高密度脂蛋白中的胆固醇测定方法和该方法中使用的试剂的制作方法
高密度脂蛋白中的胆固醇测定方法和该方法中使用的试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及简便且精确地测定高密度脂蛋白中的胆固醇的方法和该方法中使用 的试剂。
【背景技术】
[0002] 作为生物体主要的脂质的胆固醇、中性脂肪（以下，有时称为甘油三酯或者TG)和 磷脂在血液中与载脂蛋白一起形成脂蛋白而存在。该脂蛋白，根据物理性状的不同，分为乳 糜微粒、极低密度脂蛋白（以下，有时称为VLDL)、低密度脂蛋白（以下，有时称为LDL)、高密 度脂蛋白（以下，有时称为HDL)等。已知其中的HDL因为从生物体中的各组织接受胆固醇，关 系到积蓄在细胞内的胆固醇的除去作用，是以冠状动脉硬化症为代表的各种动脉硬化症的 危险预防因素。因此，HDL中的胆固醇（以下，有时称为HDL - C)的血中浓度的把握，对动脉硬 化性疾病的发病预知有用而在临床上广泛测定。
[0003] 作为HDL-C的测定方法，不需要将测定试样中的HDL与HDL以外的脂蛋白分离分级 的工序，分类为所谓的均相HDL - C直接测定法（以下，有时称为以往方法）的临床检查用的 试剂大量市售，从而在程序检查中使用（非专利文献1、4)。然而，这些实用化的临床检查用 的方法?试剂也有测定精度方面的问题，特别是在血脂异常检体中，以基准测定法(非专利 文献2、3)测定时的测定值与用各种试剂测定时的测定值的背离在国际上也一直是问题(非 专利文献4)。
[0004] 许多以往方法可以分类为在HDL-C测定前，将HDL以外的脂蛋白中的胆固醇的全 部或者一部分从反应液中消除以使得其不参与HDL - C测定的主反应（以下，有时简称为主 反应)的方法(例如，专利文献1、2);或者，在HDL-C的测定时，HDL以外的脂蛋白中的胆固醇 抑制HDL以外的脂蛋白中的胆固醇的反应以使得其不参与HDL - C测定的主反应的方法(例 如，专利文献3~6)，该以往方法中，概括为HDL以外的脂蛋白VLDL与LDL的性状并不相同，因 此由VLDL引起的测定误差的消除成为课题。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:国际公开第98/26090号小册子 [0008] 专利文献2:国际公开第2000/078999号小册子 [0009] 专利文献3:国际公开第95/24502号小册子 [0010] 专利文献4:国际公开第2004/035816号小册子 [0011] 专利文献5:国际公开第2005/100591号小册子 [0012] 专利文献6:国际公开第2006/118199号小册子 [0013]非专利文献
[0014] 非专利文献l:Clinical Chemistry 47:9 1579 - 1596(2001)
[0015] 非专利文南犬2: European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 29 269 -275(1991)
[0016] 非专利文献3:Clinical Chemistry 45:10 1803 - 1812(1999)
[0017] 非专利文献4:Clinical Chemistry 56:6 977 - 986(2010)
【发明内容】
[0018] 因此，本发明的目的在于，找到即便以像血脂异常症这样的特殊的病症的患者检 体为测定试样时，也能够提高与DCM(指定比较法，Designated Comparison Method)等基准 测定法的测定值的一致性的化合物，提供利用该化合物的HDL-C测定方法。
[0019] 本发明人等对上述课题进行了深入研究，结果发现HDL - C测定时，在#盐和聚阴 离子的存在下将胆固醇氧化酶等胆固醇测定用酶和测定试样混合时，能够大幅抑制该胆固 醇测定用酶对VLDL的反应性，更高精度地测定HDL-C。
[0020] 即，本发明涉及以下内容。
[0021 ] [ 1 ] -种高密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征在于，
[0022] 包含使测定试样与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者与胆固醇酯水解酶和胆 固醇脱氢酶在通式(I)表示的化合物和聚阴离子的存在下反应的工序，
[0023]
[0024] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0025] [2]根据[1]所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0026] [3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基# 盐、三甲基十二烷基I#盐、三甲基十六烷基盐、三乙基辛基#盐、三乙基十二烷基I# 盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基#盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷基I# 盐中的至少1种化合物。
[0027] [4]根据[1]~[3]中任1项所述的方法，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。
[0028] [5]根据[1]~[4]中任1项所述的方法，其中，在进一步存在白蛋白的条件下进行 上述工序。
[0029] [6]根据[1]~[5]中任1项所述的方法，其中，在进一步存在选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物的条件下进行上述工序。
[0030] [7] -种高密度脂蛋白胆固醇测定用试剂，含有下述(a)、（b)和(c): (a)通式(I)表 示的化合物，
[0031]
[0032] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0033] (b)聚阴离子，
[0034] (c)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶
[0035] [8]根据[7]所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0036] [9]根据[7]或者[8]所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基 |奔盐、三甲基十二烷基#盐、三甲基十六烷基I#盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷基 I#盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基I#盐、三丁基十二烷基I#盐和三丁基十六烷基 _盐中的至少1种化合物。
[0037] [10]根据[7]~[9]中任1项所述的试剂，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。
[0038] [11]根据[7]~[10]中任1项所述的试剂，其中，进一步含有白蛋白。
[0039] [12]根据[7]~[11]中任1项所述的试剂，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。
[0040] [13]根据[7]~[12]中任1项所述的试剂，其中，包含第1试剂组和第2试剂组，上述 第1试剂组含有(a)通式(I)和(b)聚阴离子，上述第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和胆固 醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0041] [14]一种试剂盒，在高密度脂蛋白胆固醇测定中使用，含有下述(a)、(b)和(c):
[0042] (a)通式（I)表示的化合物，
[0043]
[0044] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0045] (b)聚阴离子，
[0046] (c)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0047] [15]根据[14]所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链 状的碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0048] [16]根据[14]或者[15]所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基 辛基I#盐、三甲基十二烷基#盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基f奔盐、三乙基十二 烷基I#盐、三乙基十六烷基I聲盐、三丁基辛基I#盐、三丁基十二烷基#盐、以及三丁基 十六烷基I#盐中的至少1种化合物。
[0049] [17]根据[14]~[16]中任1项所述的试剂盒，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸 葡聚糖。
[0050] [18]根据[14]~[17]中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有白蛋白。
[0051] [19]根据[14]~[18]中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基 胺、聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。
[0052] [20]根据[14]~[19]中任1项所述的试剂盒，其中，包含第1试剂组和第2试剂组， 上述第1试剂组含有(a)通式(I)和(b)聚阴离子，上述第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和 胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0053] 根据本发明，不需要对测定试样进行离心分离等前处理，以简便的操作高效地对 HDL - C进行定量。另外，因为能够以少量的测定试样进行特异性测定，所以能够用于各种自 动分析装置，在临床检查领域极其有用。另外，本发明的HDL-C测定因为测定中使用的试剂 的组成是不含有2价金属作为必需成分的组成，所以还具有分析装置不受到负荷的优点。特 别是还具有以往方法中产生测定误差的含有大量的VLDL的检体，例如甘油三酯为高值、总 胆固醇和LDL胆固醇大体为正常值、IV型高血脂症这样的检体的测定精度大幅改善的优点。
【具体实施方式】
[0054] -个实施方式中，本发明提供高密度脂蛋白胆固醇(HDL - C)测定方法。本发明方 法通过在聚阴离子和#盐化合物的存在下，使用公知的胆固醇测定用试剂对含有HDL的测 定试样测定HDL-C来实施。
[0055] 作为供于本发明的方法的测定试样，只要是可能包含HDL、LDL、VLDL和乳糜微粒等 脂蛋白的检体，就可以是任意的，例如，可以举出血清、血浆等体液及其稀释物，不限定于这 止匕 -、〇
[0056]本说明书中，将HDL - C测定中使用的以胆固醇为基质的酶通称为胆固醇测定用 酶。作为胆固醇测定用酶，可举出胆固醇酯水解酶(包含分类为脂肪酶的酶）、胆固醇氧化 酶 、胆固醇脱氢酶等。
[0057] 以下，以作为临床检查领域中通用的HDL-C测定法的二工序(二试剂)进行的测定 体系为模型进行本发明方法的说明。二工序测定体系(或者二试剂测定体系)是最初进行使 用第一试剂来抑制HDL以外的脂蛋白的胆固醇与胆固醇测定用酶的反应性的工序(第1工 序），接着进行添加含有胆固醇测定用酶的第二试剂进行胆固醇测定工序(第2工序）的方 法。应予说明，以下的本说明书中，有时将二工序测定体系的第1工序、第2工序分别简称为 第1工序、第2工序。
[0058] 本发明的方法中的第1工序中，向测定试样添加聚阴离子和#盐化合物，使用聚 阴离子和鱗盐化合物对该测定试样中的HDL以外的脂蛋白进行处理。这里"处理"是指在 HDL以外的脂蛋白的粒子表面静电结合聚阴离子和I身盐化合物。本工序中，根据聚阴离子 和|舞盐化合物的添加量，有时经由聚阴离子而使HDL以外的脂蛋白粒子集合（所谓的凝 聚），但该凝聚现象并非是为了得到本发明的效果所必需的。第1工序的目的在于，通过上述 "处理"使随后的第2工序中的HDL以外的脂蛋白中的胆固醇与胆固醇测定用酶的反应性降 低。
[0059]接着，在第2工序中，使用以往公知的方法进行HDL - C的测定。作为脂蛋白中含有 的胆固醇，有酯型胆固醇（以下，有时称为胆固醇酯)和游离型胆固醇。酯型胆固醇被胆固醇 酯水解酶水解而转变为游离型胆固醇和脂肪酸。这里产生的游离型胆固醇与本来存在的游 离型胆固醇一起成为胆固醇测定用酶(例如，胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶）的基质。使 用胆固醇氧化酶作为胆固醇测定用酶时，游离型胆固醇被氧化而转变为胆留烯酮和过氧化 氢。使在过氧化物酶的存在下与过氧化氢反应而形成醌色素的化合物与之反应，测定产生 的醌色素的吸光度，由此能够测定HDL中含有的酯型胆固醇和游离型胆固醇的和，即HDL-C 量。另外，使用胆固醇脱氢酶作为胆固醇测定用酶时，基于吸光度测定作为辅酶的NAD(P)H 的增加，由此能够测定HDL-C量。
[0060] 作为本发明中使用的##盐化合物，可举出通式(I)表示的化合物（以下，有时称为 化合物(I))。
[0061]
[0062] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基，或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0063] 作为化合物（I)中的R1表示的直链或支链状的碳原子数8~22的烷基，例如可举出 辛基、异辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基（月桂基）、十三烷基、十四烷基（肉豆蔻基）、 十五烷基、十六烷基(鲸蜡基）、十七烷基、十八烷基(硬脂基）、十九烷基、二十烷基、二十一 烷基、二十二（山嵛基)等基团，优选为碳原子数8~18的烷基，更优选为碳原子数12~16的 直链烷基。
