2-脱氧青蟹肌糖还原酶的制作方法
2-脱氧青蟹肌糖还原酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新型2-脱氧青蟹肌糖还原酶和编码该酶的基因。另外，本发明涉及 (-)-vibo-栎醇的制造方法，该方法中利用了能够将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的酶。
【背景技术】
[0002] (-)-vibo-栎醇（（1R，2R，4S，5R)_环己烷-1，2,3,4,5-五醇)是从萝蘑科植物中发 现的具有下述化学结构的化合物。
[0003] 【化1】
[0004]
[0005] 到目前为止，（-)-vibo-栎醇显示出具有强力的血糖效果作用。另外，可通过(-)_ vibo-栎醇的氨基化得到的脱氧肌醇胺(歹'才夺シYyf'ミレ)和脱氧肌醇脒(テ'才夺シ彳7 ^^^乂)还是可作为各种医药农药合成用中间体的化合物(专利文献1和2)。
[0006] 进而，近年来还明确了（-)-vibo-栎醇的工业有用性。例如，在专利文献3中记载了 (-)-vibo-栎醇作为用于防止燃料电池冷却液冻结的添加剂是有用的。在用于该目的的情 况下，（-)-vibo-栎醇在长期使用后也不会被氧化，认为其可维持适宜的特性。
[0007] 另外，在专利文献4中着眼于(-)-vibo-栎醇在溶解和凝固的过程中可进行大量潜 热的吸热和放热这一点，公开了该化合物在用于有效地利用太阳热的蓄热或低廉的夜间电 力的蓄热材料中的应用。
[0008] 因此，通过简单的工序有效地生产（-)-vibo-栎醇明显存在必要性。在将（-)_ vibo-栎醇作为药物的有效成分使用的情况下，该化合物的原料要尽可能纯粹，而不应当含 有未经鉴定的杂质，因而其制造工序还应该尽可能地简化、应该能够容易地追溯其制造履 历。另外，在上述那样的工业目的中使用(-)-vibo-栎醇的情况下，其生产成本能够左右该 技术的实现性。
[0009] (-)-vibo-栎醇在传统上是从萝蘑科植物中提取的。但是，近年来，作为更为有效 的方法，有人提出了下述的方法:将肌肉肌醇用作底物，进行土壤杆菌属或沙门氏菌属微生 物的培养，在其培养液中生产出（ + )-proto_栎醇和( + )-epi-栎醇以及(-)-vibo-栎醇，由该 培养液分离出（-)-vibo-栎醇。或者还提出了下述方法:使该土壤杆菌属或沙门氏菌属微生 物的菌体与肌肉肌醇接触，仍然在其反应液中生产出（ + )-pr〇t〇-栎醇和( + )-epi-栎醇以及 (-)-vibo-栎醇，由该反应液中分离出(_)-vibo-栎醇(专利文献1和2)。
[0010] 但是，在该方法中，并未分离出将肌肉肌醇转换为(-)-vibo-栎醇的任何酶，甚至 也未明确该反应是由1种酶所致的、还是有2种以上的酶参与其中。因此，在该方法中，由于 必须将肌肉肌醇作为底物进行微生物培养、或者至少要利用由该微生物的培养物得到的菌 体，因而其工序依然很繁杂，伴有被未知杂质污染的危险性。另外，该方法显然效率低。
[0011] 在专利文献5中还提出了下述的方法:在底物中使用肌肉肌醇对作为肠杆菌属微 生物的肠杆菌sp.AB10114(FERM P-19319)进行培养，在其培养液中生产(-)-vibo-栎醇，由 该培养液分离出（-)-vibo-栎醇。在该方法中，由肌肉肌醇以约25%左右的收率得到了（-)-vibo-栎醇(参照实施例1)。但是，该方法中也仍然未分离出将肌肉肌醇转换为(-)_vib〇-栎 醇的任何酶。因而，在该方法中也必须将肌肉肌醇作为底物进行微生物培养，从而其工序依 然很繁杂，伴有被未知杂质污染的危险性。另外，在该方法中，在得到目的（-)-vibo-栎醇 时，甚至无法避免要求劳力和时间的微生物发酵工序。
[0012] 另外，在专利文献6中，公开了通过与上述专利文献5的方法中使用的肠杆菌 sp.AB10114(FERM P-19319)接触而将(-)-vibo-栎醇转换为2-脱氧青蟹肌糖的方法。即，肠 杆菌sp.AB10114(FERM P-19319)以大致80%的收率将(-)-vibo-栎醇转换为2-脱氧青蟹肌 糖(参照实施例1)。由于在专利文献6中也未分离出任何酶，因而其详细情况尚不明确，但即 使假使该反应通过1种酶进行催化，那么至少该酶活性针对由（-)-vibo-栎醇转换为2-脱氧 青蟹肌糖的方向是占优势的，认为实质上的逆反应难以进行应该是合理的。
[0013] 然而，本发明人截至目前尚未获知报告了可按照下述反应路线图所示将2-脱氧青 蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的酶的事实。
[0014] 【化2】
[0015]
2-脱氧青蟹肌糖=>(-)-vib〇-栎醇
[0016] 现有技术文献 [0017]专利文献
[0018] 专利文献1:日本特开平11-12210号公报
[0019] 专利文献2:日本特开2000-4890号公报
[0020] 专利文献3:国际公开第W02005/091413号小册子
[0021] 专利文献4:日本特开2010-215876号公报
[0022] 专利文献5:日本特开2005-70号公报
[0023] 专利文献6:日本特开2005-72号公报
【发明内容】
[0024]发明所要解决的课题
[0025]因此，本发明的目的在于通过简单的工序有效地生产(-)-vibo-栎醇。通过简单的 工序进行的生产可将杂质混入的风险最小化。另外可推测出，通过有效的生产，还能够在 (-)-V ibo-栎醇的工业领域中加以利用。
[0026]特别谋求能够将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的酶的应用。即，已知 2_脱氧青蟹肌糖（以下有时简称为"D0I"）可由葡萄糖通过仅仅两个阶段的酶反应容易地发 酵生产(W02010/109916号小册子、W010/053052号小册子和W006/109479号小册子等），可期 待能够成为非常低成本的原料。
[0027]解决课题的手段
[0028]本发明人筛选了具有(-)-vibo-栎醇生产能力的微生物，发现了能够将2-脱氧青 蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的微生物。本发明人进一步成功地由该微生物分离出了具有 将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性的酶。而且，本发明人解明了该酶 的氨基酸序列和编码其的碱基序列。因此，本发明的第1方面包括下述方案。
[0029] (1) 一种2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其来源于具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生 物，其中，该2-脱氧青蟹肌糖还原酶具有下述(a)~(c)的特性，
[0030] (a)具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性；
[0031] (b)在ρΗ7·0~9.0显示出最大活性;和
[0032] (c)利用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定出的该酶的多肽部分的分子质量为36kDa。
[0033] (2)如上述（1)的2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其中，上述微生物是属于假单胞菌 (Pseudomonas)属或伯克氏菌（Burkholderia)属的微生物。
[0034] (3)-种蛋白质，其为下述(a)~(e)中的任意一种蛋白质：
[0035] (a)由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0036] (b)由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性（同一性）的氨基 酸序列构成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0037] (c)由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0038] (d)由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或
[0039] (e)由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。
[0040] (4)如上述(3)的蛋白质，其中，上述蛋白质为(b)~（e)中的任意一种，但不包括由 序列编号2、4、6和8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0041] (5) -种基因，其编码上述(3)或(4)所述的蛋白质。
[0042] (6) -种基因，其由下述(a)或(b)的核苷酸序列构成，
[0043] (a)序列编号1所表示的核苷酸序列;或
[0044] (b)与由下述互补序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码具有2-脱氧青蟹肌糖 还原酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述互补序列与由序列编号1所表示的核苷酸序列中 的至少连续18个碱基构成的核苷酸序列互补。
[0045] (7)如上述(6)的基因，其中，上述(b)中的由至少连续18个碱基构成核苷酸序列是 选自由序列编号9、序列编号11、序列编号13、序列编号15、序列编号17、序列编号19、序列编 号21和序列编号23组成的组中的序列的全部或一部分。
[0046] 另外，根据本发明，还提供了具有将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的 催化活性的酶的生产方法。因此，本发明的第2方面谋求下述方案。
[0047] (8)-种(-)-vibo-栎醇转换用重组载体，其包含上述(5)~(7)中的任一种基因。
[0048] (9)-种(-)-vibo-栎醇转换用转化体，其导入有上述(5)~(7)中的任一种基因或 上述(8)的重组载体。
[0049] (10)-种2-脱氧青蟹肌糖还原酶的生产方法，其特征在于，将上述(9)的转化体在 适于具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质的生产的条件和时间下进行培养，由培养物 中提纯该蛋白质并进行回收。
[0050] 另外，本发明提供了使用上述酶的（-)-vibo-栎醇的生产方法。关于该生产方法， 本发明人针对本发明人首次发现的本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶进行了氨基酸序列同 源性检索，其结果发现，目前为止据推测具有肌醇2-脱氢酶活性的几种蛋白质与本发明的 新型2-脱氧青蟹肌糖还原酶显示出很高的氨基酸同源性，并且具有将2-脱氧青蟹肌糖直接 转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。在本发明人的所知范围内，并无报告指出这些蛋白质具 有将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。
[0051] 因此，本发明的第3方面如下所述。
[0052] (11)-种(-)-vibo-栎醇的制造方法，其特征在于，使上述(1)或(2)的2-脱氧青蟹 肌糖还原酶与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反应，将所生成的（-)_ vibo-栎醇由反应液中回收。
[0053] (12)-种(-)-vibo-栎醇的制造方法，其特征在于，使下述(a)~(e)中的任意一种 蛋白质与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反应，将所生成的(-)-vibo-栎醇由反应液中回收，
[0054] (a)由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0055] (b)由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0056] (c)由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0057] (d)由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或
[0058] (e)由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。
[0059]进而，根据本发明，提供了使用上述酶将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的 方法。因此，本发明的第4方面如下所述。
[0060] (13)-种将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的方法，其特征在于，使上述 (1)或(2)所述的2-脱氧青蟹肌糖还原酶与2-脱氧青蟹肌糖接触，在PH5.0~10.0的条件下 发生反应。
[0061] (14)-种将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的方法，其特征在于，使下述 (a)~(e)中的任意一种的蛋白质与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件发生反应，
[0062] (a)由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0063] (b)由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0064] (c)由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0065] (d)由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或
[0066] (e)由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。
[0067]发明的效果
[0068]根据本发明，可提供一种催化新型反应的酶。通过使用本发明的酶，能够简单且有 效地生产(-)-vibo-栎醇。
【附图说明】
[0069] 图1示出了经确认具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的能力的微生物 的16SrRNA基因序列。
[0070] 图2是示出了对于本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶（以下有时简称为"D0I还原酶" 或"D0IR"）的来自各提纯阶段的试样进行SDS-PAGE的结果的 照片。从右端的泳道起依次为： 泳道M:预染XL-ladder(Broad);泳道1:粗酶液;泳道2:硫酸铵分级；泳道3: 丁基-Toyopearl 级分;泳道4: ResoureQ级分;和泳道5:凝胶过滤级分(丙酮浓缩）。
[0071] 图3是表示本发明的D0I还原酶的最佳pH的曲线图。横轴表示pH，纵轴表示以吸光 度(340nm)的减少速度为指标的相对活性。在曲线图中，黑底的四方形表示柠檬酸缓冲液、 白底的四方形表示磷酸钾缓冲液（以下简称为"KPB"）、黑底的圆形表示Tris-盐酸缓冲液、 以及白底的圆形表示甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。竖条表示标准偏差。
[0072]图4表示已知的肌醇脱氢酶序列（在各序列的左侧示出了基因银行登录号 (GenBank Acession No·))、本发明的D0I还原酶的N末端侧氨基酸序列（D0I reductase Nterm)和本发明的D0I还原酶的内部序列(D0I reductase internal)的比对。另外示出了 为了取得本发明的D0I还原酶基因而使用的各种引物的位置。在比对中，将序列同源性的高 的部分用框围起。向右的箭头(―)表示正义链方向的引物位置，向左的箭头(―)表示反义 链方向的引物位置。需要说明的是，图中的圈起的数字与本文中括号围起的数字对应。 [0073]图5表示本发明的D0I还原酶基因的扩增中使用的PCR的温度循环条件。上段为梯 度PCR的条件，下段为TAIL-PCR的条件。
[0074]图6为示出了本发明D0I还原酶基因的克隆化的概要的示意图。
[0075]图7表示本发明D0I还原酶基因的表达用载体的结构。
[0076]图8为AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶的氨基酸序列与作为已知肌醇 脱氛酶的GenBank Accession No.EKS70356.1、GenBank Accession N〇.ADU72508.1 以及 GenBank Accession No.EIK69154.1的氨基酸序列的比对。截止目前并未报告这些已知肌 醇脱氢酶具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。
[0077]图9表示与本发明的AKC-020株来源的D0I还原酶的氨基酸序列的序列同源性低、 将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的能力低这一点已明确的肌醇脱氢酶基因 (GenBank Accession No.AAG44816.1)的编码化区域的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0078]图10表示与本发明的AKC-20株来源的D0I还原酶的氨基酸序列的序列同源性低、 将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的能力低这一点已明确的肌醇脱氢酶基因 (GenBank Accession No.CAB12924.1)的编码化区域的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0079]图11表示与本发明的AKC-020株来源的D0I还原酶的氨基酸序列的序列同源性低、 将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的能力低这一点已明确的肌醇脱氢酶基因 (GenBank Accession No.CAB15358)的编码化区域的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0080]图12是示出了对重组生产出的酶进行SDS-PAGE的结果的照片。
【具体实施方式】
[0081] 1.2-脱氧青蟹肌糖还原酶
[0082]本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶由具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生物中分 离得到。因此，除了本说明书中具体记载的微生物以外，还可以从具有同化(-)-vibo-栎醇 的能力的其它微生物中得到本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶。作为这样的微生物的选择方 法，例如在将( + )-proto_栎醇、（-)-proto-栎醇、（ + )-vib〇-栎醇、（-)-vibo-栎醇、（ + )-epi-栎醇、（-)-epi-栎醇、（+ )-gala-栎醇、（-)-gala-栎醇、（ + )-talo_栎醇、（-)-talo-栎醇、 ( + )-all〇-栎醇、（-)-allo-栎醇、scyllo-栎醇、neo-栎醇、cis-栎醇、muco-栎醇中的一种以 上作为唯一碳源进行培养后分离出显示出良好的生长的微生物即可。它们之中，作为优选 的碳源，更优选作为直接目的物的(-)-vibo-栎醇，但也可以使用含有(-)-vibo-栎醇及其 它栎醇异构体的混合物。例如，可以利用实施日本特开2000-4890号公报所记载的方法而得 到的( + )-proto_栎醇、（ + )-epi-栎醇和(-)-vibo-栎醇的混合物;或者通过使用化学催化剂 对2-脱氧青蟹肌糖(D0I)进行氢化而得到的(-)-vibo-栎醇与scyllo-栎醇的混合物。
[0083]作为更具体的示例，将土壤样品的稀释液接种在含有约0.6%(W/V)的（-)-vibo-栎醇和scyllo-栎醇的混合物的琼脂平板上。在该培养基中可以添加优选的无机氮源(例如 约0.6%(W/V)的硫酸铵）和一般的微生物生长所需要的无机盐(例如MgS〇4、KH2P〇4和NaCl 等）。其后将琼脂平板在20°C~30°C左右的温度培养1天~1周左右，将所出现的菌落分离出 即可。
[0084] 另外，从这样分离出的微生物中选拔显示出更高的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的 菌株是有利的。为了该目的，通过对分离出的菌株细胞进行超声波处理来进行破碎，得到细 胞提取液。将该提取液与含有底物:2_脱氧青蟹肌糖(D0I)的缓冲液混合，向其中添加辅酶： NADH，从而开始酶反应。并且测定反应液在规定时间内显示出的吸光度的变化，作为该反应 液中NADH转换为NADH+的速度、也即2-脱氧青蟹肌糖被还原的速度，来选拔显示出更高的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的菌株。
[0085] 进一步地，本发明的酶应该以高非对映体过剩率生成(-)-vibo-栎醇。因为这样能 够省略由生成物中分离出其中一种非对映体这样的低效率的工序。因此，优选对所选拔的 菌株进行与非对映体的生产性相关的特性化。为了该目的，例如将细胞提取液与D0I和NADH 混合。另外，通过在实施该反应时使作为辅酶再生系的甲酸脱氢酶和甲酸钠共存，酶反应可 充分地进行。在反应后，利用例如基于Shodex KS-801(商品名。昭和电工株式会社制造）的 HPLC对反应液进行分析，计算出下式，
