熔解曲线分析的制作方法
熔解曲线分析的制作方法
【专利说明】熔解曲线分析 发明领域
[0001] 本发明涉及熔解曲线分析。具体地，本发明涉及一种方法，一种装置和一种用于分 析熔解曲线数据的信号描述的计算机程序。
[0002] 发明背景
[0003] 熔解曲线分析和高分辨率熔解(HRM)分析通常是用于检测和分析样品中的核酸序 列的存在的方法。通常在核酸的PCR扩增后，正常立即进行分析，并且该分析依赖于作为温 度函数的反应溶液监测荧光。所使用的荧光分子可以是双链D N A结合的荧光基团或荧光标 记探针。
[0004] 通常情况下，对于成功的HRM分析，需要几乎完全饱和的双链DNA结合荧光基团。这 一要求限制了可能的荧光基团的选择，因为其中它们中的许多将需要过高的浓度，而不允 许有效扩增。
[0005] 传统的HRM分析不是很好地适于进行定量分析。例如，在某些情况下，能够定量评 估在多相样品中的突变序列的相对丰度将是有益的。这种类型的信息例如在与癌症和非整 倍体分析相关的所获得单核苷酸多态性(SNP)分析中是有价值的。
[0006] 此外，传统的HRM分辨能力限制了它例如在检测纯合子SNP突变体中的使用，因为 熔解温度的差异是次要的。
【发明内容】
[0007] 因此，本发明的目的是提供一种分析技术，其适合核酸分子的定量分析，并能够以 良好的分辨率(在熔解温度差异方面)进行样品中核酸的检测和/或识别。
[0008] 本发明的目的是通过如由相应的独立权利要求所限定的方法、装置和计算机程序 实现的。
[0009] 在这方面，提供了一种用于分析熔解曲线(melt curve)的新颖方法，其表征溶液 的熔解，该溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。所 述方法包括:获得在一定温度范围内熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述 荧光基团发射的作为温度的函数的光强度;在该温度范围内的多个温度下将荧光信号建模 成为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定温度 下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表示在 给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中，第一 信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型未结 合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发 射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第三项 表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项表示 在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值分析 来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得荧光信号和模型化荧光 信号之间的差满足预定标准。
[0010]该方法可以包括将所述第三项的每一个建模成为在所述给定温度下用于相应核 酸分子种群的结合位置的总体数量和第一参数函数值的乘积，所述第一参数函数是所述结 合位置的总体数量的占用水平的描述，其是溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核酸分 子种群的熔解概率的描述，其是温度的函数，并且其中确定所述第三项的每个的值包括确 定所述第一和第二参数函数的参数值。
[0011]替代地或另外，该方法可包括由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函 数是所述第一类型未结合荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，和由相应的第四 参数函数建模所述第四项的每个，所述第四参数函数是结合到相应的核酸分子种群的所述 荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，其中确定所述第二项的值包括确定所述第 三参数函数的参数值，并且其中确定所述第四项的每个的值包括确定用于相应第四参数函 数的参数值。
[0012] 数值分析可以包括在所述多个温度下将所述项的至少一个设置为预定值，并采用 数值分析来确定在所述多个温度下其它项的值。所述设置可以包括设置所述第二项和每个 所述第四项为各自的预定值，并且所述采用可包括采用数值分析来确定第一项和每个所述 第三项的值，以能够确定溶液中一个或多个核酸分子种群的相对浓度和/或特性。可替代 地，所述设置可以包括设置所述第一项和每个所述第三项为各自的预定值，并且所述采用 可以包括采用数值分析来确定第二项和每个所述第四项的值，以能够确定所述第一类型荧 光基团的特性。
[0013] 所述核酸分子可以包括，例如，源自聚合酶链反应的一种或多种类型的DNA靶序 列，和/或所述荧光基团可包括多个下列荧光基团的一种或多种:LC Green，LC Green+，Eva Green，SYT09，SYBR Green。
[0014] 此外，在这方面，提供一种用于分析熔解曲线的新颖装置，其表征溶液的熔解，该 溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。所述装置包括 至少一个处理器和至少一个存储器，所述存储器包括用于一个或多个程序的计算机程序代 码，至少一个存储器和计算机程序代码，其被配置为，与至少一个处理器一起，使该装置至 少获得在一定温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一类型 荧光基团发射的作为温度的函数的光强度，以在该温度范围内的多个温度下将荧光信号建 模为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定温度 下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表示在 给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中，第一 信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型未结 合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发 射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第三项 表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项表示 在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值分析 来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得第一荧光信号和模型化 荧光信号之间的差满足预定标准。
[0015] 此外，在这方面，提供了一种用于分析熔解曲线的新颖计算机程序，其表征溶液的 熔解，该溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。该计 算机程序包括一个或多个指令的一个或多个序列，当由一个或多个处理器执行时，其使装 置至少获得在一定温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一 类型荧光基团发射的作为温度的函数的光强度，以在该温度范围内的多个温度下将荧光信 号建模为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定 温度下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表 示在给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中， 第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型 未结合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团 的发射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第 三项表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项 表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值 分析来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得第一荧光信号和模 型化荧光信号之间的差满足预定标准。
[0016] 该计算机程序可以体现在易失性或非易失性计算机可读记录介质上，例如作为计 算机程序产品，其包括至少一个具有存储在其上的程序代码的计算机可读非暂时性介质， 当由一个装置执行时，程序代码使该装置至少执行上文描述的用于计算机程序的操作。
[0017] 在本专利申请中提出的本发明的示例性实施例不应被解释为构成所附权利要求 适用性的限制。动词"包括"及其派生词在本专利申请中作为开放性限制被使用，其不排除 还未陈述特征的存在。除非明确声明，下文所描述的特征可以相互自由组合。
[0018] 这被认为是本发明特征的新颖性特征在所附权利要求中被具体阐明。然而，本发 明本身，既涉及它的结构和操作方法，又涉及其附加目的和优点，在结合附图阅读时，从具 体实施例的以下详细描述中将被最佳理解。
【附图说明】
[0019]图1示出了示例性恪解曲线。
[0020] 图2示出了作为时间函数的荧光基团发射效率的例子。
[0021] 图3示意性示出了荧光基团的结合的一个例子。
[0022]图4示出的示例性的熔解曲线。
[0023]图5a示意性地示出了荧光基团在结合状态的变化的一个例子。
[0024]图5b示意性地示出了结合状态的荧光基团的一个例子。
[0025] 图5c示意性地示出了荧光基团在结合状态的变化的一个例子。
[0026] 图5d示意性地示出了结合状态的荧光基团的一个例子。
[0027] 图6示出了作为温度函数的熔解概率的一个例子和作为温度函数的结合位置的总 体数量的一个例子。
[0028] 图7示出了作为温度函数的熔解概率的一个例子和作为温度函数的结合位置的总 体数量的一个例子。
[0029] 图8示出了作为未结合荧光基团数目的函数的结合位置的占用水平的例子。
