内切葡聚糖酶诱导的纤维素寡聚物生产的制作方法
内切葡聚糖酶诱导的纤维素寡聚物生产的制作方法
【专利说明】内切葡聚糖酶诱导的纤维素寡聚物生产
[0001] 本发明涉及使用内切葡聚糖酶生产纤维素寡聚物(纤维素寡聚物)的方法，并且涉 及所生产的寡聚物在多种技术领域中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 纤维素是地球上最丰富的聚合物[Pinkert，Marshet等人·Chemical Reviews，109 (12): 6712-6728，2009];其以木质纤维素的形式出现在植物细胞壁中[Teeri，T. T.，Trends in Biotechnology，15(5): 160-167,1997]。植物的初生细胞壁和次生细胞壁包含10至90% 的木质纤维素纤维[取；1161^.1，厶11861116；[116 1111(11]1〇161〇11&代13〇七&1111<：，第1卷.1'11161116， Stuttgart ,2008]。在植物细胞壁中，纤维素与木质素和半纤维素一起形成纤维素原纤维。 在纤维素原纤维内部存在结晶核心，该结晶核心由30至100个彼此平行排列的纤维素分子 组成。纤维素是植物细胞壁的结构单元，并负责稳定性和拉伸强度，但同时也负责柔性。
[0004] 与糖和淀粉形成对照，纤维素不是与人体营养相关的食物，并据此是用于材料和 产生能量的伦理可再生原料。
[0005] 对纤维素寡聚物的生产和它们的潜在用途知之甚少。对食品和洗涤剂的添加将是 可行的。由于纤维素寡聚物中有大量的羟基，后者可以在许多位点进行衍生化，由此它们的 性质可以以靶向的方式进行改性。近年来，关于多步骤转化纤维素为生物燃料的大量研究 已经发表[Hahn-Haegerdal 等人，Trends in Biotechnology ,24(12) :549-556,2006， Jorgensen等人，2007，Waltz 2008]，这是因为对可再生能源的寻找推动了该领域中的研 究。
[0006] 在2008年已经报道了使用离子液体中的固体催化剂用于纤维素的水解[Rinaldi 等人，Angewandte Chemie-International Edit ion ,47(42): 8047-8050，2008]。然而，在纤 维素解聚的过程中，可能会生成葡萄糖降解产物，如羟甲基糠醛、甲酸和可能对纤维素寡聚 物的用途产生不利影响的其它产物[Rinaldi等人.Chemsuschem，3(2) :266-276,2010]。糖 在离子液体中的良好溶解性使糖的提取和离子液体的循环利用变得复杂[Rinaldi等人， Angewandte Chemie-International Edition ,47(42): 8047-8050，2008]。如果反应过早终 止，可以在1 . 5小时的反应时间之后以90 %的产率制备具有大约30DP的纤维素寡聚物 [Rinaldi等人，Angewandte Chemie-International Edition,47(42) :8047-8050,2008] 〇
[0007] 因此，本发明的目的是提供一种方法，在该方法帮助下可以提供纤维素寡聚物，但 是，并没有已知制备方法的缺点。
[0008] 发明概述
[0009] 根据本发明，提供了新颖的和令人惊奇的有利的方法过程，其借助于内切葡聚糖 酶来生产不溶性纤维素寡聚物。根据本发明的方法特别显示了关于生产这样的寡聚物的优 点，该寡聚物具有限定的链长度和不溶性纤维素寡聚物的窄链长分布，产生的可溶性糖少， 并且实现了接近水中溶解性极限的纤维素寡聚物链长。
[0010] 由于纤维素是水不溶性的，因此部分结晶的生物聚合物难以在水性介质中酶促水 解[Dadi 等人，Biotechno logy and Bioengineering ,95(5): 904-10，2006]，特别合适的，可 以进行额外的预处理，例如借助于离子液体。特别地，使用可商购的纯化的内切葡聚糖酶来 水解纤维素，如，尤其是来自黑曲霉(4.111861')、解淀粉芽孢杆菌(13.311171〇119116€3(^6118)、 海栖热袍菌(T · mar i t ima)的内切葡聚糖酶。
【附图说明】
[0011]图1&至16示出借助于内切葡聚糖酶酶促水解4"(^1过程中随着时间的0?,和0? 11， 前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲霉，b)解淀粉芽孢杆菌，c)海栖热袍菌，d)长枝木霉 (T. longibrachiatum)和e)愛默生踝节菌（T. emersonii)。
[0012] 图2a至2e示出了借助于内切葡聚糖酶酶促水解α-纤维素过程中随着时间的DPw和 DPn，前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲霉，b)解淀粉芽孢杆菌，c)海栖热袍菌，d)长枝木霉和e) 爱默生踝节菌。
[0013] 图3a至3e示出了借助于内切葡聚糖酶酶促水解Sigmacell过程中随着时间的聚合 度DPjPDPn，前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲霉，b)解淀粉芽孢杆菌，c)海栖热袍菌，d)长枝木 霉和e)爱默生踝节菌。
[0014] 图4a至4c示出了，用离子液体(IL Restart)中间处理之后借助于内切葡聚糖酶的 两步酶促水解Avi ce 1过程中随着时间的聚合度DP4PDPn，前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲霉， b)解淀粉芽孢杆菌和c)海栖热袍菌。
[0015] 图5a至5c示出了，用离子液体(IL Restart)中间处理之后借助于内切葡聚糖酶的 两步酶促水解α_纤维素过程中随着时间的聚合度DPW和DP n，前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲 霉，b)解淀粉芽孢杆菌和c)海栖热袍菌。
[0016] 本发明的详细描述
[0017] 1. -般定义
[0018] "DPn值"指的是寡聚物或聚合物的基于数字的聚合度，或数均链长。
[0019] "DPw值"指的是寡聚物或聚合物的基于重量的聚合度，或链长。
[0020] "DPn值"和"DPw值"根据本发明通过实验来确定，特别是在标准条件下使用凝胶渗 透色谱(GPC)来确定，该标准条件在实验部分中进行更详细地描述(流动相，运行温度，流 速，柱材料)。
[0021] "链长分布"和"摩尔质量分布"分别指的是通过GPC确定的链长和摩尔质量的频率 分布。数均摩尔质量Mn和重均摩尔质量Mw可以用来定量描述链长或摩尔质量分布的范围。 [0022]多分散性被定义为Mw与Mn之比，并且为1或大于1。多分散性越低，摩尔质量分布越 窄。
[0023]在本发明的上下文中，"纤维素"应在广义上理解为低木质素和基本上无半纤维素 的纤维素材料的领域，从纸浆到纯的纤维素。既可以采用纯的产品，也可以采用纤维素物 质混合物，只要它们不会对酶反应造成实质性的负面影响即可。纤维素可以是完全非结晶 的或者完全结晶的或者表现出平均程度的结晶度(Crl%)，这可以通过已知测定方法(例如 X射线衍射)来测定。所用纤维素的"DPn值"例如可以在大约30至150的范围。"DPw值"例如可 以在120至500的范围。
[0024] "纤维素寡聚物"是由多个β-1，4_糖苷连接的葡萄糖单元组成的、DPn值范围为10 至70的寡聚物。
[0025]内切葡聚糖酶(E.C. 3.2.1.4)是在纤维素分子内进行随机切割的酶。它们攻击纤 维素的非晶形区。随机链切割产生两条纤维素链，在大多数情况下它们具有不同的长度。这 导致DPw迅速减小，并且导致还原末端增加[Lynd等人，Microbiology and Molecular Biology Reviews,66(3):506-577，2002]。
[0026] 一个内切葡聚糖酶活性单位被定义为在40°C和4.5或6的pH时每分钟从羧甲基纤 维素生成lmmol葡萄糖当量的还原糖所需的酶量。
[0027] β_葡糖苷酶(E. C. 3.2.1.21，或β-l，6_糖苷酶)是作用于两个葡萄糖或取代的葡萄 糖分子之间的m-Μ键的葡糖苷酶。它是外切纤维素酶(exocellulase)，对许多β-D-糖苷底 物都具有特异性。它催化β-D-葡萄糖苷中的非还原末端残基的水解，并释放葡萄糖。
[0028] 解淀粉芽孢杆菌是革兰氏阳性的杆状细菌，其由J.Fukomoto于1943年发现 [FukomotoJ.，J.Agric.Chem.S0C.Jpn.，19;487-503;1943]。仅在1987年，一组科学家对其 表征，并宣布其为独立物种[Priest 等人.International Journal of Systematic Bacteriology，37( 1):69-71，1987]。解淀粉芽孢杆菌是从土壤中分离得到的，其具有0· 7μπι 至0.9μπι X 1.8μπι至3 . Ομπι的尺寸。其细胞表现出周生的鞭毛，可以移动，并形成链。最适温度 在30°C和40°C之间。在低于 15°C时生长停止[Priest等人，International Journal of Systematic Bacteriology ,37(1) :69-71，1987]。从解淀粉芽孢杆菌制成的淀粉酶是工业 上用于淀粉水解的酶。在美国典型培养物保藏中心，解淀粉芽孢杆菌的编号为23350。
[0029] 黑曲霉是需氧生长的丝状真菌[Schuster等人.Applied Microbiology and Biotechnology，59(4-5) :426-435,2002]。在自然界中，黑曲霉被发现于土壤、垃圾、堆肥和 腐烂植物材料中。黑曲霉生长在6°C至47°C的温度和1.4至9.8的pH范围内[Reiss，J.， Schimmelpilze Lebensweise，Nutzen，Schaden，Bekaempfung. Springer，1986]。它产生分 散在空气中的黑色遮蔽的分生孢子。在工业上，黑曲霉主要用于生产柠檬酸和葡萄糖酸 [Roukas,T.,Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,25(6):298-304,2000]。
[0030] 海栖热袍菌是杆状的、革兰氏阴性的、严格厌氧的细菌，其具有自由的外层细胞 膜。1986年，海栖热袍菌由R.Huber在意大利火山中发现。这种细菌的最适生长温度为80°C。 在55°C以下不发生增长。海栖热袍菌长度为1.5μπι至Ι?μπι，宽度为0.6μπι。它表现出近极的单 鞭毛，因此可以自由移动[Huber等人，Archives of Microbiology, 144(4):324-333, 1986]。海栖热袍菌在简单的和复杂的碳水化合物上生长，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、纤维素和 木聚糖[Nelson，K.E.等人，Nature,399(6734) :323-329,1999]〇
[0031 ] 愛默生踝节菌属于发菌科(Trichocomaceae)，该科属于子囊菌门（Ascomycota)， 其由Stolk于 1965年发现[Stolk，A.C.等人，Journal of Microbiology and Serology,31 (3):262，1965]。目前的名字是 Rasamsonia emersoni i [Houbraken,Spierenburg, Frisvad.Antonie van Leeuwenhoek,101(2):403-21,2012]〇
[0032] 长枝木霉属于肉座菌科(Hypocreaceae)。该科属于子囊菌门（Ascomycota)。长枝 木霉由Rifai于 1969年发现[Rifai ,Μ·Α· ,Mycological Paters No · 116 ,Commonwealth Mycological Institute, 1969]。该物种已经成为许多研究的目标[Bissett ,J. ,Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,62(5):924-931,1984；J., Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,69(11):2357-2372, 1991；J.,Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,69(11):2373- 2417,1991；J.,Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,69(ll): 2418-2420,1991]〇
[0033] 2.本发明的特别实施方案：
[0034] 本发明特别涉及以下实施方案：
[0035] 1.用于生产纤维素寡聚物的方法，其中
[0036] a)在水性反应介质中，使用至少一种内切葡聚糖酶(EG)(E.C.3.2.1.4)特别是微 生物的EG，诸如，举例来说，来自细菌或真菌的EG，水解切割纤维素或纤维质起始材料，以及
[0037] b)从反应介质中分离反应产物，该反应产物包含一种或多种纤维素寡聚物，即，纤 维素寡聚物部分。
[0038] 2.根据实施方案1的方法，其中所形成的（一种或多种)纤维素寡聚物具有范围为 10至100的数均链长或数均聚合度DPn。
[0039] 3.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所形成（的一种或多种)纤维素寡聚物 具有在从15至50的范围中的DPn值，如，举例来说，20至45，25至40，或30至35。
[0040] 根据本发明生产的纤维素寡聚物的链长分布例如可以在从5至500，10至4000，15 至300,20至2000,或25至150的范围中，但并不限于此。
[0041] 4.根据前述实施方案中任一项的方法，其中EG是天然的或重组产生的，任选是来 自芽孢杆菌属、曲霉属或热袍菌属的微生物，特别是物种解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉或海栖热 袍菌的遗传修饰的酶，或这些天然或重组的酶中至少两种的组合。
[0042] 5.根据前述实施方案中任一项的方法，其中酶促水解在水性介质中在大约3至8， 特别是4至7或5至6的范围中的pH和/或在从20至90°C，特别是从30至80°C或从40至70°C的 范围中的温度和/或在0.1至100小时，特别是1至72小时或1至48小时的持续时间中进行。 [0043] 6.根据前述实施方案中任一项的方法，其中至少一种EG以大约0.01至100U/ml， 如，举例来说，1至50，1.5至30，或2至10U/ml反应混合物的浓度应用。
[0044] 7.根据前述实施方案中任一项的方法，其中以基于反应混合物的总体积从0.1至5 或从1至4或从2至3% (w/v)的范围中的浓度采用纤维素。
[0045] 8.根据前述实施方案中任一项的方法，其中纤维素
[0046] al)经历预处理步骤，通过该步骤，纤维素的结晶度降低，以及
[0047] a2)使用EG对步骤al)的纤维素进行酶促水解。
[0048] 9.根据实施方案8的方法，其中，使用离子液体、酸和/或机械能量输入通过步骤 al)中的处理而降低纤维素的结晶度。
[0049] 10.根据实施方案9的方法，其中所述离子液体选自在温度100°C以下为液体的盐， 如，特别是，1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐(EM頂Ac)和3-甲基-N-丁基氯化吡啶（[C4mpy]Cl)。
[0050] 11.根据实施方案10的方法，其中，在步骤al)中，将纤维素引入离子液体中，在其 中溶解，任选在热作用下，如，举例来说，20至80°C，25至60°C或30至50°C并随后通过添加 水、有机溶剂或它们的混合物而沉淀，将沉淀分离出来，任选洗涤并且任选去除液体。
[0051] 12.根据实施方案9所述的方法，其中，在步骤al)中，用浓磷酸进行酸处理。
[0052] 13.根据实施方案9所述的方法，其中，在步骤al)中，用球磨机进行机械处理，例如 使用1mm玻璃珠，和/或，瓦特数在大约200至600或300至500或大约400W的范围中。
[0053] 14.根据前述实施方案中任一项的方法，其中，在分离反应产物之前，重复一次或 多于一次处理步骤，特别是步骤al)和a2)。
[0054] 15.根据前述实施方案之一的方法，其中，在β-葡糖苷酶的存在下额外地进行反 应。
[0055] 16.通过根据前述实施方案中任一项的方法生产的纤维素寡聚物的用途，作为食 品和饲料、化妆品或药品的添加剂，作为洗涤剂添加剂，作为流变学改性剂，以及作为有机 合成的起始材料。
[0056] 3.本发明的另外的配置
[0057] 3.1酶一一可以使用的内切葡聚糖酶
[0058] 本发明不限于具体公开的或使用的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质或酶，而是还 延伸到它们的功能等同物。
[0059] 从文献中已知的，根据本发明所使用的酶的氨基酸序列的非限制性实例在下文中 指明。
[0060] 海栖热袍菌：（SEQ ID Ν0:1)
[0061] Nelson K · E ·等人，''Evidence for lateral gene transfer between Archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima·〃Nature399:323-329 (1999)
[0062] Uniprot:Q9X274
[0064] 黑曲霉：（SEQ ID N0:2)
[0065] van Peij N.N.等人，〃The transcriptional activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene expression in Aspergillus niger , Appl.Environ.Microbiol.64:3615-3619(1998)
[0066] Uniprot:074705
[0067]
[0068] 解淀粉芽孢杆菌(SEQ ID NO:3):
[0069] Zhang G.等人/'Complete Genome Sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208, a Strain for Industrial Production of Guanos ine and Ribavirin, J.Bacteriol.193:3142-3143(2011)
[0070] Uniprot:F4E3N1
[0071]
[0072] 根据本发明具体使用或本文所描述的酶的"功能等同物"或类似物是这样的多肽， 其在本发明范围内不同于所述酶，但是其保留所期望的生物学活性，如，举例来说，内切葡 聚糖酶活性。
[0073] 因此，例如，"功能等同物"应理解为意指这样的酶，其在所使用的内切葡聚糖酶活 性测定中，具有高于或低于包含本文所定义的氨基酸序列的酶至少10%或20%，如，举例来 说，至少50 %或75 %或90 %的活性。此外，功能等同物优选在pH 2至11之间稳定，并且有利 地具有在从pH 3至10的范围中的最适pH，以及在从25°C至95°C或20°C至70°C的范围中的最 适温度，如，举例来说，大约45至60°C或大约50至55°C。
[0074] 内切葡聚糖酶活性可以借助于多种已知测定来检测。不施加任何限制，可以提及 在40°C和pH为4.5或6的标准条件下使用参考底物(如，举例来说，羧甲基纤维素)的测定。
[0075] 根据本发明，"功能等同物"也可以特别理解为意指这样的"突变体"，其在上述氨 基酸序列的至少一个序列位置具有与具体提到的氨基酸不同的氨基酸，同时保持上述生物 学活性之一。因此，"功能等同物"包括通过一个或多个氨基酸添加、取代、删除和/或倒置可 获得的突变体，上述修改可以发生在任何序列位置处，只要其导致具有根据本发明的性质 谱的突变体即可。功能等同还特别存在于当突变体和未修饰的多肽之间的反应性模式在性 质方面一致的时候，即，当相同底物以不同的速率转化的时候。合适的氨基酸取代的实例收 集在下表中：
[0076]
[0077]
[0078]上述意义中的"功能等同物"还是所描述的多肽的"前体"，以及多肽的"功能衍生 物"和"盐"。
[0079] 在本文中，"前体"是具有或不具有所期望的生物活性的多肽的天然或合成的前 体。
[0080] 术语"盐"应理解为不仅意指羧基的盐，还意指根据本发明的蛋白质分子的氨基的 酸加成盐。羧基的盐可以以本身已知的方式制备，并且包括无机盐，如，举例来说，钠，钙， 铵，铁和锌盐，以及与有机碱的盐，如，举例来说，胺，如三乙醇胺，精氨酸，赖氨酸，哌啶等。 酸加成盐，如，举例来说，与矿物酸如盐酸或硫酸的盐，以及与有机酸如乙酸或草酸的盐，同 样是本发明的主题。
[0081] 类似地，可以借助于已知技术在功能氨基酸侧基或在其N-或C-末端上制备根据本 发明的多肽的"功能衍生物"。这样的衍生物包括，例如，羧酸基团的脂族酯，羧酸基团的酰 胺，其通过与氨或与伯胺或仲胺反应可获得;游离氨基的N-酰基衍生物，其通过与酰基反应 制得;或游离羟基的〇-酰基衍生物，其通过与酰基反应制得。
[0082] 当然，"功能等同物"还包括可从其它生物体获得的多肽，以及天然存在的变体。例 如，可以通过序列比对来鉴定同源序列区域的区域，以及基于本发明的特定要求确定等同 的酶。
[0083] "功能等同物"也包括根据本发明的多肽的片段，优选地单结构域或序列基序，其 例如具有期望的生物功能。
[0084] "功能等同物"还可以是这样的融合蛋白，其包括上述多肽序列或由其衍生的功能 等同物之一，以及至少一个另外的、与其在功能上不同并且处于功能性N-或C-末端连接 (即，融合蛋白的各部分没有显著的相互功能损害）的异源序列。这样的异源序列的非限制 性实例是，例如，信号肽，组氨酸锚或酶。
[0085] 根据本发明还包括的"功能等同物"是具体公开的蛋白质的同源物。它们与具体公 开的氨基酸序列之一具有至少60%、优选至少75%、特别是至少85%，如，举例来说90、91、 92、93、94、95、96、97、98或99%的同源性（或同一性），这通过？6&18〇11和1^口111 &11， Proc.Natl. Acad, Sci.(USA)85(8)，1988,2444-2448的算法进行计算。根据本发明的同源多 肽的百分比同源性或同一性尤其意指基于本文具体描述的氨基酸序列之一的总长度的氨 基酸残基的百分比同一性。
[0086] 百分比同一"性也可以根据BLAST比对、算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或通过 使用下文详细说明的Clustal设置来确定。
[0087] 在可能的蛋白质糖基化的情况下，根据本发明的"功能等同物"包括处于去糖基化 或糖基化的形式，以及通过改变糖基化模式可获得的修饰的形式的上文指明类型的蛋白 质。
[0088] 根据本发明的蛋白质或多肽的同源物可以通过诱变而生成，即，通过蛋白质的点 突变、延伸或截短。
[0089] 根据本发明的蛋白质的同源物可以通过筛选突变体(如，举例来说，截短突变体） 的组合文库来鉴定。例如，蛋白质变体文库可以通过核酸水平上的组合诱变(如，举例来说， 通过合成的寡核苷酸的混合物的酶促连接)而产生。有大量方法用于从简并寡核苷酸序列 制备潜在同源物的文库。可以在自动DNA合成仪上进行简并基因序列的化学合成，并且，合 成的基因可以随后连接到合适的表达载体中。使用基因的简并集合使得能够在混合物中提 供编码潜在蛋白质序列的期望的集合的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法对于本领域技 术人员来说是已知的（例如，Narang，S·Α· (1983)Tetrahedron 39: 3; Itakura等人·（ 1984) Annu .Re v.Biochem .53:323; I takura等人，（1984 )Science 198:1056;Ike 等人（1983) Nucleic Acids Res.ll:477)〇
[0090] 用于在已通过点突变或截短而制备的组合文库中筛选基因产物和用于针对具有 选定特性的基因产物而筛选cDNA文库的一些技术在现有技术中是已知的。这些技术可以适 用于已由根据本发明的同源物的组合诱变产生的基因文库的快速筛选。用于筛选大规模基 因文库（其经历高通量分析）的最常用的技术包括，将基因文库克隆到可复制的表达载体 中，用所得到的载体文库转化合适的细胞，以及在下面的条件下表达组合基因，在该条件 下，对期望活性的检测有助于编码其产物已被检测出的基因的载体的分离。增加文库中功 能突变体频率的技术，递归整体诱变(REM)，可以与筛选试验组合使用以鉴定同源物(Arkin 和Yourvan(1992)PNAS89:7811_7815;Delgrave等人·（1993)Protein Engineering 6(3): 327-331)〇
[0091] 此外，通过示例的方式，本领域技术人员对于产生本文使用的内切葡聚糖酶的功 能突变体的方法是熟悉的。
[0092] 根据所使用的技术，本领域技术人员可以完全随机地或更靶向地将突变引入基因 或非编码核酸区域(其例如对调节表达是重要的），并随后构建基因文库。关于该目的所需 的分子生物学方法是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Sambrook和Russell，分子克 隆，第三版，冷泉港实验室出版社，2001年（33111131'〇〇1<：和1?1188611，]\1〇16(311131'(]1〇11；[叫，第3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)0
[0093] 修饰基因的方法和修饰由它们所编码的蛋白质的方法对于本领域技术人员来说 早已是公知的，如，举例来说，
[0094] 一一位点特异性诱变，其中基因的单个或更多核苷酸以靶向的方式被替换 (Trower MK(编）1996;In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey),
[0095] --饱和诱变，其中任何氨基酸的密码子可以在任何基因座处被替换或添加 (Kegler-Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res22:1593；Barettino D, Feigenbutz M,Valcarel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541；Barik S (1995)Mol Biotechnol 3:1)，
[0096] 一一易错聚合酶链式反应(易错PCR)，其中核苷酸序列通过错误工作的DNA聚合酶 而突变（Eckert KA，Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Resl8:3739);
[0097] 一一SeSaM方法(序列饱和法），其中通过聚合酶来防止偏好的取代。Schenk等人， Biospektrum，第3卷，2006，277-279
[0098] 一一增变株中的基因的传代，其中，例如，由于有缺陷的DNA修复机制，核苷酸序列 的突变率增加发生（Greener A,Callahan M，Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain.In:Trower MK(编）In vitro mutagenesis protocols.Humana Press，New Jersey)，或
[0099] 一一DNA改组，其中，密切相关的基因池被形成和消化，并且，片段用作聚合酶链式 反应的模板，其中通过反复的链分离和再退火最终产生全长嵌合基因 （Stemmer WPC( 1994) Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