[0086]【化3】 则獅麵獅齡樣
[0088] 从而能够鉴定出以高非对映体过剩率生成（-)-vibo-栎醇的菌株。优选能够以 80%以上的非对映体过剩率将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的菌株、更优选能够 以85%以上的非对映体过剩率将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的菌株、最优选能 够以95 %以上的非对映体过剩率将2-脱氧青蟹肌糖转换为(_)-vibo-栎醇的菌株。
[0089] 本发明人通过上述方法进行了菌株的分离、选拔和特性化，结果发现，6株假单胞 菌属（Pseudomonas sp.)、1 株栖沉积物伯克氏菌(Burkholderia sediminicola)、2株土壤 伯克氏菌(Burkholderia terrae)以及1株伯克氏菌属(Burkholderia sp.)具有以80%以 上的高非对映体过剩率由DO I生产(-)-V ibo-栎醇的能力。
[0090] 因此，本发明的具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生物从假单胞菌属或伯克氏 菌属微生物进行筛选是有利的。作为特别优选的微生物，可以举出本发明人分离出并命名 的土壤伯克氏菌（Burkholderia terrae)AKC_020株和假单胞菌属(Pseudomonas sp. )AKC_ 019 株。
[0091 ] 土壤伯克氏菌（Burkholderia terrae)AKC_020株于2013年 11 月 1 日作为NITE P- 01745被保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NPMD)(千叶县 木更津市上总鎌足2-5-8122号室）。假单胞菌属(Pseudomonas sp.)AKC-019株于2013年10 月24日作为NITE P-01740被保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏 中心(NPMD)(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8122号室）。
[0092] 本发明人进一步由土壤伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC_020株成功提纯出 了本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶。简单地说，将AKC-020株的培养细胞超声波破碎，在其 上清中加入硫酸铵和KPB，制成30 %饱和硫酸铵溶液。使该30 %饱和硫酸铵溶液的上清通过 疏水色谱，利用硫酸铵的浓度梯度洗脱活性级分。接着，将活性级分利用MOPS缓冲液透析后 加到阴离子交换色谱上，利用NaCl的浓度梯度洗脱活性级分。最后通过凝胶过滤色谱进行 提纯。在凝胶过滤色谱中，活性级分在对应于分子质量为约130KDa的保留时间洗脱，其后利 用SDS-PAGE进一步确认纯度，结果在约36KDa确认到了单一条带。从而可推测出，AKC-020株 所生产的本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶在溶液中形成了均四聚体。
[0093]本发明人进一步研究了 AKC-020株所生产的本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶的各 种性质。该酶在PH7.0~9.0显示出最大活性。另外，该酶在氧化活性评价、也即将2-脱氧青 蟹肌糖还原来生成(-)-vibo-栎醇的逆反应的评价中，对于(-)-vibo-栎醇显示出了高于肌 肉肌醇的底物特异性。
[0094] 因此，本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶来源于具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的 微生物，可以作为具有下述特性的酶来定义：
[0095] (a)具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性；
[0096] (b)在ρΗ7·0~9.0显示出最大活性;和
[0097] (c)利用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定出的该酶的多肽部分的分子质量为36kDa。
[0098]除了上述以外，本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶还可作为具有下述特性的酶来定 义：
[0099] (d)以80%以上的非对映体过剩率将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇;和
[0100] (e)在氧化活性评价中，对(-)-vibo-栎醇显示出了高于肌肉肌醇的底物特异性。
[0101] 2.具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质
[0102] 本发明人进一步考虑AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶的N末端序列和 内部序列、以及认为与其具有相关性的已知的肌醇脱氢酶（以下有时称为"IDH"）基因的编 码化序列，制作大致20个简并引物，成功获得了AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶 基因。并且由该基因的编码化区域如下确定了AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶 的氨基酸序列：
[0103] 【化4】
[0104] MIRIAVLGAGRIGRIHAGNVAASPNAQLVVVADPVESAAKSLATRLGCEASTDPAGVLERKDIDAVVIGTPTDTHIT FMLEAVRRGKAVLCEKPIDLDMEKSLAAANEVERQRGRVMLAFNRRFDPTSQAFRNAIDAGDVGEVRQVIISSRDPG MPPRDYVEHSGGIFRDMVIHDLDMARWLLGEEPVEVMAMASRLIDESLEKLTDFDTVMVQLRTASGKQCHINCCREA VYGYDQRMEVSGSKGMLLQENLRPSTIRRWSKEATDVREPLLNFFLERYEAAYKAELEAFVDALNTNSPLPTSVQDG LKALRLADAALESALSGKAVKV (序列编号 2)
[0105]从而可知，具有上述氨基酸序列的蛋白质显示出了本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原 酶活性，对于本领域技术人员来说应该可以理解，为了本发明的目的也可以使用其均等物。 为了该目的，本发明人进一步进行了与上述序列编号2显示出同源性的已知氨基酸序列的 检索。并且，本发明人在大肠杆菌内对于具有所检索出的序列的蛋白质进行重组表达，测定 了具有这些氨基酸序列的蛋白质的酶活性。其结果明确了，几种肌醇脱氢酶显示出了本发 明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性。
[0106] 更具体地说，具有与序列编号2显示出58%以上的氨基酸序列同源性的下述3种序 列（参照图8)的蛋白质显示出了与AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶同等程度的 将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。
[0107] 【化5】
[0108] GenBank Accession No.EKS70356.1
[0109] MTRIAVLGAGRIGKIHAANVASNSDAKLVVVADPFEGAANSLAEKLGCEASTDCLSVIERDDVDAVVIGTPTDTHIQ FMLHAVSKGKAVLCEKPIDLDMKKSLAAAKEVERHDGRVMLAFNRRFDPTSQAFRKAIDDGEVGDVRQVVITSRDPG MPPREYVTHSGGIFRDMVIHDLDLARWFLGEEPIEVMATGSRLVEPSLAEVPDFDTVMLQLRTESGKQCHINCCREA VYGYDQRLEVFGSRGMLLQENLRPSTIRRWSASATDAREPLLNFFLERYEAAYKTELTAFVEALRTNTTFPTSVADG LKALRLADCALESAMSCRSVKV(序列编号4);
[0110] GenBank Accession No.ADU72508.1
[0111] MKIAVLGAGRIGNVHAMNVASNPNVELVAIADPFIDNAIKLTEKYGGKAVKEPMELIESNAVDAVIIATPTDTHVDL MLSAARNGKAVLCEKPVDLNLER AEVACAELKQCDVPVMIAFNRRFDPSAAEMHSAIAKGEVGELHQ頂ISSRDPGF ASMDYLRHSGGIFRDMTIHDFDMARWLLGEEPVQVFASASRMLEPALEPLNDFDTVMVQMITKSGKQCHINCSRQAV YGHDQRIEAYGSAGMLLNDNLRPSTLRRFNKSATDARVPLVHFFLERYADAYRMELEAFISAVKHAKPVPVTPYDGY MALKLADCAQQSAETGLPVQL(序列编号6);及
[0112] GenBank Accession No.EIK69154.1
[0113] MLRIAVLGAGRIAKIHAANVAAHPNATLVLVADPWRE⑶DALSTQLGCEAAYDCAAVLNRKDIDAWIGTPTDTHID LLLAAVAQGKAVLCEKPIDLDIAKARSAAQTVERQGGKVMLGFNRRFDPDMLRLRQALDAGQIGAVRQVIITSRDPG LAPREYLEHSGGILRDMTIHDFDTARHLLGEEPVQVSAFASRLVDPSLEQIDDYDSVMVLLRTASGKQCHINCCRQA VYGYDQRVEVSGASGVLLTDNHRPSTLRHWSAEHTEALEPLQHFFLERYADAYRNELMQFVDALNEGRELPTGMRDG LYALHLADCALESVKTGRSVAVCYDR (序列编号8)
[0114] 但是，对于上述3种肌醇脱氢酶来说，截止目前均未报告它们具有将2-脱氧青蟹肌 糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。进而明确了，对于与序列编号2显示出更低的同源性 (50%以下）的肌醇脱氢酶来说，将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性很少、 或完全没有。
[0115] 因此，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可以由与序列编号2表 示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构成。优选由与序列编号2表示的氨 基酸序列具有68%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有79%以上的同 源性的氨基酸序列构成的蛋白质，进一步优选由具有85%以上的同源性的氨基酸序列构成 的蛋白质，更进一步优选由具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，特别优选 由具有95 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0116] 另外，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可以由与序列编号4表 示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构成。优选由与序列编号4表示的氨 基酸序列具有64%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有79%以上的同 源性的氨基酸序列构成的蛋白质，进一步优选由具有85%以上的同源性的氨基酸序列构成 的蛋白质，更进一步优选由具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，特别优选 由具有95 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0117] 进一步地，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可以由与序列编号 6表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成。优选由与序列编号6表示的 氨基酸序列具有65 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有80 %以上的 同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，进一步优选由具有85%以上的同源性的氨基酸序列构 成的蛋白质，更进一步优选由具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，特别优 选由具有95 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0118] 并且，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可以由与序列编号8表 示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成。优选由与序列编号8表示的氨 基酸序列具有64%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有68%以上的同 源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有80 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋 白质，进一步优选由具有85%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更进一步优选由 具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，特别优选由具有95%以上的同源性的 氨基酸序列构成的蛋白质。
[0119]在上述序列中，序列编号4与序列编号6显示出56%的同源性、序列编号4与序列编 号8显不出64%的同源性、序列编号6与序列编号8显不出54%的同源性。
[0120]需要说明的是，在本说明书中，氨基酸序列的同源性由将两个序列以最佳方式比 对时两个序列间所共有的一致氨基酸个数的百分数来表示(一致位置的氨基酸个数/进行 比对的氨基酸个数X 100)。通过可安装于互联网网址http://www.ncbi .n/m.nih. gov/egi-gin/BLAST的BLAST算法进行计算。
[0121] 此外，在与本发明的AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶显示出58%以上 的氨基酸序列同源性的上述3个肌醇脱氢酶之间，下述8个部分序列高度保守(参照图8)。因 此，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质优选具有这8个部分序列中的一者 以上。
[0122] 【化6】 部分序列1: RIAVLGAGR1G (序列编号10) 部分序列2: DAYVIGTPTDTHI (序列编号12) 部分序列3: GKAVLCEKPIDLD (序列编号14) 部分序列4: VMLAFNRRFDP (序列编号16) 部分序列5: HSGCHFRJDM (序列编号18) 部分序列6: ARWLLGEEPV (序列编号20) 部分.1 ?·:列 7: r)FDTVMVQI.RTASC.K(；)CHINCCR (.!']:列编'..J. 22) 部分序列8: AVYGYDQR (序列编号24)
[0124] 进而，已知在即使2个蛋白质分子的氨基酸序列不是完全相同、但两者的分子具有 实质上类似的结构的情况下，它们显示出相同的生物活性。例如，在将亮氨酸置换为缬氨 酸、将赖氨酸置换为精氨酸、将谷氨酰胺置换为天冬酰胺时，蛋白质的功能也可能不会发生 变化。因此，为了本发明的目的，也可适宜地使用由在序列编号2所表示的氨基酸序列中有 一个或数个氨基酸发生缺失、置换和/或添加而得到的氨基酸序列构成且具有2-脱氧青蟹 肌糖还原酶活性的蛋白质。
[0125] 3.基因
[0126] 如下文所述，在生产本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶和具有该酶活性的蛋白质 时，使用编码该酶或蛋白质的基因是有利的。
[0127] 例如，可以利用本发明人由AKC-020株中分离出并确认了序列的2-脱氧青蟹肌糖 还原酶基因对适当的宿主细胞进行转化，来有效地生产该酶。该基因的编码化区域的核苷 酸序列如下所示。
[0128] 【化7】
[0129] ATGATTCGAATCGCCGTACTCGGTGCCGGCCGCATTGGTCGCATTCACGCTGGCAACGTCGCCGCTAGTCCGAATGC ACAACTGGTCGTGGTGGCAGACCCGGTTGAAAGTGCAGCAAAATCGTTGGCTACCCGTCTGGGCTGCGAAGCCTCGA CGGACCCCGCGGGCGTGCTCGAACGCAAAGATATCGATGCGGTCGTCATCGGCACGCCGACGGACACGCACATCACG TTCATGCTTGAAGCCGTCAGGCGCGGCAAGGCTGTTCTGTGTGAGAAGCCCATCGACCTCGACATGGAAAAGTCGCT TGCCGCGGCAAACGAGGTCGAGCGCCAGCGTGGCCGCGTCATGCTCGCTTTCAATCGACGTTTCGACCCGACGTCGC AAGCATTCCGCAACGCGATTCACGCGGGCGATGTTGGCGAAGTGCGCCAGGTCATCATTTCGAGCCGCGACCCGGGC ATGCCTCCGCGTGACTATGTCGAGCACTCGGGCGGCATCTTCCGCGACATGGTGATCCACGACCTGGATATGGCGCG CTGGTTGCTCGGCGAAGAGCCCGTCGAGGTAATGGCGATGGCCAGCCGCCTCATCGACGAGTCGCTCGAAAAACTGA CCGACTTCGATACGGTGATGGTGCAGTTAGGGACCGCGTCGGGCAAGCAATGCCATATCAACTGCTGTCGCGAAGCC GTGTACGGCTACGACCAGCGCATGGAAGTCTCGGGTTCGAAGGGAATGCTCCTTCAAGAGAATCTTCGACCGTCGAC GATCCGGCGCTGGTCCAACGAAGCGACCGACGTTCGCGAGCCGCTGCTCAACTTCTTCCTGGAGCGCTACGAGGCTG CGTACAAGGCGGAGCTCGAAGCCTICGTCGATGCGCTGAACACGAACTCGCCGCTGCCGACGTCCGTGCAGGACGGT CTGAAGGCGTTGCGCCTCGCGGATGCGGCACTCGAGTCCGCGCTGTCGGGCAAAGCCGTCAAGGTGTAA
[0130] (序列编号1)
[0131] 另外，对于能够用于本发明目的的2-脱氧青蟹肌糖还原酶基因，可以具有能够在 自然界发生的全部变异、或者具有人工导入的变异和修饰。例如，已知在编码特定氨基酸的 各种密码子中存在冗余密码子(redundancy)。因此，在本发明中也可以利用最终可翻译成 相同氨基酸的代替密码子。即，由于基因编码的简并，因而在编码某一特定的氨基酸时可以 使用2种以上的密码子，因此氨基酸序列可以利用任意的1组类似的DNA低聚核苷酸进行编 码得到。该组中仅唯一的成员与天然型的酶基因序列相同，但即使是有错配的DNA低聚核苷 酸，在严谨条件下也能够与天然型序列杂交，能够对编码天然型序列的DNA进行鉴定、分离， 进一步还可将这样的基因用于本发明中。需要说明的是，在本说明书中，所谓严谨条件是指 Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrook等人、1989)中所记载 的下述条件:在含有6 X SSC(1 X SSC的组成:0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5% SDS、5XDenhardt's和100mg/mL鲱鱼精DNA的溶液中与探针一起在65°C恒温杂交8小时~16 小时，其后在例如2 X SSC、0.1 % SDS和68°C进行清洗。
[0132] 如上所述，存在有已知的3种肌醇脱氢酶(IDH)与本发明人所发现的2-脱氧青蟹肌 糖还原酶显示出58%以上的氨基酸序列同源性。并且，本发明人首次明确了，这3种IDH显示 出了迄今未被报告过的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性。进一步，本发明人通过本发明人发现 的2-脱氧青蟹肌糖还原酶的氨基酸序列与该3种IDH的氨基酸序列的比对发现了在上述8个 区域氨基酸序列高度保守。因此，对于本领域技术人员来说应该可以理解，通过使用与编码 该8个区域的任一种氨基酸序列的核苷酸的全长或其一部分互补的DNA作为探针，能够容易 地分离出显示本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。即，优选代表性地应用由与 下述8个核苷酸序列的任一种互补的序列的全长或其一部分、例如连续的15个碱基、18个碱 基、20个碱基构成的DNA作为检索本发明的基因的探针。
