重组纤维素糖化酶混合物和重组酵母复合菌株及其用图
重组纤维素糖化酶混合物和重组酵母复合菌株及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及：与野生型蛋白质相比在酵母中分泌能力增加的蛋白质表达用表达 盒、包含该表达盒的表达载体、将上述表达载体导入到宿主细胞中而形成的转化子及包含 两种以上的上述转化子的复合菌株，其中，上述表达盒包含对翻译融合配偶体 (Translational fusion partner，TFP)进行编码的多核苷酸和对选自 TrXynl I、TrBxl、 TrEGL2、PaCELl、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、ClCBH2和CfCexl的蛋白质进行编 码的多核苷酸。并且，本发明涉及一种包括用于培养上述转化子的步骤的半纤维素酶、内切 葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法及生物乙醇的生产方法。进一步，本发明涉及一种包 含β-葡萄糖苷酶、通过上述方法生产出的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的重组纤维素酶混 合物及利用上述混合物对生物质进行糖化的方法。此外，本发明涉及一种通过使用单一的 用于制备上述纤维素酶的菌株或复合使用两种以上的用于生产上述纤维素酶的菌株并将 糖化及发酵这两个工程简化为单一步骤，来以廉价的费用从纤维素生物质中生产出生物能 源或有用生化物质的方法。
【背景技术】
[0002] 全世界上，因原油枯竭及地球暖化问题而正在进行着从廉价且可再生的生物质中 容易地获取生物能源的努力。纤维素生物质为地球上最为丰富的有机物，其为能够生产以 现有石油为基础生产出的各种能源和原料平台化合物的可再生原料(Hoffert等，2002， 3以611(^，298,981)。目前，利用这种纤维素生物质来获取生物能源(特别是生物乙醇）的过 程在技术方面上是可行的，但属于高价工程，具有与目前的原油价格相比缺乏经济性的问 题（Zaldivar等，2001，Appl.Microbiol.Biotechnol·，56,17)〇
[0003] 为了从纤维素生物质中获取生物乙醇，对生物质进行分解并将分解后的糖 (sugar)进行发酵来获取生物乙醇，但由于存在于自然界中的微生物无法同时高效进行生 物质的分解和发酵，因此现有技术将生物质的分解及发酵分成两个步骤来进行，从而是无 效率的（Lynd等2002，Microbiol.Mol. Biol.Rev. 66,506)。特别是，纤维素生物质为非常坚 固的结构，其自然分解过程非常缓慢，因此为了人工加快分解速度而必须进行高费用的前 处理过程和高价的纤维素分解酶处理过程（Lynd等，1999，Biotechnol. Prog . 15，777， Himmel等，2007,Science,315,804)〇
[0004] 因此，为了确保利用纤维素生物质的生物能源及平台化合物生产的经济性，需要 能够将纤维素生物质有效分解的纤维素分解酶(纤维素酶)的低价生产技术，特别是要求开 发出能够将这种酶生产重组菌株直接应用到生物能源生产技术中的联合生物加工 (Consolidated bioprocessing)技术（Hahn-Hagerdal等，2006，Trends Biotechnol .,24, 549,Lynd等，2008,Nat.Biotechnol·，26,169)〇
[0005] 纤维素生物质通过与作为葡萄糖聚合物的纤维素、作为木糖聚合物的半纤维素、 以及木质素（lignin)结合而具有非常坚固且稳定的结构。为了利用酶来使其有效分解，首 先，需要通过物理化学前处理来瓦解植物体的稳定结构，并使酶能够接近基质，并根据基质 种类需要各种纤维素分解酶。为了分解作为葡萄糖聚合物的纤维素，内切l，4-i3-D-葡聚糖 酶(end〇-l，4-0-D_glucanase)、外切 1，4-β-?-葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(ex〇-l，4-0_D-区111〇&11&86或〇611〇13；[0117(11'01&86)和0-葡萄糖苷酶（0-8111(308丨(1&86或0611013丨&86，0-葡萄 糖苷酶或纤维二糖酶）是必不可少的（Kubicek 等，1992，Adv .Biochem. Eng. Bio techno 1,45， 1)。此外，为了分解作为木糖聚合物的半纤维素，代表性地需要内切1，4-β-木聚糖酶(-(10-1，4-0-17131^86)和0-木糖苷酶(0-171081(^86)，并且为了完全分解，需要多种脱支((16-branching)酶。在使植物体自然腐蚀的微生物(特别是霉菌）中发现这些酶，关于商业上生 产出的纤维素分解酶复合体，由诺维信(Novozymes)公司和丹尼斯克(Danisco)公司销售源 于霉菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的酶复合体。
[0006] 目前在全世界上，由上述两个跨国企业垄断生产并销售生物能源生产用生物质分 解酶，但由于其价格相当高且并不是根据生物质被最佳化的状态，因此具有根据情况需要 使用过剩的酶的问题（Merino and Cherry，2007，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol · 108,95， Kabel等，2006,Bioeng.Biotechnol.93,56)〇
[0007] 因此，如果利用细菌或酵母(yeast)等重组宿主系统来重组生产各个酶并将生产 出的各个重组酶进行组合而按生物质种类进行最佳化，则具有能减少酶的使用量的优点。 作为用于生产这种重组酶的宿主细胞，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙醇发酵 能力优异，普遍用作乙醇生产菌株，并且进行用于对该菌株导入纤维素分解能力的尝试和 用于生产重组纤维素分解酶的诸多研究（1^11(1等，2002，]^(^〇1^〇1.]\1〇1.8丨〇1.1^￥.，66， 506)，但由于纤维素分解酶的分泌生产率低于霉菌，因此作为重组酶大量生产的目的，应用 可能性较低。
[0008] 如此，虽然现有的酵母的生物乙醇发酵能力非常优异，但全然没有纤维素生物质 的分解能力，从而在将非粮型资源的纤维素生物质作为原料来生产生物能源时，具有不可 避免地使用高价纤维素分解酶的问题，并且为了解决该问题，进行了无数次的导入了外来 纤维素分解酶基因的重组菌株开发，但因酶的分泌生产率较低而具有生产出的酶无法有效 分解培养基内的纤维素基质的问题。由此，利用生产出的糖(sugar)来进行生物乙醇的生产 是受限制的。
[0009] 近年来，虽然具有在酿酒酵母中表达从几种霉菌中发掘到的纤维素糖化酶基因并 利用微晶纤维素(Avicel)来确认生物乙醇的生成的报告，但仍然存在分泌酶的量不够充分 且乙醇生成效率较低，需要供给外部酶的问题(M. Ilmen等,2011，Biotechnol Biofuels.4: 30,2011)〇
【发明内容】
[0010] 技术问题
[0011] 对此，本发明人为了利用酵母来大量分泌生产纤维素分解酶，利用本发明人所持 有的技术即作为酵母蛋白质定制型高分泌生产技术的TFP技术(韩国专利第10-0626753号、 第10-0798894号、第10-0975596号）来开发出能够高分泌生产各种酶的技术。即，从多个霉 菌基因中发掘出能够在酵母中进行大量分泌的纤维素分解酶蛋白质，并利用最佳的TFP进 行生产，确保了纤维素分解中所必须的酶群。作为上述纤维素分解中所必须的酶群，确保作 为半纤维素酶（hemicellulase)的TrXynII(Trichoderma reesei xylanase II，里氏木霉 木聚糖酶Π )、TrBxl(Trichoderma reesei beta-xylosidase，里氏木霉β-木糖苷酶），作为 外切葡聚糖酶(exoglucanase)的PaCel 1 (Polyporus acularius Cell，漏斗棱孔菌Cell)、 PaCel2(Polyporus acularius Cel2)、TeCBHl(Talaromyces emersonii CBH1，埃默森篮状 菌CBH1)、NfCBHl (Neosartorya fischeri CBH1，费氏新萨托菌CBH1)、HgCBHl (Humicola 区1^86&03!11，灰腐质霉03!11)、(]1:03!11(〇1&61:〇111；[111111:1161'111(^11；[11111103!11，嗜热毛壳菌 CBHl)、ClCBH2(Chrysosporium lucknowense CBH2,丝状真菌 CBH2)和 CfCexl (Cellulomonas f imi，奠碱纤维单胞菌），作为内切葡聚糖酶(endo-glucanase)的TrEGL2 (Trichoderma reesei EGL2,里氏木霉EGL2)，以及作为β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)的 改良后的5€1361^2(3&(^11&1'01115^0口813；1^13111186抑1361^2，扣囊复膜酵母1361^2)(韩国专利公 开第10-2013-0027984号），可通过人工混合各蛋白质而制造作为纤维素生物质糖化酶混合 物的KCC(KRIBB Cellulase cocktail，KRIBB纤维素酶混合物）系列，提高纤维素生物质的 糖化效率，并且可通过制造出最佳的定制型糖化酶，降低纤维素的糖化费用。此外，以如下 方式完成了本发明：通过复合使用用于分泌生产纤维素分解酶的各个重组酵母而使其应用 到生物质同步糖化生物乙醇的生产工程中，由此同时进行纤维素生物质糖化及发酵，能够 降低纤维素生物乙醇生产工程费用。
[0012] 用于解决问题的手段
[0013] 本发明的目的在于提供一种表达载体，其用于在酵母中大量生产半纤维素酶 TrXynII、TrBxl和内切葡聚糖酶TrEGL2、0-葡萄糖苷酶SfBGL2、外切葡聚糖酶PaCell、 PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、CfCexl及C1CBH2。
[0014] 本发明的又一目的在于提供一种由上述表达载体转化成的转化子。
[0015] 本发明的又一目的在于提供一种重组纤维素酶的生产方法，其包括以下步骤:培 养上述转化子，并从该培养物或培养上清液中回收半纤维素酶TrXynll、TrBxl、内切葡聚糖 酶 TrEGL2、外切葡聚糖酶 PaCel 1、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、ClCBH2、CfCexl 和β-葡萄糖苷酶SfBGL2。
[0016] 本发明的又一目的在于提供一种利用具有木聚糖(xylan)分解能力的所生产的半 纤维素酶来复合培养生产菌株的方法。
[0017] 本发明的又一目的在于将所生产的纤维素酶按适当的比率混合来提供生物质定 制型纤维素酶混合物。
[0018] 本发明的又一目的在于提供一种利用将上述转化子混合后的复合菌株的同步糖 化（SSF，simulatneous saccharification and fermentation)或耳关合生物加工（CBP， consolidated bioprocessing)生物乙醇发酵工程。
[0019] 发明的效果
[0020] 如果使用本发明所提供的纤维素酶表达载体，则能够在酿酒酵母中大量生产纤维 素酶，并且上述菌株可适用于同步糖化或联合生物加工中，从而能够广泛应用于木质纤维 生物质到生物乙醇制造等的产业工程中。
【附图说明】
[0021] 图1表示用于导入漏斗棱孔菌、埃默森篮状菌、费氏新萨托菌、灰腐质霉、嗜热毛壳 菌、丝状真菌和源于粪碱纤维单胞菌的外切纤维素酶基因、和源于里氏木霉的半纤维素酶、 内切葡聚糖酶基因的酵母TFP载体的聚合酶连锁反应(PCR)及细胞内重组过程的示意图。 [0022]图2是表示利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)对在酵母Y2805 菌株中导入TrXynII(A)、TrBxl(B)(图2&)、1'池61^2(〇、卩&〇611(0)(图213)、？&〇612^)、 TeCBHl (F)(图2c)、NfCBHl (G)、HgCBHl (H)(图2d)、CtCBHl (I)、C1CBH2( J)或CfCexl (K)(图 2e)而形成的24个转化子的培养上清液进行分析的结果的电泳照片。
[0023]图3是表示为了去除在所选的转化子中表达的TrXyηII(A)、TrBx 1 (B)、TrEGL2(C)、 C1CBH2(J)或CfCexl(K)(图3c)蛋白质的糖链，在对作为糖链去除酶的内切糖苷酶H(End〇-H)进行处理之后，利用SDS-PAGE进行分析的结果的电泳照片。
[0024]图4是表不利用MF或自身信号（861卜818仙1)来表达在所选的转化子中所表达的 TrXynll (A)和TrBxl (B)的情况和为了比较相对蛋白质表达量和活性而进行SDS-PAGE分析 和活性分析的结果。
[0025] 图5是表不在含有駿甲基纤维素 （carboxymethyl cellulose，CMC)的YP(2%yeast extract+2%peptone，2%酵母抽提物+2%蛋白胨）培养基中利用刚果红（congo-red)对 TrEGL2表达转化子进行染色，并以环的大小比较内切葡聚糖酶活性的结果。
[0026] 图 6 是表示为 了将最终选择的各个51'13-?3〇611、51'19-1'迚 61^、51'13^^〇611、5丁8-TeCBHl、ST13-NfCBHl、ST13-HgCBHl、自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2转化子与具有MF或自 身信号的转化子的相对蛋白质表达量进行比较(图6a的A，B)，并且为了将各个ST8-TeCBHl、 ST13-NfCBHl、ST13-HgCBHl、自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2的转化子与具有MF或自身信 号的转化子的相对活性进行比较而进行pNPC、pNPL和微晶纤维素活性分析的结果（图6b的 C、D)〇
[0027] 图 7 是表示 ST5 -TrXy n II(A)、ST4-TrBxl(B)、ST19 -TrEGL2 (C)、ST13-PaCell(D)(图 7a)、ST13-PaCel2(E)、ST8-TeCBH(F)、ST13-NfCBHl (G)、ST13-HgCBHl(H)(图7b)、自身信号-CtCBHl(I)、ST13-C1CBH2(J)和CfCexl(K)(图7c)基因的表达载体的示意图。
[0028] 图8是表示在5L发酵罐中对通过包含ST5-TrXynII(A)、ST4-TrBxl(B)(图8a)、 ST19-TrEGL2(C)、ST13-PaCell(D)(图8b)、ST13-PaCel2(E)、ST8-TeCBH(F)(图8c)、ST13-NfCBHl (G)、ST13-HgCBHl (Η)(图8d)、自身信号（self-signal )-CtCBHl (I)、ST13-C1CBH2 (J)、ST19-SfBGL2(K)和CfCexl(L)(图8e)基因的重组载体转化成的酿酒酵母菌株进行补料 分批发酵，并利用SDS-PAGE对按时间获取的培养基进行分析的结果的电泳照片，并且是表 示按每个时间测定细胞浓度和酶活性的结果的图表。
[0029]图9是表示将最终选择的各个ST5-TrXynII，ST4-TrBxl转化子进行复合培养时的 细胞生长及酶活性（图9a的A)与单一培养及复合培养各个转化子时的细胞生长进行比较， 并利用HPLC(高效液相色谱法)对木聚糖酶生产菌株的培养基和复合培养时的培养基内的 物质进行分析的结果(图9b的B)。
[0030] 图10是对根据碳源的重组复合菌株KCC-1和KCC-2的生长进行比较(A)，并利用 SDS-PAGE(B)对复合菌株培养后的分泌蛋白质进行分析的结果。
[0031] 图11表示为了在50°C下对复合菌株KCC-1和KCC-2进行糖化效率比较而反应144小 时，并通过HPLC分析确认所生成的葡萄糖的结果。
[0032]图12是将预处理后的稻草10%作为基质使用，并利用2FPU/g、5FPU/g和10FPU/g质 量的纤维素酶进行糖化之后，添加复合菌株KCC-2和对照菌株(Y2805Agal80/CYH)来进行 乙醇发酵的结果。
[0033]图13是将预处理后的稻草3%、5%作为基质使用，并在2??1]/^況?1]/^质量的纤维 素酶中添加复合菌株KCC-3和对照菌株(Y2805Agal80/CYH)来进行乙醇发酵的结果。
[0034]图14是将利用5L发酵罐预处理后的稻草6%作为基质使用，并在2FPU/g纤维素的 纤维素酶中添加复合菌株KCC-3(Y2805Agal80中ST19-BGL、ST19-EGL2、自身信号-CtCBHl、 ST13-C1CBH2)和对照菌株(Y2805Agal80/CYH)来进行乙醇发酵的结果。
【具体实施方式】
[0035]作为一实施方式，本发明提供重组半纤维素酶TrXynlIJrBxl和重组外切葡聚糖 TrEGL2、重组β-葡萄糖苷酶Sf BGL2。
[0036] 优选地，本发明的半纤维素酶TrXynlIJrBxl和内切葡聚糖酶TrEGL2可源于里氏 木霉(Trichoderma reesei)，外切葡聚糖酶PaCell、PaCel2可源于漏斗棱孔菌(Polyporus arcularius)，0_葡萄糖苷酶SfBGL2可源于扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera)。另外，外切葡聚糖酶HgCBHl、TeCBHl、NfCBHl、CtCBHl、ClCBH2、CfCe xl按其顺 序可源于灰腐质霉(Humicola grisea)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、费氏新 萨托菌（Neosartorya f ischeri)、嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum)、丝状真菌 (Chrysosporium lucknowense)和奠喊纤维单胞菌（Cellulomonas fimi)。
[0037] 在本发明的一实施例中，从里氏木霉（Trichoderma reesei)中以TrXynll、TrBxl、 TrEGL2序列信息为基础对基因进行增幅（实施例1)，从含有漏斗棱孔菌（Polyporus arcularius)的两种外切纤维素酶基因 Cell和Cel2的质粒pCELl及pCEL2中对外切葡聚糖酶 PaCell、PaCel2基因进行增幅，并且从灰腐质霉（Humicola grisea)、埃默森篮状菌 (Talaromyces emersonii)、费氏新萨托菌（Neosartorya fischeri)、嗜热毛壳菌 (Chaetomium thermophi lum)和丝状真菌（Chrysosporium lucknowense)中对外切葡聚糖 酶 HgCBHl、TeCBHl、NfCBHl、CtCBHl、C1CBH2 的序列信息进行密码子优化（codon optimization)并通过基因合成来确保基因（实施例1)。从KCTC 1436菌株中对源于粪碱纤 维单胞菌(Cellulomonas fimi)的CfCexl基因进行增幅(实施例1)。克隆对用序列号1、2表 示的TrXynll，用序列号3、4表示的TrBxl，用序列号5、6表示的TrEGL2,用序列号7、8表示的 PaCell，用序列号9、10表示的PaCel2,用序列号11、12表示的16〇8!11，用序列号13、14表示的 NfCBHl，用序列号15、16表示的取08!11，用序列号17、18表示的(：比8!11，用序列号19,20表示 的C1CBH2和用序列号21、22表示的CfCexl进行编码的基因（实施例2)，并且通过在酿酒酵母 中导入菌株来表达用于编码上述半纤维素酶、内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的基因，其结 果，确认到各个酶向细胞外分泌(实施例2)。
[0038] 作为又一实施方式，本发明提供一种用于表达与野生型蛋白质相比在酵母中分泌 能力增加的蛋白质表达用表达盒，上述表达盒包含对翻译融合配偶体（Translational fusion partner，TFP)进行编码的多核苷酸和选自 TrXynl I、TrBxl、TrEGL2、PaCELl、 PaCe 12、TeCBHl、Nf CBH1、HgCBHl、CtCBHl、Cl CBH2和 Cf Cex 1 的蛋白质进行编码的多核苷酸。
