用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法
用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法
【专利说明】用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法
【背景技术】
[0001] 1.发明领域
[0002] 本发明涉及具有改进的腐胺生产力的重组微生物和使用其以高产率生产腐胺的 方法。
[0003] 2.相关技术的描述
[0004] 多胺比如亚精胺、精胺等等存在于大多数活细胞中，并且腐胺（或1，4_丁二胺）用 作亚精胺和精胺代谢中的前体。腐胺在革兰氏阴性菌或真菌中发现，并且其在各种物种中 以高浓度存在，这表明其在微生物的代谢途径中具有重要作用。
[0005] -般而言，腐胺是聚胺尼龙_4、6-一其通过与己二酸反应产生一一合成中的重要 原料。腐胺主要通过自丙烯通过丙烯腈和琥珀腈的化学合成产生。该化学合成是三步法，其 包括催化氧化反应、使用氰化物化合物的反应和使用高压氢的加氢反应。因为该化学合成 不是环境友好的并且也消耗大量的能量，导致石油耗竭，所以存在问题。因此，需要开发涉 及生物质利用的更环境友好的和能量有效的方法用于腐胺生产。
[0006] 在微生物体内，腐胺的生物合成途径与从谷氨酸到鸟氨酸合成的精氨酸合成路线 相同。腐胺可以自微生物通过两条途径生物合成。在一条途径中，作为中间体的鸟氨酸脱羧 基以合成腐胺。在另一条途径中，通过自鸟氨酸合成的精氨酸脱羧反应产生胍基丁胺，然后 自胍基丁胺合成腐胺(Morris等，J Biol.Chem.241:13,3129-3135,1996)。这两条途径产生 代谢所需要的能量或者使细胞具有对氧化应激的抗性。
[0007] 作为使用微生物生产腐胺的方法，通过转化大肠杆菌和棒状杆菌以高浓度生产腐 胺的方法已经被报道（国际专利公开号W006/005603;国际专利公开号W009/125924;Qian ZD等，Biotechnol.Bioeng.104:4,651-662，2009;Schneider等， Appl .Microbiol · Biotechnol · 88 : 4，859-868，2010;Schneider等， Appl .Microbiol .Biotechnol ·91:17-30，2011)。例如，W009/125924公开了通过增强鸟氨酸 生物合成途径而不是失活参与在大肠杆菌中存在的腐胺的降解和利用的途径和失活作为 腐胺的前体的鸟氨酸到精氨酸的转化，来以高产率生产腐胺的方法。此外，Schneider (2010)公开了通过将能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质引入不具有腐胺生产力的棒状杆菌 属某种菌株和增强能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质进入不具有腐胺生产力的棒状杆菌属 某种菌株，以高浓度生产腐胺的方法。
[0008] 而且，对在大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞中腐胺运载体的研究已经积极地进行 (K Igarashi，Plant Physiol .Biochem. 48: 506-512,2010)。大肠杆菌的腐胺摄取经由4种 途径发生；由ATP水解作用驱动的potABCD或potFGHI，和作为H+同向转运体（symporter)的 potE和puu途径的puuP。关于参与腐胺摄取的这些复合体的Km值，PotFGHI、potAB⑶、potE和 puuP的Km值分别为0.5mM、1.5mM、1.8mM和3.7mM。在这四种腐胺摄取途径中，potFGHI复合体 被认为是最合适的。此外，P〇tE运载体具有摄取和分泌腐胺二者的功能。腐胺在中性pH下与 质子一起被输入细胞中。然而，由于腐胺合酶(speF)在酸性pH条件下表达，所以细胞外鸟氨 酸的细胞内摄取和在细胞内合成的腐胺的细胞外分泌同时发生（K u r i h a r a等， J.Bacteriology 191:8,2776-2782,2009)〇
[0009] 酵母中已知的腐胺输出蛋白（exporter)是TP01和TP04。这些氨基酸序列与芽孢杆 菌多药运载体Bit的氨基酸序列非常相似。
[0010]这两种输出蛋白与大肠杆菌中的P〇tE共享特征，并且它们在碱性条件下具有输入 腐胺、亚精胺和精胺的功能并且在酸性条件下输出它们。此外，过表达TP05基因的酵母细胞 对120mM腐胺具有抗性，反之破坏TP05基因的突变体对90mM腐胺敏感（Tachihara等， J.Biological Chemistry,280(13):12637-12642,2005)〇
[0011] 动物细胞中腐胺的合成和降解，以及摄取和分泌以不同的方式调控。虽然对聚胺 分泌的研究还没有在动物细胞以及大肠杆菌或酵母中进行，但是有报道SLC3A2(精氨酸/二 胺输出蛋白）在结肠上皮细胞中起将精氨酸输入细胞并输出腐胺、乙酰基亚精胺和乙酰基 精胺的作用。然而，没有关于在植物细胞中摄取和输出腐胺的报道（Igarashi等，Plant Physiol.&Biochem.48:506-512,2010)〇
[0012] 另一方面，由于棒状杆菌属某种微生物不具有腐胺生物合成途径，所以还没有进 行关于腐胺输出的研究。根据最近的报道，通过在产生尸胺的菌株中过表达cg2983膜蛋白 恢复细胞生长和增强尸胺生产力(Kind等，Metabolic Engineering 13:617-627，2011) 〇
[0013] 然而，还没有关于腐胺输出蛋白和腐胺生产力或生产腐胺的微生物的生长之间的 关联的报道。在以上的文献中，没有提及关于cg2983膜蛋白和腐胺的输出能力之间的关联。 [0014]在该背景下，本发明人已经进行了许多努力以开发能够以更高产率生产腐胺的菌 株。结果，NCg 12522功能揭不为腐胺生广囷株 棒状杆囷属某种微生物 中的腐胺输 出蛋白，并且可以通过与NCgl2522内源活性相比增强其活性以高产率生产腐胺。此外，培养 基中腐胺的量可以通过在具有腐胺合成途径的大肠杆菌中表达NCgl2522增加，并且因此本 发明人表明NCgl2522在大肠杆菌中也起腐胺输出蛋白的作用，从而完成本发明。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是提供被修饰以具有增强的NCgl2522活性从而以高产率生产腐胺 的重组微生物。
[0016] 本发明的另一目的是提供使用该微生物以高产率生产腐胺的方法。
【附图说明】
[0017] 图1是表明NCgl2522包含在根据本发明的克隆(B19)中的图，所述克隆(B19)最终 选自引入有棒状杆菌属染色体文库的转化的菌落;和
[0018] 图2是评估根据本发明的NCgl2522缺失的或增强的重组菌株的腐胺抗性的结果。
[0019] 1：KCCM11240P
[0020] 2：KCCM11240P ANCgl2522
[0021] 3：KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522
【具体实施方式】
[0022] 在实现以上目标的一方面中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其被修饰以 增强具有由SEQ ID N0:21或23表示的氨基酸序列的蛋白质的活性。
[0023] 在一个具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物 被进一步修饰以与其内源活性相比，具有减弱活性的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和参与 谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221)，并且所述微生物被引入具有鸟氨酸脱羧酶(0DC)活性。
[0024] 在另一具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中鸟氨酸氨 甲酰基转移酶(ArgF)具有由SEQ ID N0: 29表示的氨基酸序列，参与谷氨酸输出的蛋白质 (NCgll221)具有由SEQ ID N0:30表示的氨基酸序列，并且鸟氨酸脱羧酶(0DC)具有由SEQ ID N0:33表示的氨基酸序列。
[0025] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物 进一步修饰为与其内源活性相比，具有增强活性的乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶 (ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨 酸氨基转移酶(ArgD)。
[0026] 在仍另一具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中乙酰基-γ_谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨 酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)分别具有由SEQ ID N0:25、26、27和28表示 的氨基酸序列。
[0027] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中微生物的 乙酰转移酶(NCgl 1469)活性进一步被减弱。
[0028] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中乙酰转移 酶具有由SEQ ID N0:31或32表示的氨基酸序列。
[0029] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中微生物是 埃希式杆菌属某种或棒状杆菌属某种。
[0030] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物 是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
[0031] 在另一方面，本发明提供生产腐胺的方法，其包括以下步骤:培养具有腐胺生产力 的微生物以获得细胞培养物和从培养的微生物或细胞培养物回收腐胺。
[0032]在下文中，将详细地描述本发明。
[0033]本发明提供重组棒状杆菌属某种微生物，其中具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种 微生物被修饰为与其内源活性相比，具有增强的NCgl2522活性，并因此其具有提高的腐胺 生产力。
[0034]如本文所使用，术语"NCgl2522"指的是属于MFS(主要协同转运蛋白超家族）的通 透酶，其是从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032分离的膜蛋白。NCgl2522已知自谷氨酸棒状杆菌输 出二氨基戊烷。在本发明中，NCgl2522被确认起用于将细胞内产生的腐胺细胞外输出的运 载体的作用。基于此事实，本发明提供显示高产率腐胺生产力的重组微生物，其中NCgl2522 被修饰为与其内源活性相比，具有增强的活性，并且因此，增加细胞内产生的腐胺的输出。
[0035] 如本文所使用，术语"内源活性"指的是微生物在其天然状态即没有修饰的状态中 具有的酶的活性，并且"修饰为与内源活性相比具有增强的活性"的意思是与修饰前的相应 酶的活性相比，酶的活性被新引入或进一步提高。
[0036] 在本发明中，"酶活性的增强"包括通过内源基因活性的提高造成的酶活性的提 高、通过内部或外部因素造成的内源基因的扩增、抑制基因表达的调节因子的缺失、基因拷 贝数的增加、通过引入外源基因或修饰表达调控序列一一具体而言，基因内的启动子的置 换或修饰以及突变一一造成的活性的增加，以及其本身酶活性的引入或提高以实现超越内 源功能的效果。
[0037]在本发明中，"修饰为与内源活性相比具有增强的活性"意思是与操纵前的微生物 的活性相比，操纵后微生物的活性增加，所述操纵比如引入显示活性的基因，或增加基因拷 贝数，缺失抑制基因表达的调控因子或修饰表达调控序列，例如，使用改进的启动子。
[0038]其活性通过本发明增加的NCgl2522可以是但不具体地限于如此蛋白质，所述蛋白 质具有SEQ ID N0:21或23的氨基酸序列或具有70%或更多与其同源性、优选地80%或更多 与其同源性、更优选地90%或更多与其同源性、更优选地95%或更多与其同源性、更优选地 98%或更多与其同源性和最优选地99%或更多与其同 源性的氨基酸序列。进一步，因为显 示活性的蛋白质的氨基酸序列可以根据微生物的种类或菌株而不同，所以蛋白质不限于 此。即，蛋白质可以是蛋白突变体或人造变体，其氨基酸序列包括在SEQ ID N0:21或23的氨 基酸序列的一个或多个位置处的一个或数个氨基酸的替换、缺失、插入或添加，只要该蛋白 质通过增强其活性有助于提高腐胺生产力。如本文所使用，术语"数个"氨基酸具体指2到 20、优选地2到10、和更优选地2到5个氨基酸，但是它可以根据蛋白质的三维结构中的氨基 酸残基的位置或类型而不同。而且，氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位可包括自然发生 的突变，其由于具有多肽或人造变体的活性的微生物的个体或物种的差异而发生。
[0039] 在棒状杆菌属某种微生物中不存在腐胺生物合成途径。然而，当引入外来鸟氨酸 脱羧酶(D0C)时，腐胺被合成并细胞外分泌，这表明存在运载体，即起棒状杆菌属某种微生 物的许多膜蛋白之中的腐胺通道作用的输出蛋白。因此，为了分离棒状杆菌属某种微生物 中的腐胺输出蛋白，本发明人制备了野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体文库，并且 他们利用该文库转化生产腐胺的菌株一一谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，并且选择在包含腐 胺的基本培养基中生长的菌株。通过三次(tertiary)菌落选择，最终选择具有腐胺抗性的 克隆(B19)并且进行碱基序列分析以确认该克隆包含NCgl2522(参见图1)。作为腐胺输出蛋 白，衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522具有由SEQ ID N0:21表示的氨基酸序列， 并且衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的、与以上氨基酸序列具有98%同源性的NCgl2522 具有由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
[0040] 编码本发明的NCgl 2522的多核苷酸可包括编码以下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白 质具有:SEQ ID N0:21或23的氨基酸序列，或具有70%或更多与其同源性、优选地80%或更 多与其同源性、更优选地90%或更多与其同源性、更优选地95%或更多与其同源性、更优选 地98%或更多与其同源性和最优选地99%或更多与其同源性的氨基酸序列，只要该蛋白质 的活性与NCgl2522蛋白质的活性相似，并且最优选地，其可包括SEQ ID N0: 20或22的核苷 酸序列。
[0041] 如本文所使用的，术语"同源性"指的是两个氨基酸序列之间的相似性，并且可以 使用利用BLAST 2.0的公知方法测定，BLAST 2.0计算参数比如得分、同一性和相似性。 [0042]进一步，编码本发明的NCgl2522的多核苷酸可以是在严格条件下与SEQ ID N0:20 或22的核苷酸序列杂交的变体，或衍生自以上核苷酸序列的探针，条件是其编码功能性的 NCgl2522。如本文所使用的，术语"严格条件"指的是使多核苷酸之间特异性杂交的条件。例 如，这样的严格条件在文献(J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第 二版，Cold Spring Harbor Laboratory press ,Cold Spring Harbor,New York, 1989 ； F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John ffiley&Sons, Inc.,New York)中详细描述。
[0043] 在本发明中，"修饰为与内源活性相比具有增强的NCgl2522活性"可以通过选自以 下的方法执行:增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达调控序列以增加多核苷酸 的表达、修饰染色体上的多核苷酸序列以增强酶的活性、使抑制基因表达的调控因子缺失 和其组合。
[0044] 多核苷酸的拷贝数可以，但是不具体地限于，通过可操作地将多核苷酸连接至载 体或通过将其整合入宿主细胞基因组而增加。具体而言，宿主细胞基因组中多核苷酸的拷 贝数可以通过将可操作地连接至编码本发明的蛋白质的多核苷酸和独立于宿主细胞复制 和起作用的载体引入宿主细胞而增加，或通过将可操作地连接至多核苷酸和能够将多核苷 酸整合入宿主细胞基因组的载体引入宿主细胞而增加。
[0045] 如本文所使用的，术语"载体"指的是包含编码期望蛋白质的核苷酸序列的DNA构 建体，其可操作地连接至适当的表达调控序列以在适合的宿主细胞中表达期望的蛋白质。 该调控序列包括可以引发转录的启动子、调控转录的任选的操纵基因（operator)序列、编 码适当的mRNA核糖体结合位点的序列、和调控转录和翻译终止的序列。在载体被转化入适 当的宿主细胞之后，其可以独立于宿主基因组复制或起作用，并且可以将载体整合入基因 组本身。
[0046] 在本发明中使用的载体不具体地限制，只要它能够在宿主细胞中复制，并且可以 使用本领域中任何已知的载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌 体。例如， ？耶15、]\113、]\?1^3、]\?1^4、1父11、厶5!111、厶?11、乜0、乜1、卡隆4厶和卡隆21厶可以用作噬 菌体载体或黏粒载体。作为质粒载体，可使用pBR型、pUC型、pBluescriptll型、pGEM型、pTZ 型、pCL型和ρΕΤ型。本发明中可使用的载体不具体地限制，并且可以使用任何已知的表达载 体。优选地，可以使用 pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118S pCCIBAC载体，并且更优选地，可以使用pDZ载体。
[0047] 进一步，染色体中编码期望蛋白的多核苷酸可以使用用于染色体插入的载体由突 变的多核苷酸置换。将多核苷酸插入染色体可以通过本领域中任何已知的方法执行，例如， 同源重组。由于本发明的载体可以通过同源重组插入染色体，所以它可以进一步包括选择 标记以确认染色体插入。选择标记是为了选择转化有载体的细胞，即，为了确认期望的多核 苷酸的插入，并且选择标记可包括提供可选择表型的标记，所述表型比如抗药性、辅源营 养、对细胞毒素剂的抗性或表面蛋白表达。仅表达选择标记的细胞能够在利用选择剂处理 的环境下生存或显示不同的表型，并因而可以选择转化的细胞。