[0133] 【化8】 部分序列 1: cgaatcgccgtactcggtgccggccgcattggt (序列编号 9) 沉分):r:列 gatgcggtcgtcatcggcacgccgacggacacgcacatc (丨 i.:列编!，_；. 11) iil汾丨]列.?·_ ggcaaggctgltciglgtgagaagcccatcgacctcgac (丨 r:列编4 ⑶ 部分I列4: gtcalgclcgciucaalcgacgutcgacccg (仏列编!，J. 15)
[0134] 部分序列 5: cactcgggcggcatcttccgcgacatg (序列编号 17) 部分序列 6: gcgcgctggttgctcggcgaagagcccgtc (序列编号 19) γΛ,\\ 7： gacttcgatiicggtgatggtgcagttacggaccgcgtcgggcrtagcaatg ccatatcaactgctgtcgc (仏列编!，y 21) 部分序列 8: gccgtgtacggctacgaccagcgc (序列编号 23)
[0135] 进一步，已知大部分生物优选使用特定密码子（最佳密码子）的子集（Gene， Vol. 105，pp. 61-72,1991等），因而根据宿主微生物进行"密码子最佳化"在本发明中也是有 用的。因此，本发明的基因可以具有下述核苷酸序列：其是在序列编号1所表示的核苷酸序 列中有1个或数个核苷酸发生缺失、取代和/或添加而得到的且编码具有2-脱氧青蟹肌糖还 原酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
[0136] 4.2-脱氧青蟹肌糖还原酶的生产方法
[0137] 本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶和具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可 以利用基因重组技术容易地制造。代表性地，可以将编码这些酶蛋白质的基因以表达盒的 形式导入到宿主细胞中。然后，在这样的转化宿主细胞内（以下也称为"转化体"）能够稳定 地表达蛋白质。
[0138] 在本说明书中，所谓表达盒是指含有与表达对象的核酸或表达对象的基因功能性 结合的对转录和翻译进行调节的碱基序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达盒以功能性 结合的状态在编码序列的5'上游含有启动子序列、在3'下游含有终止子序列、根据情况含 有通常的调节元件，在这样的情况下，表达对象的核酸或表达对象的基因"可表达地导入" 到宿主细胞中。
[0139] 对于启动子，不论是结构性启动子还是调节启动子，均被定义为使RNA聚合酶与 DNA结合、 引发RNA合成的DNA序列。强启动子是指高频引发mRNA合成的启动子，在本发明也 适于使用。可以根据该宿主细胞的性质等利用lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌体的主要操 纵子和启动子区域、fd包覆蛋白质的调节区域、针对糖酵解系酶(例如3-磷酸甘油激酶、甘 油醛-3-磷酸脱氢酶）、谷氨酸脱羧酶A、丝氨酸羟甲基转移酶的启动子等。除了启动子和终 止子序列以外，可作为其它调节元件的示例而举出的序列为选择标记、扩增信号、复制起点 等。关于适宜的调节序列，例如记载于"Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185"，Academic Press(1990)中。
[0140 ]上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、菌体、转座子、IS元件、粒、粘粒、或者 线状或环状DNA等构成的载体中（即重组载体)而被插入到宿主细胞中。优选质粒和噬菌体。 这些载体在宿主细胞中可以自体复制，也可以通过染色体复制。适宜的质粒例如为大肠杆 菌的 pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、 口邯2、？卩1^236、？]\?1^4、？1^200、？1]1?290、？預-111113-81八 8七11或？8(1(：1;杆菌的？1^110、 PC194或pBD214;棒状杆菌属的pSA77或pAJ667等。除了它们以外，能够使用的质粒等还记载 于"Cloning Vectors"，Elsevier，1985中。表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的 限制酶切割、克隆化以及连接的惯用方法来进行。
[0141] 在如上述那样构建出本发明的具有表达盒的重组载体后，作为为了将该载体导入 到宿主细胞中来进行转化而能够使用的方法，例如使用共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆 转录病毒转染等惯用的克隆化法和转染法。它们的示例记载于"分子生物学的最新实验计 划（Current Protocols in Molecular Biology)"，F.Ausubel等人，Publ .Wiley 1]1七6^(^611〇6，如￥￥〇4，1997;或33111131'〇〇1<:等人，"分子克隆：实验指南"，第2版，(]〇1(1 Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989 中。
[0142] 作为本发明的宿主细胞，可以举出原核细菌、酵母(Saccharomyces)属或毕赤酵母 (Pichia)属等酵母、SF9等昆虫细胞、CH0、C0S7等动物细胞。优选的宿主为埃希氏菌、假单胞 菌、芽胞杆菌、地芽胞杆菌、甲烷单胞菌、甲基芽孢杆菌、嗜甲基菌、精朊杆菌、甲基球菌、棒 状杆菌、短杆菌、发酵单胞菌和李斯特氏菌属的细菌。进一步优选特别确保了在工业发酵生 产中的应用的大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌。大肠杆菌 由于其迅速的生长能力和发酵管理的容易性，因而为特别优选的本发明的宿主微生物的示 例。
[0143] 为了生产本发明的酶蛋白质，将如上述那样得到的转化微生物在适于上述转化微 生物的生长的条件下进行培养。来源于各种宿主微生物细胞的转化体所用的适宜的培养基 组成、培养条件、培养时间对于本领域技术人员是公知的。培养基可以为含有1种以上的碳 源、氮源、无机盐、维生素以及必要时的微量元素或维生素等微量成分的天然、半合成、合成 培养基。但是，不消说所使用的培养基必须适当满足所要培养的转化微生物的营养要求。进 一步地，在转化微生物表达有用的附加性状的情况下、例如在表达针对抗生素的耐性标记 的情况下，培养基可以含有相应的抗生素。由此使发酵中的杂菌所致的污染风险降低。需要 说明的是，为了使与附加性状相关联的后述提纯变得容易，也可以以本发明的酶和蛋白质 与其它蛋白质或标签、例如谷胱甘肽S转移酶、蛋白质A、6组氨酸标签、FLAG标签等的融合蛋 白质的方式生产为转化体。生产出的融合型可以使用适当的蛋白酶、例如凝血酶等来进行 切割。
[0144] 培养可以为分批式也可以为连续式。另外，在任一情况下，均可以为在培养的适当 时刻补给所追加的上述碳源等的形式。进一步地，培养应该在维持适宜的温度、氧浓度、pH 等的条件下继续进行。来源于一般的微生物宿主细胞的转化体的适宜培养温度通常为15°C ~45°C、优选为25°C~37°C的范围。宿主微生物为好氧性的情况下，为了确保发酵中的适当 的氧浓度，需要进行振荡(烧瓶培养等）、搅拌/通气(发酵罐培养等）。这些培养条件可由本 领域技术人员容易地设定。
[0145] 接下来，从在适于本发明的酶蛋白质的生产的条件下培养了适当的时间的培养物 中提纯本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。即，该蛋白质在转化微生物的 细胞内累积的情况下，从培养细胞提纯蛋白质即可;在该蛋白质放出到转化微生物的细胞 外的情况下，从培养上清中提纯蛋白质即可。可以利用几种提纯方法。例如通过应用盐分 级、离子交换色谱、尺寸排除色谱、羟基磷灰石吸附色谱、疏水性相互作用色谱的各种组合、 或者单一种，可以从细胞溶解液或提取液或培养上清中提纯本发明的酶蛋白。
[0146] 作为与本发明的酶蛋白质的提纯相关的具体例，可以将培养细胞超声波破碎，向 其上清中加入硫酸铵制成30 %饱和硫酸铵溶液。使该30 %饱和硫酸铵溶液的上清通过疏水 色谱，利用硫酸铵的浓度梯度洗脱活性级分。接着，将活性级分透析后加到阴离子交换色谱 上，利用NaCl的浓度梯度洗脱活性级分。最后通过凝胶过滤色谱进行提纯。
[0147] 5.(-)-vib〇-栎醇的制造方法
[0148] 通过利用本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质，能够极为简便且有 效地由2-脱氧青蟹肌糖制造(-)-vibo-栎醇。即，在(-)-vibo-栎醇的制造方法中可以应用 本发明人发现的具有序列编号2的氨基酸序列的2-脱氧青蟹肌糖还原酶，这一点是不消说 的，而截至目前仅已知显示出肌醇脱氢酶活性、却由本发明人首次明确其还具有2-脱氧青 蟹肌糖还原酶活性的由序列编号4、6和8分别表示的蛋白质也能够用于(-)-vibo-栎醇的制 造方法中。需要说明的是，这些基因的编码化区域分别如下所述。
[0149] 【化9】
[0150] atgactcgcattgcagttctcggagcaggccgtatcggaaagattcacgcagcgaacgttgcatcgaactcggacgc gaagctcgtcgtggttgcagacccgttcgaaggcgcagccaactctttggcggagaagctcggttgcgaagcgtcca ccgactgtctctctgttatcgagagggacgacgtcgatgctgtcgtcattggcacgccgaccgatacccacatccag ttcatgcttcatgcggtttcaaaagggaaggcagttctctgcgagaaacccatcgacctggatatgaaaaagtcgct cgcggcagccaaggaggtcgaacggcacgatggacgcgtgatgctggcattcaaatcgtcgattcgacccgacgtcg caggccttccggaaagccatcgatgatggggaagtcggtgatgtccgacaggttgtcattaccagtcgcgaccccgg tatgcccccgcgagagtatgtgacgcactccggcggcatcttccgcgacatggttattcacgaccttgacctcgcac gatggtttcttggagaagagcccattgaagtgatggccactggtagccggctcgtggaaccaagcctcgcggaagtt ccggacttcgatacggtcatgctgcaactgcgtaccgaaagcggaaagcaatgccacatcaattgctgtcgcgaggc cgtctacggttacgaccaacgcctcgaagtgttcggctcccgcggcatgctccttcaggaaaatctgcgaccctcca cgattcgccgctggagcgcgagtgcaaccgatgcccgtgagccgctccttaactttttcctggagcgctatgaagcg gcatataagacggagctcaccgcctttgtagaggcattgcgaacgaacactacgttcccgacttctgttgcggacgg gcttaaagcgttgcggcttgctgactgcgctcttgaatctgcgatgtcgtgtaggtcagttaaagtctaa(序列编 号3);
[0151] atgaaaattgccgtacttggcgcaggccgcattggcaacgtccacgcaatgaatgttgcaagcaaccccaatgttga actggtcgcgattgctgatcctttcatcgacaacgctatcaaactgacggagaaatatggtggcaaggccgtgaaag agccgatggagttgattgagagcaatgcggtggatgccgtgatcattgcgacacctaccgatacgcatgttgatctg atgtgagtgcagcccgcaatggtaaagcggtactgtgtgaaaaaccggtagaccttaacctggaacgtgccgaagtc gcctgcgcagagcttaagcaatgcgatgttcccgtcatgattgcctttaaccgccgctttgatcccagcgcagctga aatgcacagcgccattgcgaaaggtgaagtgggcgaactgcatcaaatcatgatttccagccgtgacccgggctttg cctccatggactatctgcgtcactctggcggcatcttccgggacatgacgattcatgattttgacatggcgcgctgg ttactcggtgaagagcctgtgcaggtatttgcctc tgccagccgtatgctggagccggcattagaaccgttgaatgatttcgataccgtgatggttcagatgatcactaaat cgggtaagcaatgccacatcaactgtagtcgtcaagccgtctatggacatgaccaacgcattgaagcttatggttct gcagggatgttactcaatgacaatcttcgcccatccactctgcgtcgtttcaataaatcggcaaccgatgctcgcgt tccattagtccacttcttcctcgaacgctatgcggatgcctaccggatggaactggaagccttcatttccgcggtta agcatgcgaagcccgttcctgttaccccttatgatggatatatggcgctgaagctcgccgactggcgcaacaatcgg ctgaaactggtttacctgtgcagctttaa(序列编号5);及
[0152] atgctacgtattgccgttctaggtgcggggagcatcgccaagatccacgccgccaacgtcgctgcccatcccaacgc cacgctggtgctggtggccgacccctggcgcgaaggcgtcgatgccctgagcacgcagttgggatgtgaagcagcat acgactgcgccgccgtgctgaaccgcaaggacatcgacgcagtggtgatcggcacgcccaccgacacccatatcgac ctgttgctggccgccgtggcccagggcaaggcggtactctgtgaaaagcccatcgacctggatatcgccaaggcgcg cagcgcagcacaaaccgtggagcgtcagggcggcaaggtgatgcttggcttcaaccgccgtttcgacccggacatgc tgcggctgcgccaggccttggacgccggccagatcggcgcagtgcgccaggtgatcattaccagccgcgaccccggc ctggctccgcgcgagtatctggaacattccggtggcatcctgcgcgatatgactatccacgacttcgacactgcccg gcacttgctgggtgaagagccggtgcaagtcagcgccttcgccagccgcctggtagacccgagcctggaacagattg acgactacgacagcgtgatggtcctgctgcgcaccgcctcgggcaagcaatgccatatcaactgctgccgccaggcg gtgtatggctacgatcaacgtgtagaagtctccggcgccagcggcgtactgctcaccgataaccacaggcccagtac cttgcgacactggagtgctgaacacactgaagcactggagccgttgcagcactttttccttgagcgctatgcggatg cctatcgtaatgagttgatgcagtttgtcgatgcgctgaatgaggggcgtgagttgcccaccggcatgcgtgatggg ctgtatgccttgcacctggctgactgtgcgttggagtcggttaagacggggcgcagcgtggccgtttgttatgaccg gtag(序列编号7)
[0153] 本发明的该酶反应在pH约5.0~约10.0的范围的缓冲液内进行即可，该pH为本发 明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶显示出最大活性的pH。上述pH优选为5.5~9.5、最优选为7.0~ 9.0。例如可以使用调整为这样的pH范围的KPB或Tris-盐酸缓冲液。反应中使用的本发明 的 酶的量可以根据底物浓度、所期望的反应时间等适宜地选择，通常为5U/L~500U/L即可。
[0154] 作为该酶反应的底物的2-脱氧青蟹肌糖可以通过例如W02010/109916号小册子、 TO10/053052号小册子和W006/109479号小册子等中记载的方法容易地得到。将该底物以所 期望的浓度溶解在上述缓冲液中即可，该浓度可示例出10mM~500mM，但并不限定于此。另 一方面，为了进行本发明的还原酶反应，必须向反应体系中添加作为辅酶的NADH。所添加的 NADH量比底物的量过剩即可，通常为底物的1.2倍~2倍的程度时是充分的。关于反应时间， 经时地监控反应液中的（-)-vibo-栎醇的浓度，使反应时间为其生成量达到最大的时刻即 可，更简便地说，也可以观察通过NADH转换为NADH+而变化的缓冲液的吸光度（例如波长 340nm)，反应时间为不发生该变化的时刻。作为适宜的反应时间的例子，可以举出20分钟~ 120小时，从酶的稳定性的方面出发，优选为30分钟~60小时、更优选为30分钟~10小时、最 优选为30分钟~3小时。反应温度依照本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质 的最大活性来确定即可，代表性地可以为约15°C~40°C、优选为25°C~30°C。
[0155] 由上述的酶反应物能够极为简单且高纯度地分离出（-)-vibo-栎醇。即，由于本发 明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质以极高的收率和非对映体过剩率将2-脱氧 青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇，因而能够避免使用色谱之类的繁杂的工序。例如，仅通过 将反应终止后的反应液适宜浓缩并加入低级醇进行再结晶，就能够分离出（-)-vibo-栎醇。 作为具体例，可以举出将酶反应液浓缩至(-)-vibo-栎醇的含量为20~50% (W/V)的程度并 向其中添加〇. 5~2倍量的乙醇的方法。
[0156] 了解了以上说明的本领域技术人员可充分地实施本发明。下面，出于进一步说明 的目的提供实施例，因而本发明并不限于该实施例。需要说明的是，在本说明书中，只要没 有特别说明，"％"表示质量/容量的百分数（％(W/V))。另外，核苷酸序列以从5'向3'方向记 载。
[0157] 实施例
[0158] 1. (-)-vibo-栎醇同化菌的筛选
[0159] 向0.85%灭菌食盐水中加入土壤约O.lg，充分搅拌。其后静置3小时，使砂石或植 物的根等沉淀，将0.1ml的上层清液涂布至栎醇琼脂培养基(组成列于表1)。在30°C培养1-2 天，利用LB琼脂培养基(组成列于表1)进行所生长的菌的分离作业。将成为单菌落的菌株植 菌至斜面培养基(栎醇琼脂培养基），于30°C进行培养后，在4°C保存。通过实施63次本实验， 取得了 109株土壤菌。
[0160] 【表1】
[0161]
[0162] 2.具有将2-脱氧青蟹肌糖(DOI)转换为(-)-vibo-栎醇的能力的微生物的获得
[0163] 将上述获得的109株土壤菌分别植菌至2mL的栎醇培养基(组成为从上述琼脂培养 基中除去琼脂的组成）中，于30°C培养1~2天。它们之中的45株确认生长良好，因而将培养 液离心（l，5000rpm、10分钟、4°C)进行集菌。将集菌后的菌体悬浮在2mL的20mM磷酸钾缓冲 液（PH7.0)中，利用超声波破碎装置（株式会社Τ0ΜΥ精工、UD-200、输出功率：60W、频率： 20kHz)处理30秒，该处理反复进行5次，将菌体破碎，离心（1，5000rpm、10分钟、4°C)回收上 清。将回收液作为粗酶液，按下述顺序进行酶反应评价。
[0164] (1)酶反应的评价
[0165] 反应液的组成如下。需要说明的是，所使用的粗酶液为10μ1。
[0166] 【表2】
[0167]
[0168] 酶反应通过利用分光光度计对于辅酶NADH转换为NAD+的量进行定量来测定。即， 在比色杯中量取D0I以外的反应组成液(990μ1)，在25°C预加热约5分钟。加入D0I溶液（10μ 1)后，迅速混合，将水作为对照，使用调节为25°C的分光光度计（岛津制作所、UV-2550)测定 2分钟的吸光度（波长340nm)的减少速度，计算出每1分钟的吸光度减少量。接着将波长 340nm的NADH的分子吸光系数设为6.2211^- 1〇11-1，将1分钟内1以111〇1的嫩0!1的减少量定义为 lunit(U)，计算出每lmL粗酶液的U，进行各菌株的评价。根据这些结果，成功获得了显示出 超过0.2U/mL (粗酶液)的活性的10株微生物。
[0169] (2)非对映体过剩率的评价
[0170] 接着，与上述同样地从这10株中获得粗酶液，对于从D0I到(-)-vibo-栎醇的反应 中的非对映体过剩率进行评价。具体地说，使用基于甲酸脱氢酶（以下称为FDH、R 〇che-Diagnostics株式会社产品编号244678)的辅酶再生系统进行D0I转换。表3中示出了转换反 应液的组成。反应液在30°C振荡培养3小时。反应终止后进行离心（15，OOOrpm，15分钟），通 过上清的HPLC分析(条件列于表4)进行(-)-vibo-栎醇和scyllo-栎醇的定量。
[0171] 【表3】
[0173]
[0172] 表3:反应液组成
[0174]
[0175]
[0176] 非对映体过剩率的计算通过下式计算出。在10株中全部达成了80%以上的高非对 映体过剩率。
