利用hmga2制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞的方法
利用hmga2制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞的方法
【专利说明】利用HMGA2制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞的 方法
[0001]发明背景 1.发明领域
[0002] 本发明涉及利用HMGA2制备由非神经元细胞重编程的诱导干细胞的方法。
[0003] 2.相关领域描述
[0004] 干细胞大体上被分成全能干细胞和多能干细胞。全能干细胞具有生成所有细胞的 分化潜力。全能干细胞生成体内所有不同种类的细胞，例如，受精卵细胞。多能干细胞生成 体内衍生自三个主要胚层或胚胎本身的任意细胞类型。
[0005] 多能干细胞，如胚胎干细胞(ESC)，增殖迅速，同时保持分化成各种细胞类型的能 力，即，多能性。胚胎干细胞是细胞移植治疗的有希望的供应源。
[0006] 直到最近，多能干细胞主要通过核移植和细胞融合（Sh inya Yamanaka， Pluripotency and Nuclear Reprogramming,Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.363 (1500) :2079-2087(2008年6月27日））来生产。然而，两种方法均使用了胚胎干细胞，因此存 在伦理困境。
[0007] 然而，由于最近发现了诱导多能干细胞（iPSC)，克服与使用胚胎干细胞相关的问 题变得可能。"诱导多能干细胞(iPSC)"是呈现与胚胎干细胞(ESC)相似的性质的细胞。诱导 多能干细胞首次在2006年通过在小鼠成纤维细胞中增加限定因子的表达而生成 (Takahashi,Y.and S.Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors,Cell 126:663-676 (2006))和在2007年通过在人成纤维细胞中增加限定因子的表达而生成(Yu Junying et al·,Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic cells, Science 318:1917-1920(2007)NTakahashi,K.et al., Induction of Pluripotent Stem Cell From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors,Cell 131:861-872(2007))〇
[0008] 关于引起成熟体细胞重编程形成1?3(：的这些研究包括0(^-3/4、3(?2、1(1€4和(3-Myc(Takahashi , Cell 126:663-676; Takahashi, Cell 131:861-872)和使用0ct4、Sox2、 Nanog和Lin28(Junying,Cell 318:1917-1920)。然而，iPSC具有限制:其无法在体内转化成 期望的细胞，因为其可导致胚胎干细胞中出现畸胎瘤，并且同时无法在体内移植时充分控 制分化。
[0009] 因此，为克服这些限制，通过定向转化/重编程分化形成具体谱系细胞的技术在 最近被重视起来。这是可在不经过多能状态的情况下通过将具体谱系特异性基因引入还未 完全分化的细胞（即，成纤维细胞)定向诱导具体细胞的技术，并且可排除多能细胞造成的 畸胎瘤形成的风险。具体地，关于一旦损坏就可能永久维持损坏的神经元细胞，已积极进行 各种研究线路来尝试定向诱导。结果是，美国教授Marius Wernig带领的研究组成功定向诱 导神经元细胞[Vierbuchen T，0stermeier A，Pang ZP，Kokubu Y，Sudhof TC，Wernig Μ (2010)Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors ·Nature 463(7284): 1035-1041 · doi : 10 · 1038/nature08797]。然而，难以体外培养 无自我更新能力的诱导神经元超过特定时间，因此难以保证细胞足量，因此在实践中不可 能获得细胞治疗所需的足量细胞，包括定向重编程涉及的分子细胞学机制。
[0010] 之后，两个德国研究组成功通过将基因引入小鼠成纤维细胞制备诱导神经干细胞 (iNSC)(Thier M.fforsdorfer P,Lakes YB,Gorris R,Herms S,0pitz T,Seiferling D, Quandel T,Hoffmann P,Nothen MM,Brustle 0,Edenhofer F(2012)Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.Cell Stem Cell 10(4): 473-479. doi :10.1016/j. stem. 2012.03.003)。关于人，有报告称成功实施了通过将单个 S0X2基因引入成纤维细胞而诱导iNSC(Thier M，Worsdorfer P,Lakes YB，Gorris R，Herms S,0pitz T,Seiferling D,Quandel T,Hoffmann P,Nothen MM,Brustle 0,Edenhofer F (2012)Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.Cell Stem Cell 10(4):473-479.doi:10.1016/j.stem.2012.03.003)〇
[0011] 然而，利用这些因子制备诱导神经元细胞的常规方法具有限制：其具有低诱导效 力，并且不能增殖神经元细胞，因此不可用于治疗目的。
[0012] 发明概述
[0013] 为解决常规方法显示出的问题，本发明的目的在于提供由分化细胞生成诱导神经 干细胞或神经元细胞的新方法、和通过该方法生成的诱导神经干细胞或神经元细胞。
[0014] 本发明的一个目的是提供用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的 试剂盒，包括(a)SRY(性别决定区Y)框2(S0X2)蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和(b)高移 动性型AT钩2(high mobility group at-hook 2，HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分 子。
[0015] 本发明的另一目的是提供制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或由其 分化的神经元细胞的方法，包括(a)递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白 或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加 S0X2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细 胞中的表达;和(b)培养步骤(a)中的细胞。
[0016] 本发明的再一目的是提供通过上述方法制备的诱导神经干细胞;或由该诱导神经 干细胞分化的神经元细胞。
[0017] 本发明的再一目的是提供用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，包括诱导神经干 细胞;或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。
[0018] 本发明的再一目的是提供预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，包 括S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子，作为 活性成分。
[0019] 本发明的再一目的是提供筛选神经干细胞或神经元细胞的再生促进剂或再生抑 制剂的方法，包括：1)制备分离的非神经元细胞;2)通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核 酸分子；和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加 S0X2蛋白和 HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达，来诱导生成诱导神经干细胞;3)任选地，使步骤2)生 成的诱导神经干细胞分化形成神经元细胞;和4)通过在步骤1或步骤2后用候选物质处理， 根据候选物质的处理的存在来确认诱导神经干细胞或神经元细胞的生成。
[0020] 本发明的再一目的是提供筛选个人定制的神经元细胞治疗产品的方法，包括：1) 制备分离的非神经元细胞;2)通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和HMGA2蛋白 或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加 S0X2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细 胞中的表达，来诱导生成诱导神经干细胞;3)使步骤2)生成的诱导神经干细胞分化形成神 经元细胞;和4)通过用候选物质处理步骤3)形成的非神经元细胞，确认非神经元细胞获取 对象的定制神经元细胞治疗产品。
[0021] 本发明的再一目的是提供促进非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的组合 物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。
[0022] 本发明的再一目的是提供用于细胞增殖的组合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2 蛋白的核酸作为活性成分。
[0023] 本发明的再一目的是提供抑制细胞衰老的组合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2 蛋白的核酸作为活性成分。
[0024]发明有益效果
[0025]根据本发明生成诱导神经干细胞的方法能够在仅利用两种诱导因子S0X2和HMGA2 时由非神经元细胞制备诱导神经干细胞。因此，本发明的方法可比利用四或五种诱导因子 的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。另外，本发明的方法显示比单独使用 S0X2时明显更高的诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的潜能。
[0026]在本发明中，0ct4不被用于重编程形成神经干细胞的过程中的重编程因子组合， 因此分化的细胞被定向重编程形成神经干细胞，而不经过去分化过程。由此制备的诱导神 经干细胞不仅可在移植于小鼠脑组织时保留自我更新能力和增殖能力，而且可充分分化形 成神经相关细胞，如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等，因此被预期用于治疗目的。 [0027] 附图简述
[0028]图1A显示在明场显微镜下观察的人类新生儿真皮(dermal)成纤维细胞(hDF)的形 ??τ 〇
[0029] 图1Β显示在明场显微镜下观察的由S0X2转导的hDF诱导而来的iNSC。
[0030] 图1C显示在明场显微镜下观察的通过S0X2转导形成的早期神经球样集落的图像。 [0031 ]图1D显示利用抗PAX6和巢蛋白抗体进行的hDF-iNSC的NSC特异性标记蛋白的免疫 细胞化学分析的结果。
[0032]图1E显示利用抗波形蛋白和S0X2抗体进行的hDF-iNSC的NSC特异性标记蛋白的免 疫细胞化学分析的结果。
[0033] 图1F显示hDF、H9-NSC和hDF-iNSC( S0X2)中的全局miRNA表达谱的热图。
[0034] 图1G显示hDF、H9-NSC和hDF-iNSC(S0X2)中的神经系统特异性miRNA的热图。
[0035] 图 1H 显示 hDF、H9-NSC 和 hDF-iNSC(S0X2)的 miR-124-3p 的定量实时 PCR 的结果。
[0036] 图 II显示 hDF、H9-NSC 和 hDF-iNSC(S0X2)的 miR-9-5p/-3p 的定量实时 PCR 的结果。 [0037] 图1J显示通过定量实时PCR测量的11〇?、!19-吧(：、11〇?-丨吧(：(3(^2)和1^3(：中的胚胎 干细胞特异性miR-302/367家族的相对表达水平。
[0038] 图 1K 显示通过定量实时 PCR 测量的 hDF、H9-NSC 和 hDF-iNSC(S0X2)中 let-7/miR-98 家族的相对表达水平。
[0039] 图 1L 显示 111丨1?-124-3口、111丨1?-9-5口、111丨1?-9-3口、抗16卜713和16卜713在其转染到5(?2转 导的hDF中之后测量的PAX6-和巢蛋白阳性集落形成率。
[0040]图 2A 显示在 hDF 对照组、S0X2-、S0X2/CMYC-、S0X2/LIN28-、和 S0X2/HMGA2 转导的 hDF组中进行的MTT细胞增殖测定的结果。
[0041 ]图 2B 显示在 5(^2-、5(^2/^1^〇、5(^2/1預28-、和5(^2/腿642转导的110?组中测量 的集落形成时间。
[0042] 图 2C 显示在 5(^2-、5(^2/^1^(：-、5(^2/1預28-、和5(^2/腿642转导的11〇?组中测量 的PAX6-和巢蛋白阳性集落形成率。
[0043] 图 2D 显示 hDF 对照组、5(^2-、5(^2/^1^(：-、5(^2/11呢8-、和5(?2/腿6六2转导的11〇? 组的流式细胞术分析结果，该流式细胞术分析利用其NSC细胞表面标记物(CD44)和阳性标 记物(CD184)在病毒转导后7天进行。
[0044] 图2E显示在明场显微镜下观察的hDF-iNSC(S0X2/HMGA2)的形态和PAX6、巢蛋白、 Ki67和HMGA2表达的免疫细胞化学分析结果。
[0045] 图 2F 显示与 hDF 表达水平相比，H9-NSC、hDF-iNSC( S0X2)和 hDF-iNSC( S0X2/HMGA2) 中的NSC特异性miRNA表达的定量实时PCR结果。
[0046] 图 2G 显示通过二硫化物处理源自 hDF、H9-NSC、hDF-iNSC(S0X2)和 hDF-iNSC(S0X2/ HMGA2)的DNA而进行的S0X2基因启动子的甲基化模式的分析结果。
[0047] 图3A显示hDF-iNSC(S0X2/HMGA2)在其分化形成三种主要细胞类型--即神经元 (α-互联蛋白、1'!1、00乂、(^1'、册、1^?2、和1'町1)、星形胶质细胞（6?4?)、和少突胶质细胞 (0LIG2和04)-一后的免疫细胞化学分析。
[0048]图3Β显示通过电压钳测量记录的源自人诱导神经干细胞(hiNSC)的神经元的钠电 流和动作电位。
[0049] 图3C显示通过电压钳测量记录的、在钠电流被利多卡因（lidocaine)限制后hiNSC 源神经元的钠电流和动作电位。
[0050] 图3D显示通过电压钳测量记录的、在钠电流通过洗出恢复后hiNSC源神经元的钠 电流和动作电位。
[0051 ] 图3E显示在CM-Dil标记的hiNSC被移植到4周龄小鼠的海马回区域后，hiNSC分化 形成神经元(TUJ1)、星形胶质细胞(GFAP)、和少突胶质细胞(MBP)，并且与CM-Dil共定位。 [0052]图4A显示利用S0X2/HMGA2由源自人脐带血的间充质干细胞生成iNCS的程序。图4A 确认神经球样集落在病毒转导后7天形成，以及hUCB-MSC源hiNSC被PAX6(红色）、巢蛋白（绿 色)和DAPI (蓝色)免疫染色。
[0053] 图 4B 显示被 5(^2、5(^2/^1^(：、5(^2/11呢8和5(^2/!1\?^2(经过21天）转导的衰老 hUCB-MSC的形态。通过β-半乳糖苷酶活性评价衰老的hUCB-MSC，和最初的iNSC簇仅通过 S0X2/HMGA2转导而生成。
[0054] 图 4C 显示对照组、被 S0X2、S0X2/CMYC、S0X2/LIN28 和 S0X2/HMGA2 转导的衰老 hUCB-MSC的PAX6-和巢蛋白（NESTIN)-阳性集落的定量结果。
[0055] 图4D显示实验示意图，示例由hUCB源⑶34+细胞重编程hiNSC的策略。
[0056]图4E经由点图显示通过流式细胞术分析的CD34+细胞纯度。显示由单核细胞分离 的⑶34+细胞具 有84.15 %的纯度。
[0057] 图4F显示通过免疫化学测定示例hUCB-CD34+iNSC的特征的图像，其中细胞用NSC 特异性标记物(PAX6,巢蛋白，和S0X2)、神经元标记物(NF)和星形胶质细胞标记物(GFAP)染 色。
[0058] 图5显示在显微镜下观察的用PAX6、巢蛋白、S0X2、Ki67和HMGA2免疫染色的H9-NSC 的图像。
[0059] 图6A显示被miR-CTL或者50nM或 100nM let-7b转染的hDF-iNSC(S0X2)，其在用 BrdU处理2.5小时后用BrdU特异性抗体(绿色)和DAPI (蓝色)免疫染色。
[0060] 图6B显示被miR-CTL或者50nM或 100nM let-7b转染的hDF-iNSC(S0X2)中BrdU阳性 细胞的定量结果。
[0061] 图6C显示被miR-CTL或者50nM或100nM let-7b转染的细胞的神经球直径。
[0062] 图6D显示被miR-CTL或者50nM或100nM let-7b转染的细胞的绝对数量。
[0063] 图6E显示被miR-CTL或者50nM或100nM let-7b转染的细胞的初级神经球比率。
[0064] 图7A显示hDF-iNSC(S0X2)、hDF-iNSC(S0X2/HMGA2)和H9-NSC中的阴性细胞表面标 记物(⑶44)和阳性细胞表面标记物(⑶184)的流式细胞术分析结果。
[0065] 图 7B 显示 hDF、H9-NSC、hDF-iNSC (S0X2)和 hDF-iNSC (S0X2/HMGA2)的全局基因组的 热图。
[0066] 图 7C 显示在 hDF-iNSC( S0X2/HMGA2)和 hDF 之间；和 hDF-iNSC( S0X2/HMGA2)和 H9-NSC之间进行比较的点图。
[0067] 图8A显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的hDF-iNSC(S0X2)的结果，其在用BrdU处 理2.5小时后用BrdU特异性抗体(绿色)和DAPI (蓝色)免疫染色。
[0068] 图8B显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的hDF-iNSC(S0X2)中BrdU阳性细胞的定量 结果。
[0069] 图8C显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的细胞的神经球直径。
[0070] 图8D显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的细胞的绝对数量。
[0071] 图8E显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的细胞的初级神经球比率。
[0072] 图9A显示H9-NSC在其分化形成三种主要细胞类型--即，神经元（ChAT、NF、和 MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)、和少突胶质细胞(04)-一后的免疫细胞化学分析。
[0073] 图9B显示通过电压钳测量记录的源自hiNSC的神经元的钠电流和动作电位。
[0074] 图9C显示通过电压钳测量记录的、在钠电流被利多卡因（0.1%)阻止后的源自 hiNSC的神经元的钠电流和动作电位。
[0075]图9D显示通过电压钳测量记录的、在钠电流通过洗出恢复后的源自hiNSC的神经 元的钠电流和动作电位。
[0076] 图9E显示移植的CM-Dil标记的hiNSC的免疫组织化学结果。
[0077] 图10A显示hMSC和hMSC源iNSC中的hMSC表面标记物（阴性标记物：CD34、CD45、和 HLA-DR;阳性标记物:CD73和⑶105)和阳性细胞表面标记物(CD184)的流式细胞术分析结 果。
[0078] 图10B分别显示关于HMGA2和hUCB-MSC的三种不同系的表达水平的蛋白质印迹分 析结果。
[0079] 图l〇C显示在S0X2或S0X2/HMGA2在hUCB-MSC中转导后测量的PAX6-和巢蛋白-阳性 集落形成率。
[0080] 图10D显示通过累积群体倍增水平(CroL)分析确定的H9-NSC、hDF-iNSC和hMSC- iNSC的增殖速率。
[0081 ] 图10E显示在S0X2或S0X2/HMGA2转导的hUCB-CD34+细胞中测量的PAX6-和巢蛋白- 阳性集落形成率。
[0082]图11显示确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的分化能力的结果。
[0083] 图12显示hUCBSC的HMGA2转导效力的测量结果。
[0084]图13显示通过免疫细胞化学分析测量的、8或更少代的HMGA2转导的hUCBSC的早期 阶段的HMGA2表达水平的结果。
[0085]图14显示通过微阵列测量的、8或更少代的HMGA2转导的hUCBSC的早期阶段的 HMGA2表达水平的结果。
[0086] 图15显示通过PCR测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的HMGA2表达水平 结果。
[0087]图16显示通过相位对比图像测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞 形态的测量结果。
[0088]图17显示通过β-gal染色测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的衰老相关 半乳糖苷酶(SA-i3-gal)的表达水平结果。
[0089] 图18显示通过MTT测定测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞增殖结 果。
[0090] 图19显示通过Ingenuity途径分析（IPA)软件测量的、HMGA2转导的hUCBSC中与 HMGA2过表达相关信号途径有关的基因和与分子细胞功能有关的基因的表达水平结果。
[0091] 图20显示用于评价HMGA2转导的hUCBSC中HMGA2过表达对P13K/AKT途径和mTOR/ p70s6K的影响的蛋白质印迹分析结果。
[0092]图21显示通过相位对比图像测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞 形态结果，和通过β-gal染色测量的、基于世代进程的衰老相关β_半乳糖苷酶(SA-i3-gal)表 达水平结果--用于评价HMGA2抑制型hUCBSC的衰老水平。
[0093] 图22显示通过MTT测定测量的、HMGA2抑制型hUCBSC中的细胞增殖结果。
[0094] 图23显示蛋白质印迹分析结果，以评价HMGA2转导的hUCBSC中HMGA2抑制对PI3K/ AKT途径和mT0R/p70s6K的影响。
[0095]图24显示HMGA2抑制型hUCBSC分化形成脂肪组织的能力的测量结果。
[0096] 图25显示HMGA2过表达型hUCBSC的基因表达和HMGA2抑制型hUCBSC的基因表达之 间的比较结果。
[0097] 图26显示对通过比较HMGA2过表达型hUCBSC的基因表达和HMGA2抑制型hUCBSC的 基因表达而选择的8个基因进行的PCR的结果。
[0098] 图27显示对在hUCBSC中表达在HMGA2过表达时增加并且在HMGA2抑制时减少的选 定基因和对在hUCBSC中表达在HMGA2过表达时减少并且在HMGA2抑制时增加的那些基因进 行的PCR的结果。
[0099]图28显示从脐带血源单核细胞分离的⑶34+细胞的流式细胞术分析结果。
[0100]图29显示⑶34+细胞数量基于在⑶34+特异性培养基中的培养天数的波动。
[0101]图30显示从⑶34+细胞到诱导神经干细胞的形态变化进程。
[0102] 图31显示用DAPI、巢蛋白、HMGA2和S0X2免疫染色的⑶34+iNSC的表达特征。
[0103] 优选实施方式详述
