用于使用代谢工程化丙酸杆菌产生正丙醇和丙酸的方法
用于使用代谢工程化丙酸杆菌产生正丙醇和丙酸的方法
【专利说明】
[0001 ]本申请案要求2012年12月21日提交的美国临时专利申请案61/740,490的优先权， 所述申请案以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
[0002] 本发明涉及代谢工程化细菌，以及其制备和其在一种用于将生物基底物生物转化 成含有正丙醇、丙酸或其组合的产物的方法中的用途。
【背景技术】
[0003] 对化石燃料的未来稀缺、成本和环境影响的顾虑已经激起人们对开采廉价、可再 生生物质作为燃料和化学品的替代来源的关注。由于原油价格已经上涨，生物基化学品和 工业产品已经变为来源于石油的对应物的有吸引力的替代方案。使用厌氧微生物的发酵方 法提供用于将生物质和农业废物转化成化学品和燃料的有前景的途径。存在大量的需要适 当处置以避免污染问题的低值农业商品和食品加工副产品/废物。这些生物质废物材料可 以用作生产燃料和化学品（例如有机酸和醇）的低成本原料。通过发酵途径衍生的产物尤其 为正丙醇和丙酸。
[0004] 正丙醇（1-丙醇、伯丙醇、丙-1-醇）为可与水和其它常用溶剂自由混溶的无害溶 剂，其在工业中有大量应用。这些应用包括例如印刷墨、涂料、清洁剂、粘合剂、除草剂、杀昆 虫剂、药物、除冰流体，以及作为用于生产酯、丙胺、卤化物和热塑性树脂的中间物。还已经 提出了在燃料掺合物中使用正丙醇，因为这种醇具有与乙醇相同的用于增加辛烷值以及充 当汽油中的抗爆添加剂的能力。
[0005] 举例来说，丙酸是广泛用于生产纤维素塑料、除草剂以及香料的重要化学品。丙酸 也是重要的防霉剂。其氨盐、钙盐、钠盐以及钾盐广泛用作食品和饲料防腐剂。某些其它羧 酸也具有工业价值，例如琥珀酸，其能够氢解以产生丁二醇，所述丁二醇适用于生产聚酯和 热成型树脂。
[0006] 虽然正丙醇与丙酸两者都可以通过发酵方法产生，但许多常规发酵方法具有生产 率(productivity)、产率(yield)以及最终产物浓度和纯度低的问题，并且其对于商业应用 而言是不经济的。目前，大部分商业出售的丙酸通过石油化学方法产生。然而，人们对通过 丙酸杆菌由糖的发酵来产生丙酸的关注已经逐渐增加。尽管通过各种方法和菌株改良来提 升发酵生产率和最终产物浓度已经取得一些成功，但在发酵方法中如何进一步提升丙酸产 率和纯度仍然是一个难题。开发用于化学生产的经济上可行的发酵方法需要不仅具有高生 产率并且可以容许高浓度的发酵产物的微生物。
[0007] 用于改良工业微生物的方法在经典菌株改良（CSI)的随机方法到代谢工程的极合 理方法范围内。尽管CSI是众所周知并且常用的方法，但其就时间与资源两者而言都是密集 型的。为了获得对抑制性发酵产物具有高耐受性的菌株，通过在培养基中用逐渐增加的抑 制剂浓度连续培养来连续筛选和选择突变体通常与通过化学诱变剂或紫外线(UV)辐射来 诱发诱变结合使用。然而，常规的培养物筛选过程是冗长、耗时的并且通常是徒劳的。最近， 还已经对重组DNA技术加以应用来提升对抑制性产品的细胞耐受性。这些方法通常更有效， 但使用起来也更复杂，并且需要了解在基因水平上的详细抑制机制，这对于受到特别工业 关注的多数微生物而言是无法获得的。
[0008] 代谢工程广泛用于设计工程化菌株以通过改变代谢流量分布来实现代谢过度生 产的较高效率。迄今为止的大部分代谢工程研究与使用生物来产生次级代谢物(例如抗生 素）、氨基酸(例如赖氨酸）以及异源蛋白质有关，所述生物具有经充分研究的遗传学和生理 学(例如，大肠杆菌(E.coli)、酵母以及杂交瘤细胞）。对代谢流量分布的化学计量分析为代 谢工程、最佳培养基调配和喂养策略以及生物过程最佳化提供指导，然而其需要对发酵细 胞中的代谢和调节网络的深入了解。尽管合理代谢工程方法已经在涉及单个基因或一个基 因簇内的一些基因的情况下取得成功，但其在涉及复杂或在很大程度上未知的代谢途径的 许多情况下是无效的。这是因为合理代谢工程方法通常一次靶向一个基因，并且因此不能 预测途径中的多个基因之间的复杂相互作用。
[0009] 丙酸杆菌是革兰氏阳性(Gram-positive)、过氧化氢酶阳性、无芽孢形成、不动、兼 性厌氧的杆状细菌。丙酸杆菌属(Propionibacterium)的成员（以复数形式或以在这个属内 的任何单个但未鉴别的物种的形式，统称为"丙酸杆菌（p r 〇 p i ο n i b a c t e r i a或a propionibacteria)"广泛用于产生维生素 B12、四吡略化合物和丙酸，以及用于益生菌和乳 酪工业。如图1所示，丙酸杆菌通过二羧酸途径产生丙酸，其中产生乙酸盐和琥珀酸盐作为 副产物。理论上，当糖酵解是通过恩伯登-梅耶霍夫-帕纳斯(Embden-Meyerhof-Parnas， EMP)途径时，一摩尔(mol)葡萄糖仅产生4/3mol丙酸盐和2/3mol醋酸盐。当存在显著细胞生 长和生物质形成时，实际丙酸盐产率低得多。即使在10克每升(g/L)的相对低浓度下，丙酸 盐也是对发酵的强抑制剂。典型分批丙酸发酵需要大致3天以达到20g/L丙酸，其丙酸产率 通常小于0.5克每克(g/g)葡萄糖。丙酸杆菌广泛用于工业中，并且已经对其中的若干种的 基因组进行完全测序。参见例如帕里奇（Parizzi)等人，"丙酸丙酸杆菌（Propioni-bacterium acidipropionici)的基因组序列对其生物技术和工业潜能提供深入了解(The genome sequence of Propioni-bacterium acidipropionici provides insights into its biotechnological and industrial potential)，"《BMC基因组学》(BMC Genomics)， 第 13 卷，2012,562-602。
[0010] 尽管迄今为止丙酸杆菌已经受到关注，然而，几乎没有研究针对这些细菌的遗传 工程，这是由于其基因组中的高GC含量、转化革兰氏阳性细菌的困难以及克隆工具的缺乏。 迄今为止，仅已基于最初从丙酸丙酸杆菌(P. acidipropionici)中分离的质粒开发了两个 表达载体（其使用两个不同的启动子）pKHEM01和pKHEM04(参见例如库亚特帕潘 (Kiatpapan)等人，"构建用于丙酸杆菌的表达载体以及其在通过费氏丙酸杆菌 (Propionibacterium freudenreichii)产生5_氨基乙酰丙酸中的用途（Construction of an expression vector for propionibacteria and its use in production of 5_ aminolevulinic acid by Propionibacterium freudenreichii)，"〈〈应用微生物生物技 术》(Appl .Microbiol .Biotechnol.)，第56卷，2001，144-149)，以及两个报导子载体(其不 具有启动子)ρ?)210(法页(Faye)等人，"构建用于费氏丙酸杆菌中的启动子活性的活体内 分析的报导子向量系统（Construction of a reporter vector system for in vivo analysis of promoter activity in Propionibacterium freudenreichii)，'，《应用和环 境微生物学》(Appl .and Enviro.Microbiology)，第74卷，第 11 期，2008,3615_3617) ;pCVEl (皮奥(Piao)等人，"来自费氏丙酸杆菌的启动子元件的分子分析(Molecular analysis of promoter elements from Propionibacterium freudenreichii)，"《生物科学与生物工程 学杂志》(J.Biosci.and Bioeng)，第97卷，第5期，2004,310-316)。这一领域中的大部分发 表的研究旨在提升维生素 B12产量(参见例如库亚特帕潘等人，如上所引用;室冈(Murooka) 等人，"使用费氏丙酸杆菌的遗传工程产生四吡咯化合物和维生素 B12.概述(Production of tetrapyrro1e compounds and vitamin B 12using genetic engineering of Propionibacterium freudenreichii .An overview)，"《莱特》(Lait)，第85卷，第 1 到2期， 2005,9-22;并且仅有一篇论文已关注通过敲除丙酸丙酸杆菌ATCC4875中的乙酸激酶(ack) 基因来提升丙酸产量(苏瓦纳卡姆（Suwannakham)等人，"构建和表征丙酸丙酸杆菌的基因 敲除突变体用于增强的丙酸发酵(Construction and characterization of knock-out mutants of Propionibacterium acidipropionici for enhanced propionic acid fermentation)，"《威立国际科学》（Wiley InterScience) (www. interscience .wiley · com)，2006年2月28日；另外参见帕里奇等人，如上所引用）。 [0011]已经显示双功能醛/醇脱氢酶能够将乙酰-CoA和丁酰-CoA分别转化成乙醇和丁醇 (参见例如纳尔(Nair)等人，"来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium ac etobutylicum)ATCC 824 的酸/醇脱氢酶基因的分子表征(Molecular characterization of an aldehyde/alcohol dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824)，"《细菌学杂志》 (J · Bacteriology)，第176卷，1994，871-885 ;余（Yu)等人，"酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum)的代谢工程用于正丁醇生产（Metabolic engineering of Clostridium tyrobutyricum for n-butanol production)，"〈〈代谢工程〉〉（Metabolic Engineering)，第 12卷，2011，373-382;布吕昂（Bruant)等人，"通过食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans)菌株P7T的一氧化碳利用和丁醇生产的基因组分析(Genomic analysis of carbon monoxide utilization and butanol production by Clostridium carboxidivorans Strain P7T)，"公共科学图书馆（PL0S0ne)(www.plosone.org)，第5卷， 第9期，2010年9月，el3033)。作为发酵产物的丙醇在例如詹森(Janssen)，"作为苏氨酸发酵 的最终产物的丙醇（Propanol as an end product ofthreonine fermentation)，"《微生 物文献》(Arch.Microbiol.)，第 182 卷，2004,482-486 中论述。
[0012] W02011029166公开一种用于将底物生物转化成正丙醇的方法，其使用遗传修饰的 微生物与用于在发酵期间以NAD(P)H形式供应还原当量的方法组合。基因编码用于丙酸盐 形成的二羧酸途径的酶，并且至少一个基因编码用于催化丙酸盐/丙酰-CoA到正丙醇的转 化的酶。
[0013] W02008098254公开组合生物与热化学转化方法以产生中间物，接着将中间物重组 到所需产物中。使用多种碳底物，其条件是总底物的不超过75百分比（％)是碳水化合物。可 以产生丙醇，以及其它产物，包括乙醇、丙二醇以及1，4_ 丁二醇。
[0014] W02009154624公开一种使用代谢工程化突变体细菌的发酵，所述细菌的ack与pta 基因中的一者或两者被破坏。使用这些工程化细菌发酵的结果是大于50g/L的产物浓度。产 物可以包括丙酸、丁酸以及乙酸。在一些实施例中使用纤维床生物反应器。