[0177] 【化9】
[0178]
[0179] 3.微生物的鉴定
[0180]为了鉴定微生物，进行了基因组的提取。在4ml的LB培养基中培养、集菌后，悬浮在 0.72ml的0.05M Tris-HCl(pH8.0)中，添加溶菌酶。在37°C培养30分钟后，进一步添加 0.08ml的2M NaCl和蛋白酶K、0.08ml的10 % SDS，在37°C处理10分钟。等量添加三饱和苯酚/ 氯仿/异戊醇（比例50:48:2)溶液，剧烈搅拌后，进行离心（l，5000rpm、10分钟、4°〇。将上层 转移到新管中，添加2倍量的乙醇，进行离心（1，5000rpm、10分钟、4°C)，弃掉上清。利用70% 乙醇进行2次漂洗，再悬浮于0. lml的0.05M Tris-HCl(pH8.0)中，加入RNase，在37°C处理1 小时。加入0.4ml的0.05M Tris-HCl (pH8.0)和0. lml的2M NaCl，反复进行苯酚/氯仿提取， 乙醇沉淀后利用70 %乙醇进行2次漂洗。将所得到的基因组悬浮在0.5ml的0.05M Tris-HCl (PH8.0)中。将所得到的基因组作为模板，利用PCR对于16SrRNA基因的部分序列进行扩增， 使用ABI PRISM(注册商标)310Genetic Analyzer确定该部分碱基序列。16SrRNA基因的扩 增条件列于表5。
[0181] 【表5】
[0182]
[0183] 使用BLAST检索（作为检索对象数据库使用16S核糖体RNA序列）进行基于16SrRNA 基因的鉴定，结果前面获得的10株微生物中，6株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、l株 属于栖沉积物伯克氏菌（Burkholderia s ed imi n i co 1 a )、2株属于土壤伯克氏菌 (Burkholderia terrae)、最后1株属于伯克氏菌属(Burkholderia sp.)。在图1中分别以序 列编号74~83示出了这些菌的16SrRNA基因。另外，在这些菌之中，将属于土壤伯克氏菌 (Burkholderia terrae)的一种菌命名为AKC-020株、将属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.)的一种菌命名为AKC-019株。
[0184] 4.D0I还原酶的提纯
[0185] 将土壤伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020株使用LB液体培养基在30°C振 荡培养一夜，将其作为前培养液。将lml的前培养液加入到100ml的酵母浸膏/胰蛋白胨/D0I 培养基（组成列于表6)中，进行主培养。关于主培养，在500ml容积的坂口瓶中装入100ml的 培养基，在转速120印111、30°(3、24小时的条件下进行。
[0186] 【表6】
[0187]
[0188] 对于l〇〇ml的培养液进行集菌，再悬浮于25ml的0.02M磷酸钾缓冲液(ΙΦΒ) (pH7.0) 后，在冰上以30秒的间隔进行5分钟超声波破碎（株式会社TOMY精工、超声波破碎装置UD-200、输出功率:200W、频率:20诎2)。将破碎液离心（15,000印111、10分钟、4°〇，在上清中加入 5.4g的硫酸铵和KPB，制成35ml的30 %饱和硫酸铵浓度溶液。在冰上冷却40分钟后进行离心 (1，5000rpm、10分钟、4°C)，将上清作为硫酸铵沉淀级分。
[0189]接下来进行疏水色谱。使用的柱剂为Toyopearl丁基_650M(东曹株式会社），使用 的空心柱的尺寸为(p2.5cmx6.5cm、柱体积为约30ml、流速为约0.8ml/分钟、收集体积 (fraction size)为约5ml/根、利用400ml的流量以30%至0%的硫酸铵浓度梯度进行洗脱。
[0190] 将疏水色谱的级分利用MOPS缓冲液透析后，接着进行阴离子交换色谱。使用的柱 为RESOURCE Q lml(GE Healthcare)、流速为lml/分钟、收集体积为lml/根，使用20mM MOPS 缓冲液(pH7.0)利用20ml的流量以0M至0.5M的NaCl浓度梯度进行洗脱。使用的仪器为AKTA purifier(GE Healthcare)。
[0191] 最后进行凝胶过滤色谱。使用的柱为了31?616300031(柱尺寸21.51111111.0.\ 30cm、东曹社制造）、流速为lml/分钟、收集体积为lml/根、利用含有0.3M NaCl的0.02M KPB (PH7.0)进行洗脱。作为分子量标记使用东方酵母株式会社制造的MW-Marker(商品名）。作 为使用的仪器使用岛津制作所制HPLC。
[0192] 通过Bradford法测定酶液中的蛋白质浓度。蛋白质定量试剂使用Protein Assay Reagent (Bio-Rad社）、标准品使用牛血清白蛋白（BSA)溶液。为了使土壤伯克氏菌 (B.terrae)AKC-020株表达D0I还原酶，利用含有D0I的培养基对其进行培养。培养的结果， 在100ml的培养基中得到了湿重0.3g的菌体。相对于D0I的总活性为78.7U。利用硫酸铵分 级、丁基-Toyopearl650M、ResoureQ、TSK-GelG3000SW进行D0I还原酶的提纯后的提纯结果 和SDS-PAGE结果分别如表7和图2所示。
[0193] 【表7】
[0194] 表7:由Burkholderia terrae AKC-020株提纯D0I还原酶
[0195]
[0196] 根据使用TSK-Gel G3000SW柱进行凝胶过滤色谱的结果，提纯酶的保留时间为 76.66分钟。另外，在相同的HPLC条件下，MW标记（马心肌细胞色素 c (分子量12，400 )、酵母肌 激酶(分子量32,000)、酵母烯醇酶(分子量67,000)、猪心肌乳酸脱氢酶(分子量142,000)、 酵母谷氨酸脱氢酶(分子量290，000))各自的保留时间为105.44分钟、94.89分钟、86.40分 钟、76.70分钟、65.01分钟。因此确定，水溶液中的提纯酶的分子质量为约130kDa。另一方 面，根据SDS-PAGE的结果（图2)，单体的分子质量为约36kDa，因而可推测本酶为均四聚体。
[0197] 5.提纯D0I还原酶的各种性质
[0198] (1)最佳 pH
[0199] D0I的还原通过利用分光光度计对于辅酶NADH转换为NAD+的量进行定量来测定。 在含有ο. 3μL?〇1的NADH的各pH的0.1M缓冲液980yL中加入10yL酶液，在25°C进行5分钟预加 热。在加入10yL的O.IM DOI后迅速混合，利用分光光度计测定2分钟的吸光度(波长340nm) 的减少速度，对各pH下的活性进行比较。结果示于图3。
[0200] (2)底物特异性
[0201] 以还原反应的逆方向进行反应时的D0I的底物特异性通过利用分光光度计对于辅 酶NAD+转换为NADH的量进行定量来测定。在含有Ι.Ομ mol的NAD+的0.1M的缓冲液980yL中加 入10yL酶液，在25°C进行5分钟预加热。在加入10yL的0.1M各底物后迅速混合，利用分光光 度计测定2分钟的吸光度(波长340nm)的增加速度，比较基于各底物的活性。将波长340nm的 NADH的分子吸光系数设为6.221111_1〇11-1，将1分钟内以111〇1的嫩0!1转换量定义为1111^〇])。结 果列于表8。表中，N.D.表不未确认到反应。
[0202] 【表8】
[0203]表8:底物特异性(氧化反应）
[0204]
[0205] (3)Km 值和 Vmax
[0206] 酶活性通过利用分光光度计对于辅酶NADH或NAD+的变化量进行定量来测定。将波 长340腦的嫩0!1的分子吸光系数设为6.2211^- 1〇11-1，将1分钟内1以111〇1祖0!1的转换量定义为 lunit(U)。另外，利用Bradford法测定酶液中的蛋白质浓度。测定底物浓度为0.02mM、 0.04禮、0.06111]\1、0.08111]\1、0.1111]\1、0.21111、0.3111]\1、1.01111、2.0111]\1时的活性，计算出相对于001的 Km值和V max。另外，测定辅酶浓度为0.04mM、0.06mM、0.08mM、0. lmM、0.2mM时的活性，计算出 相对于NADH的Km值。进一步测定栎醇浓度为1. OmM、2. OmM、3.0mM、4. OmM、5. OmM时的活性，计 算出相对于栎醇的Km值和Vmax。同样地测定NAD+浓度为0.02mM到0.04mM、0.06mM、0 . ImM、 0.2mM、0.3mM时的活性，计算出相对于NAD+的Km值。结果列于表9。
[0207] 【表9】
[0208] 表9:动态参数
[0209]
[0210] 6.D0I还原酶基因（D0IR基因）的克隆化
[0211] 通过数据库获得了在论文等中被报告具有肌醇脱氢酶（IDH)活性的已知酶的氨基 酸序列。根据这些氨基酸序列的同源性高的区域与D0IR的N末端氨基酸序列和内部氨基酸 序列选拔出了合计8处的简并引物设计区域。所制作的比对和简并引物序列如表10和图4所 示。PCR条件如表11和图5所示。
[0212] 若详细说明，则将由土壤伯克氏菌(B.terrae)AKC-020株中提取的基因组DNA作为 模板，使用如上所述设计的简并引物进行第一轮PCR(退火温度条件为45°C~60°C范围的梯 度PCR)。利用各种引物的组合进行PCR，结果在D0IRdgFl/D0IRdgR8的引物组(表10和图4的 (1)和（17))中，在退火温度60°C左右确认到了约900bp条带的扩增。使用该扩增片段为模 板，通过使用内部区域的引物的第二轮PCR(巢式PCR)来进行扩增片段的锁定，结果在 D0IRdgFl/D0IRdgR7Q的引物组(表10和图4的（1)和（15))中扩增了约700bp的片段，该碱基 序列所编码的氨基酸序列与已知的IDH氨基酸序列显示出了 34 %~53 %左右的同源性。
[0213] 接着，基于所取得的D0IR基因的部分片段的序列信息制作引物（（18)~（23))，实 施TAIL-PCR(热不对称交错PCR)(这些引物也列于表10)。需要说明的是，通过在用于下游区 域的克隆化的上游引物中使用（18)~(20)、在下游引物中使用(25)的TAIL-PCR和在上游引 物中使用（31)、在下游引物中使用（21)~（23)的TAIL-PCR，得到了分别含有下游区域和上 游区域的序列的PCR产物。由这些碱基序列信息推断出了包含D0IR的0RF的约3.0kb的碱基 序列。使用D0IR基因的0RF的上游约150bp和下游约70bp位置的序列制作引物(表10和图4的 (32)和(33))，再次使用土壤伯克氏菌(B.terrae)基因组DNA为模板进行PCR，扩增出了包含 D0IR基因的0RF全长的约1.2kb的区域。对该扩增片段进行提纯，通过直接测序确定了D0IR 基因序列。
[0214] 【表1〇】
[0215]表10:所使用的引物一览 [0216] 核苷定义：
[0217] R:G或A、Y:T或C、M:A或C、K:G或T、S:G或C、W:A或T、H:非G、D:非C、N:任意核苷
[0218] CN 105492606 A ^ 22/25 jn
[0219] 【表11】
[0220] 表11:基于简并引物的PCR组成
[0221] 用蒸馏水调节成0.05ml
[0222] 7.D0IR基因与已知基因的同源性
[0223] D0IR基因具有由全长990bp、330氨基酸残基构成的0RF(序列编号1和2)。由氨基酸 序列推断出的分子量为36195.12,另外在其氨基酸序列中包含由提纯酶的序列分析得到的 N末端"MIRIAVLGAGRI"（序列编号66)和内部氨基酸序列"AELEAFVDALNTN"（序列编号67)。对 D0IR的氨基酸序列进行BLAST同源性检索（作为检索对象数据库使用UniProtKB/ SwissProt)，结果可知与某种微生物来源肌醇2-脱氢酶（IDH)具有约80%的同源性。其中， 这些已知序列根据氨基酸序列的同源性多半被分类为IDH，实际上报告有IDH活性的同源性 为表12所示的程度。
[0224] 【表12】
[0225] 表12:D0IR与肌醇脱氢酶的氨基酸序列的同源性
[0226]
[0227] 8.表达用载体pETduet-DOIR的构建
[0228] 为了利用大肠杆菌进行D0IR的异种宿主表达，构建D0IR表达用载体pETduet-DOIR (图7)。使用引物(34)和（35)扩增AKC0-020株的D0IR基因，使用限制酶BamHI和Hindlll (参 照上述表10)克隆到pETDuet-1 (Merck社）的各个限制酶识别位点上。pETduet-DOIR转化至 E.coli BL21(DE3)株。
[0229] 另外，如上所述，由于进行BLAST检索的结果判明了与AKC0-020株的D0IR显示出同 源性的多个肌醇-2-脱氢酶的存在，因而为了研究这些肌醇-2-脱氢酶是否可催化D0I还原， 合成了该肌醇-2-脱氢酶基因，利用与上述D0IR基因相同的方法进行表达。即，通过与D0IR 的氨基酸序列的BLAST检索(作为检索对象数据库使用GenBank、roB、SwiSSPr〇t)选出了显 示出约80%、70%、60%、50%、40%、30%的同源性的6种肌醇脱氢酶(参照表13)。
[0230] 【表13】
[0231] 表13:进行了活性测定的肌醇脱氢酶
[0232]
[0233] 在合成表13所示的基因时，Bs-iolX的起始密码子为GTG，因而变更为ATG。另外据 报告，费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)USDA191来源的肌醇脱氢酶基因（Sf-Idh) 是对肌肉肌醇进行氧化的酶，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) 168来源的iolX(Bs-IolX)和iolW(Bs-IolW)编码显示出针对鲨肌醇的活性的酶。另外，iolW(Bs-IolW)被认为是 NADPH依赖型肌醇脱氢酶。将这6种基因导入至达载体pET21b( + )(MERCK社），利用大肠杆菌 BL21(DE3)株进行表达。将在各培养液中的活性列于表14。
[0234] 【表14】
[0235] 表14:基于各种肌醇脱氢酶/D0IR的D0I还原活性
[0236]
[0237] 利用 SDS-PAGE 确认 D0IR 与肋-1〇16、？&-1(111、？8-1(111、3卜1(111的重组蛋白的表达。对 于该凝胶中的条带使用ImageJ 1.46进行表达量比较，结果Bh-IolG、Pa-Idh、Ps-Idh、Sf-Idh相对于 D0IR 的表达量分别为 0.61 倍、 0.99倍、 1.25倍、 0.97倍 （图 12)。这些值表示出了相 对于D0I的活性(表14)。
[0238] 将D0I转换率与生成物的非对映体过剩率列于表15。
[0239] D0IR和BH-IolG、Pa-Idh、Ps-Idh以89%cLe.以上的非对映体过剩率将D0I转换为 (-)-vibo-栎醇。
[0240] BS-IolX以99%cLe.的非对映体转换率将D0I转换为scyllo-栎醇。Sf-Idh在培养 液中的D0I的还原弱，尽管过量添加了菌体破碎液，但未检测出作为产物的栎醇。
[0241] 【表15】
[0242] 表15:向栎醇的转换（重组E · Co 1 i来源）
[0243]
[1^料」 丄业头用T土
[0245]本发明能够在极为简便、有效、且高纯度的（-)-vibo-栎醇的工业发酵生产中应 用。
【主权项】
1. 一种2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其来源于具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生物，其 中，该2-脱氧青蟹肌糖还原酶具有下述(a)~(c)的特性， (a) 具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性； (b) 在ρΗ7·0~9.0显示出最大活性;和 (c) 利用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定出的该酶的多肽部分的分子质量为36kDa。2. 如权利要求1所述的2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其中，所述微生物是属于假单胞菌属或 伯克氏菌属的微生物。3. -种蛋白质，其为下述(a)~(e)中的任意一种蛋白质： (a) 由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (c) 由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (d) 由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或 (e) 由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。4. 如权利要求3所述的蛋白质，其中，所述蛋白质为(b)~（e)中的任意一种，但不包括 由序列编号2、4、6和8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。5. -种基因，其编码权利要求3或4所述的蛋白质。6. -种基因，其由下述(a)或(b)的核苷酸序列构成， (a) 序列编号1所表示的核苷酸序列;或 (b) 与由下述互补序列构成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有2-脱氧青蟹肌糖还原 酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述互补序列与由序列编号1所表示的核苷酸序列中的至 少连续18个碱基构成的核苷酸序列互补。7. 如权利要求6所述的基因，其中，所述(b)中的由至少连续18个碱基构成的核苷酸序 列是选自由序列编号9、序列编号11、序列编号13、序列编号15、序列编号17、序列编号19、序 列编号21和序列编号23组成的组中的序列的全部或一部分。8. -种(-)-vibo-栎醇转换用重组载体，其包含权利要求5~7中的任一种基因。9. 一种(-)-vibo-栎醇转换用转化体，其导入有权利要求5~7中的任一种基因或权利 要求8的重组载体。10. -种2-脱氧青蟹肌糖还原酶的生产方法，其特征在于，将权利要求9的转化体在适 于具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质的生产的条件和时间下进行培养，由培养物中 提纯该蛋白质并进行回收。11. 一种(-)-vibo-栎醇的制造方法，其特征在于，使权利要求1或2所述的2-脱氧青蟹 肌糖还原酶与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反应，将所生成的（-)-vibo-栎醇由反应液中回收。12. -种(-)-vibo-栎醇的制造方法，其特征在于，使下述(a)~（e)中的任意一种蛋白 质与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反应，将所生成的（-)-vibo-栎醇 由反应液中回收， (a) 由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (c) 由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (d) 由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或 (e) 由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。13. -种将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的方法，其特征在于，使权利要求1或 2所述的2-脱氧青蟹肌糖还原酶与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反 应。14. 一种将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的方法，其特征在于，使下述(a)~ (e)中的任意一种的蛋白质与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件发生反应， (a) 由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (c) 由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (d) 由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或 (e) 由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。
【专利摘要】本发明的目的在于通过简单的工序有效地生产(-)-vibo-栎醇。特别谋求能够将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的酶的应用。本发明提供一种2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其来源于具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生物，其中，该2-脱氧青蟹肌糖还原酶具有下述(a)～(c)的特性：(a)具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性；(b)在pH7.0～9.0显示出最大活性；和(c)利用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定出的该酶的多肽部分的分子质量为约36kDa。NITE BP-0174020131024
【IPC分类】C12N15/09, C12N9/04, C12N1/21, C12P7/02, C12N5/10, C12N1/15, C12N1/19
【公开号】CN105492606
【申请号】CN201480048371
【发明人】小西一诚, 伊藤伸哉, 黑川纯司