[0104] -方面，本发明提供用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的试剂 盒，其包括(a) SRY(性别决定区Y)框2(S0X2)蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和(b)高移动 性型AT钩2 (HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。
[0105] 本发明涉及通过在靶细胞如非神经元细胞等内增加两种因子S0X2和HMGA2(常规 公知的神经元分化转录因子）的表达，从靶细胞生成诱导神经干细胞。本发明的生成诱导神 经干细胞的方法可通过仅利用两种诱导因子S0X2和HMGA2由非神经元细胞制备诱导神经干 细胞，因此可比利用四或五种诱导因子的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。 另外，本发明的方法可显著减少重编程所需的时间，并且比仅利用单一S0X2基因时提供明 显更高的重编程诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的潜能。
[0106] S0X2蛋白是通过性别决定区Y-b〇X2(S〇X2)基因表达的蛋白质，已知在产前阶段基 于中枢神经系统表达并且涉及神经干细胞自我复制，但也已知常常在恶性神经胶质瘤中表 达。
[0107] 高移动性型AT钩2(HMGA2)蛋白已知通过结合于DNA充当修饰染色质结构的因子， 因此可诱导基因转录变化。
[0108] 在本发明中，S0X2蛋白和HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子可包括源自动物 (包括人、小鼠等）的所有S0X2和HMGA2，优选地源自人的S0X2和HMGA2。另外，本发明的S0X2 和HMGA2蛋白不仅可包括具有这些蛋白质的野生型氨基酸序列的那些蛋白质，而且可包括 其变体。在此，S0X2和HMGA2蛋白的变体包括由于至少一个氨基酸残基的敲除、插入、保守型 或非保守型置换或其组合具有不同于S0X2和HMGA2的天然氨基酸序列的序列的蛋白质。变 体可以是功能等同形式，其呈现与天然蛋白质相同的生物活性，或出于对理化环境提高结 构稳定性或生理活性的必要蛋白质理化性质被修饰的那些蛋白质。
[0109] 如本文所用，术语"编码S0X2或HMGA2蛋白的核酸分子"指代编码野生型S0X2或 HMGA2蛋白、或上述变体型S0X2或HMGA2蛋白--其中可通过置换、敲除、插入、或其组合修 饰至少一个核苷酸一一的核苷酸序列，并且可通过从天然来源分离或通过化学合成来制 备。
[0110]编码S0X2蛋白的核酸分子或编码HMGA2蛋白的核酸分子可处于如下形态中：各核 酸分子被独立地包含在表达载体中。
[0111] 具体地，S0X2蛋白或HMGA2蛋白可以是利用包括编码这些蛋白质的核酸分子的表 达载体由细胞系体外表达的形式的蛋白质。关于表达载体，可使用杆状病毒表达载体、哺乳 动物表达载体或细菌表达载体，而关于细胞系，可使用昆虫细胞系、哺乳动物细胞系、或细 菌细胞系，但本发明所用的表达载体和细胞系不限于此。
[0112] 如本文所用，术语"表达载体"可指代包括必需调控元件、与插入基因可操作地连 接以表达插入基因、能够表达靶蛋白的基因构建体。本发明的表达载体可用于递送重编程 诱导因子至非神经元细胞的目的。本发明的表达载体不仅可包括表达调控元件，如启动子、 操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子，而且可选择性地包括用于膜 靶向或分泌的信号序列、或前导序列，并且可根据目的用途被不同地制备。载体的启动子可 以是组成型或诱导型的。另外，表达载体包括选择性标记物，用于选择包括载体的宿主细 胞，并且在表达载体是可复制的表达载体时，其包括复制起点。表达载体可自我复制或可整 合到宿主DNA中。载体可包括质粒载体、粘粒载体、游离基因载体、病毒载体等，优选病毒载 体。病毒载体可包括源自下列的载体:逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠白血病病毒 (MLV)、禽肉瘤/造血白细胞组织增生(ASLV)、脾坏死病毒（SNV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠 乳腺肿瘤病毒(MMTV)、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、仙台病毒等，但不限于此。
[0113] 编码S0X2或HMGA2蛋白的核酸分子可以是信使RNA(mRNA)。
[0114] 如本文所用，术语"重编程"指代使以具有不同特征的状态存在的分化的细胞(例 如，无分化能力的细胞或有部分分化能力的细胞等)恢复或转化成具有新型分化能力的细 胞的过程。细胞的重编程机制指代在敲除核内的表观遗传标记（与导致功能遗传性变化而 不导致给定核苷酸序列变化相关的DNA状态）后，建立不同的表观遗传标记组，并且不同的 细胞和组织在多细胞生物体分化和成长过程中获得不同的基因表达程序。这些不同的基因 表达谱呈现通过表观遗传修饰(例如，DNA甲基化、组蛋白修饰、和其他染色质结合蛋白）被 基本上控制。因此，多细胞生物体中的细胞类型被固定，并且在细胞分化或脱离细胞周期后 不变，但在正常发育过程中或具体疾病的进展过程中的具体时期，可进行主要表观遗传重 编程。本发明提供通过用具体蛋白质处理已经分化的目标细胞来制备具有未分化细胞的潜 能的细胞的方法。
[0115] 如本文所用，术语"重编程诱导因子"指代这样的物质：可诱导最终分化的细胞或 部分分化的细胞被重编程形成具有分化形成新细胞类型的潜力的诱导神经干细胞，并且可 包括S0X2蛋白、HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子。重编程诱导因子可无限制地包括任 何能够诱导分化细胞重编程的物质。
[0116] 如本文所用，HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子可以是染色质调控因子。具体 地，染色质是核小体，具有DNA与组蛋白之间复合物的基础结构。染色质调控进行使得相应 基因的表达特征随DNA包围组蛋白的方式变化(例如，组蛋白乙酰化、DNA甲基化等)而变化。 因此，染色质可通过DNA甲基化/去甲基化被调控，并且HMGA2可通过促进S0X2基因的启动子 区域的低甲基化来充当染色质调控因子(实施例4-5)。
[0117]如本文所用，"非神经元细胞"指代除神经元细胞外充当本发明的靶细胞的所有分 化或未分化的细胞。非神经元细胞可以是源自不同动物(包括人、猴、猪、马、牛、羊、狗、猫、 鼠、兔等）的细胞，优选源自人的细胞，但通过诱导神经干细胞重编程的细胞不限于此。
[0118] 非神经元细胞可以是体细胞、成熟干细胞、或多能干细胞。
[0119] 如本文所用，术语"体细胞"指代构成成年者(adult)的细胞，具有有限的分化能力 和自我更新能力，具体地，体细胞构成人的皮肤、毛发、脂肪、血液等，优选是人成纤维细胞 或人脐带血细胞，但不限于此。
[0120] 如本文所用，"成熟干细胞"指代存在于骨、脂肪、骨髓基质、肌肉、神经等的干细 胞，优选间充质干细胞，但不限于此。
[0121 ]如本文所用，"诱导神经干细胞"指代通过对分化细胞应用重编程技术来构建具有 与神经干细胞相似或相同的多能性的未分化干细胞而制备的细胞。诱导神经干细胞具有与 神经干细胞相同或相似的特征，具体地具有相似的细胞形态、相似的基因和蛋白质表达谱， 并且可具有体内和体外多能性。因此，本发明的诱导神经干细胞可以是可分化形成神经细 胞(神经元）、星形胶质细胞、少突胶质细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞等的 神经干细胞。
[0122]本发明的试剂盒可不被具体限制，而可使用可在本领域常规使用的任何试剂盒类 型。
[0123]本发明的试剂盒可以如下形式包装:包括S0X2蛋白和编码S0X2蛋白的核酸分子的 第一组合物和包括HMGA2蛋白和编码HMGA2蛋白的核酸分子的第二组合物分别被包含在单 独的容器中，或包含在唯一的容器中，该唯一的容器被划分成超过一个部分。
[0124] 在本发明的示例性实施方式中，为确认S0X2和HMGA2蛋白在人成纤维细胞至诱导 神经干细胞的重编程诱导过程中的效果，使这些蛋白质过表达，并通过PAX6/巢蛋白阳性集 落分析连续检查其形态变化和重编程诱导效力。结果是，确认在S0X2和HMGA2的表达同时增 加时，与仅S0X2表达增加时相比，自我更新能力、增殖能力和神经元细胞分化能力以及重 编程诱导效力增加。具体地，在仅以HMGA2诱导重编程时，诱导神经干细胞的集落早约10天 形成。
[0125] 另外，确认S0X2和HMGA2可有助于脐带血源间充质干细胞(hUCB-MSCs)和脐带血源 血细胞有效重编程形成诱导神经干细胞，并且具体地，确认HMGA2可有助于重编程效力提高 并减少重编程所需时间。
[0126] 作为本发明使用的非神经元细胞，脐带血源间充质干细胞是成熟干细胞的一个代 表性实例，脐带血源血细胞是体细胞的一个代表性实例，并且这些结果表明在S0X2和HMGA2 作为重编程诱导因子的辅助下，不仅体细胞，而且成熟干细胞也可被诱导神经干细胞有效 重编程。
[0127] 另一方面，本发明提供制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或自其分化 的神经元细胞的方法。具体地，本发明的方法可包括(a)递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核 酸分子，和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加 S0X2蛋白和 HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达;和(b)培养步骤(a)的细胞。
[0128] 优选地，本发明的方法可进一步包括步骤(c):从步骤(b)获得的细胞培养物分离 神经干细胞样集落。
[0129] 在根据本发明生成诱导神经干细胞的方法中，可通过将S0X2和/或HMGA2的表达调 控元件引入靶细胞来增加 S0X2和HMGA2在靶细胞中的表达。
[0130] 具体地，递送重编程诱导因子一一如S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和 HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子--至细胞的方法可无限制地通过提供本领域使 用的核酸分子或蛋白质的常规方法进行，优选如下方法:添加重编程诱导因子至非神经元 细胞培养基、或直接将重编程诱导因子注入非神经元细胞，其中在此使用的重编程诱导因 子可以以下列形式使用：病毒，其由病毒载体转染的包装细胞获得，其中相应基因，即编码 S0X2蛋白的核酸分子和编码HMGA2蛋白的核酸分子，被分别插入;mRNAs，其通过体外转录生 成;或蛋白质，其在各种细胞系中生成。
[0131 ] 将重编程诱导因子直接注入分化细胞的方法可通过本领域已知的任何方法进行， 但不限于此，并且可通过适当选择方法进行，该方法选自微注射、电穿孔、粒子轰击、直接注 射入肌肉、和利用绝缘子和转座子的方法。
[0132]所用病毒载体可以是源自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病 毒、仙台病毒等的载体，但不限于此，并且优选地，可使用逆转录病毒载体。另外，关于包装 细胞，可在根据所用病毒载体选择后，使用本领域已知的各种细胞。
[0133] 另外，S0X2和HMGA2在靶细胞中的表达可通过引入S0X2和/或HMGA2的表达调节因 子来增加。
[0134] 具体地，HMGA2的表达调节因子可以是let_7miRNA簇抑制剂或TOE4D抑制剂。let-7miRNA簇已知是靶向HMGA2从而减少其表达的miRNA。在本发明中，可以通过引入let-7miRNA簇抑制剂来增加靶细胞中的HMGA2表达量。
[0135] 另外，S0X2的表达调节因子可以是PDE4D抑制剂。cAMP活化的主要细胞机制已知是 通过被称为环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)的同工酶系列的cAMP分解。PDE酶包括12种已知的 酶。IV型PDE抑制(PDE4抑制)被公认在炎症介导释放的抑制和气道平滑肌的松弛中尤其有 效。表明cAMP活化为在SCI后诱导神经元细胞以克服抑制剂信号的有希望的策略。通过洛利 普兰(rolipram)--TOE4抑制剂--抑制cAMP水解已知防止在脊髓挫伤后cAMP水平下降。 因此，当TOE4抑制剂结合于许旺细胞移植物时，其促进相当大的脊髓和本体感受轴突保留 和髓鞘形成。可以使用SelCID?作为TOE IV活性抑制剂。
[0136] 因此，PDE4D抑制剂--S0X2和HMGA2的常用表达调节因子--的应用可增加 S0X2 和HMGA2的表达量，从而显著增加重编程诱导效力等。
[0137] 除本发明的重编程诱导因子S0X2和HMGA2外，重编程诱导因子还可包括选自下列 的至少一种蛋白质 :0(^4、1(1?4、01^(：、1^呢8、和似11(^、或编码这些蛋白质的至少一种核酸 分子。这些蛋白质是已知的重编程诱导因子，并且其中CMYC和LIN28属于let-7miRNA簇。因 此，可通过另外表达这些诱导因子来增加重编程诱导效力。
[0138]另外，在本发明中，可利用其他纳米颗粒或化合物来引入S0X2蛋白或编码S0X2蛋 白的核酸分子、和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。
[0139] 本发明的步骤(b)的细胞培养可在本领域已知的适当的培养基和培养条件下进 行。这些培养过程可容易根据所选细胞被本领域技术人员调节。
[0140] 步骤(b)包括在神经元细胞分化培养基中培养，并且神经元细胞可自诱导神经干 细胞形成。
[0141] 另一方面，本发明提供通过上述方法制备的诱导神经干细胞或自其分化的神经元 细胞。
[0142] 诱导神经干细胞同上述。
[0143] 实施例中确认，诱导神经干细胞可分化形成神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细 胞，并且还可获得自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞。
[0144] 另一方面，本发明提供用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，其包括诱导神经干 细胞或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。
[0145] 本发明的诱导神经干细胞是可分化形成神经元相关细胞的那些细胞，因此可用于 神经元细胞再生。因此，其可用作细胞治疗产品。
[0146] 本发明的细胞治疗产品可包括1 .OX 105个细胞至1 .OX 109个细胞/lmL，优选1.0X 1〇6个细胞至1.0X108个细胞/lmL，更优选1.0X107个细胞/lmL，但不限于此。
[0147] 本发明的细胞治疗产品可不经冷冻干燥使用或被冷冻干燥以后续使用。在需要冷 冻干燥时，可在冷冻干燥前将标准冷冻保存液(例如，DMS0、甘油、和Epi 1 ife?细胞冻干介 质(Cascade Biologies))加入细胞群。
[0148] 另外，细胞治疗产品可在根据医药领域常规方法配制成适于给予患者身体的单位 给予形式后被给予，并且该制剂可包括在单次或几次给予后有效的给予剂量。适于此目的、 作为胃肠外给予制剂的制剂实例可优选为注射剂如注射安瓿瓶、输注剂如输注袋、和喷雾 剂如气溶胶制剂等。注射安瓿瓶可通过在使用前夕混合注射剂制备。关于注射液，可使用生 理盐水、葡萄糖、甘露醇、林格溶液等。另外，关于输注袋，可使用聚氯乙烯或聚乙烯材料，输 注袋可由Baxter、Becton Dickinson、Medcep、National Hospital Products、和Terumo制 造。
[0149] 细胞治疗产品可进一步包括至少一种药学上可接受的载体，例如，保存剂、镇痛 剂、增溶剂、稳定剂等，用于注射制剂;和基质、赋形剂、润滑剂、保存剂等，用于局部制剂。
[0150] 由此制备的本发明的细胞治疗产品可通过本领域使用的常规给予方法连同用于 移植和其他用途的其他干细胞一起或以与这些干细胞混合的形式给予，并且可优选被直接 灌输(移入，engrafted)或移植至疾病区域、或直接移植或输注至需要治疗的患者的腹腔， 但不限于此。另外，该给予可通过利用导管的非外科给予方法或通过截断后注入疾病区域 或移植至疾病区域的外科给予方法来给予，但更优选通过利用导管的非外科给予方法给 予。另外，根据常规方法的胃肠外给予，例如，直接给予到损伤中，和通过输注到血管中的移 植一一造血干细胞移植的普通方法，是可以的。
[0151] 上述细胞的日剂量可被给予一次或每日以几个分剂量给予，该分剂量为1.0 X104 个细胞/kg至1.0 X 101()个细胞/kg体重，优选1.0 X 105个细胞/kg至1.0 X 109个细胞/kg体 重。然而，应理解，活性成分的实际剂量考虑多种相关因素来确定，如待治疗疾病、疾病严重 程度、给予途径、患者体重、年龄和性别等，因此剂量不应被以任何方式解释为限制本发明 的范围。
[0152] 另一方面，本发明提供抑制或恢复对象的神经元细胞损伤的方法，包括给予重编 程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞。具体地，对象的神经元细胞损伤可通过给 予重编程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞被抑制或恢复，该重编程通过如下进 行:递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至 非神经元细胞;和培养该细胞。
[0153] 如本文所用，术语"对象"指代牛、狗、猪、鸡、羊、马、和包括人的哺乳动物，但不限 于此。优选地，重编程的诱导神经干细胞或其培养产物的给予可被腹膜内或血管内给予、直 接给予到损伤中或给予到关节滑膜腔中等。
[0154] 神经元细胞损伤的抑制或恢复可包括预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病。
[0155] 另一方面，本发明提供预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，其包 括SRY(性别决定区Y)框2(S0X2)蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子、和高移动性型AT钩2 (HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子，作为活性成分。
[0156] 如上所述，包括S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋 白的核酸分子的组合物可被引入非神经元细胞，以诱导其重编程形成神经干细胞，从而用 于预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病。
[0157] 另外，S0X2和/或HMGA2基因可被以如下形式提供:本领域已知的胞内基因递送系 统或基因转运体，例如，脂质复合体（lipoplex)，多聚体(polyplex)，细胞渗透肽(CPP)，蛋 白转导域(PTD)等，但不限于此。
[0158] PTD可无限制地被使用，只要其可提高S0X2和/或HMGA2的胞内引入效力。
[0159] 另外，S0X2和/或HMGA2可以是融合蛋白形式，该融合蛋白被S0X2和/或HMGA2质粒 和转运子之间的缀合物编码，从而将质粒递送到细胞中。例如，其可以是S0X2和/或HMGA2和 CPP或PTD之间、或S0X2和/或HMGA2和低分子量鱼精蛋白缀合物之间的融合蛋白形式。
[0160] 如本文所用，术语"神经元细胞损伤相关疾病"指代可由于神经元细胞改变、丧失 等发生的疾病、包括帕金森病、阿尔茨海默氏症、匹克氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、 缺血性脑病如中风、脱髓鞘疾病、多发性硬化症、癫痫、退行性神经元疾病、脊髓损伤等，但 不限于此。
[0161] 如本文所用，术语"预防"指代与通过给予上述组合物抑制或延迟神经元细胞损伤 相关疾病有关的各种行为，术语"治疗"指代与通过给予上述组合物导致神经元细胞损伤相 关疾病症状改善或有利变化有关的各种行为。
[0162] 另一方面，本发明提供筛选神经干细胞或神经元细胞的再生启动子或再生抑制剂 的方法，包括1)制备分离的非神经元细胞;2)通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分 子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞、或增加 S0X2蛋白和HMGA2蛋 白在非神经元细胞中的表达，诱导生成诱导神经干细胞;3)任选地，使步骤2)生成的诱导神 经干细胞分化形成神经元细胞;和4)在步骤1或步骤2后用候选物质进行处理，和根据候选 物质的处理，确定诱导神经干细胞或神经元细胞是否生成或其生成水平。
[0163] 在本发明中，通过非神经元细胞重编程是否生成神经干细胞或神经元细胞或生成 水平可通过观察诸如下列的变化来评价:候选物质处理之前和之后的非神经元细胞形态变 化、神经元细胞特异性标记物是否表达、自我更新能力、增殖能力、神经元细胞分化能力等。
[0164] 另外，本发明可进一步包括如下步骤：如果诱导神经干细胞或神经元细胞的生成 水平在步骤4中增加，则确定该候选物质是神经干细胞或神经元细胞的再生启动子。
[0165] 优选地，筛选方法可利用从患者分离的非神经元细胞筛选患者定制的神经干细胞 或神经元细胞再生启动子或患者定制的神经干细胞或神经元细胞再生抑制剂。
[0166] 具体地，可通过如下提供治疗方法:基于个别检查确定适于个别患者的构成或环 境的神经元细胞再生启动子或再生抑制剂。因此，可通过如下选择定制治疗剂:根据筛选方 法选择候选药物作为神经元细胞再生启动子或再生抑制剂，用该药物治疗神经元细胞损伤 相关疾病患者，和确认治疗效果，然后进行测绘(mapping)和将其储存。即，通过结合体外筛 选方法和体内确认方法，可更有效地选择和确认神经元细胞损伤相关患者的定制治疗剂。
[0167] 在本发明的示例性实施方式中，通过上述筛选方法确认，当HMGA2基因被另外引入 时，与S0X2基因或类似物被引入时相比，诱导形成诱导神经干细胞的效力增加约两倍或更 高，因此确认HMGA2蛋白可用作神经元细胞的再生启动子。
[0168] 另一方面，本发明提供筛选个人定制的神经元细胞治疗剂的方法，包括：1)制备分 离的非神经元细胞;2)通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码 HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞、或增加 S0X2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细胞中的 表达，诱导生成诱导神经干细胞;3)使步骤2)生成的诱导神经干细胞分化形成神经元细胞； 和4)用候选物质处理步骤3形成的非神经元细胞，和确定候选物质是否是针对非神经元细 胞获取对象定制的神经元细胞治疗剂。
[0169] 具体地，为根据个别患者的构成或环境来选择个人定制神经元细胞治疗产品，可 通过确认神经元再生相关机制和其相关蛋白质表达的变化、通过用候选物质处理步骤2诱 导的神经干细胞或步骤3形成的神经元细胞来确认和验证用于生成诱导神经干细胞的非神 经元细胞是否可用作非神经元细胞获取对象的定制神经元细胞治疗产品。
[0170] 另一方面，本发明提供促进非神经元细胞重编程形成诱导神经干细胞(iNSC)的组 合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。
[0171] 在本发明的示例性技术特征中，确认当HMGA2蛋白的表达和S0X2因子(传统公知是 神经元分化转录因子)一起增加时，从非神经元细胞至诱导神经干细胞的诱导效力和增殖 能力显著高于利用常规S0X2的重编程。因此，HMGA2蛋白和编码HMGA2蛋白的核酸分子可用 于促进重编程非神经元细胞形成神经干细胞。
[0172] 另一方面，本发明提供用于细胞增殖的组合物或用于抑制细胞衰老的组合物，其 包含HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。
[0173]如本文所用，术语"细胞增殖"包括细胞数量增加，因此细胞增殖伴随DNA复制、细 胞分裂、和各种细胞组分增加，并且体内细胞增殖速率可被控制。