【发明内容】
[0015] 在一个方面中，本发明提供一种用于生物合成正丙醇或丙酸的方法，其包含(a)进 行起始发酵培养液的发酵，所述起始发酵培养液包含底物、水以及丙酸杆菌，所述丙酸杆菌 被遗传修饰以包括从鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量为40百分比（％ )或更高的兼性厌氧生物获得 的adhE基因，以表达被识别为基因库基因 （GenBank Gene)ID:6062148;GI :170080868的对 丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶，从而形成包括正丙醇和丙酸作为产物的发酵产 物培养液;和(b)从发酵产物培养液回收产物正丙醇、丙酸或其组合的至少一部分。
[0016] 在另一方面中，本发明提供一种用于修饰供正丙醇或丙酸生物合成使用的丙酸杆 菌的方法，其包含(a)从GC含量为40%或更高的兼性厌氧生物获得adhE基因片段;和(b)修 饰丙酸杆菌的基因组以包括所述adhE基因片段；以使得丙酸杆菌表达被识别为基因库基因 ID:6062148;GI :170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。
[0017] 在又一方面中，本发明提供一种供生物合成使用的修饰的丙酸杆菌，其包含具有 基因组DNA的丙酸杆菌，所述基因组DNA包括从GC含量为40%或更大的兼性厌氧生物获得的 插入adhE基因片段，以使得丙酸杆菌表达被识别为基因库基因 ID:6062148;GI :170080868 的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。
【附图说明】
[0018] 图1.用于在丙酸杆菌中的正丙醇生物合成的二羧酸途径和异源adhE的表达。
[0019] 图2.pKHEM04-adhE 的构建。
[0020] 图3.通过费氏丙酸杆菌(？.:^611(161^61(311；[;0野生型的葡萄糖分批发酵的动力学。
[0021] 图4.通过表达adhE的费氏丙酸杆菌突变体菌株Pf(adhE)-l的葡萄糖分批发酵的 动力学。
[0022]图5.通过表达adhE的费氏丙酸杆菌突变体菌株Pf(adhE)_2的葡萄糖分批发酵的 动力学。
[0023]图6.通过费氏丙酸杆菌野生型的甘油分批发酵的动力学。
[0024]图7.通过表达adhE的费氏丙酸杆菌突变体菌株Pf(adhE)_l的甘油分批发酵的动 力学。
[0025]图8.通过表达adhE的费氏丙酸杆菌突变体菌株Pf(adhE)_2的甘油分批发酵的动 力学。
[0026] 图9.在各种浓度的丙醇存在下，丙醇在生长于甘油上的费氏丙酸杆菌野生型的分 批发酵中对细胞生长的作用。
[0027] 图10.在各种浓度的丙醇存在下，丙醇在生长于甘油上的费氏丙酸杆菌野生型的 分批发酵中对甘油消耗的作用。
[0028] 图11.在各种浓度的丙醇存在下，丙醇在生长于甘油上的费氏丙酸杆菌野生型的 分批发酵中对丙酸产量的作用。
【具体实施方式】
[0029] 总体而言，本发明包括一种特定的遗传修饰的丙酸杆菌微生物，其表达特定的双 功能醛/醇脱氢酶;一种制备所述微生物的方法；以及其在发酵培养基中用于制备含有正丙 醇、丙酸或其两者的产物的用途，其中与使用在其他方面相同但未被相同地遗传修饰的丙 酸杆菌相比，正丙醇的产率、滴度以及生产率有所提升，并且丙酸的滴度和生产率也得到提 升。这一结果得以实现是因为特定双功能醛/醇脱氢酶相对地增加丙酰-CoA到正丙醇的转 化。
[0030] 微生物可以选自各种物种中的任一个，所述物种包括(在非限制性实例中）费氏丙 酸杆菌、丙酸丙酸杆菌以及其组合。所选择的生物被遗传修饰以产生被识别为基因库基因 ID:6062148;GI :170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。为了根据本发明 遗传修饰（即转化)这些微生物以使得其将表达所需的脱氢酶，用于双功能醛/醇脱氢酶的 特定基因编码(adhE)从特定来源克隆。包括"基因 ID"以及"GI"的基因库识别信息指的是特 定蛋白质结构，其可以通过应用公开可获得的名为"BLAST"的网络寄存(web-hosted)软件 容易地获得，所述软件可以在美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth，NIH) 网站http://www.ncbi .nlm.nih.gov/genbank上获得，并且涉及特定相关基因的信息可以 更特定地在111^。：//?〇^.11〇13；[.111111.11；[11.80￥/^6116/?丨61'111 = 6062148处找到。用于修饰丙酸 杆菌的基因编码的来源理想地是GC含量为40%或更高的兼性厌氧生物。任何给定基因的GC 含量百分比可以通过参考发表的论文及/或通过使用适当的计算软件从已公布的序列计算 来获得。
[0031] 举例来说，在本发明的一个特定实施例中，a d h E基因可以从大肠杆菌 (Escherichiacoli)获得，基于基因库基因 ID 6062148(大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B)，已 知所述大肠杆菌具有大致51 %的GC含量。（为获得关于大肠杆菌基因组的更多以及通用信 息，参见例如德菲(Durfee)等人，"大肠杆菌DH10B的全基因组序列:对实验室主力的生物学 的深入了角军（The complete genome sequence ofEscherichia coli DH10B： Insights into the biology of a laboratory workhorse)，''〈〈细菌学杂志Kj.Bacteriology)，第 190卷，第7期，2008，2597-2606。还已知其为兼性厌氧生物。如所述术语在本文中使用，"兼 性厌氧生物"被定义为指一种生物，通常是细菌，其在氧气存在的情况下通过有氧呼吸产生 三磷酸腺苷(ATP)但也能够切换为发酵。相反，专性厌氧菌在氧气存在下死亡。
[0032]将克隆的adhE基因插入到丙酸杆菌基因组中的结果是一种突变体丙酸杆菌，其通 过表达插入的adhE基因，即产生被识别为基因库基因 ID:6062148;GI: 170080868的特定醛/ 醇脱氢酶而将丙酰-CoA转化成正丙醇。这一正丙醇可以随后按原样回收，或使其与也是通 过突变体丙酸杆菌或通过相同或不同物种的未被修饰丙酸杆菌产生的丙酸一起保留在发 酵培养液中。因此，本发明方法的一个优势是可以从发酵培养液中回收最终产物，其可以是 正丙醇、丙酸或其组合。
[0033]用于将adhE编码插入到基因组中的代谢工程可以通过所属领域的技术人员已知 的方式和方法来进行。尤其便利的是这种编码仅表示关于丙酸杆菌的单一基因，由此与涉 及一些其它生物和/或多个基因的方法相比简化修饰方法。
[0034]总体而言，本发明代谢工程化丙酸杆菌在一个非限制性实施例中可以通过以下 步 骤制备:首先从所选择的兼性厌氧生物，例如大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B分离基因组DNA， 接着使用常规设计的引物根据所属领域的技术人员的一般技术进行PCR扩增。在PCR扩增之 后，可以将adhE基因克隆到pGEM-T载体中。其后，可以随后使用pGEM-T载体作为模板将adhE 基因克隆到PKHEM04载体中，其通过使质粒经受BspHI和NdeI的限制性消化以产生DNA片段 产物，所述产物随后被连接到Ncol和Ndel限制性消化的pKHEM04质粒上来实现。经抗生素选 择的突变体可以随后通过用PKHEM04载体使丙酸杆菌培养物电穿孔来产生。所属领域的技 术人员将通常了解有效地实现所需丙酸杆菌基因组转化的转化方式和方法，并且认为额外 描述在此是不必要的。
[0035] 一旦本发明的代谢工程化丙酸杆菌已经制备好后，所述丙酸杆菌可以用于生物合 成方法中以制备例如正丙醇、丙酸或其组合。所述方法可以理想地以制备适合的发酵培养 液开始。除代谢工程化丙酸杆菌以外，发酵培养液还理想地包括水和至少一种底物，其中以 发酵培养液的总体积计，丙酸杆菌培养物的初始量在1 %到50% (体积/体积(v/v))范围内， 并且优选地为5%到25% (v/v)。总体而言，优选的是使用在0.5到4.0范围内的600纳米下接 种物光密度(〇D_)，但经常为约1.5到约2.5。代谢工程化丙酸杆菌可以用作给定发酵培养 液中的唯一发酵生物，或可以与一或多种额外发酵生物组合，所述额外发酵性生物包括(但 不限于)未被修饰的丙酸杆菌以及被修饰和未被修饰的其它属生物。
[0036]本发明方法的发酵部分中的遗传修饰的丙酸杆菌可以使用广泛多种底物。所述底 物可以包括一或多种碳源，例如在非限制性实例中，碳水化合物、醇、酸、醛、酮、氨基酸、肽 等。举例来说，这些可以包括单糖(例如葡萄糖、果糖以及木糖）、寡糖（即蔗糖、乳糖）、多糖 (即淀粉、纤维素、半纤维素）、木质纤维素材料、脂肪酸、琥珀酸盐、乳酸盐、乙酸盐、甘油等， 或其组合。底物可以是光合作用的产物，例如葡萄糖或纤维素。用作底物的单糖可以是多糖 水解的产物，例如纤维素、淀粉以及果胶的酸或酶促水解产物。出于理解目的，术语"能源" 可以与碳源互换使用，因为在化能有机营养代谢中，碳源在分解代谢期间用作电子供体并 且在细胞生长期间用作碳源。
[0037]按比例，以水计，理想的是底物表示发酵培养液的1 %到15% (w/v)，并且理想地为 2.5%、更理想地5%到10% (w/v)。发酵温度(包括斜线上升和/或下降）、发酵时间、pH以及 其它条件为所属领域的技术人员已知，并且所述各者的差异将被认为是影响产物产率、副 产物、比例等的因素。尽管如此，从商业观点出发，通常认为理想的是以低于72小时的时间 为目标以实现至少50g/L，并且更理想地至少80g/L的产物(正丙醇和/或丙酸)滴度。尽管如 上所述，但应理解产物滴度在某些实施例中可以在低于（<)lg/L到120g/L范围内。
[0038]这一反应中的正丙醇产量受烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH)可获得性限制， 其可以通过使用甘油而非葡萄糖作为底物而显著提升。在非限制性实例中，所属领域的技 术人员所熟知的解决这一限制的其它方式可以包括:用甲酸盐补充剂在生长培养基中过度 表达甲酸脱氢酶、使用电极以在培养液中建立还原环境或施加氧化还原介体或人造电子载 体以为丙醇和丙酸生物合成增加 NADH可获得性。
[0039]本发明的一个特定优势为起始发酵培养液可以被改质以使得与代谢工程化丙酸 杆菌、底物和水组合的丙醇(在本文中称为"刺激剂丙醇"）被包括在内。所述丙醇区别于产 物丙醇，因为其在发酵开始时添加。所述丙醇可以选自正丙醇和其它丙醇异构体，其中正丙 醇为优选的。外部引入的（"掺加"）丙醇可以以任何手段自身产生，如细胞内、细胞外，或为 其它化学合成的结果。然而，可以衍生出一个尤其并且出人意料地有利的影响，其中用于 "掺加"发酵培养液的丙醇自身已于细胞内产生，其例如通过单独进行的（即额外的）与本发 明方法相同的方法来实现。优选的是以发酵培养液的体积作为整体计，外部引入，但在一些 实施例中细胞内产生的"掺加"丙醇以在O.Olg/L到10g/L，更优选地2g/L到7g/L范围内的量 使用。在起始发酵培养液中的所述外部引入丙醇用以增加产物发酵培养液中的丙酸和正丙 醇产量，因此命名法的使用将其称为"刺激剂"。所述增加的量可以在10%重量每体积(w/v) 到125%w/v范围内，优选为25%w/v到125%w/v，例如在lg/L到7g/L范围内的滴度增加，其 中不同底物的差异在相同条件下指出。举例来说，全甘油底物可以在某些实施例中展现与 全葡萄糖底物相比实质上更大的提升。
[0040] 本发明的一个优势是，在某些非限制性实施例中，底物的分解代谢与在其他方面 相同但不含有遗传修饰的丙酸杆菌而是含有在其他方面相同的尚未被遗传修饰的丙酸杆 菌的起始发酵培养液的底物的分解代谢相比可以增加至少5百分比的量，所述遗传修饰通 过插入从GC含量为40%或更高的兼性厌氧生物获得的adhE基因以表达被识别为基因库基 因 ID:6062148;GI :170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶来实现。