[0030] 图9示出了根据一个实施例的示例性方法。
[0031] 图10示出了作为温度函数的结合位置相对总体数量的一个例子。
[0032] 图11示出了作为温度函数的两个核酸分子种群的光强度的相对强度的荧光信号 分量描述的一个例子。
[0033]图12示意性示出了根据一个实施例的示例性装置。
【附图说明】
[0034]
[0035] 在本文中，术语荧光基团或荧光基团分子或染料用来指报告分子，其能够在第一 波长范围吸收光能，并且作为响应，在第二波长范围发射光能。
[0036]在本文中，术语核酸分子被用来指DNA分子，RNA分子或它们的组合和/或衍生物。 此外，术语靶可替代地被用来指DNA分子，RNA分子或它们的组合和/或衍生物。
[0037] 在本文中，术语种群被用于指一组类似分子。作为一个例子，术语种群可以用于指 一组相似的核酸分子或一组类似的荧光基团。此外，术语种群或术语子群可以被用来指代 一个子组，例如荧光基团种群的第一和第二子组。结合和未结合的荧光基团是子群的例子。
[0038] 在本文中，术语熔解曲线用来指信号或一组值，其描述在感兴趣的温度范围内作 为温度函数的溶液的熔解表现。作为熔解曲线适用的信号的一个例子是由感兴趣的溶液发 射的光强度的荧光信号描述，其是温度的函数。熔解曲线信号的另一个例子是由包含核酸 和荧光基团的溶液发射的光强度的荧光信号描述，其是温度的函数。该值通常用图形表示。 [0039]在本文中，术语发射效率被用于指信号，例如用作熔解曲线的荧光信号的相对光 强度的幅度或相对幅度。
[0040]单链核酸分子、DNA和RNA，具有与使用核苷酸碱基的固有配对能力的第二链特异 性配对的能力，以形成双链结构。双链核酸分子具有特性变性（即从彼此链解离)温度，其依 赖于链的碱基序列。熔解温度（Tm)是二分之一的特定DNA双链体解离并成为单链DNA的温 度。引物-模板DNA双链体的稳定性也可通过其T m测定。
[0041 ]根据本发明的核酸分子是DNA或RNA或它们的任意组合，核酸优选是双链核酸分 子。在扩增反应或与第二核酸杂交产生双链结构后，单链核酸可以被分析。核酸分子可以是 任何类型的，如基因组DNA，mRNA(信使RNA)或siRNA(小干扰RNA)。核酸可以是天然存在的， 改性的或人造的核酸，其可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)被扩增。核酸分子可以包含， 或由任何类型的改性核酸组成。改性核酸的例子为吗啉代和锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、乙 二醇核酸、苏糖核酸和小沟结合剂。
[0042](待分析的）双链核酸分子可以是一种非扩增双链分子。如果该样品的核酸含量足 够高以允许检测，这是可能的。通常，核酸分子在使用PCR ，优选qPCR进行熔解曲线分析前被 扩增。自1980年以来，PCR已被用于在数个数量级扩增核酸分子，例如DNA和RNA (例如参见 US4683202)。定量实时PCR(qPCR)是在其中荧光染料被用于在每个PCR循环后，检测PCR产物 的量的方法(例如参见US5994056)。实时qPCR是用于基因表达分析的一种非常有效的工具。 它是用于样品中的低丰度mRNA的检测和定量的最灵敏的方法。qPCR的已知应用包括例如验 证微阵列结果，单细胞qRT-PCR，包括基因分型的诊断以及病毒、细菌和寄生虫的检测。RNA 分子使用逆转录PCR(rtPCR)被扩增。定量逆转录PCR(qRT-PCR)在用于试验的起始材料是 RNA时被使用。
[0043] 熔解曲线分析（熔解曲线分析）是加热过程中双链核酸分子的解离特性的评估 (US5871908，US6174670)。随着温度升高，双链开始解离，导致吸收强度的上升。熔解温度 (T m)通常由仪器软件从熔解曲线数据通过绘制对温度的负一阶导数(-dF/dT)计算。该导数 熔解峰是熔解温度的最高点。DNA片段的T m依赖于它的长度、G+C组成、序列、链互补性、浓度 和缓冲区成分，诸如盐、染料和PCR增强剂。
[0044] 高分辨率熔解(HRM)分析使得能基于其序列、长度、G+C含量、和链互补性的微小差 异分析核酸样品。它已被用于一些强大的应用，包括突变发现(基因扫描），杂合性缺失筛 查，DNA指纹识别，SNP基因分型，单倍型区段的表征，DNA甲基化分析，DNA映射，物种鉴定，体 细胞获得突变率，HLA兼容性分型，关联(病例/控制)研究，等位基因在种群中的流行和候选 易感基因的鉴定。
[0045]荧光基团在一个波长吸收光能量，并且作为响应，在另一较长波长重新发射光能 量。每个荧光基团均具有吸收光的不同波长范围，和发射光的另一不同波长范围。此属性使 它们能通过实时PCR仪器和通过其它分析工具和/或分析技术用于PCR产品的特异性检测。 [0046]术语淬灭描述给定荧光基团处理的量子产量的降低，其导致所发射的光的强度降 低。猝灭剂是这样的分子，其可以从荧光基团接受能量，然后消散它，而不必与供体荧光基 团发射相同范围的光(光发射）。这两个分子之间的能量传递被称为FRET(荧光共振能量转 移）。当猝灭剂从极为接近其相应的荧光基团分子被移除，荧光基团分子可以再次释放其额 外的能量作为在其特征波长的荧光。FRET荧光基团对的一些例子是FAM-TAMRA和VIC-TAMRA〇
[0047] 存在两种基本功能类型的荧光基团。第一类型的荧光基团具有结合到双链核酸分 子中的能力。SYBR Green I是这种类型的已知荧光基团的一个例子。它是对于qPRC应用最 常用的荧光基团。这种类型的其它合适的荧光基团包括溴化乙锭、BEB0、B0XT0、LC Green， SYT09和Eva Green。
[0048] 第二类型的荧光基团可被用作附着于短核酸链的标记或标签，通常引物或探针。 这种类型的荧光基团的例子包括FAM、HEX、NED和TAMRA。一些这种类型的荧光基团可被用作 淬灭剂分子。已知猝灭剂分子包括其它焚光基团，其从主焚光基团获取能量并在不同波长 发射，和猝灭剂，其不发射可见光如黑洞猝灭剂(BHQ)产品系列。
[0049]用于qPCR和熔解曲线分析的检测化学物质可分为两个基本组：非特异性化学物 质，其通常检测靶结合染料，如DNA结合染料的荧光，和靶特定化学物质，其通常利用荧光探 针和/或引物。在下文中，DNA被用作靶(或核酸分子)的一个例子，但讨论同样也适用于其它 类型的靶(或核酸分子）。
[0050]几种类型的特异性检测化学物质可商购。它们利用被专门设计用于检测靶DNA序 列的标记寡核苷酸探针。荧光标记或标签是优选的。水解探针是最常用的qPCR探针（如 TaqMan探针），但它们不适于在熔解曲线分析中使用。其它靶特异性检测化学物质，也可以 适用于熔解曲线分析，包括发夹探针(其中的分子信标探针是最流行的），LightUp(照亮)探 针和杂交探针(也称为FRET探针），其包括MGB克制杂交探针(Solaris，Pleiades)。
[0051 ]熔解曲线分析的最简单、成本最低的方法，使用DNA结合荧光基团或用于靶DNA序 列的非特异性检测的其它报告分子。这作为标准引物执行起来既快速又经济，并且可以使 用非特异性染料。使用非特异性检测化学物质，试验的灵敏度和特异性仅由PCR引物来确 定。
[0052]通常，PCR仪器被设置为在PCR扩增后，通过逐渐增加温度和监测作为温度函数的 荧光进行熔解曲线分析。作为另一实例，熔解曲线分析可以在PCR扩增完成之后，通过独立 于PCR仪器的仪器或设备进行。当温度高到足以使双链DNA变性时，荧光发生急剧下降，并且 焚光基团分子被释放。
[0053]基本熔解曲线分析通常用于检查PCR反应的特异性。数据通常例如以0.5°C的温度 增量被收集。由于较低的分辨率要求，基本熔解曲线分析可以在非饱和荧光基团条件下例 如使用SYBRGr een进行。
[0054]在HRM实验中，数据通常以0.2°C和更小的温度增量被收集。以染料为基础的HRM分 析利用DNA结合荧光基团，其可以在饱和条件下被使用，而不抑制DNA聚合酶，例如LC Green 和Eva Green。饱和浓度防止熔解期间染料分子再分配，并提供更好的分辨率。基于探针的 熔解的不同之处只在于，通常，PCR扩增步骤是不对称的，这意味着其中一条链被设计为比 另一条链更有效地扩增。
[0055] 也可以添加非特异性染料(例如Β0ΧΤ0，ΒΕΒ0)到基于探针的qPCR反应中，如例如在 文章"恪角军Combining sequence-specific probes and DNA binding dyes in real-time PCR for specific nucleic acid quantification and melting curve analysis'，， Kristina Lind，Anders Stahlberg ,Neven Zoric，和Mikael Kubista，BioTechniques: 40:315-319，2006年3月。所获得的优点是使用熔解分析检查qPCR反应的特异性的能力，而 不必在qPCR阶段之后单独添加染料。这减少了污染的风险。
[0056] 本发明的实施例使得能够考虑到从第一熔解区域解离的荧光基团的重定位，从而 例如在非饱和条件下能够进行HRM分析。
[0057] 虽然术语种群在本文中主要用于指一组相似的核酸分子或核酸序列，例如，指一 组扩增的DNA或RNA序列，该术语也可以用于指一组其它种类的类似分子。作为术语的用法 的另一个例子，一组相似类型的焚光基团分子可以被称为(单个)种群焚光基团，例如相似 类型的所有荧光基团。作为进一步的例子，荧光基团可以按照它的结合状态被分配为单独 的种群，例如结合到核酸分子的第一种群的荧光基团可以构成荧光基团的第一种群(或第 一子群），结合到核酸分子的第二种群的荧光基团可以被视为构成荧光基团的第二种群(或 第二子群），而未结合荧光基团可被认为是荧光基团的第三种群(或第三子群）。（在这方面， 请参阅下文中荧光基团和它们的结合状态的更详细描述）。
[0058] 图1示出了示例性熔解曲线110。熔解曲线，例如熔解曲线110,是在所感兴趣的温 度范围内在研究中的溶液中的一种或多种核酸分子种群的恪解行为的描述，其中术语种群 是指一组相似的核酸分子。换言之，熔解曲线110描述了溶液作为整体的熔解行为。这种核 酸分子例如可以是由PCR过程产生的DNA革E1序列，如前文所述。核酸分子的进一步例子包括 由其它方法扩增的片段，所述其它方法包括等温扩增，例如从限制性内切酶消化所得的提 取片段和例如从免疫沉淀得到的沉淀片段。