[0064] 作为化合物（I)中的R1表示的直链或支链状的碳原子数8~22的烯基，例如可举出 辛烯基、壬烯基、癸烯基、香茅基、i-碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五 碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、油烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二i-碳烯基、二十二 碳烯基等基团，更优选为碳原子数8~18的直链烯基。
[0065] 作为化合物（I)中的R2、R3或者R4表示的直链或支链状的碳原子数1~6的烷基，例 如可举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等基团，优选为碳原子数1~4的直链烷基。
[0066] 作为化合物（I)中的R2，R3或者R4表示的直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，例 如可举出乙烯基、1 一丙烯基、稀丙基(2-丙烯基）、丁烯基、戊烯基、己烯基等，更优选为碳原 子数2~4的直链烯基。
[0067] 作为化合物（I)中的X_表示的阴离子，例如可举出氢氧根离子、卤素离子、来自无 机酸的阴离子、来自有机酸的阴离子等。作为卤素离子，可举出氟离子、氯离子、溴离子、碘 离子等。作为来自无机酸的阴离子，例如可举出硝酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、碳酸 根离子、四氟硼酸根离子等。作为来自有机酸的阴离子，例如可举出甲酸根离子、乙酸根离 子、乳酸根离子、柠檬酸根离子、谷氨酸根离子等羧酸根离子等。
[0068] 本发明方法中，作为#盐化合物，可以将上述的化合物（I)单独或者组合2种以上 使用。作为化合物（I)优选的例子，可举出三甲基辛基#盐、三甲基十二烷基I#盐、三甲基 十六烷基I奔盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷基4#盐、三乙基十六烷基#盐、三丁基 辛基#盐、三丁基十二烷基#盐、三丁基十六烷基#盐、三己基十四烷基#盐等。作为 #盐，可优选举出氯化物和溴化物的盐。作为化合物（I)的具体例（制品），例如，可举出三 丁基一正辛基氯化膦、三丁基十二烷基溴化膦、三丁基十六烷基溴化膦(均为东京化成工业 株式会社制）、三己基十四烷基溴化膦、三己基十四烷基四氟硼酸膦（均为Sigma-Aldrich 制另外，本领域技术人员可以参照Green chemistry 5 143 - 152(2003)， Electrochemistry communications 9 2353 - 2358(2007) ?Electrochemistry 75 734 - 736(2007)的记载，合成例如三甲基十六烷基溴化膦、三乙基十二烷基溴化膦、三乙基十六 烷基氯化膦等式(I)表示的#盐化合物。
[0069] 作为化合物（I)的浓度，只要是可以进行本发明的HDL-C的测定的浓度，就没有特 别限制，第1工序中的反应液中的浓度优选为〇. 〇〇 lmm〇 1/L~lmo 1 /L，第1工序中的反应液中 的浓度更优选为〇. 01~10mm〇l/L。
[0070] 作为聚阴离子，只要是能够进行本发明的HDL - C的测定的聚阴离子，就没有特别 限制，可举出磷钨酸或者其盐、硫酸葡聚糖或者其盐、肝素或者其盐、聚乙二醇等，不限定于 这些。作为硫酸葡聚糖，例如，平均分子量为4000~200万，优选为4000~50万，更优选为 4000~5万，例如可举出平均分子量4000、5000、1万、3万6000、4万、5万、8万、20万、50万、100 万、200万等的硫酸葡聚糖。作为盐，例如可举出钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、镁盐等。另外，本发 明中，上述聚阴离子可以单独使用也可以组合2种以上使用。作为聚阴离子的浓度，只要是 能够进行本发明的HDL-C的测定的浓度，就没有特别限制，第1工序中的反应液中的浓度优 选为0.001~10重量％，第1工序中的反应液中的浓度更优选为0.01~1重量％。
[0071] 胆固醇测定用酶(胆固醇酯水解酶(包含分类为脂肪酶的酶）、胆固醇氧化酶、胆固 醇脱氢酶等)和过氧化物酶只要是一般用于胆固醇测定的酶，就可以不受限制地使用。这些 酶可以是来自微生物、来自动物、来自植物等任意出处，另外，可以通过基因操作而得到，不 受是否进行化学修饰限制。胆固醇测定用酶可以单独或组合2种以上使用。另外，其使用量 根据酶而不同，没有特别限制，作为第2工序中的反应液中的浓度，可以以0.001~100单位/ mL，优选以0.1~100单位/mL使用。过氧化物酶的使用量也没有限制，但作为第2工序中的反 应液中的浓度，为0.001~100单位/mL，优选为0.1~100单位/mL。
[0072] 作为在过氧化物酶的存在下与由胆固醇氧化酶的作用而生成的过氧化氢反应而 形成醌色素的化合物（以下，有时称为发色剂），可举出4一氨基安替比林和Trinder's试剂。 作为Trinder's试剂，可使用N，N-双(磺丁基）一间甲苯胺二钠(DSBmT)、N-乙基一 N-（2 - 羟基一3-磺丙基）一3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基一N-（3-甲基苯基）一Ν'一琥珀酰乙烯 二胺(EMSE)等，但不限于这些。另外，发色剂的使用浓度可以根据所希望的醌色素的形成 量、反应液量、反应时间等适当地选择。
[0073] 另外，使用胆固醇脱氢酶时的辅酶NAD(P)的使用浓度也可以适当选择。
[0074] 为了有利地实施本发明方法，可以使用将上述的聚阴离子、I#盐化合物、酶、发色 剂、辅酶等适当地组合而制备的试剂。并且，根据需要，可以配合抗坏血酸氧化酶、过氧化氢 酶、磷脂酶、鞘磷脂酶等胆固醇测定用酶以外的酶或盐、用于调整pH的缓冲剂、表面活性剂、 白蛋白等蛋白质类、抗体、抗生素、皂素、凝集素、毛地黄皂苷、环糊精、杯芳烃等对特定的脂 蛋白具有亲和性的物质、螯合剂、糖等稳定化剂，防腐剂。另外，镁离子、钙离子这样的2价金 属有时有助于酶的稳定化，可以以对HDL-C测定没有影响的（或者对测定装置没有影响的） 浓度添加。
[0075] 这些当中，作为缓冲剂，可以是Good ' s缓冲剂、磷酸、Tris、邻苯二甲酸盐等任一 个，作为反应液只要是能够设定在pH4~10的范围具有缓冲作用的条件的反应液，就可以使 用。其使用量没有特别限制，反应液中，以0.0005~2mol/L，优选以0.01~ImoVL使用。在实 施时，均根据使用的各种酶的特性或与试剂中含有的其他成分的关系等选择实验最佳条 件。
[0076] 白蛋白有时在本发明中提高灵敏度、特异性，可以适当使用。其种类只要能够进行 本发明的HDL - C的测定，就没有特别限制，例如可举出来自牛、马、羊、人、蛋白的白蛋白等， 优选牛血清白蛋白（BSA)。这些可以通过基因操作而制成，不受如何精制方法、有无化学修 饰限制。其使用量没有特别限制，反应液中的浓度优选为〇. 〇〇 1~1 〇重量％，更优选〇. 1~1 重量％。
[0077]表面活性剂只要是能够进行本发明的HDL-C的测定，就没有特别限制，可以从以 往公知的HDL - C的测定所使用的表面活性剂(非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、 阳离子性表面活性剂、两性离子性表面活性剂）中适当地选择使用。
[0078]特别是只要是将HDL选择性地可溶化的目的，可以适当使用HLB13~14的聚氧乙烯 衍生物，很优选聚氧乙烯三苄基苯基醚。作为具体例（制品名），可举出EMULGEN A - 90、 EMULGEN B - 66(均为花王株式会社制）。其浓度在第2工序的反应液中（如果换一种表现，则 相对于第1工序、第2工序的反应混合物整体)优选0.05~3重量％，更优选0.1~1.5重量％。 另外，也可以同样地使用国际公开第2004/048605号小册子所记载的多环型聚氧化烯衍生 物。
[0079]另外，作为表面活性剂，可以添加聚氧乙烯烷基胺或者聚氧乙烯烯基胺。作为聚氧 乙烯烷基胺或者聚氧乙烯烯基胺，例如可举出通式(II)表示的化合物（以下，有时称为化合 物(II))，
[008丨
[00811 (式中，R5表示直链或支链状的烷基或者烯基，R6表示氢原子或者(CH 2CH20)nH，m或η 相同或不同地为1~100的整数）。作为化合物（II)中的烷基和烯基，分别例如，可举出化合 物（I)中所述的直链或支链状的碳原子数8~22的烷基，直链或支链状的碳原 子数8~22的 烯基等，优选为碳原子数10~18的烷基或者烯基。
[0082]作为聚氧乙烯烷基胺或者聚氧乙烯烯基胺的具体例（制品），例如可举出NYMEEN L-201(N-羟乙基一月桂胺；日油株式会社）、NYMEEN L-207(聚氧乙烯月桂胺；日油株式 会社）、NYMEEN S - 204，NYMEEN S - 210(聚氧乙烯硬脂酰胺；日油株式会社）、New Call 0D - 420(聚氧乙烯烷基胺醚；日本乳化剂株式会社）、Pionin D - 3104，Pionin D - 3110(聚 氧乙烯月桂基氨基醚;竹本油脂株式会社）、BLAUN0N L - 205、L一207、L一210(聚氧乙烯月 桂胺;青木油脂工业株式会社）、BLAUN0N S - 207、S - 210(聚氧乙烯硬脂酰胺;青木油脂工 业株式会社）、BLAUN0N S - 207T(聚氧乙烯牛脂胺;青木油脂工业株式会社）、BLAUN0N 0 - 205(聚氧乙烯油胺;青木油脂工业株式会社)等。
[0083] 聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯烯基胺中的氧乙烯链的聚合度优选为1~100,更优选 为1~60。聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯烯基胺都可以单独使用，也可以组合2种以上使用。另 外，其使用量没有特别限制，反应液中的浓度优选为〇. 〇〇〇 1~1重量％，更优选〇. 〇〇 1~〇. 1 重量％。
[0084] 另外，可以含有阳离子性表面活性剂、具有氨基的表面活性剂作为表面活性剂，作 为这些例子，可举出叔胺和季铵盐。作为叔胺，例如可举出通式（III)表示的化合物（以下， 有时称为化合物（III))，
[0085]
[0086] (式中，R7表示直链或支链状的碳原子数6~30的烷基或者烯基，R8、R9相同或不同 地分别表示氢原子、直链或支链状的碳原子数1~30的烷基、或者直链或支链状的碳原子数 2~30的烯基。）作为化合物（III)的具体例（制品），例如可举出Nissan amine BB，Nissan amine AB、叔Nissan amine BB、叔Nissan amine FB(均为日油株式会社制）等。叔胺和季铵 盐的使用量没有特别限制，反应液中的浓度优选为〇. 〇〇〇 1~1重量％，更优选〇. 〇〇 1~〇. 1重 量％。上述叔胺和季铵盐均可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
[0087] 为了有利地实施本发明方法，可以提供一并包括上述的本发明方法中使用的试剂 的试剂盒。因此，其它实施方式中，本发明提供含有上述化合物（I)所示的#盐化合物、上 述聚阴离子和上述胆固醇测定用酶的HDL - C测定用试剂。在其它实施方式中，本发明提供 含有上述化合物（I)所示的#盐化合物、上述聚阴离子和上述胆固醇测定用酶的用于 HDL - C测定的试剂盒。该HDL - C测定用试剂和该试剂盒还可以含有上述的过氧化物酶、发 色剂、辅酶、白蛋白等蛋白质类、表面活性剂、胆固醇测定用酶以外的酶或盐、用于调整pH的 缓冲剂、抗体、抗生素、对特定的脂蛋白具有亲和性的物质、螯合剂、稳定化剂、防腐剂、有助 于酶的稳定化的2价金属等HDL-C测定所需的其他试剂。
[0088]如果示出本发明的HDL-C测定用试剂(二工序测定体系用）的具体例，如下。
[0089](第一试剂）
[0090] 聚阴离子
[0091 ] |筹盐化合物(化合物（I))
[0092] 发色剂(例如4 一氨基安替比林或Trinder's试剂）
[0093] (第二试剂）
[0094] 胆固醇测定用酶
[0095] 胆固醇酯水解酶 [0096]胆固醇氧化酶 [0097]过氧化物酶
[0098] 发色剂(例如4 一氨基安替比林或Trinder's试剂）
[0099] 表面活性剂
[0100] 如果示出本发明的HDL-C测定用试剂(二工序测定体系用）的其它具体例，如下。
[0101] (第一试剂）
[0102] 聚阴离子
[0103] I奔盐化合物(化合物（I))
[0104] 辅酶(NAD(P))
[0105] (第二试剂）
[0106] 胆固醇测定用酶
[0107] 胆固醇酯水解酶
[0108] 胆固醇脱氢酶
[0109] 辅酶(NAD(P))
[0110] 表面活性剂
[0111] 基于上述的二工序测定体系的说明是为了促进本发明的方法的理解而记载的，并 不是局限于特定理论的目的。因此，上述的说明以实质上在胆固醇测定用酶与脂蛋白接触 前或与接触同时进行本发明的处理为限度，不是排除本发明的方法是一工序(一试剂)测定 体系或三工序(三试剂)测定体系的意图。而且，不是排除本发明的方法是在溶液中进行反 应的液体反应体系以外(例如固定试剂的试验片，使用干式分析元件等的固形反应体系）的 意图。只要是本领域技术人员，参酌基于上述二工序测定体系的本发明方法的详细的说明、 后述的实施例的记载，自然能够将本发明方法应用于一工序测定体系、三工序测定体系以 及使用试验片、干式分析元件的反应体系，能够实验决定这些测定体系、反应体系中的各试 剂的适当的使用量。