[0174] 另外，术语"细胞衰老"指代包括下列的过程:细胞特征和功能退化，直到细胞死亡 或细胞增殖终止之时。已知的衰老原因包括代谢被代谢产物抑制、细胞表面变化、细胞骨架 分子如胶原蛋白之间交联增加、退化分子通过自由基在细胞中积累、遗传信息转录和翻译 错误积累、被致死基因遗传编程的细胞的预期寿命、胞内DNA损伤和修复活性恶化等。如本 文所用，术语"衰老"不仅包括细胞衰老，而且包括组织和活生物体衰老。具体地，干细胞衰 老可伴随，随着次代培养数增加，干细胞中衰老相关半乳糖苷酶的表达增加、干细胞尺寸 增加、干细胞增殖速率降低、增殖期缩短、端粒酶活性减少、或干细胞分化能力下降。
[0175] 在本发明实施例11至20中，确认HMGA2转导的人脐带血源细胞(hUCBSC)不仅显示 形态变化减少，而且显示SA-i3-gal表达减少和细胞增殖保持。相比之下，当HMGA2被抑制时， 形态变化增加，而且随同SA-i3-gal表达增加，细胞增殖显著减少。因此，确认HMGA2蛋白过表 达可促进基 质细胞增殖，同时抑制细胞衰老。另外，根据本发明控制基质细胞的增殖、保持 和衰老可通过下列进行:控制基质细胞的增殖一一通过经由基质细胞转染诱导HMGA2蛋白 的表达，和保持分化能力和干细胞能力，从而防止基质细胞衰老。因此，随着在培养过程中 次代培养数增加，基质细胞的衰老更快进行，因此细胞分裂快速减少的问题可被解决。这种 方法也可用于干细胞。
[0176] 下文将参考下列实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅以示例 为目的，而非意图本发明受限于这些实施例。
[0177] 制备实施例1:细胞培养
[0178] (1)在足月分娩后立即从20至30岁母体获得人脐带血源间充质干细胞（hUCB- MSC)，仅使用自分娩24小时内收集的血液样本。将脐带血样本与HetaSep溶液(Stem Cell Technology，加拿大温哥华）以5: l(v/v)的比例混合，然后在室温下进行培育，直到血红细 胞耗尽。在培育后，收集上清液，并通过在2,500rpm下Ficoll(GE healthcare life sciences，匹兹堡，PA)密度梯度离心20分钟收集单核细胞。细胞用PBS洗涤两次，并接种于 具有生长培养基的培养皿上，该生长培养基为包含10%胎牛血清(FBS;Gibco BRL)的内皮 细胞生长培养基_2(Gibco BRL，Grand IslancUNY)。在Boramae医院机构审查委员会 (Institutional Review Board，IRB)和首尔国立大学（Seoul National University)IRB (1109/001-006)的批准下进行分离和研究方案。
[0179] (2)同时，人真皮成纤维细胞(hDF，C-013_5C)购自Life Technologies，并被培养 于包含10%FBS的成纤维细胞生长培养基-2(Gibco BRL)中。
[0180] (3 )H9源人神经干细胞(H9-hNSC，NA800-100)购自Gibco，并被培养于包含StemPro 神经补充物、碱性FGF、和EGF重组蛋白的KnockOut DMEM/F12基础培养基中。
[0181] (4)分离人脐带血源基质细胞，并将其如下述培养。具体地，为从脐带血(首尔国立 大学医院）去除血红细胞，将脐带血与HetaSep溶液（Stem Cell Technology，加拿大温哥 华）以5:l(v/v)的比例混合，然后在室温下培育30分钟。小心收集上清液，通过添加 Ficoll 溶液收集单核细胞并在2，500rpm下离心20分钟。仅收获分离的细胞，用PBS洗涤两次，并以2 X 1〇5个细胞/cm2的浓度培养在包含肝素、抗坏血酸、重组人表皮生长因子(rhEGF)、氢化可 的松、血管内皮生长因子(VEGF)、重组人成纤维细胞生长因子(rhFGF-B)、重组长R胰岛素样 生长因子-1(R3-IGF-1)、硫酸庆大霉素、两性霉素-B(GA-1000))和10%FBS(Gibco)的EMEM (Gibco)培养基中。培育后4天，去除未附于底部的那些细胞，并在80%细胞汇合时进行次代 培养。
[0182] 制备实施例2:通过转导由人真皮成纤维细胞制备人诱导神经干细胞(hiNSC)
[0183] 通过VSV-G和gag/pol质粒和Fugene 6转染剂（Roche，Indianapolis，IN)，将S0X2、 HMGA2、CMYC和LIN28质粒转染到293T细胞中。在转染后48小时和72小时后收集病毒，并加载 54区/1111^聚凝胺（5丨81]^，1?〇111^〇111^〇11^，附），以转导单独或与至少两种基因组合的基因至11〇?、 hUCB-MSC和HJCB-CD34+MNC。转导后，将细胞用roS洗涤两次以去除病毒，并在生长培养基中 培养以增殖。
[0184] 为进行神经干细胞诱导，将培养基替换成ReNcell NSC维持培养基(Millipore， Billerica,ΜΑ)--神经干细胞诱导培养基，包含bFGF( Sigma)和EGF( Sigma)。通过 Accutase(Gibco BRL)对hiNSC进行次代培养。
[0185] 实施例1:分离iNSC和确认其特征
[0186] 利用逆转录病毒S0X2，通过ST0饲养细胞，在涂有聚-L-鸟氨酸(PL0)和纤连蛋白 (FN)的玻璃盖玻片上将hDF转染成hiNSC。在转染2周至3周内从S0X2转导的hDF生成S0X2样 和NSC样集落。
[0187] 分离诱导神经干细胞集落，并通过反复的次代培养和神经球培养使其稳定。为附 着诱导神经干细胞，将玻璃盖玻片涂覆PL0/FN，并将5 X 104个诱导神经干细胞散布于其上。 在24小时内，将细胞用4%多聚甲醛(PFA)固定20分钟，然后用0.3%Triton X-100 PBS透化 10分钟。将细胞用5%正常山羊血清(NGS)阻断1小时，并用初级抗体以1:100的浓度处理过 夜。第二天，将细胞用次级抗体以1:1000的浓度培育1小时。其核用DAPI染色，并在固定后干 燥。
[0188] 结果是，S0X2转导的iNSC具有与H9源NSC(H9-NSC)相似的形态，并且显示NSC特异 性标记物如PAX6、巢蛋白、波形蛋白（VnffiNTIN)和S0X2的表达(图1A至1D和S1A)。
[0189] 实施例2:分析S0X2转导的hiNSC中的miRNA表达谱
[0190] 实施例2-1:微RNA微阵列分析
[0191] 利用Trizol试剂从细胞提取全RNA，为了生成荧光标记的miRNAs，利用Agilent miRNA完全标记和杂交试剂盒将100ng全RNA样本标记并杂交。通过Agilent微阵列扫描仪扫 描带标记miRNA的信号。利用软件(Agilent特征提取软件(vll.0.1.1))提取原始数据，并利 用R统计学语言v. 2.15.0对其进行分析和可视化。
[0192] 实施例2-2 :miRNA表达谱的分析结果
[0193] 通过如同实施例2-1的微阵列分析，确定hDF、H9-NSC和S0X2转导的hiNSC的miRNA 谱。
[0194] 结果是，确认，S0X2转导的hiNSC的miRNA表达谱，与hDF相比，更相似于H9-NSC(图 1Ε)〇
[0195] 具体地，确认在成纤维细胞向功能神经元的转化中具有主要作用的神经谱系 (neural lineage)特异性miRNA如miR-9-5p、miR-9_3p、和miR-124的表达水平在H9-NSC和 S0X2转导的hiNSC中比在hDF中更加上调。
[0196] 另外，关于已知在NSC维持和自我更新的控制中发挥作用的let-7,确认整个let-7/miR-98家族的表达水平在H9-NSC和S0X2转导的hiNSC中比在hDF中更加下调（图IF和1J)。
[0197] 然而，未检测到在hDF、H9_NSC和S0X2转导的hiNSC之间胚胎干细胞特异性 miRNA--miR-302/367家族--的表达有显著改变，但在人胚胎干细胞(hESC)中检测到显 著表达。
[0198] 实施例3: Let_7b导致iNSC重编程效力、增殖、和自我更新的分析
[0199] 实施例3-1 :miRNA活性导致iNSC重编程效力的分析
[0200] 为确认miRNA活性是否促进hDF重编程形成iNSC，在重编程过程中用3(^2转染11^1?- 9-5p、miR-9-3p、miR-l 24、抗let-7b、let-7b、miR-CTL 和抗 miR-CTL。
[0201 ]具体地，利用市售hsa_let_7b( Invitrogen，PM11050)、miR-124_3p( Invitrogen， PM10691)、miR-9-5p(Invitrogen，PM10022)、miR-9-3p(Invitrogen，PM13072)和抗 let-7b (Invitrogen，AMI 1050 )使miRNA过表达，并使用适当的pre-miRNA前体-阴性对照 (Invitrogen，AM17110)和抗miRNA抑制剂-阴性对照（Invitrogen，AM17010)。
[0202]关于集落形成率测定，将2 X104个细胞的S0X-2转导的hDF接种于24孔板，然后转 染。转染利用5〇11]\1118&-161：-713、111丨1?-124-3。、111丨1?-9-5。、111丨1?-9-3。和抗161：-713进行（第0天）， 并在3天后(第3天)再次转染。
[0203] 结果是，确认S0X2转导的hDF转化成神经元样细胞，而非NSC样集落。在miR-124、 miR-9-5p或miR-9-3p转染的细胞中，与miR-CTL转染的细胞相比，形成PAX6/巢蛋白阳性集 落的效力下降很少或根本无变化。
[0204] 然而，与抗miR-CTL相比，let_7b的过表达使重编程效力下降，而let_7b抑制使重 编程效力增加至少3 · 5倍(图11)。
[0205] 实施例3-2: let_7b导致hiNSC增殖的能力
[0206] 为确认miRNA let_7b是否控制hiNSC的增殖，用S0X2转导的hiNSC转染let_7b，并 通过分裂细胞的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记来测量细胞增殖。
[0207] 具体地，为测量细胞的增殖速率，如下述将iNSC用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU;Sigma) 染色。简而言之，将1〇μΜ BrdU加入细胞培养基，并在37°C下培育5小时。然后，用roS洗涤细 胞，并用4%PFA将其在室温下固定10分钟。关于透化，在85°C下应用柠檬酸钠缓冲剂15分 钟，并用阻断液(5%NGS)培育细胞。然后将细胞用在阻断液(AbeamCambridge，MA)中稀释 的BrdU初级抗体在4°C下培育过夜。用次级Alexa-488抗体处理细胞1小时。关于核染色，将 DAPI在PBS中稀释至l:1000，并与细胞一起培育10分钟。用共聚焦显微镜(EclipseTE200， Nikon，日本东京）拍摄图像。
[0208]结果是，确认BrdU阳性细胞的百分比减少，具体地，let_7b的转染使hiNSC的增殖 以剂量依赖性方式减少（图6A和6B)。
[0209] 实施例3-3: let_7b导致hiNSC的自我更新能力
[0210] 为确认let_7b是否调节S0X2转导的hiNSC的自我更新，进行神经球形成测定。
[0211] 具体地，在miRNA处理后，将2，000个细胞在非粘性培养皿中培养，形成初级神经 球。利用Accutase使初级神经球细胞解离成单个细胞，然后在非粘性培养中以克隆密度重 新铺平板，形成次级神经球。培养7天后计数和测量次级神经球的数量和尺寸。
[0212] 结果是，确认let-7b-转染的hiNSC的尺寸小于miR-CTL转染的hiNSC的尺寸，而且 let-7b在亚克隆过程中的增加导致几乎不形成次级神经球(图6C至7E)。
[0213] 实施例4:同时转导S0X/HMGA2导致hiNSC重编程激活
[0214] 由于实施例3确认了 let_7b过表达使hiNSC重编程效力下降，因此考察MYC和LIN28 (已知抑制let-7b的表达)和HMGA2(其表达已知被let-7b抑制）的过表达是否可提高hiNSC 重编程效力。
[0215] 实施例4-1 :HMGA2导致细胞增殖的确认
[0216] 为考察CMYC、LIN28和HMGA2与S0X2组合过表达与单独S0X2过表达相比是否增加细 胞增殖，进行MTT测定。具体地，将1 X 104个细胞接种于24孔板。培育48小时后，将50yL MTT 原液(5mg/mL)加入培养基。在37°C下培育4小时后，移除包含MTT溶液的培养基。添加 DMS0以 溶解甲願晶体，然后将溶液转移至96孔板。通过EL800微板读取器(BIO-TEK Instruments， Winooski，VT)测量540nm波长下的吸光度。
[0217] 结果是，确认其中HMGA2具有最低增殖能力，并且其比CMYC低32%，比LIN28低 17%(图 2A)。
[0218] 实施例4-2 :HMGA2导致iNCS重编程效力提高的确认
[0219] 为确认CMYC、LIN28和HMGA2与S0X2组合过表达与单独S0X2过表达相比是否促进 hiNSC重编程，分别测量各情况的形成PAX6/巢蛋白阳性集落的效力。
[0220]结果是，确认HMGA2与S0X2的过表达显著增加 hiNSC的重编程效力（图2C)，并且 S0X2/HMGA2的同时过表达使形成PAX6/巢蛋白阳性集落所需的时间从17天减少至7.4天（图 2B)〇
[0221 ] 实施例4-3: HMGA2导致免疫表型变化的确认
[0222] 为确认在重编程早期阶段是否诱导了免疫表型变化，确定荧光激活细胞分选术 (FACS)〇
[0223] 结果是，观察到仅S0X2/HMGA2过表达细胞显示细胞总量约10 %的细胞群在转染后 7天从CD44-阳性变成⑶44-阴性，同时，细胞群约7%显示从⑶184-阴性变成⑶184-阳性(图 2D)。
[0224] hiNSC和H9-NSC大部分显示CD44-阴性和CD184阳性细胞群（图7A)，S0X2/HMGA2转 导的hiNSC还显示与S0X2转导的hiNSC和H9-NSC相似的形态特征，和NSC特异性标记物，如 PAX6、巢蛋白、S0X2、Ki67、和 HMGA2 的表达（图 2E)。
[0225] 实施例4-4: HMGA2导致的转录组重编程水平的评价
[0226] 为评价HMGA2导致的转录组重编程水平，通过微阵列分析来分析比较性全局基因 表达数据，并进行定量实时PCR(qRT-PCR)以评价微阵列数据。
[0227] 结果是，确认全局基因组热图和成对的散布图显示，hiNSC非常类似于H9-NSC，但 不同于亲本hDF(图 7B和7C)。S0X2-和S0X2/HMGA2转导的 iNSC中均诱导了 S0X2、HMGA2、PAX6、 巢蛋白、0LIG2、MSI 1和GLAST，并且其表达水平与H9-NSC相当（图2F)。
[0228] 实施例4-5: S0X2启动子的甲基化状态分析
[0229] 为分析hDF、H9-NSC和S0X2-和S0X2/HMGA2转导的hiNSC中的S0X2DNA的甲基化状 态，利用EZ DNA甲基化-金试剂盒(Zymo Research，Irvine，CA)使未甲基化的胸腺啼啶转化 成胞嘧啶。
[0230]具体地，通过整合热变性和利用CT转化试剂的硫酸氢钠处理，使CpG岛中的未甲基 化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。随着在进行酸性亚硫酸DNA转化后回收DNA，将转化的DNA去磺 化，随后清洁和洗脱。然后，立即通过PCR扩增酸性亚硫酸根修饰的DNA，并将其储存在-20°C 以下。关于酸性亚硫酸根转化的DNA的扩增，在MethPrimer(http://www· urogene · org/ methprimer)设计引物，并进行PCR。引物序列显示如下：
[0231] Sox2正义5'-GGGATATGATTAGTATGTATTTTTT-3'（SEQ ID N0:1)，
[0232] Sox2反义5，-AATTTTCTCCATACTATTTCTTACTCTCCT-3，（SEQ ID N0:2)
[0233] 将生成的PCR产物与pGEM T-Easy载体系统I(Promega，Madison，WI)连接。然后，将 质粒DNA克隆到细菌（DH5c〇。利用ABI 3730XL毛细管DN A测序仪(Applied Biosystems)，通 过Ml3反向引物(5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 '）测序，来分析从细菌克隆提取的质粒 DNA。随后，甲基化的CpGs通过黑圆圈表不，而未甲基化的CpG通过白圆圈表不。
[0234] 结果是，确认hiNSC中的S0X2启动子是低甲基化的，类似于H9-NSC，表明S0X2在转 录上是活化的（图2G)。因此，确认HMGA2发挥染色质调控因子的作用，促进S0X2启动子低甲 基化。
[0235] 总之，本实施例表明HMGA2,作为let_7b靶，显著增加 S0X2诱导的重编程形成hiNSC 的效力和时间，并且S0X2/HMGA2转导的hiNSC在细胞表面标记物特征、转录水平、甲基化模 式等方面显示与H9-NSC相似的特征。
[0236] 实施例5: HMGA2下调导致hiNSC增殖和自我更新抑制的确认
[0237] 为确认HMGA2是否控制hiNSC的增殖，用HMGA2靶向性siRNA(siHMGA2)转染hiNSC， 并通过BrdU标记分裂细胞来测量细胞增殖--具体地，利用市售siRNA(Dharmacon，0N Target plus SMART pool，03七札-013495-00-0005，1^€&76?6,〇))作为!《^2抑制剂，和非 革巴向性siRNA(Dharmacon，0N Target plus SMART pool，Cat#D-001810_01)作为对照。将细 胞以1 X 104的浓度接种于24孔板，并用加入无抗生素的培养基的Dharmafect转染剂 (Dharmacon)转染50nM siRNA。
[0238] 结果是，HMGA2的下调使BrdU阳性细胞的百分比急剧减少（图8A和8B)。另外，确认 siHMGA2转染的hiNSC显著减少神经球尺寸，而且减少自我更新，如通过可在初级神经球中 产生次级神经球的细胞的数量和百分比确认（图S4C至S4E)。总之，表明利用针对HMGA2的 s iRNA下调HMGA2，抑制hiNSC的增殖和自我更新。
[0239] 实施例6:hiNSC多能性的确认
[0240] 关于神经分化，将hiNSC以1,000的密度接种于包含iNSC维持培养基(ReNcell NSC 维持培养基(Millipore))的24孔板中的各聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白涂覆的盖玻片上。24小时 后，将培养基更换成Neurocult (Stem Cel 1 Techno logy)，进行随机分化。1周Neurocul t后， 将培养基更换为三种具体谱系(神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞)的诱导培养基。 [0241 ]同时，在诱导分化后，通过免疫细胞化学利用谱系相关标记物确认iNSC。
[0242]实施例6-1:神经元分化能力的确认
[0243] 作为神经元诱导培养基，使用DMEM/F12(Gibco BRL)和Neurobasal(Gibco BRL)之 间的1:1混合物，其包含B27(Gibco BRL)、Gmax(Gibco BRL)、维甲酸（Sigma)、抗坏血酸 (Sigma)、BDNF(Peprotech，Rocky Hill，NJ)、GDNF(Peprotech)、和Forskolin(Sigma)〇
[0244] 分化结果是，在对S0X2/HMGA2转导的hiNSC进行神经元诱导后10天至15天，确认未 成熟神经元标记物、神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1)、双皮质素（doublecortin， DCX)、和神经元中间丝、α-互联蛋白、和神经丝(NF)的表达(图3A)。
[0245]另外，用于hiNSC自我更新能力评价的克隆分析的结果是，确认神经元分化被诱 导，并且多传代的克隆的NF和α-互联蛋白被染色。神经元诱导10天至25天后，MAP2(成熟神 经元标记物）、酪氨酸羟化酶(TH)(多巴胺能和去甲肾上腺素能神经元标记物）、和胆碱乙酰 转移酶(ChAT)，与H9-NSC相比，以相似的水平表达(图3A和9A)。
[0246]实施例6-2:星形胶质细胞分化能力的确认
[0247] 作为星形胶质细胞诱导培养基，使用包含N2(Gibco BRL)、Gmax、和1%FBS的DMEM (高葡萄糖)培养基。
[0248] 结果是，确认S0X2/HMGA2转导的hiNSC生成胶质纤维酸性蛋白（GFAP)阳性细胞，从 而确认hiNSC分化形成星形胶质细胞(图3A)。
[0249]实施例6-3:少突胶质细胞分化能力的确认
[0250]有两种不同类型的少突胶质细胞诱导培养基。第一，将细胞在补充有N2、MEM非必 需氨基酸溶液(MEM NEAA;Gibco BRL)、肝素（Sigma)、RA、SHH(Peprotech)、和B27的DMEM/ F12培养基中培养2周，然后将培养基更换成补充有N2、B27、MEM NEAA、T3、cAMP(Sigma)、 PDGF(P 印 rotech)、IGF(R&D)和 NT3(Sigma)的DMEM/F12 培养基2 周。
[0251]结果是，确认在朝少突胶质细胞方向诱导20天至35天后检测到04和0LIG2(少突胶 质细胞标记物)双重阳性细胞(图3A)。
[0252] 实施例7: hiNSC电生理学特征分析
[0253] 为评价S0X2/HMGA2转导的hiNSC的功能，通过膜片钳读取(patch-clamp reading) 来测试电生理学性质。具体地，利用EPC 10USB扩增仪（HEKA Electronik，Lamprecht， Germany)在室温下（22±1°C)记录源自iNSC的神经元的全细胞膜片钳记录。记录室装有持 续流动的Tyrode溶液（流速，10mL/min)，并且贴片电极通过？〇10牵拉器（此148111区6 Company)由硼硅酸玻璃毛细管制成。电极在其装有移液管溶液时电阻为4M Ω至7M Ω。获取 数据，并利用脉冲程序版本8.67(HEKA Electronik)和Origin 6.1软件(MircoCal)进行分 析。将电流在3kHz下利用四极Besse 1 s过滤器过滤，并在10kHz下数字化。Tyrode溶液包含 143mM NaCl、5.4mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mM CaCl2、0.5mM NaHP〇4、10mM葡萄糖和5mM 4-(2 羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES);并且pH用Na0H调整至7.5。移液器溶液包含150mMKCl、 l.OmM MgCl2、10mM HEPES、5mM EGTA、2mM Mg-ATP，并且pH用NaOH调整至7.2。利多卡因 (〇.1%)用于阻断他电流。
[0254] 结果是，确认S0X2/HMGA2转导的hiNSC可在产生表达钠电流的神经元时生成不同 动作电位。钠电流(或内部电流)和动作电位被钠通道阻断剂利多卡因抑制，并且在洗出后 恢复正常状态（图3B至3D和9B至9D)。这些数据表明，自hiNSC分化的神经元具有正常神经元 的功能膜性质和活性。
[0255] 实施例8:在动物模型中测试hiNSC分化和存活性
[0256] 实施例8-1:移植CMDil标记的hiNSC
[0257] 利用Accutase分离S0X2/HMGA2转导的hiNSC，并将其悬浮于PBS中。用CM-Dil (分子 探针)标记hiNSC，以在注射后进行追踪。用CM-Dil在37°C水浴中培育hiNSC15分钟，然后在4 °C下培育10分钟。将CM-Dil标记的hiNSC以1X10 5个细胞/VL的密度悬浮于PBS中。利用立体 定位仪和超微栗（World Precision Instruments，Sarasota，FL)将CM-Dil标记的hiNSC移 植到室下区（SVZ)。移植后，通过缝合闭合头皮，并使动物从麻醉恢复，从而制备4周龄小鼠 模型。
[0258] 实施例8-2: IHC冷冻切片
[0259] 移植后三周，从小鼠模型分离脑，并浸入4%PFA过夜，然后转移至30 %蔗糖48小 时。然后，使分离的脑与浸润混合物(0CT化合物;Sakura Finetek，日本东京)一起成型，保 持在-70°C过夜，并在低温恒温器(CM 3050，Leica，德国韦茨拉尔）上进行冷冻切片。具体 地，用0.05%Triton X-100培育组织20分钟。用5%NGS培育组织，以阻断非特异性抗体结 合。然后，在4°C下用初级抗体以5%NGS的稀释比培育组织过夜。在室温下用Alexa 488或 Alexa 594标记的二级抗体（1:1000)培育组织1小时。用DAPI将核染色10分钟。用共聚焦显 微镜(Nikon)拍摄图像。