[0039] 在本发明的表达盒中，
[0040] i)在作为上述蛋白质选择TrXynll的情况下，上述翻译融合配偶体可选自具有序 列号为53的氨基酸序列的TFP5、具有序列号为57的氨基酸序列的TFP9、具有序列号为61的 氨基酸序列的TFP13和具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19;
[0041] ii)在作为上述蛋白质选择TrBxl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序列 号为52的氨基酸序列的TFP4;
[0042] iii)在作为上述蛋白质选择TrEGL2的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序 列号为67的氨基酸序列的TFP19;
[0043] iv)在作为上述蛋白质选择PaCELl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序 列号为61的氨基酸序列的TFP13;
[0044] v)在作为上述蛋白质选择PaCel2的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序列 号为61的氨基酸序列的TFP13;
[0045] vi)在作为上述蛋白质选择TeCBHl的情况下，上述翻译融合配偶体可选自具有序 列号为52的氨基酸序列的TFP4、具有序列号为54的氨基酸序列的TFP6、具有序列号为55的 氨基酸序列的TFP7和具有序列号为56的氨基酸序列的TFP8;
[0046] vii)在作为上述蛋白质选择NfCBHl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序 列号为61的氨基酸序列的TFP13;
[0047] viii)在作为上述蛋白质选择HgCBHl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有 序列号为61的氨基酸序列的TFP13;
[0048] ix)在作为上述蛋白质选择CtCBHl的情况下，上述翻译融合配偶体可选自具有序 列号为55的氨基酸序列的TFP7、具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19、具有序列号为47的 碱基序列的自身信号及具有序列号为48的氨基酸序列的自身信号；
[0049] X)在作为上述蛋白质选择C1CBH的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序列 号为56的氨基酸序列的TFP8或具有序列号为61的氨基酸序列的TFP13中的一者；以及
[0050] xi)在作为上述蛋白质选择CfCexl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序 列号为56的氨基酸序列的TFP8、具有序列号为59的氨基酸序列的TFP11、具有序列号为61的 氨基酸序列的TFP13或具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19中的一者。
[0051] 本发明中的术语即翻译融合配偶体是指，通过与用于编码表达率较低的蛋白质的 基因进行融合而诱导表达率较低的蛋白质的分泌生产的缩氨酸及编码该缩氨酸的基因，在 韩国专利第10-0626753号、第10-0798894号和第10-0975596号中公开了本发明中可使用的 翻译融合配偶体。
[0052] 具体来讲，可以是选自由序列号49至72组成的组中的一种翻译融合配偶体，该融 合配偶体在本发明中可以用TFP1至TFP24来表示(表3)。
[0053] 在本发明的具体实施例中，为了表达半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶，在作为具有GAL10启动子和GAL7终止子的普通酵母表达载体的、源于YEp352 的载体中，利用上述的24个TFP来对各酶的表达进行比较和分析。其结果，作为各个融合配 偶体，当在TrXynll的情况下选择TFP5、TFP9、TFP13和TFP19，在Bxl的情况下选择TFP4，在 TrEGL2的情况下选择TFP 19，在PaCe 11的情况下选择TFP 13，在PaCe 12的情况下选择TFP 13， 在TeCBHl的情况下选择TFP4、TFP6、TFP7和TFP8，在Nf CBH1的情况下选择TFP13，在HgCBHl的 情况下选择TFP13,在CtCBHl的情况下选择TFP19和自身信号缩氨酸，在C1CBH2的情况选择 TFP8和TFP13以及在CfCexl的情况下选择了??83??11、了?？13的了?？19时，确认到分泌表达了 过量的酶(实施例2、3)。反映该情况，作为各个代表融合配偶体，通过在1?(5^11的情况下选 择TFP5、在Bxl的情况下选择TFP4、在TrEGL2的情况下选择TFP19、在PaCel 1的情况下选择 TFP13、在PaCe 12的情况下选择TFP13、在TeCBHl的情况下选择TFP8、在Nf CBH1的情况下选择 TFP13、在HgCBHl的情况下选择TFP13、在CtCBHl的情况下选择自身信号缩氨酸、在C1CBH2的 情况选择TFP13以及在Cf Cex 1的情况下选择TFP13来制作出表达盒，并利用该表达盒制作出 表达载体。
[0054] 作为又一实施方式，本发明提供一种包含上述表达盒的表达载体。
[0055] 本发明中的术语即载体是指，能够运送已连接的另一核酸的核酸分子。作为载体 的一种类型的质粒是指能够使DNA块追加连接到该质粒内的环形双链DNA环。
[0056] 本发明的载体能够指示用于对以能够工作的方式连接的目标蛋白质进行编码的 基因的表达，这种载体被称作表达载体。一般来讲，在重组DNA技术的使用中，表达载体为质 粒形态。
[0057] 上述表达载体可根据宿主细胞来确定能够使用的表达载体的种类，在将酵母作为 宿主使用时，表达载体例如可使用YEpl 3载体、YCp50载体、pRS系载体和pYEX系载体等。作为 启动子，可使用例如GAL启动子和A0D启动子等。
[0058] 作为重组体DNA向酵母中的导入方法，例如可使用电穿孔法(Method Enzymol.， 194,182-187( 1990))、原生质体法（Proc.Natl .Acad. Sci.USA,84,1929-1933( 1978))和乙 酸锂法（J.Bacteriol. ,153,163-168( 1983))等。
[0059] 此外，上述表达载体中还可以包含具有用于抑制、增幅或诱导目标基因表达的各 种功能的表达抑制用片段、用于选择转化子的标记或关于抗生素的耐性基因、对以向菌体 外分泌为目的的信号进行编码的基因和适合难表达型蛋白质的定制型融合配偶体等。特别 是，作为适合上述难表达型蛋白质的定制型融合配偶体，优选使用翻译融合配偶体 (translational fusion partner:TFP)〇
[0060] 作为又 一实施方式，本发明提供一种将本发明的表达载体导入到宿主细胞中而形 成的转化子。
[0061] 本发明中的术语即"转化"是指通过将DNA导入到宿主细胞中并利用染色体之外的 因子或通过完成染色体合并而能够使DNA复制。
[0062] 在根据本发明的转化中所使用的宿主细胞可使用本技术领域中广为人知的任一 种宿主细胞，可使用本发明的半纤维素酶、纤维素酶和葡萄糖苷酶基因的导入效率和表 达效率较高的宿主，例如可包括细菌、霉菌、酵母、植物或动物（例如，哺乳动物或昆虫）细 胞。
[0063]优选地，上述宿主细胞可使用具有乙醇发酵能力的细胞，更优选地，具有上述乙醇 发酵能力的细胞可以是单胞发酵菌属、酵母和杆菌。进一步更优选地，具有上述乙醇发酵能 力的细胞可以是Y2805(Mat a ρ印4::HIS3 prbl canl his3-200 ura3-52)菌株。
[0064] 上述酵母包含但不特别限定于此：念珠菌（Candida )、德巴利氏酵母属 (Debaryomyces)、汉逊酵母菌(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属 (卩；[(311丨&)、裂殖酵母属（3(311丨208&(^11&1'01115^6 8)、亚罗酵母属（￥&1'1'0￥丨&)、酵母菌属 (Saccharomyces)、复膜抱酵母属（Saccharomycopsis)、许旺酵母属（Schwanniomyces)和 Arxula种，更优选地使用产肮假丝酵母（Candida utilis)、博伊丁假丝酵母（Candida boidinii)、白念珠菌(Candida albicans)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、毕 赤酵母（Pichia pastoris)、树干毕赤酵母（Pichia stipitis)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、扣囊复膜酵母 (Saccharomycopsis f iburigera)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)、西方许旺酉孝母（Schwanniomyces occidental is)和Arxula adeninivorans等，最优选地，可使用马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces maxianus)、酿酒 酉孝母（Saccharomyces cerevisiae)和扣囊复膜酉孝母（Saccharomycopsis fiburigera) 0
[0065] 在本发明的一实施例中确认出，在使用包含本发明的对半纤维素酶、内切葡聚糖 酶和外切葡聚糖酶进行编码的多核苷酸的表达载体，将酿酒酵母转化为Y2805(Mat a pep4::HIS3 prbl canl his3_200 ura3_52)菌株之后，从上述转化子中生产出各酶(实施 例2)。
[0066] 作为又一实施方式，本发明提供一种半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或 葡萄糖苷酶的生产方法，其包括用于培养上述转化子的步骤。优选地，提供一种半纤维素 酶、内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法，其包括用于培养上述转化子的步骤。
[0067] 可根据宿主细胞适当选择并利用用于培养本发明的转化子的培养基和培养条件。 营养培养基优选包含宿主细胞的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，举例说 明了葡萄糖、右旋糖酐、可溶性淀粉、蔗糖和甲醇等。作为无机氮源或有机氮源，举例说明了 铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米衆(corn steep liquer)、蛋白胨、酪蛋白、牛提取物、豆柏 和土豆提取物等。根据需要，可包含其它营养素，例如可包含氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钠、 氯化镁等无机盐、维生素类和抗生素（四环素、新霉素、氨苄西林和卡那霉素)等。培养时，可 适当调节温度、培养基的PH和培养时间等，以便适合细胞生长和蛋白质的大量生产。
[0068]本发明的一实施例在30YPDG( 1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，1 %葡萄糖，1 %半乳糖） 条件下培养了上述转化子。上述转化子的蛋白质确认通过使用SDS-PAGE(Sodium Dodesys Sulfate Polyacryl Amide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳） 方法来进行（图2)。
[0069] 回收上述半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的步骤可根 据通常的生化分离技术或通过使用针对蛋白质的一部分或另一部分的抗体的免疫亲和方 法来进行分离并提纯。作为另一方法，通过在蛋白质序列中添加标签(tag)，针对抗体或这 种标签，根据利用具有适当高亲和性的其它物质的亲和方法来进行提纯。作为通常的生化 分离技术，具有通过蛋白质沉淀剂进行的处理(盐析法）、离心分离、超声波破碎、超滤、透析 法、分子筛色谱法(凝胶过滤）、吸附色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法等的各种色谱法 等，通常可通过将这些组合使用来分离出纯度较高的蛋白质。
[0070] 作为又一实施方式，本发明提供一种生物乙醇的生产方法，其包括以下步骤:培养 上述转化而成的转化子；以及从通过上述步骤获取的培养物或培养上清液中回收生物乙 醇。在本发明中，培养转化子的步骤和如上所说明的步骤相同。
[0071] 本发明中的术语即"生物乙醇"是指将生物质内的碳水化合物转换为葡萄糖 (glucose)之后，通过发酵获取的乙醇。与化石燃料不同，生物乙醇完全没有环境污染物质， 并从植物中获取燃料，因此为可再生能源。作为车辆等的燃料添加剂，与生物柴油一同很早 之前就得到了广泛的使用，目前还在持续进行关于大量生产的研究。
[0072] 本发明中的回收生物乙醇的步骤可使用本领域中广泛使用的任意方法。例如，可 使用蒸馏等方法。
[0073] 作为又一实施方式，本发明提供一种包含两种以上的上述转化子的复合菌株。上 述两种以上是指包含两种以上具有对各个不同蛋白质进行编码的表达载体的转化子。 [0074]特别是，上述复合菌株可包含分泌半纤维素酶的一个以上的菌株。上述半纤维素 酶可以是内切木聚糖酶和木糖苷酶。特别是，内切木聚糖酶可以是TrXyηII，β-木糖苷酶 可以是TrBxl。本发明的复合菌株可以是具有木聚糖分解能力的菌株。
[0075] 在本发明的一实施例中，为了确认在复合培养用于生产内切木聚糖酶和β-木糖苷 酶的酵母菌株时，是否可将木聚糖(xylan)作为碳源使用，复合培养了用于表达TrXynll的 菌株和用于表达TrBxl的菌株这两种菌株。其结果，确认出可通过由两种菌株的复合培养生 产出的两种酶的阶段性作用，来从木聚糖中确保木糖(实施例5)。
[0076] 作为又一实施方式，本发明提供一种包含β-葡萄糖苷酶和回收的内切葡聚糖酶及 外切葡聚糖酶的纤维素酶混合物(KCC)。特别是，上述内切葡聚糖酶可以是内切纤维素酶， 上述外切葡聚糖酶可以是外切纤维素酶。
[0077] 此外，上述β-葡萄糖苷酶可以是具有序列号为74的氨基酸序列的酶。特别是，可以 是具有由序列号为73的碱基序列进行编码的氨基酸序列的酶。
[0078] 在本发明的一具体实施例中，本发明人利用本发明所开发出的外切纤维素酶分泌 生产酵母而将外切纤维素酶进行发酵浓缩之后，将纤维素基质作为碳源使用，并对各基质 的分解能力进行了比较。用于活性改良的所有纤维素酶混合物通过将外切纤维素酶类型1 (CBH1)、外切纤维素酶类型2(CBH2)、内切纤维素酶(EGL)和β-葡萄糖苷酶(BGL)的比率固定 为3.5 : 3.5 : 2 :1而用于分析中，混合物中所使用的EGL为ST19-TrEGL2酶，BGL使用ST19-SfBGL2酶。在EGL、BGL中按上述比率混合非水溶性纤维素条件下活性良好的ST13-PaCell和 ST13-PaCel2,并命名为 KCC-1，在 EGL、BGL 中按上述比率混合 ST13-HgCBHl 和 ST13-C1CBH2， 并命名为KCC-2,在EGL，BGL中按上述比率混合自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2,并命名为 KCC-3,在EGL、BGL中按上述比率混合ST13-CfCexl和ST13-C1CBH2,并命名为KCC-4,由此制 造出纤维素酶混合物。
[0079] 根据本发明，提供通过复合培养通过表达载体转换成的酵母转化子来应用于同时 糖化或联合生物加工的方法。
[0080] 作为又一实施方式，本发明提供一种包含上述半纤维素酶的纤维素酶混合物。上 述混合物可包含内切木聚糖酶和β-木糖苷酶，特别是，上述内切木聚糖酶可以是TrXynll蛋 白质，上述β -木糖苷酶可以是TrBxl。
[0081] 作为又一实施方式，本发明提供一种利用本发明的纤维素酶混合物来对生物质进 行糖化的方法。本发明中的生物质可以是纤维素，并且还可以是木聚糖。
[0082] 在本发明的一具体实施例中，确认出能够利用包含上述β-葡萄糖苷酶和回收的内 切葡聚糖酶及外切葡聚糖酶的纤维素酶混合物来对纤维素进行糖化(实施例6)。
[0083] 作为又一实施方式，本发明提供一种通过复合培养本发明的菌株而应用于同时糖 化或联合生物加工的方法。
[0084] 在本发明的一具体实施例中，确认出可利用四种重组纤维素酶分泌生产酵母菌株 复合体KCC-1和KCC-2来用作能够从生物质中直接生产生物乙醇的复合菌株(实施例7)，并 且确认出在将KCC3复合菌株应用于乙醇生产的情况下，能够利用最小量的商用纤维素酶并 通过同时糖化工程来从生物质中生产出乙醇(实施例8)。
[0085] 本发明涉及一种利用重组生产出的半纤维素酶和纤维素酶来制造纤维素糖化酶 混合物，并有效利用用于生产各酶的重组酵母复合菌株来进行同时糖化的方法，具体来讲， 本发明的内容如下：作为上述半纤维素酶利用TrXynll和TrBxl，作为外切葡聚糖酶利用 PaCel 1、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、C1CBH2和CfCexl，作为内切葡聚糖酶利用 TrEGL2，并且作为β-葡萄糖苷酶利用改良后的Sf BGL2，来分别进行重组分泌生产，并人工混 合分泌出的各蛋白质而制造出纤维素生物质定制型糖化酶混合物，从而提高纤维素生物质 的糖化效率并制造出最佳的糖化酶，因此可降低纤维素糖化费用。此外，将分泌生产纤维素 分解酶的上述重组酵母菌株作为复合菌株使用并应用到生物质同时糖化生物乙醇生产工 程中，从而提高生物质糖化及发酵效率并降低生物乙醇生产工程费用。
[0086] 下面，通过实施例对本发明更详细说明。但是，这些实施例用于示意性地说明本发 明，因此本发明的范围并不限定于这些实施例。
[0087] 实施例1:使用菌株及实验材料
[0088] 确保基于酵母的半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶基因
[0089] 为了有效利用源于里氏木霉（Trichoderma reesei )的内切木聚糖酶（endo-xylanase)TrXynII (序列号1、2)、β_木糖苷酶(beta-xylosidas e)TrBxl (序列号3、4)和内 切葡聚糖酶(611(1〇-8111〇3仙86)1'也61^2(序列号5、6)基因，利用了美国国家生物技术信息中 心(NCBI)的碱基序列信息。关于里氏木霉，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，Difco)内在25°C下将由生物资源中心分配的菌株(KCTC 6968)培养5天，并在仅过滤 及回收完成培养的霉菌菌丝体之后，使用T.H.Al-Samarrai霉菌基因组DNA提取方法 (T.H.Al-Sammarrai等，2000，Letters in Applied Microbiology，30,53_56)〇
[0090]为了克隆TrXyn 11基因，以提取后的基因组DNA样品1为模板，使用上游引物Trxyn_ F(序列号23)和下游引物TrXyn_R(序列号24)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次； 94°C30秒、55°C30秒及72°C3分钟25次;在72°C下7分钟1次），并且为了克隆TrBxl基因，以提 取后的基因组DNA样品1为模板，使用上游引物Trbxl_F(序列号25)和下游引物Trbxl_R(序 列号26)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒、55°C30秒及72°C30秒25次； 在72°C下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳回收约2.4kb、约600bp的切片。