【申请人】旭化成化学株式会社
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年12月5日
【公告号】US20160208224, WO2015093320A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新型2-脱氧青蟹肌糖还原酶和编码该酶的基因。另外，本发明涉及 (-)-vibo-栎醇的制造方法，该方法中利用了能够将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的酶。
【背景技术】
[0002] (-)-vibo-栎醇（（1R，2R，4S，5R)_环己烷-1，2,3,4,5-五醇)是从萝蘑科植物中发 现的具有下述化学结构的化合物。
[0003] 【化1】
[0004]
[0005] 到目前为止，（-)-vibo-栎醇显示出具有强力的血糖效果作用。另外，可通过(-)_ vibo-栎醇的氨基化得到的脱氧肌醇胺(歹'才夺シYyf'ミレ)和脱氧肌醇脒(テ'才夺シ彳7 ^^^乂)还是可作为各种医药农药合成用中间体的化合物(专利文献1和2)。
[0006] 进而，近年来还明确了（-)-vibo-栎醇的工业有用性。例如，在专利文献3中记载了 (-)-vibo-栎醇作为用于防止燃料电池冷却液冻结的添加剂是有用的。在用于该目的的情 况下，（-)-vibo-栎醇在长期使用后也不会被氧化，认为其可维持适宜的特性。
[0007] 另外，在专利文献4中着眼于(-)-vibo-栎醇在溶解和凝固的过程中可进行大量潜 热的吸热和放热这一点，公开了该化合物在用于有效地利用太阳热的蓄热或低廉的夜间电 力的蓄热材料中的应用。
[0008] 因此，通过简单的工序有效地生产（-)-vibo-栎醇明显存在必要性。在将（-)_ vibo-栎醇作为药物的有效成分使用的情况下，该化合物的原料要尽可能纯粹，而不应当含 有未经鉴定的杂质，因而其制造工序还应该尽可能地简化、应该能够容易地追溯其制造履 历。另外，在上述那样的工业目的中使用(-)-vibo-栎醇的情况下，其生产成本能够左右该 技术的实现性。
[0009] (-)-vibo-栎醇在传统上是从萝蘑科植物中提取的。但是，近年来，作为更为有效 的方法，有人提出了下述的方法:将肌肉肌醇用作底物，进行土壤杆菌属或沙门氏菌属微生 物的培养，在其培养液中生产出（ + )-proto_栎醇和( + )-epi-栎醇以及(-)-vibo-栎醇，由该 培养液分离出（-)-vibo-栎醇。或者还提出了下述方法:使该土壤杆菌属或沙门氏菌属微生 物的菌体与肌肉肌醇接触，仍然在其反应液中生产出（ + )-pr〇t〇-栎醇和( + )-epi-栎醇以及 (-)-vibo-栎醇，由该反应液中分离出(_)-vibo-栎醇(专利文献1和2)。
[0010] 但是，在该方法中，并未分离出将肌肉肌醇转换为(-)-vibo-栎醇的任何酶，甚至 也未明确该反应是由1种酶所致的、还是有2种以上的酶参与其中。因此，在该方法中，由于 必须将肌肉肌醇作为底物进行微生物培养、或者至少要利用由该微生物的培养物得到的菌 体，因而其工序依然很繁杂，伴有被未知杂质污染的危险性。另外，该方法显然效率低。
[0011] 在专利文献5中还提出了下述的方法:在底物中使用肌肉肌醇对作为肠杆菌属微 生物的肠杆菌sp.AB10114(FERM P-19319)进行培养，在其培养液中生产(-)-vibo-栎醇，由 该培养液分离出（-)-vibo-栎醇。在该方法中，由肌肉肌醇以约25%左右的收率得到了（-)-vibo-栎醇(参照实施例1)。但是，该方法中也仍然未分离出将肌肉肌醇转换为(-)_vib〇-栎 醇的任何酶。因而，在该方法中也必须将肌肉肌醇作为底物进行微生物培养，从而其工序依 然很繁杂，伴有被未知杂质污染的危险性。另外，在该方法中，在得到目的（-)-vibo-栎醇 时，甚至无法避免要求劳力和时间的微生物发酵工序。
[0012] 另外，在专利文献6中，公开了通过与上述专利文献5的方法中使用的肠杆菌 sp.AB10114(FERM P-19319)接触而将(-)-vibo-栎醇转换为2-脱氧青蟹肌糖的方法。即，肠 杆菌sp.AB10114(FERM P-19319)以大致80%的收率将(-)-vibo-栎醇转换为2-脱氧青蟹肌 糖(参照实施例1)。由于在专利文献6中也未分离出任何酶，因而其详细情况尚不明确，但即 使假使该反应通过1种酶进行催化，那么至少该酶活性针对由（-)-vibo-栎醇转换为2-脱氧 青蟹肌糖的方向是占优势的，认为实质上的逆反应难以进行应该是合理的。
[0013] 然而，本发明人截至目前尚未获知报告了可按照下述反应路线图所示将2-脱氧青 蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的酶的事实。
[0014] 【化2】
[0015]
2-脱氧青蟹肌糖=>(-)-vib〇-栎醇
[0016] 现有技术文献 [0017]专利文献
[0018] 专利文献1:日本特开平11-12210号公报
[0019] 专利文献2:日本特开2000-4890号公报
[0020] 专利文献3:国际公开第W02005/091413号小册子
[0021] 专利文献4:日本特开2010-215876号公报
[0022] 专利文献5:日本特开2005-70号公报
[0023] 专利文献6:日本特开2005-72号公报
【发明内容】
[0024]发明所要解决的课题
[0025]因此，本发明的目的在于通过简单的工序有效地生产(-)-vibo-栎醇。通过简单的 工序进行的生产可将杂质混入的风险最小化。另外可推测出，通过有效的生产，还能够在 (-)-V ibo-栎醇的工业领域中加以利用。
[0026]特别谋求能够将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的酶的应用。即，已知 2_脱氧青蟹肌糖（以下有时简称为"D0I"）可由葡萄糖通过仅仅两个阶段的酶反应容易地发 酵生产(W02010/109916号小册子、W010/053052号小册子和W006/109479号小册子等），可期 待能够成为非常低成本的原料。
[0027]解决课题的手段
[0028]本发明人筛选了具有(-)-vibo-栎醇生产能力的微生物，发现了能够将2-脱氧青 蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的微生物。本发明人进一步成功地由该微生物分离出了具有 将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性的酶。而且，本发明人解明了该酶 的氨基酸序列和编码其的碱基序列。因此，本发明的第1方面包括下述方案。
[0029] (1) 一种2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其来源于具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生 物，其中，该2-脱氧青蟹肌糖还原酶具有下述(a)~(c)的特性，
[0030] (a)具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性；
[0031] (b)在ρΗ7·0~9.0显示出最大活性;和
[0032] (c)利用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定出的该酶的多肽部分的分子质量为36kDa。
[0033] (2)如上述（1)的2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其中，上述微生物是属于假单胞菌 (Pseudomonas)属或伯克氏菌（Burkholderia)属的微生物。
[0034] (3)-种蛋白质，其为下述(a)~(e)中的任意一种蛋白质：
[0035] (a)由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0036] (b)由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性（同一性）的氨基 酸序列构成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0037] (c)由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0038] (d)由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或
[0039] (e)由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。
[0040] (4)如上述(3)的蛋白质，其中，上述蛋白质为(b)~（e)中的任意一种，但不包括由 序列编号2、4、6和8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0041] (5) -种基因，其编码上述(3)或(4)所述的蛋白质。
[0042] (6) -种基因，其由下述(a)或(b)的核苷酸序列构成，
[0043] (a)序列编号1所表示的核苷酸序列;或
[0044] (b)与由下述互补序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码具有2-脱氧青蟹肌糖 还原酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述互补序列与由序列编号1所表示的核苷酸序列中 的至少连续18个碱基构成的核苷酸序列互补。
[0045] (7)如上述(6)的基因，其中，上述(b)中的由至少连续18个碱基构成核苷酸序列是 选自由序列编号9、序列编号11、序列编号13、序列编号15、序列编号17、序列编号19、序列编 号21和序列编号23组成的组中的序列的全部或一部分。
[0046] 另外，根据本发明，还提供了具有将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的 催化活性的酶的生产方法。因此，本发明的第2方面谋求下述方案。
[0047] (8)-种(-)-vibo-栎醇转换用重组载体，其包含上述(5)~(7)中的任一种基因。
[0048] (9)-种(-)-vibo-栎醇转换用转化体，其导入有上述(5)~(7)中的任一种基因或 上述(8)的重组载体。
[0049] (10)-种2-脱氧青蟹肌糖还原酶的生产方法，其特征在于，将上述(9)的转化体在 适于具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质的生产的条件和时间下进行培养，由培养物 中提纯该蛋白质并进行回收。
[0050] 另外，本发明提供了使用上述酶的（-)-vibo-栎醇的生产方法。关于该生产方法， 本发明人针对本发明人首次发现的本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶进行了氨基酸序列同 源性检索，其结果发现，目前为止据推测具有肌醇2-脱氢酶活性的几种蛋白质与本发明的 新型2-脱氧青蟹肌糖还原酶显示出很高的氨基酸同源性，并且具有将2-脱氧青蟹肌糖直接 转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。在本发明人的所知范围内，并无报告指出这些蛋白质具 有将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。
[0051] 因此，本发明的第3方面如下所述。
[0052] (11)-种(-)-vibo-栎醇的制造方法，其特征在于，使上述(1)或(2)的2-脱氧青蟹 肌糖还原酶与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反应，将所生成的（-)_ vibo-栎醇由反应液中回收。
[0053] (12)-种(-)-vibo-栎醇的制造方法，其特征在于，使下述(a)~(e)中的任意一种 蛋白质与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反应，将所生成的(-)-vibo-栎醇由反应液中回收，
[0054] (a)由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0055] (b)由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0056] (c)由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0057] (d)由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或
[0058] (e)由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。
[0059]进而，根据本发明，提供了使用上述酶将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的 方法。因此，本发明的第4方面如下所述。
[0060] (13)-种将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的方法，其特征在于，使上述 (1)或(2)所述的2-脱氧青蟹肌糖还原酶与2-脱氧青蟹肌糖接触，在PH5.0~10.0的条件下 发生反应。
[0061] (14)-种将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的方法，其特征在于，使下述 (a)~(e)中的任意一种的蛋白质与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件发生反应，
[0062] (a)由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质；
[0063] (b)由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0064] (c)由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质；
[0065] (d)由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或
[0066] (e)由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构 成、且具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。
[0067]发明的效果
[0068]根据本发明，可提供一种催化新型反应的酶。通过使用本发明的酶，能够简单且有 效地生产(-)-vibo-栎醇。
【附图说明】
[0069] 图1示出了经确认具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的能力的微生物 的16SrRNA基因序列。
[0070] 图2是示出了对于本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶（以下有时简称为"D0I还原酶" 或"D0IR"）的来自各提纯阶段的试样进行SDS-PAGE的结果的 照片。从右端的泳道起依次为： 泳道M:预染XL-ladder(Broad);泳道1:粗酶液;泳道2:硫酸铵分级；泳道3: 丁基-Toyopearl 级分;泳道4: ResoureQ级分;和泳道5:凝胶过滤级分(丙酮浓缩）。
[0071] 图3是表示本发明的D0I还原酶的最佳pH的曲线图。横轴表示pH，纵轴表示以吸光 度(340nm)的减少速度为指标的相对活性。在曲线图中，黑底的四方形表示柠檬酸缓冲液、 白底的四方形表示磷酸钾缓冲液（以下简称为"KPB"）、黑底的圆形表示Tris-盐酸缓冲液、 以及白底的圆形表示甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。竖条表示标准偏差。
[0072]图4表示已知的肌醇脱氢酶序列（在各序列的左侧示出了基因银行登录号 (GenBank Acession No·))、本发明的D0I还原酶的N末端侧氨基酸序列（D0I reductase Nterm)和本发明的D0I还原酶的内部序列(D0I reductase internal)的比对。另外示出了 为了取得本发明的D0I还原酶基因而使用的各种引物的位置。在比对中，将序列同源性的高 的部分用框围起。向右的箭头(―)表示正义链方向的引物位置，向左的箭头(―)表示反义 链方向的引物位置。需要说明的是，图中的圈起的数字与本文中括号围起的数字对应。 [0073]图5表示本发明的D0I还原酶基因的扩增中使用的PCR的温度循环条件。上段为梯 度PCR的条件，下段为TAIL-PCR的条件。
[0074]图6为示出了本发明D0I还原酶基因的克隆化的概要的示意图。
[0075]图7表示本发明D0I还原酶基因的表达用载体的结构。
[0076]图8为AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶的氨基酸序列与作为已知肌醇 脱氛酶的GenBank Accession No.EKS70356.1、GenBank Accession N〇.ADU72508.1 以及 GenBank Accession No.EIK69154.1的氨基酸序列的比对。截止目前并未报告这些已知肌 醇脱氢酶具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。
[0077]图9表示与本发明的AKC-020株来源的D0I还原酶的氨基酸序列的序列同源性低、 将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的能力低这一点已明确的肌醇脱氢酶基因 (GenBank Accession No.AAG44816.1)的编码化区域的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0078]图10表示与本发明的AKC-20株来源的D0I还原酶的氨基酸序列的序列同源性低、 将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的能力低这一点已明确的肌醇脱氢酶基因 (GenBank Accession No.CAB12924.1)的编码化区域的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0079]图11表示与本发明的AKC-020株来源的D0I还原酶的氨基酸序列的序列同源性低、 将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的能力低这一点已明确的肌醇脱氢酶基因 (GenBank Accession No.CAB15358)的编码化区域的核苷酸序列和氨基酸序列。
[0080]图12是示出了对重组生产出的酶进行SDS-PAGE的结果的照片。
【具体实施方式】
[0081] 1.2-脱氧青蟹肌糖还原酶
[0082]本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶由具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生物中分 离得到。因此，除了本说明书中具体记载的微生物以外，还可以从具有同化(-)-vibo-栎醇 的能力的其它微生物中得到本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶。作为这样的微生物的选择方 法，例如在将( + )-proto_栎醇、（-)-proto-栎醇、（ + )-vib〇-栎醇、（-)-vibo-栎醇、（ + )-epi-栎醇、（-)-epi-栎醇、（+ )-gala-栎醇、（-)-gala-栎醇、（ + )-talo_栎醇、（-)-talo-栎醇、 ( + )-all〇-栎醇、（-)-allo-栎醇、scyllo-栎醇、neo-栎醇、cis-栎醇、muco-栎醇中的一种以 上作为唯一碳源进行培养后分离出显示出良好的生长的微生物即可。它们之中，作为优选 的碳源，更优选作为直接目的物的(-)-vibo-栎醇，但也可以使用含有(-)-vibo-栎醇及其 它栎醇异构体的混合物。例如，可以利用实施日本特开2000-4890号公报所记载的方法而得 到的( + )-proto_栎醇、（ + )-epi-栎醇和(-)-vibo-栎醇的混合物;或者通过使用化学催化剂 对2-脱氧青蟹肌糖(D0I)进行氢化而得到的(-)-vibo-栎醇与scyllo-栎醇的混合物。
[0083]作为更具体的示例，将土壤样品的稀释液接种在含有约0.6%(W/V)的（-)-vibo-栎醇和scyllo-栎醇的混合物的琼脂平板上。在该培养基中可以添加优选的无机氮源(例如 约0.6%(W/V)的硫酸铵）和一般的微生物生长所需要的无机盐(例如MgS〇4、KH2P〇4和NaCl 等）。其后将琼脂平板在20°C~30°C左右的温度培养1天~1周左右，将所出现的菌落分离出 即可。
[0084] 另外，从这样分离出的微生物中选拔显示出更高的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的 菌株是有利的。为了该目的，通过对分离出的菌株细胞进行超声波处理来进行破碎，得到细 胞提取液。将该提取液与含有底物:2_脱氧青蟹肌糖(D0I)的缓冲液混合，向其中添加辅酶： NADH，从而开始酶反应。并且测定反应液在规定时间内显示出的吸光度的变化，作为该反应 液中NADH转换为NADH+的速度、也即2-脱氧青蟹肌糖被还原的速度，来选拔显示出更高的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的菌株。