[0041] 使用本发明代谢工程化微生物，表达adhE，本发明方法的结果是丙酰-CoA有效并 且便利地大量被转化成正丙醇。以下实例和比较实例将更全面地说明本发明的某些实施例 和方面，但其不应解释为限制本发明的范围。
[0042] 实例1和比较实例1 [0043]细菌菌株、质粒以及培养基：
[0044] 用于本实例的所有细菌菌株和质粒都在表1中列出。在37摄氏度(°C)下于补充有 100微克每毫升(μg/ml)氨节青霉素(ampicillin)的卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani，LB) 培养基中有氧生长大肠杆菌DH5a(-种GC含量为40%或更高的兼性厌氧生物）以得到其转 化体。出于比较目的，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum，C.acetobutylicum)美 国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)824(其也是一种兼性 厌氧生物)在37°C下于强化梭菌培养基(RCM，蒂夫科(Difco))中厌氧培养。丙酸杆菌在32°C 下于含有l〇g/L乳酸钠、10g/L酵母提取物以及lOg/li夷蛋白酶解酪蛋白大豆培养液的北光 生物科学(Northern Lights BioScience，NLB)培养基中厌氧生长以制备感受态细胞并且 用于细胞在电穿孔之后恢复。对于发酵动力学研究，细胞在含有l〇g/L酵母提取物、5g/L胰 蛋白酶解酪蛋白、〇. 25g/L K2HP〇4、0.05g/L MnS〇4、25g/L葡萄糖或甘油(作为碳源）以及2% CaC03(用于缓冲培养基pH)的培养基中生长。为获得关于更多细节的方法，参见例如杨 (Yang)等人，"由甘油通过代谢工程化丙酸丙酸杆菌的丙酸生产（Propionic acid production from glycerol by metabolically engineered Propionibacterium acidipropionici)，"《过程生物化学》（Process Biochem)，第44卷，2009，1346-1351。这些 培养基通过121°C、15镑每平方英寸表压(psig)(约204.75千帕斯卡，1^ &)下高压灭菌30分 钟(min)来灭菌。除非另外指出，否则将过滤灭菌的潮霉素 B无菌添加到无菌培养基中达到 250μg/ml的最终浓度以用于培养和维持血清瓶中的丙酸杆菌转化体。所有储备培养物都保 持在4°C下用于短期使用并且保持在_80°C下用于长期存储。
[0045] 构建aad和adhE表达载体：
[0046] 在于10毫克每毫升(mg/ml)溶菌酶中在37°C下培育20min到30min之后，细胞被溶 解。随后使用凯杰(QIAGEN)基因组DNA试剂盒(凯杰，巴伦西亚市(Valencia)，加利福尼亚 州）分离染色体DNA。使用个别基因组DNA作为模板和具有引入BspHI和Ndel限制性位点（参 见表1)的引物于DNA引擎(MJ研究(MJ Research)，里诺市，内华达州）中PCR扩增大肠杆菌 adhE和（比较）丙酮丁醇梭菌aad基因（aad基因的GC含量为35%，基于基因库登记号： AE001438.3)。使含有5μ1 10XPCR缓冲液（英维罗根（Invitrogen)，格兰德岛（Grand Island)，纽约，美国）、1μ1 25mMMgCl2、lyl 10mM dNTP(每一）、1μ110πιΜ 正向引物、ΙμΙΙΟπιΜ 反向引物、1 μ 1基因组DNA以及2.5U TaqDNA聚合酶(英维罗根）的反应混合物(50微升(μ 1)) 经受在94°C下的初始变性步骤2min、在94°C下的34个重复变性循环30秒、在55°C下的退火 30s以及在72°C下的延伸3min以及在72°C下的PCR产物最终延伸lOmin。将PCR产物克隆到 pGEM-T载体(普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州，美国）中以构建对应的 pGEM-aad和pGEM-adhE载体，其使用QIAprep微量制备(MiniPrep)质粒纯化试剂盒来分离和 纯化。为了构建表达载体pKHEM04-aad和pKHEM04-adhE，用BspHI和Ndel RE双重消化pGEM-aad和pGEM-adhE，并且对应的aad和adhE DNA片段在使用QIAquick凝胶提取试 剂盒从琼脂 糖凝胶纯化之后与用Ncol和Ndel RE消化的pKHEM04连接(参见图2) AspHI与Ncol两者都具 有相容的粘性末端。为了检验克隆基因，通过俄亥俄州立大学(Ohio State University)的 植物-微生物基因组设施(Plant-Microbe Genomic Facility)对其DNA序列进行测序。 [0047]丙酸杆菌的转化：
[0048]用pKHEM04_aad和pKHEM04_adhE转化丙酸杆菌根据所属领域的技术人员熟知的程 序通过电穿孔来进行。为获得额外细节，参见例如薛(Xue)等人，"高摩尔渗透压浓度提升革 兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtil is)和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)的电转化效率（High osmolarity improves the electro- transformation efficiency of the Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis)，"《微生物学方法杂志》（J.Microbiol .Methods)，第34卷，1999， 183-191。将在NLB培养基中生长到0D6Q()为大致0.6到0.8的细胞在冰水上冷却10min，通过在 4°C和4，000转每分钟(rpm)下离心10min收集，用冰冷电穿孔培养基（10 %甘油)洗涤4次，并 且再悬浮于电穿孔培养基(初始培养物体积的1/40)中。随后，将在0.1cm比色杯中与lyg到2 yg质粒DNA混合的100μ1感受态细胞在冰上培育2min到5min并且用基因-脉冲发生器(Gene-Pulser)(拜耳-雷德实验室(Bio-RadLaboratories)，里奇蒙(Richmond)，加利福尼亚州）在 25微法拉化？）、200欧姆（0)、20千伏特每厘米(1^/〇11)以及在4.5与5.0毫秒(1118)之间的时 间常数下电穿孔。将电穿孔的细胞转移到lml恢复培养基中培养3小时(h)，随后涂在具有 250μg/ml潮霉素 B的NLB琼脂培养基上。在培养大致10天之后，拾取在培养板上的菌落，并且 通过PCR使用表1中所示的对应adhE或aad基因引物确认转化体。
[0049] 发酵动力学：
[0050] 在血清瓶中于32°C和大致pH 6.8(在Ca⑶3存在下)研究用所选择的转化体和亲本 菌株进行的葡萄糖和甘油分批发酵。定期取得样品以监测底物消耗以及正丙醇和有机酸产 量。为研究正丙醇对细胞生长和发酵的作用，将各种量的正丙醇添加在血清瓶中的培养基 中。未在用于生长测试的培养基中添加 CaC03。除非另外指出，否则对于每一被研究的条件 至少使用一式两个瓶子。
[0051 ]碳流量分布的化学计量分析：
[0052]为评估adhE表达和正丙醇生物合成对丙酸发酵的作用，使用在补充材料 (Supplemental Material)中给出的化学计量反应式以及以下假设进行野生型和突变体菌 株中的碳流量分布的化学计量分析：1)无中间代谢物的净累积或消耗，所述中间代谢物包 括丙酮酸盐和磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP); 2)氧化还原被平衡以使得NADH或NAD+无净改变;3) 产生充足量的三磷酸腺苷(ATP)用于细胞生长和维持，或有净ATP产生。基于最终产物(丙酸 盐、琥珀酸盐、乙酸盐以及正丙醇)和在发酵中所消耗的底物(葡萄糖或甘油）的量来估计碳 流量分布。发酵最终产物和细胞生物质的摩尔碳流量分布用所消耗的底物来标准化。
[0053]分析方法：
[0054] 细胞生长通过用分光光度计（岛津（Shimazu)，哥伦比亚，马里兰州，UV-16-1)在 1.5mL比色杯(光路长度=lcm)中测量600nm下的光密度(OD600)来监测。正丙醇用配备有火 焰离子化检测器(FID)和30.0m恪融娃石柱(Stabilwax_DA，0.25毫米(mm)膜厚度和0.25mm ID，瑞斯泰克(Restek)，贝尔丰特(Bellefonte)，宾夕法尼亚州）的气相色谱仪(GC) (GC-2014岛津，哥伦比亚，马里兰州）来分析。注射温度为200°C，并且使用自动注入器(A0C-20i， 岛津)注射ΙμL样品。最初，柱温在60°C下保持3min。随后，以每分钟30°C的恒定速率使柱温 增加到150°C，并且保持在150°C下4min，每个样品总共lOmin。葡萄糖、甘油以及有机酸（乙 酸、琥珀酸以及丙酸)根据所属领域的技术人员常用的程序使用在45°C下以0.01N H2S04作 为洗脱剂在〇.6ml/min下操作的配备有有机酸柱(拜耳雷德(Bi〇-Rad)，HPX-87)的高效液相 色谱仪(HPLC)来分析。为获得进一步细节，参见例如苏瓦纳卡姆等人，"通过由在纤维床生 物反应器中适应而获得的丙酸丙酸杆菌突变体进行的增强丙酸发酵(Enhanced propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici mutant obtained by adaptation in a fibrous-bed bioreactor)，"《生物技术与生物工程学》 (Biotechnol.Bioeng.)，第91卷，2005,325_337〇
[0055] 统计分析：
[0056] 除非另外指出，否则所有实验都是一式两份地进行，并且报告平均值和标准差。数 据分析通过使用适当的软件计算t-测试值来进行，其中统计学上显著的差异在p<0.05下。
[0057] 在丙酸杆菌中克隆和表达adhE和aad:
[0058] 分别将来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824和大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B的aad和adhE 基因成功克隆到PKHEM04中，其含有来自费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii，P·freudenreichii))亚种谢氏亚种（shermanii)IF012424的用于基因表 达的强p4启动子（参见例如皮奥，如上所引用）。通过电穿孔将所得质粒pKHEM04-aad和 pKHEM04-adhE转化成三种不同的丙酸杆菌（丙酸丙酸杆菌ATCC 4875、费氏丙酸杆菌DSM 20271以及费氏丙酸杆菌DSM 4209)。未从丙酸丙酸杆菌获得菌落，其被解释为仅指示 pKHEM04-adhE与宿主细胞的不相容性，并且不指示丙酸丙酸杆菌不能通过使用相同或不同 的载体而被遗传修饰以表达醛/醇脱氢酶基因。对于用pKHEM04-aad与pKHEM04-adhE转化的 费氏丙酸杆菌菌株两者都获得稳定的菌落。为消除任何来自污染的假阳性，拾取在NLB琼脂 培养板上的菌落并且检查其在液体培养基中产生丙酸的能力。对于用aad或adhE的引物给 出阳性培养物PCR的菌落，和用aad或adhE引物使用从突变体提取的质粒作为模板给出阳性 PCR的菌落验证了阳性转化。最后，将从转化体提取的质粒转化成大肠杆菌并且再次提取， 并且用来自大肠杆菌培养物和来自再次提取的质粒的aad或adhE引物检测到阳性PCR。
[0059] 随后测试经证实为阳性转化体的突变体从葡萄糖生产丙醇的产量。在仅2个具有 表现于费氏丙酸杆菌DSM 4209中的adhE基因的突变体的发酵培养液中检测到正丙醇生产， 所述2个突变体即Pf(adhE)-l和Pf(adhE)-2,其发酵动力学用葡萄糖和甘油作为底物进一 步表征。从任何其它阳性转化体未产生可检测量的正丙醇，这表明酶的表达水平过低或酶 在宿主细胞中不起作用。这些丙酸杆菌的野生型(WT)菌株在相同测试条件下不产生任何可 检测量的正丙醇。
