用于生产啤酒麦芽汁的方法
用于生产啤酒麦芽汁的方法
【专利说明】用于生产啤酒麦芽汁的方法
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及一种降低包含麦芽和辅料的酿造工艺中的粘度的方法。
[0004] 发明背景
[0005]酿造工艺是本领域中熟知的。它通常涉及麦芽制造、淀粉糖化(mashing)、醪液过 滤、麦芽汁煮沸和发酵/熟化的步骤。
[0006] 简言之，在麦芽制造过程中，允许谷物发芽并且然后进行干燥以及可任选地进行 烤制。麦芽制造过程引起谷物中多种酶的活化，这些酶可将谷物中的淀粉转化为糖。
[0007] 在淀粉糖化之前，将麦芽压碎以形成麦芽粉，将麦芽粉与水混合以形成醪液。麦芽 粉还可以包含一种或多种辅料。淀粉糖化是将醪液中的淀粉转化为可发酵的和不可发酵的 糖的过程。淀粉糖化过程通常在不同的温度下进行一段时间以活化负责降解蛋白质和碳水 化合物的内源酶。
[0008] 在淀粉糖化过程期间，可添加外源酶以加速反应并且使得可以更好地控制酿造工 艺。在淀粉糖化即将结束之际，温度可升至75°C_80°C。在淀粉糖化之后，在过滤步骤(如醪 液过滤或滤清）中，将所得液体从谷物中过滤出来。自该过滤步骤得到的液体被称为麦芽 汁。然后，将麦芽汁(其富含糖)与啤酒花一起煮沸，冷却，并且然后使用酵母发酵成乙醇。使 所得啤酒适应一周长至数月的时间，并且然后进行包装。
[0009] 存在于谷物中的重要非淀粉多糖是β-葡聚糖和阿糖基木聚糖。多种谷物的谷物胚 乳细胞壁典型地包括20 % -75 葡聚糖、20 % -75 %阿糖基木聚糖以及剩余5 %的蛋白质 与少量纤维素、葡甘露聚糖和酚酸。长链的阿糖基木聚糖以及在较低程度上葡聚糖（由于 酶水解而未被改性）当溶解于水中时可引起凝胶的形成，并且这些凝胶将大幅增加麦芽汁 粘度并且降低可滤性。
[0010] W0 97/42301描述了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(GH51和GH54)在用于制备麦芽汁的工 艺中的用途。
[0011]近来，原材料价格有了戏剧性的变动，这是由对谷物的需求增长、全球缺水、变化 的天气模式等引起的。这就迫使酿造工业聚焦于生产效率以及原材料节约。
[0012]在酿造中，对降低成本和/或提高生产效率的改进的过滤工艺存在着需要。
[0013] 附图
[0014] 图1示出了就用大麦和麦芽进行的高比重淀粉糖化中的粘度降低而言属于家族 GH51和GH43的阿拉伯呋喃糖苷酶的比较。左侧:剂量-反应曲线。右侧：以对照的百分比表示 的粘度降低。
[0015] 图2示出了就用小麦和麦芽进行的高比重淀粉糖化中的粘度降低而言属于家族 GH51和GH43的阿拉伯呋喃糖苷酶的比较。左侧:剂量-反应曲线。右侧：以对照的百分比表示 的粘度降低。
【发明内容】
[0016] 诸位发明人已经发现可以通过将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中来显著降 低酿造工艺的粘度，因此我们要求：
[0017] -种降低酿造工艺中的粘度的方法，该方法包括以下步骤：
[0018] (a)从麦芽和辅料制备醪液，并且
[0019] (b)将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中。
[0020] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该辅料选自下组，该组由以下各项组 成:大麦和小麦。
[0021] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种β-葡聚糖酶添加至醪液中。
[0022] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种木聚糖酶添加至醪液中。 [0023]在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少70 %的一致性。
[0024] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该醪液具有从2.0:1.0至3.0:1.0 (w/w) 的水/麦芽粉比。
[0025] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少 10% (w/w) 〇
[0026] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该淀粉糖化包括一个在从45°C到60°C 的范围内的温度下的孵育步骤。
[0027] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种蛋白酶添加至醪液中。
[0028] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种普鲁兰酶添加至醪液中。
[0029] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种脂肪酶添加至醪液中。
[0030] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种α-淀粉酶添加至醪液中。
[0031] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中将醪液过滤以得到麦芽汁。
[0032] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中将麦芽汁发酵以得到啤酒。
[0033]在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中以从0.5至10.0 mg酶蛋白/kg麦芽粉的 量添加该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43。
[0034]在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43具有针对双 取代的木糖的活性。
[0035]发明详细说明
[0036]
[0037] 贯穿本披露，使用了本领域的普通技术人员通常理解的不同术语。然而，若干术语 是以特别的含义使用，并且意为如通过以下所定义的。
[0038] 如在此使用的，将术语"麦芽粉"理解为作为啤酒生产的基础的含有淀粉或糖的材 料，例如大麦芽和辅料。通常，麦芽粉不含有任何添加水。
[0039]将术语"麦芽"理解为任何发芽的谷物，特别是大麦。
[0040]将术语"辅料"理解为麦芽粉的非大麦芽部分。辅料可以是任何富含淀粉的植物材 料，例如未发芽的谷物(例如但不限于大麦、玉米、水稻、高粱以及小麦）。辅料还包括易于发 酵的糖和/或糖浆。
[0041] -些辅料的淀粉具有相对较低的糊化温度，这使得它们能够与麦芽一起淀粉糖 化，而其他辅料(例如水稻、玉米和高粱)具有较高的糊化温度，此类辅料在将其添加至醪液 中之前典型地分开地煮熟并用α-淀粉酶液化。
[0042]将术语"醪液"理解为含有淀粉的浆液，浆液包括浸泡在水中以制造麦芽汁的压碎 的大麦芽、压碎的未发芽的谷物、其他含淀粉材料或其组合。
[0043]将术语"麦芽汁"理解为在淀粉糖化过程中提取麦芽粉后流出的未发酵液体。
[0044]将术语"酒糟"理解为当提取了麦芽粉并且分离了麦芽汁时剩下的脱水固体。
[0045] 在此将术语"啤酒"理解为发酵的麦芽汁，即一种从麦芽、辅料及啤酒花酿造的酒 精饮料。如在此使用的，术语"啤酒"旨在至少涵盖从醪液制备的啤酒，这些醪液制备自发芽 和未发芽的谷物的混合物。术语"啤酒"还涵盖用辅料制备的啤酒，以及具有所有可能酒精 度的啤酒。
[0046] 序列一致性:两个氨基酸序列之间的关联度通过参数"序列一致性"来描述。
[0047]出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传 学趋势(Trends in Genetics) 16: 276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔(Needle) 程序中所实施的尼德尔曼-翁施（此6(1161]^11-￥11118〇11)算法（尼德尔曼(此6(11611^11)和翁施 (Wunsch)，1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol. )48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间 的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项 获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
[0048](一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数）
[0049]根据本发明的麦芽汁生产
[0050]本发明涉及一种降低酿造工艺中的粘度的方法，该方法包括以下步骤：
[0051 ] (a)从麦芽和辅料制备醪液，并且
[0052] (b)将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中。
[0053]根据本发明，将该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中，由此降低了粘度，并且将 加快酿造工艺下游的任何过滤步骤。
[0054]麦芽优选源自于选自以下列表的谷物中的一种或多种，该列表由玉米、大麦、小 麦、黑麦、高粱、粟和水稻组成。优选地，麦芽是大麦芽。
[0055] 除了麦芽之外，根据本发明的麦芽粉还包括一种或多种辅料，例如未发芽的玉米， 或其他未发芽的谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、高粱(milo)、粟和/或高粱 (sorghum)，或未加工和/或精制的源自于植物的含有淀粉和/或糖的材料，这些植物是像小 麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、高粱(milo)、粟、高粱(sorghum)、马铃薯、甘薯、木薯、木薯淀粉、 西米、香蕉、甜菜和/或甘蔗。根据本发明，辅料可获得自块茎、根、茎、叶、豆荚、谷类和/或完 整谷物。
[0056] 根据本发明，选自由大麦和小麦组成的组的辅料是优选的。
[0057]形成醪液之前，麦芽和/或辅料优选被磨碎并且最优选是干磨或湿磨。
[0058]根据本发明，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少10% (w/w)，例如，该辅料是辅 料和麦芽的总重量的至少15% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少20% (w/ W)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少25% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总 重量的至少30% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少35% (w/w)，例如，该辅 料是辅料和麦芽的总重量的至少40% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少 45% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少50% (w/w)，例如，该辅料是辅料和 麦芽的总重量的至少55% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少60% (w/w)，例 如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少65% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量 的至少70% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少75% (w/w)，例如，该辅料是 辅料和麦芽的总重量的至少80% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少85% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少90% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽 的总重量的至少95% (w/w)。
