"免疫复合物。分别向l〇〇〇yL不同浓度鼠 IgG的PBS溶液中加入20yL 5. Oyg/mL的生物 素化的兔抗鼠 IgG的PBS缓冲液和20yL 1.0yg/mL的标记过的山羊抗鼠 IgG，并在室温下孵育 20分钟，从而形成夹心结构免疫复合物。再向含"兔抗鼠 I gG八鼠 I gG/山羊抗鼠 I gG"夹心免疫 复合物的上述溶液中加入20yL包覆有链霉亲和素的Dynabeads?M-280悬浮液(200yg珠粒，预 先用PBS洗3遍）。将总体积为1060yL的该悬浮液在室温下通过恒定温和旋转孵育20分钟。采 用外磁场(2分钟)将附着有免疫复合物的Dynabeads分离出来，并用1000yL含有0.1%BSA的 PBS缓冲液冲洗该珠粒4遍，以去除其它未反应物质。最后一次冲洗步骤后，用1000yL PBS再 次悬浮该珠粒，至载有"抗体/抗原/抗体"夹心免疫复合物的珠粒浓度为200yg/mL。取100yL 上述溶液注入到三电极测量池中，工作电极上方配有光电倍增管。工作电极下方有一块可 移动的磁铁。施加一个阶跃电势（1.4V vs.Ag/AgCl)以氧化三丙胺和钌（II)标记物，后者通 过"抗体/抗原/抗体"夹心复合物已固定在磁性珠粒表面，以在磷酸盐缓冲溶液(ProCel 1， 来自Roche Diagnostics，pH 6.8,0.18mol/L三丙胺溶液）中通过氧化-还原过程产生ECL。 每次测量后，磁铁要从工作电极移开。按照美国专利US 5538687描述的方法，对测量池进行 清洗并对工作电极进行电化学再生处理。
[0206] 通过比较一系列浓度不同的鼠 IgG标准样品溶液所产生的ECL的信号（前3秒内的 ECL强度对时间积分)来进行评价。由于标记物16在均相ECL测试中表现出比Ru-Ref更强的 ECL信号（图13和14)，ECL标记物16在夹心法免疫分析中在ECL信号强度方面显示出比Ru-Ref更好的性能就不足为奇了（见图15)。
[0207]由前述说明书出发，本发明所公开的这些和其它优势对于本领域技术人员是显然 的。相应地，本领域技术人员会承认，可能对上述实施方案进行改变或者修改，而不背离本 发明的宽广的发明构思。要理解的是，本发明并不局限于本文所述的具体实施方案，而是打 算将落在本发明范围和主旨内的所有变化和修改都包括在内。
【主权项】
1. 式I的电中性金属配合物： Mn+[L，L，，L，，，]n- (I) 其中，M选自过渡金属，优选钌或者锇； η是电荷数，等于或者大于2; L'、L"和L" '独立地选自含氮杂环双齿配体，优选选自2，2 联吡啶，I，10-菲咯啉及其 取代的同系物，至少一个所述配体具有至少一个可生物偶联的反应基团，如羧酸、NHS酯、磺 化-NHS酯、亚磷酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基等；2. 式II的电中性三杂配金属配合物： Mn+[ L1L2L3](II) 其中，M选自过渡金属，优选是钌或者锇； η是电荷数，等于或者大于2; L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有至少一个可生物偶联的反应基团（X)，如羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS 酯、亚磷酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基等，X直接(无需连接体Τ)或者间接 (通过连接体Τ)与一个芳环连接，其中T是含碳或者含杂原子的连接体，包括烷基、烯基、烷 氧基，醜胺或芳香环;W是Ci-Cio的烷基、Ci-Cio的烯基、Ci-Cio的烷氧基、-CONH-Ci-Cio、-NHCO-Ci-Ciq、-Ci-Cg -CONHRi-、取代或非取代的5_或者6_兀芳环、羟基、氨基、腈、氰基或者1?素;且 L2是带负电荷的含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2'_联吡啶和取代的1，10-菲咯 啉，L2具有带负电荷的取代基团，它的总负电荷数与η相同(η大于或等于2)，其中E是带负电 荷基团，如-SO3' -OSO3' -PO3H'-OPO3IT等;A是含碳或者含杂原子的连接体、包括C1-C iq的烷 基、Ci-Ciq 的烯基、Ci-Ciq 的烷氧基、-CONH-Ci-Ciq-、-NHCO-Ci -Ciq-、-Ci-C9_C0NHR2 _、取代或非 取代的5-或者6-元芳环； L3是含氮杂环双齿配体，优选选自非反应性且不带电荷的2，2 联吡啶、I，10-菲咯啉或 者其上至少带有一个取代基团W'，其中所述取代基团W'是氢或者任何不带电荷的取代基 团、优选是 Ci-Ciq 的烷基、Ci-Ciq 的烯基、Ci-Ciq 的烷氧基、-CONH-Ci-iq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-9_ CONHR3-、取代或非取代的5-或者6-元芳环、羟基、氨基、腈、氰基或者卤素，其中R是氢或者 烷基;且 R1，RdPR3各自为氢或者烷基。3.式III的电中性三杂配金属配合物： MnIL1L4L5F (III) 其中，M选自过渡金属，优选是钌或者锇； η是电荷数，等于或者大于2; L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有至少一个可生物偶联的反应基团（X)，例如羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS 酯、亚磷酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基等，X直接(无需连接体Τ)或者间接 (通过连接体Τ)与一个芳环连接，其中T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C 1-Ciq的烷基、 C1-Ciq 的烯基、C1-Ciq 的烷氧基、-CONH-C1-Ciq-^NHCO-C1-CltK-C 1-C9-CONHR1'取代或非取代 的5-或者6-元芳环； L4或L5是不同的含氮杂环双齿配体，优选选自带有取代基团2,2'_联吡啶和1，10-菲咯 啉，L4或L5各自具有带负电荷的取代基团，各自的总负电荷数与η/2相同（η大于或等于2)， 其中E是带负电荷基团，例如-SO3'-OSO3'-Ρ03Η'-0Ρ0 3!Γ等;A是含碳或者含杂原子的连接 体、包括Ci-Ciq 的烷基、Ci-Ciq 的烯基、Ci-Ciq 的烷氧基、-CONH-Ci-Ci『、-NHCO-Ci-Ci『、-Ci -Cg- C00NHR2-、取代或非取代的5-或者6-元芳环； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选SC1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧 基、-CONH-Ci-Ciq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-C9_CONHR3_、取代或非取代的5-或者6 -兀芳环、羟基、氛 基、腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自为氢或者烷基。4.式IV的电中性二杂配金属配合物：： Mn^L1L42](IV) 其中，M选自过渡金属，优选是钌或者锇； η是电荷数，等于或者大于2; L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有至少一个可生物偶联的反应基团（X)，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基等，X直接(无需连接体Τ)或者 间接(通过连接体Τ)与一个芳环连接，其中T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷 基、Ci -Ciq 的烯基、Ci-Ciq 的烷氧基、-CONH-Ci-Ciq-、-NHCO-Ci -Ciq、-Ci-Cg-CONHRi-、取代或非 取代的5-或者6-元芳环； L4是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有带负电荷的取代基团，其总负电荷数与η/2相同（η大于或等于2)，其中E是带负 电荷基团，如-S03_，-OSOf，-PO3IT，-OPO3IT等;A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C 1-C10的 烷基，Ci-Ciq 的烯基，Ci-Ciq 的烷氧基，-CONH-Ci-Ciq-，-NHCO-Ci -Ciq-，-Ci-C9_C0NHR2 _，取代或 非取代的5-或者6-元芳环； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选SC1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧 基、-CONH-Ci-Ciq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-C9_C0NHR3_、取代或非取代的5-或者6 -兀芳环、羟基、氛 基、腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自为氢或者烷基。5. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配发光金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基，C1-C 1O的烯基，C1-C1O的烷氧基，_ CONH-C1-Ciq-，-NHCO-C1-Ciq，-C 1-C9-CONHR1-，取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； W和W'各自是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是&-&〇的烷基J1-Ciq的烃基、C 1-Cio的烷氧基、-CONH-Cho、-NHCO-C1-Ciq、-Cp 9-CONHR3-、取代或非取代的5-或者6-元芳环、 羟基、氨基、腈、氰基或者卤素;且 E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等;且 Ri和R3各自是氢或者烷基。6. 根据权利要求5所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-C00H);T是具有 1-9个亚甲基的烷基，即-(CH2)1-F5W是氢或者甲基;W'是氢或者甲基;E是-SO 3 一。7. 根据权利要求5所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是NHS酯·T是 具有1-9个亚甲基的烷基，即-(CH2)1-F5W是氢或者甲基;W'是氢或者甲基;E是-SO 3'8. 根据权利要求5所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸是羧酸(-C00H)或 者NHS酯T是-(CH2) 3-; W是氢或者甲基;W '是氢或者甲基;E是-SO3 一。9. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配发光金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； W和W'各自是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是&-&〇的烷基J1-Ciq的烃基、C 1-Cio的烷氧基、-CONH-Cho、-NHCO-C1-Ciq、-Cp 9-CONHR3-、取代或非取代的5-或者6-元芳环、 羟基、氨基、腈、氰基或者卤素； E是带负电荷的基团，如-s〇3-，-0S03-，-Ρ03Η-，-0Ρ0 3Η-等； Ri和R3各自是氢或者烷基。10. 根据权利要求9所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-C00H)或者NHS 酯；T是含酰胺的连接体或者是具有1-9个亚甲基的烷基，即-(CH2)1-S-J和W'是氢或者甲 基;E是-S〇3。11. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、_ CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等； W和W'各自是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是&-&〇的烷基 Cio的烷氧基、-CONH-Cho、-NHCO-C1-Ciq、-Cp9-CONHR 3-、取代或非取代的5-或者6-元芳环、 羟基、氨基、腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自是氢或者烷基。12. 根据权利要求11所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-COOH)或其NHS 酯；T是-CONH-C1-1Q-、-NH⑶-C1-Ciq-^C 1-9-C0NHR!-或者是具有1-9个亚甲基的烷基，即_ (CH2) ; W是氢或者-CH3; W '是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP -CH2-; E是-S〇3-。13. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、_ CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是心^^)的烷基X1-Ciq的烃基X1-C iq的烷氧 基、-C0NH-Ci-iq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-9_C0NHR3、取代或非取代的5-或者6-兀芳环、羟基、氛基、 腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自是氢或者烷基。14. 根据权利要求13所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-COOH)或者NHS 酯T 是-CONH-Ch。-、-NHCO-C1-C1O-、-Cp9-CONHR 1-或具有 1-9 个亚甲基的烷 基，即-(CH2)H; W是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP-CH2-; E是-S03-。15. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是心^^)的烷基X1-Ciq的烃基X1-C iq的烷氧 基、-C0NH-Ci-iq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-9_C0NHR3_、取代或非取代的5-或者6 -兀芳环、羟基、氛基、 腈、氰基或者卤素； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、_ CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等;且 R1，RdPR3各自是氢或者烷基。16. 根据权利要求15所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-COOH)或者NHS 酯；T是-CONH-C1- 1Q-、-NH⑶-C1-Ciq-^C1-9-C0NHR!-或者是具有1-9个亚甲基的烷基，即_ (CH 2) H; W是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP-CH2-; E是-S03-。17. 根据权利要求3所述的具有如下结构的电中性的三杂配金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、- CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是心^^)的烷基X1-Ciq的烃基X1-C iq的烷氧 基、-C0NH-Ci-iq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-9_C0NHR3_、取代或非取代的5-或者6 -兀芳环、羟基、氛基、 腈、氰基或者卤素;且 W'和W"不同，选自氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是^-⑶的烷基X1-Ciq的烃 基、C1-Ciq 的烷氧基、-CONH-C1-K)、-NHCO-C1-Ciq、-&-9-C0NHR4、取代或非取代的 5-或者 6-元芳 环、羟基、氨基、腈、氰基或者卤素;且 Ri-R4各自是氢或者烷基。18. 根据权利要求17所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸（-C00H)或者羧 酸的NHS酯;T是-CONH-C1-K)-^NHCO-C 1-Ciq-^Cb-CONHR1-或者是具有1-9个亚甲基的烷基， 即-(CH 2)H; W是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP-CH2-; E是-S03-。19. 根据权利要求4所述的具有如下结构的二杂配发光金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、_ CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等； W和W'可以相同也可以不同，独立地选自氢或者任何不带电荷的&-(：1()的烷基、&-&〇的 烯基、C1-Ciq 的烷氧基、-CONH-C1-K)、-NHCO-C1-Ciq、-Cp 9-CONHR3、取代或非取代的 5-或者 6-元 芳环、羟基、氨基、腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自是氢或者烷基。20. 根据权利要求19所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-C00H)或者NHS 酯；T是-CONH-C1-1Q-、-NH⑶-C1-Ciq-^C 1-9-C0NHR!-或者是具有1-9个亚甲基的烷基，即_ (CH2) H; W和W ' 是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP-CH2-; E是-S03-。21. -种权利要求1-3的其中M是钌的电中性三杂配金属配合物标记物的合成方法，包 括以下步骤： (a)使[(对异丙基甲苯)RuC12]2与L'、L"或者L"'反应，形成第一中间体(对异丙基甲苯） (L'）RuC12，（对异丙基甲苯）（L"）RuC12或者(对异丙基甲苯）（L"'）RuC1 2; (b) 使(对异丙基甲苯）（L'）RuC12与L"或L"'反应，使(对异丙基甲苯）（L"）RuC12与L'或 1；''反应，或使(对异丙基甲苯）〇；''）1^1 2与1/或1；'反应，将第一中间体转化为第二中间体 〇/)〇；'）1?11(：12、〇/)〇；''）1?11(：1 2、或者〇；'）〇；''）1?11(：12; (c) 使（L'）（L"）RuC12与L"'反应，或使（L'）（L"'）RuC12与L" 反应，或者使 RuCl2与L'反应，将第二中间体转化为(L'）（L"）（L" '）Ru。22. -种进行电化学发光分析的方法，由以下步骤组成： (a) 使用权利要求1-20中任一项的电中性金属配合物标记生物分子，以形成具有以下 结构的被标记的生物复合物， {Mn+[L，L，，L，，，]n-}m-B(V)， (Mn^L1L2L3 JnIm-B (VI), {!Τ+α?5]11-}m-B(VII),或 {Mn+[ L1L42 JnIm-B (VIII) 其中，B是具有化学、生物化学或者生物活性的物质，优选选自半抗原、氨基酸、核酸、核 苷、核苷酸、蛋白质、适配子、抗体和抗原等； M选自过渡金属，优选是钌或者锇； η是电荷数，大于或者等于2; m是大于或者等于1的整数； L '，L"和L" '独立选自含氮杂环双齿配体，优选选自2，2 联吡啶，1，10-菲咯啉及其取 代的同系物，其中至少有一个配体通过可生物偶联的反应基团和B共价连接； L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2 联吡啶和带有取代基的1，10-菲咯啉，具 有至少一个通过生物偶联基团而与B形成的共价键； L2是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2 联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有带 负电荷的取代基团，如-S03-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等，其负电荷总数等于η; L3是含氮杂环双齿配体，优选选自非反应性且不带电荷的2,2'_联吡啶，1，10-菲咯啉以 及它们的衍生物； L4或L5是不同的含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2,2'_联吡啶和取代的1，10-菲咯 啉，其具有带负电荷的取代基团，如-S03_、-OSO3'-PO3H' -OPO3IT等，总的负电荷数为η/2; (b) 促使电中性金属配合物发光;并且， (c) 测定所发出的光，将被测物浓度与在一定时间段内发射的光强度或光子数相关联。23. 根据权利要求22所述的标记的生物复合物，其中M为钌。24. 根据权利要求22所述的标记的生物复合物，其中L'、L"和L"'为不同的基团。
【专利摘要】本发明涉及作为发光标记物的电中性金属配合物。该配合物的金属离子的正电荷被与含氮二亚胺配体(如2,2’-联吡啶，1,10-菲咯啉以及它们的衍生物)通过共价键相连的负电荷基团中和。在增强电化学激发条件下的发光强度的同时，电中性能降低金属配合物对被标记生物分子的生物和/或生物化学活性的影响。这些发光金属配合物标记分子可用于以发光信号为检测模式的生物分析方法(如电化学发光)的发展。
【IPC分类】G01N33/52, C09K11/07
【公开号】CN105492575
【申请号】CN201480045420
【发明人】周明, 余林颇
【申请人】联吡啶钌科学公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月18日
【公告号】US20160146826, WO2014203067A1
【专利说明】作为生物标记物的电中性金属配合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年6月18日提交的题目为"作为生物标记物的电中性金属配合物" 美国临时申请No. 61 /956，810的权益，将该申请的内容并入本文作为参考。 发明领域
[0003] 本发明涉及可生物偶联的发光金属配合物，以及它们作为新型标记分子在化学、 生物化学和生物分析领域中的应用，如免疫检测和DNA探针。更具体的说，本发明涉及电中 性的电化学发光标记分子以及它们在电化学发光免疫分析中的应用。
[0004] 发明背景
[0005] 基于生物亲和性（即两种生物活性物质，如抗体/抗原，的选择性结合)的生物分析 方法在很大程度上依赖生物标记分子，标记技术以及对产生于标记分子的信号的检测。生 物标记分子是能够自身，或者在与其它试剂发生物理/化学相互作用时，发出能与被测物质 的量相关的可检测的信号的化学或生物化学物质。生物标记分子包括，但不仅限于:含放射 性原子的分子(放射性），发光化合物(在光激发或化学反应中发光），电活性化合物(通过氧 化还原反应产生电信号），磁性颗粒(磁信号）和酶(通过与底物的反应，生成可检测的物质 或者光信号）。生物标记分子包含一个或多个信号产生单元以及一个或多个反应性基团。后 者与待标记的生物分子易于形成共价键。标记过程是将一个或多个标记分子和生物活性物 质结合形成复合物，该复合物保持对特定待检测物质的生物亲和性。
