使用单级自动水解预处理和酶促水解加工木质纤维素生物质的方法
使用单级自动水解预处理和酶促水解加工木质纤维素生物质的方法
【专利说明】使用单级自动水解预处理和酶促水解加工木质纤维素生物质 的方法
[0001] 发明人：Jan Larsen、Niels Poulsen、Kit Mogensen、Martin Jeppesen 发明领域
[0002] 本发明总体地涉及将木质纤维素生物质加工成可发酵糖的方法，并且特别地涉及 依赖水热预处理的方法。
【背景技术】
[0003] 对石油和其他化石燃料的历史依赖性与大气温室气体水平的急剧和令人警醒的 增加相关。国际上正在努力减少温室气体的积累，这在许多国家得到正式政策指令支持。这 些减排努力的一个中心焦点是发展利用可再生的植物生物质取代石油作为燃料和其他化 学产品的来源的工艺和技术。据估计，地球上植物来源的生物质的年生长量大约为每年 lxlO11公吨干重。参见Lieth和Whittaker(1975)。因此，生物质的利用是发展可持续经济的 终极目标。
[0004] 从基于糖和淀粉的植物材料，如甘蔗、根和粮食作物，生产的燃料乙醇已经被广泛 使用，目前的全球生产量最高达到每年730亿升。乙醇一直被认为是化石燃料的可接受的替 代品，其容易作为混合燃料的添加剂使用或甚至直接作为用于个人汽车的燃料。然而，使用 通过这些"第一代"生物乙醇技术生产的乙醇实际上没有实现温室气体排放的大量减少。当 总化石燃料输入与最终乙醇输出均计算在内时，与石油相比，净节省仅为约13 %。参见 Farrell等（2006)。此外，已经对"第一代"生物乙醇市场提出了经济和道德上的反对。这实 际上将作物作为人类食物的需求与用于个人汽车的需求形成直接竞争。事实上，燃料乙醇 的需求与已经证明在贫穷的粮食进口国引起麻烦的粮食价格增长有关。
[0005] 发展不消耗粮食作物的生物质转化系统-所谓的"第二代"生物精炼-引起了极大 的兴趣，其中可以从木质纤维素生物质生产生物乙醇和其他产品，所述木质纤维素生物质 如作物废料(秸杆、穗轴、核、茎干、壳(shell)、果壳(husk)等…）、草料、稻草、木肩、废纸等。 在"第二代"技术中，主要来源于纤维素的可发酵6-碳(C6)糖和来源于半纤维素的可发酵5-碳(C5)糖通过酶促水解或(在一些情况中）通过纯化学水解从生物质多糖聚合物链释放出 来。从"第二代"生物精炼中的生物质转化获得的可发酵糖可以用于生产燃料乙醇，或可选 地，生产其他燃料如丁醇或用于合成生物塑料或许多其他产品的乳酸单体。
[0006] C5和C6糖的总产量是木质纤维素生物质加工的商业化中的重点考虑因素。就乙醇 生产以及乳酸和其他化学产品的生产而言，将C5和C6糖工艺流合并成一种糖溶液是有利 的。现在在乙醇生产中能有效消耗C5和C6糖两者的改良的发酵生物体是可得的。参见例如 Madhavan等（2012)、Dumon等（2012)、Hu等（2011)、Kuhad等（2011)、Ghosh等（2011)、Kurian 等（2010)、Jojima等（2010)、Sanchez等（2010)、Bettiga等（2009)、Matsushika等（2009)。
[0007] 由于其物理结构的限制，木质纤维素生物质不能在没有经过一定预处理过程的情 况下有效地通过酶促水解转化成可发酵糖。已经报道了许多种不同的预处理方案，各自提 供了不同的优点和缺点。综述参见Agbor等（2011)、Girio等（2010)31"^等（2010)、 Taherzadeh和Karimi(2008)。从环境和"可再生性"的角度来看，水热预处理是特别有吸引 力的。它们利用温度为160-230°C左右的加压蒸汽/液体热水来温和地熔解与纤维素链杂乱 缔合的疏水性木质素、溶解半纤维素的主要成分（富含C5糖)和破坏纤维素链，从而提高生 产酶结合的可达性。水热预处理可以方便地与现有的燃烧煤和生物质的发电厂整合来有效 地利用汽轮机蒸汽和"过量的"发电能力。
[0008] 在水热预处理的情况下，本领域公知并且已经过广泛讨论的是，预处理必须在相 矛盾的目的之间进行优化。一方面，预处理应当理想地保持半纤维素糖含量，以最大化来源 于单体半纤维素的糖的最终产量。然而同时，预处理应当充分暴露并预调理 (precondition)纤维素链以达到酶促水解的敏感性，使得可以用最少的酶消耗获得来源于 单体纤维素的糖的合理产量。酶消耗也是生物质加工的商业化的重点考虑因素，其如在当 前定义的"全球市场经济"背景下的"经济利润"边缘摇摆。尽管近年来急剧提高，可商购的 酶制剂的高成本仍然是生物质转化中最高的运营成本之一。
[0009] 随着水热预处理温度和反应器保留时间的增加，由于化学转化成其他物质（包括 糠醛和缩合反应的产物），较大比例的来源于半纤维素的C5糖无法换回地丧失。然而，需要 较高的温度和保留时间以适当地调理(condition)纤维素纤维以高效地酶促水解成单体6 碳葡萄糖。
[0010]在现有技术中，水热预处理"强度（severity)"的一个常用参数是"R。"，其通常是 指对数值。R。反映了根据公式:Κ〇 = ?ΕΧΡ[Τ-100/14.75]的预处理温度和反应器保留时间的 复合量度，其中t是以分钟计的保留时间，且Τ是以摄氏度计的反应温度。
[0011]针对任意给定生物质原料的预处理条件的优化本质上需要来自半纤维素的单体 C5糖高产量的需求(低强度)和来自纤维素的单体C6糖高产量的需求(高强度)之间的一定 折衷。
[0012]已经报道了用于最大化来自半纤维素和纤维素的糖产量以及最小化纤维素酶催 化的木糖低聚物抑制作用的多种不同的水热预处理策略。在一些情况下，加入外源的酸或 碱以催化半纤维素降解(酸、pH<3.5)或木质素溶解(碱、pH>9.0)。在其他情况下，水热预 处理只用非常温和的源自木质纤维素的乙酸本身(PH3.5-9.0)进行。在这些温和pH条件下 的水热预处理称为"自动水解"过程，因为从半纤维素酯释放的乙酸本身进一步催化半纤维 素水解。
[0013]酸催化的水热预处理，被称为"稀酸"或"酸浸"处理，通常提供高的C5糖产量，因为 在酸催化剂的存在下相当的半纤维素溶解可以在较低温度下发生。在稀酸预处理接着酶促 水解后的总C5糖产量通常在理论上可以从任意给定生物质原料释放的量的75%左右或更 高。参见例如，Baboukaniu等（2012)、Won等（2012)、Lu等（2009)、Jeong等（2010)、Lee等 (2008)、Sassner等(2008)、Thomsen等(2006)、Chung等(2005)。
[0014]相反，自动水解水热预处理通常提供低得多的C5糖产量，因此在没有酸催化剂的 情况下需要更高温度的预处理。除了在商业上不现实的低干物质含量下进行的自动水解预 处理，自动水解处理通常提供<40%理论回收率的C5糖产量。参见例如，Diaz等（2010)、 Dogaris等（2009)。已经报道，在使用商业上不现实的反应时间和极高的酶剂量的情况下， 自动水解的C5产量高达53%。但是，即使是该非常高的C5产量仍然远低于用稀酸预处理常 规获得的水平。参见例如，Lee等(2009)、Ohgren等(2007)。
[0015] 用自动水解获得的低C5产量的结果是，大多数关于商业生物质转化系统中水热预 处理的报道聚焦于稀酸工艺。通过使用所谓的"两级"稀酸预处理已经达到85%左右的源自 半纤维素的C5糖产量。在两级预处理中，使用较低的初始温度溶解半纤维素，然后分离富含 C5的液体部分。在第二个阶段中，使用较高的温度以调理纤维素链。参见例如，Mesa等 (2011)、Kim等（2011)、Chen等（2010)、Jin等（2010)、Monavari等（2009)、Soderstrom等 (2005)、3〇(16181：1'〇1]1等（2004)、3〇(16^1：1'〇1]1等（2003)、1(;[1]1等（2001)、1^6等（1997)、 Paptheofanous等（1995)。美国国家可再生能源实验室(NREL)报道的一种复杂的"两级"稀 酸预处理系统声称用玉米秸杆作为原料已经达到90 %左右的C5产量。参见Humbird等 (2011)。
[0016] 尽管它提供较低的C5产量，但自动水解在商业规模上继续提供针对稀酸预处理的 克争优势。
[0017] 在自动水解工艺的优势中最值得注意的是与从稀酸工艺中回收的木质素相比，残 留的未水解木质素具有极大增强的市场价值。首先，在稀酸预处理中通常使用的硫酸引入 了残余硫含量。这使所得的木质素对于倾向于消耗来自自动水解的无硫木质素燃料颗粒作 为煤的"绿色"替代品的商业电厂不具有吸引力。第二，在硫酸催化的水热预处理中发生的 木质素磺化使其比较亲水，从而增加它的机械持水能力。这种亲水性增加了干燥木质素用 于商业用途的成本，也使其不适于室外储存(考虑到它容易吸收水分）。用于木质纤维素生 物质转化的NREL工艺的所谓"技术经济模型"（采用稀酸处理)甚至没有考虑将木质素作为 可售商品-仅作为工艺流的内部燃料源。参见Humbird等(2011)。相反，依赖于自动水解的工 艺方案的"经济利润"包括来自于清洁干燥的木质素颗粒的稳定销售的显著贡献。因为典型 的软木质纤维素生物质原料包含大量木质素，占干物质含量的10-40%，这是尤为重要的。 因此，即使在自动水解系统的工艺糖产量可能相对于稀酸系统降低的情况中，总体"利润 率"可以保持等同或甚至更高。
[0018] 自动水解工艺也避免了稀酸的其他公知的缺点。对硫酸的需求偏离了偏好"绿色" 加工的精神取向、引入了以酸作为工艺输入的大量操作成本、并导致了对复杂废水处理系 统和昂贵的抗腐蚀设备的需求。
[0019] 自动水解还可以有利地放大到适度的工艺状况。NREL所描述的稀酸工艺如此复杂 和精巧以至于它不能现实地在较小规模上建立-仅在每小时100吨左右生物质原料的巨大 规模上建立。这样的规模仅适于高度集中的生物质加工状况。参见Humbird等(2011)。高度 集中的玉米秸杆生物质加工可能很适合具有以化学增强的大规模生产（hyperproduction) 生长的丰富基因工程玉米的美国 。但这种系统在世界上其他地方不太适合 。这 种系统对适度的生物质加工状况不适合，例如，在甘蔗或棕榈油或高粱地的现场加工、或小 麦秸杆的区域加工，它们通常每公顷产生比玉米少得多的生物质，即使有基因工程和化学 增强。
[0020] 与稀酸相反，自动水解系统是真正"绿色"的、容易扩展的，且没有需求复杂废水处 理系统的负担。因此提供改进的自动水解系统是有利的，即使在相比于稀酸系统仅在糖产 量上可能没有明显的优势的情况下。
[0021] 自动水解的低C5单体产量的问题一般驱使木质纤维素生物质加工技术的提供商 寻求其他途径。据报道，设计以提供提高的C5产量的一些"两级"预处理系统带有自动水解 预处理。参见 W02010/113129、US2010/0279361、TO2009/108773、US2009/0308383、US8,057， 639、US20130029406。在这些"两级"预处理方案中，较低温度的预处理之后，一些富含C5的 液体部分通过固/液分离去除，接着进行固体部分的后续高温预处理。大多数这些公开的专 利申请没有报道实际的实验结果。在W02010/113129的两级自动水解预处理的说明中， Chemtex Italia报道了总共26个使用小麦秸杆的实验实施例，其平均C5糖回收率为52%。 这些C5回收率值没有区分C5回收率本身和单体糖产量，所述单体糖是在发酵成乙醇和其他 有用的产物中实际消耗的基质（substrate)。
[0022]在用于加工木质纤维素生物质的方案中引入第二预处理级导致额外的复杂性和 成本。因此，使用简单的单级自动水解系统来实质上获得两级预处理的优势是有利的。 [0023]我们已经发现，在单级自动水解预处理进行至非常低的强度时，可能出乎意料地 获得55%理论产量或更高的最终C5单体高产量，同时还获得合理的葡萄糖产量。在生物质 原料被预处理至如此低的强度而使得预处理材料的未溶解固体物质含量保留至少5.0重 量％的残余木聚糖含量时，预处理期间的C5损失最小化。然而与预期相反，该非常高的残余 木聚糖含量可以高回收率被酶促水解为单体木糖，同时只牺牲非常小比例的纤维素至葡萄 糖的转化，条件是在酶促水解过程中采用了足够高的木聚糖酶和木糖苷酶活性。
[0024] 在这些非常低的强度水平下，影响纤维素酶活性或发酵生物体的可溶性副产物的 产生保持得很低以至于预处理的材料可以直接用于酶促水解和随后的发酵，通常不需要任 何洗涤或其他脱毒步骤。
[0025] 附图简要说明
[0026]图1示出了随经受自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的预处理强度因子 变化的木聚糖数。
[0027] 图2示出了随预处理原料的木聚糖数变化的未溶解固体物质中的木聚糖重量％。
[0028] 图3示出了随经受自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的 可溶性和不溶性形式的C5回收率。
[0029] 图4示出了随经受自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的 总C5回收率。
[0030] 图5示出了随经受自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的 乙酸、糠醛和5-HNF的产量。
[0031] 图6示出了溶解固体物质的去除对于经受非常低强度自动水解预处理的软木质纤 维素生物质原料的纤维素转化的效果。
[0032] 图7示出了来自经受非常低强度自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的液 体部分的HPLC表征。
[0033] 图8示出了随其中固体部分经受酶促水解接着引入液体部分进行后水解的时间变 化的C5糖回收率。
[0034]图9示出了改良酵母菌株使用小麦秸杆进行乙醇发酵的发酵谱（fermentation profile)，该小麦秸杆用非常低强度的自动水解进行预处理、酶促水解并作为合并的液体 和固体部分使用而没有脱毒以去除发酵抑制剂。
[0035]图10示出了一个实施方案的工艺方案。
[0036]图11示出了随时间变化的纤维素转化率-C5旁路。
[0037]图12示出了随时间变化的木聚糖转化率-C5旁路。
[0038] 图13示出了随时间变化的纤维素转化率-全料衆(whole slurry)。
[0039] 图14示出了随时间变化的木聚糖转化率-全料浆。
[0040] 图15示出了随水解时间变化的预处理和水解后总C6和C5回收率-全料浆。
【具体实施方式】
[0041] 在一些实施方案中，本发明提供加工木质纤维素生物质的方法，包括：
[0042]-提供软木质纤维素生物质原料；
[0043]-在单级加压水热预处理中在3.5-9.0的pH范围内预处理所述原料至log强度Ro 3.75或更低以产生预处理的生物质料浆，其中未溶解的固体物质含有至少5.0重量％的木 聚糖；以及
[0044] 在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所 述预处理的生物质至少24小时以产生水解产物;所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡 聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶和β-木糖苷酶活性；以nkat/g葡聚糖计，内切葡聚糖 酶的活性水平为至少1100,外切葡聚糖酶的活性水平为至少280，β-葡萄糖苷酶的活性水平 为至少3000，内切木聚糖酶的活性水平为至少1400，和β-木糖苷酶的活性水平为至少75;所 述水解产物中C5单体的收率为预处理前所述原料的初始木糖和阿拉伯糖含量的至少55%。
[0045] 在一些实施方案中，所述预处理的生物质作为包含固体部分和液体部分二者的全 料浆水解。
[0046] 如在此所用，以下术语具有以下含义：
[0047] 如在此所用，关于定量数值或范围的"大约"是指相对所指的数或范围而言+/-10%〇
[0048] "自动水解"是指其中在预处理过程中由半纤维素水解释放的乙酸进一步催化半 纤维素水解的预处理过程，且适用于在pH 3.5-9.0下进行的木质纤维素生物质的任意水热 预处理。
[0049] "对于木质纤维素生物质转化而优化的可商购的纤维素酶制剂"是指足够提供预 处理的木质纤维素生物质的酶促水解且包含内切纤维素酶（内切葡聚糖酶）、外切纤维素酶 (外切葡聚糖酶）、内切木聚糖酶、木糖苷酶和葡萄糖苷酶活性的可商购的酶活性混合物。 术语"对于木质纤维素生物质转化优化的"是指其中为了在水解预处理的木质纤维素生物 质成可发酵糖中提高水解产率和/或减少酶消耗量的特定目的选择和/或改进酶混合物的 产品开发过程。
[0050] "以"一定干物质水平进行预处理是指在加压水热预处理开始时原料的干物质含 量。预处理"在"一定pH下进行，其中生物质水性内容物的pH是加压水热预处理开始时的pH。
[0051] "干物质"，也以DM表示，是指可溶性和不溶性的总固体物质，且实际上是指"非水 内容物"。通过在l〇5°C下干燥直到达到恒定重量测量干物质含量。
[0052] "纤维结构"保持在预处理后纤维片段的平均尺寸>750um的程度。
[0053]如在此所用，"葡聚糖"是指纤维素以及其它葡萄糖低聚物。
[0054] "水热预处理"是指使用包含高温液体或蒸汽或两者的水(其作为热的液体、蒸汽 或加压蒸汽），在120°C或更高温度下"蒸煮"生物质，其中添加或不添加酸或其他化学物质。 [0055] "单级加压水热预处理"是指其中生物质在单个反应器中经受加压水热预处理的 预处理，所述反应器配置为以单轮加热生物质，且其中在固/液分离步骤以从经受加压水热 预处理的原料中去除液体部分后没有应用进一步的加压水热预处理。
[0056] "固/液分离"是指通过压迫、离心或其他力施加力来使液体与固体分离的主动机 械过程。
[0057] "软木质纤维素生物质"是指木材以外的包含纤维素、半纤维素和木质素的植物生 物质。
[0058] "固体部分"和"液体部分"是指预处理生物质在固/液分离中的分级分离。分离的 液体统称为"液体部分"。包含相当多的不溶性固体含量的残余部分称为"固体部分"。"固体 部分"具有干物质含量，且通常也包含相当多的"液体部分"残留。
[0059] "理论产量"是指从聚合纤维素或聚合半纤维素结构(其中构成的单体糖也可以被 酯化或以其它方式取代)获得的纯单体糖的摩尔当量质量。作为理论产量的百分比的"C5单 体产量"如下测定:在预处理之前，使用Sluiter等(2008)的强酸水解方法，使用HPLC柱和其 中半乳糖和甘露糖与木糖共洗脱的洗脱系统分析生物质原料中的糖类。此类系统的实例包 括来自 Phenomenex的REZEX? Monossacharide H+柱和来自 Biorad的AMINEX HPX 87C?柱。 在强酸水解期间，酯和酸不稳定的取代被去除。除非另有说明，认为在未预处理的生物质中 测定的"木糖"+阿拉伯糖的总量被认为是100%理论C5单体回收率，其也可以统称为"C5单 体回收率"。使用具有纯化的外部标准基于标准曲线的HPLC表征进行单体糖测定。通过直接 测量C5单体的样品的HPLC表征来测定实际的C5单体回收率，其然后以理论产量的百分比表 不。
[0060] "木聚糖数"是指如下测定的预处理生物质的表征:预处理的生物质通常在固/液 分离以提供液体部分和固体部分后以约30%总固体物质获得。具有约30%总固体物质的这 种预处理的生物质然后通过按1:3 wt:wt的总固体(DM):水比例与70°C水混合而部分洗涤。 然后将以这种方式洗涤的预处理的生物质压榨至约30 %总固体。使用A.Sluiter等， "Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass"，US National Renewal Energy Laboratory(NREL)Laboratory Analytical Procedure(LAP)，发行日 2008年4月25 目的方法，如Technical Report NREL/TP-510-42618(2008年4月修订）（其通 过引用全文而明确并入本文）中所述，测定以这种方式洗涤以及压榨到约30%总固体物质 的预处理的生物质的木聚糖含量。使用其中半乳糖和甘露糖与木糖共洗脱的HPLC柱和洗脱 系统。此类系统的实例包括来自Phenomenex的REZEX? Monossacharide H+柱和来自Biorad 的AMINEX HPX 87C?柱。所描述的这种木聚糖含量的测量包括了一些来自没有在这些条件 下从固体部分中洗出的残余液体部分的可溶性物质的贡献。因此，"木聚糖数"提供了不溶 性固体物质中残余木聚糖含量和"液体部分"中可溶性木糖和木糖低聚物含量的"加权组 合"量度。
[0061] 未溶解固体物质的木聚糖含量通过取预处理的生物质的代表性样品、使其经受 固/液分离以提供具有至少30%总固体物质的固体部分来测定。该具有至少30%总固体物 质的预处理的生物质然后通过与70°C水以总固体物质(DM):水的1:3重量:重量的比率混合 来部分洗涤。以这种方式洗涤的预处理的生物质然后压榨到至少30 %总固体物质，并再次 通过与70°C水以总固体物质(DM):水的1:3重量:重量的比率混合来洗涤。该洗涤的材料然 后再次压榨到至少30%总固体物质，并再次通过与70°C水以总固体物质(DM):水的1:3重量 :重量的比率混合来洗涤。该洗涤的材料然后再次压榨到至少30%总固体物质，并用作待分 析的未溶解固体物质的样品。然后如上面涉及测定木聚糖数的解释中描述的那样来测定未 溶解固体物质的木聚糖含量，并表达为样品的总固体含量的重量百分比。
[0062]可以使用任何合适的软木质纤维素生物质，包括如至少小麦秸杆、玉米秸杆、玉米 穗轴、空果串（empty fruit bunches)、稻杆、燕麦杆、大麦杆、油菜猜杆、黑麦猜杆、高粱、甜 高粱、大豆秸、柳枝稷、百慕达草和其他草类、甘蔗渣、甜菜浆、玉米纤维或其任意组合的生 物质。木质纤维素生物质可以包含其他木质纤维素材料，如纸、新闻纸、纸板或其他城市或 办公室废物。木质纤维素生物质可以作为源自不同原料的材料的混合物来使用，可以是新 鲜的、部分干燥的、完全干燥的或其任意组合。在一些实施方案中，使用至少约l〇kg生物质 原料、或至少l〇〇kg生 物质原料、或至少500kg生物质原料实施本发明的方法。
[0063] 木质纤维素生物质包含插嵌在松散组织化的半纤维素基质内和密封在富含疏水 性木质素的环境内的晶体纤维素纤丝。尽管纤维素本身包含长的、直链D-葡萄糖聚合物，但 半纤维素是短的、支链糖(包括所有5-碳戊醛糖(C5糖）以及一些6-碳(C6)糖(包括葡萄糖和 甘露糖）的单体)的异质混合物。木质素是高度异质的聚合物，缺少任何特定的初级结构，并 且包含疏水性苯丙素 (pheny lpropano i d)单体。
[0064] 合适的木质纤维素生物质通常包含在预处理前为20至50%干物质的量的纤维素， 在预处理前为10至40%干物质的量的木质素和15至40%的量的半纤维素。
[0065]在一些实施方案中，生物质原料在水热预处理之前可以经历粒度减小和/或其他 机械加工，如研磨、碾制、切碎、切割或其他处理。在一些实施方案中，如Knudsen等（1998)所 述，生物质原料在加压预处理之前可以洗涤和/或沥滤有价值的盐。在一些实施方案中，原 料在加压预处理之前可以在高达99°C的温度下浸泡。
[0066]在一些实施方案中，原料在水热预处理之前首先在水性溶液中浸泡。在一些实施 方案中，如通过引用全文并入本文中的US8，123,864所述，在预处理中将原料浸泡在从后续 步骤中获得的包含乙酸的液体中是有利的。如通过引用全文并入本文中的US12/935,587所 述，在最高可能干物质含量下进行处理是有利的。在高干物质下进行预处理避免了加热不 必要的水而耗费加工能量。但是，需要一些水含量以从酶促水解获得最佳的最终糖产量。通 常，在其固有持水能力下或接近其固有持水能力预处理生物质原料是有利的。这是给定原 料在于过量水中浸泡并接着压榨到普通商业螺旋压机的机械极限(通常30_45%DM)之后达 到的水含量水平。在一些实施方案中，水热预处理在至少35 %的DM含量下进行。本领域技术 人员容易理解，水热预处理过程中DM含量可能降低，因为在加热过程中加入了一些水含量。 在一些实施方案中，原料在至少20%、或至少25%、或至少30%、或至少40%、或40%或更 低、或35%或更低、或30%或更低的DM含量下预处理。
[0067] 在一些实施方案中，用水性溶液中浸泡/润湿可以用于在预处理之前调节pH至 3.5-9.0的范围，这通常对于自动水解是有利的。容易理解，在预处理过程中pH可以变化，通 常随着乙酸从溶解的半纤维素释放而变为更酸性的水平。
[0068]在一些实施方案中，水热预处理在没有如湿式氧化预处理所需的补充氧的情况 下、或在没有添加如有机溶剂预处理所需的有机溶剂的情况下、或在没有使用如微波预处 理所需的微波加热的情况下进行。在一些实施方案中，水热预处理在140°C或更高、或150°C 或更高、或160°C或更高、或160-200°C、或170-190°C、或180°C或更低、或170°C或更低的温 度下进行。
[0069] 在一些实施方案中，一些C5含量可以在加压预处理之前通过浸泡步骤去除。在一 些实施方案中，单一反应器可以配置为加热生物质至单一目标温度。或者，单一反应器可以 配置为在该反应器中影响温度梯度，以使得生物质在单轮处理中暴露于多于一个温度区 域。在一些实施方案中，在预处理过程中，在加压反应器内部分地去除一些溶解的生物质组 分可能是有利的。
[0070] 合适的水热预处理反应器通常包括纸浆和造纸工业中已知的大多数制浆反应器。 在一些实施方案中，水热预处理由反应器中加压至10巴或更低、或12巴或更低、或4巴或更 高、或8巴或更高、或8-18巴、或18-20巴的蒸汽施用。在一些实施方案中，预处理反应器配置 用于原料的连续流入。
[0071] 在一些实施方案中，湿润的生物质在压力下传输通过反应器一段持续时间或"保 留时间"。有利地保持短的保留时间以利于更高的生物质通量。然而，所得的预处理强度由 温度及由保留时间确定。有利地保持水热预处理过程中的温度较低，不仅是因为本发明的 方法寻求非常低的预处理强度，也因为较低的温度可以使用较低的蒸汽压力完成。在预处 理温度可以在180°C或更低的水平且因此饱和的蒸汽压保持在10巴或更低压力的程度下， 出现较低的腐蚀趋势且可以使用更低等级的压力配件和钢组成，这减少工厂的资本成本。 在一些实施方案中，反应器配置为加热生物质至160-200°C、或170-190°C之间的单一目标 温度。保留时间在一些实施方案中少于60、或少于30、或少于20、或少于15、或少于14、或少 于13、或少于12、或少于10、或少于8、或少于5分钟。