[0091 ]为了克隆!'也61^2基因，在将1%駿甲基纤维素（〇&1'13(?5〇1161:1171〇611111〇86,0\^)添 加到YM(Difco,培养基）中而成的培养基内以150rpm在25°C下将分配的里氏木霉菌株培养3 天，并在仅过滤及回收完成培养的霉菌菌丝体之后，使用总RNA提取试剂盒(RNeasy Plant Mini kit，Qiagen)来分离出总RNA。使用mRNA提纯试剂盒（Oligotex mRNA Mini Kit， Qiagen)从分离出的总RNA中分离出多聚腺苷酸化的mRNA。在上述分离出的mRNA中，使用 SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)并通过RACE法对cDNA进行增幅 。以合成后的 cDNA样品1为模板，使用上游引物TrEGL2_F(序列号27)和下游引物TrEGL2_R(序列号28)来 进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒、55°C30秒及72°C1分30秒25次;在72°C 下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳回收约1200bp的切片。将聚合酶连锁反应产物克隆到 pGEM-T Easy vector(Promega)上并对碱基序列进行分析，其结果，确认出TrXynll和 TrBxl、TrEGL2基因序列（各个序列号为1、3、5)。
[0092] [表1]
[0093]
LUU?M」 为J利用NCB1顺基序列信思釆应用源t漏斗稷扎菌（Polyporus arcularius)的 PaCell(序列号7、8)和PaCel2(序列号9、10)基因，以lμL载体pCELl及pCEL2为模板，分别使 用上游/下游引物Cell_F(序列号29)/Cell_R(序列号30)、Cel2_F(序列号31)/Cel2_R(序列 号32)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒、55°C30秒、72°C 1分30秒、72°C 1分30秒反应为25次;在72°C下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳确保分别为约1.3kb、约 1.3kb的切片。
[0095] 为了应用作为源于霉菌埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、费氏新萨托菌 (Neosartorya fi scher i )、灰腐质霉（Humi cola gr i sea)、嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum)的各 CBH1 的 TeCBHl(序列号11、12)、财08!11(序列号13、14)、取08!11(序列号 15、16)、CtCBHl (序列号 17、18)和作为源于丝状真菌（Chrysosporium lucknowense)的CBH2 的C1CBH2(序列号19、20)基因，使用NCBI的碱基序列信息。关于各五种类的外切葡聚糖酶基 因，由柏业(Bioneer)公司通过酵母的密码子优化过程而人工合成。以包含在pGEM-T Easy 载体中的各TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、C1CBH2合成基因样品为模板，使用各个上游/ 下游引物CR244(序列号33)/CR246(序列号34)、CR247(序列号35)/CR249(序列号36)、CR250 (序列号37)/CR252(序列号38)、CR253(序列号39)/CR255(序列号40)、CR256(序列号41)/ CR258(序列号42)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒、55°C30秒、72°C1 分30秒、及72°C1分钟反应为25次;在72°C下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳确保分别为 约1.3kb、约1.5kb、约1.5kb、约1.5kb、约1.4kb的切片。为了应用作为源于奠碱纤维单胞菌 (Cellulomonas fimi)的CBH1的CfCexl(序列号21、22)基因，以NCBI碱基序列为基础且以 KCTC1436菌株的基因组DNA(gen〇mic DNA)为模板，使用上游/下游引物CR158(序列号43)/ CR159(序列号44)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒钟、55°C30秒钟、72 °C1分30秒及7211分钟反应为25次；在72°C下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳确保约 1.3kb的切片。
[0096] 源于扣囊复膜酵母(58(^1^1'〇1115^(^8丨8；1^13111丨86抑)的0-葡萄糖苷酶直接表达并 使用通过对现有基因进行改良而导入到Y2805Agal80菌株中的ST19-SfBGL2(韩国专利公 开:第10-2013-0027984 号）菌株。
[0097] [表 2]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101] 实施例2:通过导入翻译融合配偶体(TFP)进行的半纤维素酶、内切葡聚糖酶和外 切葡聚糖酶的分泌生产
[0102] 为了在酿酒酵母菌株中表达由实施例1确保的两种半纤维素酶、一种内切葡聚糖 酶和七种外切葡聚糖酶基因，从各个基因利用引物LNK39(序列号45)和GT50R(序列号46)增 幅之后，通过体内重组（in vivo recombination)将协助蛋白质分泌表达的24种蛋白质分 泌融合配偶体（韩国专利第10-0975596号，TFP1至TFP24)载体导入到Y2805(Mat a pep4:: HIS3 prbl canl his3-200 ura3-52)菌株中。TFP1 至TFP24的序列如下表3所示。
[0103] [表 3]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107] 由于利用LNK39(序列号45)和GT50R(序列号46)引物增幅的聚合酶连锁反应产物 包含与40base以上的载体相同的序列，因此若与线性化的载体一同导入到酵母细胞中，则 在细胞内发生交叉而生成圆形质粒载体（图1)。各个转化子从没有尿嘧啶的选择培养基 (0.67 %缺乏氨基酸的酵母基质，0.77 %缺乏尿嘧啶的营养补充物，2 %葡萄糖）中被筛选 出，并在YPDG(1 %酵母提取物、2 %蛋白胨、1 %葡萄糖、1 %半乳糖)培养基中培养40小时，然 后，用0.4ml丙酮使上清液0.6ml沉淀2小时之后进行SDS-PAGE分析，一次筛选出内切木聚糖 酶、β-木糖苷酶，内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶分泌量较多的菌株(图2a至图2e)。
[0108] 从结果可知，在含有各个载体的菌体的培养上清液中观察到蛋白质大小彼此不同 的强带状物。但是，在SDS-PAGE上显示的带状物与从TrXynII、TrBxl、TrEGL2、PaCELl、 PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、C1CBH2 和 CfCexl 基因的大小类推出的蛋白质大小 相比具有相当大的差异，这被推定为，由于在这些蛋白质序列上按上述顺序分别包含十个、 两个，一个、一个、两个、两个、一个、一个、三个、一个、四个N-糖基化诱发序列，因此上述差 异为因附加糖链而导致的差异。在24个转化子中，分别选择出被推定为半纤维素酶、内切葡 聚糖酶和外切葡聚糖酶蛋白质的大小的、带状物表达较高的转化子，并为了去除所选的转 化子通过N-糖基化而附加到蛋白质上的糖，对各蛋白质进行Endo-H酶处理，之后，重新进行 SDS-PAGE (图3a至图3c)分析。如所预想那样，可知在Endo-H处理之后被确认为正常大小的 分子量，由此确认出所表达的蛋白质被N-糖基化。
[0109] 实施例3:通过酿酒酵母菌株中的分泌表达进行的半纤维素酶、内切葡聚糖酶和外 切葡聚糖的活性确认
[0110] 为了确认从各转化子分泌出的蛋白质活性，利用了如下所述的按各蛋白质的活性 分析法。
[0111] 3-1.确认分泌出的TrXynll蛋白质的内切木聚糖酶活性
[0112] 为了确认分泌出的TrXynll蛋白质的活性，使用DNS(dinitirosali cylic acid， 二硝基水杨酸)定量法(Miller，G.L.，Anal.Chem，55:952-959，1959)。在100μΙ酶溶液中加 入1〇〇μ1基质溶液(包含1%燕麦木聚糖(opt spelt xylan)的100mM磷酸钾溶液、ρΗ5·0)，在 60°C下反应30分钟之后，添加700μ1 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid，3,5-二硝基水杨 酸)溶液，并在l〇〇°C下处理5分钟，然后，用冷水冷却后在540nm吸光度下进行测量。分析内 切木聚糖酶活性的结果(表4)，通过TFP5表达的TrXynH酶的活性为74.61单位/ml，显示出 最高的活性。酶的1单位(uni t，U)被设定为1分钟内释放出Ιμπιο 1还原糖的酶的量。
[0113] [表 4]
[0114]
[0115] 3-2.确认分泌出的TrBxl蛋白质的β-木糖苷酶活性
[0116]为了确认分泌出的TrBxl蛋白质的活性，并且为了确认分泌出的蛋白质的活性，将 0. lmL酶溶液与0.9ml基质溶液（100mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)、ImM的P-硝基苯基-β-D-吡 喃木糖苷化 _附1：1'(^1161171-0-〇-?(71(^7抑11〇81(16$即乂）一同在50°C下反应10分钟。添加与 反应溶液相等的量的0.4M碳酸钠并停止反应，在405nm下测定吸光度，其结果（表5)，通过 TFP4表达的TrBxl酶的活性为25.38单位/ml，且为最高。此时，关于酶活性，将1分钟内能够 生成1M的P-硝基苯基(p-Nitrophenol)的酶量设定为1单位(unit，U)。
[0117] [表 5]
[0118]
[0119]通过将蛋白质表达率和根据该表达率的活性相比较，从而最终选择各转化子在各 融合配偶体的控制下蛋白质表达率和活性最高的酿酒酵母菌株ST5-TrXynII和ST4-TrBxl， 并且为了比较具有MF或自身信号的转化子的相对蛋白质表达量和活性，对各转化子进行 SDS-PAGE分析和活性分析(图4)。
[0120] 3-3.确认分泌出的TrEGL2蛋白质的内切葡聚糖酶活性
[0121]为了确认分泌出的内切葡聚糖酶TrEGL2蛋白质的活性，在包含2%羧甲基纤维素 (carboxymethyl cellulose，CMC)的YP(2%酵母抽提物+2%蛋白胨)培养基内在30°C下将 转化后的细胞培养3天，并用0.1 %刚果红(congo-red)对培养板进行染色一小时之后，用1M 氯化钠(NaCl)清洗数次，然后，通过细胞周边的环大小来确认内切葡聚糖酶在转化后的细 胞中的活性（图5)，并且为了进行定量确认，使用了利用DNS(3,5-二硝基水杨酸）的比色法。 在组合100mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)和1 % CMC150ul的反应液中添加50ul培养上层稀释液 之后，在45°C下反应30分钟，加入700ul DNS并煮沸10分钟后进行冷却，并在550nm下测量吸 光度来进行比色分析，其结果如表6所示。由于TFP13-TrEGL2在反应0小时时的还原糖数值 高于反应后的还原糖数值而无法测定活性，TFP19-TrEGL2以0.38单位/ml显示出最高的活 性。此时，关于酶活性，将1分钟内能够生成lg还原糖的酶量设定为1单位(unit，U)。
[0122] 通过将蛋白质表达率和根据该表达率的活性相比较，从而最终选择各转化子在各 融合配偶体的控制下蛋白质表达率和活性最高的酿酒酵母菌株ST19-IYEGL2,并且关于各 转化子，对具有MF或自身信号的转化子的相对蛋白质表达量进行了比较(图6a的A)。
[0123] [表 6]
[0124]
[0125] 3-4.确认分泌出的PaCe 11和PaCe 12蛋白质的外切葡聚糖酶活性
[0126] 为了确认分泌出的P a C e 11和P a C e 12外切葡聚糖酶蛋白质的活性，将转化子在 3YPDG中培养40小时之后，将培养上清液用于活性确认中。在50mM乙酸缓冲溶液(pH5.0)中， 添加以〇.511^/1111将111^/1111的口即〇(口-附1：1'(^1161171^36七&-〇611〇13；[081(16 4-硝基苯基-0-纤 维二糖苷)和δ-葡萄糖酸内酯(D-Glucono-1，5-delta-lactone，D-葡萄糖酸-1，5-δ-内酯） 融化的900ul反应液和100ul培养上层稀释液，并在50°C下反应30分钟。添加与反应溶液相 等的量的2%碳酸钠，并在410nm下测定吸光度，其结果确认出，PaCell对pNPCdp没有活性， 仅在TFP13-PaCel2的情况下显示出1.7单位/ml的较弱的活性(表7)。此时，对照组为未转化 的酿酒酵母菌株Y2805。此时，关于酶活性，将1分钟内能够生成1M硝基酚的酶量设定为1单 位(unit，U)0
[0127] 通过将蛋白质表达率和根据该表达率的活性相比较，从而最终选择各转化子在各 融合配偶体的控制下蛋白质表达率和活性最高的酿酒酵母菌株ST13-PaCell和ST13-PaCel2,并且关于各转化子，对具有MF或自身信号的转化子的相对蛋白质表达量进行了比 较(图6a的A)。
[0128] [表 7]
[0129]
[0130] 3-5.外切葡聚糖酶活性分析
[0131 ]为了分析剩余6种外切葡聚糖酶的活性，将0.1ml酶溶液与0.9ml基质溶液(50mM醋 酸钠缓冲液（pH 5.0))和lmg/ml作为水溶性基质的P-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（？_ NitrophenylH-Cellobioside ;pNPC) -同在50°C下反应10分钟，添加与反应溶液相等的 量的2%碳酸钠并停止反应，在410下测定吸光度。另外，利用上述相同的方法也对作为其它 人工合成基质的口 _硝基苯基_0_〇-乳酸二糖苷化-附1：1'(^1161171-0-〇-13(31：〇13；[08丨(16)(。即1^) 进行活性测定，其结果，确认出STFP13-CfCexl的pNPC和pNPL分别为2076.7单位/ml、210单 位/ml，显示出最高的活性，其余外切纤 维素酶均显示出40单位/ml以下的微小的活性(表 8)。此时关于酶活性，将1分钟内能够生成ΙμΜ的硝基酚的酶量设定为1单位(unit，U)。
[0132] [表 8]
[0133]
[0134] 此外，为了利用作为非水溶性基质的微晶纤维素(Avicel)来对分泌出的外切纤维 素酶的活性进行分析，将500yL酶溶液与500yL基质溶液（2%微晶纤维素 pH-105纤维素、 0.04%叠氮化钠、0.3yL诺维信脂肪酶-188(0.3yL Novozyme-188)、50mM醋酸钠缓冲液 (pH5 · 0)-同在35°C、lOOOrpm下反应48小时之后，利用DNS(3，5-二硝基水杨酸）在540nm下 对分解后的糖量测定吸光度。分析微晶纤维素活性的结果(表9)，在48小时后C1CBH2为66.3 单位/ml，显示出最高的活性，在外切葡聚糖酶1类型中，HgCBHl为27单位/ml，显示出较高的 活性。水溶性基质的分解活性最高的CfCexl为1.35单位/ml，显示出最低的活性。
[0135] [表 9]
[0136]
[0137]
[0138] 通过将蛋白质表达率和根据该表达率的活性相比较，最终选择各转化子在各融合 配偶体的控制下蛋白质表达率和活性最高的五种酿酒酵母菌株（3了8-1'"8!11、31'13-NfCBHl、ST13-HgCBHl、自身信号序列-CtCBHl、ST13-C1CBH2)，并且关于各转化子，为了对具 有MF或自身信号的转化子的相对蛋白质表达量进行比较，进行SDS-PAGE(图6a的B)分析，并 且为了比较相对活性，通过将pNPC、pNPL和微晶纤维素作为基质使用来进行活性分析（图6b 的C、D)。其结果，在CtCBHl利用自身信号的情况下，显示出与TFP相比高2.5倍的活性。在剩 余四种外切纤维素酶均利用TFP技术的情况下确认出较高的分泌表达率。
[0139] 图7a至图7c是表示与各TFP融合的各半纤维素酶、内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶 基因的表达载体的示意图。在利用GAL10启动子来诱导蛋白质表达时，含有重组生产菌株的 表达载体需要高价的半乳糖，但若使用作为缺乏gal80基因的菌株Y2805Agal80，则仅通过 葡萄糖也能实现GAL10启动子的表达诱导。通过体内重组（in vivo recombination)将最终 选择的七种纤维素酶基因导入到Y2805Agal80(Mat a pep4: :HIS3gal80: :Tcl90、prbl canl his3-200 ura3-52)菌株中，并作为大量生产菌株来使用。
[0140] 实施例4:纤维素酶基因的大量生产
[0141 ]为了使用导入上述Y2805Agal80中的ST5-TrXynII、ST4-TrBxl、ST19-TrEGL2、 ST 13-PaCe 11、ST 13-PaCe 12、ST8-TeCBHl、ST 13-NfCBHl、ST 13-HgCBHl、自身信号-CtCBHl、 ST13-ClCBH2、ST13-CfCexl 生产菌株和 ST19-SfBGL2(韩国专利公开：第 10-2013-0027984 号），来大量生产各个半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶，在5L发酵 罐中进行加料分批培养。在进入该培养之前，在50mLYNB(0.67 %缺乏氨基酸的酵母基质、 〇. 5 %酪蛋白氨基酸及2 %葡萄糖)培养基中进行初期培养之后，再次在200mL的YEH)液体培 养基中进行培养而使其活性化，接种到该培养液中并在30°C下培养48小时。
[0142] 图8a至图8f是表示在5L发酵罐中对通过包含ST5-TrXynII、ST4-TrBxl (图8a)、 51'19-1'迚61^2、51'13-卩&〇611(图813)、51'13-?&〇612、5丁8-丁6〇8!11(图8。）、51'13-财〇8!11、51'13-HgCBHl (图 8d)、selfsignal-CtCBHl、ST13-ClCBH2(图 86)、51'19-5邙61^2、51'13-〇代6叉1(图 8f)的重组载体而转化成的酿酒酵母Y2805Agal80菌株进行补料分批发酵，并利用SDS-PAGE对按时间提取的每个10ul培养基进行分析的结果的电泳照片，和按每个时间测定出细 胞光学浓度或酶活性的结果的图表。外切葡聚糖酶的分泌量根据酶的种类有所差异，但确 认出以l-2g/L的标准进行分泌生产。关于发酵生产出的各个纤维素酶，通过浓缩和脱盐过 程而分析各个酶活性并进行冷冻保管，从而半纤维素酶应用在复合菌株培养实验中，剩余 纤维素酶在制作混合物之后应用在活性测定实验中。
[0143] 实施例5:重组半纤维素酶的复合菌株培养及木聚糖分解能力
[0144] 为了确认在复合培养用于生产内切木聚糖酶和β-木糖苷酶的酵母菌株时是否可 将木聚糖(xylan)作为碳源使用，复合培养了两种菌株的。关于复合培养，在3mL的最小培养 基(0.67 %缺乏氨基酸的酵母基质、0.5 %酪蛋白氨基酸、2 %葡萄糖）中进行初期培养之后， 接种到含有50mL的1%木聚糖的YPD培养基中，并在30°C下培养48小时后，按时间测定菌体 量及酶活性。内切木聚糖酶活性使用DNS定量法，β-木糖苷酶活性使用p-硝基苯基-β-D-吡 喃木糖苷(口-附1：1'〇口1161171-0-〇-?71〇口5^311〇81(16，口即乂）。如图93的4可知，确认出在复合培 养两种菌株的情况下也分泌生产出各个酶，并且确认出内切木聚糖酶和β-木糖苷酶在培养 48小时之时显示出130单位/mL和100单位/mL的酶活性。
[0145] 为了确认重组菌株的木聚糖分解能力，在YPD(酵母抽提物1%、蛋白胨2%、葡萄糖 2 % )培养基中添加2 %木聚糖，并对各菌株进行另行或复合培养，来分析木聚糖在培养基内 的分解图案（图9b的B)。木聚糖的分解图案通过按时间提取样品并利用HPLC(Agilent， RIDetector，安捷伦科技公司，示差折光检测器)来进行分析。HPLC固体相使用HPX-87H糖分 析柱(column) (Biorad)，并在糖分析柱的温度为65°C、流量(flow rate)为0.6mL、RID温度 为55°C的条件下进行分析。在培养了木聚糖酶生产酵母(TrXYL)的培养基中仅生成木二糖 (xylobiose)和木三糖(xylotriose)，与此相反，在进行复合培养的培养基(TrXYL+TrBXL) 中因生成的内切木聚糖酶而从木聚糖中生成低聚木糖(171〇-〇118〇830(：1^1^(16)，并且生成 的木二糖不再进一步分解(图9b的B)。此时，确认出未分解的木二糖和低聚木糖通过β-木糖 苷酶被转换为木糖而木糖、木二糖和木三糖均生成，在培养了木糖苷酶生产菌株的培养 基中木聚糖几乎未分解（图9b的Β)。因此，通过HPLC分析确认出，由于木聚糖被这两种酶分 解而生成总计2.7g/L木糖和0.9g/L木二糖、0.3 g//L木三糖等。因此，确认出，为了将木聚糖 作为单一碳源使用，可利用通过两种菌株的复合培养而生成的两种酶的阶段性作用，来从 木聚糖中确保木糖。