[0260]结果是，通过免疫染色检测到移植细胞，并且检测到的细胞被三种不同谱系的标 记物共同染色。免疫染色显示，发现移植的hiNSC是TUJ1(神经元）、GFAP(星形胶质细胞)和 MBP(少突胶质细胞）阳性的，其被CMDi 11荧光共同定位（图3E和9E)。总之，表明S0X2/HMGA2 转导的hiNSC能够在体内存活并分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
[0261] 实施例9:各种体细胞通过HMGA2有效重编程形成hiNSC
[0262] 实施例9-1:通过HMGA2进行hUCB-MSC的iNSC重编程
[0263]由于人脐带血(hUCB)细胞的优点是其可无侵入获得并且保留最少基因突变，因此 评价hUCB是否可用作iNSC重编程的来源。
[0264] 按照制备实施例1的描述，从hUCB分离间充质干细胞(MSC)群。在S0X2/HMGA2转导 到hUCB-MSC中后，hUCB-MSC源hiNSC集落在转染后第7天至第12天出现，并且其被免疫细胞 化学证明是PAX6和巢蛋白阳性染色的iNSC(图4A)。已有报道称MSC是⑶73和⑶105阳性的， 但是造血标记物CD34、CD45和HLA-DR阴性的。hUCB-MSC源hiNSC是CD73和CD105阴性的，表明 细胞表面标记物特征已被改变(图10A)。
[0265] 另外，确认与hDF相比，hUCB-MSC中HMGA2的表达明显较高（图10B)。S0X2/HMGA2转 导的hUCB-MSC产生比S0X2转导的hUCB-MSC高3至4倍的PAX6/巢蛋白阳性集落(图10C)。
[0266] 实施例9-2:H9-NSC和hiNSC之间的增殖能力差异
[0267] 为确认来自不同细胞来源和转基因组合的H9-NSC和hiNSC之间的增殖能力差异， 通过累积群体倍增水平分析(CPDL)测量H9-NSC和hiNSC的增殖速率。具体地，利用方程式 CPDL = ln(Nf/Ni) 1η2通过整个累积群体倍增水平确定增殖速率，其中Ni是初始接种细胞数， Nf是最终收获细胞数，In是自然对数。
[0268] 在6孔板上接种三份5 X104个细胞，并将其每4天进行次代培养。为只检测活细胞， 利用台盼蓝计数最终细胞数，并再次接种5Χ10 4个细胞。关于累积群体倍增水平的计算，计 算各传代的群体倍增数，并加和至前一传代的群体倍增数。
[0269] 结果是，确认H9-NSC和hiNSC细胞系之间增殖能力无显著差异，这表明H9-NSC和 hiNSC细胞系具有相似的增殖能力（图10D)。
[0270] 实施例9-3:诱导衰老hUCB-MSC形成神经干细胞的能力的确认
[0271] 为研究let_7b/HMGA2在重编程效力中的作用，通过转导单独S0X2或S0X2与let-7 靶向因子组合，考察衰老hTCU-MSC是否可被诱导形成神经干细胞。为此，用S0X2、S0X2/ CMYC、S0X2/LIN28、和S0X2/HMGA2转导衰老hUCB-MSC--其衰老经由衰老相关(SA)-0-半乳 糖苷酶测定确认（图4B)。
[0272] 关于半乳糖苷酶测定，将hUCB-MSC接种于6孔板，并培育直到群体达到40 %至 50%，用PBS洗涤两次，并在室温下用0.5 %戊二醛在PBS中固定5分钟。用包含ImM MgCl2的 ?85(?!17.2)洗涤细胞，并将其用乂飞&1溶液（11^/1111^1 &1、0.1211111(此[0幻6(铁氰化钾）、 0.12mM K4Fe[CN]6(亚铁氰化钾）和ImM MgCl2，在PBS中，pH 6.0)在37°C下培育过夜。第二 天，在显微镜（1X70,Olympus，日本)下拍摄图像。
[0273] S0X2/CMYC和S0X2/LIN28之间的组合导致形态变化，但不生成hiNSC集落，而仅 S0X2/HMGA2过表达被明显显示促进hiNSC集落形成（图4B)。S0X2/HMGA2过表达导致在转化 后三周由IX 1〇5个衰老hUCB-MSC形成2至4个集落(转化效力为0.004%至0.008%)(图4C)。
[0274] 实施例10:脐带血⑶34+细胞的hiNSC重编程
[0275] 实施例10-1:脐带血⑶34+细胞的分离和纯化
[0276] 通过CD34微珠分选系统(MACS)进行CD34+细胞分离。具体地，将50yL CD34微珠(# 130-046-703，Miltenyi Biotech)与在2°C至8°C下利用30分钟Lymphoprep(ProteoGenix， Portland，0R)密度梯度离心从脐带血获得的单核细胞(约IX 108)-起培育，从而磁性标记 CD34+细胞。使单核细胞的悬浮液经过连接MACS柱后的有磁场的MACS分选机，使得仅磁性标 记的CD34+细胞可被限制在柱内。将柱从MACS分选机移除后，通过施压将缓冲液推开，从而 分离被限制的CD34+细胞。在包含 10%FBS、50ng/mL SCF、20ng/mL IL-6、50ng/mL ΤΡ0和 100ng/mL Flt3的Iscove改良型Dulbecco培养基（nffiM)培养CD34+细胞。
[0277] 利用抗CD34-FITC抗体(Miltenyi Biotech)通过流式细胞术测量CD34+细胞的纯 化效力，结果是，确认84.15 %纯度的⑶34+细胞被分离和纯化（图4E和27)。
[0278] 实施例10-2:脐带血⑶34+细胞的hiNSC重编程的确认
[0279] 关于刺激胞质分裂，将MJCB-CD34+细胞用细胞因子(SCF、Flt3L、TP0和IL-6)培养3 天，并通过逆转录病毒用S0X2/HMGA2转导（图4D)。然后将细胞铺平在饲养器上，直到转导后 10天至14天，并在NSC条件下观察iNSC集落。免疫细胞化学染色的结果显示，hUCB-⑶34+ iNSC具有PAX6、S0X2和巢蛋白的阳性表达。另外，这些hUCB-CD34+iNSC能够发育成神经元或 星形胶质细胞（图4F)。单独S0X2足以生成hUCB-CD34+iNSC，但显示极低效力。共表达S0X2和 HMGA2的HJCB-CD34+细胞显示形成PAX6/巢蛋白阳性集落的频率增加10至20倍（图10E)。 [0280]总之，通过S0X2和HMGA2之间的协同相互作用进行的有效定向重编程实现，不仅干 细胞，而且各种体细胞如血细胞，重编程形成hiNSC。
[0281] 实施例11:转染hUCBSC细胞的HMGA2蛋白表达增加的确认
[0282] 实施例11-1:转染进行HMGA2过表达
[0283] 为验证HMGA2蛋白在人脐带血源基质细胞（hUCBSC)分化和衰老中的作用，用 HMGA2转染8或更少代的早期阶段的hUCBSC。
[0284] 首先，将HMGA2序列克隆到pMX逆转录病毒载体中。将HMGA2质粒连同VSV-G和gag/ pol质粒转染到293T细胞中。转染后48小时和72小时收集病毒 悬浮液，并利用其在5yg/mL聚 凝胺的存在下转染hUCBSC。测量转导效力，显示为80%或更高，如图12所示。
[0285] 实施例11-2:免疫细胞化学分析
[0286] 在实施例11-1制备的HMGA2转染的8或更少代的早期阶段的人脐带血源基质细胞 (hUCBSC)中，通过免疫细胞化学分析确认HMGA2蛋白表达增加，结果显示在图13中。
[0287] 实施例11-3:微阵列
[0288] 在实施例11-1制备的HMGA2转染的8或更少代的早期阶段的人脐带血源基质细胞 (hUCBSC)中，通过微阵列分析确认HMGA2蛋白表达增加，结果显示在图14中。
[0289] 实施例11-4:根据次代培养传代进程的HMGA2表达水平的测量
[0290] 在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过PCR确认 根据次代培养进程的HMGA2表达水平。
[0291 ] 根据制造商推荐的方案，利用Trizol试剂?1(1]1￥；[1：1'(^11，1^)提取全1?嫩，然后向 其加入寡dT引物和Accupower RT预混物(Bioneer，Korea)，以合成cDNA。利用cDNA作为模板 按照制造商推荐的方案进行PCR，结果显示在图15中。根据PCR实验结果，确认HMGA2表达水 平随次代培养从第6传代进行至第20传代而减少。
[0292] 实施例12:根据次代培养传代进程的形态变化的确认
[0293]在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过相位对 比图像测量根据次代培养传代进程的细胞形态，结果显示在图16中。
[0294]根据图16,确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)随着传代进程变得更扁平和更长， 而人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的形态变化减少。
[0295] 实施例13:SA-b_gal (衰老相关β-半乳糖苷酶)染色
[0296] 为确认实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的衰老水 平，通过β-gal染色法测量根据次代培养传代进程的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-i3-gal)表 达水平，结果显示在图17中。
[0297] 根据图17,确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)使衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal)表达水平减少。
[0298] 实施例14:根据次代培养传代的细胞增殖
[0299] 在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过MTT测定 测量根据次代培养传代进程的细胞增殖水平，结果显示在图18中。
[0300] 根据图18,确认与对照相比，人脐带血源基质细胞(hUCBSC)使根据次代培养传代 进程的细胞增殖水平较少减少。
[0301 ] 实施例15:HMGA2对PI3K/AKT途径的影响的评价 [0302]实施例15-1:相关基因的确认
[0303] 在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞（hUCBSC)中，通过 Ingenuity途径分析(IPA)软件说明HMGA2过表达相关的信号传导途径的相关基因和分子细 胞功能的相关基因，结果显示在图19中。
[0304] 根据图19,确认与转录控制相关的elF4和p70S6K信号被大量表达，并且与elF4和 P70S6K相关的mTOR和PI3K/AKT信号途径被大量表达。
[0305] 实施例15-2:蛋白质印迹
[0306]在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，进行蛋白质 印迹，评价HMGA2过表达对PI3K/AKT途径和mT0R/p70s6K的影响。
[0307] 对下列进行蛋白质印迹分析：（i)HMGA2过表达的hUCBSC，（ii)LY294002处理的 HMGA2过表达的hUCBSC，和（i i i)作为比较例的GFP。
[0308]具体地，将细胞在包含ImM苯甲基磺酰氟、ImM抑肽酶、ImM亮肽素、ImM抗痛素和 O.lmM原钒酸钠的50mM Tris-HCl缓冲剂中粉碎。通过DC测定试剂盒(Bi〇-Rad，USA)确认蛋 白质含量，通过在10 %至15 %聚丙烯酰胺凝胶上加载特定量蛋白质进行SDS-PAGE，并将蛋 白质转移至50V和350mA的硝化纤维素膜5小时。所有抗体按照制造商的说明来使用，并且通 过增强型化学发光检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech Buckinghamshire，UK)确认 蛋白质带，结果显示在图20中。
[0309] 根据图20，确认HMGA2诱导了 AKT、mT0R和p70S6K磷酸化，并且在用LY294002处理时 蛋白质表达总量无变化，但AKT、mT0R和p70S6K磷酸化被抑制。
[0310] 虽然HMGA2抑制了 pl6INK4i^Pp21GIP1/WAFl的表达水平，但表达水平通过LY294002处 理被恢复，因此PI3K/AKT/mT0R/p70S6K途径适于降低pl6 INK4^Pp21GIP1/WAFl的表达水平。
[0311] 另外，确认HMGA2过表达激活PI3K/AKT/mT0R/p70S6K途径并且抑制ρ16ΙΝΚ41Ρ p21 QP1/WAFl 的表达。
[0312] 实施例16:HMGA2抑制导致根据次代培养传代进程的形态变化的确认
[0313]为验证HMGA2蛋白在人脐带血源基质细胞（hUCBSC)分化和衰老中的作用，利用 siRNA抑制8或更少代的早期阶段的hUCBSC中的HMGA2表达。
[0314] 在HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过相位对比图像测量 根据次代培养传代进程的细胞形态，结果显示在图21中。即，确认HMGA2表达被抑制的人脐 带血源基质细胞(hUCBSC)变得更扁平和更长。
[0315] 实施例17:HMGA2抑制导致的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-f3-gal)表达水平的测量
[0316] 为确认HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的衰老水平，通过β-gal 染色测量衰老相关半乳糖苷酶(SA-i3-gal)的表达水平，结果显示在图21中。
[0317] 确认HMGA2转导的hUCBSC增加衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-i3-gal)的表达水平。 [0318] 实施例18:次代培养传代对细胞增殖的影响的确认
[0319] 在HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过MTT测定测量根据次 代培养传代进程的细胞增殖，结果显示在图22中。根据图22，确认HMGA2被抑制的hUCBSC显 著减少根据次代培养传代进程的细胞增殖。
[0320] 实施例19:蛋白质印迹
[0321] 在人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，为评价HMGA2抑制对PI3K/AKT途径和mTOR/ p70s6K的影响，进行蛋白质印迹，结果显示在图23中。
[0322] 根据图23,确认AKT、mT0R和p70S6K磷酸化急剧减少，而pl6INK4i^Pp21 GIP1/WAFl的表 达水平增加。根据这些结果，确认HMGA2的抑制抑制PI3K/AKT/mT0R/p70S6K途径，而增加 pl6INK4i^Pp21QP1/WAFl 的表达。
[0323] 基于实施例15-2和上述实施例的结果，HMGA2蛋白表达导致的人脐带血源基质细 胞(hUCBSC)的信号传导途径显示在图24中。
[0324] 实施例20:脂肪组织分化能力的测量
[0325] 测量HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)分化能力。
[0326] 为了解基于细胞中存在的累积脂肪的分化水平，将培养的细胞用油红0染色，并用 100%异丙醇再次提取渗入细胞的油红0，并通过ELISA平板阅读器（EL800，Bi O-Tek Instruments，USA)将其在0D 500下定量。结果显不在图25中。
[0327] 根据图25，确认HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中油红0染色的百分 比低于对照组，并且脂肪细胞分化相关的基因如PPARr、aP2和C/EBP-b的表达率迅速减少。
[0328] 实施例21:HMGA2控制相关基因的筛选和PCR
[0329] 比较实施例11-1制备的HMGA2过表达人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中的基因表达 和实施例7制备的HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中的基因表达，如图26所 不。
[0330] 基于图26的结果，选择在HMGA2过表达时表达水平增加而在HMGA2被抑制时表达水 平减少的三种基因 ，Cyclin F、Cyclin E1和⑶C25A，而且选择在HMGA2过表达时表达水平减 少而在HMGA2被抑制时表达水平增加的五种基因，C14orfl53、EID2B、ZNF394、CDKN2AIPNI^P C9orf80。由此选择的八种基因进行PCR，结果显示在图27中。
【主权项】
1. 用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的试剂盒，包括： (a) SRY(性别决定区Y)框2 (S0X2)蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和 (b) 高移动性型AT钩2 (HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述编码S0X2蛋白的核酸分子和所述编码HMGA2 蛋白的核酸分子分别独立地被包括在表达载体内。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述编码HMGA2蛋白的核酸分子是染色质调控因 子。4. 制备自非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞的方法，包 括： (a) 递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分 子至非神经元细胞，或增加所述S0X2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达;和 (b) 培养步骤(a)中的细胞。5. 根据权利要求4所述的方法，进一步包括： (c) 从步骤(b)获得的培养物分离神经干细胞样集落。6. 根据权利要求4所述的方法，其中步骤(b)包括在神经元细胞分化培养基上进行培 养，并且其特征在于由所述非神经元细胞形成所述诱导神经干细胞，并且由所述诱导神经 干细胞形成所述神经元细胞。7. 根据权利要求4所述的方法，其中步骤(a)通过下列进行： 将S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子加 入所述非神经元细胞的培养基； 将S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子直 接加入所述非神经元细胞;或 用病毒感染所述非神经元细胞，所述病毒由其中插入了编码S0X2蛋白的核酸分子和编 码HMGA2蛋白的核酸分子的病毒载体转染的包装细胞获得。8. 根据权利要求4所述的方法，其中增加所述S0X2蛋白或所述HMGA2蛋白在所述非神经 元细胞中的表达的特征在于分别将S0X2或HMGA2的表达调节因子引入所述非神经元细胞。9. 根据权利要求8所述的方法，其中HMGA2的表达调节因子是1et-7miRNA簇抑制剂或 PDE4D抑制剂。10. 根据权利要求8所述的方法，其中S0X2的表达调节因子是PDE4D抑制剂。11. 根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞源自人。12. 根据权利要求4所述的方法，其中所述非神经元细胞是体细胞或成熟干细胞。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述体细胞是血细胞。14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述成熟干细胞是间充质干细胞。15. 通过权利要求4至14任一项所述的方法制备的诱导神经干细胞;或自所述诱导神经 干细胞分化的神经元细胞。16. 用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，包括权利要求15所述的诱导神经干细胞或 自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。17. 预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，包括： SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子;和 HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子， 作为活性成分。18. 根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述神经元细胞损伤相关疾病选自帕金 森病、阿尔茨海默氏症、匹克氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、缺血性脑病、脱髓鞘疾病、 多发性硬化症、癫痫、退行性神经系统疾病、和脊髓损伤。19. 筛选神经干细胞或神经元细胞的再生促进剂或再生抑制剂的方法，包括： 1) 制备分离的非神经元细胞； 2) 通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核 酸分子至非神经元细胞、或增加所述S0X2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达， 诱导生成诱导神经干细胞； 3) 任选地，使步骤2)生成的所述诱导神经干细胞分化形成神经元细胞;和 4) 在步骤1或步骤2后用候选物质进行处理，和根据候选物质的处理，确定所述诱导神 经干细胞或所述神经元细胞是否生成、或其生成水平。20. 根据权利要求19所述的方法，进一步包括下列步骤:如果步骤4中所述诱导神经干 细胞或所述神经元细胞的生成水平增加，则确定候选物质是神经干细胞或神经元细胞的再 生启动子。21. 根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中利用从患者分离的非神经元细胞， 筛选患者定制的神经干细胞或神经元细胞再生促进剂或患者定制的神经干细胞或神经元 细胞再生抑制剂。22. 筛选个人定制的神经元细胞治疗剂的方法，包括： 1) 制备分离的非神经元细胞； 2) 通过递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核 酸分子至非神经元细胞、或增加所述SOX2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达， 诱导生成诱导神经干细胞； 3) 使步骤2)生成的所述诱导神经干细胞分化形成神经元细胞;和 4) 用候选物质处理步骤3形成的所述非神经元细胞，和确定所述候选物质是否是针对 非神经元细胞获取对象定制的神经元细胞治疗剂。23. 促进非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的组合物，包括HMGA2蛋白或编码 HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。24. 用于细胞增殖的组合物，包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。25. 抑制细胞衰老的组合物，包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。26. 根据权利要求24或权利要求25所述的组合物，其中所述细胞是脐带血源基质细胞。27. 预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的方法，包括向有需要的对象给予权利要求 15所述的诱导神经干细胞或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞。28. 预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的方法，包括向有需要的对象给予SOX2蛋白 或编码SOX2蛋白的核酸分子;和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。
【专利摘要】本发明涉及制备由分化细胞重编程的诱导神经干细胞的方法。根据本发明生成诱导神经干细胞的方法能够仅利用两种诱导因子SOX2和HMGA2由非神经元细胞制备诱导神经干细胞。因此，本发明的方法可比使用四种或五种诱导因子的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。另外，本发明的方法显示比仅施用单一SOX2基因时明显更高的诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的的效能。