[0059]所研究的溶液中所包括的一个或多个核酸分子种群的每一个均显示出熔解行为， 即其类型和序列的特征。如果溶液包含两个或多个不同序列的核酸分子种群，熔解曲线是 两个或多个核酸分子种群的共同熔解行为的指示，并且在不借助于复杂的分析技术的情况 下，它通常不可能提取特定于任何单个核酸分子种群的熔解曲线。如果溶液包含核酸分子 的单个种群，熔解曲线110可以直接指示单个核酸分子种群的熔解行为。然而，取决于作为 熔解曲线110推导基础应用的其它类型荧光基团或报告分子的特性，描述作为整体的溶液 的熔解行为的熔解曲线110,与特定于包含在溶液中的单个核酸分子种群的熔解曲线之间 的关系在某种程度上可能更复杂。因此，进一步的分析可能被需要，以基于整体熔解曲线 110提取单个核酸分子种群的熔解行为。
[0060] 下文中，为了描述的简洁和清楚，荧光基团分子被简称为荧光基团。在感兴趣的溶 液中的荧光基团可以是未结合于溶液的任何核酸分子的自由荧光基团，即未结合荧光基 团。可替代地，荧光基团可以结合到溶液中的核酸分子中的一个。由荧光基团发射的光通常 取决于其至溶液中的核酸分子的一个的结合，即取决于荧光基团的结合状态。作为一个例 子，未结合双链DNA结合荧光基团以第一光强度发射光，而当它们被结合到双链核酸分子的 种群时，它们以第二光强度发射光，其中第一光强度显著低于第二光强度。第二光强度依赖 于核酸分子中双链区域的量，从而提供了依赖于供相应的荧光基团结合的核酸分子的序 列，其在熔解或再退火过程中可检测。用作本文中的示例的第一和第二光强度和/或由荧光 基团发射的光的波长依赖于所用的荧光基团的特性。第一和第二光强度可以进一步依赖于 环境因素，例如周围溶液的化学组成。
[0061] 熔解曲线110的例子是由感兴趣的溶液发射的光强度的荧光信号描述，其是温度 的函数。适合于表示熔解曲线数据以及因此表示熔解曲线110的荧光信号，熔解可以通过为 所研究的溶液提供已知数量、已知浓度和/或已知体积的特定类型荧光基团分子，并将溶液 的温度从起始温度提高到最终温度，而在同一时间使用第一波长的光激发溶液-特别是其 中的荧光基团，所述第一波长是所使用的荧光基团分子的类型的特征。其结果是，荧光基团 分子以第二波长发射光，所述第二波长是所采用的荧光基团分子的特征。因此，由溶液发射 的光构成荧光信号，所述荧光信号因此是熔解曲线数据的描述。
[0062] 虽然由荧光基团种群发射的光的强度可以是恒定的或基本上恒定，而与温度无 关，通常由荧光基团种群发射的光的强度进一步依赖于温度(并且因而依赖于核酸的解离 状态），例如使得荧光基团种群的有效发射效率随着温度的升高而降低。升高温度意味着溶 液的分子表现出更多的运动，并且因此分子之间碰撞的概率增加。进入激发态的焚光基团 通常导致荧光基团以其波长特性发射光，但碰撞可以通过声子的相互作用提供从激发态的 替代松弛路径，由此导致尽管激发态，荧光基团也不能发光。因此，对于某些荧光基团种群， 增加温度意味着降低发射效率。
[0063] 作为这方面的一个例子，发射效率ru,tot可以表现出随着温度的升高呈指数衰减， 例如根据按照公式(1)的参数函数。
[0064]
( 1 )
[0065]其中参数Hi表示给定荧光基团种群的基准发射效率，T表示温度，并且参数^表示 由于分子间的碰撞，对于给定荧光基团种群的发射效率衰减系数。作为非限制性示例，参数 ^的值可以在从5至5001/°C的范围内。下标i=0的情况下参数表示用于未结合荧光基团种 群的公式（1)的相应参数，而在下标i>0的情况下参数表示用于结合到所感兴趣的溶液中的 核酸分子种群中的一个的荧光基团的公式（1)的相应参数。基准发射效率的值m用于指示 未结合荧光基团种群相较于溶液中的其它荧光基团，即相较于结合到核酸分子种群中的一 个的分子的荧光基团种群的相对发射效率，并且因而它们的绝对值，对于根据公式(1)的发 射效率模型的适用性，通常不是至关重要的。然而，如果这样的信息是可获得的，对于给定 类型的荧光基团和/或对于给定的核酸分子种群，能够使用先验已知的参考值。代替将发射 效率建模为随温度升高的单调指数衰减，衰减可替代地可以例如通过表现出随温度升高单 调减少的线性函数或分段线性函数来建模。按照公式（1)在给定温度下发射效率ru,tot的温 度描述函数的一个例子是由图2中的实线曲线提供的。
[0066] 虽然发射效率随着温度升高的单调衰减可以被认为是几种类型的荧光基团的特 征，某些类型荧光基团的特征可以随温度而变化，并且因此其发射效率可能会表现出对温 度更复杂的依赖性。或者，溶液可含有具有温度有关行为的猝灭剂分子。例如。在低温下猝 灭的荧光基团可以表明发射效率，按照根据公式(2)的参数函数，其是温度的函数。
[0067]
( 2 )
[0068] 其中所述参数τη表示由于分子间的碰撞，对于给定的荧光基团种群的发射效率衰 减系数，并且参数T2i表示由于淬灭发射效率的衰减系数，而公式(2)的其余参数表示与如针 对公式（1)所述相同的物理特性。按照公式(2)在给定温度下发射效率ru, tclt的温度描述的函 数的一个例子是由图2中的虚线曲线提供的。
[0069] 所研究的溶液通常包括一个或多个核酸分子序列的每一个的大量实例，换句话 说，该溶液可被视为包括一个或多个核酸分子种群，每个种群包括大量具有特征序列的相 应核酸分子。一个或多个双链核酸分子种群的每一个包含荧光基团可以结合的结合位置的 总体数量化，其中下标i表示相应的核酸分子种群。通常，对于给定的核酸种群，仅有结合位 置的总体数量化的一部分被占用。所占用的结合位置的数量被表示为m，并且因此占用水平 以rn/Ni表不。
[0070] 当给定的核酸分子种群熔解时，其结合位置的总体数量K随着温度的升高而降 低，并在同一时间给定的核酸分子种群从其结合位置释放荧光基团。因此，给定核酸分子种 群的结合位置的占用水平m/Ni也改变。这种现象在下文中更详细地讨论。从给定核酸分子 种群释放的荧光基团成为未结合荧光基团，结合到溶液的另一核酸分子种群的荧光基团或 结合到溶液的相同核酸种群的另一结合位置的荧光基团。因此，从给定核酸分子释放的荧 光基团从给定核酸分子的结合位置到别的地方改变位置，但不从溶液中消失，因此，溶液中 的荧光基团的总体数量n tclt保持恒定，尽管给定核酸分子群种熔解。因此，在溶液中的荧光 基团的总体数量ntot可以例如由公式(3)表示：
[湖]
⑶
[0072] 其中参数n〇(T)表不在温度T卜浴液中的未结合荧光基团的数量，参数m(T)代表在 温度T下结合到核酸分子种群i的荧光基团的数量，并且参数Ntgt表示在溶液中的核酸分子 种群的总体数量。因此，参数n〇(T)可被认为是未结合荧光基团的种群相对大小的指示，而 参数m(T)可被认为是结合到核酸分子种群i的分子的荧光基团种群的相对大小的指示。
[0073]图3通过在给定温度T下指示未结合荧光基团的种群310,结合到第一种群核酸分 子的荧光基团种群320和结合到第二种群核酸分子的荧光基团种群330示意性示出了此模 型。在该图示中，黑色圆圈表示结合到相应核酸分子种群的荧光基团，而白色圆圈表示在第 一和第二种群320,330的核酸分子内的未占用结合位置。因此根据图3的示例，在给定温度 T，有22个未结合荧光基团，10个结合到第一种群320的核酸分子的16个结合位置的荧光基 团，因而提供10/16 = 0.625的占用水平，以及13个结合到第二种群330的核酸分子的20个结 合位置的荧光基团，从而提供了 13/20 = 0.65的占用水平。
[0074] 图4示出了用于溶液的示例性熔解曲线，所述溶液包括第一种群320和第二种群 330的核酸分子，熔解曲线从50°C延伸至100°C。在温度1^ = 601,并且通常在第一种群320 的核酸分子发生任何熔解之前，结合位置的总体数量和与其结合的荧光基团数量是在图3 的示例中所示的那些，即沁=16，111 = 10，犯=20并且112 = 13。在温度12和/或在温度了2周围， T2是第一种群320的核酸分子的平均熔解温度，由于熔解，第一种群320的核酸分子开始放 松结合位置，即NKhpNKTs)。因此，一些结合到第一种群320的核酸分子的荧光基团成为 未结合焚光基团310,并且它们中一些进一步结合到第二种群330的核酸分子。在温度T2和/ 或温度T 2周围荧光基团结合状态的这种变化在图5a中示意性地被示出。
[0075] 在温度T3,第一种群320的核酸分子已经完全熔解，并且因此失去了所有的结合位 置，= 而在Τ4具有平均熔解温度的第二种群330的核酸分子仍然继续具有初始的 结合位置的总体数量，即Ν 2 = 20,并且在本实施例中，与其结合的荧光基团的数量为η2=17。 在温度Τ3和/或温度Τ3周围的荧光基团的结合状态在图5b中被示意性地示出。
[0076] 此外，在温度T4和/或温度T4周围，T4是第二种群330的核酸分子的平均熔解温度， 第二种群330的核酸分子由于熔解开始放松结合位置，即N 2(T3)>N2(T4)。因此，一些结合到 第二种群330的核酸分子的荧光基团成为未结合荧光基团310。荧光基团的结合状态在温度 Τ4和/或温度T4周围的这种变化在图5c中被示意性地示出。最后，在温度!^，第二种群330的 核酸分子也已经完全熔解并且因此失去了它们的所有结合位置，即Ν 2(Τ5)=0。因此，该溶液 的所有荧光基团都成为未结合荧光基团310。在温度T#P/或温度1~ 5周围的荧光基团的结合 状态在图5d中被示意性地示出。
[0077] 给定的核酸分子种群的熔解过程可以由熔解行为的概率密度函数描述来建模，其 是时间的函数，特别是在熔解温度Tm>1和/或在熔解温度T m>1的周围。作为一个例子，核酸分 子种群i的熔解概率可以被假定遵循正态分布，因此熔解概率可以被表示为温度的函数，成 为高斯概率密度函数
[0078] (4)
[0079] 其中T表示温度，参数NM表示在已经基本上发生任何熔解之前，种群i的核酸分子 的结合位置的总体数量，参数T m>1代表种群i的核酸分子的熔解温度，并且参数〇1代表核酸 分子种群i的熔解宽度。熔解温度T m>1和熔解宽度〇1是表征核酸分子种群的参数，并且因此 这些参数可以例如被用于识别核酸分子种群。
[0080] 因此，用于核酸分子种群i的结合位置的总体数量可以通过累计概率分布来获得
[0081] C 5 )
[0082] 其中erf〇是误差函数，如本领域已知的，其表现出S形。误差函数erf〇被定义为
[0083]
[0084] 根据公式(4)，作为温度函数的熔解概率通过图6中左侧的曲线所示的例子被示 出，其中Tm>1 = 75°C，〇1 = 3°C，而图6中右侧的曲线描绘了相应数量的总体结合位置，根据式 (5)，其是温度的函数。
[0085] 适于建模核酸分子种群i的熔解的概率密度函数的另一实例是逻辑概率分布，其 根据
[0086] ( 6 )[0087] 因此，用于核酸分子种群i的结合位置的总体数量可以通过累计概率分布来获得
[0088] (7)
[0089] 个例子。
[0090] 根据公式(6)，作为温度函数的熔解概率通过图7中左侧的曲线所示的例子被示 出，其中Tm>1 = 75°C，并且〇1 = 3°C，而图7中右侧的曲线描绘了相应数量的总体结合位置，根 据式(7)，其是温度的函数。