[0146] 实施例6:生物质糖化混合物的制造及活性改良
[0147] 通过利用本发明所开发出的外切纤维素酶分泌生产酵母而将外切纤维素酶发酵 浓缩之后，将纤维素基质作为碳源使用，并对各基质的分解能力进行了比较。用于活性改良 的所有纤维素酶混合物通过将外切纤维素酶类型1(CBH1)、外切纤维素酶类型2(CBH2)、内 切纤维素酶(EGL)和β-葡萄糖苷酶(BGL)的比率固定为3.5:3.5:2:1而利用于分析中，混合 物中所使用的EGL为ST19-TrEGL2酶，BGL使用ST19-SfBGL2(韩国专利公开第10-2013-0027984 号）酶。
[0148] 此外，为了使酶提纯费用最少化，混合物制造中所使用的酶以如下方式来使用:从 发酵培养基中回收通过发酵培养生产出的四种纤维素分解酶，并进行脱盐及10倍浓缩之 后，将各个酶不经过提纯过程而直接添加到混合物组成中。在EGL、BGL中按上述比率混合非 水溶性纤维素条件下活性良好的ST13-PaCell和ST13-PaCel2,并命名为KCC-1，在EGL、BGL 中按上述比率混合ST13-HgCBHl和ST13-C1CBH2,并命名为KCC-2,在EGL、BGL中按上述比率 混合自身信号（self signal)-CtCBHl和ST13-C1CBH2,并命名为KCC-3,由此与作为商业化 酶的、在纤维素酶（Celluclast)中添加0.5%诺维信脂肪酶188(0.5%~〇￥〇271116 188) (Sigma)的而形成的混合物进行了活性比较。
[0149] 通过将作为非水溶性纤维素的滤纸（filter paper)用作基质的活性测量方法 (B.Adney等，1996)对各混合物的活性进行了比较，在滤纸活性测量方法中用FPU表示每小 时糖化滤纸基质4%时所需的酶活性。下表10为，用每克蛋白质中的FPU来表示通过用于分 解纤维素的四种主要酶而制作混合物并对滤纸进行分解的活性的结果，并且为将预处理后 的EFB (empty frui t bunch，空果串）作为基质来对混合物的相对活性进行比较的结果。
[0150] [表 10]
[0151]
[0152] 确认出，当添加 HgCBHl和C1CBH2(KCC_2)或CtCBHl和C1CBH2(KCC_3)时，与原有版 本的KCC-1混合物(源于漏斗棱孔菌(Polyporus arcularius)的CBH1和CBH2)相比活性有所 改善。关于滤纸活性，确认出，KCC-3相对于KCC-1改善为8.8倍，KCC-3相对于KCC-2改善为 2.65倍，在如￥〇271116公司的纤维素酶(061111(31 &8〇中添加0.5%诺维信脂肪酶188(0.5% N〇V〇zymel88)(BGL)的情况的活性为KCC-3的2.62倍，1(0：-3的活性比之前小幅提升。
[0153] 关于预处理后的EFB活性，确认出，KCC-3与KCC-1相比改善为约2.2倍，与KCC-2相 比改善为约1.5倍，与在纤维素酶（Cel luclast)中添加0.5 %诺维信脂肪酶188(0.5 % Novozyme 188)的样品相比活性改善为约2.7倍。
[0154] CBH1类型中微晶纤维素(Avicel)基质的分解能力较低，但使用在水溶性基质中活 性最高的ST13-CfCexl发酵浓缩液，在EGL，BGL和ST13-C1CBH2中按上述比例混合来命名为 KCC-4,并以预处理后的生物质EFB为对象进行活性分析。其结果，确认出，KCC-4与KCC-3相 比活性改善为130% (表11)，并且由于这种效果被认为，追加添加到KCC-4中的酶ST13-CfCexl不仅具有外切纤维素酶活性而且还具有作为半纤维素分解酶的内切木聚糖酶 (endo-xylanase)活性，因此被预测为在预处理生物质中具有高于KCC-3的活性是与木聚糖 酶(xylanase)活性有关联的。
[0155] [表 11]
[0156]
[0157] 为了确认这种效果，将利用酵母而重组大量生产的ST5-TrXynII和ST4-TrBxl添加 到各个酶混合物中并以用氢氧化钠(NaOH)预处理后的稻草为对象进行活性比较，其结果， 与在KCC-3中添加 ST4-TrBxl的情况相比，添加 ST5-TrXynII时的活性被改进为约600%，在 已含有木聚糖酶活性的KCC-4中添加 ST5-TrXynII和ST4-TrBxl的情况下，活性改善停留在 约130% (表12)。因此，被推测为，在非水溶性预处理生物质中KCC-4因半纤维素酶而导致活 性受影响，从而纤维素酶的活性较低，由此可知，为了开发有效的纤维素酶混合物，优选以 不仅包含纤维素酶而且同时包含半纤维素酶的方式进行开发。
[0158] [表 12]
[0159]
[0160] 实施例7:应用纤维素分解/糖可用性增进复合菌株的同时糖化技术开发
[0161] 为了开发可利用构成KCC-1和KCC-2的四种重组纤维素酶分泌生产酵母菌株复合 体KCC-1和KCC-2来从生物质中直接生产出生物乙醇的复合菌株，向培养基内供给少量的 1 %葡萄糖和1%微晶纤维素或羧甲基纤维素并培养24小时。在37°C下进行了 3小时的酶糖 化，以便分泌生产出的纤维素酶能够分解微晶纤维素和羧甲基纤维素，并与对照菌株 (Y2805Agal80/CYH)-同比较了细胞生长直至96小时为止（图10A)。可确认出，在将葡萄糖 作为单一碳源来供给的情况下，两个菌株的生长没有差异，然而在降低葡萄糖浓度且将羧 甲基纤维素和微晶纤维素作为碳源来供给的培养基中KCC-1和KCC-2的生长虽然微小但与 对照组相比生长增加。但是，在KCC-1和KCC-2菌株复合体的细胞生长方面没有较大的差异 (图 10A)〇
[0162] 为了分析从培养中的复合菌株分泌出的纤维素酶的情况，在培养96小时之后对培 养基进行SDS-PAGE分析，其结果可知，在对照组中未确认到的纤维素酶在复合菌株KCC-1和 KCC-2中分泌生产到培养基内（图10B)。
[0163] 实施例8:重组酶混合物的纤维素分解能力及乙醇发酵能力的比较分析
[0164] 为了将分泌生产四种酶的复合菌株KCC-1和K CC-2的由温度引起的酶糖化效率相 比较，对四种复合菌株进行前期培养之后，在含有微晶纤维素的50mL烧瓶中按外切(Exo): EGL: BGL = 7:2:1的比率接种各菌株，并通过24小时的培养充分分泌生产出纤维素酶。使分 泌生产出的复合酶在37°C、50°C下反应144小时，并通过HPLC分析来确认已生成的葡萄糖。 虽然在37°C下进行酶反应的情况下完全没有生成葡萄糖，在50°C下糖化效率非常低，但在 KCC-2的情况下生成0.54g/L葡萄糖（图11)。因此，确认出，可通过优化酶混合物的组成及糖 化条件，来实现作为不溶性纤维素(cellulose)基质的微晶纤维素(Avicel)的糖化。
[0165] 由于在将本发明所开发出的纤维素酶分泌生产酵母复合体直接应用于乙醇生产 中来进行糖化及发酵的情况下，期望可通过使为糖化而应另行加入的纤维素酶的使用量最 少化来实现低价的乙醇生产，从而进行了实际的乙醇发酵研究。关于乙醇发酵，首先对生产 构成 KCC-2 的酶的菌株 ST19-BGL、ST19-EGL2、ST13-HgCBHl 和 ST13-C1CBH2 这四种菌株进行 种菌培养，之后将各细胞量按1:1:4:4比率混合而使用。关于生物质，通过用固液比为1:10 的2 % NaOH(氢氧化钠)在120°C下对干燥的稻草进行1小时预处理来使用。作为乙醇发酵条 件，通过将10 %生物质与乙醇培养基（酵母抽提物0.5 %、蛋白胨0.5 %、KH2P04、硫酸铵 0 · 2%、MgS〇4 · H200 · 04%、pH5 · 0)混合而制作发酵培养基，并在此基础上加入Novozyme公司 的商用纤维素酶（C-Tec:H-Tec = 7:3)以使其分别达到2FPU/g、5FPU/g、10FPU/g纤维素 (cellulose)之后，在50°C、150rpm下进行6小时的初期糖化。在糖化6小时后，将经种菌培养 的菌株按适当比率进行混合(KCC-2)而接种到该培养上。作为对照发酵菌株使用通过不包 含纤维素酶基因的载体而转换成的Y2805Agal80/CYH菌株(CYH)，并按时间采样且用HPLC 确认葡萄糖和乙醇的生成及消耗之后，利用图表来表示（图12)。
[0166] 其结果，在使用外部加入酶的10FPU纤维素酶的情况下，与对照组相比差异微小， 但在使用5FPU纤维素酶的情况下为能够确认出与对照组的乙醇生产率差异的程度，特别 是，在使用2FPU纤维素酶的情况下与对照组相比显现出约3倍以上的乙醇生产率的差异（图 12A)。一般来讲，在进行利用纤维素生物质的生物乙醇生产时，为了使生产率最大化，根据 纤维素生物质的种类而外部投入酶会有所差异，但与使用约10~50FPU/g纤维素 (cellulose)的情况相比较，能够大幅度降低酶费用。
[0167] 为了确认当在构成糖化酶活性优异的KCC-3混合物酶的酶生产复合菌株中添加商 用纤维素酶时所生产的乙醇，在Y2805Agal80中按1:1:4:4比率混合ST19-BGL、ST19-EGL2、 自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2这四种菌株来使用。稻草和发酵培养基通过与上述内容相 同的方法制造而使用，并且生物质的量使用3%和5%，由此在烧瓶中进行了培养。加入 Novozyme公司的商用纤维素酶(C-TeC:H-Tec = 7:3)以使其分别达到2FPU/g、5FPU/g(稻草 的葡萄糖含量)之后，在YH)培养基中混合经初期培养的30 % (30mL)菌株，并在30°C、150rpm 下进行同时糖化（图13)。确认出，在与2FPU纤维素酶一同进行同时糖化的情况下，对照组中 没有生成乙醇，与此相反，在使用复合菌株的情况下，所添加的稻草3% (含有21g葡萄糖)均 被糖化且95%以上被转换为乙醇（图13的A)。若增加稻草和纤维素酶的使用量，则在对照组 中也产生乙醇，但其生产量远远达不到重组复合菌株。
[0168] 实施例9:重组酶混合物在发酵罐中的乙醇发酵能力比较分析
[0169] 在生产KCC-3混合物酶的四种复合菌株中混合作为商用化酶的C-Tec和H-Tec并在 5L发酵罐中进行同时糖化发酵。通过用2%氢氧化钠(NaOH)在160°C下处理1小时之后进行 中和并干燥、6%的粉碎的稻草作为基质使用，并使用乙醇发酵培养基(蛋白胨5g/L、酵母抽 提物5g/L、KH2P04 5g/L、硫酸铵28/1、]\^3〇4〇.48/1)。在生产1(0：-3酶的菌株￥2805厶83180 中按1:1:4:4比例混合ST19-BGL、ST19-EGL2、自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2而使用，并加 入Novozyme公司的商用纤维素酶(C-Tec:H-Tec = 7:3)使其为2FPU/g纤维素。通过将在YNB (酵母氮源(yeast nitrogen base )6 · 7g/L、酪蛋白氨基酸（casaminoacid)5g/L、葡萄糖 (glucose)20g/L)培养基中一次培养的菌株(50mL)在YH)中进行二次培养(450mL)而接种到 总计2L发酵液中，以使菌株接种量达到30%，并混合成与各比率相应后，在30°C、150rpm~ 300rpm、pH5 · 3~pH5 · 5、0vvm~Ο · lvvm下进行同时糖化发酵。从上述结果确认出，在对照组 中生成4g/L乙醇，与此相反，在KCC-3菌株复合体中生成直至接近理论产出率19g/L/的乙醇 (图14A)。为了确认这种差异是由在重组酵母细胞中分泌出的纤维素酶而引起的，对发酵中 的培养基进行了 SDS-PAGE分析，其结果确认出，虽然初期加入的外部酶C-tec在发酵约56小 时之后不再存在，但在野生型酵母(Wild-type yeats)中未确认到的重组纤维素酶在KCC-3 中持续进行发酵中的分泌生产。因此，确认出在将本发明所提供的纤维素酶生产菌株进行 混合而应用于乙醇生产的情况下，能够使用最少量的商用化纤维素酶且通过同时糖化工程 从生物质中生产出乙醇。
[0170]本发明所属技术领域的技术人员从上述的说明中应能理解，本发明在不变更其技 术思想或必要特征的情况下，可以以其它具体方式实施。与此相关联地，应理解为上述实施 例在所有方面均为示意性的，而不是限定性的。本发明的范围应解释为，与上述详细的说明 相比，从后述的权利要求书的意义和范围以及其等价概念中导出的所有变更或变型的方式 包括在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种与野生型蛋白质相比在酵母中分泌能力增加的蛋白质表达用表达盒，所述表达 盒包含对翻译融合配偶体(Translationalfusionpartner，TFP)进行编码的多核苷酸和 对选自TrXynll、TrBxl、TrEGL2、PaCELl、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、C1CBH2 和 CfCexl的蛋白质进行编码的多核苷酸。2. 根据权利要求1所述的表达盒，其中， i) 所述TrXynll为包含序列号为2的氨基酸序列的蛋白质;或 ii) 所述TrBxl为包含序列号为4的氨基酸序列的蛋白质;或 iii)所述TrEGL2为包含序列号为6的氨基酸序列的蛋白质;或 iv) 所述PaCELl为包含序列号为8的氨基酸序列的蛋白质;或 v) 所述PaCel2为包含序列号为10的氨基酸序列的蛋白质;或 vi) 所述TeCBHl为包含序列号为12的氨基酸序列的蛋白质;或 vii) 所述NfCBHl为包含序列号为14的氨基酸序列的蛋白质;或 viii) 所述HgCBHl为包含序列号为16的氨基酸序列的蛋白质;或 ix) 所述CtCBHl为包含序列号为18的氨基酸序列的蛋白质;或 X)所述C1CBH2为包含序列号为20的氨基酸序列的蛋白质;或 xi)所述CfCexl为包含序列号为22的氨基酸序列的蛋白质。3. 根据权利要求1所述的表达盒，其中 i) 在作为所述蛋白质选择TrXynll的情况下，所述翻译融合配偶体选自具有序列号为 53的氨基酸序列的TFP5、具有序列号为57的氨基酸序列的TFP9、具有序列号为61的氨基酸 序列的TFP13和具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19; ii) 在作为所述蛋白质选择TrBxl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为52的 氨基酸序列的TFP4; iii) 在作为所述蛋白质选择TrEGL2的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为67 的氨基酸序列的TFP19; iv) 在作为所述蛋白质选择PaCELl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为61 的氨基酸序列的TFP13; v) 在作为所述蛋白质选择PaCel2的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为61的 氨基酸序列的TFP13; vi) 在作为所述蛋白质选择TeCBHl的情况下，所述翻译融合配偶体选自具有序列号为 52的氨基酸序列的TFP4、具有序列号为54的氨基酸序列的TFP6、具有序列号为55的氨基酸 序列的TFP7和具有序列号为56的氨基酸序列的TFP8; vii) 在作为所述蛋白质选择NfCBHl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为61 的氨基酸序列的TFP13; viii) 在作为所述蛋白质选择HgCBHl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为 61的氨基酸序列的TFP13; ix) 在作为所述蛋白质选择CtCBHl的情况下，所述翻译融合配偶体选自具有序列号为 55的氨基酸序列的TFP7、具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19、具有序列号为47的碱基序 列的自身信号和具有序列号为48的氨基酸序列的自身信号； X)在作为所述蛋白质选择C1CBH2的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为56的 氨基酸序列的TFP8或具有序列号为61的氨基酸序列的TFP13中的一者； xi)在作为所述蛋白质选择CfCexl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为56 的氨基酸序列的TFP8、具有序列号为59的氨基酸序列的TFP11、具有序列号为61的氨基酸序 列的TFP13或具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19中的一者。4. 一种表达载体，包含根据权利要求1至3中任一项所述的表达盒。5. -种将根据权利要求4所述的表达载体导入到宿主细胞中而形成的转化子。6. 根据权利要求5所述的转化子，其中， 所述宿主细胞为具有乙醇发酵能力的细胞。7. 根据权利要求6所述的转化子，其中， 所述具有乙醇发酵能力的细胞为Y2805(Matapep4: :HIS3prblcanlhis3_200ura3-52)菌株。8. -种半纤维素酶、内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法，包括用于培养根据权 利要求5所述的转化子的步骤。9. 一种生物乙醇的生产方法，包括以下步骤： i) 培养根据权利要求5所述的转化成的转化子；以及 ii) 从由所述i)步骤获取的培养物或培养上清液中回收生物乙醇。10. 根据权利9所述的生物乙醇的生产方法，其中， 所述转化子由具有乙醇发酵能力的宿主细胞制成。11. 一种复合菌株，包含两种以上根据权利要求5所述的转化子。12. 根据权利要求11所述的复合菌株，其中， 所述复合菌株包含一个以上的分泌半纤维素酶的菌株。13. 根据权利要求11所述的复合菌株，其中， 所述复合菌株具有木聚糖分解能力。14. 一种纤维素酶混合物，包含β-葡萄糖苷酶和根据权利要求8生产出的内切葡聚糖酶 及外切葡聚糖酶。15. 根据权利要求14所述的纤维素酶混合物，其中， 所述葡萄糖苷酶具有序列号为74的氨基酸序列。16. 根据权利要求13所述的纤维素酶混合物，其中， 所述混合物包括内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖苷酶。17. -种利用根据权利要求13所述的混合物对生物质进行糖化的方法。18. -种纤维素酶混合物，包含根据权利要求7生产出的半纤维素酶。19. 根据权利要求18所述的纤维素酶混合物，其中， 所述混合物包含内切木聚糖酶和木糖苷酶。20. 根据权利要求19所述的纤维素酶混合物，其中， 所述内切木聚糖酶为TrXynll蛋白质，所述β-木糖苷酶为TrBxl。21. -种利用根据权利要求18所述的混合物对生物质进行糖化的方法。
【专利摘要】本发明涉及：与野生型相比在酵母中蛋白质分泌能力增加的表达盒、包含表达盒的表达载体、将表达载体导入宿主细胞而形成的转化子及包含两种以上转化子的复合菌株，其中，表达盒包含对翻译融合配偶体(Translational？fusion？partner,TFP)进行编码的多核苷酸和对选自TrXynII、TrBxl、TrEGL2、PaCEL1、PaCel2、TeCBH1、NfCBH1、HgCBH1、CtCBH1、ClCBH2和CfCex1的蛋白质进行编码的多核苷酸。并且，涉及包括培养转化子的步骤的半纤维素酶、内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法及生物乙醇的生产方法。进一步，涉及包含β-葡萄糖苷酶、通过上述方法生产的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的纤维素酶混合物及利用混合物对生物质糖化的方法。此外，涉及通过使用单一或复合使用两个以上生产纤维素酶的菌株，来从纤维素生物质生产生物能源或有用生化物质的方法。
【IPC分类】C12N15/62, C12P7/06, C12N15/81
【公开号】CN105492612
【申请号】CN201480048306