[0059]根据本发明的一个方面，该醪液通过研磨（grounding)-种包括麦芽和辅料的麦 芽粉来获得。可以将添加至麦 芽粉的水预热，以便在醪液形成的时刻醪液便达到所希望的 醪液温度。
[0060] 本发明对于低水/麦芽粉比是尤其有用的，因此根据本发明，该醪液具有从2.0: 1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦芽粉比，例如，该醪液具有从2.1:1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦 芽粉比，例如，该醪液具有从2.2:1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦芽粉比，例如，该醪液具有从 2.3:1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦芽粉比，例如，该醪液具有从2.4:1.0至3.0:1.0(w/w)的 水/麦芽粉比，例如，该醪液具有从2.5:1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦芽粉比。
[0061] 淀粉糖化过程的温度特征曲线可以是来自常规的淀粉糖化过程的特征曲线，其中 设置温度以达到由麦芽酶最佳降解麦芽粉干物质。
[0062] 淀粉糖化过程通常应用温度的受控分步增加，其中每个步骤都偏好一个酶促作用 超过另一个。淀粉糖化温度特征曲线在本领域通常是已知的。在本发明的一个方面中，该淀 粉糖化包括至少一个在从45°C到60°C的范围内的温度下的孵育步骤，其中该阿拉伯呋喃糖 苷酶GH43是有活性的。
[0063]根据本发明有用的淀粉糖化温度特征曲线的一个实例是52°C(20min);64°C (40min) ;72°C(20min) ;78°C(5min);其中已经使用了l°C/min的加热速率。
[0064] 在一个方面中，该醪液的pH在约4.6至约6.4的范围内。在另一个方面中，该pH在约 4.6至6.2的范围内，如在pH约4.8至约6.0之间的范围内，优选在pH约5.0至约6.0之间的范 围内，更优选在pH约5.0至约5.6之间的范围内，甚至更优选在pH约5.0至约5.4之间的范围 内。
[0065] 从醪液得到麦芽汁典型地包括将麦芽汁从酒糟中过滤出来。可以使热水穿过酒糟 以清洗或喷洒任何剩余的来自麦芽粉的提取物。
[0066] 在从麦芽粉的酒糟中分离出麦芽汁之后，可以将麦芽汁照原样使用，或它可以被 脱水以提供浓缩和/或干燥的麦芽汁。可以将浓缩的和/或干燥的麦芽汁用作酿造提取物、 用作麦芽提取物调味品、用于非酒精麦芽饮料、麦芽醋、早餐谷物食品、用于糖果等。
[0067] 在一个优选实施例中，将麦芽汁发酵以生产酒精饮料，优选啤酒，例如爱尔啤酒 (ale)、烈性爱尔啤酒、苦啤酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒 (lager)、出口啤酒、麦芽酒(malt liquor)、大麦酒、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低 醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。麦芽汁的发酵可包括以包含新鲜酵母，即先前未曾用于本 发明的酵母或其可为回收的酵母的酵母浆投入麦芽汁。应用的酵母可以为适于碑酒酿造的 任何酵母，尤其是选自酵母属的酵母，例如酿酒酵母和葡萄汁酵母，包括这些有机体的天然 或人工产生的变体。用于生产啤酒的麦芽汁的发酵方法是本领域的普通技术人员熟知的。
[0068] 座
[0069] 在一个方面中，该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43是在淀粉糖化开始时引入的。在另一个 方面中，该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43是在淀粉糖化过程中引入的。
[0070] 在一个方面中，本发明包括将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种β-葡聚糖酶二者 添加至醪液中；特别是将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种β-葡聚糖酶GH5添加至醪液中； 优选将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种β-葡聚糖酶GH5_5添加至醪液中。
[0071] 在一个方面中，本发明包括将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种木聚糖酶二者添 加至醪液中；特别是将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种木聚糖酶GH10添加至醪液中。 [0072] 在一个方面中，本发明包括将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43、一种β-葡聚糖酶和一 种木聚糖酶添加至醪液中。
[0073] 在一个方面中，本发明包括添加一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43、一种β-葡聚糖酶GH5 和一种木聚糖酶GH10,特别是一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43、一种β-葡聚糖酶GH5_5和一种木 聚糖酶GH10。
[0074] 在另一个优选的实施例中，将一种或多种另外的酶添加至醪液中，所述一种或多 种酶包括但不限于蛋白酶、普鲁兰酶、脂肪酶以及淀粉酶。
[0075] 有待在本发明中应用的酶应根据它们在本发明的工艺的加工温度下保留足够的 活性的能力，以及它们在醪液的中等酸度pH下保留足够的活性的能力进行选择，并应以有 效量添加。这些酶可源自于任何来源，优选源自于植物或藻类，并且更优选源自于微生物， 如源自于细菌或真菌。
[0076] 阿拉伯呋喃糖苷酶GH43
[0077]在本披露中应用的糖苷水解酶家族的编号遵循科蒂尼奥(Coutinho)，P.M.&亨利 Henris sat) ,Β. (1999)iS：URL：http: //afmb. cnrs-mrs . fr/~cazy/CAZY/index.html 的CAZy-碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)服务器，或可替代地，科蒂尼 奥，P. M. &亨利萨特，B. 1999;纤维素酶及其他碳水化合物活性酶的模块化结构:综合数据库 方法（The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach)，于"纤维素降解的遗传学、生物化学以及生 态学（Genetics，Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation)''中，K·大宫 (Ohmiya)、Κ·林(Hayashi)、Κ·萨卡（Sakka)、Υ·小林(Kobayashi)、S. XU田（Karita)和T ·木村 (Kimura)编辑，大学出版社有限公司（Uni Publishers Co.)，东京，第15-23页，以及伯恩 (Bourne)，Y.&亨利萨特，B. 2001;糖苷水解酶和糖基转移酶:家族和官能分子(Glycoside hydrolases and glycosyltransferases:families and functional modules)，结构生物 学新见（Current Opinion in Structural Biology) 11:593-600的概念。
[0078]在一个优选实施例中，阿拉伯呋喃糖苷酶GH43(或也被称为GH43的α-L-阿拉伯呋 喃糖苷酶)具有针对双取代的木糖的活性。
[0079]该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43可以是微生物来源的，例如可源自于丝状真菌菌株(例 如，腐质霉属、曲霉属、木霉属、镰孢属、青霉属)或源自于细菌(例如，芽孢杆菌属、双歧杆菌 属)。
[0080]优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43源自于特异腐质霉。最优选地，该阿拉伯呋喃糖 苷酶GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少70%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷 酶GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少75%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少8 0 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少85%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少9 0 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少91 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少92%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少93%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少9 4 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少95%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少9 6 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少97%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少9 8 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID Ν 0:1中所示的序列具有至少9 9 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID Ν0:1中所示的序列具有100%的一致性。
[0081 ] 该阿拉伯咲喃糖苷酶GH43还可源自于青春双岐杆菌（Bifidobacterium adolescenti)。更优选地，该阿拉伯咲喃糖苷酶GH43是由凡莱尔(Van Laere)1997年描述于 应用微生物学与生物技术(Appl .Microbiol .Biotechnol)，47,231-235中和/或由范登布罗 克(Van den Broek)2005年描述于应用微生物学与生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology)中的酶。
[0082]可以按0 · 5-20mg酶蛋白/kg麦芽粉;优选0 · 5-15mg酶蛋白/kg麦芽粉;并且甚至更 优选0.5-10mg酶蛋白/kg麦芽粉的量添加该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43。
[0083] 阿拉伯呋喃糖苷酶GH51