[0091] 本文所描述的正态分布和逻辑分布用作合适的概率密度函数的非限制性例子，该 函数可以被应用以基于参数函数建模熔解概率。此外，相应的累计概率分布用作合适的S型 函数的非限制性例子，用于建模结合位置的相应的总体数量，其是温度的函数。在这方面， 概率密度函数可以应用不同于公式(5)和(7)中所采用的S型函数的S型函数，例如累计学生 t分布，反正切，双曲正切以及多个代数函数。因此，已知类型的另一分布或甚至任意分布与 合适的相应累计分布函数一起可以被应用。分布的类型可以是先验已知的，或分布的类型 可基于所测得的数据，例如基于熔解曲线或其导数被确定或近似。
[0092] 如在之前已经简要地指出的，对于种群i的核酸分子，仅结合位置的总体数量化的 一部分被占用。通常，占用水平取决于溶液中的未结合荧光基团数量。因为，如上所述，当温 度达到或超过它们的熔解温度时，溶液中的核酸分子释放荧光基团，并且所述链彼此分离， 溶液中的未结合荧光基团的数量取决于温度，并且因此占用水平mUVNdT)也至少间接地 依赖于温度。作为一个例子，种群i的核酸分子的占用水平ηΚ?/ΝΚΤ)可以使用参数函数被 建模，该参数函数为未结合荧光基团数量的指数函数，
[0093]
( 8 )
[0094] 其中参数n〇(T)表示在温度T溶液中的未结合荧光基团的数量，参数γι代表了用于 种群i的核酸分子的填充平衡系数。填充平衡系数取决于所使用的荧光基团，并且可以因此 独立于核酸分子种群，即公式(8)中的参数丫 1可以由适用于所有核酸分子种群的参数γ来 代替。图8中的实线曲线示出了占用水平ndlO/NdT)的一个例子，根据公式(8)，其是未结合 荧光基团的数量的函数。种群i的核酸分子的占用的结合位置的数量m(T)以及因此与其结 合的荧光基团的数量可以基于公式(8)被解决，其为
[0095：
( 9 )
[0096] 由于在溶液中的荧光基团的总体数量ntclt保持恒定，将公式(9)代入公式(3)能够 通过相应的结合位置的总体数量表示结合到溶液中的各核酸分子种群的荧光基团数量，并 因此将公式(3)重写成
[0097]
( 1〇)
[0098] 作为另一个例子，种群i的核酸分子的占用水平mUVNdT)可以用参数函数来建 模，该参数函数是进一步涉及谐波振荡的未结合荧光基团数量的指数函数，为：
[0099]
[0100] 其中X =。而公式（11)的其它参数在公式(8)的上下文中被描述。图8中的 虚线曲线示出了占用水平rnUVNdT)的一个例子，根据公式（11)，其是未结合荧光基团数 量的函数。因此，公式（11)可通过结合位置的相应总体数量，例如在公式(3)中沿针对公式 (9)如上所示的线，来表达结合到溶液中的各核酸分子种群的荧光基团数量。
[0101] 虽然公式(8)和（11)所提供的参数函数的非限制性示例适于建模占用水平m(T)/ NKT)为未结合荧光基团数量的函数，不同于这些的函数，甚至是任意函数也可以被应用。 [0102]之前的描述已经假设，所研究的溶液设置有单一类型的荧光基团，因此具有依赖 于它们的结合状态的类似行为，并为温度的函数。然而，可以使用两种或更多种不同类型的 荧光基团以获得熔解曲线数据的相应两个或多个荧光信号描述。而根据例如在图3和图5a 至5d的上下文所描述的模型，单个结合位置被假定为能够一次仅结合给定类型的单个荧光 基团，它可以假设单个结合位置能够同时结合不同类型的两个或多个荧光基团。
[0103]优选地，不同类型的荧光基团发射不同波长的光，以有利于源自不同类型的荧光 基团的光之间的区分。此外，不同类型的荧光基团在发射效率上可呈现不同的变化，其是温 度的函数，和/或DNA靶结合位置的占用水平的不同进化，其是在所研究的溶液中的未结合 荧光基团的数量的函数。而荧光基团行为的前一方面可以例如基于公式（1)或(2)被建模， 发射效率模型的参数是针对两种或多种类型的荧光基团中的每一种是不同的。类似地，虽 然核酸分子行为的后一方面可以例如基于公式(8)或（11)被建模，占用水平模型的参数针 对两种或多种类型的荧光基团中的每一种是不同的。因此，使用两种或多种不同类型的荧 光基团用来提供熔解曲线数据的两个或多个荧光信号描述，该荧光信号描述至少部分相互 独立，因此，提高了分析的精度和可靠性。
[0104] 适于建模包含一个或多个核酸分子种群的溶液特性的示例性公式被描述，为了描 述的清楚和简便起见，其使用荧光基团作为报告分子的一个例子，该荧光基团响应于通过 具有合适特性的光的激发，在其特性波长发射光。但是，在这方面，荧光基团用作合适的报 告分子的非限制性例子。
[0105] 在一般情况下，所研究的溶液可以被提供有任何报告分子，当其结合状态改变时， 其改变其可测量性质中的一个或多个。作为这方面的另一实例，可以应用依赖于其结合状 态改变其电-化学势的报告分子。因此，熔解曲线数据可以由从溶液中测量的电化学势的信 号描述来表示，其是温度的函数。作为进一步的例子，可以应用依赖于其结合状态改变从其 发出的热能的报告分子。因此，熔解曲线数据可以由溶液发射的热能的信号描述来表示，其 是温度的函数。作为再一示 例，可以应用依赖于其结合状态改变报告-靶复合物的质量的报 告分子。因此，熔解曲线数据可以由报告-靶复合物的重量的信号描述来表示，其是温度的 函数。
[0106] 荧光基团的使用可以类似于使用两种或更多种不同类型荧光基团的方式，与不同 类型的报告分子的使用相结合。例如，如果应用两种荧光基团和依赖于它们的结合状态改 变它们的电化学势的标记分子，能够获得由所研究的溶液发射的光的荧光信号描述表示的 第一熔解曲线，其是温度的函数，和由所研究的溶液的电化学势的信号描述表示的第二熔 解曲线，其是温度的函数，两个熔解曲线都作为熔解曲线数据的表示，因此有利于以与仅靠 单一类型的报告分子的情况相比，更准确且可靠的方式分析熔解行为。
[0107] 返回到焚光基团作为报告分子的一个例子，考虑到核酸分子和焚光基团的上述特 性和它们之间的关系，代表在给定温度下的熔解曲线数据的荧光信号F(T)可根据下式被建 模
[_
… (12)
[0109] 其中参数Fo(T)表示在温度T下在所研究的溶液中由未结合荧光基团发射的光的 例如组合强度的荧光，并且参数FJT)表示在温度T下由结合至种群i的核酸分子的荧光基 团发射的光的例如组合强度的焚光。换句话说，参数Fo(T)可被认为是代表由未结合焚光基 团的种群发射的光，而参数^(1〇可以被认为是代表由结合到核酸分子种群i的分子的荧光 基团种群发射的光，公式（12)从而将荧光信号F(T)估计或表示为两个或多个信号分量的总 和。因此，公式（12)建模在给定温度下整体熔解曲线的荧光信号描述，其是第一信号分量和 一组第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由未结合荧光基团发射的 组合光强度，每个第二信号分量表示在给定温度下由结合到相应种群的核酸分子的荧光基 团发射的组合光强度。公式(12)可以被写为
[0110]
(13)
[0111]其中参数n〇(T)表示在温度T未结合荧光基团的相对数量，参数m(T)代表在温度T 结合到种群i的核酸分子的荧光基团的相对数量，参数/函数n〇,tclt(T)表示在温度τ单个未结 合荧光基团的平均发射效率，并且参数/函数ru.tcWT)代表在温度T结合到种群i的核酸分子 的单个荧光基团的平均发射效率。公式（13)可被认为提供第一信号分量，其是第一项n〇(T) 和第二项ηο,Μ(Τ)的乘积，并提供各第二信号分量，其是各第三项m(T)和各第四项ru,tclt(T) 的乘积。
[0112] 未结合荧光基团的数量η〇(Τ)和结合到核酸分子的荧光基团数量m(T)是相对的， 因为它们并不一定需要指示荧光基团的实际相应数量，但n〇(T)和m(T)的值足以指示未结 合荧光基团的实际数量和结合到所述一个或多个核酸分子种群的每个的荧光基团的实际 数量的比值一或以另一种方式，指示未结合荧光基团的实际数量和结合到所述一个或多个 核酸分子种群的每个的荧光基团的实际数量，相对于荧光基团的总体数量n tclt的比值。因 此，作为一个例子，结合到第一给定种群的核酸分子的荧光基团的相对数量m(T)相对于结 合到第二给定种群的核酸分子的荧光基团的相对数量r^(T)用作在所研究的溶液中第一给 定种群的核酸分子相对于第二给定种群的核酸分子的浓度的指示。
[0113] 如前所述，荧光基团的发射效率可通过合适的温度函数，例如根据公式（1)或（2) 的函数被建模。作为一个例子，如果假设根据公式（1)的模型表不焚光基团的发射效率，公 式（13)可以写为
[0114]
[0115] 公式（14)因此可以被认为是由一个参数函数提供建模公式（13)的第二项的一个 例子，该参数函数是未结合荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，并且将公式（13) 的各第四项建模为相应的参数函数，该参数函数是结合到相应核酸分子种群的荧光基团的 发射效率的描述，其是温度的函数。
[0116] 作为一个例子，如果进一步应用根据公式(8)的模型，其确定为未结合荧光基团的 函数的占用水平nKO/NdT)，将公式(9)代入式(14)，得到：
[0117]
5
[0118] 从而从公式中消除结合在每个核酸分子种群中的荧光基团的相对数量m(T)。因 此，公式（15)可以被认为是将公式（13)的每个第三项建模成为在给定温度下用于核酸分子 各种群的结合位置的总体数量和所述结合位置的总体数量的占用水平描述的参数函数值 的乘积的一个例子，该参数函数是溶液中未结合荧光基团的相对数量的函数。
[0119] 此外，由于用于给定核酸分子种群的结合位置的总体数量可以如前文所述被建 模，例如，其可以用公式(5)替代Ni(T)，以改写式(15)为
[0120]
[0121]因此，公式（16)用作一个例子，其将用于公式（15)的给定核酸分子种群的结合位 置的总体数量建模为参数函数，该参数函数是各种群的核酸分子的熔解概率的描述，其是 温度的函数。
[0122] 将熔解曲线数据表示为温度函数的荧光信号F(T)可以基于在感兴趣的温度范围 内的多个测量，其中所测量的信号KT)可能涉及不准确性和可能甚至测量误差。作为一个 例子，该荧光信号F(T)可基于公式(17)得到。
[0123] I(T)=A · F(T)+B (17)
[0124] 其中项A是调整因子并且项B是偏移，从而提供线性失真的示例性模型。例如，调整 因子A和偏移B可能由以下原因引起，所采用的用于测量荧光信号F(T)的设备的特性，诸如 光检测器性质，所采用的作为设备的一部分的可能的放大器的增益，所采用的作为设备的 一部分的模拟-数字转换器的特性等。因此，某些校正和/或补偿可以被进行以补偿和/或最 小化所测量的信号失真的影响，以便基于测量信号KT)获得荧光信号F(T)。因此，由于校正 和/或补偿可能影响荧光信号F(T)的绝对值，服从例如基于公式（12)至（16)中的一个的建 模的荧光信号F(T)可以是标准化的荧光信号F n_(T)。标准化可能涉及例如在给定的参考 温度，将标准化的荧光信号Fn_(T)的值设置为给定的参考值，例如设为值1，并且例如根据 公式（18)，相应地使荧光信号F(T)的其金倌标准化。
