使用含有可通过丙酸盐诱导的ilvbn操纵子的重组棒杆菌生产L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异...的制作方法
使用含有可通过丙酸盐诱导的ilvbn操纵子的重组棒杆菌生产L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异 ...的制作方法
【专利说明】使用含有可通过丙酸盐诱导的M vbn操纵子的重组棒杆菌生 产L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲 基戊酸或α-酮异己酸的方法
[0001] 本发明涉及一种使用微生物生产氨基酸及酮酸的方法，其中通过丙酸盐可诱导的 启动子使得某些基因可以受调节的表达。 现有技术
[0002] 氨基酸和酮酸用于人体医药、制药工业、化妆品、食品工业和动物营养。
[0003]许多这些化合物是通过棒状细菌菌株特别是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)发酵产生的。由于其重要性，改良生产方法的研究在持续进行。方法改良可包 括发酵技术措施例如搅拌或氧供给，或者营养培养基的成分，例如在发酵期间的糖浓度，或 者产物形式的加工，例如离子交换层析，或者微生物自身的固有生产特征。
[0004] 为了改良这些微生物的生产特征，使用诱变、选择和突变体选择的方法。以此方 式，获得对于抗代谢物例如缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸或者亮氨酸类似物4-氮亮氨酸或者 5，5，5-三氟亮氨酸有抗性的菌株，所述菌株产生化学化合物，例如L-氨基酸L-缬氨酸或者 L-亮氨酸。
[0005] 一些年来，重组DNA技术的方法已经同样用于L-氨基酸生产菌株谷氨酸棒杆菌的 菌株改良，例如增加或弱化各个氨基酸生物合成基因，例如在生产过程中也进行基因表达 的时序调节，以及研究对于化学化合物生产的影响。
[0006] 谷氨酸棒杆菌的生物学、遗传学和生物技术的概述见于"Handbook of Corynebacterium glutamicum"（Eds·:L·Eggeling and M.Bott,CRC Press ,Taylor& Francis，2005)、Journal of Biotechnology(Chief Editor:A.Piihler)特别出版的题目为 "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology"（Journal of Biotechnology 104/1-3,（2003))的出版物以及T.Scheper所著（Managing Editor) "Microbial Production of L-Amino Acids"（Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79，Springer Verlag,Berlin,Germany,2003)〇
[0007] 谷氛酸棒杆菌基因组的核昔酸序列在Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99_109(2003))、ΕΡ1108790和Kalinowski et al.(Journal of Biotechnology 104/1-3，（2003))中描述。
[0008] 谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列同样可以从美国国家医学图书馆的国家生物 技术信息中心（NCBI)数据库（86也68(^，]\?)，1]54)、日本0嫩数据库（008几]^811丨11^，如口311)或 者欧洲分子生物学实验室的核苷酸序列数据库(EMBL, Heidelberg, Germany和Cambridge, UK)获得。
[0009] 总的来说，基因的表达有两种可能性。在持续表达中，基因通过组成型启动子持续 表达，并且相应的蛋白质聚集在细胞中。
[0010] 另一方面，可诱导启动子用于诱导表达。靶基因的表达可以通过诱导物诱导。如果 (过)表达对于生产生物体具有负面作用，则使用这种方法。导致这种情况的原因可能是在 生长期间代谢来源的高荷载。结果是生长减慢及因此延长生物反应器的运行时间及与之相 关的在工业生产中的成本增加。诱导的表达在细胞毒性产物的情况中也是有益的。在此，在 诱导表达后发生细胞的自体中毒和死亡。针对生产方法的经济性，因此尝试将该方法再分 为生长期和生产期。在生长期，产生尽可能大量的生物量，然后在生产期通过启动子诱导产 生靶蛋白质。以此方式，可以获得最大产率，从而该方法成为明显更经济的。
[0011 ] 对于可调节的大肠杆菌(Escherichia coli)启动子lac、APL和trp，已经示出其可 以用于棒状细菌中调节各个基因的表达（Tsuchiya and Morinaga，Bio/Technology 6 (1988)428-431)。
[0012] 可诱导启动子的理想情况是棒状细菌启动子，其由易于获得的非昂贵的物质调 To
[0013] EP 0530765 Bl(Kyowa Hakko)描述了使用棒杆菌的可诱导启动子-在此是异柠檬 酸裂合酶基因的可诱导启动子-以产生酶如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和ICL以及生 理学活性蛋白质，如胰岛素或者α-、β_或λ-干扰素。只要培养基中存在不同于糖的碳源(C 源），这种启动子即可导致基因表达;在存在糖的情况下其被抑制。然而，由于在一般的发酵 培养基中使用糖作为C源，因此有用的是获得可调节启动子，所述启动子即使在存在糖的条 件下使用非昂贵的诱导物也导致基因表达。
[0014] DE 4440118 C1(如US 5965391，FZ Jiilich)保护了来自棒杆菌的可诱导启动子-在此是苹果酸合酶基因 aceB的可诱导启动子-生产蛋白质的用途;在此诱导物是碳源乳酸 盐、丙酮酸盐或乙酸盐。
[0015] Plassmeier等（Journal of Biotechnology 159/1-2(2012))描述了谷氨酸棒杆 菌的prpDBC2操纵子的启动子，其基因是在作为主要C源的丙酸盐上生长所必需的，并且编 码酶2-甲基柠檬酸脱水酶(PrpD2)、2-甲基异柠檬酸裂合酶(PrpB2)及2-甲基柠檬酸合酶 (PrpC2)。启动子测试载体构建体的分析可以鉴别prpDBC2操纵子上长度为121个碱基对的 操纵子区，其是通过激活物PrpR经丙酸盐诱导的转录所必需的。EMSA研究示出2-甲基柠檬 酸盐可能发挥作为PrpR的共激活物的功能。
[0016] 发明目的
[0017]本发明基于如下目的，即生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮氨酸、优选L-缬氨酸，或者生产α_酮酸α-酮异戊酸，α-酮甲基戊酸或者α-酮异己酸的新方法，所述方法具 有优选改良的产率和/或细胞内和/或在培养基中更高的产物终浓度。在此，应优选存在比 产率(spezifischen Ausbeute)的改良（即相对于采用的碳源的希望的产物产率）。
[0018] 所述新方法应优选可以不依赖于培养基的主要碳源而调节L-氨基酸和/或α-酮酸 的产生。
[0019] 在新方法中，如果可能，则不希望的副产物的形成、特别是不希望的副产物丙氨酸 的形成应还优选被抑制，因为副产物的分离是非常费力及高成本的，并且对于肉汤的产物 纯度和碳产率具有负面作用。
[0020] 使用的方法应还优选导致用于生产的菌株的遗传稳定性增加，及因此在发酵过程 (培养阶段和主发酵罐)中可以产生大量世代而不降低输出数据。
[0021] 发明描述
[0022]本发明的目的通过使用激活物PrpR结合的操纵基因调苄基因 ilvBN的表达而实 现。
[0023] ilvBN(EC No.4.1.3.18)是编码乙酰乳酸合酶的亚基的基因。
[0024]本发明的目的因此是通过棒杆菌属(Corynebacterium)微生物发酵生产L-氨基酸 或者α-酮酸的方法，所述L-氨基酸选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，优选L-缬氨酸， 所述α-酮酸选自酮异戊酸、酮甲基戊酸和酮异己酸，所述微生物含有可复制形式的具有操 纵基因活性的多核苷酸，所述多核苷酸序列与SEQ ID Ν0:1、2或3所示序列的位置1-121的 序列至少85 %、优选至少90 %、92 %、94%或96 %、特别是至少97 %、98 %或99 %、特别优选 100%相同，激活物PrpR与所述多核苷酸结合，并且功能上在所述多核苷酸的下游在3'末端 是具有启动子活性的第二个多核苷酸，以及编码乙酰乳酸合酶亚基的基因 ilvB和ilvN，并 且所述多核苷酸随着添加激活物PrpR而调苄基因 ilvBN的转录，所述激活物PrpR由培养基 中的共激活物2-甲基柠檬酸盐激活，在无诱导物的第一阶段之后，在随后的第二阶段向培 养基中加入丙酸盐或者2-甲基柠檬酸盐作为诱导物，由此ilvBN基因表达及因此在希望的 L-氨基酸或α-酮酸富集在培养基或细胞中的条件下合成希望的L-氨基酸或α-酮酸。
[0025]具有操纵基因活性的多核苷酸优选是在棒状细菌中天然调节2-甲基柠檬酸脱水 酶表达的操纵基因，或者衍生自这种操纵基因的多核苷酸。
[0026]具有操纵基因活性的多核苷酸优选包含这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID Ν0:11 所示序列或者与SEQ ID N0:l、2或3所示序列的位置22-49的序列(在下文也称作"IR Γ)至 少90%、优选至少92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同，以及 还包含这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID Ν0:12所示序列或者与SEQ ID Ν0:1、2或3所示序 列的位置77-105的序列（在下文称作"IR 2"）至少90%、优选至少92%、94%或96%、特别至 少97%、98%或99%、特别优选100%相同。在优选的实施方案中，序列"IR Γ位于具有操纵 基因活性的多核苷酸的位置22-49,在优选的实施方案中序列"IR 2"位于位置77-105。 [0027]在本发明的优选实施方案中，具有操纵基因活性的多核苷酸是较长的多核苷酸的 一部分，所述较长的多核苷酸优选与SEQ ID N0:1、2或3的位置1-177的序列具有至少90%、 优选至少92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别优选100%的序列相同性。 [0028] 基因 ilvB优选是编码具有与SEQ ID N0:9的氨基酸序列具有至少90%、优选至少 92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同性的氨基酸序列的多肽 的多核苷酸。
[0029]特别优选这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID N0:8的位置499-2379的序列是至少 90%、优选至少92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同的。 [0030] 基因 ilvN优选是编码具有与SEQ ID N0:10的氨基酸序列具有至少90%、优选至少 92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同性的氨基酸序列的多肽 的多核苷酸。
[0031]特别优选这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID N0:8的位置2393-2911的序列至少 90%、优选至少92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别优选100%相同。 [0032]由基因 ilvB和ilvN编码的多肽聚集在一起产生功能性乙酰乳酸合酶。
[0033]丙酸盐或丙酸优选用于诱导表达。在这方面，发生"丙酸盐诱导"。丙酸盐在体外被 转变为实际的共激活物2-甲基柠檬酸盐。或者，2-甲基柠檬酸盐也可以直接用于诱导，但是 由于其较低的可用性而不太优选。根据本发明，术语"丙酸盐诱导"也包括用2-甲基柠檬酸 盐诱导。
[0034] 在生产完成后，优选分离希望的L-氨基酸或α_酮酸，发酵肉汤的其它成分和/或生 物量任选以其全部或部分(>〇至100%)保留在分离的产物中或者被完全除去。
[0035] 在本发明的方法中，首先发生生物量的无诱导培养阶段(生长期，第一阶段）。在这 个阶段，优选没有或者几乎没有任何氨基酸或酮酸形成(<5g/l)。在随后的生产阶段(诱导 期，第二阶段），通过丙酸盐或2-甲基柠檬酸盐诱导生物合成基因 ilvBN而诱导生产。培养阶 段包括所有培养步骤，从保留样品开始，通过优选应用摇瓶阶段直至优选应用培养发酵罐。 培养阶段也可以仍包括主发酵的第一阶段。优选地 ，培养阶段最晚在主发酵的头3-15个小 时、优选5-10小时之后完成。
[0036]诱导期优选包括在接种主发酵罐直至主发酵结束之后0-20小时的时间。在较早的 时间点-即在培养发酵罐中-诱导可以是有利的，并且是本发明方法的一个特定实施方案。
[0037] 在生产期精确调节/计量丙酸浓度是必需的，从而一方面保持氨基酸或酮酸合成 的诱导，另一方面防止丙酸盐或其降解中间产物（丙酰-CoA，2_甲基-柠檬酸盐）的毒性作 用。诱导期优选的丙酸浓度范围是〇.l-l〇g/l。丙酸可以丙酸补加形式连续加入或者在诱导 期间不同时间点以一或多个丙酸脉冲形式分批加入。单次剂量的丙酸作为主发酵培养基的 培养基成分也是可以的，并且是本发明方法的一个特定实施方案。
[0038] 生产氨基酸和酮酸的一大问题通常是副产物的形成。形成的副产物降低碳产率且 必须另外任选被分离，这是非常费力及高成本的。
[0039] 副产物的形成的一个实例是在缬氨酸生物合成中副产物丙氨酸的形成。在常规生 产方法中，丙氨酸的形成增加，其中通常根据细胞世代数发生组成型表达。
[0040] 在三阶段方法(摇瓶、培养发酵罐、主发酵罐）中，从保留样品直至收获生产发酵 罐，传代大约20-25代;在四阶段方法(摇瓶、预接种(PreSeed)发酵罐、培养发酵罐、主发酵 罐）中，传代甚至超过30代。在如此多的传代中，副产物形成和生物量形成通常相应大大增 加。
[0041] 然而，根据本发明，发现副产物形成和生物量形成显著降低。此外，发现在本发明 的生产方法中副产物形成和生物量形成不依赖于传代数。这提示本发明的方法管理导致采 用的菌株的遗传稳定性增加。因此，培养期原则上可以扩展为任何长度，这对于方法管理是 特别有利的。
[0042]本发明的一个特别优选的方法因此特征在于其包括至少四个阶段，即至少三个培 养期和一个生产期。在此，培养优选包括在摇瓶中、在预接种发酵罐以及在种子发酵罐中培 养。生产优选在生产发酵罐中进行。
[0043]本发明进一步优选的方法因此特征在于在培养期采用的细菌传代至少16代、优选 至少24代，和/或在整个发酵期间（包括培养和生产)传代至少25代、优选至少30代。
[0044]本发明还涉及激活物PrpR结合的具有操纵基因活性的多核苷酸的应用，该多核苷 酸具有与SEQ ID N0:l、2或3的位置 1-121 的序列至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、 98%、99%或100%相同、优选至少97%、特别优选至少98%、特别优选至少99%及尤其优选 100 %相同的序列，以调苄基因 i 1 vBN的表达，优选组合该基因上游的启动子。
[0045]本发明还涉及包含具有操纵基因活性的多核苷酸、下游启动子和编码乙酰乳酸合 酶的基因 ilvBN的表达盒，所述多核苷酸的序列与SEQ ID N0:1、2或3的位置1-121的序列至 少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%或100%、优选至少97%、特别优选至少 98%、特别优选至少99 %及尤其优选100 %相同。
[0046] 具有操纵基因活性的多核苷酸优选总是具有如优选的前文强调的特征，特别是保 守区 "IR Γ 和 "IR 2"。
[0047] ilvBN基因上游的启动子或者操纵子下游的启动子可以是任何希望的启动子。
[0048] 优选可用于谷氨酸棒杆菌中的本发明的启动子的实例在例如Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3) ,311-323(2003))的综述文章的图 1 中描述。以相同 方式，可以米用由Vasicova et al(Journal of Bacteriology 181,6188-6191(1999))描 述的d a p A启动子的变体，如启动子A 2 5。此外，可以使用谷氨酸棒杆菌的g a p启动子（E P 06007373)。最后，可以使用由Amann et al. (Genes 69(2) ,301-315(1988))和Amann and Brosius(Genes 40(2-3)，183-190( 1985))描述的公知启动子T3、T7、SP6、M13、lac、tac和 trc〇
[0049] 在优选的实施方案中，根据本发明采用的启动子是具有启动子活性的多核苷酸， 其序列与SEQ ID N0:4的位置 122-206的序列至少90%、92%、94%、96%、97%、98%、99% 或100%、优选至少97%、特别优选至少98%、特别优选至少99%及尤其优选100%相同。
[0050] 本发明的表达盒优选是具有序列SEQ ID N0:13的表达盒。
[0051] 本发明的另一主题是含有本发明的表达盒的载体。
[0052] Kirchner and Tauch(Journal of Biotechnology 104:287-299(2003))描述了 优选用于谷氨酸棒杆菌中的载体的选择。
[0053]使用本发明载体的同源重组使得可以将染色体上DNA区段置换为本发明的表达 盒，其通过载体被转运至细胞中。对于载体的环形DNA分子与染色体上靶DNA之间的有效重 组，含有本发明表达盒的被置换的DNA区提供在具有与靶位点同源的核苷酸序列的末端，从 而载体的整合位点或者DNA的置换位点被限定。
[0054] 本发明表达盒的掺入可以发生在ilvBN基因、优选天然ilvBN基因的天然基因位 点，任选i ΙνΒΝ基因的天然启动子在此也由本发明的表达盒置换。