[0048] 如本文所使用的，术语"转化"指的是将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体以由该 多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达的方式引入宿主细胞。只要转化的多核苷酸在宿 主细胞中可以表达，它可以被整合入或放置在宿主细胞的染色体中，或者可以染色体外地 存在。进一步，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。该多核苷酸可以以任何形式引入，只 要它可以被引入宿主细胞中并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主 细胞，所述表达盒为包含其自主表达所需要的所有元件的基因构建体。通常，表达盒包括可 操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点或翻译终止信号。该表达 盒可以是自身可复制的表达载体的形式。多核苷酸也可以被引入宿主细胞并且可操作地连 接至在宿主细胞中表达所需要的序列。
[0049] 进一步，如本文所使用的，术语"可操作地连接"指的是编码期望蛋白质的多核苷 酸序列与引发和介导多核苷酸序列转录的启动子序列之间的功能性连接。
[0050] 同样，用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰可以，但不限于，通过在表达 调控序列上通过核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导修饰以便 进一步增强表达调控序列的活性而进行，或通过利用具有更强活性的核苷酸序列置换表达 调控序列而进行。该表达调控序列包括，但不具体地限于，启动子、操纵基因序列、编码核糖 体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。
[0051] 强异源启动子代替原始启动子可以在多核苷酸表达单位的上游连接，并且强启动 子的实例可包括CJ7启动子、lysCPl启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动 子，并且更优选地，作为棒状杆菌属衍生的启动子的lysCPl启动子或CJ7启动子，并且编码 该酶的多核苷酸可操作地与其连接使得其表达率可以增加。在此，lysCPl启动子是通过核 苷酸序列替换编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的多核苷酸的启动子区域的改进 的启动子，并且与野生型相比，是增加天冬氨酸激酶基因表达的强启动子，导致相应酶活性 5倍增加(W0 2009/096689)。进一步，CJ7启动子是这样的启动子，其在产氨短杆菌中探查 (exploration)强启动子序列期间被发现并且确认在产氨短杆菌和埃希氏杆菌属中表达并 且具有强启动子活性。CJ7启动子是也在谷氨酸棒状杆菌中显示高表达活性的启动子(韩国 专利号0620092和W0 2006/065095)。
[0052]而且，染色体上的多核苷酸序列的修饰可以，但不具体限于，通过在表达调控序列 上通过多核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导突变以便进一步 增强表达多核苷酸序列的活性而进行，或通过利用修饰为具有更强活性的多核苷酸序列置 换该序列而进行。
[0053]在本发明的一个优选的实施方式中，为了提供具有提高的腐胺生产力的棒状杆菌 属某种微生物，基因拷贝数可以通过将具有编码参与腐胺分泌的NCgl2522的SEQ ID N0:20 或22的核苷酸序列的多核苷酸引入染色体而增加，或NCgl2522的自身启动子可以用具有提 高活性的启动子，优选地，具有SEQ ID N0:24的核苷酸序列的CJ7启动子替换。
[0054]如本文所使用的，术语"具有腐胺生产力的微生物"或"生产腐胺的微生物"指的是 通过为不具有腐胺生产力的亲本菌株提供腐胺生产力而制备的微生物。提供有腐胺生产力 或生产腐胺的微生物可以是，但不具体限于，具有被用作腐胺生物合成的原料的鸟氨酸的 提高生产力的微生物，其中为了增强从谷氨酸到鸟氨酸的生物合成途径，该微生物被修饰 为具有比内源活性更高活性的转化谷氨酸至乙酰谷氨酸(N-乙酰谷氨酸）的乙酰谷氨酸合 酶或转化乙酰鸟氨酸至鸟氨酸的鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、转化乙酰谷氨酸至乙酰谷氨酰 基磷酸盐(N-乙酰谷氨酰基磷酸盐)的乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、转化乙酰谷氨酰基磷酸盐至 乙酰谷氨酸半醛(N-乙酰谷氨酸半醛)的乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶(ArgC)、或转化乙 酰谷氨酸半醛至乙酰鸟氨酸(N-乙酰鸟氨酸）的乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)。进一步，该 微生物是被修饰为具有比内源活性更弱活性的参与从鸟氨酸合成精氨酸的鸟氨酸氨甲酰 基转移酶（ArgF)、参与谷氨酸分泌的蛋白质（NCgl 1221)、和/或乙酰化腐胺的蛋白质 (NCgl469)的微生物，和/或被修饰为具有鸟氨酸脱羧酶(0DC)活性的微生物。
[0055] 就这一点而言，乙酰基-γ -谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨 酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)、鸟氨酸氨甲 酰基转移酶(ArgF)、参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221)和鸟氨酸脱羧酶(0DC)可以具有， 但是不具体地限于，优选地分别由SEQ ID N0:25、26、27、28、29、30和33表示的氨基酸序列， 或分别具有70%或更多与其同源性，更优选80%或更多与其同源性，或更优选90%或更多 与其同源性的氨基酸序列。此外，乙酰化腐胺的蛋白质(NCgl469)可具有，但是不具体地限 于，优选地由SEQ ID N0:31或32表示的氨基酸序列，或具有70%或更多与其同源性，更优选 80%或更多与其同源性，或更优选90%或更多与其同源性的氨基酸序列。
[0056] 在这些蛋白 质中，乙酰基-γ -谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟 氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)和鸟氨酸 脱羧酶(0DC)的活性的增加可以通过以上描述的增加 NCgl2522活性的方法实现，例如，选自 以下方法的方法:增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达调控序列以增加多核苷 酸的表达、修饰染色体上的多核苷酸序列以增强酶的活性、使抑制酶的多核苷酸表达的调 控因子缺失、和其组合。
[0057]进一步，鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)、参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221)和 乙酰化腐胺的蛋白质(NCgl469)的活性可以通过选自以下的方法减弱：编码该蛋白质的多 核苷酸的部分或全部缺失、修饰表达调控序列用于抑制多核苷酸表达、修饰染色体上的多 核苷酸序列用于减弱蛋白质活性和其组合。
[0058] 具体地，编码蛋白质的多核苷酸的部分或全部缺失可以通过将用于染色体插入的 载体引入微生物，从而利用部分去除的多核苷酸或标记基因替换染色体上编码内源靶蛋白 的多核苷酸而进行。所述"部分"可根据多核苷酸的类型而变化，但是具体指1到300,优选地 1到100，并且更优选地1到50个核苷酸。
[0059] 而且，表达调控序列的修饰可以通过在表达调控序列上通过核苷酸序列的缺失、 插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导修饰以便减弱表达调控序列的活性而进行，或 通过利用具有更弱活性的核苷酸序列置换表达调控序列而进行。该表达调控序列包括启动 子、操纵基因序列、编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。
[0060] 此外，染色体上多核苷酸序列的修饰可以通过在序列上通过多核苷酸序列的缺 失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导突变以便进一步减弱酶活性而进行，或通过 利用被修饰为具有更弱活性的多核苷酸序列置换该序列而进行。
[0061 ]而且，抑制酶的多核苷酸表达的调控因子可以通过利用部分去除的多核苷酸或标 记基因替换表达抑制因子的多核苷酸而缺失。所述"部分"可以根据多核苷酸的类型变化， 但是具体指1到300，优选地1到100，并且更优选地1到50个核苷酸。
[0062]同时，本发明的微生物是具有腐胺生产力的微生物，并包括表达具有由SEQ ID N0:21或23表示的氨基酸序列的蛋白质的原核微生物，并且其实例可包括属于以下菌属的 微生物:埃希氏杆菌属某种、志贺氏杆菌属某种、柠檬酸杆菌属某种、沙门氏菌属某种、肠杆 菌属某种、耶尔森菌属某种、克雷白氏杆菌属某种、欧文氏菌属某种、棒状杆菌属某种、短杆 菌属某种、乳酸菌属某种、月形单胞菌属某种(Se 1 enomanas sp.)、弧菌属某种、假单胞菌属 某种、链霉菌属某种、隐秘杆菌属某种、产碱杆菌属某种等。本发明的微生物优选为属于埃 希氏杆菌属某种的微生物或属于棒状杆菌属某种的微生物，和更优选地，大肠杆菌或谷氨 酸棒状杆菌。
[0063]在本发明的具体的实施方式中，具有登录号KCCM11138P的棒状杆菌属某种微生物 (韩国专利公开号2012-0064046)和具有登录号KCCM11240P的棒状杆菌属某种微生物（韩国 专利申请号2012-0003634)被用作具有从谷氨酸到腐胺的增强的合成途径的菌株，从而以 高浓度生产腐胺。
[0064]在本发明的仍另一实施方式中，使用基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的腐胺生产 菌株--KCCM11138P和KCCM11240P，和具有相同基因型的基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869 的腐胺生产菌株--DAB12-a和DAB12-KATCC13869菌株可以从美国菌种保藏中心(ATCC) 获得。即，对于每个菌株，在给予的ATCC的目录中列出唯一的登录号，并且该菌株可以使用 该登录号订购。具体而言，腐胺生产菌株DAB12-a的特征在于:缺失编码鸟氨酸氨甲酰基转 移酶(ArgF)的基因和编码谷氨酸输出蛋白NCgll221的基因，引入编码鸟氨酸脱羧酶(0CD) 的基因，和由谷氨酸棒状杆菌ATCC13869中的改进的启动子置换鸟氨酸生物合成基因操纵 子(argCJBD)的启动子。进一步，腐胺生产菌株DAB12-b的特征在于，其通过修饰DAB12-a菌 株而制备以具有与内源活性相比减弱活性的乙酰化腐胺的蛋白质(NCgll469)。
[0065]根据一个优选的实例，通过缺失编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的基因和编码 谷氨酸输出蛋白NCgll221的基因，由改进的启动子置换编码参与从谷氨酸合成鸟氨酸的酶 的ArgCJBD基因簇的自身启动子，和将编码鸟氨酸脱羧酶(0DC)的基因引入野生型谷氨酸棒 状杆菌ATCC13032中的染色体而制备谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，并且通过另外地使在微 生物中编码乙酰转移酶NCgll469的基因减弱而制备的谷氨酸棒状杆菌KCCM11240P被制备 为腐胺生产菌株。
[0066]同时，为了制备衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522缺失菌株，基于衍生 自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522的氨基酸序列，制备质粒pDZ-ΓNCgl2522(K/0)。
[0067] 将质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)转化入制备的腐胺生产菌株KCCM11138P和 KCCM11240P内，并选择作为NCgl2522缺失菌株，并且这些菌株分别命名为KCCM11138P Δ NCgl2522和KCCM11240P ANCgl2522。以相同的方式，制备衍生自谷氨酸棒状杆菌 ATCC13869的NCgl2522缺失菌株并命名为DAB12-a Δ NCgl2522和DAB12-b Δ NCgl2522。
[0068] 将如此制备的4种类型的NCgl2522缺失的菌株的腐胺生产力与亲本菌株的腐胺生 产力进行比较，结果，与亲本菌株相比，所有NCgl2522缺失的KCCM11138P ANCgl2522、 KCCM11240P Δ NCgl2522、DAB12-a Δ NCgl2522和DAB12-b Δ NCgl2522中的腐胺生产力 降低(参见表3)。基于此结果，本发明人确认腐胺生产菌株中NCgl2522活性与腐胺生产力密 切相关，并且为了通过增强活性增加腐胺生产力，他们制备了NCgl2522增强菌株。
[0069] 为此，在本发明的一个优选的实例中，NCgl2522被另外地引入到谷氨酸棒状杆菌 菌株的转座子内，或者染色体内的自身NCgl2522启动子被由本发明人最近开发的CJ7启动 子(KCCM10617,韩国专利号10-0620092)置换。
[0070] 将如此制备的6种类型的NCgl2522增强菌株的腐胺生产力与亲本菌株的腐胺生产 力进行比较，结果，与亲本菌株相比，通过将NCgl2522另外引入到转座子内制备的所有菌株 的腐胺生产力增加(参见表6)。在显示腐胺生产力提高的NCgl2522增强菌株中测量细胞内 腐胺浓度，结果，与亲本菌株相比，它们显示细胞内腐胺浓度的降低(参见表9)。基于这些结 果，本发明人确认细胞内生产的腐胺的细胞外输出通过增强腐胺生产菌株中的NCgl2522活 性而增加，从而提高腐胺生产力。
[0071] 因此，具有增强的腐胺生产力一一其中腐胺生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P 被修饰为与内源活性相比，具有增强的NCgl2522活性，并因此显示增强的输出腐胺的能 力--的棒状杆菌属某种微生物命名为谷氨酸棒状杆菌CC01-0510,并在2013年3月8日依 照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11401P。
[0072] 根据本发明的另一方面，本发明提供了生产腐胺的方法，包括以下步骤：
[0073] (i)培养具有腐胺生产力的微生物以获得细胞培养物;和
[0074] (ii)从培养的微生物或细胞培养物回收腐胺。
[0075]在该方法中，培养微生物的步骤可以，但是不具体地限于，优选地通过本领域已知 的分批培养、连续培养和补料分批培养进行。就这一点而言，培养条件不具体地限制，但是 最佳的pH(例如，pH 5到9,优选地pH 6到8,和最优选地pH 6.8)可以通过使用碱性化学品 (例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化学品（例如，磷酸或硫酸)保持。而且，需氧条件可 以通过将氧或含氧气体混合物加入到细胞培养物保持。培养温度可以保持在20到45°C，并 优选地在25到40°C。此外，培养优选地进行大约10到160小时。通过以上培养产生的腐胺可 排出至培养基或保留在细胞内。
[0076] 而且，待使用的培养基可包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦 芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素）、油脂（例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油）、脂肪酸（例 如，软脂酸、硬脂酸和亚油酸）、醇（例如，丙三醇和乙醇）和有机酸（例如，乙酸）单独地或结 合作为碳源;含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米溶液、大 豆粉和尿素）、或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)单独地或结 合作为氮源;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其相应的含钠盐单独地或结合作为磷源;其它必 需的生长刺激物质包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁）、氨基酸和维生素。
[0077] 回收在本发明的培养步骤中生产的腐胺的方法可以，例如，根据分批培养、连续培 养或补料分批培养使用本领域中已知的合适方法执行，从而从培养物中收集期望的氨基 酸。
[0078] 在下文中，将参考实施例更详细的描述本发明。然而，这些实施例仅是说明性的目 的，并且本发明不意欲由这些实施例限制。
[0079]参考实施例1:制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物
[0080] 为了制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物，阻断自鸟氨酸的精氨酸生物 合成途径，增强自谷氨酸的鸟氨酸生物合成途径，并且引入外来的鸟氨酸脱羧酶(0CD)以制 备提供有腐胺生产力的微生物，如韩国专利公开号10-2012-0064046中描述的。
[0081] 具体而言，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032,将菌株染色体中编码鸟氨酸氨甲酰基 转移酶(ArgF)的基因和编码NCgll221--其是参与谷氨酸输出的蛋白质一一的基因通过 同源重组缺失，从而增加为鸟氨酸前体的谷氨酸的细胞内含量。进一步，将衍生自野生型大 肠杆菌W3110的编码鸟氨酸脱羧酶(0DC)-一其参与从鸟氨酸合成腐胺一一的基因引入菌 株的染色体中。此外，编码参与从谷氨酸合成鸟氨酸的酶的argCJBD基因簇的自身启动子由 改进的启动子CJ7启动子置换以制备具有腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株。此时， argCJBD编码乙酰基-γ -谷氨酰基磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移 酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)，其参与自谷氨酸的鸟氨 酸生物合成途径。如此制备的具有腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株在2010年11月24日依 照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11138P。关于具有腐胺 生产力的棒状杆菌属某种微生物的制备的详细描述在韩国专利公开号10-2012-0064046中 描述，其公开内容以其全部通过引用并入。