【发明人】孙廷薰, 成奉炫, 裴贞勋, 李超龙, 金美辰, 金炫辰, 龙焕雄, 林光默
【申请人】韩国生命工学研究院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月2日
【公告号】WO2015002471A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及：与野生型蛋白质相比在酵母中分泌能力增加的蛋白质表达用表达 盒、包含该表达盒的表达载体、将上述表达载体导入到宿主细胞中而形成的转化子及包含 两种以上的上述转化子的复合菌株，其中，上述表达盒包含对翻译融合配偶体 (Translational fusion partner，TFP)进行编码的多核苷酸和对选自 TrXynl I、TrBxl、 TrEGL2、PaCELl、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、ClCBH2和CfCexl的蛋白质进行编 码的多核苷酸。并且，本发明涉及一种包括用于培养上述转化子的步骤的半纤维素酶、内切 葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法及生物乙醇的生产方法。进一步，本发明涉及一种包 含β-葡萄糖苷酶、通过上述方法生产出的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的重组纤维素酶混 合物及利用上述混合物对生物质进行糖化的方法。此外，本发明涉及一种通过使用单一的 用于制备上述纤维素酶的菌株或复合使用两种以上的用于生产上述纤维素酶的菌株并将 糖化及发酵这两个工程简化为单一步骤，来以廉价的费用从纤维素生物质中生产出生物能 源或有用生化物质的方法。
【背景技术】
[0002] 全世界上，因原油枯竭及地球暖化问题而正在进行着从廉价且可再生的生物质中 容易地获取生物能源的努力。纤维素生物质为地球上最为丰富的有机物，其为能够生产以 现有石油为基础生产出的各种能源和原料平台化合物的可再生原料(Hoffert等，2002， 3以611(^，298,981)。目前，利用这种纤维素生物质来获取生物能源(特别是生物乙醇）的过 程在技术方面上是可行的，但属于高价工程，具有与目前的原油价格相比缺乏经济性的问 题（Zaldivar等，2001，Appl.Microbiol.Biotechnol·，56,17)〇
[0003] 为了从纤维素生物质中获取生物乙醇，对生物质进行分解并将分解后的糖 (sugar)进行发酵来获取生物乙醇，但由于存在于自然界中的微生物无法同时高效进行生 物质的分解和发酵，因此现有技术将生物质的分解及发酵分成两个步骤来进行，从而是无 效率的（Lynd等2002，Microbiol.Mol. Biol.Rev. 66,506)。特别是，纤维素生物质为非常坚 固的结构，其自然分解过程非常缓慢，因此为了人工加快分解速度而必须进行高费用的前 处理过程和高价的纤维素分解酶处理过程（Lynd等，1999，Biotechnol. Prog . 15，777， Himmel等，2007,Science,315,804)〇
[0004] 因此，为了确保利用纤维素生物质的生物能源及平台化合物生产的经济性，需要 能够将纤维素生物质有效分解的纤维素分解酶(纤维素酶)的低价生产技术，特别是要求开 发出能够将这种酶生产重组菌株直接应用到生物能源生产技术中的联合生物加工 (Consolidated bioprocessing)技术（Hahn-Hagerdal等，2006，Trends Biotechnol .,24, 549,Lynd等，2008,Nat.Biotechnol·，26,169)〇
[0005] 纤维素生物质通过与作为葡萄糖聚合物的纤维素、作为木糖聚合物的半纤维素、 以及木质素（lignin)结合而具有非常坚固且稳定的结构。为了利用酶来使其有效分解，首 先，需要通过物理化学前处理来瓦解植物体的稳定结构，并使酶能够接近基质，并根据基质 种类需要各种纤维素分解酶。为了分解作为葡萄糖聚合物的纤维素，内切l，4-i3-D-葡聚糖 酶(end〇-l，4-0-D_glucanase)、外切 1，4-β-?-葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(ex〇-l，4-0_D-区111〇&11&86或〇611〇13；[0117(11'01&86)和0-葡萄糖苷酶（0-8111(308丨(1&86或0611013丨&86，0-葡萄 糖苷酶或纤维二糖酶）是必不可少的（Kubicek 等，1992，Adv .Biochem. Eng. Bio techno 1,45， 1)。此外，为了分解作为木糖聚合物的半纤维素，代表性地需要内切1，4-β-木聚糖酶(-(10-1，4-0-17131^86)和0-木糖苷酶(0-171081(^86)，并且为了完全分解，需要多种脱支((16-branching)酶。在使植物体自然腐蚀的微生物(特别是霉菌）中发现这些酶，关于商业上生 产出的纤维素分解酶复合体，由诺维信(Novozymes)公司和丹尼斯克(Danisco)公司销售源 于霉菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的酶复合体。
[0006] 目前在全世界上，由上述两个跨国企业垄断生产并销售生物能源生产用生物质分 解酶，但由于其价格相当高且并不是根据生物质被最佳化的状态，因此具有根据情况需要 使用过剩的酶的问题（Merino and Cherry，2007，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol · 108,95， Kabel等，2006,Bioeng.Biotechnol.93,56)〇
[0007] 因此，如果利用细菌或酵母(yeast)等重组宿主系统来重组生产各个酶并将生产 出的各个重组酶进行组合而按生物质种类进行最佳化，则具有能减少酶的使用量的优点。 作为用于生产这种重组酶的宿主细胞，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙醇发酵 能力优异，普遍用作乙醇生产菌株，并且进行用于对该菌株导入纤维素分解能力的尝试和 用于生产重组纤维素分解酶的诸多研究（1^11(1等，2002，]^(^〇1^〇1.]\1〇1.8丨〇1.1^￥.，66， 506)，但由于纤维素分解酶的分泌生产率低于霉菌，因此作为重组酶大量生产的目的，应用 可能性较低。
[0008] 如此，虽然现有的酵母的生物乙醇发酵能力非常优异，但全然没有纤维素生物质 的分解能力，从而在将非粮型资源的纤维素生物质作为原料来生产生物能源时，具有不可 避免地使用高价纤维素分解酶的问题，并且为了解决该问题，进行了无数次的导入了外来 纤维素分解酶基因的重组菌株开发，但因酶的分泌生产率较低而具有生产出的酶无法有效 分解培养基内的纤维素基质的问题。由此，利用生产出的糖(sugar)来进行生物乙醇的生产 是受限制的。
[0009] 近年来，虽然具有在酿酒酵母中表达从几种霉菌中发掘到的纤维素糖化酶基因并 利用微晶纤维素(Avicel)来确认生物乙醇的生成的报告，但仍然存在分泌酶的量不够充分 且乙醇生成效率较低，需要供给外部酶的问题(M. Ilmen等,2011，Biotechnol Biofuels.4: 30,2011)〇
【发明内容】
[0010] 技术问题
[0011] 对此，本发明人为了利用酵母来大量分泌生产纤维素分解酶，利用本发明人所持 有的技术即作为酵母蛋白质定制型高分泌生产技术的TFP技术(韩国专利第10-0626753号、 第10-0798894号、第10-0975596号）来开发出能够高分泌生产各种酶的技术。即，从多个霉 菌基因中发掘出能够在酵母中进行大量分泌的纤维素分解酶蛋白质，并利用最佳的TFP进 行生产，确保了纤维素分解中所必须的酶群。作为上述纤维素分解中所必须的酶群，确保作 为半纤维素酶（hemicellulase)的TrXynII(Trichoderma reesei xylanase II，里氏木霉 木聚糖酶Π )、TrBxl(Trichoderma reesei beta-xylosidase，里氏木霉β-木糖苷酶），作为 外切葡聚糖酶(exoglucanase)的PaCel 1 (Polyporus acularius Cell，漏斗棱孔菌Cell)、 PaCel2(Polyporus acularius Cel2)、TeCBHl(Talaromyces emersonii CBH1，埃默森篮状 菌CBH1)、NfCBHl (Neosartorya fischeri CBH1，费氏新萨托菌CBH1)、HgCBHl (Humicola 区1^86&03!11，灰腐质霉03!11)、(]1:03!11(〇1&61:〇111；[111111:1161'111(^11；[11111103!11，嗜热毛壳菌 CBHl)、ClCBH2(Chrysosporium lucknowense CBH2,丝状真菌 CBH2)和 CfCexl (Cellulomonas f imi，奠碱纤维单胞菌），作为内切葡聚糖酶(endo-glucanase)的TrEGL2 (Trichoderma reesei EGL2,里氏木霉EGL2)，以及作为β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)的 改良后的5€1361^2(3&(^11&1'01115^0口813；1^13111186抑1361^2，扣囊复膜酵母1361^2)(韩国专利公 开第10-2013-0027984号），可通过人工混合各蛋白质而制造作为纤维素生物质糖化酶混合 物的KCC(KRIBB Cellulase cocktail，KRIBB纤维素酶混合物）系列，提高纤维素生物质的 糖化效率，并且可通过制造出最佳的定制型糖化酶，降低纤维素的糖化费用。此外，以如下 方式完成了本发明：通过复合使用用于分泌生产纤维素分解酶的各个重组酵母而使其应用 到生物质同步糖化生物乙醇的生产工程中，由此同时进行纤维素生物质糖化及发酵，能够 降低纤维素生物乙醇生产工程费用。
[0012] 用于解决问题的手段
[0013] 本发明的目的在于提供一种表达载体，其用于在酵母中大量生产半纤维素酶 TrXynII、TrBxl和内切葡聚糖酶TrEGL2、0-葡萄糖苷酶SfBGL2、外切葡聚糖酶PaCell、 PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、CfCexl及C1CBH2。
[0014] 本发明的又一目的在于提供一种由上述表达载体转化成的转化子。
[0015] 本发明的又一目的在于提供一种重组纤维素酶的生产方法，其包括以下步骤:培 养上述转化子，并从该培养物或培养上清液中回收半纤维素酶TrXynll、TrBxl、内切葡聚糖 酶 TrEGL2、外切葡聚糖酶 PaCel 1、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、ClCBH2、CfCexl 和β-葡萄糖苷酶SfBGL2。
[0016] 本发明的又一目的在于提供一种利用具有木聚糖(xylan)分解能力的所生产的半 纤维素酶来复合培养生产菌株的方法。
[0017] 本发明的又一目的在于将所生产的纤维素酶按适当的比率混合来提供生物质定 制型纤维素酶混合物。
[0018] 本发明的又一目的在于提供一种利用将上述转化子混合后的复合菌株的同步糖 化（SSF，simulatneous saccharification and fermentation)或耳关合生物加工（CBP， consolidated bioprocessing)生物乙醇发酵工程。
[0019] 发明的效果
[0020] 如果使用本发明所提供的纤维素酶表达载体，则能够在酿酒酵母中大量生产纤维 素酶，并且上述菌株可适用于同步糖化或联合生物加工中，从而能够广泛应用于木质纤维 生物质到生物乙醇制造等的产业工程中。
【附图说明】
[0021] 图1表示用于导入漏斗棱孔菌、埃默森篮状菌、费氏新萨托菌、灰腐质霉、嗜热毛壳 菌、丝状真菌和源于粪碱纤维单胞菌的外切纤维素酶基因、和源于里氏木霉的半纤维素酶、 内切葡聚糖酶基因的酵母TFP载体的聚合酶连锁反应(PCR)及细胞内重组过程的示意图。 [0022]图2是表示利用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)对在酵母Y2805 菌株中导入TrXynII(A)、TrBxl(B)(图2&)、1'池61^2(〇、卩&〇611(0)(图213)、？&〇612^)、 TeCBHl (F)(图2c)、NfCBHl (G)、HgCBHl (H)(图2d)、CtCBHl (I)、C1CBH2( J)或CfCexl (K)(图 2e)而形成的24个转化子的培养上清液进行分析的结果的电泳照片。
[0023]图3是表示为了去除在所选的转化子中表达的TrXyηII(A)、TrBx 1 (B)、TrEGL2(C)、 C1CBH2(J)或CfCexl(K)(图3c)蛋白质的糖链，在对作为糖链去除酶的内切糖苷酶H(End〇-H)进行处理之后，利用SDS-PAGE进行分析的结果的电泳照片。
[0024]图4是表不利用MF或自身信号（861卜818仙1)来表达在所选的转化子中所表达的 TrXynll (A)和TrBxl (B)的情况和为了比较相对蛋白质表达量和活性而进行SDS-PAGE分析 和活性分析的结果。
[0025] 图5是表不在含有駿甲基纤维素 （carboxymethyl cellulose，CMC)的YP(2%yeast extract+2%peptone，2%酵母抽提物+2%蛋白胨）培养基中利用刚果红（congo-red)对 TrEGL2表达转化子进行染色，并以环的大小比较内切葡聚糖酶活性的结果。
[0026] 图 6 是表示为 了将最终选择的各个51'13-?3〇611、51'19-1'迚 61^、51'13^^〇611、5丁8-TeCBHl、ST13-NfCBHl、ST13-HgCBHl、自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2转化子与具有MF或自 身信号的转化子的相对蛋白质表达量进行比较(图6a的A，B)，并且为了将各个ST8-TeCBHl、 ST13-NfCBHl、ST13-HgCBHl、自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2的转化子与具有MF或自身信 号的转化子的相对活性进行比较而进行pNPC、pNPL和微晶纤维素活性分析的结果（图6b的 C、D)〇
[0027] 图 7 是表示 ST5 -TrXy n II(A)、ST4-TrBxl(B)、ST19 -TrEGL2 (C)、ST13-PaCell(D)(图 7a)、ST13-PaCel2(E)、ST8-TeCBH(F)、ST13-NfCBHl (G)、ST13-HgCBHl(H)(图7b)、自身信号-CtCBHl(I)、ST13-C1CBH2(J)和CfCexl(K)(图7c)基因的表达载体的示意图。
[0028] 图8是表示在5L发酵罐中对通过包含ST5-TrXynII(A)、ST4-TrBxl(B)(图8a)、 ST19-TrEGL2(C)、ST13-PaCell(D)(图8b)、ST13-PaCel2(E)、ST8-TeCBH(F)(图8c)、ST13-NfCBHl (G)、ST13-HgCBHl (Η)(图8d)、自身信号（self-signal )-CtCBHl (I)、ST13-C1CBH2 (J)、ST19-SfBGL2(K)和CfCexl(L)(图8e)基因的重组载体转化成的酿酒酵母菌株进行补料 分批发酵，并利用SDS-PAGE对按时间获取的培养基进行分析的结果的电泳照片，并且是表 示按每个时间测定细胞浓度和酶活性的结果的图表。
[0029]图9是表示将最终选择的各个ST5-TrXynII，ST4-TrBxl转化子进行复合培养时的 细胞生长及酶活性（图9a的A)与单一培养及复合培养各个转化子时的细胞生长进行比较， 并利用HPLC(高效液相色谱法)对木聚糖酶生产菌株的培养基和复合培养时的培养基内的 物质进行分析的结果(图9b的B)。
[0030] 图10是对根据碳源的重组复合菌株KCC-1和KCC-2的生长进行比较(A)，并利用 SDS-PAGE(B)对复合菌株培养后的分泌蛋白质进行分析的结果。
[0031] 图11表示为了在50°C下对复合菌株KCC-1和KCC-2进行糖化效率比较而反应144小 时，并通过HPLC分析确认所生成的葡萄糖的结果。
[0032]图12是将预处理后的稻草10%作为基质使用，并利用2FPU/g、5FPU/g和10FPU/g质 量的纤维素酶进行糖化之后，添加复合菌株KCC-2和对照菌株(Y2805Agal80/CYH)来进行 乙醇发酵的结果。
[0033]图13是将预处理后的稻草3%、5%作为基质使用，并在2??1]/^況?1]/^质量的纤维 素酶中添加复合菌株KCC-3和对照菌株(Y2805Agal80/CYH)来进行乙醇发酵的结果。
[0034]图14是将利用5L发酵罐预处理后的稻草6%作为基质使用，并在2FPU/g纤维素的 纤维素酶中添加复合菌株KCC-3(Y2805Agal80中ST19-BGL、ST19-EGL2、自身信号-CtCBHl、 ST13-C1CBH2)和对照菌株(Y2805Agal80/CYH)来进行乙醇发酵的结果。
【具体实施方式】
[0035]作为一实施方式，本发明提供重组半纤维素酶TrXynlIJrBxl和重组外切葡聚糖 TrEGL2、重组β-葡萄糖苷酶Sf BGL2。
[0036] 优选地，本发明的半纤维素酶TrXynlIJrBxl和内切葡聚糖酶TrEGL2可源于里氏 木霉(Trichoderma reesei)，外切葡聚糖酶PaCell、PaCel2可源于漏斗棱孔菌(Polyporus arcularius)，0_葡萄糖苷酶SfBGL2可源于扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera)。另外，外切葡聚糖酶HgCBHl、TeCBHl、NfCBHl、CtCBHl、ClCBH2、CfCe xl按其顺 序可源于灰腐质霉(Humicola grisea)、埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、费氏新 萨托菌（Neosartorya f ischeri)、嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum)、丝状真菌 (Chrysosporium lucknowense)和奠喊纤维单胞菌（Cellulomonas fimi)。
[0037] 在本发明的一实施例中，从里氏木霉（Trichoderma reesei)中以TrXynll、TrBxl、 TrEGL2序列信息为基础对基因进行增幅（实施例1)，从含有漏斗棱孔菌（Polyporus arcularius)的两种外切纤维素酶基因 Cell和Cel2的质粒pCELl及pCEL2中对外切葡聚糖酶 PaCell、PaCel2基因进行增幅，并且从灰腐质霉（Humicola grisea)、埃默森篮状菌 (Talaromyces emersonii)、费氏新萨托菌（Neosartorya fischeri)、嗜热毛壳菌 (Chaetomium thermophi lum)和丝状真菌（Chrysosporium lucknowense)中对外切葡聚糖 酶 HgCBHl、TeCBHl、NfCBHl、CtCBHl、C1CBH2 的序列信息进行密码子优化（codon optimization)并通过基因合成来确保基因（实施例1)。从KCTC 1436菌株中对源于粪碱纤 维单胞菌(Cellulomonas fimi)的CfCexl基因进行增幅(实施例1)。克隆对用序列号1、2表 示的TrXynll，用序列号3、4表示的TrBxl，用序列号5、6表示的TrEGL2,用序列号7、8表示的 PaCell，用序列号9、10表示的PaCel2,用序列号11、12表示的16〇8!11，用序列号13、14表示的 NfCBHl，用序列号15、16表示的取08!11，用序列号17、18表示的(：比8!11，用序列号19,20表示 的C1CBH2和用序列号21、22表示的CfCexl进行编码的基因（实施例2)，并且通过在酿酒酵母 中导入菌株来表达用于编码上述半纤维素酶、内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的基因，其结 果，确认到各个酶向细胞外分泌(实施例2)。
[0038] 作为又一实施方式，本发明提供一种用于表达与野生型蛋白质相比在酵母中分泌 能力增加的蛋白质表达用表达盒，上述表达盒包含对翻译融合配偶体（Translational fusion partner，TFP)进行编码的多核苷酸和选自 TrXynl I、TrBxl、TrEGL2、PaCELl、 PaCe 12、TeCBHl、Nf CBH1、HgCBHl、CtCBHl、Cl CBH2和 Cf Cex 1 的蛋白质进行编码的多核苷酸。