[0125] t 、 (18)
[0126] 因为它通常足以考虑跨越感兴趣的温度范围的相对荧光，为了确定核酸分子种群 的相对浓度和/或所采用的荧光基团的温度相关行为，应用标准化的荧光信号F n〇rm(T)代替 (近似)荧光信号F(T)，所述F(T)是基于对所测量的信号I(T)施加校正和/或补偿获得的，在 这方面不影响建模的结果。
[0127] 尽管在这里在公式（17)的上下文中被描述，标准化可被应用于任何荧光信号，例 如应用于基于不同的、可能的非线性、失真模型获得的荧光信号，或甚至通过未知推导手段 获得的荧光信号。此外，标准化可以利用不同于公式(18)中的例举的参考温度和/或通过使 用不同标准化方案进行。
[0128] 鉴于上述情况，由公式（12)在概念层次描述的熔解模型和在公式（13)至（16)中采 用各种例举的进一步层次的细节可被用于溶液的熔解曲线分析，所述溶液包括核酸分子的 一个或多个种群和恒定数量的至少单一类型的荧光基团。
[0129] 作为一个例子，图9描绘了流程图，其示出了用于分析熔解曲线的方法900,其表征 溶液的熔解，所述溶液包括一种或多种类型的核酸分子和恒定数量的至少第一类型的荧光 基团。方法900包括如步骤910中所指出的获得熔解在感兴趣的温度范围内的熔解曲线数据 的荧光信号描述。荧光信号表示由所述第一类型的荧光基团发射的光的强度，其是温度的 函数。方法900还包括按照如通过公式（13)至（16)中的一个所描述的熔解模型，在感兴趣的 温度范围内的多个温度下，建模所获得的荧光信号，如方框920所示。也就是说，由公式（13) 至（16)所述的熔解模型被应用于估计或表示荧光信号。方法900还包括利用数值分析确定 所应用的熔解模型的项或其参数的值，以表征熔解的各分量，如方框930所示。方法900可以 进一步包括输出数值分析的结果，例如提供该结果以将其显示在仪器的显示装置上，或提 供该结果用于存储在该装置的存储器中，以用于在该装置或另一装置中的随后进一步使 用。可能被应用于执行在方框910,920和930中所示的过程的功能、操作和/或程序的非限制 性实例将在下文中被描述。
[0130]获得荧光信号(方框910)可以包括，例如，从存储设备，例如从计算机的存储器中 读取预组成的荧光信号。作为另一实例，获得荧光信号可包括将所研究的溶液暴露于感兴 趣的温度范围内的多个温度，而在同一时间使用合适波长的光激发溶液，以使其中的荧光 基团在一个波长发射光，该波长是所采用的荧光基团的类型的特征，并捕获代表所发出的 光的信号，作为熔解曲线数据的荧光信号描述。作为进一步的例子，该荧光信号可通过将也 是熔解曲线数据的描述的另一种类型的源信号，转换成(直接)代表由所述荧光基团发射的 光的强度的作为温度函数的荧光信号而获得。作为一个例子，该荧光信号可基于作为温度 函数的熔解曲线的负一阶导数的信号描述获得。这样的源信号可被获得作为熔解分析的结 果，因为它将(平均)熔解温度方便地表示为信号中的峰值。
[0131 ]建模所获得的焚光信号(方框920)可包括例如根据公式（12)在多个温度的每一个 下，将荧光信号建模为第一信号分量和一组第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示 在给定温度下由溶液中的所述第一类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信 号分量表示在所述给定温度下由结合到核酸分子相应种群的所述荧光基团发射的组合光 强度。根据公式（13)，第一信号分量可被提供为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在 所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的相对数量，并且所述第二项表示在所述给 定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发射效率。每个第二信号分量被提供为相应的第 三项和相应的第四项的乘积，所述第三项表示在所述给定温度下，结合到核酸分子相应种 群的所述荧光基团的相对数量，并且所述第四项表示在所述给定温度下结合到核酸分子的 相应种群的所述荧光基团的发射效率。而且，根据公式（13)的熔解模型的第二项可例如根 据按照公式（1)或公式(2)的参数函数被进一步建模，根据公式（13)的每个所述第三项可例 如根据公式(9)和可能进一步例如通过公式(5)或公式(7)进一步被建模，这取决于熔解模 型的预期应用和关于熔解模型的项和/或参数的值的可能先验知识。
[0132] 利用数值分析(方框930)可以包括利用数值分析确定在所述多个温度下，所述第 一项、所述第二项、每个所述第三项和每个所述第四项的值，使得所获得的荧光信号和所建 模的荧光信号之间的差满足预定标准。所获得的荧光信号与所建模的荧光信号之间的差满 足预定标准可包括例如差最小化成本函数。如果荧光信号在公式（13)的基础上直接被建 模，在所述多个温度下第一、第二、第三和第四项的值可以直接被确定。如果荧光信号例如 在公式（14)至（16)中的一个的基础上被建模，其中所述第二、第三和第四项中的一个或多 个可基于相应参数函数被建模，为由一个或多个参数函数表示的项确定值可以包括确定相 应参数函数的参数值。
[0133] 在某些情况下，熔解模型的一个或多个参数值是预先知道的。因此，利用数值分析 确定熔解模型的第一、第二、第三和第四项的值可以包括在感兴趣的温度范围内的多个温 度下，将所述项中的至少一个设置为相应的预定值，并采用数值分析确定在所述多个温度 下熔解模型的其它项的值。这因此意味着在熔解模型中代入项和/或参数的预定值，并应用 数值分析导出剩余未知项和/或参数的值。
[0134] 方法900还可以被应用于分析熔解曲线，其表征溶液的熔解，所述溶液还包括恒定 数量的第二类型荧光基团。对于这样的应用，方法900可以进一步包括应用在方框910的上 下文中所描述的过程，以便获得表示由第二类型荧光基团发射的光的强度的第二荧光信 号，应用在方框920的上下文中所描述的过程，以通过采用类似于施加于(第一)荧光信号的 方法来建模第二荧光信号，并应用在方框930的上下文中所描述的过程，以利用数值分析来 确定熔解模型的第一项、第二项、各第三项和各第四项的值，使得所获得的第二荧光信号和 相应的建模的荧光信号之间的差满足预定标准。因此，例如基于第一类型荧光基团或基于 第二类型荧光基团确定的用于第 一、第二、第三和第四项的确定的值的组，可被选择来表示 溶液的熔解，其提供了与相应荧光信号的更好匹配。
[0135] 在下文中，通过描述单个计算或模拟轮，基于例如在示例性方法900的情况下的熔 解模型，提供了熔解特性的计算示例。
[0136] a)通过将所采用版本的熔解模型的所有参数设定为期望的值，开始一轮模拟/计 算。例如，如果应用根据公式（16)的熔解模型，荧光基团的总体数量n tclt，未结合荧光基团的 发射特性的参数描述(nm)，结合到核酸分子的各种群的荧光基团的发射特性的参数描述 (丫：^^丄用于核酸分子的各种群的熔解参数⑴^~几一以及核酸分子种群的总体数 量(N tgt)被设置为期望值。
[0137] b)根据本实例，作为数值分析的第一计算步骤中，在感兴趣的温度范围内作为温 度的函数的结合位置的总体数目NJT)被确定。这例如可以在公式(5)的基础上进行。作为 这方面的一个例子，图10示出了用于溶液的结合位置的相对总体数量化")的曲线描述，所 述溶液包括核酸分子的两个种群(标有"靶Γ和"靶2"，即N tgt = 2)，其中用于核酸分子的两 个种群的熔解参数是
[0138] Tm, i = 75°C，Tm,2 = 90°C，〇1 = 〇2 = l°c，Νι,ο = 1 · 7，N2,o = 1 · 5。
[0139] c)作为该实例接下来的步骤，用于各核酸分子种群的结合位置的计算总体数量化 (T)被采用，其和溶液中的荧光基团的总体数量11_保持恒定，而与温度无关(参照公式(3)) 这一事实的知识一起，来基于公式（10)计算未结合荧光基团的数量n〇(T)。虽然未结合荧光 基团的数量η〇(Τ)在一般的情况下不能使用分析方法基于公式（10)得到解决，本领域中已 知的数值方法，如牛顿迭代，可以被用来确定no (Τ)。因此，使用ntclt，Ni (Τ)，NtgjP γ i的值的 知识，m(T)的值可以例如在公式(9)的基础上被解决。作为这方面的一个例子，图10还示出 了作为温度函数的未结合荧光基团的相对数量n〇(T)的曲线描述。
[0140] d)作为本实施例的最后步骤，第一信号分量Fo(T)，第二信号分量FKT)和所产生的 建模的焚光信号F(T)被确定。这可以被实现，由于发射特性(％，T〇，ru，Ti)的参数描述也被 设置为期望值，相应的发射效率可例如基于公式（1)被确定，并且建模荧光信号分量Fo(T) 和?"! 1)可以根据公式（14)导出。作为这方面的一个例子，建模的荧光信号F(T)可与所得到 的荧光信号进行比较，并且其间的差或相似性可通过使用合适的预定成本函数进行评估。 图11不出了信号分量Fi(T)，其表不由本实例的核酸分子的两个种群的每一个(标记为"革巴 Γ和"靶2"）及其总和（"测量的信号"）所发射的光的组合强度，其中用于核酸分子的两个种 群的熔解参数与图10的情况下相同，并且发射特性的参数描述为1() = 50^1^ = 0.01， =^2=1,111 = 112 = 1^1=12 = 5014 0
[0141] 在上面的例子中，在步骤a)中的设置的期望的参数值可以表示用于熔解模型的各 项和/或参数的已知和因此预定的值，并且因此通过a)至d)的单个模拟/运算轮可足以确定 用于其余项和/或参数的值。
[0142] 作为另一实例，在步骤a)中设置的期望参数值中的一些可以是用于熔解模型的各 项和/或参数的已知和因此预定的参数值，而其它期望的参数值是应用于给定模拟/计算轮 的未知项和/或参数值的候选值。因此，从a)至d)的多个模拟/计算轮可能被需要来测试候 选值的所有期望组合，同时保持已知参数在整个模拟轮中处于它们的预定值，以评估各模 仿的荧光信号F(T)和所观察到的荧光信号之间的匹配。一旦所有期望的组合已被模拟，得 到模仿的荧光信号F(T)与观测到的荧光信号之间的最佳匹配的候选值(和预定参数值）的 组合被选择以代表熔解。
[0143] 作为这方面的一个例子，发射特性(no, TQ，ru，Ti)的参数描述在整个模拟轮可能具 有已知的并且因此预定的值，而其余参数，包括用于核酸分子的各种群的熔解参数(T m,η σηΝΜ)以及核酸分子种群的总体数量Ntgt可能具有由模拟来确定的未知值。作为这方面的 另一个例子，用于核酸分子的各种群的熔解参数 (Tm i，〇i，Ni Q)以及核酸分子种群的总体数 量Ntgt和它们的相对浓度在整个模拟轮中可能具有已知并且因此预定的值，而发射特性 (ri 〇，TQ，rU，Ti)的参数描述可具有由模拟来确定的未知值。在进一步的示例方案中，熔解模 型的所有参数可以被认为是未知参数，可能需要大量模拟/运算轮。