[0100] 使用"定向进化"（尤其描述于，Reetz MT和Jaeger K_E(1999)，Topics Curr Chem 200:31；Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution,收录于：Demain AL,Davies JE(编）Manual of industrial microbiology and biotechnology.American Society for Microbiology)，本领域技术人员也可以以选择性方式并且大规模地产生功能突变体。这 里，在第一步中，最初产生相应蛋白质的基因文库，其中可以采用例如上文所指出的方法。 基因文库以合适的方式表达，例如通过细菌或通过噬菌体展示系统表达。
[0101]表达功能突变体的宿主生物的相关基因可以经历另外的突变周期，所述功能突变 体具有这样的特性，该特性很大程度上符合期望特性。突变和选择或筛选的步骤可以迭代 地重复，直到存在的功能突变体以足够的程度具有期望特性为止。作为该迭代步骤的结果， 可以逐步进行有限数量的突变(如，举例来说，1至5个突变），并针对它们在各自的酶特性上 的影响进行评估和选择。然后，所选择的突变体可以以相同的方式经历另外的突变步骤。待 研究的单个突变体的数量因此可以显著减少。
[0102]合适的表达构建体尤其可以用于根据本发明可用的内切葡聚糖酶的重组制备。
[0103] 本发明的主题还可以是表达构建体，其包括，在调控核酸序列的遗传控制下，编码 根据本发明的酶的核酸序列；以及包括这些表达构建体中的至少一个的载体。
[0104] 根据本发明，"表达单元"应理解为意指具有表达活性的核酸，其包括如本文所定 义的启动子，并且，在其功能性连接至待表达的核酸或基因后，其将调节该核酸或该基因的 表达(换句话说，转录和翻译）。这就是为什么在这种情况下它也被称为"调控核酸序列"。除 了启动子，可以存在另外的调控元件，如，举例来说，增强子。
[0105] 根据本发明，"表达盒"或"表达构建体"应理解为意指功能性连接至待表达的核酸 或待表达的基因的表达单元。与表达单元形成对照，表达盒因此不仅包括调节转录和翻译 的核酸序列，还包括作为转录和翻译的结果将要表达为蛋白质的那些核酸序列。
[0106] 在本发明的上下文中，术语"表达"或"过表达"描述了微生物中的一种或多种酶的 细胞内活性的产生或增加，所述酶由相应DNA编码。为此目的，例如，可以将基因引入生物 体，将现有的基因替换为不同的基因，增大(一个或多个)基因的拷贝数，使用强启动子，或 者使用编码具有高活性的相应酶的基因，并且，这些措施可以任选地组合。
[0107] 优选地，根据本发明的此类构建体包括相应编码序列的5'-上游启动子和3'-下游 终止子序列，和，任选地，另外的通常的调控元件，在每种情况下有效地连接到编码序列。
[0108] 根据本发明，"启动子"、"具有启动子活性的核酸"或"启动子序列"应理解为意指 这样的核酸，其与待转录的核酸功能性连接，调控该核酸的转录。
[0109] 在本文中，"功能的"或"有效的"连接应理解为意指，例如，具有启动子活性的核 酸、和待转录的核酸序列、和任选其它调控元件(如，举例来说，确保核酸转录的核酸序列）、 和例如终止子，它们之一以这样一种方式顺序布置，在该方式下各个调控元件在核酸序列 转录时可以完成其功能。对于这样的目的，不一定需要化学意义上的直接连接。遗传控制序 列（如，举例来说，增强子序列）也可以从位于较远距离的位置或甚至从其它DNA分子发挥其 针对靶序列的功能。优选的布置是这样的，其中待转录的核酸序列位于启动子序列的后面 (即，在3 '端），以使得这两个序列彼此共价键合。在这种情况下，启动子序列和待重组表达 的核酸序列之间的距离可以小于200个碱基对或小于100个碱基对或小于50个碱基对。
[0110] 除了启动子和终止子以外，可以提到的调控元件的其它例子有:靶向序列，增强 子，多腺苷酸化信号，可选择的标记，放大信号，复制起点等。合适的调控序列描述于例如 Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego，CA(1990)。
[0111] 根据本发明的核酸构建体尤其包括这样的核酸构建体，其中编码序列已被有利地 有效地或功能性地连接到一个或多个用于控制，例如增加基因表达的调控信号。
[0112] 除了这些调控序列，这些序列的天然调控仍可以存在于实际结构基因的上游，并 且可以任选已经遗传修饰使得天然调控已关闭以及使得基因的表达已增加。然而，核酸构 建体在结构上也可以更简单，换句话说，没有额外的调控信号已被插入到编码序列的上游， 并且天然启动子连同其调控并没有被删除。相反，天然调控序列以这样一种方式被突变，其 中，调控不再发生并且基因表达增加。
[0113]优选的核酸构建体有利地还包含已经提到的功能性连接到启动子的"增强子"序 列中的一个或多个，并且，这些可以使得核酸序列的表达增加。另外，可以在DNA序列的3'端 插入另外的有利序列，如其它调控元件或终止子。根据本发明的核酸可以作为一个或多个 拷贝存在于构建体中。其它标记物(如抗生素抗性或营养缺陷型-互补基因）可以任选地另 外存在于构建体中，用于针对该构建体进行选择。
[0? Μ] 合适的调控序列的例子存在于下面的启动子中，如cos，tac，trp，tet，trp-tet， lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，rhaP(rhaPBAD)SP6，A-Pr，或存在于λ-PL启 动子中，其有利地用于革兰氏阴性菌中。其它的有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性启 动子amy和SP02中，存在于酵母或真菌启动子ADC1，MFalpha，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF， rp28，ADH中。用于调控的人工启动子也可以使用。
[0115] 为了表达，核酸构建体被插入到宿主生物体中，有利地，载体如举例来说质粒或噬 菌体，其使得基因在宿主中的最佳表达成为可能。除了质粒和噬菌体，载体也应理解为意指 本领域技术人员已知的所有其它载体，也就是说，例如，病毒如SV40，CMV，杆状病毒和腺病 毒，转座子，IS元件，噬粒，粘粒以及线状或环状DNA。这些载体遵从在宿主生物体中自主复 制或遵从染色体复制。这些载体构成本发明的另外的实施方案。
[0116] 合适的质粒为，例如，在大肠杆菌中有pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19， pKC30，pRep4，pHSl，pKK223-3，pDHE19.2，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN- Agtll或pBdCI，在链霉菌中有pIJlOl，pIJ364，pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌中有 pUB110，pC194或pBD214,在棒状杆菌中有pSA77或pAJ667,在真菌中有pALSl，pIL2或 pBBl 16，在酵母中有 2alphaM，pAG-1，YEp6，YEp 13 或pEMBLYe23，或者，在植物中有 pLGV23， pGHlac+，pBIN19，pAK2004或pDH51。上述质粒是可能的质粒中的小的选择。其它的质粒对于 本领域技术人员来说是公知的，并且，可以例如在书籍Cloning Vectors(Pouwels P.H.等 人编著Elsevier,Amsterdam-New York_0xford，1985, ISBN 0 444 904018)中找到。
[0117] 在载体的其它配置中，包含根据本发明的核酸构建体或根据本发明的核酸的载体 也可以有利地以线性DNA的形式引入到微生物中并且经由异源或同源重组整合到宿主生物 体的基因组内。这种线性DNA可以由线性化载体(如质粒)构成，或仅由根据本发明的核酸构 建体或核酸构成。
[0118] 对于生物体中异源基因的最佳表达，有利的是根据该生物体中使用的特定"密码 子使用"来修改核酸序列。"密码子使用"可以通过对所讨论的生物体的其它的、已知的基因 进行计算机评估容易地确定。
[0119] 根据本发明的表达盒通过将合适的启动子融合到合适的编码核苷酸序列和终止 子或多腺苷酸化信号来制备。为此目的，人们会使用通常的重组和克隆技术，这些技术例如 描述于T · Maniatis，E.F.Fritsch和J. Sambrook，Molecular Cloning : A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY( 1989)，以及描述于 T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)，以及描述于Ausubel，F.M.等人， Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc . and Wiley Interscience(1987)〇
[0120] 为了表达，重组核酸构建体或基因构建体被插入到合适的宿主生物体中，有利地 为宿主特异性载体，这使得基因在宿主中可以最佳表达。载体对于本领域技术人员来说是 公知的，并且，可以例如在"Cloning Vectors"（Pouwels P.H.等人编著，Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)中找到。
[0121] 可以借助根据本发明的载体来产生重组微生物，这样的重组微生物例如用至少一 种根据本发明的载体进行转化，并且可以用来生产可以根据本发明使用的内切葡聚糖酶。 有利的是，上述根据本发明的重组构建体被引入合适的宿主系统并表达。在本文中，优选使 用本领域技术人员已知的克隆和转染方法，如，举例来说，共沉淀，原生质体融合，电穿孔， 逆转录病毒转染等，以在相应的表达系统中表达上述核酸。合适的系统例如描述于， Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人编著，Wiley Interscience, New York 1997,或Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual ·第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY,1989〇
[0122] 用于根据本发明的核酸或核酸构建体的合适的重组宿主生物体原则上是所有的 原核或真核生物。有利的是使用微生物(如细菌、真菌或酵母)作为宿主生物体。有利的是使 用革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，优选来自以下科的细菌，肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)，链霉 菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)，特别优选来自以下属的细菌，埃 希氏菌属(Escherichia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，链霉菌属（Streptomyces)，诺卡氏菌 属（Nocardia)，伯克氏菌属（Burkholderia)，沙门氏菌属（Salmonella)，农杆菌属 (Agrobacterium)，梭菌属（Clostridium)或红球菌属(Rhodococcus)。属和种，大肠杆菌，非 常特别优选。其它有利的细菌可以另外在变形菌，β-变形菌或γ-变形菌的组中找到。
[0123] 在本文中，根据本发明的一个或多个宿主生物体优选至少包含编码内切葡聚糖酶 的核酸序列，编码具有如上面所定义的内切葡聚糖酶活性的酶的核酸构建体或载体中的至 少一种：。
[0124] 取决于宿主生物体，根据本发明的方法中使用的生物体以本领域技术人员已知的 方式生长或培养。作为一项规则，微生物生长在液体介质中，其中包含碳源，通常为糖的形 式，氮源，通常为有机氮源(如酵母提取物)或盐(如硫酸铵）的形式，微量元素，如铁，锰，镁 盐，以及任选的维生素，温度在〇°C和100°C之间，优选在10°C和60°C之间，同时通入氧气。在 本文中，液体介质的pH值可以保持在固定值，即，其在培养期间可以进行调节也可以不进行 调节。培养可以分批、半分批或连续进行。营养物质可以在发酵开始时提供，或者半连续或 连续补料。
[0125] 为了重组生产可以根据本发明使用的内切葡聚糖酶或者其功能性生物活性片段， 对产生这种酶的微生物进行培养，任选诱导该酶的表达，并且从培养物中分离该酶。如果期 望的话，该多肽由此也可以在工业规模上生产。
[0126] 已经根据本发明产生的微生物可以通过分批法、补料-分批法或重复补料-分批法 连续或不连续生长。已知培养方法的概述可以在Chmiel编著的教科书中找到(BioprozeP technik 1.Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,1991)[Bioprocess engineering 1. Introduction to bioprocess technology])，或者在Storhas编著的教科书中找到（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[生物反应器和外围单元](Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden， 1994))〇
[0127] 所使用的培养基必须适当地满足所考虑的菌株的需要。用于多种微生物的培养基 的描述可以在以下手册中找到，美国细菌学学会的"常规细菌学方法手册（Manual of Methods for General Bacteriology)"（Washington D.C.，USA,1981)〇
[0128] 可以根据本发明使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生 素和/或微量元素。
[0129] 优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源的例子是葡萄糖，果糖，甘露 糖，半乳糖，核糖，山梨糖，核酮糖，乳糖，麦芽糖，鹿糖，棉子糖，淀粉或纤维素。糖也可经由 复杂化合物被加入到培养基中，如糖蜜或糖精制中的其它副产物。也有利的是可以添加多 种碳源的混合物。其它可能的碳源是油和脂肪，如，举例来说，豆油，葵花子油，花生油和椰 子脂，脂肪酸，如，举例来说，棕榈酸，硬脂酸或亚油酸，醇，如，举例来说，甘油，甲醇或乙醇， 以及，有机酸，如，举例来说，乙酸或乳酸。
[0130] 氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的材料。氮源的例子包括氨气 或铵盐，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵，硝酸盐，尿素，氨基酸或复杂氮源，如 玉米浆、大豆柏、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏等。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
[0131 ]可以存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的 氯盐、磷盐或硫酸盐。
[0132] 无机含硫化合物，如，举例来说，硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫 代硫酸盐、硫化物、以及有机硫化合物，如硫醇(mercaptan)和硫醇(thio 1 )，可以用作硫源。
[0133] 磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。
[0134] 螯合剂可以添加到培养基中，以维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包括 二羟基苯酚，如儿茶酚或原儿茶酸，或有机酸如柠檬酸。
[0135] 通常，根据本发明使用的发酵培养基还包含其它生长因子，如维生素或生长促进 剂，其包括，例如，生物素，核黄素，硫胺素，叶酸，烟酸，泛酸盐和吡哆醇。生长因子和盐经常 从复合培养基组分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等获得。另外，合适的前体可以加入到培养 基中。培养基中的化合物的确切组成在很大程度上取决于所讨论的实验，并且将针对每个 单独的情况单独决定。关于培养基优化的信息可以在下面的教科书中找到，"应用微生物学 生理学，实践方法（Applied Microbiol .Physiology,A Practical Approach)"（编者 P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)pp. 53-73, ISBN 0199635773)。生长培养基也 可以从商业来源获得，如标准1 (Standard 1) (Merck)或BHI (脑心浸液，DIFC0)等。
[0136] 培养基的所有组分都进行灭菌，或通过加热手段（1.5巴和121°C，20分钟），或通过 过滤除菌。组分可以一起灭菌或分别灭菌(如果适当的话）。培养基的所有组分可以在发酵 开始时就存在，或者可以连续或分批加入，根据需要而定。
[0137] 培养物温度通常在15°C和45°C之间，优选25°C至40°C，并且可以在实验期间保持 恒定或者进行改变。培养基的pH值应在5至8.5的范围内，优选大约7.0。在发酵期间，在发酵 期间，发酵pH值可以通过加入碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)或酸性化合物 (如磷酸或硫酸)来控制。消泡剂(如，举例来说，脂肪酸聚乙二醇酯)可以用于控制泡沫的发 展。为了保持质粒的稳定性，合适的选择性作用物质（如，举例来说，抗生素)可以加入到培 养基中。为了维持有氧条件，氧气或含氧气体混合物(例如，环境空气)被通入到培养物中。 培养物温度通常为20°C至45°C。并且，培养持续进行，直到形成最多期望产物为止。该目标 通常在10小时至160小时内完成。
[0138] 然后，发酵液被进一步处理。取决于什么是所需要的，所有或部分生物量可以通过 以下分离方法从发酵液中去除，如，举例来说，离心、过滤、倾析或这些方法的组合，或者完 全留在所述发酵液中。
[0139] 如果多肽不分泌到培养基中，细胞也可以被破碎并且通过常规蛋白质分离方法从 裂解物中获得产物。细胞可以任选地如下破碎，通过高频超声，通过高压，如举例来说，在弗 氏细胞压碎器(French pressure cell)中，通过渗透裂解(osmolysis)，通过洗涤剂、裂解 酶或有机溶剂的作用，通过均化器或通过几种上述方法的组合。
[0140] 多肽可以使用已知的色谱技术进行纯化，如分子筛层析(凝胶过滤），如Q-琼脂糖 凝胶层析、离子交换层析和疏水层析，并且也可以使用其它常用方法，如超滤、结晶、盐析、 透析和非变性凝胶电泳。合适的方法例如描述于C ο 〇 p e r，T . G .，B i 〇 c h e m i s c h e Arbeitsmethoden[Biochemical working methods]，Verlag Walter de Gruyter,Berlin, New York，或者描述于Scopes,R.，Protein Purification,Springer Verlag,New York, Heidelberg,Berlin。
[0141] 为了分离重组蛋白，有利的是可以使用载体系统或通过特定核苷酸序列延长cDNA 的寡核苷酸，并由此编码例如用于更简单的纯化的目的的修饰的多肽或融合蛋白。合适的 这种修饰例如被称为"标签"的修饰，其用作锚，如，举例来说，被称为6-组氨酸锚的修饰或 作为抗原能够被抗体识别的表位(例如描述于Harlow，E.和Lane，D.，1988,Antibodies : A Laboratory Manual .Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)。这些锚可以用于将蛋白质附着至 固体支持物，如，举例来说，可以装填到例如层析柱中的聚合物基质，或者用于将蛋白质附 着至微量滴定板或任何其它支持物。
[0142] 同时，这些锚也可以用于蛋白质的鉴定。为了鉴定蛋白质，常规标记物如荧光染 料、酶标记物(其与底物反应后，形成可检测的反应产物)或放射性标记物可以另外单独使 用或与锚组合使用，用于蛋白质的衍生化。
[0143] 内切葡聚糖酶可以以游离或固定化的形式使用。固定化的酶应理解为意指固定至 惰性支持物上的酶。合适的载体材料和固定于其上的酶已知于EP-A-1149849，EP-A-1 069 183和DE-0S 100193773,并且已知于其中引用的参考文献。这些文件的有关公开以其全部 内容被引用。合适的载体材料包括，例如，粘土，粘土矿物，如高岭石，娃藻土，珍珠岩，二氧 化硅，氧化铝，碳酸钠，碳酸钙，纤维素粉末，阴离子交换材料，合成聚合物，如聚苯乙烯，丙 烯酸树脂，酚醛树脂，聚氨酯和聚烯烃，如聚乙烯和聚丙烯。对于有支持的酶的生产，载体材 料通常以细颗粒形式被使用，优选多孔形式。载体材料的粒径通常不超过5mm，特别是不超 过2mm(粒径分布曲线）。相似地，当使用内切葡聚糖酶作为全细胞催化剂时，可以选择游离 或固定化的形式。载体材料例如为海藻酸钙和角叉菜胶。酶和细胞也可以直接用戊二醛交 联（交联至CLEA)。相应的和其它的固定化技术例如描述于J . Lalonde和A .Margolin" Immobilization of Enzymes〃于K.Drauz和H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,Vol. III,991-1032,ffiley-VCH,ffeinheim〇
[0144] 3.2纤维素寡聚物生产
[0145] 借助于内切葡聚糖酶，通过单或多个酶促水解生产纤维素寡聚物，任选地与用离 子液体和/或机械处理来处理纤维素组合。最佳顺序可以由本领域技术人员通过简单的初 步实验来确定。
[0146] a)用离子液体处理纤维素
[0147] 为此目的，将纤维素悬浮于例如冷EMM Ac中。为此目的，例如，每毫升EMM Ac中 0.02g纤维素加热直至液体变清。然后，用水沉淀纤维素。通过真空过滤从离子液体和用于 沉淀的水中分离沉淀的纤维素。然后用水洗涤纤维素。
[0148] b)机械处理纤维素
[0149] 将10% (w/w)纤维素悬浮于蒸馏水中。按照用法说明，以1mm玻璃珠准备球磨机(例 如，Beadbeater，Biospec Products)，装填纤维素悬浮物并进行研磨。冷却后，再次研磨纤 维素。此过程在冰上重复数次。此后，用蒸馏水从玻璃珠中洗脱纤维素直至洗脱水变清。收 集洗脱的悬浮液且然后离心。将水从经预处理的纤维素中倾出，并且，在酶促水解中使用该 纤维素。
[0150] c)纤维素的酶促水解
[0151] 新鲜预处理的纤维素用于酶促水解。制备合适的缓冲液(醋酸盐缓冲液，磷酸盐缓 冲液或1^8缓冲液，0.01至0.251，？!14至7)用于水解，例如，0.謂？!14.5的醋酸钠缓冲液 和0.1M pH 6的Na-K磷酸盐缓冲液。最佳缓冲液浓度和pH可以通过进行仅几个初步实验来 确定。
[0152] 将纤维素酶以所需的浓度溶解在缓冲液中。将纤维素酶溶液加入到经称量的纤维 素中，并在涡旋混合器中混合几秒钟。除非另有说明，在2ml Eppendorf反应容器中大约 l〇mg(干重)纤维素与lml纤维素酶溶液一起用于水解，并且，这些在恒温混匀仪中在40°C和 SOOmirT1下孵育所需的时间段。为了终止反应，样品在台式离心机中在HOOOmirT1下离心沉 降3分钟。在进行一些例行初步实验后，用于更大批量的相应程序也是可能的。
[0153] c)进一步酶促水解
[0154] 为了进一步降解不完全水解的纤维素，已经水解的纤维素可以用离子液体进行再 处理，并且，处理过的纤维素可以经历另一次酶促水解。这在用离子液体预处理后如上文所 述进行，与上文所述相同。
[0155] 本发明现在将在实验部分参照以下具体实施例更详细地说明。
[0156] 3.3 应用
[0157] 应用领域一一并非希望通过列举对它们进行限制一一为例如纤维增强，或者表面 活性物质或配方(消泡剂、流变学改性剂等)的改性的领域。
[0158] 实验部分
[0159] I.材料
[0160] 纤维素：
[0161] 根据本发明，使用了具有不同特性谱的多种纤维素。纤维素底物在它们的聚合度 或它们的链长分布和它们的结晶度和可用表面方面不同。表1给出了所用底物的概述。
[0162] 表1:所用纤维素底物，以及它们的性质
[0163]
[0164] DPw和DPN经由本文所描述的GPCW确定。
[0165] 纤维素底物的聚合度和链长分布通过GPC确定。为了进行该测量，将样品通过现有 的方法进行衍生并随后通过GPC测量[Rinaldi等人Angewandte Chemie-International Edition,47(42) :8047-8050,2008，Rinaldi等人，Chemsuschem,3(2) :266-276,2010]。根据 本发明分析的样品不再需要进行衍生用于GPC测量，这归因于备选的GPC方法[Engel等人 2012，Biotechnology for Biofuels 5:77]。表1示出了根据本发明所使用的GPC测量系统 所确定的底物聚合度。
[0166] 酶：
[0167] 表2:所用纤维素酶(来自Megazyme公司）的概述
[0 168]
[0169] II.设备
[0170] 表3:有机GPC仪器使用
[0171]
[0173] 表4:水性GPC仪器使用
[0174]
[0175] 表5:HPLC 仪器
[0176]
[0178] III.方法
[0179] 1.用离子液体进行纤维素预处理
[0180] 将纤维素悬浮于冷EM頂Ac中。为此目的，每50ml EM頂Ac 0.75g纤维素被加热至 80°C至少40分钟，直至液体变清。然后，用400ml水沉淀纤维素。通过真空过滤从离子液体和 用于沉淀的水中分离沉淀的纤维素，其中使用网眼尺寸为〇.2μπι的醋酸纤维素过滤器。此 后，用500ml水洗涤纤维素3次。
[0181] 2.纤维素的机械预处理
[0182] 将10 % (w/w)纤维素悬浮于蒸馏水中。按照说明，以1 mm玻璃珠准备球磨机 (Beadbeater，Biospec Products)，装填纤维素悬浮物并研磨3分钟。此后，球磨机必须冷却 3分钟，直至可以再次研磨纤维素。此过程在冰上重复5次。此后，用蒸馏水从玻璃珠中洗脱 纤维素直至洗脱水变清。收集洗脱的悬浮液，且然后以^OOmirT 1离心(Rotina 35R)3分钟。 将水从经预处理的纤维素中倾出，并且，在酶促水解中使用纤维素。
[0183] 3.纤维素的酶促水解
[0184] 新鲜预处理的纤维素被用于酶促水解。由于纤维素在预处理后未被干燥，因此湿 重必须被转换为干重。在这种情况下，不可能通过对一些经预处理的纤维素进行干燥而预 先确定干重，因为这需要数天。为了计算溶胀因子，我们因此假设5%的纤维素损失作为预 处理的结果。经预处理的纤维素的湿重被确定并除以用于预处理的重量的95%。然后，所确 定的溶胀因子用于计算所需的经预处理的湿润纤维素的量。由于湿重在预处理后可能变 化，因此该因子在每次预处理后必须重新确定。制备0.1M pH 4.5的醋酸钠缓冲液和0.1M pH 6的Na-K磷酸盐缓冲液，用于水解。