[0084]阿拉伯呋喃糖苷酶GH51(或也被称为GH51的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶）具有针对单 取代的木糖的活性。它可以是微生物来源的，例如可源自于丝状真菌菌株(例如，亚灰树花 菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、木霉属、镰孢属、青霉属)或源自于细菌(例如芽孢杆 菌属）。
[0085] 优选地，该酶是一种源自于大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)的GH51的阿 拉伯呋喃糖苷酶。最优选地，该GH51的阿拉伯呋喃糖苷酶是如SEQ ID N0:2所示的多肽。 [0086] 葡聚糖酶
[0087] 在一个另外的实施例中，将一种β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4.)添加至醪液中。β-葡聚 糖酶也被称为纤维素酶并且可以是真菌来源的，如来自曲霉属(例如，米曲霉或黑曲霉），或 者来自细菌如芽孢杆菌属(例如，枯草芽孢杆菌）。
[0088] 具体而言，该β_葡聚糖酶可源自于嗜热子嚢菌属(Thermoascus)，特别是源自于金 黄色嗜热子囊菌。最优选地，该β-葡聚糖酶是一种GH5葡聚糖酶;特别是一种GH5_5葡聚糖 酶。
[0089] 木聚糖酶
[0090] 在一个另外的实施例中，将一种木聚糖酶添加至醪液中。在一个方面中，木聚糖酶 活性由一种来自糖基水解酶家族10... 的木聚糖酶提供。在一个方面中，该木聚糖酶与W0 94/ 21785中所述的木聚糖酶具有至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少 80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91 %，更优选至少92%，更优选至少 93%，更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选至少 98%，并且最优选至少99%或甚至100%的一致性。在另一个方面中，该木聚糖酶是来自诺 维信公司（Novozymes A/S)的Shearzyme?。
[0091] 在一个优选实施例中，该木聚糖酶源自于棘孢曲霉，尤其是来自棘孢曲霉的家族 GH10木聚糖酶。
[0092] 蛋白酶
[0093] 在一个另外的实施例中，将一种蛋白酶添加至醪液中。适合的蛋白酶包括微生物 蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下 水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。这些蛋白酶负责使醪液中的全长的高分子量蛋白成为低 分子量蛋白。低分子量蛋白对于酵母营养是必要的，并且高分子量蛋白确保泡沫稳定性。因 此，本领域的技术人员熟知，蛋白酶应以平衡的量添加，同时允许针对该酵母的充足的游离 氨基酸，并且留下足够的高分子量蛋白以稳定泡沫。在一个方面中，蛋白酶活性由蛋白水解 酶系统提供，该蛋白水解酶系统具有适合的FAN产生活性，包括内切-蛋白酶、外肽酶或其任 何组合，优选金属蛋白酶。优选地，该蛋白酶与W0 99/67370中所述的SEQ ID N0:6中所示的 氨基酸序列具有至少50 %，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，更优选至 少85 %，更优选至少90%，更优选至少91 %，更优选至少92%，更优选至少93 %，更优选至少 94%，更优选至少95 %，更优选至少96%，更优选至少97 %，更优选至少98%，并且最优选至 少99 %或甚至100 %的一致性。在另一个方面中，该蛋白酶是可从诺维信公司获得的 Neutrase?〇
[0094] 普鲁兰酶
[0095] 在一个另外的实施例中，将一种普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)添加至醪液中。普鲁兰酶 催化普鲁兰、支链淀粉和糖原中，以及支链淀粉和糖原的α-和β-极限糊精中的（l->6)-a-D-糖苷键的水解。
[0096] 根据本发明的普鲁兰酶优选是来自例如火球菌属或芽孢杆菌属(例如嗜酸性普鲁 兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus))的普鲁兰酶，例如描述于凯利(Kelly)等人， 1994,欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMS Microbiol.Letters) 115:97-106中的普 鲁兰酶;或可从诺维信公司获得的普鲁兰酶，如Promozyme 400L。该普鲁兰酶还可以来自长 野芽抱杆菌（Bacillus naganoencis)或脱支芽抱杆菌（Bacillus deramificans)，例如像 源自于脱支芽孢杆菌(美国专利5,736,375)。
[0097]最优选地，该普鲁兰酶源自于嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌。一种优选的普鲁兰酶是一 种具有如下氨基酸序列的普鲁兰酶，该氨基酸序列与W0 2009/075682中披露的普鲁兰酶3 的序列是至少50%，例如至少55%，例如至少60%，例如至少65%，例如至少66%，例如至少 70%，例如至少75%，例如至少80 %，例如至少85%，例如至少86 %，例如至少87%，例如至 少88%，例如至少89%，例如至少90%，例如至少91 %，例如至少92%，例如至少93%，例如 至少94%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%或甚 至100 % -致的。
[0098] 脂肪酶
[0099] 在一个另外的实施例中，将一种脂肪酶(EC 3.2.1.41)添加至醪液中。在一个实施 例中，脂肪酶活性由一种对甘油三酯和/或半乳糖脂和/或磷脂具有活性的脂肪酶提供。优 选地，脂肪酶活性由一种来自镰孢属（包括尖孢镰孢（F.oxysporum)和异孢镰孢 (F.heterosporum))、曲霉属(包括塔宾曲霉(A. tubigensis))、根霉属(包括米根霉)或嗜热 丝孢菌属(Thermomyces)(包括疏棉状嗜热丝孢菌(T. lanuginosus))的脂肪酶，或这些脂肪 酶的变体提供。一个实例是Lipopan X(Lipopan Xtra)，一种具有取代G91A+D96W+E99K+ P256V+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)的疏棉状 嗜热丝孢菌脂肪酶的变体，描述于W0 2004099400A2中。在另一个方面中，该脂肪酶是一种 来自尖孢镰孢的脂肪酶/磷脂酶，描述于EP 869167中，可从诺维信公司获得，如Lipopan? F。在本发明的一个优选实施例中，该脂肪酶是LipozymeTL/'或Lipolase1';这种脂肪酶对 过滤速度和雾度减少具有显著地良好作用，并且可从丹麦诺维信公司获得。该脂肪酶还可 以是Lipex?，Lip〇Zyme的一种变体，可从丹麦诺维信公司获得。脂肪酶将来自大麦的脂质 (例如甘油三酯)降解为偏甘油酯和游离脂肪酸。这导致较低的浊度和大大改进的醪液过滤 及滤清特性。
[0100] α-淀粉酶
[0101] 在一个另外的实施例中，将一种α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)添加至醪液中。有待在本 发明的工艺和/或组合物中使用的一种具体的淀粉酶可为芽孢杆菌属α_淀粉酶。熟知的 芽孢杆菌属淀粉酶包括源自于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的菌 株的α_淀粉酶。在本发明的一个方面中，有用的芽孢杆菌属α_淀粉酶是如在W0 99/19467第 3页第18行至第6页第27行中定义的α-淀粉酶。优选地，该α-淀粉酶与W0 99/19467中披露为 SEQ ID Ν0:3的氨基酸序列中所示的氨基酸序列（具有突变：I181*+G182*+N193F)具有至少 50%，更优选至少60 %，更优选至少70 %，更优选至少80 %，优选至少85 %，更优选至少 90%，优选至少91 %，优选至少92%，优选至少93%，优选至少94%，更优选至少95%，优选 至少96 %，优选至少97 %，更优选至少98 %，并且最优选至少99 %的一致性。还考虑了来自 诺维信公司的α-淀粉酶Termamyl? SC。有待用于本发明的工艺中的另一种α-淀粉酶可以是 任何真菌α-淀粉酶，例如源自于曲霉属内一个物种，并且优选源自于黑曲霉的菌株的α-淀 粉酶。
[0102] 在下列实例中进一步阐明本发明，这些实例并不旨在以任何方式限制所要求保护 的本发明的范围。
[0103] 实例 1
[0104] 当被添加至包含大麦芽和大麦的醪液中时，属于家族GH43与家族GH51的阿拉伯呋 喃糖苷酶(AraF)降低麦芽汁粘度的能力的比较
[0105] 按以下方式制备麦芽汁：
[0106] 将48.0g磨碎的大麦芽(0.2mm)和32.0g大麦与 197ml H20(54°C)和3.0ml CaC12溶 液（ll.Og CaCl2*2H20/500ml H20) -起添加至淀粉糖化烧杯中。
[0107] 分别按2.5、5以及10mg Ep/kg麦芽粉的剂量，在淀粉糖化(52°C)开始时单独地添 加属于家族GH43(SEQ ID N0:1)和GH51(SEQ ID N0:2)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0108] 使用了以下淀粉糖化特征曲线：52°C(20min)，64°C(40min)，72°C(20min)，78°C (5min)，冷却至20°C。淀粉糖化静止之间的加热速率是1 °C/min。
[0109] 在淀粉糖化之后，通过添加水对蒸发损失进行校正，目标是280g的最终重量。通过 置于塑料漏斗中的纸过滤器(瓦特曼(Whatman)5971/2)过滤醪液。在20°C下，分析滤液(麦 芽汁）的密度(啤酒分析仪(Beeranalyzer)，安东帕公司(Anton Paar)，格拉茨(Graz)，奥地 利）以及动态粘度（微量粘度计，安东帕公司，格拉茨，奥地利）。使用描述于 Mitteleuropdische Brautechnische Analysenkommission(MEBAK) "原材料（Raw Material)"（2011)，第3.1.4.4章中的双曲线函数将动态粘度n = f (密度)标准化至24.2°P 的水平。
[0110] 图1示出了就用大麦和麦芽进行的高比重淀粉糖化中的粘度降低而言属于家族 GH51和GH43的阿拉伯呋喃糖苷酶的比较。左侧:剂量-反应曲线；右侧：以对照的百分比表示 的粘度降低。该图显示在2.5mg酶蛋白/kg麦芽粉的酶水平下，当使用AraF GH51时，粘度降 低是2.1%，而当使用4瓜？6財3时，粘度降低是7.7%。这显示4抑？6财3在高比重淀粉糖化 方面出乎意料地好。
[0111] 实例2
[0112] 当被添加至包含大麦芽和小麦的醪液中时，属于家族GH43与家族GH51的阿拉伯呋 喃糖苷酶(AraF)降低麦芽汁粘度的能力的比较
[0113] 按以下方式制备麦芽汁：
[0114] 将48.0g磨碎的大麦芽(0.2mm)和32.0g小麦与 197ml H20(54°C)和3.0ml CaC12溶 液（ll.Og CaCl2*2H20/500ml H20) -起添加至淀粉糖化烧杯中。
[0115] 分别按2.5、5以及10mg Ep/kg麦芽粉的剂量，在淀粉糖化(52°C)开始时单独地添 加属于家族GH43(SEQ ID N0:1)和GH51(SEQ ID N0:2)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0116] 使用了以下淀粉糖化特征曲线：52°C(20min)，64°C(40min)，72°C(20min)，78°C (5min)，冷却至20°C。淀粉糖化静止之间的加热速率是1 °C/min。