[0144] 在一个情况下，其中熔解模型的多个项或参数具有未知值，可能有利的是，限制各 候选值的范围和/或数量，以减少分析过程的复杂性并增加结束于正确和有意义的结果的 可能性。候选值可在所述情况下例如基于典型值的先验知识被选择。作为另一示例，所观察 到的荧光信号的特性或熔解曲线数据整体可以被用于选择例如用于熔解温度Tmu和熔解宽 度〇 1的候选值的适当范围。作为一个具体的例子，如果假定在图1中所示的整体熔解曲线， 可以看到，由于该整体熔解曲线的急剧下降，核酸分子的一个或多个种群的熔解看起来好 像发生在75°C及其附近，并且更进一步，核酸分子的一个或多个种群的熔解发生在90°C及 其附近。因此，该数值分析可以被限制为例如仅考虑用于参数UP 〇1的值，连同Nu的适当 相应值，其中参数UP〇1的值在75°C附近和90°C附近的适当温度子范围内，并且通过假定 核酸分子的1，2, ...，Nmax种群在两个温度子范围熔解，以避免用于这些参数的值的考虑，这 种考虑看起来无论如何不可能提供具有能观察到荧光信号的适当模型。
[0145]按照本发明的实施例的熔解曲线分析可被使用的一个实际例子是典型的SNP检测 情境，其中所研究的样品可以是对于感兴趣的SNP的纯合或杂合的。在纯合的情况下，基因 组中的靶的两个副本在感兴趣区域是相同的并且靶DNA包括两条互补链。在杂合的情况下， 在感兴趣的区域内存在两种不同类型的序列。最初，当杂合样品未被扩增时，这两个不同的 序列都包括互补链，但在变性和/或扩增后，这四个不同链可以导致两个原始同源双链和两 个新创建的异源双链的不匹配的方式配对。典型的是两异源双链比任一原始同源双链具有 显著降低的T m。因此，有可能的是，当两个不同的异源双链熔解时，四个分离链可以形成两 个同源双链。在根据本发明的实施例的熔解曲线分析方面，这意味着，当两个单独的异源双 链核酸种群熔解时，自由的单链核酸链可以形成具有相应结合位置的两个新型同源双链体 核酸种群。因此，当温度变化时，靶的数量N tgjP所述靶的相应种群可以改变。如果有必要， 根据本发明的实施例的熔解曲线分析可将这种从一个种群到另一个种群的转变纳入考虑。
[0146] 应用于示例性方法900的情况下，例如以实现通过a)至d)的一个或多个模拟/运算 轮的数值分析，基本上可以应用本领域中已知的任何数值分析方法。适用的方法的非限制 性实例包括，Levenberg-Marquardt算法，其也被称为阻尼最小二乘法，高斯-牛顿算法，梯 度下降法，内尔德-米德法，共辄梯度法，随机搜索法等。
[0147] 在根据公式（12)至（16)的任一个的模型的应用中，感兴趣的温度范围优选覆盖从 温度范围的下端到温度范围的上端，该温度范围的下端低于所研究溶液中的任何核酸分子 种群的熔解，该温度范围的上端高于所研究溶液中的任何核酸分子种群的熔解温度。从50 °C延伸到高达100°C的温度范围通常足以覆盖感兴趣的核酸分子种群的熔解行为的分析。 然而，延伸至低于50°C的温度和/或高于100°C的温度的温度范围可以被应用。可替代地，鉴 于熔解行为的预先知识，感兴趣的更集中的温度范围可以被应用。在这方面，感兴趣的温度 范围通常至少覆盖整体熔解曲线的至少陡降部分，其通常表明一个或多个核酸分子种群的 熔解，以保证捕捉完整熔解行为以及因此所研究的溶液中任何熔解基本已发生之前的情 况，以能够确定包括在溶液中的核酸分子种群的初始相对浓度。
[0148] 作为非限制性的进一步的例子，图12示意性地示出了示例性装置1200,其可被用 于实施上文所描述的熔解曲线分析方法900或其变型。该装置1200包括处理器1210和存储 器1220,处理器1210被配置为从存储器1220读取和写入到存储器1220。装置1200还可以包 括通信接口 1230,诸如网络卡或网络适配器，使得能够与一个或多个其它装置进行无线或 有线通信。该装置1200还可以包括用户接口 1240,用于提供数据、命令和/或其它输入到处 理器1210,和/或用于从处理器1210接收数据或其它输出，用户接口 1240包括例如显示器、 一个或多个键、键盘、鼠标或相应定点装置、触摸屏等中的一者或多者。装置1200可以包括 图12的实例中没有示出的其它部件。
[0149] 虽然处理器1210在图12的例子中被提供为单个部件，处理器1210可以被实现为一 个或多个单独的部件。虽然存储器1220被示为单个部件，存储器1220可以被实现为一个或 多个单独的部件，其中的一些或全部可以被集成/可移除和/或可以提供永久/半永久/动 态/高速缓存的存储。
[0150] 该装置1200可以被实施为具有足够处理能力的专用或通用设备。可替代地，装置 1200可以被实施为专用于实施上文所述的熔解曲线分析方法或其变型和与熔解曲线分析 相关的可能方法或功能的装置。
[0151] 存储器1220可以存储计算机程序1250,其包含当被加载到处理器1210并由处理器 1210执行时，控制装置1200的操作的计算机可执行指令。作为实例，计算机程序1250可包括 一个或多个指令的一个或多个序列。该计算机程序1250可以被提供为计算机程序代码。处 理器1210能够通过从存储器1220读取包括在其中的一个或多个指令的一个或多个序列，来 加载和执行该计算机程序1250。一个或多个指令的一个或多个序列可以被配置为，当由一 个或多个处理器执行时，引起装置，例如装置1200,执行上文所描述的熔解曲线分析的方法 或其变型。
[0152] 因此，装置1200可以包括至少一个处理器1210和至少一个存储器1220,其包括用 于一个或多个程序的计算机程序代码，至少一个存储器1220和计算机程序代码，其被配置 为与至少一个处理器1210-起，使装置1200执行上文所述的熔解曲线分析方法或其变型。 [0153]计算机程序1250可以独立于装置被提供，并且该计算机程序1250可以经由任何合 适传输机构在装置1200处被提供。作为一个例子，所述传输机构可以包括至少一个具有存 储于其上的程序代码的计算机可读非暂时性介质，和程序代码，当被装置执行时，其使装置 至少执行处理以实施前述熔解曲线分析方法或其变型。传输机构例如可以是计算机可读存 储介质，计算机程序产品，存储器装置的记录介质，诸如CD-R0M、DVD，相应的光学介质，有形 地体现计算机程序1250的制造制品等。作为进一步的例子，传输机构可以是配置成可靠地 传送计算机程序1250的信号。
[0154] 参照处理器不应被理解为仅包括可编程处理器，而是也可以包括专用电路，诸如 现场可编程门阵列(FPGA)、专用电路(ASIC)，信号处理器等。在前面的描述中描述的特性， 可以明确描述组合之外的组合被应用。虽然功能已经参照某些特征被描述，这些功能可以 通过已经描述的或未描述的其它特征执行。虽然特征已经参照某些实施例被描述，这些特 征也可以存在于已经描述的或未描述的其它实施例中。
[0155] 作为一个例子，本发明的实施例可以适用于促进与癌症的诊断或预知相关的已知 基因组的特定区域内的变体的基因分型。样品DNA将优选进行纯化，之后，它的区域或一部 分将通过使用例如PCR扩增。PCR步骤可以被优化以即使在dsDNA结合荧光基团存在下也发 生，实现实时监测扩增，为内部质量控制检测失效扩增，和熔解分析，而不需要打开该试管 用于任何其它试剂的添加。在PCR步骤后，扩增产物将能够在相同的仪器内，通过运行熔解 曲线分析技术被分析。由于所使用的染料的特性将是已知，根据本发明的实施例的熔解曲 线分析为在扩增样品中识别不同分子的数量和它们的比例提供了有力的工具。除了识别先 前已知的突变变体的存在，按照本发明的实施例的熔解曲线分析也可以应用 于找到先前未 知的也可能相关的变体。而通常所有这样的显示出任何变化的标志的样品将必须用另一种 技术诸如定序进行确认，例如在筛选大量只包括少量具有变化的样本的情况下，按照本发 明的实施例的熔解曲线分析有可能节约成本，因为待测序样品的数量可显著减少。
[0156] 按照本发明的实施例的熔解曲线分析也可实现基于靶定量的熔解曲线。作为一个 例子，基于扩增效率的方法已经在公开号W02010/128206A1中更彻底地被描述，其是在相同 的反应中使用相同的引物被扩增的相同扩增，并且具有几乎相同的序列。在该方法中，靶被 与具有几乎相同的序列的已知量片段混合。扩增后，两个靶的相对数量通过分析熔解曲线 数据进行评估。在W02010/128206A1中，熔解峰值必须相对良好地分离，以允许传统的熔解 曲线分析方法适应两个靶的熔解峰值。同样，标准系列的已知靶比率被需要，以校准分析系 统。相反，当使用根据本发明的实施例的熔解曲线分析用于分析时，具有相关序列的靶的熔 点彼此更接近，使试验的设计更容易。对于W02010/128206A1的方法，具有尽可能相似的序 列也是有利的，因为相似性确保这两个目标相等的扩增效率，即相似的扩增效率对试验是 关键的。将根据本发明的实施例的熔解曲线分析用于量化也将消除为每一个不同类型的试 验运行标准系列的要求。
【主权项】
1. 一种用于分析熔解曲线的方法，所述熔解曲线表征溶液的熔解，所述溶液包含核酸 分子的一个或多个种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团，所述方法包括： 获得在温度范围内熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述荧光基团发射 的作为温度函数的光强度； 在所述温度范围内的多个温度下将所述荧光信号建模成为第一信号分量和一组一个 或多个第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由所述溶液中的所述第 一类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信号分量分别表示在所述给定的温 度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度， 其中，所述第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在所述 给定温度下所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，所述第二项表示在所述给定温度 下所述第一类型的未结合荧光基团的发射效率，并且 其中每个第二信号分量均被提供作为相应的第三项和相应的第四项的乘积，所述第三 项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且所述 第四项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和 利用数值分析来确定在所述多个温度下所述第一项、所述第二项、所述第三项和所述 第四项的值，使得所述荧光信号和模仿的荧光信号之间的差满足预定标准。