[0185] 将黑曲霉、长枝木霉和爱默生踝节菌内切葡聚糖酶和黑曲霉β-葡糖苷酶以所需的 浓度溶解在醋酸钠缓冲液中。将海栖热袍菌和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶以所需的浓度 溶解在Na-K磷酸盐缓冲液中。将纤维素酶溶液加入到经称量的纤维素中，并在涡旋混合器 中混合几秒钟。除非另有说明，在2ml Eppendorf反应容器中lOmg(干重)纤维素与lml纤维 素酶溶液一起用于水解，并且，这些在恒温混匀仪中在40°C和SOOmirT1下孵育所需的时间 段。为了终止反应，样品在台式离心机中在HOOOmirT 1下离心沉降3分钟，并且，上清液被去 除并转移到另一个Eppendorf反应容器中。将沉淀和上清液冷冻于-80°C，并且可以在稍后 的时间点进行分析。
[0186] 4.在用离子液体重新预处理后进行第二次酶促水解(IL重启）
[0187] 为了研究由于纤维素的结构性质或改变(如，举例来说，结晶和再结晶）所导致的 不完全纤维素水解，已经被水解的纤维素用离子液体进行再处理，并且，处理过的纤维素再 次经历酶促水解。用离子液体预处理的纤维素水解后，进行IL重启。相应缓冲液中的10U/ml 内切葡聚糖酶和3U/mli3-葡糖苷酶被用于两个水解步骤。
[0188] 由于新鲜水解的纤维素用于IL重启，因此对水解后的纤维素损失进行计算。为此 目的，所用的5种内切葡聚糖酶水解后的纤维素损失必须预先确定(见下文）。所确定的纤维 素损失用来计算水解后的纤维素的量(干重）。水解后得到的沉淀溶解于EMIM Ac中于80°C 下2小时。EMIM Ac的所需量取决于纤维素的量和水分含量，因为纤维素样品中存在的水降 低EMIM Ac的纤维素溶解能力。此后，通过加水使纤维素从EMIM Ac中沉淀下来。用水洗涤纤 维素3次。为了分离除去液体，纤维素在SOOmirT1下离心3分钟(Rotina 35R)，且随后倾出液 体。通过称重确定纤维素样品的湿重。所确定的样品湿重和所计算的水解后干重用于确定 样品的溶胀因子。在此方法中由纤维素酶纯化的纤维素随后用于第二次水解。为了确定纤 维素的湿重，使用先前确定的溶胀因子。
[0189] IV.分析方法
[0190] 1.有机凝胶渗透色谱法
[0191]有机凝胶渗透色谱法(GPC。)用于确定纤维素样品的链长分布。为了进行GPC。，来自 水解的纤维素样品被冻干，且随后将冻干物溶解于80°C的DMF/19 % (v/v)EM頂Ac。溶解的 纤维素通过〇. Ιμπι PT-FE过滤器过滤，并且将滤液转移到HPLC玻璃容器中。具有上述仪器使 用(表3)的GPC。系统在下列条件下用于进行分析。
[0192]
[0193] 浓度通过RI检测器进行检测。纤维素链的摩尔质量通过散射光检测器来确定。纤 维素寡聚物的检测限为聚合度大约10APW和DPn两者均借助于ASTRA软件来确定。
[0194] 2.水性凝胶渗透色谱法
[0195] 水性凝胶渗透色谱法(GPCW)将用于确定水性水解上清液中糖的组成。关于水性 GPC，来自水解的上清液被过滤除菌(0.2μπι)并转移到HPLC玻璃容器中。具有表4的组成部分 的GPC系统在下列条件下用于进行分析。
[0196]
[0197]来自Megazyme (爱尔兰）的葡萄糖和纤维素寡聚物（纤维二糖[C2]至纤维六糖 [C6])用于校准。保留时间为27至31.5分钟。分析物通过RI检测器进行检测。
[0198] 3.干物质测定
[0199] 为了后验确定在水解中所用的纤维素的精确量，测定了经预处理的纤维素的干物 质。为此目的，对Eppendorf反应容器进行标记并在80°C干燥3天。记录重量后，Eppendorf反 应容器用特定量的湿纤维素填充，并记录重量。此后，经填充的Eppendorf反应容器在80°C 干燥。干燥后，Eppendorf反应容器被再次称重。将从空湿、湿重和干重来确定溶胀因子。由 于新鲜预处理的纤维素被用于所有的实验，因此所确定的溶胀因子仅用于随后验证关于水 解实验所计算的值。
[0200] 溶胀因子=湿重/干重
[0201] 4,纤维素损失确定
[0202]纤维素损失确定使得能够确定分解成可溶性糖和纤维素寡聚物的纤维素的量。为 了确定纤维素损失，30mg纤维素干物质通过上述方法水解。
[0203] 然而，纤维素不通过离心从缓冲液中分离。孔径0.2μπι的醋酸纤维素滤膜的重量被 记录下来，并且经水解的纤维素悬浮液通过该过滤器进行过滤。过滤器连同经水解的纤维 素一起，用l〇ml蒸馏水洗涤3次，并且在80°C下干燥3天。干燥后，醋酸纤维素过滤器连同干 燥的纤维素一起称重，并记录该重量。从用于水解的纤维素和纤维素干燥后的重量之间的 重量差，可以确定纤维素损失。
[0204] 重量趋向于被确定得过高，这是因为这种方法没有除去任何吸附在纤维素上的纤 维素酶。在未经水解的纤维素的情况下，可附着的纤维素酶总共达到〇. 8 %和2.3 %之间。由 于葡萄糖和可溶性纤维素寡聚物的产生，在水解期间纤维素酶的量相对于不溶性纤维素增 加。如果纤维素减少70%，可附着于其上的纤维素酶的量最大达到7.6%。作为形成可溶性 糖和纤维素寡聚物的结果，纤维素的实际损失因此略高于由该方法所确定的损失。
[0205] 5.高效液相色谱法
[0206] 高效液相色谱法(HPLC)允许确定水解混合物的水性上清液中的葡萄糖和纤维二 糖的浓度。为了进行HPLC，来自水解的上清液被过滤除菌并转移到HPLC玻璃容器中。使用下 列条件下的HPLC(表5)用于分析：
[0207]
[0208] 6.4-羟基苯甲酸酰肼测定
[0209] 4-羟基苯甲酸酰肼测定(PAHBAH测定)允许确定水解混合物的水性上清液中的还 原糖的摩尔浓度。还原可溶性糖与PAHBAH试剂反应，产生黄色染料，其可以在410nm处光度 测量。出于校准的目的，以所使用的缓冲液建立葡萄糖校准系列，浓度范围为〇 .〇25g/l至 0.5g/l 〇
[0210] 必须制备两种试剂(A和B)用于PAHBAH测定，这两种试剂的组成列于下表中。在进 行PAHBAH测定之前，从试剂A和B(比例为1:10)制备工作试剂。前者将仅能保留几个小时，因 此应在进行PAHBAH测定之前即刻制备。待测定的样品和校准溶液与工作试剂以1:3和1:5的 比例混合，并且在l〇〇°C下孵育15分钟。样品和标准溶液已冷却至室温后，在光度计中于 410nm处对它们进行测量。可溶性还原糖和纤维素寡聚物的量可以借助于校准线以mol/ml 确定，该校准线通过线性回归确定。
[0211]
[0212」7.十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0213] 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS凝胶电泳）连同来自Life Technologies (Cal if ornia, USA)的SDS凝胶系统被用于验证所用酶的纯度。
[0214] 转化实施例
[0215] 为了制备具有接近水中溶解度的大小的纤维素寡聚物，首先使用3种纤维素底物 Avicel、a-纤维素和Sigmacell以及使用5种内切葡聚糖酶和2种β-葡糖苷酶进行实验。实验 开始前，检查所用的酶的纯度，并且在溶胀于各自的反应缓冲液中后检查所用的纤维素的 大小分布。除非另有说明，对于所有酶促水解来说，首先进行IL预处理，并随后进行酶促水 解。3种纤维素首先用所有的内切葡聚糖酶水解2小时。此后，在后面的实验中研究具有最低 的葡萄糖和可溶性纤维素寡聚物生产的3种内切葡聚糖酶的反应。
[0216] 实施例1:纤维素底物AVicel、a-纤维素和Sigmacell的GPC。
[0217] 为了进行3种酶促非水解的纤维素底物Avicel、a-纤维素和Sigmacell的GPCo,这3 种底物的样品在缓冲液中40°C下孵育1天。此后，与水解样品类似，将它们制备用于GPCo,且 然后通过GPCo进行分析。
[0218] 对于Avicel，关于醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液的链长分布的测定得到了相同的 结果。已在磷酸盐缓冲液中孵育的α-纤维素和Sigmacell样品的链长分布显示出曲线朝向 较长链的比例移位。此现象的原因还不清楚。与未在缓冲液中孵育的样品相比，已在醋酸盐 缓冲液中孵育的样品没有朝向较长的链长移位。在下文中，已预先在醋酸盐缓冲液中孵育 并随后冻干的底物样品被用作参考，用于显示未酶促降解的纤维素和Sigmacell的链长 分布。
[0219] 实施例2:由来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌、海栖热袍菌、长枝木霉和爱默生踝节菌 的内切葡聚糖酶水解Avicel
[0220] 通过GPCo分析由来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶水解 Avicel
[0221] 黑曲霉
[0222]水解混合物的组分：
[0223] 10mg/ml Avicel,
[0224] 10U/ml黑曲霉内切葡聚糖酶，
[0225] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0226] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0227] 结果:无内切葡聚糖酶的样品的链长分布在10和1000葡萄糖单元之间，最大值在 250处。用黑曲霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，观察到链长分布的上端向较短链长移位了 700 葡萄糖单元。该反应时间后，链长分布在10和300葡萄糖单元之间。最大分布在90葡萄糖单 元处。在5分钟和24小时之间的时间期间，链长分布的上端向较短链长移位了 100葡萄糖单 元。24小时后，曲线在10和200葡萄糖单元之间，并且在70葡萄糖单元处具有最大值。
[0228] 解淀粉芽孢杆菌
[0229] 水解混合物的组分：
[0230] 10mg/ml Avicel,
[0231 ] 10U/ml解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶，
[0232] 3U/ml农杆菌属物种β-葡糖苷酶，
[0233] 40°C，0.1Μ pH 6的磷酸盐缓冲液
[0234] 结果:无内切葡聚糖酶的样品的链长分布在10和700葡萄糖单元之间，最大在250 处。对于用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶水解Avicel，在20分钟后也可以观察到链长分布 的上端向较短的链移位。与20分钟样品相比，2小时样品的链长分布向较短链长移位了 150 葡萄糖单元。在2小时和24小时之间的样品的曲线相同。因此，底物没有任何的进一步分解。 水解24小时后，得到了在10和200葡萄糖单元之间并且在大约65葡萄糖单元处具有最大值 的链长分布。
[0235] 海栖热袍菌
[0236] 水解混合物的组分：
[0237] 10mg/ml Avicel,
[0238] 10U/ml海栖热袍菌内切葡聚糖酶，
[0239] 3U/ml农杆菌属物种β-葡糖苷酶，
[0240] 40°C，0.1M pH 6的磷酸盐缓冲液
[0241] 无内切葡聚糖酶的样品的GPCo测量显示链长分布为10至700葡萄糖单元。在用海 栖热袍菌内切葡聚糖酶水解A v i c e 1的最初5分钟期间，观察到链分布的上端向较短的链移 位。这类似于用黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶水解Aviceld分钟样品显示15和 300葡萄糖单元之间的链长分布。直至24小时后实验结束时，链长分布的上端持续向较短链 长移位。在该反应时间后，链长分布在15和300葡萄糖单元之间，最大值在90葡萄糖单元处。
[0242] 长枝木霉
[0243] 水解混合物的组分：
[0244] 10mg/ml Avicel,
[0245] 10U/ml长枝木霉内切葡聚糖酶，
[0246] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0247] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0248] 与已经提到的通过黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌内切葡聚糖酶水解 Avice 1相比，通过长枝木霉内切葡聚糖酶水解Avice 1进行得较慢。
[0249] 上述内切葡聚糖酶在5分钟水解后的链长分布的上端在300和400葡萄糖单元之 间。对于长枝木霉内切葡聚糖酶，仅在20分钟后情况才是这样。然而，24小时后，10至200葡 萄糖单元和在60葡萄糖单元处的最大值的链长分布与黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍 菌内切葡聚糖酶的相应链长分布可比。
[0250] 爱默生踝节菌
[0251] 水解混合物的组分：
[0252] 10mg/ml Avicel,
[0253] 10U/ml爱默生踝节菌内切葡聚糖酶，
[0254] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0255] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0256] 无内切葡聚糖酶的样品的链长分布在10和700葡萄糖单元之间，最大值为250葡萄 糖单元。在通过爱默生踝节菌内切葡聚糖酶的Avicel水解中，链长分布的上端在水解的最 初4小时期间向较短链长移位。4小时后，链长分布曲线在15和200葡萄糖单元之间，最大值 在70葡萄糖单元处。
[0257] 总结：
[0258] 使用所用的5种内切葡聚糖酶，在24小时的水解后，能够实现链长分布的上端向较 短链长的移位。随着水解增加，链长分布的原过程变窄。对于所有内切葡聚糖酶来说，链长 分布的下端在7和15葡萄糖单元之间的范围。因此，可以检测所有内切葡聚糖酶的内切酶活 性。
[0259 ]实施例3:经酶促水解的Avi ce 1的聚合度DP的确定
[0260] 进行GPC分析，以确定(实施例2的)经酶促水解的Avicel的DP。
[0261] 样品组成GPCo:
[0262] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0263] 流动相:DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0264] 实验结果以图的形式示出于附图la至le中。
[0265] 在加入纤维素酶之前，样品（0小时样品）的DPw初始值在160和220之间，平均为 190〇
[0266] 下文中陈述的所有百分数都是指初始平均DPw为190。
[0267] 在使用来自黑曲霉、海栖热袍菌、爱默生踝节菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶的水 解实验期间，在最初5分钟期间DPw下降了37%至53%，并因此在90和120之间。24小时后，在 使用黑曲霉、海栖热袍菌和长枝木霉内切葡聚糖酶的水解实验中， DPw进一步下降10%至 21 %到初始值的50 %至37 %。
[0268]使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶水解的DPw在20分钟后为初始值的40%。水解 24小时后，DPw进一步下降5 %到初始值的35 %。
[0269] 爱默生踝节菌内切葡聚糖酶水解的DPw在水解20分钟后下降了初始值的52%。水 解2小时后，DPw已达到值70,这是初始值的36%。此后，DPw上升到120,直到24小时的反应时 间结束。在使用爱默生踝节菌内切葡聚糖酶水解Sigmacell中，DPw和DPn也在水解3小时后均 上升。因此，不能假定观察到的上升是测量误差。可能的原因是短链的降解增加，由此，所存 在的较长的链相比起来会更加突出。
[0270] 当使用来自解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶时，在水解2小时后，未 观察到Avicel的进一步降解。在使用来自黑曲霉和爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶的水解实 验中，可以观察到DPw的进一步减小，直到实验结束。
[0271] 当使用所有内切葡聚糖酶时，与实验周期的剩余部分相比，在实验的最初5分钟期 间DPw相对于初始值降低最多。在最初1至2小时期间，DPw降低到大约50%。与其它内切葡聚 糖酶相比，当使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖 酶时，可以实现最低的DPw，值为65。
[0272] 多分散性(其列于下表中）由DPw和DPn计算得到：
[0273]
[0274] DPw、DPn和多分散性(PD)通过GPCo确定(软件:ASTRA)
[0275] 箭头指示各自的趋势
[0276] 多分散性随着降低的DPw降低。因此，多分散性和纤维素的降解程度之间存在相关 性。
[0277] 实施例4: Avicel水解的质量平衡
[0278] 纤维素的水解不仅产生所需的不溶性纤维素寡聚物，也产生可溶性纤维素寡聚物 和葡萄糖。本实施例涉及由于产生可溶性纤维素寡聚物和葡萄糖所导致的所用纤维素的损 失的定量和评估。溶解的纤维素寡聚物和葡萄糖借助于HP LC和PAHBAH试验进行定量。 Avi ce 1水解样品的水性上清液被用于这些研究。葡萄糖和纤维二糖的浓度通过HPLC分析来 确定。对于所有的所用内切葡聚糖酶来说，这两种溶解的糖的浓度都随着时间而增加。
[0279] 酶促水解后Avicel的质量分布编辑在下表中：
[0280]
[0281 ]在24小时后通过确定纤维素损失测量不溶性纤维素寡聚物；
[0282] 在24小时后通过PAHBAH试验测量还原糖；
[0283] 在24小时后通过HPLC测量葡萄糖和纤维二糖；
[0284] 未知的可溶性纤维素寡聚物(PAHBAH试验和HPLC分析之差)24小时后；
[0285] 百分比基于所用的纤维素完全转化时形成的葡萄糖和纤维二糖
[0286] 在11 %的未知的可溶性纤维素寡聚物时，爱默生踝节菌内切葡聚糖酶是未知的可 溶性纤维素寡聚物的最高生产者。解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶产生6.1%的未知的可溶 性纤维素寡聚物。当使用长枝木霉内切葡聚糖酶时，生成2%的未知的可溶性纤维素寡聚 物。使用海栖热袍菌和黑曲霉内切葡聚糖酶产生非常低量的未知的可溶性纤维素寡聚物， 或者其量完全不能测出，为〇. 5 %和0 %。由于爱默生踝节菌和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖 酶相比起其它内切葡聚糖酶产生最高量的可溶性纤维素寡聚物，因此这两种内切葡聚糖酶 可以用于生产可溶性纤维素寡聚物。
[0287] 在水解后29%纤维素时，爱默生踝节菌内切葡聚糖酶的使用主要产生葡萄糖、纤 维二糖(51%)和可溶性纤维素寡聚物（11%)。当在水解后75%不溶性纤维素时使用解淀粉 芽孢杆菌内切葡聚糖酶、在81 %时黑曲霉内切葡聚糖酶以及在96.6 %时海栖热袍菌内切葡 聚糖酶时，相比起其它内切葡聚糖酶，实现了最佳的纤维素产量。因此，解淀粉芽孢杆菌和 黑曲霉内切葡聚糖酶对下面这样的工业过程特别重要，该工业过程以生产不溶性纤维素寡 聚物为目标当不溶性纤维素采取相对短链的纤维素寡聚物的形式时。
[0288] 实施例5:通过来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌海栖热袍菌、长枝木霉和爱默生踝节 菌的内切葡聚糖酶酶促水解纤维素
[0289] 借助于GPC。确定α-纤维素的水解样品的链长分布。
[0290] 黑曲霉
[0291] 水解混合物的组分：
[0292] lOmg/mla-纤维素，
[0293] 10U/ml黑曲霉（内切葡聚糖酶，
[0294] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0295] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0296] 未经酶处理的α-纤维素显示出以下特征过程:在20至90葡萄糖单元范围内纤维素 链浓度增加。在90至200葡萄糖单元范围内斜率下降，然后在200至450葡萄糖单元范围内再 次上升。
[0297] 用黑曲霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，肩部不再可见。与未水解样品的过程相比， 链长分布的上端向较短链长移位。同样地，分布的最大值向较短链移位。分布为10和800葡 萄糖单元之间，最大值为120。直至19小时，链长分布持续变窄。此时曲线范围在10和450葡 萄糖单元之间，最大值在75处。因此，实现了最大值减小80 %以及链长分布上端减小75 %。
[0298] 解淀粉芽孢杆菌
[0299] 水解混合物的组分：
[0300] 10mg/mla-纤维素，
[0301] l〇U/ml解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶，
[0302] 3U/ml农杆菌属物种β-葡糖苷酶，
[0303] 40°C，0· 1Μ pH 6的磷酸盐缓冲液
[0304]通过解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶水解a-纤维素的链长分布由GPC。确定。用黑曲 霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，仅可辨别出链长分布在10和30葡萄糖单元之间的下降变浅， 而非肩部。20分钟的反应时间后，该变浅不再可辨别;相反，可以观察到近高斯链长分布。在 实验结束时，链长分布在10和400葡萄糖单元之间，最大值在80葡萄糖单元处。酶促水解使 最大值降低了 80%并且使上端降低了 75%。
[0305] 海栖热袍菌 [0306] 水解混合物的组分：
[0307] 10mg/mla-纤维素，
[0308] 10U/ml海栖热袍菌内切葡聚糖酶，
[0309] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0310] 40。(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0311] 通过海栖热袍菌内切葡聚糖酶水解的a-纤维素的链长分布由GPC。确定。来自于通 过海栖热袍菌水解a-纤维素并通过GPC。分析的5分钟样品证明链长分布在10和1800葡萄糖 单元之间。与无酶样品相比，纤维素寡聚物存在于10至20葡萄糖单元的范围内。5分钟后，最 大值从450移位至350。肩部不再明显，但在大约120葡萄糖单元处可以辨别出轻微变浅的下 降。与30葡萄糖单元至最大值范围中的倾斜度相比，在10和30葡萄糖单元之间范围中的链 长分布的倾斜度较浅。在水解期间，链长分布的上端和曲线的最大值向较短链长移位。在19 小时的反应时间后，曲线在10和600之间，并且最大值在150葡萄糖单元处。因此，链长分布 的最大值降低了65%，并且，链长分布的上端降低了65%。
[0312] 长枝木霉 [0313]水解混合物的组分：
[0314] lOmg/mla-纤维素，
[0315] 10U/ml长枝木霉内切葡聚糖酶，
[0316] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0317] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0318] 通过长枝木霉内切葡聚糖酶水解的a-纤维素的链长分布由GPC。确定。在5分钟的 水解时间后，通过长枝木霉内切葡聚糖酶水解的α-纤维素的链长分布的上端向较短链长移 位。该反应时间后，链长分布在10和1500葡萄糖单元之间。与无酶样品相比，最大值已从450 移位到200葡萄糖单元。同样地，肩部已向较短链长移位并处于大约25葡萄糖单元。在19小 时的反应时间期间，链长分布的上端持续向较短链长移位。同样地，曲线的最大值向较短链 移位。由于在实验过程中链长分布变窄，因此在实验期间最大值的高度增加。19小时后，链 长分布在10和400葡萄糖单元之间，并且，最大值在75葡萄糖单元处。
[0319]在19小时的水解时间内，最大值降低了 80%，并且，链长分布的上端降低了 75%。
[0320] 爱默生踝节菌 [0321]水解混合物的组分：
[0322] lOmg/mla-纤维素，
[0323] 10U/ml爱默生踝节菌内切葡聚糖酶，
[0324] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0325] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0326] 通过爱默生踝节菌内切葡聚糖酶水解的a-纤维素的链长分布由GPC。确定。无酶样 品的链长分布在20和1800葡萄糖单元之间，最大值在450葡萄糖单元处。链长分布在90和 200葡萄糖单元之间有较浅的区域(肩部）。在5分钟水解后，通过爱默生踝节菌内切葡聚糖 酶水解的纤维素的链长分布的上端向较短链长移位。该反应时间后，链长分布在10和 1500葡萄糖单元之间。比无酶样品相比，最大值已从450移位到280葡萄糖单元。同样地，肩 部已向较短链长移位并处于大约30葡萄糖单元。在19小时的反应时间期间，链长分布的上 端持续向较短链长移位。同样地，曲线的最大值向较短链移位。由于在实验过程中链长分布 变窄，因此在实验期间最大值的高度增加。19小时后，链长分布在10和300葡萄糖单元之间， 并且最大值在70葡萄糖单元处。酶促水解使最大值降低了 85%，并且使链长分布的上端降 低了80%。
[0327] 总结：
[0328] 通过比较所提出的内切葡聚糖酶，来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 表现出最快的纤维素降解。来自长枝木霉和爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶降解纤维素较 慢。然而，19小时后，链长分布在相同范围内。当使用来自海栖热袍菌的内切葡聚糖酶时，与 通过来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌的内切葡聚糖酶水解相比，a-纤维素同样降解更慢。然 而，在19小时的反应时间后，a-纤维素没有降解到与使用其它内切葡聚糖酶时相同的程度。 对于较慢的内切葡聚糖酶尤其可以观察到最大值首先向较短链移位，并且形成具有10至30 葡萄糖单元的链长的纤维素寡聚物。随着反应时间的推移，链长分布及其最大值持续向较 短链长移位。链长分布因此变窄并且最大值的高度增加。
[0329]实施例6:经酶促水解的a-纤维素的聚合度DP的确定 [0330]进行GPC分析，以确定经酶促水解的a-纤维素(实施例5)的DP。
[0331] 样品组成GPCo:
[0332] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0333] 流动相：DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0334] 实验结果示出于附图2a至2e中
[0335] 将无酶溶液加入到0小时样品中，并且通过GPCo分析纤维素冻干物。先前在醋酸盐 缓冲液中孵育并随后冻干的α-纤维素样品用作参考。未水解的α-纤维素样品的DPw为550。 DPn为230。
[0336] 水解5分钟后，黑曲霉样品的DPw下降到180。因此，DPw降低至少50 %得以实现。DPw 继续不断地降低，并且，19小时后，达到值110并因此为初始值的约2 5 %。这表明D P W的降低 随着时间而减慢。5分钟的反应时间后，DPn从初始的240降低到140。当19小时后实验结束 时，DPn降低到50。
[0337] 5分钟内，解淀粉芽孢杆菌样品的DPw降低到140。该反应时间后，DPn达到70。19小时 后，DPw为90且DPn为50。