[0039] 在本发明的表达盒中，
[0040] i)在作为上述蛋白质选择TrXynll的情况下，上述翻译融合配偶体可选自具有序 列号为53的氨基酸序列的TFP5、具有序列号为57的氨基酸序列的TFP9、具有序列号为61的 氨基酸序列的TFP13和具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19;
[0041] ii)在作为上述蛋白质选择TrBxl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序列 号为52的氨基酸序列的TFP4;
[0042] iii)在作为上述蛋白质选择TrEGL2的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序 列号为67的氨基酸序列的TFP19;
[0043] iv)在作为上述蛋白质选择PaCELl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序 列号为61的氨基酸序列的TFP13;
[0044] v)在作为上述蛋白质选择PaCel2的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序列 号为61的氨基酸序列的TFP13;
[0045] vi)在作为上述蛋白质选择TeCBHl的情况下，上述翻译融合配偶体可选自具有序 列号为52的氨基酸序列的TFP4、具有序列号为54的氨基酸序列的TFP6、具有序列号为55的 氨基酸序列的TFP7和具有序列号为56的氨基酸序列的TFP8;
[0046] vii)在作为上述蛋白质选择NfCBHl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序 列号为61的氨基酸序列的TFP13;
[0047] viii)在作为上述蛋白质选择HgCBHl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有 序列号为61的氨基酸序列的TFP13;
[0048] ix)在作为上述蛋白质选择CtCBHl的情况下，上述翻译融合配偶体可选自具有序 列号为55的氨基酸序列的TFP7、具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19、具有序列号为47的 碱基序列的自身信号及具有序列号为48的氨基酸序列的自身信号；
[0049] X)在作为上述蛋白质选择C1CBH的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序列 号为56的氨基酸序列的TFP8或具有序列号为61的氨基酸序列的TFP13中的一者；以及
[0050] xi)在作为上述蛋白质选择CfCexl的情况下，上述翻译融合配偶体可以是具有序 列号为56的氨基酸序列的TFP8、具有序列号为59的氨基酸序列的TFP11、具有序列号为61的 氨基酸序列的TFP13或具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19中的一者。
[0051] 本发明中的术语即翻译融合配偶体是指，通过与用于编码表达率较低的蛋白质的 基因进行融合而诱导表达率较低的蛋白质的分泌生产的缩氨酸及编码该缩氨酸的基因，在 韩国专利第10-0626753号、第10-0798894号和第10-0975596号中公开了本发明中可使用的 翻译融合配偶体。
[0052] 具体来讲，可以是选自由序列号49至72组成的组中的一种翻译融合配偶体，该融 合配偶体在本发明中可以用TFP1至TFP24来表示(表3)。
[0053] 在本发明的具体实施例中，为了表达半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶，在作为具有GAL10启动子和GAL7终止子的普通酵母表达载体的、源于YEp352 的载体中，利用上述的24个TFP来对各酶的表达进行比较和分析。其结果，作为各个融合配 偶体，当在TrXynll的情况下选择TFP5、TFP9、TFP13和TFP19，在Bxl的情况下选择TFP4，在 TrEGL2的情况下选择TFP 19，在PaCe 11的情况下选择TFP 13，在PaCe 12的情况下选择TFP 13， 在TeCBHl的情况下选择TFP4、TFP6、TFP7和TFP8，在Nf CBH1的情况下选择TFP13，在HgCBHl的 情况下选择TFP13,在CtCBHl的情况下选择TFP19和自身信号缩氨酸，在C1CBH2的情况选择 TFP8和TFP13以及在CfCexl的情况下选择了??83??11、了?？13的了?？19时，确认到分泌表达了 过量的酶(实施例2、3)。反映该情况，作为各个代表融合配偶体，通过在1?(5^11的情况下选 择TFP5、在Bxl的情况下选择TFP4、在TrEGL2的情况下选择TFP19、在PaCel 1的情况下选择 TFP13、在PaCe 12的情况下选择TFP13、在TeCBHl的情况下选择TFP8、在Nf CBH1的情况下选择 TFP13、在HgCBHl的情况下选择TFP13、在CtCBHl的情况下选择自身信号缩氨酸、在C1CBH2的 情况选择TFP13以及在Cf Cex 1的情况下选择TFP13来制作出表达盒，并利用该表达盒制作出 表达载体。
[0054] 作为又一实施方式，本发明提供一种包含上述表达盒的表达载体。
[0055] 本发明中的术语即载体是指，能够运送已连接的另一核酸的核酸分子。作为载体 的一种类型的质粒是指能够使DNA块追加连接到该质粒内的环形双链DNA环。
[0056] 本发明的载体能够指示用于对以能够工作的方式连接的目标蛋白质进行编码的 基因的表达，这种载体被称作表达载体。一般来讲，在重组DNA技术的使用中，表达载体为质 粒形态。
[0057] 上述表达载体可根据宿主细胞来确定能够使用的表达载体的种类，在将酵母作为 宿主使用时，表达载体例如可使用YEpl 3载体、YCp50载体、pRS系载体和pYEX系载体等。作为 启动子，可使用例如GAL启动子和A0D启动子等。
[0058] 作为重组体DNA向酵母中的导入方法，例如可使用电穿孔法(Method Enzymol.， 194,182-187( 1990))、原生质体法（Proc.Natl .Acad. Sci.USA,84,1929-1933( 1978))和乙 酸锂法（J.Bacteriol. ,153,163-168( 1983))等。
[0059] 此外，上述表达载体中还可以包含具有用于抑制、增幅或诱导目标基因表达的各 种功能的表达抑制用片段、用于选择转化子的标记或关于抗生素的耐性基因、对以向菌体 外分泌为目的的信号进行编码的基因和适合难表达型蛋白质的定制型融合配偶体等。特别 是，作为适合上述难表达型蛋白质的定制型融合配偶体，优选使用翻译融合配偶体 (translational fusion partner:TFP)〇
[0060] 作为又 一实施方式，本发明提供一种将本发明的表达载体导入到宿主细胞中而形 成的转化子。
[0061] 本发明中的术语即"转化"是指通过将DNA导入到宿主细胞中并利用染色体之外的 因子或通过完成染色体合并而能够使DNA复制。
[0062] 在根据本发明的转化中所使用的宿主细胞可使用本技术领域中广为人知的任一 种宿主细胞，可使用本发明的半纤维素酶、纤维素酶和葡萄糖苷酶基因的导入效率和表 达效率较高的宿主，例如可包括细菌、霉菌、酵母、植物或动物（例如，哺乳动物或昆虫）细 胞。
[0063]优选地，上述宿主细胞可使用具有乙醇发酵能力的细胞，更优选地，具有上述乙醇 发酵能力的细胞可以是单胞发酵菌属、酵母和杆菌。进一步更优选地，具有上述乙醇发酵能 力的细胞可以是Y2805(Mat a ρ印4::HIS3 prbl canl his3-200 ura3-52)菌株。
[0064] 上述酵母包含但不特别限定于此：念珠菌（Candida )、德巴利氏酵母属 (Debaryomyces)、汉逊酵母菌(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属 (卩；[(311丨&)、裂殖酵母属（3(311丨208&(^11&1'01115^6 8)、亚罗酵母属（￥&1'1'0￥丨&)、酵母菌属 (Saccharomyces)、复膜抱酵母属（Saccharomycopsis)、许旺酵母属（Schwanniomyces)和 Arxula种，更优选地使用产肮假丝酵母（Candida utilis)、博伊丁假丝酵母（Candida boidinii)、白念珠菌(Candida albicans)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、毕 赤酵母（Pichia pastoris)、树干毕赤酵母（Pichia stipitis)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、扣囊复膜酵母 (Saccharomycopsis f iburigera)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica)、西方许旺酉孝母（Schwanniomyces occidental is)和Arxula adeninivorans等，最优选地，可使用马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces maxianus)、酿酒 酉孝母（Saccharomyces cerevisiae)和扣囊复膜酉孝母（Saccharomycopsis fiburigera) 0
[0065] 在本发明的一实施例中确认出，在使用包含本发明的对半纤维素酶、内切葡聚糖 酶和外切葡聚糖酶进行编码的多核苷酸的表达载体，将酿酒酵母转化为Y2805(Mat a pep4::HIS3 prbl canl his3_200 ura3_52)菌株之后，从上述转化子中生产出各酶(实施 例2)。
[0066] 作为又一实施方式，本发明提供一种半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或 葡萄糖苷酶的生产方法，其包括用于培养上述转化子的步骤。优选地，提供一种半纤维素 酶、内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法，其包括用于培养上述转化子的步骤。
[0067] 可根据宿主细胞适当选择并利用用于培养本发明的转化子的培养基和培养条件。 营养培养基优选包含宿主细胞的生长所需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，举例说 明了葡萄糖、右旋糖酐、可溶性淀粉、蔗糖和甲醇等。作为无机氮源或有机氮源，举例说明了 铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米衆(corn steep liquer)、蛋白胨、酪蛋白、牛提取物、豆柏 和土豆提取物等。根据需要，可包含其它营养素，例如可包含氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钠、 氯化镁等无机盐、维生素类和抗生素（四环素、新霉素、氨苄西林和卡那霉素)等。培养时，可 适当调节温度、培养基的PH和培养时间等，以便适合细胞生长和蛋白质的大量生产。
[0068]本发明的一实施例在30YPDG( 1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，1 %葡萄糖，1 %半乳糖） 条件下培养了上述转化子。上述转化子的蛋白质确认通过使用SDS-PAGE(Sodium Dodesys Sulfate Polyacryl Amide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶电泳） 方法来进行（图2)。
[0069] 回收上述半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的步骤可根 据通常的生化分离技术或通过使用针对蛋白质的一部分或另一部分的抗体的免疫亲和方 法来进行分离并提纯。作为另一方法，通过在蛋白质序列中添加标签(tag)，针对抗体或这 种标签，根据利用具有适当高亲和性的其它物质的亲和方法来进行提纯。作为通常的生化 分离技术，具有通过蛋白质沉淀剂进行的处理(盐析法）、离心分离、超声波破碎、超滤、透析 法、分子筛色谱法(凝胶过滤）、吸附色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法等的各种色谱法 等，通常可通过将这些组合使用来分离出纯度较高的蛋白质。
[0070] 作为又一实施方式，本发明提供一种生物乙醇的生产方法，其包括以下步骤:培养 上述转化而成的转化子；以及从通过上述步骤获取的培养物或培养上清液中回收生物乙 醇。在本发明中，培养转化子的步骤和如上所说明的步骤相同。
[0071] 本发明中的术语即"生物乙醇"是指将生物质内的碳水化合物转换为葡萄糖 (glucose)之后，通过发酵获取的乙醇。与化石燃料不同，生物乙醇完全没有环境污染物质， 并从植物中获取燃料，因此为可再生能源。作为车辆等的燃料添加剂，与生物柴油一同很早 之前就得到了广泛的使用，目前还在持续进行关于大量生产的研究。
[0072] 本发明中的回收生物乙醇的步骤可使用本领域中广泛使用的任意方法。例如，可 使用蒸馏等方法。
[0073] 作为又一实施方式，本发明提供一种包含两种以上的上述转化子的复合菌株。上 述两种以上是指包含两种以上具有对各个不同蛋白质进行编码的表达载体的转化子。 [0074]特别是，上述复合菌株可包含分泌半纤维素酶的一个以上的菌株。上述半纤维素 酶可以是内切木聚糖酶和木糖苷酶。特别是，内切木聚糖酶可以是TrXyηII，β-木糖苷酶 可以是TrBxl。本发明的复合菌株可以是具有木聚糖分解能力的菌株。
[0075] 在本发明的一实施例中，为了确认在复合培养用于生产内切木聚糖酶和β-木糖苷 酶的酵母菌株时，是否可将木聚糖(xylan)作为碳源使用，复合培养了用于表达TrXynll的 菌株和用于表达TrBxl的菌株这两种菌株。其结果，确认出可通过由两种菌株的复合培养生 产出的两种酶的阶段性作用，来从木聚糖中确保木糖(实施例5)。
[0076] 作为又一实施方式，本发明提供一种包含β-葡萄糖苷酶和回收的内切葡聚糖酶及 外切葡聚糖酶的纤维素酶混合物(KCC)。特别是，上述内切葡聚糖酶可以是内切纤维素酶， 上述外切葡聚糖酶可以是外切纤维素酶。
[0077] 此外，上述β-葡萄糖苷酶可以是具有序列号为74的氨基酸序列的酶。特别是，可以 是具有由序列号为73的碱基序列进行编码的氨基酸序列的酶。
[0078] 在本发明的一具体实施例中，本发明人利用本发明所开发出的外切纤维素酶分泌 生产酵母而将外切纤维素酶进行发酵浓缩之后，将纤维素基质作为碳源使用，并对各基质 的分解能力进行了比较。用于活性改良的所有纤维素酶混合物通过将外切纤维素酶类型1 (CBH1)、外切纤维素酶类型2(CBH2)、内切纤维素酶(EGL)和β-葡萄糖苷酶(BGL)的比率固定 为3.5 : 3.5 : 2 :1而用于分析中，混合物中所使用的EGL为ST19-TrEGL2酶，BGL使用ST19-SfBGL2酶。在EGL、BGL中按上述比率混合非水溶性纤维素条件下活性良好的ST13-PaCell和 ST13-PaCel2,并命名为 KCC-1，在 EGL、BGL 中按上述比率混合 ST13-HgCBHl 和 ST13-C1CBH2， 并命名为KCC-2,在EGL，BGL中按上述比率混合自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2,并命名为 KCC-3,在EGL、BGL中按上述比率混合ST13-CfCexl和ST13-C1CBH2,并命名为KCC-4,由此制 造出纤维素酶混合物。
[0079] 根据本发明，提供通过复合培养通过表达载体转换成的酵母转化子来应用于同时 糖化或联合生物加工的方法。
[0080] 作为又一实施方式，本发明提供一种包含上述半纤维素酶的纤维素酶混合物。上 述混合物可包含内切木聚糖酶和β-木糖苷酶，特别是，上述内切木聚糖酶可以是TrXynll蛋 白质，上述β -木糖苷酶可以是TrBxl。
[0081] 作为又一实施方式，本发明提供一种利用本发明的纤维素酶混合物来对生物质进 行糖化的方法。本发明中的生物质可以是纤维素，并且还可以是木聚糖。
[0082] 在本发明的一具体实施例中，确认出能够利用包含上述β-葡萄糖苷酶和回收的内 切葡聚糖酶及外切葡聚糖酶的纤维素酶混合物来对纤维素进行糖化(实施例6)。
[0083] 作为又一实施方式，本发明提供一种通过复合培养本发明的菌株而应用于同时糖 化或联合生物加工的方法。
[0084] 在本发明的一具体实施例中，确认出可利用四种重组纤维素酶分泌生产酵母菌株 复合体KCC-1和KCC-2来用作能够从生物质中直接生产生物乙醇的复合菌株(实施例7)，并 且确认出在将KCC3复合菌株应用于乙醇生产的情况下，能够利用最小量的商用纤维素酶并 通过同时糖化工程来从生物质中生产出乙醇(实施例8)。
[0085] 本发明涉及一种利用重组生产出的半纤维素酶和纤维素酶来制造纤维素糖化酶 混合物，并有效利用用于生产各酶的重组酵母复合菌株来进行同时糖化的方法，具体来讲， 本发明的内容如下：作为上述半纤维素酶利用TrXynll和TrBxl，作为外切葡聚糖酶利用 PaCel 1、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、C1CBH2和CfCexl，作为内切葡聚糖酶利用 TrEGL2，并且作为β-葡萄糖苷酶利用改良后的Sf BGL2，来分别进行重组分泌生产，并人工混 合分泌出的各蛋白质而制造出纤维素生物质定制型糖化酶混合物，从而提高纤维素生物质 的糖化效率并制造出最佳的糖化酶，因此可降低纤维素糖化费用。此外，将分泌生产纤维素 分解酶的上述重组酵母菌株作为复合菌株使用并应用到生物质同时糖化生物乙醇生产工 程中，从而提高生物质糖化及发酵效率并降低生物乙醇生产工程费用。
[0086] 下面，通过实施例对本发明更详细说明。但是，这些实施例用于示意性地说明本发 明，因此本发明的范围并不限定于这些实施例。
[0087] 实施例1:使用菌株及实验材料
[0088] 确保基于酵母的半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶基因
[0089] 为了有效利用源于里氏木霉（Trichoderma reesei )的内切木聚糖酶（endo-xylanase)TrXynII (序列号1、2)、β_木糖苷酶(beta-xylosidas e)TrBxl (序列号3、4)和内 切葡聚糖酶(611(1〇-8111〇3仙86)1'也61^2(序列号5、6)基因，利用了美国国家生物技术信息中 心(NCBI)的碱基序列信息。关于里氏木霉，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，Difco)内在25°C下将由生物资源中心分配的菌株(KCTC 6968)培养5天，并在仅过滤 及回收完成培养的霉菌菌丝体之后，使用T.H.Al-Samarrai霉菌基因组DNA提取方法 (T.H.Al-Sammarrai等，2000，Letters in Applied Microbiology，30,53_56)〇
[0090]为了克隆TrXyn 11基因，以提取后的基因组DNA样品1为模板，使用上游引物Trxyn_ F(序列号23)和下游引物TrXyn_R(序列号24)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次； 94°C30秒、55°C30秒及72°C3分钟25次;在72°C下7分钟1次），并且为了克隆TrBxl基因，以提 取后的基因组DNA样品1为模板，使用上游引物Trbxl_F(序列号25)和下游引物Trbxl_R(序 列号26)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒、55°C30秒及72°C30秒25次； 在72°C下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳回收约2.4kb、约600bp的切片。