[0117]在淀粉糖化之后，通过添加水对蒸发损失进行校正，目标是280g的最终重量。通过 置于塑料漏斗中的纸过滤器(瓦特曼597V2)过滤醪液。在20°C下，分析滤液(麦芽汁）的密度 (啤酒分析仪，安东帕公司，格拉茨，奥地利）以及动态粘度(微量粘度计，安东帕公司，格拉 茨，奥地利）。使用描述于 Mitteleuropiiische Brautechni sche Analysenkommission (MEBAK) "原材料(Raw Material)"（2011)，第3.1.4.4章中的双曲线函数将动态粘度n = f (密度)标准化至24 · 2° P的水平。
[0118] 图2示出了就用小麦和麦芽进行的高比重淀粉糖化中的粘度降低而言属于家族 GH51和GH43的阿拉伯呋喃糖苷酶的比较。左侧:剂量-反应曲线；右侧：以对照的百分比表示 的粘度降低。该图显示在2.5mg酶蛋白/kg麦芽粉的酶水平下，当使用AraF GH51时，粘度降 低是1.7%，而当使用AraF GH43时，粘度降低是11.3%。这显示AraF GH43在高比重淀粉糖 化方面出乎意料地好。
[0119] 实例3
[0120] 来自特异腐质霉的阿拉伯呋喃糖苷酶家族GH43(SEQ ID NO: 1)应用于淀粉糖化对 后续醪液过滤的影响
[0121] 材料和方法
[0122] 使用配备有0.2mm筛网的锤磨机磨碎未发芽大麦（184g)和比尔森(Pilsner)麦芽 (276g)。将氯化钙添加至脱盐水中以实现60ppm Ca2+-离子的最终浓度。在将水加热至51°C 后，添加麦芽粉(室温）。当达到50°C的醪液温度时，根据表2添加酶，并且开始淀粉糖化程序 读1)。
[0123] 在淀粉糖化之后，针对蒸发损失调节热醪液的重量并将其立即转移至夹套加热 (78°C)的过滤单元类型的KHS EW14/2CW中，其配备有标准聚丙烯醪液滤布以及用于施用气 压的连接件。允许醪液沉降4分钟。然后，对过滤器加压(40kPa过压），并且再过一分钟后，通 过打开过滤器的底阀开始过滤。每2秒自动监测滤液的重量，直至达到1050g的总质量。为了 评价过滤性能，应用了范登布施(Vandenbusche)等人（酿酒和饮料工业国际版(Brewing and Beverage Industry International)(3)，2004,第14-18页）所描述的修改方法。简言 之，通过时间/质量对质量作图进行监测数据的线性化。将200-1000g之间的线性化数据的 斜率用于计算滤过系数(Fk-值）。将Fk-值定义为Fk = n*a*c/p (η =动态粘度;a =滤饼的比 阻力;c =不可溶颗粒的浓度;P =压力）。低的Fk-值指示良好的过滤。
[0124] 除Fk-值之外，用于过滤性能评价的第二、更简单的参数直至收集1000g的滤液的 时间被用于图解说明。
[0125] 分析滤液(麦芽汁）的粘度、提取物密度、β-葡聚糖(>10000kDa)和阿糖基木聚糖的 含量。
[0126] 表1:应用于该实验中的淀粉糖化方案
[0127]
[0128]
[0129] 表2:被测试酶的过滤性能的比较以及所得滤液的分析数据。在所有的试验中，按 36KNU-S/kg麦芽粉和0.16AU-N/kg麦芽粉的剂量水平使用Termamyl SC和Neutrase 0.8L， 分别为了补偿由麦芽提供的降低的内源酶活性(―使用40%未发芽大麦）ΑΧυ =真菌木聚 糖酶活性单位，EGU =内切葡聚糖酶活性单位，KNU-S = a-淀粉酶活性单位，AU-N =蛋白酶活 性单位
[0130]
[0131] 结果
[0132] 醪液从40 %大麦和60 %麦芽产生，并且水/麦芽粉比为2.5 :1。在淀粉糖化开始时 按两种剂量水平（50FXU =真菌木聚糖酶活性单位+140EGU=内切葡聚糖酶活性单位，和 100FXU+280EGU，基于总麦芽粉）添加 premium酶共混物Ultraflo Max?，该共混物在工业中 用于改善醪液分离，其包含内切木聚糖酶以及纤维二糖水解酶、内切-和外切-β_葡聚糖酶 活性的混合物。将这些的醪液-过滤性能与以相同方式生产的醪液进行比较，但是不同的是 添加的酶共混物包含来自棘孢曲霉的内切-1，4-β-木聚糖酶家族GH10、来自金黄色嗜热子 囊菌的内切葡聚糖酶家族GH5_5和第三酶，即来自特异腐质霉的阿拉伯呋喃糖苷酶家族 GH43(SEQ ID Ν0:1)〇
[0133] 表2证明在淀粉糖化中使用后一组合将甜麦芽汁的过滤时间分别减少至约63% (当与低剂量U1 traf 1 〇 Max相比时）和约72 % (当与高剂量U1 traf 1 〇 Max相比时）。较好的过 滤反映为较低的滤液粘度，分别降低至约89% (当与低剂量Ultraflo Max相比时）和92% (当与高剂量Ultraflo Max相比时）。
[0134] 可以将粘度的降低归因于高分子阿糖基木聚糖的较好降解，当将来自特异腐质霉 的阿拉伯呋喃糖苷酶家族GH43(SEQ ID N0:1)与来自棘孢曲霉的内切-1，4-β-木聚糖酶家 族GH10结合使用而非单独使用内切-1，4-β-木聚糖酶时，粘度降低了约53 %。
[0135] 实例4
[0136] 来自特异腐质霉的阿拉伯呋喃糖苷酶家族GH43应用于淀粉糖化对啤酒过滤的影 疸
[0137] 材料和方法
[0138] 使用间隙距离为0.2mm的盘磨机磨碎未发芽大麦(64g)和比尔森麦芽(96g)。将氯 化钙添加至脱盐水中以实现60ppm Ca2+-离子的最终浓度。在将水加热至51°C后，添加麦芽 粉(室温）。当达到50°C的醪液温度时，根据表4添加酶，并且开始淀粉糖化程序(表3)。在淀 粉糖化中水/麦芽粉比为2.5:1。在淀粉糖化之后，针对蒸发损失调节热醪液的重量至600g， 并且立即通过马歇雷-纳格尔(Macherey-Nagel)514V4滤纸过滤。
[0139] 分析甜麦芽汁的密度并使用含有60ppm Ca2+_离子的高压釜处理的脱盐水稀释至 14° Plato。将稀释的麦芽汁加热至沸腾温度并且添加0. 145g啤酒花（传统哈拉道 (Hallertauer 1'抑虹丨丨〇11)，2012，17%€[酸）/45(^麦芽汁。将麦芽汁煮沸40分钟，并且在煮 沸后，通过添加高压釜处理的水补偿蒸发损失。将过夜增殖的酵母菌株W34/70以2*10 7个细 胞/mL麦芽汁的浓度添加。在12°C下进行7天发酵，随后在冰上储存5天。然后，将啤酒脱气并 在2°C下，在2000rpm下离心，并且将上清液通过瓦特曼597 1/2滤纸预过滤，以便去除剩余的 酵母细胞。然后，将50mL预过滤的啤酒填入XK26柱（通用电气医疗集团（GE-Healthcare)) 中，该柱被回火至0°C并且配备有0.45μπι醋酸纤维素过滤器。在达到温度平衡以后，将50kPa 压力(N2)施加在该柱上。每1秒自动监测随时间推移过滤的啤酒的质量。可将所应用的过滤 类型描述为表面过滤，意味着随过滤时间推移，流速由于过滤阻力增加而降低。评价在淀粉 糖化中添加的单独的酶对啤酒过滤的影响(性能）的第一步是基于监测数据计算初始流速。 通过从达到流速是初始流速一半时监测到的数据中提取滤液质量和过滤时间而得到用于 指示啤酒过滤性能的参数。在过滤前后，分析啤酒的β-葡聚糖、阿糖基木聚糖的含量以及粘 度(在0°C下）。
[0140] 表3:应用于该实验中的淀粉糖化方案
[0141]
'[0142]~表4:被测试酶的啤酒过滤性能的It较以及所得非滤液和滤液的分析数据。在所有1 的试验中，按36KNU-S/kg麦芽粉和0，16AU-N/kg麦芽粉的剂量水平使用Termamyl SC和 Neutrase 0.8L，分别为了补偿由麦芽提供的降低的内源酶活性(―使用40%未发芽大麦）。 FXU =真菌木聚糖酶活性单位，EGU=内切葡聚糖酶活性单位，KNU-S = a-淀
[0143] 粉酶活性单位，AU_N=蛋白酶活性单位。
[0144]
[0145] 结果
[0146]啤酒从40%大麦和60%麦芽产生，其中原始比重为14°Plato。在淀粉糖化开始时 按工业上通常应用的剂量上限（l〇〇FXU =真菌木聚糖酶活性单位+280EGU=内切葡聚糖酶 活性单位，基于总麦芽粉)给予premium酶共混物Ultraflo Ma以作为挑战性基准，该共混物 在工业中用于改善醪液和啤酒分离，其包含内切木聚糖酶以及纤维二糖水解酶、内切-和外 切-β-葡聚糖酶活性的混合物。将过滤性能与以相同方式生产的啤酒进行比较，但是不同的 是添加的酶共混物包含来自棘孢曲霉的内切-1，4-β-木聚糖酶家族GH10、来自金黄色嗜热 子囊菌的内切葡聚糖酶家族GH5_5和第三酶，即来自特异腐质霉的阿拉伯呋喃糖苷酶家族 GH43(AraFGH43)。表2证明在淀粉糖化中使用后一组合将啤酒过滤改进了约17 % (基于到初 始流速降至1/2*初始流速为止的时间之后收集的滤液的质量)或约14% (基于到初始流速 降至1/2*初始流速为止的时间长度）。较好的过滤来源于使得初始流动更快的较低粘度以 及即较低的总半纤维素含量(β_葡聚糖+阿糖基木聚糖的总和），其降低了膜滤器的饱和度 (计时），即滤液残余物/质量单位滤液(膜的饱和度在约63-82mg半纤维素的范围内）。
【主权项】
1. 一种降低酿造工艺中的粘度的方法，该方法包括以下步骤： (a) 从麦芽和辅料制备醪液，并且 (b) 将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至该醪液中。2. 根据权利要求1所述的方法，其中该辅料选自下组，该组由以下各项组成:大麦和小 麦。3. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种β_葡聚糖酶添加至该醪液 中。4. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种木聚糖酶添加至该醪液 中。5. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶与SEQIDNO: 1 中所示的序列具有至少70%的一致性。6. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该醪液具有2.0:1.0至3.0:1.0(w/w) 的水/麦芽粉比。7. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少 10% (w/w) 〇8. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该淀粉糖化包括一个在从45°C到60°C 的范围内的温度下的孵育步骤。9. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种蛋白酶添加至该醪液中。10. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种普鲁兰酶添加至该醪液 中。11. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种脂肪酶添加至该醪液中。12. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种α_淀粉酶添加至该醪液 中。13. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中将该醪液过滤以得到麦芽汁。14. 根据权利要求13所述的方法，其中将该麦芽汁发酵以得到啤酒。15. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中以从0.5至10.Omg酶蛋白/kg麦芽粉 的量添加该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43。16. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43具有针对 双取代的木糖的活性。
【专利摘要】一种降低酿造工艺中的粘度的方法，该方法包括以下步骤：(a)从麦芽和辅料制备醪液，并且(b)将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中。
【IPC分类】C12C5/00, C12C7/047
【公开号】CN105492590
【申请号】CN201480048137
【发明人】A·毛赫, N·埃尔维基, J·埃克洛夫, K·B·R·M·克罗
【申请人】诺维信公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月4日
【公告号】EP3041923A1, WO2015032850A1
【专利说明】用于生产啤酒麦芽汁的方法