[0082]参考实施例2:制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物 [0083]编码参考实施例1中制备的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P中的乙酰转移酶NCgl 1469 的基因被减弱以不产生N-乙酰基腐胺，从而制备具有提高的腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌 菌株为另一种具 有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物。
[0084] 具体而言，基于编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgll469的基因的核苷酸序列， 用于获得NCgll469的N-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:1和2的引物对和用于获得 NCgll469的C-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:3和4的引物对如下表1构建。
[0085] [表1]
[0086]
[0087]使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和两个引物对进行PCR，从 而分别获得N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。将这些PCR片段电泳以获得期望的片段。 此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒、55°C下退火30秒和72°C下延伸30秒。如此获 得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sail处理，并且如此获得的C-末端区域的 片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶BamHI和 Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-NCgll469(K/0)。
[0088] 将质粒pDZ-NCgl 1469 (K/0)通过电穿孔转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P内以获 得转化体。然后，将该转化体铺板(plate)并在包含卡那霉素（25μg/ml)和X-gal (5-溴-4-氯-3-二氢吲哚-D-半乳糖苷）的BHIS平板(37g/l Braine心浸液，91g/l山梨醇，2%琼脂)上 培养，用于菌落形成。从平板上形成的菌落，选择蓝色菌落作为引入有质粒pDZ-NCgll469 (K/0)的菌株。
[0089]将选择的菌株接种在CM培养基（10g/l葡萄糖，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l 牛肉膏，2.5g/l NaCl，2g/l尿素 ，pH 6.8)中在30°C下摇动培养8小时。随后，将每个细胞培 养物从10-4连续地稀释到ΙΟ#。然后，将稀释的样品铺板并在包含X-gal的固体培养基上培 养，用于菌落形成。
[0090]从形成的菌落，选择以相对低频率出现的白色菌落以制备通过缺失编码NCgl 1469 的基因而具有提尚的腐胺生广力的谷氣酸棒状杆菌菌株。如此制备的具有提尚的腐胺生广 力的谷氨酸棒状杆菌菌株被命名为KCCM11138P Δ NCgl 1469并且在2011年12月26日依照布 达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11240P。关于具有腐胺生产 力的棒状杆菌属某种微生物的制备的详细描述在韩国专利申请号10-2012-0003634中给 出，其公开内容以其全部通过引用并入。
[0091] 实施例1:腐胺输出蛋白的探查和具有腐胺抗性的文库克隆的选择
[0092] 谷氨酸棒状杆菌不具有腐胺生物合成途径。然而，当将外部鸟氨酸脱羧酶引入谷 氨酸棒状杆菌以具有生产腐胺的能力时，它产生和细胞外地分泌腐胺。这表明在棒状杆菌 属某种微生物的许多膜蛋白之中起腐胺通道作用的运载体的存在。
[0093] 为了从棒状杆菌属某种微生物分离和隔离腐胺输出蛋白，制备野生型谷氨酸棒状 杆菌ATCC13032的染色体文库。具体而言，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体用限制性内 切酶Sau3AI处理，进行不完全切割。分离3~5kb的基因片段，并将其克隆入用BamHI处理的 PECCG122载体(大肠杆菌和棒状杆菌属的穿梭载体;韩国专利公开号10-1992-0000933)。 [0094]将如此获得的棒状杆菌染色体文库转化入腐胺生产菌株一一根据参考实施例1的 谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，然后选择在0.35M包含腐胺的基本培养基(在1升蒸馏水的基 础上，其包含l〇g葡萄糖，〇.4g MgS〇4.7H20,4g NH4Cl，lg KH2P〇4，lg K2HP〇4,2g尿素，10mg FeS〇4 · 7H2〇，lmg MnS〇4 · 5H2〇,5mg烟酰胺，5mg盐酸硫胺素，O.lmg生物素，ImM精氨酸，25mg 卡那霉素，0.35M腐胺，pH 7.0)中生长的菌株。从引入有棒状杆菌染色体文库的大约5.5 X 1〇5种转化体，选择413个菌落，然后每个文库克隆--其腐胺抗性也通过二次检测确 定一一被重新引入腐胺生产菌株。最终，选择一个克隆(B19)，其腐胺抗性通过三次检测确 定。使该克隆经受核苷酸序列分析。结果，发现在B19克隆中具有NCgl2522(图1)。
[0095]从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中作为腐胺输出蛋白分离的NCgl2522具有由SEQ ID N0:21表示的氨基酸序列，其由具有由SEQ ID N0:20表示的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0096] 实施例2:NCgl2522缺失菌株的制备和其腐胺生产力的检测
[0097] 〈2-1>从基于ATCC13032的腐胺生产菌株制备NCgl2522缺失菌株
[0098]为了检测谷氨酸棒状杆菌ATCC13032衍生的NCgl2522是否参与腐胺输出，构建缺 失编码NCgl2522的基因的载体。
[0099] 具体而言，基于编码NCgll469的基因的核苷酸序列--其由SEQ ID N0:20表示， 用于获得NCgll469的N-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:5和6的引物对和用于获得 NCgll469的C-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:7和8的引物对如下表2中构建。
[0100][表 2]
[0101]
[0102] 使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和两个引物对进行PCR，从 而扩增NCgl2522基因的N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。电泳这些PCR片段以获得期望 的片段。此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸30 秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sa 11处理，和如此获得的C-末端 区域的片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶 BamHI和Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)。
[0103] 将质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)通过电穿孔分别转化入参考实施例1和2的谷氨酸棒 状杆菌KCCM11138P和KCCM11240P中，从而获得转化体。然后，将该转化体铺板并在包含卡那 霉素（25μg/ml)和X-gal (5-溴-4-氯-3-二氢吲哚-D-半乳糖苷）的BHIS平板(37g/l Braine 心浸液，91g/l山梨醇，2%琼脂)上培养，用于菌落形成。从平板上形成的菌落，选择蓝色菌 落作为引入有质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)的菌株。
[0104]将选择的菌株在CM培养基（10g/l葡萄糖，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l牛肉 膏，2.5g/l NaCl，2g/l尿素 ，pH 6.8)中在30°C下摇动培养8小时。随后，将每个细胞培养物 从10-4连续地稀释到10-1()。然后，将稀释的样品铺板并在包含X-gal的固体培养基上培养，用 于菌落形成。从形成的菌落，选择以相对低频率出现的白色菌落以最终获得菌株，在该菌株 中编码NCgl2522的基因通过二次交换缺失。最终选择的菌株使用SEQ ID N0:5和8的引物对 经历PCR以确定编码NCgl2522的基因的缺失。谷氨酸棒状杆菌突变菌株分别被命名为 KCCM11138P ANCgl2522和KCCM11240P ANCgl2522。
[0105] 〈2-2>从基于ATCC13869的腐胺生产菌株制备NCgl2522缺失菌株
[0106] NCgl2522缺失菌株从基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的腐胺生产菌株制备，所述 菌株为具有与KCCM11138P和KCCM11240P相同基因型的DAB12-a(argF缺失，NCgll221缺失， 大肠杆菌speC引入，arg操纵子启动子替换；参见参考实施例1)和DAB12-b(argF缺失， NCgll221缺失，大肠杆菌speC引入，arg操纵子启动子替换，NCgll469缺失，参见参考实施例 2)，KCCM11138P和KCCM11240P为基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的腐胺生产菌株。
[0107]具体而言，为了检测编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因序列 和由其表达的蛋白质，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板和SEQ ID N0: 5和8的引物对进行PCR。此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和 72°C下延伸2分钟。将如此获得的PCR产物通过电泳分离，并进行测序。结果，发现编码谷氨 酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因的核苷酸序列由SEQIDN0 :22表示，和由此 编码的蛋白质的氨基酸序列由SEQ ID N0:23表示。当谷氨酸棒状杆菌ATCC13032衍生的 NCgl2522的氨基酸序列与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的氨基酸序列相比较 时，发现它们具有98%的序列同源性。
[0108] 为了缺失编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因，以与实施例Οι〉 相同的方式，使用谷氨酸棒状杆菌 ATCC13869 的基因组 DNA 作为模板和表 2 的两个引物对 进行PCR，从而分别扩增NCgl2522基因的Ν-末端区域和C-末端区域的PCR片段。将这些PCR片 段电泳以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环：95°C下变性30秒，55°C下退火30 秒，和72°C下延伸30秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sail处理， 并且如此获得的C-末端区域的片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克 隆入用限制性内切酶BamHI和Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-2 ' NCgl2522(K/0)。
[0109] 以与实施例〈2-1>中相同的方式，将质粒pDZ-2'NCgl2522(K/0)分别转化入谷氨酸 棒状杆菌DAB12-a和DAB12-b。选择其中编码NCgl2522的基因被缺失的菌株。如此选择的谷 氨酸棒状杆菌突变菌株分别被命名为DAB12-a ANCgl2522和DAB12-b ANCgl2522。
[0110] <2-3>NCgl2522缺失菌株的腐胺生产力的评估
[0111] 为了确定腐胺生产菌株中NCgl2522缺失对腐胺生产力的影响，将实施例〈2-1>和〈 2-2>中制备的谷氨酸棒状杆菌突变菌株的腐胺生产力进行比较。
[0112] 具体而言，将4种类型的谷氨酸棒状杆菌突变体（KCCM11138P ANCgl2522、 KCCM11240P ANCgl2522、DAB12-a ANCgl2522和DAB12-b ANCgl2522)和4种类型的亲本 菌株(1(01111138?、1(01111240?、04812-3和04812-13)分别在包含11111精氨酸的01平板培养基 (1升基础上，1%葡萄糖，1%聚胨，0.5%酵母提取物，0.5%牛肉膏，0.25%NaCl，0.2%尿 素 ，100μΙ 50%Na0H，2%琼脂，pH 6.8)上铺板，并在30°(3下培养24小时。将1个接种环 (platinum loop)的如此培养的每种菌株接种在25ml效价培养基（1升基础上，8%葡萄糖 ， 0.25%大豆蛋白，0.50%固体玉米浆，4%(冊4)2304,0.1%1(!12?04,0.05%]\^504.7!120， 0.15%尿素，100〖生物素，311^盐酸硫胺素，311^泛酸| 15,311^烟酰胺，5%〇3(1)3)中，然后在30 °C^P200rpm下摇动培养98小时。将ImM精氨酸加入到培养基中，用于培养所有菌株。测量每 个培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表3中显示。
[0113] [表 3]
[0114]
[0115] 如表3中所示，在4种类型的NCgl2522缺失的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中观察到腐 胺产量的显著降低。
[0116] 实施例3:NCgl2522增强菌株的制备和其腐胺生产力的检测
[0117] 〈3-1>将NCgl2522引入到ATCC13032染色体中的转座子基因中
[0118] 为了确认通过具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物KCCM111 38P中的 NCgl2522基因（包含自身启动子区域)的另外的染色体插入引起腐胺的高产，将NCgl2522引 入到转座子基因。使用用于转化的载体pDZTn(韩国专利公开号10-2008-0033054)，其允许 将基因引入使用的棒状杆菌属某种微生物的染色体上的转座子基因。
[0119] 包含自身启动子的NCgl2522基因使用ATCC13032菌株的染色体作为模板以及SEQ ID N0:9和10的引物对进行扩增(表4)。此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒，55°C 下退火30秒，和72°C下延伸30秒或2分钟。通过PCR，获得具有1.88kb大小的基因片段。将该 PCR产物在0.8 %琼脂糖凝胶中电泳以洗脱和纯化期望大小的带。pDZTn载体用Xho I处理，并 进行ATCC13032菌株的NCgl2522PCR产物的融合克隆。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。得到的质粒命名为pDZTn-l'NCgl2522。
[0120] [表 4]
[0121]
[0122] 将质粒pDZTn-Γ NCgl2522通过电穿孔转化入参考实施例1中描述的谷氨酸棒状杆 菌KCCM11138P中以获得转化体。从转化体，以与实施例2中相同的方式选择其中NCgl 2522被 引入转座子的菌株。
[0123] 使用选择的菌株的基因组DNA和SEQ ID N0:9和10的引物对进行PCR，从而确认 NCgl2522通过引入质粒pDZTn-l'NCgl2522被引入到转座子中。此时，进行PCR反应30个循 环:94°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸2分钟。
[0124] 如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为KCCM11138P Tn:l'NCgl2522。
[0125] 〈3-2>从基于ATCC13032的腐胺生产菌株制备NCgl2522启动子替换的菌株
[0126] 为了增强腐胺生产菌株中NCgl2522活性，在染色体上NCgl2522起始密码子前面引 入CJ7启动子(W0 2006/65095)。
[0127] 首先，获得包含在启动子两端具有由SEQ ID N0: 24表示的核苷酸序列和具有原始 NCgl2522序列的CJ7启动子的同源重组片段。具体而言，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的 基因组DNA作为模板和SEQ ID NO: 11和12的引物对进行PCR以获得CJ7启动子的5 ' -末端区 域。此时，进行PCR反应30个循环:94°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸30秒。进 一步，在相同的条件下使用SEQ ID N0:13和14的引物对进行PCR以获得CJ7启动子区域。此 外，在相同的条件下使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组作为模板和SEQIDN0 :15和 16的引物对进行PCR以获得CJ7启动子的3'-末端区域。启动子替换中使用的引物与下面的 表5中的相同。
[0128] [表 5]
[0129]
[0130]将如此获得的每种PCR产物融合-克隆入用BamHI和Xbal处理的pDZ载体。在融合克 隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。所得质粒命名为pDZ_P(CJ7)_l' NCgl2522〇