[0112] 例如，上述例示的HDL-C测定用试剂中，以不损害其性能为限度，可以选择仅第一 试剂含有上述胆固醇测定用酶、过氧化物酶等酶、发色剂、辅酶等，或仅第二试剂含有，或者 双方含有。另外，可以参照国际公开第02/38800号小册子、日本特开2007 - 325587号公报、 日本特开2009 -125049号公报、日本特开2009 - 247317号公报等，将上述试剂应用于试验 片、干式分析元件等。应予说明，有时可以在本发明方法中使用能够用于利用试验片、干式 分析元件等进行的HDL-C测定的其它成分、技术。
[0113]本发明方法中，因为抑制HDL以外的脂蛋白中的胆固醇参与主反应，所以HDL - C测 定后也残存在反应液中。因此，如果在HDL - C测定后进一步实施解除HDL-C以外的胆固醇 的反应抑制的方法(能够使全部的脂蛋白可溶化的表面活性剂的添加等），能够测定HDL以 外的脂蛋白中的胆固醇（临床中的所谓的nonHDL - C等）。另外，本发明方法中，本领域技术 人员使用公知的甘油三酯测定用酶组代替胆固醇测定用酶，能够测定HDL中的甘油三酯、 HDL以外的脂蛋白中的甘油三酯。
[om]实施例
[0115] 以下举出实施例进一步对本发明进行详细说明，本发明不受这些任何限制。应予 说明，本实施例和比较例中，使用下述制造商的试剂和酶。应予说明，表面活性剂的成分名 记载各制造商的产品手册记载名称。
[0116] MES(株式会社同仁化学研究所）、氢氧化钠(KISHIDA化学株式会社）、T00S(株式会 社同仁化学研究所）、4一氨基安替比林(和光纯药工业株式会社）、磷钨酸钠(KISHIDA化学 株式会社）、葡聚糖硫酸钠(分子量4000)(东京化成工业株式会社）、葡聚糖硫酸钠(分子量 36000~5万）（和光纯药株式会社）、葡聚糖硫酸钠(分子量50万）（和光纯药工业株式会社）、 氯化镁(KISHIDA化学株式会社）、三丁基一正辛基氯化膦(东京化成工业株式会社）、三丁基 十二烷基溴化膦(东京化成工业株式会社）、三丁基十六烷基溴化膦(东京化成工业株式会 社）、三己基十四烷基溴化膦(东京化成工业株式会社）、胆固醇酯酶(旭化成株式会社）、胆 固醇氧化酶(Oriental Yeast工业株式会社）、过氧化物酶（东洋纺织株式会社）、EMULGEN B - 66(成分名聚氧乙烯三苄基苯基醚；花王株式会社）、牛血清白蛋白（BSA; Sigma)、 BLAUNON L-205(成分名聚氧乙烯月桂胺;青木油脂工业株式会社）、BLAUN0N S - 207(成分 名聚氧乙烯硬脂酰胺;青木油脂工业株式会社）、十六烷基三甲基溴化铵（东京化成工业株 式会社）、叔Nissan amine BB(成分名二甲基月桂胺；日油株式会社）、Pegnol 005(成分名 聚氧乙烯三苄基苯基醚;东邦化学工业株式会社）、EMULGEN A-60(成分名聚氧乙烯二苯乙 稀化苯基醚;花王株式会社）、New Call 610(成分名聚氧乙稀多环苯基醚；日本乳化剂株式 会社）、New Call 2600FB(成分名聚氧化稀多环苯基醚；日本乳化剂株式会社）、胆酸钠(和 光纯药工业株式会社）、Enajicol L - 30AN(成分名氨基丙酸酯;狮王株式会社）、AMPHIT0L 24B(成分名月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱;花王株式会社）、Enajicol C-40H(成分名咪唑 啉甜菜碱;狮王株式会社）。三甲基十六烷基溴化膦(CAS编号[71221 - 96 - 0])、三乙基十二 烷基溴化膦(CAS编号[21743 - 53 - 3])、三乙基十六烷基氯化膦(CAS编号[56155 - 08 - 9] 通过Electrochemistry communications 9 2353 - 2358(2007)记载的方法合成。
[0117](比较例1)以往方法的特性的比较评价
[0118]使用将通过超离心分离法制备的HDL组分、VLDL组分利用生理食盐水以两组分中 的胆固醇浓度为50mg/dL的方式进行稀释而成的试样（以下，对该试样，有时称为HDL组分试 样、VLDL组分试样），对以往方法的特性进行比较评价。比较评价通过使用对下述所示的第 一试剂（以下，有时称为基础第一试剂)仅添加聚阴离子的试剂（比较例1 一 1)、添加专利文 献3中记载的化合物的组合的试剂（比较例1 一2)、添加专利文献4中记载的化合物的试剂 (比较例1 一 3 )、添加专利文献6中记载的化合物的试剂（比较例1 一 4、比较例1 一 5)而实施。 将向基础第一试剂添加的各成分名和浓度示于表1。第二试剂（以下，有时称为基础第二试 剂)使用以下所示组成的试剂。
[0119]第一试剂(基础第一试剂）
[0120] MES-NaOH 缓冲液（pH6 · 5) 100mmol/L
[0121] 4 -氨基安替比林0.7mmol/L
[0122] 第二试剂(基础第二试剂）
[0123] MES-NaOH 缓冲液(pH6 · 5) 100mmol/L
[0124] 胆固醇酯酶1单位/mL
[0125] 胆固醇氧化酶1单位/mL
[0126] 过氧化物酶5单位/mL
[0127] T00S 0.1mmol/L
[0128] EMULGENB - 661·0重量％
[0129] [表 1]
[0130]
[0131 ] 测定使用日立7170形自动分析机(Hitachi High-Technologies株式会社)进行。 向HDL组分试样或者VLDL组分试样2.4yL添加各比较例的第一试剂240yL，约5分钟后，再添 加基础第二试剂80yL。测定临添加基础第二试剂之前和添加后5分 钟后的吸光度，求出其差 (2点法）。吸光度测定在主波长600nm、副波长700nm下进行。
[0132]将使用比较例1 一 1的第一试剂测定的HDL组分试样的吸光度作为100,求出使用比 较例1 一2~比较例1 一5的第一试剂测定的HDL组分试样的相对吸光度（％ )(各比较例的HDL 组分试样的吸光度X 100/比较例1 一 1的HDL组分试样的吸光度）。并且，对各第一试剂下的 测定，计算VLDL组分试样相对于HDL组分试样的吸光度的相对吸光度（％ )(同一比较例中的 VLDL组分试样的吸光度X 100/HDL组分试样的吸光度）ADL组分试样的相对吸光度大、且 VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度小的条件是实现本发明的课题所要求的条件， 即，维持胆固醇测定用酶与HDL-C的反应性的状态下，降低胆固醇测定用酶与VLDL-C的反 应性的条件。将结果示于表2。
[0133][表 2]
[0134]
[0135] 首先，HDL组分试样的相对吸光度（％ )表示各比较例的第一试剂与HDL组分的反应 性的相对强度。因此数值小于100时，表示与比较例1一1相比，对HDL组分的反应性降低。接 下来，VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度（％ )因 HDL组分试样与VLDL组分试样的胆 固醇浓度相同，所以反映对两组分的反应性的差。如果数值为100,则表示对HDL组分和VLDL 组分的反应性同等，数值越小表示与VLDL组分的反应性越低。比较例1 一 1的VLDL组分试样 相对于HDL组分试样的相对吸光度为19.1%，可以说是相对于HDL组分可抑制VLDL组分的反 应性的条件的之一。比较例1 一 2(专利文献3)是基于使基础第一试剂进一步与2价金属盐共 存的试剂的试验条件，但相对于比较例1 一 1能够在维持对HDL组分的反应性的情况下，进一 步降低对VLDL组分的反应性。但是，2价金属盐(特别是镁盐)与作为自动分析装置的流路清 洗剂的碱性清洗液混合时，形成水难溶性的氢氧化盐(氢氧化镁)而引起流路堵塞等，在装 置的维护管理方面有重大问题，这作为以往技术的课题已认识到。比较例1 一 3(专利文献4) 与单独使用聚阴离子的比较例1 一 1相比，VLDL组分的反应性略微降低，但无法抑制至使用 镁离子的比较例1 一 2的水平。另外，可知比较例1 一4、1 一 5 (专利文献6)中，不但无法抑制 VLDL组分的反应性(特别是比较例1 一 5 )，而且与HDL组分的反应性也降低。
[0136] (实施例1)对解决课题有效的化合物的筛选
[0137] 使用通过超离心分离法制备的HDL组分、VLDL组分并利用生理食盐水以两组分中 的胆固醇浓度为50mg/dL的方式进行稀释而得的试样（以下，有时将该试样称为HDL组分试 样、VLDL组分试样），实施降低胆固醇测定用酶与VLDL组分的反应性的化合物的筛选。筛选 用的试剂使用在比较例1记载的基础第一试剂中按表3所示的浓度添加了聚阴离子、各种 I身盐化合物、BSA而得的试剂(实施例1 一 1~实施例1 一 16)。第二试剂使用比较例1记载的 基础第二试剂。
[0138] [表 3]
[0139]
[0140] 其中，表中，PTA表示磷钨酸钠，以0.04重量％使用。DS表示葡聚糖硫酸钠，以0.05 重量％使用。另外，对于#盐化合物而言，Pm (16)表示三甲基十六烷基溴化膦，P222(12)表示 三乙基十二烷基溴化膦，P222(16)表示三乙基十六烷基氯化膦，P4448表示三丁基一正辛基氯化 勝，P444(12)表不二丁基十^烷基漠化勝，P444(16)表不二丁基十八烷基漠化勝，P666(14)表不二 己基十四烷基溴化膦。浓度均表示第一试剂中的浓度。
[0141] 测定和结果的解析与比较例1同样地实施。即，将使用比较例1 一 1的第一试剂测定 的HDL组分试样的吸光度作为100，求出使用各实施例的第一试剂测定的HDL组分试样的相 对吸光度（％)。并且，各第一试剂的测定中，计算相对于HDL组分试样的吸光度的VLDL组分 试样的相对吸光度（％ )。将结果不于表4。
[0142] [表 4]
4 J -j
[0143] j
[0144] 由表4可知含有本发明的盐化合物的第一试剂在表3所示的实施例1 一 1~实施 例1 一 16中均能够在维持胆固醇测定用酶与HDL组分的反应性的状态下，抑制与VLDL组分的 反应性。而且，其反应性抑制的程度与使用了比较例1 一 2的镁离子的情况相比为同等程度 以上。含有本发明的盐化合物的第一试剂即便与自动分析装置的碱性清洗液混合也不 产生水难溶性的物质，因此可以说对使用比较例1 一2的第一试剂的情况是极其有用的方 法。另外，可知与比较例1 一3~比较例1 一5相比，含有本发明的#盐化合物的第一试剂对 VLDL组分的反应性抑制更优异。
[0145] 这样的效果在使用了三甲基十六烷基溴化膦、三乙基十二烷基溴化膦、三乙基十 六烷基氯化膦、三丁基一正辛基氯化膦、三丁基十二烷基溴化膦、三丁基十六烷基溴化膦、 三己基十四烷基溴化膦中的任一情况下都得到确认。另外，该效果并不取决于并用的聚阴 离子的种类，无论磷钨酸钠还是硫酸葡聚糖都显示相同的效果(将实施例1 一 2与实施例1 一 3、1 -4、1 一 5进行比较，或者将实施例1 一 10与实施例1 一 11、1 - 12进行比较）。而且，使用硫 酸葡聚糖时，不论其分子量如何，都能够得到目标效果(将实施例1 一3~1 一5进行比较）。另 外，无论有无 BSA，效果都不变动(将实施例1 一 9与1 一 10进行比较）。
[0146] (实施例2)利用添加了本发明的#盐化合物的第一试剂得到的血清检体的HDL胆 固醇测定值与利用简易DCM得到的HDL胆固醇测定值的相关
[0147] 使用磷钨酸钠作为聚阴离子，含有本发明的I#盐化合物的第一试剂(试剂A、B、C、 D、E、F、G、H、I)如下制备。
[0148]第一试剂(试剂A)
[0168] 使用由试剂A~试剂I的第一试剂和比较例1记载的基础第二试剂构成的HDL胆固 醇测定用试剂，测定人血清90检体中的HDL胆固醇浓度。人血清中的HDL胆固醇浓度的真值 使用DCM(非专利文献3)进行测定。将由DCM得到的测定值设为X，将各实施例的值设为Y，比 较相关系数、回归式。将结果示于表5。应予说明，本实施例中使用的人血清90检体的脂质项 目的测定值分布为总胆固醇（T 一 CH0)49~289mg/dL、HDL胆固醇（HDL - C)19~112mg/dL、 LDL胆固醇（LDL - C)24~196mg/dL、游离胆固醇（F - CH0)12~84mg/dL、甘油三酯（TG)20~ 351mg/dL，虽然包括一部分偏离参考基准值的检体，但可以说是由大体正常的检体构成的 检体组。应予说明，T一CH0使用Cholestest(注册商标)CH0，HDL-C使用Cholestest(注册商 标)N HDL，LDL-C使用Cholestest(注册商标)LDL，F-CH0使用Pure-auto(注册商标)S F - CH0-N，TG使用Cholestest(注册商标)TG(均为SEKISUI MEDICAL株式会社制）进行测定。另 外，TG为200mg/dL以上的检体用生理食盐水稀释2倍后供于DCM。
[0169] 上述D CΜ的具体的顺序如下。D CΜ分离液使用以下的试剂。葡聚糖硫酸钠 (Dextralip50，Sigma)，氯化镁6水合物(KISHIDA化学株式会社）、叠氮化钠(KISHIDA化学株 式会社）。测定顺序记于以下。
[0170] (1)分离液的制备
[0171] 试剂a
[0172] 葡聚糖硫酸钠20g/L
[0173] 叠氮化钠 0.5g/L
[0174] 试剂 b
[0175] 氯化镁 0.7mol/L
[0176] 叠氮化钠 0.5g/L
[0177] 制备试剂a和试剂b，将两者等量混合。
[0178] (2)将血清试样和上述（1)制备的分离液按体积比10:1进行混合，利用旋涡混合器 进行混合。
[0179] (3)室温下静置10~30分钟后，进行1500G、4°C、30分钟离心。
[0180] (4)回收上清液，使用Cholestest(注册商标)CH0(SEEISUI MEDICAL株式会社）测 定总胆固醇含量。因为血清试样利用分离液稀释至1.1倍，所以将得到的测定值乘以1.1倍， 作为血清试样中的HDL胆固醇值。
[0181] [表 5] 「01821
?〇?83?~(比较例2)由以往方法得到的第一试剂的测定值与由DCM得到的测定值的相关^' [0184]作为以往方法的第一试剂，制备以下的第一试剂(试剂J、K、L、Μ、N)。
[0185]第一试剂(试剂J)
[0186] MES-NaOH 缓冲液（pH6·5) 100mmol/L
[0187] 4 -氨基安替比林 0.7mmol/L
[0188] 磷钨酸钠 0.04重量％
[0189]第一试剂(试剂K)
[0190]
[0191] 第一试剂(试剂L)