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及一种降低包含麦芽和辅料的酿造工艺中的粘度的方法。
[0004] 发明背景
[0005]酿造工艺是本领域中熟知的。它通常涉及麦芽制造、淀粉糖化(mashing)、醪液过 滤、麦芽汁煮沸和发酵/熟化的步骤。
[0006] 简言之，在麦芽制造过程中，允许谷物发芽并且然后进行干燥以及可任选地进行 烤制。麦芽制造过程引起谷物中多种酶的活化，这些酶可将谷物中的淀粉转化为糖。
[0007] 在淀粉糖化之前，将麦芽压碎以形成麦芽粉，将麦芽粉与水混合以形成醪液。麦芽 粉还可以包含一种或多种辅料。淀粉糖化是将醪液中的淀粉转化为可发酵的和不可发酵的 糖的过程。淀粉糖化过程通常在不同的温度下进行一段时间以活化负责降解蛋白质和碳水 化合物的内源酶。
[0008] 在淀粉糖化过程期间，可添加外源酶以加速反应并且使得可以更好地控制酿造工 艺。在淀粉糖化即将结束之际，温度可升至75°C_80°C。在淀粉糖化之后，在过滤步骤(如醪 液过滤或滤清）中，将所得液体从谷物中过滤出来。自该过滤步骤得到的液体被称为麦芽 汁。然后，将麦芽汁(其富含糖)与啤酒花一起煮沸，冷却，并且然后使用酵母发酵成乙醇。使 所得啤酒适应一周长至数月的时间，并且然后进行包装。
[0009] 存在于谷物中的重要非淀粉多糖是β-葡聚糖和阿糖基木聚糖。多种谷物的谷物胚 乳细胞壁典型地包括20 % -75 葡聚糖、20 % -75 %阿糖基木聚糖以及剩余5 %的蛋白质 与少量纤维素、葡甘露聚糖和酚酸。长链的阿糖基木聚糖以及在较低程度上葡聚糖（由于 酶水解而未被改性）当溶解于水中时可引起凝胶的形成，并且这些凝胶将大幅增加麦芽汁 粘度并且降低可滤性。
[0010] W0 97/42301描述了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(GH51和GH54)在用于制备麦芽汁的工 艺中的用途。
[0011]近来，原材料价格有了戏剧性的变动，这是由对谷物的需求增长、全球缺水、变化 的天气模式等引起的。这就迫使酿造工业聚焦于生产效率以及原材料节约。
[0012]在酿造中，对降低成本和/或提高生产效率的改进的过滤工艺存在着需要。
[0013] 附图
[0014] 图1示出了就用大麦和麦芽进行的高比重淀粉糖化中的粘度降低而言属于家族 GH51和GH43的阿拉伯呋喃糖苷酶的比较。左侧:剂量-反应曲线。右侧：以对照的百分比表示 的粘度降低。
[0015] 图2示出了就用小麦和麦芽进行的高比重淀粉糖化中的粘度降低而言属于家族 GH51和GH43的阿拉伯呋喃糖苷酶的比较。左侧:剂量-反应曲线。右侧：以对照的百分比表示 的粘度降低。
【发明内容】
[0016] 诸位发明人已经发现可以通过将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中来显著降 低酿造工艺的粘度，因此我们要求：
[0017] -种降低酿造工艺中的粘度的方法，该方法包括以下步骤：
[0018] (a)从麦芽和辅料制备醪液，并且
[0019] (b)将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中。
[0020] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该辅料选自下组，该组由以下各项组 成:大麦和小麦。
[0021] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种β-葡聚糖酶添加至醪液中。
[0022] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种木聚糖酶添加至醪液中。 [0023]在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少70 %的一致性。
[0024] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该醪液具有从2.0:1.0至3.0:1.0 (w/w) 的水/麦芽粉比。
[0025] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少 10% (w/w) 〇
[0026] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该淀粉糖化包括一个在从45°C到60°C 的范围内的温度下的孵育步骤。
[0027] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种蛋白酶添加至醪液中。
[0028] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种普鲁兰酶添加至醪液中。
[0029] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种脂肪酶添加至醪液中。
[0030] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中另外将一种α-淀粉酶添加至醪液中。
[0031] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中将醪液过滤以得到麦芽汁。
[0032] 在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中将麦芽汁发酵以得到啤酒。
[0033]在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中以从0.5至10.0 mg酶蛋白/kg麦芽粉的 量添加该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43。
[0034]在一个方面中，本发明涉及一种方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43具有针对双 取代的木糖的活性。
[0035]发明详细说明
[0036]
[0037] 贯穿本披露，使用了本领域的普通技术人员通常理解的不同术语。然而，若干术语 是以特别的含义使用，并且意为如通过以下所定义的。
[0038] 如在此使用的，将术语"麦芽粉"理解为作为啤酒生产的基础的含有淀粉或糖的材 料，例如大麦芽和辅料。通常，麦芽粉不含有任何添加水。
[0039]将术语"麦芽"理解为任何发芽的谷物，特别是大麦。
[0040]将术语"辅料"理解为麦芽粉的非大麦芽部分。辅料可以是任何富含淀粉的植物材 料，例如未发芽的谷物(例如但不限于大麦、玉米、水稻、高粱以及小麦）。辅料还包括易于发 酵的糖和/或糖浆。
[0041] -些辅料的淀粉具有相对较低的糊化温度，这使得它们能够与麦芽一起淀粉糖 化，而其他辅料(例如水稻、玉米和高粱)具有较高的糊化温度，此类辅料在将其添加至醪液 中之前典型地分开地煮熟并用α-淀粉酶液化。
[0042]将术语"醪液"理解为含有淀粉的浆液，浆液包括浸泡在水中以制造麦芽汁的压碎 的大麦芽、压碎的未发芽的谷物、其他含淀粉材料或其组合。
[0043]将术语"麦芽汁"理解为在淀粉糖化过程中提取麦芽粉后流出的未发酵液体。
[0044]将术语"酒糟"理解为当提取了麦芽粉并且分离了麦芽汁时剩下的脱水固体。
[0045] 在此将术语"啤酒"理解为发酵的麦芽汁，即一种从麦芽、辅料及啤酒花酿造的酒 精饮料。如在此使用的，术语"啤酒"旨在至少涵盖从醪液制备的啤酒，这些醪液制备自发芽 和未发芽的谷物的混合物。术语"啤酒"还涵盖用辅料制备的啤酒，以及具有所有可能酒精 度的啤酒。
[0046] 序列一致性:两个氨基酸序列之间的关联度通过参数"序列一致性"来描述。
[0047]出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件 (The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传 学趋势(Trends in Genetics) 16: 276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔(Needle) 程序中所实施的尼德尔曼-翁施（此6(1161]^11-￥11118〇11)算法（尼德尔曼(此6(11611^11)和翁施 (Wunsch)，1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol. )48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间 的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，和EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项 获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
[0048](一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数）
[0049]根据本发明的麦芽汁生产
[0050]本发明涉及一种降低酿造工艺中的粘度的方法，该方法包括以下步骤：
[0051 ] (a)从麦芽和辅料制备醪液，并且
[0052] (b)将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中。
[0053]根据本发明，将该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中，由此降低了粘度，并且将 加快酿造工艺下游的任何过滤步骤。
[0054]麦芽优选源自于选自以下列表的谷物中的一种或多种，该列表由玉米、大麦、小 麦、黑麦、高粱、粟和水稻组成。优选地，麦芽是大麦芽。
[0055] 除了麦芽之外，根据本发明的麦芽粉还包括一种或多种辅料，例如未发芽的玉米， 或其他未发芽的谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、高粱(milo)、粟和/或高粱 (sorghum)，或未加工和/或精制的源自于植物的含有淀粉和/或糖的材料，这些植物是像小 麦、黑麦、燕麦、玉米、水稻、高粱(milo)、粟、高粱(sorghum)、马铃薯、甘薯、木薯、木薯淀粉、 西米、香蕉、甜菜和/或甘蔗。根据本发明，辅料可获得自块茎、根、茎、叶、豆荚、谷类和/或完 整谷物。
[0056] 根据本发明，选自由大麦和小麦组成的组的辅料是优选的。
[0057]形成醪液之前，麦芽和/或辅料优选被磨碎并且最优选是干磨或湿磨。
[0058]根据本发明，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少10% (w/w)，例如，该辅料是辅 料和麦芽的总重量的至少15% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少20% (w/ W)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少25% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总 重量的至少30% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少35% (w/w)，例如，该辅 料是辅料和麦芽的总重量的至少40% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少 45% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少50% (w/w)，例如，该辅料是辅料和 麦芽的总重量的至少55% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少60% (w/w)，例 如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少65% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量 的至少70% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少75% (w/w)，例如，该辅料是 辅料和麦芽的总重量的至少80% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少85% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少90% (w/w)，例如，该辅料是辅料和麦芽 的总重量的至少95% (w/w)。