[0131] 将如此制备的质粒pDZ-P(CJ7)-l'NCgl2522通过电穿孔转化入根据参考实施例1 和2的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P和KCCM11240P从而制备转化体。将如此制备的转化体接 种在CM培养基中并且在30°C下摇动培养8小时。将由此获得的每个细胞培养物从ΚΓ 4稀释到 10 一1()，并在包含25μg/ml卡那霉素和X-gal的BHIS平板上铺板和培养，用于菌落形成。
[0132] 与大多数具有蓝色的菌落相比，白色菌落以相对低频率出现，并且选择其以最终 获得菌株，在该菌株中NCgl2522启动子用CJ7启动子通过二次交换替换。使用选择的菌株的 基因组DNA作为模板和SEQ ID勵:13和16的引物对进行?〇?以确定通过引入质粒?02-1'(^7 (NCgl2522)将CJ7启动子引入到染色体上的NCgl2522起始密码子的前面。此时，进行PCR反 应30个循环:94°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸1分钟。
[0133] 如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株分别命名为KCCM11138P P(CJ7)-NCgl2522 和KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522。
[0134] 〈3-3>将NCgl2522基因引入ATCC13869染色体上的转座子基因中
[0135] 为了确认通过谷氨酸棒状杆菌微生物ATCC13869衍生的腐胺菌株中NCgl2522基因 的另外的染色体插入引起腐胺的高产，确定将NCgl2522(包含启动子区域）引入到转座子基 因。使用ATCC13869菌株的染色体作为模板和SEQ ID ^):17和10的引物对(参见表16)扩增 NCgl2522基因。此时，进行PCR反应30个循环:94°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下 延伸30秒或2分钟。通过PCR，获得具有1.97kb大小的基因片段。将如此制备的NCgl2522PCR 片段融合-克隆入用Xhol处理的pDZTn载体。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit (Clontech)。所得质粒命名为 pDZTn-2'NCgl2522。
[0136] [表 6]
[0137]
[0138] 以与实施例〈3-1>相同的方式将质粒pDZTn-2'NCgl2522转化入谷氨酸棒状杆菌 DAB12-a以确定NCgl2522引入转座子。
[0139] 如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为DAB12-a Tn:2'NCgl2522。
[0140] 〈3-4>从基于ATCC13869的腐胺生产菌株制备NCgl2522启动子替换的菌株
[0141] 为了在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl2522起始密码子前面引入CJ7启动子，使 用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板和下面表7中给出的三个引物对以与实 施例〈3-2>中相同的方式分别进行PCR。结果，CJ7启动子区域、其N-末端区域和C-末端区域 的PCR片段被扩增然后电泳以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环:94°C下变性30 秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸30秒。将如此获得的CJ7启动子区域、其N-末端区域和C-末端区域的PCR片段融合-克隆入用BamHI和Xbal处理的pDZ载体。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。所得的质粒命名为pDZ-P(CJ7)-2'NCgl2522。
[0142] [表 7]
[0143]
[0144] 以与实施例〈3-2>中相同的方式将质粒pDZ-'P(CJ7)-2'NCgl2522转化入谷氨酸棒 状杆菌DAB12-a和DAB12-b的每个中以选择菌株，在该菌株中将CJ7启动子引入NCgl2522起 始密码子的前面。如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522 和DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522。
[0145] <3-5>NCgl2522增强菌株的腐胺生产力的评估
[0146] 为了确定在腐胺生产菌株中通过启动子替换NCgl 2522活性增强对腐胺生产力的 影响，将实施例〈3_1>到〈3-4>中制备的6种类型的谷氨酸棒状杆菌突变菌株(KCCM11138P Tn:l'NCgl2522、KCCM11138P P(CJ7)-NCgl2522、KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522、DAB12-a Tn:2'NCgl2522、DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522和DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522)和4种类型的亲 本菌株(1(01111138?、1(01111240?、04812-3和04812-13)的腐胺生产力进行比较。将每种菌株 以与实施例2-3中相同的方式培养，并且测量每种培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表8 中显示。
[0147] [表 8]
[0148]
[0149]如表8中所显示的，在其中NCgl2522活性通过将NCgl2522另外的引入到转座子或 通过启动子替换而增强的所有6种类型的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中观察到腐胺产量的增 加。
[0150] 实施例4:NCgl2522增强菌株的细胞内腐胺浓度的测量
[0151] 为了确认在具有增强的NCgl2522活性的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中细胞内腐胺 浓度通过增强的输出腐胺的能力而降低，将谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Τη:1' NCgl2522和亲本菌株KCCM11138P中的细胞内腐胺浓度通过使用有机溶剂提取进行测量。细 胞内代谢物分析根据文献（Nakamura J等，Appl .Environ.Microbiol .73(14) :4491-4498, 2007)中描述的方法进行。
[0152] 首先，将谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn: l'NCgl2522和亲本菌株 KCCM11138P接种在包含ImM精氨酸的25ml的CM液体培养基(在1升的基础上，1 %葡萄糖，1 % 聚胨，0.5%酵母提取物，0.5%牛肉膏，0.25%恥(：1，0.2%尿素，10(^150%恥0!14!16.8，） 中，并在30°C和200rpm下摇动培养。当细胞生长在培养期间达到指数期时，将细胞从培养基 中通过快速真空过滤（Durapore HV，0 ·45μηι;Μ;?1 lipore，Bill erica，MA)分离。将吸附细胞 的过滤器用l〇ml冷水洗涤两次，然后在包含5M吗啉乙磺酸和5M蛋氨酸砜的乙醇中浸泡10分 钟。
[0153] 将由此获得的提取液与等体积的氯仿和0.4倍体积的水混合均匀，并且仅将水相 施加于吸附柱(spin column)以去除蛋白污染物。通过毛细管电泳质谱分析过滤的提取液， 结果在下面的表9中显示。
[0154] [表 9]
[0155] _
[0156] 如表9中所显示的，与亲本菌株KCCM1 1138P相比，在具有增强的NCgl2522活性的谷 氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn:l'NCgl2522中观察到细胞内腐胺浓度的降低。这表 明通过谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn: l'NCgl2522中NCgl2522活性的增强引起 的提高的输出腐胺的能力导致细胞内腐胺的有效的细胞外输出。
[0157] 实施例5:NCgl2522缺失或增强菌株的腐胺抗性的评估
[0158] 为了检测NCgl2522对腐胺抗性的影响，评估了KCCM11240P、KCCM11240P Λ NCgl2522和KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522菌株的腐胺抗性。
[0159] 将每种菌株接种在包含ImM精氨酸的2ml的CM液体培养基中并在30°C下培养大约 10小时，然后以1〇5、1〇 4、1〇3、1〇2和1〇1的顺序进行稀释。将如此制备的每种稀释物在包含冊 或0.8M腐胺的CMA平板(在1升基础上，1 %葡萄糖，1 %聚胨，0.5 %酵母提取物，0.5 %牛肉 膏，0.25%NaCl，0.2%尿素，1.8%琼脂，ImM精氨酸，pH 6.8)上点样（8?〇〇，并在30°(3下培 养48小时以比较菌株之间的生长差异。
[0160]结果，菌株显示两种不同的生长模式。如图2中所显示的，NCgl2522基因缺失菌株 在高浓度腐胺的条件下不生长，而NCgl2522基因增强菌株在相同条件下生长。该结果显示， 与亲本菌株相比，在高浓度腐胺的条件下KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522的细胞生长增加是 由增加的输出腐胺的能力--其由于NCgl2522基因的增强--引起的。结果，NCgl2522的 引入和增强对于高浓度腐胺的发酵是必需的。
[0161] 实施例6:通过将NCgl2522引入大肠杆菌中的腐胺发酵
[0162] 为了确定当谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522在具有腐胺生物合成途径的野 生型大肠杆菌菌株W3110中表达时，腐胺产量是否增加，将表达speC--其为腐胺合成 酶--的载体或表达NCgl2522的载体引入W3110。
[0163] 为了制备表达speC的载体，使用W3110染色体作为模板和SEQ ID N0:34和35的引 物对扩增大约2. lkb的speC基因片段(参见表10)。该PCR产物在0.8 %琼脂糖凝胶中电泳，然 后将期望大小的带洗脱并纯化。包含Trc启动子的pSE280载体（Invitrogen)用Ncol和EcoRI 处理，然后将speC PCR产物融合-克隆入该载体内。在融合克隆中使用In-Fusion?HD Cloning Kit(Clontech)。所得质粒命名为pSE280_speC〇
[0164] 为了制备表达NCgl2522的载体，使用pSE280作为模板和SEQIDN0:36和37的引物 对获得Trc启动子片段，并且使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032染色体作为模板和SEQ ID NO: 38和39的引物对获得NCgl2522片段。这些PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，然后将期望 大小的带洗脱并纯化。将Trc启动子片段和NCgl2522片段融合-克隆入用Hindlll处理的 pcclBAC中。所得质粒命名为pcclBAC-P(trc)-NCgl2522。
[0165] [表 10]
[0166]
[0167] 将质粒 pSE280-speC 或 pcclBAC-P(trc)-NCgl2522转化入 W3110。使用 2XTSS 溶液 (Epicentre)进行转化入大肠杆菌。将引入pSE280-speC的大肠杆菌铺板并在包含氨节青霉 素（100μg/ml)的LB平板(在1升基础上，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g Nacl，2%琼脂)上 培养，用于菌落形成。将引入pcclBAC-P(trc)-NCgl2522的大肠杆菌铺板并在包含氯霉素 (35μg/ml)的LB平板上培养，用于菌落形成。检测如此获得的菌株的腐胺生产力。
[0168] 具体而言，将W3110、W3110pSE280-speC和W3110pcclBAC-P(trc)-NCgl2522分别接 种在LB、LA和LC平板上并在37°C培养24小时，然后接种在25ml效价培养基(在1升基础上，2g (NH4) 2P〇4,6.75g KH2P〇4,0.85g柠檬酸，0.7g MgS〇4 · 7Η20,0·5%(v/v)痕量元素，10g葡萄 糖，3g AMS，30g CaC03)中并在37°C下培养24小时。1L痕量金属溶液包含5M HCl、10g FeS〇4 · 7H20、2.25g ZnS〇4 · 7H20、lg CuS〇4 · 5H20、0.5g MnS〇4 · 5H20、0.23g Na2B4〇7 · 10H20、2g CaCl2 · 2H20和0.1g(NH4)6M〇7〇2 · 4H20。
[0169] 测量每个培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表11中显示。
[0170] [表 11]
[0171]
[0172] 如表11中所显示的，与引入有腐胺生物合成酶speC的W3110pcclBAC-pSE280-speC 相比，在引入有NCgl2522的W3110pcclBAC-P(trc)-NCgl2522中观察到高腐胺产量。
[0173]该结果表明NCgl2522蛋白在大肠杆菌中也具有输出腐胺的能力。
[0174]本发明人发现进行将NCgl2522另外引入具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生 物KCCM11138P的转座子中以增强谷氨酸棒状杆菌菌株的NCgl2522活性，并因此腐胺可以以 高产率生产，这归因于增加的输出腐胺的能力，并且他们命名该菌株为谷氨酸棒状杆菌 CC01-0510,并且在2013年3月8日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登 录号为 KCCM11401P。
[0175] 基于以上描述，本领域技术人员应当理解，其它具体的实施方式可以用于实践本 发明而不背离本发明的技术理念或基本特征。就这一点而言，以上描述的实施例仅用于说 明性目的，并且本发明不意欲被这些实施例所限制。本发明的范围应当理解为包含源自权 利要求书或其等价概念一一而不是以上详细描述一一的意义和范围的所有变形或修改形 式。
[0176] 本发明的效果
[0177] 具有本发明的提高的腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物被修饰以与其内源活 性相比，具有增强的输出细胞内腐胺的NCgl2522活性，这导致增加的腐胺的细胞外输出和 增加的腐胺抗性。
[0178] 进一步，当NCgl2522在包含本发明的腐胺合成途径的大肠杆菌中表达时，发现细 胞外腐胺的量增加。因此，谷氨酸棒状杆菌衍生的NCgl2522可应用至具有腐胺生产力的微 生物，其可以用于有效生产腐胺。
[0179] 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0180] 原始保藏接收证明
[0181 ]由国际保藏机构根据第7.1条发出
[0182]至:CJ第一制糖株式会社
[0183]大韩民国首尔市中区南大门路5街500号
[0184]
12345678910 _ 2 证明上述翻译与原文无误 3 2013年 3 月20 日 4 专利代理人Son Min印 5 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约 6
[0190]原始保藏接收证明 7
[0191]由国际保藏机构根据第7.1条发出 8 至:CJ第一制糖株式会社 9 大韩民国首尔市中区双林洞292号 10 斯玛特普雷克斯(CJ中心）
[0195]
[0196]
[0197] 证明上述翻译与原文无误
[0198] 2013年 3 月20 日
[0199] 专利代理人Son Min印
[0200] 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0201] 原始保藏接收证明
[0202] 由国际保藏机构根据第7.1条发出 [0203]至:CJ第一制糖株式会社
[0204]大韩民国首尔市中区东湖路330号 [0205] CJ第一制糖中心邮政编号100-400
[0206]
[0207]
[0208] 证明上述翻译与原文无误
[0209] 2013年 3 月20 日
[0210] 专利代理人Son Min印
【主权项】
1. 具有腐胺生产力的微生物，其被修饰为具有增强的蛋白质活性，所述蛋白质具有由 SEQIDNO:21或23表示的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物进一步被修饰为 与内源活性相比，具有减弱活性的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和参与谷氨酸输出的蛋白 质(NCgll221)，并被修饰为具有增强的鸟氨酸脱羧酶(0DC)活性。3. 根据权利要求2所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述鸟氨酸氨甲酰基转移酶 (ArgF)具有由SEQIDN0:29表示的氨基酸序列，所述参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221) 具有由SEQIDN0:30表示的氨基酸序列，和所述鸟氨酸脱羧酶(0DC)具有由SEQIDN0:33 表示的氨基酸序列。4. 根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物进一步被修饰为 与内源活性相比，具有增强活性的乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合 酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)。5. 根据权利要求4所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述乙酰基-γ-谷氨酰基-磷 酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和 乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)分别具有由SEQIDN0:25、26、27和28表示的氨基酸序列。6. 根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物的乙酰转移酶 (NCgll469)活性进一步被减弱。7. 根据权利要求6所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述乙酰转移酶(NCgll469) 具有由SEQIDNO:31或32表示的氨基酸序列。8. 根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物是埃希氏杆菌属 某种或棒状杆菌属某种。9. 根据权利要求8所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌或谷 氨酸棒状杆菌。10. 生产腐胺的方法，包括以下步骤： (i)培养具有权利要求1到9中任一项的具有腐胺生产力的微生物以获得细胞培养物； 和 (ii)从所述培养的微生物或所述细胞培养物回收腐胺。