[0006] 通过一系列的电化学氧化还原反应以及与共反应剂（诸如专利US 6451225和US 6702986中披露的三丙胺)发生的后续化学反应，电化学发光(ECL)已经发展成为一种成熟 的生物分析技术，在此技术中，一种金属配位化合物，如舒（Π )多二亚胺(polydiimine)复 合物，被用作ECL标记分子的信号产生单元。美国专利（5221605,5238808,5310687， 5714089,5731147,6140138,6316607)和许多研究论文披露了ECL标记分子以及它们在免疫 分析和 DNA 探针领域的应用 Η^Ι^η:6·Ρ·Β1α^Λι?Γηθ?Β?·，(：Ηη·αιθπκ1991，37/9，1534-1539;J.H.Kenten et al.，Clin.Chem.l991,37/9,1626-1632·)。
[0007] 对ECL标记分子的改进是一个长期持续的努力方向。一方面，有大量的工作试图通 过在一个或多个与钌（II)离子配位的配体上连接上功能基团而重新设计钌（II)配合物。另 一方面，把ECL发光体从钌（II)配合物扩展到其它金属配合物的努力也进行了很多，其中一 些在专利中有所披露。比如美国专利5858676和6468741分别公开了稀土金属配合物和铼配 合物的 ECL。专利申请 W02012107420，US2013/0323719，US2013/0323857，W02014019707， W02014019708和W02014019711则公开了用作ECL标记分子的基于铱的新型配合物。
[0008] 在基于钌（II)的ECL发光体的改进方面，美国专利US 5981286公开了带有亲水性 双齿配体的钌（II)配合物。W0 99/15694公开了一种分子设计，其中金属配合物发光体通过 共价键与共反应剂（即三丙胺或其类似物)相连接。不过，由于在ECL过程中，共反应剂是要 被消耗的（而不是循环使用），所以它的浓度在实际的生物测定中须比发光体的浓度高很多 倍。这种方案不能帮助提高ECL的强度。为了提高ECL生物检测的灵敏度，美国专利US 5679519公开了一种多标记的探针复合物，它包含有生物素化的牛血清白蛋白分子作为平 台，以及大量被该平台结合的电化学发光标记分子。另外，美国专利申请US 2005/0059834 中也提出了构造担载有多个ECL发光体的树枝状构架从而实现在生物分子的单个位点上进 行多标记（也见M.Zhou et al.，Anal.Chem.2003,75,6708-6717)。
[0009] 进一步地，双齿配体的的选择也已经超越了以2，2 联吡啶和1，10-菲咯啉的基础 类型。美国专利7750157 B2(EP1759204 A1)公开了一种钌（II)标记物设计，其中生物偶联 臂连接在一个既非2，2 联吡啶也非1，10-菲咯啉的双齿配体上。
[0010] 以上专利和研究论文中所披露的这些钌（II)ECL发光体（没有生物偶联基团）和 ECL标记分子(带有生物偶联基团）的一个共同特点是它们都有一个带正电荷的金属配合物 发光体(见图1A)，和不发光的反离子，如氯离子Cr或六氟磷酸根离子PFf等。用这些发光体 标记的物质的生物活性或者选择性亲和能力会由于带正电的金属配合物的引入而降低。降 低了的生物活性在基于生物亲和性的生物检测中会提升非特异性结合，从而降低生物分析 的灵敏度和重复性。针对带有正电性ECL发光体的标记物的这一缺点，美国专利5958783 (CN1134154，EP0720614 B1)公开了一类ECL标记分子(见图1B)，其特征在于，在带正电的发 光体和反应基团（即生物偶联基团）之间有一个带电荷的连接体。据其披露，由于降低了对 蛋白的非特异性结合，这类标记物改进了ECL免疫分析的性能。不过在这个标记物中，信号 产生单元(ECL发光体)本身还是带正电荷的金属配合物，需要反离子来中和其正电荷。
[0011] 同样为了降低有害的非特异性结合，美国专利6808939B2(CN1612861A)公开了一 类带电荷(尤其是负电荷)功能基团的双齿配体（即联吡啶和菲咯啉）以及含有这些带电荷 配体的钌（II)配合物标记分子(见图1C)。这些结构为M(L'）（L"） 2的二杂配标记分子具有负 电荷以及可离解的阳离子。结果显示，一些带负电荷的发光体标记在抗体上后，非特异性的 ECL信号显著降低。然而，在降低非特异性信号的同时，没有显示对特异性信号水平的改进。
[0012] 这些ECL发光体或含这些发光体的标记分子或者带正电荷（绝大多数情况），或者 带负电荷，都需要有反离子来中和电荷。它们都是离子性化合物，在电解液溶液中均会分开 或电离成阳离子和阴离子。此外，已经合成的这些金属配合物或者是二杂配，或者是均配金 属配合物，即配合物中至少有两个二齿配体是相同的。
[0013] L.Della Ciana等（J.Phys.Chem.C 2010,114,3653-3658)描述了一个二杂配两性 离子钌(II)发光体，其含有两个相同的2,2'_联吡啶配体和一个苯磺酸化的菲咯啉配体，该 发光体在水相中的ECL强度与三联吡啶钌（II)配合物相比要高。不过，和其它一些不具有生 物偶联基团的、报道所称的高强度ECL发光体一样，该发光体用于ECL免疫分析不可行，而且 在该金属配合物上引入反应性生物偶联基团的合成方法也未建立。
[0014] 钌(II)配合物在包含有共反应剂和溶剂的特定电解质溶液中的ECL强度随着配体 的结构和配体的组合方式不同而差别巨大。由于ECL产生过程的复杂性(W.Miao et al， JACS，2002，124，14478-14485)，一般共识是，任何单一的性质，诸如光量子效率，氧化还原 电势，发光波长以及发光体的电荷状态与ECL强度没有相关性（M.Zhou et al， Inorg. Chem. 2005，44，8317-8325)。不过，用电中性的发光体标记一个生物物质不会改变该 物质的电荷状态。因此，在大小相近或分子量类似的标记物中，电中性的标记分子对于待标 记生物物质的生物活性的影响最小。鉴于此，本发明注重设计配体的结合方式，以使金属配 合物(例如钌（II)配合物)成为电中性的ECL标记物，其在水性缓冲溶液或任何其它溶剂中 不解离成阳离子和阴离子。
[0015] 在我们通过使用电中性标记物降低标记物对被标记物活性的影响的同时，我们惊 奇地发现电中性的ECL标记物不仅降低了非特异性信号，一部分电中性ECL标记分子还产生 了更高的ECL强度。
[0016] 过去公开的钌（II)配合物标记分子的合成主要遵循一种方法(见下面反应式）。在 这种方法中，首先合成顺式I了二亚胺二氯化物(cis-ruthenium diimine(L)dicholoride)， 即cis-RU(L)2Cl 2)，然后再将具有生物偶联功能的二亚胺配体与金属离子配位。
[0017] RuCl3\xH2〇+L-cis-Ru(L)2Cl2(l)
[0018] cis-Ru(L)2Cl2+L'-Ru(L)2(L'）C12(2)
[0019] 美国专利US 6808929B2公开了另一种合成方法(专利中的实施例2)。其中，一个具 有生物偶联功能的二亚胺配体，即4-甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_联吡啶，先和氯化钌（II) 发生配位，而后再引入另外两个相同的配体，形成ECL标记物。
[0020] 这些合成方法产生二杂配配合物标记分子，它们具有两个不具有生物偶联功能的 相同配体和一个具有生物偶联功能的配体。合成三杂配金属配合物ECL标记分子的工作在 现有技术中还未见报道。
[0021] 不同于图1A-C中那些具有带正电荷或者带负电荷的钌（II)发光体，图1D所示的电 中性ECL标记分子具有三个不同的配体，不能套用二杂配配合物标记分子的合成方法来进 行合成。所以，本发明中除了披露配体组合模式外，该发明也涉及一种将三个不同的二亚胺 配体依次与金属离子配位形成三杂配ECL标记分子的合成方法。
[0022]本发明进一步公开了用这类中性ECL发光体标记的生物物质以及它们在ECL免疫 分析中的应用。
[0023] 本发明的一个目的是提供具有电中性金属配合物发光体的发光生物标记物。
[0024] 本发明的另一个目的是提供导致金属配合物发光体呈电中性的不同的配体组合 模式。
[0025] 本发明的又一个目的是提供具有电中性金属配合物发光体的三杂配标记物的合 成方法。
[0026] 本发明的再一个目的是提供标记有电中性金属配合物发光体的物质。
[0027] 本发明还有一个目的是提供用于开展化学物质、生物化学物质和生物活性物质的 ECL定量分析的生物标记分子。
[0028] 发明概述
[0029]本发明涉及生物分析方法的改进，具体来说是利用金属配合物的电产生化学发光 或电化学发光(ECL)的免疫分析和核酸检测。本发明所描述的金属配合物以钌（II)配合物 作为实例。但是，能生成与金属钌(II)多二亚胺配合物类似的金属螯合物的其它过渡金属， 如金属锇、铂、铼、铱等，也在本发明的涵盖范围内。
【附图说明】
[0030]图1展不现有技术公开的(A-C)和本发明披露的(D)ECL标记分子。
[0031] 图2是化合物3的1H NMR图谱。
[0032] 图3是化合物6的1H NMR图谱。
[0033] 图4是化合物10的1H NMR图谱。
[0034] 图5是化合物15的1H NMR图谱。
[0035] 图6是化合物16的1H NMR图谱。
[0036] 图7是标记分子17的1H NMR图谱（图谱左边:芳香环区；图谱右边:脂肪链区）。
[0037] 图8是标记分子18的1H NMR图谱。
[0038] 图9是标记分子19的1H NMR图谱。
[0039] 图10是标记分子20的1H NMR图谱。
[0040] 图11是标记分子16，19,27和Ru(2,2'_联吡啶)2[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (标识为Ru-Ref)的吸收光谱。
[0041 ] 图12是标记分子16，19,27和Ru(2,2'_联吡啶)2[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (标识为Ru-Ref)的光致发光光谱。
[0042]图13比较不同标记分子在含有三丙胺的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中以1.4V vs.Ag/AgCl阶跃电势激发所得到的电化学发光强度。钌（II)配合物的浓度均为:0.1μπι〇1 L-、
[0043] 图14比较标记分子16和Ru-Ref在含有三丙胺的pH值为6.8的磷酸缓冲溶液中以 1.4V vs.Ag/AgCl电阶跃电势激发所得到的电化学发光强度。钌(II)配合物的浓度分别为： 10-7，10- 8，10-9mol L-、
[0044] 图15比较使用标记分子16和Ru-Ref在免疫分析测试中的ECL信号强度。
[0045] 发明详述
[0046] 本文中所用到的术语"金属配合物"，"配位金属配合物"，"发光金属配合物"，"ECL 金属配合物"，"钌（II)配合物"，"金属钌（II)配合物"和"金属螯合物"有时可交替使用。在 本发明的范围里，金属配合物或者ECL金属配合物包含"发光体"或"ECL发光体"以及"标记 分子"或"ECL标记分子"。前者是没有生物偶联基团的金属配合物，而后者则指的是具有生 物偶联基团的金属配合物。生物偶联基团是一类功能化的或能进行反应的反应性基团，它 可以在温和的条件下，如处于室温的生理缓冲溶液中，和其它化学、生物化学和生物物质发 生反应，形成高度稳定的共价键。
[0047] 在本发明的范围内，被称作"标记物"，"标记物分子"，"钌(II)标记物"和"ECL标记 物"的物质可与其它物质形成共价键，这些其它物质诸如，具有生物活性的被测物或其类似 物，基于亲和性的被测物的识别性配对物或 其类似物，前述识别性配对物的结合配对物，或 者能与被测物形成共价键的反应性化学物质，其类似物或结合配对物。上述物质也可以与 一个或多个结合配对物和/或一个或多个反应性组分形成的组合相连接。另外，上述物质也 可连接与结合配对物、反应性组分、或者一个或多个结合配对物和/或一个或多个反应性组 分形成的组合相连接的被测物或其类似物。落入本发明范围的还包括多个有待直接、或通 过如上述的其它分子连接到被测物或其类似物的上述物质。
[0048]本专利涉及电中性的带有金属配合物发光体的ECL标记物。本文中可能用到的短 语"中性"，"电中性"或者"电子中性"指的是金属阳离子的正电荷被阴离子性的多原子取代 基团所平衡或者中和的状态，这些阴离子性的多原子取代基团直接或者间接地键接于双齿 (优选二亚胺)配体上的一个或多个芳环上。这类配体包括2,2'_联吡啶，1，10-菲咯啉及其 衍生物。