[0059]根据本发明的一个方面，该醪液通过研磨（grounding)-种包括麦芽和辅料的麦 芽粉来获得。可以将添加至麦 芽粉的水预热，以便在醪液形成的时刻醪液便达到所希望的 醪液温度。
[0060] 本发明对于低水/麦芽粉比是尤其有用的，因此根据本发明，该醪液具有从2.0: 1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦芽粉比，例如，该醪液具有从2.1:1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦 芽粉比，例如，该醪液具有从2.2:1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦芽粉比，例如，该醪液具有从 2.3:1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦芽粉比，例如，该醪液具有从2.4:1.0至3.0:1.0(w/w)的 水/麦芽粉比，例如，该醪液具有从2.5:1.0至3.0:1.0(w/w)的水/麦芽粉比。
[0061] 淀粉糖化过程的温度特征曲线可以是来自常规的淀粉糖化过程的特征曲线，其中 设置温度以达到由麦芽酶最佳降解麦芽粉干物质。
[0062] 淀粉糖化过程通常应用温度的受控分步增加，其中每个步骤都偏好一个酶促作用 超过另一个。淀粉糖化温度特征曲线在本领域通常是已知的。在本发明的一个方面中，该淀 粉糖化包括至少一个在从45°C到60°C的范围内的温度下的孵育步骤，其中该阿拉伯呋喃糖 苷酶GH43是有活性的。
[0063]根据本发明有用的淀粉糖化温度特征曲线的一个实例是52°C(20min);64°C (40min) ;72°C(20min) ;78°C(5min);其中已经使用了l°C/min的加热速率。
[0064] 在一个方面中，该醪液的pH在约4.6至约6.4的范围内。在另一个方面中，该pH在约 4.6至6.2的范围内，如在pH约4.8至约6.0之间的范围内，优选在pH约5.0至约6.0之间的范 围内，更优选在pH约5.0至约5.6之间的范围内，甚至更优选在pH约5.0至约5.4之间的范围 内。
[0065] 从醪液得到麦芽汁典型地包括将麦芽汁从酒糟中过滤出来。可以使热水穿过酒糟 以清洗或喷洒任何剩余的来自麦芽粉的提取物。
[0066] 在从麦芽粉的酒糟中分离出麦芽汁之后，可以将麦芽汁照原样使用，或它可以被 脱水以提供浓缩和/或干燥的麦芽汁。可以将浓缩的和/或干燥的麦芽汁用作酿造提取物、 用作麦芽提取物调味品、用于非酒精麦芽饮料、麦芽醋、早餐谷物食品、用于糖果等。
[0067] 在一个优选实施例中，将麦芽汁发酵以生产酒精饮料，优选啤酒，例如爱尔啤酒 (ale)、烈性爱尔啤酒、苦啤酒(bitter)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒 (lager)、出口啤酒、麦芽酒(malt liquor)、大麦酒、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低 醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。麦芽汁的发酵可包括以包含新鲜酵母，即先前未曾用于本 发明的酵母或其可为回收的酵母的酵母浆投入麦芽汁。应用的酵母可以为适于碑酒酿造的 任何酵母，尤其是选自酵母属的酵母，例如酿酒酵母和葡萄汁酵母，包括这些有机体的天然 或人工产生的变体。用于生产啤酒的麦芽汁的发酵方法是本领域的普通技术人员熟知的。
[0068] 座
[0069] 在一个方面中，该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43是在淀粉糖化开始时引入的。在另一个 方面中，该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43是在淀粉糖化过程中引入的。
[0070] 在一个方面中，本发明包括将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种β-葡聚糖酶二者 添加至醪液中；特别是将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种β-葡聚糖酶GH5添加至醪液中； 优选将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种β-葡聚糖酶GH5_5添加至醪液中。
[0071] 在一个方面中，本发明包括将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种木聚糖酶二者添 加至醪液中；特别是将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43和一种木聚糖酶GH10添加至醪液中。 [0072] 在一个方面中，本发明包括将一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43、一种β-葡聚糖酶和一 种木聚糖酶添加至醪液中。
[0073] 在一个方面中，本发明包括添加一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43、一种β-葡聚糖酶GH5 和一种木聚糖酶GH10,特别是一种阿拉伯呋喃糖苷酶GH43、一种β-葡聚糖酶GH5_5和一种木 聚糖酶GH10。
[0074] 在另一个优选的实施例中，将一种或多种另外的酶添加至醪液中，所述一种或多 种酶包括但不限于蛋白酶、普鲁兰酶、脂肪酶以及淀粉酶。
[0075] 有待在本发明中应用的酶应根据它们在本发明的工艺的加工温度下保留足够的 活性的能力，以及它们在醪液的中等酸度pH下保留足够的活性的能力进行选择，并应以有 效量添加。这些酶可源自于任何来源，优选源自于植物或藻类，并且更优选源自于微生物， 如源自于细菌或真菌。
[0076] 阿拉伯呋喃糖苷酶GH43
[0077]在本披露中应用的糖苷水解酶家族的编号遵循科蒂尼奥(Coutinho)，P.M.&亨利 Henris sat) ,Β. (1999)iS：URL：http: //afmb. cnrs-mrs . fr/~cazy/CAZY/index.html 的CAZy-碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)服务器，或可替代地，科蒂尼 奥，P. M. &亨利萨特，B. 1999;纤维素酶及其他碳水化合物活性酶的模块化结构:综合数据库 方法（The modular structure of cellulases and other carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach)，于"纤维素降解的遗传学、生物化学以及生 态学（Genetics，Biochemistry and Ecology of Cellulose Degradation)''中，K·大宫 (Ohmiya)、Κ·林(Hayashi)、Κ·萨卡（Sakka)、Υ·小林(Kobayashi)、S. XU田（Karita)和T ·木村 (Kimura)编辑，大学出版社有限公司（Uni Publishers Co.)，东京，第15-23页，以及伯恩 (Bourne)，Y.&亨利萨特，B. 2001;糖苷水解酶和糖基转移酶:家族和官能分子(Glycoside hydrolases and glycosyltransferases:families and functional modules)，结构生物 学新见（Current Opinion in Structural Biology) 11:593-600的概念。
[0078]在一个优选实施例中，阿拉伯呋喃糖苷酶GH43(或也被称为GH43的α-L-阿拉伯呋 喃糖苷酶)具有针对双取代的木糖的活性。
[0079]该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43可以是微生物来源的，例如可源自于丝状真菌菌株(例 如，腐质霉属、曲霉属、木霉属、镰孢属、青霉属)或源自于细菌(例如，芽孢杆菌属、双歧杆菌 属)。
[0080]优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43源自于特异腐质霉。最优选地，该阿拉伯呋喃糖 苷酶GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少70%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷 酶GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少75%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少8 0 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少85%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少9 0 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少91 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少92%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少93%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少9 4 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少95%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少9 6 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID NO: 1中所示的序列具有至少97%的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID N 0:1中所示的序列具有至少9 8 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 G Η 4 3与S E Q ID Ν 0:1中所示的序列具有至少9 9 %的一致性;优选地，该阿拉伯呋喃糖苷酶 GH43与SEQ ID Ν0:1中所示的序列具有100%的一致性。
[0081 ] 该阿拉伯咲喃糖苷酶GH43还可源自于青春双岐杆菌（Bifidobacterium adolescenti)。更优选地，该阿拉伯咲喃糖苷酶GH43是由凡莱尔(Van Laere)1997年描述于 应用微生物学与生物技术(Appl .Microbiol .Biotechnol)，47,231-235中和/或由范登布罗 克(Van den Broek)2005年描述于应用微生物学与生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology)中的酶。
[0082]可以按0 · 5-20mg酶蛋白/kg麦芽粉;优选0 · 5-15mg酶蛋白/kg麦芽粉;并且甚至更 优选0.5-10mg酶蛋白/kg麦芽粉的量添加该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43。
[0083] 阿拉伯呋喃糖苷酶GH51