[0338]当使用爱默生踝节菌内切葡聚糖酶时，水解20分钟后，样品的DPw为150。当使用长 枝木霉内切葡聚糖酶时，40分钟后，DPw达到170。使用来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌的内切 葡聚糖酶时，5分钟后就已经达到这个区域的值。因此，当使用爱默生踝节菌和长枝木霉内 切葡聚糖酶时，DPw的降低比使用黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时进行得更慢。用 爱默生踝节菌内切葡聚糖酶水解19小时后，DPw达到90且DPn达到50。当使用长枝木霉内切葡 聚糖酶时，水解19小时后，DPw达到90且DPn达到40。在Avicel和Sigmacell的水解中，用爱默 生踝节菌内切葡聚糖酶水解大约1小时后，DPw和DPn增加。当使用α-纤维素时，不能观察到DP 的增加。当使用Avicel和Sigmacell时，DP的增加在大约70a的DPw处，当使用α-纤维素时，未 达到该DPw。因此，取决于DPw增加是可能的。当使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶时，也可以观察 到纤维素的降解。然而，水解19小时后，DPw值为150,并且因此高于使用其它内切葡聚糖 酶时。水解19小时后，DPn值为65，与其它内切葡聚糖酶相比DPn也较高。
[0339]通过用5种所用内切葡聚糖酶水解α-纤维素的比较，当使用来自解淀粉芽孢杆菌、 长枝木霉和爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶反应时间19小时的时候，获得了最低的DPw。这些 值在90和93之间。
[0340] 对于所有内切葡聚糖酶，可以观察到DPw的减小，直至实验结束。关于Avicel，多分 散性(参见下表）由DPw和DPn计算得到。
[0341]
[U342」UPW、UPn 和(JLU 通]Q：GP(Jo 佛足（软忏：ASTKA)
[0343] 箭头指示各自的趋势
[0344] 当使用α-纤维素时，DPW和多分散性之间也存在相关性
[0345] 实施例7 :α-纤维素水解的质量平衡
[0346] 结果编辑在下表中：
[0347]
[0349] 不溶性纤维素寡聚物在19小时后通过确定纤维素损失来测量；
[0350] 还原糖在19小时后通过PAHBAH试验测量；
[0351] 葡萄糖和纤维二糖在19小时后通过HPLC测量；
[0352 ]未知的可溶性纤维素寡聚物(PAHBAH试验和HPLC分析之差）19小时后；
[0353] 百分比基于所用的纤维素完全转化时形成的葡萄糖和纤维二糖
[0354] 使用来自海栖热袍菌和黑曲霉的内切葡聚糖酶，87.1 %和94.5 %的不溶性纤维素 在水解后测得。因此，这两种酶由于纤维素损失少而对下面这样的工业过程特别重要，在 该工业过程中，可溶性纤维素寡聚物和葡萄糖不是生产目标当不溶性纤维素采取短链纤维 素寡聚物的形式时。通过海栖热袍菌内切葡聚糖酶，19小时后，DP W为150，比其它内切葡聚 糖酶相同水解时间后的DPw大约高50个单元。因此，虽然使用这种内切葡聚糖酶形成了很少 的副产物，然而DPw没有降低到与使用其它内切葡聚糖酶时相同的程度。以110的DP W，使用黑 曲霉内切葡聚糖酶产生与使用来自解淀粉芽孢杆菌、爱默生踝节菌和长枝木霉的内切葡聚 糖酶相同范围内的DPw。与其它内切葡聚糖酶相比，相同比率的DP W降低以及葡萄糖和可溶性 纤维素寡聚物的低产生，使得黑曲霉内切葡聚糖酶成为用于酶促水解纤维素的有利的内 切葡聚糖酶。
[0355] 以0.7%和0%，来自解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶几乎不产生或 完全不产生可溶性的纤维素寡聚物。来自黑曲霉和长枝木霉的内切葡聚糖酶分别产生 2.7 %和3.1 %的未知纤维素寡聚物。与其它内切葡聚糖酶相比，爱默生踝节菌内切葡聚糖 酶以27.4%产生最大量的未知可溶性纤维素寡聚物。因此，爱默生踝节菌内切葡聚糖酶非 常适合于生产比纤维二糖大的可溶性纤维素寡聚物。
[0356] 实施例8:通过来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌、海栖热袍菌、长枝木霉和爱默生踝节 菌的内切葡聚糖酶酶促水解Sigmacel 1
[0357] 借助于GPC。确定α-纤维素和Sigmacell的水解样品的链长分布。
[0358] 黑曲霉
[0359] 水解混合物的组分：
[0360] 10mg/ml Sigmacell,
[0361] 10U/ml黑曲霉内切葡聚糖酶，
[0362] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0363] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0364]未酶促降解的Sigmacell的链长分布范围在10和1000葡萄糖单元之间，最大值在 300-400葡萄糖单元处，并且，与在50葡萄糖单元和最大值之间的范围内相比，10和50葡萄 糖单元之间的范围内有更浅的倾斜。用黑曲霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，浅区段在10和20 葡萄糖单元之间。链长分布在10和500葡萄糖单元之间，最大值在100葡萄糖单元处。水解6 小时后，链长分布的上端在10和350葡萄糖单元之间，并因此，与5分钟样品的链长分布相 比，向较短链长移位了 150葡萄糖单元。在6小时水解样品中曲线的左手部分中没有变浅可 以分辨。
[0365] 解淀粉芽孢杆菌
[0366] 水解混合物的组分：
[0367] 10mg/ml Sigmacell,
[0368] 10U/ml解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶，
[0369] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0370] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0371]通过来自解淀粉芽孢杆菌的内切葡聚糖酶水解Sigmace 11的5分钟样品的链长分 布在10和400葡萄糖单元之间。该反应时间后，在15和50葡萄糖单元之间没有变浅可以观察 到。直至20小时后实验结束，链长分布的上端持续不断地向较短链移位。该反应时间后，分 布为10和300葡萄糖单元之间。最大值同样向较短链长移位，并且在65葡萄糖单元处。
[0372] 海栖热袍菌
[0373] 水解混合物的组分：
[0374] 10mg/ml Sigmacell,
[0375] 10U/ml海栖热袍菌内切葡聚糖酶，
[0376] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0377] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0378] 用来自海栖热袍菌的内切葡聚糖酶水解5分钟后，链长分布与未处理的Sigmacell 处于相同范围。链长分布的最大值向较短链长移位了 100葡萄糖单元，并且，在10至200葡萄 糖单元的范围内可以辨别出短纤维素链的增加。直至20小时反应时间的实验结束时，链长 分布持续向较短链长移位;在该时间点，其在10和400葡萄糖单元之间。与使用黑曲霉和解 淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶的Sigmacel 1水解实验相比，使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶观 察到较慢的S i gmac e 11降解。
[0379] 长枝木霉
[0380]水解混合物的组分：
[0381] 10mg/ml Sigmacell,
[0382] 10U/ml长枝木霉内切葡聚糖酶，
[0383] 3U/ml农杆菌属物种β-葡糖苷酶，
[0384] 40°C，0.1M pH 4.5的醋酸盐缓冲液< br>[0385] 用来自长枝木霉的内切葡聚糖酶水解Sigmacell 5分钟后，链长分布在15和800葡 萄糖单元之间。在该时间点，在15和60葡萄糖单元之间，链长分布的前面范围中的变浅仍然 可以辨别，但与未处理的Sigmacell的情况相比，其在更短的范围内。链长分布的上端和链 长分布的最大值在实验期间持续向较短链移位，并且，在实验期间变浅持续减少，直至不再 可辨别。20小时后，曲线在10和300葡萄糖单元之间，最大值在80葡萄糖单元处。
[0386] 爱默生踝节菌
[0387] 水解混合物的组分：
[0388] 10mg/ml Sigmacell,
[0389] 10U/ml爱默生踝节菌内切葡聚糖酶，
[0390] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0391] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0392] 与其它水解样品相比，20小时样品的链长分布显示出预料不到的过程。通过来自 爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶水解Sigmacell 1小时后，链长分布范围为10至300葡萄糖单 元，最大值为70葡萄糖单元。此后，可以观察到较长链的增加，伴随着链长分布范围持续变 窄。由于链长分布向较长链长移位，曲线的最大值同样向较长链长移位。6小时的水解时间 后，链长分布在10和250葡萄糖单元之间，最大值在100葡萄糖单元处。
[0393] 总结：
[0394] 比较通过所用的5种内切葡聚糖酶降解Sigmacell，使用黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌 内切葡聚糖酶实现了快速降解。海栖热袍菌和长枝木霉内切葡聚糖酶的降解速率较慢。当 使用来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌、海栖热袍菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶时，水解 Sigmacell 19小时后，链长分布的上端在300至400葡萄糖单元处。使用爱默生踝节菌内切 葡聚糖酶，1小时水解时间后，可以观察到较长链的增加。当使用Avicel和爱默生踝节菌内 切葡聚糖酶时，2小时水解时间后，同样观察到较长纤维素链的增加，这就是为什么不能假 定该观察是测量误差。该观察的原因还不清楚。一种可能性是短链的降解增加，由此，所存 在的较长的链相比起来会更加突出。
[0395] 实施例9:经酶促水解的Sigmace 11的聚合度DP的确定
[0396] 进行GPC分析，以确定经酶促水解的Sigmacell(实施例8)的DP。
[0397] 样品组成GPCo:
[0398] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0399] 流动相：DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0400] 实验结果示出于附图3a至3e中。
[04011 使用黑曲霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，DPw下降到130。DPn从110下降到60。因此， DPw和DPn两者均降低了至少55%。20分钟水解时间后，DPw达100且DPn达40。因此，水解进行 得更慢了。DPw为120，1小时样品和3小时样品的DPw略微增加。DPn显示了类似的过程。6小时 的反应时间后DPw为100和DPn为50支持这样的假设，即，1小时和3小时的水解时间后DPw和 DPn的增加可能同样基于对测量的扰动。
[0402]当使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时，5分钟的水解时间后可以使DPw降低到初 始值的50%。直到实验结束时，DPw持续下降至80，然后停滞。关于DPn，可以观察到类似的过 程。该值同样在5分钟的水解时间后减半，且然后在40分钟后当DPn为50时停滞。实现了降解 的终止。与通过来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌的内切葡聚糖酶水解相比，通过来自爱默生 踝节菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶水解Sigmacell进行得更慢。在5分钟的反应时间后，当 使用爱默生踝节菌内切葡聚糖酶时，DPw为150。1小时的反应时间后，DPw继续下降至75。在该 时间点，DP N处于40。水解3小时后，可以观察到DPw的增加。关于通过爱默生踝节菌内切葡聚 糖酶水解纤维素，同样地，水解2小时后，DPw和DPn两者都增加。一个可能的原因是短链的 降解增加，由此，所存在的较长的链相比起来会更加突出。
[0403]当使用长枝木霉内切葡聚糖酶时，5分钟的反应时间后，DPw达到200。1小时的反应 时间后，DPw继续下降至130。在该时间点，DPn为65。当使用长枝木霉内切葡聚糖酶时，1小时 后，纤维素继续被降解，并且，在实验终止后，DPw达80且DPn达50。
[0404] 与通过来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌、爱默生踝节菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶 水解Sigmacell相比，使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶水解Sigmacell进行得更慢。20小时的 反应时间后，DPw为100且DPn为45,这与当使用黑曲霉内切葡聚糖酶时在6小时反应时间后处 于相同的范围内。
[0405] 使用所提出的内切葡聚糖酶水解20小时后，DPw可以被降低到小于初始值的一半。 所用的内切葡聚糖酶在它们的反应速率和实验结束时所达到的DPw的方面不同。使用来自 解淀粉芽孢杆菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶可以达到最低的DP值。使用来自解淀粉芽孢杆 菌的内切葡聚糖酶，DPw停滞于80。因此，实现了降解的终止。使用来自黑曲霉、海栖热袍菌 和爱默生踝节菌内切葡聚糖酶，DPw下降直到实验结束。因此，未实现降解的终止。
[0406] 由于这样一个事实，即，与其它内切葡聚糖酶相比，来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌 的内切葡聚糖酶的反应速率更快，这些内切葡聚糖酶对于进一步的实验研究来说特别重 要。
[0407] 与六￥；[061和€[-纤维素的情况一样，Sigmacell的多分散性同样由DPw和DPn计算得 到，并且，可见下表。
[0408]
[0410] DPW、DPN 和 CLD 通过 GPCo 确定(软件:ASTRA)
[0411] 箭头指示各自的趋势
[0412] 使用来自黑曲霉和爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶酶促水解的DP和多分散性结果 彼此不相关联。由于黑曲霉内切葡聚糖酶的水解样品中的测量误差和爱默生踝节菌内切葡 聚糖酶的水解样品不寻常的DP上升，然而，关于这些内切葡聚糖酶，没有使用1天后的DP结 果。其它内切葡聚糖酶的1天水解时间的DPw和多分散性彼此相关，如同关于Avi ce 1和α-纤 维素已经观察到的那样。
[0413] 实施例l〇:Sigmacell水解的质量平衡 [0414]读数收集在下表中：
[0415]
[w'l &」 个浴?王纤维系昜眾物仕卻小叮后通迓佛疋纤维系烦天米测重；
[0417] 还原糖在20小时后通过ΡΑΗΒΑΗ试验测量；
[0418] 葡萄糖和纤维二糖在20小时后通过HPLC测量；
[0419] 未知的可溶性纤维素寡聚物(ΡΑΗΒΑΗ试验和HPLC分析之差)20小时后；
[0420]百分比基于所用的纤维素完全转化时形成的葡萄糖和纤维二糖
[0421] 使用来自黑曲霉的内切葡聚糖酶，水解后测量到87.9%的不溶性纤维素。当使用 海栖热袍菌内切葡聚糖酶时，测量到100%的不溶性纤维素。由于Sigmacell损失少，因此这 两种酶对于其中可溶性纤维素寡聚物和葡萄糖不是生产目标的工业过程来说特别重要。
[0422] 使用ΡΑΗΒΑΗ试验，在通过海栖热袍菌内切葡聚糖酶的S i gmac e 11水解中确定出 9.1 %的还原糖部分。由于至少9.1 %的所用纤维素已被转化为葡萄糖和可溶性纤维素寡聚 物，因此，100%不溶性纤维素的比例太高了。当使用来自解淀粉芽孢杆菌、海栖热袍菌和黑 曲霉的内切葡聚糖酶时，产生了少于4%的未知的可溶性纤维素寡聚物。使用来自爱默生踝 节菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶分别产生了 12.7%和25.4%的未知的可溶性纤维素寡聚 物。因此，这些内切葡聚糖酶适合于生产可溶性纤维素寡聚物。
[0423] 实施例11:用离子液体进一步预处理后纤维素的第二次酶促水解:（IL重启）
[0424] 使用IL重启，已通过酶促水解降解2天的纤维素再溶解于离子液体中，且随后沉 淀。该纤维素通过进一步预处理被再次降解。使用这种方法，可以研究由底物引起的降解终 止。这些研究的结果描述于下文。
[0425] 来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶被用于这些实验，因 为对于纤维素寡聚物的生产来说它们特别有兴趣，这归因于产生溶解糖少。使用短链底物 Avicel和长链底物α-纤维素进行这些研究，以便研究是否存在链长依赖性。
[0426] 实施例lla:IL重启后的Avicel的水解
[0427] 通过GPCo分析样品，以分析对Avicel水解的后续实验。
[0428] 水解混合物的组分：
[0429] 10mg/ml Avicel,
[0430] 分别来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的10U/ml内切葡聚糖酶，
[0431 ]分别来自黑曲霉和农杆菌属物种的3U/mli3-葡糖苷酶，
[0432] 40°(3，分别为0.说？!16的磷酸盐缓冲液和0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液。
[0433] 对于进行IL重启的样品的链长分布，可以观察到，其与简单水解相比，链长分布的 上端向较短链的移位。通过第二次水解所产生的链长分布根据所用的内切葡聚糖酶而不 同。当使用黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时，进行IL重启后可以辨别出具有18葡 萄糖单元大小的纤维素寡聚物的增加。由于具有18葡萄糖单元大小的纤维素寡聚物的增 加，在进行IL重启后使用黑曲霉内切葡聚糖酶水解中观察到18葡萄糖单元处的进一步最大 值。使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶，进行IL重启后可以观察到具有15葡萄糖单元大小的纤 维素寡聚物的增加。
[0434] 实施例1 lb: IL重启后经酶促水解的Avice 1的聚合度DP的确定
[0435] 进行GPC分析，以确定经酶促水解的Avice 1 (实施例1 la)的DP。
[0436] 样品组成GPCo:
[0437] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0438] 流动相：DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0439] 实验结果示出于附图4a至4c中。
[0440]由黑曲霉内切葡聚糖酶水解21小时后，DPw达到85。已孵育45小时的样品的分析表 明纤维素没有任何进一步降解。事实上，DPw上升到95。因此，当使用这种内切葡聚糖酶和 Av i ce 1时，1天的反应时间是足够的。
[0441]通过IL重启的处理允许DPw降低到单次水解后的值的一半。因此，IL重启方法是用 于生产DPw为40的纤维素的合适的方法。
[0442]当使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时，除重启实验的样品以外的样品的DPw在 55和65之间。当使用IL重启方法时，获得了 35的DPw。
[0443] 当使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶时，1天和2天样品的DPw达到80。IL重启方法导致 55的DPw。与简单水解的DPw相比，使用这种方法时，DPw可以降低至少30%。
[0444] 实施例11 c: IL重启后α-纤维素的水解
[0445] 通过GPC分析样品，以分析α-纤维素水解的后续实验。
[0446] 水解混合物的组分：
[0447] 10mg/mla-纤维素，
[0448] 分别来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的10U/ml内切葡聚糖酶，
[0449] 分别来自黑曲霉和农杆菌属物种的3U/mli3-葡糖苷酶，
[0450] 40°(3，分别为0.说？!16的磷酸盐缓冲液和0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液。
[0451]使用所用酶的α-纤维素水解实验的链长分布显示与Avicel水解基本上类似的谱。 仅IL重启实验导致显著降低的分子量。当使用黑曲霉内切葡聚糖酶时，进行IL重启后可以 辨别出具有18葡萄糖单元大小的纤维素寡聚物的增加。进行IL重启后，链长分布向较短链 移位，并且在10和200葡萄糖单元之间。当使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶用于水解α-纤 维素时，进行IL重启后链长分布的最大值向较短链长移位了 30葡萄糖单元。使用海栖热袍 菌内切葡聚糖酶进行IL重启后，没有观察到链长分布的上端或链长分布的最大值向较短链 长的移位。
[0452] 实施例lid: IL重启后经酶促水解的α-纤维素的聚合度DP的确定
[0453] 进行GPC分析，以确定经酶促水解的α-纤维素(实施例11c)的DP。
[0454] 样品组成GPC。：
[0455] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0456] 流动相:DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0457] 实验结果示出于附图5a至5c中。
[0458] 对于来自黑曲霉和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶来说，通过将反应时间延长至2天， 可以实现DPw的降低。对于解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶来说，这并不清楚，因为由于冻干 问题，1天水解样品被丢弃了。
[0459] 至于黑曲霉内切葡聚糖酶，与简单水解相比，当使用IL重启时，2天后DPw降低了 40% 〇
[0460]与简单水解相比，当使用IL重启方法与解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时，2天后 DPw可以降低36%。
[0461 ]使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶，水解1天后DPw达140且水解2天后DPw达120。与简单 水解相比，通过进行IL重启，不能实现进一步的降解。
[0462] 在简单水解中，DPw下降直至2天后实验结束；因此，没有实现降解的终止。
[0463] 使用IL重启方法，可以生产DPw为55的α-纤维素。
[0464] 实施例中使用的β-葡糖苷酶是本发明的可选的进一步配置。已经可以在根据本发 明的研究的范围内证明所述酶的使用不是强制性的。
[0465] 已知的是，由于纤维素降解产物(尤其是纤维二糖）的存在，β_葡糖苷酶能够防止 由内切葡聚糖酶所引起的任何产物抑制。然而，使用这种酶的实际必要性可以通过少量的 例行初步实验来确定。
[0466] 参考了本文引用的文献的公开内容。
【主权项】
1. 用于生产纤维素寡聚物的方法，其中 a) 在水性反应介质中，使用至少一种内切葡聚糖酶(EG) (E.C. 3.2.1.4)，水解切割纤维 素(纤维质的起始材料），以及 b) 从反应介质中分离包含一种或多种纤维素寡聚物的反应产物，S卩，纤维素寡聚物部 分。2. 根据权利要求1的方法，其中所形成的（一种或多种)纤维素寡聚物具有在从10至100 的范围中的数均链长(数均聚合度DPn)。3. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所形成的（一种或多种)纤维素寡聚物具有 在从15至50的范围中的DPn值。4. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中EG是天然的或重组产生的，任选地来自芽 孢杆菌属(Bacillus)、曲霉属(Aspergillus)或热袍菌属(Thermotoga)，特别地物种解淀粉 芽抱杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)、黑曲霉（Aspergillusniger)或海栖热袍菌 (Thermotogamaritima)的微生物的经遗传修饰的酶，或这些天然或重组酶中的至少两种 的组合。5. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中酶促水解在水性介质中在大约3至8,特别 是4至7的范围中的pH和/或在从20至90°C，特别地从30至80°C的范围中的温度和/或在0.1 至100小时，特别地1至48小时的持续时间中进行。6. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种EG以大约0.01至100，如，举例来 说，1至50或2至10U/ml反应混合物的浓度施用。7. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中以基于反应混合物的总体积的从0.1至5% (w/v)的范围中的浓度施用纤维素。8. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中纤维素 al)经历预处理步骤，通过所述步骤纤维素的结晶度降低，以及 a2)使用EG将步骤al)的纤维素酶促水解。9. 根据权利要求8的方法，其中使用离子液体、酸和/或机械能量输入通过步骤al)中的 处理降低纤维素的结晶度。10. 根据权利要求9的方法，其中离子液体选自在100°C以下温度为液体的盐，如，特别 是，1 -乙基-3-甲基咪唑乙酸盐(EM頂Ac)和3-甲基-N-丁基氯化吡啶（[C4mpy]C1)。11. 根据权利要求10的方法，其中，在步骤al)中，将纤维素引入离子液体中，在其中溶 解，任选在热作用下并随后通过添加水、有机溶剂或其混合物而沉淀，将沉淀分离下来，任 选洗涤并且任选去除液体。12. 根据权利要求9的方法，其中，在步骤al)中，用浓磷酸进行酸处理。13. 根据权利要求9的方法，其中，在步骤al)中，用球磨机进行机械处理。14. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中在分离反应产物之前，重复一次或多于一 次处理步骤，特别是步骤al)和a2)。15. 通过根据前述权利要求中任一项的方法生产的纤维素寡聚物作为食品和饲料、化 妆品或药品的添加剂，作为洗涤剂添加剂，作为流变学改性剂，以及作为用于有机合成的起 始材料的用途。