[0060] 以葡萄糖作为碳源的分批发酵动力学：
[0061] 图3、图4以及图5显示用生长在葡萄糖(作为底物）上的费氏丙酸杆菌DSM 4209野 生型(WT)和两个表达adhE基因的突变体Pf(adhE)_l和Pf(adhE)_2的发酵动力学。正如所预 期的，仅是两个突变体而不是WT能够产生正丙醇。在72h之后在突变体的发酵培养液中检测 到正丙醇，并且在约270h时达到最大浓度(来自Pf(adhE)-l的342m g//L和来自Pf(adhE)-2的 291mg/L)。其后，丙醇生产水平由于培养基中的葡萄糖的可获得性有限而趋平。值得注意的 是，与用WT相比，用突变体的葡萄糖消耗和酸生产都显著较快。与用WT相比，在用突变体时， 丙酸与乙酸两者在发酵中都以较快速率产生并且达到较高最终浓度。约9.9g/L到l.lg/L丙 酸和4g/L到4.5g/L乙酸在突变体中产生，而仅8.7g/L丙酸和2.8g/L乙酸通过WT产生。
[0062] 表2概括并且比较来自这些发酵的底物消耗速率以及酸生产率和产率。总体而言， 在所有菌株中获得相当的丙酸产率，但突变体具有显著较高的生产率。明显地，adhE基因在 突变体中的表达不仅导致正丙醇生物合成，并且相对地增加突变体中的有机酸产量。
[0063] 实例2和比较实例2
[0064] 用甘油作为底物的分批发酵动力学
[0065] 还以甘油作为碳源研究了各种菌株的分批发酵动力学，并且结果显示在图6、图7 以及图8中，关键的动力学参数概括于表2中。再次，突变体产生显著量的正丙醇，而WT不产 生任何可检测的量。与葡萄糖发酵相比，多50%到65%的正丙醇以较快速率自甘油产生，在 发酵结束时达到大致500mg/L的最大丙醇滴度。尤其值得注意的是，突变体能够快得多并且 有效得多地使用甘油，其中在200h中消耗全部20g/L甘油（消耗速率:大致 0.10g/L · h)，而 WT在300h中仅使用大致10g/L甘油（消耗速率:大致0.032g/L · h)。因此，较多丙酸由突变体 以0.047g/L · h的较高生产率产生，所述生产率超过用WT的双倍产量(0.021g/L · h)，并且 甚至比用葡萄糖作为碳源的生产率(大致〇.〇31g/L · h)更快。然而，丙酸产率在WT与突变体 两者中类似，大致为〇.64g/g，其高于来自葡萄糖的丙酸产率(大致0.49g/g)。类似于葡萄糖 发酵，通过突变体从甘油产生的乙酸盐也比通过WT产生的更多（大致1.35相对于(vs.)大致 0.6g/L)。来自甘油发酵的P/A比率是用葡萄糖的P/A比率的3到4倍(大致10相对于大致3)， 其指示与针对乙酸生物合成相比，较多甘油碳针对丙酸生物合成。
[0066] adhE表达和正丙醇生物合成对流量分布的作用：
[0067] adhE的表达和正丙醇生物合成可以改变NADH平衡，并且由此影响丙酸发酵中的碳 流量分布。基于发酵中间物(丙酮酸盐和PEP)中无净改变以及氧化还原平衡的假设，在各种 发酵条件下的摩尔流量分布是由对底物(葡萄糖或甘油）消耗和产物形成的实验数据计算 得到，并且结果概括于表3中。在以葡萄糖作为底物的情况下，大部分丙酮酸盐通过恩伯登-梅耶霍夫-帕纳斯(EMP)途径产生。与WT相比，突变体有较少的底物碳进入到细胞生物质中 (5.9%相对于15.8%)，但较多进入到乙酸盐中（28.0%相对于21.1%)，可能是因为细胞需 要较多NADH用于正丙醇和增加的丙酸生物合成。在用较为还原性的底物甘油的情况下，所 有丙酮酸盐都通过EMP途径产生，并且与WT相比，突变体有较多底物碳进入到细胞生物质中 (11.9%相对于5.3 % )并且较少进入到琥珀酸盐中（4.8%相对于11.6% )。另一方面，就突 变体和WT而言，到丙酸盐和正丙醇中的相对碳流量几乎相同，为约75%。到乙酸盐中的碳流 量就突变体(8.6%)与WT(8.2%)两者而言也是类似的。在突变体中产生稍微较多的乙酸盐 以补偿在正丙醇的生物合成中被adhE消耗的额外NADH。用于确定碳流量的反应式提供于表 5和表6中。
[0068] 实例3和比较实例3 [0069]丙醇对丙酸发酵的作用：
[0070]在培养基中培养费氏丙酸杆菌DSM 4209野生型细胞，所述培养基具有甘油作为碳 源以及各种量的正丙醇((^/1、0.58凡、18/1、58/1以及1(^/1)以说明正丙醇对细胞生长和 发酵的作用。如在图9、图10以及图11中可见，丙醇在0.1g/L到lg/L的低浓度下不显著影响 细胞生长或发酵，但在l〇g/L的较高浓度下以显著较长的停滞期抑制细胞生长。然而，在5g/ L丙醇存在下，细胞能够在停滞期中的短期适应之后以显著较高的速率消耗甘油并且产生 丙酸。比生长速率、甘油消耗速率以及丙酸生产率和产率由时程数据估计得到并且概括于 表4中。结果显示，在5g/L正丙醇(p<0.05)存在下，丙酸生产率和滴度增加约20%。同时，乙 酸盐产量在5g/L到10g/L丙醇存在下显著减少，尽管归因于在低浓度水平下的乙酸盐产量 的较大差异，对P/A比率的作用并不显著。琥珀酸产量未受所研究的浓度范围中的正丙醇影 响。
[0071] 表1.用于本研究的细菌菌株、质粒以及引物
[0072] L0073J
[0074] Ap、氨苄青霉素抗性基因;Hyg%潮霉素 B抗性
[0075] 表2. WT、Pf(adhE)_l以及Pf(adhE)_2在不同碳源上的动力学参数
[0076] Luu//」"八比毕：闪酸盐/乙酸盐比毕；
[0078] *指示值显著高于对照物(野生型）的值，p<0.05
[0079] 表3.在分批发酵中生长在葡萄糖和甘油上的野生型和adhE-突变体中的碳流量分 布的化学计量分析
[0080]
[Oubij
[0082] 表4.正丙醇对在血清瓶中生长在甘油上的费氏丙酸杆菌WT丙酸发酵的作用
[0083]
[0084] aP/A比率：内酸盐/乙酸盐比率
[0085] *指示值显著高于对照物(Og/L丙醇）的值，p<0.05
[0086] #指示值显著低于对照物(Og/L丙醇）的值，p<0.05
[0087] 表5.用于碳流量分布的化学计量反应式
[0088]
[0089]
[0090] 细胞生物质由式C4H4X〇4yN4Z表示
[0091 ]表6.用于代谢碳流量分布计算的条件或约束
[0092]
_3]^d =产生的乙酸盐;e =产生的琥珀酸盐;f =产生的丙酸盐;g =产生的正丙醇；生 物质=3h
【主权项】
1. 一种生物合成地制备正丙醇、丙酸或其组合的方法，其包含 (a) 进行起始发酵培养液的发酵，所述起始发酵培养液包含 底物、水以及丙酸杆菌，所述丙酸杆菌被遗传修饰以包括从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40百 分比或更高的兼性厌氧生物获得的adhE基因，以表达被识别为基因库基因(GenBankGene) ID:6062148;GI:170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶，从而形成包括正 丙醇和丙酸作为产物的发酵产物培养液;和 (b) 从所述发酵产物培养液回收所述产物正丙醇、丙酸或其组合的至少一部分。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述遗传修饰的丙酸杆菌选自物种费氏丙酸杆菌 (Propionibacteriumfreudenreichii)、丙酉爱丙酉爱杆菌（Propionibacterium acidipropionici)以及其组合。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述兼性厌氧生物是大肠杆菌(Escherichia coli)〇4. 根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述起始发酵培养液进一步包 含刺激剂正丙醇。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述刺激剂正丙醇在细胞内产生。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞内产生的正丙醇是通过以下制备的 (a) 进行培养液的发酵，所述培养液包含 底物、水以及丙酸杆菌，所述丙酸杆菌被遗传修饰以包括从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40百 分比或更高的兼性厌氧生物获得的adhE基因，以表达被识别为基因库基因ID:6062148;GI: 170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶， 从而形成发酵产物培养液，其包括细胞内产生的正丙醇;和 (b) 从所述发酵产物培养液回收所述细胞内产生的正丙醇的至少一部分。7. 根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述底物包含选自由甘油、葡 萄糖以及其组合组成的群组的碳化合物。8. 根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述起始发酵培养液展现，所 述底物的分解代谢与在其他方面相同但不含有所述遗传修饰的丙酸杆菌而是含有在其他 方面相同的尚未被遗传修饰的丙酸杆菌的起始发酵培养液的底物的分解代谢相比增加了 至少5百分比的量，所述遗传修饰通过插入从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40百分比或更高的兼性 厌氧生物获得的adhE基因以表达被识别为基因库基因ID: 6062148;GI:170080868的对丙 酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶来实现。9. 根据权利要求1到8中任一权利要求所述的方法，其中所述遗传修饰的丙酸杆菌选自 物种费氏丙酸杆菌、丙酸丙酸杆菌以及其组合。10. -种用于修饰供正丙醇或丙酸生物合成使用的丙酸杆菌的方法，其包含 (a) 从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40百分比或更高的兼性厌氧生物获得adhE基因片段;和 (b) 修饰丙酸杆菌的基因组以包括所述adhE基因片段；以使得所述丙酸杆菌表达被识 别为基因库基因ID:6062148;GI:170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述丙酸杆菌选自物种费氏丙酸杆菌、丙酸丙酸 杆菌以及其组合。12. 根据权利要求10或11所述的方法，其中所述adhE基因片段是从大肠杆菌获得的。13. -种供生物合成使用的修饰的丙酸杆菌，其包含具有以下基因组DNA的丙酸杆菌， 所述基因组DNA包括从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40%或更大的兼性厌氧生物获得的插入adhE 基因片段，以使得所述丙酸杆菌表达被识别为基因库基因ID:6062148;GI:170080868的对 丙酰-C〇A具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述丙酸杆菌选自物种费氏丙酸杆菌、丙酸丙酸 杆菌以及其组合。15. 根据权利要求13或14所述的方法，其中所述兼性厌氧生物是大肠杆菌。
【专利摘要】本发明制备一种代谢工程化丙酸杆菌，其被基因组修饰以表达被识别为基因库基因ID：6062148；GI：170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶，并且将其用于发酵方法中以生物合成地制备正丙醇、丙酸或其组合。
【IPC分类】C12P7/52, C07K14/245, C12P7/04
【公开号】CN105492613
【申请号】CN201380064321
【发明人】S-T·杨, E·阿马尔, C·C·斯托瓦斯, B·A·罗德里格兹
【申请人】陶氏环球技术有限责任公司, 俄亥俄州立大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2013年12月16日