[0198] 使用由试剂J~试剂N的第一试剂和比较例1记载的基础第二试剂构成的HDL胆固 醇测定用试剂，测定与实施例2相同的人血清90检体中的HDL胆固醇浓度。将由DCM得到的测 定值设为X，将各实施例的值设为Y，比较相关系数、回归式。将结果示于表6。
[0199] [表 6]
[0200]
[0201]由实施例2可知使用了含有本发明品的盐和聚阴离子的第一试剂的测定中，看 到与DCM的良好的相关关系。可知试剂A~试剂I中任一第一试剂中，与不含鱗盐的试剂J相 比，相关明显是显著的，与使用专利文献3记载的2价金属的方法(试剂K)、使用专利文献4记 载的聚氧乙烯月桂胺的方法(试剂L)、使用专利文献6记载的十六烷基三甲基溴化铵的方法 (试剂Μ和试剂N)相比，测定大体正常的检体组时的DCM的相关同等或有改善。
[0202](实施例3)异常检体的测定
[0203]使用由试剂Ε~试剂I的第一试剂和比较例1记载的第二试剂构成的HDL胆固醇测 定用试剂，测定表7所示的人血清检体中的HDL胆固醇浓度。应予说明，表7所示的各检体的 脂质浓度使用实施例2记载的各脂质测定用试剂进行测定。HDL胆固醇值如下计算。首先向 血清1. OmL重叠一层密度1.006的食盐水，以26000G进行30分钟离心。接着从上层除去与重 叠层的食盐水同体积量，将浮上的乳糜微粒层除去。对这样得到的样品应用DCM进行测定。 由DCM得到的测定值和使用各试剂时的测定值示于表8。
[0204] [表7]
[0205]
[0209] (单位mg/dL)
[0210] (比较例3)
[0211]使用由试剂J~试剂N的第一试剂和比较例1记载的基础第二试剂构成的HDL胆固 醇测定用试剂，测定表7所示的人血清检体中的HDL胆固醇浓度。将由DCM得到的测定值和使 用各试剂时的测定值示于表9。
[0212] [表 9]
[0213]
[0214] (单位 mg/dL)
[0215] 使用比较例所示的试剂J~试剂N对表7所示的甘油三酯为异常高值、总胆固醇和 LDL胆固醇为大体正常值的IV型高血脂症样的检体进行测定时，如表9所示，相对于DCM值偏 离较大。另一方面，使用含有本发明的#盐和聚阴离子的试剂E~试剂I测定表7所示的检 体的情况下，也显示与DCM值很好地一致的值。认为这是由于，总胆固醇和LDL胆固醇为大体 正常值、含有大量乳糜微粒、VLDL的检体中，通过以往的方法无法适当处理乳糜微粒、VLDL， 相对于此，将本发明的#盐与聚阴离子并用时，能够更可靠地处理乳糜微粒、VLDL，因此测 定精度提尚。
[0216](实施例4)与表面活性剂的组合 [0217]对表面活性剂的种类进行试验。
[0218]使用通过超离心分离法制备的HDL组分、VLDL组分并利用生理食盐水以两组分中 的胆固醇浓度为50mg/dL的方式进行稀释而得的试样（以下，有时将该试样称为HDL组分试 样、VLDL组分试样），对改变第二试剂中添加的表面活性剂的种类时的影响进行验证。第二 试剂使用在比较例1中记载的基础第二试剂中添加表10所示的表面活性剂代替添加 EMULGEN B - 66而得的试剂。对于第一试剂，作为以往方法，使用比较例2的试剂J，作为添加 了成为基准的本发明的#盐化合物的试剂，使用含有三丁基十二烷基溴化膦的实施例2的 试剂F。
[0219]第二试剂
[0220]
[0221] [表 10]
[0222]
[0223] 将使用试剂J作为第一试剂测定的HDL组分试样的吸光度设为100,对使用实施例 3 - 1~实施例3 - 8的各第二试剂的试验中使用添加了本发明的I聲盐化合物的试剂F作为 第一试剂测定的HDL组分试样的相对吸光度（％)进行计算。并且，各测定中，计算相对于HDL 组分试样的吸光度的VLDL组分试样的相对吸光度（％ ) ADL组分试样的相对吸光度大、且 VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度小的条件是实现课题所要求的条件，即，维持胆 固醇测定用酶与HDL的反应性的状态下，降低胆固醇测定用酶与VLDL的反应性的条件。将结 果示于表11。
[0224] [表 11]
[0225]
[0226] 对添加同一表面活性剂的第二试剂彼此，比较第一试剂中的本发明的|秦盐化合 物的添加效果。使用了含有属于非离子性表面活性剂的Pegnol 005(实施例3 - 1)、EMULGEN △ 一60(实施例3 - 2)、恥￥〇&11610(实施例3 - 3)、恥￥〇&11 260(^8(实施例3 - 4)的第二 试剂的情况与使用了EMULGEN B - 66的情况(实施例2)同样，确认了如下的目标反应:通过 将本发明的#盐化合物与聚阴离子一起添加到第一试剂中，在大体维持胆固醇测定用酶 对HDL组分的反应性的状态下，VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度降低，即抑制胆固 醇测定用酶对VLDL组分的反应性。使用了属于阴离子性表面活性剂的Ena j i co 1 L - 30AN (实施例3 - 5)、胆酸钠(实施例3 - 6)时，使用试剂J作为第一试剂测定HDL组分试样，结果在 规定的反应时间内吸光度的增加不饱和而发色反应不结束(不显示数据）。但是，将第一试 剂作为本发明的试剂F时，改善了与HDL组分的反应性，试剂F/试剂J的HDL组分的吸光度比 为超过100%的值。另外，对使用试剂J作为第一试剂时的胆固醇测定用酶与VLDL组分的反 应性而言，使用Enaji COlL - 30AN时与HDL组分为相同程度（108.2%)，使用胆酸钠时与 VLDL组分的反应性高至HDL组分的6倍(635.5% )。但是，使用本发明的试剂F作为第一试剂 时，各表面活性剂中VLDL组分的反应性均得到大幅抑制，VLDL组分试样/HDL组分试样的吸 光度比小（12.5%，3.4%)。
[0227] 使用属于两离子性表面活性剂的AMPHITOL 24B(实施例3 - 7)、Enajicol C - 40H (实施例3 - 8)的情况也确认了与使用阴离子表面活性剂的情况相同的现象。即，将本发明 的I#盐化合物与聚阴离子一起添加到第一试剂中，在大体维持（108.7%，105.0% )对HDL 组分的反应性的状态下，VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度降低（102%-45.9%， 171.7%^7.1%)〇
[0228] 根据以上，对使本发明的I#盐化合物和聚阴离子与脂蛋白共存对LDL和VLDL进行 处理的方法中的抑制胆固醇测定用酶与VLDL的反应性的效果而言，证实了在为了使HDL可 溶化而使用的任一表面活性剂的共存下都得到该效果。
【主权项】
1. 一种方法，是高密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征在于， 包括使测定试样与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者与胆固醇酯水解酶和胆固醇 脱氢酶在通式(I)表示的化合物和聚阴离子的存在下反应的工序，式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原子数8~ 22的烯基，R2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或者直链 或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基# 盐、三甲基十二烷基盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷基I# 盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基#盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷基 盐中的至少1种化合物。4. 根据权利要求1~3中任1项所述的方法，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。5. 根据权利要求1~4中任1项所述的方法，其中，在进一步存在白蛋白的条件下进行所 述工序。6. 根据权利要求1~5中任1项所述的方法，其中，在进一步存在选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物的条件下进行所述工序。7. -种高密度脂蛋白胆固醇测定用试剂，含有下述(a)、（b)和(c): (a) 通式(I)表示的化合物，式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原子数8~ 22的烯基，R2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或者直链 或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子， (b) 聚阴离子， (c) 胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。8. 根据权利要求7所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。9. 根据权利要求7或8所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基# 盐、三甲基十二烷基!奔盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基#盐、三乙基十二烷基# 盐、三乙基十六烷基#盐、三丁基辛基I#盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷基I# 盐中的至少1种化合物。10. 根据权利要求7~9中任1项所述的试剂，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。11. 根据权利要求7~10中任1项所述的试剂，其中，进一步含有白蛋白。12. 根据权利要求7~11中任1项所述的试剂，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。13. 根据权利要求7~12中任1项所述的试剂，其中，包含第1试剂组和第2试剂组，所述 第1试剂组含有(a)通式(I)和(b)聚阴离子，第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧 化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。14. 一种试剂盒，在高密度脂蛋白胆固醇测定中使用，含有下述(a)、（b)和(c): (a) 通式(I)表示的化合物，式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原子数8~ 22的烯基，R2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或者直链 或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子， (b) 聚阴离子， (c) 胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。15. 根据权利要求14所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链 状的碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。16. 根据权利要求14或15所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛 基I#盐、三甲基十二烷基f#盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷 基#盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷 基#盐中的至少1种化合物。17. 根据权利要求14~16中任1项所述的试剂盒，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸 葡聚糖。18. 根据权利要求14~17中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有白蛋白。19. 根据权利要求14~18中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基 胺、聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。20. 根据权利要求14~19中任1项所述的试剂盒，包含第1试剂组和第2试剂组，所述第1 试剂组含有(a)通式（I)和(b)聚阴离子，所述第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和胆固醇 氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
【专利摘要】本发明提供即便将像血脂异常症这样的特殊病症的检体作为测定试样时，也能够提高与DCM等基准测定法的测定值的一致性的HDL－C测定方法。将测定试样与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶在下述通式(I)(式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8～22的烷基、或者直链或支链状的碳原子数8～22的烯基，R2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1～6的烷基、或者直链或支链状的碳原子数2～6的烯基，X-表示阴离子。)表示的化合物和聚阴离子的存在下反应，测定HDL－C。
【IPC分类】C12Q1/44, C12Q1/60, C12Q1/26, C12Q1/32, G01N33/92
【公开号】CN105492623
【申请号】CN201480047506
【发明人】大田美惠子, 大野爱子
【申请人】积水医疗株式会社