【专利摘要】本发明涉及使用内切葡聚糖酶生产纤维素寡聚物(纤维素寡聚物)的方法，并且涉及所生产的寡聚物在多种技术领域中的用途。
【IPC分类】C12P19/14
【公开号】CN105492619
【申请号】CN201480047987
【发明人】M·格兰斯特罗姆, A·金德勒, A·斯拜斯, S·克鲁格, B·邦哈格
【申请人】巴斯夫欧洲公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月30日
【公告号】EP3017056A2, WO2015000858A2, WO2015000858A3
【专利说明】内切葡聚糖酶诱导的纤维素寡聚物生产
[0001] 本发明涉及使用内切葡聚糖酶生产纤维素寡聚物(纤维素寡聚物)的方法，并且涉 及所生产的寡聚物在多种技术领域中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 纤维素是地球上最丰富的聚合物[Pinkert，Marshet等人·Chemical Reviews，109 (12): 6712-6728，2009];其以木质纤维素的形式出现在植物细胞壁中[Teeri，T. T.，Trends in Biotechnology，15(5): 160-167,1997]。植物的初生细胞壁和次生细胞壁包含10至90% 的木质纤维素纤维[取；1161^.1，厶11861116；[116 1111(11]1〇161〇11&代13〇七&1111<：，第1卷.1'11161116， Stuttgart ,2008]。在植物细胞壁中，纤维素与木质素和半纤维素一起形成纤维素原纤维。 在纤维素原纤维内部存在结晶核心，该结晶核心由30至100个彼此平行排列的纤维素分子 组成。纤维素是植物细胞壁的结构单元，并负责稳定性和拉伸强度，但同时也负责柔性。
[0004] 与糖和淀粉形成对照，纤维素不是与人体营养相关的食物，并据此是用于材料和 产生能量的伦理可再生原料。
[0005] 对纤维素寡聚物的生产和它们的潜在用途知之甚少。对食品和洗涤剂的添加将是 可行的。由于纤维素寡聚物中有大量的羟基，后者可以在许多位点进行衍生化，由此它们的 性质可以以靶向的方式进行改性。近年来，关于多步骤转化纤维素为生物燃料的大量研究 已经发表[Hahn-Haegerdal 等人，Trends in Biotechnology ,24(12) :549-556,2006， Jorgensen等人，2007，Waltz 2008]，这是因为对可再生能源的寻找推动了该领域中的研 究。
[0006] 在2008年已经报道了使用离子液体中的固体催化剂用于纤维素的水解[Rinaldi 等人，Angewandte Chemie-International Edit ion ,47(42): 8047-8050，2008]。然而，在纤 维素解聚的过程中，可能会生成葡萄糖降解产物，如羟甲基糠醛、甲酸和可能对纤维素寡聚 物的用途产生不利影响的其它产物[Rinaldi等人.Chemsuschem，3(2) :266-276,2010]。糖 在离子液体中的良好溶解性使糖的提取和离子液体的循环利用变得复杂[Rinaldi等人， Angewandte Chemie-International Edition ,47(42): 8047-8050，2008]。如果反应过早终 止，可以在1 . 5小时的反应时间之后以90 %的产率制备具有大约30DP的纤维素寡聚物 [Rinaldi等人，Angewandte Chemie-International Edition,47(42) :8047-8050,2008] 〇
[0007] 因此，本发明的目的是提供一种方法，在该方法帮助下可以提供纤维素寡聚物，但 是，并没有已知制备方法的缺点。
[0008] 发明概述
[0009] 根据本发明，提供了新颖的和令人惊奇的有利的方法过程，其借助于内切葡聚糖 酶来生产不溶性纤维素寡聚物。根据本发明的方法特别显示了关于生产这样的寡聚物的优 点，该寡聚物具有限定的链长度和不溶性纤维素寡聚物的窄链长分布，产生的可溶性糖少， 并且实现了接近水中溶解性极限的纤维素寡聚物链长。
[0010] 由于纤维素是水不溶性的，因此部分结晶的生物聚合物难以在水性介质中酶促水 解[Dadi 等人，Biotechno logy and Bioengineering ,95(5): 904-10，2006]，特别合适的，可 以进行额外的预处理，例如借助于离子液体。特别地，使用可商购的纯化的内切葡聚糖酶来 水解纤维素，如，尤其是来自黑曲霉(4.111861')、解淀粉芽孢杆菌(13.311171〇119116€3(^6118)、 海栖热袍菌(T · mar i t ima)的内切葡聚糖酶。
【附图说明】
[0011]图1&至16示出借助于内切葡聚糖酶酶促水解4"(^1过程中随着时间的0?,和0? 11， 前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲霉，b)解淀粉芽孢杆菌，c)海栖热袍菌，d)长枝木霉 (T. longibrachiatum)和e)愛默生踝节菌（T. emersonii)。
[0012] 图2a至2e示出了借助于内切葡聚糖酶酶促水解α-纤维素过程中随着时间的DPw和 DPn，前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲霉，b)解淀粉芽孢杆菌，c)海栖热袍菌，d)长枝木霉和e) 爱默生踝节菌。
[0013] 图3a至3e示出了借助于内切葡聚糖酶酶促水解Sigmacell过程中随着时间的聚合 度DPjPDPn，前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲霉，b)解淀粉芽孢杆菌，c)海栖热袍菌，d)长枝木 霉和e)爱默生踝节菌。
[0014] 图4a至4c示出了，用离子液体(IL Restart)中间处理之后借助于内切葡聚糖酶的 两步酶促水解Avi ce 1过程中随着时间的聚合度DP4PDPn，前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲霉， b)解淀粉芽孢杆菌和c)海栖热袍菌。
[0015] 图5a至5c示出了，用离子液体(IL Restart)中间处理之后借助于内切葡聚糖酶的 两步酶促水解α_纤维素过程中随着时间的聚合度DPW和DP n，前述内切葡聚糖酶来自a)黑曲 霉，b)解淀粉芽孢杆菌和c)海栖热袍菌。
[0016] 本发明的详细描述
[0017] 1. -般定义
[0018] "DPn值"指的是寡聚物或聚合物的基于数字的聚合度，或数均链长。
[0019] "DPw值"指的是寡聚物或聚合物的基于重量的聚合度，或链长。
[0020] "DPn值"和"DPw值"根据本发明通过实验来确定，特别是在标准条件下使用凝胶渗 透色谱(GPC)来确定，该标准条件在实验部分中进行更详细地描述(流动相，运行温度，流 速，柱材料)。
[0021] "链长分布"和"摩尔质量分布"分别指的是通过GPC确定的链长和摩尔质量的频率 分布。数均摩尔质量Mn和重均摩尔质量Mw可以用来定量描述链长或摩尔质量分布的范围。 [0022]多分散性被定义为Mw与Mn之比，并且为1或大于1。多分散性越低，摩尔质量分布越 窄。
[0023]在本发明的上下文中，"纤维素"应在广义上理解为低木质素和基本上无半纤维素 的纤维素材料的领域，从纸浆到纯的纤维素。既可以采用纯的产品，也可以采用纤维素物 质混合物，只要它们不会对酶反应造成实质性的负面影响即可。纤维素可以是完全非结晶 的或者完全结晶的或者表现出平均程度的结晶度(Crl%)，这可以通过已知测定方法(例如 X射线衍射)来测定。所用纤维素的"DPn值"例如可以在大约30至150的范围。"DPw值"例如可 以在120至500的范围。
[0024] "纤维素寡聚物"是由多个β-1，4_糖苷连接的葡萄糖单元组成的、DPn值范围为10 至70的寡聚物。
[0025]内切葡聚糖酶(E.C. 3.2.1.4)是在纤维素分子内进行随机切割的酶。它们攻击纤 维素的非晶形区。随机链切割产生两条纤维素链，在大多数情况下它们具有不同的长度。这 导致DPw迅速减小，并且导致还原末端增加[Lynd等人，Microbiology and Molecular Biology Reviews,66(3):506-577，2002]。
[0026] 一个内切葡聚糖酶活性单位被定义为在40°C和4.5或6的pH时每分钟从羧甲基纤 维素生成lmmol葡萄糖当量的还原糖所需的酶量。
[0027] β_葡糖苷酶(E. C. 3.2.1.21，或β-l，6_糖苷酶)是作用于两个葡萄糖或取代的葡萄 糖分子之间的m-Μ键的葡糖苷酶。它是外切纤维素酶(exocellulase)，对许多β-D-糖苷底 物都具有特异性。它催化β-D-葡萄糖苷中的非还原末端残基的水解，并释放葡萄糖。
[0028] 解淀粉芽孢杆菌是革兰氏阳性的杆状细菌，其由J.Fukomoto于1943年发现 [FukomotoJ.，J.Agric.Chem.S0C.Jpn.，19;487-503;1943]。仅在1987年，一组科学家对其 表征，并宣布其为独立物种[Priest 等人.International Journal of Systematic Bacteriology，37( 1):69-71，1987]。解淀粉芽孢杆菌是从土壤中分离得到的，其具有0· 7μπι 至0.9μπι X 1.8μπι至3 . Ομπι的尺寸。其细胞表现出周生的鞭毛，可以移动，并形成链。最适温度 在30°C和40°C之间。在低于 15°C时生长停止[Priest等人，International Journal of Systematic Bacteriology ,37(1) :69-71，1987]。从解淀粉芽孢杆菌制成的淀粉酶是工业 上用于淀粉水解的酶。在美国典型培养物保藏中心，解淀粉芽孢杆菌的编号为23350。
[0029] 黑曲霉是需氧生长的丝状真菌[Schuster等人.Applied Microbiology and Biotechnology，59(4-5) :426-435,2002]。在自然界中，黑曲霉被发现于土壤、垃圾、堆肥和 腐烂植物材料中。黑曲霉生长在6°C至47°C的温度和1.4至9.8的pH范围内[Reiss，J.， Schimmelpilze Lebensweise，Nutzen，Schaden，Bekaempfung. Springer，1986]。它产生分 散在空气中的黑色遮蔽的分生孢子。在工业上，黑曲霉主要用于生产柠檬酸和葡萄糖酸 [Roukas,T.,Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,25(6):298-304,2000]。
[0030] 海栖热袍菌是杆状的、革兰氏阴性的、严格厌氧的细菌，其具有自由的外层细胞 膜。1986年，海栖热袍菌由R.Huber在意大利火山中发现。这种细菌的最适生长温度为80°C。 在55°C以下不发生增长。海栖热袍菌长度为1.5μπι至Ι?μπι，宽度为0.6μπι。它表现出近极的单 鞭毛，因此可以自由移动[Huber等人，Archives of Microbiology, 144(4):324-333, 1986]。海栖热袍菌在简单的和复杂的碳水化合物上生长，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、纤维素和 木聚糖[Nelson，K.E.等人，Nature,399(6734) :323-329,1999]〇
[0031 ] 愛默生踝节菌属于发菌科(Trichocomaceae)，该科属于子囊菌门（Ascomycota)， 其由Stolk于 1965年发现[Stolk，A.C.等人，Journal of Microbiology and Serology,31 (3):262，1965]。目前的名字是 Rasamsonia emersoni i [Houbraken,Spierenburg, Frisvad.Antonie van Leeuwenhoek,101(2):403-21,2012]〇
[0032] 长枝木霉属于肉座菌科(Hypocreaceae)。该科属于子囊菌门（Ascomycota)。长枝 木霉由Rifai于 1969年发现[Rifai ,Μ·Α· ,Mycological Paters No · 116 ,Commonwealth Mycological Institute, 1969]。该物种已经成为许多研究的目标[Bissett ,J. ,Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,62(5):924-931,1984；J., Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,69(11):2357-2372, 1991；J.,Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,69(11):2373- 2417,1991；J.,Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne de Botanique,69(ll): 2418-2420,1991]〇
[0033] 2.本发明的特别实施方案：
[0034] 本发明特别涉及以下实施方案：
[0035] 1.用于生产纤维素寡聚物的方法，其中
[0036] a)在水性反应介质中，使用至少一种内切葡聚糖酶(EG)(E.C.3.2.1.4)特别是微 生物的EG，诸如，举例来说，来自细菌或真菌的EG，水解切割纤维素或纤维质起始材料，以及
[0037] b)从反应介质中分离反应产物，该反应产物包含一种或多种纤维素寡聚物，即，纤 维素寡聚物部分。
[0038] 2.根据实施方案1的方法，其中所形成的（一种或多种)纤维素寡聚物具有范围为 10至100的数均链长或数均聚合度DPn。
[0039] 3.根据前述实施方案中任一项的方法，其中所形成（的一种或多种)纤维素寡聚物 具有在从15至50的范围中的DPn值，如，举例来说，20至45，25至40，或30至35。
[0040] 根据本发明生产的纤维素寡聚物的链长分布例如可以在从5至500，10至4000，15 至300,20至2000,或25至150的范围中，但并不限于此。
[0041] 4.根据前述实施方案中任一项的方法，其中EG是天然的或重组产生的，任选是来 自芽孢杆菌属、曲霉属或热袍菌属的微生物，特别是物种解淀粉芽孢杆菌、黑曲霉或海栖热 袍菌的遗传修饰的酶，或这些天然或重组的酶中至少两种的组合。
[0042] 5.根据前述实施方案中任一项的方法，其中酶促水解在水性介质中在大约3至8， 特别是4至7或5至6的范围中的pH和/或在从20至90°C，特别是从30至80°C或从40至70°C的 范围中的温度和/或在0.1至100小时，特别是1至72小时或1至48小时的持续时间中进行。 [0043] 6.根据前述实施方案中任一项的方法，其中至少一种EG以大约0.01至100U/ml， 如，举例来说，1至50，1.5至30，或2至10U/ml反应混合物的浓度应用。
[0044] 7.根据前述实施方案中任一项的方法，其中以基于反应混合物的总体积从0.1至5 或从1至4或从2至3% (w/v)的范围中的浓度采用纤维素。
[0045] 8.根据前述实施方案中任一项的方法，其中纤维素
[0046] al)经历预处理步骤，通过该步骤，纤维素的结晶度降低，以及
[0047] a2)使用EG对步骤al)的纤维素进行酶促水解。
[0048] 9.根据实施方案8的方法，其中，使用离子液体、酸和/或机械能量输入通过步骤 al)中的处理而降低纤维素的结晶度。
[0049] 10.根据实施方案9的方法，其中所述离子液体选自在温度100°C以下为液体的盐， 如，特别是，1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐(EM頂Ac)和3-甲基-N-丁基氯化吡啶（[C4mpy]Cl)。
[0050] 11.根据实施方案10的方法，其中，在步骤al)中，将纤维素引入离子液体中，在其 中溶解，任选在热作用下，如，举例来说，20至80°C，25至60°C或30至50°C并随后通过添加 水、有机溶剂或它们的混合物而沉淀，将沉淀分离出来，任选洗涤并且任选去除液体。
[0051] 12.根据实施方案9所述的方法，其中，在步骤al)中，用浓磷酸进行酸处理。
[0052] 13.根据实施方案9所述的方法，其中，在步骤al)中，用球磨机进行机械处理，例如 使用1mm玻璃珠，和/或，瓦特数在大约200至600或300至500或大约400W的范围中。
[0053] 14.根据前述实施方案中任一项的方法，其中，在分离反应产物之前，重复一次或 多于一次处理步骤，特别是步骤al)和a2)。
[0054] 15.根据前述实施方案之一的方法，其中，在β-葡糖苷酶的存在下额外地进行反 应。
[0055] 16.通过根据前述实施方案中任一项的方法生产的纤维素寡聚物的用途，作为食 品和饲料、化妆品或药品的添加剂，作为洗涤剂添加剂，作为流变学改性剂，以及作为有机 合成的起始材料。
[0056] 3.本发明的另外的配置
[0057] 3.1酶一一可以使用的内切葡聚糖酶
[0058] 本发明不限于具体公开的或使用的具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质或酶，而是还 延伸到它们的功能等同物。
[0059] 从文献中已知的，根据本发明所使用的酶的氨基酸序列的非限制性实例在下文中 指明。
[0060] 海栖热袍菌：（SEQ ID Ν0:1)
[0061] Nelson K · E ·等人，''Evidence for lateral gene transfer between Archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima·〃Nature399:323-329 (1999)
[0062] Uniprot:Q9X274
[0064] 黑曲霉：（SEQ ID N0:2)
[0065] van Peij N.N.等人，〃The transcriptional activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene expression in Aspergillus niger , Appl.Environ.Microbiol.64:3615-3619(1998)
[0066] Uniprot:074705
[0067]
[0068] 解淀粉芽孢杆菌(SEQ ID NO:3):
[0069] Zhang G.等人/'Complete Genome Sequence of Bacillus amyloliquefaciens TA208, a Strain for Industrial Production of Guanos ine and Ribavirin, J.Bacteriol.193:3142-3143(2011)
[0070] Uniprot:F4E3N1
[0071]
[0072] 根据本发明具体使用或本文所描述的酶的"功能等同物"或类似物是这样的多肽， 其在本发明范围内不同于所述酶，但是其保留所期望的生物学活性，如，举例来说，内切葡 聚糖酶活性。
[0073] 因此，例如，"功能等同物"应理解为意指这样的酶，其在所使用的内切葡聚糖酶活 性测定中，具有高于或低于包含本文所定义的氨基酸序列的酶至少10%或20%，如，举例来 说，至少50 %或75 %或90 %的活性。此外，功能等同物优选在pH 2至11之间稳定，并且有利 地具有在从pH 3至10的范围中的最适pH，以及在从25°C至95°C或20°C至70°C的范围中的最 适温度，如，举例来说，大约45至60°C或大约50至55°C。
[0074] 内切葡聚糖酶活性可以借助于多种已知测定来检测。不施加任何限制，可以提及 在40°C和pH为4.5或6的标准条件下使用参考底物(如，举例来说，羧甲基纤维素)的测定。
[0075] 根据本发明，"功能等同物"也可以特别理解为意指这样的"突变体"，其在上述氨 基酸序列的至少一个序列位置具有与具体提到的氨基酸不同的氨基酸，同时保持上述生物 学活性之一。因此，"功能等同物"包括通过一个或多个氨基酸添加、取代、删除和/或倒置可 获得的突变体，上述修改可以发生在任何序列位置处，只要其导致具有根据本发明的性质 谱的突变体即可。功能等同还特别存在于当突变体和未修饰的多肽之间的反应性模式在性 质方面一致的时候，即，当相同底物以不同的速率转化的时候。合适的氨基酸取代的实例收 集在下表中：
[0076]
[0077]
[0078]上述意义中的"功能等同物"还是所描述的多肽的"前体"，以及多肽的"功能衍生 物"和"盐"。
[0079] 在本文中，"前体"是具有或不具有所期望的生物活性的多肽的天然或合成的前 体。
[0080] 术语"盐"应理解为不仅意指羧基的盐，还意指根据本发明的蛋白质分子的氨基的 酸加成盐。羧基的盐可以以本身已知的方式制备，并且包括无机盐，如，举例来说，钠，钙， 铵，铁和锌盐，以及与有机碱的盐，如，举例来说，胺，如三乙醇胺，精氨酸，赖氨酸，哌啶等。 酸加成盐，如，举例来说，与矿物酸如盐酸或硫酸的盐，以及与有机酸如乙酸或草酸的盐，同 样是本发明的主题。
[0081] 类似地，可以借助于已知技术在功能氨基酸侧基或在其N-或C-末端上制备根据本 发明的多肽的"功能衍生物"。这样的衍生物包括，例如，羧酸基团的脂族酯，羧酸基团的酰 胺，其通过与氨或与伯胺或仲胺反应可获得;游离氨基的N-酰基衍生物，其通过与酰基反应 制得;或游离羟基的〇-酰基衍生物，其通过与酰基反应制得。
[0082] 当然，"功能等同物"还包括可从其它生物体获得的多肽，以及天然存在的变体。例 如，可以通过序列比对来鉴定同源序列区域的区域，以及基于本发明的特定要求确定等同 的酶。
[0083] "功能等同物"也包括根据本发明的多肽的片段，优选地单结构域或序列基序，其 例如具有期望的生物功能。
[0084] "功能等同物"还可以是这样的融合蛋白，其包括上述多肽序列或由其衍生的功能 等同物之一，以及至少一个另外的、与其在功能上不同并且处于功能性N-或C-末端连接 (即，融合蛋白的各部分没有显著的相互功能损害）的异源序列。这样的异源序列的非限制 性实例是，例如，信号肽，组氨酸锚或酶。
[0085] 根据本发明还包括的"功能等同物"是具体公开的蛋白质的同源物。它们与具体公 开的氨基酸序列之一具有至少60%、优选至少75%、特别是至少85%，如，举例来说90、91、 92、93、94、95、96、97、98或99%的同源性（或同一性），这通过？6&18〇11和1^口111 &11， Proc.Natl. Acad, Sci.(USA)85(8)，1988,2444-2448的算法进行计算。根据本发明的同源多 肽的百分比同源性或同一性尤其意指基于本文具体描述的氨基酸序列之一的总长度的氨 基酸残基的百分比同一性。
[0086] 百分比同一"性也可以根据BLAST比对、算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或通过 使用下文详细说明的Clustal设置来确定。
[0087] 在可能的蛋白质糖基化的情况下，根据本发明的"功能等同物"包括处于去糖基化 或糖基化的形式，以及通过改变糖基化模式可获得的修饰的形式的上文指明类型的蛋白 质。
[0088] 根据本发明的蛋白质或多肽的同源物可以通过诱变而生成，即，通过蛋白质的点 突变、延伸或截短。
[0089] 根据本发明的蛋白质的同源物可以通过筛选突变体(如，举例来说，截短突变体） 的组合文库来鉴定。例如，蛋白质变体文库可以通过核酸水平上的组合诱变(如，举例来说， 通过合成的寡核苷酸的混合物的酶促连接)而产生。有大量方法用于从简并寡核苷酸序列 制备潜在同源物的文库。可以在自动DNA合成仪上进行简并基因序列的化学合成，并且，合 成的基因可以随后连接到合适的表达载体中。使用基因的简并集合使得能够在混合物中提 供编码潜在蛋白质序列的期望的集合的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法对于本领域技 术人员来说是已知的（例如，Narang，S·Α· (1983)Tetrahedron 39: 3; Itakura等人·（ 1984) Annu .Re v.Biochem .53:323; I takura等人，（1984 )Science 198:1056;Ike 等人（1983) Nucleic Acids Res.ll:477)〇
[0090] 用于在已通过点突变或截短而制备的组合文库中筛选基因产物和用于针对具有 选定特性的基因产物而筛选cDNA文库的一些技术在现有技术中是已知的。这些技术可以适 用于已由根据本发明的同源物的组合诱变产生的基因文库的快速筛选。用于筛选大规模基 因文库（其经历高通量分析）的最常用的技术包括，将基因文库克隆到可复制的表达载体 中，用所得到的载体文库转化合适的细胞，以及在下面的条件下表达组合基因，在该条件 下，对期望活性的检测有助于编码其产物已被检测出的基因的载体的分离。增加文库中功 能突变体频率的技术，递归整体诱变(REM)，可以与筛选试验组合使用以鉴定同源物(Arkin 和Yourvan(1992)PNAS89:7811_7815;Delgrave等人·（1993)Protein Engineering 6(3): 327-331)〇
[0091] 此外，通过示例的方式，本领域技术人员对于产生本文使用的内切葡聚糖酶的功 能突变体的方法是熟悉的。
[0092] 根据所使用的技术，本领域技术人员可以完全随机地或更靶向地将突变引入基因 或非编码核酸区域(其例如对调节表达是重要的），并随后构建基因文库。关于该目的所需 的分子生物学方法是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Sambrook和Russell，分子克 隆，第三版，冷泉港实验室出版社，2001年（33111131'〇〇1<：和1?1188611，]\1〇16(311131'(]1〇11；[叫，第3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)0
[0093] 修饰基因的方法和修饰由它们所编码的蛋白质的方法对于本领域技术人员来说 早已是公知的，如，举例来说，
[0094] 一一位点特异性诱变，其中基因的单个或更多核苷酸以靶向的方式被替换 (Trower MK(编）1996;In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey),
[0095] --饱和诱变，其中任何氨基酸的密码子可以在任何基因座处被替换或添加 (Kegler-Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res22:1593；Barettino D, Feigenbutz M,Valcarel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541；Barik S (1995)Mol Biotechnol 3:1)，
[0096] 一一易错聚合酶链式反应(易错PCR)，其中核苷酸序列通过错误工作的DNA聚合酶 而突变（Eckert KA，Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Resl8:3739);
[0097] 一一SeSaM方法(序列饱和法），其中通过聚合酶来防止偏好的取代。Schenk等人， Biospektrum，第3卷，2006，277-279
[0098] 一一增变株中的基因的传代，其中，例如，由于有缺陷的DNA修复机制，核苷酸序列 的突变率增加发生（Greener A,Callahan M，Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain.In:Trower MK(编）In vitro mutagenesis protocols.Humana Press，New Jersey)，或