【IPC分类】C12N15/10, C12N5/0797, C12N5/10
【公开号】CN105492597
【申请号】CN201480032201
【发明人】康景宣, 俞炅录
【申请人】首尔大学校产学协力团, 康干细胞生物技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年4月4日
【公告号】EP2982747A1, WO2014163425A1
【专利说明】利用HMGA2制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞的 方法
[0001]发明背景 1.发明领域
[0002] 本发明涉及利用HMGA2制备由非神经元细胞重编程的诱导干细胞的方法。
[0003] 2.相关领域描述
[0004] 干细胞大体上被分成全能干细胞和多能干细胞。全能干细胞具有生成所有细胞的 分化潜力。全能干细胞生成体内所有不同种类的细胞，例如，受精卵细胞。多能干细胞生成 体内衍生自三个主要胚层或胚胎本身的任意细胞类型。
[0005] 多能干细胞，如胚胎干细胞(ESC)，增殖迅速，同时保持分化成各种细胞类型的能 力，即，多能性。胚胎干细胞是细胞移植治疗的有希望的供应源。
[0006] 直到最近，多能干细胞主要通过核移植和细胞融合（Sh inya Yamanaka， Pluripotency and Nuclear Reprogramming,Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.363 (1500) :2079-2087(2008年6月27日））来生产。然而，两种方法均使用了胚胎干细胞，因此存 在伦理困境。
[0007] 然而，由于最近发现了诱导多能干细胞（iPSC)，克服与使用胚胎干细胞相关的问 题变得可能。"诱导多能干细胞(iPSC)"是呈现与胚胎干细胞(ESC)相似的性质的细胞。诱导 多能干细胞首次在2006年通过在小鼠成纤维细胞中增加限定因子的表达而生成 (Takahashi,Y.and S.Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors,Cell 126:663-676 (2006))和在2007年通过在人成纤维细胞中增加限定因子的表达而生成(Yu Junying et al·,Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic cells, Science 318:1917-1920(2007)NTakahashi,K.et al., Induction of Pluripotent Stem Cell From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors,Cell 131:861-872(2007))〇
[0008] 关于引起成熟体细胞重编程形成1?3(：的这些研究包括0(^-3/4、3(?2、1(1€4和(3-Myc(Takahashi , Cell 126:663-676; Takahashi, Cell 131:861-872)和使用0ct4、Sox2、 Nanog和Lin28(Junying,Cell 318:1917-1920)。然而，iPSC具有限制:其无法在体内转化成 期望的细胞，因为其可导致胚胎干细胞中出现畸胎瘤，并且同时无法在体内移植时充分控 制分化。
[0009] 因此，为克服这些限制，通过定向转化/重编程分化形成具体谱系细胞的技术在 最近被重视起来。这是可在不经过多能状态的情况下通过将具体谱系特异性基因引入还未 完全分化的细胞（即，成纤维细胞)定向诱导具体细胞的技术，并且可排除多能细胞造成的 畸胎瘤形成的风险。具体地，关于一旦损坏就可能永久维持损坏的神经元细胞，已积极进行 各种研究线路来尝试定向诱导。结果是，美国教授Marius Wernig带领的研究组成功定向诱 导神经元细胞[Vierbuchen T，0stermeier A，Pang ZP，Kokubu Y，Sudhof TC，Wernig Μ (2010)Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors ·Nature 463(7284): 1035-1041 · doi : 10 · 1038/nature08797]。然而，难以体外培养 无自我更新能力的诱导神经元超过特定时间，因此难以保证细胞足量，因此在实践中不可 能获得细胞治疗所需的足量细胞，包括定向重编程涉及的分子细胞学机制。
[0010] 之后，两个德国研究组成功通过将基因引入小鼠成纤维细胞制备诱导神经干细胞 (iNSC)(Thier M.fforsdorfer P,Lakes YB,Gorris R,Herms S,0pitz T,Seiferling D, Quandel T,Hoffmann P,Nothen MM,Brustle 0,Edenhofer F(2012)Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.Cell Stem Cell 10(4): 473-479. doi :10.1016/j. stem. 2012.03.003)。关于人，有报告称成功实施了通过将单个 S0X2基因引入成纤维细胞而诱导iNSC(Thier M，Worsdorfer P,Lakes YB，Gorris R，Herms S,0pitz T,Seiferling D,Quandel T,Hoffmann P,Nothen MM,Brustle 0,Edenhofer F (2012)Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.Cell Stem Cell 10(4):473-479.doi:10.1016/j.stem.2012.03.003)〇
[0011] 然而，利用这些因子制备诱导神经元细胞的常规方法具有限制：其具有低诱导效 力，并且不能增殖神经元细胞，因此不可用于治疗目的。
[0012] 发明概述
[0013] 为解决常规方法显示出的问题，本发明的目的在于提供由分化细胞生成诱导神经 干细胞或神经元细胞的新方法、和通过该方法生成的诱导神经干细胞或神经元细胞。
[0014] 本发明的一个目的是提供用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的 试剂盒，包括(a)SRY(性别决定区Y)框2(S0X2)蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和(b)高移 动性型AT钩2(high mobility group at-hook 2，HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分 子。
[0015] 本发明的另一目的是提供制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或由其 分化的神经元细胞的方法，包括(a)递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白 或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加 S0X2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细 胞中的表达;和(b)培养步骤(a)中的细胞。
[0016] 本发明的再一目的是提供通过上述方法制备的诱导神经干细胞;或由该诱导神经 干细胞分化的神经元细胞。
[0017] 本发明的再一目的是提供用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，包括诱导神经干 细胞;或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。
[0018] 本发明的再一目的是提供预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，包 括S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子，作为 活性成分。
[0019] 本发明的再一目的是提供筛选神经干细胞或神经元细胞的再生促进剂或再生抑 制剂的方法，包括：1)制备分离的非神经元细胞;2)通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核 酸分子；和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加 S0X2蛋白和 HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达，来诱导生成诱导神经干细胞;3)任选地，使步骤2)生 成的诱导神经干细胞分化形成神经元细胞;和4)通过在步骤1或步骤2后用候选物质处理， 根据候选物质的处理的存在来确认诱导神经干细胞或神经元细胞的生成。
[0020] 本发明的再一目的是提供筛选个人定制的神经元细胞治疗产品的方法，包括：1) 制备分离的非神经元细胞;2)通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和HMGA2蛋白 或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加 S0X2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细 胞中的表达，来诱导生成诱导神经干细胞;3)使步骤2)生成的诱导神经干细胞分化形成神 经元细胞;和4)通过用候选物质处理步骤3)形成的非神经元细胞，确认非神经元细胞获取 对象的定制神经元细胞治疗产品。
[0021] 本发明的再一目的是提供促进非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的组合 物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。
[0022] 本发明的再一目的是提供用于细胞增殖的组合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2 蛋白的核酸作为活性成分。
[0023] 本发明的再一目的是提供抑制细胞衰老的组合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2 蛋白的核酸作为活性成分。
[0024]发明有益效果
[0025]根据本发明生成诱导神经干细胞的方法能够在仅利用两种诱导因子S0X2和HMGA2 时由非神经元细胞制备诱导神经干细胞。因此，本发明的方法可比利用四或五种诱导因子 的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。另外，本发明的方法显示比单独使用 S0X2时明显更高的诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的潜能。
[0026]在本发明中，0ct4不被用于重编程形成神经干细胞的过程中的重编程因子组合， 因此分化的细胞被定向重编程形成神经干细胞，而不经过去分化过程。由此制备的诱导神 经干细胞不仅可在移植于小鼠脑组织时保留自我更新能力和增殖能力，而且可充分分化形 成神经相关细胞，如神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等，因此被预期用于治疗目的。 [0027] 附图简述
[0028]图1A显示在明场显微镜下观察的人类新生儿真皮(dermal)成纤维细胞(hDF)的形 ??τ 〇
[0029] 图1Β显示在明场显微镜下观察的由S0X2转导的hDF诱导而来的iNSC。
[0030] 图1C显示在明场显微镜下观察的通过S0X2转导形成的早期神经球样集落的图像。 [0031 ]图1D显示利用抗PAX6和巢蛋白抗体进行的hDF-iNSC的NSC特异性标记蛋白的免疫 细胞化学分析的结果。
[0032]图1E显示利用抗波形蛋白和S0X2抗体进行的hDF-iNSC的NSC特异性标记蛋白的免 疫细胞化学分析的结果。
[0033] 图1F显示hDF、H9-NSC和hDF-iNSC( S0X2)中的全局miRNA表达谱的热图。
[0034] 图1G显示hDF、H9-NSC和hDF-iNSC(S0X2)中的神经系统特异性miRNA的热图。
[0035] 图 1H 显示 hDF、H9-NSC 和 hDF-iNSC(S0X2)的 miR-124-3p 的定量实时 PCR 的结果。
[0036] 图 II显示 hDF、H9-NSC 和 hDF-iNSC(S0X2)的 miR-9-5p/-3p 的定量实时 PCR 的结果。 [0037] 图1J显示通过定量实时PCR测量的11〇?、!19-吧(：、11〇?-丨吧(：(3(^2)和1^3(：中的胚胎 干细胞特异性miR-302/367家族的相对表达水平。
[0038] 图 1K 显示通过定量实时 PCR 测量的 hDF、H9-NSC 和 hDF-iNSC(S0X2)中 let-7/miR-98 家族的相对表达水平。
[0039] 图 1L 显示 111丨1?-124-3口、111丨1?-9-5口、111丨1?-9-3口、抗16卜713和16卜713在其转染到5(?2转 导的hDF中之后测量的PAX6-和巢蛋白阳性集落形成率。
[0040]图 2A 显示在 hDF 对照组、S0X2-、S0X2/CMYC-、S0X2/LIN28-、和 S0X2/HMGA2 转导的 hDF组中进行的MTT细胞增殖测定的结果。
[0041 ]图 2B 显示在 5(^2-、5(^2/^1^〇、5(^2/1預28-、和5(^2/腿642转导的110?组中测量 的集落形成时间。
[0042] 图 2C 显示在 5(^2-、5(^2/^1^(：-、5(^2/1預28-、和5(^2/腿642转导的11〇?组中测量 的PAX6-和巢蛋白阳性集落形成率。
[0043] 图 2D 显示 hDF 对照组、5(^2-、5(^2/^1^(：-、5(^2/11呢8-、和5(?2/腿6六2转导的11〇? 组的流式细胞术分析结果，该流式细胞术分析利用其NSC细胞表面标记物(CD44)和阳性标 记物(CD184)在病毒转导后7天进行。
[0044] 图2E显示在明场显微镜下观察的hDF-iNSC(S0X2/HMGA2)的形态和PAX6、巢蛋白、 Ki67和HMGA2表达的免疫细胞化学分析结果。
[0045] 图 2F 显示与 hDF 表达水平相比，H9-NSC、hDF-iNSC( S0X2)和 hDF-iNSC( S0X2/HMGA2) 中的NSC特异性miRNA表达的定量实时PCR结果。
[0046] 图 2G 显示通过二硫化物处理源自 hDF、H9-NSC、hDF-iNSC(S0X2)和 hDF-iNSC(S0X2/ HMGA2)的DNA而进行的S0X2基因启动子的甲基化模式的分析结果。
[0047] 图3A显示hDF-iNSC(S0X2/HMGA2)在其分化形成三种主要细胞类型--即神经元 (α-互联蛋白、1'!1、00乂、(^1'、册、1^?2、和1'町1)、星形胶质细胞（6?4?)、和少突胶质细胞 (0LIG2和04)-一后的免疫细胞化学分析。
[0048]图3Β显示通过电压钳测量记录的源自人诱导神经干细胞(hiNSC)的神经元的钠电 流和动作电位。
[0049] 图3C显示通过电压钳测量记录的、在钠电流被利多卡因（lidocaine)限制后hiNSC 源神经元的钠电流和动作电位。
[0050] 图3D显示通过电压钳测量记录的、在钠电流通过洗出恢复后hiNSC源神经元的钠 电流和动作电位。
[0051 ] 图3E显示在CM-Dil标记的hiNSC被移植到4周龄小鼠的海马回区域后，hiNSC分化 形成神经元(TUJ1)、星形胶质细胞(GFAP)、和少突胶质细胞(MBP)，并且与CM-Dil共定位。 [0052]图4A显示利用S0X2/HMGA2由源自人脐带血的间充质干细胞生成iNCS的程序。图4A 确认神经球样集落在病毒转导后7天形成，以及hUCB-MSC源hiNSC被PAX6(红色）、巢蛋白（绿 色)和DAPI (蓝色)免疫染色。
[0053] 图 4B 显示被 5(^2、5(^2/^1^(：、5(^2/11呢8和5(^2/!1\?^2(经过21天）转导的衰老 hUCB-MSC的形态。通过β-半乳糖苷酶活性评价衰老的hUCB-MSC，和最初的iNSC簇仅通过 S0X2/HMGA2转导而生成。
[0054] 图 4C 显示对照组、被 S0X2、S0X2/CMYC、S0X2/LIN28 和 S0X2/HMGA2 转导的衰老 hUCB-MSC的PAX6-和巢蛋白（NESTIN)-阳性集落的定量结果。
[0055] 图4D显示实验示意图，示例由hUCB源⑶34+细胞重编程hiNSC的策略。
[0056]图4E经由点图显示通过流式细胞术分析的CD34+细胞纯度。显示由单核细胞分离 的⑶34+细胞具 有84.15 %的纯度。
[0057] 图4F显示通过免疫化学测定示例hUCB-CD34+iNSC的特征的图像，其中细胞用NSC 特异性标记物(PAX6,巢蛋白，和S0X2)、神经元标记物(NF)和星形胶质细胞标记物(GFAP)染 色。
[0058] 图5显示在显微镜下观察的用PAX6、巢蛋白、S0X2、Ki67和HMGA2免疫染色的H9-NSC 的图像。
[0059] 图6A显示被miR-CTL或者50nM或 100nM let-7b转染的hDF-iNSC(S0X2)，其在用 BrdU处理2.5小时后用BrdU特异性抗体(绿色)和DAPI (蓝色)免疫染色。
[0060] 图6B显示被miR-CTL或者50nM或 100nM let-7b转染的hDF-iNSC(S0X2)中BrdU阳性 细胞的定量结果。
[0061] 图6C显示被miR-CTL或者50nM或100nM let-7b转染的细胞的神经球直径。
[0062] 图6D显示被miR-CTL或者50nM或100nM let-7b转染的细胞的绝对数量。
[0063] 图6E显示被miR-CTL或者50nM或100nM let-7b转染的细胞的初级神经球比率。
[0064] 图7A显示hDF-iNSC(S0X2)、hDF-iNSC(S0X2/HMGA2)和H9-NSC中的阴性细胞表面标 记物(⑶44)和阳性细胞表面标记物(⑶184)的流式细胞术分析结果。
[0065] 图 7B 显示 hDF、H9-NSC、hDF-iNSC (S0X2)和 hDF-iNSC (S0X2/HMGA2)的全局基因组的 热图。
[0066] 图 7C 显示在 hDF-iNSC( S0X2/HMGA2)和 hDF 之间；和 hDF-iNSC( S0X2/HMGA2)和 H9-NSC之间进行比较的点图。
[0067] 图8A显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的hDF-iNSC(S0X2)的结果，其在用BrdU处 理2.5小时后用BrdU特异性抗体(绿色)和DAPI (蓝色)免疫染色。
[0068] 图8B显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的hDF-iNSC(S0X2)中BrdU阳性细胞的定量 结果。
[0069] 图8C显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的细胞的神经球直径。
[0070] 图8D显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的细胞的绝对数量。
[0071] 图8E显示被siCTL或50nM siHMGA2转染的细胞的初级神经球比率。
[0072] 图9A显示H9-NSC在其分化形成三种主要细胞类型--即，神经元（ChAT、NF、和 MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)、和少突胶质细胞(04)-一后的免疫细胞化学分析。
[0073] 图9B显示通过电压钳测量记录的源自hiNSC的神经元的钠电流和动作电位。
[0074] 图9C显示通过电压钳测量记录的、在钠电流被利多卡因（0.1%)阻止后的源自 hiNSC的神经元的钠电流和动作电位。
[0075]图9D显示通过电压钳测量记录的、在钠电流通过洗出恢复后的源自hiNSC的神经 元的钠电流和动作电位。
[0076] 图9E显示移植的CM-Dil标记的hiNSC的免疫组织化学结果。
[0077] 图10A显示hMSC和hMSC源iNSC中的hMSC表面标记物（阴性标记物：CD34、CD45、和 HLA-DR;阳性标记物:CD73和⑶105)和阳性细胞表面标记物(CD184)的流式细胞术分析结 果。
[0078] 图10B分别显示关于HMGA2和hUCB-MSC的三种不同系的表达水平的蛋白质印迹分 析结果。
[0079] 图l〇C显示在S0X2或S0X2/HMGA2在hUCB-MSC中转导后测量的PAX6-和巢蛋白-阳性 集落形成率。
[0080] 图10D显示通过累积群体倍增水平(CroL)分析确定的H9-NSC、hDF-iNSC和hMSC- iNSC的增殖速率。
[0081 ] 图10E显示在S0X2或S0X2/HMGA2转导的hUCB-CD34+细胞中测量的PAX6-和巢蛋白- 阳性集落形成率。
[0082]图11显示确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的分化能力的结果。
[0083] 图12显示hUCBSC的HMGA2转导效力的测量结果。
[0084]图13显示通过免疫细胞化学分析测量的、8或更少代的HMGA2转导的hUCBSC的早期 阶段的HMGA2表达水平的结果。
[0085]图14显示通过微阵列测量的、8或更少代的HMGA2转导的hUCBSC的早期阶段的 HMGA2表达水平的结果。
[0086] 图15显示通过PCR测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的HMGA2表达水平 结果。
[0087]图16显示通过相位对比图像测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞 形态的测量结果。
[0088]图17显示通过β-gal染色测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的衰老相关 半乳糖苷酶(SA-i3-gal)的表达水平结果。
[0089] 图18显示通过MTT测定测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞增殖结 果。
[0090] 图19显示通过Ingenuity途径分析（IPA)软件测量的、HMGA2转导的hUCBSC中与 HMGA2过表达相关信号途径有关的基因和与分子细胞功能有关的基因的表达水平结果。
[0091] 图20显示用于评价HMGA2转导的hUCBSC中HMGA2过表达对P13K/AKT途径和mTOR/ p70s6K的影响的蛋白质印迹分析结果。
[0092]图21显示通过相位对比图像测量的、基于HMGA2转导的hUCBSC的世代进程的细胞 形态结果，和通过β-gal染色测量的、基于世代进程的衰老相关β_半乳糖苷酶(SA-i3-gal)表 达水平结果--用于评价HMGA2抑制型hUCBSC的衰老水平。
[0093] 图22显示通过MTT测定测量的、HMGA2抑制型hUCBSC中的细胞增殖结果。
[0094] 图23显示蛋白质印迹分析结果，以评价HMGA2转导的hUCBSC中HMGA2抑制对PI3K/ AKT途径和mT0R/p70s6K的影响。
[0095]图24显示HMGA2抑制型hUCBSC分化形成脂肪组织的能力的测量结果。
[0096] 图25显示HMGA2过表达型hUCBSC的基因表达和HMGA2抑制型hUCBSC的基因表达之 间的比较结果。
[0097] 图26显示对通过比较HMGA2过表达型hUCBSC的基因表达和HMGA2抑制型hUCBSC的 基因表达而选择的8个基因进行的PCR的结果。
[0098] 图27显示对在hUCBSC中表达在HMGA2过表达时增加并且在HMGA2抑制时减少的选 定基因和对在hUCBSC中表达在HMGA2过表达时减少并且在HMGA2抑制时增加的那些基因进 行的PCR的结果。
[0099]图28显示从脐带血源单核细胞分离的⑶34+细胞的流式细胞术分析结果。
[0100]图29显示⑶34+细胞数量基于在⑶34+特异性培养基中的培养天数的波动。
[0101]图30显示从⑶34+细胞到诱导神经干细胞的形态变化进程。
[0102] 图31显示用DAPI、巢蛋白、HMGA2和S0X2免疫染色的⑶34+iNSC的表达特征。