[0049] 由于在配位金属配合物中的金属离子的阳离子本性，现有技术中公开的标记分子 的电中性是由反离子达成的。对于带正电荷发光体的ECL标记物（例如美国专利US 5221605,5238808,5310687,5714089,5731147,6140138,6316607)，反离子是氯离子、六氟 磷酸根离子等。而对于带负电荷发光体的ECL标记物(披露于美国专利US 6808939)，反离子 例如是钠离子或质子。因此，现有技术中公开的ECL发光体和ECL标记物在化学上均为离子 型化合物，其在适宜的电解质溶液中，比如磷酸盐缓冲溶液中，离解为阳离子和阴离子。
[0050] 本发明所公开的带有电中性发光体的ECL标记物是电中性的两性离子。在本发明 所公开的金属配合物发光体结构中，金属阳离子的正电荷被一个或多个双齿配体(优选是 二亚胺）的芳环上的带负电荷的取代基所中和。因此，本发明所公开的ECL发光体和ECL标记 分子在溶解于电解质溶液中时，不会离解为阳离子和阴离子。
[0051] 这类电中性的金属配合物标记物具有以下通式
[0052] Mn+[L，L，，L，，，]n-(I)
[0053] 其中，Μ选自过渡金属，优选是钌或者锇;η是电荷数，等于或者大于2;L'、L"和L"' 独立地选自含氮杂环双齿配体，优选选自2，2联吡啶、1，10-菲咯啉及其取代的同系物。至 少有一个配体具有至少一个可生物偶联的反应基团，如羧基、N-琥珀酰亚胺基羧酸酯(NHS 酯）、N-羟基磺化琥珀酰亚胺基羧酸酯(磺化-NHS酯）、亚磷酰胺、异硫氰基、甲酰基、氨基、肼 基、羟基和马来酰亚氨基等。
[0054]基于三个二亚胺配体是相同还是不同的，三-二亚胺金属配合物可能是均配、二杂 配或三杂配的。对于正二价的金属离子，如钌（II)，不可能形成电中性的均配型三-二亚胺 配合物。因此，本发明只涉及二杂配和三杂配金属配合物，特别是具有以下结构的三杂配金 属配合物：
[0055] Μη+[?ΛΑ3]η-(II)和
[0056] Μη+[?ΛΛ/]η-(III)
[0057] 其中，Μ选自过渡金属，优选是钌或者锇;η是电荷数，等于或者大于2。
[0058] L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2 联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，如 下所示：
[0059]
[0060] L1具有至少一个反应基团（X)，比如羧基、Ν-琥珀酰亚胺基羧酸酯(NHS酯）、Ν-羟基 磺化琥珀酰亚胺基羧酸酯(磺化-NHS酯）、亚磷酰胺、异硫氰基、甲酰基、氨基、肼基、羟基和 马来酰亚氨基，X直接(无需连接体Τ)或者间接(通过连接体Τ)与一个芳环连接。Τ是含碳或 者含杂原子的连接体，包括Ci-Cn)的亚烷基、CrCn)的亚烯基、Q-Cn)的烷氧基、-⑶NH-Q- &0-、-顯(》-(：1-&()-、-(：1-(： 9-〇)順1?1-、取代或非取代的5-或者6-元芳环。1是氢或者任何不带 电荷的取代基团，优选为Ci-Cio的烷基、Ci-Cio的烯基、Ci-Cio的烷氧基、 -CONH-Ci-Cio、-NHCO-Ci-Ciq、-Ci_C9 -C0NHR3、取代或非取代的5_或者6_兀芳环、羟基、氨基、腈、氰基或者卤素。 [0061 ] L2是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2 联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，如
下所示-
[0062]
[0063] 1/具有带电荷的取代基团，它的总负电荷数与η相同（η大于或等于2,优选为2)，其 中Ε是带电荷基团；Α是含碳或者含杂原子的连接体。优选地，Ε是带负电荷的基团，比如_ S03-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ03Η-等;A是含碳或者包含杂原子的连接体，包括CrCw的烷基、&-&〇 的烯基、&-CK)的烷氧基、-CONH-Ci-Cio-、-NHCO-Ci-Cio-、-Ci-Cg-CONHRr、取代或非取代的 5-或者6-元芳环。
[0064] L3是电中性的含氮杂环双齿配体，优选选自不带电荷的2,2'_联吡啶，1，10-菲咯 啉，或者其上至少带有一个取代基团W'。取代基团W'优选是氢或者不带电荷并且在温和水 溶液条件下不具有反应性的取代基团，例如Ci-Cnj的烷基Xi-Cio的烯基、&-&〇的烷氧基、_ CONH-CrCn)、-NH⑶-Ci-Cio、-CrCg-CONHRs、取代或非取代的5-或者6-元芳环、羟基、氨基、 腈、氰基或者卤素。
[0065] L4和L5各自是带有单价阴离子的含氮杂环双齿配体，优选选自取代2,2'_联吡啶和 1，10-菲咯啉，如下所示：
[0066
[0067] L4PL5各自具有带负电荷的取代基，其中E是带电荷基团，A是含碳或者含杂原子的 连接体。优选地，E是带负电荷的基团，比如-S0 3_、-0S03_、-Ρ03Η_、-0Ρ03Η，; A是含碳或者包 含杂原子的连接体，包括Ci-Cn)的烷基Xi-Cn)的烯基Xi-Cn)的烷氧基、-⑶NH-Ci-Cn)-、-NHCO-Ci-Cio-、-Ci-CVCONHRi-、取代或非取代的5-或者6-元芳环。
[0068] 以二氯(对异丙基甲苯)钌（II)二聚体，即[(对异丙基甲苯)RuC12]2,作为起始原 料，依次用两个二亚胺配体逐步替代其中的两个对异丙基甲苯分子，下面的通用合成方法 使得三个二亚胺配体(相同或者不同）与金属离子逐步配位：
[0069] [(对异丙基甲苯)RuC12]2+L' - (对异丙基甲苯）（L'）RuC12
[0070] (对异丙基甲苯）（L'）RuC12+L"4(L"）（L'）RuC12
[0071] (L"）（ L，）RuC 12+L" ' -（ L，）（ L"）（ L"，）Ru
[0072] (这里，L'、L"和L" '是L\L2和L3,或者L\L4和L5)
[0073] 本发明提出了同样的三杂配目标配合物（L'）（L"）（L"'）Ru能够从不同的起始原 料，通过不同的中间体合成出来。在钌（II)中心引入配体的具体顺序并不重要。这种配体置 换循序上的适应性有助于减少在制备供筛选的大量化合物时所需的合成步骤数目，因为不 同的目标化合物可以共用某些通用中间体。
[0074] 例如，改变上述三个反应的配体替换顺序，我们可以有如下的另一个合成路径：
[0075] [(对异丙基甲苯)RuC12]2，+L" ' -(对异丙基甲苯）（L" '）RuC12
[0076] (对异丙基甲苯）（L" '）RuC12+L' -（L'）（L" '）RuC12
[0077] (L，）（L，，，）RuCl2+L，，-（L，）（L，，）（L，，，）Ru
[0078] (这里，L '、L" 和L"，是L1，L2和L3，或者L1，L 4和L5)
[0079] 总之，合成顺序包括以下步骤。首先，使[(对异丙基甲苯)RuC12]2和L'、L"或L"'反 应形成第一中间体(对异丙基甲苯）（1/)此(：1 2、（对异丙基甲苯）（1；'）此(：12或(对异丙基甲 苯）（L" '）RuC12。第二步，通过使(对异丙基甲苯）（L'）RuC12与L"或L" '反应，使(对异丙基甲 苯）（L"）RuC12与L'或L"'反应，或使(对异丙基甲苯）〇；''）此(：1 2与1/或1；'反应，将第一中间 体转化为第二中间体(L'）（L"）RuC12，（L'）（L" '）RuC12或者(L"）（L" '）RuC12。第三步，使(L'） 〇；'）此(：12与1；''反应，或使〇/)〇；''）1^1 2与1；'反应，或者使〇；'）〇；''）1^12与1/反应，将 第二中间体转化为〇/)〇；'）〇；''）此。在以上的合成步骤中，1/、1；'和1；''可以替换为1^儿 2和 L3，或者替换为L1，L4和L5，以保持在钌核的周围布置有三个配体。
[0080] -系列的合成实施例证明了任何配体都可以在上述的通用合成路径中的任何一 个步骤中与钌（II)配位。表1列出了以上和以下定义的1^丄 2丄3丄4和1^配体，它们将被用于 本发明的实施例中。
[0081 ]表1本发明实施例中所用到的双齿二亚胺配体示例
[0082]
[0083]如上所述，L1是生物偶联功能化的含氮杂环双齿配体，优选选自2,2'_联吡啶、1， 10-菲咯啉以及它们的取代的同系物。L1无论是游离态或者与金属离子配位后，都能够与生 物物质在温和的条件下发生反应或者偶联。所述功能基团或者生物偶联基团选自羧基、N-琥珀酰亚胺基羧酸酯(NHS酯）、N-羟基磺化琥珀酰亚胺基羧酸酯(磺化-NHS酯），亚磷酰胺、 异硫氰基、甲酰基、氨基、肼基、羟基和马来酰亚氨基等。除了表1中所列举的本发明中用作 ECL标记物合成实施例的配体外，L1还可以选自以下，但不局限于以下，可生物偶联的二亚 胺配体：
[0084]
[0085]
[0086] L1尤选是具有肉个货电何的ΙΓΜΙ泶朴双齿配怀，1尤选选目m天μκ哫和1，1U-菲 咯啉的衍生物。表1中所示的配体L 2为磺酸化的2,2'_联吡啶和1，10-菲咯啉的衍生物。示例 的配体的荷负电基团是-S03-。不过，该负电基团也可以选自-0S0 3-、-Ρ03Η-、-0Ρ03Η-等。合成 过程中使用的原料或中间体可以盐形式存在，比如钠盐。除了表1中所列举的本发明中用作 ECL标记物合成实施例的配体外，L2还可以选自以下，但不局限于以下的二价阴离子二亚胺 配体：
[00871 一·ι.η η -
[0088] L3是不带任何电荷基团的含氮双齿配体，优选选自2,2'-联吡啶、1，10-菲咯啉以 及它们的取代的同系物。除了表1中所列举的本发明中用作ECL标记物合成实施例的配体 外，L 3还可以选自以下配体，但不局限于以下配体：
[008?
一IN IN- 一IN M- 一IN IN -
[0090] L4和L5优选为一价阴离子型含氮杂环双齿配体，优选选自2，2 联吡啶和1，10-菲 咯啉的衍生物。表1所例示的L4和L5配体为磺酸化的2,2'_联吡啶和1，10-菲咯啉的衍生物。 所示配体中的的负电荷基团是-S03_。但负电荷基团也可选自-0S03_、-Ρ03Η_、-0P0 3Hg。合成 过程中的起始原料或中间体可以盐形式存在，比如钠盐。除了表1中所列举的本发明中用作 ECL标记物合成实施例的配体外，L4和L5还可选自，但不局限于，以下描述的一价阴离子二亚 胺配体：
[0091]
[0092] 表1中所例不的配体Li谷目具有羧酸基团作为生物偶联基团。在形成多二业肢金 属配合物以后，该羧酸基团可以容易地转化为N-琥珀酰亚胺酯(NHS酯）和N-羟基磺化琥珀 酰亚胺酯（磺化-NHS酯）。具体将羧酸基团转化为NHS酯的方法详见文献(M.Zhou et al， Anal. Chem. 2003，75，6708-6717)和专利（如US6808939 B2)。在转化过程中，通常使用N，N-二环己基碳酰二亚胺(DCC，溶于二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，乙腈，四氢呋喃 等有机溶剂)或者1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，用于水溶液）。
[0093] 由于有大量可供选择的配体作为钌（II)的潜在配位伙伴，以及以上描述的合成方 案的灵活性，多种可能的配体组合方案可以导致电中性的钌配合物，即Μ η+α?3]η?ΡΜη+ α?5]η'这些钌配合物的例子如下所示。这些钌标记物的合成在实施例中举例描述。
[0094]
[OUVDJ
[C
[0098]
[0099」
[ο
[0104] 本发明进一步提供了标记的生物分子，它由电中性的金属配合物与生物分子反应 形成，它们具有如下结构：
[0105] {Mn+[L，L，，L，，，]n-}m_B(V)，
[0106] {Μη+[?ΛΑ3]η-} m_B(VI),
[0107] {Mn+ [ LH5 ]n-} m_B (V11)，or
[0108] {Μη+[?ΛΛ]η-}m-B(VIII)
[0109] B是具有化学、生物化学或者生物活性的物质，优选选自半抗原、氨基酸、核酸、核 苷、核苷酸、蛋白质、适配子、抗体和抗原等;m是大于或者等于1的整数。
[0110]经过标记的生物分子被用作生物分析，所述生物分析涉及对金属配合物在光子激 发或电化学激发下产生的发光的测量。进一步的步骤 包括进行电化学发光分析，其中电化 学发光分析是电化学发光免疫分析和电化学发光DNA测定。
[0111] 在电化学发光分析中，电中性的金属配合物受促发光。在一确定时间段内。所发出 的光的强度或者光子数与被测物的浓度相关。 实施例
[0112] 配体合成
[0113] 1.具有生物偶联基团的2,2'_联吡啶配体合成:4-(2,2'_联吡啶-4-基)正丁酸(化 合物3) ^Λ? ? >1 ?