[0055] 或者，本发明的表达盒也可以整合进不具有编码功能的染色体的基因间区域中， 或者整合在另一基因位点，该另一基因位点优选是染色体上的不是细胞生长及氨基酸或酮 酸生产所必需的核苷酸序列。
[0056] 在优选的实施方案中，根据本发明，本发明的表达盒也可以以多个拷贝掺入染色 体中，及也任选在不同的基因位点掺入。
[0057]代替将本发明的表达盒掺入染色体中，另一选项是本发明采用的操纵基因也可以 掺入染色体中，组合在i 1 vBN基因天然基因位点的启动子，其中优选i 1 vBN基因的天然启动 子由操纵基因和启动子的构建体置换。
[0058]代替将本发明的表达盒掺入染色体中，另一选项是当然也可以采用含有本发明的 表达盒的染色体外复制载体。
[0059]本发明同样进一步涉及微生物，优选棒杆菌，特别是产生选自L-亮氨酸、L-缬氨酸 和L-异亮氨酸的L-氨基酸或者选自酮异戊酸、酮甲基戊酸和酮异己酸的α-酮酸的棒杆菌， 其含有本发明的表达盒和/或本发明的载体。
[0060]关于多核苷酸的生物化学和化学结构的详细描述，例如其在活生物体中例如在微 生物中的存在，可见于Berg等所著教科书"Biochemie"[Biochemistry](Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin,Germany,2003;ISBN 3-8274-1303-6)。
[0061] 如果多核苷酸由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶 (T)的脱氧核糖核苷酸单体组成，则论及的是脱氧核糖多核苷酸或者脱氧核糖核酸(DNA)。 如果多核苷酸由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的核糖 核苷酸单体组成，则论及的是核糖多核苷酸或者核糖核酸(RNA)。在提及的多核苷酸中，单 体彼此通过3' -5磷酸二酯键共价连接。
[0062] "具有操纵基因活性的多核苷酸"或者"操纵基因"应理解为是指多核苷酸，优选脱 氧核糖多核苷酸或者核酸，优选脱氧核糖核酸(DNA)，其通过具有启动子活性的多核苷酸与 被转录的多核苷酸功能性连接，通过与各种调节蛋白（激活物或阻抑物，其随之与配体或效 应分子相互作用)相互作用启动或关闭这个多核苷酸的转录。
[0063] "具有启动子活性的多核苷酸"或者"启动子"是指多核苷酸、优选脱氧核糖多核苷 酸，或者核酸，优选脱氧核糖核酸(DNA)，其与被转录的多核苷酸功能性连接，限定这个多核 苷酸转录的起始点和起始频率，从而可以影响受控制的多核苷酸的表达水平。
[0064]基于DNA的双链结构，本发明也涉及与SEQ ID N0:1、2或3列出的序列的链互补的 链。
[0065] "转录"应理解为是指通过从DNA基体开始产生互补RNA分子的过程。蛋白质、如RNA 聚合酶、"Sigma因子"和转录调节蛋白参与这个过程。然后合成的RNA(信使RNA，m-RNA)作为 翻译过程中的基体，随后产生多肽或蛋白质。
[0066]从化学的观点来看，基因是多核苷酸。编码蛋白质/多肽的多核苷酸在此与术语 "基因"同义使用。因此，"基因"和"编码区"这两个术语同义使用，"蛋白质"和"多肽"这两个 术语也同义使用。
[0067] "功能性下游联接或连接"在此应理解为是指本发明的具有操纵基因活性的多核 苷酸与具有启动子活性的另一多核苷酸及进一步的寡核苷酸或多核苷酸的依次排列，导致 所述进一步的多核苷酸的转录。
[0068] 如果所述进一步的多核苷酸是编码多肽/蛋白质的多核苷酸，其由以起始密码子 开始、包含终止密码子及任选包含转录终止子的多肽编码区组成，则"功能性下游联接或连 接"是指导致所述进一步的多核苷酸转录及合成的RNA的翻译的顺序排列。
[0069] 所述进一步的多核苷酸编码一或多个多肽。编码蛋白质/多肽的多核苷酸基本上 由蛋白质编码序列的起始密码子及一或多个终止密码子组成，起始密码子选自ATG、GTG和 TTG，优选ATG或GTG，特别优选ATG，终止密码子选自TAA、TAG和TGA。
[0070] 如果所述进一步的多核苷酸编码许多蛋白质/多肽，核糖体结合位点可以位于每 个基因之前。在最后的基因之后任选是终止子。
[0071] 本发明的进一步的多核苷酸由基因 i 1 v B和i 1 v N组成，其编码乙酰乳酸合酶 (IlvBN，EC No. :4.1.3.18)的亚基。
[0072] 本发明进一步涉及本发明的表达盒或者本发明的载体在微生物中表达ilvBN基因 的应用。本发明的表达盒保证合成的RNA、优选mRNA的转录和翻译为多肽，即乙酰乳酸合酶 的两个亚基的转录和翻译。
[0073] 使用本发明的表达盒，基因 ilvBN在微生物中可以在希望的时间表达或过表达。
[0074] 过表达通常理解为是指与起始菌株(亲代菌株)或野生型菌株(如果是起始菌株） 相比，核糖核酸、蛋白质（多肽)或酶的细胞内浓度或活性增加。起始菌株(亲代菌株)理解为 是指对其进行导致过表达的措施的菌株。
[0075] 在过表达的情况中，优选重组过表达的方法。在这些方法中是组合所有方法，其中 微生物使用在体外制备的DNA分子产生。这种DNA分子包含例如启动子、表达盒、基因、等位 基因、编码区等。通过转化、缀合、转导或相似方法将这些转化为希望的微生物。
[0076] 通过使用本发明采用的操纵基因和/或使用本发明的表达盒的过表达措施，基于 在进行过表达措施之前的菌株中多肽的活性或浓度，乙酰乳酸合酶的活性或浓度一般优选 增加至少 10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400% 或者 500%，优选最大增 加至 1000%、2000%、4000%、10000%或20000%。
[0077] 表达或过表达的程度可以通过测量由基因转录的mRNA的量确定，通过确定多肽的 量及确定酶活性而确定。
[0078] 对于确定mRNA的量，可以使用"Northern印迹"和定量RT-PCR方法。在定量RT-PCR 中，聚合酶链反应之前是逆转录。对此，可以使用Roche Diagnostics公司的LightCycler? 系统（Boehringer Mannheim GmbH,Roche Molecular Biochemicals，Mannheim,Germany)， 例如在Jungwirth et al.(FEMS Microbiology Letters 281,190-197(2008) )中描述。凝 胶中蛋白质的浓度可以通过一维或二维蛋白质凝胶分离及随后的蛋白质浓度光学鉴别而 使用合适的分析软件确定。在棒状细菌情况中，制备蛋白质凝胶及鉴别蛋白质的常规方法 是由Hermann et al · (Electrophoresis，22:1712-23(2001))描述的方法。蛋白质浓度也可 以使用特异于待检测蛋白质的抗体通过Western印迹杂交方法确定（Sambrook et al.， Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)，随后使用合适的软件对浓度进行光学测定 (Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5:32-39；Lottspeich,Angewandte Chemie 321: 2630-2647( 1999))。采集的数据的统计学意义通过T检验确定(Gosset ,Biometrika 6( 1): 1-25(1908))。
[0079] 使用本发明采用的操纵基因的ilvBN基因的过表达措施可以与其它过表达措施以 合适方式组合。
[0080] 为了实现过表达，在现有技术领域可利用多种方法。这些方法除了修饰管理或控 制基因表达的核苷酸序列之外，也包括增加拷贝数。
[0081] 拷贝数的增加可以通过在微生物的细胞质中复制的质粒进行。为此，在现有技术 中针对各种微生物描述了众多质粒，使用这些质粒可以调苄基因拷贝数的所需增加。对于 棒杆菌属的合适质粒在例如Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3)，27_40， (2003))或者在Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71,5920-5928(2005))中描述。
[0082] 拷贝数增加至少一个（1)拷贝可另外通过将进一步的拷贝插入微生物染色体中而 发生。对于棒杆菌属合适的方法在例如专利说明书W0 03/014330、W0 03/040373和W0 04/ 069996中描述。
[0083] 可进一步发生基因表达的增加，其中许多启动子位于希望的基因之前或者与待表 达的基因功能性连接，以此方式实现表达增加。这种方式例如在专利说明书W0 2006/ 069711中描述。
[0084] 延伸率(Geschwindigkeit der Elongation)受密码子使用的影响；通过使用通常 在起始菌株中发生的t(转移)RNA的密码子可以增加翻译。此外，起始密码子置换为在许多 微生物中最常发生(在大肠杆菌中为77%)的密码子ATG可以明显改良翻译，因为在RNA水 平，密码子AUG比例如密码子⑶G和UUG有效2-3倍(Khudyakov et al.，FEBS Letters 232 (2):369-71(1988)；Reddy et al. proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60(1985))。也可以优化起始密码子的序列环境，已经描述了起 始密码子与侧翼区之间的相互作用影响（Stenstrom et al.，Gene 273(2): 259-65(2001); Hui et al.,EMB0 Journal 3(3):623-9(1984))〇
[0085] DNA处理、DNA的消化和连接、转化体的转化和选择的说明见于已知的Sambrook等 的指南Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
[0086] 在本发明的一个优选实施方案中，使用这样的微生物，其中希望的L_氨基酸或a_ 酮酸的生物合成途径的其他基因另外以增加的形式存在，特别是过表达的。
[0087]对于L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸或者α-酮异己酸的生 产，优选选自如下一组的编码L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α_酮异戊酸、α_酮-β_甲基戊酸或者α_ 酮异己酸的生物合成的酶的一或多个基因或多核苷酸可以另外过表达：
[0088] a)多核苷酸（ilvC基因），其编码异构还原酶（IlvC，EC No. :1.1.1.86)，
[0089] b)多核苷酸（ilvD基因），其编码二羟酸脱水酶（IlvD，EC No. :4·2·1·9)，
[0090] c)多核苷酸（ilvE基因），其编码转氨酶（IlvE，EC No. :2.6.1.42),
[0091] (1)多核苷酸（丨14基因），其编码苏氨酸脱水酶（114^1:4.3丄19)，
[0092] e)多核苷酸(hom基因），其编码高丝氨酸脱氢酶(Hom，EC No.:1.2.1.11)，
[0093] f)多核苷酸(thrB基因），其编码高丝氨酸激酶(ThrB，EC No. :2.7.1.39),
[0094] g)多核苷酸(thrC基因），其编码苏氨酸合酶(ThrC，EC No.:4.2.3.1)，
[0095] h)多核苷酸(leuA基因），其编码异丙基苹果酸合酶(LeuA，EC No. :2.3.3.13),
[0096] i)多核苷酸（leuB基因），其编码异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB，EC No. :1.1.1.85)，
[0097] j)多核苷酸（leuC基因），其编码异丙基苹果酸异构酶(LeuC，EC No· :4·2· 1 ·33)的 大亚基
[0098] k)多核苷酸（leuD基因），其编码异丙基苹果酸异构酶(LeuD，EC No· :4·2· 1 ·33)的 小亚基，
[00"] 对于异亮氨酸和缴氨酸，特别优选的是基因 hom、ilvA、ilvC、ilvD和ilvE，对于α- 酮异戊酸(KIV)和α-酮-β-甲基戊酸(KMV)，特别优选的是基因 ilvC和ilvD，对于α-酮异己酸 (KIC)，特别优选的是基因 ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC和leuD。
[0100]在一个优选的实施方案中，使用其中降低希望的L-氨基酸或a-酮酸形成的代谢途 径至少被部分弱化的微生物。
[0101]如果优选产生缬氨酸或酮异戊酸，则可以弱化异亮氨酸(对于前体酮丁酸的形 成：;11￥4、1:11沾、1:111^、11〇111)和/或亮氨酸（161^、161113、1611〇0)的代谢途径。如果优选产生异亮 氨酸或酮甲基戊酸，则可以弱化亮氨酸的生物合成途径。如果优选产生亮氨酸或酮异己酸， 则可以弱化异亮氨酸(或者前体酮丁酸)的生物合成途径。
[0102] 在本文中术语"弱化"描述了细菌中由合适的DNA编码的一或多种酶(蛋白质）的细 胞内活性的降低或关闭，通过例如使用弱启动子或使用编码具有低活性的合适的酶或失活 合适的基因或酶(蛋白质）的基因或等位基因或者任选组合这些措施。各个靶基因的完全或 部分弱化可以例如通过基因的完全或部分缺失或者通过在结构基因中或者在启动子区或 在核糖体结合位点中插入点突变而实现。特异性降低基因表达的另一方法是反义技术，其 中将合成较长反义RNA的短寡脱氧核苷酸或载体带入靶细胞中。反义RNA可以结合特异性 mRNA的互补区段并且降低其稳定性或者阻断可翻译性。本领域技术人员在Srivastava et al · (Applied Environmental Microbiology 20000ct;66(10) :4366-4371)中发现这样一 个实例。所述反义技术也可以通过使用本发明的操纵基因/启动子进行，其中在靶基因之后 以"反义"方向克隆。在加入诱导物丙酸盐之后，诱导被弱化的靶基因的互补链的mRNA形成。 通过将这种反义mRNA加入靶基因的mRNA，降低靶基因的表达。基因 i 1 vBN的调节表达或过表 达或者L-氨基酸或α_酮酸的调节产生优选在棒杆菌属微生物中进行。在棒杆菌属内，优选 的菌株是基于如下菌种的那些:有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)，典型菌株保藏 为DSM44549，谷氨酸棒杆菌，典型菌株保藏为ATCC13032，及产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，典型菌株保藏为ATCC6871。非常特别优选谷氨酸棒杆菌。
[0103] 现有技术领域也已知其它名称的谷氨酸棒杆菌的一些代表性菌株。这些菌株包括 例如：菌株ATCC13870，其被命名为嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophilum)，菌株DSM20137,其被命名为百合棒状杆菌（Corynebacterium lilium)，菌株ATCC17965，其被命名为栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)，菌 株ATCC14067,其被命名为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，菌株ATCC13869,其被命 名为乳发酵短杆菌（1^'6￥；^&(^61'；[111111&(31:0€61'1116111：11111)，及菌株41'0(]14020，其被命名为双 歧杆菌（Brevibacterium divaricatum) 〇
[0104] 针对谷氨酸棒杆菌的术语"产谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus)"同样常 见。有效棒杆菌菌种的一些代表性菌株在现有技术领域也被命名为热产氨棒杆菌 (Corynebacterium thermoaminogenes)，例如菌株FERM BP-1539。
[0105] 用于本发明措施中的微生物或菌株(起始菌株)优选已经具有将希望的L-氨基酸 或α-酮酸分泌进其周围的营养培养基中并在此积聚的能力。在下文中，术语"产生"也用于 此含义。特别地，本发明采用的菌株在诱导后优选具有在细胞或在营养培养基中富集或积 聚2 (至少)〇.5g/l*h、优选至少1.0或2.0g/l*h的希望的氨基酸的能力。起始菌株优选是已 经通过诱变和选择、通过重组DNA技术或者通过组合这两种方法产生的菌株。
[0106] 本领域技术人员可理解也可以获得适于本发明措施的微生物，首先在野生型菌株 如在谷氨酸棒杆菌典型菌株ATCC 13032或菌株ATCC 14067中采用根据本发明使用的操纵 基因以调节希望的基因的表达及随后通过现有技术领域描述的进一步的遗传学措施诱导 微生物产生氨基酸或酮酸。
[0107] 产生或分泌L-缬氨酸的棒状细菌的已知代表性菌株是例如：乳发酵短杆菌FERM BP-1763(在US5，188,948中描述） ；乳发酵短杆菌FERMBP-3007(在US5,521，074中描述）； 谷氨酸棒杆菌FERMBP-3006(在US5,521，074中描述）；及谷氨酸棒杆菌FERMBP-1764(在 US 5,188,948中描述）。
[0108] 产生L-缬氨酸的微生物典型具有反馈抗性或脱敏的乙酰乳酸合酶（AHAS，EC 4.1.3.18)。其代表合成异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的平行代谢途径的第一种酶(Umbarger， H.E.1987,Biosynthesis of the branched-chain amino acids,pp.352-367,in F.C.Neidhardt,J.L. Ingraham,K.B. Low,B.Magasanik,M.Schaechter, and H.E.Umbarger (ed.),Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology,American Society for Microbiology,Washington,D.C·)。全酶总是由2个大亚 基和2个小亚基组成。大的AHAS亚基形成催化结构域，由i lvB编码;小亚基作为调节结构域， 由ilvN编码。应理解反馈抗性乙酰乳 酸合酶是指与野生形式(野生型)相比对支链氨基酸缬 氨酸、亮氨酸和异亮氨酸或其混合物的抑制具有更低的敏感性的乙酰乳酸合酶。在谷氨酸 棒杆菌物种的乙酰乳酸合酶的情况中，菌株ATCC13032、ATCC14067(也称作黄色短杆菌)或 ATCC13869(也称作乳发酵短杆菌)菌株是合适的野生型菌株。