[0099] 一一DNA改组，其中，密切相关的基因池被形成和消化，并且，片段用作聚合酶链式 反应的模板，其中通过反复的链分离和再退火最终产生全长嵌合基因 （Stemmer WPC( 1994) Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
[0100] 使用"定向进化"（尤其描述于，Reetz MT和Jaeger K_E(1999)，Topics Curr Chem 200:31；Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution,收录于：Demain AL,Davies JE(编）Manual of industrial microbiology and biotechnology.American Society for Microbiology)，本领域技术人员也可以以选择性方式并且大规模地产生功能突变体。这 里，在第一步中，最初产生相应蛋白质的基因文库，其中可以采用例如上文所指出的方法。 基因文库以合适的方式表达，例如通过细菌或通过噬菌体展示系统表达。
[0101]表达功能突变体的宿主生物的相关基因可以经历另外的突变周期，所述功能突变 体具有这样的特性，该特性很大程度上符合期望特性。突变和选择或筛选的步骤可以迭代 地重复，直到存在的功能突变体以足够的程度具有期望特性为止。作为该迭代步骤的结果， 可以逐步进行有限数量的突变(如，举例来说，1至5个突变），并针对它们在各自的酶特性上 的影响进行评估和选择。然后，所选择的突变体可以以相同的方式经历另外的突变步骤。待 研究的单个突变体的数量因此可以显著减少。
[0102]合适的表达构建体尤其可以用于根据本发明可用的内切葡聚糖酶的重组制备。
[0103] 本发明的主题还可以是表达构建体，其包括，在调控核酸序列的遗传控制下，编码 根据本发明的酶的核酸序列；以及包括这些表达构建体中的至少一个的载体。
[0104] 根据本发明，"表达单元"应理解为意指具有表达活性的核酸，其包括如本文所定 义的启动子，并且，在其功能性连接至待表达的核酸或基因后，其将调节该核酸或该基因的 表达(换句话说，转录和翻译）。这就是为什么在这种情况下它也被称为"调控核酸序列"。除 了启动子，可以存在另外的调控元件，如，举例来说，增强子。
[0105] 根据本发明，"表达盒"或"表达构建体"应理解为意指功能性连接至待表达的核酸 或待表达的基因的表达单元。与表达单元形成对照，表达盒因此不仅包括调节转录和翻译 的核酸序列，还包括作为转录和翻译的结果将要表达为蛋白质的那些核酸序列。
[0106] 在本发明的上下文中，术语"表达"或"过表达"描述了微生物中的一种或多种酶的 细胞内活性的产生或增加，所述酶由相应DNA编码。为此目的，例如，可以将基因引入生物 体，将现有的基因替换为不同的基因，增大(一个或多个)基因的拷贝数，使用强启动子，或 者使用编码具有高活性的相应酶的基因，并且，这些措施可以任选地组合。
[0107] 优选地，根据本发明的此类构建体包括相应编码序列的5'-上游启动子和3'-下游 终止子序列，和，任选地，另外的通常的调控元件，在每种情况下有效地连接到编码序列。
[0108] 根据本发明，"启动子"、"具有启动子活性的核酸"或"启动子序列"应理解为意指 这样的核酸，其与待转录的核酸功能性连接，调控该核酸的转录。
[0109] 在本文中，"功能的"或"有效的"连接应理解为意指，例如，具有启动子活性的核 酸、和待转录的核酸序列、和任选其它调控元件(如，举例来说，确保核酸转录的核酸序列）、 和例如终止子，它们之一以这样一种方式顺序布置，在该方式下各个调控元件在核酸序列 转录时可以完成其功能。对于这样的目的，不一定需要化学意义上的直接连接。遗传控制序 列（如，举例来说，增强子序列）也可以从位于较远距离的位置或甚至从其它DNA分子发挥其 针对靶序列的功能。优选的布置是这样的，其中待转录的核酸序列位于启动子序列的后面 (即，在3 '端），以使得这两个序列彼此共价键合。在这种情况下，启动子序列和待重组表达 的核酸序列之间的距离可以小于200个碱基对或小于100个碱基对或小于50个碱基对。
[0110] 除了启动子和终止子以外，可以提到的调控元件的其它例子有:靶向序列，增强 子，多腺苷酸化信号，可选择的标记，放大信号，复制起点等。合适的调控序列描述于例如 Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego，CA(1990)。
[0111] 根据本发明的核酸构建体尤其包括这样的核酸构建体，其中编码序列已被有利地 有效地或功能性地连接到一个或多个用于控制，例如增加基因表达的调控信号。
[0112] 除了这些调控序列，这些序列的天然调控仍可以存在于实际结构基因的上游，并 且可以任选已经遗传修饰使得天然调控已关闭以及使得基因的表达已增加。然而，核酸构 建体在结构上也可以更简单，换句话说，没有额外的调控信号已被插入到编码序列的上游， 并且天然启动子连同其调控并没有被删除。相反，天然调控序列以这样一种方式被突变，其 中，调控不再发生并且基因表达增加。
[0113]优选的核酸构建体有利地还包含已经提到的功能性连接到启动子的"增强子"序 列中的一个或多个，并且，这些可以使得核酸序列的表达增加。另外，可以在DNA序列的3'端 插入另外的有利序列，如其它调控元件或终止子。根据本发明的核酸可以作为一个或多个 拷贝存在于构建体中。其它标记物(如抗生素抗性或营养缺陷型-互补基因）可以任选地另 外存在于构建体中，用于针对该构建体进行选择。
[0? Μ] 合适的调控序列的例子存在于下面的启动子中，如cos，tac，trp，tet，trp-tet， lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，rhaP(rhaPBAD)SP6，A-Pr，或存在于λ-PL启 动子中，其有利地用于革兰氏阴性菌中。其它的有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性启 动子amy和SP02中，存在于酵母或真菌启动子ADC1，MFalpha，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF， rp28，ADH中。用于调控的人工启动子也可以使用。
[0115] 为了表达，核酸构建体被插入到宿主生物体中，有利地，载体如举例来说质粒或噬 菌体，其使得基因在宿主中的最佳表达成为可能。除了质粒和噬菌体，载体也应理解为意指 本领域技术人员已知的所有其它载体，也就是说，例如，病毒如SV40，CMV，杆状病毒和腺病 毒，转座子，IS元件，噬粒，粘粒以及线状或环状DNA。这些载体遵从在宿主生物体中自主复 制或遵从染色体复制。这些载体构成本发明的另外的实施方案。
[0116] 合适的质粒为，例如，在大肠杆菌中有pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19， pKC30，pRep4，pHSl，pKK223-3，pDHE19.2，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN- Agtll或pBdCI，在链霉菌中有pIJlOl，pIJ364，pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌中有 pUB110，pC194或pBD214,在棒状杆菌中有pSA77或pAJ667,在真菌中有pALSl，pIL2或 pBBl 16，在酵母中有 2alphaM，pAG-1，YEp6，YEp 13 或pEMBLYe23，或者，在植物中有 pLGV23， pGHlac+，pBIN19，pAK2004或pDH51。上述质粒是可能的质粒中的小的选择。其它的质粒对于 本领域技术人员来说是公知的，并且，可以例如在书籍Cloning Vectors(Pouwels P.H.等 人编著Elsevier,Amsterdam-New York_0xford，1985, ISBN 0 444 904018)中找到。
[0117] 在载体的其它配置中，包含根据本发明的核酸构建体或根据本发明的核酸的载体 也可以有利地以线性DNA的形式引入到微生物中并且经由异源或同源重组整合到宿主生物 体的基因组内。这种线性DNA可以由线性化载体(如质粒)构成，或仅由根据本发明的核酸构 建体或核酸构成。
[0118] 对于生物体中异源基因的最佳表达，有利的是根据该生物体中使用的特定"密码 子使用"来修改核酸序列。"密码子使用"可以通过对所讨论的生物体的其它的、已知的基因 进行计算机评估容易地确定。
[0119] 根据本发明的表达盒通过将合适的启动子融合到合适的编码核苷酸序列和终止 子或多腺苷酸化信号来制备。为此目的，人们会使用通常的重组和克隆技术，这些技术例如 描述于T · Maniatis，E.F.Fritsch和J. Sambrook，Molecular Cloning : A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY( 1989)，以及描述于 T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)，以及描述于Ausubel，F.M.等人， Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc . and Wiley Interscience(1987)〇
[0120] 为了表达，重组核酸构建体或基因构建体被插入到合适的宿主生物体中，有利地 为宿主特异性载体，这使得基因在宿主中可以最佳表达。载体对于本领域技术人员来说是 公知的，并且，可以例如在"Cloning Vectors"（Pouwels P.H.等人编著，Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985)中找到。
[0121] 可以借助根据本发明的载体来产生重组微生物，这样的重组微生物例如用至少一 种根据本发明的载体进行转化，并且可以用来生产可以根据本发明使用的内切葡聚糖酶。 有利的是，上述根据本发明的重组构建体被引入合适的宿主系统并表达。在本文中，优选使 用本领域技术人员已知的克隆和转染方法，如，举例来说，共沉淀，原生质体融合，电穿孔， 逆转录病毒转染等，以在相应的表达系统中表达上述核酸。合适的系统例如描述于， Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人编著，Wiley Interscience, New York 1997,或Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual ·第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY,1989〇
[0122] 用于根据本发明的核酸或核酸构建体的合适的重组宿主生物体原则上是所有的 原核或真核生物。有利的是使用微生物(如细菌、真菌或酵母)作为宿主生物体。有利的是使 用革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，优选来自以下科的细菌，肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)，链霉 菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)，特别优选来自以下属的细菌，埃 希氏菌属(Escherichia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，链霉菌属（Streptomyces)，诺卡氏菌 属（Nocardia)，伯克氏菌属（Burkholderia)，沙门氏菌属（Salmonella)，农杆菌属 (Agrobacterium)，梭菌属（Clostridium)或红球菌属(Rhodococcus)。属和种，大肠杆菌，非 常特别优选。其它有利的细菌可以另外在变形菌，β-变形菌或γ-变形菌的组中找到。
[0123] 在本文中，根据本发明的一个或多个宿主生物体优选至少包含编码内切葡聚糖酶 的核酸序列，编码具有如上面所定义的内切葡聚糖酶活性的酶的核酸构建体或载体中的至 少一种：。
[0124] 取决于宿主生物体，根据本发明的方法中使用的生物体以本领域技术人员已知的 方式生长或培养。作为一项规则，微生物生长在液体介质中，其中包含碳源，通常为糖的形 式，氮源，通常为有机氮源(如酵母提取物)或盐(如硫酸铵）的形式，微量元素，如铁，锰，镁 盐，以及任选的维生素，温度在〇°C和100°C之间，优选在10°C和60°C之间，同时通入氧气。在 本文中，液体介质的pH值可以保持在固定值，即，其在培养期间可以进行调节也可以不进行 调节。培养可以分批、半分批或连续进行。营养物质可以在发酵开始时提供，或者半连续或 连续补料。
[0125] 为了重组生产可以根据本发明使用的内切葡聚糖酶或者其功能性生物活性片段， 对产生这种酶的微生物进行培养，任选诱导该酶的表达，并且从培养物中分离该酶。如果期 望的话，该多肽由此也可以在工业规模上生产。
[0126] 已经根据本发明产生的微生物可以通过分批法、补料-分批法或重复补料-分批法 连续或不连续生长。已知培养方法的概述可以在Chmiel编著的教科书中找到(BioprozeP technik 1.Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,1991)[Bioprocess engineering 1. Introduction to bioprocess technology])，或者在Storhas编著的教科书中找到（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[生物反应器和外围单元](Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden， 1994))〇
[0127] 所使用的培养基必须适当地满足所考虑的菌株的需要。用于多种微生物的培养基 的描述可以在以下手册中找到，美国细菌学学会的"常规细菌学方法手册（Manual of Methods for General Bacteriology)"（Washington D.C.，USA,1981)〇
[0128] 可以根据本发明使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生 素和/或微量元素。
[0129] 优选的碳源是糖，如单糖、二糖或多糖。非常好的碳源的例子是葡萄糖，果糖，甘露 糖，半乳糖，核糖，山梨糖，核酮糖，乳糖，麦芽糖，鹿糖，棉子糖，淀粉或纤维素。糖也可经由 复杂化合物被加入到培养基中，如糖蜜或糖精制中的其它副产物。也有利的是可以添加多 种碳源的混合物。其它可能的碳源是油和脂肪，如，举例来说，豆油，葵花子油，花生油和椰 子脂，脂肪酸，如，举例来说，棕榈酸，硬脂酸或亚油酸，醇，如，举例来说，甘油，甲醇或乙醇， 以及，有机酸，如，举例来说，乙酸或乳酸。
[0130] 氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的材料。氮源的例子包括氨气 或铵盐，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵，硝酸盐，尿素，氨基酸或复杂氮源，如 玉米浆、大豆柏、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏等。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
[0131 ]可以存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的 氯盐、磷盐或硫酸盐。
[0132] 无机含硫化合物，如，举例来说，硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫 代硫酸盐、硫化物、以及有机硫化合物，如硫醇(mercaptan)和硫醇(thio 1 )，可以用作硫源。
[0133] 磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。
[0134] 螯合剂可以添加到培养基中，以维持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包括 二羟基苯酚，如儿茶酚或原儿茶酸，或有机酸如柠檬酸。
[0135] 通常，根据本发明使用的发酵培养基还包含其它生长因子，如维生素或生长促进 剂，其包括，例如，生物素，核黄素，硫胺素，叶酸，烟酸，泛酸盐和吡哆醇。生长因子和盐经常 从复合培养基组分如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等获得。另外，合适的前体可以加入到培养 基中。培养基中的化合物的确切组成在很大程度上取决于所讨论的实验，并且将针对每个 单独的情况单独决定。关于培养基优化的信息可以在下面的教科书中找到，"应用微生物学 生理学，实践方法（Applied Microbiol .Physiology,A Practical Approach)"（编者 P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)pp. 53-73, ISBN 0199635773)。生长培养基也 可以从商业来源获得，如标准1 (Standard 1) (Merck)或BHI (脑心浸液，DIFC0)等。
[0136] 培养基的所有组分都进行灭菌，或通过加热手段（1.5巴和121°C，20分钟），或通过 过滤除菌。组分可以一起灭菌或分别灭菌(如果适当的话）。培养基的所有组分可以在发酵 开始时就存在，或者可以连续或分批加入，根据需要而定。
[0137] 培养物温度通常在15°C和45°C之间，优选25°C至40°C，并且可以在实验期间保持 恒定或者进行改变。培养基的pH值应在5至8.5的范围内，优选大约7.0。在发酵期间，在发酵 期间，发酵pH值可以通过加入碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水)或酸性化合物 (如磷酸或硫酸)来控制。消泡剂(如，举例来说，脂肪酸聚乙二醇酯)可以用于控制泡沫的发 展。为了保持质粒的稳定性，合适的选择性作用物质（如，举例来说，抗生素)可以加入到培 养基中。为了维持有氧条件，氧气或含氧气体混合物(例如，环境空气)被通入到培养物中。 培养物温度通常为20°C至45°C。并且，培养持续进行，直到形成最多期望产物为止。该目标 通常在10小时至160小时内完成。
[0138] 然后，发酵液被进一步处理。取决于什么是所需要的，所有或部分生物量可以通过 以下分离方法从发酵液中去除，如，举例来说，离心、过滤、倾析或这些方法的组合，或者完 全留在所述发酵液中。
[0139] 如果多肽不分泌到培养基中，细胞也可以被破碎并且通过常规蛋白质分离方法从 裂解物中获得产物。细胞可以任选地如下破碎，通过高频超声，通过高压，如举例来说，在弗 氏细胞压碎器(French pressure cell)中，通过渗透裂解(osmolysis)，通过洗涤剂、裂解 酶或有机溶剂的作用，通过均化器或通过几种上述方法的组合。
[0140] 多肽可以使用已知的色谱技术进行纯化，如分子筛层析(凝胶过滤），如Q-琼脂糖 凝胶层析、离子交换层析和疏水层析，并且也可以使用其它常用方法，如超滤、结晶、盐析、 透析和非变性凝胶电泳。合适的方法例如描述于C ο 〇 p e r，T . G .，B i 〇 c h e m i s c h e Arbeitsmethoden[Biochemical working methods]，Verlag Walter de Gruyter,Berlin, New York，或者描述于Scopes,R.，Protein Purification,Springer Verlag,New York, Heidelberg,Berlin。
[0141] 为了分离重组蛋白，有利的是可以使用载体系统或通过特定核苷酸序列延长cDNA 的寡核苷酸，并由此编码例如用于更简单的纯化的目的的修饰的多肽或融合蛋白。合适的 这种修饰例如被称为"标签"的修饰，其用作锚，如，举例来说，被称为6-组氨酸锚的修饰或 作为抗原能够被抗体识别的表位(例如描述于Harlow，E.和Lane，D.，1988,Antibodies : A Laboratory Manual .Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)。这些锚可以用于将蛋白质附着至 固体支持物，如，举例来说，可以装填到例如层析柱中的聚合物基质，或者用于将蛋白质附 着至微量滴定板或任何其它支持物。
[0142] 同时，这些锚也可以用于蛋白质的鉴定。为了鉴定蛋白质，常规标记物如荧光染 料、酶标记物(其与底物反应后，形成可检测的反应产物)或放射性标记物可以另外单独使 用或与锚组合使用，用于蛋白质的衍生化。
[0143] 内切葡聚糖酶可以以游离或固定化的形式使用。固定化的酶应理解为意指固定至 惰性支持物上的酶。合适的载体材料和固定于其上的酶已知于EP-A-1149849，EP-A-1 069 183和DE-0S 100193773,并且已知于其中引用的参考文献。这些文件的有关公开以其全部 内容被引用。合适的载体材料包括，例如，粘土，粘土矿物，如高岭石，娃藻土，珍珠岩，二氧 化硅，氧化铝，碳酸钠，碳酸钙，纤维素粉末，阴离子交换材料，合成聚合物，如聚苯乙烯，丙 烯酸树脂，酚醛树脂，聚氨酯和聚烯烃，如聚乙烯和聚丙烯。对于有支持的酶的生产，载体材 料通常以细颗粒形式被使用，优选多孔形式。载体材料的粒径通常不超过5mm，特别是不超 过2mm(粒径分布曲线）。相似地，当使用内切葡聚糖酶作为全细胞催化剂时，可以选择游离 或固定化的形式。载体材料例如为海藻酸钙和角叉菜胶。酶和细胞也可以直接用戊二醛交 联（交联至CLEA)。相应的和其它的固定化技术例如描述于J . Lalonde和A .Margolin" Immobilization of Enzymes〃于K.Drauz和H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,Vol. III,991-1032,ffiley-VCH,ffeinheim〇
[0144] 3.2纤维素寡聚物生产
[0145] 借助于内切葡聚糖酶，通过单或多个酶促水解生产纤维素寡聚物，任选地与用离 子液体和/或机械处理来处理纤维素组合。最佳顺序可以由本领域技术人员通过简单的初 步实验来确定。
[0146] a)用离子液体处理纤维素
[0147] 为此目的，将纤维素悬浮于例如冷EMM Ac中。为此目的，例如，每毫升EMM Ac中 0.02g纤维素加热直至液体变清。然后，用水沉淀纤维素。通过真空过滤从离子液体和用于 沉淀的水中分离沉淀的纤维素。然后用水洗涤纤维素。
[0148] b)机械处理纤维素
[0149] 将10% (w/w)纤维素悬浮于蒸馏水中。按照用法说明，以1mm玻璃珠准备球磨机(例 如，Beadbeater，Biospec Products)，装填纤维素悬浮物并进行研磨。冷却后，再次研磨纤 维素。此过程在冰上重复数次。此后，用蒸馏水从玻璃珠中洗脱纤维素直至洗脱水变清。收 集洗脱的悬浮液且然后离心。将水从经预处理的纤维素中倾出，并且，在酶促水解中使用该 纤维素。
[0150] c)纤维素的酶促水解
[0151] 新鲜预处理的纤维素用于酶促水解。制备合适的缓冲液(醋酸盐缓冲液，磷酸盐缓 冲液或1^8缓冲液，0.01至0.251，？!14至7)用于水解，例如，0.謂？!14.5的醋酸钠缓冲液 和0.1M pH 6的Na-K磷酸盐缓冲液。最佳缓冲液浓度和pH可以通过进行仅几个初步实验来 确定。
[0152] 将纤维素酶以所需的浓度溶解在缓冲液中。将纤维素酶溶液加入到经称量的纤维 素中，并在涡旋混合器中混合几秒钟。除非另有说明，在2ml Eppendorf反应容器中大约 l〇mg(干重)纤维素与lml纤维素酶溶液一起用于水解，并且，这些在恒温混匀仪中在40°C和 SOOmirT1下孵育所需的时间段。为了终止反应，样品在台式离心机中在HOOOmirT1下离心沉 降3分钟。在进行一些例行初步实验后，用于更大批量的相应程序也是可能的。
[0153] c)进一步酶促水解
[0154] 为了进一步降解不完全水解的纤维素，已经水解的纤维素可以用离子液体进行再 处理，并且，处理过的纤维素可以经历另一次酶促水解。这在用离子液体预处理后如上文所 述进行，与上文所述相同。
[0155] 本发明现在将在实验部分参照以下具体实施例更详细地说明。
[0156] 3.3 应用
[0157] 应用领域一一并非希望通过列举对它们进行限制一一为例如纤维增强，或者表面 活性物质或配方(消泡剂、流变学改性剂等)的改性的领域。
[0158] 实验部分
[0159] I.材料
[0160] 纤维素：
[0161] 根据本发明，使用了具有不同特性谱的多种纤维素。纤维素底物在它们的聚合度 或它们的链长分布和它们的结晶度和可用表面方面不同。表1给出了所用底物的概述。
[0162] 表1:所用纤维素底物，以及它们的性质
[0163]
[0164] DPw和DPN经由本文所描述的GPCW确定。
[0165] 纤维素底物的聚合度和链长分布通过GPC确定。为了进行该测量，将样品通过现有 的方法进行衍生并随后通过GPC测量[Rinaldi等人Angewandte Chemie-International Edition,47(42) :8047-8050,2008，Rinaldi等人，Chemsuschem,3(2) :266-276,2010]。根据 本发明分析的样品不再需要进行衍生用于GPC测量，这归因于备选的GPC方法[Engel等人 2012，Biotechnology for Biofuels 5:77]。表1示出了根据本发明所使用的GPC测量系统 所确定的底物聚合度。
[0166] 酶：
[0167] 表2:所用纤维素酶(来自Megazyme公司）的概述
[0 168]
[0169] II.设备
[0170] 表3:有机GPC仪器使用
[0171]
[0173] 表4:水性GPC仪器使用
[0174]
[0175] 表5:HPLC 仪器
[0176]
[0178] III.方法
[0179] 1.用离子液体进行纤维素预处理
[0180] 将纤维素悬浮于冷EM頂Ac中。为此目的，每50ml EM頂Ac 0.75g纤维素被加热至 80°C至少40分钟，直至液体变清。然后，用400ml水沉淀纤维素。通过真空过滤从离子液体和 用于沉淀的水中分离沉淀的纤维素，其中使用网眼尺寸为〇.2μπι的醋酸纤维素过滤器。此 后，用500ml水洗涤纤维素3次。
[0181] 2.纤维素的机械预处理
[0182] 将10 % (w/w)纤维素悬浮于蒸馏水中。按照说明，以1 mm玻璃珠准备球磨机 (Beadbeater，Biospec Products)，装填纤维素悬浮物并研磨3分钟。此后，球磨机必须冷却 3分钟，直至可以再次研磨纤维素。此过程在冰上重复5次。此后，用蒸馏水从玻璃珠中洗脱 纤维素直至洗脱水变清。收集洗脱的悬浮液，且然后以^OOmirT 1离心(Rotina 35R)3分钟。 将水从经预处理的纤维素中倾出，并且，在酶促水解中使用纤维素。
[0183] 3.纤维素的酶促水解
[0184] 新鲜预处理的纤维素被用于酶促水解。由于纤维素在预处理后未被干燥，因此湿 重必须被转换为干重。在这种情况下，不可能通过对一些经预处理的纤维素进行干燥而预 先确定干重，因为这需要数天。为了计算溶胀因子，我们因此假设5%的纤维素损失作为预 处理的结果。经预处理的纤维素的湿重被确定并除以用于预处理的重量的95%。然后，所确 定的溶胀因子用于计算所需的经预处理的湿润纤维素的量。由于湿重在预处理后可能变 化，因此该因子在每次预处理后必须重新确定。制备0.1M pH 4.5的醋酸钠缓冲液和0.1M pH 6的Na-K磷酸盐缓冲液，用于水解。