[0091 ]为了克隆!'也61^2基因，在将1%駿甲基纤维素（〇&1'13(?5〇1161:1171〇611111〇86,0\^)添 加到YM(Difco,培养基）中而成的培养基内以150rpm在25°C下将分配的里氏木霉菌株培养3 天，并在仅过滤及回收完成培养的霉菌菌丝体之后，使用总RNA提取试剂盒(RNeasy Plant Mini kit，Qiagen)来分离出总RNA。使用mRNA提纯试剂盒（Oligotex mRNA Mini Kit， Qiagen)从分离出的总RNA中分离出多聚腺苷酸化的mRNA。在上述分离出的mRNA中，使用 SMARTerTM RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)并通过RACE法对cDNA进行增幅 。以合成后的 cDNA样品1为模板，使用上游引物TrEGL2_F(序列号27)和下游引物TrEGL2_R(序列号28)来 进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒、55°C30秒及72°C1分30秒25次;在72°C 下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳回收约1200bp的切片。将聚合酶连锁反应产物克隆到 pGEM-T Easy vector(Promega)上并对碱基序列进行分析，其结果，确认出TrXynll和 TrBxl、TrEGL2基因序列（各个序列号为1、3、5)。
[0092] [表1]
[0093]
LUU?M」 为J利用NCB1顺基序列信思釆应用源t漏斗稷扎菌（Polyporus arcularius)的 PaCell(序列号7、8)和PaCel2(序列号9、10)基因，以lμL载体pCELl及pCEL2为模板，分别使 用上游/下游引物Cell_F(序列号29)/Cell_R(序列号30)、Cel2_F(序列号31)/Cel2_R(序列 号32)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒、55°C30秒、72°C 1分30秒、72°C 1分30秒反应为25次;在72°C下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳确保分别为约1.3kb、约 1.3kb的切片。
[0095] 为了应用作为源于霉菌埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、费氏新萨托菌 (Neosartorya fi scher i )、灰腐质霉（Humi cola gr i sea)、嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum)的各 CBH1 的 TeCBHl(序列号11、12)、财08!11(序列号13、14)、取08!11(序列号 15、16)、CtCBHl (序列号 17、18)和作为源于丝状真菌（Chrysosporium lucknowense)的CBH2 的C1CBH2(序列号19、20)基因，使用NCBI的碱基序列信息。关于各五种类的外切葡聚糖酶基 因，由柏业(Bioneer)公司通过酵母的密码子优化过程而人工合成。以包含在pGEM-T Easy 载体中的各TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、C1CBH2合成基因样品为模板，使用各个上游/ 下游引物CR244(序列号33)/CR246(序列号34)、CR247(序列号35)/CR249(序列号36)、CR250 (序列号37)/CR252(序列号38)、CR253(序列号39)/CR255(序列号40)、CR256(序列号41)/ CR258(序列号42)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒、55°C30秒、72°C1 分30秒、及72°C1分钟反应为25次;在72°C下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳确保分别为 约1.3kb、约1.5kb、约1.5kb、约1.5kb、约1.4kb的切片。为了应用作为源于奠碱纤维单胞菌 (Cellulomonas fimi)的CBH1的CfCexl(序列号21、22)基因，以NCBI碱基序列为基础且以 KCTC1436菌株的基因组DNA(gen〇mic DNA)为模板，使用上游/下游引物CR158(序列号43)/ CR159(序列号44)来进行聚合酶连锁反应(在94°C下5分钟1次;94°C30秒钟、55°C30秒钟、72 °C1分30秒及7211分钟反应为25次；在72°C下7分钟1次），并通过琼脂糖凝胶电泳确保约 1.3kb的切片。
[0096] 源于扣囊复膜酵母(58(^1^1'〇1115^(^8丨8；1^13111丨86抑)的0-葡萄糖苷酶直接表达并 使用通过对现有基因进行改良而导入到Y2805Agal80菌株中的ST19-SfBGL2(韩国专利公 开:第10-2013-0027984 号）菌株。
[0097] [表 2]
[0098]
[0099]
[0100]
[0101] 实施例2:通过导入翻译融合配偶体(TFP)进行的半纤维素酶、内切葡聚糖酶和外 切葡聚糖酶的分泌生产
[0102] 为了在酿酒酵母菌株中表达由实施例1确保的两种半纤维素酶、一种内切葡聚糖 酶和七种外切葡聚糖酶基因，从各个基因利用引物LNK39(序列号45)和GT50R(序列号46)增 幅之后，通过体内重组（in vivo recombination)将协助蛋白质分泌表达的24种蛋白质分 泌融合配偶体（韩国专利第10-0975596号，TFP1至TFP24)载体导入到Y2805(Mat a pep4:: HIS3 prbl canl his3-200 ura3-52)菌株中。TFP1 至TFP24的序列如下表3所示。
[0103] [表 3]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107] 由于利用LNK39(序列号45)和GT50R(序列号46)引物增幅的聚合酶连锁反应产物 包含与40base以上的载体相同的序列，因此若与线性化的载体一同导入到酵母细胞中，则 在细胞内发生交叉而生成圆形质粒载体（图1)。各个转化子从没有尿嘧啶的选择培养基 (0.67 %缺乏氨基酸的酵母基质，0.77 %缺乏尿嘧啶的营养补充物，2 %葡萄糖）中被筛选 出，并在YPDG(1 %酵母提取物、2 %蛋白胨、1 %葡萄糖、1 %半乳糖)培养基中培养40小时，然 后，用0.4ml丙酮使上清液0.6ml沉淀2小时之后进行SDS-PAGE分析，一次筛选出内切木聚糖 酶、β-木糖苷酶，内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶分泌量较多的菌株(图2a至图2e)。
[0108] 从结果可知，在含有各个载体的菌体的培养上清液中观察到蛋白质大小彼此不同 的强带状物。但是，在SDS-PAGE上显示的带状物与从TrXynII、TrBxl、TrEGL2、PaCELl、 PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、C1CBH2 和 CfCexl 基因的大小类推出的蛋白质大小 相比具有相当大的差异，这被推定为，由于在这些蛋白质序列上按上述顺序分别包含十个、 两个，一个、一个、两个、两个、一个、一个、三个、一个、四个N-糖基化诱发序列，因此上述差 异为因附加糖链而导致的差异。在24个转化子中，分别选择出被推定为半纤维素酶、内切葡 聚糖酶和外切葡聚糖酶蛋白质的大小的、带状物表达较高的转化子，并为了去除所选的转 化子通过N-糖基化而附加到蛋白质上的糖，对各蛋白质进行Endo-H酶处理，之后，重新进行 SDS-PAGE (图3a至图3c)分析。如所预想那样，可知在Endo-H处理之后被确认为正常大小的 分子量，由此确认出所表达的蛋白质被N-糖基化。
[0109] 实施例3:通过酿酒酵母菌株中的分泌表达进行的半纤维素酶、内切葡聚糖酶和外 切葡聚糖的活性确认
[0110] 为了确认从各转化子分泌出的蛋白质活性，利用了如下所述的按各蛋白质的活性 分析法。
[0111] 3-1.确认分泌出的TrXynll蛋白质的内切木聚糖酶活性
[0112] 为了确认分泌出的TrXynll蛋白质的活性，使用DNS(dinitirosali cylic acid， 二硝基水杨酸)定量法(Miller，G.L.，Anal.Chem，55:952-959，1959)。在100μΙ酶溶液中加 入1〇〇μ1基质溶液(包含1%燕麦木聚糖(opt spelt xylan)的100mM磷酸钾溶液、ρΗ5·0)，在 60°C下反应30分钟之后，添加700μ1 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid，3,5-二硝基水杨 酸)溶液，并在l〇〇°C下处理5分钟，然后，用冷水冷却后在540nm吸光度下进行测量。分析内 切木聚糖酶活性的结果(表4)，通过TFP5表达的TrXynH酶的活性为74.61单位/ml，显示出 最高的活性。酶的1单位(uni t，U)被设定为1分钟内释放出Ιμπιο 1还原糖的酶的量。
[0113] [表 4]
[0114]
[0115] 3-2.确认分泌出的TrBxl蛋白质的β-木糖苷酶活性
[0116]为了确认分泌出的TrBxl蛋白质的活性，并且为了确认分泌出的蛋白质的活性，将 0. lmL酶溶液与0.9ml基质溶液（100mM磷酸钠缓冲溶液(pH7.0)、ImM的P-硝基苯基-β-D-吡 喃木糖苷化 _附1：1'(^1161171-0-〇-?(71(^7抑11〇81(16$即乂）一同在50°C下反应10分钟。添加与 反应溶液相等的量的0.4M碳酸钠并停止反应，在405nm下测定吸光度，其结果（表5)，通过 TFP4表达的TrBxl酶的活性为25.38单位/ml，且为最高。此时，关于酶活性，将1分钟内能够 生成1M的P-硝基苯基(p-Nitrophenol)的酶量设定为1单位(unit，U)。
[0117] [表 5]
[0118]
[0119]通过将蛋白质表达率和根据该表达率的活性相比较，从而最终选择各转化子在各 融合配偶体的控制下蛋白质表达率和活性最高的酿酒酵母菌株ST5-TrXynII和ST4-TrBxl， 并且为了比较具有MF或自身信号的转化子的相对蛋白质表达量和活性，对各转化子进行 SDS-PAGE分析和活性分析(图4)。
[0120] 3-3.确认分泌出的TrEGL2蛋白质的内切葡聚糖酶活性
[0121]为了确认分泌出的内切葡聚糖酶TrEGL2蛋白质的活性，在包含2%羧甲基纤维素 (carboxymethyl cellulose，CMC)的YP(2%酵母抽提物+2%蛋白胨)培养基内在30°C下将 转化后的细胞培养3天，并用0.1 %刚果红(congo-red)对培养板进行染色一小时之后，用1M 氯化钠(NaCl)清洗数次，然后，通过细胞周边的环大小来确认内切葡聚糖酶在转化后的细 胞中的活性（图5)，并且为了进行定量确认，使用了利用DNS(3,5-二硝基水杨酸）的比色法。 在组合100mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)和1 % CMC150ul的反应液中添加50ul培养上层稀释液 之后，在45°C下反应30分钟，加入700ul DNS并煮沸10分钟后进行冷却，并在550nm下测量吸 光度来进行比色分析，其结果如表6所示。由于TFP13-TrEGL2在反应0小时时的还原糖数值 高于反应后的还原糖数值而无法测定活性，TFP19-TrEGL2以0.38单位/ml显示出最高的活 性。此时，关于酶活性，将1分钟内能够生成lg还原糖的酶量设定为1单位(unit，U)。
[0122] 通过将蛋白质表达率和根据该表达率的活性相比较，从而最终选择各转化子在各 融合配偶体的控制下蛋白质表达率和活性最高的酿酒酵母菌株ST19-IYEGL2,并且关于各 转化子，对具有MF或自身信号的转化子的相对蛋白质表达量进行了比较(图6a的A)。
[0123] [表 6]
[0124]
[0125] 3-4.确认分泌出的PaCe 11和PaCe 12蛋白质的外切葡聚糖酶活性
[0126] 为了确认分泌出的P a C e 11和P a C e 12外切葡聚糖酶蛋白质的活性，将转化子在 3YPDG中培养40小时之后，将培养上清液用于活性确认中。在50mM乙酸缓冲溶液(pH5.0)中， 添加以〇.511^/1111将111^/1111的口即〇(口-附1：1'(^1161171^36七&-〇611〇13；[081(16 4-硝基苯基-0-纤 维二糖苷)和δ-葡萄糖酸内酯(D-Glucono-1，5-delta-lactone，D-葡萄糖酸-1，5-δ-内酯） 融化的900ul反应液和100ul培养上层稀释液，并在50°C下反应30分钟。添加与反应溶液相 等的量的2%碳酸钠，并在410nm下测定吸光度，其结果确认出，PaCell对pNPCdp没有活性， 仅在TFP13-PaCel2的情况下显示出1.7单位/ml的较弱的活性(表7)。此时，对照组为未转化 的酿酒酵母菌株Y2805。此时，关于酶活性，将1分钟内能够生成1M硝基酚的酶量设定为1单 位(unit，U)0
[0127] 通过将蛋白质表达率和根据该表达率的活性相比较，从而最终选择各转化子在各 融合配偶体的控制下蛋白质表达率和活性最高的酿酒酵母菌株ST13-PaCell和ST13-PaCel2,并且关于各转化子，对具有MF或自身信号的转化子的相对蛋白质表达量进行了比 较(图6a的A)。
[0128] [表 7]
[0129]
[0130] 3-5.外切葡聚糖酶活性分析
[0131 ]为了分析剩余6种外切葡聚糖酶的活性，将0.1ml酶溶液与0.9ml基质溶液(50mM醋 酸钠缓冲液（pH 5.0))和lmg/ml作为水溶性基质的P-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（？_ NitrophenylH-Cellobioside ;pNPC) -同在50°C下反应10分钟，添加与反应溶液相等的 量的2%碳酸钠并停止反应，在410下测定吸光度。另外，利用上述相同的方法也对作为其它 人工合成基质的口 _硝基苯基_0_〇-乳酸二糖苷化-附1：1'(^1161171-0-〇-13(31：〇13；[08丨(16)(。即1^) 进行活性测定，其结果，确认出STFP13-CfCexl的pNPC和pNPL分别为2076.7单位/ml、210单 位/ml，显示出最高的活性，其余外切纤 维素酶均显示出40单位/ml以下的微小的活性(表 8)。此时关于酶活性，将1分钟内能够生成ΙμΜ的硝基酚的酶量设定为1单位(unit，U)。
[0132] [表 8]
[0133]
[0134] 此外，为了利用作为非水溶性基质的微晶纤维素(Avicel)来对分泌出的外切纤维 素酶的活性进行分析，将500yL酶溶液与500yL基质溶液（2%微晶纤维素 pH-105纤维素、 0.04%叠氮化钠、0.3yL诺维信脂肪酶-188(0.3yL Novozyme-188)、50mM醋酸钠缓冲液 (pH5 · 0)-同在35°C、lOOOrpm下反应48小时之后，利用DNS(3，5-二硝基水杨酸）在540nm下 对分解后的糖量测定吸光度。分析微晶纤维素活性的结果(表9)，在48小时后C1CBH2为66.3 单位/ml，显示出最高的活性，在外切葡聚糖酶1类型中，HgCBHl为27单位/ml，显示出较高的 活性。水溶性基质的分解活性最高的CfCexl为1.35单位/ml，显示出最低的活性。
[0135] [表 9]
[0136]
[0137]
[0138] 通过将蛋白质表达率和根据该表达率的活性相比较，最终选择各转化子在各融合 配偶体的控制下蛋白质表达率和活性最高的五种酿酒酵母菌株（3了8-1'"8!11、31'13-NfCBHl、ST13-HgCBHl、自身信号序列-CtCBHl、ST13-C1CBH2)，并且关于各转化子，为了对具 有MF或自身信号的转化子的相对蛋白质表达量进行比较，进行SDS-PAGE(图6a的B)分析，并 且为了比较相对活性，通过将pNPC、pNPL和微晶纤维素作为基质使用来进行活性分析（图6b 的C、D)。其结果，在CtCBHl利用自身信号的情况下，显示出与TFP相比高2.5倍的活性。在剩 余四种外切纤维素酶均利用TFP技术的情况下确认出较高的分泌表达率。
[0139] 图7a至图7c是表示与各TFP融合的各半纤维素酶、内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶 基因的表达载体的示意图。在利用GAL10启动子来诱导蛋白质表达时，含有重组生产菌株的 表达载体需要高价的半乳糖，但若使用作为缺乏gal80基因的菌株Y2805Agal80，则仅通过 葡萄糖也能实现GAL10启动子的表达诱导。通过体内重组（in vivo recombination)将最终 选择的七种纤维素酶基因导入到Y2805Agal80(Mat a pep4: :HIS3gal80: :Tcl90、prbl canl his3-200 ura3-52)菌株中，并作为大量生产菌株来使用。
[0140] 实施例4:纤维素酶基因的大量生产
[0141 ]为了使用导入上述Y2805Agal80中的ST5-TrXynII、ST4-TrBxl、ST19-TrEGL2、 ST 13-PaCe 11、ST 13-PaCe 12、ST8-TeCBHl、ST 13-NfCBHl、ST 13-HgCBHl、自身信号-CtCBHl、 ST13-ClCBH2、ST13-CfCexl 生产菌株和 ST19-SfBGL2(韩国专利公开：第 10-2013-0027984 号），来大量生产各个半纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶，在5L发酵 罐中进行加料分批培养。在进入该培养之前，在50mLYNB(0.67 %缺乏氨基酸的酵母基质、 〇. 5 %酪蛋白氨基酸及2 %葡萄糖)培养基中进行初期培养之后，再次在200mL的YEH)液体培 养基中进行培养而使其活性化，接种到该培养液中并在30°C下培养48小时。
[0142] 图8a至图8f是表示在5L发酵罐中对通过包含ST5-TrXynII、ST4-TrBxl (图8a)、 51'19-1'迚61^2、51'13-卩&〇611(图813)、51'13-?&〇612、5丁8-丁6〇8!11(图8。）、51'13-财〇8!11、51'13-HgCBHl (图 8d)、selfsignal-CtCBHl、ST13-ClCBH2(图 86)、51'19-5邙61^2、51'13-〇代6叉1(图 8f)的重组载体而转化成的酿酒酵母Y2805Agal80菌株进行补料分批发酵，并利用SDS-PAGE对按时间提取的每个10ul培养基进行分析的结果的电泳照片，和按每个时间测定出细 胞光学浓度或酶活性的结果的图表。外切葡聚糖酶的分泌量根据酶的种类有所差异，但确 认出以l-2g/L的标准进行分泌生产。关于发酵生产出的各个纤维素酶，通过浓缩和脱盐过 程而分析各个酶活性并进行冷冻保管，从而半纤维素酶应用在复合菌株培养实验中，剩余 纤维素酶在制作混合物之后应用在活性测定实验中。
[0143] 实施例5:重组半纤维素酶的复合菌株培养及木聚糖分解能力
[0144] 为了确认在复合培养用于生产内切木聚糖酶和β-木糖苷酶的酵母菌株时是否可 将木聚糖(xylan)作为碳源使用，复合培养了两种菌株的。关于复合培养，在3mL的最小培养 基(0.67 %缺乏氨基酸的酵母基质、0.5 %酪蛋白氨基酸、2 %葡萄糖）中进行初期培养之后， 接种到含有50mL的1%木聚糖的YPD培养基中，并在30°C下培养48小时后，按时间测定菌体 量及酶活性。内切木聚糖酶活性使用DNS定量法，β-木糖苷酶活性使用p-硝基苯基-β-D-吡 喃木糖苷(口-附1：1'〇口1161171-0-〇-?71〇口5^311〇81(16，口即乂）。如图93的4可知，确认出在复合培 养两种菌株的情况下也分泌生产出各个酶，并且确认出内切木聚糖酶和β-木糖苷酶在培养 48小时之时显示出130单位/mL和100单位/mL的酶活性。
[0145] 为了确认重组菌株的木聚糖分解能力，在YPD(酵母抽提物1%、蛋白胨2%、葡萄糖 2 % )培养基中添加2 %木聚糖，并对各菌株进行另行或复合培养，来分析木聚糖在培养基内 的分解图案（图9b的B)。木聚糖的分解图案通过按时间提取样品并利用HPLC(Agilent， RIDetector，安捷伦科技公司，示差折光检测器)来进行分析。HPLC固体相使用HPX-87H糖分 析柱(column) (Biorad)，并在糖分析柱的温度为65°C、流量(flow rate)为0.6mL、RID温度 为55°C的条件下进行分析。在培养了木聚糖酶生产酵母(TrXYL)的培养基中仅生成木二糖 (xylobiose)和木三糖(xylotriose)，与此相反，在进行复合培养的培养基(TrXYL+TrBXL) 中因生成的内切木聚糖酶而从木聚糖中生成低聚木糖(171〇-〇118〇830(：1^1^(16)，并且生成 的木二糖不再进一步分解(图9b的B)。此时，确认出未分解的木二糖和低聚木糖通过β-木糖 苷酶被转换为木糖而木糖、木二糖和木三糖均生成，在培养了木糖苷酶生产菌株的培养 基中木聚糖几乎未分解（图9b的Β)。因此，通过HPLC分析确认出，由于木聚糖被这两种酶分 解而生成总计2.7g/L木糖和0.9g/L木二糖、0.3 g//L木三糖等。因此，确认出，为了将木聚糖 作为单一碳源使用，可利用通过两种菌株的复合培养而生成的两种酶的阶段性作用，来从 木聚糖中确保木糖。