【专利摘要】本发明涉及以高产率生产腐胺的重组微生物和使用该微生物生产腐胺的方法，其中在微生物中NCgl2522活性增加，所述微生物以使得腐胺生产是可能的方式被修饰。KCCM11138P20101124
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/52
【公开号】CN105492593
【申请号】CN201480017057
【发明人】李京珉, 郑熙景, 梁荣烈, 严惠媛, 金昌谦, 李红仙, 朴寿真, 尹钟铉, 李白硕, 李善英
【申请人】Cj第一制糖株式会社
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年2月25日
【公告号】EP2977443A1, WO2014148743A1
【专利说明】用于腐胺生产的重组微生物和使用其生产腐胺的方法
【背景技术】
[0001] 1.发明领域
[0002] 本发明涉及具有改进的腐胺生产力的重组微生物和使用其以高产率生产腐胺的 方法。
[0003] 2.相关技术的描述
[0004] 多胺比如亚精胺、精胺等等存在于大多数活细胞中，并且腐胺（或1，4_丁二胺）用 作亚精胺和精胺代谢中的前体。腐胺在革兰氏阴性菌或真菌中发现，并且其在各种物种中 以高浓度存在，这表明其在微生物的代谢途径中具有重要作用。
[0005] -般而言，腐胺是聚胺尼龙_4、6-一其通过与己二酸反应产生一一合成中的重要 原料。腐胺主要通过自丙烯通过丙烯腈和琥珀腈的化学合成产生。该化学合成是三步法，其 包括催化氧化反应、使用氰化物化合物的反应和使用高压氢的加氢反应。因为该化学合成 不是环境友好的并且也消耗大量的能量，导致石油耗竭，所以存在问题。因此，需要开发涉 及生物质利用的更环境友好的和能量有效的方法用于腐胺生产。
[0006] 在微生物体内，腐胺的生物合成途径与从谷氨酸到鸟氨酸合成的精氨酸合成路线 相同。腐胺可以自微生物通过两条途径生物合成。在一条途径中，作为中间体的鸟氨酸脱羧 基以合成腐胺。在另一条途径中，通过自鸟氨酸合成的精氨酸脱羧反应产生胍基丁胺，然后 自胍基丁胺合成腐胺(Morris等，J Biol.Chem.241:13,3129-3135,1996)。这两条途径产生 代谢所需要的能量或者使细胞具有对氧化应激的抗性。
[0007] 作为使用微生物生产腐胺的方法，通过转化大肠杆菌和棒状杆菌以高浓度生产腐 胺的方法已经被报道（国际专利公开号W006/005603;国际专利公开号W009/125924;Qian ZD等，Biotechnol.Bioeng.104:4,651-662，2009;Schneider等， Appl .Microbiol · Biotechnol · 88 : 4，859-868，2010;Schneider等， Appl .Microbiol .Biotechnol ·91:17-30，2011)。例如，W009/125924公开了通过增强鸟氨酸 生物合成途径而不是失活参与在大肠杆菌中存在的腐胺的降解和利用的途径和失活作为 腐胺的前体的鸟氨酸到精氨酸的转化，来以高产率生产腐胺的方法。此外，Schneider (2010)公开了通过将能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质引入不具有腐胺生产力的棒状杆菌 属某种菌株和增强能够转化鸟氨酸至腐胺的蛋白质进入不具有腐胺生产力的棒状杆菌属 某种菌株，以高浓度生产腐胺的方法。
[0008] 而且，对在大肠杆菌、酵母、植物和动物细胞中腐胺运载体的研究已经积极地进行 (K Igarashi，Plant Physiol .Biochem. 48: 506-512,2010)。大肠杆菌的腐胺摄取经由4种 途径发生；由ATP水解作用驱动的potABCD或potFGHI，和作为H+同向转运体（symporter)的 potE和puu途径的puuP。关于参与腐胺摄取的这些复合体的Km值，PotFGHI、potAB⑶、potE和 puuP的Km值分别为0.5mM、1.5mM、1.8mM和3.7mM。在这四种腐胺摄取途径中，potFGHI复合体 被认为是最合适的。此外，P〇tE运载体具有摄取和分泌腐胺二者的功能。腐胺在中性pH下与 质子一起被输入细胞中。然而，由于腐胺合酶(speF)在酸性pH条件下表达，所以细胞外鸟氨 酸的细胞内摄取和在细胞内合成的腐胺的细胞外分泌同时发生（K u r i h a r a等， J.Bacteriology 191:8,2776-2782,2009)〇
[0009] 酵母中已知的腐胺输出蛋白（exporter)是TP01和TP04。这些氨基酸序列与芽孢杆 菌多药运载体Bit的氨基酸序列非常相似。
[0010]这两种输出蛋白与大肠杆菌中的P〇tE共享特征，并且它们在碱性条件下具有输入 腐胺、亚精胺和精胺的功能并且在酸性条件下输出它们。此外，过表达TP05基因的酵母细胞 对120mM腐胺具有抗性，反之破坏TP05基因的突变体对90mM腐胺敏感（Tachihara等， J.Biological Chemistry,280(13):12637-12642,2005)〇
[0011] 动物细胞中腐胺的合成和降解，以及摄取和分泌以不同的方式调控。虽然对聚胺 分泌的研究还没有在动物细胞以及大肠杆菌或酵母中进行，但是有报道SLC3A2(精氨酸/二 胺输出蛋白）在结肠上皮细胞中起将精氨酸输入细胞并输出腐胺、乙酰基亚精胺和乙酰基 精胺的作用。然而，没有关于在植物细胞中摄取和输出腐胺的报道（Igarashi等，Plant Physiol.&Biochem.48:506-512,2010)〇
[0012] 另一方面，由于棒状杆菌属某种微生物不具有腐胺生物合成途径，所以还没有进 行关于腐胺输出的研究。根据最近的报道，通过在产生尸胺的菌株中过表达cg2983膜蛋白 恢复细胞生长和增强尸胺生产力(Kind等，Metabolic Engineering 13:617-627，2011) 〇
[0013] 然而，还没有关于腐胺输出蛋白和腐胺生产力或生产腐胺的微生物的生长之间的 关联的报道。在以上的文献中，没有提及关于cg2983膜蛋白和腐胺的输出能力之间的关联。 [0014]在该背景下，本发明人已经进行了许多努力以开发能够以更高产率生产腐胺的菌 株。结果，NCg 12522功能揭不为腐胺生广囷株 棒状杆囷属某种微生物 中的腐胺输 出蛋白，并且可以通过与NCgl2522内源活性相比增强其活性以高产率生产腐胺。此外，培养 基中腐胺的量可以通过在具有腐胺合成途径的大肠杆菌中表达NCgl2522增加，并且因此本 发明人表明NCgl2522在大肠杆菌中也起腐胺输出蛋白的作用，从而完成本发明。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是提供被修饰以具有增强的NCgl2522活性从而以高产率生产腐胺 的重组微生物。
[0016] 本发明的另一目的是提供使用该微生物以高产率生产腐胺的方法。
【附图说明】
[0017] 图1是表明NCgl2522包含在根据本发明的克隆(B19)中的图，所述克隆(B19)最终 选自引入有棒状杆菌属染色体文库的转化的菌落;和
[0018] 图2是评估根据本发明的NCgl2522缺失的或增强的重组菌株的腐胺抗性的结果。
[0019] 1：KCCM11240P
[0020] 2：KCCM11240P ANCgl2522
[0021] 3：KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522
【具体实施方式】
[0022] 在实现以上目标的一方面中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其被修饰以 增强具有由SEQ ID N0:21或23表示的氨基酸序列的蛋白质的活性。
[0023] 在一个具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物 被进一步修饰以与其内源活性相比，具有减弱活性的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和参与 谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221)，并且所述微生物被引入具有鸟氨酸脱羧酶(0DC)活性。
[0024] 在另一具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中鸟氨酸氨 甲酰基转移酶(ArgF)具有由SEQ ID N0: 29表示的氨基酸序列，参与谷氨酸输出的蛋白质 (NCgll221)具有由SEQ ID N0:30表示的氨基酸序列，并且鸟氨酸脱羧酶(0DC)具有由SEQ ID N0:33表示的氨基酸序列。
[0025] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物 进一步修饰为与其内源活性相比，具有增强活性的乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶 (ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨 酸氨基转移酶(ArgD)。
[0026] 在仍另一具体的实施方式中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中乙酰基-γ_谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨 酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)分别具有由SEQ ID N0:25、26、27和28表示 的氨基酸序列。
[0027] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中微生物的 乙酰转移酶(NCgl 1469)活性进一步被减弱。
[0028] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中乙酰转移 酶具有由SEQ ID N0:31或32表示的氨基酸序列。
[0029] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中微生物是 埃希式杆菌属某种或棒状杆菌属某种。
[0030] 在仍另一【具体实施方式】中，本发明提供具有腐胺生产力的微生物，其中该微生物 是大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌。
[0031] 在另一方面，本发明提供生产腐胺的方法，其包括以下步骤:培养具有腐胺生产力 的微生物以获得细胞培养物和从培养的微生物或细胞培养物回收腐胺。
[0032]在下文中，将详细地描述本发明。
[0033]本发明提供重组棒状杆菌属某种微生物，其中具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种 微生物被修饰为与其内源活性相比，具有增强的NCgl2522活性，并因此其具有提高的腐胺 生产力。
[0034]如本文所使用，术语"NCgl2522"指的是属于MFS(主要协同转运蛋白超家族）的通 透酶，其是从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032分离的膜蛋白。NCgl2522已知自谷氨酸棒状杆菌输 出二氨基戊烷。在本发明中，NCgl2522被确认起用于将细胞内产生的腐胺细胞外输出的运 载体的作用。基于此事实，本发明提供显示高产率腐胺生产力的重组微生物，其中NCgl2522 被修饰为与其内源活性相比，具有增强的活性，并且因此，增加细胞内产生的腐胺的输出。
[0035] 如本文所使用，术语"内源活性"指的是微生物在其天然状态即没有修饰的状态中 具有的酶的活性，并且"修饰为与内源活性相比具有增强的活性"的意思是与修饰前的相应 酶的活性相比，酶的活性被新引入或进一步提高。
[0036] 在本发明中，"酶活性的增强"包括通过内源基因活性的提高造成的酶活性的提 高、通过内部或外部因素造成的内源基因的扩增、抑制基因表达的调节因子的缺失、基因拷 贝数的增加、通过引入外源基因或修饰表达调控序列一一具体而言，基因内的启动子的置 换或修饰以及突变一一造成的活性的增加，以及其本身酶活性的引入或提高以实现超越内 源功能的效果。
[0037]在本发明中，"修饰为与内源活性相比具有增强的活性"意思是与操纵前的微生物 的活性相比，操纵后微生物的活性增加，所述操纵比如引入显示活性的基因，或增加基因拷 贝数，缺失抑制基因表达的调控因子或修饰表达调控序列，例如，使用改进的启动子。
[0038]其活性通过本发明增加的NCgl2522可以是但不具体地限于如此蛋白质，所述蛋白 质具有SEQ ID N0:21或23的氨基酸序列或具有70%或更多与其同源性、优选地80%或更多 与其同源性、更优选地90%或更多与其同源性、更优选地95%或更多与其同源性、更优选地 98%或更多与其同源性和最优选地99%或更多与其同 源性的氨基酸序列。进一步，因为显 示活性的蛋白质的氨基酸序列可以根据微生物的种类或菌株而不同，所以蛋白质不限于 此。即，蛋白质可以是蛋白突变体或人造变体，其氨基酸序列包括在SEQ ID N0:21或23的氨 基酸序列的一个或多个位置处的一个或数个氨基酸的替换、缺失、插入或添加，只要该蛋白 质通过增强其活性有助于提高腐胺生产力。如本文所使用，术语"数个"氨基酸具体指2到 20、优选地2到10、和更优选地2到5个氨基酸，但是它可以根据蛋白质的三维结构中的氨基 酸残基的位置或类型而不同。而且，氨基酸的替换、缺失、插入、添加或倒位可包括自然发生 的突变，其由于具有多肽或人造变体的活性的微生物的个体或物种的差异而发生。
[0039] 在棒状杆菌属某种微生物中不存在腐胺生物合成途径。然而，当引入外来鸟氨酸 脱羧酶(D0C)时，腐胺被合成并细胞外分泌，这表明存在运载体，即起棒状杆菌属某种微生 物的许多膜蛋白之中的腐胺通道作用的输出蛋白。因此，为了分离棒状杆菌属某种微生物 中的腐胺输出蛋白，本发明人制备了野生型谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体文库，并且 他们利用该文库转化生产腐胺的菌株一一谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，并且选择在包含腐 胺的基本培养基中生长的菌株。通过三次(tertiary)菌落选择，最终选择具有腐胺抗性的 克隆(B19)并且进行碱基序列分析以确认该克隆包含NCgl2522(参见图1)。作为腐胺输出蛋 白，衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522具有由SEQ ID N0:21表示的氨基酸序列， 并且衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的、与以上氨基酸序列具有98%同源性的NCgl2522 具有由SEQ ID NO:23表示的氨基酸序列。
[0040] 编码本发明的NCgl 2522的多核苷酸可包括编码以下蛋白质的多核苷酸，所述蛋白 质具有:SEQ ID N0:21或23的氨基酸序列，或具有70%或更多与其同源性、优选地80%或更 多与其同源性、更优选地90%或更多与其同源性、更优选地95%或更多与其同源性、更优选 地98%或更多与其同源性和最优选地99%或更多与其同源性的氨基酸序列，只要该蛋白质 的活性与NCgl2522蛋白质的活性相似，并且最优选地，其可包括SEQ ID N0: 20或22的核苷 酸序列。
[0041] 如本文所使用的，术语"同源性"指的是两个氨基酸序列之间的相似性，并且可以 使用利用BLAST 2.0的公知方法测定，BLAST 2.0计算参数比如得分、同一性和相似性。 [0042]进一步，编码本发明的NCgl2522的多核苷酸可以是在严格条件下与SEQ ID N0:20 或22的核苷酸序列杂交的变体，或衍生自以上核苷酸序列的探针，条件是其编码功能性的 NCgl2522。如本文所使用的，术语"严格条件"指的是使多核苷酸之间特异性杂交的条件。例 如，这样的严格条件在文献(J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第 二版，Cold Spring Harbor Laboratory press ,Cold Spring Harbor,New York, 1989 ； F.M.Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John ffiley&Sons, Inc.,New York)中详细描述。
[0043] 在本发明中，"修饰为与内源活性相比具有增强的NCgl2522活性"可以通过选自以 下的方法执行:增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达调控序列以增加多核苷酸 的表达、修饰染色体上的多核苷酸序列以增强酶的活性、使抑制基因表达的调控因子缺失 和其组合。
[0044] 多核苷酸的拷贝数可以，但是不具体地限于，通过可操作地将多核苷酸连接至载 体或通过将其整合入宿主细胞基因组而增加。具体而言，宿主细胞基因组中多核苷酸的拷 贝数可以通过将可操作地连接至编码本发明的蛋白质的多核苷酸和独立于宿主细胞复制 和起作用的载体引入宿主细胞而增加，或通过将可操作地连接至多核苷酸和能够将多核苷 酸整合入宿主细胞基因组的载体引入宿主细胞而增加。
[0045] 如本文所使用的，术语"载体"指的是包含编码期望蛋白质的核苷酸序列的DNA构 建体，其可操作地连接至适当的表达调控序列以在适合的宿主细胞中表达期望的蛋白质。 该调控序列包括可以引发转录的启动子、调控转录的任选的操纵基因（operator)序列、编 码适当的mRNA核糖体结合位点的序列、和调控转录和翻译终止的序列。在载体被转化入适 当的宿主细胞之后，其可以独立于宿主基因组复制或起作用，并且可以将载体整合入基因 组本身。
[0046] 在本发明中使用的载体不具体地限制，只要它能够在宿主细胞中复制，并且可以 使用本领域中任何已知的载体。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌 体。例如， ？耶15、]\113、]\?1^3、]\?1^4、1父11、厶5!111、厶?11、乜0、乜1、卡隆4厶和卡隆21厶可以用作噬 菌体载体或黏粒载体。作为质粒载体，可使用pBR型、pUC型、pBluescriptll型、pGEM型、pTZ 型、pCL型和ρΕΤ型。本发明中可使用的载体不具体地限制，并且可以使用任何已知的表达载 体。优选地，可以使用 pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118S pCCIBAC载体，并且更优选地，可以使用pDZ载体。