[0072] 生物质原料可以通过各种方式从大气压下装载到加压反应器中。在一些实施方案 中，可是使用水闸型"颗粒栗"系统装载生物质原料，例如通过引用全文并入本文中的US 13/062,522中所述的系统。在一些实施方案中，使用所谓的"螺旋塞"进料机装载预处理反 应器可能是有利的。
[0073] 预处理的生物质可以通过各种方式从加压反应器卸载。在一些实施方案中，预处 理的生物质以保持材料的纤维结构的方式卸载。保持预处理生物质的纤维结构是有利的， 因为这允许预处理物质的固体部分在固/液分离过程中使用普通螺旋压榨设备压榨到相当 高的干物质水平，并从而避免了隔膜压滤机系统的增加的费用和复杂性。
[0074]纤维结构可以通过以非爆破性的方式从加压反应器中去除原料来维持。在一些实 施方案中，可以使用水闸型系统，如通过引用全文并入本文中的US13/043,486中所述的系 统完成非爆破性去除，并从而保持纤维结构。在一些实施方案中，可以使用水力旋流器去除 系统，如通过引用全文并入本文中的US12/996,392中所述的那些完成非爆破性去除，并从 而保持纤维结构。
[0075]在一些实施方案中，预处理的生物质可以使用"蒸汽爆破"（其涉及预处理物质的 爆破性释放)从加压预处理反应器中去除。蒸汽爆破的、预处理的生物质没有保持它的纤维 结构，且因此需要更加精细的固/液分离系统以达到与保留纤维结构的预处理生物质使用 普通螺旋压机系统可以达到的干物质含量相当的干物质含量。
[0076]生物质原料预处理至非常低的强度（log Ro 3.75或更低）。这通常将造成预处理 的生物质具有10%或更高的木聚糖数。参数"木聚糖数"是指反映了不溶性固体物质中保留 的残留木聚糖含量及液体部分中可溶性木糖和木糖低聚物的浓度两者的加权组合的复合 量度。在较低的R〇强度下，木聚糖数较高。因此，最高的木聚糖数是指最低的预处理强度。木 聚糖数甚至在非常低的强度下提供了与传统的强度测量log R〇的负线性相关性，其中未溶 解的固体物质中的残留木聚糖含量更高。图1显示了对于多种不同的原料，预处理强度log R〇和所产生的预处理生物质的木聚糖数之间的关系，其在实施例1中详细解释。
[0077]木聚糖数作为预处理强度的量度特别有用，因为具有等同木聚糖数的不同预处理 生物质原料表现出等同的C5单体回收率。相反，常规的Ro强度只是预处理条件的经验描述， 其没有提供不同生物质原料之间比较的合理基础。例如，如图1所示，至强度log R〇 = 3.75 的单级自动水解提供具有6-7%之间的木聚糖数的预处理甘蔗渣和玉米秸杆，但对于典型 的小麦秸杆品种，所得的预处理原料的木聚糖数是大约10%。
[0078]本领域技术人员可以容易地对任何给定的原料确定合适的预处理强度log Ro以 产生具有期望木聚糖数的预处理的生物质。在一些实施方案中，生物质原料预处理至非常 低的强度log Ro 3.75或更低、或3.74或更低、或3.73或更低、或3.72或更低、或3.71或更 低、或3.70或更低、或3.69或更低、或3.68或更低、或3.67或更低、或3.66或更低、或3.65或 更低、或3.64或更低、或3.63或更低、或3.62或更低、或3.61或更低、或3.60或更低、或3.59 或更低、或3.58或更低、或3.57或更低、或3.56或更低、或3.55或更低、或3.54或更低、或 3.53或更低、或3.52或更低、或3.51或更低、或3.50或更低、或3.45或更低、或3.40或更低。 在一些实施方案中，生物质原料预处理至非常低的强度log R〇,以产生具有11%或更高、或 12%或更高、或13%或更高、或14%或更高、或15%或更高、或16%或更高、或17%或更高的 木聚糖数的预处理的生物质。
[0079] 木聚糖数在生产规模的生物质加工中可用作实际量度，因为它可以基于简单的测 量(如通过近红外光谱监测仪提供的那些)而容易地在线测量。木聚糖数可以进一步用作用 于控制预处理的终点量度，如W02013/120492中描述的。
[0080] 作为木聚糖数(其反映了可溶性木聚糖含量以及未溶解固体物质中的残余木聚糖 含量二者的复合量度）的替代方案，预处理的效果可以依据未溶解固体物质中的残余木聚 糖含量来表达。未溶解固体物质中的残余木聚糖含量与木聚糖数之间的关系示于图2中，其 在实施例1中解释。本领域技术人员可以对任何给定的原料容易地确定合适的预处理强度 1 og Ro以产生具有在未溶解固体物质中期望的残余木聚糖含量的预处理的生物质。例如， 如图2所示，在足以产生木聚糖数为10%的预处理的生物质的强度下进行的单级自动水解 对软木质纤维素原料而言，通常将产生具有约5.0重量％的未溶解固体物质中的残余木聚 糖含量的预处理的生物质，所述原料包括但不限于小麦秸杆、甘蔗渣、空果串和玉米秸杆。 在一些实施方案中，生物质原料预处理至适于产生以下预处理的生物质的强度log Ro:未 溶解固体物质的残余木聚糖含量为至少5.0重量％、或至少5.1%、或至少5.2%、或至少 5.3%、或至少5.4%、或至少5.5 %、或至少5.6%、或至少5.7%、或至少5.8 %、或至少 5.9%、或至少6.0%、或至少6.1 %、或至少6.2%、或至少6.3%、或至少6.4%、或至少 6.5%、或至少6.6%、或至少6.7 %、或至少6.8%、或至少6.9%、或至少7.0 %、或至少 7.1%、或至少7.2%、或至少7.3 %、或至少7.4%、或至少7.5%、或至少7.6%、或至少 7.7%、或至少7.8%、或至少7.9 %、或至少8.0%、或至少8.1%、或至少8.2 %、或至少 8.3%、或至少8.4%、或至少8.5%.
[0081] 生物质原料预处理至非常低的强度是有利的，其中预处理的原料的木聚糖数是 10%或更高，或其中预处理的原料中未溶解固体物质的残余木聚糖含量是至少5.0%或更 高。该非常低的强度水平对应于其中预处理前原料的总半纤维素含量(在预处理过程中溶 解的或不可逆地失去的)被最小化的过程。我们出乎意料的发现，对于小麦秸杆、甘蔗渣、甜 高粱渣、玉米秸杆和空果串的典型品种，在单级自动水解预处理至非常低的强度的原料的 酶促水解后，可以获得至少55%理论值的非常高的最终C5单体产量而没有C6单体产量的明 显损失，条件是在酶促水解过程中采用足够高的木聚糖酶和木糖苷酶活性。在非常低的强 度水平下，很大一部分的原料的半纤维素含量在预处理之后保留在固体部分中，其中其随 后可以用酶促水解以高回收率水解成C5单体，其中使用了足够的木聚糖酶和木糖苷酶活 性。
[0082] 应当注意的是，关于"木糖回收率"的报道常常不是以与在此报道的木糖回收率相 当的术语表示。例如，Ohgren等(2007)和Lee等(2009)报道了高木糖回收率。但这些值只是 指来自预处理的生物质的木糖回收率，而不是表示为预处理之前原料的原始半纤维素含量 的百分比。或例如，W02010/113129是指作为预处理之前原料的半纤维素含量百分比的半纤 维素回收率，但没有指明单体产量(其始终比总半纤维素回收率小）。在一些实施方案中，可 以在酶促水解后的水解产物中获得至少5 6 %理论值的C 5单体收率、或至少5 7 %、或至少 58%、或至少59%、或至少60%、或至少61 %、或至少62 %、或至少63%、或至少64%、或至少 65%〇
[0083] 酶促水解可以用多种不同的方式进行。在一些实施方案中，预处理的生物质作为 全料浆进行水解，意味着来自所述预处理的生物质的基本上所有的固体物质都在包含溶解 和未溶解固体物质二者的单一反应混合物中经受酶促水解。如本文所使用，术语"全料衆" 指的是酶促水解反应混合物，其中在酶促水解开始时未溶解固体物质与溶解固体物质的重 量比小于2.2:1。
[0084] 预处理的生物质料浆中的"未溶解固体物质"和"溶解固体物质"测定如下：
[0085] 根据Weiss等（2009)描述的程序来测定"总固体物质"和"过滤的总固体物质"含 量。从那些数值中，可根据下式计算"未溶解固体物质"和"溶解固体物质"含量：
[0086] [未溶解固体物质](重量％) = ([总固体物质](重量％)-[过滤的总固体物质](重 量％))/(1_[过滤的总固体物质](重量％))
[0087][溶解固体物质](重量％)=[总固体物质](重量％)_[未溶解固体物质](重量％) [0088]在一些实施方案中，在酶促水解之前，使预处理的生物质经受固/液分离步骤以产 生单独的固体部分和液体部分。这种分离通常是有利的，因为所述预处理的生物质中溶解 固体物质的一些组分通常发挥抑制酶促水解中使用的一种或多种酶的活性的作用。例如， 将溶解固体物质含量从预处理生物质全料浆中移除明显改善了用如本文描述的预处理的 原料取得的纤维素转化率，所述原料以高的干物质含量经受使用针对木质纤维素生物质转 化优化的、可商购的纤维素酶制剂进行的酶促水解，所述制剂由GENENC0R?(作为商标 ACCELLERASE TRIO?)或由N0V0ZYMES?(作为商标CELLIC CTEC3?)提供，如图6所示并且在 实施例4中解释的。
[0089]然而令人惊讶的是，当预处理的生物质料浆被充分稀释到较低的干物质含量时， 在预处理的生物质料浆中存在的抑制物质的浓度被充分稀释，使得可在全料浆水解中、且 甚至以较低的酶剂量水平获得等同的转化率，如在实施例10中所解释的。
[0090] 在酶促水解之前采用固/液分离步骤的实施方案中，其中期望酶促水解以高干物 质含量进行，在固体部分中达到最高实用的干物质含量水平，或者从固体部分中去除最高 实用的溶解固体物质量是有利的。在一些实施方案中，固/液分离获得具有至少40重量％、 或至少45%、或至少50%、或至少55% DM含量的固体部分。使用普通的螺旋压机系统的固/ 液分离通常可以在固体部分中获得高达50%的DM水平，只要生物质原料以保持纤维结构的 方式预处理。在一些实施方案中，承担更高的工厂资本支出以获得更有效的固/液分离可能 是有利的，例如，使用隔膜压滤机系统。在一些实施方案中，溶解的固体物质可以通过系列 洗涤和压榨或通过制浆和造纸领域中已知的置换洗涤技术从固体部分去除。在一些实施方 案中，或者直接通过固/液分离，或者通过洗涤和固/液分离的一些结合，固体部分的溶解固 体物质含量降低至少50%、或至少55%、或至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少 75%。
[0091] 在固体部分的酶促水解期间，从这样的固/液分离所得的液体部分然后可与固体 部分保持分离。我们命名这个暂时的分离为"C5旁路"。在固体部分的酶促水解已达到期望 程度的葡聚糖转化率后，富C5的"旁路"材料可以然后添加回到水解混合物中。我们对此称 为"C5旁路"材料的"后水解"。以这种方式，使得否则会由预处理生物质料浆中存在的酶抑 制性溶解固体物质引起的干扰最小化。从通过至非常低的强度的单级自动水解预处理以提 供具有10%或更高的木聚糖数、或具有5.0%或更高的未溶解固体物质木聚糖含量的预处 理的材料的软木质纤维素生物质原料(如典型的小麦秸杆、甘蔗渣、甜高粱渣、玉米秸杆和 空果串品种)所获得的液体部分通常包含小的C6单体的组分（lx)，主要是葡萄糖及一些其 他糖的;较大的可溶C6低聚物组分(大约2x-7x);较大的C5单体组分(大约4x-8x)，主要是木 糖及一些阿拉伯糖和其他糖;和大得多的可溶性木糖低聚物组分(大约18x-30x)。可溶性木 糖低聚物通常主要地包括木六糖、木五糖、木四糖、木三糖和木二糖及一些较高级链的低聚 物。这些木糖低聚物(或木糖-低聚物(xylo-oligomer))通常在"后水解"过程中通过用于固 体部分酶促水解的酶活性来酶促水解。或者换言之，通过将分离的液体部分与水解的固体 部分混合，固体部分中的木糖-低聚物通过残留在水解的固体部分内的酶活性的作用而被 降解为木糖单体。
[0092] 或者，在一些实施方案中，分离的液体部分可用于其他目的。在一些实施方案中， 分离的液体部分可与从水解产物发酵回收乙醇后获得的酒精废液(thin stillage)共混。 共混的液体部分和酒精废液然后可以用作生物甲烷基质。或者，酒精废液和液体部分可以 作为单独的生物甲烷基质使用。令人惊讶的是，酒精废液以及液体部分的生物甲烷潜能在 产生具有10%或更大木聚糖数的预处理生物质的非常低强度的预处理后增大。因此在一些 实施方案中，在非常低强度下进行C6发酵是有利的，因为增大的生物甲烷产率可以抵消有 所下降的乙醇产率。在一些实施方案中，至少75匪3甲烷/吨生物质原料、或至少78、或至少 80、或至少82、或至少85、或至少87、或至少90、或至少92、或至少95的生物甲烷产率可以从 包含合并的液体部分和酒精废液的生物甲烷基质产生，其中原料已预处理至低强度log R〇 从而产生具有至少10%木聚糖数的预处理生物质，或其中未溶解固体物质包含至少5.0重 量％木聚糖。在一些实施方案中，将全料浆水解产物本身用作生物甲烷基质。
[0093]在一些实施方案中，本发明提供了加工木质纤维素生物质的方法，包括：
[0094]-提供软木质纤维素生物质原料；
[0095]-在至非常低的强度的单级加压水热预处理中在3.5-9.0的pH范围内预处理所述 原料，以使所述预处理的生物质特征是具有10%或更高的木聚糖数；
[0096] -将所述预处理的生物质分离成固体部分和液体部分，
[0097] -在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所 述固体部分，所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、内切木聚糖 酶和木糖苷酶活性，以及
[0098] -随后混合分离的液体部分和水解的固体部分，从而所述液体部分中的木糖低聚 物被所述水解的固体部分中残留的酶活性的作用降解为木糖单体。
[0099] 在一些实施方案中，来自分离的固体部分或来自水解的固体部分(其已添加分离 的液体部分以进行后水解）、或来自全料浆的酶促水解产物随后经受发酵以产生乙醇。
[0100] 在一些实施方案中，在水解产物发酵后回收的酒精废液用作生产生物甲烷的基 质。在一些实施方案中，分离的液体部分与在水解产物发酵后回收的酒精废液共混，并且用 作合并的生物甲烷基质。
[0101] 容易理解，"固体部分"和"液体部分"可以进一步被细分或加工。在一些实施方案 中，在进行固/液分离的同时从预处理反应器中去除生物质。在一些实施方案中，预处理的 生物质在从反应器中卸载之后进行固/液分离步骤(通常使用简单和低成本的螺旋压机系 统）以产生固体部分和液体部分。
[0102] 本领域中众所周知，当水解在较低干物质含量下进行时，使用纤维素酶活性的酶 促水解更加有效。较高的固体物质浓度有效地抑制纤维素酶催化作用，尽管造成该公知效 果的具体原因尚未完全明白。参见例如，Kristensen等(2009)。尽管本领域的普遍观点是在 最高实际干物质含量下的水解是有利的，但这必然与增大的酶消耗相关。相同的酶促水解 效果可以在较低干物质含量下使用相同的酶制剂实现，节省了酶成本。
[0103] 本领域技术人员通过常规实验容易确定对于任何给定的生物质原料和酶制剂，适 合达到指定工艺目标的进行酶促水解的DM水平。在一些实施方案中，尽管产生的酶消耗有 所增大，但在非常高的DM>20%下进行水解可能是有利的。出于各种原因，通常认为在最高 可实现的干物质水平下进行水解是有利的，所述原因包括最小化水消耗和节省乙醇蒸馏中 的能量成本，其中由较高干物质水平下的酶促水解产生的较高糖浓度导致较高的乙醇浓 度，其进而减小蒸馏成本。在一些实施方案中，分离的固体部分或全料浆的酶促水解可在 8%DM或更高、或9%DM或更高、或10%DM或更高、或11%DM或更高、或12%DM或更高、或13% DM或更高、或14%DM或更高、或15%DM或更高、或16%DM或更高、或17%DM或更高、或18%DM 或更高、或19%DM或更高、或20%DM或更高、或21%DM或更高、或22%DM或更高、或23%DM或 更高、或25%DM或更高、或30%DM或更高、或35%DM或更高下进行。
[0104]在一些实施方案中，以40%或更高的DM从预处理的生物质的固/液分离回收固体 部分，且添加另外的水含量以使得酶促水解可以在较低DM水平下进行。容易理解，水含量可 以以新鲜水、有或者没有添加剂(如任何分子量的聚乙二醇(PEG)或表面活性剂、盐、用于调 节pH的化学物质如氨、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化钠、抗细菌或抗真菌剂、或其他物质）的 浓缩或其他工艺溶液的形式添加。
[0105] 为了在水解产物中取得至少55%或更高的C5单体收率，根据本发明的方法，利用 多种酶活性来进行酶促水解。用于酶促水解的酶的混合物应包含至少一种以下活性：内切 葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶和木糖苷酶。本领域技术人员将 容易理解，可应用各种不同的酶剂量水平，取决于进行水解时的干物质含量、作为工艺目标 所期望的葡聚糖转化率和作为工艺目标所期望的水解时间。因此，适于较高的干物质、快速 水解的酶剂量水平可大大降低，并在较低的干物质、较长的水解时间框架中使用。
[0106] 作为一般规则，水解产物中至少55%或更高的C5单体产率可以相对快地实现，通 常在低至24小时的时间框架中，一般在18小时到60小时的范围内。尽快实现这些非常高的 C5单体收率是有利的，因为一旦木聚糖含量基本上从未溶解固体物质中去除，内切葡聚糖 酶和外切葡聚糖酶就相对较少地在生产性结合(productive binding)的途径中受阻碍。在 一些实施方案中，在取得高的C5单体收率后，用过量的内切和外切葡聚糖酶活性补充酶混 合物可能是有利的。可通常取得这些高C5单体收率的水解时间框架在例如图11中表示，并 且如实施例10中解释的，显示出全料浆水解中的木聚糖转化率为12%DM，其中预处理后的 总C5 回收率约为77%。如所示的那样，即使在非常低的酶剂量水平下，可在40小时内实现至 少55 %的C5单体收率。
[0107] 适于实施本发明方法以取得55%或更高的C5单体收率的各种酶活性的合适水平 通常如下：
[0108] 内切葡聚糖酶是指4-( 1，3; 1，4)-?Η)_葡聚糖4-葡聚糖水解酶，又称为β-l，4-葡聚 糖酶(EC 3.2.1.4)。出于界定极限值的目的，内切葡聚糖酶活性使用Ghose( 1987)的方法使 用羟乙基纤维素(HEC)作为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。典型的内切葡聚糖酶的水平 在酶促水解开始时应至少为ll〇〇nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转化程度和 干物质含量，内切葡聚糖酶活性水平可在1100_30000nkat/g葡聚糖的范围内变化。在一些 实施方案中，所述范围可以在1100-2832之间，或在1130-1529之间，或在2317-3852之间，或 在3000-5120之间，或在4000-8000之间，或在7000-10000之间，或在11000-20000之间。
[0109] 外切葡聚糖酶是指4-?Η)_葡聚糖纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)。出于界定极限 值的目的，外切葡聚糖酶活性使用Bailey和Tahtiharju(2003)的方法使用4-甲基-伞形酮 基(umbel liferyl)-0-D_乳糖苷为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。典型的外切葡聚糖酶 的水平在酶促水解开始时应至少为280nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转化 程度和干物质含量，活性水平可在280-20000nkat/g葡聚糖的范围内变化。在一些实施方案 中，所述范围可以在280-690之间，或在370-560之间，或在400-932之间，或在700-1240之 间，或在1200-2000之间，或在3000-5000之间。
[0110] β-葡萄糖苷酶是指β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)。出于界定极限值的 目的，β-葡萄糖苷酶活性使用Berghem和Pettersson(1974)的方法使用4-硝基苯基-β-D-P比 喃葡萄糖苷为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。典型的β-葡萄糖苷酶的水平在酶促水解开 始时应至少为3000nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转化程度和干物质含量， 活性水平可在3000-50000 nkat/g葡聚糖范围内。在一些实施方案中，所述范围可以在 3000-7500之间，或在4000-6010之间，或在5000-1000之间，或在7000-14000之间，或在 15000-25000之间。
[0111] 内切木聚糖酶是指4-β-?-木聚糖木聚糖水解酶(4-0-D-xylan xylanohydrolase) (EC 3.2.1.8)。出于界定极限值的目的，内切木聚糖酶活性使用Bailey等（1992)的方法使 用桦木木聚糖作为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。对于所测试的活性，可用柠檬酸盐缓 冲剂将pH值调节至合适的水平。典型的内切木聚糖酶的水平在酶促水解开始时应至少为 1400nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转化程度和干物质含量，活性水平可在 1400-70000nkat/g葡聚糖范围内变化。在一些实施方案中，所述范围可以在1400-3800之 间，或在4000-5000之间，或在6000-7000之间，或在7000-8000之间，或在9000-12000之间， 或在11000-15000之间，或在15000-20000之间，或在18000-30000之间。
[0112] β-木糖苷酶是指4-β-?-木聚糖木糖水解酶（4-0-D-xylan xylohydrolase) (EC 3.2.1.37)。出于界定极限值的目的，β-木糖苷酶活性使用Poutanen和Puls(1988)的方法使 用对-硝基苯基-β-D-木聚糖吡喃糖苷作为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。典型的β-木糖 苷酶的水平在酶促水解开始时应至少为75nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转 化程度和干物质含量，活性水平可在75-124之间、或在100-300之间、或在250-500之间、或 在400-800之间、或在700-20000nkat/g葡聚糖之间的范围内变化。在一些实施方案中，所述 范围可以在700-900之间，或在800-1400之间，或在1100-1700之间，或在1500-2500之间，或 在2000-3500之间，或在3000-5000之间，或在4000-10000之间，或在8000-20000之间。
[0113] 任何上面指定用于活性测定的分析都可以以适当的方式改变，包括可以将样品调 节到用于测量目的的适当的稀释度。该分析可以通过与标准曲线比较而适用于测量从水解 混合物中提取的代表性样品，在所述标准曲线中，将已知活性在相似的背景干物质含量下 添加到样品中。
[0114] 本领域技术人员容易理解，适合实施本发明方法的酶混合物的组成可以在相对较 宽的范围内变化。合适的酶制剂包括可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶 制剂。优化过程中酶混合物的选择和改进可以包括基因工程技术，例如Zhang等(2006)中所 描述的那些或本领域已知的其他方法。可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素 酶制剂通常由制造商和/或供应商原样鉴定。这些通常与可商购的用于一般用途或为在制 造动物饲料、食品、纺织品洗涤剂或在造纸行业使用而优化的纤维素酶制剂不同。在一些实 施方案中，使用的可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂由GENENC0R? 提供且包含从遗传修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)的发酵分离的外切葡聚糖酶、内 切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶和β葡萄糖苷酶，例如在ACCELLERASE TRIO?商标下出 售的商用纤维素酶制剂。在一些实施方案中，使用的可商购的为木质纤维素生物质转化而 优化的纤维素酶制剂由N0V0ZYMES?提供且包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖 酶、木糖苷酶和β葡萄糖苷酶，例如在CELLIC CTEC2?或CELLIC CTEC3?商标下出售的商用 纤维素酶制剂。
[0115] 详细分析三种可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂中所代 表的酶活性。对于这些商用纤维素酶制剂中的每一个，表征12种不同酶活性的水平，并以每 克蛋白质表示。实施例8中提供实验细节。结果如表1所示。应注意，用于该实施例中的分析 方法不同于本文为测定活性而依赖的那些方法。这些结果仅仅提供一般性的定性比较，而 不应视为将有关权利要求限制为本发明的方法。
[0116] 表1、为木质纤维素生物质转化而优化的商用纤维素酶制剂中选择的活性测量。
[0117]
[0118] 或者可以通过本领域熟知的方法从多种微生物(包括好氧和厌氧细菌、白腐真菌、 软腐真菌和厌氧真菌)获得能有效水解木质纤维素生物质的酶混合物。参见例如Singhania 等（2010)。产生纤维素酶的生物体通常以合适的比例分泌不同酶的混合物，以适用于木质 纤维素基质的水解。可用于木质纤维素生物质转化的优选纤维素酶制剂来源包括真菌如木 霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、镜刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、 曲霉属(Aspergillus)和白腐真菌属(Phanerochaete)的种。