[0185] 将黑曲霉、长枝木霉和爱默生踝节菌内切葡聚糖酶和黑曲霉β-葡糖苷酶以所需的 浓度溶解在醋酸钠缓冲液中。将海栖热袍菌和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶以所需的浓度 溶解在Na-K磷酸盐缓冲液中。将纤维素酶溶液加入到经称量的纤维素中，并在涡旋混合器 中混合几秒钟。除非另有说明，在2ml Eppendorf反应容器中lOmg(干重)纤维素与lml纤维 素酶溶液一起用于水解，并且，这些在恒温混匀仪中在40°C和SOOmirT1下孵育所需的时间 段。为了终止反应，样品在台式离心机中在HOOOmirT 1下离心沉降3分钟，并且，上清液被去 除并转移到另一个Eppendorf反应容器中。将沉淀和上清液冷冻于-80°C，并且可以在稍后 的时间点进行分析。
[0186] 4.在用离子液体重新预处理后进行第二次酶促水解(IL重启）
[0187] 为了研究由于纤维素的结构性质或改变(如，举例来说，结晶和再结晶）所导致的 不完全纤维素水解，已经被水解的纤维素用离子液体进行再处理，并且，处理过的纤维素再 次经历酶促水解。用离子液体预处理的纤维素水解后，进行IL重启。相应缓冲液中的10U/ml 内切葡聚糖酶和3U/mli3-葡糖苷酶被用于两个水解步骤。
[0188] 由于新鲜水解的纤维素用于IL重启，因此对水解后的纤维素损失进行计算。为此 目的，所用的5种内切葡聚糖酶水解后的纤维素损失必须预先确定(见下文）。所确定的纤维 素损失用来计算水解后的纤维素的量(干重）。水解后得到的沉淀溶解于EMIM Ac中于80°C 下2小时。EMIM Ac的所需量取决于纤维素的量和水分含量，因为纤维素样品中存在的水降 低EMIM Ac的纤维素溶解能力。此后，通过加水使纤维素从EMIM Ac中沉淀下来。用水洗涤纤 维素3次。为了分离除去液体，纤维素在SOOmirT1下离心3分钟(Rotina 35R)，且随后倾出液 体。通过称重确定纤维素样品的湿重。所确定的样品湿重和所计算的水解后干重用于确定 样品的溶胀因子。在此方法中由纤维素酶纯化的纤维素随后用于第二次水解。为了确定纤 维素的湿重，使用先前确定的溶胀因子。
[0189] IV.分析方法
[0190] 1.有机凝胶渗透色谱法
[0191]有机凝胶渗透色谱法(GPC。)用于确定纤维素样品的链长分布。为了进行GPC。，来自 水解的纤维素样品被冻干，且随后将冻干物溶解于80°C的DMF/19 % (v/v)EM頂Ac。溶解的 纤维素通过〇. Ιμπι PT-FE过滤器过滤，并且将滤液转移到HPLC玻璃容器中。具有上述仪器使 用(表3)的GPC。系统在下列条件下用于进行分析。
[0192]
[0193] 浓度通过RI检测器进行检测。纤维素链的摩尔质量通过散射光检测器来确定。纤 维素寡聚物的检测限为聚合度大约10APW和DPn两者均借助于ASTRA软件来确定。
[0194] 2.水性凝胶渗透色谱法
[0195] 水性凝胶渗透色谱法(GPCW)将用于确定水性水解上清液中糖的组成。关于水性 GPC，来自水解的上清液被过滤除菌(0.2μπι)并转移到HPLC玻璃容器中。具有表4的组成部分 的GPC系统在下列条件下用于进行分析。
[0196]
[0197]来自Megazyme (爱尔兰）的葡萄糖和纤维素寡聚物（纤维二糖[C2]至纤维六糖 [C6])用于校准。保留时间为27至31.5分钟。分析物通过RI检测器进行检测。
[0198] 3.干物质测定
[0199] 为了后验确定在水解中所用的纤维素的精确量，测定了经预处理的纤维素的干物 质。为此目的，对Eppendorf反应容器进行标记并在80°C干燥3天。记录重量后，Eppendorf反 应容器用特定量的湿纤维素填充，并记录重量。此后，经填充的Eppendorf反应容器在80°C 干燥。干燥后，Eppendorf反应容器被再次称重。将从空湿、湿重和干重来确定溶胀因子。由 于新鲜预处理的纤维素被用于所有的实验，因此所确定的溶胀因子仅用于随后验证关于水 解实验所计算的值。
[0200] 溶胀因子=湿重/干重
[0201] 4,纤维素损失确定
[0202]纤维素损失确定使得能够确定分解成可溶性糖和纤维素寡聚物的纤维素的量。为 了确定纤维素损失，30mg纤维素干物质通过上述方法水解。
[0203] 然而，纤维素不通过离心从缓冲液中分离。孔径0.2μπι的醋酸纤维素滤膜的重量被 记录下来，并且经水解的纤维素悬浮液通过该过滤器进行过滤。过滤器连同经水解的纤维 素一起，用l〇ml蒸馏水洗涤3次，并且在80°C下干燥3天。干燥后，醋酸纤维素过滤器连同干 燥的纤维素一起称重，并记录该重量。从用于水解的纤维素和纤维素干燥后的重量之间的 重量差，可以确定纤维素损失。
[0204] 重量趋向于被确定得过高，这是因为这种方法没有除去任何吸附在纤维素上的纤 维素酶。在未经水解的纤维素的情况下，可附着的纤维素酶总共达到〇. 8 %和2.3 %之间。由 于葡萄糖和可溶性纤维素寡聚物的产生，在水解期间纤维素酶的量相对于不溶性纤维素增 加。如果纤维素减少70%，可附着于其上的纤维素酶的量最大达到7.6%。作为形成可溶性 糖和纤维素寡聚物的结果，纤维素的实际损失因此略高于由该方法所确定的损失。
[0205] 5.高效液相色谱法
[0206] 高效液相色谱法(HPLC)允许确定水解混合物的水性上清液中的葡萄糖和纤维二 糖的浓度。为了进行HPLC，来自水解的上清液被过滤除菌并转移到HPLC玻璃容器中。使用下 列条件下的HPLC(表5)用于分析：
[0207]
[0208] 6.4-羟基苯甲酸酰肼测定
[0209] 4-羟基苯甲酸酰肼测定(PAHBAH测定)允许确定水解混合物的水性上清液中的还 原糖的摩尔浓度。还原可溶性糖与PAHBAH试剂反应，产生黄色染料，其可以在410nm处光度 测量。出于校准的目的，以所使用的缓冲液建立葡萄糖校准系列，浓度范围为〇 .〇25g/l至 0.5g/l 〇
[0210] 必须制备两种试剂(A和B)用于PAHBAH测定，这两种试剂的组成列于下表中。在进 行PAHBAH测定之前，从试剂A和B(比例为1:10)制备工作试剂。前者将仅能保留几个小时，因 此应在进行PAHBAH测定之前即刻制备。待测定的样品和校准溶液与工作试剂以1:3和1:5的 比例混合，并且在l〇〇°C下孵育15分钟。样品和标准溶液已冷却至室温后，在光度计中于 410nm处对它们进行测量。可溶性还原糖和纤维素寡聚物的量可以借助于校准线以mol/ml 确定，该校准线通过线性回归确定。
[0211]
[0212」7.十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0213] 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS凝胶电泳）连同来自Life Technologies (Cal if ornia, USA)的SDS凝胶系统被用于验证所用酶的纯度。
[0214] 转化实施例
[0215] 为了制备具有接近水中溶解度的大小的纤维素寡聚物，首先使用3种纤维素底物 Avicel、a-纤维素和Sigmacell以及使用5种内切葡聚糖酶和2种β-葡糖苷酶进行实验。实验 开始前，检查所用的酶的纯度，并且在溶胀于各自的反应缓冲液中后检查所用的纤维素的 大小分布。除非另有说明，对于所有酶促水解来说，首先进行IL预处理，并随后进行酶促水 解。3种纤维素首先用所有的内切葡聚糖酶水解2小时。此后，在后面的实验中研究具有最低 的葡萄糖和可溶性纤维素寡聚物生产的3种内切葡聚糖酶的反应。
[0216] 实施例1:纤维素底物AVicel、a-纤维素和Sigmacell的GPC。
[0217] 为了进行3种酶促非水解的纤维素底物Avicel、a-纤维素和Sigmacell的GPCo,这3 种底物的样品在缓冲液中40°C下孵育1天。此后，与水解样品类似，将它们制备用于GPCo,且 然后通过GPCo进行分析。
[0218] 对于Avicel，关于醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液的链长分布的测定得到了相同的 结果。已在磷酸盐缓冲液中孵育的α-纤维素和Sigmacell样品的链长分布显示出曲线朝向 较长链的比例移位。此现象的原因还不清楚。与未在缓冲液中孵育的样品相比，已在醋酸盐 缓冲液中孵育的样品没有朝向较长的链长移位。在下文中，已预先在醋酸盐缓冲液中孵育 并随后冻干的底物样品被用作参考，用于显示未酶促降解的纤维素和Sigmacell的链长 分布。
[0219] 实施例2:由来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌、海栖热袍菌、长枝木霉和爱默生踝节菌 的内切葡聚糖酶水解Avicel
[0220] 通过GPCo分析由来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶水解 Avicel
[0221] 黑曲霉
[0222]水解混合物的组分：
[0223] 10mg/ml Avicel,
[0224] 10U/ml黑曲霉内切葡聚糖酶，
[0225] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0226] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0227] 结果:无内切葡聚糖酶的样品的链长分布在10和1000葡萄糖单元之间，最大值在 250处。用黑曲霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，观察到链长分布的上端向较短链长移位了 700 葡萄糖单元。该反应时间后，链长分布在10和300葡萄糖单元之间。最大分布在90葡萄糖单 元处。在5分钟和24小时之间的时间期间，链长分布的上端向较短链长移位了 100葡萄糖单 元。24小时后，曲线在10和200葡萄糖单元之间，并且在70葡萄糖单元处具有最大值。
[0228] 解淀粉芽孢杆菌
[0229] 水解混合物的组分：
[0230] 10mg/ml Avicel,
[0231 ] 10U/ml解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶，
[0232] 3U/ml农杆菌属物种β-葡糖苷酶，
[0233] 40°C，0.1Μ pH 6的磷酸盐缓冲液
[0234] 结果:无内切葡聚糖酶的样品的链长分布在10和700葡萄糖单元之间，最大在250 处。对于用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶水解Avicel，在20分钟后也可以观察到链长分布 的上端向较短的链移位。与20分钟样品相比，2小时样品的链长分布向较短链长移位了 150 葡萄糖单元。在2小时和24小时之间的样品的曲线相同。因此，底物没有任何的进一步分解。 水解24小时后，得到了在10和200葡萄糖单元之间并且在大约65葡萄糖单元处具有最大值 的链长分布。
[0235] 海栖热袍菌
[0236] 水解混合物的组分：
[0237] 10mg/ml Avicel,
[0238] 10U/ml海栖热袍菌内切葡聚糖酶，
[0239] 3U/ml农杆菌属物种β-葡糖苷酶，
[0240] 40°C，0.1M pH 6的磷酸盐缓冲液
[0241] 无内切葡聚糖酶的样品的GPCo测量显示链长分布为10至700葡萄糖单元。在用海 栖热袍菌内切葡聚糖酶水解A v i c e 1的最初5分钟期间，观察到链分布的上端向较短的链移 位。这类似于用黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶水解Aviceld分钟样品显示15和 300葡萄糖单元之间的链长分布。直至24小时后实验结束时，链长分布的上端持续向较短链 长移位。在该反应时间后，链长分布在15和300葡萄糖单元之间，最大值在90葡萄糖单元处。
[0242] 长枝木霉
[0243] 水解混合物的组分：
[0244] 10mg/ml Avicel,
[0245] 10U/ml长枝木霉内切葡聚糖酶，
[0246] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0247] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0248] 与已经提到的通过黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌内切葡聚糖酶水解 Avice 1相比，通过长枝木霉内切葡聚糖酶水解Avice 1进行得较慢。
[0249] 上述内切葡聚糖酶在5分钟水解后的链长分布的上端在300和400葡萄糖单元之 间。对于长枝木霉内切葡聚糖酶，仅在20分钟后情况才是这样。然而，24小时后，10至200葡 萄糖单元和在60葡萄糖单元处的最大值的链长分布与黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍 菌内切葡聚糖酶的相应链长分布可比。
[0250] 爱默生踝节菌
[0251] 水解混合物的组分：
[0252] 10mg/ml Avicel,
[0253] 10U/ml爱默生踝节菌内切葡聚糖酶，
[0254] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0255] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0256] 无内切葡聚糖酶的样品的链长分布在10和700葡萄糖单元之间，最大值为250葡萄 糖单元。在通过爱默生踝节菌内切葡聚糖酶的Avicel水解中，链长分布的上端在水解的最 初4小时期间向较短链长移位。4小时后，链长分布曲线在15和200葡萄糖单元之间，最大值 在70葡萄糖单元处。
[0257] 总结：
[0258] 使用所用的5种内切葡聚糖酶，在24小时的水解后，能够实现链长分布的上端向较 短链长的移位。随着水解增加，链长分布的原过程变窄。对于所有内切葡聚糖酶来说，链长 分布的下端在7和15葡萄糖单元之间的范围。因此，可以检测所有内切葡聚糖酶的内切酶活 性。
[0259 ]实施例3:经酶促水解的Avi ce 1的聚合度DP的确定
[0260] 进行GPC分析，以确定(实施例2的)经酶促水解的Avicel的DP。
[0261] 样品组成GPCo:
[0262] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0263] 流动相:DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0264] 实验结果以图的形式示出于附图la至le中。
[0265] 在加入纤维素酶之前，样品（0小时样品）的DPw初始值在160和220之间，平均为 190〇
[0266] 下文中陈述的所有百分数都是指初始平均DPw为190。
[0267] 在使用来自黑曲霉、海栖热袍菌、爱默生踝节菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶的水 解实验期间，在最初5分钟期间DPw下降了37%至53%，并因此在90和120之间。24小时后，在 使用黑曲霉、海栖热袍菌和长枝木霉内切葡聚糖酶的水解实验中， DPw进一步下降10%至 21 %到初始值的50 %至37 %。
[0268]使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶水解的DPw在20分钟后为初始值的40%。水解 24小时后，DPw进一步下降5 %到初始值的35 %。
[0269] 爱默生踝节菌内切葡聚糖酶水解的DPw在水解20分钟后下降了初始值的52%。水 解2小时后，DPw已达到值70,这是初始值的36%。此后，DPw上升到120,直到24小时的反应时 间结束。在使用爱默生踝节菌内切葡聚糖酶水解Sigmacell中，DPw和DPn也在水解3小时后均 上升。因此，不能假定观察到的上升是测量误差。可能的原因是短链的降解增加，由此，所存 在的较长的链相比起来会更加突出。
[0270] 当使用来自解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶时，在水解2小时后，未 观察到Avicel的进一步降解。在使用来自黑曲霉和爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶的水解实 验中，可以观察到DPw的进一步减小，直到实验结束。
[0271] 当使用所有内切葡聚糖酶时，与实验周期的剩余部分相比，在实验的最初5分钟期 间DPw相对于初始值降低最多。在最初1至2小时期间，DPw降低到大约50%。与其它内切葡聚 糖酶相比，当使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖 酶时，可以实现最低的DPw，值为65。
[0272] 多分散性(其列于下表中）由DPw和DPn计算得到：
[0273]
[0274] DPw、DPn和多分散性(PD)通过GPCo确定(软件:ASTRA)
[0275] 箭头指示各自的趋势
[0276] 多分散性随着降低的DPw降低。因此，多分散性和纤维素的降解程度之间存在相关 性。
[0277] 实施例4: Avicel水解的质量平衡
[0278] 纤维素的水解不仅产生所需的不溶性纤维素寡聚物，也产生可溶性纤维素寡聚物 和葡萄糖。本实施例涉及由于产生可溶性纤维素寡聚物和葡萄糖所导致的所用纤维素的损 失的定量和评估。溶解的纤维素寡聚物和葡萄糖借助于HP LC和PAHBAH试验进行定量。 Avi ce 1水解样品的水性上清液被用于这些研究。葡萄糖和纤维二糖的浓度通过HPLC分析来 确定。对于所有的所用内切葡聚糖酶来说，这两种溶解的糖的浓度都随着时间而增加。
[0279] 酶促水解后Avicel的质量分布编辑在下表中：
[0280]
[0281 ]在24小时后通过确定纤维素损失测量不溶性纤维素寡聚物；
[0282] 在24小时后通过PAHBAH试验测量还原糖；
[0283] 在24小时后通过HPLC测量葡萄糖和纤维二糖；
[0284] 未知的可溶性纤维素寡聚物(PAHBAH试验和HPLC分析之差)24小时后；
[0285] 百分比基于所用的纤维素完全转化时形成的葡萄糖和纤维二糖
[0286] 在11 %的未知的可溶性纤维素寡聚物时，爱默生踝节菌内切葡聚糖酶是未知的可 溶性纤维素寡聚物的最高生产者。解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶产生6.1%的未知的可溶 性纤维素寡聚物。当使用长枝木霉内切葡聚糖酶时，生成2%的未知的可溶性纤维素寡聚 物。使用海栖热袍菌和黑曲霉内切葡聚糖酶产生非常低量的未知的可溶性纤维素寡聚物， 或者其量完全不能测出，为〇. 5 %和0 %。由于爱默生踝节菌和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖 酶相比起其它内切葡聚糖酶产生最高量的可溶性纤维素寡聚物，因此这两种内切葡聚糖酶 可以用于生产可溶性纤维素寡聚物。
[0287] 在水解后29%纤维素时，爱默生踝节菌内切葡聚糖酶的使用主要产生葡萄糖、纤 维二糖(51%)和可溶性纤维素寡聚物（11%)。当在水解后75%不溶性纤维素时使用解淀粉 芽孢杆菌内切葡聚糖酶、在81 %时黑曲霉内切葡聚糖酶以及在96.6 %时海栖热袍菌内切葡 聚糖酶时，相比起其它内切葡聚糖酶，实现了最佳的纤维素产量。因此，解淀粉芽孢杆菌和 黑曲霉内切葡聚糖酶对下面这样的工业过程特别重要，该工业过程以生产不溶性纤维素寡 聚物为目标当不溶性纤维素采取相对短链的纤维素寡聚物的形式时。
[0288] 实施例5:通过来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌海栖热袍菌、长枝木霉和爱默生踝节 菌的内切葡聚糖酶酶促水解纤维素
[0289] 借助于GPC。确定α-纤维素的水解样品的链长分布。
[0290] 黑曲霉
[0291] 水解混合物的组分：
[0292] lOmg/mla-纤维素，
[0293] 10U/ml黑曲霉（内切葡聚糖酶，
[0294] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0295] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0296] 未经酶处理的α-纤维素显示出以下特征过程:在20至90葡萄糖单元范围内纤维素 链浓度增加。在90至200葡萄糖单元范围内斜率下降，然后在200至450葡萄糖单元范围内再 次上升。
[0297] 用黑曲霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，肩部不再可见。与未水解样品的过程相比， 链长分布的上端向较短链长移位。同样地，分布的最大值向较短链移位。分布为10和800葡 萄糖单元之间，最大值为120。直至19小时，链长分布持续变窄。此时曲线范围在10和450葡 萄糖单元之间，最大值在75处。因此，实现了最大值减小80 %以及链长分布上端减小75 %。
[0298] 解淀粉芽孢杆菌
[0299] 水解混合物的组分：
[0300] 10mg/mla-纤维素，
[0301] l〇U/ml解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶，
[0302] 3U/ml农杆菌属物种β-葡糖苷酶，
[0303] 40°C，0· 1Μ pH 6的磷酸盐缓冲液
[0304]通过解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶水解a-纤维素的链长分布由GPC。确定。用黑曲 霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，仅可辨别出链长分布在10和30葡萄糖单元之间的下降变浅， 而非肩部。20分钟的反应时间后，该变浅不再可辨别;相反，可以观察到近高斯链长分布。在 实验结束时，链长分布在10和400葡萄糖单元之间，最大值在80葡萄糖单元处。酶促水解使 最大值降低了 80%并且使上端降低了 75%。
[0305] 海栖热袍菌 [0306] 水解混合物的组分：
[0307] 10mg/mla-纤维素，
[0308] 10U/ml海栖热袍菌内切葡聚糖酶，
[0309] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0310] 40。(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0311] 通过海栖热袍菌内切葡聚糖酶水解的a-纤维素的链长分布由GPC。确定。来自于通 过海栖热袍菌水解a-纤维素并通过GPC。分析的5分钟样品证明链长分布在10和1800葡萄糖 单元之间。与无酶样品相比，纤维素寡聚物存在于10至20葡萄糖单元的范围内。5分钟后，最 大值从450移位至350。肩部不再明显，但在大约120葡萄糖单元处可以辨别出轻微变浅的下 降。与30葡萄糖单元至最大值范围中的倾斜度相比，在10和30葡萄糖单元之间范围中的链 长分布的倾斜度较浅。在水解期间，链长分布的上端和曲线的最大值向较短链长移位。在19 小时的反应时间后，曲线在10和600之间，并且最大值在150葡萄糖单元处。因此，链长分布 的最大值降低了65%，并且，链长分布的上端降低了65%。
[0312] 长枝木霉 [0313]水解混合物的组分：
[0314] lOmg/mla-纤维素，
[0315] 10U/ml长枝木霉内切葡聚糖酶，
[0316] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0317] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0318] 通过长枝木霉内切葡聚糖酶水解的a-纤维素的链长分布由GPC。确定。在5分钟的 水解时间后，通过长枝木霉内切葡聚糖酶水解的α-纤维素的链长分布的上端向较短链长移 位。该反应时间后，链长分布在10和1500葡萄糖单元之间。与无酶样品相比，最大值已从450 移位到200葡萄糖单元。同样地，肩部已向较短链长移位并处于大约25葡萄糖单元。在19小 时的反应时间期间，链长分布的上端持续向较短链长移位。同样地，曲线的最大值向较短链 移位。由于在实验过程中链长分布变窄，因此在实验期间最大值的高度增加。19小时后，链 长分布在10和400葡萄糖单元之间，并且，最大值在75葡萄糖单元处。
[0319]在19小时的水解时间内，最大值降低了 80%，并且，链长分布的上端降低了 75%。
[0320] 爱默生踝节菌 [0321]水解混合物的组分：
[0322] lOmg/mla-纤维素，
[0323] 10U/ml爱默生踝节菌内切葡聚糖酶，
[0324] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0325] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0326] 通过爱默生踝节菌内切葡聚糖酶水解的a-纤维素的链长分布由GPC。确定。无酶样 品的链长分布在20和1800葡萄糖单元之间，最大值在450葡萄糖单元处。链长分布在90和 200葡萄糖单元之间有较浅的区域(肩部）。在5分钟水解后，通过爱默生踝节菌内切葡聚糖 酶水解的纤维素的链长分布的上端向较短链长移位。该反应时间后，链长分布在10和 1500葡萄糖单元之间。比无酶样品相比，最大值已从450移位到280葡萄糖单元。同样地，肩 部已向较短链长移位并处于大约30葡萄糖单元。在19小时的反应时间期间，链长分布的上 端持续向较短链长移位。同样地，曲线的最大值向较短链移位。由于在实验过程中链长分布 变窄，因此在实验期间最大值的高度增加。19小时后，链长分布在10和300葡萄糖单元之间， 并且最大值在70葡萄糖单元处。酶促水解使最大值降低了 85%，并且使链长分布的上端降 低了80%。
[0327] 总结：
[0328] 通过比较所提出的内切葡聚糖酶，来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 表现出最快的纤维素降解。来自长枝木霉和爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶降解纤维素较 慢。然而，19小时后，链长分布在相同范围内。当使用来自海栖热袍菌的内切葡聚糖酶时，与 通过来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌的内切葡聚糖酶水解相比，a-纤维素同样降解更慢。然 而，在19小时的反应时间后，a-纤维素没有降解到与使用其它内切葡聚糖酶时相同的程度。 对于较慢的内切葡聚糖酶尤其可以观察到最大值首先向较短链移位，并且形成具有10至30 葡萄糖单元的链长的纤维素寡聚物。随着反应时间的推移，链长分布及其最大值持续向较 短链长移位。链长分布因此变窄并且最大值的高度增加。
[0329]实施例6:经酶促水解的a-纤维素的聚合度DP的确定 [0330]进行GPC分析，以确定经酶促水解的a-纤维素(实施例5)的DP。
[0331] 样品组成GPCo:
[0332] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0333] 流动相：DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0334] 实验结果示出于附图2a至2e中
[0335] 将无酶溶液加入到0小时样品中，并且通过GPCo分析纤维素冻干物。先前在醋酸盐 缓冲液中孵育并随后冻干的α-纤维素样品用作参考。未水解的α-纤维素样品的DPw为550。 DPn为230。
[0336] 水解5分钟后，黑曲霉样品的DPw下降到180。因此，DPw降低至少50 %得以实现。DPw 继续不断地降低，并且，19小时后，达到值110并因此为初始值的约2 5 %。这表明D P W的降低 随着时间而减慢。5分钟的反应时间后，DPn从初始的240降低到140。当19小时后实验结束 时，DPn降低到50。