[0103] 优选实施方式详述
[0104] -方面，本发明提供用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的试剂 盒，其包括(a) SRY(性别决定区Y)框2(S0X2)蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和(b)高移动 性型AT钩2 (HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。
[0105] 本发明涉及通过在靶细胞如非神经元细胞等内增加两种因子S0X2和HMGA2(常规 公知的神经元分化转录因子）的表达，从靶细胞生成诱导神经干细胞。本发明的生成诱导神 经干细胞的方法可通过仅利用两种诱导因子S0X2和HMGA2由非神经元细胞制备诱导神经干 细胞，因此可比利用四或五种诱导因子的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。 另外，本发明的方法可显著减少重编程所需的时间，并且比仅利用单一S0X2基因时提供明 显更高的重编程诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的潜能。
[0106] S0X2蛋白是通过性别决定区Y-b〇X2(S〇X2)基因表达的蛋白质，已知在产前阶段基 于中枢神经系统表达并且涉及神经干细胞自我复制，但也已知常常在恶性神经胶质瘤中表 达。
[0107] 高移动性型AT钩2(HMGA2)蛋白已知通过结合于DNA充当修饰染色质结构的因子， 因此可诱导基因转录变化。
[0108] 在本发明中，S0X2蛋白和HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子可包括源自动物 (包括人、小鼠等）的所有S0X2和HMGA2，优选地源自人的S0X2和HMGA2。另外，本发明的S0X2 和HMGA2蛋白不仅可包括具有这些蛋白质的野生型氨基酸序列的那些蛋白质，而且可包括 其变体。在此，S0X2和HMGA2蛋白的变体包括由于至少一个氨基酸残基的敲除、插入、保守型 或非保守型置换或其组合具有不同于S0X2和HMGA2的天然氨基酸序列的序列的蛋白质。变 体可以是功能等同形式，其呈现与天然蛋白质相同的生物活性，或出于对理化环境提高结 构稳定性或生理活性的必要蛋白质理化性质被修饰的那些蛋白质。
[0109] 如本文所用，术语"编码S0X2或HMGA2蛋白的核酸分子"指代编码野生型S0X2或 HMGA2蛋白、或上述变体型S0X2或HMGA2蛋白--其中可通过置换、敲除、插入、或其组合修 饰至少一个核苷酸一一的核苷酸序列，并且可通过从天然来源分离或通过化学合成来制 备。
[0110]编码S0X2蛋白的核酸分子或编码HMGA2蛋白的核酸分子可处于如下形态中：各核 酸分子被独立地包含在表达载体中。
[0111] 具体地，S0X2蛋白或HMGA2蛋白可以是利用包括编码这些蛋白质的核酸分子的表 达载体由细胞系体外表达的形式的蛋白质。关于表达载体，可使用杆状病毒表达载体、哺乳 动物表达载体或细菌表达载体，而关于细胞系，可使用昆虫细胞系、哺乳动物细胞系、或细 菌细胞系，但本发明所用的表达载体和细胞系不限于此。
[0112] 如本文所用，术语"表达载体"可指代包括必需调控元件、与插入基因可操作地连 接以表达插入基因、能够表达靶蛋白的基因构建体。本发明的表达载体可用于递送重编程 诱导因子至非神经元细胞的目的。本发明的表达载体不仅可包括表达调控元件，如启动子、 操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子，而且可选择性地包括用于膜 靶向或分泌的信号序列、或前导序列，并且可根据目的用途被不同地制备。载体的启动子可 以是组成型或诱导型的。另外，表达载体包括选择性标记物，用于选择包括载体的宿主细 胞，并且在表达载体是可复制的表达载体时，其包括复制起点。表达载体可自我复制或可整 合到宿主DNA中。载体可包括质粒载体、粘粒载体、游离基因载体、病毒载体等，优选病毒载 体。病毒载体可包括源自下列的载体:逆转录病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、鼠白血病病毒 (MLV)、禽肉瘤/造血白细胞组织增生(ASLV)、脾坏死病毒（SNV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、小鼠 乳腺肿瘤病毒(MMTV)、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、仙台病毒等，但不限于此。
[0113] 编码S0X2或HMGA2蛋白的核酸分子可以是信使RNA(mRNA)。
[0114] 如本文所用，术语"重编程"指代使以具有不同特征的状态存在的分化的细胞(例 如，无分化能力的细胞或有部分分化能力的细胞等)恢复或转化成具有新型分化能力的细 胞的过程。细胞的重编程机制指代在敲除核内的表观遗传标记（与导致功能遗传性变化而 不导致给定核苷酸序列变化相关的DNA状态）后，建立不同的表观遗传标记组，并且不同的 细胞和组织在多细胞生物体分化和成长过程中获得不同的基因表达程序。这些不同的基因 表达谱呈现通过表观遗传修饰(例如，DNA甲基化、组蛋白修饰、和其他染色质结合蛋白）被 基本上控制。因此，多细胞生物体中的细胞类型被固定，并且在细胞分化或脱离细胞周期后 不变，但在正常发育过程中或具体疾病的进展过程中的具体时期，可进行主要表观遗传重 编程。本发明提供通过用具体蛋白质处理已经分化的目标细胞来制备具有未分化细胞的潜 能的细胞的方法。
[0115] 如本文所用，术语"重编程诱导因子"指代这样的物质：可诱导最终分化的细胞或 部分分化的细胞被重编程形成具有分化形成新细胞类型的潜力的诱导神经干细胞，并且可 包括S0X2蛋白、HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子。重编程诱导因子可无限制地包括任 何能够诱导分化细胞重编程的物质。
[0116] 如本文所用，HMGA2蛋白或编码这些蛋白的核酸分子可以是染色质调控因子。具体 地，染色质是核小体，具有DNA与组蛋白之间复合物的基础结构。染色质调控进行使得相应 基因的表达特征随DNA包围组蛋白的方式变化(例如，组蛋白乙酰化、DNA甲基化等)而变化。 因此，染色质可通过DNA甲基化/去甲基化被调控，并且HMGA2可通过促进S0X2基因的启动子 区域的低甲基化来充当染色质调控因子(实施例4-5)。
[0117]如本文所用，"非神经元细胞"指代除神经元细胞外充当本发明的靶细胞的所有分 化或未分化的细胞。非神经元细胞可以是源自不同动物(包括人、猴、猪、马、牛、羊、狗、猫、 鼠、兔等）的细胞，优选源自人的细胞，但通过诱导神经干细胞重编程的细胞不限于此。
[0118] 非神经元细胞可以是体细胞、成熟干细胞、或多能干细胞。
[0119] 如本文所用，术语"体细胞"指代构成成年者(adult)的细胞，具有有限的分化能力 和自我更新能力，具体地，体细胞构成人的皮肤、毛发、脂肪、血液等，优选是人成纤维细胞 或人脐带血细胞，但不限于此。
[0120] 如本文所用，"成熟干细胞"指代存在于骨、脂肪、骨髓基质、肌肉、神经等的干细 胞，优选间充质干细胞，但不限于此。
[0121 ]如本文所用，"诱导神经干细胞"指代通过对分化细胞应用重编程技术来构建具有 与神经干细胞相似或相同的多能性的未分化干细胞而制备的细胞。诱导神经干细胞具有与 神经干细胞相同或相似的特征，具体地具有相似的细胞形态、相似的基因和蛋白质表达谱， 并且可具有体内和体外多能性。因此，本发明的诱导神经干细胞可以是可分化形成神经细 胞(神经元）、星形胶质细胞、少突胶质细胞、GABA能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞等的 神经干细胞。
[0122]本发明的试剂盒可不被具体限制，而可使用可在本领域常规使用的任何试剂盒类 型。
[0123]本发明的试剂盒可以如下形式包装:包括S0X2蛋白和编码S0X2蛋白的核酸分子的 第一组合物和包括HMGA2蛋白和编码HMGA2蛋白的核酸分子的第二组合物分别被包含在单 独的容器中，或包含在唯一的容器中，该唯一的容器被划分成超过一个部分。
[0124] 在本发明的示例性实施方式中，为确认S0X2和HMGA2蛋白在人成纤维细胞至诱导 神经干细胞的重编程诱导过程中的效果，使这些蛋白质过表达，并通过PAX6/巢蛋白阳性集 落分析连续检查其形态变化和重编程诱导效力。结果是，确认在S0X2和HMGA2的表达同时增 加时，与仅S0X2表达增加时相比，自我更新能力、增殖能力和神经元细胞分化能力以及重 编程诱导效力增加。具体地，在仅以HMGA2诱导重编程时，诱导神经干细胞的集落早约10天 形成。
[0125] 另外，确认S0X2和HMGA2可有助于脐带血源间充质干细胞(hUCB-MSCs)和脐带血源 血细胞有效重编程形成诱导神经干细胞，并且具体地，确认HMGA2可有助于重编程效力提高 并减少重编程所需时间。
[0126] 作为本发明使用的非神经元细胞，脐带血源间充质干细胞是成熟干细胞的一个代 表性实例，脐带血源血细胞是体细胞的一个代表性实例，并且这些结果表明在S0X2和HMGA2 作为重编程诱导因子的辅助下，不仅体细胞，而且成熟干细胞也可被诱导神经干细胞有效 重编程。
[0127] 另一方面，本发明提供制备由非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或自其分化 的神经元细胞的方法。具体地，本发明的方法可包括(a)递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核 酸分子，和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞，或增加 S0X2蛋白和 HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达;和(b)培养步骤(a)的细胞。
[0128] 优选地，本发明的方法可进一步包括步骤(c):从步骤(b)获得的细胞培养物分离 神经干细胞样集落。
[0129] 在根据本发明生成诱导神经干细胞的方法中，可通过将S0X2和/或HMGA2的表达调 控元件引入靶细胞来增加 S0X2和HMGA2在靶细胞中的表达。
[0130] 具体地，递送重编程诱导因子一一如S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和 HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子--至细胞的方法可无限制地通过提供本领域使 用的核酸分子或蛋白质的常规方法进行，优选如下方法:添加重编程诱导因子至非神经元 细胞培养基、或直接将重编程诱导因子注入非神经元细胞，其中在此使用的重编程诱导因 子可以以下列形式使用：病毒，其由病毒载体转染的包装细胞获得，其中相应基因，即编码 S0X2蛋白的核酸分子和编码HMGA2蛋白的核酸分子，被分别插入;mRNAs，其通过体外转录生 成;或蛋白质，其在各种细胞系中生成。
[0131 ] 将重编程诱导因子直接注入分化细胞的方法可通过本领域已知的任何方法进行， 但不限于此，并且可通过适当选择方法进行，该方法选自微注射、电穿孔、粒子轰击、直接注 射入肌肉、和利用绝缘子和转座子的方法。
[0132]所用病毒载体可以是源自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病 毒、仙台病毒等的载体，但不限于此，并且优选地，可使用逆转录病毒载体。另外，关于包装 细胞，可在根据所用病毒载体选择后，使用本领域已知的各种细胞。
[0133] 另外，S0X2和HMGA2在靶细胞中的表达可通过引入S0X2和/或HMGA2的表达调节因 子来增加。
[0134] 具体地，HMGA2的表达调节因子可以是let_7miRNA簇抑制剂或TOE4D抑制剂。let-7miRNA簇已知是靶向HMGA2从而减少其表达的miRNA。在本发明中，可以通过引入let-7miRNA簇抑制剂来增加靶细胞中的HMGA2表达量。
[0135] 另外，S0X2的表达调节因子可以是PDE4D抑制剂。cAMP活化的主要细胞机制已知是 通过被称为环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)的同工酶系列的cAMP分解。PDE酶包括12种已知的 酶。IV型PDE抑制(PDE4抑制)被公认在炎症介导释放的抑制和气道平滑肌的松弛中尤其有 效。表明cAMP活化为在SCI后诱导神经元细胞以克服抑制剂信号的有希望的策略。通过洛利 普兰(rolipram)--TOE4抑制剂--抑制cAMP水解已知防止在脊髓挫伤后cAMP水平下降。 因此，当TOE4抑制剂结合于许旺细胞移植物时，其促进相当大的脊髓和本体感受轴突保留 和髓鞘形成。可以使用SelCID?作为TOE IV活性抑制剂。
[0136] 因此，PDE4D抑制剂--S0X2和HMGA2的常用表达调节因子--的应用可增加 S0X2 和HMGA2的表达量，从而显著增加重编程诱导效力等。
[0137] 除本发明的重编程诱导因子S0X2和HMGA2外，重编程诱导因子还可包括选自下列 的至少一种蛋白质 :0(^4、1(1?4、01^(：、1^呢8、和似11(^、或编码这些蛋白质的至少一种核酸 分子。这些蛋白质是已知的重编程诱导因子，并且其中CMYC和LIN28属于let-7miRNA簇。因 此，可通过另外表达这些诱导因子来增加重编程诱导效力。
[0138]另外，在本发明中，可利用其他纳米颗粒或化合物来引入S0X2蛋白或编码S0X2蛋 白的核酸分子、和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。
[0139] 本发明的步骤(b)的细胞培养可在本领域已知的适当的培养基和培养条件下进 行。这些培养过程可容易根据所选细胞被本领域技术人员调节。
[0140] 步骤(b)包括在神经元细胞分化培养基中培养，并且神经元细胞可自诱导神经干 细胞形成。
[0141] 另一方面，本发明提供通过上述方法制备的诱导神经干细胞或自其分化的神经元 细胞。
[0142] 诱导神经干细胞同上述。
[0143] 实施例中确认，诱导神经干细胞可分化形成神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细 胞，并且还可获得自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞。
[0144] 另一方面，本发明提供用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，其包括诱导神经干 细胞或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。
[0145] 本发明的诱导神经干细胞是可分化形成神经元相关细胞的那些细胞，因此可用于 神经元细胞再生。因此，其可用作细胞治疗产品。
[0146] 本发明的细胞治疗产品可包括1 .OX 105个细胞至1 .OX 109个细胞/lmL，优选1.0X 1〇6个细胞至1.0X108个细胞/lmL，更优选1.0X107个细胞/lmL，但不限于此。
[0147] 本发明的细胞治疗产品可不经冷冻干燥使用或被冷冻干燥以后续使用。在需要冷 冻干燥时，可在冷冻干燥前将标准冷冻保存液(例如，DMS0、甘油、和Epi 1 ife?细胞冻干介 质(Cascade Biologies))加入细胞群。
[0148] 另外，细胞治疗产品可在根据医药领域常规方法配制成适于给予患者身体的单位 给予形式后被给予，并且该制剂可包括在单次或几次给予后有效的给予剂量。适于此目的、 作为胃肠外给予制剂的制剂实例可优选为注射剂如注射安瓿瓶、输注剂如输注袋、和喷雾 剂如气溶胶制剂等。注射安瓿瓶可通过在使用前夕混合注射剂制备。关于注射液，可使用生 理盐水、葡萄糖、甘露醇、林格溶液等。另外，关于输注袋，可使用聚氯乙烯或聚乙烯材料，输 注袋可由Baxter、Becton Dickinson、Medcep、National Hospital Products、和Terumo制 造。
[0149] 细胞治疗产品可进一步包括至少一种药学上可接受的载体，例如，保存剂、镇痛 剂、增溶剂、稳定剂等，用于注射制剂;和基质、赋形剂、润滑剂、保存剂等，用于局部制剂。
[0150] 由此制备的本发明的细胞治疗产品可通过本领域使用的常规给予方法连同用于 移植和其他用途的其他干细胞一起或以与这些干细胞混合的形式给予，并且可优选被直接 灌输(移入，engrafted)或移植至疾病区域、或直接移植或输注至需要治疗的患者的腹腔， 但不限于此。另外，该给予可通过利用导管的非外科给予方法或通过截断后注入疾病区域 或移植至疾病区域的外科给予方法来给予，但更优选通过利用导管的非外科给予方法给 予。另外，根据常规方法的胃肠外给予，例如，直接给予到损伤中，和通过输注到血管中的移 植一一造血干细胞移植的普通方法，是可以的。
[0151] 上述细胞的日剂量可被给予一次或每日以几个分剂量给予，该分剂量为1.0 X104 个细胞/kg至1.0 X 101()个细胞/kg体重，优选1.0 X 105个细胞/kg至1.0 X 109个细胞/kg体 重。然而，应理解，活性成分的实际剂量考虑多种相关因素来确定，如待治疗疾病、疾病严重 程度、给予途径、患者体重、年龄和性别等，因此剂量不应被以任何方式解释为限制本发明 的范围。
[0152] 另一方面，本发明提供抑制或恢复对象的神经元细胞损伤的方法，包括给予重编 程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞。具体地，对象的神经元细胞损伤可通过给 予重编程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞被抑制或恢复，该重编程通过如下进 行:递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至 非神经元细胞;和培养该细胞。
[0153] 如本文所用，术语"对象"指代牛、狗、猪、鸡、羊、马、和包括人的哺乳动物，但不限 于此。优选地，重编程的诱导神经干细胞或其培养产物的给予可被腹膜内或血管内给予、直 接给予到损伤中或给予到关节滑膜腔中等。
[0154] 神经元细胞损伤的抑制或恢复可包括预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病。
[0155] 另一方面，本发明提供预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，其包 括SRY(性别决定区Y)框2(S0X2)蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子、和高移动性型AT钩2 (HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子，作为活性成分。
[0156] 如上所述，包括S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋 白的核酸分子的组合物可被引入非神经元细胞，以诱导其重编程形成神经干细胞，从而用 于预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病。
[0157] 另外，S0X2和/或HMGA2基因可被以如下形式提供:本领域已知的胞内基因递送系 统或基因转运体，例如，脂质复合体（lipoplex)，多聚体(polyplex)，细胞渗透肽(CPP)，蛋 白转导域(PTD)等，但不限于此。
[0158] PTD可无限制地被使用，只要其可提高S0X2和/或HMGA2的胞内引入效力。
[0159] 另外，S0X2和/或HMGA2可以是融合蛋白形式，该融合蛋白被S0X2和/或HMGA2质粒 和转运子之间的缀合物编码，从而将质粒递送到细胞中。例如，其可以是S0X2和/或HMGA2和 CPP或PTD之间、或S0X2和/或HMGA2和低分子量鱼精蛋白缀合物之间的融合蛋白形式。
[0160] 如本文所用，术语"神经元细胞损伤相关疾病"指代可由于神经元细胞改变、丧失 等发生的疾病、包括帕金森病、阿尔茨海默氏症、匹克氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、 缺血性脑病如中风、脱髓鞘疾病、多发性硬化症、癫痫、退行性神经元疾病、脊髓损伤等，但 不限于此。
[0161] 如本文所用，术语"预防"指代与通过给予上述组合物抑制或延迟神经元细胞损伤 相关疾病有关的各种行为，术语"治疗"指代与通过给予上述组合物导致神经元细胞损伤相 关疾病症状改善或有利变化有关的各种行为。
[0162] 另一方面，本发明提供筛选神经干细胞或神经元细胞的再生启动子或再生抑制剂 的方法，包括1)制备分离的非神经元细胞;2)通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分 子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞、或增加 S0X2蛋白和HMGA2蛋 白在非神经元细胞中的表达，诱导生成诱导神经干细胞;3)任选地，使步骤2)生成的诱导神 经干细胞分化形成神经元细胞;和4)在步骤1或步骤2后用候选物质进行处理，和根据候选 物质的处理，确定诱导神经干细胞或神经元细胞是否生成或其生成水平。
[0163] 在本发明中，通过非神经元细胞重编程是否生成神经干细胞或神经元细胞或生成 水平可通过观察诸如下列的变化来评价:候选物质处理之前和之后的非神经元细胞形态变 化、神经元细胞特异性标记物是否表达、自我更新能力、增殖能力、神经元细胞分化能力等。
[0164] 另外，本发明可进一步包括如下步骤：如果诱导神经干细胞或神经元细胞的生成 水平在步骤4中增加，则确定该候选物质是神经干细胞或神经元细胞的再生启动子。
[0165] 优选地，筛选方法可利用从患者分离的非神经元细胞筛选患者定制的神经干细胞 或神经元细胞再生启动子或患者定制的神经干细胞或神经元细胞再生抑制剂。
[0166] 具体地，可通过如下提供治疗方法:基于个别检查确定适于个别患者的构成或环 境的神经元细胞再生启动子或再生抑制剂。因此，可通过如下选择定制治疗剂:根据筛选方 法选择候选药物作为神经元细胞再生启动子或再生抑制剂，用该药物治疗神经元细胞损伤 相关疾病患者，和确认治疗效果，然后进行测绘(mapping)和将其储存。即，通过结合体外筛 选方法和体内确认方法，可更有效地选择和确认神经元细胞损伤相关患者的定制治疗剂。
[0167] 在本发明的示例性实施方式中，通过上述筛选方法确认，当HMGA2基因被另外引入 时，与S0X2基因或类似物被引入时相比，诱导形成诱导神经干细胞的效力增加约两倍或更 高，因此确认HMGA2蛋白可用作神经元细胞的再生启动子。
[0168] 另一方面，本发明提供筛选个人定制的神经元细胞治疗剂的方法，包括：1)制备分 离的非神经元细胞;2)通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码 HMGA2蛋白的核酸分子至非神经元细胞、或增加 S0X2蛋白和HMGA2蛋白在非神经元细胞中的 表达，诱导生成诱导神经干细胞;3)使步骤2)生成的诱导神经干细胞分化形成神经元细胞； 和4)用候选物质处理步骤3形成的非神经元细胞，和确定候选物质是否是针对非神经元细 胞获取对象定制的神经元细胞治疗剂。
[0169] 具体地，为根据个别患者的构成或环境来选择个人定制神经元细胞治疗产品，可 通过确认神经元再生相关机制和其相关蛋白质表达的变化、通过用候选物质处理步骤2诱 导的神经干细胞或步骤3形成的神经元细胞来确认和验证用于生成诱导神经干细胞的非神 经元细胞是否可用作非神经元细胞获取对象的定制神经元细胞治疗产品。
[0170] 另一方面，本发明提供促进非神经元细胞重编程形成诱导神经干细胞(iNSC)的组 合物，其包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。
[0171] 在本发明的示例性技术特征中，确认当HMGA2蛋白的表达和S0X2因子(传统公知是 神经元分化转录因子)一起增加时，从非神经元细胞至诱导神经干细胞的诱导效力和增殖 能力显著高于利用常规S0X2的重编程。因此，HMGA2蛋白和编码HMGA2蛋白的核酸分子可用 于促进重编程非神经元细胞形成神经干细胞。
[0172] 另一方面，本发明提供用于细胞增殖的组合物或用于抑制细胞衰老的组合物，其 包含HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。
[0173]如本文所用，术语"细胞增殖"包括细胞数量增加，因此细胞增殖伴随DNA复制、细 胞分裂、和各种细胞组分增加，并且体内细胞增殖速率可被控制。