[0119] 特别地对一种真菌物质，里氏木霉，进行了广泛的研究。野生型里氏木霉分泌包含 两种对纤维素链的还原和非还原末端具有相应特异性的外切纤维素酶(纤维二糖水解酶）、 至少五种具有不同纤维素识别位点的不同的内切纤维素酶、两种β葡萄糖苷酶以及多种内 切木聚糖酶和外切木糖苷酶的酶混合物。参见Rouvinen，J.等（1990)、Divne，C.等（1994)、 Martinez，D.等（2008)。商用纤维素酶制剂通常还包括α-阿拉伯呋喃糖苷酶和乙酰木聚糖 酯酶活性。参见例如Vinzant，Τ.等(2001)。
[0120] 之前已经表明，与野生型生物体天然分泌的混合物中存在的比例不同的相对比例 的优化酶活性混合物产生更高的糖产量。参见Rosgaard等（2007)。实际上，已经建议，包括 多达16种不同酶蛋白的酶共混物的优化可以有利地针对经过任何给定预处理的任何给定 生物质原料单独地确定。参见Billard，H.等(2012)、8 &1^^」6〇,6.等(2010)。然而，作为商业 实用性，商用酶提供商通常寻求产生最小可行数目的不同酶共混物，以使在大规模生产中 可以获得规模经济性。
[0121] 在一些实施方案中，用一种或多种额外的或补充的酶活性补充可商购的为木质纤 维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂可能是有利的。在一些实施方案中，简单地增加商 用制剂中存在的一种或多种组分酶的相对比例可能是有利的。在一些实施方案中，引入专 门的附加活性可能是有利的。例如，在使用任何给定生物质原料实施本发明的方法中，可以 鉴定可以有利地通过使用一种或多种补充酶活性水解的特定未水解的糖键。此类未水解的 键可以通过使用本领域熟知的方法对可溶性水解产物或不溶性未水解残留物中低聚糖类 的表征来鉴定。未水解的键还可以如Nguema-〇na等(2012)所述的，使用针对特定糖键的单 克隆抗体通过综合微阵列聚合物谱分析来鉴定。在一些实施方案中，用额外的内切木聚糖 酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶、葡糖醛酸苷酶(glucouronidase)、木聚糖酯酶、淀粉酶、木 糖苷酶、呋喃葡萄糖(glucouranyl)酯酶或阿拉伯呋喃糖苷酶中任何一种或多种补充可商 购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂可能是有利的。
[0122] 在一些实施方案中，如Humbird等(2011)所述，可选地在木质纤维素生物质加工设 施处现场生产酶可能是有利的。在一些实施方案中，可以在现场生产可商购的为木质纤维 素生物质转化而优化的纤维素酶制剂，有或者没有适合特定生物质原料的特定酶活性的定 制补充。
[0123] 在一些实施方案中，酶混合物可以进一步包括甘露糖苷酶化03.2.1.25)、&-0_半 乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、a-D-葡萄糖苷酸酶(EC 3.2.1.139)、肉桂酸酯酶(EC 3.1.1.-)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、B_1，3木糖苷酶活性(EC 3.2.1.72)、α-1，3和/或α-l，5阿拉伯糖呋喃糖苷酶活 性(EC 3.2.1.23)或其他活性中的任何一种或多种。
[0124] 通过单级自动水解预处理至非常低强度水平的生物质的另一个令人吃惊的特征 是将用作发酵生物体的抑制剂的预处理副产物的浓度保持在非常低的水平。其结果是，直 接在发酵中使用通过本发明的方法获得的水解的生物质而不需要任何洗涤或其他脱毒步 骤通常是可能的。
[0125] 如本领域中众所周知的，自动水解水热预处理通常产生多种可溶性副产物，其起 至Γ发酵抑制剂"的作用，因为它们抑制发酵生物体的生长和/或代谢。不同的发酵抑制剂以 不同的量产生，取决于木质纤维素原料的性质和预处理的强度。参见Klinke等(2004)。在自 动水解预处理过程中通常形成至少三类发酵抑制剂：（1)作为单糖或寡糖的降解产物的呋 喃类，主要是2-糠醛和5-HMF(5-羟甲基糠醛）；（2)作为木质素结构的降解产物的单体酚类； 和(3)源自半纤维素和木质素中的乙酰基团的小有机酸，主要是乙酸。不同抑制剂的混合物 已被证实在使用酵母菌株（参见，例如Palmquist等（1999))和使用产乙醇大肠杆菌 (Escherichia coli)(参见，例如Zaldivar等（1999))的生物乙醇发酵中协同地发挥作用。 在一些实施方案中，使用本领域熟知的方法使预处理的生物质进行闪蒸以降低挥发性抑制 剂(最明显的是糠醛)的水平可能是有利的。对预处理至木聚糖数为10%或更高的典型生物 质原料品种如小麦秸杆、甜高粱渣、甘蔗渣、玉米秸杆和空果串的自动水解，在我们的经验 中只有乙酸和糠醛水平对发酵生物体是潜在抑制性的。当生物质原料在35%或更高DM下进 行预处理至木聚糖数10%或更高，且当固体部分在25%或更低的DM下（具有添加的水以调 节DM但没有洗涤步骤)随后酶促水解时，水解产物中的糠醛水平通常可以保持低于3g/kg， 且乙酸水平低于9g/kg。这些水平对于使用指定菌株的酵母发酵而言通常是可接受的。在酶 促水解过程中，一些额外的乙酸从固体部分中半纤维素的降解释放。在一些实施方案中，使 用电渗析或本领域已知的其他方法从液体部分和/或水解的固体部分去除一些乙酸含量可 能是有利的。
[0126] 不同原料可以通过反应器保留时间和温度的多种不同组合、使用足以产生具有木 聚糖数10%或更高的预处理生物质的至低强度log Ro的单级自动水解进行预处理。本领域 技术人员容易通过常规实验确定使用带有任何给定的生物质反应器-装载和反应器-卸载 系统的任何给定的反应器适用于任何给定原料的合适的预处理途径。在原料使用由水闸_ 系统或螺旋塞进料机装载和由"颗粒栗"水闸系统或水力旋流器系统卸载的连续反应器预 处理的情况下，使用典型的小麦秸杆或空果串品种，在180°C的温度和24分钟的反应器保留 时间下、或在175°C至185°C范围内的温度和18至35分钟范围内的保留时间下、或在170°C至 190°C范围内的温度和13至40分钟范围内的保留时间下通常可以达到10%或更高木聚糖数 的非常低的强度。对于典型的玉米秸杆、甘蔗渣和甜高粱渣品种，10%或更高木聚糖数的非 常低的强度通常可以使用175°C至185°C范围内的温度8至25分钟范围的保留时间、或使用 170°C至190°C范围内的温度6至35分钟范围的保留时间达到。本领域技术人员容易理解，保 留时间和温度可以调整以达到相当的R〇强度水平。
[0127] 预处理至木聚糖数10%或更高的原料的酶促水解通常可以用商业上合理的酶消 耗量在高DM>20%下进行，不需要特定的洗涤或脱毒步骤，其中固体部分被压榨至至少 40 % DM，或其中固体部分的溶解固体物质含量降低至少50 %。
[0128] 在一些实施方案中，酶混合物可进一步包括甘露糖苷酶类(EC3.2.1.25)、a-D_半 乳糖苷酶^0 3.2.1.22)、&-1^-阿拉伯糖咲喃糖苷酶（&-]^-&1&13；[110;1^1^&1108丨(1&868)^0 3 · 2 · 1 · 55)、a-D-葡萄糖醛酸酶(EC3 · 2 · 1 · 139)、肉桂酸酯酶(EC 3 · 1 · 1 ·-)、或阿魏酸酯酶 (EC 3.1丄73)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1丄72)、B-1，3木糖苷酶活性(EC 3.2丄72)、α-1， 3和/或α-l，5阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性(EC 3.2.1.23)或其它活性中的任意一种或多种。
[0129] 本领域技术人员很容易确定施用的任何给定酶制剂的合适剂量水平和酶促水解 的合适pH和温度条件以及合适的持续时间。如前所述，水解持续时间可根据工艺目标而变 化。较长的水解导致更好的最终葡萄糖转化率，但在生产规模下投入更大的资本和操作成 本。在一些实施方案中，水解持续时间为至少24小时，或至少36小时，或至少48小时，或至少 64小时，或至少72小时，或至少96小时，或在24到150小时的时间之间。保持较低的酶剂量水 平从而最小化酶的成本通常是有利的。在一些实施方案中，使用高酶剂量可能是有利的。在 实施本发明的方法时，本领域技术人员可以在考虑包括当地生物质成本、产物流的市场价 格、工厂总资本成本和摊销计划及其他因素的相关因素后确定酶剂量的经济优化。在其中 使用可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂的实施方案中，可以使用制 造商提供的一般剂量范围来确定在其内进行优化的一般范围。
[0130] 在一些实施方案中，在分离的固体部分被酶促水解至理想的转化程度后，保持在 C5旁路中的液体部分与水解产物混合物混合用于后水解。在一些实施方案中，所有回收的 液体部分可以一次性加入，而在另外的实施方案中，可以去除液体部分中的某些组分和/或 可以逐步添加液体部分。在一些实施方案中，在与液体部分混合之前，固体部分被水解至至 少50%、或至少55%、或至少60%纤维素转化，意思是在水解产物中至少获得了葡萄糖单体 的指定理论产率。液体部分中存在的相当大部分的木糖低聚物通常可以被水解产物混合物 中保持活性的木聚糖酶和其他酶的作用水解成木糖单体。在一些实施方案中，后水解进行 至少6小时，或15-50小时、或至少24小时的时间。在一些实施方案中，液体部分中存在的木 糖低聚物质量的至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少 85%、或至少90%在后水解过程中通过水解产物混合物中保持活性的木聚糖酶和其他酶的 作用被水解为木糖单体。在一些实施方案中，液体部分直接与水解产物混合而没有进一步 添加化学添加剂。在一些实施方案中，液体部分的某些组分如乙酸、糠醛或酚类可以在与水 解产物混合之前从液体部分中去除。
[0131] 在一些实施方案中，固体部分的酶促水解和/或液体部分的后水解可以作为同步 糖化发酵(SSF)过程进行。本领域中众所周知，当SSF可以在与酶促水解的最佳温度相同的 温度下进行时，酶消耗量可以最小化，因为在酶促水解过程中引入的发酵生物体消耗葡萄 糖和木糖单体，并从而降低酶催化反应的产物抑制。在一些实施方案中，后水解仅在纤维部 分被水解(不添加发酵生物体)到至少60%纤维素转化之后进行。在一些实施方案中，SSF可 以在酶促水解的初期后进行，即在酶促水解的初期后添加发酵生物体，并且发酵和水解二 者都持续，任选地在对酶促水解而言非最佳的温度下。
[0132] 在通过在35%或更高的DM下单级自动水解到足够低以产生具有10%或更高的木 聚糖数的预处理生物质的强度log R〇来预处理生物质原料（如小麦秸杆、甘蔗渣、甜高粱 渣、玉米秸杆或空果串）的情况中，在获得的预处理生物质的固体部分具有至少40%DM或去 除至少50%溶解固体物质的情况中，在随后使用可商购的为木质纤维素生物质转化而优化 的纤维素酶制剂以15-27%的DM酶促水解固体部分的情况中，在酶促水解进行至少48小时 的情况中，在获得至少50%葡萄糖转化后将液体部分添加至固体部分水解产物中的情况 中，及在添加的液体部分经历至少6小时时间的后水解的情况中，达到合并的C5/C6水解产 物中对应于理论最大C5单体产量的60 %或更高的C5单体产量的C5单体浓度通常是可能的。
[0133] 在一些实施方案中，可以使用一种或多种改良的酵母菌株直接将合并的C5/C6水 解产物发酵成乙醇。
[0134] 图9示出了一个实施方案的工艺方案。如图所示，浸泡、洗涤或润湿软木质纤维素 生物质至35%或更高的DM。在3.5-9.0范围内的pH下在单级自动水解中使用加压蒸汽预处 理生物质至特征是木聚糖数10%或更高的强度。预处理的生物质进行固/液分离以产生液 体部分和具有40 %或更高DM含量的固体部分。调节固体部分至合适的DM含量，然后在15 % 或更高的DM含量下进行酶促水解至纤维素酶转化率60%或更高的程度。随后混合分离的液 体部分和水解的固体部分，并进行后水解，从而在液体部分中存在的相当大量的木糖低聚 物被水解为单体的木糖。在所述的水解和后水解结束后，C5单体的产率通常是至少60%，而 纤维素转化率相似地为至少60%。
[0135] 在替代的实施方案中，使预处理的生物质作为全料浆来经受酶促水解。在再其它 实施方案中，分离液体部分，并使固体部分经受酶促水解和随后的发酵。在一些实施方案 中，从这样的发酵中回收乙醇之后，剩余的酒精废液可以与分离的液体部分共混并且用作 生物甲烷基质。
[0136] 实施例
[0137] 实施例1:作为预处理强度量度的固体部分的"木聚糖数"表征。
[0138] 在以35-50%干物质预处理之前，用0-10g乙酸/kg干物质生物质(pH>4.0)浸泡小 麦秸杆(WS)、玉米秸杆(CS)、甜甘蔗渣（SCB)和空果串（EFB)。在170-200°c的温度下预处理 约60kg DM/h生物质，保留时间为12-18分钟。使用水闸系统将生物质装载至反应器中，并使 用水闸系统卸载预处理的材料。加压预处理反应器内的压力对应于所用温度下饱和蒸汽的 压力。使用螺旋压榨机对预处理的生物质进行固/液分离，从而产生液体部分和具有约30% 干物质的固体部分。固体部分用约3kg水/kg干生物质洗涤，并且再次压榨至约30 %干物质。 Petersen等(2009)进一步描述了关于预处理反应器和过程的详细内容。
[0139] 根据Sluiter等(2005)和Sluiter等(2008)所述的方法，使用装备来自Phenomenex 的Rezex Monossacharide H+柱的Dionex Ultimate 3000 HPLC系统分析原始原料的碳水 化合物。在连续预处理三小时后收集液体部分和固体部分的样品，并且在三小时内三次收 集样品以确保样品从稳态预处理获得。根据Sluiter等(2008)描述的方法，使用装备Rezex Monossacharide H+单糖柱的来自Dionex的Ultimate 3000 HPLC系统分析固体部分的碳水 化合物。根据Sluiter等（2006)描述的方法，使用装备Rezex Monossacharide H+单糖柱的 来自Dionex的Ultimate 3000 HPLC系统分析液体部分的碳水化合物和降解产物。通过在具 有5 mM硫酸的水中以1:4的比例悬浮固体部分和之后根据Sluiter等(2006)描述的方法，使 用装备Rezex Monossacharide H+柱的来自Dionex的Ultimate 3000 HPLC系统进行分析来 分析固体部分中的降解产物。根据Weiss等(2009)中所述的方法分析干物质含量和悬浮固 体物质的量。如Petersen等(2009)所述设置质量平衡并测定纤维素和半纤维素回收率。也 定量在预处理过程中每kg生物质干物质降解为5-HMF或糠醛的糖的量和从半纤维素释放的 乙酸的量，虽然由于闪烁(flashing)导致的糠醛损失没有计算在内。
[0140] 预处理过程的强度通常通过首先由Overend等（1987)提出的强度因子来描述。强 度因子通常表示为对数值，以使得1〇8 (办）=#4叩（（1'-1^#)/14.75)，其中办是强度因子， t是以分钟计的保留时间，T是温度，而Tref是参照温度，通常为100°C。强度因子是基于半纤 维素溶解的动力学，如Belkecemi等（1991 )、Jacobsen 和 Wyman (2000)或 Lloyd等（2003)所 述。因此预处理的强度与预处理之后固体部分中保留的残余半纤维素含量有关。
[0141] 根据Sluiter等（2008)所述的方法，使用装备来自Phenomenex的Rezex Monossacharide H+柱的Dionex Ultimate 3000 HPLC系统分析如所述地制备和洗涤的固 体部分的C5含量。当通过水热自动水解预处理时，按照以上所述产生和洗涤的固体部分中 的木聚糖含量与软木质纤维素生物质（例如小麦秸杆、玉米秸杆或EFB)的强度因子线性相 关。作为按照以上所述制备和洗涤的固体部分中木聚糖含量的强度定义在预处理设定之间 是可转换的。木聚糖数是洗涤的固体部分中测量的木聚糖含量，其包括一些来自可溶性物 质的成分。图1对于小麦秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣和来自棕榈油加工的空果串示出了木聚糖 数对预处理强度1 〇g (R。)的相关性。
[0142] 如所示的，对于通过单级自动水解预处理的各种测试生物质原料，在木聚糖数和 预处理强度之间存在明显的负线性相关。
[0143] 实验中未溶解固体物质的木聚糖含量还计算为:从纤维部分的总木聚糖含量中减 去纤维(低聚物和单体)之间液体中的溶解木聚糖含量。
[0144] [纤维中的固体木聚糖](重量％ )=[纤维部分中的总木聚糖](重量％ )-[纤维部 分中的溶解木聚糖](重量％)
[0145] 溶解木聚糖含量通过[纤维部分中的（溶解固体物质重量％/总固体物质重量％)] X [液体部分中的溶解木聚糖浓度]来计算。
[0146] 对于预处理的小麦秸杆(PWS)、玉米秸杆(PCS)、甘蔗渣(SCB)和来自油棕榈的空果 串（PEFB)，计算得到的未溶解固体物质的木聚糖含量（以重量％计)在图2中示作木聚糖数 的函数。
[0147] 实施例2.随预处理强度变化的C5回收率
[0148] 如实施例1中所述预处理生物质原料并表征样品。图3示出了通过单级自动水解预 处理小麦秸杆的实验中，随木聚糖数变化的C5回收率(木糖+阿拉伯糖）Χ5回收率显示为水 不溶性固体物质(WIS)、水溶性固体物质(WSS)和总回收率。如所示的，作为水不溶性和水溶 性固体物质的C5回收率均随木聚糖数的增加而提高。随着木聚糖数增加超过10%，作为水 溶性固体物质的C5回收率降低，而作为水不溶性固体物质的C5回收率继续提高。
[0149] 测试的典型小麦秸杆品种在预处理之前以干物质计包含约27%的半纤维素。图4 示出了预处理之后，对于通过自动水解预处理的小麦秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣和EFB随木聚 糖数变化的总C5回收率。测试的典型玉米秸杆、甜甘蔗渣和EFB品种在预处理之前以干物质 计分别包含约25%、19%和23 %的C5含量。如所示的，对于所有原料，预处理之后的总C5回 收率取决于如预处理生物质的木聚糖数定义的预处理强度。如所示的，在预处理之后回收 的90%的C5含量可以被完全水解为C5单体的情况下，当预处理强度的特征是产生10%或更 高的木聚糖数时，通常可以预期酶促水解后至少60%的最终C5单体产率。
[0150] 实施例3.随预处理强度变化的抑制酶和酵母生长的降解产物的产生
[0151] 如实施例1中所述预处理生物质原料，并表征样品。图5示出了通过单级自动水解 预处理小麦秸杆的实验中，乙酸释放以及糠醛和5-羟甲基糠醛(5-HMF)的产生与木聚糖数 的相关性。如所示的，这些公认为抑制发酵酵母且在某些情况下也抑制纤维素酶的降解产 物的产生在木聚糖数小于10%时呈指数增长。在10%或更高木聚糖数下，糠醛和乙酸的水 平落入到允许预处理的生物质发酵而不需要脱毒步骤的范围内。对于乙酸，其水平在预处 理至木聚糖数10%或更高的生物质的酶促水解过程中进一步提高，尽管通常达到被改造以 消耗C5和C6糖两者的酵母良好耐受的水平。
[0152] 实施例4.随固体部分DM%变化的固体部分中保留的物质对纤维素酶的抑制。
[0153] 在基本上按照W02006/056838中所描述和所用的6-室反应器的原理工作的6-室自 由降落反应器中进行实验。6-室水解反应器设计为以高于20%DM的固体浓度进行液化和水 解的实验。反应器由分成6个独立的室的水平放置的辊筒组成，每个室24cm宽和50cm高。每 个室中安装了三个桨叶的水平旋转轴用于混合/搅拌。l.lkW马达用作驱动，并且旋转速度 在2.5至16.5rpm范围内可调。旋转的方向经编程为每两分钟在顺时针和逆时针方向之间切 换。外部的充水加热夹套使得能够控制高达80C的温度。
[0154] 实验使用了通过使用实施例1中描述的系统进行单级自动水解预处理的小麦秸 杆。将生物质润湿至DM>35 %，并在pH>4.0下用蒸汽预处理至强度log Ro大约3.7，产生具 有木聚糖数10.5%的预处理材料。在丹麦的Skarbak的Inbicon试验工厂进行预处理。使用 水闸系统将生物质装载至预处理反应器中，并使用水闸系统从反应器卸载预处理的生物 质。在某些情况下，使用螺旋压榨机使预处理的生物质接受固/液分离，从而产生液体部分 和固体部分。固体部分具有大约30%的DM含量，包含大部分的初始纤维素和木质素，部分的 半纤维素和总共大约25 %的溶解固体物质。
[0155] 将6室反应器的室填充包含所有溶解和未溶解固体物质的总预处理生物质或包含 大约25 %总溶解固体物质的压榨固体部分。调节干物质含量至19 % DM。使用每克葡聚糖 0 · 08ml来自 Novozymes的CTec2?或每克葡聚糖0 · 2-0 · 3 ml来自 DuPont，Genencor 的 八(^6116瓜86 11?101￥在50(]和。!15.0至5.3下水解预处理的生物质。这些可商购的为木质纤 维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂的剂量水平完全是在制造商建议的范围内。在混合 速度6rpm下进行酶促水解实验96小时。
[0156] 可见，如本文所述测量的采用Accellerase TRIO的实验中的酶活性的最初范围 是:外切葡聚糖酶为280-5000 nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶为1100-20000nkat/g葡聚糖， β-葡萄糖苷酶为3000-25000nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶为1400-30000nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶为75-25000nkat/g葡聚糖nkat/g葡聚糖。
[0157] 图6示出了在这些条件下酶促水解之后的纤维素转化，其随酶促水解之前去除 的％溶解固体物质而变化。如所示的，在这些酶剂量水平下去除75 %溶解固体物质从绝对 值来说（in absolute terms)增加纤维素转化10-20 %。因此，在待使用分离的固体部分来 进行酶促水解的情况下，在酶促水解之前压榨所述固体部分至DM含量为至少40%或另外地 减少溶解固体物质含量至少50%是有利的，因为这通常将提供提高的酶性能。
[0158] 实施例5.来自预处理至木聚糖数>10%的生物质的液体部分的糖含量和水解 [0159]预处理小麦秸杆、玉米秸杆和甘蔗渣，至强度log Ro 3.63以产生具有木聚糖数 11.5%的预处理的小麦秸杆(WS)，至强度log Ro3.51以产生具有木聚糖数12.3%的预处理 的甘蔗渣（SCB)，和至强度log Ro 3.35以产生具有木聚糖数15.5%的预处理的玉米秸杆 (CS)。预处理的原料经受固/液分离以产生液体部分和固体部分，如实施例4所述。根据 (Sluiter，Hames等2005)所述的方法，使用装备Rezex Monossacharide柱的Dionex Ultimate 3000 HPLC系统分析液体部分的碳水化合物和降解产物。表2示出了以DM含量百 分比表示的液体部分的糖含量，其划分成低聚物和单体的葡萄糖/葡聚糖、木糖/木聚糖和 阿拉伯糖/阿拉伯聚糖的类别。如所示的，尽管一些葡萄糖含量以单体和低聚物的形式存 在，糖含量的主要部分是低聚的木聚糖。注意到使用自动水解获得的液体部分中木聚糖低 聚物占优势，这与使用稀酸预处理获得的液体部分相反。在用稀酸水热预处理法预处理的 生物质中，液体部分通常通过酸催化剂的作用水解为单体成分。
[0160] 表2.预处理至木聚糖数> 10 %的生物质中液体部分的糖含量
[0161]
[0162] 进一步通过米用Thermo Scientific Dionex CarboPacTM PA200柱使用模块化的 Dionex ICS-5000色谱系统的HPLC分析表征来自预处理的小麦秸杆的液体部分。使用NaOH/ NaOAc-梯度条件分离分析物，并通过使用金电极的积分和脉冲安培检测（IPAD)进行测量。 图7示出了描述液体部分的洗脱谱的HPLC色谱图，其中木二糖(X 2)、木三糖（X3)、木四糖 (Χ4)、木五糖(?)和木六糖(Χ 6)标准品的洗脱谱作为较高的迹线重叠在较低的迹线上。如所 示的，自动水解的生物质的液体部分包括包含少量的木糖单体和相当大量的木二糖(Χ2)、 木三糖(χ 3)、木四糖(Χ4)、木五糖(χ5)和木六糖(χ6)以及其他物质的混合物。
[0163] 实施例6.固体部分的酶促水解和在纤维水解后来自预处理至木聚糖数>10%并 压榨至> 40 % DM的生物质的液体部分的添加接着后水解
[0164] 如实施例4所述的在6-室自由降落反应器中进行了实验。
[0165] 实验使用通过至强度log Ro在约3.19至3.73之间的单级自动水解预处理的小麦 秸杆、玉米秸杆或甘蔗渣以产生具有木聚糖数11.5至15.6%的预处理生物质。将生物质切 割并润湿至DM>35%，并在170_190°C下用蒸汽预处理12分钟。在丹麦的Skarbak的Inbicon 试验工厂进行预处理。使用螺旋压榨机使预处理的生物质接受固/液分离以产生具有> 40%DM的固体部分。保存液体部分(C5旁路）以便随后添加到水解产物(后水解）。
[0166] 将6室反应器的室填充大约10kg的压榨预处理生物质的固体部分，并通过加水调 节至19-22%DM。使用来自GENENC0R-DuP0NT的ACCELLERASETRI0 TM在50°C和pH5·0至5·3下 水解预处理的固体部分。混合速度是6rpm。运行水解实验96小时，且然后在加入保存的液体 部分(C5旁路），并在50°C和pH 5.0至5.3下运行后水解48小时。
[0167] 每天获取HPLC样品以跟踪纤维素和半纤维素的转化，并使用装备Rezex Monossacharide柱的Ultimate 3000 HPLC系统通过使用外标的定量来分析葡萄糖、木糖和 阿拉伯糖。
[0168] 图8示出了使用预处理至木聚糖数12.3%并用每克葡聚糖0.31111八(^6116^86 Tri〇TM(GenenC〇r)水解的甘蔗渣，在固体部分水解96小时后加入液体部分的半纤维素转化 的水解数据。所示的是典型的水解谱图。C5单体回收率以来自水解反应中存在的物质的理 论产量的百分比表示。固体部分中的大多数半纤维素在固体部分水解的前24小时内被转化 成单体糖。96小时后液体部分的加入提高了理论潜在产量，这解释了刚加入液体部分之后 观察到的C5转化的下降。在前24小时内，大多数来自液体部分的C5被转化成单体。将恰在液 体部分加入之前的C5转化与水解终点时相比较，计算液体部分的C5转化为在这些条件下使 用甘蔗渣的90%是可能的。