2. 根据权利要求1所述的方法，其中建模所述荧光信号还包括 将每个所述第三项建模为在所述给定温度下用于相应核酸分子种群的结合位置的总 体数量和第一参数函数的值的乘积，所述第一参数函数是所述结合位置的总体数量的占用 水平的描述，所述第一参数函数是所述溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核 酸分子种群的熔解概率的描述，所述第二参数函数是温度的函数，并且 其中确定每个所述第三项的值包括确定所述第一参数函数和所述第二参数函数的参 数值。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第二参数函数是呈现S形形状的函数。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述第二参数函数被定义为：其中T表示给定的温度，参数N1,〇表示在已经基本上发生任何熔解以前，相应核酸分子 种群的结合位置的总体数量，参数Tm, i表示相应核酸分子种群的平均熔解温度，并且参数〇1 表示用于相应核酸分子种群的熔解宽度，并且其中erf(x)是误差函数。5. 根据权利要求2至4中的任一项所述的方法，其中所述第一参数函数被定义为其中，no表不在溶液中的所述第一类型未结合焚光基团的相对数量，并且参数γ i表不 用于相应核酸分子种群的填充平衡系数。6. 根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中建模所述荧光信号进一步包括： 由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函数是所述第一类型的未结合荧光基 团的发射效率的描述，所述第三参数函数是温度的函数，和 由相应的第四参数函数建模每个所述第四项，所述第四参数函数是结合到相应的核酸 分子种群的所述荧光基团的发射效率的描述，所述第四参数函数是温度的函数， 其中确定用于所述第二项的值包括确定所述第三参数函数的参数值，并且其中确定用 于每个所述第四项的值包括确定用于相应第四参数函数的参数值。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述第三参数函数被定义为：其中参数n〇表示所述第一类型的未结合荧光基团的相对基准发射效率，τ表示给定的温 度，并且参数το表示所述第一类型的未结合荧光基团的温度衰减系数，并且 其中，所述第四参数函数被定义为其中参数m表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对基准发射效率，T表示 给定的温度，并且参数^表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的温度衰减系数。8. 根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中利用数值分析包括 在所述多个温度下将所述项中的至少一项设置为预定值，和 在所述多个温度下采用数值分析确定其它项的值。9. 根据权利要求8所述的方法， 其中所述设置包括将所述第二项和每个所述第四项设置为相应的预定值，并且 其中所述采用包括采用数值分析确定所述第一项和每个所述第三项的值，以能够确定 溶液中的一种或多种核酸分子种群的相对浓度和/或特性。10. 根据权利要求8所述的方法， 其中所述设置包括将所述第一项和每个所述第三项设置为相应的预定值，并且 其中所述采用包括采用数值分析确定所述第二项和每个所述第四项的值，以能够确定 所述第一类型的荧光基团的特性。11. 根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核酸分子 包括源自聚合酶链反应的一种或多种类型的DNA靶序列。12. 根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述第一类型的荧光基团包括下 列多个基团之一：LC Green，LC Green+，Eva Green，SYT09,SYBR Green。13. -种计算机程序，包括一个或多个指令的一个或多个序列，其在由一个或多个处理 器执行时使得装置至少执行根据权利要求1至12中任一项所述的方法。14. 一种计算机程序产品，包括至少一个具有存储在其上的程序代码的计算机可读非 暂时性介质，所述程序代码，当由装置执行时，使所述装置至少执行根据权利要求1至12中 的任一项所述的方法。15. -种用于分析熔解曲线的装置，所述熔解曲线表征溶液的熔解，所述溶液包含核酸 分子的一个或多个种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团，所述装置包括至少一个处 理器和至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于一个或多个程序的计算机程序代 码，所述至少一个存储器和所述计算机程序代码被配置为，与所述至少一个处理器一起，使 所述装置至少执行以下内容： 获得在温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一类型的 焚光基团发射的作为温度函数的光强度， 在所述温度范围内的多个温度下将所述荧光信号建模为第一信号分量和一组一个或 多个第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由所述溶液中的所述第一 类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信号分量分别表示在所述给定的温度 下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度， 其中，所述第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在所述 给定温度下所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，所述第二项表示在所述给定温度 下所述第一类型的未结合荧光基团的发射效率，并且 其中每个第二信号分量被提供作为相应的第三项和相应的第四项的乘积，所述第三项 表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且所述第 四项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和 利用数值分析来确定在所述多个温度下所述第一项、所述第二项、所述第三项和所述 第四项的值，使得第一荧光信号和模仿的荧光信号之间的差满足预定标准。16. 根据权利要求15所述的装置，其中建模所述荧光信号还包括 建模每个所述第三项作为在所述给定温度下用于相应核酸分子种群的结合位置的总 体数量和第一参数函数值的乘积，所述第一参数函数是所述结合位置的总体数量的占用水 平的描述，所述第一参数函数是溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核 酸分子种群的熔解概率的描述，所述第二参数函数是温度的函数，并且 其中确定用于每个所述第三项的值包括确定所述第一参数函数和所述第二参数函数 的参数值。17. 根据权利要求16所述的装置，其中所述第二参数函数是呈现S形形状的函数。18. 根据权利要求17所述的装置，其中所述第二参数函数被定义为其中T表示给定的温度，参数N1,〇表示在已经基本上发生任何熔解以前，相应核酸分子 种群的结合位置的总体数量，参数Tm, i表示相应核酸分子种群的平均熔解温度，并且参数〇1 表示相应核酸分子种群的熔解宽度，并且其中erf(x)是误差函数。19. 根据权利要求17或18所述的装置，其中所述第一参数函数被定义为其中，no表示在溶液中的所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，并且参数丫1表 示用于相应核酸分子种群的填充平衡系数。20. 根据权利要求15至19中的任一项所述的装置，其中建模所述荧光信号还包括 由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函数是所述第一类型的未结合荧光基 团的发射效率的描述，所述第三参数函数是温度的函数，和 由相应的第四参数函数建模每个所述第四项，所述第四参数函数是结合到相应的核酸 分子种群的所述荧光基团的发射效率的描述，所述第四参数函数是温度的函数， 其中确定用于所述第二项的值包括确定所述第三参数函数的参数值，并且其中确定用 于每个所述第四项的值包括确定用于相应第四参数函数的参数值。21. 根据权利要求20所述的装置，其中所述第三参数函数被定义为其中参数n〇表示所述第一类型的未结合荧光基团的相对基准发射效率，τ表示给定的温 度，并且参数το表示所述第一类型的未结合荧光基团的温度衰减系数，并且 其中所述第四参数函数被定义为其中参数m表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对基准发射效率，T表示 给定的温度，并且参数^表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的温度衰减系数。22. 根据权利要求15至21中的任一项所述的装置，其中利用数值分析来确定所述第一 项、所述第二项、所述第三项和所述第四项的值包括 在所述多个温度下将所述项的至少一个设置为预定值，和 在所述多个温度下采用数值分析确定其它项的值。23. 根据权利要求22所述的装置， 其中，所述设置包括将所述第二项和每个所述第四项设置为相应的预定值，并且 其中，所述采用包括采用数值分析确定所述第一项和每个所述第三项的值，以确定溶 液中的一种或多种核酸分子种群的相对浓度和/或特性。24. 根据权利要求22所述的装置， 其中，所述设置包括将所述第一项和每个所述第三项设置为相应的预定值，并且 其中，所述采用包括使用数值分析确定所述第二项和每个所述第四项的值，以确定溶 液中的所述第一类型的荧光基团的特性。
【专利摘要】提供一种用于利用荧光表征具有独特的Tm的诸如PCR产物的核酸分子的高分辨率率熔解曲线分析的方法。所述技术包括将原始熔解曲线数据建模称为至少两个信号分量的总和，第一信号分量表示由未结合/自由荧光基团发射的高强度，并且一个或多个第二信号分量表示由结合到双链DNA的荧光基团发射的组合光强度。数值分析被用来确定有助于总信号的不同分量的值，使得模型尽可能严密地匹配原始荧光数据。该方法使得即使在非饱和燃料浓度下仍能够提高靶合适的混合物的分辨率，因为考虑到从低温双链到在较高温度下熔解的双链的插入染料的再分配效果。
【IPC分类】G06F19/20, C12Q1/68
【公开号】CN105492624