[0174] 另外，术语"细胞衰老"指代包括下列的过程:细胞特征和功能退化，直到细胞死亡 或细胞增殖终止之时。已知的衰老原因包括代谢被代谢产物抑制、细胞表面变化、细胞骨架 分子如胶原蛋白之间交联增加、退化分子通过自由基在细胞中积累、遗传信息转录和翻译 错误积累、被致死基因遗传编程的细胞的预期寿命、胞内DNA损伤和修复活性恶化等。如本 文所用，术语"衰老"不仅包括细胞衰老，而且包括组织和活生物体衰老。具体地，干细胞衰 老可伴随，随着次代培养数增加，干细胞中衰老相关半乳糖苷酶的表达增加、干细胞尺寸 增加、干细胞增殖速率降低、增殖期缩短、端粒酶活性减少、或干细胞分化能力下降。
[0175] 在本发明实施例11至20中，确认HMGA2转导的人脐带血源细胞(hUCBSC)不仅显示 形态变化减少，而且显示SA-i3-gal表达减少和细胞增殖保持。相比之下，当HMGA2被抑制时， 形态变化增加，而且随同SA-i3-gal表达增加，细胞增殖显著减少。因此，确认HMGA2蛋白过表 达可促进基 质细胞增殖，同时抑制细胞衰老。另外，根据本发明控制基质细胞的增殖、保持 和衰老可通过下列进行:控制基质细胞的增殖一一通过经由基质细胞转染诱导HMGA2蛋白 的表达，和保持分化能力和干细胞能力，从而防止基质细胞衰老。因此，随着在培养过程中 次代培养数增加，基质细胞的衰老更快进行，因此细胞分裂快速减少的问题可被解决。这种 方法也可用于干细胞。
[0176] 下文将参考下列实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅以示例 为目的，而非意图本发明受限于这些实施例。
[0177] 制备实施例1:细胞培养
[0178] (1)在足月分娩后立即从20至30岁母体获得人脐带血源间充质干细胞（hUCB- MSC)，仅使用自分娩24小时内收集的血液样本。将脐带血样本与HetaSep溶液(Stem Cell Technology，加拿大温哥华）以5: l(v/v)的比例混合，然后在室温下进行培育，直到血红细 胞耗尽。在培育后，收集上清液，并通过在2,500rpm下Ficoll(GE healthcare life sciences，匹兹堡，PA)密度梯度离心20分钟收集单核细胞。细胞用PBS洗涤两次，并接种于 具有生长培养基的培养皿上，该生长培养基为包含10%胎牛血清(FBS;Gibco BRL)的内皮 细胞生长培养基_2(Gibco BRL，Grand IslancUNY)。在Boramae医院机构审查委员会 (Institutional Review Board，IRB)和首尔国立大学（Seoul National University)IRB (1109/001-006)的批准下进行分离和研究方案。
[0179] (2)同时，人真皮成纤维细胞(hDF，C-013_5C)购自Life Technologies，并被培养 于包含10%FBS的成纤维细胞生长培养基-2(Gibco BRL)中。
[0180] (3 )H9源人神经干细胞(H9-hNSC，NA800-100)购自Gibco，并被培养于包含StemPro 神经补充物、碱性FGF、和EGF重组蛋白的KnockOut DMEM/F12基础培养基中。
[0181] (4)分离人脐带血源基质细胞，并将其如下述培养。具体地，为从脐带血(首尔国立 大学医院）去除血红细胞，将脐带血与HetaSep溶液（Stem Cell Technology，加拿大温哥 华）以5:l(v/v)的比例混合，然后在室温下培育30分钟。小心收集上清液，通过添加 Ficoll 溶液收集单核细胞并在2，500rpm下离心20分钟。仅收获分离的细胞，用PBS洗涤两次，并以2 X 1〇5个细胞/cm2的浓度培养在包含肝素、抗坏血酸、重组人表皮生长因子(rhEGF)、氢化可 的松、血管内皮生长因子(VEGF)、重组人成纤维细胞生长因子(rhFGF-B)、重组长R胰岛素样 生长因子-1(R3-IGF-1)、硫酸庆大霉素、两性霉素-B(GA-1000))和10%FBS(Gibco)的EMEM (Gibco)培养基中。培育后4天，去除未附于底部的那些细胞，并在80%细胞汇合时进行次代 培养。
[0182] 制备实施例2:通过转导由人真皮成纤维细胞制备人诱导神经干细胞(hiNSC)
[0183] 通过VSV-G和gag/pol质粒和Fugene 6转染剂（Roche，Indianapolis，IN)，将S0X2、 HMGA2、CMYC和LIN28质粒转染到293T细胞中。在转染后48小时和72小时后收集病毒，并加载 54区/1111^聚凝胺（5丨81]^，1?〇111^〇111^〇11^，附），以转导单独或与至少两种基因组合的基因至11〇?、 hUCB-MSC和HJCB-CD34+MNC。转导后，将细胞用roS洗涤两次以去除病毒，并在生长培养基中 培养以增殖。
[0184] 为进行神经干细胞诱导，将培养基替换成ReNcell NSC维持培养基(Millipore， Billerica,ΜΑ)--神经干细胞诱导培养基，包含bFGF( Sigma)和EGF( Sigma)。通过 Accutase(Gibco BRL)对hiNSC进行次代培养。
[0185] 实施例1:分离iNSC和确认其特征
[0186] 利用逆转录病毒S0X2，通过ST0饲养细胞，在涂有聚-L-鸟氨酸(PL0)和纤连蛋白 (FN)的玻璃盖玻片上将hDF转染成hiNSC。在转染2周至3周内从S0X2转导的hDF生成S0X2样 和NSC样集落。
[0187] 分离诱导神经干细胞集落，并通过反复的次代培养和神经球培养使其稳定。为附 着诱导神经干细胞，将玻璃盖玻片涂覆PL0/FN，并将5 X 104个诱导神经干细胞散布于其上。 在24小时内，将细胞用4%多聚甲醛(PFA)固定20分钟，然后用0.3%Triton X-100 PBS透化 10分钟。将细胞用5%正常山羊血清(NGS)阻断1小时，并用初级抗体以1:100的浓度处理过 夜。第二天，将细胞用次级抗体以1:1000的浓度培育1小时。其核用DAPI染色，并在固定后干 燥。
[0188] 结果是，S0X2转导的iNSC具有与H9源NSC(H9-NSC)相似的形态，并且显示NSC特异 性标记物如PAX6、巢蛋白、波形蛋白（VnffiNTIN)和S0X2的表达(图1A至1D和S1A)。
[0189] 实施例2:分析S0X2转导的hiNSC中的miRNA表达谱
[0190] 实施例2-1:微RNA微阵列分析
[0191] 利用Trizol试剂从细胞提取全RNA，为了生成荧光标记的miRNAs，利用Agilent miRNA完全标记和杂交试剂盒将100ng全RNA样本标记并杂交。通过Agilent微阵列扫描仪扫 描带标记miRNA的信号。利用软件(Agilent特征提取软件(vll.0.1.1))提取原始数据，并利 用R统计学语言v. 2.15.0对其进行分析和可视化。
[0192] 实施例2-2 :miRNA表达谱的分析结果
[0193] 通过如同实施例2-1的微阵列分析，确定hDF、H9-NSC和S0X2转导的hiNSC的miRNA 谱。
[0194] 结果是，确认，S0X2转导的hiNSC的miRNA表达谱，与hDF相比，更相似于H9-NSC(图 1Ε)〇
[0195] 具体地，确认在成纤维细胞向功能神经元的转化中具有主要作用的神经谱系 (neural lineage)特异性miRNA如miR-9-5p、miR-9_3p、和miR-124的表达水平在H9-NSC和 S0X2转导的hiNSC中比在hDF中更加上调。
[0196] 另外，关于已知在NSC维持和自我更新的控制中发挥作用的let-7,确认整个let-7/miR-98家族的表达水平在H9-NSC和S0X2转导的hiNSC中比在hDF中更加下调（图IF和1J)。
[0197] 然而，未检测到在hDF、H9_NSC和S0X2转导的hiNSC之间胚胎干细胞特异性 miRNA--miR-302/367家族--的表达有显著改变，但在人胚胎干细胞(hESC)中检测到显 著表达。
[0198] 实施例3: Let_7b导致iNSC重编程效力、增殖、和自我更新的分析
[0199] 实施例3-1 :miRNA活性导致iNSC重编程效力的分析
[0200] 为确认miRNA活性是否促进hDF重编程形成iNSC，在重编程过程中用3(^2转染11^1?- 9-5p、miR-9-3p、miR-l 24、抗let-7b、let-7b、miR-CTL 和抗 miR-CTL。
[0201 ]具体地，利用市售hsa_let_7b( Invitrogen，PM11050)、miR-124_3p( Invitrogen， PM10691)、miR-9-5p(Invitrogen，PM10022)、miR-9-3p(Invitrogen，PM13072)和抗 let-7b (Invitrogen，AMI 1050 )使miRNA过表达，并使用适当的pre-miRNA前体-阴性对照 (Invitrogen，AM17110)和抗miRNA抑制剂-阴性对照（Invitrogen，AM17010)。
[0202]关于集落形成率测定，将2 X104个细胞的S0X-2转导的hDF接种于24孔板，然后转 染。转染利用5〇11]\1118&-161：-713、111丨1?-124-3。、111丨1?-9-5。、111丨1?-9-3。和抗161：-713进行（第0天）， 并在3天后(第3天)再次转染。
[0203] 结果是，确认S0X2转导的hDF转化成神经元样细胞，而非NSC样集落。在miR-124、 miR-9-5p或miR-9-3p转染的细胞中，与miR-CTL转染的细胞相比，形成PAX6/巢蛋白阳性集 落的效力下降很少或根本无变化。
[0204] 然而，与抗miR-CTL相比，let_7b的过表达使重编程效力下降，而let_7b抑制使重 编程效力增加至少3 · 5倍(图11)。
[0205] 实施例3-2: let_7b导致hiNSC增殖的能力
[0206] 为确认miRNA let_7b是否控制hiNSC的增殖，用S0X2转导的hiNSC转染let_7b，并 通过分裂细胞的5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记来测量细胞增殖。
[0207] 具体地，为测量细胞的增殖速率，如下述将iNSC用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU;Sigma) 染色。简而言之，将1〇μΜ BrdU加入细胞培养基，并在37°C下培育5小时。然后，用roS洗涤细 胞，并用4%PFA将其在室温下固定10分钟。关于透化，在85°C下应用柠檬酸钠缓冲剂15分 钟，并用阻断液(5%NGS)培育细胞。然后将细胞用在阻断液(AbeamCambridge，MA)中稀释 的BrdU初级抗体在4°C下培育过夜。用次级Alexa-488抗体处理细胞1小时。关于核染色，将 DAPI在PBS中稀释至l:1000，并与细胞一起培育10分钟。用共聚焦显微镜(EclipseTE200， Nikon，日本东京）拍摄图像。
[0208]结果是，确认BrdU阳性细胞的百分比减少，具体地，let_7b的转染使hiNSC的增殖 以剂量依赖性方式减少（图6A和6B)。
[0209] 实施例3-3: let_7b导致hiNSC的自我更新能力
[0210] 为确认let_7b是否调节S0X2转导的hiNSC的自我更新，进行神经球形成测定。
[0211] 具体地，在miRNA处理后，将2，000个细胞在非粘性培养皿中培养，形成初级神经 球。利用Accutase使初级神经球细胞解离成单个细胞，然后在非粘性培养中以克隆密度重 新铺平板，形成次级神经球。培养7天后计数和测量次级神经球的数量和尺寸。
[0212] 结果是，确认let-7b-转染的hiNSC的尺寸小于miR-CTL转染的hiNSC的尺寸，而且 let-7b在亚克隆过程中的增加导致几乎不形成次级神经球(图6C至7E)。
[0213] 实施例4:同时转导S0X/HMGA2导致hiNSC重编程激活
[0214] 由于实施例3确认了 let_7b过表达使hiNSC重编程效力下降，因此考察MYC和LIN28 (已知抑制let-7b的表达)和HMGA2(其表达已知被let-7b抑制）的过表达是否可提高hiNSC 重编程效力。
[0215] 实施例4-1 :HMGA2导致细胞增殖的确认
[0216] 为考察CMYC、LIN28和HMGA2与S0X2组合过表达与单独S0X2过表达相比是否增加细 胞增殖，进行MTT测定。具体地，将1 X 104个细胞接种于24孔板。培育48小时后，将50yL MTT 原液(5mg/mL)加入培养基。在37°C下培育4小时后，移除包含MTT溶液的培养基。添加 DMS0以 溶解甲願晶体，然后将溶液转移至96孔板。通过EL800微板读取器(BIO-TEK Instruments， Winooski，VT)测量540nm波长下的吸光度。
[0217] 结果是，确认其中HMGA2具有最低增殖能力，并且其比CMYC低32%，比LIN28低 17%(图 2A)。
[0218] 实施例4-2 :HMGA2导致iNCS重编程效力提高的确认
[0219] 为确认CMYC、LIN28和HMGA2与S0X2组合过表达与单独S0X2过表达相比是否促进 hiNSC重编程，分别测量各情况的形成PAX6/巢蛋白阳性集落的效力。
[0220]结果是，确认HMGA2与S0X2的过表达显著增加 hiNSC的重编程效力（图2C)，并且 S0X2/HMGA2的同时过表达使形成PAX6/巢蛋白阳性集落所需的时间从17天减少至7.4天（图 2B)〇
[0221 ] 实施例4-3: HMGA2导致免疫表型变化的确认
[0222] 为确认在重编程早期阶段是否诱导了免疫表型变化，确定荧光激活细胞分选术 (FACS)〇
[0223] 结果是，观察到仅S0X2/HMGA2过表达细胞显示细胞总量约10 %的细胞群在转染后 7天从CD44-阳性变成⑶44-阴性，同时，细胞群约7%显示从⑶184-阴性变成⑶184-阳性(图 2D)。
[0224] hiNSC和H9-NSC大部分显示CD44-阴性和CD184阳性细胞群（图7A)，S0X2/HMGA2转 导的hiNSC还显示与S0X2转导的hiNSC和H9-NSC相似的形态特征，和NSC特异性标记物，如 PAX6、巢蛋白、S0X2、Ki67、和 HMGA2 的表达（图 2E)。
[0225] 实施例4-4: HMGA2导致的转录组重编程水平的评价
[0226] 为评价HMGA2导致的转录组重编程水平，通过微阵列分析来分析比较性全局基因 表达数据，并进行定量实时PCR(qRT-PCR)以评价微阵列数据。
[0227] 结果是，确认全局基因组热图和成对的散布图显示，hiNSC非常类似于H9-NSC，但 不同于亲本hDF(图 7B和7C)。S0X2-和S0X2/HMGA2转导的 iNSC中均诱导了 S0X2、HMGA2、PAX6、 巢蛋白、0LIG2、MSI 1和GLAST，并且其表达水平与H9-NSC相当（图2F)。
[0228] 实施例4-5: S0X2启动子的甲基化状态分析
[0229] 为分析hDF、H9-NSC和S0X2-和S0X2/HMGA2转导的hiNSC中的S0X2DNA的甲基化状 态，利用EZ DNA甲基化-金试剂盒(Zymo Research，Irvine，CA)使未甲基化的胸腺啼啶转化 成胞嘧啶。
[0230]具体地，通过整合热变性和利用CT转化试剂的硫酸氢钠处理，使CpG岛中的未甲基 化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。随着在进行酸性亚硫酸DNA转化后回收DNA，将转化的DNA去磺 化，随后清洁和洗脱。然后，立即通过PCR扩增酸性亚硫酸根修饰的DNA，并将其储存在-20°C 以下。关于酸性亚硫酸根转化的DNA的扩增，在MethPrimer(http://www· urogene · org/ methprimer)设计引物，并进行PCR。引物序列显示如下：
[0231] Sox2正义5'-GGGATATGATTAGTATGTATTTTTT-3'（SEQ ID N0:1)，
[0232] Sox2反义5，-AATTTTCTCCATACTATTTCTTACTCTCCT-3，（SEQ ID N0:2)
[0233] 将生成的PCR产物与pGEM T-Easy载体系统I(Promega，Madison，WI)连接。然后，将 质粒DNA克隆到细菌（DH5c〇。利用ABI 3730XL毛细管DN A测序仪(Applied Biosystems)，通 过Ml3反向引物(5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 '）测序，来分析从细菌克隆提取的质粒 DNA。随后，甲基化的CpGs通过黑圆圈表不，而未甲基化的CpG通过白圆圈表不。
[0234] 结果是，确认hiNSC中的S0X2启动子是低甲基化的，类似于H9-NSC，表明S0X2在转 录上是活化的（图2G)。因此，确认HMGA2发挥染色质调控因子的作用，促进S0X2启动子低甲 基化。
[0235] 总之，本实施例表明HMGA2,作为let_7b靶，显著增加 S0X2诱导的重编程形成hiNSC 的效力和时间，并且S0X2/HMGA2转导的hiNSC在细胞表面标记物特征、转录水平、甲基化模 式等方面显示与H9-NSC相似的特征。
[0236] 实施例5: HMGA2下调导致hiNSC增殖和自我更新抑制的确认
[0237] 为确认HMGA2是否控制hiNSC的增殖，用HMGA2靶向性siRNA(siHMGA2)转染hiNSC， 并通过BrdU标记分裂细胞来测量细胞增殖--具体地，利用市售siRNA(Dharmacon，0N Target plus SMART pool，03七札-013495-00-0005，1^€&76?6,〇))作为!《^2抑制剂，和非 革巴向性siRNA(Dharmacon，0N Target plus SMART pool，Cat#D-001810_01)作为对照。将细 胞以1 X 104的浓度接种于24孔板，并用加入无抗生素的培养基的Dharmafect转染剂 (Dharmacon)转染50nM siRNA。
[0238] 结果是，HMGA2的下调使BrdU阳性细胞的百分比急剧减少（图8A和8B)。另外，确认 siHMGA2转染的hiNSC显著减少神经球尺寸，而且减少自我更新，如通过可在初级神经球中 产生次级神经球的细胞的数量和百分比确认（图S4C至S4E)。总之，表明利用针对HMGA2的 s iRNA下调HMGA2，抑制hiNSC的增殖和自我更新。
[0239] 实施例6:hiNSC多能性的确认
[0240] 关于神经分化，将hiNSC以1,000的密度接种于包含iNSC维持培养基(ReNcell NSC 维持培养基(Millipore))的24孔板中的各聚-L-鸟氨酸/纤连蛋白涂覆的盖玻片上。24小时 后，将培养基更换成Neurocult (Stem Cel 1 Techno logy)，进行随机分化。1周Neurocul t后， 将培养基更换为三种具体谱系(神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞)的诱导培养基。 [0241 ]同时，在诱导分化后，通过免疫细胞化学利用谱系相关标记物确认iNSC。
[0242]实施例6-1:神经元分化能力的确认
[0243] 作为神经元诱导培养基，使用DMEM/F12(Gibco BRL)和Neurobasal(Gibco BRL)之 间的1:1混合物，其包含B27(Gibco BRL)、Gmax(Gibco BRL)、维甲酸（Sigma)、抗坏血酸 (Sigma)、BDNF(Peprotech，Rocky Hill，NJ)、GDNF(Peprotech)、和Forskolin(Sigma)〇
[0244] 分化结果是，在对S0X2/HMGA2转导的hiNSC进行神经元诱导后10天至15天，确认未 成熟神经元标记物、神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ1)、双皮质素（doublecortin， DCX)、和神经元中间丝、α-互联蛋白、和神经丝(NF)的表达(图3A)。
[0245]另外，用于hiNSC自我更新能力评价的克隆分析的结果是，确认神经元分化被诱 导，并且多传代的克隆的NF和α-互联蛋白被染色。神经元诱导10天至25天后，MAP2(成熟神 经元标记物）、酪氨酸羟化酶(TH)(多巴胺能和去甲肾上腺素能神经元标记物）、和胆碱乙酰 转移酶(ChAT)，与H9-NSC相比，以相似的水平表达(图3A和9A)。
[0246]实施例6-2:星形胶质细胞分化能力的确认
[0247] 作为星形胶质细胞诱导培养基，使用包含N2(Gibco BRL)、Gmax、和1%FBS的DMEM (高葡萄糖)培养基。
[0248] 结果是，确认S0X2/HMGA2转导的hiNSC生成胶质纤维酸性蛋白（GFAP)阳性细胞，从 而确认hiNSC分化形成星形胶质细胞(图3A)。
[0249]实施例6-3:少突胶质细胞分化能力的确认
[0250]有两种不同类型的少突胶质细胞诱导培养基。第一，将细胞在补充有N2、MEM非必 需氨基酸溶液(MEM NEAA;Gibco BRL)、肝素（Sigma)、RA、SHH(Peprotech)、和B27的DMEM/ F12培养基中培养2周，然后将培养基更换成补充有N2、B27、MEM NEAA、T3、cAMP(Sigma)、 PDGF(P 印 rotech)、IGF(R&D)和 NT3(Sigma)的DMEM/F12 培养基2 周。
[0251]结果是，确认在朝少突胶质细胞方向诱导20天至35天后检测到04和0LIG2(少突胶 质细胞标记物)双重阳性细胞(图3A)。
[0252] 实施例7: hiNSC电生理学特征分析
[0253] 为评价S0X2/HMGA2转导的hiNSC的功能，通过膜片钳读取(patch-clamp reading) 来测试电生理学性质。具体地，利用EPC 10USB扩增仪（HEKA Electronik，Lamprecht， Germany)在室温下（22±1°C)记录源自iNSC的神经元的全细胞膜片钳记录。记录室装有持 续流动的Tyrode溶液（流速，10mL/min)，并且贴片电极通过？〇10牵拉器（此148111区6 Company)由硼硅酸玻璃毛细管制成。电极在其装有移液管溶液时电阻为4M Ω至7M Ω。获取 数据，并利用脉冲程序版本8.67(HEKA Electronik)和Origin 6.1软件(MircoCal)进行分 析。将电流在3kHz下利用四极Besse 1 s过滤器过滤，并在10kHz下数字化。Tyrode溶液包含 143mM NaCl、5.4mM KCl、0.5mM MgCl2、1.8mM CaCl2、0.5mM NaHP〇4、10mM葡萄糖和5mM 4-(2 羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES);并且pH用Na0H调整至7.5。移液器溶液包含150mMKCl、 l.OmM MgCl2、10mM HEPES、5mM EGTA、2mM Mg-ATP，并且pH用NaOH调整至7.2。利多卡因 (〇.1%)用于阻断他电流。
[0254] 结果是，确认S0X2/HMGA2转导的hiNSC可在产生表达钠电流的神经元时生成不同 动作电位。钠电流(或内部电流)和动作电位被钠通道阻断剂利多卡因抑制，并且在洗出后 恢复正常状态（图3B至3D和9B至9D)。这些数据表明，自hiNSC分化的神经元具有正常神经元 的功能膜性质和活性。
[0255] 实施例8:在动物模型中测试hiNSC分化和存活性
[0256] 实施例8-1:移植CMDil标记的hiNSC
[0257] 利用Accutase分离S0X2/HMGA2转导的hiNSC，并将其悬浮于PBS中。用CM-Dil (分子 探针)标记hiNSC，以在注射后进行追踪。用CM-Dil在37°C水浴中培育hiNSC15分钟，然后在4 °C下培育10分钟。将CM-Dil标记的hiNSC以1X10 5个细胞/VL的密度悬浮于PBS中。利用立体 定位仪和超微栗（World Precision Instruments，Sarasota，FL)将CM-Dil标记的hiNSC移 植到室下区（SVZ)。移植后，通过缝合闭合头皮，并使动物从麻醉恢复，从而制备4周龄小鼠 模型。
[0258] 实施例8-2: IHC冷冻切片
[0259] 移植后三周，从小鼠模型分离脑，并浸入4%PFA过夜，然后转移至30 %蔗糖48小 时。然后，使分离的脑与浸润混合物(0CT化合物;Sakura Finetek，日本东京)一起成型，保 持在-70°C过夜，并在低温恒温器(CM 3050，Leica，德国韦茨拉尔）上进行冷冻切片。具体 地，用0.05%Triton X-100培育组织20分钟。用5%NGS培育组织，以阻断非特异性抗体结 合。然后，在4°C下用初级抗体以5%NGS的稀释比培育组织过夜。在室温下用Alexa 488或 Alexa 594标记的二级抗体（1:1000)培育组织1小时。用DAPI将核染色10分钟。用共聚焦显 微镜(Nikon)拍摄图像。