[0085] 进一步地，本发明的酶应该以高非对映体过剩率生成(-)-vibo-栎醇。因为这样能 够省略由生成物中分离出其中一种非对映体这样的低效率的工序。因此，优选对所选拔的 菌株进行与非对映体的生产性相关的特性化。为了该目的，例如将细胞提取液与D0I和NADH 混合。另外，通过在实施该反应时使作为辅酶再生系的甲酸脱氢酶和甲酸钠共存，酶反应可 充分地进行。在反应后，利用例如基于Shodex KS-801(商品名。昭和电工株式会社制造）的 HPLC对反应液进行分析，计算出下式，
[0086]【化3】 则獅麵獅齡樣
[0088] 从而能够鉴定出以高非对映体过剩率生成（-)-vibo-栎醇的菌株。优选能够以 80%以上的非对映体过剩率将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的菌株、更优选能够 以85%以上的非对映体过剩率将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的菌株、最优选能 够以95 %以上的非对映体过剩率将2-脱氧青蟹肌糖转换为(_)-vibo-栎醇的菌株。
[0089] 本发明人通过上述方法进行了菌株的分离、选拔和特性化，结果发现，6株假单胞 菌属（Pseudomonas sp.)、1 株栖沉积物伯克氏菌(Burkholderia sediminicola)、2株土壤 伯克氏菌(Burkholderia terrae)以及1株伯克氏菌属(Burkholderia sp.)具有以80%以 上的高非对映体过剩率由DO I生产(-)-V ibo-栎醇的能力。
[0090] 因此，本发明的具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生物从假单胞菌属或伯克氏 菌属微生物进行筛选是有利的。作为特别优选的微生物，可以举出本发明人分离出并命名 的土壤伯克氏菌（Burkholderia terrae)AKC_020株和假单胞菌属(Pseudomonas sp. )AKC_ 019 株。
[0091 ] 土壤伯克氏菌（Burkholderia terrae)AKC_020株于2013年 11 月 1 日作为NITE P- 01745被保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NPMD)(千叶县 木更津市上总鎌足2-5-8122号室）。假单胞菌属(Pseudomonas sp.)AKC-019株于2013年10 月24日作为NITE P-01740被保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏 中心(NPMD)(千叶县木更津市上总鎌足2-5-8122号室）。
[0092] 本发明人进一步由土壤伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC_020株成功提纯出 了本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶。简单地说，将AKC-020株的培养细胞超声波破碎，在其 上清中加入硫酸铵和KPB，制成30 %饱和硫酸铵溶液。使该30 %饱和硫酸铵溶液的上清通过 疏水色谱，利用硫酸铵的浓度梯度洗脱活性级分。接着，将活性级分利用MOPS缓冲液透析后 加到阴离子交换色谱上，利用NaCl的浓度梯度洗脱活性级分。最后通过凝胶过滤色谱进行 提纯。在凝胶过滤色谱中，活性级分在对应于分子质量为约130KDa的保留时间洗脱，其后利 用SDS-PAGE进一步确认纯度，结果在约36KDa确认到了单一条带。从而可推测出，AKC-020株 所生产的本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶在溶液中形成了均四聚体。
[0093]本发明人进一步研究了 AKC-020株所生产的本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶的各 种性质。该酶在PH7.0~9.0显示出最大活性。另外，该酶在氧化活性评价、也即将2-脱氧青 蟹肌糖还原来生成(-)-vibo-栎醇的逆反应的评价中，对于(-)-vibo-栎醇显示出了高于肌 肉肌醇的底物特异性。
[0094] 因此，本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶来源于具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的 微生物，可以作为具有下述特性的酶来定义：
[0095] (a)具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性；
[0096] (b)在ρΗ7·0~9.0显示出最大活性;和
[0097] (c)利用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定出的该酶的多肽部分的分子质量为36kDa。
[0098]除了上述以外，本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶还可作为具有下述特性的酶来定 义：
[0099] (d)以80%以上的非对映体过剩率将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇;和
[0100] (e)在氧化活性评价中，对(-)-vibo-栎醇显示出了高于肌肉肌醇的底物特异性。
[0101] 2.具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质
[0102] 本发明人进一步考虑AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶的N末端序列和 内部序列、以及认为与其具有相关性的已知的肌醇脱氢酶（以下有时称为"IDH"）基因的编 码化序列，制作大致20个简并引物，成功获得了AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶 基因。并且由该基因的编码化区域如下确定了AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶 的氨基酸序列：
[0103] 【化4】
[0104] MIRIAVLGAGRIGRIHAGNVAASPNAQLVVVADPVESAAKSLATRLGCEASTDPAGVLERKDIDAVVIGTPTDTHIT FMLEAVRRGKAVLCEKPIDLDMEKSLAAANEVERQRGRVMLAFNRRFDPTSQAFRNAIDAGDVGEVRQVIISSRDPG MPPRDYVEHSGGIFRDMVIHDLDMARWLLGEEPVEVMAMASRLIDESLEKLTDFDTVMVQLRTASGKQCHINCCREA VYGYDQRMEVSGSKGMLLQENLRPSTIRRWSKEATDVREPLLNFFLERYEAAYKAELEAFVDALNTNSPLPTSVQDG LKALRLADAALESALSGKAVKV (序列编号 2)
[0105]从而可知，具有上述氨基酸序列的蛋白质显示出了本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原 酶活性，对于本领域技术人员来说应该可以理解，为了本发明的目的也可以使用其均等物。 为了该目的，本发明人进一步进行了与上述序列编号2显示出同源性的已知氨基酸序列的 检索。并且，本发明人在大肠杆菌内对于具有所检索出的序列的蛋白质进行重组表达，测定 了具有这些氨基酸序列的蛋白质的酶活性。其结果明确了，几种肌醇脱氢酶显示出了本发 明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性。
[0106] 更具体地说，具有与序列编号2显示出58%以上的氨基酸序列同源性的下述3种序 列（参照图8)的蛋白质显示出了与AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶同等程度的 将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。
[0107] 【化5】
[0108] GenBank Accession No.EKS70356.1
[0109] MTRIAVLGAGRIGKIHAANVASNSDAKLVVVADPFEGAANSLAEKLGCEASTDCLSVIERDDVDAVVIGTPTDTHIQ FMLHAVSKGKAVLCEKPIDLDMKKSLAAAKEVERHDGRVMLAFNRRFDPTSQAFRKAIDDGEVGDVRQVVITSRDPG MPPREYVTHSGGIFRDMVIHDLDLARWFLGEEPIEVMATGSRLVEPSLAEVPDFDTVMLQLRTESGKQCHINCCREA VYGYDQRLEVFGSRGMLLQENLRPSTIRRWSASATDAREPLLNFFLERYEAAYKTELTAFVEALRTNTTFPTSVADG LKALRLADCALESAMSCRSVKV(序列编号4);
[0110] GenBank Accession No.ADU72508.1
[0111] MKIAVLGAGRIGNVHAMNVASNPNVELVAIADPFIDNAIKLTEKYGGKAVKEPMELIESNAVDAVIIATPTDTHVDL MLSAARNGKAVLCEKPVDLNLER AEVACAELKQCDVPVMIAFNRRFDPSAAEMHSAIAKGEVGELHQ頂ISSRDPGF ASMDYLRHSGGIFRDMTIHDFDMARWLLGEEPVQVFASASRMLEPALEPLNDFDTVMVQMITKSGKQCHINCSRQAV YGHDQRIEAYGSAGMLLNDNLRPSTLRRFNKSATDARVPLVHFFLERYADAYRMELEAFISAVKHAKPVPVTPYDGY MALKLADCAQQSAETGLPVQL(序列编号6);及
[0112] GenBank Accession No.EIK69154.1
[0113] MLRIAVLGAGRIAKIHAANVAAHPNATLVLVADPWRE⑶DALSTQLGCEAAYDCAAVLNRKDIDAWIGTPTDTHID LLLAAVAQGKAVLCEKPIDLDIAKARSAAQTVERQGGKVMLGFNRRFDPDMLRLRQALDAGQIGAVRQVIITSRDPG LAPREYLEHSGGILRDMTIHDFDTARHLLGEEPVQVSAFASRLVDPSLEQIDDYDSVMVLLRTASGKQCHINCCRQA VYGYDQRVEVSGASGVLLTDNHRPSTLRHWSAEHTEALEPLQHFFLERYADAYRNELMQFVDALNEGRELPTGMRDG LYALHLADCALESVKTGRSVAVCYDR (序列编号8)
[0114] 但是，对于上述3种肌醇脱氢酶来说，截止目前均未报告它们具有将2-脱氧青蟹肌 糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性。进而明确了，对于与序列编号2显示出更低的同源性 (50%以下）的肌醇脱氢酶来说，将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性很少、 或完全没有。
[0115] 因此，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可以由与序列编号2表 示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构成。优选由与序列编号2表示的氨 基酸序列具有68%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有79%以上的同 源性的氨基酸序列构成的蛋白质，进一步优选由具有85%以上的同源性的氨基酸序列构成 的蛋白质，更进一步优选由具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，特别优选 由具有95 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0116] 另外，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可以由与序列编号4表 示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构成。优选由与序列编号4表示的氨 基酸序列具有64%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有79%以上的同 源性的氨基酸序列构成的蛋白质，进一步优选由具有85%以上的同源性的氨基酸序列构成 的蛋白质，更进一步优选由具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，特别优选 由具有95 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0117] 进一步地，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可以由与序列编号 6表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成。优选由与序列编号6表示的 氨基酸序列具有65 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有80 %以上的 同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，进一步优选由具有85%以上的同源性的氨基酸序列构 成的蛋白质，更进一步优选由具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，特别优 选由具有95 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。
[0118] 并且，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可以由与序列编号8表 示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成。优选由与序列编号8表示的氨 基酸序列具有64%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有68%以上的同 源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更优选由具有80 %以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋 白质，进一步优选由具有85%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，更进一步优选由 具有90%以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，特别优选由具有95%以上的同源性的 氨基酸序列构成的蛋白质。
[0119]在上述序列中，序列编号4与序列编号6显示出56%的同源性、序列编号4与序列编 号8显不出64%的同源性、序列编号6与序列编号8显不出54%的同源性。
[0120]需要说明的是，在本说明书中，氨基酸序列的同源性由将两个序列以最佳方式比 对时两个序列间所共有的一致氨基酸个数的百分数来表示(一致位置的氨基酸个数/进行 比对的氨基酸个数X 100)。通过可安装于互联网网址http://www.ncbi .n/m.nih. gov/egi-gin/BLAST的BLAST算法进行计算。
[0121] 此外，在与本发明的AKC-020株所生产的2-脱氧青蟹肌糖还原酶显示出58%以上 的氨基酸序列同源性的上述3个肌醇脱氢酶之间，下述8个部分序列高度保守(参照图8)。因 此，本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质优选具有这8个部分序列中的一者 以上。
[0122] 【化6】 部分序列1: RIAVLGAGR1G (序列编号10) 部分序列2: DAYVIGTPTDTHI (序列编号12) 部分序列3: GKAVLCEKPIDLD (序列编号14) 部分序列4: VMLAFNRRFDP (序列编号16) 部分序列5: HSGCHFRJDM (序列编号18) 部分序列6: ARWLLGEEPV (序列编号20) 部分.1 ?·:列 7: r)FDTVMVQI.RTASC.K(；)CHINCCR (.!']:列编'..J. 22) 部分序列8: AVYGYDQR (序列编号24)
[0124] 进而，已知在即使2个蛋白质分子的氨基酸序列不是完全相同、但两者的分子具有 实质上类似的结构的情况下，它们显示出相同的生物活性。例如，在将亮氨酸置换为缬氨 酸、将赖氨酸置换为精氨酸、将谷氨酰胺置换为天冬酰胺时，蛋白质的功能也可能不会发生 变化。因此，为了本发明的目的，也可适宜地使用由在序列编号2所表示的氨基酸序列中有 一个或数个氨基酸发生缺失、置换和/或添加而得到的氨基酸序列构成且具有2-脱氧青蟹 肌糖还原酶活性的蛋白质。
[0125] 3.基因
[0126] 如下文所述，在生产本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶和具有该酶活性的蛋白质 时，使用编码该酶或蛋白质的基因是有利的。
[0127] 例如，可以利用本发明人由AKC-020株中分离出并确认了序列的2-脱氧青蟹肌糖 还原酶基因对适当的宿主细胞进行转化，来有效地生产该酶。该基因的编码化区域的核苷 酸序列如下所示。
[0128] 【化7】
[0129] ATGATTCGAATCGCCGTACTCGGTGCCGGCCGCATTGGTCGCATTCACGCTGGCAACGTCGCCGCTAGTCCGAATGC ACAACTGGTCGTGGTGGCAGACCCGGTTGAAAGTGCAGCAAAATCGTTGGCTACCCGTCTGGGCTGCGAAGCCTCGA CGGACCCCGCGGGCGTGCTCGAACGCAAAGATATCGATGCGGTCGTCATCGGCACGCCGACGGACACGCACATCACG TTCATGCTTGAAGCCGTCAGGCGCGGCAAGGCTGTTCTGTGTGAGAAGCCCATCGACCTCGACATGGAAAAGTCGCT TGCCGCGGCAAACGAGGTCGAGCGCCAGCGTGGCCGCGTCATGCTCGCTTTCAATCGACGTTTCGACCCGACGTCGC AAGCATTCCGCAACGCGATTCACGCGGGCGATGTTGGCGAAGTGCGCCAGGTCATCATTTCGAGCCGCGACCCGGGC ATGCCTCCGCGTGACTATGTCGAGCACTCGGGCGGCATCTTCCGCGACATGGTGATCCACGACCTGGATATGGCGCG CTGGTTGCTCGGCGAAGAGCCCGTCGAGGTAATGGCGATGGCCAGCCGCCTCATCGACGAGTCGCTCGAAAAACTGA CCGACTTCGATACGGTGATGGTGCAGTTAGGGACCGCGTCGGGCAAGCAATGCCATATCAACTGCTGTCGCGAAGCC GTGTACGGCTACGACCAGCGCATGGAAGTCTCGGGTTCGAAGGGAATGCTCCTTCAAGAGAATCTTCGACCGTCGAC GATCCGGCGCTGGTCCAACGAAGCGACCGACGTTCGCGAGCCGCTGCTCAACTTCTTCCTGGAGCGCTACGAGGCTG CGTACAAGGCGGAGCTCGAAGCCTICGTCGATGCGCTGAACACGAACTCGCCGCTGCCGACGTCCGTGCAGGACGGT CTGAAGGCGTTGCGCCTCGCGGATGCGGCACTCGAGTCCGCGCTGTCGGGCAAAGCCGTCAAGGTGTAA
[0130] (序列编号1)
[0131] 另外，对于能够用于本发明目的的2-脱氧青蟹肌糖还原酶基因，可以具有能够在 自然界发生的全部变异、或者具有人工导入的变异和修饰。例如，已知在编码特定氨基酸的 各种密码子中存在冗余密码子(redundancy)。因此，在本发明中也可以利用最终可翻译成 相同氨基酸的代替密码子。即，由于基因编码的简并，因而在编码某一特定的氨基酸时可以 使用2种以上的密码子，因此氨基酸序列可以利用任意的1组类似的DNA低聚核苷酸进行编 码得到。该组中仅唯一的成员与天然型的酶基因序列相同，但即使是有错配的DNA低聚核苷 酸，在严谨条件下也能够与天然型序列杂交，能够对编码天然型序列的DNA进行鉴定、分离， 进一步还可将这样的基因用于本发明中。需要说明的是，在本说明书中，所谓严谨条件是指 Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrook等人、1989)中所记载 的下述条件:在含有6 X SSC(1 X SSC的组成:0.15M氯化钠、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、0.5% SDS、5XDenhardt's和100mg/mL鲱鱼精DNA的溶液中与探针一起在65°C恒温杂交8小时~16 小时，其后在例如2 X SSC、0.1 % SDS和68°C进行清洗。
[0132] 如上所述，存在有已知的3种肌醇脱氢酶(IDH)与本发明人所发现的2-脱氧青蟹肌 糖还原酶显示出58%以上的氨基酸序列同源性。并且，本发明人首次明确了，这3种IDH显示 出了迄今未被报告过的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性。进一步，本发明人通过本发明人发现 的2-脱氧青蟹肌糖还原酶的氨基酸序列与该3种IDH的氨基酸序列的比对发现了在上述8个 区域氨基酸序列高度保守。因此，对于本领域技术人员来说应该可以理解，通过使用与编码 该8个区域的任一种氨基酸序列的核苷酸的全长或其一部分互补的DNA作为探针，能够容易 地分离出显示本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。即，优选代表性地应用由与 下述8个核苷酸序列的任一种互补的序列的全长或其一部分、例如连续的15个碱基、18个碱 基、20个碱基构成的DNA作为检索本发明的基因的探针。