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月1日
【公告号】CA2921825A1, EP3040421A1, US20160208311, WO2015030236A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及简便且精确地测定高密度脂蛋白中的胆固醇的方法和该方法中使用 的试剂。
【背景技术】
[0002] 作为生物体主要的脂质的胆固醇、中性脂肪（以下，有时称为甘油三酯或者TG)和 磷脂在血液中与载脂蛋白一起形成脂蛋白而存在。该脂蛋白，根据物理性状的不同，分为乳 糜微粒、极低密度脂蛋白（以下，有时称为VLDL)、低密度脂蛋白（以下，有时称为LDL)、高密 度脂蛋白（以下，有时称为HDL)等。已知其中的HDL因为从生物体中的各组织接受胆固醇，关 系到积蓄在细胞内的胆固醇的除去作用，是以冠状动脉硬化症为代表的各种动脉硬化症的 危险预防因素。因此，HDL中的胆固醇（以下，有时称为HDL - C)的血中浓度的把握，对动脉硬 化性疾病的发病预知有用而在临床上广泛测定。
[0003] 作为HDL-C的测定方法，不需要将测定试样中的HDL与HDL以外的脂蛋白分离分级 的工序，分类为所谓的均相HDL - C直接测定法（以下，有时称为以往方法）的临床检查用的 试剂大量市售，从而在程序检查中使用（非专利文献1、4)。然而，这些实用化的临床检查用 的方法?试剂也有测定精度方面的问题，特别是在血脂异常检体中，以基准测定法(非专利 文献2、3)测定时的测定值与用各种试剂测定时的测定值的背离在国际上也一直是问题(非 专利文献4)。
[0004] 许多以往方法可以分类为在HDL-C测定前，将HDL以外的脂蛋白中的胆固醇的全 部或者一部分从反应液中消除以使得其不参与HDL - C测定的主反应（以下，有时简称为主 反应)的方法(例如，专利文献1、2);或者，在HDL-C的测定时，HDL以外的脂蛋白中的胆固醇 抑制HDL以外的脂蛋白中的胆固醇的反应以使得其不参与HDL - C测定的主反应的方法(例 如，专利文献3~6)，该以往方法中，概括为HDL以外的脂蛋白VLDL与LDL的性状并不相同，因 此由VLDL引起的测定误差的消除成为课题。
[0005] 现有技术文献
[0006] 专利文献
[0007] 专利文献1:国际公开第98/26090号小册子 [0008] 专利文献2:国际公开第2000/078999号小册子 [0009] 专利文献3:国际公开第95/24502号小册子 [0010] 专利文献4:国际公开第2004/035816号小册子 [0011] 专利文献5:国际公开第2005/100591号小册子 [0012] 专利文献6:国际公开第2006/118199号小册子 [0013]非专利文献
[0014] 非专利文献l:Clinical Chemistry 47:9 1579 - 1596(2001)
[0015] 非专利文南犬2: European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry 29 269 -275(1991)
[0016] 非专利文献3:Clinical Chemistry 45:10 1803 - 1812(1999)
[0017] 非专利文献4:Clinical Chemistry 56:6 977 - 986(2010)
【发明内容】
[0018] 因此，本发明的目的在于，找到即便以像血脂异常症这样的特殊的病症的患者检 体为测定试样时，也能够提高与DCM(指定比较法，Designated Comparison Method)等基准 测定法的测定值的一致性的化合物，提供利用该化合物的HDL-C测定方法。
[0019] 本发明人等对上述课题进行了深入研究，结果发现HDL - C测定时，在#盐和聚阴 离子的存在下将胆固醇氧化酶等胆固醇测定用酶和测定试样混合时，能够大幅抑制该胆固 醇测定用酶对VLDL的反应性，更高精度地测定HDL-C。
[0020] 即，本发明涉及以下内容。
[0021 ] [ 1 ] -种高密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征在于，
[0022] 包含使测定试样与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者与胆固醇酯水解酶和胆 固醇脱氢酶在通式(I)表示的化合物和聚阴离子的存在下反应的工序，
[0023]
[0024] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0025] [2]根据[1]所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0026] [3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基# 盐、三甲基十二烷基I#盐、三甲基十六烷基盐、三乙基辛基#盐、三乙基十二烷基I# 盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基#盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷基I# 盐中的至少1种化合物。
[0027] [4]根据[1]~[3]中任1项所述的方法，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。
[0028] [5]根据[1]~[4]中任1项所述的方法，其中，在进一步存在白蛋白的条件下进行 上述工序。
[0029] [6]根据[1]~[5]中任1项所述的方法，其中，在进一步存在选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物的条件下进行上述工序。
[0030] [7] -种高密度脂蛋白胆固醇测定用试剂，含有下述(a)、（b)和(c): (a)通式(I)表 示的化合物，
[0031]
[0032] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0033] (b)聚阴离子，
[0034] (c)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶
[0035] [8]根据[7]所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0036] [9]根据[7]或者[8]所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基 |奔盐、三甲基十二烷基#盐、三甲基十六烷基I#盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷基 I#盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基I#盐、三丁基十二烷基I#盐和三丁基十六烷基 _盐中的至少1种化合物。
[0037] [10]根据[7]~[9]中任1项所述的试剂，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。
[0038] [11]根据[7]~[10]中任1项所述的试剂，其中，进一步含有白蛋白。
[0039] [12]根据[7]~[11]中任1项所述的试剂，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。
[0040] [13]根据[7]~[12]中任1项所述的试剂，其中，包含第1试剂组和第2试剂组，上述 第1试剂组含有(a)通式(I)和(b)聚阴离子，上述第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和胆固 醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0041] [14]一种试剂盒，在高密度脂蛋白胆固醇测定中使用，含有下述(a)、(b)和(c):
[0042] (a)通式（I)表示的化合物，
[0043]
[0044] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0045] (b)聚阴离子，
[0046] (c)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0047] [15]根据[14]所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链 状的碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。
[0048] [16]根据[14]或者[15]所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基 辛基I#盐、三甲基十二烷基#盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基f奔盐、三乙基十二 烷基I#盐、三乙基十六烷基I聲盐、三丁基辛基I#盐、三丁基十二烷基#盐、以及三丁基 十六烷基I#盐中的至少1种化合物。
[0049] [17]根据[14]~[16]中任1项所述的试剂盒，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸 葡聚糖。
[0050] [18]根据[14]~[17]中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有白蛋白。
[0051] [19]根据[14]~[18]中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基 胺、聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。
[0052] [20]根据[14]~[19]中任1项所述的试剂盒，其中，包含第1试剂组和第2试剂组， 上述第1试剂组含有(a)通式(I)和(b)聚阴离子，上述第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和 胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
[0053] 根据本发明，不需要对测定试样进行离心分离等前处理，以简便的操作高效地对 HDL - C进行定量。另外，因为能够以少量的测定试样进行特异性测定，所以能够用于各种自 动分析装置，在临床检查领域极其有用。另外，本发明的HDL-C测定因为测定中使用的试剂 的组成是不含有2价金属作为必需成分的组成，所以还具有分析装置不受到负荷的优点。特 别是还具有以往方法中产生测定误差的含有大量的VLDL的检体，例如甘油三酯为高值、总 胆固醇和LDL胆固醇大体为正常值、IV型高血脂症这样的检体的测定精度大幅改善的优点。
【具体实施方式】
[0054] -个实施方式中，本发明提供高密度脂蛋白胆固醇(HDL - C)测定方法。本发明方 法通过在聚阴离子和#盐化合物的存在下，使用公知的胆固醇测定用试剂对含有HDL的测 定试样测定HDL-C来实施。
[0055] 作为供于本发明的方法的测定试样，只要是可能包含HDL、LDL、VLDL和乳糜微粒等 脂蛋白的检体，就可以是任意的，例如，可以举出血清、血浆等体液及其稀释物，不限定于这 止匕 -、〇
[0056]本说明书中，将HDL - C测定中使用的以胆固醇为基质的酶通称为胆固醇测定用 酶。作为胆固醇测定用酶，可举出胆固醇酯水解酶(包含分类为脂肪酶的酶）、胆固醇氧化 酶 、胆固醇脱氢酶等。
[0057] 以下，以作为临床检查领域中通用的HDL-C测定法的二工序(二试剂)进行的测定 体系为模型进行本发明方法的说明。二工序测定体系(或者二试剂测定体系)是最初进行使 用第一试剂来抑制HDL以外的脂蛋白的胆固醇与胆固醇测定用酶的反应性的工序(第1工 序），接着进行添加含有胆固醇测定用酶的第二试剂进行胆固醇测定工序(第2工序）的方 法。应予说明，以下的本说明书中，有时将二工序测定体系的第1工序、第2工序分别简称为 第1工序、第2工序。
[0058] 本发明的方法中的第1工序中，向测定试样添加聚阴离子和#盐化合物，使用聚 阴离子和鱗盐化合物对该测定试样中的HDL以外的脂蛋白进行处理。这里"处理"是指在 HDL以外的脂蛋白的粒子表面静电结合聚阴离子和I身盐化合物。本工序中，根据聚阴离子 和|舞盐化合物的添加量，有时经由聚阴离子而使HDL以外的脂蛋白粒子集合（所谓的凝 聚），但该凝聚现象并非是为了得到本发明的效果所必需的。第1工序的目的在于，通过上述 "处理"使随后的第2工序中的HDL以外的脂蛋白中的胆固醇与胆固醇测定用酶的反应性降 低。
[0059]接着，在第2工序中，使用以往公知的方法进行HDL - C的测定。作为脂蛋白中含有 的胆固醇，有酯型胆固醇（以下，有时称为胆固醇酯)和游离型胆固醇。酯型胆固醇被胆固醇 酯水解酶水解而转变为游离型胆固醇和脂肪酸。这里产生的游离型胆固醇与本来存在的游 离型胆固醇一起成为胆固醇测定用酶(例如，胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶）的基质。使 用胆固醇氧化酶作为胆固醇测定用酶时，游离型胆固醇被氧化而转变为胆留烯酮和过氧化 氢。使在过氧化物酶的存在下与过氧化氢反应而形成醌色素的化合物与之反应，测定产生 的醌色素的吸光度，由此能够测定HDL中含有的酯型胆固醇和游离型胆固醇的和，即HDL-C 量。另外，使用胆固醇脱氢酶作为胆固醇测定用酶时，基于吸光度测定作为辅酶的NAD(P)H 的增加，由此能够测定HDL-C量。
[0060] 作为本发明中使用的##盐化合物，可举出通式(I)表示的化合物（以下，有时称为 化合物(I))。
[0061]
[0062] (式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基，或者直链或支链状的碳原 子数8~22的烯基，R 2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或 者直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。）