[0109] 谷氨酸棒杆菌中编码乙酰乳酸合酶的基因 ilvBN在例如Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology 175(17) :5595-603(1993))或EP1108790中描述。登记号 L09232 (GenBank，NCBI)示出基因序列。
[0110] 不再由支链氨基酸(亮氨酸、缴氨酸、异亮氨酸)反馈抑制的AHAS的酶变体在例如 Mendel et al.(Journal of Molecular Biology 325,275-284(2003))NElisakova et al.(Applied and Environmental Microbiology 71，207-213(2005))、Wada et al. (Bioscience Biotechnology&Biochemistry，72(11)，2959-2965，（2008))及EP1491634中 描述。优选的是反馈抗性乙酰乳酸合酶的变体，其在由i 1 vN编码的小亚基中携带一或多个 选自如下的氨基酸置换:在氨基酸序列位置20由L-天冬氨酸代替甘氨酸，在氨基酸序列位 置21由L-天冬氨酸代替L-异亮氨酸，在氨基酸序列位置22由L-苯丙氨酸代替L-异亮氨酸， 在位置42是除了L-丙氨酸之外的每个蛋白质氨基酸、优选L-缬氨酸、L-异亮氨酸及L-亮氨 酸、特别优选L-缬氨酸，及任选在位置47由L-亮氨酸代替L-组氨酸(在DE 102011118019 A1 中描述）。
[0111] 已知的代表性的产生或分泌L-异亮氨酸的棒杆菌菌株是例如：黄色短杆菌FERM BP-760(在US 4,656,135中描述）；黄色短杆菌FERM BP-2215(在US 5,294,547中描述）；及 谷氨酸棒杆菌FERM BP-758(在US 4,656，135中描述）。
[0112] 分泌或产生α-酮酸的菌株基于例如:谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032;黄色短杆菌菌 株ATCC 14067;及乳发酵短杆菌菌株ATCC 13869。
[0113]本发明提供了生产L-氨基酸或α-酮酸的微生物，所述L-氨基酸选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，所述α-酮酸选自α-酮异戊酸、α-酮甲基戊酸和α-酮异己酸，通过使用 根据本发明的操纵基因，使得微生物可以或具有编码乙酰乳酸合酶的ilvBN基因的调节表 达。
[0114]此外，本发明提供了一种发酵产生L-氨基酸或α-酮酸的方法，所述L-氨基酸选自 L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，所述α-酮酸选自α-酮异戊酸、α-酮甲基戊酸和α-酮异己 酸，所述方法包括如下步骤：
[0115] a)在合适的培养基中培养本发明的微生物，获得发酵肉汤，及
[0116] b)富集来自a)的发酵肉汤中和/或微生物细胞中的L-氨基酸或α-酮酸。
[0117]优选L-氨基酸或α-酮酸或者含有L-氨基酸或α-酮酸的液体或固体产物得自含有 L-氨基酸或α-酮酸的发酵肉汤。
[0118] 产生的微生物可以连续培养，如WO 05/021772所述，或者在分批方法(分批培养或 分批处理)或者在补料分批方法(补料方法)或者重复补料分批方法(重复补料方法）中分批 培养，以产生希望的有机化学化合物。已知培养方法的概述在Chmi el教科书中 (Bioprozesstechnik 1,Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Technology 1, Introduction to Bioprocess Technology](Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))或者在 Storhas 的教科书中（Bioreaktoren and periphere Einrichtungen[Bioreactors and Peripheral Devices](Vieweg Verlag,Braunschweig/ Wiesbaden, 1994))可获得。
[0119] 使用的培养培养基或发酵培养基必须以合适方式符合相应菌株的要求。关于各种 微生物的培养培养基的描述包含在美国细菌学学会的手册"Manual of Methods for General Bacteriology"（Washington D.C. ,USA, 1981)中。术语培养培养基与发酵培养基 或者培养基可互换使用。
[0120] 使用的碳源可以是糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来 自甜菜或甘蔗加工的含有蔗糖的溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素，油和脂肪如大豆油、葵 花油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油、甲醇和乙醇，以及有 机酸如乙酸或乳酸。
[0121] 使用的氮源可以是有机含氮化合物，如胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉 米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可 以单独使用或者作为混合物使用。
[0122] 使用的磷源可以是磷酸、磷酸铵、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾，或者相应的含钠 盐。
[0123] 培养基必须进一步含有盐，例如金属如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物形式或硫酸盐 形式，例如硫酸镁或硫酸铁，其是生长所必需的。最后，必需的生长物质如氨基酸如高丝氨 酸和维生素如硫胺素、生物素或泛酸可以另外用于上述物质中。
[0124] 丙酸盐优选作为盐加入培养基中，但是也可以作为丙酸加入。合适的丙酸盐是丙 酸镁、丙酸钠、丙酸钙、丙酸铵和丙酸钾。丙酸盐以游离酸或丙酸阴离子溶解存在于培养基 中。
[0125] 提及的原料可以单一批次或者在培养期间以合适方式加入培养物中。
[0126] 为了控制培养物的pH，合适地应用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨、氢氧化 铵或者氨水或者酸性化合物如磷酸或硫酸。pH通常调节为6.0-8.5，优选6.5-8。为了控制泡 沫发生，可以应用抗泡沫剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以在培养 基中加入合适的选择性作用物质如抗生素。发酵优选在有氧条件下进行。为了维持这些条 件，在培养物中加入氧或含氧气体混合物例如空气。也可以使用富含过氧化氢的液体。在限 氧条件下发酵是本发明的另一个特定实施方案。任选地，发酵在超压下进行，例如在0.03-0.2MPa超压下。培养温度通常为20°C_45°C，优选25°C_40°C，特别优选30° -37°C。在分批或 补料分批方法中，培养优选连续进行直至已经形成足以测量到获得希望的有机化学化合物 的量。这个目标通常在10小时至160小时内实现。在连续方法中，可以进行较长的培养时间。 由于微生物的活性，在发酵培养基和/或微生物细胞中富集(积聚)有机化学化合物。
[0127] 合适的发酵培养基例如见于专利说明书US 5,770,409、US 5,990,350、US 5,275， 940、W0 2007/012078、US 5,827,698、W0 2009/043803、US 5,756,345或者US 7,138,266。
[0128] 分析L-氨基酸以在发酵过程中一或多个时间确定其浓度可以通过分离L-氨基酸 进行，通过离子交换层析、优选阳离子交换层析及随后使用茚三酮的柱后衍生化进行，如在 Spackman et al. (Analytical Chemistry 30:1190-1206(1958))中描述。代替讳三酮，邻 苯二醛也可以用于柱后衍生化。关于离子交换层析的综述文章见于Pickering(LC · GC (Magazine of Chromatographic Science)7(6),484-487(1989))〇
[0129] 也可以例如使用邻苯二醛或异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化，及通过反向层析 (RPC)、优选高效液相层析(HPLC)形式分离所得氨基酸衍生物。这种方法在例如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 51:1167-1174(1979))中描述。
[0130] 通过光度测定(吸光度、荧光)进行检测。
[0131 ] 关于氨基酸分析的综述见于例如教科书Bioanalytik"，Lottspeich and Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany 1998)。
[0132] 分析a-酮酸以在发酵过程中一或多个时间确定其浓度可以通过分离酮酸及其它 分泌产物而进行，通过在磺化苯乙烯/二乙烯苯聚合物上以H+形式进行离子交换层析、优选 阳离子交换层析，例如使用〇 · 025N硫酸及随后在215nm(或者在230或275nm)进行UV检测。优 选地，可以采用REZEX RFQ-Fast Fruit H+柱(Phenomenex);也可以使用针对分离相的其它 供应商(例如Aminex，BioRad)。相似的分离在供应商的合适应用实例中描述。
[0133] 分析丙酸以在发酵过程中一或多个时间确定其浓度可以通过HPLC分离有机酸而 实现。￥41?14~]^丨3〇3吐！1+300\7.8_45215(长度为300_，直径为7.8_)用作柱。硫酸和 乙腈的混合物(215ml的0.5M硫酸、50ml乙腈，用蒸馏水加至5L)作为洗脱液。0.005M硫酸作 为运行样品的溶剂。将无细胞运行样品以1:20稀释。
[0134] 分离参数如下:流速0.4ml/分钟;样品注射体积20μ1;温度35°C。在215nm通过UV进 行分光光度检测。丙酸的保持时间是30.258分钟。可测范围是0.09-7.514g/l。
[0135] 本发明的方法或发酵方法在关于如下的一或多个参数方面的性能与使用其中不 存在本发明的表达盒的微生物的方法或发酵方法相比优选增加至少0.5%、至少1%、至少 1.5%或者至少2%，所述参数选自：浓度(形成的化合物/体积）、产率(形成的化合物/消耗 的碳源）、形成物(形成的化合物/体积和时间）及特定形成物(形成的化合物/细胞干重或者 生物量干重和时间，或者形成的化合物/细胞蛋白质和时间）或者其它方法参数及其组合。 这在大规模生产中被认为是非常有价值的。
[0136] 通过发酵措施，获得发酵肉汤，其含有希望的氨基酸或酮酸。
[0137] 随后，进行液体或固体形式的含有氨基酸或酮酸的产物的制备或生产或提取。
[0138] 发酵肉汤应理解是指发酵培养基或营养培养基，其中微生物已经在一定温度培养 一定时间。发酵培养基或在发酵期间采用的培养基含有保证希望的化合物产生及典型复制 或存活的所有物质或成分。
[0139] 在发酵结束时，所得发酵肉汤因此含有：
[0140] a)由于微生物细胞复制的结果而形成的微生物的生物量(细胞群(Zellmasse))，
[0141] b)在发酵过程中形成的希望的氨基酸或酮酸，
[0142] c)在发酵过程中任选形成的有机副产物，及
[0143] d)在发酵期间未被消耗的所用发酵培养基或原料的组成成分，例如维生素如生物 素或盐如硫酸镁。
[0144] 有机副产物包括除了各自的希望的化合物之外由在发酵中采用的微生物产生的 物质，任选是分泌的。
[0145] 发酵肉汤从培养容器或发酵容器中取出，任选收集，并用于制备液体或固体形式 的含有氨基酸或酮酸的产物。为此，也使用"获得含有精细化学物的产物"这样的说法。在最 简单的情况中，从发酵容器中取出的含有精细化学物的发酵肉汤自身就是获得的产物。
[0146]通过选自如下的一或多种措施，实现从发酵肉汤中浓缩或纯化希望的有机化学化 合物：
[0147] a)部分（>0% 至〈80%)至完全（100%)或几乎完全（28 0%、290%、295%、2 96%、2 97%、2 98%、2 99%)除去水，
[0148] b)部分（>0% 至〈80%)至完全（100%)或几乎完全（280%、290%、295%、2 96%、2 97%、2 98%、2 99%)除去生物量，其任选在除去前被失活，
[0149] c)部分（>0% 至〈80%)至完全（100%)或几乎完全（280%、290%、295%、2 96%、2 97%、2 98%、2 99%、2 99.3%、2 99.7%)除去在发酵期间形成的有机副产物，及
[0150] d)部分（>0%)至完全（100%)或几乎完全（2 80%、2 90%、2 95%、2 96%、2 97%、2 98%、2 99%、2 99.3%、2 99.7%)除去采用的发酵培养基或原料的组成成分，这 些成分在发酵期间未被消耗。
[0151]以此方式，分离具有希望的化合物含量的产物。
[0152] 部分（>0%至〈80%)至完全（100%)或几乎完全U 80%至〈100%)除去水（措施 a))也被称作干燥。
[0153] 在所述方法的一种变化中，希望的有机化学化合物、优选L-氨基酸的纯的U 80% 重量，2 90%重量)或者高纯度的（2 95%重量，2 97%重量，2 99%重量)产物形式是通过 完全或几乎完全除去水、生物量、有机副产物及采用的发酵培养基的未消耗的成分而获得 的。对于措施a)、b)、c)或d)，现有领域有许多可用的技术指导。
[0154]在使用棒杆菌属细菌生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮氨酸或者α-酮酸 酮异戊酸、酮甲基戊酸或酮异己酸的方法的情况中，优选其中获得不含有发酵肉汤组成成 分的产物的那些方法。这些产物特别用于人类医药、制药工业和食品工业。
[0155]本发明的方法用于发酵生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮氨酸或者α-酮 酸酮异戊酸、酮甲基戊酸或酮异己酸。
[0156]本发明最后涉及本发明的微生物发酵生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮 氨酸或者α_酮酸酮异戊酸、酮甲基戊酸或酮异己酸的应用。
[0157] 本发明在下文借助于举例的实施方案更详细地描述。
[0158] 实施例1:置换构建体pK18mobsacB_PprpD2_ilvB的克隆
[0159] 从Life Technologies GmbH公司（Darmstadt，Germany)的谷氨酸棒杆菌 ATCC14067的基因组序列开始，合成一个大小为1390bp的DNA片段(Seq ID N0:5)，其由如下 成分组成：
[0160] · ilvB上游的同源DNA区域
[0161] ?来自谷氨酸棒杆菌ATCC14067的PprpD2启动子
[0162] ?来自谷氨酸棒杆菌ATCC14067的gap基因的核糖体结合位点
[0163] · ilvB基因的同源区，其携带代替GTG起始密码子的ATG起始密码子。
[0164] 利用末端导入的裂解位点EcoRI和Hindlll，通过使用两种限制酶各自裂解以克隆 所述片段，随后连接在使用EcoRI和Hindlll相似裂解的载体pK18m〇bsaCB中。该质粒命名为 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB。其使得可以产生其中ilvB基因的天然启动子缺失并由可诱导 的启动子PprpD2置换的突变体。在此，天然起始密码子(GTG)另外由核糖体优选的起始密码 子ATG置换。
[0165] 实施例2:置换构建体pK18mobsacB_ilvN(M13)的构建
[0166] 从Life Technologies GmbH公司（Darmstadt，Germany)的谷氨酸棒杆菌 八丁0：14067的基因组序列开始，合成一个大小为1421&?的0嫩片段（5叫10勵 ：14)，其包含 ilvB基因的一部分、ilvB基因与ilvN基因之间的基因间区域，以及ilvN基因的一部分。在 此，i 1 vN基因中的天然序列"GGAATCATT"（ i 1 vN的基因起点下游的+58至+66bp，基因起点定 义为+1)被转变为"GATGACTTT"。因此，IlvN蛋白的氨基酸序列在位置20、21和22由Gly(20)、 Ile(21)、Ile(22)改变为 Asp(20)、Asp(21)、Phe(22)。
[0167] 利用末端导入的裂解位点EcoRI和Hindlll，通过使用两种限制酶各自裂解以连接 所述片段，随后连接在使用EcoRI和Hindlll相似裂解的载体pK18m〇bsaCB中。该质粒命名为 pK18mobsacB_ilvN(M13)。其使得可以产生其中天然基因序列GGAATCATT(ilvN的基因起点 下游+58至+66bp，基因起点定义为+1)被改变为GATGACTTT的突变体。
[0168] 实施例3:突变体谷氨酸棒杆菌ATCC14067_PprpD2-ilvBN、谷氨酸棒杆菌 ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN 和谷氨酸棒杆菌 VPS_PprpD2-ilvBN 的构建