[0337] 5分钟内，解淀粉芽孢杆菌样品的DPw降低到140。该反应时间后，DPn达到70。19小时 后，DPw为90且DPn为50。
[0338]当使用爱默生踝节菌内切葡聚糖酶时，水解20分钟后，样品的DPw为150。当使用长 枝木霉内切葡聚糖酶时，40分钟后，DPw达到170。使用来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌的内切 葡聚糖酶时，5分钟后就已经达到这个区域的值。因此，当使用爱默生踝节菌和长枝木霉内 切葡聚糖酶时，DPw的降低比使用黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时进行得更慢。用 爱默生踝节菌内切葡聚糖酶水解19小时后，DPw达到90且DPn达到50。当使用长枝木霉内切葡 聚糖酶时，水解19小时后，DPw达到90且DPn达到40。在Avicel和Sigmacell的水解中，用爱默 生踝节菌内切葡聚糖酶水解大约1小时后，DPw和DPn增加。当使用α-纤维素时，不能观察到DP 的增加。当使用Avicel和Sigmacell时，DP的增加在大约70a的DPw处，当使用α-纤维素时，未 达到该DPw。因此，取决于DPw增加是可能的。当使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶时，也可以观察 到纤维素的降解。然而，水解19小时后，DPw值为150,并且因此高于使用其它内切葡聚糖 酶时。水解19小时后，DPn值为65，与其它内切葡聚糖酶相比DPn也较高。
[0339]通过用5种所用内切葡聚糖酶水解α-纤维素的比较，当使用来自解淀粉芽孢杆菌、 长枝木霉和爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶反应时间19小时的时候，获得了最低的DPw。这些 值在90和93之间。
[0340] 对于所有内切葡聚糖酶，可以观察到DPw的减小，直至实验结束。关于Avicel，多分 散性(参见下表）由DPw和DPn计算得到。
[0341]
[U342」UPW、UPn 和(JLU 通]Q：GP(Jo 佛足（软忏：ASTKA)
[0343] 箭头指示各自的趋势
[0344] 当使用α-纤维素时，DPW和多分散性之间也存在相关性
[0345] 实施例7 :α-纤维素水解的质量平衡
[0346] 结果编辑在下表中：
[0347]
[0349] 不溶性纤维素寡聚物在19小时后通过确定纤维素损失来测量；
[0350] 还原糖在19小时后通过PAHBAH试验测量；
[0351] 葡萄糖和纤维二糖在19小时后通过HPLC测量；
[0352 ]未知的可溶性纤维素寡聚物(PAHBAH试验和HPLC分析之差）19小时后；
[0353] 百分比基于所用的纤维素完全转化时形成的葡萄糖和纤维二糖
[0354] 使用来自海栖热袍菌和黑曲霉的内切葡聚糖酶，87.1 %和94.5 %的不溶性纤维素 在水解后测得。因此，这两种酶由于纤维素损失少而对下面这样的工业过程特别重要，在 该工业过程中，可溶性纤维素寡聚物和葡萄糖不是生产目标当不溶性纤维素采取短链纤维 素寡聚物的形式时。通过海栖热袍菌内切葡聚糖酶，19小时后，DP W为150，比其它内切葡聚 糖酶相同水解时间后的DPw大约高50个单元。因此，虽然使用这种内切葡聚糖酶形成了很少 的副产物，然而DPw没有降低到与使用其它内切葡聚糖酶时相同的程度。以110的DP W，使用黑 曲霉内切葡聚糖酶产生与使用来自解淀粉芽孢杆菌、爱默生踝节菌和长枝木霉的内切葡聚 糖酶相同范围内的DPw。与其它内切葡聚糖酶相比，相同比率的DP W降低以及葡萄糖和可溶性 纤维素寡聚物的低产生，使得黑曲霉内切葡聚糖酶成为用于酶促水解纤维素的有利的内 切葡聚糖酶。
[0355] 以0.7%和0%，来自解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶几乎不产生或 完全不产生可溶性的纤维素寡聚物。来自黑曲霉和长枝木霉的内切葡聚糖酶分别产生 2.7 %和3.1 %的未知纤维素寡聚物。与其它内切葡聚糖酶相比，爱默生踝节菌内切葡聚糖 酶以27.4%产生最大量的未知可溶性纤维素寡聚物。因此，爱默生踝节菌内切葡聚糖酶非 常适合于生产比纤维二糖大的可溶性纤维素寡聚物。
[0356] 实施例8:通过来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌、海栖热袍菌、长枝木霉和爱默生踝节 菌的内切葡聚糖酶酶促水解Sigmacel 1
[0357] 借助于GPC。确定α-纤维素和Sigmacell的水解样品的链长分布。
[0358] 黑曲霉
[0359] 水解混合物的组分：
[0360] 10mg/ml Sigmacell,
[0361] 10U/ml黑曲霉内切葡聚糖酶，
[0362] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0363] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0364]未酶促降解的Sigmacell的链长分布范围在10和1000葡萄糖单元之间，最大值在 300-400葡萄糖单元处，并且，与在50葡萄糖单元和最大值之间的范围内相比，10和50葡萄 糖单元之间的范围内有更浅的倾斜。用黑曲霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，浅区段在10和20 葡萄糖单元之间。链长分布在10和500葡萄糖单元之间，最大值在100葡萄糖单元处。水解6 小时后，链长分布的上端在10和350葡萄糖单元之间，并因此，与5分钟样品的链长分布相 比，向较短链长移位了 150葡萄糖单元。在6小时水解样品中曲线的左手部分中没有变浅可 以分辨。
[0365] 解淀粉芽孢杆菌
[0366] 水解混合物的组分：
[0367] 10mg/ml Sigmacell,
[0368] 10U/ml解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶，
[0369] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0370] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0371]通过来自解淀粉芽孢杆菌的内切葡聚糖酶水解Sigmace 11的5分钟样品的链长分 布在10和400葡萄糖单元之间。该反应时间后，在15和50葡萄糖单元之间没有变浅可以观察 到。直至20小时后实验结束，链长分布的上端持续不断地向较短链移位。该反应时间后，分 布为10和300葡萄糖单元之间。最大值同样向较短链长移位，并且在65葡萄糖单元处。
[0372] 海栖热袍菌
[0373] 水解混合物的组分：
[0374] 10mg/ml Sigmacell,
[0375] 10U/ml海栖热袍菌内切葡聚糖酶，
[0376] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0377] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0378] 用来自海栖热袍菌的内切葡聚糖酶水解5分钟后，链长分布与未处理的Sigmacell 处于相同范围。链长分布的最大值向较短链长移位了 100葡萄糖单元，并且，在10至200葡萄 糖单元的范围内可以辨别出短纤维素链的增加。直至20小时反应时间的实验结束时，链长 分布持续向较短链长移位;在该时间点，其在10和400葡萄糖单元之间。与使用黑曲霉和解 淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶的Sigmacel 1水解实验相比，使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶观 察到较慢的S i gmac e 11降解。
[0379] 长枝木霉
[0380]水解混合物的组分：
[0381] 10mg/ml Sigmacell,
[0382] 10U/ml长枝木霉内切葡聚糖酶，
[0383] 3U/ml农杆菌属物种β-葡糖苷酶，
[0384] 40°C，0.1M pH 4.5的醋酸盐缓冲液< br>[0385] 用来自长枝木霉的内切葡聚糖酶水解Sigmacell 5分钟后，链长分布在15和800葡 萄糖单元之间。在该时间点，在15和60葡萄糖单元之间，链长分布的前面范围中的变浅仍然 可以辨别，但与未处理的Sigmacell的情况相比，其在更短的范围内。链长分布的上端和链 长分布的最大值在实验期间持续向较短链移位，并且，在实验期间变浅持续减少，直至不再 可辨别。20小时后，曲线在10和300葡萄糖单元之间，最大值在80葡萄糖单元处。
[0386] 爱默生踝节菌
[0387] 水解混合物的组分：
[0388] 10mg/ml Sigmacell,
[0389] 10U/ml爱默生踝节菌内切葡聚糖酶，
[0390] 3U/ml黑曲霉β-葡糖苷酶，
[0391] 40°(3,0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液
[0392] 与其它水解样品相比，20小时样品的链长分布显示出预料不到的过程。通过来自 爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶水解Sigmacell 1小时后，链长分布范围为10至300葡萄糖单 元，最大值为70葡萄糖单元。此后，可以观察到较长链的增加，伴随着链长分布范围持续变 窄。由于链长分布向较长链长移位，曲线的最大值同样向较长链长移位。6小时的水解时间 后，链长分布在10和250葡萄糖单元之间，最大值在100葡萄糖单元处。
[0393] 总结：
[0394] 比较通过所用的5种内切葡聚糖酶降解Sigmacell，使用黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌 内切葡聚糖酶实现了快速降解。海栖热袍菌和长枝木霉内切葡聚糖酶的降解速率较慢。当 使用来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌、海栖热袍菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶时，水解 Sigmacell 19小时后，链长分布的上端在300至400葡萄糖单元处。使用爱默生踝节菌内切 葡聚糖酶，1小时水解时间后，可以观察到较长链的增加。当使用Avicel和爱默生踝节菌内 切葡聚糖酶时，2小时水解时间后，同样观察到较长纤维素链的增加，这就是为什么不能假 定该观察是测量误差。该观察的原因还不清楚。一种可能性是短链的降解增加，由此，所存 在的较长的链相比起来会更加突出。
[0395] 实施例9:经酶促水解的Sigmace 11的聚合度DP的确定
[0396] 进行GPC分析，以确定经酶促水解的Sigmacell(实施例8)的DP。
[0397] 样品组成GPCo:
[0398] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0399] 流动相：DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0400] 实验结果示出于附图3a至3e中。
[04011 使用黑曲霉内切葡聚糖酶水解5分钟后，DPw下降到130。DPn从110下降到60。因此， DPw和DPn两者均降低了至少55%。20分钟水解时间后，DPw达100且DPn达40。因此，水解进行 得更慢了。DPw为120，1小时样品和3小时样品的DPw略微增加。DPn显示了类似的过程。6小时 的反应时间后DPw为100和DPn为50支持这样的假设，即，1小时和3小时的水解时间后DPw和 DPn的增加可能同样基于对测量的扰动。
[0402]当使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时，5分钟的水解时间后可以使DPw降低到初 始值的50%。直到实验结束时，DPw持续下降至80，然后停滞。关于DPn，可以观察到类似的过 程。该值同样在5分钟的水解时间后减半，且然后在40分钟后当DPn为50时停滞。实现了降解 的终止。与通过来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌的内切葡聚糖酶水解相比，通过来自爱默生 踝节菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶水解Sigmacell进行得更慢。在5分钟的反应时间后，当 使用爱默生踝节菌内切葡聚糖酶时，DPw为150。1小时的反应时间后，DPw继续下降至75。在该 时间点，DP N处于40。水解3小时后，可以观察到DPw的增加。关于通过爱默生踝节菌内切葡聚 糖酶水解纤维素，同样地，水解2小时后，DPw和DPn两者都增加。一个可能的原因是短链的 降解增加，由此，所存在的较长的链相比起来会更加突出。
[0403]当使用长枝木霉内切葡聚糖酶时，5分钟的反应时间后，DPw达到200。1小时的反应 时间后，DPw继续下降至130。在该时间点，DPn为65。当使用长枝木霉内切葡聚糖酶时，1小时 后，纤维素继续被降解，并且，在实验终止后，DPw达80且DPn达50。
[0404] 与通过来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌、爱默生踝节菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶 水解Sigmacell相比，使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶水解Sigmacell进行得更慢。20小时的 反应时间后，DPw为100且DPn为45,这与当使用黑曲霉内切葡聚糖酶时在6小时反应时间后处 于相同的范围内。
[0405] 使用所提出的内切葡聚糖酶水解20小时后，DPw可以被降低到小于初始值的一半。 所用的内切葡聚糖酶在它们的反应速率和实验结束时所达到的DPw的方面不同。使用来自 解淀粉芽孢杆菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶可以达到最低的DP值。使用来自解淀粉芽孢杆 菌的内切葡聚糖酶，DPw停滞于80。因此，实现了降解的终止。使用来自黑曲霉、海栖热袍菌 和爱默生踝节菌内切葡聚糖酶，DPw下降直到实验结束。因此，未实现降解的终止。
[0406] 由于这样一个事实，即，与其它内切葡聚糖酶相比，来自黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌 的内切葡聚糖酶的反应速率更快，这些内切葡聚糖酶对于进一步的实验研究来说特别重 要。
[0407] 与六￥；[061和€[-纤维素的情况一样，Sigmacell的多分散性同样由DPw和DPn计算得 到，并且，可见下表。
[0408]
[0410] DPW、DPN 和 CLD 通过 GPCo 确定(软件:ASTRA)
[0411] 箭头指示各自的趋势
[0412] 使用来自黑曲霉和爱默生踝节菌的内切葡聚糖酶酶促水解的DP和多分散性结果 彼此不相关联。由于黑曲霉内切葡聚糖酶的水解样品中的测量误差和爱默生踝节菌内切葡 聚糖酶的水解样品不寻常的DP上升，然而，关于这些内切葡聚糖酶，没有使用1天后的DP结 果。其它内切葡聚糖酶的1天水解时间的DPw和多分散性彼此相关，如同关于Avi ce 1和α-纤 维素已经观察到的那样。
[0413] 实施例l〇:Sigmacell水解的质量平衡 [0414]读数收集在下表中：
[0415]
[w'l &」 个浴?王纤维系昜眾物仕卻小叮后通迓佛疋纤维系烦天米测重；
[0417] 还原糖在20小时后通过ΡΑΗΒΑΗ试验测量；
[0418] 葡萄糖和纤维二糖在20小时后通过HPLC测量；
[0419] 未知的可溶性纤维素寡聚物(ΡΑΗΒΑΗ试验和HPLC分析之差)20小时后；
[0420]百分比基于所用的纤维素完全转化时形成的葡萄糖和纤维二糖
[0421] 使用来自黑曲霉的内切葡聚糖酶，水解后测量到87.9%的不溶性纤维素。当使用 海栖热袍菌内切葡聚糖酶时，测量到100%的不溶性纤维素。由于Sigmacell损失少，因此这 两种酶对于其中可溶性纤维素寡聚物和葡萄糖不是生产目标的工业过程来说特别重要。
[0422] 使用ΡΑΗΒΑΗ试验，在通过海栖热袍菌内切葡聚糖酶的S i gmac e 11水解中确定出 9.1 %的还原糖部分。由于至少9.1 %的所用纤维素已被转化为葡萄糖和可溶性纤维素寡聚 物，因此，100%不溶性纤维素的比例太高了。当使用来自解淀粉芽孢杆菌、海栖热袍菌和黑 曲霉的内切葡聚糖酶时，产生了少于4%的未知的可溶性纤维素寡聚物。使用来自爱默生踝 节菌和长枝木霉的内切葡聚糖酶分别产生了 12.7%和25.4%的未知的可溶性纤维素寡聚 物。因此，这些内切葡聚糖酶适合于生产可溶性纤维素寡聚物。
[0423] 实施例11:用离子液体进一步预处理后纤维素的第二次酶促水解:（IL重启）
[0424] 使用IL重启，已通过酶促水解降解2天的纤维素再溶解于离子液体中，且随后沉 淀。该纤维素通过进一步预处理被再次降解。使用这种方法，可以研究由底物引起的降解终 止。这些研究的结果描述于下文。
[0425] 来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶被用于这些实验，因 为对于纤维素寡聚物的生产来说它们特别有兴趣，这归因于产生溶解糖少。使用短链底物 Avicel和长链底物α-纤维素进行这些研究，以便研究是否存在链长依赖性。
[0426] 实施例lla:IL重启后的Avicel的水解
[0427] 通过GPCo分析样品，以分析对Avicel水解的后续实验。
[0428] 水解混合物的组分：
[0429] 10mg/ml Avicel,
[0430] 分别来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的10U/ml内切葡聚糖酶，
[0431 ]分别来自黑曲霉和农杆菌属物种的3U/mli3-葡糖苷酶，
[0432] 40°(3，分别为0.说？!16的磷酸盐缓冲液和0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液。
[0433] 对于进行IL重启的样品的链长分布，可以观察到，其与简单水解相比，链长分布的 上端向较短链的移位。通过第二次水解所产生的链长分布根据所用的内切葡聚糖酶而不 同。当使用黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时，进行IL重启后可以辨别出具有18葡 萄糖单元大小的纤维素寡聚物的增加。由于具有18葡萄糖单元大小的纤维素寡聚物的增 加，在进行IL重启后使用黑曲霉内切葡聚糖酶水解中观察到18葡萄糖单元处的进一步最大 值。使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶，进行IL重启后可以观察到具有15葡萄糖单元大小的纤 维素寡聚物的增加。
[0434] 实施例1 lb: IL重启后经酶促水解的Avice 1的聚合度DP的确定
[0435] 进行GPC分析，以确定经酶促水解的Avice 1 (实施例1 la)的DP。
[0436] 样品组成GPCo:
[0437] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0438] 流动相：DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0439] 实验结果示出于附图4a至4c中。
[0440]由黑曲霉内切葡聚糖酶水解21小时后，DPw达到85。已孵育45小时的样品的分析表 明纤维素没有任何进一步降解。事实上，DPw上升到95。因此，当使用这种内切葡聚糖酶和 Av i ce 1时，1天的反应时间是足够的。
[0441]通过IL重启的处理允许DPw降低到单次水解后的值的一半。因此，IL重启方法是用 于生产DPw为40的纤维素的合适的方法。
[0442]当使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时，除重启实验的样品以外的样品的DPw在 55和65之间。当使用IL重启方法时，获得了 35的DPw。
[0443] 当使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶时，1天和2天样品的DPw达到80。IL重启方法导致 55的DPw。与简单水解的DPw相比，使用这种方法时，DPw可以降低至少30%。
[0444] 实施例11 c: IL重启后α-纤维素的水解
[0445] 通过GPC分析样品，以分析α-纤维素水解的后续实验。
[0446] 水解混合物的组分：
[0447] 10mg/mla-纤维素，
[0448] 分别来自黑曲霉、解淀粉芽孢杆菌和海栖热袍菌的10U/ml内切葡聚糖酶，
[0449] 分别来自黑曲霉和农杆菌属物种的3U/mli3-葡糖苷酶，
[0450] 40°(3，分别为0.说？!16的磷酸盐缓冲液和0.说？!14.5的醋酸盐缓冲液。
[0451]使用所用酶的α-纤维素水解实验的链长分布显示与Avicel水解基本上类似的谱。 仅IL重启实验导致显著降低的分子量。当使用黑曲霉内切葡聚糖酶时，进行IL重启后可以 辨别出具有18葡萄糖单元大小的纤维素寡聚物的增加。进行IL重启后，链长分布向较短链 移位，并且在10和200葡萄糖单元之间。当使用解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶用于水解α-纤 维素时，进行IL重启后链长分布的最大值向较短链长移位了 30葡萄糖单元。使用海栖热袍 菌内切葡聚糖酶进行IL重启后，没有观察到链长分布的上端或链长分布的最大值向较短链 长的移位。
[0452] 实施例lid: IL重启后经酶促水解的α-纤维素的聚合度DP的确定
[0453] 进行GPC分析，以确定经酶促水解的α-纤维素(实施例11c)的DP。
[0454] 样品组成GPC。：
[0455] 2mg/ml纤维素冻干物，在DMF/19%EMIM Ac(v/v)中
[0456] 流动相:DMF/10%EMIM Ac(v/v)，50°C
[0457] 实验结果示出于附图5a至5c中。
[0458] 对于来自黑曲霉和海栖热袍菌的内切葡聚糖酶来说，通过将反应时间延长至2天， 可以实现DPw的降低。对于解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶来说，这并不清楚，因为由于冻干 问题，1天水解样品被丢弃了。
[0459] 至于黑曲霉内切葡聚糖酶，与简单水解相比，当使用IL重启时，2天后DPw降低了 40% 〇
[0460]与简单水解相比，当使用IL重启方法与解淀粉芽孢杆菌内切葡聚糖酶时，2天后 DPw可以降低36%。
[0461 ]使用海栖热袍菌内切葡聚糖酶，水解1天后DPw达140且水解2天后DPw达120。与简单 水解相比，通过进行IL重启，不能实现进一步的降解。
[0462] 在简单水解中，DPw下降直至2天后实验结束；因此，没有实现降解的终止。
[0463] 使用IL重启方法，可以生产DPw为55的α-纤维素。
[0464] 实施例中使用的β-葡糖苷酶是本发明的可选的进一步配置。已经可以在根据本发 明的研究的范围内证明所述酶的使用不是强制性的。
[0465] 已知的是，由于纤维素降解产物(尤其是纤维二糖）的存在，β_葡糖苷酶能够防止 由内切葡聚糖酶所引起的任何产物抑制。然而，使用这种酶的实际必要性可以通过少量的 例行初步实验来确定。
[0466] 参考了本文引用的文献的公开内容。
【主权项】
1. 用于生产纤维素寡聚物的方法，其中 a) 在水性反应介质中，使用至少一种内切葡聚糖酶(EG) (E.C. 3.2.1.4)，水解切割纤维 素(纤维质的起始材料），以及 b) 从反应介质中分离包含一种或多种纤维素寡聚物的反应产物，S卩，纤维素寡聚物部 分。2. 根据权利要求1的方法，其中所形成的（一种或多种)纤维素寡聚物具有在从10至100 的范围中的数均链长(数均聚合度DPn)。3. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中所形成的（一种或多种)纤维素寡聚物具有 在从15至50的范围中的DPn值。4. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中EG是天然的或重组产生的，任选地来自芽 孢杆菌属(Bacillus)、曲霉属(Aspergillus)或热袍菌属(Thermotoga)，特别地物种解淀粉 芽抱杆菌（Bacillusamyloliquefaciens)、黑曲霉（Aspergillusniger)或海栖热袍菌 (Thermotogamaritima)的微生物的经遗传修饰的酶，或这些天然或重组酶中的至少两种 的组合。5. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中酶促水解在水性介质中在大约3至8,特别 是4至7的范围中的pH和/或在从20至90°C，特别地从30至80°C的范围中的温度和/或在0.1 至100小时，特别地1至48小时的持续时间中进行。6. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中至少一种EG以大约0.01至100，如，举例来 说，1至50或2至10U/ml反应混合物的浓度施用。7. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中以基于反应混合物的总体积的从0.1至5% (w/v)的范围中的浓度施用纤维素。8. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中纤维素 al)经历预处理步骤，通过所述步骤纤维素的结晶度降低，以及 a2)使用EG将步骤al)的纤维素酶促水解。9. 根据权利要求8的方法，其中使用离子液体、酸和/或机械能量输入通过步骤al)中的 处理降低纤维素的结晶度。10. 根据权利要求9的方法，其中离子液体选自在100°C以下温度为液体的盐，如，特别 是，1 -乙基-3-甲基咪唑乙酸盐(EM頂Ac)和3-甲基-N-丁基氯化吡啶（[C4mpy]C1)。11. 根据权利要求10的方法，其中，在步骤al)中，将纤维素引入离子液体中，在其中溶 解，任选在热作用下并随后通过添加水、有机溶剂或其混合物而沉淀，将沉淀分离下来，任 选洗涤并且任选去除液体。12. 根据权利要求9的方法，其中，在步骤al)中，用浓磷酸进行酸处理。13. 根据权利要求9的方法，其中，在步骤al)中，用球磨机进行机械处理。14. 根据前述权利要求中任一项的方法，其中在分离反应产物之前，重复一次或多于一 次处理步骤，特别是步骤al)和a2)。15. 通过根据前述权利要求中任一项的方法生产的纤维素寡聚物作为食品和饲料、化 妆品或药品的添加剂，作为洗涤剂添加剂，作为流变学改性剂，以及作为用于有机合成的起 始材料的用途。
【专利摘要】本发明涉及使用内切葡聚糖酶生产纤维素寡聚物(纤维素寡聚物)的方法，并且涉及所生产的寡聚物在多种技术领域中的用途。
【IPC分类】C12P19/14
【公开号】CN105492619
【申请号】CN201480047987
【发明人】M·格兰斯特罗姆, A·金德勒, A·斯拜斯, S·克鲁格, B·邦哈格
【申请人】巴斯夫欧洲公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月30日
【公告号】EP3017056A2, WO2015000858A2, WO2015000858A3
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