[0063] 作为化合物（I)中的R1表示的直链或支链状的碳原子数8~22的烷基，例如可举出 辛基、异辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基（月桂基）、十三烷基、十四烷基（肉豆蔻基）、 十五烷基、十六烷基(鲸蜡基）、十七烷基、十八烷基(硬脂基）、十九烷基、二十烷基、二十一 烷基、二十二（山嵛基)等基团，优选为碳原子数8~18的烷基，更优选为碳原子数12~16的 直链烷基。
[0064] 作为化合物（I)中的R1表示的直链或支链状的碳原子数8~22的烯基，例如可举出 辛烯基、壬烯基、癸烯基、香茅基、i-碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五 碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、油烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二i-碳烯基、二十二 碳烯基等基团，更优选为碳原子数8~18的直链烯基。
[0065] 作为化合物（I)中的R2、R3或者R4表示的直链或支链状的碳原子数1~6的烷基，例 如可举出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等基团，优选为碳原子数1~4的直链烷基。
[0066] 作为化合物（I)中的R2，R3或者R4表示的直链或支链状的碳原子数2~6的烯基，例 如可举出乙烯基、1 一丙烯基、稀丙基(2-丙烯基）、丁烯基、戊烯基、己烯基等，更优选为碳原 子数2~4的直链烯基。
[0067] 作为化合物（I)中的X_表示的阴离子，例如可举出氢氧根离子、卤素离子、来自无 机酸的阴离子、来自有机酸的阴离子等。作为卤素离子，可举出氟离子、氯离子、溴离子、碘 离子等。作为来自无机酸的阴离子，例如可举出硝酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子、碳酸 根离子、四氟硼酸根离子等。作为来自有机酸的阴离子，例如可举出甲酸根离子、乙酸根离 子、乳酸根离子、柠檬酸根离子、谷氨酸根离子等羧酸根离子等。
[0068] 本发明方法中，作为#盐化合物，可以将上述的化合物（I)单独或者组合2种以上 使用。作为化合物（I)优选的例子，可举出三甲基辛基#盐、三甲基十二烷基I#盐、三甲基 十六烷基I奔盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷基4#盐、三乙基十六烷基#盐、三丁基 辛基#盐、三丁基十二烷基#盐、三丁基十六烷基#盐、三己基十四烷基#盐等。作为 #盐，可优选举出氯化物和溴化物的盐。作为化合物（I)的具体例（制品），例如，可举出三 丁基一正辛基氯化膦、三丁基十二烷基溴化膦、三丁基十六烷基溴化膦(均为东京化成工业 株式会社制）、三己基十四烷基溴化膦、三己基十四烷基四氟硼酸膦（均为Sigma-Aldrich 制另外，本领域技术人员可以参照Green chemistry 5 143 - 152(2003)， Electrochemistry communications 9 2353 - 2358(2007) ?Electrochemistry 75 734 - 736(2007)的记载，合成例如三甲基十六烷基溴化膦、三乙基十二烷基溴化膦、三乙基十六 烷基氯化膦等式(I)表示的#盐化合物。
[0069] 作为化合物（I)的浓度，只要是可以进行本发明的HDL-C的测定的浓度，就没有特 别限制，第1工序中的反应液中的浓度优选为〇. 〇〇 lmm〇 1/L~lmo 1 /L，第1工序中的反应液中 的浓度更优选为〇. 01~10mm〇l/L。
[0070] 作为聚阴离子，只要是能够进行本发明的HDL - C的测定的聚阴离子，就没有特别 限制，可举出磷钨酸或者其盐、硫酸葡聚糖或者其盐、肝素或者其盐、聚乙二醇等，不限定于 这些。作为硫酸葡聚糖，例如，平均分子量为4000~200万，优选为4000~50万，更优选为 4000~5万，例如可举出平均分子量4000、5000、1万、3万6000、4万、5万、8万、20万、50万、100 万、200万等的硫酸葡聚糖。作为盐，例如可举出钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、镁盐等。另外，本发 明中，上述聚阴离子可以单独使用也可以组合2种以上使用。作为聚阴离子的浓度，只要是 能够进行本发明的HDL-C的测定的浓度，就没有特别限制，第1工序中的反应液中的浓度优 选为0.001~10重量％，第1工序中的反应液中的浓度更优选为0.01~1重量％。
[0071] 胆固醇测定用酶(胆固醇酯水解酶(包含分类为脂肪酶的酶）、胆固醇氧化酶、胆固 醇脱氢酶等)和过氧化物酶只要是一般用于胆固醇测定的酶，就可以不受限制地使用。这些 酶可以是来自微生物、来自动物、来自植物等任意出处，另外，可以通过基因操作而得到，不 受是否进行化学修饰限制。胆固醇测定用酶可以单独或组合2种以上使用。另外，其使用量 根据酶而不同，没有特别限制，作为第2工序中的反应液中的浓度，可以以0.001~100单位/ mL，优选以0.1~100单位/mL使用。过氧化物酶的使用量也没有限制，但作为第2工序中的反 应液中的浓度，为0.001~100单位/mL，优选为0.1~100单位/mL。
[0072] 作为在过氧化物酶的存在下与由胆固醇氧化酶的作用而生成的过氧化氢反应而 形成醌色素的化合物（以下，有时称为发色剂），可举出4一氨基安替比林和Trinder's试剂。 作为Trinder's试剂，可使用N，N-双(磺丁基）一间甲苯胺二钠(DSBmT)、N-乙基一 N-（2 - 羟基一3-磺丙基）一3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基一N-（3-甲基苯基）一Ν'一琥珀酰乙烯 二胺(EMSE)等，但不限于这些。另外，发色剂的使用浓度可以根据所希望的醌色素的形成 量、反应液量、反应时间等适当地选择。
[0073] 另外，使用胆固醇脱氢酶时的辅酶NAD(P)的使用浓度也可以适当选择。
[0074] 为了有利地实施本发明方法，可以使用将上述的聚阴离子、I#盐化合物、酶、发色 剂、辅酶等适当地组合而制备的试剂。并且，根据需要，可以配合抗坏血酸氧化酶、过氧化氢 酶、磷脂酶、鞘磷脂酶等胆固醇测定用酶以外的酶或盐、用于调整pH的缓冲剂、表面活性剂、 白蛋白等蛋白质类、抗体、抗生素、皂素、凝集素、毛地黄皂苷、环糊精、杯芳烃等对特定的脂 蛋白具有亲和性的物质、螯合剂、糖等稳定化剂，防腐剂。另外，镁离子、钙离子这样的2价金 属有时有助于酶的稳定化，可以以对HDL-C测定没有影响的（或者对测定装置没有影响的） 浓度添加。
[0075] 这些当中，作为缓冲剂，可以是Good ' s缓冲剂、磷酸、Tris、邻苯二甲酸盐等任一 个，作为反应液只要是能够设定在pH4~10的范围具有缓冲作用的条件的反应液，就可以使 用。其使用量没有特别限制，反应液中，以0.0005~2mol/L，优选以0.01~ImoVL使用。在实 施时，均根据使用的各种酶的特性或与试剂中含有的其他成分的关系等选择实验最佳条 件。
[0076] 白蛋白有时在本发明中提高灵敏度、特异性，可以适当使用。其种类只要能够进行 本发明的HDL - C的测定，就没有特别限制，例如可举出来自牛、马、羊、人、蛋白的白蛋白等， 优选牛血清白蛋白（BSA)。这些可以通过基因操作而制成，不受如何精制方法、有无化学修 饰限制。其使用量没有特别限制，反应液中的浓度优选为〇. 〇〇 1~1 〇重量％，更优选〇. 1~1 重量％。
[0077]表面活性剂只要是能够进行本发明的HDL-C的测定，就没有特别限制，可以从以 往公知的HDL - C的测定所使用的表面活性剂(非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂、 阳离子性表面活性剂、两性离子性表面活性剂）中适当地选择使用。
[0078]特别是只要是将HDL选择性地可溶化的目的，可以适当使用HLB13~14的聚氧乙烯 衍生物，很优选聚氧乙烯三苄基苯基醚。作为具体例（制品名），可举出EMULGEN A - 90、 EMULGEN B - 66(均为花王株式会社制）。其浓度在第2工序的反应液中（如果换一种表现，则 相对于第1工序、第2工序的反应混合物整体)优选0.05~3重量％，更优选0.1~1.5重量％。 另外，也可以同样地使用国际公开第2004/048605号小册子所记载的多环型聚氧化烯衍生 物。
[0079]另外，作为表面活性剂，可以添加聚氧乙烯烷基胺或者聚氧乙烯烯基胺。作为聚氧 乙烯烷基胺或者聚氧乙烯烯基胺，例如可举出通式(II)表示的化合物（以下，有时称为化合 物(II))，
[008丨
[00811 (式中，R5表示直链或支链状的烷基或者烯基，R6表示氢原子或者(CH 2CH20)nH，m或η 相同或不同地为1~100的整数）。作为化合物（II)中的烷基和烯基，分别例如，可举出化合 物（I)中所述的直链或支链状的碳原子数8~22的烷基，直链或支链状的碳原 子数8~22的 烯基等，优选为碳原子数10~18的烷基或者烯基。
[0082]作为聚氧乙烯烷基胺或者聚氧乙烯烯基胺的具体例（制品），例如可举出NYMEEN L-201(N-羟乙基一月桂胺；日油株式会社）、NYMEEN L-207(聚氧乙烯月桂胺；日油株式 会社）、NYMEEN S - 204，NYMEEN S - 210(聚氧乙烯硬脂酰胺；日油株式会社）、New Call 0D - 420(聚氧乙烯烷基胺醚；日本乳化剂株式会社）、Pionin D - 3104，Pionin D - 3110(聚 氧乙烯月桂基氨基醚;竹本油脂株式会社）、BLAUN0N L - 205、L一207、L一210(聚氧乙烯月 桂胺;青木油脂工业株式会社）、BLAUN0N S - 207、S - 210(聚氧乙烯硬脂酰胺;青木油脂工 业株式会社）、BLAUN0N S - 207T(聚氧乙烯牛脂胺;青木油脂工业株式会社）、BLAUN0N 0 - 205(聚氧乙烯油胺;青木油脂工业株式会社)等。
[0083] 聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯烯基胺中的氧乙烯链的聚合度优选为1~100,更优选 为1~60。聚氧乙烯烷基胺和聚氧乙烯烯基胺都可以单独使用，也可以组合2种以上使用。另 外，其使用量没有特别限制，反应液中的浓度优选为〇. 〇〇〇 1~1重量％，更优选〇. 〇〇 1~〇. 1 重量％。
[0084] 另外，可以含有阳离子性表面活性剂、具有氨基的表面活性剂作为表面活性剂，作 为这些例子，可举出叔胺和季铵盐。作为叔胺，例如可举出通式（III)表示的化合物（以下， 有时称为化合物（III))，
[0085]
[0086] (式中，R7表示直链或支链状的碳原子数6~30的烷基或者烯基，R8、R9相同或不同 地分别表示氢原子、直链或支链状的碳原子数1~30的烷基、或者直链或支链状的碳原子数 2~30的烯基。）作为化合物（III)的具体例（制品），例如可举出Nissan amine BB，Nissan amine AB、叔Nissan amine BB、叔Nissan amine FB(均为日油株式会社制）等。叔胺和季铵 盐的使用量没有特别限制，反应液中的浓度优选为〇. 〇〇〇 1~1重量％，更优选〇. 〇〇 1~〇. 1重 量％。上述叔胺和季铵盐均可以单独使用，也可以组合2种以上使用。
[0087] 为了有利地实施本发明方法，可以提供一并包括上述的本发明方法中使用的试剂 的试剂盒。因此，其它实施方式中，本发明提供含有上述化合物（I)所示的#盐化合物、上 述聚阴离子和上述胆固醇测定用酶的HDL - C测定用试剂。在其它实施方式中，本发明提供 含有上述化合物（I)所示的#盐化合物、上述聚阴离子和上述胆固醇测定用酶的用于 HDL - C测定的试剂盒。该HDL - C测定用试剂和该试剂盒还可以含有上述的过氧化物酶、发 色剂、辅酶、白蛋白等蛋白质类、表面活性剂、胆固醇测定用酶以外的酶或盐、用于调整pH的 缓冲剂、抗体、抗生素、对特定的脂蛋白具有亲和性的物质、螯合剂、稳定化剂、防腐剂、有助 于酶的稳定化的2价金属等HDL-C测定所需的其他试剂。
[0088]如果示出本发明的HDL-C测定用试剂(二工序测定体系用）的具体例，如下。
[0089](第一试剂）
[0090] 聚阴离子
[0091 ] |筹盐化合物(化合物（I))
[0092] 发色剂(例如4 一氨基安替比林或Trinder's试剂）
[0093] (第二试剂）
[0094] 胆固醇测定用酶
[0095] 胆固醇酯水解酶 [0096]胆固醇氧化酶 [0097]过氧化物酶
[0098] 发色剂(例如4 一氨基安替比林或Trinder's试剂）
[0099] 表面活性剂
[0100] 如果示出本发明的HDL-C测定用试剂(二工序测定体系用）的其它具体例，如下。
[0101] (第一试剂）
[0102] 聚阴离子
[0103] I奔盐化合物(化合物（I))
[0104] 辅酶(NAD(P))
[0105] (第二试剂）
[0106] 胆固醇测定用酶
[0107] 胆固醇酯水解酶
[0108] 胆固醇脱氢酶
[0109] 辅酶(NAD(P))
[0110] 表面活性剂
[0111] 基于上述的二工序测定体系的说明是为了促进本发明的方法的理解而记载的，并 不是局限于特定理论的目的。因此，上述的说明以实质上在胆固醇测定用酶与脂蛋白接触 前或与接触同时进行本发明的处理为限度，不是排除本发明的方法是一工序(一试剂)测定 体系或三工序(三试剂)测定体系的意图。而且，不是排除本发明的方法是在溶液中进行反 应的液体反应体系以外(例如固定试剂的试验片，使用干式分析元件等的固形反应体系）的 意图。只要是本领域技术人员，参酌基于上述二工序测定体系的本发明方法的详细的说明、 后述的实施例的记载，自然能够将本发明方法应用于一工序测定体系、三工序测定体系以 及使用试验片、干式分析元件的反应体系，能够实验决定这些测定体系、反应体系中的各试 剂的适当的使用量。