[0169] 通过根据Liebl et al · (FEMS Microbiology Letters 65，299-304( 1989))方案 的电穿孔方法将实施例1中所述的载体pK18mobsacB_PprpD2-i 1 vB转移至菌株谷氨酸棒杆 菌ATCC14067及缬氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ilvN(M13)(见实施例4)及谷氨酸 棒杆菌缴氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌VPS中。载体pK18mobsacB或pKlSmobsacE^PprpDS-ilvB 在谷氨酸棒杆菌 ATCC14067、谷氨酸棒杆菌 ATCC14067_ilvN(M13) 和谷氨酸棒杆菌 VPS 中不能单独复制，而且仅在其由于重组的结果而整合进染色体中时保留在细胞中。含有整 合的口1(181]1(^83〇13_?口印02_;[1￥13的克隆的选择通过在1^琼脂上铺板接合混合物 (conjugation batch)而进行（Sambrook et al. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Habor，New ￥<^1<:，1989)，所述1^琼脂中已经补加1511^/1卡 那霉素和50mg/ml萘啶酸。产生的克隆在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上划线并在33 °C保温16小时。对于其中由于二次重组事件的结果质粒已经被切除的突变体的选择，将克 隆在LB液体培养基中非选择性培养20小时，然后在含有10 %蔗糖的LB琼脂上划线，保温24 小时。
[0170] 质粒pK18mobsacB_PprpD2_ilvB以及起始质粒pK18mobsacB除了卡那霉素抗性基 因之外还含有编码枯草杆菌(Bacillus subtil is)果聚糖鹿糖酶的sacB基因的拷贝。可以 由蔗糖诱导的表达导致形成果聚糖蔗糖酶，其催化对于谷氨酸棒杆菌有毒性的产物果聚糖 的合成。在含有蔗糖的LB-琼脂上，仅那些其中整合的pK18m 〇bsaCB_PprpD2-ilVB已经被切 除的克隆生长。在切除的情况中，与质粒一起，ilvB基因的完全野生型拷贝包括野生型启动 子区域可被切除，或者含有PprpD2启动子的ilvB基因的重组拷贝被切除。
[0171]检测大约40-50个菌落的"在存在蔗糖条件下生长"及"在存在卡那霉素条件下不 生长"的表型。为了证实重组PprpD2-ilvB等位基因保留在染色体中，根据Innis等的标准 PCR方法，借助于聚合酶链反应研究大约20个含有"在存在蔗糖条件下生长"及"在存在卡那 霉素条件下不生长"的表型的菌落（PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)。由此，携带修饰的重组PprpD2_ilvB等位基因区域 的DNA片段从所述菌落的染色体DNA中扩增。选择如下引物寡核苷酸进行检验PCR。
[0172] 检测引物 1(SEQ ID N0:6)
[0173] 5'-AAA GCC TGC ATC GCG GAG AC-3'
[0174] 检测引物2(SEQ ID NO:7)
[0175] 5'-TGG TGA TGC CGC GGA TAT CG-3'
[0176] 所述引物使得可以扩增含有重组PprpD2-ilvBN基因座的克隆中大约880bp的DNA 片段。在含有野生型PilvBN-ilvBN基因座的克隆中，扩增大小约1136bp的DNA片段。
[0177] 扩增的DNA片段通过在0.8%浓度琼脂糖凝胶中电泳鉴别。因此可以示出菌株在染 色体上携带修饰的重组PPr PD2-ilvBN等位基因。菌株被命名为谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ PprpD2-i1vBN、ATCC14067_i1vN(Ml3)_PprpD2-i1vBN和VPS_PprpD2-i1vBN。
[0178] 实施例4:菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ilvN(M13)的构建
[0179] 将实施例2中所述的载体PK18mobsacB_ilvN(M13)通过与实施例3中所述方法相似 的电穿孔方法转移至菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067中。通过实施例3中所述的培养技术进行 克隆的选择。基于分离自20个克隆的染色体DNA进行阳性克隆的检测，使用检测引物3和4通 过聚合酶链反应扩增长度为947bp的产物，随后对PCR产物进行测序。
[0180] 检测引物3(SEQ ID N0:15)
[0181] 5'-CCC AGT AGT CAT CGA CTT C-3'
[0182] 检测引物4(SEQ ID N0:16)
[0183] 5'-CAG CGT CAG CAT CAT AAA GC-3'
[0184] 实施例5:谷氨酸棒杆菌ATCC14067_PprpD2-ilvBN产生L-缬氨酸的性能检测
[0185] 为了研究其产生L-缬氨酸的能力，将菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_PprpD2-ilvBN 的5个克隆及参考菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067在10ml检测培养基中在33°C预培养16小时。 对于生产检测，将l〇ml检测培养基用获得的预培养物接种，由此起始0D 6Q()(在600nm的光密 度)为0.1。在3个摇瓶中检测每个克隆，举例的菌株由总共15个摇瓶表示。
[0186] 检测培养基与Keilhauer等（Journal of Bacteriology( 1993) 175:5593-5603)中 描述的CgXII培养基相同，但是另外含有7.5g/l酵母提取物（Difco(Becton Dickinson GmbH)，Heidelberg)。检测培养基的成分在下表1中概括示出。诱导结I氨酸合成的检测培养 基另外含有浓度为〇. 6g/l (基于游离酸)的丙酸盐。
[0187] 表1 「01881
[0189] 培养在33°C在100ml摇瓶中以200rpm进行。摇瓶的位移是5cm。在24和48小时后，从 培养物中取样，确定葡萄糖含量和L-缬氨酸含量的光密度，将细胞短暂离心（台式离心机型 号5415D(Eppendorf)，在 13000rpm室温离心 10分钟）。
[0190] 使用GENios微滴定平板光度计（TeCan，Reading UK)在660nm波长确定光密度。在 测量之前将样品用去矿物质水1:100稀释。
[0191] 使用偶联酶检测(己糖激酶/葡萄糖6-磷酸脱氢酶)通过NADH形成确定葡萄糖。
[0192] 通过反相HPLC(Lindroth et al ·，Analytical chemistry( 1979)51:1167-1174) 从培养上清中定量确定细胞外氨基酸浓度。使用带有荧光检测仪(G1321A)的HPLC仪器系列 HP1100 (Hewlett-Packard，Waldbronn，Germa ny);系统控制和数据分析使用HP Chem-Station(Hewlett-Packard)进行。将分析的ΙμL氨基酸溶液与自动化柱前衍生化mit 20μ1 邻苯二酸/2-疏基乙醇即用试剂(Pierce Europe BV，Oud-Bei jer land，Nether lands)混合。 在此获得的焚光硫代的异吲噪（Jones et al. Journal of Chromatography(1983)266: 471-482)通过组合的柱前(40x4mm Hypersil 0DS 5)和主柱(Hypersil 0DS 5,两个柱得自 CS-Chromatographie Service GmbH公司，Langerwehe，Germany)使用增加的非极性相（甲 醇)梯度程序进行分离。极性洗脱液是乙酸钠(〇. 1M; pH7.2);流速为0.8ml/分钟。衍生的氨 基酸的荧光检测在激发波长230nm及发射波长450nm进行。缬氨酸浓度通过与外在标准比较 而计算。
[0193] 对于计算产率，将形成的L-缬氨酸的量除以消耗的葡萄糖的量。
[0194] 结果在表2中呈现，示出举例的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_PprpD2-i 1 vBN在培 养基中存在丙酸盐条件下显著分泌缬氨酸，而没有丙酸盐则与对照菌株谷氨酸棒杆菌 ATCC14067无不同，后者在任何条件下均不显著产生缬氨酸。
[0195] 表2:在培养基中无丙酸(表2A)或者在培养基中具有0.6g/l丙酸(表2B)条件下保 温24小时后L-缬氨酸形成。缩写：:ATCC 14067_PprpD2-ilvBN; std. dev.:标准误差。
[0196] 表2A:无丙酸的结果
[0197]
[0198] 表2B:具有丙酸的结果
[0199]
[0200] 实施例6:使用谷氨酸棒杆菌缬氨酸生产菌株的性能检测
[0201] 与实施例5相似，在摇瓶系统中研究菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ilvN(M13)_ PprpD2_i 1 vBN 和谷氨酸棒杆菌 VPS_PprpD2_i 1 vBN。
[0202] 为了研究其产生L-缬氨酸的能力，将在10ml检测培养基(表3)中的菌株谷氨酸棒 杆菌ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN及作为参考菌株的谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ ilvN(M13)，或者菌株谷氨酸棒杆菌VPS_PprpD2-ilvBN及作为参考菌株的谷氨酸棒杆菌 VPS，在33°C预培养16小时。对于生产检测，将每10ml检测培养基接种获得的预培养物，由此 起始0D6QQ(在600nm的光密度)为0.1。每个克隆在三个摇瓶中检测，由此举例的菌株总共15 个摇瓶。
[0203] 表3:SK1039用作检测培养基 [0204]
[0205] 诱导缬氨酸合成的检测培养基另外含有浓度为0.6g/l的丙酸盐(基于游离酸）。
[0206] 培养条件及生物量、葡萄糖和缬氨酸浓度的确定与实施例5所述相似地进行。
[0207] 结果见表4,示出缬氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2- ilvBN和VPS_PprpD2-ilvBN在培养基中存在丙酸盐的条件下与未修饰的起始菌株谷氨酸棒 杆菌ATCC14067_ilvN(M13)和谷氨酸棒杆菌VPS相比相对于采用的碳源具有更高的缬氨酸 比产率。
[0208]表4:在培养基中无丙酸(表4A)及在培养基中具有0.6g/l丙酸(表4B)的条件下保 温24小时的L-缬氨酸产率;缩写:std. dev .=标准误差 [0209]表4A:无丙酸的结果
[0210]
[0211]表4B:具有丙酸的结果
[0212]
[0213] 实施例7:菌株VPS_PprpD2-ilvBN和VPS的缬氨酸稳定性检测
[0214]稳定性检测在l〇ml液体培养物中进行(如实施例6所述）。
[0215] 菌株 VPS 和 VPS_PprpD2-i 1 vBN 的预培养
[0216] 将在100ml摇瓶(具有挡板）中的10ml液体培养物接种50μ1每种甘油连续培养物并 保温22小时（33°C，200rpm，5cm振幅） 。
[0217]测量培养物的光密度，并将1.5ml的培养物用甘油（10%甘油终浓度)处理，作为冷 冻培养物在_80°C在螺旋盖容器中冷冻。
[0218] 将一个新的10ml液体培养物接种50μ1该培养物，将其在33°C再振荡保温22小时。
[0219] 再重复两次这个程序，由此每个甘油培养物均总共在四次连续液体培养中培养。 每次培养相应于大约8个细胞世代。在液体培养中四次传代因此相应于总共超过30(ca.32) 个细胞世代。
[0220] 菌株 VPS 和 VPS_PprpD2-ilvBN 的主培养
[0221 ]将每个连续培养或低温培养的摇瓶培养物接种10ml的每种液体培养基，起始0D为 0.1。将该培养物随后保温24小时。每个培养均一式两份确定进行。在保温结束时（24小时 后），取样分析光密度、缬氨酸效价及剩余的糖浓度。如实施例5所述进行分析。
[0222]性能检测的结果(表5)示出经每次传代，菌株VPS的缬氨酸效价（以相对变化百分 比表示）、缬氨酸/生物量比率（以缬氨酸/0D表示)和产率（以形成的产物g/消耗的底物g表 示)变得不良或降低。这证明突变在群体中建立，其对于产物形成是负面的，对于生物量形 成是正面的。在两个培养阶段后（15.6代），菌株VPS已经示出在检测培养中的性能数据降低 (主培养结果）。因此，在4阶段过程中（3个培养阶段+1个生产阶段），预期性能数据(效价、产 率、生物量特异性产物形成）显著降低。然而，对于本发明菌株VPS_PprpD2-i ΙνΒΝ，未见到这 个负面影响，甚至经过四个培养阶段超过30代也未见到。与此相反，生物量特异性缬氨酸形 成(缬氨酸/OD)甚至略为增加。因此，模拟由三个培养阶段和一个主培养阶段组成的至少4 阶段生产过程或者甚至超出了要求。
[0223]表5:稳定性检测的性能数据(在保温24小时后L-缬氨酸产率，生物量特异性产物 形成(缬氨酸/0D)及与对照组（=0)相比作为额外的细胞世代函数的缬氨酸形成的相对变 化(平均值)）
[0224]
[0225] 图 1:质粒 pK18mobsacB_PprpD2_ilvB 图
[0226] 使用的缩写和名称具有如下含义：
[0227] 〇riV:pMBl 的 ColEl-样起点
[0228] sacB:编码蛋白质果聚糖鹿糖酶的sacB基因
[0229] RP4mob:RP4 移动位点
[0230] Kan:卡那霉素抗性基因
[0231] PprpD2:丙酸盐可诱导启动子
[0232] ' ilvB:ilvB基因的5'区
[0233] HindIII:HindIII限制酶的裂解位点
[0234] EcoRI :EcoRI限制酶的裂解位点
【主权项】
1. 通过在培养基中发酵棒杆菌属微生物生产选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的 L-氨基酸或者选自α-酮异戊酸、α-酮-甲基戊酸和α-酮异己酸的α-酮酸的方法，所述微生物 含有可复制形式具有操纵基因活性的多核苷酸，所述多核苷酸的序列与SEQIDNO: 1、2或3 的位置1-121所示序列至少85%相同，其被激活物PrpR所结合并且功能上在所述多核苷酸 下游在3'末端是具有启动子活性的第二个多核苷酸以及编码乙酰乳酸合酶亚基的基因 ilvB和ilvN，并且所述多核苷酸作为添加激活物PrpR的函数调苄基因ilvBN的转录，其中在 无诱导物的第一阶段(生长期)之后，在第二阶段向所述培养基中加入丙酸盐或者2-甲基柠 檬酸盐作为诱导物，由此在希望的L-氨基酸或α-酮酸富集在培养基和/或细胞中的条件下 合成希望的L-氨基酸或α-酮酸。2. 权利要求1的方法，特征在于具有操纵基因活性的多核苷酸包含这样的多核苷酸（IR 1)，其序列与SEQIDN0:l、2或3的位置22-49所示序列至少90%、优选至少92%、94%或 96%、特别优选100%相同，以及还包含这样的多核苷酸（IR2)，其序列与SEQIDNO: 1、2或 3的位置77-105所示序列至少90%、优选至少92%、94%或96%、特别优选100%相同，具有 操纵基因活性的多核苷酸优选是具有与SEQIDNO: 1、2或3的位置1-121所示序列至少 90%、92%、94%或96%、特别优选100%相同的序列的多核苷酸。3. 权利要求1或2的方法，特征在于具有启动子活性的多核苷酸是具有与SEQIDN0:4 的位置122-206所示序列至少90%、92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别 优选100%相同的序列的多核苷酸。4. 前述任一项权利要求的方法，特征在于ilvB基因是编码如下多肽的多核苷酸，所述 多肽序列与SEQIDN0:9的序列至少90%、92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或 99%、特别优选100%相同，并且ilvN基因是编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽序列与SEQ IDNO: 10的序列至少90%、92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别优选 100%相同。5. 前述任一项权利要求的方法，特征在于采用这样的微生物，其中希望的L-氨基酸或 α-酮酸的生物合成途径的额外的其它酶是增加的，特别是过表达的，和/或其中降低希望的 L-氨基酸或α-酮酸形成的代谢途径至少被部分弱化。6. 前述任一项权利要求的方法，特征在于合成L-缬氨酸。7. 前述任一项权利要求的方法，特征在于在培养阶段采用的棒杆菌传代至少16代、优 选至少24代，发酵优选包含至少四个阶段，优选由摇瓶、预接种发酵罐、种子发酵罐和生产 发酵罐组成。8. 具有操纵基因活性的多核苷酸、优选与基因上游的启动子组合在调节编码乙酰乳酸 合酶的ilvBN基因表达中的应用，所述多核苷酸序列与SEQIDNO: 1、2或3的位置1-121所示 序列至少85%相同。9. 表达盒，其包含序列与SEQIDNO: 1、2或3的位置1-121所示序列至少85%相同的具 有操纵基因活性的多核苷酸，优选具有与SEQIDN0:4的位置122-206所示序列至少90%相 同的序列的下游启动子，以及编码乙酰乳酸合酶的基因ilvBN。10. 载体，其含有前述权利要求的表达盒。11. 权利要求9的表达盒或者权利要求10的载体用于在微生物、优选棒杆菌属中表达 ilvBN基因中的应用。 12 ·微生物，优选棒杆菌属，特别优选谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum)， 其含有可复制形式的权利要求9的表达盒或者权利要求10的载体。13. 权利要求12的微生物，特征在于所述表达盒已经整合进微生物的染色体中。14. 前述任一项权利要求的微生物，特征在于其生产选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮 氨酸、优选L-缬氨酸的L-氨基酸，或者生产选自酮异戊酸、酮甲基戊酸和酮异己酸的α-酮 酸。15. 权利要求14的微生物，特征在于其生产L-缬氨酸，及优选L-缬氨酸的生物合成途径 的额外的其它酶以增加的形式存在，特别是过表达的，和/或其中降低L-缬氨酸形成的代谢 途径至少被部分弱化。
【专利摘要】本发明涉及一种使用微生物生产氨基酸和酮酸的方法，在所述微生物中，由丙酸盐可诱导的启动子使得可以调节某些基因的表达。
【IPC分类】C12P13/06, C12P7/40, C12N15/63, C12P13/08, C12N15/77, C12N9/10
【公开号】CN105492616
【申请号】CN201480043905