[0146] 实施例6:生物质糖化混合物的制造及活性改良
[0147] 通过利用本发明所开发出的外切纤维素酶分泌生产酵母而将外切纤维素酶发酵 浓缩之后，将纤维素基质作为碳源使用，并对各基质的分解能力进行了比较。用于活性改良 的所有纤维素酶混合物通过将外切纤维素酶类型1(CBH1)、外切纤维素酶类型2(CBH2)、内 切纤维素酶(EGL)和β-葡萄糖苷酶(BGL)的比率固定为3.5:3.5:2:1而利用于分析中，混合 物中所使用的EGL为ST19-TrEGL2酶，BGL使用ST19-SfBGL2(韩国专利公开第10-2013-0027984 号）酶。
[0148] 此外，为了使酶提纯费用最少化，混合物制造中所使用的酶以如下方式来使用:从 发酵培养基中回收通过发酵培养生产出的四种纤维素分解酶，并进行脱盐及10倍浓缩之 后，将各个酶不经过提纯过程而直接添加到混合物组成中。在EGL、BGL中按上述比率混合非 水溶性纤维素条件下活性良好的ST13-PaCell和ST13-PaCel2,并命名为KCC-1，在EGL、BGL 中按上述比率混合ST13-HgCBHl和ST13-C1CBH2,并命名为KCC-2,在EGL、BGL中按上述比率 混合自身信号（self signal)-CtCBHl和ST13-C1CBH2,并命名为KCC-3,由此与作为商业化 酶的、在纤维素酶（Celluclast)中添加0.5%诺维信脂肪酶188(0.5%~〇￥〇271116 188) (Sigma)的而形成的混合物进行了活性比较。
[0149] 通过将作为非水溶性纤维素的滤纸（filter paper)用作基质的活性测量方法 (B.Adney等，1996)对各混合物的活性进行了比较，在滤纸活性测量方法中用FPU表示每小 时糖化滤纸基质4%时所需的酶活性。下表10为，用每克蛋白质中的FPU来表示通过用于分 解纤维素的四种主要酶而制作混合物并对滤纸进行分解的活性的结果，并且为将预处理后 的EFB (empty frui t bunch，空果串）作为基质来对混合物的相对活性进行比较的结果。
[0150] [表 10]
[0151]
[0152] 确认出，当添加 HgCBHl和C1CBH2(KCC_2)或CtCBHl和C1CBH2(KCC_3)时，与原有版 本的KCC-1混合物(源于漏斗棱孔菌(Polyporus arcularius)的CBH1和CBH2)相比活性有所 改善。关于滤纸活性，确认出，KCC-3相对于KCC-1改善为8.8倍，KCC-3相对于KCC-2改善为 2.65倍，在如￥〇271116公司的纤维素酶(061111(31 &8〇中添加0.5%诺维信脂肪酶188(0.5% N〇V〇zymel88)(BGL)的情况的活性为KCC-3的2.62倍，1(0：-3的活性比之前小幅提升。
[0153] 关于预处理后的EFB活性，确认出，KCC-3与KCC-1相比改善为约2.2倍，与KCC-2相 比改善为约1.5倍，与在纤维素酶（Cel luclast)中添加0.5 %诺维信脂肪酶188(0.5 % Novozyme 188)的样品相比活性改善为约2.7倍。
[0154] CBH1类型中微晶纤维素(Avicel)基质的分解能力较低，但使用在水溶性基质中活 性最高的ST13-CfCexl发酵浓缩液，在EGL，BGL和ST13-C1CBH2中按上述比例混合来命名为 KCC-4,并以预处理后的生物质EFB为对象进行活性分析。其结果，确认出，KCC-4与KCC-3相 比活性改善为130% (表11)，并且由于这种效果被认为，追加添加到KCC-4中的酶ST13-CfCexl不仅具有外切纤维素酶活性而且还具有作为半纤维素分解酶的内切木聚糖酶 (endo-xylanase)活性，因此被预测为在预处理生物质中具有高于KCC-3的活性是与木聚糖 酶(xylanase)活性有关联的。
[0155] [表 11]
[0156]
[0157] 为了确认这种效果，将利用酵母而重组大量生产的ST5-TrXynII和ST4-TrBxl添加 到各个酶混合物中并以用氢氧化钠(NaOH)预处理后的稻草为对象进行活性比较，其结果， 与在KCC-3中添加 ST4-TrBxl的情况相比，添加 ST5-TrXynII时的活性被改进为约600%，在 已含有木聚糖酶活性的KCC-4中添加 ST5-TrXynII和ST4-TrBxl的情况下，活性改善停留在 约130% (表12)。因此，被推测为，在非水溶性预处理生物质中KCC-4因半纤维素酶而导致活 性受影响，从而纤维素酶的活性较低，由此可知，为了开发有效的纤维素酶混合物，优选以 不仅包含纤维素酶而且同时包含半纤维素酶的方式进行开发。
[0158] [表 12]
[0159]
[0160] 实施例7:应用纤维素分解/糖可用性增进复合菌株的同时糖化技术开发
[0161] 为了开发可利用构成KCC-1和KCC-2的四种重组纤维素酶分泌生产酵母菌株复合 体KCC-1和KCC-2来从生物质中直接生产出生物乙醇的复合菌株，向培养基内供给少量的 1 %葡萄糖和1%微晶纤维素或羧甲基纤维素并培养24小时。在37°C下进行了 3小时的酶糖 化，以便分泌生产出的纤维素酶能够分解微晶纤维素和羧甲基纤维素，并与对照菌株 (Y2805Agal80/CYH)-同比较了细胞生长直至96小时为止（图10A)。可确认出，在将葡萄糖 作为单一碳源来供给的情况下，两个菌株的生长没有差异，然而在降低葡萄糖浓度且将羧 甲基纤维素和微晶纤维素作为碳源来供给的培养基中KCC-1和KCC-2的生长虽然微小但与 对照组相比生长增加。但是，在KCC-1和KCC-2菌株复合体的细胞生长方面没有较大的差异 (图 10A)〇
[0162] 为了分析从培养中的复合菌株分泌出的纤维素酶的情况，在培养96小时之后对培 养基进行SDS-PAGE分析，其结果可知，在对照组中未确认到的纤维素酶在复合菌株KCC-1和 KCC-2中分泌生产到培养基内（图10B)。
[0163] 实施例8:重组酶混合物的纤维素分解能力及乙醇发酵能力的比较分析
[0164] 为了将分泌生产四种酶的复合菌株KCC-1和K CC-2的由温度引起的酶糖化效率相 比较，对四种复合菌株进行前期培养之后，在含有微晶纤维素的50mL烧瓶中按外切(Exo): EGL: BGL = 7:2:1的比率接种各菌株，并通过24小时的培养充分分泌生产出纤维素酶。使分 泌生产出的复合酶在37°C、50°C下反应144小时，并通过HPLC分析来确认已生成的葡萄糖。 虽然在37°C下进行酶反应的情况下完全没有生成葡萄糖，在50°C下糖化效率非常低，但在 KCC-2的情况下生成0.54g/L葡萄糖（图11)。因此，确认出，可通过优化酶混合物的组成及糖 化条件，来实现作为不溶性纤维素(cellulose)基质的微晶纤维素(Avicel)的糖化。
[0165] 由于在将本发明所开发出的纤维素酶分泌生产酵母复合体直接应用于乙醇生产 中来进行糖化及发酵的情况下，期望可通过使为糖化而应另行加入的纤维素酶的使用量最 少化来实现低价的乙醇生产，从而进行了实际的乙醇发酵研究。关于乙醇发酵，首先对生产 构成 KCC-2 的酶的菌株 ST19-BGL、ST19-EGL2、ST13-HgCBHl 和 ST13-C1CBH2 这四种菌株进行 种菌培养，之后将各细胞量按1:1:4:4比率混合而使用。关于生物质，通过用固液比为1:10 的2 % NaOH(氢氧化钠)在120°C下对干燥的稻草进行1小时预处理来使用。作为乙醇发酵条 件，通过将10 %生物质与乙醇培养基（酵母抽提物0.5 %、蛋白胨0.5 %、KH2P04、硫酸铵 0 · 2%、MgS〇4 · H200 · 04%、pH5 · 0)混合而制作发酵培养基，并在此基础上加入Novozyme公司 的商用纤维素酶（C-Tec:H-Tec = 7:3)以使其分别达到2FPU/g、5FPU/g、10FPU/g纤维素 (cellulose)之后，在50°C、150rpm下进行6小时的初期糖化。在糖化6小时后，将经种菌培养 的菌株按适当比率进行混合(KCC-2)而接种到该培养上。作为对照发酵菌株使用通过不包 含纤维素酶基因的载体而转换成的Y2805Agal80/CYH菌株(CYH)，并按时间采样且用HPLC 确认葡萄糖和乙醇的生成及消耗之后，利用图表来表示（图12)。
[0166] 其结果，在使用外部加入酶的10FPU纤维素酶的情况下，与对照组相比差异微小， 但在使用5FPU纤维素酶的情况下为能够确认出与对照组的乙醇生产率差异的程度，特别 是，在使用2FPU纤维素酶的情况下与对照组相比显现出约3倍以上的乙醇生产率的差异（图 12A)。一般来讲，在进行利用纤维素生物质的生物乙醇生产时，为了使生产率最大化，根据 纤维素生物质的种类而外部投入酶会有所差异，但与使用约10~50FPU/g纤维素 (cellulose)的情况相比较，能够大幅度降低酶费用。
[0167] 为了确认当在构成糖化酶活性优异的KCC-3混合物酶的酶生产复合菌株中添加商 用纤维素酶时所生产的乙醇，在Y2805Agal80中按1:1:4:4比率混合ST19-BGL、ST19-EGL2、 自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2这四种菌株来使用。稻草和发酵培养基通过与上述内容相 同的方法制造而使用，并且生物质的量使用3%和5%，由此在烧瓶中进行了培养。加入 Novozyme公司的商用纤维素酶(C-TeC:H-Tec = 7:3)以使其分别达到2FPU/g、5FPU/g(稻草 的葡萄糖含量)之后，在YH)培养基中混合经初期培养的30 % (30mL)菌株，并在30°C、150rpm 下进行同时糖化（图13)。确认出，在与2FPU纤维素酶一同进行同时糖化的情况下，对照组中 没有生成乙醇，与此相反，在使用复合菌株的情况下，所添加的稻草3% (含有21g葡萄糖)均 被糖化且95%以上被转换为乙醇（图13的A)。若增加稻草和纤维素酶的使用量，则在对照组 中也产生乙醇，但其生产量远远达不到重组复合菌株。
[0168] 实施例9:重组酶混合物在发酵罐中的乙醇发酵能力比较分析
[0169] 在生产KCC-3混合物酶的四种复合菌株中混合作为商用化酶的C-Tec和H-Tec并在 5L发酵罐中进行同时糖化发酵。通过用2%氢氧化钠(NaOH)在160°C下处理1小时之后进行 中和并干燥、6%的粉碎的稻草作为基质使用，并使用乙醇发酵培养基(蛋白胨5g/L、酵母抽 提物5g/L、KH2P04 5g/L、硫酸铵28/1、]\^3〇4〇.48/1)。在生产1(0：-3酶的菌株￥2805厶83180 中按1:1:4:4比例混合ST19-BGL、ST19-EGL2、自身信号-CtCBHl和ST13-C1CBH2而使用，并加 入Novozyme公司的商用纤维素酶(C-Tec:H-Tec = 7:3)使其为2FPU/g纤维素。通过将在YNB (酵母氮源(yeast nitrogen base )6 · 7g/L、酪蛋白氨基酸（casaminoacid)5g/L、葡萄糖 (glucose)20g/L)培养基中一次培养的菌株(50mL)在YH)中进行二次培养(450mL)而接种到 总计2L发酵液中，以使菌株接种量达到30%，并混合成与各比率相应后，在30°C、150rpm~ 300rpm、pH5 · 3~pH5 · 5、0vvm~Ο · lvvm下进行同时糖化发酵。从上述结果确认出，在对照组 中生成4g/L乙醇，与此相反，在KCC-3菌株复合体中生成直至接近理论产出率19g/L/的乙醇 (图14A)。为了确认这种差异是由在重组酵母细胞中分泌出的纤维素酶而引起的，对发酵中 的培养基进行了 SDS-PAGE分析，其结果确认出，虽然初期加入的外部酶C-tec在发酵约56小 时之后不再存在，但在野生型酵母(Wild-type yeats)中未确认到的重组纤维素酶在KCC-3 中持续进行发酵中的分泌生产。因此，确认出在将本发明所提供的纤维素酶生产菌株进行 混合而应用于乙醇生产的情况下，能够使用最少量的商用化纤维素酶且通过同时糖化工程 从生物质中生产出乙醇。
[0170]本发明所属技术领域的技术人员从上述的说明中应能理解，本发明在不变更其技 术思想或必要特征的情况下，可以以其它具体方式实施。与此相关联地，应理解为上述实施 例在所有方面均为示意性的，而不是限定性的。本发明的范围应解释为，与上述详细的说明 相比，从后述的权利要求书的意义和范围以及其等价概念中导出的所有变更或变型的方式 包括在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种与野生型蛋白质相比在酵母中分泌能力增加的蛋白质表达用表达盒，所述表达 盒包含对翻译融合配偶体(Translationalfusionpartner，TFP)进行编码的多核苷酸和 对选自TrXynll、TrBxl、TrEGL2、PaCELl、PaCel2、TeCBHl、NfCBHl、HgCBHl、CtCBHl、C1CBH2 和 CfCexl的蛋白质进行编码的多核苷酸。2. 根据权利要求1所述的表达盒，其中， i) 所述TrXynll为包含序列号为2的氨基酸序列的蛋白质;或 ii) 所述TrBxl为包含序列号为4的氨基酸序列的蛋白质;或 iii)所述TrEGL2为包含序列号为6的氨基酸序列的蛋白质;或 iv) 所述PaCELl为包含序列号为8的氨基酸序列的蛋白质;或 v) 所述PaCel2为包含序列号为10的氨基酸序列的蛋白质;或 vi) 所述TeCBHl为包含序列号为12的氨基酸序列的蛋白质;或 vii) 所述NfCBHl为包含序列号为14的氨基酸序列的蛋白质;或 viii) 所述HgCBHl为包含序列号为16的氨基酸序列的蛋白质;或 ix) 所述CtCBHl为包含序列号为18的氨基酸序列的蛋白质;或 X)所述C1CBH2为包含序列号为20的氨基酸序列的蛋白质;或 xi)所述CfCexl为包含序列号为22的氨基酸序列的蛋白质。3. 根据权利要求1所述的表达盒，其中 i) 在作为所述蛋白质选择TrXynll的情况下，所述翻译融合配偶体选自具有序列号为 53的氨基酸序列的TFP5、具有序列号为57的氨基酸序列的TFP9、具有序列号为61的氨基酸 序列的TFP13和具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19; ii) 在作为所述蛋白质选择TrBxl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为52的 氨基酸序列的TFP4; iii) 在作为所述蛋白质选择TrEGL2的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为67 的氨基酸序列的TFP19; iv) 在作为所述蛋白质选择PaCELl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为61 的氨基酸序列的TFP13; v) 在作为所述蛋白质选择PaCel2的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为61的 氨基酸序列的TFP13; vi) 在作为所述蛋白质选择TeCBHl的情况下，所述翻译融合配偶体选自具有序列号为 52的氨基酸序列的TFP4、具有序列号为54的氨基酸序列的TFP6、具有序列号为55的氨基酸 序列的TFP7和具有序列号为56的氨基酸序列的TFP8; vii) 在作为所述蛋白质选择NfCBHl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为61 的氨基酸序列的TFP13; viii) 在作为所述蛋白质选择HgCBHl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为 61的氨基酸序列的TFP13; ix) 在作为所述蛋白质选择CtCBHl的情况下，所述翻译融合配偶体选自具有序列号为 55的氨基酸序列的TFP7、具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19、具有序列号为47的碱基序 列的自身信号和具有序列号为48的氨基酸序列的自身信号； X)在作为所述蛋白质选择C1CBH2的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为56的 氨基酸序列的TFP8或具有序列号为61的氨基酸序列的TFP13中的一者； xi)在作为所述蛋白质选择CfCexl的情况下，所述翻译融合配偶体为具有序列号为56 的氨基酸序列的TFP8、具有序列号为59的氨基酸序列的TFP11、具有序列号为61的氨基酸序 列的TFP13或具有序列号为67的氨基酸序列的TFP19中的一者。4. 一种表达载体，包含根据权利要求1至3中任一项所述的表达盒。5. -种将根据权利要求4所述的表达载体导入到宿主细胞中而形成的转化子。6. 根据权利要求5所述的转化子，其中， 所述宿主细胞为具有乙醇发酵能力的细胞。7. 根据权利要求6所述的转化子，其中， 所述具有乙醇发酵能力的细胞为Y2805(Matapep4: :HIS3prblcanlhis3_200ura3-52)菌株。8. -种半纤维素酶、内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法，包括用于培养根据权 利要求5所述的转化子的步骤。9. 一种生物乙醇的生产方法，包括以下步骤： i) 培养根据权利要求5所述的转化成的转化子；以及 ii) 从由所述i)步骤获取的培养物或培养上清液中回收生物乙醇。10. 根据权利9所述的生物乙醇的生产方法，其中， 所述转化子由具有乙醇发酵能力的宿主细胞制成。11. 一种复合菌株，包含两种以上根据权利要求5所述的转化子。12. 根据权利要求11所述的复合菌株，其中， 所述复合菌株包含一个以上的分泌半纤维素酶的菌株。13. 根据权利要求11所述的复合菌株，其中， 所述复合菌株具有木聚糖分解能力。14. 一种纤维素酶混合物，包含β-葡萄糖苷酶和根据权利要求8生产出的内切葡聚糖酶 及外切葡聚糖酶。15. 根据权利要求14所述的纤维素酶混合物，其中， 所述葡萄糖苷酶具有序列号为74的氨基酸序列。16. 根据权利要求13所述的纤维素酶混合物，其中， 所述混合物包括内切纤维素酶、外切纤维素酶和葡萄糖苷酶。17. -种利用根据权利要求13所述的混合物对生物质进行糖化的方法。18. -种纤维素酶混合物，包含根据权利要求7生产出的半纤维素酶。19. 根据权利要求18所述的纤维素酶混合物，其中， 所述混合物包含内切木聚糖酶和木糖苷酶。20. 根据权利要求19所述的纤维素酶混合物，其中， 所述内切木聚糖酶为TrXynll蛋白质，所述β-木糖苷酶为TrBxl。21. -种利用根据权利要求18所述的混合物对生物质进行糖化的方法。
【专利摘要】本发明涉及：与野生型相比在酵母中蛋白质分泌能力增加的表达盒、包含表达盒的表达载体、将表达载体导入宿主细胞而形成的转化子及包含两种以上转化子的复合菌株，其中，表达盒包含对翻译融合配偶体(Translational？fusion？partner,TFP)进行编码的多核苷酸和对选自TrXynII、TrBxl、TrEGL2、PaCEL1、PaCel2、TeCBH1、NfCBH1、HgCBH1、CtCBH1、ClCBH2和CfCex1的蛋白质进行编码的多核苷酸。并且，涉及包括培养转化子的步骤的半纤维素酶、内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶的生产方法及生物乙醇的生产方法。进一步，涉及包含β-葡萄糖苷酶、通过上述方法生产的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的纤维素酶混合物及利用混合物对生物质糖化的方法。此外，涉及通过使用单一或复合使用两个以上生产纤维素酶的菌株，来从纤维素生物质生产生物能源或有用生化物质的方法。
【IPC分类】C12N15/62, C12P7/06, C12N15/81
【公开号】CN105492612
【申请号】CN201480048306
【发明人】孙廷薰, 成奉炫, 裴贞勋, 李超龙, 金美辰, 金炫辰, 龙焕雄, 林光默
【申请人】韩国生命工学研究院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年7月2日
【公告号】WO2015002471A1
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