[0112] 例如，上述例示的HDL-C测定用试剂中，以不损害其性能为限度，可以选择仅第一 试剂含有上述胆固醇测定用酶、过氧化物酶等酶、发色剂、辅酶等，或仅第二试剂含有，或者 双方含有。另外，可以参照国际公开第02/38800号小册子、日本特开2007 - 325587号公报、 日本特开2009 -125049号公报、日本特开2009 - 247317号公报等，将上述试剂应用于试验 片、干式分析元件等。应予说明，有时可以在本发明方法中使用能够用于利用试验片、干式 分析元件等进行的HDL-C测定的其它成分、技术。
[0113]本发明方法中，因为抑制HDL以外的脂蛋白中的胆固醇参与主反应，所以HDL - C测 定后也残存在反应液中。因此，如果在HDL - C测定后进一步实施解除HDL-C以外的胆固醇 的反应抑制的方法(能够使全部的脂蛋白可溶化的表面活性剂的添加等），能够测定HDL以 外的脂蛋白中的胆固醇（临床中的所谓的nonHDL - C等）。另外，本发明方法中，本领域技术 人员使用公知的甘油三酯测定用酶组代替胆固醇测定用酶，能够测定HDL中的甘油三酯、 HDL以外的脂蛋白中的甘油三酯。
[om]实施例
[0115] 以下举出实施例进一步对本发明进行详细说明，本发明不受这些任何限制。应予 说明，本实施例和比较例中，使用下述制造商的试剂和酶。应予说明，表面活性剂的成分名 记载各制造商的产品手册记载名称。
[0116] MES(株式会社同仁化学研究所）、氢氧化钠(KISHIDA化学株式会社）、T00S(株式会 社同仁化学研究所）、4一氨基安替比林(和光纯药工业株式会社）、磷钨酸钠(KISHIDA化学 株式会社）、葡聚糖硫酸钠(分子量4000)(东京化成工业株式会社）、葡聚糖硫酸钠(分子量 36000~5万）（和光纯药株式会社）、葡聚糖硫酸钠(分子量50万）（和光纯药工业株式会社）、 氯化镁(KISHIDA化学株式会社）、三丁基一正辛基氯化膦(东京化成工业株式会社）、三丁基 十二烷基溴化膦(东京化成工业株式会社）、三丁基十六烷基溴化膦(东京化成工业株式会 社）、三己基十四烷基溴化膦(东京化成工业株式会社）、胆固醇酯酶(旭化成株式会社）、胆 固醇氧化酶(Oriental Yeast工业株式会社）、过氧化物酶（东洋纺织株式会社）、EMULGEN B - 66(成分名聚氧乙烯三苄基苯基醚；花王株式会社）、牛血清白蛋白（BSA; Sigma)、 BLAUNON L-205(成分名聚氧乙烯月桂胺;青木油脂工业株式会社）、BLAUN0N S - 207(成分 名聚氧乙烯硬脂酰胺;青木油脂工业株式会社）、十六烷基三甲基溴化铵（东京化成工业株 式会社）、叔Nissan amine BB(成分名二甲基月桂胺；日油株式会社）、Pegnol 005(成分名 聚氧乙烯三苄基苯基醚;东邦化学工业株式会社）、EMULGEN A-60(成分名聚氧乙烯二苯乙 稀化苯基醚;花王株式会社）、New Call 610(成分名聚氧乙稀多环苯基醚；日本乳化剂株式 会社）、New Call 2600FB(成分名聚氧化稀多环苯基醚；日本乳化剂株式会社）、胆酸钠(和 光纯药工业株式会社）、Enajicol L - 30AN(成分名氨基丙酸酯;狮王株式会社）、AMPHIT0L 24B(成分名月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱;花王株式会社）、Enajicol C-40H(成分名咪唑 啉甜菜碱;狮王株式会社）。三甲基十六烷基溴化膦(CAS编号[71221 - 96 - 0])、三乙基十二 烷基溴化膦(CAS编号[21743 - 53 - 3])、三乙基十六烷基氯化膦(CAS编号[56155 - 08 - 9] 通过Electrochemistry communications 9 2353 - 2358(2007)记载的方法合成。
[0117](比较例1)以往方法的特性的比较评价
[0118]使用将通过超离心分离法制备的HDL组分、VLDL组分利用生理食盐水以两组分中 的胆固醇浓度为50mg/dL的方式进行稀释而成的试样（以下，对该试样，有时称为HDL组分试 样、VLDL组分试样），对以往方法的特性进行比较评价。比较评价通过使用对下述所示的第 一试剂（以下，有时称为基础第一试剂)仅添加聚阴离子的试剂（比较例1 一 1)、添加专利文 献3中记载的化合物的组合的试剂（比较例1 一2)、添加专利文献4中记载的化合物的试剂 (比较例1 一 3 )、添加专利文献6中记载的化合物的试剂（比较例1 一 4、比较例1 一 5)而实施。 将向基础第一试剂添加的各成分名和浓度示于表1。第二试剂（以下，有时称为基础第二试 剂)使用以下所示组成的试剂。
[0119]第一试剂(基础第一试剂）
[0120] MES-NaOH 缓冲液（pH6 · 5) 100mmol/L
[0121] 4 -氨基安替比林0.7mmol/L
[0122] 第二试剂(基础第二试剂）
[0123] MES-NaOH 缓冲液(pH6 · 5) 100mmol/L
[0124] 胆固醇酯酶1单位/mL
[0125] 胆固醇氧化酶1单位/mL
[0126] 过氧化物酶5单位/mL
[0127] T00S 0.1mmol/L
[0128] EMULGENB - 661·0重量％
[0129] [表 1]
[0130]
[0131 ] 测定使用日立7170形自动分析机(Hitachi High-Technologies株式会社)进行。 向HDL组分试样或者VLDL组分试样2.4yL添加各比较例的第一试剂240yL，约5分钟后，再添 加基础第二试剂80yL。测定临添加基础第二试剂之前和添加后5分 钟后的吸光度，求出其差 (2点法）。吸光度测定在主波长600nm、副波长700nm下进行。
[0132]将使用比较例1 一 1的第一试剂测定的HDL组分试样的吸光度作为100,求出使用比 较例1 一2~比较例1 一5的第一试剂测定的HDL组分试样的相对吸光度（％ )(各比较例的HDL 组分试样的吸光度X 100/比较例1 一 1的HDL组分试样的吸光度）。并且，对各第一试剂下的 测定，计算VLDL组分试样相对于HDL组分试样的吸光度的相对吸光度（％ )(同一比较例中的 VLDL组分试样的吸光度X 100/HDL组分试样的吸光度）ADL组分试样的相对吸光度大、且 VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度小的条件是实现本发明的课题所要求的条件， 即，维持胆固醇测定用酶与HDL-C的反应性的状态下，降低胆固醇测定用酶与VLDL-C的反 应性的条件。将结果示于表2。
[0133][表 2]
[0134]
[0135] 首先，HDL组分试样的相对吸光度（％ )表示各比较例的第一试剂与HDL组分的反应 性的相对强度。因此数值小于100时，表示与比较例1一1相比，对HDL组分的反应性降低。接 下来，VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度（％ )因 HDL组分试样与VLDL组分试样的胆 固醇浓度相同，所以反映对两组分的反应性的差。如果数值为100,则表示对HDL组分和VLDL 组分的反应性同等，数值越小表示与VLDL组分的反应性越低。比较例1 一 1的VLDL组分试样 相对于HDL组分试样的相对吸光度为19.1%，可以说是相对于HDL组分可抑制VLDL组分的反 应性的条件的之一。比较例1 一 2(专利文献3)是基于使基础第一试剂进一步与2价金属盐共 存的试剂的试验条件，但相对于比较例1 一 1能够在维持对HDL组分的反应性的情况下，进一 步降低对VLDL组分的反应性。但是，2价金属盐(特别是镁盐)与作为自动分析装置的流路清 洗剂的碱性清洗液混合时，形成水难溶性的氢氧化盐(氢氧化镁)而引起流路堵塞等，在装 置的维护管理方面有重大问题，这作为以往技术的课题已认识到。比较例1 一 3(专利文献4) 与单独使用聚阴离子的比较例1 一 1相比，VLDL组分的反应性略微降低，但无法抑制至使用 镁离子的比较例1 一 2的水平。另外，可知比较例1 一4、1 一 5 (专利文献6)中，不但无法抑制 VLDL组分的反应性(特别是比较例1 一 5 )，而且与HDL组分的反应性也降低。
[0136] (实施例1)对解决课题有效的化合物的筛选
[0137] 使用通过超离心分离法制备的HDL组分、VLDL组分并利用生理食盐水以两组分中 的胆固醇浓度为50mg/dL的方式进行稀释而得的试样（以下，有时将该试样称为HDL组分试 样、VLDL组分试样），实施降低胆固醇测定用酶与VLDL组分的反应性的化合物的筛选。筛选 用的试剂使用在比较例1记载的基础第一试剂中按表3所示的浓度添加了聚阴离子、各种 I身盐化合物、BSA而得的试剂(实施例1 一 1~实施例1 一 16)。第二试剂使用比较例1记载的 基础第二试剂。
[0138] [表 3]
[0139]
[0140] 其中，表中，PTA表示磷钨酸钠，以0.04重量％使用。DS表示葡聚糖硫酸钠，以0.05 重量％使用。另外，对于#盐化合物而言，Pm (16)表示三甲基十六烷基溴化膦，P222(12)表示 三乙基十二烷基溴化膦，P222(16)表示三乙基十六烷基氯化膦，P4448表示三丁基一正辛基氯化 勝，P444(12)表不二丁基十^烷基漠化勝，P444(16)表不二丁基十八烷基漠化勝，P666(14)表不二 己基十四烷基溴化膦。浓度均表示第一试剂中的浓度。
[0141] 测定和结果的解析与比较例1同样地实施。即，将使用比较例1 一 1的第一试剂测定 的HDL组分试样的吸光度作为100，求出使用各实施例的第一试剂测定的HDL组分试样的相 对吸光度（％)。并且，各第一试剂的测定中，计算相对于HDL组分试样的吸光度的VLDL组分 试样的相对吸光度（％ )。将结果不于表4。
[0142] [表 4]
4 J -j
[0143] j
[0144] 由表4可知含有本发明的盐化合物的第一试剂在表3所示的实施例1 一 1~实施 例1 一 16中均能够在维持胆固醇测定用酶与HDL组分的反应性的状态下，抑制与VLDL组分的 反应性。而且，其反应性抑制的程度与使用了比较例1 一 2的镁离子的情况相比为同等程度 以上。含有本发明的盐化合物的第一试剂即便与自动分析装置的碱性清洗液混合也不 产生水难溶性的物质，因此可以说对使用比较例1 一2的第一试剂的情况是极其有用的方 法。另外，可知与比较例1 一3~比较例1 一5相比，含有本发明的#盐化合物的第一试剂对 VLDL组分的反应性抑制更优异。
[0145] 这样的效果在使用了三甲基十六烷基溴化膦、三乙基十二烷基溴化膦、三乙基十 六烷基氯化膦、三丁基一正辛基氯化膦、三丁基十二烷基溴化膦、三丁基十六烷基溴化膦、 三己基十四烷基溴化膦中的任一情况下都得到确认。另外，该效果并不取决于并用的聚阴 离子的种类，无论磷钨酸钠还是硫酸葡聚糖都显示相同的效果(将实施例1 一 2与实施例1 一 3、1 -4、1 一 5进行比较，或者将实施例1 一 10与实施例1 一 11、1 - 12进行比较）。而且，使用硫 酸葡聚糖时，不论其分子量如何，都能够得到目标效果(将实施例1 一3~1 一5进行比较）。另 外，无论有无 BSA，效果都不变动(将实施例1 一 9与1 一 10进行比较）。
[0146] (实施例2)利用添加了本发明的#盐化合物的第一试剂得到的血清检体的HDL胆 固醇测定值与利用简易DCM得到的HDL胆固醇测定值的相关
[0147] 使用磷钨酸钠作为聚阴离子，含有本发明的I#盐化合物的第一试剂(试剂A、B、C、 D、E、F、G、H、I)如下制备。
[0148]第一试剂(试剂A)
[0168] 使用由试剂A~试剂I的第一试剂和比较例1记载的基础第二试剂构成的HDL胆固 醇测定用试剂，测定人血清90检体中的HDL胆固醇浓度。人血清中的HDL胆固醇浓度的真值 使用DCM(非专利文献3)进行测定。将由DCM得到的测定值设为X，将各实施例的值设为Y，比 较相关系数、回归式。将结果示于表5。应予说明，本实施例中使用的人血清90检体的脂质项 目的测定值分布为总胆固醇（T 一 CH0)49~289mg/dL、HDL胆固醇（HDL - C)19~112mg/dL、 LDL胆固醇（LDL - C)24~196mg/dL、游离胆固醇（F - CH0)12~84mg/dL、甘油三酯（TG)20~ 351mg/dL，虽然包括一部分偏离参考基准值的检体，但可以说是由大体正常的检体构成的 检体组。应予说明，T一CH0使用Cholestest(注册商标)CH0，HDL-C使用Cholestest(注册商 标)N HDL，LDL-C使用Cholestest(注册商标)LDL，F-CH0使用Pure-auto(注册商标)S F - CH0-N，TG使用Cholestest(注册商标)TG(均为SEKISUI MEDICAL株式会社制）进行测定。另 外，TG为200mg/dL以上的检体用生理食盐水稀释2倍后供于DCM。
[0169] 上述D CΜ的具体的顺序如下。D CΜ分离液使用以下的试剂。葡聚糖硫酸钠 (Dextralip50，Sigma)，氯化镁6水合物(KISHIDA化学株式会社）、叠氮化钠(KISHIDA化学株 式会社）。测定顺序记于以下。
[0170] (1)分离液的制备
[0171] 试剂a
[0172] 葡聚糖硫酸钠20g/L
[0173] 叠氮化钠 0.5g/L
[0174] 试剂 b
[0175] 氯化镁 0.7mol/L
[0176] 叠氮化钠 0.5g/L
[0177] 制备试剂a和试剂b，将两者等量混合。
[0178] (2)将血清试样和上述（1)制备的分离液按体积比10:1进行混合，利用旋涡混合器 进行混合。
[0179] (3)室温下静置10~30分钟后，进行1500G、4°C、30分钟离心。
[0180] (4)回收上清液，使用Cholestest(注册商标)CH0(SEEISUI MEDICAL株式会社）测 定总胆固醇含量。因为血清试样利用分离液稀释至1.1倍，所以将得到的测定值乘以1.1倍， 作为血清试样中的HDL胆固醇值。
[0181] [表 5] 「01821
?〇?83?~(比较例2)由以往方法得到的第一试剂的测定值与由DCM得到的测定值的相关^' [0184]作为以往方法的第一试剂，制备以下的第一试剂(试剂J、K、L、Μ、N)。
[0185]第一试剂(试剂J)
[0186] MES-NaOH 缓冲液（pH6·5) 100mmol/L
[0187] 4 -氨基安替比林 0.7mmol/L
[0188] 磷钨酸钠 0.04重量％
[0189]第一试剂(试剂K)
[0190]
[0191] 第一试剂(试剂L)