【公告号】EP2935596A2, WO2014099707A2, WO2014099707A3
【专利说明】
[0001 ]本申请案要求2012年12月21日提交的美国临时专利申请案61/740,490的优先权， 所述申请案以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
[0002] 本发明涉及代谢工程化细菌，以及其制备和其在一种用于将生物基底物生物转化 成含有正丙醇、丙酸或其组合的产物的方法中的用途。
【背景技术】
[0003] 对化石燃料的未来稀缺、成本和环境影响的顾虑已经激起人们对开采廉价、可再 生生物质作为燃料和化学品的替代来源的关注。由于原油价格已经上涨，生物基化学品和 工业产品已经变为来源于石油的对应物的有吸引力的替代方案。使用厌氧微生物的发酵方 法提供用于将生物质和农业废物转化成化学品和燃料的有前景的途径。存在大量的需要适 当处置以避免污染问题的低值农业商品和食品加工副产品/废物。这些生物质废物材料可 以用作生产燃料和化学品（例如有机酸和醇）的低成本原料。通过发酵途径衍生的产物尤其 为正丙醇和丙酸。
[0004] 正丙醇（1-丙醇、伯丙醇、丙-1-醇）为可与水和其它常用溶剂自由混溶的无害溶 剂，其在工业中有大量应用。这些应用包括例如印刷墨、涂料、清洁剂、粘合剂、除草剂、杀昆 虫剂、药物、除冰流体，以及作为用于生产酯、丙胺、卤化物和热塑性树脂的中间物。还已经 提出了在燃料掺合物中使用正丙醇，因为这种醇具有与乙醇相同的用于增加辛烷值以及充 当汽油中的抗爆添加剂的能力。
[0005] 举例来说，丙酸是广泛用于生产纤维素塑料、除草剂以及香料的重要化学品。丙酸 也是重要的防霉剂。其氨盐、钙盐、钠盐以及钾盐广泛用作食品和饲料防腐剂。某些其它羧 酸也具有工业价值，例如琥珀酸，其能够氢解以产生丁二醇，所述丁二醇适用于生产聚酯和 热成型树脂。
[0006] 虽然正丙醇与丙酸两者都可以通过发酵方法产生，但许多常规发酵方法具有生产 率(productivity)、产率(yield)以及最终产物浓度和纯度低的问题，并且其对于商业应用 而言是不经济的。目前，大部分商业出售的丙酸通过石油化学方法产生。然而，人们对通过 丙酸杆菌由糖的发酵来产生丙酸的关注已经逐渐增加。尽管通过各种方法和菌株改良来提 升发酵生产率和最终产物浓度已经取得一些成功，但在发酵方法中如何进一步提升丙酸产 率和纯度仍然是一个难题。开发用于化学生产的经济上可行的发酵方法需要不仅具有高生 产率并且可以容许高浓度的发酵产物的微生物。
[0007] 用于改良工业微生物的方法在经典菌株改良（CSI)的随机方法到代谢工程的极合 理方法范围内。尽管CSI是众所周知并且常用的方法，但其就时间与资源两者而言都是密集 型的。为了获得对抑制性发酵产物具有高耐受性的菌株，通过在培养基中用逐渐增加的抑 制剂浓度连续培养来连续筛选和选择突变体通常与通过化学诱变剂或紫外线(UV)辐射来 诱发诱变结合使用。然而，常规的培养物筛选过程是冗长、耗时的并且通常是徒劳的。最近， 还已经对重组DNA技术加以应用来提升对抑制性产品的细胞耐受性。这些方法通常更有效， 但使用起来也更复杂，并且需要了解在基因水平上的详细抑制机制，这对于受到特别工业 关注的多数微生物而言是无法获得的。
[0008] 代谢工程广泛用于设计工程化菌株以通过改变代谢流量分布来实现代谢过度生 产的较高效率。迄今为止的大部分代谢工程研究与使用生物来产生次级代谢物(例如抗生 素）、氨基酸(例如赖氨酸）以及异源蛋白质有关，所述生物具有经充分研究的遗传学和生理 学(例如，大肠杆菌(E.coli)、酵母以及杂交瘤细胞）。对代谢流量分布的化学计量分析为代 谢工程、最佳培养基调配和喂养策略以及生物过程最佳化提供指导，然而其需要对发酵细 胞中的代谢和调节网络的深入了解。尽管合理代谢工程方法已经在涉及单个基因或一个基 因簇内的一些基因的情况下取得成功，但其在涉及复杂或在很大程度上未知的代谢途径的 许多情况下是无效的。这是因为合理代谢工程方法通常一次靶向一个基因，并且因此不能 预测途径中的多个基因之间的复杂相互作用。
[0009] 丙酸杆菌是革兰氏阳性(Gram-positive)、过氧化氢酶阳性、无芽孢形成、不动、兼 性厌氧的杆状细菌。丙酸杆菌属(Propionibacterium)的成员（以复数形式或以在这个属内 的任何单个但未鉴别的物种的形式，统称为"丙酸杆菌（p r 〇 p i ο n i b a c t e r i a或a propionibacteria)"广泛用于产生维生素 B12、四吡略化合物和丙酸，以及用于益生菌和乳 酪工业。如图1所示，丙酸杆菌通过二羧酸途径产生丙酸，其中产生乙酸盐和琥珀酸盐作为 副产物。理论上，当糖酵解是通过恩伯登-梅耶霍夫-帕纳斯(Embden-Meyerhof-Parnas， EMP)途径时，一摩尔(mol)葡萄糖仅产生4/3mol丙酸盐和2/3mol醋酸盐。当存在显著细胞生 长和生物质形成时，实际丙酸盐产率低得多。即使在10克每升(g/L)的相对低浓度下，丙酸 盐也是对发酵的强抑制剂。典型分批丙酸发酵需要大致3天以达到20g/L丙酸，其丙酸产率 通常小于0.5克每克(g/g)葡萄糖。丙酸杆菌广泛用于工业中，并且已经对其中的若干种的 基因组进行完全测序。参见例如帕里奇（Parizzi)等人，"丙酸丙酸杆菌（Propioni-bacterium acidipropionici)的基因组序列对其生物技术和工业潜能提供深入了解(The genome sequence of Propioni-bacterium acidipropionici provides insights into its biotechnological and industrial potential)，"《BMC基因组学》(BMC Genomics)， 第 13 卷，2012,562-602。
[0010] 尽管迄今为止丙酸杆菌已经受到关注，然而，几乎没有研究针对这些细菌的遗传 工程，这是由于其基因组中的高GC含量、转化革兰氏阳性细菌的困难以及克隆工具的缺乏。 迄今为止，仅已基于最初从丙酸丙酸杆菌(P. acidipropionici)中分离的质粒开发了两个 表达载体（其使用两个不同的启动子）pKHEM01和pKHEM04(参见例如库亚特帕潘 (Kiatpapan)等人，"构建用于丙酸杆菌的表达载体以及其在通过费氏丙酸杆菌 (Propionibacterium freudenreichii)产生5_氨基乙酰丙酸中的用途（Construction of an expression vector for propionibacteria and its use in production of 5_ aminolevulinic acid by Propionibacterium freudenreichii)，"〈〈应用微生物生物技 术》(Appl .Microbiol .Biotechnol.)，第56卷，2001，144-149)，以及两个报导子载体(其不 具有启动子)ρ?)210(法页(Faye)等人，"构建用于费氏丙酸杆菌中的启动子活性的活体内 分析的报导子向量系统（Construction of a reporter vector system for in vivo analysis of promoter activity in Propionibacterium freudenreichii)，'，《应用和环 境微生物学》(Appl .and Enviro.Microbiology)，第74卷，第 11 期，2008,3615_3617) ;pCVEl (皮奥(Piao)等人，"来自费氏丙酸杆菌的启动子元件的分子分析(Molecular analysis of promoter elements from Propionibacterium freudenreichii)，"《生物科学与生物工程 学杂志》(J.Biosci.and Bioeng)，第97卷，第5期，2004,310-316)。这一领域中的大部分发 表的研究旨在提升维生素 B12产量(参见例如库亚特帕潘等人，如上所引用;室冈(Murooka) 等人，"使用费氏丙酸杆菌的遗传工程产生四吡咯化合物和维生素 B12.概述(Production of tetrapyrro1e compounds and vitamin B 12using genetic engineering of Propionibacterium freudenreichii .An overview)，"《莱特》(Lait)，第85卷，第 1 到2期， 2005,9-22;并且仅有一篇论文已关注通过敲除丙酸丙酸杆菌ATCC4875中的乙酸激酶(ack) 基因来提升丙酸产量(苏瓦纳卡姆（Suwannakham)等人，"构建和表征丙酸丙酸杆菌的基因 敲除突变体用于增强的丙酸发酵(Construction and characterization of knock-out mutants of Propionibacterium acidipropionici for enhanced propionic acid fermentation)，"《威立国际科学》（Wiley InterScience) (www. interscience .wiley · com)，2006年2月28日；另外参见帕里奇等人，如上所引用）。 [0011]已经显示双功能醛/醇脱氢酶能够将乙酰-CoA和丁酰-CoA分别转化成乙醇和丁醇 (参见例如纳尔(Nair)等人，"来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium ac etobutylicum)ATCC 824 的酸/醇脱氢酶基因的分子表征(Molecular characterization of an aldehyde/alcohol dehydrogenase gene from Clostridium acetobutylicum ATCC 824)，"《细菌学杂志》 (J · Bacteriology)，第176卷，1994，871-885 ;余（Yu)等人，"酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum)的代谢工程用于正丁醇生产（Metabolic engineering of Clostridium tyrobutyricum for n-butanol production)，"〈〈代谢工程〉〉（Metabolic Engineering)，第 12卷，2011，373-382;布吕昂（Bruant)等人，"通过食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans)菌株P7T的一氧化碳利用和丁醇生产的基因组分析(Genomic analysis of carbon monoxide utilization and butanol production by Clostridium carboxidivorans Strain P7T)，"公共科学图书馆（PL0S0ne)(www.plosone.org)，第5卷， 第9期，2010年9月，el3033)。作为发酵产物的丙醇在例如詹森(Janssen)，"作为苏氨酸发酵 的最终产物的丙醇（Propanol as an end product ofthreonine fermentation)，"《微生 物文献》(Arch.Microbiol.)，第 182 卷，2004,482-486 中论述。
[0012] W02011029166公开一种用于将底物生物转化成正丙醇的方法，其使用遗传修饰的 微生物与用于在发酵期间以NAD(P)H形式供应还原当量的方法组合。基因编码用于丙酸盐 形成的二羧酸途径的酶，并且至少一个基因编码用于催化丙酸盐/丙酰-CoA到正丙醇的转 化的酶。
[0013] W02008098254公开组合生物与热化学转化方法以产生中间物，接着将中间物重组 到所需产物中。使用多种碳底物，其条件是总底物的不超过75百分比（％)是碳水化合物。可 以产生丙醇，以及其它产物，包括乙醇、丙二醇以及1，4_ 丁二醇。