【发明人】R·格斯特迈尔, H·拉莫斯-维拉, K·马林
【申请人】赢创德固赛有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年5月23日
【公告号】EP2811028A1, US20160115506, WO2014195154A1
【专利说明】使用含有可通过丙酸盐诱导的M vbn操纵子的重组棒杆菌生 产L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲 基戊酸或α-酮异己酸的方法
[0001] 本发明涉及一种使用微生物生产氨基酸及酮酸的方法，其中通过丙酸盐可诱导的 启动子使得某些基因可以受调节的表达。 现有技术
[0002] 氨基酸和酮酸用于人体医药、制药工业、化妆品、食品工业和动物营养。
[0003]许多这些化合物是通过棒状细菌菌株特别是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)发酵产生的。由于其重要性，改良生产方法的研究在持续进行。方法改良可包 括发酵技术措施例如搅拌或氧供给，或者营养培养基的成分，例如在发酵期间的糖浓度，或 者产物形式的加工，例如离子交换层析，或者微生物自身的固有生产特征。
[0004] 为了改良这些微生物的生产特征，使用诱变、选择和突变体选择的方法。以此方 式，获得对于抗代谢物例如缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸或者亮氨酸类似物4-氮亮氨酸或者 5，5，5-三氟亮氨酸有抗性的菌株，所述菌株产生化学化合物，例如L-氨基酸L-缬氨酸或者 L-亮氨酸。
[0005] 一些年来，重组DNA技术的方法已经同样用于L-氨基酸生产菌株谷氨酸棒杆菌的 菌株改良，例如增加或弱化各个氨基酸生物合成基因，例如在生产过程中也进行基因表达 的时序调节，以及研究对于化学化合物生产的影响。
[0006] 谷氨酸棒杆菌的生物学、遗传学和生物技术的概述见于"Handbook of Corynebacterium glutamicum"（Eds·:L·Eggeling and M.Bott,CRC Press ,Taylor& Francis，2005)、Journal of Biotechnology(Chief Editor:A.Piihler)特别出版的题目为 "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology"（Journal of Biotechnology 104/1-3,（2003))的出版物以及T.Scheper所著（Managing Editor) "Microbial Production of L-Amino Acids"（Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79，Springer Verlag,Berlin,Germany,2003)〇
[0007] 谷氛酸棒杆菌基因组的核昔酸序列在Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99_109(2003))、ΕΡ1108790和Kalinowski et al.(Journal of Biotechnology 104/1-3，（2003))中描述。
[0008] 谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列同样可以从美国国家医学图书馆的国家生物 技术信息中心（NCBI)数据库（86也68(^，]\?)，1]54)、日本0嫩数据库（008几]^811丨11^，如口311)或 者欧洲分子生物学实验室的核苷酸序列数据库(EMBL, Heidelberg, Germany和Cambridge, UK)获得。
[0009] 总的来说，基因的表达有两种可能性。在持续表达中，基因通过组成型启动子持续 表达，并且相应的蛋白质聚集在细胞中。
[0010] 另一方面，可诱导启动子用于诱导表达。靶基因的表达可以通过诱导物诱导。如果 (过)表达对于生产生物体具有负面作用，则使用这种方法。导致这种情况的原因可能是在 生长期间代谢来源的高荷载。结果是生长减慢及因此延长生物反应器的运行时间及与之相 关的在工业生产中的成本增加。诱导的表达在细胞毒性产物的情况中也是有益的。在此，在 诱导表达后发生细胞的自体中毒和死亡。针对生产方法的经济性，因此尝试将该方法再分 为生长期和生产期。在生长期，产生尽可能大量的生物量，然后在生产期通过启动子诱导产 生靶蛋白质。以此方式，可以获得最大产率，从而该方法成为明显更经济的。
[0011 ] 对于可调节的大肠杆菌(Escherichia coli)启动子lac、APL和trp，已经示出其可 以用于棒状细菌中调节各个基因的表达（Tsuchiya and Morinaga，Bio/Technology 6 (1988)428-431)。
[0012] 可诱导启动子的理想情况是棒状细菌启动子，其由易于获得的非昂贵的物质调 To
[0013] EP 0530765 Bl(Kyowa Hakko)描述了使用棒杆菌的可诱导启动子-在此是异柠檬 酸裂合酶基因的可诱导启动子-以产生酶如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和ICL以及生 理学活性蛋白质，如胰岛素或者α-、β_或λ-干扰素。只要培养基中存在不同于糖的碳源(C 源），这种启动子即可导致基因表达;在存在糖的情况下其被抑制。然而，由于在一般的发酵 培养基中使用糖作为C源，因此有用的是获得可调节启动子，所述启动子即使在存在糖的条 件下使用非昂贵的诱导物也导致基因表达。
[0014] DE 4440118 C1(如US 5965391，FZ Jiilich)保护了来自棒杆菌的可诱导启动子-在此是苹果酸合酶基因 aceB的可诱导启动子-生产蛋白质的用途;在此诱导物是碳源乳酸 盐、丙酮酸盐或乙酸盐。
[0015] Plassmeier等（Journal of Biotechnology 159/1-2(2012))描述了谷氨酸棒杆 菌的prpDBC2操纵子的启动子，其基因是在作为主要C源的丙酸盐上生长所必需的，并且编 码酶2-甲基柠檬酸脱水酶(PrpD2)、2-甲基异柠檬酸裂合酶(PrpB2)及2-甲基柠檬酸合酶 (PrpC2)。启动子测试载体构建体的分析可以鉴别prpDBC2操纵子上长度为121个碱基对的 操纵子区，其是通过激活物PrpR经丙酸盐诱导的转录所必需的。EMSA研究示出2-甲基柠檬 酸盐可能发挥作为PrpR的共激活物的功能。
[0016] 发明目的
[0017]本发明基于如下目的，即生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮氨酸、优选L-缬氨酸，或者生产α_酮酸α-酮异戊酸，α-酮甲基戊酸或者α-酮异己酸的新方法，所述方法具 有优选改良的产率和/或细胞内和/或在培养基中更高的产物终浓度。在此，应优选存在比 产率(spezifischen Ausbeute)的改良（即相对于采用的碳源的希望的产物产率）。
[0018] 所述新方法应优选可以不依赖于培养基的主要碳源而调节L-氨基酸和/或α-酮酸 的产生。
[0019] 在新方法中，如果可能，则不希望的副产物的形成、特别是不希望的副产物丙氨酸 的形成应还优选被抑制，因为副产物的分离是非常费力及高成本的，并且对于肉汤的产物 纯度和碳产率具有负面作用。
[0020] 使用的方法应还优选导致用于生产的菌株的遗传稳定性增加，及因此在发酵过程 (培养阶段和主发酵罐)中可以产生大量世代而不降低输出数据。
[0021] 发明描述
[0022]本发明的目的通过使用激活物PrpR结合的操纵基因调苄基因 ilvBN的表达而实 现。
[0023] ilvBN(EC No.4.1.3.18)是编码乙酰乳酸合酶的亚基的基因。
[0024]本发明的目的因此是通过棒杆菌属(Corynebacterium)微生物发酵生产L-氨基酸 或者α-酮酸的方法，所述L-氨基酸选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，优选L-缬氨酸， 所述α-酮酸选自酮异戊酸、酮甲基戊酸和酮异己酸，所述微生物含有可复制形式的具有操 纵基因活性的多核苷酸，所述多核苷酸序列与SEQ ID Ν0:1、2或3所示序列的位置1-121的 序列至少85 %、优选至少90 %、92 %、94%或96 %、特别是至少97 %、98 %或99 %、特别优选 100%相同，激活物PrpR与所述多核苷酸结合，并且功能上在所述多核苷酸的下游在3'末端 是具有启动子活性的第二个多核苷酸，以及编码乙酰乳酸合酶亚基的基因 ilvB和ilvN，并 且所述多核苷酸随着添加激活物PrpR而调苄基因 ilvBN的转录，所述激活物PrpR由培养基 中的共激活物2-甲基柠檬酸盐激活，在无诱导物的第一阶段之后，在随后的第二阶段向培 养基中加入丙酸盐或者2-甲基柠檬酸盐作为诱导物，由此ilvBN基因表达及因此在希望的 L-氨基酸或α-酮酸富集在培养基或细胞中的条件下合成希望的L-氨基酸或α-酮酸。
[0025]具有操纵基因活性的多核苷酸优选是在棒状细菌中天然调节2-甲基柠檬酸脱水 酶表达的操纵基因，或者衍生自这种操纵基因的多核苷酸。
[0026]具有操纵基因活性的多核苷酸优选包含这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID Ν0:11 所示序列或者与SEQ ID N0:l、2或3所示序列的位置22-49的序列(在下文也称作"IR Γ)至 少90%、优选至少92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同，以及 还包含这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID Ν0:12所示序列或者与SEQ ID Ν0:1、2或3所示序 列的位置77-105的序列（在下文称作"IR 2"）至少90%、优选至少92%、94%或96%、特别至 少97%、98%或99%、特别优选100%相同。在优选的实施方案中，序列"IR Γ位于具有操纵 基因活性的多核苷酸的位置22-49,在优选的实施方案中序列"IR 2"位于位置77-105。 [0027]在本发明的优选实施方案中，具有操纵基因活性的多核苷酸是较长的多核苷酸的 一部分，所述较长的多核苷酸优选与SEQ ID N0:1、2或3的位置1-177的序列具有至少90%、 优选至少92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别优选100%的序列相同性。 [0028] 基因 ilvB优选是编码具有与SEQ ID N0:9的氨基酸序列具有至少90%、优选至少 92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同性的氨基酸序列的多肽 的多核苷酸。
[0029]特别优选这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID N0:8的位置499-2379的序列是至少 90%、优选至少92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同的。 [0030] 基因 ilvN优选是编码具有与SEQ ID N0:10的氨基酸序列具有至少90%、优选至少 92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同性的氨基酸序列的多肽 的多核苷酸。
[0031]特别优选这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID N0:8的位置2393-2911的序列至少 90%、优选至少92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别优选100%相同。 [0032]由基因 ilvB和ilvN编码的多肽聚集在一起产生功能性乙酰乳酸合酶。
[0033]丙酸盐或丙酸优选用于诱导表达。在这方面，发生"丙酸盐诱导"。丙酸盐在体外被 转变为实际的共激活物2-甲基柠檬酸盐。或者，2-甲基柠檬酸盐也可以直接用于诱导，但是 由于其较低的可用性而不太优选。根据本发明，术语"丙酸盐诱导"也包括用2-甲基柠檬酸 盐诱导。
[0034] 在生产完成后，优选分离希望的L-氨基酸或α_酮酸，发酵肉汤的其它成分和/或生 物量任选以其全部或部分(>〇至100%)保留在分离的产物中或者被完全除去。
[0035] 在本发明的方法中，首先发生生物量的无诱导培养阶段(生长期，第一阶段）。在这 个阶段，优选没有或者几乎没有任何氨基酸或酮酸形成(<5g/l)。在随后的生产阶段(诱导 期，第二阶段），通过丙酸盐或2-甲基柠檬酸盐诱导生物合成基因 ilvBN而诱导生产。培养阶 段包括所有培养步骤，从保留样品开始，通过优选应用摇瓶阶段直至优选应用培养发酵罐。 培养阶段也可以仍包括主发酵的第一阶段。优选地 ，培养阶段最晚在主发酵的头3-15个小 时、优选5-10小时之后完成。
[0036]诱导期优选包括在接种主发酵罐直至主发酵结束之后0-20小时的时间。在较早的 时间点-即在培养发酵罐中-诱导可以是有利的，并且是本发明方法的一个特定实施方案。
[0037] 在生产期精确调节/计量丙酸浓度是必需的，从而一方面保持氨基酸或酮酸合成 的诱导，另一方面防止丙酸盐或其降解中间产物（丙酰-CoA，2_甲基-柠檬酸盐）的毒性作 用。诱导期优选的丙酸浓度范围是〇.l-l〇g/l。丙酸可以丙酸补加形式连续加入或者在诱导 期间不同时间点以一或多个丙酸脉冲形式分批加入。单次剂量的丙酸作为主发酵培养基的 培养基成分也是可以的，并且是本发明方法的一个特定实施方案。
[0038] 生产氨基酸和酮酸的一大问题通常是副产物的形成。形成的副产物降低碳产率且 必须另外任选被分离，这是非常费力及高成本的。
[0039] 副产物的形成的一个实例是在缬氨酸生物合成中副产物丙氨酸的形成。在常规生 产方法中，丙氨酸的形成增加，其中通常根据细胞世代数发生组成型表达。
[0040] 在三阶段方法(摇瓶、培养发酵罐、主发酵罐）中，从保留样品直至收获生产发酵 罐，传代大约20-25代;在四阶段方法(摇瓶、预接种(PreSeed)发酵罐、培养发酵罐、主发酵 罐）中，传代甚至超过30代。在如此多的传代中，副产物形成和生物量形成通常相应大大增 加。
[0041] 然而，根据本发明，发现副产物形成和生物量形成显著降低。此外，发现在本发明 的生产方法中副产物形成和生物量形成不依赖于传代数。这提示本发明的方法管理导致采 用的菌株的遗传稳定性增加。因此，培养期原则上可以扩展为任何长度，这对于方法管理是 特别有利的。
[0042]本发明的一个特别优选的方法因此特征在于其包括至少四个阶段，即至少三个培 养期和一个生产期。在此，培养优选包括在摇瓶中、在预接种发酵罐以及在种子发酵罐中培 养。生产优选在生产发酵罐中进行。
[0043]本发明进一步优选的方法因此特征在于在培养期采用的细菌传代至少16代、优选 至少24代，和/或在整个发酵期间（包括培养和生产)传代至少25代、优选至少30代。
[0044]本发明还涉及激活物PrpR结合的具有操纵基因活性的多核苷酸的应用，该多核苷 酸具有与SEQ ID N0:l、2或3的位置 1-121 的序列至少85%、90%、92%、94%、96%、97%、 98%、99%或100%相同、优选至少97%、特别优选至少98%、特别优选至少99%及尤其优选 100 %相同的序列，以调苄基因 i 1 vBN的表达，优选组合该基因上游的启动子。
[0045]本发明还涉及包含具有操纵基因活性的多核苷酸、下游启动子和编码乙酰乳酸合 酶的基因 ilvBN的表达盒，所述多核苷酸的序列与SEQ ID N0:1、2或3的位置1-121的序列至 少85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%、99%或100%、优选至少97%、特别优选至少 98%、特别优选至少99 %及尤其优选100 %相同。
[0046] 具有操纵基因活性的多核苷酸优选总是具有如优选的前文强调的特征，特别是保 守区 "IR Γ 和 "IR 2"。
[0047] ilvBN基因上游的启动子或者操纵子下游的启动子可以是任何希望的启动子。
[0048] 优选可用于谷氨酸棒杆菌中的本发明的启动子的实例在例如Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3) ,311-323(2003))的综述文章的图 1 中描述。以相同 方式，可以米用由Vasicova et al(Journal of Bacteriology 181,6188-6191(1999))描 述的d a p A启动子的变体，如启动子A 2 5。此外，可以使用谷氨酸棒杆菌的g a p启动子（E P 06007373)。最后，可以使用由Amann et al. (Genes 69(2) ,301-315(1988))和Amann and Brosius(Genes 40(2-3)，183-190( 1985))描述的公知启动子T3、T7、SP6、M13、lac、tac和 trc〇
[0049] 在优选的实施方案中，根据本发明采用的启动子是具有启动子活性的多核苷酸， 其序列与SEQ ID N0:4的位置 122-206的序列至少90%、92%、94%、96%、97%、98%、99% 或100%、优选至少97%、特别优选至少98%、特别优选至少99%及尤其优选100%相同。
[0050] 本发明的表达盒优选是具有序列SEQ ID N0:13的表达盒。
[0051] 本发明的另一主题是含有本发明的表达盒的载体。
[0052] Kirchner and Tauch(Journal of Biotechnology 104:287-299(2003))描述了 优选用于谷氨酸棒杆菌中的载体的选择。
[0053]使用本发明载体的同源重组使得可以将染色体上DNA区段置换为本发明的表达 盒，其通过载体被转运至细胞中。对于载体的环形DNA分子与染色体上靶DNA之间的有效重 组，含有本发明表达盒的被置换的DNA区提供在具有与靶位点同源的核苷酸序列的末端，从 而载体的整合位点或者DNA的置换位点被限定。
[0054] 本发明表达盒的掺入可以发生在ilvBN基因、优选天然ilvBN基因的天然基因位 点，任选i ΙνΒΝ基因的天然启动子在此也由本发明的表达盒置换。
[0055] 或者，本发明的表达盒也可以整合进不具有编码功能的染色体的基因间区域中， 或者整合在另一基因位点，该另一基因位点优选是染色体上的不是细胞生长及氨基酸或酮 酸生产所必需的核苷酸序列。