[0047] 进一步，染色体中编码期望蛋白的多核苷酸可以使用用于染色体插入的载体由突 变的多核苷酸置换。将多核苷酸插入染色体可以通过本领域中任何已知的方法执行，例如， 同源重组。由于本发明的载体可以通过同源重组插入染色体，所以它可以进一步包括选择 标记以确认染色体插入。选择标记是为了选择转化有载体的细胞，即，为了确认期望的多核 苷酸的插入，并且选择标记可包括提供可选择表型的标记，所述表型比如抗药性、辅源营 养、对细胞毒素剂的抗性或表面蛋白表达。仅表达选择标记的细胞能够在利用选择剂处理 的环境下生存或显示不同的表型，并因而可以选择转化的细胞。
[0048] 如本文所使用的，术语"转化"指的是将包含编码靶蛋白的多核苷酸的载体以由该 多核苷酸编码的蛋白质在宿主细胞中表达的方式引入宿主细胞。只要转化的多核苷酸在宿 主细胞中可以表达，它可以被整合入或放置在宿主细胞的染色体中，或者可以染色体外地 存在。进一步，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。该多核苷酸可以以任何形式引入，只 要它可以被引入宿主细胞中并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主 细胞，所述表达盒为包含其自主表达所需要的所有元件的基因构建体。通常，表达盒包括可 操作地连接至多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点或翻译终止信号。该表达 盒可以是自身可复制的表达载体的形式。多核苷酸也可以被引入宿主细胞并且可操作地连 接至在宿主细胞中表达所需要的序列。
[0049] 进一步，如本文所使用的，术语"可操作地连接"指的是编码期望蛋白质的多核苷 酸序列与引发和介导多核苷酸序列转录的启动子序列之间的功能性连接。
[0050] 同样，用于增加多核苷酸表达的表达调控序列的修饰可以，但不限于，通过在表达 调控序列上通过核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导修饰以便 进一步增强表达调控序列的活性而进行，或通过利用具有更强活性的核苷酸序列置换表达 调控序列而进行。该表达调控序列包括，但不具体地限于，启动子、操纵基因序列、编码核糖 体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。
[0051] 强异源启动子代替原始启动子可以在多核苷酸表达单位的上游连接，并且强启动 子的实例可包括CJ7启动子、lysCPl启动子、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动 子，并且更优选地，作为棒状杆菌属衍生的启动子的lysCPl启动子或CJ7启动子，并且编码 该酶的多核苷酸可操作地与其连接使得其表达率可以增加。在此，lysCPl启动子是通过核 苷酸序列替换编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的多核苷酸的启动子区域的改进 的启动子，并且与野生型相比，是增加天冬氨酸激酶基因表达的强启动子，导致相应酶活性 5倍增加(W0 2009/096689)。进一步，CJ7启动子是这样的启动子，其在产氨短杆菌中探查 (exploration)强启动子序列期间被发现并且确认在产氨短杆菌和埃希氏杆菌属中表达并 且具有强启动子活性。CJ7启动子是也在谷氨酸棒状杆菌中显示高表达活性的启动子(韩国 专利号0620092和W0 2006/065095)。
[0052]而且，染色体上的多核苷酸序列的修饰可以，但不具体限于，通过在表达调控序列 上通过多核苷酸序列的缺失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导突变以便进一步 增强表达多核苷酸序列的活性而进行，或通过利用修饰为具有更强活性的多核苷酸序列置 换该序列而进行。
[0053]在本发明的一个优选的实施方式中，为了提供具有提高的腐胺生产力的棒状杆菌 属某种微生物，基因拷贝数可以通过将具有编码参与腐胺分泌的NCgl2522的SEQ ID N0:20 或22的核苷酸序列的多核苷酸引入染色体而增加，或NCgl2522的自身启动子可以用具有提 高活性的启动子，优选地，具有SEQ ID N0:24的核苷酸序列的CJ7启动子替换。
[0054]如本文所使用的，术语"具有腐胺生产力的微生物"或"生产腐胺的微生物"指的是 通过为不具有腐胺生产力的亲本菌株提供腐胺生产力而制备的微生物。提供有腐胺生产力 或生产腐胺的微生物可以是，但不具体限于，具有被用作腐胺生物合成的原料的鸟氨酸的 提高生产力的微生物，其中为了增强从谷氨酸到鸟氨酸的生物合成途径，该微生物被修饰 为具有比内源活性更高活性的转化谷氨酸至乙酰谷氨酸(N-乙酰谷氨酸）的乙酰谷氨酸合 酶或转化乙酰鸟氨酸至鸟氨酸的鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、转化乙酰谷氨酸至乙酰谷氨酰 基磷酸盐(N-乙酰谷氨酰基磷酸盐)的乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、转化乙酰谷氨酰基磷酸盐至 乙酰谷氨酸半醛(N-乙酰谷氨酸半醛)的乙酰基-γ-谷氨酰基磷酸还原酶(ArgC)、或转化乙 酰谷氨酸半醛至乙酰鸟氨酸(N-乙酰鸟氨酸）的乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)。进一步，该 微生物是被修饰为具有比内源活性更弱活性的参与从鸟氨酸合成精氨酸的鸟氨酸氨甲酰 基转移酶（ArgF)、参与谷氨酸分泌的蛋白质（NCgl 1221)、和/或乙酰化腐胺的蛋白质 (NCgl469)的微生物，和/或被修饰为具有鸟氨酸脱羧酶(0DC)活性的微生物。
[0055] 就这一点而言，乙酰基-γ -谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨 酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)、鸟氨酸氨甲 酰基转移酶(ArgF)、参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221)和鸟氨酸脱羧酶(0DC)可以具有， 但是不具体地限于，优选地分别由SEQ ID N0:25、26、27、28、29、30和33表示的氨基酸序列， 或分别具有70%或更多与其同源性，更优选80%或更多与其同源性，或更优选90%或更多 与其同源性的氨基酸序列。此外，乙酰化腐胺的蛋白质(NCgl469)可具有，但是不具体地限 于，优选地由SEQ ID N0:31或32表示的氨基酸序列，或具有70%或更多与其同源性，更优选 80%或更多与其同源性，或更优选90%或更多与其同源性的氨基酸序列。
[0056] 在这些蛋白 质中，乙酰基-γ -谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟 氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)和鸟氨酸 脱羧酶(0DC)的活性的增加可以通过以上描述的增加 NCgl2522活性的方法实现，例如，选自 以下方法的方法:增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达调控序列以增加多核苷 酸的表达、修饰染色体上的多核苷酸序列以增强酶的活性、使抑制酶的多核苷酸表达的调 控因子缺失、和其组合。
[0057]进一步，鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)、参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221)和 乙酰化腐胺的蛋白质(NCgl469)的活性可以通过选自以下的方法减弱：编码该蛋白质的多 核苷酸的部分或全部缺失、修饰表达调控序列用于抑制多核苷酸表达、修饰染色体上的多 核苷酸序列用于减弱蛋白质活性和其组合。
[0058] 具体地，编码蛋白质的多核苷酸的部分或全部缺失可以通过将用于染色体插入的 载体引入微生物，从而利用部分去除的多核苷酸或标记基因替换染色体上编码内源靶蛋白 的多核苷酸而进行。所述"部分"可根据多核苷酸的类型而变化，但是具体指1到300,优选地 1到100，并且更优选地1到50个核苷酸。
[0059] 而且，表达调控序列的修饰可以通过在表达调控序列上通过核苷酸序列的缺失、 插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导修饰以便减弱表达调控序列的活性而进行，或 通过利用具有更弱活性的核苷酸序列置换表达调控序列而进行。该表达调控序列包括启动 子、操纵基因序列、编码核糖体结合位点的序列和调控转录和翻译终止的序列。
[0060] 此外，染色体上多核苷酸序列的修饰可以通过在序列上通过多核苷酸序列的缺 失、插入、非保守的或保守的替换或其组合诱导突变以便进一步减弱酶活性而进行，或通过 利用被修饰为具有更弱活性的多核苷酸序列置换该序列而进行。
[0061 ]而且，抑制酶的多核苷酸表达的调控因子可以通过利用部分去除的多核苷酸或标 记基因替换表达抑制因子的多核苷酸而缺失。所述"部分"可以根据多核苷酸的类型变化， 但是具体指1到300，优选地1到100，并且更优选地1到50个核苷酸。
[0062]同时，本发明的微生物是具有腐胺生产力的微生物，并包括表达具有由SEQ ID N0:21或23表示的氨基酸序列的蛋白质的原核微生物，并且其实例可包括属于以下菌属的 微生物:埃希氏杆菌属某种、志贺氏杆菌属某种、柠檬酸杆菌属某种、沙门氏菌属某种、肠杆 菌属某种、耶尔森菌属某种、克雷白氏杆菌属某种、欧文氏菌属某种、棒状杆菌属某种、短杆 菌属某种、乳酸菌属某种、月形单胞菌属某种(Se 1 enomanas sp.)、弧菌属某种、假单胞菌属 某种、链霉菌属某种、隐秘杆菌属某种、产碱杆菌属某种等。本发明的微生物优选为属于埃 希氏杆菌属某种的微生物或属于棒状杆菌属某种的微生物，和更优选地，大肠杆菌或谷氨 酸棒状杆菌。
[0063]在本发明的具体的实施方式中，具有登录号KCCM11138P的棒状杆菌属某种微生物 (韩国专利公开号2012-0064046)和具有登录号KCCM11240P的棒状杆菌属某种微生物（韩国 专利申请号2012-0003634)被用作具有从谷氨酸到腐胺的增强的合成途径的菌株，从而以 高浓度生产腐胺。
[0064]在本发明的仍另一实施方式中，使用基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的腐胺生产 菌株--KCCM11138P和KCCM11240P，和具有相同基因型的基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869 的腐胺生产菌株--DAB12-a和DAB12-KATCC13869菌株可以从美国菌种保藏中心(ATCC) 获得。即，对于每个菌株，在给予的ATCC的目录中列出唯一的登录号，并且该菌株可以使用 该登录号订购。具体而言，腐胺生产菌株DAB12-a的特征在于:缺失编码鸟氨酸氨甲酰基转 移酶(ArgF)的基因和编码谷氨酸输出蛋白NCgll221的基因，引入编码鸟氨酸脱羧酶(0CD) 的基因，和由谷氨酸棒状杆菌ATCC13869中的改进的启动子置换鸟氨酸生物合成基因操纵 子(argCJBD)的启动子。进一步，腐胺生产菌株DAB12-b的特征在于，其通过修饰DAB12-a菌 株而制备以具有与内源活性相比减弱活性的乙酰化腐胺的蛋白质(NCgll469)。
[0065]根据一个优选的实例，通过缺失编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)的基因和编码 谷氨酸输出蛋白NCgll221的基因，由改进的启动子置换编码参与从谷氨酸合成鸟氨酸的酶 的ArgCJBD基因簇的自身启动子，和将编码鸟氨酸脱羧酶(0DC)的基因引入野生型谷氨酸棒 状杆菌ATCC13032中的染色体而制备谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，并且通过另外地使在微 生物中编码乙酰转移酶NCgll469的基因减弱而制备的谷氨酸棒状杆菌KCCM11240P被制备 为腐胺生产菌株。
[0066]同时，为了制备衍生自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522缺失菌株，基于衍生 自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522的氨基酸序列，制备质粒pDZ-ΓNCgl2522(K/0)。
[0067] 将质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)转化入制备的腐胺生产菌株KCCM11138P和 KCCM11240P内，并选择作为NCgl2522缺失菌株，并且这些菌株分别命名为KCCM11138P Δ NCgl2522和KCCM11240P ANCgl2522。以相同的方式，制备衍生自谷氨酸棒状杆菌 ATCC13869的NCgl2522缺失菌株并命名为DAB12-a Δ NCgl2522和DAB12-b Δ NCgl2522。
[0068] 将如此制备的4种类型的NCgl2522缺失的菌株的腐胺生产力与亲本菌株的腐胺生 产力进行比较，结果，与亲本菌株相比，所有NCgl2522缺失的KCCM11138P ANCgl2522、 KCCM11240P Δ NCgl2522、DAB12-a Δ NCgl2522和DAB12-b Δ NCgl2522中的腐胺生产力 降低(参见表3)。基于此结果，本发明人确认腐胺生产菌株中NCgl2522活性与腐胺生产力密 切相关，并且为了通过增强活性增加腐胺生产力，他们制备了NCgl2522增强菌株。
[0069] 为此，在本发明的一个优选的实例中，NCgl2522被另外地引入到谷氨酸棒状杆菌 菌株的转座子内，或者染色体内的自身NCgl2522启动子被由本发明人最近开发的CJ7启动 子(KCCM10617,韩国专利号10-0620092)置换。
[0070] 将如此制备的6种类型的NCgl2522增强菌株的腐胺生产力与亲本菌株的腐胺生产 力进行比较，结果，与亲本菌株相比，通过将NCgl2522另外引入到转座子内制备的所有菌株 的腐胺生产力增加(参见表6)。在显示腐胺生产力提高的NCgl2522增强菌株中测量细胞内 腐胺浓度，结果，与亲本菌株相比，它们显示细胞内腐胺浓度的降低(参见表9)。基于这些结 果，本发明人确认细胞内生产的腐胺的细胞外输出通过增强腐胺生产菌株中的NCgl2522活 性而增加，从而提高腐胺生产力。
[0071] 因此，具有增强的腐胺生产力一一其中腐胺生产菌株谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P 被修饰为与内源活性相比，具有增强的NCgl2522活性，并因此显示增强的输出腐胺的能 力--的棒状杆菌属某种微生物命名为谷氨酸棒状杆菌CC01-0510,并在2013年3月8日依 照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11401P。
[0072] 根据本发明的另一方面，本发明提供了生产腐胺的方法，包括以下步骤：
[0073] (i)培养具有腐胺生产力的微生物以获得细胞培养物;和
[0074] (ii)从培养的微生物或细胞培养物回收腐胺。
[0075]在该方法中，培养微生物的步骤可以，但是不具体地限于，优选地通过本领域已知 的分批培养、连续培养和补料分批培养进行。就这一点而言，培养条件不具体地限制，但是 最佳的pH(例如，pH 5到9,优选地pH 6到8,和最优选地pH 6.8)可以通过使用碱性化学品 (例如，氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化学品（例如，磷酸或硫酸)保持。而且，需氧条件可 以通过将氧或含氧气体混合物加入到细胞培养物保持。培养温度可以保持在20到45°C，并 优选地在25到40°C。此外，培养优选地进行大约10到160小时。通过以上培养产生的腐胺可 排出至培养基或保留在细胞内。
[0076] 而且，待使用的培养基可包括糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦 芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素）、油脂（例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油）、脂肪酸（例 如，软脂酸、硬脂酸和亚油酸）、醇（例如，丙三醇和乙醇）和有机酸（例如，乙酸）单独地或结 合作为碳源;含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米溶液、大 豆粉和尿素）、或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)单独地或结 合作为氮源;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或与其相应的含钠盐单独地或结合作为磷源;其它必 需的生长刺激物质包括金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁）、氨基酸和维生素。
[0077] 回收在本发明的培养步骤中生产的腐胺的方法可以，例如，根据分批培养、连续培 养或补料分批培养使用本领域中已知的合适方法执行，从而从培养物中收集期望的氨基 酸。
[0078] 在下文中，将参考实施例更详细的描述本发明。然而，这些实施例仅是说明性的目 的，并且本发明不意欲由这些实施例限制。
[0079]参考实施例1:制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物
[0080] 为了制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物，阻断自鸟氨酸的精氨酸生物 合成途径，增强自谷氨酸的鸟氨酸生物合成途径，并且引入外来的鸟氨酸脱羧酶(0CD)以制 备提供有腐胺生产力的微生物，如韩国专利公开号10-2012-0064046中描述的。
[0081] 具体而言，基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032,将菌株染色体中编码鸟氨酸氨甲酰基 转移酶(ArgF)的基因和编码NCgll221--其是参与谷氨酸输出的蛋白质一一的基因通过 同源重组缺失，从而增加为鸟氨酸前体的谷氨酸的细胞内含量。进一步，将衍生自野生型大 肠杆菌W3110的编码鸟氨酸脱羧酶(0DC)-一其参与从鸟氨酸合成腐胺一一的基因引入菌 株的染色体中。此外，编码参与从谷氨酸合成鸟氨酸的酶的argCJBD基因簇的自身启动子由 改进的启动子CJ7启动子置换以制备具有腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株。此时， argCJBD编码乙酰基-γ -谷氨酰基磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移 酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)，其参与自谷氨酸的鸟氨 酸生物合成途径。如此制备的具有腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌菌株在2010年11月24日依 照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11138P。关于具有腐胺 生产力的棒状杆菌属某种微生物的制备的详细描述在韩国专利公开号10-2012-0064046中 描述，其公开内容以其全部通过引用并入。