[0014] W02009154624公开一种使用代谢工程化突变体细菌的发酵，所述细菌的ack与pta 基因中的一者或两者被破坏。使用这些工程化细菌发酵的结果是大于50g/L的产物浓度。产 物可以包括丙酸、丁酸以及乙酸。在一些实施例中使用纤维床生物反应器。
【发明内容】
[0015] 在一个方面中，本发明提供一种用于生物合成正丙醇或丙酸的方法，其包含(a)进 行起始发酵培养液的发酵，所述起始发酵培养液包含底物、水以及丙酸杆菌，所述丙酸杆菌 被遗传修饰以包括从鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量为40百分比（％ )或更高的兼性厌氧生物获得 的adhE基因，以表达被识别为基因库基因 （GenBank Gene)ID:6062148;GI :170080868的对 丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶，从而形成包括正丙醇和丙酸作为产物的发酵产 物培养液;和(b)从发酵产物培养液回收产物正丙醇、丙酸或其组合的至少一部分。
[0016] 在另一方面中，本发明提供一种用于修饰供正丙醇或丙酸生物合成使用的丙酸杆 菌的方法，其包含(a)从GC含量为40%或更高的兼性厌氧生物获得adhE基因片段;和(b)修 饰丙酸杆菌的基因组以包括所述adhE基因片段；以使得丙酸杆菌表达被识别为基因库基因 ID:6062148;GI :170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。
[0017] 在又一方面中，本发明提供一种供生物合成使用的修饰的丙酸杆菌，其包含具有 基因组DNA的丙酸杆菌，所述基因组DNA包括从GC含量为40%或更大的兼性厌氧生物获得的 插入adhE基因片段，以使得丙酸杆菌表达被识别为基因库基因 ID:6062148;GI :170080868 的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。
【附图说明】
[0018] 图1.用于在丙酸杆菌中的正丙醇生物合成的二羧酸途径和异源adhE的表达。
[0019] 图2.pKHEM04-adhE 的构建。
[0020] 图3.通过费氏丙酸杆菌(？.:^611(161^61(311；[;0野生型的葡萄糖分批发酵的动力学。
[0021] 图4.通过表达adhE的费氏丙酸杆菌突变体菌株Pf(adhE)-l的葡萄糖分批发酵的 动力学。
[0022]图5.通过表达adhE的费氏丙酸杆菌突变体菌株Pf(adhE)_2的葡萄糖分批发酵的 动力学。
[0023]图6.通过费氏丙酸杆菌野生型的甘油分批发酵的动力学。
[0024]图7.通过表达adhE的费氏丙酸杆菌突变体菌株Pf(adhE)_l的甘油分批发酵的动 力学。
[0025]图8.通过表达adhE的费氏丙酸杆菌突变体菌株Pf(adhE)_2的甘油分批发酵的动 力学。
[0026] 图9.在各种浓度的丙醇存在下，丙醇在生长于甘油上的费氏丙酸杆菌野生型的分 批发酵中对细胞生长的作用。
[0027] 图10.在各种浓度的丙醇存在下，丙醇在生长于甘油上的费氏丙酸杆菌野生型的 分批发酵中对甘油消耗的作用。
[0028] 图11.在各种浓度的丙醇存在下，丙醇在生长于甘油上的费氏丙酸杆菌野生型的 分批发酵中对丙酸产量的作用。
【具体实施方式】
[0029] 总体而言，本发明包括一种特定的遗传修饰的丙酸杆菌微生物，其表达特定的双 功能醛/醇脱氢酶;一种制备所述微生物的方法；以及其在发酵培养基中用于制备含有正丙 醇、丙酸或其两者的产物的用途，其中与使用在其他方面相同但未被相同地遗传修饰的丙 酸杆菌相比，正丙醇的产率、滴度以及生产率有所提升，并且丙酸的滴度和生产率也得到提 升。这一结果得以实现是因为特定双功能醛/醇脱氢酶相对地增加丙酰-CoA到正丙醇的转 化。
[0030] 微生物可以选自各种物种中的任一个，所述物种包括(在非限制性实例中）费氏丙 酸杆菌、丙酸丙酸杆菌以及其组合。所选择的生物被遗传修饰以产生被识别为基因库基因 ID:6062148;GI :170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。为了根据本发明 遗传修饰（即转化)这些微生物以使得其将表达所需的脱氢酶，用于双功能醛/醇脱氢酶的 特定基因编码(adhE)从特定来源克隆。包括"基因 ID"以及"GI"的基因库识别信息指的是特 定蛋白质结构，其可以通过应用公开可获得的名为"BLAST"的网络寄存(web-hosted)软件 容易地获得，所述软件可以在美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth，NIH) 网站http://www.ncbi .nlm.nih.gov/genbank上获得，并且涉及特定相关基因的信息可以 更特定地在111^。：//?〇^.11〇13；[.111111.11；[11.80￥/^6116/?丨61'111 = 6062148处找到。用于修饰丙酸 杆菌的基因编码的来源理想地是GC含量为40%或更高的兼性厌氧生物。任何给定基因的GC 含量百分比可以通过参考发表的论文及/或通过使用适当的计算软件从已公布的序列计算 来获得。
[0031] 举例来说，在本发明的一个特定实施例中，a d h E基因可以从大肠杆菌 (Escherichiacoli)获得，基于基因库基因 ID 6062148(大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B)，已 知所述大肠杆菌具有大致51 %的GC含量。（为获得关于大肠杆菌基因组的更多以及通用信 息，参见例如德菲(Durfee)等人，"大肠杆菌DH10B的全基因组序列:对实验室主力的生物学 的深入了角军（The complete genome sequence ofEscherichia coli DH10B： Insights into the biology of a laboratory workhorse)，''〈〈细菌学杂志Kj.Bacteriology)，第 190卷，第7期，2008，2597-2606。还已知其为兼性厌氧生物。如所述术语在本文中使用，"兼 性厌氧生物"被定义为指一种生物，通常是细菌，其在氧气存在的情况下通过有氧呼吸产生 三磷酸腺苷(ATP)但也能够切换为发酵。相反，专性厌氧菌在氧气存在下死亡。
[0032]将克隆的adhE基因插入到丙酸杆菌基因组中的结果是一种突变体丙酸杆菌，其通 过表达插入的adhE基因，即产生被识别为基因库基因 ID:6062148;GI: 170080868的特定醛/ 醇脱氢酶而将丙酰-CoA转化成正丙醇。这一正丙醇可以随后按原样回收，或使其与也是通 过突变体丙酸杆菌或通过相同或不同物种的未被修饰丙酸杆菌产生的丙酸一起保留在发 酵培养液中。因此，本发明方法的一个优势是可以从发酵培养液中回收最终产物，其可以是 正丙醇、丙酸或其组合。
[0033]用于将adhE编码插入到基因组中的代谢工程可以通过所属领域的技术人员已知 的方式和方法来进行。尤其便利的是这种编码仅表示关于丙酸杆菌的单一基因，由此与涉 及一些其它生物和/或多个基因的方法相比简化修饰方法。
[0034]总体而言，本发明代谢工程化丙酸杆菌在一个非限制性实施例中可以通过以下 步 骤制备:首先从所选择的兼性厌氧生物，例如大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B分离基因组DNA， 接着使用常规设计的引物根据所属领域的技术人员的一般技术进行PCR扩增。在PCR扩增之 后，可以将adhE基因克隆到pGEM-T载体中。其后，可以随后使用pGEM-T载体作为模板将adhE 基因克隆到PKHEM04载体中，其通过使质粒经受BspHI和NdeI的限制性消化以产生DNA片段 产物，所述产物随后被连接到Ncol和Ndel限制性消化的pKHEM04质粒上来实现。经抗生素选 择的突变体可以随后通过用PKHEM04载体使丙酸杆菌培养物电穿孔来产生。所属领域的技 术人员将通常了解有效地实现所需丙酸杆菌基因组转化的转化方式和方法，并且认为额外 描述在此是不必要的。
[0035] 一旦本发明的代谢工程化丙酸杆菌已经制备好后，所述丙酸杆菌可以用于生物合 成方法中以制备例如正丙醇、丙酸或其组合。所述方法可以理想地以制备适合的发酵培养 液开始。除代谢工程化丙酸杆菌以外，发酵培养液还理想地包括水和至少一种底物，其中以 发酵培养液的总体积计，丙酸杆菌培养物的初始量在1 %到50% (体积/体积(v/v))范围内， 并且优选地为5%到25% (v/v)。总体而言，优选的是使用在0.5到4.0范围内的600纳米下接 种物光密度(〇D_)，但经常为约1.5到约2.5。代谢工程化丙酸杆菌可以用作给定发酵培养 液中的唯一发酵生物，或可以与一或多种额外发酵生物组合，所述额外发酵性生物包括(但 不限于)未被修饰的丙酸杆菌以及被修饰和未被修饰的其它属生物。
[0036]本发明方法的发酵部分中的遗传修饰的丙酸杆菌可以使用广泛多种底物。所述底 物可以包括一或多种碳源，例如在非限制性实例中，碳水化合物、醇、酸、醛、酮、氨基酸、肽 等。举例来说，这些可以包括单糖(例如葡萄糖、果糖以及木糖）、寡糖（即蔗糖、乳糖）、多糖 (即淀粉、纤维素、半纤维素）、木质纤维素材料、脂肪酸、琥珀酸盐、乳酸盐、乙酸盐、甘油等， 或其组合。底物可以是光合作用的产物，例如葡萄糖或纤维素。用作底物的单糖可以是多糖 水解的产物，例如纤维素、淀粉以及果胶的酸或酶促水解产物。出于理解目的，术语"能源" 可以与碳源互换使用，因为在化能有机营养代谢中，碳源在分解代谢期间用作电子供体并 且在细胞生长期间用作碳源。
[0037]按比例，以水计，理想的是底物表示发酵培养液的1 %到15% (w/v)，并且理想地为 2.5%、更理想地5%到10% (w/v)。发酵温度(包括斜线上升和/或下降）、发酵时间、pH以及 其它条件为所属领域的技术人员已知，并且所述各者的差异将被认为是影响产物产率、副 产物、比例等的因素。尽管如此，从商业观点出发，通常认为理想的是以低于72小时的时间 为目标以实现至少50g/L，并且更理想地至少80g/L的产物(正丙醇和/或丙酸)滴度。尽管如 上所述，但应理解产物滴度在某些实施例中可以在低于（<)lg/L到120g/L范围内。
[0038]这一反应中的正丙醇产量受烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH)可获得性限制， 其可以通过使用甘油而非葡萄糖作为底物而显著提升。在非限制性实例中，所属领域的技 术人员所熟知的解决这一限制的其它方式可以包括:用甲酸盐补充剂在生长培养基中过度 表达甲酸脱氢酶、使用电极以在培养液中建立还原环境或施加氧化还原介体或人造电子载 体以为丙醇和丙酸生物合成增加 NADH可获得性。
[0039]本发明的一个特定优势为起始发酵培养液可以被改质以使得与代谢工程化丙酸 杆菌、底物和水组合的丙醇(在本文中称为"刺激剂丙醇"）被包括在内。所述丙醇区别于产 物丙醇，因为其在发酵开始时添加。所述丙醇可以选自正丙醇和其它丙醇异构体，其中正丙 醇为优选的。外部引入的（"掺加"）丙醇可以以任何手段自身产生，如细胞内、细胞外，或为 其它化学合成的结果。然而，可以衍生出一个尤其并且出人意料地有利的影响，其中用于 "掺加"发酵培养液的丙醇自身已于细胞内产生，其例如通过单独进行的（即额外的）与本发 明方法相同的方法来实现。优选的是以发酵培养液的体积作为整体计，外部引入，但在一些 实施例中细胞内产生的"掺加"丙醇以在O.Olg/L到10g/L，更优选地2g/L到7g/L范围内的量 使用。在起始发酵培养液中的所述外部引入丙醇用以增加产物发酵培养液中的丙酸和正丙 醇产量，因此命名法的使用将其称为"刺激剂"。所述增加的量可以在10%重量每体积(w/v) 到125%w/v范围内，优选为25%w/v到125%w/v，例如在lg/L到7g/L范围内的滴度增加，其 中不同底物的差异在相同条件下指出。举例来说，全甘油底物可以在某些实施例中展现与 全葡萄糖底物相比实质上更大的提升。
[0040] 本发明的一个优势是，在某些非限制性实施例中，底物的分解代谢与在其他方面 相同但不含有遗传修饰的丙酸杆菌而是含有在其他方面相同的尚未被遗传修饰的丙酸杆 菌的起始发酵培养液的底物的分解代谢相比可以增加至少5百分比的量，所述遗传修饰通 过插入从GC含量为40%或更高的兼性厌氧生物获得的adhE基因以表达被识别为基因库基 因 ID:6062148;GI :170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶来实现。