[0084]阿拉伯呋喃糖苷酶GH51(或也被称为GH51的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶）具有针对单 取代的木糖的活性。它可以是微生物来源的，例如可源自于丝状真菌菌株(例如，亚灰树花 菌属(Meripilus)、腐质霉属、曲霉属、木霉属、镰孢属、青霉属)或源自于细菌(例如芽孢杆 菌属）。
[0085] 优选地，该酶是一种源自于大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)的GH51的阿 拉伯呋喃糖苷酶。最优选地，该GH51的阿拉伯呋喃糖苷酶是如SEQ ID N0:2所示的多肽。 [0086] 葡聚糖酶
[0087] 在一个另外的实施例中，将一种β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4.)添加至醪液中。β-葡聚 糖酶也被称为纤维素酶并且可以是真菌来源的，如来自曲霉属(例如，米曲霉或黑曲霉），或 者来自细菌如芽孢杆菌属(例如，枯草芽孢杆菌）。
[0088] 具体而言，该β_葡聚糖酶可源自于嗜热子嚢菌属(Thermoascus)，特别是源自于金 黄色嗜热子囊菌。最优选地，该β-葡聚糖酶是一种GH5葡聚糖酶;特别是一种GH5_5葡聚糖 酶。
[0089] 木聚糖酶
[0090] 在一个另外的实施例中，将一种木聚糖酶添加至醪液中。在一个方面中，木聚糖酶 活性由一种来自糖基水解酶家族10... 的木聚糖酶提供。在一个方面中，该木聚糖酶与W0 94/ 21785中所述的木聚糖酶具有至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少 80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91 %，更优选至少92%，更优选至少 93%，更优选至少94%，更优选至少95%，更优选至少96%，更优选至少97%，更优选至少 98%，并且最优选至少99%或甚至100%的一致性。在另一个方面中，该木聚糖酶是来自诺 维信公司（Novozymes A/S)的Shearzyme?。
[0091] 在一个优选实施例中，该木聚糖酶源自于棘孢曲霉，尤其是来自棘孢曲霉的家族 GH10木聚糖酶。
[0092] 蛋白酶
[0093] 在一个另外的实施例中，将一种蛋白酶添加至醪液中。适合的蛋白酶包括微生物 蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即由在低于pH 7的酸性条件下 水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。这些蛋白酶负责使醪液中的全长的高分子量蛋白成为低 分子量蛋白。低分子量蛋白对于酵母营养是必要的，并且高分子量蛋白确保泡沫稳定性。因 此，本领域的技术人员熟知，蛋白酶应以平衡的量添加，同时允许针对该酵母的充足的游离 氨基酸，并且留下足够的高分子量蛋白以稳定泡沫。在一个方面中，蛋白酶活性由蛋白水解 酶系统提供，该蛋白水解酶系统具有适合的FAN产生活性，包括内切-蛋白酶、外肽酶或其任 何组合，优选金属蛋白酶。优选地，该蛋白酶与W0 99/67370中所述的SEQ ID N0:6中所示的 氨基酸序列具有至少50 %，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，更优选至 少85 %，更优选至少90%，更优选至少91 %，更优选至少92%，更优选至少93 %，更优选至少 94%，更优选至少95 %，更优选至少96%，更优选至少97 %，更优选至少98%，并且最优选至 少99 %或甚至100 %的一致性。在另一个方面中，该蛋白酶是可从诺维信公司获得的 Neutrase?〇
[0094] 普鲁兰酶
[0095] 在一个另外的实施例中，将一种普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)添加至醪液中。普鲁兰酶 催化普鲁兰、支链淀粉和糖原中，以及支链淀粉和糖原的α-和β-极限糊精中的（l->6)-a-D-糖苷键的水解。
[0096] 根据本发明的普鲁兰酶优选是来自例如火球菌属或芽孢杆菌属(例如嗜酸性普鲁 兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus))的普鲁兰酶，例如描述于凯利(Kelly)等人， 1994,欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMS Microbiol.Letters) 115:97-106中的普 鲁兰酶;或可从诺维信公司获得的普鲁兰酶，如Promozyme 400L。该普鲁兰酶还可以来自长 野芽抱杆菌（Bacillus naganoencis)或脱支芽抱杆菌（Bacillus deramificans)，例如像 源自于脱支芽孢杆菌(美国专利5,736,375)。
[0097]最优选地，该普鲁兰酶源自于嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌。一种优选的普鲁兰酶是一 种具有如下氨基酸序列的普鲁兰酶，该氨基酸序列与W0 2009/075682中披露的普鲁兰酶3 的序列是至少50%，例如至少55%，例如至少60%，例如至少65%，例如至少66%，例如至少 70%，例如至少75%，例如至少80 %，例如至少85%，例如至少86 %，例如至少87%，例如至 少88%，例如至少89%，例如至少90%，例如至少91 %，例如至少92%，例如至少93%，例如 至少94%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%或甚 至100 % -致的。
[0098] 脂肪酶
[0099] 在一个另外的实施例中，将一种脂肪酶(EC 3.2.1.41)添加至醪液中。在一个实施 例中，脂肪酶活性由一种对甘油三酯和/或半乳糖脂和/或磷脂具有活性的脂肪酶提供。优 选地，脂肪酶活性由一种来自镰孢属（包括尖孢镰孢（F.oxysporum)和异孢镰孢 (F.heterosporum))、曲霉属(包括塔宾曲霉(A. tubigensis))、根霉属(包括米根霉)或嗜热 丝孢菌属(Thermomyces)(包括疏棉状嗜热丝孢菌(T. lanuginosus))的脂肪酶，或这些脂肪 酶的变体提供。一个实例是Lipopan X(Lipopan Xtra)，一种具有取代G91A+D96W+E99K+ P256V+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N+270A+271G+272G+273F(+274S)的疏棉状 嗜热丝孢菌脂肪酶的变体，描述于W0 2004099400A2中。在另一个方面中，该脂肪酶是一种 来自尖孢镰孢的脂肪酶/磷脂酶，描述于EP 869167中，可从诺维信公司获得，如Lipopan? F。在本发明的一个优选实施例中，该脂肪酶是LipozymeTL/'或Lipolase1';这种脂肪酶对 过滤速度和雾度减少具有显著地良好作用，并且可从丹麦诺维信公司获得。该脂肪酶还可 以是Lipex?，Lip〇Zyme的一种变体，可从丹麦诺维信公司获得。脂肪酶将来自大麦的脂质 (例如甘油三酯)降解为偏甘油酯和游离脂肪酸。这导致较低的浊度和大大改进的醪液过滤 及滤清特性。
[0100] α-淀粉酶
[0101] 在一个另外的实施例中，将一种α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)添加至醪液中。有待在本 发明的工艺和/或组合物中使用的一种具体的淀粉酶可为芽孢杆菌属α_淀粉酶。熟知的 芽孢杆菌属淀粉酶包括源自于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的菌 株的α_淀粉酶。在本发明的一个方面中，有用的芽孢杆菌属α_淀粉酶是如在W0 99/19467第 3页第18行至第6页第27行中定义的α-淀粉酶。优选地，该α-淀粉酶与W0 99/19467中披露为 SEQ ID Ν0:3的氨基酸序列中所示的氨基酸序列（具有突变：I181*+G182*+N193F)具有至少 50%，更优选至少60 %，更优选至少70 %，更优选至少80 %，优选至少85 %，更优选至少 90%，优选至少91 %，优选至少92%，优选至少93%，优选至少94%，更优选至少95%，优选 至少96 %，优选至少97 %，更优选至少98 %，并且最优选至少99 %的一致性。还考虑了来自 诺维信公司的α-淀粉酶Termamyl? SC。有待用于本发明的工艺中的另一种α-淀粉酶可以是 任何真菌α-淀粉酶，例如源自于曲霉属内一个物种，并且优选源自于黑曲霉的菌株的α-淀 粉酶。
[0102] 在下列实例中进一步阐明本发明，这些实例并不旨在以任何方式限制所要求保护 的本发明的范围。
[0103] 实例 1
[0104] 当被添加至包含大麦芽和大麦的醪液中时，属于家族GH43与家族GH51的阿拉伯呋 喃糖苷酶(AraF)降低麦芽汁粘度的能力的比较
[0105] 按以下方式制备麦芽汁：
[0106] 将48.0g磨碎的大麦芽(0.2mm)和32.0g大麦与 197ml H20(54°C)和3.0ml CaC12溶 液（ll.Og CaCl2*2H20/500ml H20) -起添加至淀粉糖化烧杯中。
[0107] 分别按2.5、5以及10mg Ep/kg麦芽粉的剂量，在淀粉糖化(52°C)开始时单独地添 加属于家族GH43(SEQ ID N0:1)和GH51(SEQ ID N0:2)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0108] 使用了以下淀粉糖化特征曲线：52°C(20min)，64°C(40min)，72°C(20min)，78°C (5min)，冷却至20°C。淀粉糖化静止之间的加热速率是1 °C/min。
[0109] 在淀粉糖化之后，通过添加水对蒸发损失进行校正，目标是280g的最终重量。通过 置于塑料漏斗中的纸过滤器(瓦特曼(Whatman)5971/2)过滤醪液。在20°C下，分析滤液(麦 芽汁）的密度(啤酒分析仪(Beeranalyzer)，安东帕公司(Anton Paar)，格拉茨(Graz)，奥地 利）以及动态粘度（微量粘度计，安东帕公司，格拉茨，奥地利）。使用描述于 Mitteleuropdische Brautechnische Analysenkommission(MEBAK) "原材料（Raw Material)"（2011)，第3.1.4.4章中的双曲线函数将动态粘度n = f (密度)标准化至24.2°P 的水平。
[0110] 图1示出了就用大麦和麦芽进行的高比重淀粉糖化中的粘度降低而言属于家族 GH51和GH43的阿拉伯呋喃糖苷酶的比较。左侧:剂量-反应曲线；右侧：以对照的百分比表示 的粘度降低。该图显示在2.5mg酶蛋白/kg麦芽粉的酶水平下，当使用AraF GH51时，粘度降 低是2.1%，而当使用4瓜？6財3时，粘度降低是7.7%。这显示4抑？6财3在高比重淀粉糖化 方面出乎意料地好。
[0111] 实例2
[0112] 当被添加至包含大麦芽和小麦的醪液中时，属于家族GH43与家族GH51的阿拉伯呋 喃糖苷酶(AraF)降低麦芽汁粘度的能力的比较
[0113] 按以下方式制备麦芽汁：
[0114] 将48.0g磨碎的大麦芽(0.2mm)和32.0g小麦与 197ml H20(54°C)和3.0ml CaC12溶 液（ll.Og CaCl2*2H20/500ml H20) -起添加至淀粉糖化烧杯中。
[0115] 分别按2.5、5以及10mg Ep/kg麦芽粉的剂量，在淀粉糖化(52°C)开始时单独地添 加属于家族GH43(SEQ ID N0:1)和GH51(SEQ ID N0:2)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
[0116] 使用了以下淀粉糖化特征曲线：52°C(20min)，64°C(40min)，72°C(20min)，78°C (5min)，冷却至20°C。淀粉糖化静止之间的加热速率是1 °C/min。