[0082]参考实施例2:制备具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物 [0083]编码参考实施例1中制备的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P中的乙酰转移酶NCgl 1469 的基因被减弱以不产生N-乙酰基腐胺，从而制备具有提高的腐胺生产力的谷氨酸棒状杆菌 菌株为另一种具 有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物。
[0084] 具体而言，基于编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgll469的基因的核苷酸序列， 用于获得NCgll469的N-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:1和2的引物对和用于获得 NCgll469的C-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:3和4的引物对如下表1构建。
[0085] [表1]
[0086]
[0087]使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和两个引物对进行PCR，从 而分别获得N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。将这些PCR片段电泳以获得期望的片段。 此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒、55°C下退火30秒和72°C下延伸30秒。如此获 得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sail处理，并且如此获得的C-末端区域的 片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶BamHI和 Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-NCgll469(K/0)。
[0088] 将质粒pDZ-NCgl 1469 (K/0)通过电穿孔转化入谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P内以获 得转化体。然后，将该转化体铺板(plate)并在包含卡那霉素（25μg/ml)和X-gal (5-溴-4-氯-3-二氢吲哚-D-半乳糖苷）的BHIS平板(37g/l Braine心浸液，91g/l山梨醇，2%琼脂)上 培养，用于菌落形成。从平板上形成的菌落，选择蓝色菌落作为引入有质粒pDZ-NCgll469 (K/0)的菌株。
[0089]将选择的菌株接种在CM培养基（10g/l葡萄糖，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l 牛肉膏，2.5g/l NaCl，2g/l尿素 ，pH 6.8)中在30°C下摇动培养8小时。随后，将每个细胞培 养物从10-4连续地稀释到ΙΟ#。然后，将稀释的样品铺板并在包含X-gal的固体培养基上培 养，用于菌落形成。
[0090]从形成的菌落，选择以相对低频率出现的白色菌落以制备通过缺失编码NCgl 1469 的基因而具有提尚的腐胺生广力的谷氣酸棒状杆菌菌株。如此制备的具有提尚的腐胺生广 力的谷氨酸棒状杆菌菌株被命名为KCCM11138P Δ NCgl 1469并且在2011年12月26日依照布 达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登录号为KCCM11240P。关于具有腐胺生产 力的棒状杆菌属某种微生物的制备的详细描述在韩国专利申请号10-2012-0003634中给 出，其公开内容以其全部通过引用并入。
[0091] 实施例1:腐胺输出蛋白的探查和具有腐胺抗性的文库克隆的选择
[0092] 谷氨酸棒状杆菌不具有腐胺生物合成途径。然而，当将外部鸟氨酸脱羧酶引入谷 氨酸棒状杆菌以具有生产腐胺的能力时，它产生和细胞外地分泌腐胺。这表明在棒状杆菌 属某种微生物的许多膜蛋白之中起腐胺通道作用的运载体的存在。
[0093] 为了从棒状杆菌属某种微生物分离和隔离腐胺输出蛋白，制备野生型谷氨酸棒状 杆菌ATCC13032的染色体文库。具体而言，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体用限制性内 切酶Sau3AI处理，进行不完全切割。分离3~5kb的基因片段，并将其克隆入用BamHI处理的 PECCG122载体(大肠杆菌和棒状杆菌属的穿梭载体;韩国专利公开号10-1992-0000933)。 [0094]将如此获得的棒状杆菌染色体文库转化入腐胺生产菌株一一根据参考实施例1的 谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P，然后选择在0.35M包含腐胺的基本培养基(在1升蒸馏水的基 础上，其包含l〇g葡萄糖，〇.4g MgS〇4.7H20,4g NH4Cl，lg KH2P〇4，lg K2HP〇4,2g尿素，10mg FeS〇4 · 7H2〇，lmg MnS〇4 · 5H2〇,5mg烟酰胺，5mg盐酸硫胺素，O.lmg生物素，ImM精氨酸，25mg 卡那霉素，0.35M腐胺，pH 7.0)中生长的菌株。从引入有棒状杆菌染色体文库的大约5.5 X 1〇5种转化体，选择413个菌落，然后每个文库克隆--其腐胺抗性也通过二次检测确 定一一被重新引入腐胺生产菌株。最终，选择一个克隆(B19)，其腐胺抗性通过三次检测确 定。使该克隆经受核苷酸序列分析。结果，发现在B19克隆中具有NCgl2522(图1)。
[0095]从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中作为腐胺输出蛋白分离的NCgl2522具有由SEQ ID N0:21表示的氨基酸序列，其由具有由SEQ ID N0:20表示的核苷酸序列的多核苷酸编码。
[0096] 实施例2:NCgl2522缺失菌株的制备和其腐胺生产力的检测
[0097] 〈2-1>从基于ATCC13032的腐胺生产菌株制备NCgl2522缺失菌株
[0098]为了检测谷氨酸棒状杆菌ATCC13032衍生的NCgl2522是否参与腐胺输出，构建缺 失编码NCgl2522的基因的载体。
[0099] 具体而言，基于编码NCgll469的基因的核苷酸序列--其由SEQ ID N0:20表示， 用于获得NCgll469的N-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:5和6的引物对和用于获得 NCgll469的C-末端区域的同源重组片段的SEQ ID N0:7和8的引物对如下表2中构建。
[0100][表 2]
[0101]
[0102] 使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组DNA作为模板和两个引物对进行PCR，从 而扩增NCgl2522基因的N-末端区域和C-末端区域的PCR片段。电泳这些PCR片段以获得期望 的片段。此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸30 秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sa 11处理，和如此获得的C-末端 区域的片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克隆入用限制性内切酶 BamHI和Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)。
[0103] 将质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)通过电穿孔分别转化入参考实施例1和2的谷氨酸棒 状杆菌KCCM11138P和KCCM11240P中，从而获得转化体。然后，将该转化体铺板并在包含卡那 霉素（25μg/ml)和X-gal (5-溴-4-氯-3-二氢吲哚-D-半乳糖苷）的BHIS平板(37g/l Braine 心浸液，91g/l山梨醇，2%琼脂)上培养，用于菌落形成。从平板上形成的菌落，选择蓝色菌 落作为引入有质粒pDZ-l'NCgl2522(K/0)的菌株。
[0104]将选择的菌株在CM培养基（10g/l葡萄糖，10g/l聚胨，5g/l酵母提取物，5g/l牛肉 膏，2.5g/l NaCl，2g/l尿素 ，pH 6.8)中在30°C下摇动培养8小时。随后，将每个细胞培养物 从10-4连续地稀释到10-1()。然后，将稀释的样品铺板并在包含X-gal的固体培养基上培养，用 于菌落形成。从形成的菌落，选择以相对低频率出现的白色菌落以最终获得菌株，在该菌株 中编码NCgl2522的基因通过二次交换缺失。最终选择的菌株使用SEQ ID N0:5和8的引物对 经历PCR以确定编码NCgl2522的基因的缺失。谷氨酸棒状杆菌突变菌株分别被命名为 KCCM11138P ANCgl2522和KCCM11240P ANCgl2522。
[0105] 〈2-2>从基于ATCC13869的腐胺生产菌株制备NCgl2522缺失菌株
[0106] NCgl2522缺失菌株从基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的腐胺生产菌株制备，所述 菌株为具有与KCCM11138P和KCCM11240P相同基因型的DAB12-a(argF缺失，NCgll221缺失， 大肠杆菌speC引入，arg操纵子启动子替换；参见参考实施例1)和DAB12-b(argF缺失， NCgll221缺失，大肠杆菌speC引入，arg操纵子启动子替换，NCgll469缺失，参见参考实施例 2)，KCCM11138P和KCCM11240P为基于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的腐胺生产菌株。
[0107]具体而言，为了检测编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因序列 和由其表达的蛋白质，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板和SEQ ID N0: 5和8的引物对进行PCR。此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和 72°C下延伸2分钟。将如此获得的PCR产物通过电泳分离，并进行测序。结果，发现编码谷氨 酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因的核苷酸序列由SEQIDN0 :22表示，和由此 编码的蛋白质的氨基酸序列由SEQ ID N0:23表示。当谷氨酸棒状杆菌ATCC13032衍生的 NCgl2522的氨基酸序列与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的氨基酸序列相比较 时，发现它们具有98%的序列同源性。
[0108] 为了缺失编码谷氨酸棒状杆菌ATCC13869衍生的NCgl2522的基因，以与实施例Οι〉 相同的方式，使用谷氨酸棒状杆菌 ATCC13869 的基因组 DNA 作为模板和表 2 的两个引物对 进行PCR，从而分别扩增NCgl2522基因的Ν-末端区域和C-末端区域的PCR片段。将这些PCR片 段电泳以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环：95°C下变性30秒，55°C下退火30 秒，和72°C下延伸30秒。如此获得的N-末端区域的片段用限制性内切酶BamHI和Sail处理， 并且如此获得的C-末端区域的片段用限制性内切酶Sail和Xbal处理。将如此处理的片段克 隆入用限制性内切酶BamHI和Xbal处理的pDZ载体，从而构建质粒pDZ-2 ' NCgl2522(K/0)。
[0109] 以与实施例〈2-1>中相同的方式，将质粒pDZ-2'NCgl2522(K/0)分别转化入谷氨酸 棒状杆菌DAB12-a和DAB12-b。选择其中编码NCgl2522的基因被缺失的菌株。如此选择的谷 氨酸棒状杆菌突变菌株分别被命名为DAB12-a ANCgl2522和DAB12-b ANCgl2522。
[0110] <2-3>NCgl2522缺失菌株的腐胺生产力的评估
[0111] 为了确定腐胺生产菌株中NCgl2522缺失对腐胺生产力的影响，将实施例〈2-1>和〈 2-2>中制备的谷氨酸棒状杆菌突变菌株的腐胺生产力进行比较。
[0112] 具体而言，将4种类型的谷氨酸棒状杆菌突变体（KCCM11138P ANCgl2522、 KCCM11240P ANCgl2522、DAB12-a ANCgl2522和DAB12-b ANCgl2522)和4种类型的亲本 菌株(1(01111138?、1(01111240?、04812-3和04812-13)分别在包含11111精氨酸的01平板培养基 (1升基础上，1%葡萄糖，1%聚胨，0.5%酵母提取物，0.5%牛肉膏，0.25%NaCl，0.2%尿 素 ，100μΙ 50%Na0H，2%琼脂，pH 6.8)上铺板，并在30°(3下培养24小时。将1个接种环 (platinum loop)的如此培养的每种菌株接种在25ml效价培养基（1升基础上，8%葡萄糖 ， 0.25%大豆蛋白，0.50%固体玉米浆，4%(冊4)2304,0.1%1(!12?04,0.05%]\^504.7!120， 0.15%尿素，100〖生物素，311^盐酸硫胺素，311^泛酸| 15,311^烟酰胺，5%〇3(1)3)中，然后在30 °C^P200rpm下摇动培养98小时。将ImM精氨酸加入到培养基中，用于培养所有菌株。测量每 个培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表3中显示。
[0113] [表 3]
[0114]
[0115] 如表3中所示，在4种类型的NCgl2522缺失的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中观察到腐 胺产量的显著降低。
[0116] 实施例3:NCgl2522增强菌株的制备和其腐胺生产力的检测
[0117] 〈3-1>将NCgl2522引入到ATCC13032染色体中的转座子基因中
[0118] 为了确认通过具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物KCCM111 38P中的 NCgl2522基因（包含自身启动子区域)的另外的染色体插入引起腐胺的高产，将NCgl2522引 入到转座子基因。使用用于转化的载体pDZTn(韩国专利公开号10-2008-0033054)，其允许 将基因引入使用的棒状杆菌属某种微生物的染色体上的转座子基因。
[0119] 包含自身启动子的NCgl2522基因使用ATCC13032菌株的染色体作为模板以及SEQ ID N0:9和10的引物对进行扩增(表4)。此时，进行PCR反应30个循环:95°C下变性30秒，55°C 下退火30秒，和72°C下延伸30秒或2分钟。通过PCR，获得具有1.88kb大小的基因片段。将该 PCR产物在0.8 %琼脂糖凝胶中电泳以洗脱和纯化期望大小的带。pDZTn载体用Xho I处理，并 进行ATCC13032菌株的NCgl2522PCR产物的融合克隆。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。得到的质粒命名为pDZTn-l'NCgl2522。
[0120] [表 4]
[0121]
[0122] 将质粒pDZTn-Γ NCgl2522通过电穿孔转化入参考实施例1中描述的谷氨酸棒状杆 菌KCCM11138P中以获得转化体。从转化体，以与实施例2中相同的方式选择其中NCgl 2522被 引入转座子的菌株。
[0123] 使用选择的菌株的基因组DNA和SEQ ID N0:9和10的引物对进行PCR，从而确认 NCgl2522通过引入质粒pDZTn-l'NCgl2522被引入到转座子中。此时，进行PCR反应30个循 环:94°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸2分钟。
[0124] 如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为KCCM11138P Tn:l'NCgl2522。
[0125] 〈3-2>从基于ATCC13032的腐胺生产菌株制备NCgl2522启动子替换的菌株
[0126] 为了增强腐胺生产菌株中NCgl2522活性，在染色体上NCgl2522起始密码子前面引 入CJ7启动子(W0 2006/65095)。
[0127] 首先，获得包含在启动子两端具有由SEQ ID N0: 24表示的核苷酸序列和具有原始 NCgl2522序列的CJ7启动子的同源重组片段。具体而言，使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的 基因组DNA作为模板和SEQ ID NO: 11和12的引物对进行PCR以获得CJ7启动子的5 ' -末端区 域。此时，进行PCR反应30个循环:94°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸30秒。进 一步，在相同的条件下使用SEQ ID N0:13和14的引物对进行PCR以获得CJ7启动子区域。此 外，在相同的条件下使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组作为模板和SEQIDN0 :15和 16的引物对进行PCR以获得CJ7启动子的3'-末端区域。启动子替换中使用的引物与下面的 表5中的相同。
[0128] [表 5]
[0129]
[0130]将如此获得的每种PCR产物融合-克隆入用BamHI和Xbal处理的pDZ载体。在融合克 隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。所得质粒命名为pDZ_P(CJ7)_l' NCgl2522〇
[0131] 将如此制备的质粒pDZ-P(CJ7)-l'NCgl2522通过电穿孔转化入根据参考实施例1 和2的谷氨酸棒状杆菌KCCM11138P和KCCM11240P从而制备转化体。将如此制备的转化体接 种在CM培养基中并且在30°C下摇动培养8小时。将由此获得的每个细胞培养物从ΚΓ 4稀释到 10 一1()，并在包含25μg/ml卡那霉素和X-gal的BHIS平板上铺板和培养，用于菌落形成。
[0132] 与大多数具有蓝色的菌落相比，白色菌落以相对低频率出现，并且选择其以最终 获得菌株，在该菌株中NCgl2522启动子用CJ7启动子通过二次交换替换。使用选择的菌株的 基因组DNA作为模板和SEQ ID勵:13和16的引物对进行?〇?以确定通过引入质粒?02-1'(^7 (NCgl2522)将CJ7启动子引入到染色体上的NCgl2522起始密码子的前面。此时，进行PCR反 应30个循环:94°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸1分钟。