[0056] 在优选的实施方案中，根据本发明，本发明的表达盒也可以以多个拷贝掺入染色 体中，及也任选在不同的基因位点掺入。
[0057]代替将本发明的表达盒掺入染色体中，另一选项是本发明采用的操纵基因也可以 掺入染色体中，组合在i 1 vBN基因天然基因位点的启动子，其中优选i 1 vBN基因的天然启动 子由操纵基因和启动子的构建体置换。
[0058]代替将本发明的表达盒掺入染色体中，另一选项是当然也可以采用含有本发明的 表达盒的染色体外复制载体。
[0059]本发明同样进一步涉及微生物，优选棒杆菌，特别是产生选自L-亮氨酸、L-缬氨酸 和L-异亮氨酸的L-氨基酸或者选自酮异戊酸、酮甲基戊酸和酮异己酸的α-酮酸的棒杆菌， 其含有本发明的表达盒和/或本发明的载体。
[0060]关于多核苷酸的生物化学和化学结构的详细描述，例如其在活生物体中例如在微 生物中的存在，可见于Berg等所著教科书"Biochemie"[Biochemistry](Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin,Germany,2003;ISBN 3-8274-1303-6)。
[0061] 如果多核苷酸由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶 (T)的脱氧核糖核苷酸单体组成，则论及的是脱氧核糖多核苷酸或者脱氧核糖核酸(DNA)。 如果多核苷酸由含有核碱基或碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)的核糖 核苷酸单体组成，则论及的是核糖多核苷酸或者核糖核酸(RNA)。在提及的多核苷酸中，单 体彼此通过3' -5磷酸二酯键共价连接。
[0062] "具有操纵基因活性的多核苷酸"或者"操纵基因"应理解为是指多核苷酸，优选脱 氧核糖多核苷酸或者核酸，优选脱氧核糖核酸(DNA)，其通过具有启动子活性的多核苷酸与 被转录的多核苷酸功能性连接，通过与各种调节蛋白（激活物或阻抑物，其随之与配体或效 应分子相互作用)相互作用启动或关闭这个多核苷酸的转录。
[0063] "具有启动子活性的多核苷酸"或者"启动子"是指多核苷酸、优选脱氧核糖多核苷 酸，或者核酸，优选脱氧核糖核酸(DNA)，其与被转录的多核苷酸功能性连接，限定这个多核 苷酸转录的起始点和起始频率，从而可以影响受控制的多核苷酸的表达水平。
[0064]基于DNA的双链结构，本发明也涉及与SEQ ID N0:1、2或3列出的序列的链互补的 链。
[0065] "转录"应理解为是指通过从DNA基体开始产生互补RNA分子的过程。蛋白质、如RNA 聚合酶、"Sigma因子"和转录调节蛋白参与这个过程。然后合成的RNA(信使RNA，m-RNA)作为 翻译过程中的基体，随后产生多肽或蛋白质。
[0066]从化学的观点来看，基因是多核苷酸。编码蛋白质/多肽的多核苷酸在此与术语 "基因"同义使用。因此，"基因"和"编码区"这两个术语同义使用，"蛋白质"和"多肽"这两个 术语也同义使用。
[0067] "功能性下游联接或连接"在此应理解为是指本发明的具有操纵基因活性的多核 苷酸与具有启动子活性的另一多核苷酸及进一步的寡核苷酸或多核苷酸的依次排列，导致 所述进一步的多核苷酸的转录。
[0068] 如果所述进一步的多核苷酸是编码多肽/蛋白质的多核苷酸，其由以起始密码子 开始、包含终止密码子及任选包含转录终止子的多肽编码区组成，则"功能性下游联接或连 接"是指导致所述进一步的多核苷酸转录及合成的RNA的翻译的顺序排列。
[0069] 所述进一步的多核苷酸编码一或多个多肽。编码蛋白质/多肽的多核苷酸基本上 由蛋白质编码序列的起始密码子及一或多个终止密码子组成，起始密码子选自ATG、GTG和 TTG，优选ATG或GTG，特别优选ATG，终止密码子选自TAA、TAG和TGA。
[0070] 如果所述进一步的多核苷酸编码许多蛋白质/多肽，核糖体结合位点可以位于每 个基因之前。在最后的基因之后任选是终止子。
[0071] 本发明的进一步的多核苷酸由基因 i 1 v B和i 1 v N组成，其编码乙酰乳酸合酶 (IlvBN，EC No. :4.1.3.18)的亚基。
[0072] 本发明进一步涉及本发明的表达盒或者本发明的载体在微生物中表达ilvBN基因 的应用。本发明的表达盒保证合成的RNA、优选mRNA的转录和翻译为多肽，即乙酰乳酸合酶 的两个亚基的转录和翻译。
[0073] 使用本发明的表达盒，基因 ilvBN在微生物中可以在希望的时间表达或过表达。
[0074] 过表达通常理解为是指与起始菌株(亲代菌株)或野生型菌株(如果是起始菌株） 相比，核糖核酸、蛋白质（多肽)或酶的细胞内浓度或活性增加。起始菌株(亲代菌株)理解为 是指对其进行导致过表达的措施的菌株。
[0075] 在过表达的情况中，优选重组过表达的方法。在这些方法中是组合所有方法，其中 微生物使用在体外制备的DNA分子产生。这种DNA分子包含例如启动子、表达盒、基因、等位 基因、编码区等。通过转化、缀合、转导或相似方法将这些转化为希望的微生物。
[0076] 通过使用本发明采用的操纵基因和/或使用本发明的表达盒的过表达措施，基于 在进行过表达措施之前的菌株中多肽的活性或浓度，乙酰乳酸合酶的活性或浓度一般优选 增加至少 10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400% 或者 500%，优选最大增 加至 1000%、2000%、4000%、10000%或20000%。
[0077] 表达或过表达的程度可以通过测量由基因转录的mRNA的量确定，通过确定多肽的 量及确定酶活性而确定。
[0078] 对于确定mRNA的量，可以使用"Northern印迹"和定量RT-PCR方法。在定量RT-PCR 中，聚合酶链反应之前是逆转录。对此，可以使用Roche Diagnostics公司的LightCycler? 系统（Boehringer Mannheim GmbH,Roche Molecular Biochemicals，Mannheim,Germany)， 例如在Jungwirth et al.(FEMS Microbiology Letters 281,190-197(2008) )中描述。凝 胶中蛋白质的浓度可以通过一维或二维蛋白质凝胶分离及随后的蛋白质浓度光学鉴别而 使用合适的分析软件确定。在棒状细菌情况中，制备蛋白质凝胶及鉴别蛋白质的常规方法 是由Hermann et al · (Electrophoresis，22:1712-23(2001))描述的方法。蛋白质浓度也可 以使用特异于待检测蛋白质的抗体通过Western印迹杂交方法确定（Sambrook et al.， Molecular cloning:a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)，随后使用合适的软件对浓度进行光学测定 (Lohaus and Meyer(1998)Biospektrum 5:32-39；Lottspeich,Angewandte Chemie 321: 2630-2647( 1999))。采集的数据的统计学意义通过T检验确定(Gosset ,Biometrika 6( 1): 1-25(1908))。
[0079] 使用本发明采用的操纵基因的ilvBN基因的过表达措施可以与其它过表达措施以 合适方式组合。
[0080] 为了实现过表达，在现有技术领域可利用多种方法。这些方法除了修饰管理或控 制基因表达的核苷酸序列之外，也包括增加拷贝数。
[0081] 拷贝数的增加可以通过在微生物的细胞质中复制的质粒进行。为此，在现有技术 中针对各种微生物描述了众多质粒，使用这些质粒可以调苄基因拷贝数的所需增加。对于 棒杆菌属的合适质粒在例如Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3)，27_40， (2003))或者在Stansen et al. (Applied and Environmental Microbiology 71,5920-5928(2005))中描述。
[0082] 拷贝数增加至少一个（1)拷贝可另外通过将进一步的拷贝插入微生物染色体中而 发生。对于棒杆菌属合适的方法在例如专利说明书W0 03/014330、W0 03/040373和W0 04/ 069996中描述。
[0083] 可进一步发生基因表达的增加，其中许多启动子位于希望的基因之前或者与待表 达的基因功能性连接，以此方式实现表达增加。这种方式例如在专利说明书W0 2006/ 069711中描述。
[0084] 延伸率(Geschwindigkeit der Elongation)受密码子使用的影响；通过使用通常 在起始菌株中发生的t(转移)RNA的密码子可以增加翻译。此外，起始密码子置换为在许多 微生物中最常发生(在大肠杆菌中为77%)的密码子ATG可以明显改良翻译，因为在RNA水 平，密码子AUG比例如密码子⑶G和UUG有效2-3倍(Khudyakov et al.，FEBS Letters 232 (2):369-71(1988)；Reddy et al. proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(17):5656-60(1985))。也可以优化起始密码子的序列环境，已经描述了起 始密码子与侧翼区之间的相互作用影响（Stenstrom et al.，Gene 273(2): 259-65(2001); Hui et al.,EMB0 Journal 3(3):623-9(1984))〇
[0085] DNA处理、DNA的消化和连接、转化体的转化和选择的说明见于已知的Sambrook等 的指南Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
[0086] 在本发明的一个优选实施方案中，使用这样的微生物，其中希望的L_氨基酸或a_ 酮酸的生物合成途径的其他基因另外以增加的形式存在，特别是过表达的。
[0087]对于L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲基戊酸或者α-酮异己酸的生 产，优选选自如下一组的编码L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α_酮异戊酸、α_酮-β_甲基戊酸或者α_ 酮异己酸的生物合成的酶的一或多个基因或多核苷酸可以另外过表达：
[0088] a)多核苷酸（ilvC基因），其编码异构还原酶（IlvC，EC No. :1.1.1.86)，
[0089] b)多核苷酸（ilvD基因），其编码二羟酸脱水酶（IlvD，EC No. :4·2·1·9)，
[0090] c)多核苷酸（ilvE基因），其编码转氨酶（IlvE，EC No. :2.6.1.42),
[0091] (1)多核苷酸（丨14基因），其编码苏氨酸脱水酶（114^1:4.3丄19)，
[0092] e)多核苷酸(hom基因），其编码高丝氨酸脱氢酶(Hom，EC No.:1.2.1.11)，
[0093] f)多核苷酸(thrB基因），其编码高丝氨酸激酶(ThrB，EC No. :2.7.1.39),
[0094] g)多核苷酸(thrC基因），其编码苏氨酸合酶(ThrC，EC No.:4.2.3.1)，
[0095] h)多核苷酸(leuA基因），其编码异丙基苹果酸合酶(LeuA，EC No. :2.3.3.13),
[0096] i)多核苷酸（leuB基因），其编码异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB，EC No. :1.1.1.85)，
[0097] j)多核苷酸（leuC基因），其编码异丙基苹果酸异构酶(LeuC，EC No· :4·2· 1 ·33)的 大亚基
[0098] k)多核苷酸（leuD基因），其编码异丙基苹果酸异构酶(LeuD，EC No· :4·2· 1 ·33)的 小亚基，
[00"] 对于异亮氨酸和缴氨酸，特别优选的是基因 hom、ilvA、ilvC、ilvD和ilvE，对于α- 酮异戊酸(KIV)和α-酮-β-甲基戊酸(KMV)，特别优选的是基因 ilvC和ilvD，对于α-酮异己酸 (KIC)，特别优选的是基因 ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC和leuD。
[0100]在一个优选的实施方案中，使用其中降低希望的L-氨基酸或a-酮酸形成的代谢途 径至少被部分弱化的微生物。
[0101]如果优选产生缬氨酸或酮异戊酸，则可以弱化异亮氨酸(对于前体酮丁酸的形 成：;11￥4、1:11沾、1:111^、11〇111)和/或亮氨酸（161^、161113、1611〇0)的代谢途径。如果优选产生异亮 氨酸或酮甲基戊酸，则可以弱化亮氨酸的生物合成途径。如果优选产生亮氨酸或酮异己酸， 则可以弱化异亮氨酸(或者前体酮丁酸)的生物合成途径。
[0102] 在本文中术语"弱化"描述了细菌中由合适的DNA编码的一或多种酶(蛋白质）的细 胞内活性的降低或关闭，通过例如使用弱启动子或使用编码具有低活性的合适的酶或失活 合适的基因或酶(蛋白质）的基因或等位基因或者任选组合这些措施。各个靶基因的完全或 部分弱化可以例如通过基因的完全或部分缺失或者通过在结构基因中或者在启动子区或 在核糖体结合位点中插入点突变而实现。特异性降低基因表达的另一方法是反义技术，其 中将合成较长反义RNA的短寡脱氧核苷酸或载体带入靶细胞中。反义RNA可以结合特异性 mRNA的互补区段并且降低其稳定性或者阻断可翻译性。本领域技术人员在Srivastava et al · (Applied Environmental Microbiology 20000ct;66(10) :4366-4371)中发现这样一 个实例。所述反义技术也可以通过使用本发明的操纵基因/启动子进行，其中在靶基因之后 以"反义"方向克隆。在加入诱导物丙酸盐之后，诱导被弱化的靶基因的互补链的mRNA形成。 通过将这种反义mRNA加入靶基因的mRNA，降低靶基因的表达。基因 i 1 vBN的调节表达或过表 达或者L-氨基酸或α_酮酸的调节产生优选在棒杆菌属微生物中进行。在棒杆菌属内，优选 的菌株是基于如下菌种的那些:有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)，典型菌株保藏 为DSM44549，谷氨酸棒杆菌，典型菌株保藏为ATCC13032，及产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)，典型菌株保藏为ATCC6871。非常特别优选谷氨酸棒杆菌。
[0103] 现有技术领域也已知其它名称的谷氨酸棒杆菌的一些代表性菌株。这些菌株包括 例如：菌株ATCC13870，其被命名为嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophilum)，菌株DSM20137,其被命名为百合棒状杆菌（Corynebacterium lilium)，菌株ATCC17965，其被命名为栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)，菌 株ATCC14067,其被命名为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，菌株ATCC13869,其被命 名为乳发酵短杆菌（1^'6￥；^&(^61'；[111111&(31:0€61'1116111：11111)，及菌株41'0(]14020，其被命名为双 歧杆菌（Brevibacterium divaricatum) 〇
[0104] 针对谷氨酸棒杆菌的术语"产谷氨酸小球菌(Micrococcus glutamicus)"同样常 见。有效棒杆菌菌种的一些代表性菌株在现有技术领域也被命名为热产氨棒杆菌 (Corynebacterium thermoaminogenes)，例如菌株FERM BP-1539。
[0105] 用于本发明措施中的微生物或菌株(起始菌株)优选已经具有将希望的L-氨基酸 或α-酮酸分泌进其周围的营养培养基中并在此积聚的能力。在下文中，术语"产生"也用于 此含义。特别地，本发明采用的菌株在诱导后优选具有在细胞或在营养培养基中富集或积 聚2 (至少)〇.5g/l*h、优选至少1.0或2.0g/l*h的希望的氨基酸的能力。起始菌株优选是已 经通过诱变和选择、通过重组DNA技术或者通过组合这两种方法产生的菌株。
[0106] 本领域技术人员可理解也可以获得适于本发明措施的微生物，首先在野生型菌株 如在谷氨酸棒杆菌典型菌株ATCC 13032或菌株ATCC 14067中采用根据本发明使用的操纵 基因以调节希望的基因的表达及随后通过现有技术领域描述的进一步的遗传学措施诱导 微生物产生氨基酸或酮酸。
[0107] 产生或分泌L-缬氨酸的棒状细菌的已知代表性菌株是例如：乳发酵短杆菌FERM BP-1763(在US5，188,948中描述） ；乳发酵短杆菌FERMBP-3007(在US5,521，074中描述）； 谷氨酸棒杆菌FERMBP-3006(在US5,521，074中描述）；及谷氨酸棒杆菌FERMBP-1764(在 US 5,188,948中描述）。
[0108] 产生L-缬氨酸的微生物典型具有反馈抗性或脱敏的乙酰乳酸合酶（AHAS，EC 4.1.3.18)。其代表合成异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸的平行代谢途径的第一种酶(Umbarger， H.E.1987,Biosynthesis of the branched-chain amino acids,pp.352-367,in F.C.Neidhardt,J.L. Ingraham,K.B. Low,B.Magasanik,M.Schaechter, and H.E.Umbarger (ed.),Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology,American Society for Microbiology,Washington,D.C·)。全酶总是由2个大亚 基和2个小亚基组成。大的AHAS亚基形成催化结构域，由i lvB编码;小亚基作为调节结构域， 由ilvN编码。应理解反馈抗性乙酰乳 酸合酶是指与野生形式(野生型)相比对支链氨基酸缬 氨酸、亮氨酸和异亮氨酸或其混合物的抑制具有更低的敏感性的乙酰乳酸合酶。在谷氨酸 棒杆菌物种的乙酰乳酸合酶的情况中，菌株ATCC13032、ATCC14067(也称作黄色短杆菌)或 ATCC13869(也称作乳发酵短杆菌)菌株是合适的野生型菌株。