[0169] 表3示出了在不同环境下预处理且使用不同剂量水平的可商购的为木质纤维素生 物质转化而优化的纤维素酶制剂(4(^6116抑86 1'1'；[01￥(6611611(301'))水解的不同生物质的水 解数据。使用的所有酶剂量水平均在制造商建议的范围内。如所示的，使用单级自动水解以 及具有C5旁路和后水解的酶促水解，用制造商建议的可商购的为木质纤维素生物质转化而 优化的纤维素酶制剂的剂量可以达到60%或更高的C5单体产率，同时仍然达到60%或更高 的纤维素转化。
[0170] 可见，用Accellerase TRIO如本文所述测量的表3中提及的实验中的酶活性的最 初范围是:外切葡聚糖酶为280-5000nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶为1100-20000nkat/g葡 聚糖，β-葡萄糖苷酶为3000-25000nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶为1400-30000nkat/g葡聚 糖，木糖苷酶为75-25000nkat/g葡聚糖。
[0171] 表3.具有C5旁路的使用非常低强度的单级自动水解和后水解的水解产率
[0172]
[0173」实施例7.合并水解产物中C5和C6糖通过改良的酵母共发酵为乙醇
[0174] 作为使用通过单级自动水解预处理至木聚糖数>10%制备的从软木质纤维素生 物质（在这里是小麦秸杆)产生的水解产物的实例，图9示出了在用能够转化C5和C6糖两者 的GM0酵母(来自TERRAN0L?的菌株VI)发酵之前，在没有脱毒或任何其他处理步骤的情况下 进行发酵的数据。如实施例4所述分离的、来自预处理小麦秸杆的固体部分利用来自 Novozymes的Cellic Ctec2?水解，然后与保存的液体部分合并，并且在没有任何脱毒以去 除发酵抑制剂的情况下使用。
[0175] 在发酵前用Κ0Η颗粒调节水解产物至pH 5.5,并补充3g/L尿素。发酵以分批发酵进 行。反应器中的初始细胞浓度是0.75g dw/L。使用自动添加10%NH3控制发酵在pH 5.5。保 持温度在30°C，且搅拌速度为300rpm。如所示的，葡萄糖和木糖容易消耗且乙醇容易产生， 尽管存在通常在较高预处理强度水平下证明为抑制性的乙酸、糠醛和其他化合物。
[0176] 实施例8.商用纤维素酶制剂活性水平的实验测定
[0177] 稀释来自 GENENC0R?的ACCELLERASE TRIO?以及来自 N0V0ZYMES?的CELLIC CTEC2?和CELLIC CTEC3?的商用制剂，以使得酶制剂将具有等同的密度，意味着等同规格 的等份试样具有等同的质量。加入等同体积的稀释酶制剂，且试验测定一式两份或一式三 份地进行。
[0178] 在50mM的NaOAC缓冲液pH 5中，在25°C下进行CBHI (外切纤维素酶）活性分析25分 钟。通过跟踪从模式底物4-甲基伞形酮基-β-纤维二糖苷的4-甲基伞形酮(Abs:347nm)的连 续释放速率一式三份地测定活性。活性单位是lymole MeUmb当量/分钟。CTEC3、ACTrio和 CTEC2分析中酶制剂浓度分别为0.16、0.14、0.17mg/ml。底物浓度是0.5mg/ml。
[0179] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行内切-1，4-β-葡聚糖酶活性的分析60 分钟。通过跟踪与模式底物Avicel ΡΗ-101的还原末端产生相关的吸光度变化一式三份地 测定活性。活性单位是lymole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析中酶制剂浓度 分别为〇 · 80、0 · 67、0 · 79mg/ml。底物浓度是80mg/ml。
[0180] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行β_葡萄糖苷酶活性的分析20分钟。通 过跟踪从模式底物纤维二糖的葡萄糖释放相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活性单 位是2ymole葡萄糖/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂浓度分别为0.1、0.12、 0.12mg/ml。底物浓度是 1.7mg/ml。
[0181] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行内切-1，4-β-木聚糖酶活性的分析60 分钟。通过跟踪与模式底物水可提取的阿拉伯糖基木聚糖的还原末端产生相关的吸光度变 化一式三份地测定活性。活性单位是lymole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析 中酶制剂浓度分别为1.12、0.97、1.1211^/1111。底物浓度是1〇1^/1111。
[0182] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行β_木糖苷酶活性的分析60分钟。通过 跟踪与模式底物水可提取的阿拉伯糖基木聚糖的水解相关的木糖释放一式两份地测定活 性。活性单位是Ιμπιο?木糖/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂浓度分别为1.12、 0.97、1.12mg/ml。底物浓度是 10mg/ml。
[0183] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的分析60 分钟。通过跟踪与模式底物水可提取的阿拉伯糖基木聚糖的水解相关的阿拉伯糖释放一式 三份地测定活性。活性单位是lymole阿拉伯糖/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂 浓度分别为1.12、0.97、1.12mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0184] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行淀粉葡萄糖苷酶(AMG)活性的分析80 分钟。通过跟踪与模式底物可溶性玉米淀粉的葡萄糖释放相关的吸光度变化一式三份地测 定活性。活性单位是bmole葡萄糖/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂浓度分别为 1 · 12、0 · 97、1 · 12mg/ml。底物浓度是 10mg/ml。
[0185] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行α-淀粉酶活性的分析60分钟。通过跟 踪与模式底物可溶性玉米淀粉的还原末端产生相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活 性单位是lymole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂浓度分别为1.12、 0.97、1.12mg/ml。底物浓度是 10mg/ml。
[0186] 在100mM琥珀酸盐缓冲液pH 5中，在25°C下进行乙酰木聚糖酯酶活性的分析25分 钟。通过跟踪从模式底物4，4-硝基苯基乙酸酯的4-硝基苯基(Abs: 410nm)的连续释放速率 一式三份地测定活性。活性单位是lymole pNP当量/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶 制剂浓度分别为〇. 48、0.42、0.51mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0187] 活性测定的结果如表1所示。
[0188] 这些结果提供了酶制剂之间的定性比较，但在大多数情形下没有根据用于出于本 文权利要求的目的测定酶活性的nkat值的方法进行。
[0189] 实施例9:对在通过低强度单级自动水解预处理的原料的酶促水解中取得高C5单 体收率重要的酶活性的确定
[0190] 如实施例4中所述，将小麦秸杆预处理至强度log Ro 3.52(183°C，保留时间12分 钟）以产生具有木聚糖数13.5%的预处理生物质，大约7.8重量％木聚糖留在未溶解固体物 质中，如图2估计的那样。预处理的葡聚糖回收率为100%。预处理的木聚糖回收率为77%。
[0191] 以滤纸单位(Filter Paper Units)(FPU)的纤维素酶活性的测量分别针对三种单 独的可商购的纤维素酶制剂ACCELLERASETRIO?(来自GENENCOR?)，CELLIC CTEC3?(来自 N0V0ZYMES?)，以及以1:0.2的重量比混合的CELLUCLAST和N0V0ZYME 188的混合物（来自 N0V0ZYMES?)进行测定。通过Ghose (1987)的方法测定FPU活性，发现对CTEC3得到179FPU/g 酶制剂，而对CELLUCLCAST/188得到60FPU/g酶制剂。
[0192] 水解实验基本上如实施例6所述的进行，除了最初干物质含量为22%DM，添加1重 量％聚乙二醇(PEG )，固体部分的最初水解进行94小时，添加的液体部分(C5旁路）的后水解 进行50小时，以及使用的酶是以等同剂量（以FPU/g葡聚糖计）14.3FHJ/g葡聚糖应用的 CTEC3、ACTRI0或CELLUCLAST/188。
[0193] 应用的酶的实际剂量：CTEC3为0.08 g/g葡聚糖，AcTRIO为0.24g/g葡聚糖， CELLUCLAST/188 为0.22g/g葡聚糖。
[0194] 如本文所述测量的用于实验中的酶活性（以nkat/g葡聚糖计)估计如下：
[0195] 外切葡聚糖内切葡聚糖β-葡萄糖苷木聚糖蘇 木糖苷酶 酶 酶 酶 Trio 685a 2829b 8016c !2024c 267d Colluo/188-f- 477 2X〇0 3372 2200 51 CTEC3 607a 2949e Ι0〇?6Γ N/A N/A
[0196] +:基于Juhasz等(2005)报告的值
[0197] a:使用4-甲基伞形酮基-β-纤维二糖苷作为底物测量
[0198] b:基于ACCELLERASE TRIO产品信息表单，其报告使用羧甲基纤维素(CMC)作为底 物的最小内切葡聚糖酶值并且假设羟乙基纤维素的相应值将是CMC值的大约0.35倍，如例 如Dori等（1995)所报告的那样
[0199] c:基于ACCELLERASE TRIO产品信息表单，其报告最小值
[0200] d:基于另外测量的木糖苷酶活性的比率，其对比3.86:1的Trio: Cel luclast每克 酶制剂
[0201] e:基于另外测量的内切葡聚糖酶活性的比率，其对比3.12:1的CTEC3: TRIO每克酶 制剂
[0202] f:基于另外测量的β-葡萄糖苷酶活性的比率，对比3.76:1的CTEC3: TRIO每克酶制 剂
[0203] 可见，如本文所述测量的这些实验中的酶活性最初在以下范围内：外切葡聚糖酶 280-1240nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶1100-8000nkat/g葡聚糖，β-葡萄糖苷酶3000-15000nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶9000-30000nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶75-1400nkat/g 葡聚糖。
[0204] 图11示出了在各个不同反应室内随时间变化的纤维素转化率。纤维素转化率测定 为当提取样品时葡萄糖浓度除以理论葡萄糖潜能。当添加 C 5旁路时，葡萄糖潜能改变，这是 因为所述旁路含有未消化的少量葡萄糖低聚物，导致总转化率下降。如图所示，纤维素转化 动力学对CTEC和TRIO室是等同的，但对CELLUCLAST/188室并非如此。这归因于明显较低的 木聚糖酶和木糖苷酶活性水平。
[0205]图12示出了随时间变化的相应木聚糖转化率。木聚糖转化率以与纤维素转化率相 同的方式计算，但由于C5旁路含有大量木糖低聚物，当将C5旁路添加到水解产物时转化率 最初急剧下降。如图所示，木聚糖转化动力学对CTEC和TRIO室是等同的，但对CELLUCLAST/ 188室并非如此。这再次归因于明显较低的木聚糖酶和木糖苷酶活性水平。
[0206]当预处理的木聚糖回收率为77%时，图12中所示的木聚糖回收率对应于水解产物 中非常高的最终C5单体回收率，例如，图12中80%的回收率对应于(0.80)*(0.77) = 61.6% 的C5单体回收率。
[0207] 葡聚糖和木聚糖含量如Sluiter，A ·，B · Hames等（2005 )，Determination of Sugars，Byproducts，and Degradation Products in Liquid Fraction Process Samples，NREL-Biomass Program and in Sluiter，A.，B.Hames等（2006)，Determintation of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass，NREL_Biomass Program所描述 的那样测定。
[0208] 实施例10:稀释至较低干物质允许使用全料浆在较低酶剂量下的等同转化率
[0209] 在实施例9中所描述的实验中，6室水解反应器的两个室被用于比较全料浆的水 解，其中预处理后与固体部分分离的液体部分没有保存为后来添加到水解产物的旁路，而 是返回与固体部分共混并同时水解。全料浆稀释至12%DM，其使得抑制性溶解物质的浓度 与实施例9所述反应中获得的浓度大约是等同的，其中溶解的固体物质被移除并与22%DM 下的固体部分的水解保持分离(C5旁路）。CTEC3和ACTRI0用作酶制剂并且以10.7FPU/g葡聚 糖的低剂量应用。
[0210] 待如本文所述测量的用于实验中的酶活性（以nkat/g葡聚糖计)估计(基于实施例 9中给出的值)如下：
[0211] 外切葡聚耱内切葡聚糖β-蔔萄糖苷木聚糖酶 木糖寄酶 酶 酶 _酶 Trio 514 2:122 6012 9018 200 CTEC3 455 2212 7535 N/A 秘 A
[0212] 可见，如本文所述测量的这些实验中的酶活性最初在以下范围内：外切葡聚糖酶 280-1240nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶1100-8000nkat/g葡聚糖，β-葡萄糖苷酶3000-15000nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶9000-30000nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶为75-1400nkat/ g葡聚糖。
[0213] 图13示出了两种全料浆水解样品随时间变化的纤维素转化率。纤维素转化率如实 施例9中所述的测定。如图所示，纤维素转化动力学对CTEC和TRIO室是等同的。此外，尽管酶 剂量较低，但转化率水平等同于用C5旁路和后水解取得的那些，如实施例9中所述。
[0214] 图14示出了两种全料浆水解样品随时间变化的相应木聚糖转化率。如图所示，木 聚糖转化动力学对CTEC和TRIO室是大约等同的。当预处理的木聚糖回收率为77 %时，图14 中所示的木聚糖回收率对应于水解产物中非常高的最终C5单体回收率，例如，图12中80% 的回收率对应于(〇. 80) * (0.77 )= 61.6 %的C5单体回收率。如图所示，在全料浆水解中，在 这些条件下在41小时的水解中获得了至少55 %的非常高的C5单体回收率，对应于图14中 71 %的木聚糖转化率。
[0215]表4中示出了实施例9和10中描述的实验的预处理、7K解和回收率的不同参数。
[0216] 表4:使用非常低强度的单级自动水解的水解产率
[0217]
Luz 17」 大jjtTiyu丄丄：牲mj ti拡但h、j王料水牛
[0220]如实施例4中所述，将甘蔗渣预处理至强度log Ro 3.43(180°C，保留时间12分钟） 以产生具有木聚糖数12.0%的预处理生物质，大约6.8重量％木聚糖保留在未溶解固体物 质中，如图2估计的那样。预处理的木聚糖回收率为83%。在离开反应器后，将料浆压榨成大 约57%的纤维部分和液体部分。收集并分析预处理的材料(纤维部分以及液体部分）。样品 的干物质和组成如前面实施例中所述的那样测定。
[0221] 在实施例6中描述的6室反应器中进行实验。预处理的甘蔗渣被用作全料浆混合 物，其中在添加酶之前将纤维部分与液体部分混合。然后用水将干物质含量调节至18重 量％01。水解在50°(3下进行，使用20重量％氢氧化钙溶液(0 &(0!〇2)将?!1调节为4.7到5.3之 间。将4〇〇6116瓜86 1'1'；[0以0.161]11^葡聚糖(9.5??1]/^葡聚糖）的浓度用作酶。每天取样并 对糖含量进行分析。在118h后停止水解。以双重测定进行实验。
[0222] 如本文所述测量的用于实验中的酶活性（以nkat/g葡聚糖计)估计(基于实施例9 中给出的值)最初如下：
[0223] 外切葡聚糖内切葡聚檣β-葡萄糖苷木聚糖酶 木糖苷酶 ..峰 酶 酶 Τ?0 478 1:973 55￥1 8387 1Μ
[0224] 可见，如本文所述测量的这些实验中的酶活性最初在以下范围内：外切葡聚糖酶 nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶nkat/g葡聚糖，β-葡萄糖苷酶nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶 nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶nkat/g葡聚糖。
[0225] 表5中示出了本实施例11中描述的实验的预处理、水解和回收率的各种不同参数。
[0226] 表5:使用非常低强度的单级自动水解的水解产率
[0227]
[0228] ~图15示出了随甘蔗渣的全料浆水解的水解时间变化的水解产物中总C5和C6单体-回收率。如图所示，在这些条件下在24小时内，获得了至少55%的总C5单体回收率。
[0229] 实施例12:在来自通过低强度自动水解预处理的原料的水解产物的C6乙醇发酵后 残留的酒精废液的改善的生物甲烷潜能
[0230] 将小麦秸杆如实施例4中所述预处理至三种不同的强度以产生具有木聚糖数 3.0%、9.1%和13.2%的预处理生物质，分别具有在未溶解固体物质中残留的大约2.0%、 4.3 %和7.8重量％的木聚糖，如图2所估计的。
[0231] 使预处理的材料经受固/液分离以产生纤维部分(其随后用于酶促水解实验中）以 及液体部分(其保持与水解分离）。固体部分用CTEC3水解，剂量分别为:针对3.0%木聚糖数 样品0.052g/g葡聚糖;针对9.1 %木聚糖数样品0.056g/g葡聚糖;和针对13.2%木聚糖数样 品0.075g/g葡聚糖。
[0232] 可见，如本文所述测量的这些实验中的酶活性最初在以下范围内：外切葡聚糖酶 nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶nkat/g葡聚糖，β-葡萄糖苷酶nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶 nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶nkat/g葡聚糖。
[0233] 水解在50°C、在22%DM调节至5.0的pH下进行144小时。在144小时后，将普通面包 酵母(C6发酵)添加到水解产物，将温度降至37°C并使发酵/水解再继续60小时。在发酵/水 解结束时，不同组之间的乙醇浓度大约等同，在61.77-63.68g/kg乙醇之间。
[0234] 来自发酵的水解产物以及来自相应的分离液体部分的生物甲烷产量使用 卩代(^1'；[(^3 3。；[1(16￥311(1，？16(161'；[(^3，丹麦的接种体、以接种体/底物比率5-6.5(基于挥发 性固体物质）、以一式两份分批分析进行测定。
[0235] 小心地测定每个预处理的质量平衡，并用于估计来自三种不同强度水平中每一种 的水解产物中每一种的C6乙醇发酵后残留的酒精废液的生物甲烷潜能。减去已知的乙醇对 观察的生物甲烷潜能的贡献，测定来自1吨小麦秸杆干物质的估计甲烷产量。结果在表6中 示出。
[0236] 表6:从1吨秸杆干物质获得的酒精废液和液体部分的甲烷产量，取决于预处理的 强度。
[0237]
[0238] 实施方案和实施例的描述只是说明性的，并且不意图用来限制权利要求的范围。 本文中引用的各参考文献在此明确通过引用全文并入。
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【主权项】
1. 一种加工木质纤维素生物质的方法，包括： -提供软木质纤维素生物质原料； -在单级加压水热预处理中在3.5-9.0的pH范围内预处理所述原料至log强度Ro3.75 或更低以产生预处理的生物质料浆，其中未溶解的固体物质含有至少5.0重量％的木聚糖； 以及 在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所述预 处理的生物质至少24小时以产生水解产物，所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖 酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶和β-木糖苷酶活性；以nkat/g葡聚糖计，内切葡聚糖酶的 活性水平为至少1100,外切葡聚糖酶的活性水平为至少280，β-葡萄糖苷酶的活性水平为至 少3000，内切木聚糖酶的活性水平为至少1400，和β-木糖苷酶的活性水平为至少75;所述水 解产物中C5单体的收率为预处理前所述原料的初始木糖和阿拉伯糖含量的至少55%。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述预处理的生物质作为全料浆进行水解。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述水解在干物质含量8至19 %之间进行。4. 根据权利要求2所述的方法，其中所述全料浆水解产物被用作生物甲烷基质。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述预处理的生物质经受固/液分离步骤以产生液 体部分和具有至少40重量％的干物质含量的固体部分，并且所述固体部分进行水解。6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述水解在20 %或更大的干物质含量下进行。7. 根据权利要求4所述的方法，其中在所述固体部分的酶促水解已达到期望程度的葡 聚糖转化率后，所述分离的液体部分被添加返回到所述水解混合物中。8. 根据权利要求7所述的方法，其中存在于液体部分中的至少85%的木糖-低聚物在后 水解过程中水解为木糖单体。9. 根据权利要求7所述的方法，其中在至少50%的纤维素已转化为葡萄糖后，将液体部 分添加到水解的固体部分。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述原料是小麦秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣、甜高粱 渣或空果串。11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述原料以至少35%的干物质含量经受加压预处 理。12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述加压预处理在10巴或更低的压力下进行。13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述原料使用水力旋流器系统从加压预处理反应 器中去除。14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述原料预处理达到使得生物质的特征为具有 12 %或更高的木聚糖数的强度。15. 根据权利要求1所述的方法，其中酶促水解使用为木质纤维素生物质转化而优化的 可商购的纤维素酶制剂进行。16. 根据权利要求1所述的方法，其中酶促水解进行至少96小时。17. 根据权利要求1所述的方法，其特征还在于使用一种或多种改良的酵母菌株将合并 的C5/C6水解产物直接发酵为乙醇。
【专利摘要】本发明涉及一种加工木质纤维素生物质的方法，包括：–提供软木质纤维素生物质原料；–在单级加压水热预处理中在3.5-9.0的pH范围内预处理所述原料至log强度Ro？3.75或更低以产生预处理的生物质料浆，其中未溶解的固体物质含有至少5.0重量％的木聚糖；以及在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所述预处理的生物质至少24小时以产生水解产物；所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶和β-木糖苷酶活性；以nkat/g葡聚糖计，内切葡聚糖酶的活性水平为至少1100，外切葡聚糖酶的活性水平为至少280，β-葡萄糖苷酶的活性水平为至少3000，内切木聚糖酶的活性水平为至少1400，和β-木糖苷酶的活性水平为至少75；所述水解产物中C5单体的收率为预处理前所述原料的初始木糖和阿拉伯糖含量的至少55％。
【IPC分类】D21C3/04, C12P7/10, D21C1/04
【公开号】CN105492615
【申请号】CN201480043613
【发明人】J·拉森, N·N·波尔森, M·D·杰普森, K·K·摩根森
【申请人】因比肯公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年2月5日