[0115] 将35〇111以0.56111〇1)1.61的正丁基锂的己烷溶液加入-78°〇的含二异丙基胺 (82.8mL，0.59mol)的1.5L无水四氢呋喃(THF)中，在-78°C氮气保护条件下搅拌该混合物1 个小时。86.6g(0.50mol )2_溴-4-甲基吡啶溶于200mLTHF中，然后将该溶液加入到二异丙基 氨基锂(LDA)溶液中。反应4小时后，将3-溴丙腈(75g，0.56mo 1)溶于1 OOmL无水THF的溶液滴 加到混合物中，反应温度提升到〇°C，在此温度下继续反应24小时。然后将反应混合物倒入 500mL水中，并用1M的盐酸中和该溶液。产物用乙酸乙酯萃出。合并的乙酸乙酯溶液经盐水 洗涤后，用无水硫酸镁干燥，随后旋转蒸发。粗产品经过柱色谱分离后，得到51.5g化合物1 (收率为46%)</H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ8·30(1Η)，7·35(1Η)，7·11(1Η)，2·78(2Η)，2·40 (2Η)，2·01(2Η) 〇
[0116] 将 18.38(81.3111〇1)化合物1和3(^(81.5111〇1)2-(三正丁基锡）吡啶在40011^甲苯中 用氮气鼓泡10分钟，随后加入5.0g四（三苯基膦）。该混合物在氮气保护下回流60个小时后 冷却至室温。将混合物中的黑色固体滤除，将滤液旋转蒸发，再重新用二氯甲烷溶解。该溶 液通过一个经过三乙胺处理过的硅胶色谱柱，用乙醚/乙酸乙酯（1:1)洗脱。旋转蒸发后，得 至丨Jl5g化合物2(收率为81.5%) </H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ8.67( 1H)，8.59( 1H)，8.40( 1H)， 8·26(1Η)，7·81(1Η)，7·31(1Η)，7·14(1Η)，2·85(2Η)，2·37(2Η)，2·05(2Η)。
[0117] 将1 OOmL浓盐酸（12mo 1L-1)加入15g (67 · 2mmo 1)化合物2中并回流19个小时。往室温 下的酸混合物中加入氨水溶液，调节溶液pH至5。产物用乙酸乙酯萃出，旋蒸得到灰色粉末， 再重新用甲醇溶解后滴入水中。经过滤和真空干燥后收集到白色沉淀物3。得到10.5g(收率 64.5%)。咕 NMR(CD30D，400M Hz，见图2)δ8 ·65( 1Η)，8·53( 1Η)，8 ·27( 1Η)，8 ·17( 1Η)，7·93 (1Η)，7·43(1Η)，7·32(1Η)，2·79(2Η)，2·37(2Η)，2·01(2Η)。
[0118] 2.具有生物偶联基团的1，10-菲咯啉配体的合成:5-((菲咯啉-5-)氨基)-5-戊酮 酸(化合物4)。
[0119]
[0120] 将158(76.8111111〇1)1，10-菲咯啉-5-胺和9.28(80111111〇1)戊二酐在15011^01^中混合。 在氮气保护下，加热反应混合物至50°C持续7小时。反应完成后，将溶剂DMF旋转蒸发，用乙 醇洗涤残余物并过滤。将得到的固体研磨后，再用乙醇洗涤，随后真空干燥，得到llg白色粉 末4(收率46%)</H NMR(CD30D，400M Ηζ)δ12· 13(s，lH)，10.12(s，lH)，9.10-9.00(d，J = 36Hz，2H)，8.58(d，lH)，8.44-8.42(d，J=8Hz，lH)，8.16(s，lH)，7.82-7.79(m，lH)，7.73-7·70(m，1H)，2·56(m，2H)，2·33(m，2H)，1·94-1·86(m，2H)。
[0121] 3. -价阴离子配体(盐形式)合成：（4'_甲基_2,2'_联吡啶-4-基）甲磺酸钠(化合 物6)
[0122]
[0123] 将20g(108.5mmo 1)4，4 ' -二甲基-2，2 ' -联吡啶溶解于400mL无水四氯甲烷中，再加 入19g(106.8mmol )N-溴代琥珀酰亚胺和2.6g过氧化苯甲酰。将混合物回流过夜并冷却至室 温。滤除混合物中的固体，滤液用旋转蒸发仪浓缩。将浓缩液通过经过三乙胺处理的硅胶色 谱柱，得到68的4-(溴甲基)-4'-甲基-2,2'-联吡啶(化合物5)，将其与4.98(38.9_31)亚硫 酸钠和100mL水混合，所得浑浊液回流6小时。趁热将上清液浓缩到30mL并冷却到室温。将析 出的黄色沉淀过滤收集，并用二氯甲烷洗涤，最终得到3.6g(4'_甲基_2,2'_联吡啶-4-基） 甲磺酸钠（化合物6)</H MMR(D2〇,400M Hz，见图3)δ8·81(1Η)，8·67(1Η)，8·44(1Η)，8.30 (1Η)，7·88(1Η)，7·76(1Η)，4·42(2Η)，2·73(3Η)。
[0124] 4.另一个一价阴离子配体(盐形式）的合成：（4'_羟甲基_2,2'_联吡啶-4-基）甲磺 酸钠(化合物8)
[0125]
[0126] 将 3g(23 · 8mmol )Na2S03和 3 · 9g( 13 · 97mmol)化合物 7 混合于 35mL 水中，化合物7 是由 [2,2'_联吡啶]_4,4'_二甲醇制备4,4'_二(溴甲基)-2,2'_联吡啶的副产物。将混合物在氮 气保护下回流5小时。将反应液旋转蒸发，并将溶解在含有10%甲醇的水溶液中。经硅胶色 谱柱后，得到4.1g淡粉色产物。产率97%</Η NMR(D20,400M Ηζ)δ8·53(1Η)，8·48(1Η)，7·92 (1Η)，7·84(1Η)，7·49(1Η)，7·38(1Η)，4·69(2Η)，4·24(2Η)。
[0127] (对异丙基甲苯）（L'）RuC12的合成
[0128] 我们证明，选自表1中1^儿2儿3儿4儿5的任何一个配体1/能用作初始材料与二氯(对 异丙基甲苯)舒（II)二聚体，即[(p-cymeme)RuCl2]2,反应生成一个中间体(对异丙基甲苯） (L，）RuC12〇
[0129] 5.(对异丙基甲苯）（2,2'_联吡啶)RuC12(化合物9)的合成
[0130]
[0131] 将2.(^(3.27臟〇1)[(对异丙基甲苯)1?11(：12]2和1.038(6.59臟〇1)2,2'-联吡啶溶解 于400mL甲醇中，将该溶液回流8小时。在反应过程中，溶液的颜色从红色变为黄色。旋转蒸 发最终反应液后，所得固体经硅胶色谱柱提纯，甲醇/水洗脱剂洗脱得到1.64g黄色粉末(化 合物9)</H NMR(CDC13,400M Ηζ)δ9·76(2Η)，8·40(2Η)，8·07(2Η)，7·75(2Η)，6·22(2Η)，6·09 (2Η)，2·74(1Η)，2·29(3Η)，1·05(6Η)。
[0132] 6.(对异丙基甲苯）（4,7-二苯基-1，10-菲咯啉)RuC12(化合物10)合成
[0133]
[0134] 将0 · 613g( 1 · Ommol)[(对异丙基甲苯)RuCl2]2和0 · 665g(2mmol )4，7 ' -二苯基-1， 1 〇-菲咯啉溶解于50mL乙醇中，在氩气保护下将溶液回流4小时。旋转蒸发乙醇，黄色固体溶 于二氯甲烷后滴入无水乙醚中。过滤收集黄色沉淀，并真空干燥。得到1.21g产物（收率 95%)</H NMR(CD30D，400M Hz，见图4)δ9.89((1, J = 5.5Hz，2H)，8.13((1, J = 2.5Hz，2H)，8·05 (d，J = 5.4Hz，2H)，7.73-7.57(m，10H)，6.29(d，J = 6.4Hz，2H)，6.06(d，J = 6.3Hz，2H)，2.74 (m，J = 13.6,6.8Hz，lH)，2.30(s，3H)，1.07(t，J = 10.6Hz，6H)。
[0135] 7.(对异丙基甲苯）（红菲咯啉二磺酸钠)RuC12(化合物11)合成
[0136]
[0137] 将浴fl50mL甲醇中的0.8068(1.316臟〇1)[(对弁内基甲苯）此(：12」2和浴亍7511^水 中的1.412g(2.632mmol)红菲咯啉二磺酸钠混合并在氩气保护下溶液回流4小时。旋转蒸发 除去溶剂后得黄色固体2.2g，该化合物无需提纯直接用于后面的反应步骤。
[0138] (L，）（L，，）RuC12 的合成
[0139] 我们证明，选自表1中^2、1^、1>丄5的任何一个配体1；'能替换中间体(对异丙基甲 苯）（L'）RuCl冲的剩余对异丙基甲苯，从而形成〇/)〇；'）1^12。由于立体异构体混合物分 离困难，这些二氯杂配二亚胺配合物未经提纯直接用于制备三杂配ECL标记物。作为示例， 图5给出化合物15在⑶30D中的 1H NMR谱图。
[0140] 8.合成cis-(2,2'-联吡啶）[4-(2,2'_联吡啶-4-基）丁酸]RuC12配合物（化合物 12)〇
[0141]
[0142] 将0 · 44g( 1 · 8mmol )4-(2，2 ' -联吡啶-4-基）丁酸和0 · 83g( 1 · 74mmo1 )(对异丙基甲 苯）（2,2'_联吡啶)RuC12以及0.61g(14.39mmol)氯化锂混合于15mL DMF中。混合物在氮气 保护下回流3小时。反应过程中，溶液颜色从黄色变为深紫色。在混合物冷却至室温后，在搅 拌下，将混合物倒入200mL乙醚中。过滤收集深紫色的沉淀，再以甲醇/水为淋洗剂，用硅胶 色谱柱除去少量带有荧光的副产物。产出产品0.40g(收率40 % )。
[0143] 9.cis-(2,2'-联吡啶）[4_ 甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_联吡啶]Ru(II)C12(化合物 13)的合成。
[014
[0145] 化合物13的合成方法与化合物12相同。
[0146] l〇.cis-(4,7-二苯基-1,10-菲咯啉）[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸钠]Ru(II)C1 2 (化合物14)的合成
[0147]
[0148] 将1.568(4.02111111〇1)2,2'-联吡啶-4,4'-二甲磺酸钠和2.568(3.92111111〇1)(口-cymeme) (4,7_二苯基-1，10-菲略啉）RuCl2以及 1 · 35g(31.84mmol)氯化裡混合于50mL DMF 中。将该溶液在氮气保护下回流3小时。冷却至室温后，将深紫色混合物倒入400mL丙酮中。 收集深紫色固体。滤液中也发现含有一定量的产物，因此将滤液旋转蒸发。合并后的紫色固 体以甲醇为淋洗剂，用硅胶色谱柱处理。最后将紫色的浓溶液滴入干燥的乙醚中，经过滤和 干燥，得到深紫色固体3.4g(收率97 % )。
[0149] 11. (2，2'-联吡啶）（红菲咯啉二磺酸钠)Ru(II)C12配合物(化合物15)的合成
[0150]
11 1S
[0151] 将0.355g(2.27mmol)2,2'-联吡啶和1.785g(2.12mmol)(对异丙基甲苯)红菲咯啉 二磺酸钠)RuC1 2以及0.772g( 18.2mmol)氯化锂混合于30mL DMF中。该溶液在氮气保护下回 流3.5小时。在冷却至室温后，旋转蒸发深紫色溶液，固体再溶于甲醇中。硅胶色谱柱纯化产 出1.75g深紫色固体(异构体混合物）。图5是化合物15在CD 30D中的1H NMR图谱。
[0152] (L，）（L"）（L" '）Ru标记物的合成
[0153] 12.三杂配金属配合物标记物-Ru(2，2 ' -联吡啶）（红菲咯啉二磺酸盐）[4_(2，2 ' -联吡啶-4-基)丁酸](16)的合成
[0154]
[0155] 标记物16经两种不同的方案进行合成。在方案A中，一个二价阴离子配体，红菲咯 啉磺酸钠盐(在本发明中定义为L2)，替代(Oa^RuCls配合物12中的两个配位氯原子，生 成目标标记物16。在方案B中，一个可生物偶联的配体，即化合物3,4-(2,2'_联吡啶-4-基） 正丁酸(在本发明中，定义为L 1)，替代(L2)(L3)RuC12配合物15中的两个配位氯原子，生成同 样的目标标记物16。两种合成方案的细节如下所示。
[0156] 方案A:将200mg(0.35mol)的化合物12和191.811^(0.36臟〇1)红菲咯啉磺酸钠盐溶 解于25mL甲醇/水(4:1)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3.5小时。在反应过程中，溶液 由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤，滤液浓缩至5mL，再用甲醇/水(2:1)溶液做淋洗 剂，经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发并真空干燥后，得到目标化合物。产量200mg。
[0157] 方案 B:将800mg(0.925mol)化合物 15 和 224mg(0.925mmol)4-(2,2'-联吡啶-4-基） 正丁酸(化合物3)溶解于40mL甲醇/水(3:1)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3小时。在 反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤，滤液浓缩至10mL，再用甲醇/水 (2:1)溶液做淋洗剂，经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发 并真空干燥后，得到目标化合物。产量 650mg，产率65%。图6是其 1H NMR图谱。4 NMR(CD30D，400M Ηζ)δ8·60-8·85(4Η)，7·22-8·35 (25Η)，2·78-2·96(2Η)，2·22-2·36(2Η)，1·90-2·08(2Η)。