[0109] 谷氨酸棒杆菌中编码乙酰乳酸合酶的基因 ilvBN在例如Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology 175(17) :5595-603(1993))或EP1108790中描述。登记号 L09232 (GenBank，NCBI)示出基因序列。
[0110] 不再由支链氨基酸(亮氨酸、缴氨酸、异亮氨酸)反馈抑制的AHAS的酶变体在例如 Mendel et al.(Journal of Molecular Biology 325,275-284(2003))NElisakova et al.(Applied and Environmental Microbiology 71，207-213(2005))、Wada et al. (Bioscience Biotechnology&Biochemistry，72(11)，2959-2965，（2008))及EP1491634中 描述。优选的是反馈抗性乙酰乳酸合酶的变体，其在由i 1 vN编码的小亚基中携带一或多个 选自如下的氨基酸置换:在氨基酸序列位置20由L-天冬氨酸代替甘氨酸，在氨基酸序列位 置21由L-天冬氨酸代替L-异亮氨酸，在氨基酸序列位置22由L-苯丙氨酸代替L-异亮氨酸， 在位置42是除了L-丙氨酸之外的每个蛋白质氨基酸、优选L-缬氨酸、L-异亮氨酸及L-亮氨 酸、特别优选L-缬氨酸，及任选在位置47由L-亮氨酸代替L-组氨酸(在DE 102011118019 A1 中描述）。
[0111] 已知的代表性的产生或分泌L-异亮氨酸的棒杆菌菌株是例如：黄色短杆菌FERM BP-760(在US 4,656,135中描述）；黄色短杆菌FERM BP-2215(在US 5,294,547中描述）；及 谷氨酸棒杆菌FERM BP-758(在US 4,656，135中描述）。
[0112] 分泌或产生α-酮酸的菌株基于例如:谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032;黄色短杆菌菌 株ATCC 14067;及乳发酵短杆菌菌株ATCC 13869。
[0113]本发明提供了生产L-氨基酸或α-酮酸的微生物，所述L-氨基酸选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，所述α-酮酸选自α-酮异戊酸、α-酮甲基戊酸和α-酮异己酸，通过使用 根据本发明的操纵基因，使得微生物可以或具有编码乙酰乳酸合酶的ilvBN基因的调节表 达。
[0114]此外，本发明提供了一种发酵产生L-氨基酸或α-酮酸的方法，所述L-氨基酸选自 L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，所述α-酮酸选自α-酮异戊酸、α-酮甲基戊酸和α-酮异己 酸，所述方法包括如下步骤：
[0115] a)在合适的培养基中培养本发明的微生物，获得发酵肉汤，及
[0116] b)富集来自a)的发酵肉汤中和/或微生物细胞中的L-氨基酸或α-酮酸。
[0117]优选L-氨基酸或α-酮酸或者含有L-氨基酸或α-酮酸的液体或固体产物得自含有 L-氨基酸或α-酮酸的发酵肉汤。
[0118] 产生的微生物可以连续培养，如WO 05/021772所述，或者在分批方法(分批培养或 分批处理)或者在补料分批方法(补料方法)或者重复补料分批方法(重复补料方法）中分批 培养，以产生希望的有机化学化合物。已知培养方法的概述在Chmi el教科书中 (Bioprozesstechnik 1,Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Technology 1, Introduction to Bioprocess Technology](Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))或者在 Storhas 的教科书中（Bioreaktoren and periphere Einrichtungen[Bioreactors and Peripheral Devices](Vieweg Verlag,Braunschweig/ Wiesbaden, 1994))可获得。
[0119] 使用的培养培养基或发酵培养基必须以合适方式符合相应菌株的要求。关于各种 微生物的培养培养基的描述包含在美国细菌学学会的手册"Manual of Methods for General Bacteriology"（Washington D.C. ,USA, 1981)中。术语培养培养基与发酵培养基 或者培养基可互换使用。
[0120] 使用的碳源可以是糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、来 自甜菜或甘蔗加工的含有蔗糖的溶液、淀粉、淀粉水解物和纤维素，油和脂肪如大豆油、葵 花油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油、甲醇和乙醇，以及有 机酸如乙酸或乳酸。
[0121] 使用的氮源可以是有机含氮化合物，如胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉 米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可 以单独使用或者作为混合物使用。
[0122] 使用的磷源可以是磷酸、磷酸铵、磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾，或者相应的含钠 盐。
[0123] 培养基必须进一步含有盐，例如金属如钠、钾、镁、钙和铁的氯化物形式或硫酸盐 形式，例如硫酸镁或硫酸铁，其是生长所必需的。最后，必需的生长物质如氨基酸如高丝氨 酸和维生素如硫胺素、生物素或泛酸可以另外用于上述物质中。
[0124] 丙酸盐优选作为盐加入培养基中，但是也可以作为丙酸加入。合适的丙酸盐是丙 酸镁、丙酸钠、丙酸钙、丙酸铵和丙酸钾。丙酸盐以游离酸或丙酸阴离子溶解存在于培养基 中。
[0125] 提及的原料可以单一批次或者在培养期间以合适方式加入培养物中。
[0126] 为了控制培养物的pH，合适地应用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨、氢氧化 铵或者氨水或者酸性化合物如磷酸或硫酸。pH通常调节为6.0-8.5，优选6.5-8。为了控制泡 沫发生，可以应用抗泡沫剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以在培养 基中加入合适的选择性作用物质如抗生素。发酵优选在有氧条件下进行。为了维持这些条 件，在培养物中加入氧或含氧气体混合物例如空气。也可以使用富含过氧化氢的液体。在限 氧条件下发酵是本发明的另一个特定实施方案。任选地，发酵在超压下进行，例如在0.03-0.2MPa超压下。培养温度通常为20°C_45°C，优选25°C_40°C，特别优选30° -37°C。在分批或 补料分批方法中，培养优选连续进行直至已经形成足以测量到获得希望的有机化学化合物 的量。这个目标通常在10小时至160小时内实现。在连续方法中，可以进行较长的培养时间。 由于微生物的活性，在发酵培养基和/或微生物细胞中富集(积聚)有机化学化合物。
[0127] 合适的发酵培养基例如见于专利说明书US 5,770,409、US 5,990,350、US 5,275， 940、W0 2007/012078、US 5,827,698、W0 2009/043803、US 5,756,345或者US 7,138,266。
[0128] 分析L-氨基酸以在发酵过程中一或多个时间确定其浓度可以通过分离L-氨基酸 进行，通过离子交换层析、优选阳离子交换层析及随后使用茚三酮的柱后衍生化进行，如在 Spackman et al. (Analytical Chemistry 30:1190-1206(1958))中描述。代替讳三酮，邻 苯二醛也可以用于柱后衍生化。关于离子交换层析的综述文章见于Pickering(LC · GC (Magazine of Chromatographic Science)7(6),484-487(1989))〇
[0129] 也可以例如使用邻苯二醛或异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化，及通过反向层析 (RPC)、优选高效液相层析(HPLC)形式分离所得氨基酸衍生物。这种方法在例如Lindroth et al.(Analytical Chemistry 51:1167-1174(1979))中描述。
[0130] 通过光度测定(吸光度、荧光)进行检测。
[0131 ] 关于氨基酸分析的综述见于例如教科书Bioanalytik"，Lottspeich and Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany 1998)。
[0132] 分析a-酮酸以在发酵过程中一或多个时间确定其浓度可以通过分离酮酸及其它 分泌产物而进行，通过在磺化苯乙烯/二乙烯苯聚合物上以H+形式进行离子交换层析、优选 阳离子交换层析，例如使用〇 · 025N硫酸及随后在215nm(或者在230或275nm)进行UV检测。优 选地，可以采用REZEX RFQ-Fast Fruit H+柱(Phenomenex);也可以使用针对分离相的其它 供应商(例如Aminex，BioRad)。相似的分离在供应商的合适应用实例中描述。
[0133] 分析丙酸以在发酵过程中一或多个时间确定其浓度可以通过HPLC分离有机酸而 实现。￥41?14~]^丨3〇3吐！1+300\7.8_45215(长度为300_，直径为7.8_)用作柱。硫酸和 乙腈的混合物(215ml的0.5M硫酸、50ml乙腈，用蒸馏水加至5L)作为洗脱液。0.005M硫酸作 为运行样品的溶剂。将无细胞运行样品以1:20稀释。
[0134] 分离参数如下:流速0.4ml/分钟;样品注射体积20μ1;温度35°C。在215nm通过UV进 行分光光度检测。丙酸的保持时间是30.258分钟。可测范围是0.09-7.514g/l。
[0135] 本发明的方法或发酵方法在关于如下的一或多个参数方面的性能与使用其中不 存在本发明的表达盒的微生物的方法或发酵方法相比优选增加至少0.5%、至少1%、至少 1.5%或者至少2%，所述参数选自：浓度(形成的化合物/体积）、产率(形成的化合物/消耗 的碳源）、形成物(形成的化合物/体积和时间）及特定形成物(形成的化合物/细胞干重或者 生物量干重和时间，或者形成的化合物/细胞蛋白质和时间）或者其它方法参数及其组合。 这在大规模生产中被认为是非常有价值的。
[0136] 通过发酵措施，获得发酵肉汤，其含有希望的氨基酸或酮酸。
[0137] 随后，进行液体或固体形式的含有氨基酸或酮酸的产物的制备或生产或提取。
[0138] 发酵肉汤应理解是指发酵培养基或营养培养基，其中微生物已经在一定温度培养 一定时间。发酵培养基或在发酵期间采用的培养基含有保证希望的化合物产生及典型复制 或存活的所有物质或成分。
[0139] 在发酵结束时，所得发酵肉汤因此含有：
[0140] a)由于微生物细胞复制的结果而形成的微生物的生物量(细胞群(Zellmasse))，
[0141] b)在发酵过程中形成的希望的氨基酸或酮酸，
[0142] c)在发酵过程中任选形成的有机副产物，及
[0143] d)在发酵期间未被消耗的所用发酵培养基或原料的组成成分，例如维生素如生物 素或盐如硫酸镁。
[0144] 有机副产物包括除了各自的希望的化合物之外由在发酵中采用的微生物产生的 物质，任选是分泌的。
[0145] 发酵肉汤从培养容器或发酵容器中取出，任选收集，并用于制备液体或固体形式 的含有氨基酸或酮酸的产物。为此，也使用"获得含有精细化学物的产物"这样的说法。在最 简单的情况中，从发酵容器中取出的含有精细化学物的发酵肉汤自身就是获得的产物。
[0146]通过选自如下的一或多种措施，实现从发酵肉汤中浓缩或纯化希望的有机化学化 合物：
[0147] a)部分（>0% 至〈80%)至完全（100%)或几乎完全（28 0%、290%、295%、2 96%、2 97%、2 98%、2 99%)除去水，
[0148] b)部分（>0% 至〈80%)至完全（100%)或几乎完全（280%、290%、295%、2 96%、2 97%、2 98%、2 99%)除去生物量，其任选在除去前被失活，
[0149] c)部分（>0% 至〈80%)至完全（100%)或几乎完全（280%、290%、295%、2 96%、2 97%、2 98%、2 99%、2 99.3%、2 99.7%)除去在发酵期间形成的有机副产物，及
[0150] d)部分（>0%)至完全（100%)或几乎完全（2 80%、2 90%、2 95%、2 96%、2 97%、2 98%、2 99%、2 99.3%、2 99.7%)除去采用的发酵培养基或原料的组成成分，这 些成分在发酵期间未被消耗。
[0151]以此方式，分离具有希望的化合物含量的产物。
[0152] 部分（>0%至〈80%)至完全（100%)或几乎完全U 80%至〈100%)除去水（措施 a))也被称作干燥。
[0153] 在所述方法的一种变化中，希望的有机化学化合物、优选L-氨基酸的纯的U 80% 重量，2 90%重量)或者高纯度的（2 95%重量，2 97%重量，2 99%重量)产物形式是通过 完全或几乎完全除去水、生物量、有机副产物及采用的发酵培养基的未消耗的成分而获得 的。对于措施a)、b)、c)或d)，现有领域有许多可用的技术指导。
[0154]在使用棒杆菌属细菌生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮氨酸或者α-酮酸 酮异戊酸、酮甲基戊酸或酮异己酸的方法的情况中，优选其中获得不含有发酵肉汤组成成 分的产物的那些方法。这些产物特别用于人类医药、制药工业和食品工业。
[0155]本发明的方法用于发酵生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮氨酸或者α-酮 酸酮异戊酸、酮甲基戊酸或酮异己酸。
[0156]本发明最后涉及本发明的微生物发酵生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮 氨酸或者α_酮酸酮异戊酸、酮甲基戊酸或酮异己酸的应用。
[0157] 本发明在下文借助于举例的实施方案更详细地描述。
[0158] 实施例1:置换构建体pK18mobsacB_PprpD2_ilvB的克隆
[0159] 从Life Technologies GmbH公司（Darmstadt，Germany)的谷氨酸棒杆菌 ATCC14067的基因组序列开始，合成一个大小为1390bp的DNA片段(Seq ID N0:5)，其由如下 成分组成：
[0160] · ilvB上游的同源DNA区域
[0161] ?来自谷氨酸棒杆菌ATCC14067的PprpD2启动子
[0162] ?来自谷氨酸棒杆菌ATCC14067的gap基因的核糖体结合位点
[0163] · ilvB基因的同源区，其携带代替GTG起始密码子的ATG起始密码子。
[0164] 利用末端导入的裂解位点EcoRI和Hindlll，通过使用两种限制酶各自裂解以克隆 所述片段，随后连接在使用EcoRI和Hindlll相似裂解的载体pK18m〇bsaCB中。该质粒命名为 pK18mobsacB_PprpD2-ilvB。其使得可以产生其中ilvB基因的天然启动子缺失并由可诱导 的启动子PprpD2置换的突变体。在此，天然起始密码子(GTG)另外由核糖体优选的起始密码 子ATG置换。
[0165] 实施例2:置换构建体pK18mobsacB_ilvN(M13)的构建
[0166] 从Life Technologies GmbH公司（Darmstadt，Germany)的谷氨酸棒杆菌 八丁0：14067的基因组序列开始，合成一个大小为1421&?的0嫩片段（5叫10勵 ：14)，其包含 ilvB基因的一部分、ilvB基因与ilvN基因之间的基因间区域，以及ilvN基因的一部分。在 此，i 1 vN基因中的天然序列"GGAATCATT"（ i 1 vN的基因起点下游的+58至+66bp，基因起点定 义为+1)被转变为"GATGACTTT"。因此，IlvN蛋白的氨基酸序列在位置20、21和22由Gly(20)、 Ile(21)、Ile(22)改变为 Asp(20)、Asp(21)、Phe(22)。
[0167] 利用末端导入的裂解位点EcoRI和Hindlll，通过使用两种限制酶各自裂解以连接 所述片段，随后连接在使用EcoRI和Hindlll相似裂解的载体pK18m〇bsaCB中。该质粒命名为 pK18mobsacB_ilvN(M13)。其使得可以产生其中天然基因序列GGAATCATT(ilvN的基因起点 下游+58至+66bp，基因起点定义为+1)被改变为GATGACTTT的突变体。
[0168] 实施例3:突变体谷氨酸棒杆菌ATCC14067_PprpD2-ilvBN、谷氨酸棒杆菌 ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN 和谷氨酸棒杆菌 VPS_PprpD2-ilvBN 的构建
[0169] 通过根据Liebl et al · (FEMS Microbiology Letters 65，299-304( 1989))方案 的电穿孔方法将实施例1中所述的载体pK18mobsacB_PprpD2-i 1 vB转移至菌株谷氨酸棒杆 菌ATCC14067及缬氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ilvN(M13)(见实施例4)及谷氨酸 棒杆菌缴氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌VPS中。载体pK18mobsacB或pKlSmobsacE^PprpDS-ilvB 在谷氨酸棒杆菌 ATCC14067、谷氨酸棒杆菌 ATCC14067_ilvN(M13) 和谷氨酸棒杆菌 VPS 中不能单独复制，而且仅在其由于重组的结果而整合进染色体中时保留在细胞中。含有整 合的口1(181]1(^83〇13_?口印02_;[1￥13的克隆的选择通过在1^琼脂上铺板接合混合物 (conjugation batch)而进行（Sambrook et al. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Habor，New ￥<^1<:，1989)，所述1^琼脂中已经补加1511^/1卡 那霉素和50mg/ml萘啶酸。产生的克隆在含有25mg/l卡那霉素的LB琼脂平板上划线并在33 °C保温16小时。对于其中由于二次重组事件的结果质粒已经被切除的突变体的选择，将克 隆在LB液体培养基中非选择性培养20小时，然后在含有10 %蔗糖的LB琼脂上划线，保温24 小时。