[0041] 使用本发明代谢工程化微生物，表达adhE，本发明方法的结果是丙酰-CoA有效并 且便利地大量被转化成正丙醇。以下实例和比较实例将更全面地说明本发明的某些实施例 和方面，但其不应解释为限制本发明的范围。
[0042] 实例1和比较实例1 [0043]细菌菌株、质粒以及培养基：
[0044] 用于本实例的所有细菌菌株和质粒都在表1中列出。在37摄氏度(°C)下于补充有 100微克每毫升(μg/ml)氨节青霉素(ampicillin)的卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani，LB) 培养基中有氧生长大肠杆菌DH5a(-种GC含量为40%或更高的兼性厌氧生物）以得到其转 化体。出于比较目的，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum，C.acetobutylicum)美 国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)824(其也是一种兼性 厌氧生物)在37°C下于强化梭菌培养基(RCM，蒂夫科(Difco))中厌氧培养。丙酸杆菌在32°C 下于含有l〇g/L乳酸钠、10g/L酵母提取物以及lOg/li夷蛋白酶解酪蛋白大豆培养液的北光 生物科学(Northern Lights BioScience，NLB)培养基中厌氧生长以制备感受态细胞并且 用于细胞在电穿孔之后恢复。对于发酵动力学研究，细胞在含有l〇g/L酵母提取物、5g/L胰 蛋白酶解酪蛋白、〇. 25g/L K2HP〇4、0.05g/L MnS〇4、25g/L葡萄糖或甘油(作为碳源）以及2% CaC03(用于缓冲培养基pH)的培养基中生长。为获得关于更多细节的方法，参见例如杨 (Yang)等人，"由甘油通过代谢工程化丙酸丙酸杆菌的丙酸生产（Propionic acid production from glycerol by metabolically engineered Propionibacterium acidipropionici)，"《过程生物化学》（Process Biochem)，第44卷，2009，1346-1351。这些 培养基通过121°C、15镑每平方英寸表压(psig)(约204.75千帕斯卡，1^ &)下高压灭菌30分 钟(min)来灭菌。除非另外指出，否则将过滤灭菌的潮霉素 B无菌添加到无菌培养基中达到 250μg/ml的最终浓度以用于培养和维持血清瓶中的丙酸杆菌转化体。所有储备培养物都保 持在4°C下用于短期使用并且保持在_80°C下用于长期存储。
[0045] 构建aad和adhE表达载体：
[0046] 在于10毫克每毫升(mg/ml)溶菌酶中在37°C下培育20min到30min之后，细胞被溶 解。随后使用凯杰(QIAGEN)基因组DNA试剂盒(凯杰，巴伦西亚市(Valencia)，加利福尼亚 州）分离染色体DNA。使用个别基因组DNA作为模板和具有引入BspHI和Ndel限制性位点（参 见表1)的引物于DNA引擎(MJ研究(MJ Research)，里诺市，内华达州）中PCR扩增大肠杆菌 adhE和（比较）丙酮丁醇梭菌aad基因（aad基因的GC含量为35%，基于基因库登记号： AE001438.3)。使含有5μ1 10XPCR缓冲液（英维罗根（Invitrogen)，格兰德岛（Grand Island)，纽约，美国）、1μ1 25mMMgCl2、lyl 10mM dNTP(每一）、1μ110πιΜ 正向引物、ΙμΙΙΟπιΜ 反向引物、1 μ 1基因组DNA以及2.5U TaqDNA聚合酶(英维罗根）的反应混合物(50微升(μ 1)) 经受在94°C下的初始变性步骤2min、在94°C下的34个重复变性循环30秒、在55°C下的退火 30s以及在72°C下的延伸3min以及在72°C下的PCR产物最终延伸lOmin。将PCR产物克隆到 pGEM-T载体(普洛麦格(Promega)，麦迪逊(Madison)，威斯康星州，美国）中以构建对应的 pGEM-aad和pGEM-adhE载体，其使用QIAprep微量制备(MiniPrep)质粒纯化试剂盒来分离和 纯化。为了构建表达载体pKHEM04-aad和pKHEM04-adhE，用BspHI和Ndel RE双重消化pGEM-aad和pGEM-adhE，并且对应的aad和adhE DNA片段在使用QIAquick凝胶提取试 剂盒从琼脂 糖凝胶纯化之后与用Ncol和Ndel RE消化的pKHEM04连接(参见图2) AspHI与Ncol两者都具 有相容的粘性末端。为了检验克隆基因，通过俄亥俄州立大学(Ohio State University)的 植物-微生物基因组设施(Plant-Microbe Genomic Facility)对其DNA序列进行测序。 [0047]丙酸杆菌的转化：
[0048]用pKHEM04_aad和pKHEM04_adhE转化丙酸杆菌根据所属领域的技术人员熟知的程 序通过电穿孔来进行。为获得额外细节，参见例如薛(Xue)等人，"高摩尔渗透压浓度提升革 兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtil is)和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)的电转化效率（High osmolarity improves the electro- transformation efficiency of the Gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis)，"《微生物学方法杂志》（J.Microbiol .Methods)，第34卷，1999， 183-191。将在NLB培养基中生长到0D6Q()为大致0.6到0.8的细胞在冰水上冷却10min，通过在 4°C和4，000转每分钟(rpm)下离心10min收集，用冰冷电穿孔培养基（10 %甘油)洗涤4次，并 且再悬浮于电穿孔培养基(初始培养物体积的1/40)中。随后，将在0.1cm比色杯中与lyg到2 yg质粒DNA混合的100μ1感受态细胞在冰上培育2min到5min并且用基因-脉冲发生器(Gene-Pulser)(拜耳-雷德实验室(Bio-RadLaboratories)，里奇蒙(Richmond)，加利福尼亚州）在 25微法拉化？）、200欧姆（0)、20千伏特每厘米(1^/〇11)以及在4.5与5.0毫秒(1118)之间的时 间常数下电穿孔。将电穿孔的细胞转移到lml恢复培养基中培养3小时(h)，随后涂在具有 250μg/ml潮霉素 B的NLB琼脂培养基上。在培养大致10天之后，拾取在培养板上的菌落，并且 通过PCR使用表1中所示的对应adhE或aad基因引物确认转化体。
[0049] 发酵动力学：
[0050] 在血清瓶中于32°C和大致pH 6.8(在Ca⑶3存在下)研究用所选择的转化体和亲本 菌株进行的葡萄糖和甘油分批发酵。定期取得样品以监测底物消耗以及正丙醇和有机酸产 量。为研究正丙醇对细胞生长和发酵的作用，将各种量的正丙醇添加在血清瓶中的培养基 中。未在用于生长测试的培养基中添加 CaC03。除非另外指出，否则对于每一被研究的条件 至少使用一式两个瓶子。
[0051 ]碳流量分布的化学计量分析：
[0052]为评估adhE表达和正丙醇生物合成对丙酸发酵的作用，使用在补充材料 (Supplemental Material)中给出的化学计量反应式以及以下假设进行野生型和突变体菌 株中的碳流量分布的化学计量分析：1)无中间代谢物的净累积或消耗，所述中间代谢物包 括丙酮酸盐和磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP); 2)氧化还原被平衡以使得NADH或NAD+无净改变;3) 产生充足量的三磷酸腺苷(ATP)用于细胞生长和维持，或有净ATP产生。基于最终产物(丙酸 盐、琥珀酸盐、乙酸盐以及正丙醇)和在发酵中所消耗的底物(葡萄糖或甘油）的量来估计碳 流量分布。发酵最终产物和细胞生物质的摩尔碳流量分布用所消耗的底物来标准化。
[0053]分析方法：
[0054] 细胞生长通过用分光光度计（岛津（Shimazu)，哥伦比亚，马里兰州，UV-16-1)在 1.5mL比色杯(光路长度=lcm)中测量600nm下的光密度(OD600)来监测。正丙醇用配备有火 焰离子化检测器(FID)和30.0m恪融娃石柱(Stabilwax_DA，0.25毫米(mm)膜厚度和0.25mm ID，瑞斯泰克(Restek)，贝尔丰特(Bellefonte)，宾夕法尼亚州）的气相色谱仪(GC) (GC-2014岛津，哥伦比亚，马里兰州）来分析。注射温度为200°C，并且使用自动注入器(A0C-20i， 岛津)注射ΙμL样品。最初，柱温在60°C下保持3min。随后，以每分钟30°C的恒定速率使柱温 增加到150°C，并且保持在150°C下4min，每个样品总共lOmin。葡萄糖、甘油以及有机酸（乙 酸、琥珀酸以及丙酸)根据所属领域的技术人员常用的程序使用在45°C下以0.01N H2S04作 为洗脱剂在〇.6ml/min下操作的配备有有机酸柱(拜耳雷德(Bi〇-Rad)，HPX-87)的高效液相 色谱仪(HPLC)来分析。为获得进一步细节，参见例如苏瓦纳卡姆等人，"通过由在纤维床生 物反应器中适应而获得的丙酸丙酸杆菌突变体进行的增强丙酸发酵(Enhanced propionic acid fermentation by Propionibacterium acidipropionici mutant obtained by adaptation in a fibrous-bed bioreactor)，"《生物技术与生物工程学》 (Biotechnol.Bioeng.)，第91卷，2005,325_337〇
[0055] 统计分析：
[0056] 除非另外指出，否则所有实验都是一式两份地进行，并且报告平均值和标准差。数 据分析通过使用适当的软件计算t-测试值来进行，其中统计学上显著的差异在p<0.05下。
[0057] 在丙酸杆菌中克隆和表达adhE和aad:
[0058] 分别将来自丙酮丁醇梭菌ATCC 824和大肠杆菌菌株K-12亚株DH10B的aad和adhE 基因成功克隆到PKHEM04中，其含有来自费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii，P·freudenreichii))亚种谢氏亚种（shermanii)IF012424的用于基因表 达的强p4启动子（参见例如皮奥，如上所引用）。通过电穿孔将所得质粒pKHEM04-aad和 pKHEM04-adhE转化成三种不同的丙酸杆菌（丙酸丙酸杆菌ATCC 4875、费氏丙酸杆菌DSM 20271以及费氏丙酸杆菌DSM 4209)。未从丙酸丙酸杆菌获得菌落，其被解释为仅指示 pKHEM04-adhE与宿主细胞的不相容性，并且不指示丙酸丙酸杆菌不能通过使用相同或不同 的载体而被遗传修饰以表达醛/醇脱氢酶基因。对于用pKHEM04-aad与pKHEM04-adhE转化的 费氏丙酸杆菌菌株两者都获得稳定的菌落。为消除任何来自污染的假阳性，拾取在NLB琼脂 培养板上的菌落并且检查其在液体培养基中产生丙酸的能力。对于用aad或adhE的引物给 出阳性培养物PCR的菌落，和用aad或adhE引物使用从突变体提取的质粒作为模板给出阳性 PCR的菌落验证了阳性转化。最后，将从转化体提取的质粒转化成大肠杆菌并且再次提取， 并且用来自大肠杆菌培养物和来自再次提取的质粒的aad或adhE引物检测到阳性PCR。
[0059] 随后测试经证实为阳性转化体的突变体从葡萄糖生产丙醇的产量。在仅2个具有 表现于费氏丙酸杆菌DSM 4209中的adhE基因的突变体的发酵培养液中检测到正丙醇生产， 所述2个突变体即Pf(adhE)-l和Pf(adhE)-2,其发酵动力学用葡萄糖和甘油作为底物进一 步表征。从任何其它阳性转化体未产生可检测量的正丙醇，这表明酶的表达水平过低或酶 在宿主细胞中不起作用。这些丙酸杆菌的野生型(WT)菌株在相同测试条件下不产生任何可 检测量的正丙醇。