[0198] 使用由试剂J~试剂N的第一试剂和比较例1记载的基础第二试剂构成的HDL胆固 醇测定用试剂，测定与实施例2相同的人血清90检体中的HDL胆固醇浓度。将由DCM得到的测 定值设为X，将各实施例的值设为Y，比较相关系数、回归式。将结果示于表6。
[0199] [表 6]
[0200]
[0201]由实施例2可知使用了含有本发明品的盐和聚阴离子的第一试剂的测定中，看 到与DCM的良好的相关关系。可知试剂A~试剂I中任一第一试剂中，与不含鱗盐的试剂J相 比，相关明显是显著的，与使用专利文献3记载的2价金属的方法(试剂K)、使用专利文献4记 载的聚氧乙烯月桂胺的方法(试剂L)、使用专利文献6记载的十六烷基三甲基溴化铵的方法 (试剂Μ和试剂N)相比，测定大体正常的检体组时的DCM的相关同等或有改善。
[0202](实施例3)异常检体的测定
[0203]使用由试剂Ε~试剂I的第一试剂和比较例1记载的第二试剂构成的HDL胆固醇测 定用试剂，测定表7所示的人血清检体中的HDL胆固醇浓度。应予说明，表7所示的各检体的 脂质浓度使用实施例2记载的各脂质测定用试剂进行测定。HDL胆固醇值如下计算。首先向 血清1. OmL重叠一层密度1.006的食盐水，以26000G进行30分钟离心。接着从上层除去与重 叠层的食盐水同体积量，将浮上的乳糜微粒层除去。对这样得到的样品应用DCM进行测定。 由DCM得到的测定值和使用各试剂时的测定值示于表8。
[0204] [表7]
[0205]
[0209] (单位mg/dL)
[0210] (比较例3)
[0211]使用由试剂J~试剂N的第一试剂和比较例1记载的基础第二试剂构成的HDL胆固 醇测定用试剂，测定表7所示的人血清检体中的HDL胆固醇浓度。将由DCM得到的测定值和使 用各试剂时的测定值示于表9。
[0212] [表 9]
[0213]
[0214] (单位 mg/dL)
[0215] 使用比较例所示的试剂J~试剂N对表7所示的甘油三酯为异常高值、总胆固醇和 LDL胆固醇为大体正常值的IV型高血脂症样的检体进行测定时，如表9所示，相对于DCM值偏 离较大。另一方面，使用含有本发明的#盐和聚阴离子的试剂E~试剂I测定表7所示的检 体的情况下，也显示与DCM值很好地一致的值。认为这是由于，总胆固醇和LDL胆固醇为大体 正常值、含有大量乳糜微粒、VLDL的检体中，通过以往的方法无法适当处理乳糜微粒、VLDL， 相对于此，将本发明的#盐与聚阴离子并用时，能够更可靠地处理乳糜微粒、VLDL，因此测 定精度提尚。
[0216](实施例4)与表面活性剂的组合 [0217]对表面活性剂的种类进行试验。
[0218]使用通过超离心分离法制备的HDL组分、VLDL组分并利用生理食盐水以两组分中 的胆固醇浓度为50mg/dL的方式进行稀释而得的试样（以下，有时将该试样称为HDL组分试 样、VLDL组分试样），对改变第二试剂中添加的表面活性剂的种类时的影响进行验证。第二 试剂使用在比较例1中记载的基础第二试剂中添加表10所示的表面活性剂代替添加 EMULGEN B - 66而得的试剂。对于第一试剂，作为以往方法，使用比较例2的试剂J，作为添加 了成为基准的本发明的#盐化合物的试剂，使用含有三丁基十二烷基溴化膦的实施例2的 试剂F。
[0219]第二试剂
[0220]
[0221] [表 10]
[0222]
[0223] 将使用试剂J作为第一试剂测定的HDL组分试样的吸光度设为100,对使用实施例 3 - 1~实施例3 - 8的各第二试剂的试验中使用添加了本发明的I聲盐化合物的试剂F作为 第一试剂测定的HDL组分试样的相对吸光度（％)进行计算。并且，各测定中，计算相对于HDL 组分试样的吸光度的VLDL组分试样的相对吸光度（％ ) ADL组分试样的相对吸光度大、且 VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度小的条件是实现课题所要求的条件，即，维持胆 固醇测定用酶与HDL的反应性的状态下，降低胆固醇测定用酶与VLDL的反应性的条件。将结 果示于表11。
[0224] [表 11]
[0225]
[0226] 对添加同一表面活性剂的第二试剂彼此，比较第一试剂中的本发明的|秦盐化合 物的添加效果。使用了含有属于非离子性表面活性剂的Pegnol 005(实施例3 - 1)、EMULGEN △ 一60(实施例3 - 2)、恥￥〇&11610(实施例3 - 3)、恥￥〇&11 260(^8(实施例3 - 4)的第二 试剂的情况与使用了EMULGEN B - 66的情况(实施例2)同样，确认了如下的目标反应:通过 将本发明的#盐化合物与聚阴离子一起添加到第一试剂中，在大体维持胆固醇测定用酶 对HDL组分的反应性的状态下，VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度降低，即抑制胆固 醇测定用酶对VLDL组分的反应性。使用了属于阴离子性表面活性剂的Ena j i co 1 L - 30AN (实施例3 - 5)、胆酸钠(实施例3 - 6)时，使用试剂J作为第一试剂测定HDL组分试样，结果在 规定的反应时间内吸光度的增加不饱和而发色反应不结束(不显示数据）。但是，将第一试 剂作为本发明的试剂F时，改善了与HDL组分的反应性，试剂F/试剂J的HDL组分的吸光度比 为超过100%的值。另外，对使用试剂J作为第一试剂时的胆固醇测定用酶与VLDL组分的反 应性而言，使用Enaji COlL - 30AN时与HDL组分为相同程度（108.2%)，使用胆酸钠时与 VLDL组分的反应性高至HDL组分的6倍(635.5% )。但是，使用本发明的试剂F作为第一试剂 时，各表面活性剂中VLDL组分的反应性均得到大幅抑制，VLDL组分试样/HDL组分试样的吸 光度比小（12.5%，3.4%)。
[0227] 使用属于两离子性表面活性剂的AMPHITOL 24B(实施例3 - 7)、Enajicol C - 40H (实施例3 - 8)的情况也确认了与使用阴离子表面活性剂的情况相同的现象。即，将本发明 的I#盐化合物与聚阴离子一起添加到第一试剂中，在大体维持（108.7%，105.0% )对HDL 组分的反应性的状态下，VLDL组分试样/HDL组分试样的相对吸光度降低（102%-45.9%， 171.7%^7.1%)〇
[0228] 根据以上，对使本发明的I#盐化合物和聚阴离子与脂蛋白共存对LDL和VLDL进行 处理的方法中的抑制胆固醇测定用酶与VLDL的反应性的效果而言，证实了在为了使HDL可 溶化而使用的任一表面活性剂的共存下都得到该效果。
【主权项】
1. 一种方法，是高密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征在于， 包括使测定试样与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者与胆固醇酯水解酶和胆固醇 脱氢酶在通式(I)表示的化合物和聚阴离子的存在下反应的工序，式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原子数8~ 22的烯基，R2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或者直链 或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基# 盐、三甲基十二烷基盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷基I# 盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基#盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷基 盐中的至少1种化合物。4. 根据权利要求1~3中任1项所述的方法，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。5. 根据权利要求1~4中任1项所述的方法，其中，在进一步存在白蛋白的条件下进行所 述工序。6. 根据权利要求1~5中任1项所述的方法，其中，在进一步存在选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物的条件下进行所述工序。7. -种高密度脂蛋白胆固醇测定用试剂，含有下述(a)、（b)和(c): (a) 通式(I)表示的化合物，式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原子数8~ 22的烯基，R2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或者直链 或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子， (b) 聚阴离子， (c) 胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。8. 根据权利要求7所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链状的 碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。9. 根据权利要求7或8所述的试剂，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛基# 盐、三甲基十二烷基!奔盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基#盐、三乙基十二烷基# 盐、三乙基十六烷基#盐、三丁基辛基I#盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷基I# 盐中的至少1种化合物。10. 根据权利要求7~9中任1项所述的试剂，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸葡聚 糖。11. 根据权利要求7~10中任1项所述的试剂，其中，进一步含有白蛋白。12. 根据权利要求7~11中任1项所述的试剂，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基胺、 聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。13. 根据权利要求7~12中任1项所述的试剂，其中，包含第1试剂组和第2试剂组，所述 第1试剂组含有(a)通式(I)和(b)聚阴离子，第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧 化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。14. 一种试剂盒，在高密度脂蛋白胆固醇测定中使用，含有下述(a)、（b)和(c): (a) 通式(I)表示的化合物，式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8~22的烷基、或者直链或支链状的碳原子数8~ 22的烯基，R2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1~6的烷基、或者直链 或支链状的碳原子数2~6的烯基，X-表示阴离子， (b) 聚阴离子， (c) 胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。15. 根据权利要求14所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物中，R1表示直链或支链 状的碳原子数8~16的烷基，R 2、R3以及R4为直链或支链状的碳原子数1~4的烷基。16. 根据权利要求14或15所述的试剂盒，其中，通式（I)表示的化合物为选自三甲基辛 基I#盐、三甲基十二烷基f#盐、三甲基十六烷基#盐、三乙基辛基I#盐、三乙基十二烷 基#盐、三乙基十六烷基I#盐、三丁基辛基盐、三丁基十二烷基#盐和三丁基十六烷 基#盐中的至少1种化合物。17. 根据权利要求14~16中任1项所述的试剂盒，其中，聚阴离子为磷钨酸钠或者硫酸 葡聚糖。18. 根据权利要求14~17中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有白蛋白。19. 根据权利要求14~18中任1项所述的试剂盒，其中，进一步含有选自聚氧乙烯烷基 胺、聚氧乙烯烯基胺、叔胺和季铵盐中的至少1种化合物。20. 根据权利要求14~19中任1项所述的试剂盒，包含第1试剂组和第2试剂组，所述第1 试剂组含有(a)通式（I)和(b)聚阴离子，所述第2试剂组含有(c)胆固醇酯水解酶和胆固醇 氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶。
【专利摘要】本发明提供即便将像血脂异常症这样的特殊病症的检体作为测定试样时，也能够提高与DCM等基准测定法的测定值的一致性的HDL－C测定方法。将测定试样与胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或者胆固醇酯水解酶和胆固醇脱氢酶在下述通式(I)(式中，R1表示直链或支链状的碳原子数8～22的烷基、或者直链或支链状的碳原子数8～22的烯基，R2、R3以及R4相同或不同地表示直链或支链状的碳原子数1～6的烷基、或者直链或支链状的碳原子数2～6的烯基，X-表示阴离子。)表示的化合物和聚阴离子的存在下反应，测定HDL－C。
【IPC分类】C12Q1/44, C12Q1/60, C12Q1/26, C12Q1/32, G01N33/92
【公开号】CN105492623
【申请号】CN201480047506
【发明人】大田美惠子, 大野爱子
【申请人】积水医疗株式会社
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年9月1日
【公告号】CA2921825A1, EP3040421A1, US20160208311, WO2015030236A1
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