[0170] 质粒pK18mobsacB_PprpD2_ilvB以及起始质粒pK18mobsacB除了卡那霉素抗性基 因之外还含有编码枯草杆菌(Bacillus subtil is)果聚糖鹿糖酶的sacB基因的拷贝。可以 由蔗糖诱导的表达导致形成果聚糖蔗糖酶，其催化对于谷氨酸棒杆菌有毒性的产物果聚糖 的合成。在含有蔗糖的LB-琼脂上，仅那些其中整合的pK18m 〇bsaCB_PprpD2-ilVB已经被切 除的克隆生长。在切除的情况中，与质粒一起，ilvB基因的完全野生型拷贝包括野生型启动 子区域可被切除，或者含有PprpD2启动子的ilvB基因的重组拷贝被切除。
[0171]检测大约40-50个菌落的"在存在蔗糖条件下生长"及"在存在卡那霉素条件下不 生长"的表型。为了证实重组PprpD2-ilvB等位基因保留在染色体中，根据Innis等的标准 PCR方法，借助于聚合酶链反应研究大约20个含有"在存在蔗糖条件下生长"及"在存在卡那 霉素条件下不生长"的表型的菌落（PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，1990，Academic Press)。由此，携带修饰的重组PprpD2_ilvB等位基因区域 的DNA片段从所述菌落的染色体DNA中扩增。选择如下引物寡核苷酸进行检验PCR。
[0172] 检测引物 1(SEQ ID N0:6)
[0173] 5'-AAA GCC TGC ATC GCG GAG AC-3'
[0174] 检测引物2(SEQ ID NO:7)
[0175] 5'-TGG TGA TGC CGC GGA TAT CG-3'
[0176] 所述引物使得可以扩增含有重组PprpD2-ilvBN基因座的克隆中大约880bp的DNA 片段。在含有野生型PilvBN-ilvBN基因座的克隆中，扩增大小约1136bp的DNA片段。
[0177] 扩增的DNA片段通过在0.8%浓度琼脂糖凝胶中电泳鉴别。因此可以示出菌株在染 色体上携带修饰的重组PPr PD2-ilvBN等位基因。菌株被命名为谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ PprpD2-i1vBN、ATCC14067_i1vN(Ml3)_PprpD2-i1vBN和VPS_PprpD2-i1vBN。
[0178] 实施例4:菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ilvN(M13)的构建
[0179] 将实施例2中所述的载体PK18mobsacB_ilvN(M13)通过与实施例3中所述方法相似 的电穿孔方法转移至菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067中。通过实施例3中所述的培养技术进行 克隆的选择。基于分离自20个克隆的染色体DNA进行阳性克隆的检测，使用检测引物3和4通 过聚合酶链反应扩增长度为947bp的产物，随后对PCR产物进行测序。
[0180] 检测引物3(SEQ ID N0:15)
[0181] 5'-CCC AGT AGT CAT CGA CTT C-3'
[0182] 检测引物4(SEQ ID N0:16)
[0183] 5'-CAG CGT CAG CAT CAT AAA GC-3'
[0184] 实施例5:谷氨酸棒杆菌ATCC14067_PprpD2-ilvBN产生L-缬氨酸的性能检测
[0185] 为了研究其产生L-缬氨酸的能力，将菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_PprpD2-ilvBN 的5个克隆及参考菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067在10ml检测培养基中在33°C预培养16小时。 对于生产检测，将l〇ml检测培养基用获得的预培养物接种，由此起始0D 6Q()(在600nm的光密 度)为0.1。在3个摇瓶中检测每个克隆，举例的菌株由总共15个摇瓶表示。
[0186] 检测培养基与Keilhauer等（Journal of Bacteriology( 1993) 175:5593-5603)中 描述的CgXII培养基相同，但是另外含有7.5g/l酵母提取物（Difco(Becton Dickinson GmbH)，Heidelberg)。检测培养基的成分在下表1中概括示出。诱导结I氨酸合成的检测培养 基另外含有浓度为〇. 6g/l (基于游离酸)的丙酸盐。
[0187] 表1 「01881
[0189] 培养在33°C在100ml摇瓶中以200rpm进行。摇瓶的位移是5cm。在24和48小时后，从 培养物中取样，确定葡萄糖含量和L-缬氨酸含量的光密度，将细胞短暂离心（台式离心机型 号5415D(Eppendorf)，在 13000rpm室温离心 10分钟）。
[0190] 使用GENios微滴定平板光度计（TeCan，Reading UK)在660nm波长确定光密度。在 测量之前将样品用去矿物质水1:100稀释。
[0191] 使用偶联酶检测(己糖激酶/葡萄糖6-磷酸脱氢酶)通过NADH形成确定葡萄糖。
[0192] 通过反相HPLC(Lindroth et al ·，Analytical chemistry( 1979)51:1167-1174) 从培养上清中定量确定细胞外氨基酸浓度。使用带有荧光检测仪(G1321A)的HPLC仪器系列 HP1100 (Hewlett-Packard，Waldbronn，Germa ny);系统控制和数据分析使用HP Chem-Station(Hewlett-Packard)进行。将分析的ΙμL氨基酸溶液与自动化柱前衍生化mit 20μ1 邻苯二酸/2-疏基乙醇即用试剂(Pierce Europe BV，Oud-Bei jer land，Nether lands)混合。 在此获得的焚光硫代的异吲噪（Jones et al. Journal of Chromatography(1983)266: 471-482)通过组合的柱前(40x4mm Hypersil 0DS 5)和主柱(Hypersil 0DS 5,两个柱得自 CS-Chromatographie Service GmbH公司，Langerwehe，Germany)使用增加的非极性相（甲 醇)梯度程序进行分离。极性洗脱液是乙酸钠(〇. 1M; pH7.2);流速为0.8ml/分钟。衍生的氨 基酸的荧光检测在激发波长230nm及发射波长450nm进行。缬氨酸浓度通过与外在标准比较 而计算。
[0193] 对于计算产率，将形成的L-缬氨酸的量除以消耗的葡萄糖的量。
[0194] 结果在表2中呈现，示出举例的菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_PprpD2-i 1 vBN在培 养基中存在丙酸盐条件下显著分泌缬氨酸，而没有丙酸盐则与对照菌株谷氨酸棒杆菌 ATCC14067无不同，后者在任何条件下均不显著产生缬氨酸。
[0195] 表2:在培养基中无丙酸(表2A)或者在培养基中具有0.6g/l丙酸(表2B)条件下保 温24小时后L-缬氨酸形成。缩写：:ATCC 14067_PprpD2-ilvBN; std. dev.:标准误差。
[0196] 表2A:无丙酸的结果
[0197]
[0198] 表2B:具有丙酸的结果
[0199]
[0200] 实施例6:使用谷氨酸棒杆菌缬氨酸生产菌株的性能检测
[0201] 与实施例5相似，在摇瓶系统中研究菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ilvN(M13)_ PprpD2_i 1 vBN 和谷氨酸棒杆菌 VPS_PprpD2_i 1 vBN。
[0202] 为了研究其产生L-缬氨酸的能力，将在10ml检测培养基(表3)中的菌株谷氨酸棒 杆菌ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2-ilvBN及作为参考菌株的谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ ilvN(M13)，或者菌株谷氨酸棒杆菌VPS_PprpD2-ilvBN及作为参考菌株的谷氨酸棒杆菌 VPS，在33°C预培养16小时。对于生产检测，将每10ml检测培养基接种获得的预培养物，由此 起始0D6QQ(在600nm的光密度)为0.1。每个克隆在三个摇瓶中检测，由此举例的菌株总共15 个摇瓶。
[0203] 表3:SK1039用作检测培养基 [0204]
[0205] 诱导缬氨酸合成的检测培养基另外含有浓度为0.6g/l的丙酸盐(基于游离酸）。
[0206] 培养条件及生物量、葡萄糖和缬氨酸浓度的确定与实施例5所述相似地进行。
[0207] 结果见表4,示出缬氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14067_ilvN(M13)_PprpD2- ilvBN和VPS_PprpD2-ilvBN在培养基中存在丙酸盐的条件下与未修饰的起始菌株谷氨酸棒 杆菌ATCC14067_ilvN(M13)和谷氨酸棒杆菌VPS相比相对于采用的碳源具有更高的缬氨酸 比产率。
[0208]表4:在培养基中无丙酸(表4A)及在培养基中具有0.6g/l丙酸(表4B)的条件下保 温24小时的L-缬氨酸产率;缩写:std. dev .=标准误差 [0209]表4A:无丙酸的结果
[0210]
[0211]表4B:具有丙酸的结果
[0212]
[0213] 实施例7:菌株VPS_PprpD2-ilvBN和VPS的缬氨酸稳定性检测
[0214]稳定性检测在l〇ml液体培养物中进行(如实施例6所述）。
[0215] 菌株 VPS 和 VPS_PprpD2-i 1 vBN 的预培养
[0216] 将在100ml摇瓶(具有挡板）中的10ml液体培养物接种50μ1每种甘油连续培养物并 保温22小时（33°C，200rpm，5cm振幅） 。
[0217]测量培养物的光密度，并将1.5ml的培养物用甘油（10%甘油终浓度)处理，作为冷 冻培养物在_80°C在螺旋盖容器中冷冻。
[0218] 将一个新的10ml液体培养物接种50μ1该培养物，将其在33°C再振荡保温22小时。
[0219] 再重复两次这个程序，由此每个甘油培养物均总共在四次连续液体培养中培养。 每次培养相应于大约8个细胞世代。在液体培养中四次传代因此相应于总共超过30(ca.32) 个细胞世代。
[0220] 菌株 VPS 和 VPS_PprpD2-ilvBN 的主培养
[0221 ]将每个连续培养或低温培养的摇瓶培养物接种10ml的每种液体培养基，起始0D为 0.1。将该培养物随后保温24小时。每个培养均一式两份确定进行。在保温结束时（24小时 后），取样分析光密度、缬氨酸效价及剩余的糖浓度。如实施例5所述进行分析。
[0222]性能检测的结果(表5)示出经每次传代，菌株VPS的缬氨酸效价（以相对变化百分 比表示）、缬氨酸/生物量比率（以缬氨酸/0D表示)和产率（以形成的产物g/消耗的底物g表 示)变得不良或降低。这证明突变在群体中建立，其对于产物形成是负面的，对于生物量形 成是正面的。在两个培养阶段后（15.6代），菌株VPS已经示出在检测培养中的性能数据降低 (主培养结果）。因此，在4阶段过程中（3个培养阶段+1个生产阶段），预期性能数据(效价、产 率、生物量特异性产物形成）显著降低。然而，对于本发明菌株VPS_PprpD2-i ΙνΒΝ，未见到这 个负面影响，甚至经过四个培养阶段超过30代也未见到。与此相反，生物量特异性缬氨酸形 成(缬氨酸/OD)甚至略为增加。因此，模拟由三个培养阶段和一个主培养阶段组成的至少4 阶段生产过程或者甚至超出了要求。
[0223]表5:稳定性检测的性能数据(在保温24小时后L-缬氨酸产率，生物量特异性产物 形成(缬氨酸/0D)及与对照组（=0)相比作为额外的细胞世代函数的缬氨酸形成的相对变 化(平均值)）
[0224]
[0225] 图 1:质粒 pK18mobsacB_PprpD2_ilvB 图
[0226] 使用的缩写和名称具有如下含义：
[0227] 〇riV:pMBl 的 ColEl-样起点
[0228] sacB:编码蛋白质果聚糖鹿糖酶的sacB基因
[0229] RP4mob:RP4 移动位点
[0230] Kan:卡那霉素抗性基因
[0231] PprpD2:丙酸盐可诱导启动子
[0232] ' ilvB:ilvB基因的5'区
[0233] HindIII:HindIII限制酶的裂解位点
[0234] EcoRI :EcoRI限制酶的裂解位点
【主权项】
1. 通过在培养基中发酵棒杆菌属微生物生产选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的 L-氨基酸或者选自α-酮异戊酸、α-酮-甲基戊酸和α-酮异己酸的α-酮酸的方法，所述微生物 含有可复制形式具有操纵基因活性的多核苷酸，所述多核苷酸的序列与SEQIDNO: 1、2或3 的位置1-121所示序列至少85%相同，其被激活物PrpR所结合并且功能上在所述多核苷酸 下游在3'末端是具有启动子活性的第二个多核苷酸以及编码乙酰乳酸合酶亚基的基因 ilvB和ilvN，并且所述多核苷酸作为添加激活物PrpR的函数调苄基因ilvBN的转录，其中在 无诱导物的第一阶段(生长期)之后，在第二阶段向所述培养基中加入丙酸盐或者2-甲基柠 檬酸盐作为诱导物，由此在希望的L-氨基酸或α-酮酸富集在培养基和/或细胞中的条件下 合成希望的L-氨基酸或α-酮酸。2. 权利要求1的方法，特征在于具有操纵基因活性的多核苷酸包含这样的多核苷酸（IR 1)，其序列与SEQIDN0:l、2或3的位置22-49所示序列至少90%、优选至少92%、94%或 96%、特别优选100%相同，以及还包含这样的多核苷酸（IR2)，其序列与SEQIDNO: 1、2或 3的位置77-105所示序列至少90%、优选至少92%、94%或96%、特别优选100%相同，具有 操纵基因活性的多核苷酸优选是具有与SEQIDNO: 1、2或3的位置1-121所示序列至少 90%、92%、94%或96%、特别优选100%相同的序列的多核苷酸。3. 权利要求1或2的方法，特征在于具有启动子活性的多核苷酸是具有与SEQIDN0:4 的位置122-206所示序列至少90%、92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别 优选100%相同的序列的多核苷酸。4. 前述任一项权利要求的方法，特征在于ilvB基因是编码如下多肽的多核苷酸，所述 多肽序列与SEQIDN0:9的序列至少90%、92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或 99%、特别优选100%相同，并且ilvN基因是编码如下多肽的多核苷酸，所述多肽序列与SEQ IDNO: 10的序列至少90%、92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别优选 100%相同。5. 前述任一项权利要求的方法，特征在于采用这样的微生物，其中希望的L-氨基酸或 α-酮酸的生物合成途径的额外的其它酶是增加的，特别是过表达的，和/或其中降低希望的 L-氨基酸或α-酮酸形成的代谢途径至少被部分弱化。6. 前述任一项权利要求的方法，特征在于合成L-缬氨酸。7. 前述任一项权利要求的方法，特征在于在培养阶段采用的棒杆菌传代至少16代、优 选至少24代，发酵优选包含至少四个阶段，优选由摇瓶、预接种发酵罐、种子发酵罐和生产 发酵罐组成。8. 具有操纵基因活性的多核苷酸、优选与基因上游的启动子组合在调节编码乙酰乳酸 合酶的ilvBN基因表达中的应用，所述多核苷酸序列与SEQIDNO: 1、2或3的位置1-121所示 序列至少85%相同。9. 表达盒，其包含序列与SEQIDNO: 1、2或3的位置1-121所示序列至少85%相同的具 有操纵基因活性的多核苷酸，优选具有与SEQIDN0:4的位置122-206所示序列至少90%相 同的序列的下游启动子，以及编码乙酰乳酸合酶的基因ilvBN。10. 载体，其含有前述权利要求的表达盒。11. 权利要求9的表达盒或者权利要求10的载体用于在微生物、优选棒杆菌属中表达 ilvBN基因中的应用。 12 ·微生物，优选棒杆菌属，特别优选谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum)， 其含有可复制形式的权利要求9的表达盒或者权利要求10的载体。13. 权利要求12的微生物，特征在于所述表达盒已经整合进微生物的染色体中。14. 前述任一项权利要求的微生物，特征在于其生产选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮 氨酸、优选L-缬氨酸的L-氨基酸，或者生产选自酮异戊酸、酮甲基戊酸和酮异己酸的α-酮 酸。15. 权利要求14的微生物，特征在于其生产L-缬氨酸，及优选L-缬氨酸的生物合成途径 的额外的其它酶以增加的形式存在，特别是过表达的，和/或其中降低L-缬氨酸形成的代谢 途径至少被部分弱化。
【专利摘要】本发明涉及一种使用微生物生产氨基酸和酮酸的方法，在所述微生物中，由丙酸盐可诱导的启动子使得可以调节某些基因的表达。
【IPC分类】C12P13/06, C12P7/40, C12N15/63, C12P13/08, C12N15/77, C12N9/10
【公开号】CN105492616
【申请号】CN201480043905
【发明人】R·格斯特迈尔, H·拉莫斯-维拉, K·马林
【申请人】赢创德固赛有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年5月23日
【公告号】EP2811028A1, US20160115506, WO2014195154A1
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