【公告号】CA2877769A1, CA2919521A1, CN104540956A, EP2880172A1, US20150191758, WO2014019589A1
【专利说明】使用单级自动水解预处理和酶促水解加工木质纤维素生物质 的方法
[0001] 发明人：Jan Larsen、Niels Poulsen、Kit Mogensen、Martin Jeppesen 发明领域
[0002] 本发明总体地涉及将木质纤维素生物质加工成可发酵糖的方法，并且特别地涉及 依赖水热预处理的方法。
【背景技术】
[0003] 对石油和其他化石燃料的历史依赖性与大气温室气体水平的急剧和令人警醒的 增加相关。国际上正在努力减少温室气体的积累，这在许多国家得到正式政策指令支持。这 些减排努力的一个中心焦点是发展利用可再生的植物生物质取代石油作为燃料和其他化 学产品的来源的工艺和技术。据估计，地球上植物来源的生物质的年生长量大约为每年 lxlO11公吨干重。参见Lieth和Whittaker(1975)。因此，生物质的利用是发展可持续经济的 终极目标。
[0004] 从基于糖和淀粉的植物材料，如甘蔗、根和粮食作物，生产的燃料乙醇已经被广泛 使用，目前的全球生产量最高达到每年730亿升。乙醇一直被认为是化石燃料的可接受的替 代品，其容易作为混合燃料的添加剂使用或甚至直接作为用于个人汽车的燃料。然而，使用 通过这些"第一代"生物乙醇技术生产的乙醇实际上没有实现温室气体排放的大量减少。当 总化石燃料输入与最终乙醇输出均计算在内时，与石油相比，净节省仅为约13 %。参见 Farrell等（2006)。此外，已经对"第一代"生物乙醇市场提出了经济和道德上的反对。这实 际上将作物作为人类食物的需求与用于个人汽车的需求形成直接竞争。事实上，燃料乙醇 的需求与已经证明在贫穷的粮食进口国引起麻烦的粮食价格增长有关。
[0005] 发展不消耗粮食作物的生物质转化系统-所谓的"第二代"生物精炼-引起了极大 的兴趣，其中可以从木质纤维素生物质生产生物乙醇和其他产品，所述木质纤维素生物质 如作物废料(秸杆、穗轴、核、茎干、壳(shell)、果壳(husk)等…）、草料、稻草、木肩、废纸等。 在"第二代"技术中，主要来源于纤维素的可发酵6-碳(C6)糖和来源于半纤维素的可发酵5-碳(C5)糖通过酶促水解或(在一些情况中）通过纯化学水解从生物质多糖聚合物链释放出 来。从"第二代"生物精炼中的生物质转化获得的可发酵糖可以用于生产燃料乙醇，或可选 地，生产其他燃料如丁醇或用于合成生物塑料或许多其他产品的乳酸单体。
[0006] C5和C6糖的总产量是木质纤维素生物质加工的商业化中的重点考虑因素。就乙醇 生产以及乳酸和其他化学产品的生产而言，将C5和C6糖工艺流合并成一种糖溶液是有利 的。现在在乙醇生产中能有效消耗C5和C6糖两者的改良的发酵生物体是可得的。参见例如 Madhavan等（2012)、Dumon等（2012)、Hu等（2011)、Kuhad等（2011)、Ghosh等（2011)、Kurian 等（2010)、Jojima等（2010)、Sanchez等（2010)、Bettiga等（2009)、Matsushika等（2009)。
[0007] 由于其物理结构的限制，木质纤维素生物质不能在没有经过一定预处理过程的情 况下有效地通过酶促水解转化成可发酵糖。已经报道了许多种不同的预处理方案，各自提 供了不同的优点和缺点。综述参见Agbor等（2011)、Girio等（2010)31"^等（2010)、 Taherzadeh和Karimi(2008)。从环境和"可再生性"的角度来看，水热预处理是特别有吸引 力的。它们利用温度为160-230°C左右的加压蒸汽/液体热水来温和地熔解与纤维素链杂乱 缔合的疏水性木质素、溶解半纤维素的主要成分（富含C5糖)和破坏纤维素链，从而提高生 产酶结合的可达性。水热预处理可以方便地与现有的燃烧煤和生物质的发电厂整合来有效 地利用汽轮机蒸汽和"过量的"发电能力。
[0008] 在水热预处理的情况下，本领域公知并且已经过广泛讨论的是，预处理必须在相 矛盾的目的之间进行优化。一方面，预处理应当理想地保持半纤维素糖含量，以最大化来源 于单体半纤维素的糖的最终产量。然而同时，预处理应当充分暴露并预调理 (precondition)纤维素链以达到酶促水解的敏感性，使得可以用最少的酶消耗获得来源于 单体纤维素的糖的合理产量。酶消耗也是生物质加工的商业化的重点考虑因素，其如在当 前定义的"全球市场经济"背景下的"经济利润"边缘摇摆。尽管近年来急剧提高，可商购的 酶制剂的高成本仍然是生物质转化中最高的运营成本之一。
[0009] 随着水热预处理温度和反应器保留时间的增加，由于化学转化成其他物质（包括 糠醛和缩合反应的产物），较大比例的来源于半纤维素的C5糖无法换回地丧失。然而，需要 较高的温度和保留时间以适当地调理(condition)纤维素纤维以高效地酶促水解成单体6 碳葡萄糖。
[0010]在现有技术中，水热预处理"强度（severity)"的一个常用参数是"R。"，其通常是 指对数值。R。反映了根据公式:Κ〇 = ?ΕΧΡ[Τ-100/14.75]的预处理温度和反应器保留时间的 复合量度，其中t是以分钟计的保留时间，且Τ是以摄氏度计的反应温度。
[0011]针对任意给定生物质原料的预处理条件的优化本质上需要来自半纤维素的单体 C5糖高产量的需求(低强度)和来自纤维素的单体C6糖高产量的需求(高强度)之间的一定 折衷。
[0012]已经报道了用于最大化来自半纤维素和纤维素的糖产量以及最小化纤维素酶催 化的木糖低聚物抑制作用的多种不同的水热预处理策略。在一些情况下，加入外源的酸或 碱以催化半纤维素降解(酸、pH<3.5)或木质素溶解(碱、pH>9.0)。在其他情况下，水热预 处理只用非常温和的源自木质纤维素的乙酸本身(PH3.5-9.0)进行。在这些温和pH条件下 的水热预处理称为"自动水解"过程，因为从半纤维素酯释放的乙酸本身进一步催化半纤维 素水解。
[0013]酸催化的水热预处理，被称为"稀酸"或"酸浸"处理，通常提供高的C5糖产量，因为 在酸催化剂的存在下相当的半纤维素溶解可以在较低温度下发生。在稀酸预处理接着酶促 水解后的总C5糖产量通常在理论上可以从任意给定生物质原料释放的量的75%左右或更 高。参见例如，Baboukaniu等（2012)、Won等（2012)、Lu等（2009)、Jeong等（2010)、Lee等 (2008)、Sassner等(2008)、Thomsen等(2006)、Chung等(2005)。
[0014]相反，自动水解水热预处理通常提供低得多的C5糖产量，因此在没有酸催化剂的 情况下需要更高温度的预处理。除了在商业上不现实的低干物质含量下进行的自动水解预 处理，自动水解处理通常提供<40%理论回收率的C5糖产量。参见例如，Diaz等（2010)、 Dogaris等（2009)。已经报道，在使用商业上不现实的反应时间和极高的酶剂量的情况下， 自动水解的C5产量高达53%。但是，即使是该非常高的C5产量仍然远低于用稀酸预处理常 规获得的水平。参见例如，Lee等(2009)、Ohgren等(2007)。
[0015] 用自动水解获得的低C5产量的结果是，大多数关于商业生物质转化系统中水热预 处理的报道聚焦于稀酸工艺。通过使用所谓的"两级"稀酸预处理已经达到85%左右的源自 半纤维素的C5糖产量。在两级预处理中，使用较低的初始温度溶解半纤维素，然后分离富含 C5的液体部分。在第二个阶段中，使用较高的温度以调理纤维素链。参见例如，Mesa等 (2011)、Kim等（2011)、Chen等（2010)、Jin等（2010)、Monavari等（2009)、Soderstrom等 (2005)、3〇(16181：1'〇1]1等（2004)、3〇(16^1：1'〇1]1等（2003)、1(;[1]1等（2001)、1^6等（1997)、 Paptheofanous等（1995)。美国国家可再生能源实验室(NREL)报道的一种复杂的"两级"稀 酸预处理系统声称用玉米秸杆作为原料已经达到90 %左右的C5产量。参见Humbird等 (2011)。
[0016] 尽管它提供较低的C5产量，但自动水解在商业规模上继续提供针对稀酸预处理的 克争优势。
[0017] 在自动水解工艺的优势中最值得注意的是与从稀酸工艺中回收的木质素相比，残 留的未水解木质素具有极大增强的市场价值。首先，在稀酸预处理中通常使用的硫酸引入 了残余硫含量。这使所得的木质素对于倾向于消耗来自自动水解的无硫木质素燃料颗粒作 为煤的"绿色"替代品的商业电厂不具有吸引力。第二，在硫酸催化的水热预处理中发生的 木质素磺化使其比较亲水，从而增加它的机械持水能力。这种亲水性增加了干燥木质素用 于商业用途的成本，也使其不适于室外储存(考虑到它容易吸收水分）。用于木质纤维素生 物质转化的NREL工艺的所谓"技术经济模型"（采用稀酸处理)甚至没有考虑将木质素作为 可售商品-仅作为工艺流的内部燃料源。参见Humbird等(2011)。相反，依赖于自动水解的工 艺方案的"经济利润"包括来自于清洁干燥的木质素颗粒的稳定销售的显著贡献。因为典型 的软木质纤维素生物质原料包含大量木质素，占干物质含量的10-40%，这是尤为重要的。 因此，即使在自动水解系统的工艺糖产量可能相对于稀酸系统降低的情况中，总体"利润 率"可以保持等同或甚至更高。
[0018] 自动水解工艺也避免了稀酸的其他公知的缺点。对硫酸的需求偏离了偏好"绿色" 加工的精神取向、引入了以酸作为工艺输入的大量操作成本、并导致了对复杂废水处理系 统和昂贵的抗腐蚀设备的需求。
[0019] 自动水解还可以有利地放大到适度的工艺状况。NREL所描述的稀酸工艺如此复杂 和精巧以至于它不能现实地在较小规模上建立-仅在每小时100吨左右生物质原料的巨大 规模上建立。这样的规模仅适于高度集中的生物质加工状况。参见Humbird等(2011)。高度 集中的玉米秸杆生物质加工可能很适合具有以化学增强的大规模生产（hyperproduction) 生长的丰富基因工程玉米的美国 。但这种系统在世界上其他地方不太适合 。这 种系统对适度的生物质加工状况不适合，例如，在甘蔗或棕榈油或高粱地的现场加工、或小 麦秸杆的区域加工，它们通常每公顷产生比玉米少得多的生物质，即使有基因工程和化学 增强。
[0020] 与稀酸相反，自动水解系统是真正"绿色"的、容易扩展的，且没有需求复杂废水处 理系统的负担。因此提供改进的自动水解系统是有利的，即使在相比于稀酸系统仅在糖产 量上可能没有明显的优势的情况下。
[0021] 自动水解的低C5单体产量的问题一般驱使木质纤维素生物质加工技术的提供商 寻求其他途径。据报道，设计以提供提高的C5产量的一些"两级"预处理系统带有自动水解 预处理。参见 W02010/113129、US2010/0279361、TO2009/108773、US2009/0308383、US8,057， 639、US20130029406。在这些"两级"预处理方案中，较低温度的预处理之后，一些富含C5的 液体部分通过固/液分离去除，接着进行固体部分的后续高温预处理。大多数这些公开的专 利申请没有报道实际的实验结果。在W02010/113129的两级自动水解预处理的说明中， Chemtex Italia报道了总共26个使用小麦秸杆的实验实施例，其平均C5糖回收率为52%。 这些C5回收率值没有区分C5回收率本身和单体糖产量，所述单体糖是在发酵成乙醇和其他 有用的产物中实际消耗的基质（substrate)。
[0022]在用于加工木质纤维素生物质的方案中引入第二预处理级导致额外的复杂性和 成本。因此，使用简单的单级自动水解系统来实质上获得两级预处理的优势是有利的。 [0023]我们已经发现，在单级自动水解预处理进行至非常低的强度时，可能出乎意料地 获得55%理论产量或更高的最终C5单体高产量，同时还获得合理的葡萄糖产量。在生物质 原料被预处理至如此低的强度而使得预处理材料的未溶解固体物质含量保留至少5.0重 量％的残余木聚糖含量时，预处理期间的C5损失最小化。然而与预期相反，该非常高的残余 木聚糖含量可以高回收率被酶促水解为单体木糖，同时只牺牲非常小比例的纤维素至葡萄 糖的转化，条件是在酶促水解过程中采用了足够高的木聚糖酶和木糖苷酶活性。
[0024] 在这些非常低的强度水平下，影响纤维素酶活性或发酵生物体的可溶性副产物的 产生保持得很低以至于预处理的材料可以直接用于酶促水解和随后的发酵，通常不需要任 何洗涤或其他脱毒步骤。
[0025] 附图简要说明
[0026]图1示出了随经受自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的预处理强度因子 变化的木聚糖数。
[0027] 图2示出了随预处理原料的木聚糖数变化的未溶解固体物质中的木聚糖重量％。
[0028] 图3示出了随经受自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的 可溶性和不溶性形式的C5回收率。
[0029] 图4示出了随经受自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的 总C5回收率。
[0030] 图5示出了随经受自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的 乙酸、糠醛和5-HNF的产量。
[0031] 图6示出了溶解固体物质的去除对于经受非常低强度自动水解预处理的软木质纤 维素生物质原料的纤维素转化的效果。
[0032] 图7示出了来自经受非常低强度自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的液 体部分的HPLC表征。
[0033] 图8示出了随其中固体部分经受酶促水解接着引入液体部分进行后水解的时间变 化的C5糖回收率。
[0034]图9示出了改良酵母菌株使用小麦秸杆进行乙醇发酵的发酵谱（fermentation profile)，该小麦秸杆用非常低强度的自动水解进行预处理、酶促水解并作为合并的液体 和固体部分使用而没有脱毒以去除发酵抑制剂。
[0035]图10示出了一个实施方案的工艺方案。
[0036]图11示出了随时间变化的纤维素转化率-C5旁路。
[0037]图12示出了随时间变化的木聚糖转化率-C5旁路。
[0038] 图13示出了随时间变化的纤维素转化率-全料衆(whole slurry)。
[0039] 图14示出了随时间变化的木聚糖转化率-全料浆。
[0040] 图15示出了随水解时间变化的预处理和水解后总C6和C5回收率-全料浆。
【具体实施方式】
[0041] 在一些实施方案中，本发明提供加工木质纤维素生物质的方法，包括：
[0042]-提供软木质纤维素生物质原料；
[0043]-在单级加压水热预处理中在3.5-9.0的pH范围内预处理所述原料至log强度Ro 3.75或更低以产生预处理的生物质料浆，其中未溶解的固体物质含有至少5.0重量％的木 聚糖；以及
[0044] 在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所 述预处理的生物质至少24小时以产生水解产物;所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡 聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶和β-木糖苷酶活性；以nkat/g葡聚糖计，内切葡聚糖 酶的活性水平为至少1100,外切葡聚糖酶的活性水平为至少280，β-葡萄糖苷酶的活性水平 为至少3000，内切木聚糖酶的活性水平为至少1400，和β-木糖苷酶的活性水平为至少75;所 述水解产物中C5单体的收率为预处理前所述原料的初始木糖和阿拉伯糖含量的至少55%。
[0045] 在一些实施方案中，所述预处理的生物质作为包含固体部分和液体部分二者的全 料浆水解。
[0046] 如在此所用，以下术语具有以下含义：
[0047] 如在此所用，关于定量数值或范围的"大约"是指相对所指的数或范围而言+/-10%〇
[0048] "自动水解"是指其中在预处理过程中由半纤维素水解释放的乙酸进一步催化半 纤维素水解的预处理过程，且适用于在pH 3.5-9.0下进行的木质纤维素生物质的任意水热 预处理。
[0049] "对于木质纤维素生物质转化而优化的可商购的纤维素酶制剂"是指足够提供预 处理的木质纤维素生物质的酶促水解且包含内切纤维素酶（内切葡聚糖酶）、外切纤维素酶 (外切葡聚糖酶）、内切木聚糖酶、木糖苷酶和葡萄糖苷酶活性的可商购的酶活性混合物。 术语"对于木质纤维素生物质转化优化的"是指其中为了在水解预处理的木质纤维素生物 质成可发酵糖中提高水解产率和/或减少酶消耗量的特定目的选择和/或改进酶混合物的 产品开发过程。
[0050] "以"一定干物质水平进行预处理是指在加压水热预处理开始时原料的干物质含 量。预处理"在"一定pH下进行，其中生物质水性内容物的pH是加压水热预处理开始时的pH。
[0051] "干物质"，也以DM表示，是指可溶性和不溶性的总固体物质，且实际上是指"非水 内容物"。通过在l〇5°C下干燥直到达到恒定重量测量干物质含量。
[0052] "纤维结构"保持在预处理后纤维片段的平均尺寸>750um的程度。
[0053]如在此所用，"葡聚糖"是指纤维素以及其它葡萄糖低聚物。
[0054] "水热预处理"是指使用包含高温液体或蒸汽或两者的水(其作为热的液体、蒸汽 或加压蒸汽），在120°C或更高温度下"蒸煮"生物质，其中添加或不添加酸或其他化学物质。 [0055] "单级加压水热预处理"是指其中生物质在单个反应器中经受加压水热预处理的 预处理，所述反应器配置为以单轮加热生物质，且其中在固/液分离步骤以从经受加压水热 预处理的原料中去除液体部分后没有应用进一步的加压水热预处理。
[0056] "固/液分离"是指通过压迫、离心或其他力施加力来使液体与固体分离的主动机 械过程。
[0057] "软木质纤维素生物质"是指木材以外的包含纤维素、半纤维素和木质素的植物生 物质。
[0058] "固体部分"和"液体部分"是指预处理生物质在固/液分离中的分级分离。分离的 液体统称为"液体部分"。包含相当多的不溶性固体含量的残余部分称为"固体部分"。"固体 部分"具有干物质含量，且通常也包含相当多的"液体部分"残留。
[0059] "理论产量"是指从聚合纤维素或聚合半纤维素结构(其中构成的单体糖也可以被 酯化或以其它方式取代)获得的纯单体糖的摩尔当量质量。作为理论产量的百分比的"C5单 体产量"如下测定:在预处理之前，使用Sluiter等(2008)的强酸水解方法，使用HPLC柱和其 中半乳糖和甘露糖与木糖共洗脱的洗脱系统分析生物质原料中的糖类。此类系统的实例包 括来自 Phenomenex的REZEX? Monossacharide H+柱和来自 Biorad的AMINEX HPX 87C?柱。 在强酸水解期间，酯和酸不稳定的取代被去除。除非另有说明，认为在未预处理的生物质中 测定的"木糖"+阿拉伯糖的总量被认为是100%理论C5单体回收率，其也可以统称为"C5单 体回收率"。使用具有纯化的外部标准基于标准曲线的HPLC表征进行单体糖测定。通过直接 测量C5单体的样品的HPLC表征来测定实际的C5单体回收率，其然后以理论产量的百分比表 不。
[0060] "木聚糖数"是指如下测定的预处理生物质的表征:预处理的生物质通常在固/液 分离以提供液体部分和固体部分后以约30%总固体物质获得。具有约30%总固体物质的这 种预处理的生物质然后通过按1:3 wt:wt的总固体(DM):水比例与70°C水混合而部分洗涤。 然后将以这种方式洗涤的预处理的生物质压榨至约30 %总固体。使用A.Sluiter等， "Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass"，US National Renewal Energy Laboratory(NREL)Laboratory Analytical Procedure(LAP)，发行日 2008年4月25 目的方法，如Technical Report NREL/TP-510-42618(2008年4月修订）（其通 过引用全文而明确并入本文）中所述，测定以这种方式洗涤以及压榨到约30%总固体物质 的预处理的生物质的木聚糖含量。使用其中半乳糖和甘露糖与木糖共洗脱的HPLC柱和洗脱 系统。此类系统的实例包括来自Phenomenex的REZEX? Monossacharide H+柱和来自Biorad 的AMINEX HPX 87C?柱。所描述的这种木聚糖含量的测量包括了一些来自没有在这些条件 下从固体部分中洗出的残余液体部分的可溶性物质的贡献。因此，"木聚糖数"提供了不溶 性固体物质中残余木聚糖含量和"液体部分"中可溶性木糖和木糖低聚物含量的"加权组 合"量度。
[0061] 未溶解固体物质的木聚糖含量通过取预处理的生物质的代表性样品、使其经受 固/液分离以提供具有至少30%总固体物质的固体部分来测定。该具有至少30%总固体物 质的预处理的生物质然后通过与70°C水以总固体物质(DM):水的1:3重量:重量的比率混合 来部分洗涤。以这种方式洗涤的预处理的生物质然后压榨到至少30 %总固体物质，并再次 通过与70°C水以总固体物质(DM):水的1:3重量:重量的比率混合来洗涤。该洗涤的材料然 后再次压榨到至少30%总固体物质，并再次通过与70°C水以总固体物质(DM):水的1:3重量 :重量的比率混合来洗涤。该洗涤的材料然后再次压榨到至少30%总固体物质，并用作待分 析的未溶解固体物质的样品。然后如上面涉及测定木聚糖数的解释中描述的那样来测定未 溶解固体物质的木聚糖含量，并表达为样品的总固体含量的重量百分比。
[0062]可以使用任何合适的软木质纤维素生物质，包括如至少小麦秸杆、玉米秸杆、玉米 穗轴、空果串（empty fruit bunches)、稻杆、燕麦杆、大麦杆、油菜猜杆、黑麦猜杆、高粱、甜 高粱、大豆秸、柳枝稷、百慕达草和其他草类、甘蔗渣、甜菜浆、玉米纤维或其任意组合的生 物质。木质纤维素生物质可以包含其他木质纤维素材料，如纸、新闻纸、纸板或其他城市或 办公室废物。木质纤维素生物质可以作为源自不同原料的材料的混合物来使用，可以是新 鲜的、部分干燥的、完全干燥的或其任意组合。在一些实施方案中，使用至少约l〇kg生物质 原料、或至少l〇〇kg生 物质原料、或至少500kg生物质原料实施本发明的方法。
[0063] 木质纤维素生物质包含插嵌在松散组织化的半纤维素基质内和密封在富含疏水 性木质素的环境内的晶体纤维素纤丝。尽管纤维素本身包含长的、直链D-葡萄糖聚合物，但 半纤维素是短的、支链糖(包括所有5-碳戊醛糖(C5糖）以及一些6-碳(C6)糖(包括葡萄糖和 甘露糖）的单体)的异质混合物。木质素是高度异质的聚合物，缺少任何特定的初级结构，并 且包含疏水性苯丙素 (pheny lpropano i d)单体。
[0064] 合适的木质纤维素生物质通常包含在预处理前为20至50%干物质的量的纤维素， 在预处理前为10至40%干物质的量的木质素和15至40%的量的半纤维素。
[0065]在一些实施方案中，生物质原料在水热预处理之前可以经历粒度减小和/或其他 机械加工，如研磨、碾制、切碎、切割或其他处理。在一些实施方案中，如Knudsen等（1998)所 述，生物质原料在加压预处理之前可以洗涤和/或沥滤有价值的盐。在一些实施方案中，原 料在加压预处理之前可以在高达99°C的温度下浸泡。
[0066]在一些实施方案中，原料在水热预处理之前首先在水性溶液中浸泡。在一些实施 方案中，如通过引用全文并入本文中的US8，123,864所述，在预处理中将原料浸泡在从后续 步骤中获得的包含乙酸的液体中是有利的。如通过引用全文并入本文中的US12/935,587所 述，在最高可能干物质含量下进行处理是有利的。在高干物质下进行预处理避免了加热不 必要的水而耗费加工能量。但是，需要一些水含量以从酶促水解获得最佳的最终糖产量。通 常，在其固有持水能力下或接近其固有持水能力预处理生物质原料是有利的。这是给定原 料在于过量水中浸泡并接着压榨到普通商业螺旋压机的机械极限(通常30_45%DM)之后达 到的水含量水平。在一些实施方案中，水热预处理在至少35 %的DM含量下进行。本领域技术 人员容易理解，水热预处理过程中DM含量可能降低，因为在加热过程中加入了一些水含量。 在一些实施方案中，原料在至少20%、或至少25%、或至少30%、或至少40%、或40%或更 低、或35%或更低、或30%或更低的DM含量下预处理。
[0067] 在一些实施方案中，用水性溶液中浸泡/润湿可以用于在预处理之前调节pH至 3.5-9.0的范围，这通常对于自动水解是有利的。容易理解，在预处理过程中pH可以变化，通 常随着乙酸从溶解的半纤维素释放而变为更酸性的水平。
[0068]在一些实施方案中，水热预处理在没有如湿式氧化预处理所需的补充氧的情况 下、或在没有添加如有机溶剂预处理所需的有机溶剂的情况下、或在没有使用如微波预处 理所需的微波加热的情况下进行。在一些实施方案中，水热预处理在140°C或更高、或150°C 或更高、或160°C或更高、或160-200°C、或170-190°C、或180°C或更低、或170°C或更低的温 度下进行。
[0069] 在一些实施方案中，一些C5含量可以在加压预处理之前通过浸泡步骤去除。在一 些实施方案中，单一反应器可以配置为加热生物质至单一目标温度。或者，单一反应器可以 配置为在该反应器中影响温度梯度，以使得生物质在单轮处理中暴露于多于一个温度区 域。在一些实施方案中，在预处理过程中，在加压反应器内部分地去除一些溶解的生物质组 分可能是有利的。
[0070] 合适的水热预处理反应器通常包括纸浆和造纸工业中已知的大多数制浆反应器。 在一些实施方案中，水热预处理由反应器中加压至10巴或更低、或12巴或更低、或4巴或更 高、或8巴或更高、或8-18巴、或18-20巴的蒸汽施用。在一些实施方案中，预处理反应器配置 用于原料的连续流入。
[0071] 在一些实施方案中，湿润的生物质在压力下传输通过反应器一段持续时间或"保 留时间"。有利地保持短的保留时间以利于更高的生物质通量。然而，所得的预处理强度由 温度及由保留时间确定。有利地保持水热预处理过程中的温度较低，不仅是因为本发明的 方法寻求非常低的预处理强度，也因为较低的温度可以使用较低的蒸汽压力完成。在预处 理温度可以在180°C或更低的水平且因此饱和的蒸汽压保持在10巴或更低压力的程度下， 出现较低的腐蚀趋势且可以使用更低等级的压力配件和钢组成，这减少工厂的资本成本。 在一些实施方案中，反应器配置为加热生物质至160-200°C、或170-190°C之间的单一目标 温度。保留时间在一些实施方案中少于60、或少于30、或少于20、或少于15、或少于14、或少 于13、或少于12、或少于10、或少于8、或少于5分钟。