[0133] 如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株分别命名为KCCM11138P P(CJ7)-NCgl2522 和KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522。
[0134] 〈3-3>将NCgl2522基因引入ATCC13869染色体上的转座子基因中
[0135] 为了确认通过谷氨酸棒状杆菌微生物ATCC13869衍生的腐胺菌株中NCgl2522基因 的另外的染色体插入引起腐胺的高产，确定将NCgl2522(包含启动子区域）引入到转座子基 因。使用ATCC13869菌株的染色体作为模板和SEQ ID ^):17和10的引物对(参见表16)扩增 NCgl2522基因。此时，进行PCR反应30个循环:94°C下变性30秒，55°C下退火30秒，和72°C下 延伸30秒或2分钟。通过PCR，获得具有1.97kb大小的基因片段。将如此制备的NCgl2522PCR 片段融合-克隆入用Xhol处理的pDZTn载体。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit (Clontech)。所得质粒命名为 pDZTn-2'NCgl2522。
[0136] [表 6]
[0137]
[0138] 以与实施例〈3-1>相同的方式将质粒pDZTn-2'NCgl2522转化入谷氨酸棒状杆菌 DAB12-a以确定NCgl2522引入转座子。
[0139] 如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为DAB12-a Tn:2'NCgl2522。
[0140] 〈3-4>从基于ATCC13869的腐胺生产菌株制备NCgl2522启动子替换的菌株
[0141] 为了在谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl2522起始密码子前面引入CJ7启动子，使 用谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的基因组DNA作为模板和下面表7中给出的三个引物对以与实 施例〈3-2>中相同的方式分别进行PCR。结果，CJ7启动子区域、其N-末端区域和C-末端区域 的PCR片段被扩增然后电泳以获得期望的片段。此时，进行PCR反应30个循环:94°C下变性30 秒，55°C下退火30秒，和72°C下延伸30秒。将如此获得的CJ7启动子区域、其N-末端区域和C-末端区域的PCR片段融合-克隆入用BamHI和Xbal处理的pDZ载体。在融合克隆中使用In-FusionHD Cloning Kit(Clontech)。所得的质粒命名为pDZ-P(CJ7)-2'NCgl2522。
[0142] [表 7]
[0143]
[0144] 以与实施例〈3-2>中相同的方式将质粒pDZ-'P(CJ7)-2'NCgl2522转化入谷氨酸棒 状杆菌DAB12-a和DAB12-b的每个中以选择菌株，在该菌株中将CJ7启动子引入NCgl2522起 始密码子的前面。如此选择的谷氨酸棒状杆菌突变菌株命名为DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522 和DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522。
[0145] <3-5>NCgl2522增强菌株的腐胺生产力的评估
[0146] 为了确定在腐胺生产菌株中通过启动子替换NCgl 2522活性增强对腐胺生产力的 影响，将实施例〈3_1>到〈3-4>中制备的6种类型的谷氨酸棒状杆菌突变菌株(KCCM11138P Tn:l'NCgl2522、KCCM11138P P(CJ7)-NCgl2522、KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522、DAB12-a Tn:2'NCgl2522、DAB12-a P(CJ7)-NCgl2522和DAB12-b P(CJ7)-NCgl2522)和4种类型的亲 本菌株(1(01111138?、1(01111240?、04812-3和04812-13)的腐胺生产力进行比较。将每种菌株 以与实施例2-3中相同的方式培养，并且测量每种培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表8 中显示。
[0147] [表 8]
[0148]
[0149]如表8中所显示的，在其中NCgl2522活性通过将NCgl2522另外的引入到转座子或 通过启动子替换而增强的所有6种类型的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中观察到腐胺产量的增 加。
[0150] 实施例4:NCgl2522增强菌株的细胞内腐胺浓度的测量
[0151] 为了确认在具有增强的NCgl2522活性的谷氨酸棒状杆菌突变菌株中细胞内腐胺 浓度通过增强的输出腐胺的能力而降低，将谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Τη:1' NCgl2522和亲本菌株KCCM11138P中的细胞内腐胺浓度通过使用有机溶剂提取进行测量。细 胞内代谢物分析根据文献（Nakamura J等，Appl .Environ.Microbiol .73(14) :4491-4498, 2007)中描述的方法进行。
[0152] 首先，将谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn: l'NCgl2522和亲本菌株 KCCM11138P接种在包含ImM精氨酸的25ml的CM液体培养基(在1升的基础上，1 %葡萄糖，1 % 聚胨，0.5%酵母提取物，0.5%牛肉膏，0.25%恥(：1，0.2%尿素，10(^150%恥0!14!16.8，） 中，并在30°C和200rpm下摇动培养。当细胞生长在培养期间达到指数期时，将细胞从培养基 中通过快速真空过滤（Durapore HV，0 ·45μηι;Μ;?1 lipore，Bill erica，MA)分离。将吸附细胞 的过滤器用l〇ml冷水洗涤两次，然后在包含5M吗啉乙磺酸和5M蛋氨酸砜的乙醇中浸泡10分 钟。
[0153] 将由此获得的提取液与等体积的氯仿和0.4倍体积的水混合均匀，并且仅将水相 施加于吸附柱(spin column)以去除蛋白污染物。通过毛细管电泳质谱分析过滤的提取液， 结果在下面的表9中显示。
[0154] [表 9]
[0155] _
[0156] 如表9中所显示的，与亲本菌株KCCM1 1138P相比，在具有增强的NCgl2522活性的谷 氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn:l'NCgl2522中观察到细胞内腐胺浓度的降低。这表 明通过谷氨酸棒状杆菌突变菌株KCCM11138P Tn: l'NCgl2522中NCgl2522活性的增强引起 的提高的输出腐胺的能力导致细胞内腐胺的有效的细胞外输出。
[0157] 实施例5:NCgl2522缺失或增强菌株的腐胺抗性的评估
[0158] 为了检测NCgl2522对腐胺抗性的影响，评估了KCCM11240P、KCCM11240P Λ NCgl2522和KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522菌株的腐胺抗性。
[0159] 将每种菌株接种在包含ImM精氨酸的2ml的CM液体培养基中并在30°C下培养大约 10小时，然后以1〇5、1〇 4、1〇3、1〇2和1〇1的顺序进行稀释。将如此制备的每种稀释物在包含冊 或0.8M腐胺的CMA平板(在1升基础上，1 %葡萄糖，1 %聚胨，0.5 %酵母提取物，0.5 %牛肉 膏，0.25%NaCl，0.2%尿素，1.8%琼脂，ImM精氨酸，pH 6.8)上点样（8?〇〇，并在30°(3下培 养48小时以比较菌株之间的生长差异。
[0160]结果，菌株显示两种不同的生长模式。如图2中所显示的，NCgl2522基因缺失菌株 在高浓度腐胺的条件下不生长，而NCgl2522基因增强菌株在相同条件下生长。该结果显示， 与亲本菌株相比，在高浓度腐胺的条件下KCCM11240P P(CJ7)-NCgl2522的细胞生长增加是 由增加的输出腐胺的能力--其由于NCgl2522基因的增强--引起的。结果，NCgl2522的 引入和增强对于高浓度腐胺的发酵是必需的。
[0161] 实施例6:通过将NCgl2522引入大肠杆菌中的腐胺发酵
[0162] 为了确定当谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl2522在具有腐胺生物合成途径的野 生型大肠杆菌菌株W3110中表达时，腐胺产量是否增加，将表达speC--其为腐胺合成 酶--的载体或表达NCgl2522的载体引入W3110。
[0163] 为了制备表达speC的载体，使用W3110染色体作为模板和SEQ ID N0:34和35的引 物对扩增大约2. lkb的speC基因片段(参见表10)。该PCR产物在0.8 %琼脂糖凝胶中电泳，然 后将期望大小的带洗脱并纯化。包含Trc启动子的pSE280载体（Invitrogen)用Ncol和EcoRI 处理，然后将speC PCR产物融合-克隆入该载体内。在融合克隆中使用In-Fusion?HD Cloning Kit(Clontech)。所得质粒命名为pSE280_speC〇
[0164] 为了制备表达NCgl2522的载体，使用pSE280作为模板和SEQIDN0:36和37的引物 对获得Trc启动子片段，并且使用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032染色体作为模板和SEQ ID NO: 38和39的引物对获得NCgl2522片段。这些PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，然后将期望 大小的带洗脱并纯化。将Trc启动子片段和NCgl2522片段融合-克隆入用Hindlll处理的 pcclBAC中。所得质粒命名为pcclBAC-P(trc)-NCgl2522。
[0165] [表 10]
[0166]
[0167] 将质粒 pSE280-speC 或 pcclBAC-P(trc)-NCgl2522转化入 W3110。使用 2XTSS 溶液 (Epicentre)进行转化入大肠杆菌。将引入pSE280-speC的大肠杆菌铺板并在包含氨节青霉 素（100μg/ml)的LB平板(在1升基础上，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g Nacl，2%琼脂)上 培养，用于菌落形成。将引入pcclBAC-P(trc)-NCgl2522的大肠杆菌铺板并在包含氯霉素 (35μg/ml)的LB平板上培养，用于菌落形成。检测如此获得的菌株的腐胺生产力。
[0168] 具体而言，将W3110、W3110pSE280-speC和W3110pcclBAC-P(trc)-NCgl2522分别接 种在LB、LA和LC平板上并在37°C培养24小时，然后接种在25ml效价培养基(在1升基础上，2g (NH4) 2P〇4,6.75g KH2P〇4,0.85g柠檬酸，0.7g MgS〇4 · 7Η20,0·5%(v/v)痕量元素，10g葡萄 糖，3g AMS，30g CaC03)中并在37°C下培养24小时。1L痕量金属溶液包含5M HCl、10g FeS〇4 · 7H20、2.25g ZnS〇4 · 7H20、lg CuS〇4 · 5H20、0.5g MnS〇4 · 5H20、0.23g Na2B4〇7 · 10H20、2g CaCl2 · 2H20和0.1g(NH4)6M〇7〇2 · 4H20。
[0169] 测量每个培养物中的腐胺浓度，结果在下面的表11中显示。
[0170] [表 11]
[0171]
[0172] 如表11中所显示的，与引入有腐胺生物合成酶speC的W3110pcclBAC-pSE280-speC 相比，在引入有NCgl2522的W3110pcclBAC-P(trc)-NCgl2522中观察到高腐胺产量。
[0173]该结果表明NCgl2522蛋白在大肠杆菌中也具有输出腐胺的能力。
[0174]本发明人发现进行将NCgl2522另外引入具有腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生 物KCCM11138P的转座子中以增强谷氨酸棒状杆菌菌株的NCgl2522活性，并因此腐胺可以以 高产率生产，这归因于增加的输出腐胺的能力，并且他们命名该菌株为谷氨酸棒状杆菌 CC01-0510,并且在2013年3月8日依照布达佩斯条约在韩国微生物保藏中心(KCCM)保藏，登 录号为 KCCM11401P。
[0175] 基于以上描述，本领域技术人员应当理解，其它具体的实施方式可以用于实践本 发明而不背离本发明的技术理念或基本特征。就这一点而言，以上描述的实施例仅用于说 明性目的，并且本发明不意欲被这些实施例所限制。本发明的范围应当理解为包含源自权 利要求书或其等价概念一一而不是以上详细描述一一的意义和范围的所有变形或修改形 式。
[0176] 本发明的效果
[0177] 具有本发明的提高的腐胺生产力的棒状杆菌属某种微生物被修饰以与其内源活 性相比，具有增强的输出细胞内腐胺的NCgl2522活性，这导致增加的腐胺的细胞外输出和 增加的腐胺抗性。
[0178] 进一步，当NCgl2522在包含本发明的腐胺合成途径的大肠杆菌中表达时，发现细 胞外腐胺的量增加。因此，谷氨酸棒状杆菌衍生的NCgl2522可应用至具有腐胺生产力的微 生物，其可以用于有效生产腐胺。
[0179] 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0180] 原始保藏接收证明
[0181 ]由国际保藏机构根据第7.1条发出
[0182]至:CJ第一制糖株式会社
[0183]大韩民国首尔市中区南大门路5街500号
[0184]
12345678910 _ 2 证明上述翻译与原文无误 3 2013年 3 月20 日 4 专利代理人Son Min印 5 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约 6
[0190]原始保藏接收证明 7
[0191]由国际保藏机构根据第7.1条发出 8 至:CJ第一制糖株式会社 9 大韩民国首尔市中区双林洞292号 10 斯玛特普雷克斯(CJ中心）
[0195]
[0196]
[0197] 证明上述翻译与原文无误
[0198] 2013年 3 月20 日
[0199] 专利代理人Son Min印
[0200] 国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
[0201] 原始保藏接收证明
[0202] 由国际保藏机构根据第7.1条发出 [0203]至:CJ第一制糖株式会社
[0204]大韩民国首尔市中区东湖路330号 [0205] CJ第一制糖中心邮政编号100-400
[0206]
[0207]
[0208] 证明上述翻译与原文无误
[0209] 2013年 3 月20 日
[0210] 专利代理人Son Min印
【主权项】
1. 具有腐胺生产力的微生物，其被修饰为具有增强的蛋白质活性，所述蛋白质具有由 SEQIDNO:21或23表示的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物进一步被修饰为 与内源活性相比，具有减弱活性的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ArgF)和参与谷氨酸输出的蛋白 质(NCgll221)，并被修饰为具有增强的鸟氨酸脱羧酶(0DC)活性。3. 根据权利要求2所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述鸟氨酸氨甲酰基转移酶 (ArgF)具有由SEQIDN0:29表示的氨基酸序列，所述参与谷氨酸输出的蛋白质(NCgll221) 具有由SEQIDN0:30表示的氨基酸序列，和所述鸟氨酸脱羧酶(0DC)具有由SEQIDN0:33 表示的氨基酸序列。4. 根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物进一步被修饰为 与内源活性相比，具有增强活性的乙酰基-γ-谷氨酰基-磷酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合 酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)。5. 根据权利要求4所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述乙酰基-γ-谷氨酰基-磷 酸还原酶(ArgC)、乙酰谷氨酸合酶或鸟氨酸乙酰转移酶(ArgJ)、乙酰谷氨酸激酶(ArgB)和 乙酰鸟氨酸氨基转移酶(ArgD)分别具有由SEQIDN0:25、26、27和28表示的氨基酸序列。6. 根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物的乙酰转移酶 (NCgll469)活性进一步被减弱。7. 根据权利要求6所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述乙酰转移酶(NCgll469) 具有由SEQIDNO:31或32表示的氨基酸序列。8. 根据权利要求1所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物是埃希氏杆菌属 某种或棒状杆菌属某种。9. 根据权利要求8所述的具有腐胺生产力的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌或谷 氨酸棒状杆菌。10. 生产腐胺的方法，包括以下步骤： (i)培养具有权利要求1到9中任一项的具有腐胺生产力的微生物以获得细胞培养物； 和 (ii)从所述培养的微生物或所述细胞培养物回收腐胺。
【专利摘要】本发明涉及以高产率生产腐胺的重组微生物和使用该微生物生产腐胺的方法，其中在微生物中NCgl2522活性增加，所述微生物以使得腐胺生产是可能的方式被修饰。KCCM11138P20101124
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/52
【公开号】CN105492593
【申请号】CN201480017057
【发明人】李京珉, 郑熙景, 梁荣烈, 严惠媛, 金昌谦, 李红仙, 朴寿真, 尹钟铉, 李白硕, 李善英
【申请人】Cj第一制糖株式会社
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年2月25日
【公告号】EP2977443A1, WO2014148743A1
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