[0133] 【化8】 部分序列 1: cgaatcgccgtactcggtgccggccgcattggt (序列编号 9) 沉分):r:列 gatgcggtcgtcatcggcacgccgacggacacgcacatc (丨 i.:列编!，_；. 11) iil汾丨]列.?·_ ggcaaggctgltciglgtgagaagcccatcgacctcgac (丨 r:列编4 ⑶ 部分I列4: gtcalgclcgciucaalcgacgutcgacccg (仏列编!，J. 15)
[0134] 部分序列 5: cactcgggcggcatcttccgcgacatg (序列编号 17) 部分序列 6: gcgcgctggttgctcggcgaagagcccgtc (序列编号 19) γΛ,\\ 7： gacttcgatiicggtgatggtgcagttacggaccgcgtcgggcrtagcaatg ccatatcaactgctgtcgc (仏列编!，y 21) 部分序列 8: gccgtgtacggctacgaccagcgc (序列编号 23)
[0135] 进一步，已知大部分生物优选使用特定密码子（最佳密码子）的子集（Gene， Vol. 105，pp. 61-72,1991等），因而根据宿主微生物进行"密码子最佳化"在本发明中也是有 用的。因此，本发明的基因可以具有下述核苷酸序列：其是在序列编号1所表示的核苷酸序 列中有1个或数个核苷酸发生缺失、取代和/或添加而得到的且编码具有2-脱氧青蟹肌糖还 原酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
[0136] 4.2-脱氧青蟹肌糖还原酶的生产方法
[0137] 本发明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶和具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质可 以利用基因重组技术容易地制造。代表性地，可以将编码这些酶蛋白质的基因以表达盒的 形式导入到宿主细胞中。然后，在这样的转化宿主细胞内（以下也称为"转化体"）能够稳定 地表达蛋白质。
[0138] 在本说明书中，所谓表达盒是指含有与表达对象的核酸或表达对象的基因功能性 结合的对转录和翻译进行调节的碱基序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达盒以功能性 结合的状态在编码序列的5'上游含有启动子序列、在3'下游含有终止子序列、根据情况含 有通常的调节元件，在这样的情况下，表达对象的核酸或表达对象的基因"可表达地导入" 到宿主细胞中。
[0139] 对于启动子，不论是结构性启动子还是调节启动子，均被定义为使RNA聚合酶与 DNA结合、 引发RNA合成的DNA序列。强启动子是指高频引发mRNA合成的启动子，在本发明也 适于使用。可以根据该宿主细胞的性质等利用lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌体的主要操 纵子和启动子区域、fd包覆蛋白质的调节区域、针对糖酵解系酶(例如3-磷酸甘油激酶、甘 油醛-3-磷酸脱氢酶）、谷氨酸脱羧酶A、丝氨酸羟甲基转移酶的启动子等。除了启动子和终 止子序列以外，可作为其它调节元件的示例而举出的序列为选择标记、扩增信号、复制起点 等。关于适宜的调节序列，例如记载于"Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185"，Academic Press(1990)中。
[0140 ]上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、菌体、转座子、IS元件、粒、粘粒、或者 线状或环状DNA等构成的载体中（即重组载体)而被插入到宿主细胞中。优选质粒和噬菌体。 这些载体在宿主细胞中可以自体复制，也可以通过染色体复制。适宜的质粒例如为大肠杆 菌的 pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pKK223-3、pDHE19.2、 口邯2、？卩1^236、？]\?1^4、？1^200、？1]1?290、？預-111113-81八 8七11或？8(1(：1;杆菌的？1^110、 PC194或pBD214;棒状杆菌属的pSA77或pAJ667等。除了它们以外，能够使用的质粒等还记载 于"Cloning Vectors"，Elsevier，1985中。表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的 限制酶切割、克隆化以及连接的惯用方法来进行。
[0141] 在如上述那样构建出本发明的具有表达盒的重组载体后，作为为了将该载体导入 到宿主细胞中来进行转化而能够使用的方法，例如使用共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆 转录病毒转染等惯用的克隆化法和转染法。它们的示例记载于"分子生物学的最新实验计 划（Current Protocols in Molecular Biology)"，F.Ausubel等人，Publ .Wiley 1]1七6^(^611〇6，如￥￥〇4，1997;或33111131'〇〇1<:等人，"分子克隆：实验指南"，第2版，(]〇1(1 Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989 中。
[0142] 作为本发明的宿主细胞，可以举出原核细菌、酵母(Saccharomyces)属或毕赤酵母 (Pichia)属等酵母、SF9等昆虫细胞、CH0、C0S7等动物细胞。优选的宿主为埃希氏菌、假单胞 菌、芽胞杆菌、地芽胞杆菌、甲烷单胞菌、甲基芽孢杆菌、嗜甲基菌、精朊杆菌、甲基球菌、棒 状杆菌、短杆菌、发酵单胞菌和李斯特氏菌属的细菌。进一步优选特别确保了在工业发酵生 产中的应用的大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌。大肠杆菌 由于其迅速的生长能力和发酵管理的容易性，因而为特别优选的本发明的宿主微生物的示 例。
[0143] 为了生产本发明的酶蛋白质，将如上述那样得到的转化微生物在适于上述转化微 生物的生长的条件下进行培养。来源于各种宿主微生物细胞的转化体所用的适宜的培养基 组成、培养条件、培养时间对于本领域技术人员是公知的。培养基可以为含有1种以上的碳 源、氮源、无机盐、维生素以及必要时的微量元素或维生素等微量成分的天然、半合成、合成 培养基。但是，不消说所使用的培养基必须适当满足所要培养的转化微生物的营养要求。进 一步地，在转化微生物表达有用的附加性状的情况下、例如在表达针对抗生素的耐性标记 的情况下，培养基可以含有相应的抗生素。由此使发酵中的杂菌所致的污染风险降低。需要 说明的是，为了使与附加性状相关联的后述提纯变得容易，也可以以本发明的酶和蛋白质 与其它蛋白质或标签、例如谷胱甘肽S转移酶、蛋白质A、6组氨酸标签、FLAG标签等的融合蛋 白质的方式生产为转化体。生产出的融合型可以使用适当的蛋白酶、例如凝血酶等来进行 切割。
[0144] 培养可以为分批式也可以为连续式。另外，在任一情况下，均可以为在培养的适当 时刻补给所追加的上述碳源等的形式。进一步地，培养应该在维持适宜的温度、氧浓度、pH 等的条件下继续进行。来源于一般的微生物宿主细胞的转化体的适宜培养温度通常为15°C ~45°C、优选为25°C~37°C的范围。宿主微生物为好氧性的情况下，为了确保发酵中的适当 的氧浓度，需要进行振荡(烧瓶培养等）、搅拌/通气(发酵罐培养等）。这些培养条件可由本 领域技术人员容易地设定。
[0145] 接下来，从在适于本发明的酶蛋白质的生产的条件下培养了适当的时间的培养物 中提纯本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。即，该蛋白质在转化微生物的 细胞内累积的情况下，从培养细胞提纯蛋白质即可;在该蛋白质放出到转化微生物的细胞 外的情况下，从培养上清中提纯蛋白质即可。可以利用几种提纯方法。例如通过应用盐分 级、离子交换色谱、尺寸排除色谱、羟基磷灰石吸附色谱、疏水性相互作用色谱的各种组合、 或者单一种，可以从细胞溶解液或提取液或培养上清中提纯本发明的酶蛋白。
[0146] 作为与本发明的酶蛋白质的提纯相关的具体例，可以将培养细胞超声波破碎，向 其上清中加入硫酸铵制成30 %饱和硫酸铵溶液。使该30 %饱和硫酸铵溶液的上清通过疏水 色谱，利用硫酸铵的浓度梯度洗脱活性级分。接着，将活性级分透析后加到阴离子交换色谱 上，利用NaCl的浓度梯度洗脱活性级分。最后通过凝胶过滤色谱进行提纯。
[0147] 5.(-)-vib〇-栎醇的制造方法
[0148] 通过利用本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质，能够极为简便且有 效地由2-脱氧青蟹肌糖制造(-)-vibo-栎醇。即，在(-)-vibo-栎醇的制造方法中可以应用 本发明人发现的具有序列编号2的氨基酸序列的2-脱氧青蟹肌糖还原酶，这一点是不消说 的，而截至目前仅已知显示出肌醇脱氢酶活性、却由本发明人首次明确其还具有2-脱氧青 蟹肌糖还原酶活性的由序列编号4、6和8分别表示的蛋白质也能够用于(-)-vibo-栎醇的制 造方法中。需要说明的是，这些基因的编码化区域分别如下所述。
[0149] 【化9】
[0150] atgactcgcattgcagttctcggagcaggccgtatcggaaagattcacgcagcgaacgttgcatcgaactcggacgc gaagctcgtcgtggttgcagacccgttcgaaggcgcagccaactctttggcggagaagctcggttgcgaagcgtcca ccgactgtctctctgttatcgagagggacgacgtcgatgctgtcgtcattggcacgccgaccgatacccacatccag ttcatgcttcatgcggtttcaaaagggaaggcagttctctgcgagaaacccatcgacctggatatgaaaaagtcgct cgcggcagccaaggaggtcgaacggcacgatggacgcgtgatgctggcattcaaatcgtcgattcgacccgacgtcg caggccttccggaaagccatcgatgatggggaagtcggtgatgtccgacaggttgtcattaccagtcgcgaccccgg tatgcccccgcgagagtatgtgacgcactccggcggcatcttccgcgacatggttattcacgaccttgacctcgcac gatggtttcttggagaagagcccattgaagtgatggccactggtagccggctcgtggaaccaagcctcgcggaagtt ccggacttcgatacggtcatgctgcaactgcgtaccgaaagcggaaagcaatgccacatcaattgctgtcgcgaggc cgtctacggttacgaccaacgcctcgaagtgttcggctcccgcggcatgctccttcaggaaaatctgcgaccctcca cgattcgccgctggagcgcgagtgcaaccgatgcccgtgagccgctccttaactttttcctggagcgctatgaagcg gcatataagacggagctcaccgcctttgtagaggcattgcgaacgaacactacgttcccgacttctgttgcggacgg gcttaaagcgttgcggcttgctgactgcgctcttgaatctgcgatgtcgtgtaggtcagttaaagtctaa(序列编 号3);
[0151] atgaaaattgccgtacttggcgcaggccgcattggcaacgtccacgcaatgaatgttgcaagcaaccccaatgttga actggtcgcgattgctgatcctttcatcgacaacgctatcaaactgacggagaaatatggtggcaaggccgtgaaag agccgatggagttgattgagagcaatgcggtggatgccgtgatcattgcgacacctaccgatacgcatgttgatctg atgtgagtgcagcccgcaatggtaaagcggtactgtgtgaaaaaccggtagaccttaacctggaacgtgccgaagtc gcctgcgcagagcttaagcaatgcgatgttcccgtcatgattgcctttaaccgccgctttgatcccagcgcagctga aatgcacagcgccattgcgaaaggtgaagtgggcgaactgcatcaaatcatgatttccagccgtgacccgggctttg cctccatggactatctgcgtcactctggcggcatcttccgggacatgacgattcatgattttgacatggcgcgctgg ttactcggtgaagagcctgtgcaggtatttgcctc tgccagccgtatgctggagccggcattagaaccgttgaatgatttcgataccgtgatggttcagatgatcactaaat cgggtaagcaatgccacatcaactgtagtcgtcaagccgtctatggacatgaccaacgcattgaagcttatggttct gcagggatgttactcaatgacaatcttcgcccatccactctgcgtcgtttcaataaatcggcaaccgatgctcgcgt tccattagtccacttcttcctcgaacgctatgcggatgcctaccggatggaactggaagccttcatttccgcggtta agcatgcgaagcccgttcctgttaccccttatgatggatatatggcgctgaagctcgccgactggcgcaacaatcgg ctgaaactggtttacctgtgcagctttaa(序列编号5);及
[0152] atgctacgtattgccgttctaggtgcggggagcatcgccaagatccacgccgccaacgtcgctgcccatcccaacgc cacgctggtgctggtggccgacccctggcgcgaaggcgtcgatgccctgagcacgcagttgggatgtgaagcagcat acgactgcgccgccgtgctgaaccgcaaggacatcgacgcagtggtgatcggcacgcccaccgacacccatatcgac ctgttgctggccgccgtggcccagggcaaggcggtactctgtgaaaagcccatcgacctggatatcgccaaggcgcg cagcgcagcacaaaccgtggagcgtcagggcggcaaggtgatgcttggcttcaaccgccgtttcgacccggacatgc tgcggctgcgccaggccttggacgccggccagatcggcgcagtgcgccaggtgatcattaccagccgcgaccccggc ctggctccgcgcgagtatctggaacattccggtggcatcctgcgcgatatgactatccacgacttcgacactgcccg gcacttgctgggtgaagagccggtgcaagtcagcgccttcgccagccgcctggtagacccgagcctggaacagattg acgactacgacagcgtgatggtcctgctgcgcaccgcctcgggcaagcaatgccatatcaactgctgccgccaggcg gtgtatggctacgatcaacgtgtagaagtctccggcgccagcggcgtactgctcaccgataaccacaggcccagtac cttgcgacactggagtgctgaacacactgaagcactggagccgttgcagcactttttccttgagcgctatgcggatg cctatcgtaatgagttgatgcagtttgtcgatgcgctgaatgaggggcgtgagttgcccaccggcatgcgtgatggg ctgtatgccttgcacctggctgactgtgcgttggagtcggttaagacggggcgcagcgtggccgtttgttatgaccg gtag(序列编号7)
[0153] 本发明的该酶反应在pH约5.0~约10.0的范围的缓冲液内进行即可，该pH为本发 明的2-脱氧青蟹肌糖还原酶显示出最大活性的pH。上述pH优选为5.5~9.5、最优选为7.0~ 9.0。例如可以使用调整为这样的pH范围的KPB或Tris-盐酸缓冲液。反应中使用的本发明 的 酶的量可以根据底物浓度、所期望的反应时间等适宜地选择，通常为5U/L~500U/L即可。
[0154] 作为该酶反应的底物的2-脱氧青蟹肌糖可以通过例如W02010/109916号小册子、 TO10/053052号小册子和W006/109479号小册子等中记载的方法容易地得到。将该底物以所 期望的浓度溶解在上述缓冲液中即可，该浓度可示例出10mM~500mM，但并不限定于此。另 一方面，为了进行本发明的还原酶反应，必须向反应体系中添加作为辅酶的NADH。所添加的 NADH量比底物的量过剩即可，通常为底物的1.2倍~2倍的程度时是充分的。关于反应时间， 经时地监控反应液中的（-)-vibo-栎醇的浓度，使反应时间为其生成量达到最大的时刻即 可，更简便地说，也可以观察通过NADH转换为NADH+而变化的缓冲液的吸光度（例如波长 340nm)，反应时间为不发生该变化的时刻。作为适宜的反应时间的例子，可以举出20分钟~ 120小时，从酶的稳定性的方面出发，优选为30分钟~60小时、更优选为30分钟~10小时、最 优选为30分钟~3小时。反应温度依照本发明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质 的最大活性来确定即可，代表性地可以为约15°C~40°C、优选为25°C~30°C。
[0155] 由上述的酶反应物能够极为简单且高纯度地分离出（-)-vibo-栎醇。即，由于本发 明的具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质以极高的收率和非对映体过剩率将2-脱氧 青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇，因而能够避免使用色谱之类的繁杂的工序。例如，仅通过 将反应终止后的反应液适宜浓缩并加入低级醇进行再结晶，就能够分离出（-)-vibo-栎醇。 作为具体例，可以举出将酶反应液浓缩至(-)-vibo-栎醇的含量为20~50% (W/V)的程度并 向其中添加〇. 5~2倍量的乙醇的方法。
[0156] 了解了以上说明的本领域技术人员可充分地实施本发明。下面，出于进一步说明 的目的提供实施例，因而本发明并不限于该实施例。需要说明的是，在本说明书中，只要没 有特别说明，"％"表示质量/容量的百分数（％(W/V))。另外，核苷酸序列以从5'向3'方向记 载。
[0157] 实施例
[0158] 1. (-)-vibo-栎醇同化菌的筛选
[0159] 向0.85%灭菌食盐水中加入土壤约O.lg，充分搅拌。其后静置3小时，使砂石或植 物的根等沉淀，将0.1ml的上层清液涂布至栎醇琼脂培养基(组成列于表1)。在30°C培养1-2 天，利用LB琼脂培养基(组成列于表1)进行所生长的菌的分离作业。将成为单菌落的菌株植 菌至斜面培养基(栎醇琼脂培养基），于30°C进行培养后，在4°C保存。通过实施63次本实验， 取得了 109株土壤菌。
[0160] 【表1】
[0161]
[0162] 2.具有将2-脱氧青蟹肌糖(DOI)转换为(-)-vibo-栎醇的能力的微生物的获得
[0163] 将上述获得的109株土壤菌分别植菌至2mL的栎醇培养基(组成为从上述琼脂培养 基中除去琼脂的组成）中，于30°C培养1~2天。它们之中的45株确认生长良好，因而将培养 液离心（l，5000rpm、10分钟、4°C)进行集菌。将集菌后的菌体悬浮在2mL的20mM磷酸钾缓冲 液（PH7.0)中，利用超声波破碎装置（株式会社Τ0ΜΥ精工、UD-200、输出功率：60W、频率： 20kHz)处理30秒，该处理反复进行5次，将菌体破碎，离心（1，5000rpm、10分钟、4°C)回收上 清。将回收液作为粗酶液，按下述顺序进行酶反应评价。
[0164] (1)酶反应的评价
[0165] 反应液的组成如下。需要说明的是，所使用的粗酶液为10μ1。
[0166] 【表2】
[0167]
[0168] 酶反应通过利用分光光度计对于辅酶NADH转换为NAD+的量进行定量来测定。即， 在比色杯中量取D0I以外的反应组成液(990μ1)，在25°C预加热约5分钟。加入D0I溶液（10μ 1)后，迅速混合，将水作为对照，使用调节为25°C的分光光度计（岛津制作所、UV-2550)测定 2分钟的吸光度（波长340nm)的减少速度，计算出每1分钟的吸光度减少量。接着将波长 340nm的NADH的分子吸光系数设为6.2211^- 1〇11-1，将1分钟内1以111〇1的嫩0!1的减少量定义为 lunit(U)，计算出每lmL粗酶液的U，进行各菌株的评价。根据这些结果，成功获得了显示出 超过0.2U/mL (粗酶液)的活性的10株微生物。
[0169] (2)非对映体过剩率的评价
[0170] 接着，与上述同样地从这10株中获得粗酶液，对于从D0I到(-)-vibo-栎醇的反应 中的非对映体过剩率进行评价。具体地说，使用基于甲酸脱氢酶（以下称为FDH、R 〇che-Diagnostics株式会社产品编号244678)的辅酶再生系统进行D0I转换。表3中示出了转换反 应液的组成。反应液在30°C振荡培养3小时。反应终止后进行离心（15，OOOrpm，15分钟），通 过上清的HPLC分析(条件列于表4)进行(-)-vibo-栎醇和scyllo-栎醇的定量。
[0171] 【表3】
[0173]
[0172] 表3:反应液组成
[0174]
[0175]