[0072] 生物质原料可以通过各种方式从大气压下装载到加压反应器中。在一些实施方案 中，可是使用水闸型"颗粒栗"系统装载生物质原料，例如通过引用全文并入本文中的US 13/062,522中所述的系统。在一些实施方案中，使用所谓的"螺旋塞"进料机装载预处理反 应器可能是有利的。
[0073] 预处理的生物质可以通过各种方式从加压反应器卸载。在一些实施方案中，预处 理的生物质以保持材料的纤维结构的方式卸载。保持预处理生物质的纤维结构是有利的， 因为这允许预处理物质的固体部分在固/液分离过程中使用普通螺旋压榨设备压榨到相当 高的干物质水平，并从而避免了隔膜压滤机系统的增加的费用和复杂性。
[0074]纤维结构可以通过以非爆破性的方式从加压反应器中去除原料来维持。在一些实 施方案中，可以使用水闸型系统，如通过引用全文并入本文中的US13/043,486中所述的系 统完成非爆破性去除，并从而保持纤维结构。在一些实施方案中，可以使用水力旋流器去除 系统，如通过引用全文并入本文中的US12/996,392中所述的那些完成非爆破性去除，并从 而保持纤维结构。
[0075]在一些实施方案中，预处理的生物质可以使用"蒸汽爆破"（其涉及预处理物质的 爆破性释放)从加压预处理反应器中去除。蒸汽爆破的、预处理的生物质没有保持它的纤维 结构，且因此需要更加精细的固/液分离系统以达到与保留纤维结构的预处理生物质使用 普通螺旋压机系统可以达到的干物质含量相当的干物质含量。
[0076]生物质原料预处理至非常低的强度（log Ro 3.75或更低）。这通常将造成预处理 的生物质具有10%或更高的木聚糖数。参数"木聚糖数"是指反映了不溶性固体物质中保留 的残留木聚糖含量及液体部分中可溶性木糖和木糖低聚物的浓度两者的加权组合的复合 量度。在较低的R〇强度下，木聚糖数较高。因此，最高的木聚糖数是指最低的预处理强度。木 聚糖数甚至在非常低的强度下提供了与传统的强度测量log R〇的负线性相关性，其中未溶 解的固体物质中的残留木聚糖含量更高。图1显示了对于多种不同的原料，预处理强度log R〇和所产生的预处理生物质的木聚糖数之间的关系，其在实施例1中详细解释。
[0077]木聚糖数作为预处理强度的量度特别有用，因为具有等同木聚糖数的不同预处理 生物质原料表现出等同的C5单体回收率。相反，常规的Ro强度只是预处理条件的经验描述， 其没有提供不同生物质原料之间比较的合理基础。例如，如图1所示，至强度log R〇 = 3.75 的单级自动水解提供具有6-7%之间的木聚糖数的预处理甘蔗渣和玉米秸杆，但对于典型 的小麦秸杆品种，所得的预处理原料的木聚糖数是大约10%。
[0078]本领域技术人员可以容易地对任何给定的原料确定合适的预处理强度log Ro以 产生具有期望木聚糖数的预处理的生物质。在一些实施方案中，生物质原料预处理至非常 低的强度log Ro 3.75或更低、或3.74或更低、或3.73或更低、或3.72或更低、或3.71或更 低、或3.70或更低、或3.69或更低、或3.68或更低、或3.67或更低、或3.66或更低、或3.65或 更低、或3.64或更低、或3.63或更低、或3.62或更低、或3.61或更低、或3.60或更低、或3.59 或更低、或3.58或更低、或3.57或更低、或3.56或更低、或3.55或更低、或3.54或更低、或 3.53或更低、或3.52或更低、或3.51或更低、或3.50或更低、或3.45或更低、或3.40或更低。 在一些实施方案中，生物质原料预处理至非常低的强度log R〇,以产生具有11%或更高、或 12%或更高、或13%或更高、或14%或更高、或15%或更高、或16%或更高、或17%或更高的 木聚糖数的预处理的生物质。
[0079] 木聚糖数在生产规模的生物质加工中可用作实际量度，因为它可以基于简单的测 量(如通过近红外光谱监测仪提供的那些)而容易地在线测量。木聚糖数可以进一步用作用 于控制预处理的终点量度，如W02013/120492中描述的。
[0080] 作为木聚糖数(其反映了可溶性木聚糖含量以及未溶解固体物质中的残余木聚糖 含量二者的复合量度）的替代方案，预处理的效果可以依据未溶解固体物质中的残余木聚 糖含量来表达。未溶解固体物质中的残余木聚糖含量与木聚糖数之间的关系示于图2中，其 在实施例1中解释。本领域技术人员可以对任何给定的原料容易地确定合适的预处理强度 1 og Ro以产生具有在未溶解固体物质中期望的残余木聚糖含量的预处理的生物质。例如， 如图2所示，在足以产生木聚糖数为10%的预处理的生物质的强度下进行的单级自动水解 对软木质纤维素原料而言，通常将产生具有约5.0重量％的未溶解固体物质中的残余木聚 糖含量的预处理的生物质，所述原料包括但不限于小麦秸杆、甘蔗渣、空果串和玉米秸杆。 在一些实施方案中，生物质原料预处理至适于产生以下预处理的生物质的强度log Ro:未 溶解固体物质的残余木聚糖含量为至少5.0重量％、或至少5.1%、或至少5.2%、或至少 5.3%、或至少5.4%、或至少5.5 %、或至少5.6%、或至少5.7%、或至少5.8 %、或至少 5.9%、或至少6.0%、或至少6.1 %、或至少6.2%、或至少6.3%、或至少6.4%、或至少 6.5%、或至少6.6%、或至少6.7 %、或至少6.8%、或至少6.9%、或至少7.0 %、或至少 7.1%、或至少7.2%、或至少7.3 %、或至少7.4%、或至少7.5%、或至少7.6%、或至少 7.7%、或至少7.8%、或至少7.9 %、或至少8.0%、或至少8.1%、或至少8.2 %、或至少 8.3%、或至少8.4%、或至少8.5%.
[0081] 生物质原料预处理至非常低的强度是有利的，其中预处理的原料的木聚糖数是 10%或更高，或其中预处理的原料中未溶解固体物质的残余木聚糖含量是至少5.0%或更 高。该非常低的强度水平对应于其中预处理前原料的总半纤维素含量(在预处理过程中溶 解的或不可逆地失去的)被最小化的过程。我们出乎意料的发现，对于小麦秸杆、甘蔗渣、甜 高粱渣、玉米秸杆和空果串的典型品种，在单级自动水解预处理至非常低的强度的原料的 酶促水解后，可以获得至少55%理论值的非常高的最终C5单体产量而没有C6单体产量的明 显损失，条件是在酶促水解过程中采用足够高的木聚糖酶和木糖苷酶活性。在非常低的强 度水平下，很大一部分的原料的半纤维素含量在预处理之后保留在固体部分中，其中其随 后可以用酶促水解以高回收率水解成C5单体，其中使用了足够的木聚糖酶和木糖苷酶活 性。
[0082] 应当注意的是，关于"木糖回收率"的报道常常不是以与在此报道的木糖回收率相 当的术语表示。例如，Ohgren等(2007)和Lee等(2009)报道了高木糖回收率。但这些值只是 指来自预处理的生物质的木糖回收率，而不是表示为预处理之前原料的原始半纤维素含量 的百分比。或例如，W02010/113129是指作为预处理之前原料的半纤维素含量百分比的半纤 维素回收率，但没有指明单体产量(其始终比总半纤维素回收率小）。在一些实施方案中，可 以在酶促水解后的水解产物中获得至少5 6 %理论值的C 5单体收率、或至少5 7 %、或至少 58%、或至少59%、或至少60%、或至少61 %、或至少62 %、或至少63%、或至少64%、或至少 65%〇
[0083] 酶促水解可以用多种不同的方式进行。在一些实施方案中，预处理的生物质作为 全料浆进行水解，意味着来自所述预处理的生物质的基本上所有的固体物质都在包含溶解 和未溶解固体物质二者的单一反应混合物中经受酶促水解。如本文所使用，术语"全料衆" 指的是酶促水解反应混合物，其中在酶促水解开始时未溶解固体物质与溶解固体物质的重 量比小于2.2:1。
[0084] 预处理的生物质料浆中的"未溶解固体物质"和"溶解固体物质"测定如下：
[0085] 根据Weiss等（2009)描述的程序来测定"总固体物质"和"过滤的总固体物质"含 量。从那些数值中，可根据下式计算"未溶解固体物质"和"溶解固体物质"含量：
[0086] [未溶解固体物质](重量％) = ([总固体物质](重量％)-[过滤的总固体物质](重 量％))/(1_[过滤的总固体物质](重量％))
[0087][溶解固体物质](重量％)=[总固体物质](重量％)_[未溶解固体物质](重量％) [0088]在一些实施方案中，在酶促水解之前，使预处理的生物质经受固/液分离步骤以产 生单独的固体部分和液体部分。这种分离通常是有利的，因为所述预处理的生物质中溶解 固体物质的一些组分通常发挥抑制酶促水解中使用的一种或多种酶的活性的作用。例如， 将溶解固体物质含量从预处理生物质全料浆中移除明显改善了用如本文描述的预处理的 原料取得的纤维素转化率，所述原料以高的干物质含量经受使用针对木质纤维素生物质转 化优化的、可商购的纤维素酶制剂进行的酶促水解，所述制剂由GENENC0R?(作为商标 ACCELLERASE TRIO?)或由N0V0ZYMES?(作为商标CELLIC CTEC3?)提供，如图6所示并且在 实施例4中解释的。
[0089]然而令人惊讶的是，当预处理的生物质料浆被充分稀释到较低的干物质含量时， 在预处理的生物质料浆中存在的抑制物质的浓度被充分稀释，使得可在全料浆水解中、且 甚至以较低的酶剂量水平获得等同的转化率，如在实施例10中所解释的。
[0090] 在酶促水解之前采用固/液分离步骤的实施方案中，其中期望酶促水解以高干物 质含量进行，在固体部分中达到最高实用的干物质含量水平，或者从固体部分中去除最高 实用的溶解固体物质量是有利的。在一些实施方案中，固/液分离获得具有至少40重量％、 或至少45%、或至少50%、或至少55% DM含量的固体部分。使用普通的螺旋压机系统的固/ 液分离通常可以在固体部分中获得高达50%的DM水平，只要生物质原料以保持纤维结构的 方式预处理。在一些实施方案中，承担更高的工厂资本支出以获得更有效的固/液分离可能 是有利的，例如，使用隔膜压滤机系统。在一些实施方案中，溶解的固体物质可以通过系列 洗涤和压榨或通过制浆和造纸领域中已知的置换洗涤技术从固体部分去除。在一些实施方 案中，或者直接通过固/液分离，或者通过洗涤和固/液分离的一些结合，固体部分的溶解固 体物质含量降低至少50%、或至少55%、或至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少 75%。
[0091] 在固体部分的酶促水解期间，从这样的固/液分离所得的液体部分然后可与固体 部分保持分离。我们命名这个暂时的分离为"C5旁路"。在固体部分的酶促水解已达到期望 程度的葡聚糖转化率后，富C5的"旁路"材料可以然后添加回到水解混合物中。我们对此称 为"C5旁路"材料的"后水解"。以这种方式，使得否则会由预处理生物质料浆中存在的酶抑 制性溶解固体物质引起的干扰最小化。从通过至非常低的强度的单级自动水解预处理以提 供具有10%或更高的木聚糖数、或具有5.0%或更高的未溶解固体物质木聚糖含量的预处 理的材料的软木质纤维素生物质原料(如典型的小麦秸杆、甘蔗渣、甜高粱渣、玉米秸杆和 空果串品种)所获得的液体部分通常包含小的C6单体的组分（lx)，主要是葡萄糖及一些其 他糖的;较大的可溶C6低聚物组分(大约2x-7x);较大的C5单体组分(大约4x-8x)，主要是木 糖及一些阿拉伯糖和其他糖;和大得多的可溶性木糖低聚物组分(大约18x-30x)。可溶性木 糖低聚物通常主要地包括木六糖、木五糖、木四糖、木三糖和木二糖及一些较高级链的低聚 物。这些木糖低聚物(或木糖-低聚物(xylo-oligomer))通常在"后水解"过程中通过用于固 体部分酶促水解的酶活性来酶促水解。或者换言之，通过将分离的液体部分与水解的固体 部分混合，固体部分中的木糖-低聚物通过残留在水解的固体部分内的酶活性的作用而被 降解为木糖单体。
[0092] 或者，在一些实施方案中，分离的液体部分可用于其他目的。在一些实施方案中， 分离的液体部分可与从水解产物发酵回收乙醇后获得的酒精废液(thin stillage)共混。 共混的液体部分和酒精废液然后可以用作生物甲烷基质。或者，酒精废液和液体部分可以 作为单独的生物甲烷基质使用。令人惊讶的是，酒精废液以及液体部分的生物甲烷潜能在 产生具有10%或更大木聚糖数的预处理生物质的非常低强度的预处理后增大。因此在一些 实施方案中，在非常低强度下进行C6发酵是有利的，因为增大的生物甲烷产率可以抵消有 所下降的乙醇产率。在一些实施方案中，至少75匪3甲烷/吨生物质原料、或至少78、或至少 80、或至少82、或至少85、或至少87、或至少90、或至少92、或至少95的生物甲烷产率可以从 包含合并的液体部分和酒精废液的生物甲烷基质产生，其中原料已预处理至低强度log R〇 从而产生具有至少10%木聚糖数的预处理生物质，或其中未溶解固体物质包含至少5.0重 量％木聚糖。在一些实施方案中，将全料浆水解产物本身用作生物甲烷基质。
[0093]在一些实施方案中，本发明提供了加工木质纤维素生物质的方法，包括：
[0094]-提供软木质纤维素生物质原料；
[0095]-在至非常低的强度的单级加压水热预处理中在3.5-9.0的pH范围内预处理所述 原料，以使所述预处理的生物质特征是具有10%或更高的木聚糖数；
[0096] -将所述预处理的生物质分离成固体部分和液体部分，
[0097] -在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所 述固体部分，所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、内切木聚糖 酶和木糖苷酶活性，以及
[0098] -随后混合分离的液体部分和水解的固体部分，从而所述液体部分中的木糖低聚 物被所述水解的固体部分中残留的酶活性的作用降解为木糖单体。
[0099] 在一些实施方案中，来自分离的固体部分或来自水解的固体部分(其已添加分离 的液体部分以进行后水解）、或来自全料浆的酶促水解产物随后经受发酵以产生乙醇。
[0100] 在一些实施方案中，在水解产物发酵后回收的酒精废液用作生产生物甲烷的基 质。在一些实施方案中，分离的液体部分与在水解产物发酵后回收的酒精废液共混，并且用 作合并的生物甲烷基质。
[0101] 容易理解，"固体部分"和"液体部分"可以进一步被细分或加工。在一些实施方案 中，在进行固/液分离的同时从预处理反应器中去除生物质。在一些实施方案中，预处理的 生物质在从反应器中卸载之后进行固/液分离步骤(通常使用简单和低成本的螺旋压机系 统）以产生固体部分和液体部分。
[0102] 本领域中众所周知，当水解在较低干物质含量下进行时，使用纤维素酶活性的酶 促水解更加有效。较高的固体物质浓度有效地抑制纤维素酶催化作用，尽管造成该公知效 果的具体原因尚未完全明白。参见例如，Kristensen等(2009)。尽管本领域的普遍观点是在 最高实际干物质含量下的水解是有利的，但这必然与增大的酶消耗相关。相同的酶促水解 效果可以在较低干物质含量下使用相同的酶制剂实现，节省了酶成本。
[0103] 本领域技术人员通过常规实验容易确定对于任何给定的生物质原料和酶制剂，适 合达到指定工艺目标的进行酶促水解的DM水平。在一些实施方案中，尽管产生的酶消耗有 所增大，但在非常高的DM>20%下进行水解可能是有利的。出于各种原因，通常认为在最高 可实现的干物质水平下进行水解是有利的，所述原因包括最小化水消耗和节省乙醇蒸馏中 的能量成本，其中由较高干物质水平下的酶促水解产生的较高糖浓度导致较高的乙醇浓 度，其进而减小蒸馏成本。在一些实施方案中，分离的固体部分或全料浆的酶促水解可在 8%DM或更高、或9%DM或更高、或10%DM或更高、或11%DM或更高、或12%DM或更高、或13% DM或更高、或14%DM或更高、或15%DM或更高、或16%DM或更高、或17%DM或更高、或18%DM 或更高、或19%DM或更高、或20%DM或更高、或21%DM或更高、或22%DM或更高、或23%DM或 更高、或25%DM或更高、或30%DM或更高、或35%DM或更高下进行。
[0104]在一些实施方案中，以40%或更高的DM从预处理的生物质的固/液分离回收固体 部分，且添加另外的水含量以使得酶促水解可以在较低DM水平下进行。容易理解，水含量可 以以新鲜水、有或者没有添加剂(如任何分子量的聚乙二醇(PEG)或表面活性剂、盐、用于调 节pH的化学物质如氨、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化钠、抗细菌或抗真菌剂、或其他物质）的 浓缩或其他工艺溶液的形式添加。
[0105] 为了在水解产物中取得至少55%或更高的C5单体收率，根据本发明的方法，利用 多种酶活性来进行酶促水解。用于酶促水解的酶的混合物应包含至少一种以下活性：内切 葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶和木糖苷酶。本领域技术人员将 容易理解，可应用各种不同的酶剂量水平，取决于进行水解时的干物质含量、作为工艺目标 所期望的葡聚糖转化率和作为工艺目标所期望的水解时间。因此，适于较高的干物质、快速 水解的酶剂量水平可大大降低，并在较低的干物质、较长的水解时间框架中使用。
[0106] 作为一般规则，水解产物中至少55%或更高的C5单体产率可以相对快地实现，通 常在低至24小时的时间框架中，一般在18小时到60小时的范围内。尽快实现这些非常高的 C5单体收率是有利的，因为一旦木聚糖含量基本上从未溶解固体物质中去除，内切葡聚糖 酶和外切葡聚糖酶就相对较少地在生产性结合(productive binding)的途径中受阻碍。在 一些实施方案中，在取得高的C5单体收率后，用过量的内切和外切葡聚糖酶活性补充酶混 合物可能是有利的。可通常取得这些高C5单体收率的水解时间框架在例如图11中表示，并 且如实施例10中解释的，显示出全料浆水解中的木聚糖转化率为12%DM，其中预处理后的 总C5 回收率约为77%。如所示的那样，即使在非常低的酶剂量水平下，可在40小时内实现至 少55 %的C5单体收率。
[0107] 适于实施本发明方法以取得55%或更高的C5单体收率的各种酶活性的合适水平 通常如下：
[0108] 内切葡聚糖酶是指4-( 1，3; 1，4)-?Η)_葡聚糖4-葡聚糖水解酶，又称为β-l，4-葡聚 糖酶(EC 3.2.1.4)。出于界定极限值的目的，内切葡聚糖酶活性使用Ghose( 1987)的方法使 用羟乙基纤维素(HEC)作为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。典型的内切葡聚糖酶的水平 在酶促水解开始时应至少为ll〇〇nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转化程度和 干物质含量，内切葡聚糖酶活性水平可在1100_30000nkat/g葡聚糖的范围内变化。在一些 实施方案中，所述范围可以在1100-2832之间，或在1130-1529之间，或在2317-3852之间，或 在3000-5120之间，或在4000-8000之间，或在7000-10000之间，或在11000-20000之间。
[0109] 外切葡聚糖酶是指4-?Η)_葡聚糖纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)。出于界定极限 值的目的，外切葡聚糖酶活性使用Bailey和Tahtiharju(2003)的方法使用4-甲基-伞形酮 基(umbel liferyl)-0-D_乳糖苷为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。典型的外切葡聚糖酶 的水平在酶促水解开始时应至少为280nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转化 程度和干物质含量，活性水平可在280-20000nkat/g葡聚糖的范围内变化。在一些实施方案 中，所述范围可以在280-690之间，或在370-560之间，或在400-932之间，或在700-1240之 间，或在1200-2000之间，或在3000-5000之间。
[0110] β-葡萄糖苷酶是指β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)。出于界定极限值的 目的，β-葡萄糖苷酶活性使用Berghem和Pettersson(1974)的方法使用4-硝基苯基-β-D-P比 喃葡萄糖苷为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。典型的β-葡萄糖苷酶的水平在酶促水解开 始时应至少为3000nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转化程度和干物质含量， 活性水平可在3000-50000 nkat/g葡聚糖范围内。在一些实施方案中，所述范围可以在 3000-7500之间，或在4000-6010之间，或在5000-1000之间，或在7000-14000之间，或在 15000-25000之间。
[0111] 内切木聚糖酶是指4-β-?-木聚糖木聚糖水解酶(4-0-D-xylan xylanohydrolase) (EC 3.2.1.8)。出于界定极限值的目的，内切木聚糖酶活性使用Bailey等（1992)的方法使 用桦木木聚糖作为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。对于所测试的活性，可用柠檬酸盐缓 冲剂将pH值调节至合适的水平。典型的内切木聚糖酶的水平在酶促水解开始时应至少为 1400nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转化程度和干物质含量，活性水平可在 1400-70000nkat/g葡聚糖范围内变化。在一些实施方案中，所述范围可以在1400-3800之 间，或在4000-5000之间，或在6000-7000之间，或在7000-8000之间，或在9000-12000之间， 或在11000-15000之间，或在15000-20000之间，或在18000-30000之间。
[0112] β-木糖苷酶是指4-β-?-木聚糖木糖水解酶（4-0-D-xylan xylohydrolase) (EC 3.2.1.37)。出于界定极限值的目的，β-木糖苷酶活性使用Poutanen和Puls(1988)的方法使 用对-硝基苯基-β-D-木聚糖吡喃糖苷作为底物确定并表示为nkat/g酶制剂。典型的β-木糖 苷酶的水平在酶促水解开始时应至少为75nkat/g葡聚糖。取决于工艺目标，如水解速度、转 化程度和干物质含量，活性水平可在75-124之间、或在100-300之间、或在250-500之间、或 在400-800之间、或在700-20000nkat/g葡聚糖之间的范围内变化。在一些实施方案中，所述 范围可以在700-900之间，或在800-1400之间，或在1100-1700之间，或在1500-2500之间，或 在2000-3500之间，或在3000-5000之间，或在4000-10000之间，或在8000-20000之间。
[0113] 任何上面指定用于活性测定的分析都可以以适当的方式改变，包括可以将样品调 节到用于测量目的的适当的稀释度。该分析可以通过与标准曲线比较而适用于测量从水解 混合物中提取的代表性样品，在所述标准曲线中，将已知活性在相似的背景干物质含量下 添加到样品中。
[0114] 本领域技术人员容易理解，适合实施本发明方法的酶混合物的组成可以在相对较 宽的范围内变化。合适的酶制剂包括可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶 制剂。优化过程中酶混合物的选择和改进可以包括基因工程技术，例如Zhang等(2006)中所 描述的那些或本领域已知的其他方法。可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素 酶制剂通常由制造商和/或供应商原样鉴定。这些通常与可商购的用于一般用途或为在制 造动物饲料、食品、纺织品洗涤剂或在造纸行业使用而优化的纤维素酶制剂不同。在一些实 施方案中，使用的可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂由GENENC0R? 提供且包含从遗传修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)的发酵分离的外切葡聚糖酶、内 切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶和β葡萄糖苷酶，例如在ACCELLERASE TRIO?商标下出 售的商用纤维素酶制剂。在一些实施方案中，使用的可商购的为木质纤维素生物质转化而 优化的纤维素酶制剂由N0V0ZYMES?提供且包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖 酶、木糖苷酶和β葡萄糖苷酶，例如在CELLIC CTEC2?或CELLIC CTEC3?商标下出售的商用 纤维素酶制剂。
[0115] 详细分析三种可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂中所代 表的酶活性。对于这些商用纤维素酶制剂中的每一个，表征12种不同酶活性的水平，并以每 克蛋白质表示。实施例8中提供实验细节。结果如表1所示。应注意，用于该实施例中的分析 方法不同于本文为测定活性而依赖的那些方法。这些结果仅仅提供一般性的定性比较，而 不应视为将有关权利要求限制为本发明的方法。
[0116] 表1、为木质纤维素生物质转化而优化的商用纤维素酶制剂中选择的活性测量。
[0117]
[0118] 或者可以通过本领域熟知的方法从多种微生物(包括好氧和厌氧细菌、白腐真菌、 软腐真菌和厌氧真菌)获得能有效水解木质纤维素生物质的酶混合物。参见例如Singhania 等（2010)。产生纤维素酶的生物体通常以合适的比例分泌不同酶的混合物，以适用于木质 纤维素基质的水解。可用于木质纤维素生物质转化的优选纤维素酶制剂来源包括真菌如木 霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、镜刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、 曲霉属(Aspergillus)和白腐真菌属(Phanerochaete)的种。