[0117]在淀粉糖化之后，通过添加水对蒸发损失进行校正，目标是280g的最终重量。通过 置于塑料漏斗中的纸过滤器(瓦特曼597V2)过滤醪液。在20°C下，分析滤液(麦芽汁）的密度 (啤酒分析仪，安东帕公司，格拉茨，奥地利）以及动态粘度(微量粘度计，安东帕公司，格拉 茨，奥地利）。使用描述于 Mitteleuropiiische Brautechni sche Analysenkommission (MEBAK) "原材料(Raw Material)"（2011)，第3.1.4.4章中的双曲线函数将动态粘度n = f (密度)标准化至24 · 2° P的水平。
[0118] 图2示出了就用小麦和麦芽进行的高比重淀粉糖化中的粘度降低而言属于家族 GH51和GH43的阿拉伯呋喃糖苷酶的比较。左侧:剂量-反应曲线；右侧：以对照的百分比表示 的粘度降低。该图显示在2.5mg酶蛋白/kg麦芽粉的酶水平下，当使用AraF GH51时，粘度降 低是1.7%，而当使用AraF GH43时，粘度降低是11.3%。这显示AraF GH43在高比重淀粉糖 化方面出乎意料地好。
[0119] 实例3
[0120] 来自特异腐质霉的阿拉伯呋喃糖苷酶家族GH43(SEQ ID NO: 1)应用于淀粉糖化对 后续醪液过滤的影响
[0121] 材料和方法
[0122] 使用配备有0.2mm筛网的锤磨机磨碎未发芽大麦（184g)和比尔森(Pilsner)麦芽 (276g)。将氯化钙添加至脱盐水中以实现60ppm Ca2+-离子的最终浓度。在将水加热至51°C 后，添加麦芽粉(室温）。当达到50°C的醪液温度时，根据表2添加酶，并且开始淀粉糖化程序 读1)。
[0123] 在淀粉糖化之后，针对蒸发损失调节热醪液的重量并将其立即转移至夹套加热 (78°C)的过滤单元类型的KHS EW14/2CW中，其配备有标准聚丙烯醪液滤布以及用于施用气 压的连接件。允许醪液沉降4分钟。然后，对过滤器加压(40kPa过压），并且再过一分钟后，通 过打开过滤器的底阀开始过滤。每2秒自动监测滤液的重量，直至达到1050g的总质量。为了 评价过滤性能，应用了范登布施(Vandenbusche)等人（酿酒和饮料工业国际版(Brewing and Beverage Industry International)(3)，2004,第14-18页）所描述的修改方法。简言 之，通过时间/质量对质量作图进行监测数据的线性化。将200-1000g之间的线性化数据的 斜率用于计算滤过系数(Fk-值）。将Fk-值定义为Fk = n*a*c/p (η =动态粘度;a =滤饼的比 阻力;c =不可溶颗粒的浓度;P =压力）。低的Fk-值指示良好的过滤。
[0124] 除Fk-值之外，用于过滤性能评价的第二、更简单的参数直至收集1000g的滤液的 时间被用于图解说明。
[0125] 分析滤液(麦芽汁）的粘度、提取物密度、β-葡聚糖(>10000kDa)和阿糖基木聚糖的 含量。
[0126] 表1:应用于该实验中的淀粉糖化方案
[0127]
[0128]
[0129] 表2:被测试酶的过滤性能的比较以及所得滤液的分析数据。在所有的试验中，按 36KNU-S/kg麦芽粉和0.16AU-N/kg麦芽粉的剂量水平使用Termamyl SC和Neutrase 0.8L， 分别为了补偿由麦芽提供的降低的内源酶活性(―使用40%未发芽大麦）ΑΧυ =真菌木聚 糖酶活性单位，EGU =内切葡聚糖酶活性单位，KNU-S = a-淀粉酶活性单位，AU-N =蛋白酶活 性单位
[0130]
[0131] 结果
[0132] 醪液从40 %大麦和60 %麦芽产生，并且水/麦芽粉比为2.5 :1。在淀粉糖化开始时 按两种剂量水平（50FXU =真菌木聚糖酶活性单位+140EGU=内切葡聚糖酶活性单位，和 100FXU+280EGU，基于总麦芽粉）添加 premium酶共混物Ultraflo Max?，该共混物在工业中 用于改善醪液分离，其包含内切木聚糖酶以及纤维二糖水解酶、内切-和外切-β_葡聚糖酶 活性的混合物。将这些的醪液-过滤性能与以相同方式生产的醪液进行比较，但是不同的是 添加的酶共混物包含来自棘孢曲霉的内切-1，4-β-木聚糖酶家族GH10、来自金黄色嗜热子 囊菌的内切葡聚糖酶家族GH5_5和第三酶，即来自特异腐质霉的阿拉伯呋喃糖苷酶家族 GH43(SEQ ID Ν0:1)〇
[0133] 表2证明在淀粉糖化中使用后一组合将甜麦芽汁的过滤时间分别减少至约63% (当与低剂量U1 traf 1 〇 Max相比时）和约72 % (当与高剂量U1 traf 1 〇 Max相比时）。较好的过 滤反映为较低的滤液粘度，分别降低至约89% (当与低剂量Ultraflo Max相比时）和92% (当与高剂量Ultraflo Max相比时）。
[0134] 可以将粘度的降低归因于高分子阿糖基木聚糖的较好降解，当将来自特异腐质霉 的阿拉伯呋喃糖苷酶家族GH43(SEQ ID N0:1)与来自棘孢曲霉的内切-1，4-β-木聚糖酶家 族GH10结合使用而非单独使用内切-1，4-β-木聚糖酶时，粘度降低了约53 %。
[0135] 实例4
[0136] 来自特异腐质霉的阿拉伯呋喃糖苷酶家族GH43应用于淀粉糖化对啤酒过滤的影 疸
[0137] 材料和方法
[0138] 使用间隙距离为0.2mm的盘磨机磨碎未发芽大麦(64g)和比尔森麦芽(96g)。将氯 化钙添加至脱盐水中以实现60ppm Ca2+-离子的最终浓度。在将水加热至51°C后，添加麦芽 粉(室温）。当达到50°C的醪液温度时，根据表4添加酶，并且开始淀粉糖化程序(表3)。在淀 粉糖化中水/麦芽粉比为2.5:1。在淀粉糖化之后，针对蒸发损失调节热醪液的重量至600g， 并且立即通过马歇雷-纳格尔(Macherey-Nagel)514V4滤纸过滤。
[0139] 分析甜麦芽汁的密度并使用含有60ppm Ca2+_离子的高压釜处理的脱盐水稀释至 14° Plato。将稀释的麦芽汁加热至沸腾温度并且添加0. 145g啤酒花（传统哈拉道 (Hallertauer 1'抑虹丨丨〇11)，2012，17%€[酸）/45(^麦芽汁。将麦芽汁煮沸40分钟，并且在煮 沸后，通过添加高压釜处理的水补偿蒸发损失。将过夜增殖的酵母菌株W34/70以2*10 7个细 胞/mL麦芽汁的浓度添加。在12°C下进行7天发酵，随后在冰上储存5天。然后，将啤酒脱气并 在2°C下，在2000rpm下离心，并且将上清液通过瓦特曼597 1/2滤纸预过滤，以便去除剩余的 酵母细胞。然后，将50mL预过滤的啤酒填入XK26柱（通用电气医疗集团（GE-Healthcare)) 中，该柱被回火至0°C并且配备有0.45μπι醋酸纤维素过滤器。在达到温度平衡以后，将50kPa 压力(N2)施加在该柱上。每1秒自动监测随时间推移过滤的啤酒的质量。可将所应用的过滤 类型描述为表面过滤，意味着随过滤时间推移，流速由于过滤阻力增加而降低。评价在淀粉 糖化中添加的单独的酶对啤酒过滤的影响(性能）的第一步是基于监测数据计算初始流速。 通过从达到流速是初始流速一半时监测到的数据中提取滤液质量和过滤时间而得到用于 指示啤酒过滤性能的参数。在过滤前后，分析啤酒的β-葡聚糖、阿糖基木聚糖的含量以及粘 度(在0°C下）。
[0140] 表3:应用于该实验中的淀粉糖化方案
[0141]
'[0142]~表4:被测试酶的啤酒过滤性能的It较以及所得非滤液和滤液的分析数据。在所有1 的试验中，按36KNU-S/kg麦芽粉和0，16AU-N/kg麦芽粉的剂量水平使用Termamyl SC和 Neutrase 0.8L，分别为了补偿由麦芽提供的降低的内源酶活性(―使用40%未发芽大麦）。 FXU =真菌木聚糖酶活性单位，EGU=内切葡聚糖酶活性单位，KNU-S = a-淀
[0143] 粉酶活性单位，AU_N=蛋白酶活性单位。
[0144]
[0145] 结果
[0146]啤酒从40%大麦和60%麦芽产生，其中原始比重为14°Plato。在淀粉糖化开始时 按工业上通常应用的剂量上限（l〇〇FXU =真菌木聚糖酶活性单位+280EGU=内切葡聚糖酶 活性单位，基于总麦芽粉)给予premium酶共混物Ultraflo Ma以作为挑战性基准，该共混物 在工业中用于改善醪液和啤酒分离，其包含内切木聚糖酶以及纤维二糖水解酶、内切-和外 切-β-葡聚糖酶活性的混合物。将过滤性能与以相同方式生产的啤酒进行比较，但是不同的 是添加的酶共混物包含来自棘孢曲霉的内切-1，4-β-木聚糖酶家族GH10、来自金黄色嗜热 子囊菌的内切葡聚糖酶家族GH5_5和第三酶，即来自特异腐质霉的阿拉伯呋喃糖苷酶家族 GH43(AraFGH43)。表2证明在淀粉糖化中使用后一组合将啤酒过滤改进了约17 % (基于到初 始流速降至1/2*初始流速为止的时间之后收集的滤液的质量)或约14% (基于到初始流速 降至1/2*初始流速为止的时间长度）。较好的过滤来源于使得初始流动更快的较低粘度以 及即较低的总半纤维素含量(β_葡聚糖+阿糖基木聚糖的总和），其降低了膜滤器的饱和度 (计时），即滤液残余物/质量单位滤液(膜的饱和度在约63-82mg半纤维素的范围内）。
【主权项】
1. 一种降低酿造工艺中的粘度的方法，该方法包括以下步骤： (a) 从麦芽和辅料制备醪液，并且 (b) 将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至该醪液中。2. 根据权利要求1所述的方法，其中该辅料选自下组，该组由以下各项组成:大麦和小 麦。3. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种β_葡聚糖酶添加至该醪液 中。4. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种木聚糖酶添加至该醪液 中。5. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶与SEQIDNO: 1 中所示的序列具有至少70%的一致性。6. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该醪液具有2.0:1.0至3.0:1.0(w/w) 的水/麦芽粉比。7. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该辅料是辅料和麦芽的总重量的至少 10% (w/w) 〇8. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该淀粉糖化包括一个在从45°C到60°C 的范围内的温度下的孵育步骤。9. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种蛋白酶添加至该醪液中。10. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种普鲁兰酶添加至该醪液 中。11. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种脂肪酶添加至该醪液中。12. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中另外将一种α_淀粉酶添加至该醪液 中。13. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中将该醪液过滤以得到麦芽汁。14. 根据权利要求13所述的方法，其中将该麦芽汁发酵以得到啤酒。15. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中以从0.5至10.Omg酶蛋白/kg麦芽粉 的量添加该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43。16. 根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中该阿拉伯呋喃糖苷酶GH43具有针对 双取代的木糖的活性。
【专利摘要】一种降低酿造工艺中的粘度的方法，该方法包括以下步骤：(a)从麦芽和辅料制备醪液，并且(b)将阿拉伯呋喃糖苷酶GH43添加至醪液中。
【IPC分类】C12C5/00, C12C7/047
【公开号】CN105492590
【申请号】CN201480048137
【发明人】A·毛赫, N·埃尔维基, J·埃克洛夫, K·B·R·M·克罗
【申请人】诺维信公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月4日
【公告号】EP3041923A1, WO2015032850A1
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