[0060] 以葡萄糖作为碳源的分批发酵动力学：
[0061] 图3、图4以及图5显示用生长在葡萄糖(作为底物）上的费氏丙酸杆菌DSM 4209野 生型(WT)和两个表达adhE基因的突变体Pf(adhE)_l和Pf(adhE)_2的发酵动力学。正如所预 期的，仅是两个突变体而不是WT能够产生正丙醇。在72h之后在突变体的发酵培养液中检测 到正丙醇，并且在约270h时达到最大浓度(来自Pf(adhE)-l的342m g//L和来自Pf(adhE)-2的 291mg/L)。其后，丙醇生产水平由于培养基中的葡萄糖的可获得性有限而趋平。值得注意的 是，与用WT相比，用突变体的葡萄糖消耗和酸生产都显著较快。与用WT相比，在用突变体时， 丙酸与乙酸两者在发酵中都以较快速率产生并且达到较高最终浓度。约9.9g/L到l.lg/L丙 酸和4g/L到4.5g/L乙酸在突变体中产生，而仅8.7g/L丙酸和2.8g/L乙酸通过WT产生。
[0062] 表2概括并且比较来自这些发酵的底物消耗速率以及酸生产率和产率。总体而言， 在所有菌株中获得相当的丙酸产率，但突变体具有显著较高的生产率。明显地，adhE基因在 突变体中的表达不仅导致正丙醇生物合成，并且相对地增加突变体中的有机酸产量。
[0063] 实例2和比较实例2
[0064] 用甘油作为底物的分批发酵动力学
[0065] 还以甘油作为碳源研究了各种菌株的分批发酵动力学，并且结果显示在图6、图7 以及图8中，关键的动力学参数概括于表2中。再次，突变体产生显著量的正丙醇，而WT不产 生任何可检测的量。与葡萄糖发酵相比，多50%到65%的正丙醇以较快速率自甘油产生，在 发酵结束时达到大致500mg/L的最大丙醇滴度。尤其值得注意的是，突变体能够快得多并且 有效得多地使用甘油，其中在200h中消耗全部20g/L甘油（消耗速率:大致 0.10g/L · h)，而 WT在300h中仅使用大致10g/L甘油（消耗速率:大致0.032g/L · h)。因此，较多丙酸由突变体 以0.047g/L · h的较高生产率产生，所述生产率超过用WT的双倍产量(0.021g/L · h)，并且 甚至比用葡萄糖作为碳源的生产率(大致〇.〇31g/L · h)更快。然而，丙酸产率在WT与突变体 两者中类似，大致为〇.64g/g，其高于来自葡萄糖的丙酸产率(大致0.49g/g)。类似于葡萄糖 发酵，通过突变体从甘油产生的乙酸盐也比通过WT产生的更多（大致1.35相对于(vs.)大致 0.6g/L)。来自甘油发酵的P/A比率是用葡萄糖的P/A比率的3到4倍(大致10相对于大致3)， 其指示与针对乙酸生物合成相比，较多甘油碳针对丙酸生物合成。
[0066] adhE表达和正丙醇生物合成对流量分布的作用：
[0067] adhE的表达和正丙醇生物合成可以改变NADH平衡，并且由此影响丙酸发酵中的碳 流量分布。基于发酵中间物(丙酮酸盐和PEP)中无净改变以及氧化还原平衡的假设，在各种 发酵条件下的摩尔流量分布是由对底物(葡萄糖或甘油）消耗和产物形成的实验数据计算 得到，并且结果概括于表3中。在以葡萄糖作为底物的情况下，大部分丙酮酸盐通过恩伯登-梅耶霍夫-帕纳斯(EMP)途径产生。与WT相比，突变体有较少的底物碳进入到细胞生物质中 (5.9%相对于15.8%)，但较多进入到乙酸盐中（28.0%相对于21.1%)，可能是因为细胞需 要较多NADH用于正丙醇和增加的丙酸生物合成。在用较为还原性的底物甘油的情况下，所 有丙酮酸盐都通过EMP途径产生，并且与WT相比，突变体有较多底物碳进入到细胞生物质中 (11.9%相对于5.3 % )并且较少进入到琥珀酸盐中（4.8%相对于11.6% )。另一方面，就突 变体和WT而言，到丙酸盐和正丙醇中的相对碳流量几乎相同，为约75%。到乙酸盐中的碳流 量就突变体(8.6%)与WT(8.2%)两者而言也是类似的。在突变体中产生稍微较多的乙酸盐 以补偿在正丙醇的生物合成中被adhE消耗的额外NADH。用于确定碳流量的反应式提供于表 5和表6中。
[0068] 实例3和比较实例3 [0069]丙醇对丙酸发酵的作用：
[0070]在培养基中培养费氏丙酸杆菌DSM 4209野生型细胞，所述培养基具有甘油作为碳 源以及各种量的正丙醇((^/1、0.58凡、18/1、58/1以及1(^/1)以说明正丙醇对细胞生长和 发酵的作用。如在图9、图10以及图11中可见，丙醇在0.1g/L到lg/L的低浓度下不显著影响 细胞生长或发酵，但在l〇g/L的较高浓度下以显著较长的停滞期抑制细胞生长。然而，在5g/ L丙醇存在下，细胞能够在停滞期中的短期适应之后以显著较高的速率消耗甘油并且产生 丙酸。比生长速率、甘油消耗速率以及丙酸生产率和产率由时程数据估计得到并且概括于 表4中。结果显示，在5g/L正丙醇(p<0.05)存在下，丙酸生产率和滴度增加约20%。同时，乙 酸盐产量在5g/L到10g/L丙醇存在下显著减少，尽管归因于在低浓度水平下的乙酸盐产量 的较大差异，对P/A比率的作用并不显著。琥珀酸产量未受所研究的浓度范围中的正丙醇影 响。
[0071] 表1.用于本研究的细菌菌株、质粒以及引物
[0072] L0073J
[0074] Ap、氨苄青霉素抗性基因;Hyg%潮霉素 B抗性
[0075] 表2. WT、Pf(adhE)_l以及Pf(adhE)_2在不同碳源上的动力学参数
[0076] Luu//」"八比毕：闪酸盐/乙酸盐比毕；
[0078] *指示值显著高于对照物(野生型）的值，p<0.05
[0079] 表3.在分批发酵中生长在葡萄糖和甘油上的野生型和adhE-突变体中的碳流量分 布的化学计量分析
[0080]
[Oubij
[0082] 表4.正丙醇对在血清瓶中生长在甘油上的费氏丙酸杆菌WT丙酸发酵的作用
[0083]
[0084] aP/A比率：内酸盐/乙酸盐比率
[0085] *指示值显著高于对照物(Og/L丙醇）的值，p<0.05
[0086] #指示值显著低于对照物(Og/L丙醇）的值，p<0.05
[0087] 表5.用于碳流量分布的化学计量反应式
[0088]
[0089]
[0090] 细胞生物质由式C4H4X〇4yN4Z表示
[0091 ]表6.用于代谢碳流量分布计算的条件或约束
[0092]
_3]^d =产生的乙酸盐;e =产生的琥珀酸盐;f =产生的丙酸盐;g =产生的正丙醇；生 物质=3h
【主权项】
1. 一种生物合成地制备正丙醇、丙酸或其组合的方法，其包含 (a) 进行起始发酵培养液的发酵，所述起始发酵培养液包含 底物、水以及丙酸杆菌，所述丙酸杆菌被遗传修饰以包括从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40百 分比或更高的兼性厌氧生物获得的adhE基因，以表达被识别为基因库基因(GenBankGene) ID:6062148;GI:170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶，从而形成包括正 丙醇和丙酸作为产物的发酵产物培养液;和 (b) 从所述发酵产物培养液回收所述产物正丙醇、丙酸或其组合的至少一部分。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述遗传修饰的丙酸杆菌选自物种费氏丙酸杆菌 (Propionibacteriumfreudenreichii)、丙酉爱丙酉爱杆菌（Propionibacterium acidipropionici)以及其组合。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述兼性厌氧生物是大肠杆菌(Escherichia coli)〇4. 根据权利要求1到3中任一权利要求所述的方法，其中所述起始发酵培养液进一步包 含刺激剂正丙醇。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述刺激剂正丙醇在细胞内产生。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞内产生的正丙醇是通过以下制备的 (a) 进行培养液的发酵，所述培养液包含 底物、水以及丙酸杆菌，所述丙酸杆菌被遗传修饰以包括从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40百 分比或更高的兼性厌氧生物获得的adhE基因，以表达被识别为基因库基因ID:6062148;GI: 170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶， 从而形成发酵产物培养液，其包括细胞内产生的正丙醇;和 (b) 从所述发酵产物培养液回收所述细胞内产生的正丙醇的至少一部分。7. 根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述底物包含选自由甘油、葡 萄糖以及其组合组成的群组的碳化合物。8. 根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述起始发酵培养液展现，所 述底物的分解代谢与在其他方面相同但不含有所述遗传修饰的丙酸杆菌而是含有在其他 方面相同的尚未被遗传修饰的丙酸杆菌的起始发酵培养液的底物的分解代谢相比增加了 至少5百分比的量，所述遗传修饰通过插入从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40百分比或更高的兼性 厌氧生物获得的adhE基因以表达被识别为基因库基因ID: 6062148;GI:170080868的对丙 酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶来实现。9. 根据权利要求1到8中任一权利要求所述的方法，其中所述遗传修饰的丙酸杆菌选自 物种费氏丙酸杆菌、丙酸丙酸杆菌以及其组合。10. -种用于修饰供正丙醇或丙酸生物合成使用的丙酸杆菌的方法，其包含 (a) 从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40百分比或更高的兼性厌氧生物获得adhE基因片段;和 (b) 修饰丙酸杆菌的基因组以包括所述adhE基因片段；以使得所述丙酸杆菌表达被识 别为基因库基因ID:6062148;GI:170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述丙酸杆菌选自物种费氏丙酸杆菌、丙酸丙酸 杆菌以及其组合。12. 根据权利要求10或11所述的方法，其中所述adhE基因片段是从大肠杆菌获得的。13. -种供生物合成使用的修饰的丙酸杆菌，其包含具有以下基因组DNA的丙酸杆菌， 所述基因组DNA包括从鸟嘌呤-胞嘧啶含量为40%或更大的兼性厌氧生物获得的插入adhE 基因片段，以使得所述丙酸杆菌表达被识别为基因库基因ID:6062148;GI:170080868的对 丙酰-C〇A具有活性的双功能醛/醇脱氢酶。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述丙酸杆菌选自物种费氏丙酸杆菌、丙酸丙酸 杆菌以及其组合。15. 根据权利要求13或14所述的方法，其中所述兼性厌氧生物是大肠杆菌。
【专利摘要】本发明制备一种代谢工程化丙酸杆菌，其被基因组修饰以表达被识别为基因库基因ID：6062148；GI：170080868的对丙酰-CoA具有活性的双功能醛/醇脱氢酶，并且将其用于发酵方法中以生物合成地制备正丙醇、丙酸或其组合。
【IPC分类】C12P7/52, C07K14/245, C12P7/04
【公开号】CN105492613
【申请号】CN201380064321
【发明人】S-T·杨, E·阿马尔, C·C·斯托瓦斯, B·A·罗德里格兹
【申请人】陶氏环球技术有限责任公司, 俄亥俄州立大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2013年12月16日
【公告号】EP2935596A2, WO2014099707A2, WO2014099707A3
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