[0119] 特别地对一种真菌物质，里氏木霉，进行了广泛的研究。野生型里氏木霉分泌包含 两种对纤维素链的还原和非还原末端具有相应特异性的外切纤维素酶(纤维二糖水解酶）、 至少五种具有不同纤维素识别位点的不同的内切纤维素酶、两种β葡萄糖苷酶以及多种内 切木聚糖酶和外切木糖苷酶的酶混合物。参见Rouvinen，J.等（1990)、Divne，C.等（1994)、 Martinez，D.等（2008)。商用纤维素酶制剂通常还包括α-阿拉伯呋喃糖苷酶和乙酰木聚糖 酯酶活性。参见例如Vinzant，Τ.等(2001)。
[0120] 之前已经表明，与野生型生物体天然分泌的混合物中存在的比例不同的相对比例 的优化酶活性混合物产生更高的糖产量。参见Rosgaard等（2007)。实际上，已经建议，包括 多达16种不同酶蛋白的酶共混物的优化可以有利地针对经过任何给定预处理的任何给定 生物质原料单独地确定。参见Billard，H.等(2012)、8 &1^^」6〇,6.等(2010)。然而，作为商业 实用性，商用酶提供商通常寻求产生最小可行数目的不同酶共混物，以使在大规模生产中 可以获得规模经济性。
[0121] 在一些实施方案中，用一种或多种额外的或补充的酶活性补充可商购的为木质纤 维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂可能是有利的。在一些实施方案中，简单地增加商 用制剂中存在的一种或多种组分酶的相对比例可能是有利的。在一些实施方案中，引入专 门的附加活性可能是有利的。例如，在使用任何给定生物质原料实施本发明的方法中，可以 鉴定可以有利地通过使用一种或多种补充酶活性水解的特定未水解的糖键。此类未水解的 键可以通过使用本领域熟知的方法对可溶性水解产物或不溶性未水解残留物中低聚糖类 的表征来鉴定。未水解的键还可以如Nguema-〇na等(2012)所述的，使用针对特定糖键的单 克隆抗体通过综合微阵列聚合物谱分析来鉴定。在一些实施方案中，用额外的内切木聚糖 酶、葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶、葡糖醛酸苷酶(glucouronidase)、木聚糖酯酶、淀粉酶、木 糖苷酶、呋喃葡萄糖(glucouranyl)酯酶或阿拉伯呋喃糖苷酶中任何一种或多种补充可商 购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂可能是有利的。
[0122] 在一些实施方案中，如Humbird等(2011)所述，可选地在木质纤维素生物质加工设 施处现场生产酶可能是有利的。在一些实施方案中，可以在现场生产可商购的为木质纤维 素生物质转化而优化的纤维素酶制剂，有或者没有适合特定生物质原料的特定酶活性的定 制补充。
[0123] 在一些实施方案中，酶混合物可以进一步包括甘露糖苷酶化03.2.1.25)、&-0_半 乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)、a-D-葡萄糖苷酸酶(EC 3.2.1.139)、肉桂酸酯酶(EC 3.1.1.-)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、B_1，3木糖苷酶活性(EC 3.2.1.72)、α-1，3和/或α-l，5阿拉伯糖呋喃糖苷酶活 性(EC 3.2.1.23)或其他活性中的任何一种或多种。
[0124] 通过单级自动水解预处理至非常低强度水平的生物质的另一个令人吃惊的特征 是将用作发酵生物体的抑制剂的预处理副产物的浓度保持在非常低的水平。其结果是，直 接在发酵中使用通过本发明的方法获得的水解的生物质而不需要任何洗涤或其他脱毒步 骤通常是可能的。
[0125] 如本领域中众所周知的，自动水解水热预处理通常产生多种可溶性副产物，其起 至Γ发酵抑制剂"的作用，因为它们抑制发酵生物体的生长和/或代谢。不同的发酵抑制剂以 不同的量产生，取决于木质纤维素原料的性质和预处理的强度。参见Klinke等(2004)。在自 动水解预处理过程中通常形成至少三类发酵抑制剂：（1)作为单糖或寡糖的降解产物的呋 喃类，主要是2-糠醛和5-HMF(5-羟甲基糠醛）；（2)作为木质素结构的降解产物的单体酚类； 和(3)源自半纤维素和木质素中的乙酰基团的小有机酸，主要是乙酸。不同抑制剂的混合物 已被证实在使用酵母菌株（参见，例如Palmquist等（1999))和使用产乙醇大肠杆菌 (Escherichia coli)(参见，例如Zaldivar等（1999))的生物乙醇发酵中协同地发挥作用。 在一些实施方案中，使用本领域熟知的方法使预处理的生物质进行闪蒸以降低挥发性抑制 剂(最明显的是糠醛)的水平可能是有利的。对预处理至木聚糖数为10%或更高的典型生物 质原料品种如小麦秸杆、甜高粱渣、甘蔗渣、玉米秸杆和空果串的自动水解，在我们的经验 中只有乙酸和糠醛水平对发酵生物体是潜在抑制性的。当生物质原料在35%或更高DM下进 行预处理至木聚糖数10%或更高，且当固体部分在25%或更低的DM下（具有添加的水以调 节DM但没有洗涤步骤)随后酶促水解时，水解产物中的糠醛水平通常可以保持低于3g/kg， 且乙酸水平低于9g/kg。这些水平对于使用指定菌株的酵母发酵而言通常是可接受的。在酶 促水解过程中，一些额外的乙酸从固体部分中半纤维素的降解释放。在一些实施方案中，使 用电渗析或本领域已知的其他方法从液体部分和/或水解的固体部分去除一些乙酸含量可 能是有利的。
[0126] 不同原料可以通过反应器保留时间和温度的多种不同组合、使用足以产生具有木 聚糖数10%或更高的预处理生物质的至低强度log Ro的单级自动水解进行预处理。本领域 技术人员容易通过常规实验确定使用带有任何给定的生物质反应器-装载和反应器-卸载 系统的任何给定的反应器适用于任何给定原料的合适的预处理途径。在原料使用由水闸_ 系统或螺旋塞进料机装载和由"颗粒栗"水闸系统或水力旋流器系统卸载的连续反应器预 处理的情况下，使用典型的小麦秸杆或空果串品种，在180°C的温度和24分钟的反应器保留 时间下、或在175°C至185°C范围内的温度和18至35分钟范围内的保留时间下、或在170°C至 190°C范围内的温度和13至40分钟范围内的保留时间下通常可以达到10%或更高木聚糖数 的非常低的强度。对于典型的玉米秸杆、甘蔗渣和甜高粱渣品种，10%或更高木聚糖数的非 常低的强度通常可以使用175°C至185°C范围内的温度8至25分钟范围的保留时间、或使用 170°C至190°C范围内的温度6至35分钟范围的保留时间达到。本领域技术人员容易理解，保 留时间和温度可以调整以达到相当的R〇强度水平。
[0127] 预处理至木聚糖数10%或更高的原料的酶促水解通常可以用商业上合理的酶消 耗量在高DM>20%下进行，不需要特定的洗涤或脱毒步骤，其中固体部分被压榨至至少 40 % DM，或其中固体部分的溶解固体物质含量降低至少50 %。
[0128] 在一些实施方案中，酶混合物可进一步包括甘露糖苷酶类(EC3.2.1.25)、a-D_半 乳糖苷酶^0 3.2.1.22)、&-1^-阿拉伯糖咲喃糖苷酶（&-]^-&1&13；[110;1^1^&1108丨(1&868)^0 3 · 2 · 1 · 55)、a-D-葡萄糖醛酸酶(EC3 · 2 · 1 · 139)、肉桂酸酯酶(EC 3 · 1 · 1 ·-)、或阿魏酸酯酶 (EC 3.1丄73)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1丄72)、B-1，3木糖苷酶活性(EC 3.2丄72)、α-1， 3和/或α-l，5阿拉伯糖呋喃糖苷酶活性(EC 3.2.1.23)或其它活性中的任意一种或多种。
[0129] 本领域技术人员很容易确定施用的任何给定酶制剂的合适剂量水平和酶促水解 的合适pH和温度条件以及合适的持续时间。如前所述，水解持续时间可根据工艺目标而变 化。较长的水解导致更好的最终葡萄糖转化率，但在生产规模下投入更大的资本和操作成 本。在一些实施方案中，水解持续时间为至少24小时，或至少36小时，或至少48小时，或至少 64小时，或至少72小时，或至少96小时，或在24到150小时的时间之间。保持较低的酶剂量水 平从而最小化酶的成本通常是有利的。在一些实施方案中，使用高酶剂量可能是有利的。在 实施本发明的方法时，本领域技术人员可以在考虑包括当地生物质成本、产物流的市场价 格、工厂总资本成本和摊销计划及其他因素的相关因素后确定酶剂量的经济优化。在其中 使用可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂的实施方案中，可以使用制 造商提供的一般剂量范围来确定在其内进行优化的一般范围。
[0130] 在一些实施方案中，在分离的固体部分被酶促水解至理想的转化程度后，保持在 C5旁路中的液体部分与水解产物混合物混合用于后水解。在一些实施方案中，所有回收的 液体部分可以一次性加入，而在另外的实施方案中，可以去除液体部分中的某些组分和/或 可以逐步添加液体部分。在一些实施方案中，在与液体部分混合之前，固体部分被水解至至 少50%、或至少55%、或至少60%纤维素转化，意思是在水解产物中至少获得了葡萄糖单体 的指定理论产率。液体部分中存在的相当大部分的木糖低聚物通常可以被水解产物混合物 中保持活性的木聚糖酶和其他酶的作用水解成木糖单体。在一些实施方案中，后水解进行 至少6小时，或15-50小时、或至少24小时的时间。在一些实施方案中，液体部分中存在的木 糖低聚物质量的至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%、或至少80%、或至少 85%、或至少90%在后水解过程中通过水解产物混合物中保持活性的木聚糖酶和其他酶的 作用被水解为木糖单体。在一些实施方案中，液体部分直接与水解产物混合而没有进一步 添加化学添加剂。在一些实施方案中，液体部分的某些组分如乙酸、糠醛或酚类可以在与水 解产物混合之前从液体部分中去除。
[0131] 在一些实施方案中，固体部分的酶促水解和/或液体部分的后水解可以作为同步 糖化发酵(SSF)过程进行。本领域中众所周知，当SSF可以在与酶促水解的最佳温度相同的 温度下进行时，酶消耗量可以最小化，因为在酶促水解过程中引入的发酵生物体消耗葡萄 糖和木糖单体，并从而降低酶催化反应的产物抑制。在一些实施方案中，后水解仅在纤维部 分被水解(不添加发酵生物体)到至少60%纤维素转化之后进行。在一些实施方案中，SSF可 以在酶促水解的初期后进行，即在酶促水解的初期后添加发酵生物体，并且发酵和水解二 者都持续，任选地在对酶促水解而言非最佳的温度下。
[0132] 在通过在35%或更高的DM下单级自动水解到足够低以产生具有10%或更高的木 聚糖数的预处理生物质的强度log R〇来预处理生物质原料（如小麦秸杆、甘蔗渣、甜高粱 渣、玉米秸杆或空果串）的情况中，在获得的预处理生物质的固体部分具有至少40%DM或去 除至少50%溶解固体物质的情况中，在随后使用可商购的为木质纤维素生物质转化而优化 的纤维素酶制剂以15-27%的DM酶促水解固体部分的情况中，在酶促水解进行至少48小时 的情况中，在获得至少50%葡萄糖转化后将液体部分添加至固体部分水解产物中的情况 中，及在添加的液体部分经历至少6小时时间的后水解的情况中，达到合并的C5/C6水解产 物中对应于理论最大C5单体产量的60 %或更高的C5单体产量的C5单体浓度通常是可能的。
[0133] 在一些实施方案中，可以使用一种或多种改良的酵母菌株直接将合并的C5/C6水 解产物发酵成乙醇。
[0134] 图9示出了一个实施方案的工艺方案。如图所示，浸泡、洗涤或润湿软木质纤维素 生物质至35%或更高的DM。在3.5-9.0范围内的pH下在单级自动水解中使用加压蒸汽预处 理生物质至特征是木聚糖数10%或更高的强度。预处理的生物质进行固/液分离以产生液 体部分和具有40 %或更高DM含量的固体部分。调节固体部分至合适的DM含量，然后在15 % 或更高的DM含量下进行酶促水解至纤维素酶转化率60%或更高的程度。随后混合分离的液 体部分和水解的固体部分，并进行后水解，从而在液体部分中存在的相当大量的木糖低聚 物被水解为单体的木糖。在所述的水解和后水解结束后，C5单体的产率通常是至少60%，而 纤维素转化率相似地为至少60%。
[0135] 在替代的实施方案中，使预处理的生物质作为全料浆来经受酶促水解。在再其它 实施方案中，分离液体部分，并使固体部分经受酶促水解和随后的发酵。在一些实施方案 中，从这样的发酵中回收乙醇之后，剩余的酒精废液可以与分离的液体部分共混并且用作 生物甲烷基质。
[0136] 实施例
[0137] 实施例1:作为预处理强度量度的固体部分的"木聚糖数"表征。
[0138] 在以35-50%干物质预处理之前，用0-10g乙酸/kg干物质生物质(pH>4.0)浸泡小 麦秸杆(WS)、玉米秸杆(CS)、甜甘蔗渣（SCB)和空果串（EFB)。在170-200°c的温度下预处理 约60kg DM/h生物质，保留时间为12-18分钟。使用水闸系统将生物质装载至反应器中，并使 用水闸系统卸载预处理的材料。加压预处理反应器内的压力对应于所用温度下饱和蒸汽的 压力。使用螺旋压榨机对预处理的生物质进行固/液分离，从而产生液体部分和具有约30% 干物质的固体部分。固体部分用约3kg水/kg干生物质洗涤，并且再次压榨至约30 %干物质。 Petersen等(2009)进一步描述了关于预处理反应器和过程的详细内容。
[0139] 根据Sluiter等(2005)和Sluiter等(2008)所述的方法，使用装备来自Phenomenex 的Rezex Monossacharide H+柱的Dionex Ultimate 3000 HPLC系统分析原始原料的碳水 化合物。在连续预处理三小时后收集液体部分和固体部分的样品，并且在三小时内三次收 集样品以确保样品从稳态预处理获得。根据Sluiter等(2008)描述的方法，使用装备Rezex Monossacharide H+单糖柱的来自Dionex的Ultimate 3000 HPLC系统分析固体部分的碳水 化合物。根据Sluiter等（2006)描述的方法，使用装备Rezex Monossacharide H+单糖柱的 来自Dionex的Ultimate 3000 HPLC系统分析液体部分的碳水化合物和降解产物。通过在具 有5 mM硫酸的水中以1:4的比例悬浮固体部分和之后根据Sluiter等(2006)描述的方法，使 用装备Rezex Monossacharide H+柱的来自Dionex的Ultimate 3000 HPLC系统进行分析来 分析固体部分中的降解产物。根据Weiss等(2009)中所述的方法分析干物质含量和悬浮固 体物质的量。如Petersen等(2009)所述设置质量平衡并测定纤维素和半纤维素回收率。也 定量在预处理过程中每kg生物质干物质降解为5-HMF或糠醛的糖的量和从半纤维素释放的 乙酸的量，虽然由于闪烁(flashing)导致的糠醛损失没有计算在内。
[0140] 预处理过程的强度通常通过首先由Overend等（1987)提出的强度因子来描述。强 度因子通常表示为对数值，以使得1〇8 (办）=#4叩（（1'-1^#)/14.75)，其中办是强度因子， t是以分钟计的保留时间，T是温度，而Tref是参照温度，通常为100°C。强度因子是基于半纤 维素溶解的动力学，如Belkecemi等（1991 )、Jacobsen 和 Wyman (2000)或 Lloyd等（2003)所 述。因此预处理的强度与预处理之后固体部分中保留的残余半纤维素含量有关。
[0141] 根据Sluiter等（2008)所述的方法，使用装备来自Phenomenex的Rezex Monossacharide H+柱的Dionex Ultimate 3000 HPLC系统分析如所述地制备和洗涤的固 体部分的C5含量。当通过水热自动水解预处理时，按照以上所述产生和洗涤的固体部分中 的木聚糖含量与软木质纤维素生物质（例如小麦秸杆、玉米秸杆或EFB)的强度因子线性相 关。作为按照以上所述制备和洗涤的固体部分中木聚糖含量的强度定义在预处理设定之间 是可转换的。木聚糖数是洗涤的固体部分中测量的木聚糖含量，其包括一些来自可溶性物 质的成分。图1对于小麦秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣和来自棕榈油加工的空果串示出了木聚糖 数对预处理强度1 〇g (R。)的相关性。
[0142] 如所示的，对于通过单级自动水解预处理的各种测试生物质原料，在木聚糖数和 预处理强度之间存在明显的负线性相关。
[0143] 实验中未溶解固体物质的木聚糖含量还计算为:从纤维部分的总木聚糖含量中减 去纤维(低聚物和单体)之间液体中的溶解木聚糖含量。
[0144] [纤维中的固体木聚糖](重量％ )=[纤维部分中的总木聚糖](重量％ )-[纤维部 分中的溶解木聚糖](重量％)
[0145] 溶解木聚糖含量通过[纤维部分中的（溶解固体物质重量％/总固体物质重量％)] X [液体部分中的溶解木聚糖浓度]来计算。
[0146] 对于预处理的小麦秸杆(PWS)、玉米秸杆(PCS)、甘蔗渣(SCB)和来自油棕榈的空果 串（PEFB)，计算得到的未溶解固体物质的木聚糖含量（以重量％计)在图2中示作木聚糖数 的函数。
[0147] 实施例2.随预处理强度变化的C5回收率
[0148] 如实施例1中所述预处理生物质原料并表征样品。图3示出了通过单级自动水解预 处理小麦秸杆的实验中，随木聚糖数变化的C5回收率(木糖+阿拉伯糖）Χ5回收率显示为水 不溶性固体物质(WIS)、水溶性固体物质(WSS)和总回收率。如所示的，作为水不溶性和水溶 性固体物质的C5回收率均随木聚糖数的增加而提高。随着木聚糖数增加超过10%，作为水 溶性固体物质的C5回收率降低，而作为水不溶性固体物质的C5回收率继续提高。
[0149] 测试的典型小麦秸杆品种在预处理之前以干物质计包含约27%的半纤维素。图4 示出了预处理之后，对于通过自动水解预处理的小麦秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣和EFB随木聚 糖数变化的总C5回收率。测试的典型玉米秸杆、甜甘蔗渣和EFB品种在预处理之前以干物质 计分别包含约25%、19%和23 %的C5含量。如所示的，对于所有原料，预处理之后的总C5回 收率取决于如预处理生物质的木聚糖数定义的预处理强度。如所示的，在预处理之后回收 的90%的C5含量可以被完全水解为C5单体的情况下，当预处理强度的特征是产生10%或更 高的木聚糖数时，通常可以预期酶促水解后至少60%的最终C5单体产率。
[0150] 实施例3.随预处理强度变化的抑制酶和酵母生长的降解产物的产生
[0151] 如实施例1中所述预处理生物质原料，并表征样品。图5示出了通过单级自动水解 预处理小麦秸杆的实验中，乙酸释放以及糠醛和5-羟甲基糠醛(5-HMF)的产生与木聚糖数 的相关性。如所示的，这些公认为抑制发酵酵母且在某些情况下也抑制纤维素酶的降解产 物的产生在木聚糖数小于10%时呈指数增长。在10%或更高木聚糖数下，糠醛和乙酸的水 平落入到允许预处理的生物质发酵而不需要脱毒步骤的范围内。对于乙酸，其水平在预处 理至木聚糖数10%或更高的生物质的酶促水解过程中进一步提高，尽管通常达到被改造以 消耗C5和C6糖两者的酵母良好耐受的水平。
[0152] 实施例4.随固体部分DM%变化的固体部分中保留的物质对纤维素酶的抑制。
[0153] 在基本上按照W02006/056838中所描述和所用的6-室反应器的原理工作的6-室自 由降落反应器中进行实验。6-室水解反应器设计为以高于20%DM的固体浓度进行液化和水 解的实验。反应器由分成6个独立的室的水平放置的辊筒组成，每个室24cm宽和50cm高。每 个室中安装了三个桨叶的水平旋转轴用于混合/搅拌。l.lkW马达用作驱动，并且旋转速度 在2.5至16.5rpm范围内可调。旋转的方向经编程为每两分钟在顺时针和逆时针方向之间切 换。外部的充水加热夹套使得能够控制高达80C的温度。
[0154] 实验使用了通过使用实施例1中描述的系统进行单级自动水解预处理的小麦秸 杆。将生物质润湿至DM>35 %，并在pH>4.0下用蒸汽预处理至强度log Ro大约3.7，产生具 有木聚糖数10.5%的预处理材料。在丹麦的Skarbak的Inbicon试验工厂进行预处理。使用 水闸系统将生物质装载至预处理反应器中，并使用水闸系统从反应器卸载预处理的生物 质。在某些情况下，使用螺旋压榨机使预处理的生物质接受固/液分离，从而产生液体部分 和固体部分。固体部分具有大约30%的DM含量，包含大部分的初始纤维素和木质素，部分的 半纤维素和总共大约25 %的溶解固体物质。
[0155] 将6室反应器的室填充包含所有溶解和未溶解固体物质的总预处理生物质或包含 大约25 %总溶解固体物质的压榨固体部分。调节干物质含量至19 % DM。使用每克葡聚糖 0 · 08ml来自 Novozymes的CTec2?或每克葡聚糖0 · 2-0 · 3 ml来自 DuPont，Genencor 的 八(^6116瓜86 11?101￥在50(]和。!15.0至5.3下水解预处理的生物质。这些可商购的为木质纤 维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂的剂量水平完全是在制造商建议的范围内。在混合 速度6rpm下进行酶促水解实验96小时。
[0156] 可见，如本文所述测量的采用Accellerase TRIO的实验中的酶活性的最初范围 是:外切葡聚糖酶为280-5000 nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶为1100-20000nkat/g葡聚糖， β-葡萄糖苷酶为3000-25000nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶为1400-30000nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶为75-25000nkat/g葡聚糖nkat/g葡聚糖。
[0157] 图6示出了在这些条件下酶促水解之后的纤维素转化，其随酶促水解之前去除 的％溶解固体物质而变化。如所示的，在这些酶剂量水平下去除75 %溶解固体物质从绝对 值来说（in absolute terms)增加纤维素转化10-20 %。因此，在待使用分离的固体部分来 进行酶促水解的情况下，在酶促水解之前压榨所述固体部分至DM含量为至少40%或另外地 减少溶解固体物质含量至少50%是有利的，因为这通常将提供提高的酶性能。
[0158] 实施例5.来自预处理至木聚糖数>10%的生物质的液体部分的糖含量和水解 [0159]预处理小麦秸杆、玉米秸杆和甘蔗渣，至强度log Ro 3.63以产生具有木聚糖数 11.5%的预处理的小麦秸杆(WS)，至强度log Ro3.51以产生具有木聚糖数12.3%的预处理 的甘蔗渣（SCB)，和至强度log Ro 3.35以产生具有木聚糖数15.5%的预处理的玉米秸杆 (CS)。预处理的原料经受固/液分离以产生液体部分和固体部分，如实施例4所述。根据 (Sluiter，Hames等2005)所述的方法，使用装备Rezex Monossacharide柱的Dionex Ultimate 3000 HPLC系统分析液体部分的碳水化合物和降解产物。表2示出了以DM含量百 分比表示的液体部分的糖含量，其划分成低聚物和单体的葡萄糖/葡聚糖、木糖/木聚糖和 阿拉伯糖/阿拉伯聚糖的类别。如所示的，尽管一些葡萄糖含量以单体和低聚物的形式存 在，糖含量的主要部分是低聚的木聚糖。注意到使用自动水解获得的液体部分中木聚糖低 聚物占优势，这与使用稀酸预处理获得的液体部分相反。在用稀酸水热预处理法预处理的 生物质中，液体部分通常通过酸催化剂的作用水解为单体成分。
[0160] 表2.预处理至木聚糖数> 10 %的生物质中液体部分的糖含量
[0161]
[0162] 进一步通过米用Thermo Scientific Dionex CarboPacTM PA200柱使用模块化的 Dionex ICS-5000色谱系统的HPLC分析表征来自预处理的小麦秸杆的液体部分。使用NaOH/ NaOAc-梯度条件分离分析物，并通过使用金电极的积分和脉冲安培检测（IPAD)进行测量。 图7示出了描述液体部分的洗脱谱的HPLC色谱图，其中木二糖(X 2)、木三糖（X3)、木四糖 (Χ4)、木五糖(?)和木六糖(Χ 6)标准品的洗脱谱作为较高的迹线重叠在较低的迹线上。如所 示的，自动水解的生物质的液体部分包括包含少量的木糖单体和相当大量的木二糖(Χ2)、 木三糖(χ 3)、木四糖(Χ4)、木五糖(χ5)和木六糖(χ6)以及其他物质的混合物。
[0163] 实施例6.固体部分的酶促水解和在纤维水解后来自预处理至木聚糖数>10%并 压榨至> 40 % DM的生物质的液体部分的添加接着后水解
[0164] 如实施例4所述的在6-室自由降落反应器中进行了实验。
[0165] 实验使用通过至强度log Ro在约3.19至3.73之间的单级自动水解预处理的小麦 秸杆、玉米秸杆或甘蔗渣以产生具有木聚糖数11.5至15.6%的预处理生物质。将生物质切 割并润湿至DM>35%，并在170_190°C下用蒸汽预处理12分钟。在丹麦的Skarbak的Inbicon 试验工厂进行预处理。使用螺旋压榨机使预处理的生物质接受固/液分离以产生具有> 40%DM的固体部分。保存液体部分(C5旁路）以便随后添加到水解产物(后水解）。
[0166] 将6室反应器的室填充大约10kg的压榨预处理生物质的固体部分，并通过加水调 节至19-22%DM。使用来自GENENC0R-DuP0NT的ACCELLERASETRI0 TM在50°C和pH5·0至5·3下 水解预处理的固体部分。混合速度是6rpm。运行水解实验96小时，且然后在加入保存的液体 部分(C5旁路），并在50°C和pH 5.0至5.3下运行后水解48小时。
[0167] 每天获取HPLC样品以跟踪纤维素和半纤维素的转化，并使用装备Rezex Monossacharide柱的Ultimate 3000 HPLC系统通过使用外标的定量来分析葡萄糖、木糖和 阿拉伯糖。
[0168] 图8示出了使用预处理至木聚糖数12.3%并用每克葡聚糖0.31111八(^6116^86 Tri〇TM(GenenC〇r)水解的甘蔗渣，在固体部分水解96小时后加入液体部分的半纤维素转化 的水解数据。所示的是典型的水解谱图。C5单体回收率以来自水解反应中存在的物质的理 论产量的百分比表示。固体部分中的大多数半纤维素在固体部分水解的前24小时内被转化 成单体糖。96小时后液体部分的加入提高了理论潜在产量，这解释了刚加入液体部分之后 观察到的C5转化的下降。在前24小时内，大多数来自液体部分的C5被转化成单体。将恰在液 体部分加入之前的C5转化与水解终点时相比较，计算液体部分的C5转化为在这些条件下使 用甘蔗渣的90%是可能的。