[0260]结果是，通过免疫染色检测到移植细胞，并且检测到的细胞被三种不同谱系的标 记物共同染色。免疫染色显示，发现移植的hiNSC是TUJ1(神经元）、GFAP(星形胶质细胞)和 MBP(少突胶质细胞）阳性的，其被CMDi 11荧光共同定位（图3E和9E)。总之，表明S0X2/HMGA2 转导的hiNSC能够在体内存活并分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
[0261] 实施例9:各种体细胞通过HMGA2有效重编程形成hiNSC
[0262] 实施例9-1:通过HMGA2进行hUCB-MSC的iNSC重编程
[0263]由于人脐带血(hUCB)细胞的优点是其可无侵入获得并且保留最少基因突变，因此 评价hUCB是否可用作iNSC重编程的来源。
[0264] 按照制备实施例1的描述，从hUCB分离间充质干细胞(MSC)群。在S0X2/HMGA2转导 到hUCB-MSC中后，hUCB-MSC源hiNSC集落在转染后第7天至第12天出现，并且其被免疫细胞 化学证明是PAX6和巢蛋白阳性染色的iNSC(图4A)。已有报道称MSC是⑶73和⑶105阳性的， 但是造血标记物CD34、CD45和HLA-DR阴性的。hUCB-MSC源hiNSC是CD73和CD105阴性的，表明 细胞表面标记物特征已被改变(图10A)。
[0265] 另外，确认与hDF相比，hUCB-MSC中HMGA2的表达明显较高（图10B)。S0X2/HMGA2转 导的hUCB-MSC产生比S0X2转导的hUCB-MSC高3至4倍的PAX6/巢蛋白阳性集落(图10C)。
[0266] 实施例9-2:H9-NSC和hiNSC之间的增殖能力差异
[0267] 为确认来自不同细胞来源和转基因组合的H9-NSC和hiNSC之间的增殖能力差异， 通过累积群体倍增水平分析(CPDL)测量H9-NSC和hiNSC的增殖速率。具体地，利用方程式 CPDL = ln(Nf/Ni) 1η2通过整个累积群体倍增水平确定增殖速率，其中Ni是初始接种细胞数， Nf是最终收获细胞数，In是自然对数。
[0268] 在6孔板上接种三份5 X104个细胞，并将其每4天进行次代培养。为只检测活细胞， 利用台盼蓝计数最终细胞数，并再次接种5Χ10 4个细胞。关于累积群体倍增水平的计算，计 算各传代的群体倍增数，并加和至前一传代的群体倍增数。
[0269] 结果是，确认H9-NSC和hiNSC细胞系之间增殖能力无显著差异，这表明H9-NSC和 hiNSC细胞系具有相似的增殖能力（图10D)。
[0270] 实施例9-3:诱导衰老hUCB-MSC形成神经干细胞的能力的确认
[0271] 为研究let_7b/HMGA2在重编程效力中的作用，通过转导单独S0X2或S0X2与let-7 靶向因子组合，考察衰老hTCU-MSC是否可被诱导形成神经干细胞。为此，用S0X2、S0X2/ CMYC、S0X2/LIN28、和S0X2/HMGA2转导衰老hUCB-MSC--其衰老经由衰老相关(SA)-0-半乳 糖苷酶测定确认（图4B)。
[0272] 关于半乳糖苷酶测定，将hUCB-MSC接种于6孔板，并培育直到群体达到40 %至 50%，用PBS洗涤两次，并在室温下用0.5 %戊二醛在PBS中固定5分钟。用包含ImM MgCl2的 ?85(?!17.2)洗涤细胞，并将其用乂飞&1溶液（11^/1111^1 &1、0.1211111(此[0幻6(铁氰化钾）、 0.12mM K4Fe[CN]6(亚铁氰化钾）和ImM MgCl2，在PBS中，pH 6.0)在37°C下培育过夜。第二 天，在显微镜（1X70,Olympus，日本)下拍摄图像。
[0273] S0X2/CMYC和S0X2/LIN28之间的组合导致形态变化，但不生成hiNSC集落，而仅 S0X2/HMGA2过表达被明显显示促进hiNSC集落形成（图4B)。S0X2/HMGA2过表达导致在转化 后三周由IX 1〇5个衰老hUCB-MSC形成2至4个集落(转化效力为0.004%至0.008%)(图4C)。
[0274] 实施例10:脐带血⑶34+细胞的hiNSC重编程
[0275] 实施例10-1:脐带血⑶34+细胞的分离和纯化
[0276] 通过CD34微珠分选系统(MACS)进行CD34+细胞分离。具体地，将50yL CD34微珠(# 130-046-703，Miltenyi Biotech)与在2°C至8°C下利用30分钟Lymphoprep(ProteoGenix， Portland，0R)密度梯度离心从脐带血获得的单核细胞(约IX 108)-起培育，从而磁性标记 CD34+细胞。使单核细胞的悬浮液经过连接MACS柱后的有磁场的MACS分选机，使得仅磁性标 记的CD34+细胞可被限制在柱内。将柱从MACS分选机移除后，通过施压将缓冲液推开，从而 分离被限制的CD34+细胞。在包含 10%FBS、50ng/mL SCF、20ng/mL IL-6、50ng/mL ΤΡ0和 100ng/mL Flt3的Iscove改良型Dulbecco培养基（nffiM)培养CD34+细胞。
[0277] 利用抗CD34-FITC抗体(Miltenyi Biotech)通过流式细胞术测量CD34+细胞的纯 化效力，结果是，确认84.15 %纯度的⑶34+细胞被分离和纯化（图4E和27)。
[0278] 实施例10-2:脐带血⑶34+细胞的hiNSC重编程的确认
[0279] 关于刺激胞质分裂，将MJCB-CD34+细胞用细胞因子(SCF、Flt3L、TP0和IL-6)培养3 天，并通过逆转录病毒用S0X2/HMGA2转导（图4D)。然后将细胞铺平在饲养器上，直到转导后 10天至14天，并在NSC条件下观察iNSC集落。免疫细胞化学染色的结果显示，hUCB-⑶34+ iNSC具有PAX6、S0X2和巢蛋白的阳性表达。另外，这些hUCB-CD34+iNSC能够发育成神经元或 星形胶质细胞（图4F)。单独S0X2足以生成hUCB-CD34+iNSC，但显示极低效力。共表达S0X2和 HMGA2的HJCB-CD34+细胞显示形成PAX6/巢蛋白阳性集落的频率增加10至20倍（图10E)。 [0280]总之，通过S0X2和HMGA2之间的协同相互作用进行的有效定向重编程实现，不仅干 细胞，而且各种体细胞如血细胞，重编程形成hiNSC。
[0281] 实施例11:转染hUCBSC细胞的HMGA2蛋白表达增加的确认
[0282] 实施例11-1:转染进行HMGA2过表达
[0283] 为验证HMGA2蛋白在人脐带血源基质细胞（hUCBSC)分化和衰老中的作用，用 HMGA2转染8或更少代的早期阶段的hUCBSC。
[0284] 首先，将HMGA2序列克隆到pMX逆转录病毒载体中。将HMGA2质粒连同VSV-G和gag/ pol质粒转染到293T细胞中。转染后48小时和72小时收集病毒 悬浮液，并利用其在5yg/mL聚 凝胺的存在下转染hUCBSC。测量转导效力，显示为80%或更高，如图12所示。
[0285] 实施例11-2:免疫细胞化学分析
[0286] 在实施例11-1制备的HMGA2转染的8或更少代的早期阶段的人脐带血源基质细胞 (hUCBSC)中，通过免疫细胞化学分析确认HMGA2蛋白表达增加，结果显示在图13中。
[0287] 实施例11-3:微阵列
[0288] 在实施例11-1制备的HMGA2转染的8或更少代的早期阶段的人脐带血源基质细胞 (hUCBSC)中，通过微阵列分析确认HMGA2蛋白表达增加，结果显示在图14中。
[0289] 实施例11-4:根据次代培养传代进程的HMGA2表达水平的测量
[0290] 在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过PCR确认 根据次代培养进程的HMGA2表达水平。
[0291 ] 根据制造商推荐的方案，利用Trizol试剂?1(1]1￥；[1：1'(^11，1^)提取全1?嫩，然后向 其加入寡dT引物和Accupower RT预混物(Bioneer，Korea)，以合成cDNA。利用cDNA作为模板 按照制造商推荐的方案进行PCR，结果显示在图15中。根据PCR实验结果，确认HMGA2表达水 平随次代培养从第6传代进行至第20传代而减少。
[0292] 实施例12:根据次代培养传代进程的形态变化的确认
[0293]在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过相位对 比图像测量根据次代培养传代进程的细胞形态，结果显示在图16中。
[0294]根据图16,确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)随着传代进程变得更扁平和更长， 而人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的形态变化减少。
[0295] 实施例13:SA-b_gal (衰老相关β-半乳糖苷酶)染色
[0296] 为确认实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的衰老水 平，通过β-gal染色法测量根据次代培养传代进程的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-i3-gal)表 达水平，结果显示在图17中。
[0297] 根据图17,确认人脐带血源基质细胞(hUCBSC)使衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal)表达水平减少。
[0298] 实施例14:根据次代培养传代的细胞增殖
[0299] 在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过MTT测定 测量根据次代培养传代进程的细胞增殖水平，结果显示在图18中。
[0300] 根据图18,确认与对照相比，人脐带血源基质细胞(hUCBSC)使根据次代培养传代 进程的细胞增殖水平较少减少。
[0301 ] 实施例15:HMGA2对PI3K/AKT途径的影响的评价 [0302]实施例15-1:相关基因的确认
[0303] 在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞（hUCBSC)中，通过 Ingenuity途径分析(IPA)软件说明HMGA2过表达相关的信号传导途径的相关基因和分子细 胞功能的相关基因，结果显示在图19中。
[0304] 根据图19,确认与转录控制相关的elF4和p70S6K信号被大量表达，并且与elF4和 P70S6K相关的mTOR和PI3K/AKT信号途径被大量表达。
[0305] 实施例15-2:蛋白质印迹
[0306]在实施例11-1制备的HMGA2转导的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，进行蛋白质 印迹，评价HMGA2过表达对PI3K/AKT途径和mT0R/p70s6K的影响。
[0307] 对下列进行蛋白质印迹分析：（i)HMGA2过表达的hUCBSC，（ii)LY294002处理的 HMGA2过表达的hUCBSC，和（i i i)作为比较例的GFP。
[0308]具体地，将细胞在包含ImM苯甲基磺酰氟、ImM抑肽酶、ImM亮肽素、ImM抗痛素和 O.lmM原钒酸钠的50mM Tris-HCl缓冲剂中粉碎。通过DC测定试剂盒(Bi〇-Rad，USA)确认蛋 白质含量，通过在10 %至15 %聚丙烯酰胺凝胶上加载特定量蛋白质进行SDS-PAGE，并将蛋 白质转移至50V和350mA的硝化纤维素膜5小时。所有抗体按照制造商的说明来使用，并且通 过增强型化学发光检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech Buckinghamshire，UK)确认 蛋白质带，结果显示在图20中。
[0309] 根据图20，确认HMGA2诱导了 AKT、mT0R和p70S6K磷酸化，并且在用LY294002处理时 蛋白质表达总量无变化，但AKT、mT0R和p70S6K磷酸化被抑制。
[0310] 虽然HMGA2抑制了 pl6INK4i^Pp21GIP1/WAFl的表达水平，但表达水平通过LY294002处 理被恢复，因此PI3K/AKT/mT0R/p70S6K途径适于降低pl6 INK4^Pp21GIP1/WAFl的表达水平。
[0311] 另外，确认HMGA2过表达激活PI3K/AKT/mT0R/p70S6K途径并且抑制ρ16ΙΝΚ41Ρ p21 QP1/WAFl 的表达。
[0312] 实施例16:HMGA2抑制导致根据次代培养传代进程的形态变化的确认
[0313]为验证HMGA2蛋白在人脐带血源基质细胞（hUCBSC)分化和衰老中的作用，利用 siRNA抑制8或更少代的早期阶段的hUCBSC中的HMGA2表达。
[0314] 在HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过相位对比图像测量 根据次代培养传代进程的细胞形态，结果显示在图21中。即，确认HMGA2表达被抑制的人脐 带血源基质细胞(hUCBSC)变得更扁平和更长。
[0315] 实施例17:HMGA2抑制导致的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-f3-gal)表达水平的测量
[0316] 为确认HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)的衰老水平，通过β-gal 染色测量衰老相关半乳糖苷酶(SA-i3-gal)的表达水平，结果显示在图21中。
[0317] 确认HMGA2转导的hUCBSC增加衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-i3-gal)的表达水平。 [0318] 实施例18:次代培养传代对细胞增殖的影响的确认
[0319] 在HMGA2表达被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，通过MTT测定测量根据次 代培养传代进程的细胞增殖，结果显示在图22中。根据图22，确认HMGA2被抑制的hUCBSC显 著减少根据次代培养传代进程的细胞增殖。
[0320] 实施例19:蛋白质印迹
[0321] 在人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中，为评价HMGA2抑制对PI3K/AKT途径和mTOR/ p70s6K的影响，进行蛋白质印迹，结果显示在图23中。
[0322] 根据图23,确认AKT、mT0R和p70S6K磷酸化急剧减少，而pl6INK4i^Pp21 GIP1/WAFl的表 达水平增加。根据这些结果，确认HMGA2的抑制抑制PI3K/AKT/mT0R/p70S6K途径，而增加 pl6INK4i^Pp21QP1/WAFl 的表达。
[0323] 基于实施例15-2和上述实施例的结果，HMGA2蛋白表达导致的人脐带血源基质细 胞(hUCBSC)的信号传导途径显示在图24中。
[0324] 实施例20:脂肪组织分化能力的测量
[0325] 测量HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)分化能力。
[0326] 为了解基于细胞中存在的累积脂肪的分化水平，将培养的细胞用油红0染色，并用 100%异丙醇再次提取渗入细胞的油红0，并通过ELISA平板阅读器（EL800，Bi O-Tek Instruments，USA)将其在0D 500下定量。结果显不在图25中。
[0327] 根据图25，确认HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中油红0染色的百分 比低于对照组，并且脂肪细胞分化相关的基因如PPARr、aP2和C/EBP-b的表达率迅速减少。
[0328] 实施例21:HMGA2控制相关基因的筛选和PCR
[0329] 比较实施例11-1制备的HMGA2过表达人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中的基因表达 和实施例7制备的HMGA2被抑制的人脐带血源基质细胞(hUCBSC)中的基因表达，如图26所 不。
[0330] 基于图26的结果，选择在HMGA2过表达时表达水平增加而在HMGA2被抑制时表达水 平减少的三种基因 ，Cyclin F、Cyclin E1和⑶C25A，而且选择在HMGA2过表达时表达水平减 少而在HMGA2被抑制时表达水平增加的五种基因，C14orfl53、EID2B、ZNF394、CDKN2AIPNI^P C9orf80。由此选择的八种基因进行PCR，结果显示在图27中。
【主权项】
1. 用于诱导非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的试剂盒，包括： (a) SRY(性别决定区Y)框2 (S0X2)蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子;和 (b) 高移动性型AT钩2 (HMGA2)蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述编码S0X2蛋白的核酸分子和所述编码HMGA2 蛋白的核酸分子分别独立地被包括在表达载体内。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述编码HMGA2蛋白的核酸分子是染色质调控因 子。4. 制备自非神经元细胞重编程的诱导神经干细胞或自其分化的神经元细胞的方法，包 括： (a) 递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分 子至非神经元细胞，或增加所述S0X2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达;和 (b) 培养步骤(a)中的细胞。5. 根据权利要求4所述的方法，进一步包括： (c) 从步骤(b)获得的培养物分离神经干细胞样集落。6. 根据权利要求4所述的方法，其中步骤(b)包括在神经元细胞分化培养基上进行培 养，并且其特征在于由所述非神经元细胞形成所述诱导神经干细胞，并且由所述诱导神经 干细胞形成所述神经元细胞。7. 根据权利要求4所述的方法，其中步骤(a)通过下列进行： 将S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子加 入所述非神经元细胞的培养基； 将S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子直 接加入所述非神经元细胞;或 用病毒感染所述非神经元细胞，所述病毒由其中插入了编码S0X2蛋白的核酸分子和编 码HMGA2蛋白的核酸分子的病毒载体转染的包装细胞获得。8. 根据权利要求4所述的方法，其中增加所述S0X2蛋白或所述HMGA2蛋白在所述非神经 元细胞中的表达的特征在于分别将S0X2或HMGA2的表达调节因子引入所述非神经元细胞。9. 根据权利要求8所述的方法，其中HMGA2的表达调节因子是1et-7miRNA簇抑制剂或 PDE4D抑制剂。10. 根据权利要求8所述的方法，其中S0X2的表达调节因子是PDE4D抑制剂。11. 根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞源自人。12. 根据权利要求4所述的方法，其中所述非神经元细胞是体细胞或成熟干细胞。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述体细胞是血细胞。14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述成熟干细胞是间充质干细胞。15. 通过权利要求4至14任一项所述的方法制备的诱导神经干细胞;或自所述诱导神经 干细胞分化的神经元细胞。16. 用于神经元细胞再生的细胞治疗产品，包括权利要求15所述的诱导神经干细胞或 自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞，作为活性成分。17. 预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的药物组合物，包括： SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子;和 HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子， 作为活性成分。18. 根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述神经元细胞损伤相关疾病选自帕金 森病、阿尔茨海默氏症、匹克氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化、缺血性脑病、脱髓鞘疾病、 多发性硬化症、癫痫、退行性神经系统疾病、和脊髓损伤。19. 筛选神经干细胞或神经元细胞的再生促进剂或再生抑制剂的方法，包括： 1) 制备分离的非神经元细胞； 2) 通过递送S0X2蛋白或编码S0X2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核 酸分子至非神经元细胞、或增加所述S0X2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达， 诱导生成诱导神经干细胞； 3) 任选地，使步骤2)生成的所述诱导神经干细胞分化形成神经元细胞;和 4) 在步骤1或步骤2后用候选物质进行处理，和根据候选物质的处理，确定所述诱导神 经干细胞或所述神经元细胞是否生成、或其生成水平。20. 根据权利要求19所述的方法，进一步包括下列步骤:如果步骤4中所述诱导神经干 细胞或所述神经元细胞的生成水平增加，则确定候选物质是神经干细胞或神经元细胞的再 生启动子。21. 根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其中利用从患者分离的非神经元细胞， 筛选患者定制的神经干细胞或神经元细胞再生促进剂或患者定制的神经干细胞或神经元 细胞再生抑制剂。22. 筛选个人定制的神经元细胞治疗剂的方法，包括： 1) 制备分离的非神经元细胞； 2) 通过递送SOX2蛋白或编码SOX2蛋白的核酸分子和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核 酸分子至非神经元细胞、或增加所述SOX2蛋白和所述HMGA2蛋白在非神经元细胞中的表达， 诱导生成诱导神经干细胞； 3) 使步骤2)生成的所述诱导神经干细胞分化形成神经元细胞;和 4) 用候选物质处理步骤3形成的所述非神经元细胞，和确定所述候选物质是否是针对 非神经元细胞获取对象定制的神经元细胞治疗剂。23. 促进非神经元细胞重编程形成神经干细胞(NSC)的组合物，包括HMGA2蛋白或编码 HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。24. 用于细胞增殖的组合物，包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。25. 抑制细胞衰老的组合物，包括HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸作为活性成分。26. 根据权利要求24或权利要求25所述的组合物，其中所述细胞是脐带血源基质细胞。27. 预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的方法，包括向有需要的对象给予权利要求 15所述的诱导神经干细胞或自所述诱导神经干细胞分化的神经元细胞。28. 预防或治疗神经元细胞损伤相关疾病的方法，包括向有需要的对象给予SOX2蛋白 或编码SOX2蛋白的核酸分子;和HMGA2蛋白或编码HMGA2蛋白的核酸分子。
【专利摘要】本发明涉及制备由分化细胞重编程的诱导神经干细胞的方法。根据本发明生成诱导神经干细胞的方法能够仅利用两种诱导因子SOX2和HMGA2由非神经元细胞制备诱导神经干细胞。因此，本发明的方法可比使用四种或五种诱导因子的常规方法以更有效的方式制备诱导神经干细胞。另外，本发明的方法显示比仅施用单一SOX2基因时明显更高的诱导效力和增殖能力，因此增加其用于治疗目的的效能。
【IPC分类】C12N15/10, C12N5/0797, C12N5/10
【公开号】CN105492597
【申请号】CN201480032201
【发明人】康景宣, 俞炅录
【申请人】首尔大学校产学协力团, 康干细胞生物技术有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年4月4日
【公告号】EP2982747A1, WO2014163425A1
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