[0176] 非对映体过剩率的计算通过下式计算出。在10株中全部达成了80%以上的高非对 映体过剩率。
[0177] 【化9】
[0178]
[0179] 3.微生物的鉴定
[0180]为了鉴定微生物，进行了基因组的提取。在4ml的LB培养基中培养、集菌后，悬浮在 0.72ml的0.05M Tris-HCl(pH8.0)中，添加溶菌酶。在37°C培养30分钟后，进一步添加 0.08ml的2M NaCl和蛋白酶K、0.08ml的10 % SDS，在37°C处理10分钟。等量添加三饱和苯酚/ 氯仿/异戊醇（比例50:48:2)溶液，剧烈搅拌后，进行离心（l，5000rpm、10分钟、4°〇。将上层 转移到新管中，添加2倍量的乙醇，进行离心（1，5000rpm、10分钟、4°C)，弃掉上清。利用70% 乙醇进行2次漂洗，再悬浮于0. lml的0.05M Tris-HCl(pH8.0)中，加入RNase，在37°C处理1 小时。加入0.4ml的0.05M Tris-HCl (pH8.0)和0. lml的2M NaCl，反复进行苯酚/氯仿提取， 乙醇沉淀后利用70 %乙醇进行2次漂洗。将所得到的基因组悬浮在0.5ml的0.05M Tris-HCl (PH8.0)中。将所得到的基因组作为模板，利用PCR对于16SrRNA基因的部分序列进行扩增， 使用ABI PRISM(注册商标)310Genetic Analyzer确定该部分碱基序列。16SrRNA基因的扩 增条件列于表5。
[0181] 【表5】
[0182]
[0183] 使用BLAST检索（作为检索对象数据库使用16S核糖体RNA序列）进行基于16SrRNA 基因的鉴定，结果前面获得的10株微生物中，6株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、l株 属于栖沉积物伯克氏菌（Burkholderia s ed imi n i co 1 a )、2株属于土壤伯克氏菌 (Burkholderia terrae)、最后1株属于伯克氏菌属(Burkholderia sp.)。在图1中分别以序 列编号74~83示出了这些菌的16SrRNA基因。另外，在这些菌之中，将属于土壤伯克氏菌 (Burkholderia terrae)的一种菌命名为AKC-020株、将属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.)的一种菌命名为AKC-019株。
[0184] 4.D0I还原酶的提纯
[0185] 将土壤伯克氏菌(Burkholderia terrae)AKC-020株使用LB液体培养基在30°C振 荡培养一夜，将其作为前培养液。将lml的前培养液加入到100ml的酵母浸膏/胰蛋白胨/D0I 培养基（组成列于表6)中，进行主培养。关于主培养，在500ml容积的坂口瓶中装入100ml的 培养基，在转速120印111、30°(3、24小时的条件下进行。
[0186] 【表6】
[0187]
[0188] 对于l〇〇ml的培养液进行集菌，再悬浮于25ml的0.02M磷酸钾缓冲液(ΙΦΒ) (pH7.0) 后，在冰上以30秒的间隔进行5分钟超声波破碎（株式会社TOMY精工、超声波破碎装置UD-200、输出功率:200W、频率:20诎2)。将破碎液离心（15,000印111、10分钟、4°〇，在上清中加入 5.4g的硫酸铵和KPB，制成35ml的30 %饱和硫酸铵浓度溶液。在冰上冷却40分钟后进行离心 (1，5000rpm、10分钟、4°C)，将上清作为硫酸铵沉淀级分。
[0189]接下来进行疏水色谱。使用的柱剂为Toyopearl丁基_650M(东曹株式会社），使用 的空心柱的尺寸为(p2.5cmx6.5cm、柱体积为约30ml、流速为约0.8ml/分钟、收集体积 (fraction size)为约5ml/根、利用400ml的流量以30%至0%的硫酸铵浓度梯度进行洗脱。
[0190] 将疏水色谱的级分利用MOPS缓冲液透析后，接着进行阴离子交换色谱。使用的柱 为RESOURCE Q lml(GE Healthcare)、流速为lml/分钟、收集体积为lml/根，使用20mM MOPS 缓冲液(pH7.0)利用20ml的流量以0M至0.5M的NaCl浓度梯度进行洗脱。使用的仪器为AKTA purifier(GE Healthcare)。
[0191] 最后进行凝胶过滤色谱。使用的柱为了31?616300031(柱尺寸21.51111111.0.\ 30cm、东曹社制造）、流速为lml/分钟、收集体积为lml/根、利用含有0.3M NaCl的0.02M KPB (PH7.0)进行洗脱。作为分子量标记使用东方酵母株式会社制造的MW-Marker(商品名）。作 为使用的仪器使用岛津制作所制HPLC。
[0192] 通过Bradford法测定酶液中的蛋白质浓度。蛋白质定量试剂使用Protein Assay Reagent (Bio-Rad社）、标准品使用牛血清白蛋白（BSA)溶液。为了使土壤伯克氏菌 (B.terrae)AKC-020株表达D0I还原酶，利用含有D0I的培养基对其进行培养。培养的结果， 在100ml的培养基中得到了湿重0.3g的菌体。相对于D0I的总活性为78.7U。利用硫酸铵分 级、丁基-Toyopearl650M、ResoureQ、TSK-GelG3000SW进行D0I还原酶的提纯后的提纯结果 和SDS-PAGE结果分别如表7和图2所示。
[0193] 【表7】
[0194] 表7:由Burkholderia terrae AKC-020株提纯D0I还原酶
[0195]
[0196] 根据使用TSK-Gel G3000SW柱进行凝胶过滤色谱的结果，提纯酶的保留时间为 76.66分钟。另外，在相同的HPLC条件下，MW标记（马心肌细胞色素 c (分子量12，400 )、酵母肌 激酶(分子量32,000)、酵母烯醇酶(分子量67,000)、猪心肌乳酸脱氢酶(分子量142,000)、 酵母谷氨酸脱氢酶(分子量290，000))各自的保留时间为105.44分钟、94.89分钟、86.40分 钟、76.70分钟、65.01分钟。因此确定，水溶液中的提纯酶的分子质量为约130kDa。另一方 面，根据SDS-PAGE的结果（图2)，单体的分子质量为约36kDa，因而可推测本酶为均四聚体。
[0197] 5.提纯D0I还原酶的各种性质
[0198] (1)最佳 pH
[0199] D0I的还原通过利用分光光度计对于辅酶NADH转换为NAD+的量进行定量来测定。 在含有ο. 3μL?〇1的NADH的各pH的0.1M缓冲液980yL中加入10yL酶液，在25°C进行5分钟预加 热。在加入10yL的O.IM DOI后迅速混合，利用分光光度计测定2分钟的吸光度(波长340nm) 的减少速度，对各pH下的活性进行比较。结果示于图3。
[0200] (2)底物特异性
[0201] 以还原反应的逆方向进行反应时的D0I的底物特异性通过利用分光光度计对于辅 酶NAD+转换为NADH的量进行定量来测定。在含有Ι.Ομ mol的NAD+的0.1M的缓冲液980yL中加 入10yL酶液，在25°C进行5分钟预加热。在加入10yL的0.1M各底物后迅速混合，利用分光光 度计测定2分钟的吸光度(波长340nm)的增加速度，比较基于各底物的活性。将波长340nm的 NADH的分子吸光系数设为6.221111_1〇11-1，将1分钟内以111〇1的嫩0!1转换量定义为1111^〇])。结 果列于表8。表中，N.D.表不未确认到反应。
[0202] 【表8】
[0203]表8:底物特异性(氧化反应）
[0204]
[0205] (3)Km 值和 Vmax
[0206] 酶活性通过利用分光光度计对于辅酶NADH或NAD+的变化量进行定量来测定。将波 长340腦的嫩0!1的分子吸光系数设为6.2211^- 1〇11-1，将1分钟内1以111〇1祖0!1的转换量定义为 lunit(U)。另外，利用Bradford法测定酶液中的蛋白质浓度。测定底物浓度为0.02mM、 0.04禮、0.06111]\1、0.08111]\1、0.1111]\1、0.21111、0.3111]\1、1.01111、2.0111]\1时的活性，计算出相对于001的 Km值和V max。另外，测定辅酶浓度为0.04mM、0.06mM、0.08mM、0. lmM、0.2mM时的活性，计算出 相对于NADH的Km值。进一步测定栎醇浓度为1. OmM、2. OmM、3.0mM、4. OmM、5. OmM时的活性，计 算出相对于栎醇的Km值和Vmax。同样地测定NAD+浓度为0.02mM到0.04mM、0.06mM、0 . ImM、 0.2mM、0.3mM时的活性，计算出相对于NAD+的Km值。结果列于表9。
[0207] 【表9】
[0208] 表9:动态参数
[0209]
[0210] 6.D0I还原酶基因（D0IR基因）的克隆化
[0211] 通过数据库获得了在论文等中被报告具有肌醇脱氢酶（IDH)活性的已知酶的氨基 酸序列。根据这些氨基酸序列的同源性高的区域与D0IR的N末端氨基酸序列和内部氨基酸 序列选拔出了合计8处的简并引物设计区域。所制作的比对和简并引物序列如表10和图4所 示。PCR条件如表11和图5所示。
[0212] 若详细说明，则将由土壤伯克氏菌(B.terrae)AKC-020株中提取的基因组DNA作为 模板，使用如上所述设计的简并引物进行第一轮PCR(退火温度条件为45°C~60°C范围的梯 度PCR)。利用各种引物的组合进行PCR，结果在D0IRdgFl/D0IRdgR8的引物组(表10和图4的 (1)和（17))中，在退火温度60°C左右确认到了约900bp条带的扩增。使用该扩增片段为模 板，通过使用内部区域的引物的第二轮PCR(巢式PCR)来进行扩增片段的锁定，结果在 D0IRdgFl/D0IRdgR7Q的引物组(表10和图4的（1)和（15))中扩增了约700bp的片段，该碱基 序列所编码的氨基酸序列与已知的IDH氨基酸序列显示出了 34 %~53 %左右的同源性。
[0213] 接着，基于所取得的D0IR基因的部分片段的序列信息制作引物（（18)~（23))，实 施TAIL-PCR(热不对称交错PCR)(这些引物也列于表10)。需要说明的是，通过在用于下游区 域的克隆化的上游引物中使用（18)~(20)、在下游引物中使用(25)的TAIL-PCR和在上游引 物中使用（31)、在下游引物中使用（21)~（23)的TAIL-PCR，得到了分别含有下游区域和上 游区域的序列的PCR产物。由这些碱基序列信息推断出了包含D0IR的0RF的约3.0kb的碱基 序列。使用D0IR基因的0RF的上游约150bp和下游约70bp位置的序列制作引物(表10和图4的 (32)和(33))，再次使用土壤伯克氏菌(B.terrae)基因组DNA为模板进行PCR，扩增出了包含 D0IR基因的0RF全长的约1.2kb的区域。对该扩增片段进行提纯，通过直接测序确定了D0IR 基因序列。
[0214] 【表1〇】
[0215]表10:所使用的引物一览 [0216] 核苷定义：
[0217] R:G或A、Y:T或C、M:A或C、K:G或T、S:G或C、W:A或T、H:非G、D:非C、N:任意核苷
[0218] CN 105492606 A ^ 22/25 jn
[0219] 【表11】
[0220] 表11:基于简并引物的PCR组成
[0221] 用蒸馏水调节成0.05ml
[0222] 7.D0IR基因与已知基因的同源性
[0223] D0IR基因具有由全长990bp、330氨基酸残基构成的0RF(序列编号1和2)。由氨基酸 序列推断出的分子量为36195.12,另外在其氨基酸序列中包含由提纯酶的序列分析得到的 N末端"MIRIAVLGAGRI"（序列编号66)和内部氨基酸序列"AELEAFVDALNTN"（序列编号67)。对 D0IR的氨基酸序列进行BLAST同源性检索（作为检索对象数据库使用UniProtKB/ SwissProt)，结果可知与某种微生物来源肌醇2-脱氢酶（IDH)具有约80%的同源性。其中， 这些已知序列根据氨基酸序列的同源性多半被分类为IDH，实际上报告有IDH活性的同源性 为表12所示的程度。
[0224] 【表12】
[0225] 表12:D0IR与肌醇脱氢酶的氨基酸序列的同源性
[0226]
[0227] 8.表达用载体pETduet-DOIR的构建
[0228] 为了利用大肠杆菌进行D0IR的异种宿主表达，构建D0IR表达用载体pETduet-DOIR (图7)。使用引物(34)和（35)扩增AKC0-020株的D0IR基因，使用限制酶BamHI和Hindlll (参 照上述表10)克隆到pETDuet-1 (Merck社）的各个限制酶识别位点上。pETduet-DOIR转化至 E.coli BL21(DE3)株。
[0229] 另外，如上所述，由于进行BLAST检索的结果判明了与AKC0-020株的D0IR显示出同 源性的多个肌醇-2-脱氢酶的存在，因而为了研究这些肌醇-2-脱氢酶是否可催化D0I还原， 合成了该肌醇-2-脱氢酶基因，利用与上述D0IR基因相同的方法进行表达。即，通过与D0IR 的氨基酸序列的BLAST检索(作为检索对象数据库使用GenBank、roB、SwiSSPr〇t)选出了显 示出约80%、70%、60%、50%、40%、30%的同源性的6种肌醇脱氢酶(参照表13)。
[0230] 【表13】
[0231] 表13:进行了活性测定的肌醇脱氢酶
[0232]
[0233] 在合成表13所示的基因时，Bs-iolX的起始密码子为GTG，因而变更为ATG。另外据 报告，费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)USDA191来源的肌醇脱氢酶基因（Sf-Idh) 是对肌肉肌醇进行氧化的酶，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) 168来源的iolX(Bs-IolX)和iolW(Bs-IolW)编码显示出针对鲨肌醇的活性的酶。另外，iolW(Bs-IolW)被认为是 NADPH依赖型肌醇脱氢酶。将这6种基因导入至达载体pET21b( + )(MERCK社），利用大肠杆菌 BL21(DE3)株进行表达。将在各培养液中的活性列于表14。
[0234] 【表14】
[0235] 表14:基于各种肌醇脱氢酶/D0IR的D0I还原活性
[0236]
[0237] 利用 SDS-PAGE 确认 D0IR 与肋-1〇16、？&-1(111、？8-1(111、3卜1(111的重组蛋白的表达。对 于该凝胶中的条带使用ImageJ 1.46进行表达量比较，结果Bh-IolG、Pa-Idh、Ps-Idh、Sf-Idh相对于 D0IR 的表达量分别为 0.61 倍、 0.99倍、 1.25倍、 0.97倍 （图 12)。这些值表示出了相 对于D0I的活性(表14)。
[0238] 将D0I转换率与生成物的非对映体过剩率列于表15。
[0239] D0IR和BH-IolG、Pa-Idh、Ps-Idh以89%cLe.以上的非对映体过剩率将D0I转换为 (-)-vibo-栎醇。
[0240] BS-IolX以99%cLe.的非对映体转换率将D0I转换为scyllo-栎醇。Sf-Idh在培养 液中的D0I的还原弱，尽管过量添加了菌体破碎液，但未检测出作为产物的栎醇。
[0241] 【表15】
[0242] 表15:向栎醇的转换（重组E · Co 1 i来源）
[0243]
[1^料」 丄业头用T土
[0245]本发明能够在极为简便、有效、且高纯度的（-)-vibo-栎醇的工业发酵生产中应 用。
【主权项】
1. 一种2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其来源于具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生物，其 中，该2-脱氧青蟹肌糖还原酶具有下述(a)~(c)的特性， (a) 具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性； (b) 在ρΗ7·0~9.0显示出最大活性;和 (c) 利用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定出的该酶的多肽部分的分子质量为36kDa。2. 如权利要求1所述的2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其中，所述微生物是属于假单胞菌属或 伯克氏菌属的微生物。3. -种蛋白质，其为下述(a)~(e)中的任意一种蛋白质： (a) 由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (c) 由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (d) 由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或 (e) 由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。4. 如权利要求3所述的蛋白质，其中，所述蛋白质为(b)~（e)中的任意一种，但不包括 由序列编号2、4、6和8所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。5. -种基因，其编码权利要求3或4所述的蛋白质。6. -种基因，其由下述(a)或(b)的核苷酸序列构成， (a) 序列编号1所表示的核苷酸序列;或 (b) 与由下述互补序列构成的DNA在严格条件下杂交、且编码具有2-脱氧青蟹肌糖还原 酶活性的蛋白质的核苷酸序列，所述互补序列与由序列编号1所表示的核苷酸序列中的至 少连续18个碱基构成的核苷酸序列互补。7. 如权利要求6所述的基因，其中，所述(b)中的由至少连续18个碱基构成的核苷酸序 列是选自由序列编号9、序列编号11、序列编号13、序列编号15、序列编号17、序列编号19、序 列编号21和序列编号23组成的组中的序列的全部或一部分。8. -种(-)-vibo-栎醇转换用重组载体，其包含权利要求5~7中的任一种基因。9. 一种(-)-vibo-栎醇转换用转化体，其导入有权利要求5~7中的任一种基因或权利 要求8的重组载体。10. -种2-脱氧青蟹肌糖还原酶的生产方法，其特征在于，将权利要求9的转化体在适 于具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质的生产的条件和时间下进行培养，由培养物中 提纯该蛋白质并进行回收。11. 一种(-)-vibo-栎醇的制造方法，其特征在于，使权利要求1或2所述的2-脱氧青蟹 肌糖还原酶与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反应，将所生成的（-)-vibo-栎醇由反应液中回收。12. -种(-)-vibo-栎醇的制造方法，其特征在于，使下述(a)~（e)中的任意一种蛋白 质与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反应，将所生成的（-)-vibo-栎醇 由反应液中回收， (a) 由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (c) 由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (d) 由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或 (e) 由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。13. -种将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的方法，其特征在于，使权利要求1或 2所述的2-脱氧青蟹肌糖还原酶与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件下发生反 应。14. 一种将2-脱氧青蟹肌糖转换为（-)-vibo-栎醇的方法，其特征在于，使下述(a)~ (e)中的任意一种的蛋白质与2-脱氧青蟹肌糖接触，在pH5.0~10.0的条件发生反应， (a) 由序列编号2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质； (b) 由与序列编号2所表示的氨基酸序列具有58%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (c) 由与序列编号4所表示的氨基酸序列具有56%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质； (d) 由与序列编号6所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质;或 (e) 由与序列编号8所表示的氨基酸序列具有54%以上的同源性的氨基酸序列构成、且 具有2-脱氧青蟹肌糖还原酶活性的蛋白质。
【专利摘要】本发明的目的在于通过简单的工序有效地生产(-)-vibo-栎醇。特别谋求能够将2-脱氧青蟹肌糖直接转换为(-)-vibo-栎醇的酶的应用。本发明提供一种2-脱氧青蟹肌糖还原酶，其来源于具有同化(-)-vibo-栎醇的能力的微生物，其中，该2-脱氧青蟹肌糖还原酶具有下述(a)～(c)的特性：(a)具有将2-脱氧青蟹肌糖转换为(-)-vibo-栎醇的催化活性；(b)在pH7.0～9.0显示出最大活性；和(c)利用SDS-聚丙烯酰胺电泳测定出的该酶的多肽部分的分子质量为约36kDa。NITE BP-0174020131024
【IPC分类】C12N15/09, C12N9/04, C12N1/21, C12P7/02, C12N5/10, C12N1/15, C12N1/19
【公开号】CN105492606
【申请号】CN201480048371
【发明人】小西一诚, 伊藤伸哉, 黑川纯司
【申请人】旭化成化学株式会社
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年12月5日
【公告号】US20160208224, WO2015093320A1
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