[0158] 11.由通用的中间体(L2)(L3)RuC12配合物（15)出发用不同的可生物偶联的配体 (本发明中定义为L 1)合成制备两种三杂配金属配合物标记物:Ru(2,2'_联吡啶）（红菲咯啉 二磺酸盐）[4-甲基-4 ' -(3-羧丙基)-2，2 ' -联吡啶](17)和Ru(2，2 ' -联吡啶）（红菲咯啉二 磺酸盐）[5-( (1，10-菲咯啉-5-基)氨基)-5-戊酮酸](18)。
[0159]
[0160] 化合物17和18便用前?的万案B进仃合成。
[0161] 标记物 17:将 505mg(0.58mol)化合物 15 和 17911^(0.70_〇1)4-[4'-甲基-(2,2'-联 吡啶)-4-基]正丁酸溶解于30mL甲醇/水(3:1)中，在氮气保护条件下将溶液回流3.5小时。 在反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤旋转蒸干。将固体再次溶解于 甲醇/水混合物中，并经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发并真空干燥，得到目标化合物。产量 410mg。图7是其 1HNMR图谱。4 MMR(CD30D，400M Ηζ)δ8·57-8·80(4Η)，7·90-8·34(11Η)， 7·52-7·84(10Η)，7·34-7·45(2Η),7.18-7.29(1Η)，2·77-2.95(2Η)，2·52-2·66(3Η),2.10-2·34(2Η)，1·87-2·08(2Η)〇
[0162] 标记物 18:将 340mg(0.39mmol)化合物 15 和 121·6mg(0·39mmol)5-((l，10-菲咯啉-5-基)氨基)-5-戊酮酸溶解于35mL甲醇/水(6:l)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3.5小 时。在反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤旋转蒸干。将固体重新溶 解于甲醇产/水混合物中，并使用甲醇/水(2:1)作为洗脱剂经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发 并真空干燥，得到目标化合物。产量300mg，产率75 %。图8是其1H NMR图谱。
[0163] 12.由通用中间体(L2)(L3)RuC12配合物（14)合成在2,2'_联吡啶上带有荷电基团 的两种三杂配标记物:Ru(2，2 ' -联吡啶-4，4' -二亚甲磺酸盐）（4，7-二苯基-1，10-菲咯啉） [4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸](19)和Ru(2,2'_联吡啶_4,4'_二亚甲磺酸盐）（4,7_二苯基-1，10-韮咯卩林）(? . 1 0-韮咯卩林-5-某）氣某酸? QO) "
[0164]
[0165] 标记物 19:将2.00g(2.24mmol)化合物 14和0·54g(2·23mmol)4-(2,2'-联吡啶-4-基)正丁酸(化合物3)溶解于35mL甲醇/水(6:l)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3.5小 时。在反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤并旋转蒸干。将固体重新 溶解于甲醇/水混合物中，再用甲醇/水(4:1)溶液做淋洗剂，经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸 发后，将浓缩后的溶液滴入无水乙醚中，过滤，得到棕色粉末产物630mg，产率27.6 %。4 NMR(CD30D，400M Hz，见图9)? NMR(CD30D，400M Hz,Figure 9)δ8·60-8·85(4Η) ,7.20-8.40 (25Η)，4·10-4·45(4Η)，2·73-3·00(2Η)，2·12-2.34(2H)，1.83-2.10(2H)。
[0166] 标记物 20:将 500mg(0.56mmol)化合物 14 和 173mg(0·56mmol)5-((l，10-菲咯啉-5-基)氨基)-5-戊酮酸溶解于35mL甲醇/水(6:l)中，在氮气保护条件下将该溶液回流3小时。 在反应过程中，颜色由暗紫色变为明亮的橙色。将反应液过滤并旋转蒸干。将固体重新溶解 于甲醇/水混合物中，再用甲醇/水(4:1)溶液做淋洗剂，经过硅胶色谱柱提纯。旋转蒸发并 真空干燥后，得到目标化合物。产量180mg，产率29.6%。图10是其 1H NMR图谱。
[0167] 13.三杂配金属配合物的合成-Ru(2,2'_联吡啶）（2,2'_联吡啶_4,4'_二亚甲磺酸 盐）[4-(2,2'_联吡啶-4-基)丁酸](21)
[0168]
[0169] 将 145 · 5mg(0 · 375mmol )2，2 ' -联吡啶-4，4' -二亚甲磺酸钠和 203 · 4mg(0 · 357mmol) 化合物12混合于15mL水/甲醇(40:60)溶液中。将该深紫色溶液在氮气保护条件下回流3小 时。得到的明亮的橙色溶液经旋转蒸发浓缩并用水/甲醇(30:70)做淋洗剂，经过硅胶色谱 柱提纯，得到 150mg橙色化合物21。4 NMR(CD30D，400M Ηζ)δ8 · 64-8 · 79(5H)，8 · 59(1H)，8 · 10 (3Η),7.67-7·90(6Η),7.41-7·57(5Η),7.32-7.38(lH)，4.26(s，4Η)，2·81-2·90(2Η),2.17-2·28(2Η)，1·93-2·05(2Η)〇
[0170] 14.三杂配标记物的合成-Ru[(4'_甲基-2,2'_联吡啶-4-基）甲磺酸根][(4'_羟甲 基-2，2 ' -联吡啶-4-基）甲磺酸盐）[4-( 2，2 ' -联吡啶-4-基)丁酸](24)
[0171]
[0172] 将1 · 22g(2 · Ommol)[(对异丙基甲苯)RuC12]2和 0 · 969g(4 · Ommol )4-(2，2 ' -吡啶-4-基)丁酸溶解于300mL甲醇中，将该溶液回流6小时。旋转蒸发最终的溶液并使用甲醇用硅胶 色谱柱提纯固体，得到黄色粉末化合物(22)1.6g(产率73%)。咕NMR(CD 30D，400M Ηζ)δ9.5 (d ,J = 4.9Hz,lH) ,9.35(t ,J = 4.9Hz,lH),8.52(d ,J = 8.0Hz,lH) ,8.41 (d, J= 1.2Hz ,H), 8.21(t ,J = 7.4Hz,lH),7.75(dd ,J = 9.7,3.6Hz,lH),7.64(dd ,J = 5.8,1.5Hz,lH),6.11(t, J = 7.5Hz,2H) ,5.87(t,J = 6.3Hz,2H),2.97-2.87(m,2H),2.63(dq,J = 13.8,6.9Hz,lH), 2.40(q ,J = 7.5Hz,2H),2.27(s,3H),2.08-1.97(m,2H)a.04(d ,J = 6.9Hz,6H)〇
[0173] 将607mg(1.10mmol)化合物 22 和 286mg(1.0mmol)4'-甲基-(2,2'-联吡啶）-4-基） 甲磺酸钠以及200mg(4.72mmol)氯化锂混合于30mL DMF中，并在氮气保护下回流3小时。在 冷却至室温后，将反应混合物滴入400mL丙酮中。过滤收集深色沉淀并用丙酮冲洗三遍产出 300mg化合物23，产率42.8 %。
[0174] 将 300mg(0 · 43mmol)化合物 23 和130mg(0 · 43mmol) (3' -轻甲基-(1，1 ' -二苯基)_3_ 基）甲磺酸钠与30mL甲醇混合。在氮气的保护下将该混合物回流3小时。冷却至室温后，将通 过旋转蒸发将该溶液浓缩，并用水/甲醇做淋洗剂，经过硅胶色谱柱提纯，得到300mg化合物 24(产率34%) </H NMR(CD30D，400M Ηζ)δ8· 73-8·65(ι?，3H)，8.63(s，lH)，8.56(s，2Η)，8·07 (t，J=7.8Hz，lH)，7.86-7.56(m，6H)，7.51-7.40(m，4H)，7.32(m，2H)，4.81(s，2H)，4.24(s， 4H)，2.85(d，J = 0.7Hz，2H)，2.56(s，3H)，2.24(dd，J = 6.8,2.5Hz，2H)，1.97(m，2H)。
[0175] 14.从通用中间体配合物25，cis-[(4'-甲基-2,2'_联吡啶-4-基）甲磺酸盐Ru(II) Cl2,制备两种二杂配标记物:Ru[(4'_甲基_2,2'联吡啶-4-基）甲磺酸根M4-甲基-4'-(3- 羧丙基)-2,2'_联吡啶](26)和Ru[(4'_甲基-2,2'-联吡啶-4-基）甲磺酸根] 2[4-(2,2'-联 吡啶-4-基)丁酸](27)
[0176]
[Οι //」 你 ·丄?πιπιουκ，日、
不uz/4mgu ·丄?πιπιου?-?ζ,ζ -狀 基)正丁酸混入35mL甲醇/水(6:1)中。在氮气的保护下将该混合物回流3小时。待到冷却至 室温后，将反应混合物旋转蒸干，用水重新溶解，并过滤。滤液用甲醇/水为淋洗剂过硅胶色 谱柱提纯，产出240mg产物26</H MMR(CD30D，400M Ηζ)δ8·71(3Η)，8·60(3Η)，8· 11(1H)， 7·59-7·92(6Η),7.44-7·57(3Η),7.27-7.42(m，3H)，4·28(4Η)，2·90(2Η)，2·60(6Η),2.35 (2Η),2.04(2Η)0
[0178]标记物 27:将 595.611^(0.80111111〇1)化合物25和26411^(1.03111111〇1)4-[4'-甲基-(2， 2 联吡啶)4-基]丁酸混入30mL甲醇/水(4:1)中。在氮气的保护下将该混合物回流3小时。 待到冷却至室温后，将反应混合物旋转蒸干，用水重新溶解并过滤。滤液用甲醇/水为淋洗 剂，经过硅胶色谱柱提纯，得到150mg标记物27。4 MMR(CD30D，400M Ηζ) δ8.67 (2H)，8.55 (4Η),7.55-7·78(6Η),7.42-7·54(2Η),7.25-7·37(4Η)，4·24(4Η)，2·84(2Η)，2·56(9Η)， 2·23(2Η)，1·98(2Η)。
[0179] 15.羧酸转化为其NHS酯
[0180] 上面所描述的ECL标记物能直接用于标记含有一个或者多个氨基基团的化学、生 物化学和生物物质。通常的实验程序涉及到在N-羟基琥珀酰亚胺或者磺化NHS(N-羟基琥珀 酰亚胺)协助下，二环己基碳酰二亚胺(DCC，用于非质子溶剂)或者水溶性的乙基-(二甲基 氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)。实施例18介绍了使用带羧基的标记物标记蛋白的实例。一个 更方便、更直接的标记诸如蛋白、抗体、抗原和氨基修饰的核苷酸等含-NH 2的化学、生物化 学和生物物质的方法是在一个简单反应中使用所谓的活性酯，即NHS酯。
[0181] 合成NHS活性酸的一般方法是在无水非质子溶剂（例如二氯甲烷、DMF、DMS0、乙腈 等）中将过量的N-羟基琥珀酰亚胺与带羧基的标记物混合。一般再加入过量的偶联试剂如 二环己基碳酰二亚胺(DCC)，以形成高度不稳定的活化酸中间体。室温条件下，这种由酸到 NHS酯的转变已经证实在乙腈溶液中需要20个小时来完成（M.Zhou et al， Anal .Chem. 2003,75,6708-6717)。比如，为了将标记物16转变为它的NHS酯28,24.8mg (25mmo 1)的标记物 16 与 8 · 7mg (75 · 6mmo 1) N-羟基琥泊酰亚胺和 16 · 5mg (79 · 9mmo 1) DCC 在 lmL DMF中进行混合。该混合物在氮气保护的条件下保持搅拌20个小时。该反应可以用TLC进行 监测。将反应混合物滴入干燥的乙醚中，然后离心分离，可得到粗产品。
[0182]
过程也能够在水性溶液例如吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中进行，但采用水溶性的1-乙基Ιο-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐 (EDC) 作为偶联剂。 NHS 酯足够稳定，可以被提纯，并 可在低温无水环境储存。它也可以无须从反应混合物中分离，而直接用于标记蛋白。
[0184] 光致发光和电化学发光
[0185] 16.测定吸收光谱和光致发光光谱
[0186] 前面实施例中所合成的钌（II)二亚胺配合物，Mn+aWM+aW广和Μη+ [ιΛΛ]'在受到波长处于它们的吸收波段的光的激发时，都能发光，它们的吸收波段可以 通过测量其在从UV至近红外波长范围的吸收进行确定。图11和12分别示出了吸收光谱和光 致发光光谱。所有这些钌（Π )配合物在350~550nm范围内都具有金属到配体的电荷转移 (MLCT)带。表2列出了MLCT最大值，它们的摩尔吸光系数和最强发光。
[0187] 表2.在298K的水溶液中，关于MLCT吸收和发射的光物理数据。Ru-Ref表示用作参 照的钌（II)二亚胺标记物，Ru( 2，2 ' -联吡啶)2 [4-( 2，2 ' -联吡啶-4-基)丁酸]Cl2。
[0188]
[0189]
[0190] 17.ECL 的测定
[0191] 钌（II)配合物的氧化还原ECL是在含有三丙胺的磷酸盐缓冲溶液(ProCell，得自 Roche Diagnostics，pH6.8,0.18M三丙胺溶液）中，使用电势阶跃技术产生的。所用的电势 为1 · 4V(vsAg/AgCl)，记录ECL随时间的变化。Ru (2，2 ' -联吡啶)2 [4-(2，2 ' -联吡啶- 4-基)丁 酸]Cl2，简写为Ru-Ref，在所有的ECL测试中被用作参照。