[0169] 表3示出了在不同环境下预处理且使用不同剂量水平的可商购的为木质纤维素生 物质转化而优化的纤维素酶制剂(4(^6116抑86 1'1'；[01￥(6611611(301'))水解的不同生物质的水 解数据。使用的所有酶剂量水平均在制造商建议的范围内。如所示的，使用单级自动水解以 及具有C5旁路和后水解的酶促水解，用制造商建议的可商购的为木质纤维素生物质转化而 优化的纤维素酶制剂的剂量可以达到60%或更高的C5单体产率，同时仍然达到60%或更高 的纤维素转化。
[0170] 可见，用Accellerase TRIO如本文所述测量的表3中提及的实验中的酶活性的最 初范围是:外切葡聚糖酶为280-5000nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶为1100-20000nkat/g葡 聚糖，β-葡萄糖苷酶为3000-25000nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶为1400-30000nkat/g葡聚 糖，木糖苷酶为75-25000nkat/g葡聚糖。
[0171] 表3.具有C5旁路的使用非常低强度的单级自动水解和后水解的水解产率
[0172]
[0173」实施例7.合并水解产物中C5和C6糖通过改良的酵母共发酵为乙醇
[0174] 作为使用通过单级自动水解预处理至木聚糖数>10%制备的从软木质纤维素生 物质（在这里是小麦秸杆)产生的水解产物的实例，图9示出了在用能够转化C5和C6糖两者 的GM0酵母(来自TERRAN0L?的菌株VI)发酵之前，在没有脱毒或任何其他处理步骤的情况下 进行发酵的数据。如实施例4所述分离的、来自预处理小麦秸杆的固体部分利用来自 Novozymes的Cellic Ctec2?水解，然后与保存的液体部分合并，并且在没有任何脱毒以去 除发酵抑制剂的情况下使用。
[0175] 在发酵前用Κ0Η颗粒调节水解产物至pH 5.5,并补充3g/L尿素。发酵以分批发酵进 行。反应器中的初始细胞浓度是0.75g dw/L。使用自动添加10%NH3控制发酵在pH 5.5。保 持温度在30°C，且搅拌速度为300rpm。如所示的，葡萄糖和木糖容易消耗且乙醇容易产生， 尽管存在通常在较高预处理强度水平下证明为抑制性的乙酸、糠醛和其他化合物。
[0176] 实施例8.商用纤维素酶制剂活性水平的实验测定
[0177] 稀释来自 GENENC0R?的ACCELLERASE TRIO?以及来自 N0V0ZYMES?的CELLIC CTEC2?和CELLIC CTEC3?的商用制剂，以使得酶制剂将具有等同的密度，意味着等同规格 的等份试样具有等同的质量。加入等同体积的稀释酶制剂，且试验测定一式两份或一式三 份地进行。
[0178] 在50mM的NaOAC缓冲液pH 5中，在25°C下进行CBHI (外切纤维素酶）活性分析25分 钟。通过跟踪从模式底物4-甲基伞形酮基-β-纤维二糖苷的4-甲基伞形酮(Abs:347nm)的连 续释放速率一式三份地测定活性。活性单位是lymole MeUmb当量/分钟。CTEC3、ACTrio和 CTEC2分析中酶制剂浓度分别为0.16、0.14、0.17mg/ml。底物浓度是0.5mg/ml。
[0179] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行内切-1，4-β-葡聚糖酶活性的分析60 分钟。通过跟踪与模式底物Avicel ΡΗ-101的还原末端产生相关的吸光度变化一式三份地 测定活性。活性单位是lymole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析中酶制剂浓度 分别为〇 · 80、0 · 67、0 · 79mg/ml。底物浓度是80mg/ml。
[0180] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行β_葡萄糖苷酶活性的分析20分钟。通 过跟踪从模式底物纤维二糖的葡萄糖释放相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活性单 位是2ymole葡萄糖/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂浓度分别为0.1、0.12、 0.12mg/ml。底物浓度是 1.7mg/ml。
[0181] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行内切-1，4-β-木聚糖酶活性的分析60 分钟。通过跟踪与模式底物水可提取的阿拉伯糖基木聚糖的还原末端产生相关的吸光度变 化一式三份地测定活性。活性单位是lymole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析 中酶制剂浓度分别为1.12、0.97、1.1211^/1111。底物浓度是1〇1^/1111。
[0182] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行β_木糖苷酶活性的分析60分钟。通过 跟踪与模式底物水可提取的阿拉伯糖基木聚糖的水解相关的木糖释放一式两份地测定活 性。活性单位是Ιμπιο?木糖/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂浓度分别为1.12、 0.97、1.12mg/ml。底物浓度是 10mg/ml。
[0183] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的分析60 分钟。通过跟踪与模式底物水可提取的阿拉伯糖基木聚糖的水解相关的阿拉伯糖释放一式 三份地测定活性。活性单位是lymole阿拉伯糖/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂 浓度分别为1.12、0.97、1.12mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0184] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行淀粉葡萄糖苷酶(AMG)活性的分析80 分钟。通过跟踪与模式底物可溶性玉米淀粉的葡萄糖释放相关的吸光度变化一式三份地测 定活性。活性单位是bmole葡萄糖/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂浓度分别为 1 · 12、0 · 97、1 · 12mg/ml。底物浓度是 10mg/ml。
[0185] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中，在50°C下进行α-淀粉酶活性的分析60分钟。通过跟 踪与模式底物可溶性玉米淀粉的还原末端产生相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活 性单位是lymole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶制剂浓度分别为1.12、 0.97、1.12mg/ml。底物浓度是 10mg/ml。
[0186] 在100mM琥珀酸盐缓冲液pH 5中，在25°C下进行乙酰木聚糖酯酶活性的分析25分 钟。通过跟踪从模式底物4，4-硝基苯基乙酸酯的4-硝基苯基(Abs: 410nm)的连续释放速率 一式三份地测定活性。活性单位是lymole pNP当量/分钟。CTEC3、ACTrio和CTEC2分析的酶 制剂浓度分别为〇. 48、0.42、0.51mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0187] 活性测定的结果如表1所示。
[0188] 这些结果提供了酶制剂之间的定性比较，但在大多数情形下没有根据用于出于本 文权利要求的目的测定酶活性的nkat值的方法进行。
[0189] 实施例9:对在通过低强度单级自动水解预处理的原料的酶促水解中取得高C5单 体收率重要的酶活性的确定
[0190] 如实施例4中所述，将小麦秸杆预处理至强度log Ro 3.52(183°C，保留时间12分 钟）以产生具有木聚糖数13.5%的预处理生物质，大约7.8重量％木聚糖留在未溶解固体物 质中，如图2估计的那样。预处理的葡聚糖回收率为100%。预处理的木聚糖回收率为77%。
[0191] 以滤纸单位(Filter Paper Units)(FPU)的纤维素酶活性的测量分别针对三种单 独的可商购的纤维素酶制剂ACCELLERASETRIO?(来自GENENCOR?)，CELLIC CTEC3?(来自 N0V0ZYMES?)，以及以1:0.2的重量比混合的CELLUCLAST和N0V0ZYME 188的混合物（来自 N0V0ZYMES?)进行测定。通过Ghose (1987)的方法测定FPU活性，发现对CTEC3得到179FPU/g 酶制剂，而对CELLUCLCAST/188得到60FPU/g酶制剂。
[0192] 水解实验基本上如实施例6所述的进行，除了最初干物质含量为22%DM，添加1重 量％聚乙二醇(PEG )，固体部分的最初水解进行94小时，添加的液体部分(C5旁路）的后水解 进行50小时，以及使用的酶是以等同剂量（以FPU/g葡聚糖计）14.3FHJ/g葡聚糖应用的 CTEC3、ACTRI0或CELLUCLAST/188。
[0193] 应用的酶的实际剂量：CTEC3为0.08 g/g葡聚糖，AcTRIO为0.24g/g葡聚糖， CELLUCLAST/188 为0.22g/g葡聚糖。
[0194] 如本文所述测量的用于实验中的酶活性（以nkat/g葡聚糖计)估计如下：
[0195] 外切葡聚糖内切葡聚糖β-葡萄糖苷木聚糖蘇 木糖苷酶 酶 酶 酶 Trio 685a 2829b 8016c !2024c 267d Colluo/188-f- 477 2X〇0 3372 2200 51 CTEC3 607a 2949e Ι0〇?6Γ N/A N/A
[0196] +:基于Juhasz等(2005)报告的值
[0197] a:使用4-甲基伞形酮基-β-纤维二糖苷作为底物测量
[0198] b:基于ACCELLERASE TRIO产品信息表单，其报告使用羧甲基纤维素(CMC)作为底 物的最小内切葡聚糖酶值并且假设羟乙基纤维素的相应值将是CMC值的大约0.35倍，如例 如Dori等（1995)所报告的那样
[0199] c:基于ACCELLERASE TRIO产品信息表单，其报告最小值
[0200] d:基于另外测量的木糖苷酶活性的比率，其对比3.86:1的Trio: Cel luclast每克 酶制剂
[0201] e:基于另外测量的内切葡聚糖酶活性的比率，其对比3.12:1的CTEC3: TRIO每克酶 制剂
[0202] f:基于另外测量的β-葡萄糖苷酶活性的比率，对比3.76:1的CTEC3: TRIO每克酶制 剂
[0203] 可见，如本文所述测量的这些实验中的酶活性最初在以下范围内：外切葡聚糖酶 280-1240nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶1100-8000nkat/g葡聚糖，β-葡萄糖苷酶3000-15000nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶9000-30000nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶75-1400nkat/g 葡聚糖。
[0204] 图11示出了在各个不同反应室内随时间变化的纤维素转化率。纤维素转化率测定 为当提取样品时葡萄糖浓度除以理论葡萄糖潜能。当添加 C 5旁路时，葡萄糖潜能改变，这是 因为所述旁路含有未消化的少量葡萄糖低聚物，导致总转化率下降。如图所示，纤维素转化 动力学对CTEC和TRIO室是等同的，但对CELLUCLAST/188室并非如此。这归因于明显较低的 木聚糖酶和木糖苷酶活性水平。
[0205]图12示出了随时间变化的相应木聚糖转化率。木聚糖转化率以与纤维素转化率相 同的方式计算，但由于C5旁路含有大量木糖低聚物，当将C5旁路添加到水解产物时转化率 最初急剧下降。如图所示，木聚糖转化动力学对CTEC和TRIO室是等同的，但对CELLUCLAST/ 188室并非如此。这再次归因于明显较低的木聚糖酶和木糖苷酶活性水平。
[0206]当预处理的木聚糖回收率为77%时，图12中所示的木聚糖回收率对应于水解产物 中非常高的最终C5单体回收率，例如，图12中80%的回收率对应于(0.80)*(0.77) = 61.6% 的C5单体回收率。
[0207] 葡聚糖和木聚糖含量如Sluiter，A ·，B · Hames等（2005 )，Determination of Sugars，Byproducts，and Degradation Products in Liquid Fraction Process Samples，NREL-Biomass Program and in Sluiter，A.，B.Hames等（2006)，Determintation of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass，NREL_Biomass Program所描述 的那样测定。
[0208] 实施例10:稀释至较低干物质允许使用全料浆在较低酶剂量下的等同转化率
[0209] 在实施例9中所描述的实验中，6室水解反应器的两个室被用于比较全料浆的水 解，其中预处理后与固体部分分离的液体部分没有保存为后来添加到水解产物的旁路，而 是返回与固体部分共混并同时水解。全料浆稀释至12%DM，其使得抑制性溶解物质的浓度 与实施例9所述反应中获得的浓度大约是等同的，其中溶解的固体物质被移除并与22%DM 下的固体部分的水解保持分离(C5旁路）。CTEC3和ACTRI0用作酶制剂并且以10.7FPU/g葡聚 糖的低剂量应用。
[0210] 待如本文所述测量的用于实验中的酶活性（以nkat/g葡聚糖计)估计(基于实施例 9中给出的值)如下：
[0211] 外切葡聚耱内切葡聚糖β-蔔萄糖苷木聚糖酶 木糖寄酶 酶 酶 _酶 Trio 514 2:122 6012 9018 200 CTEC3 455 2212 7535 N/A 秘 A
[0212] 可见，如本文所述测量的这些实验中的酶活性最初在以下范围内：外切葡聚糖酶 280-1240nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶1100-8000nkat/g葡聚糖，β-葡萄糖苷酶3000-15000nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶9000-30000nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶为75-1400nkat/ g葡聚糖。
[0213] 图13示出了两种全料浆水解样品随时间变化的纤维素转化率。纤维素转化率如实 施例9中所述的测定。如图所示，纤维素转化动力学对CTEC和TRIO室是等同的。此外，尽管酶 剂量较低，但转化率水平等同于用C5旁路和后水解取得的那些，如实施例9中所述。
[0214] 图14示出了两种全料浆水解样品随时间变化的相应木聚糖转化率。如图所示，木 聚糖转化动力学对CTEC和TRIO室是大约等同的。当预处理的木聚糖回收率为77 %时，图14 中所示的木聚糖回收率对应于水解产物中非常高的最终C5单体回收率，例如，图12中80% 的回收率对应于(〇. 80) * (0.77 )= 61.6 %的C5单体回收率。如图所示，在全料浆水解中，在 这些条件下在41小时的水解中获得了至少55 %的非常高的C5单体回收率，对应于图14中 71 %的木聚糖转化率。
[0215]表4中示出了实施例9和10中描述的实验的预处理、7K解和回收率的不同参数。
[0216] 表4:使用非常低强度的单级自动水解的水解产率
[0217]
Luz 17」 大jjtTiyu丄丄：牲mj ti拡但h、j王料水牛
[0220]如实施例4中所述，将甘蔗渣预处理至强度log Ro 3.43(180°C，保留时间12分钟） 以产生具有木聚糖数12.0%的预处理生物质，大约6.8重量％木聚糖保留在未溶解固体物 质中，如图2估计的那样。预处理的木聚糖回收率为83%。在离开反应器后，将料浆压榨成大 约57%的纤维部分和液体部分。收集并分析预处理的材料(纤维部分以及液体部分）。样品 的干物质和组成如前面实施例中所述的那样测定。
[0221] 在实施例6中描述的6室反应器中进行实验。预处理的甘蔗渣被用作全料浆混合 物，其中在添加酶之前将纤维部分与液体部分混合。然后用水将干物质含量调节至18重 量％01。水解在50°(3下进行，使用20重量％氢氧化钙溶液(0 &(0!〇2)将?!1调节为4.7到5.3之 间。将4〇〇6116瓜86 1'1'；[0以0.161]11^葡聚糖(9.5??1]/^葡聚糖）的浓度用作酶。每天取样并 对糖含量进行分析。在118h后停止水解。以双重测定进行实验。
[0222] 如本文所述测量的用于实验中的酶活性（以nkat/g葡聚糖计)估计(基于实施例9 中给出的值)最初如下：
[0223] 外切葡聚糖内切葡聚檣β-葡萄糖苷木聚糖酶 木糖苷酶 ..峰 酶 酶 Τ?0 478 1:973 55￥1 8387 1Μ
[0224] 可见，如本文所述测量的这些实验中的酶活性最初在以下范围内：外切葡聚糖酶 nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶nkat/g葡聚糖，β-葡萄糖苷酶nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶 nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶nkat/g葡聚糖。
[0225] 表5中示出了本实施例11中描述的实验的预处理、水解和回收率的各种不同参数。
[0226] 表5:使用非常低强度的单级自动水解的水解产率
[0227]
[0228] ~图15示出了随甘蔗渣的全料浆水解的水解时间变化的水解产物中总C5和C6单体-回收率。如图所示，在这些条件下在24小时内，获得了至少55%的总C5单体回收率。
[0229] 实施例12:在来自通过低强度自动水解预处理的原料的水解产物的C6乙醇发酵后 残留的酒精废液的改善的生物甲烷潜能
[0230] 将小麦秸杆如实施例4中所述预处理至三种不同的强度以产生具有木聚糖数 3.0%、9.1%和13.2%的预处理生物质，分别具有在未溶解固体物质中残留的大约2.0%、 4.3 %和7.8重量％的木聚糖，如图2所估计的。
[0231] 使预处理的材料经受固/液分离以产生纤维部分(其随后用于酶促水解实验中）以 及液体部分(其保持与水解分离）。固体部分用CTEC3水解，剂量分别为:针对3.0%木聚糖数 样品0.052g/g葡聚糖;针对9.1 %木聚糖数样品0.056g/g葡聚糖;和针对13.2%木聚糖数样 品0.075g/g葡聚糖。
[0232] 可见，如本文所述测量的这些实验中的酶活性最初在以下范围内：外切葡聚糖酶 nkat/g葡聚糖，内切葡聚糖酶nkat/g葡聚糖，β-葡萄糖苷酶nkat/g葡聚糖、内切木聚糖酶 nkat/g葡聚糖，β-木糖苷酶nkat/g葡聚糖。
[0233] 水解在50°C、在22%DM调节至5.0的pH下进行144小时。在144小时后，将普通面包 酵母(C6发酵)添加到水解产物，将温度降至37°C并使发酵/水解再继续60小时。在发酵/水 解结束时，不同组之间的乙醇浓度大约等同，在61.77-63.68g/kg乙醇之间。
[0234] 来自发酵的水解产物以及来自相应的分离液体部分的生物甲烷产量使用 卩代(^1'；[(^3 3。；[1(16￥311(1，？16(161'；[(^3，丹麦的接种体、以接种体/底物比率5-6.5(基于挥发 性固体物质）、以一式两份分批分析进行测定。
[0235] 小心地测定每个预处理的质量平衡，并用于估计来自三种不同强度水平中每一种 的水解产物中每一种的C6乙醇发酵后残留的酒精废液的生物甲烷潜能。减去已知的乙醇对 观察的生物甲烷潜能的贡献，测定来自1吨小麦秸杆干物质的估计甲烷产量。结果在表6中 示出。
[0236] 表6:从1吨秸杆干物质获得的酒精废液和液体部分的甲烷产量，取决于预处理的 强度。
[0237]
[0238] 实施方案和实施例的描述只是说明性的，并且不意图用来限制权利要求的范围。 本文中引用的各参考文献在此明确通过引用全文并入。
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【主权项】
1. 一种加工木质纤维素生物质的方法，包括： -提供软木质纤维素生物质原料； -在单级加压水热预处理中在3.5-9.0的pH范围内预处理所述原料至log强度Ro3.75 或更低以产生预处理的生物质料浆，其中未溶解的固体物质含有至少5.0重量％的木聚糖； 以及 在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所述预 处理的生物质至少24小时以产生水解产物，所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖 酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶和β-木糖苷酶活性；以nkat/g葡聚糖计，内切葡聚糖酶的 活性水平为至少1100,外切葡聚糖酶的活性水平为至少280，β-葡萄糖苷酶的活性水平为至 少3000，内切木聚糖酶的活性水平为至少1400，和β-木糖苷酶的活性水平为至少75;所述水 解产物中C5单体的收率为预处理前所述原料的初始木糖和阿拉伯糖含量的至少55%。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述预处理的生物质作为全料浆进行水解。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述水解在干物质含量8至19 %之间进行。4. 根据权利要求2所述的方法，其中所述全料浆水解产物被用作生物甲烷基质。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述预处理的生物质经受固/液分离步骤以产生液 体部分和具有至少40重量％的干物质含量的固体部分，并且所述固体部分进行水解。6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述水解在20 %或更大的干物质含量下进行。7. 根据权利要求4所述的方法，其中在所述固体部分的酶促水解已达到期望程度的葡 聚糖转化率后，所述分离的液体部分被添加返回到所述水解混合物中。8. 根据权利要求7所述的方法，其中存在于液体部分中的至少85%的木糖-低聚物在后 水解过程中水解为木糖单体。9. 根据权利要求7所述的方法，其中在至少50%的纤维素已转化为葡萄糖后，将液体部 分添加到水解的固体部分。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述原料是小麦秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣、甜高粱 渣或空果串。11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述原料以至少35%的干物质含量经受加压预处 理。12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述加压预处理在10巴或更低的压力下进行。13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述原料使用水力旋流器系统从加压预处理反应 器中去除。14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述原料预处理达到使得生物质的特征为具有 12 %或更高的木聚糖数的强度。15. 根据权利要求1所述的方法，其中酶促水解使用为木质纤维素生物质转化而优化的 可商购的纤维素酶制剂进行。16. 根据权利要求1所述的方法，其中酶促水解进行至少96小时。17. 根据权利要求1所述的方法，其特征还在于使用一种或多种改良的酵母菌株将合并 的C5/C6水解产物直接发酵为乙醇。
【专利摘要】本发明涉及一种加工木质纤维素生物质的方法，包括：–提供软木质纤维素生物质原料；–在单级加压水热预处理中在3.5-9.0的pH范围内预处理所述原料至log强度Ro？3.75或更低以产生预处理的生物质料浆，其中未溶解的固体物质含有至少5.0重量％的木聚糖；以及在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所述预处理的生物质至少24小时以产生水解产物；所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶和β-木糖苷酶活性；以nkat/g葡聚糖计，内切葡聚糖酶的活性水平为至少1100，外切葡聚糖酶的活性水平为至少280，β-葡萄糖苷酶的活性水平为至少3000，内切木聚糖酶的活性水平为至少1400，和β-木糖苷酶的活性水平为至少75；所述水解产物中C5单体的收率为预处理前所述原料的初始木糖和阿拉伯糖含量的至少55％。
【IPC分类】D21C3/04, C12P7/10, D21C1/04
【公开号】CN105492615
【申请号】CN201480043613
【发明人】J·拉森, N·N·波尔森, M·D·杰普森, K·K·摩根森
【申请人】因比肯公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年2月5日
【公告号】CA2877769A1, CA2919521A1, CN104540956A, EP2880172A1, US20150191758, WO2014019589A1
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