[0192] 图13显示了在电势阶跃实验中，不同标记物的ECL强度衰减。相比于Ru-Ref，许多 标记物在保持类似的强度-时间曲线的同时，都显示出了更高的ECL强度。
[0193] 图14是标记物16与Ru-Ref分别在10-7、10-8和1〇Λιο1 I/1浓度下的ECL比较。
[0194] 抗体标记
[0195] 18.使用含羧基的标记物标记抗体
[0196] 将2.511^(2.5以111〇1)16溶解于50(^1^]\^5缓冲溶液（0.1]\14!1 = 4.7)中，浓度为 5mmol/L。向该溶液中加入1.0mg(5.2ymol)l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸 盐（EDC)和3 · Omg(13 · 8μπιο 1)磺化NHS，它们的终浓度分别为1 Ommo 1 /LEDC和27mmo 1 /L磺化 NHS。将该溶液置在室温下震荡10分钟。再向该反应液中加入0.7yL (1 Ομπιο 1) 2-巯基乙醇，其 终浓度为20mmol/L。在室温下静置5分钟后，取该溶液8.0yL(含有40nmol 16)，加入500yL含 有山羊抗鼠 IgG(1.2mg/mL，大约有4nmo 1纯山羊抗鼠 IgG，预设标记比为10)的roS(0. lmo 1 / L，pH=7.4)中。在室温下混合并培育2小时。
[0197] 如上获得的溶液(大约0.5mL)载入预先用PBS平衡的ro-10柱(填充有Sephadex G-25介质，来自GE Healthcare Life Sciences)。在分离过程中形成两个黄色带。收集先洗脱 出来的带溶液，其对应于已经被标记的山羊抗鼠 IgG，大约有0.75mL。
[0198] 采用Bradf ord或者BCA蛋白分析法定量测定山羊抗鼠 I gG的量，以确定实际的标记 物与蛋白的比例（结合比）。基于标记分子的摩尔吸光系数，标记物16在455nm处的吸收可与 标记物的量相关。在以上描述的条件下，标记物16与山羊抗鼠 IgG的结合比大约为6。
[0199] 19.使用NHS酯标记物标记抗体
[0200]本发明所公开的带有-S03-基团的电中性标记物的NHS酯形式可以溶解于水、DMS0 和DMF。为了避免NHS的水解，标记物要么先溶于DMS0作为储备溶液立即使用；要么通过将预 定体积的蛋白缓冲溶液直接加入含预设量的NHS酯标记物的试管中来以固体形式直接使 用。以下详细介绍使用固体NHS酯标记物的程序。
[0201] 将lmL山羊抗鼠 IgG(1.2mg/mL，大约8nmol蛋白）的PBS溶液加入装有8mg标记物28 粉末的试管中。将试管在室温下震荡并孵育该混合物两小时。如上获得的溶液载入预先用 PBS平衡的PD-10柱。在分离过程中，有两个黄色带形成。收集首先洗脱的带，其对应于已被 标记的山羊抗鼠 IgG。
[0202] 通过蛋白定量分析和标记物28在455nm处的吸收测量，测定标记物28与山羊抗鼠 IgG的结合比。该比例为4.5。标记蛋白的效率受很多因素影响。即使在相同的条件下（同样 的缓冲液，相同的反应时间），不同的标记物和不同的蛋白也可能有不同的结合比。因此，标 记物对蛋白的预设标记比必须通过实验来确定，以得到所要求的结合比。
[0203]免疫分析
[0204] 20.在夹心法免疫分析中使用标记有标记物16和Ref-Ru的山羊抗鼠 IgG。
[0205] 在这个示例的ECL免疫分析测试中，鼠 IgG用作被检测物质(抗原），而标记过的山 羊抗鼠 IgG(H+L)和生物素化的兔抗鼠 IgG(H+L)则分别作为显信号抗体和捕获抗体。包覆有 链霉亲和素的?Μ-280被选作磁性介质，用于捕获"生物素化的抗体/抗原/标记过 的抗体"免疫复合物。分别向l〇〇〇yL不同浓度鼠 IgG的PBS溶液中加入20yL 5. Oyg/mL的生物 素化的兔抗鼠 IgG的PBS缓冲液和20yL 1.0yg/mL的标记过的山羊抗鼠 IgG，并在室温下孵育 20分钟，从而形成夹心结构免疫复合物。再向含"兔抗鼠 I gG八鼠 I gG/山羊抗鼠 I gG"夹心免疫 复合物的上述溶液中加入20yL包覆有链霉亲和素的Dynabeads?M-280悬浮液(200yg珠粒，预 先用PBS洗3遍）。将总体积为1060yL的该悬浮液在室温下通过恒定温和旋转孵育20分钟。采 用外磁场(2分钟)将附着有免疫复合物的Dynabeads分离出来，并用1000yL含有0.1%BSA的 PBS缓冲液冲洗该珠粒4遍，以去除其它未反应物质。最后一次冲洗步骤后，用1000yL PBS再 次悬浮该珠粒，至载有"抗体/抗原/抗体"夹心免疫复合物的珠粒浓度为200yg/mL。取100yL 上述溶液注入到三电极测量池中，工作电极上方配有光电倍增管。工作电极下方有一块可 移动的磁铁。施加一个阶跃电势（1.4V vs.Ag/AgCl)以氧化三丙胺和钌（II)标记物，后者通 过"抗体/抗原/抗体"夹心复合物已固定在磁性珠粒表面，以在磷酸盐缓冲溶液(ProCel 1， 来自Roche Diagnostics，pH 6.8,0.18mol/L三丙胺溶液）中通过氧化-还原过程产生ECL。 每次测量后，磁铁要从工作电极移开。按照美国专利US 5538687描述的方法，对测量池进行 清洗并对工作电极进行电化学再生处理。
[0206] 通过比较一系列浓度不同的鼠 IgG标准样品溶液所产生的ECL的信号（前3秒内的 ECL强度对时间积分)来进行评价。由于标记物16在均相ECL测试中表现出比Ru-Ref更强的 ECL信号（图13和14)，ECL标记物16在夹心法免疫分析中在ECL信号强度方面显示出比Ru-Ref更好的性能就不足为奇了（见图15)。
[0207]由前述说明书出发，本发明所公开的这些和其它优势对于本领域技术人员是显然 的。相应地，本领域技术人员会承认，可能对上述实施方案进行改变或者修改，而不背离本 发明的宽广的发明构思。要理解的是，本发明并不局限于本文所述的具体实施方案，而是打 算将落在本发明范围和主旨内的所有变化和修改都包括在内。
【主权项】
1. 式I的电中性金属配合物： Mn+[L，L，，L，，，]n- (I) 其中，M选自过渡金属，优选钌或者锇； η是电荷数，等于或者大于2; L'、L"和L" '独立地选自含氮杂环双齿配体，优选选自2，2 联吡啶，I，10-菲咯啉及其 取代的同系物，至少一个所述配体具有至少一个可生物偶联的反应基团，如羧酸、NHS酯、磺 化-NHS酯、亚磷酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基等；2. 式II的电中性三杂配金属配合物： Mn+[ L1L2L3](II) 其中，M选自过渡金属，优选是钌或者锇； η是电荷数，等于或者大于2; L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有至少一个可生物偶联的反应基团（X)，如羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS 酯、亚磷酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基等，X直接(无需连接体Τ)或者间接 (通过连接体Τ)与一个芳环连接，其中T是含碳或者含杂原子的连接体，包括烷基、烯基、烷 氧基，醜胺或芳香环;W是Ci-Cio的烷基、Ci-Cio的烯基、Ci-Cio的烷氧基、-CONH-Ci-Cio、-NHCO-Ci-Ciq、-Ci-Cg -CONHRi-、取代或非取代的5_或者6_兀芳环、羟基、氨基、腈、氰基或者1?素;且 L2是带负电荷的含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2'_联吡啶和取代的1，10-菲咯 啉，L2具有带负电荷的取代基团，它的总负电荷数与η相同(η大于或等于2)，其中E是带负电 荷基团，如-SO3' -OSO3' -PO3H'-OPO3IT等;A是含碳或者含杂原子的连接体、包括C1-C iq的烷 基、Ci-Ciq 的烯基、Ci-Ciq 的烷氧基、-CONH-Ci-Ciq-、-NHCO-Ci -Ciq-、-Ci-C9_C0NHR2 _、取代或非 取代的5-或者6-元芳环； L3是含氮杂环双齿配体，优选选自非反应性且不带电荷的2，2 联吡啶、I，10-菲咯啉或 者其上至少带有一个取代基团W'，其中所述取代基团W'是氢或者任何不带电荷的取代基 团、优选是 Ci-Ciq 的烷基、Ci-Ciq 的烯基、Ci-Ciq 的烷氧基、-CONH-Ci-iq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-9_ CONHR3-、取代或非取代的5-或者6-元芳环、羟基、氨基、腈、氰基或者卤素，其中R是氢或者 烷基;且 R1，RdPR3各自为氢或者烷基。3.式III的电中性三杂配金属配合物： MnIL1L4L5F (III) 其中，M选自过渡金属，优选是钌或者锇； η是电荷数，等于或者大于2; L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有至少一个可生物偶联的反应基团（X)，例如羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS 酯、亚磷酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基等，X直接(无需连接体Τ)或者间接 (通过连接体Τ)与一个芳环连接，其中T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C 1-Ciq的烷基、 C1-Ciq 的烯基、C1-Ciq 的烷氧基、-CONH-C1-Ciq-^NHCO-C1-CltK-C 1-C9-CONHR1'取代或非取代 的5-或者6-元芳环； L4或L5是不同的含氮杂环双齿配体，优选选自带有取代基团2,2'_联吡啶和1，10-菲咯 啉，L4或L5各自具有带负电荷的取代基团，各自的总负电荷数与η/2相同（η大于或等于2)， 其中E是带负电荷基团，例如-SO3'-OSO3'-Ρ03Η'-0Ρ0 3!Γ等;A是含碳或者含杂原子的连接 体、包括Ci-Ciq 的烷基、Ci-Ciq 的烯基、Ci-Ciq 的烷氧基、-CONH-Ci-Ci『、-NHCO-Ci-Ci『、-Ci -Cg- C00NHR2-、取代或非取代的5-或者6-元芳环； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选SC1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧 基、-CONH-Ci-Ciq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-C9_CONHR3_、取代或非取代的5-或者6 -兀芳环、羟基、氛 基、腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自为氢或者烷基。4.式IV的电中性二杂配金属配合物：： Mn^L1L42](IV) 其中，M选自过渡金属，优选是钌或者锇； η是电荷数，等于或者大于2; L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有至少一个可生物偶联的反应基团（X)，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基等，X直接(无需连接体Τ)或者 间接(通过连接体Τ)与一个芳环连接，其中T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷 基、Ci -Ciq 的烯基、Ci-Ciq 的烷氧基、-CONH-Ci-Ciq-、-NHCO-Ci -Ciq、-Ci-Cg-CONHRi-、取代或非 取代的5-或者6-元芳环； L4是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有带负电荷的取代基团，其总负电荷数与η/2相同（η大于或等于2)，其中E是带负 电荷基团，如-S03_，-OSOf，-PO3IT，-OPO3IT等;A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C 1-C10的 烷基，Ci-Ciq 的烯基，Ci-Ciq 的烷氧基，-CONH-Ci-Ciq-，-NHCO-Ci -Ciq-，-Ci-C9_C0NHR2 _，取代或 非取代的5-或者6-元芳环； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选SC1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧 基、-CONH-Ci-Ciq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-C9_C0NHR3_、取代或非取代的5-或者6 -兀芳环、羟基、氛 基、腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自为氢或者烷基。5. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配发光金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基，C1-C 1O的烯基，C1-C1O的烷氧基，_ CONH-C1-Ciq-，-NHCO-C1-Ciq，-C 1-C9-CONHR1-，取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； W和W'各自是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是&-&〇的烷基J1-Ciq的烃基、C 1-Cio的烷氧基、-CONH-Cho、-NHCO-C1-Ciq、-Cp 9-CONHR3-、取代或非取代的5-或者6-元芳环、 羟基、氨基、腈、氰基或者卤素;且 E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等;且 Ri和R3各自是氢或者烷基。6. 根据权利要求5所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-C00H);T是具有 1-9个亚甲基的烷基，即-(CH2)1-F5W是氢或者甲基;W'是氢或者甲基;E是-SO 3 一。7. 根据权利要求5所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是NHS酯·T是 具有1-9个亚甲基的烷基，即-(CH2)1-F5W是氢或者甲基;W'是氢或者甲基;E是-SO 3'8. 根据权利要求5所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸是羧酸(-C00H)或 者NHS酯T是-(CH2) 3-; W是氢或者甲基;W '是氢或者甲基;E是-SO3 一。9. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配发光金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； W和W'各自是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是&-&〇的烷基J1-Ciq的烃基、C 1-Cio的烷氧基、-CONH-Cho、-NHCO-C1-Ciq、-Cp 9-CONHR3-、取代或非取代的5-或者6-元芳环、 羟基、氨基、腈、氰基或者卤素； E是带负电荷的基团，如-s〇3-，-0S03-，-Ρ03Η-，-0Ρ0 3Η-等； Ri和R3各自是氢或者烷基。10. 根据权利要求9所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-C00H)或者NHS 酯；T是含酰胺的连接体或者是具有1-9个亚甲基的烷基，即-(CH2)1-S-J和W'是氢或者甲 基;E是-S〇3。11. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、_ CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等； W和W'各自是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是&-&〇的烷基 Cio的烷氧基、-CONH-Cho、-NHCO-C1-Ciq、-Cp9-CONHR 3-、取代或非取代的5-或者6-元芳环、 羟基、氨基、腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自是氢或者烷基。12. 根据权利要求11所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-COOH)或其NHS 酯；T是-CONH-C1-1Q-、-NH⑶-C1-Ciq-^C 1-9-C0NHR!-或者是具有1-9个亚甲基的烷基，即_ (CH2) ; W是氢或者-CH3; W '是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP -CH2-; E是-S〇3-。13. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、_ CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是心^^)的烷基X1-Ciq的烃基X1-C iq的烷氧 基、-C0NH-Ci-iq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-9_C0NHR3、取代或非取代的5-或者6-兀芳环、羟基、氛基、 腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自是氢或者烷基。14. 根据权利要求13所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-COOH)或者NHS 酯T 是-CONH-Ch。-、-NHCO-C1-C1O-、-Cp9-CONHR 1-或具有 1-9 个亚甲基的烷 基，即-(CH2)H; W是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP-CH2-; E是-S03-。15. 根据权利要求2所述的具有如下结构的电中性的三杂配金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是心^^)的烷基X1-Ciq的烃基X1-C iq的烷氧 基、-C0NH-Ci-iq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-9_C0NHR3_、取代或非取代的5-或者6 -兀芳环、羟基、氛基、 腈、氰基或者卤素； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、_ CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等;且 R1，RdPR3各自是氢或者烷基。16. 根据权利要求15所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-COOH)或者NHS 酯；T是-CONH-C1- 1Q-、-NH⑶-C1-Ciq-^C1-9-C0NHR!-或者是具有1-9个亚甲基的烷基，即_ (CH 2) H; W是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP-CH2-; E是-S03-。17. 根据权利要求3所述的具有如下结构的电中性的三杂配金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、- CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等； W是氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是心^^)的烷基X1-Ciq的烃基X1-C iq的烷氧 基、-C0NH-Ci-iq、-NHCO-Ci-Ciq、 -Ci-9_C0NHR3_、取代或非取代的5-或者6 -兀芳环、羟基、氛基、 腈、氰基或者卤素;且 W'和W"不同，选自氢或者任何不带电荷的取代基团，优选是^-⑶的烷基X1-Ciq的烃 基、C1-Ciq 的烷氧基、-CONH-C1-K)、-NHCO-C1-Ciq、-&-9-C0NHR4、取代或非取代的 5-或者 6-元芳 环、羟基、氨基、腈、氰基或者卤素;且 Ri-R4各自是氢或者烷基。18. 根据权利要求17所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸（-C00H)或者羧 酸的NHS酯;T是-CONH-C1-K)-^NHCO-C 1-Ciq-^Cb-CONHR1-或者是具有1-9个亚甲基的烷基， 即-(CH 2)H; W是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP-CH2-; E是-S03-。19. 根据权利要求4所述的具有如下结构的二杂配发光金属配合物：其中X是可生物偶联的反应基团，优选是羧酸、羧酸的NHS酯、羧酸的磺化-NHS酯、亚磷 酰胺、异硫氰基、醛、胺、肼、羟基和马来酰亚氨基，X直接(无需连接体T)或者间接(通过连接 体T)与一个芳环连接； T是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-C1O的烷基X1-C 1O的烯基X1-C1O的烷氧基、_ CONH-C1-Ciq-、-NHCO-C1-Ciq、-C 1-C9-CONHR1-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； A是含碳或者含杂原子的连接体，包括C1-Ciq的烷基X1-C iq的烯基X1-Ciq的烷氧基、_ CONH-Cho-、-NHCO-C1-Ciq-、-Cp9-CONHR 2-、取代或非取代的 5-或者 6-元芳环； E是带负电荷的基团，如-s〇3-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等； W和W'可以相同也可以不同，独立地选自氢或者任何不带电荷的&-(：1()的烷基、&-&〇的 烯基、C1-Ciq 的烷氧基、-CONH-C1-K)、-NHCO-C1-Ciq、-Cp 9-CONHR3、取代或非取代的 5-或者 6-元 芳环、羟基、氨基、腈、氰基或者卤素;且 R1，RdPR3各自是氢或者烷基。20. 根据权利要求19所述的电中性的三杂配金属配合物，其中X是羧酸(-C00H)或者NHS 酯；T是-CONH-C1-1Q-、-NH⑶-C1-Ciq-^C 1-9-C0NHR!-或者是具有1-9个亚甲基的烷基，即_ (CH2) H; W和W ' 是氢或者-CH3; A是亚甲基，SP-CH2-; E是-S03-。21. -种权利要求1-3的其中M是钌的电中性三杂配金属配合物标记物的合成方法，包 括以下步骤： (a)使[(对异丙基甲苯)RuC12]2与L'、L"或者L"'反应，形成第一中间体(对异丙基甲苯） (L'）RuC12，（对异丙基甲苯）（L"）RuC12或者(对异丙基甲苯）（L"'）RuC1 2; (b) 使(对异丙基甲苯）（L'）RuC12与L"或L"'反应，使(对异丙基甲苯）（L"）RuC12与L'或 1；''反应，或使(对异丙基甲苯）〇；''）1^1 2与1/或1；'反应，将第一中间体转化为第二中间体 〇/)〇；'）1?11(：12、〇/)〇；''）1?11(：1 2、或者〇；'）〇；''）1?11(：12; (c) 使（L'）（L"）RuC12与L"'反应，或使（L'）（L"'）RuC12与L" 反应，或者使 RuCl2与L'反应，将第二中间体转化为(L'）（L"）（L" '）Ru。22. -种进行电化学发光分析的方法，由以下步骤组成： (a) 使用权利要求1-20中任一项的电中性金属配合物标记生物分子，以形成具有以下 结构的被标记的生物复合物， {Mn+[L，L，，L，，，]n-}m-B(V)， (Mn^L1L2L3 JnIm-B (VI), {!Τ+α?5]11-}m-B(VII),或 {Mn+[ L1L42 JnIm-B (VIII) 其中，B是具有化学、生物化学或者生物活性的物质，优选选自半抗原、氨基酸、核酸、核 苷、核苷酸、蛋白质、适配子、抗体和抗原等； M选自过渡金属，优选是钌或者锇； η是电荷数，大于或者等于2; m是大于或者等于1的整数； L '，L"和L" '独立选自含氮杂环双齿配体，优选选自2，2 联吡啶，1，10-菲咯啉及其取 代的同系物，其中至少有一个配体通过可生物偶联的反应基团和B共价连接； L1是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2 联吡啶和带有取代基的1，10-菲咯啉，具 有至少一个通过生物偶联基团而与B形成的共价键； L2是含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2，2 联吡啶和取代的1，10-菲咯啉，其具有带 负电荷的取代基团，如-S03-、-0S03-、-Ρ03Η-、-0Ρ0 3Η-等，其负电荷总数等于η; L3是含氮杂环双齿配体，优选选自非反应性且不带电荷的2,2'_联吡啶，1，10-菲咯啉以 及它们的衍生物； L4或L5是不同的含氮杂环双齿配体，优选选自取代的2,2'_联吡啶和取代的1，10-菲咯 啉，其具有带负电荷的取代基团，如-S03_、-OSO3'-PO3H' -OPO3IT等，总的负电荷数为η/2; (b) 促使电中性金属配合物发光;并且， (c) 测定所发出的光，将被测物浓度与在一定时间段内发射的光强度或光子数相关联。23. 根据权利要求22所述的标记的生物复合物，其中M为钌。24. 根据权利要求22所述的标记的生物复合物，其中L'、L"和L"'为不同的基团。
【专利摘要】本发明涉及作为发光标记物的电中性金属配合物。该配合物的金属离子的正电荷被与含氮二亚胺配体(如2,2’-联吡啶，1,10-菲咯啉以及它们的衍生物)通过共价键相连的负电荷基团中和。在增强电化学激发条件下的发光强度的同时，电中性能降低金属配合物对被标记生物分子的生物和/或生物化学活性的影响。这些发光金属配合物标记分子可用于以发光信号为检测模式的生物分析方法(如电化学发光)的发展。
【IPC分类】G01N33/52, C09K11/07
【公开号】CN105492575
【申请号】CN201480045420
【发明人】周明, 余林颇
【申请人】联吡啶钌科学公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月18日
【公告号】US20160146826, WO2014203067A1
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