【申请号】CN201380077243
【发明人】T·冯莱伯, J·库克拉, D·科昂
【申请人】恩姆菲舍尔科技公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2013年4月23日
【公告号】EP2989209A1, US20160085908, WO2014174143A1
【专利说明】熔解曲线分析 发明领域
[0001] 本发明涉及熔解曲线分析。具体地，本发明涉及一种方法，一种装置和一种用于分 析熔解曲线数据的信号描述的计算机程序。
[0002] 发明背景
[0003] 熔解曲线分析和高分辨率熔解(HRM)分析通常是用于检测和分析样品中的核酸序 列的存在的方法。通常在核酸的PCR扩增后，正常立即进行分析，并且该分析依赖于作为温 度函数的反应溶液监测荧光。所使用的荧光分子可以是双链D N A结合的荧光基团或荧光标 记探针。
[0004] 通常情况下，对于成功的HRM分析，需要几乎完全饱和的双链DNA结合荧光基团。这 一要求限制了可能的荧光基团的选择，因为其中它们中的许多将需要过高的浓度，而不允 许有效扩增。
[0005] 传统的HRM分析不是很好地适于进行定量分析。例如，在某些情况下，能够定量评 估在多相样品中的突变序列的相对丰度将是有益的。这种类型的信息例如在与癌症和非整 倍体分析相关的所获得单核苷酸多态性(SNP)分析中是有价值的。
[0006] 此外，传统的HRM分辨能力限制了它例如在检测纯合子SNP突变体中的使用，因为 熔解温度的差异是次要的。
【发明内容】
[0007] 因此，本发明的目的是提供一种分析技术，其适合核酸分子的定量分析，并能够以 良好的分辨率(在熔解温度差异方面)进行样品中核酸的检测和/或识别。
[0008] 本发明的目的是通过如由相应的独立权利要求所限定的方法、装置和计算机程序 实现的。
[0009] 在这方面，提供了一种用于分析熔解曲线(melt curve)的新颖方法，其表征溶液 的熔解，该溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。所 述方法包括:获得在一定温度范围内熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述 荧光基团发射的作为温度的函数的光强度;在该温度范围内的多个温度下将荧光信号建模 成为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定温度 下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表示在 给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中，第一 信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型未结 合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发 射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第三项 表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项表示 在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值分析 来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得荧光信号和模型化荧光 信号之间的差满足预定标准。
[0010]该方法可以包括将所述第三项的每一个建模成为在所述给定温度下用于相应核 酸分子种群的结合位置的总体数量和第一参数函数值的乘积，所述第一参数函数是所述结 合位置的总体数量的占用水平的描述，其是溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核酸分 子种群的熔解概率的描述，其是温度的函数，并且其中确定所述第三项的每个的值包括确 定所述第一和第二参数函数的参数值。
[0011]替代地或另外，该方法可包括由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函 数是所述第一类型未结合荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，和由相应的第四 参数函数建模所述第四项的每个，所述第四参数函数是结合到相应的核酸分子种群的所述 荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，其中确定所述第二项的值包括确定所述第 三参数函数的参数值，并且其中确定所述第四项的每个的值包括确定用于相应第四参数函 数的参数值。
[0012] 数值分析可以包括在所述多个温度下将所述项的至少一个设置为预定值，并采用 数值分析来确定在所述多个温度下其它项的值。所述设置可以包括设置所述第二项和每个 所述第四项为各自的预定值，并且所述采用可包括采用数值分析来确定第一项和每个所述 第三项的值，以能够确定溶液中一个或多个核酸分子种群的相对浓度和/或特性。可替代 地，所述设置可以包括设置所述第一项和每个所述第三项为各自的预定值，并且所述采用 可以包括采用数值分析来确定第二项和每个所述第四项的值，以能够确定所述第一类型荧 光基团的特性。
[0013] 所述核酸分子可以包括，例如，源自聚合酶链反应的一种或多种类型的DNA靶序 列，和/或所述荧光基团可包括多个下列荧光基团的一种或多种:LC Green，LC Green+，Eva Green，SYT09，SYBR Green。
[0014] 此外，在这方面，提供一种用于分析熔解曲线的新颖装置，其表征溶液的熔解，该 溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。所述装置包括 至少一个处理器和至少一个存储器，所述存储器包括用于一个或多个程序的计算机程序代 码，至少一个存储器和计算机程序代码，其被配置为，与至少一个处理器一起，使该装置至 少获得在一定温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一类型 荧光基团发射的作为温度的函数的光强度，以在该温度范围内的多个温度下将荧光信号建 模为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定温度 下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表示在 给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中，第一 信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型未结 合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发 射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第三项 表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项表示 在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值分析 来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得第一荧光信号和模型化 荧光信号之间的差满足预定标准。
[0015] 此外，在这方面，提供了一种用于分析熔解曲线的新颖计算机程序，其表征溶液的 熔解，该溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。该计 算机程序包括一个或多个指令的一个或多个序列，当由一个或多个处理器执行时，其使装 置至少获得在一定温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一 类型荧光基团发射的作为温度的函数的光强度，以在该温度范围内的多个温度下将荧光信 号建模为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定 温度下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表 示在给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中， 第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型 未结合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团 的发射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第 三项表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项 表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值 分析来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得第一荧光信号和模 型化荧光信号之间的差满足预定标准。
[0016] 该计算机程序可以体现在易失性或非易失性计算机可读记录介质上，例如作为计 算机程序产品，其包括至少一个具有存储在其上的程序代码的计算机可读非暂时性介质， 当由一个装置执行时，程序代码使该装置至少执行上文描述的用于计算机程序的操作。
[0017] 在本专利申请中提出的本发明的示例性实施例不应被解释为构成所附权利要求 适用性的限制。动词"包括"及其派生词在本专利申请中作为开放性限制被使用，其不排除 还未陈述特征的存在。除非明确声明，下文所描述的特征可以相互自由组合。
[0018] 这被认为是本发明特征的新颖性特征在所附权利要求中被具体阐明。然而，本发 明本身，既涉及它的结构和操作方法，又涉及其附加目的和优点，在结合附图阅读时，从具 体实施例的以下详细描述中将被最佳理解。
【附图说明】
[0019]图1示出了示例性恪解曲线。
[0020] 图2示出了作为时间函数的荧光基团发射效率的例子。
[0021] 图3示意性示出了荧光基团的结合的一个例子。
[0022]图4示出的示例性的熔解曲线。
[0023]图5a示意性地示出了荧光基团在结合状态的变化的一个例子。
[0024]图5b示意性地示出了结合状态的荧光基团的一个例子。
[0025] 图5c示意性地示出了荧光基团在结合状态的变化的一个例子。
[0026] 图5d示意性地示出了结合状态的荧光基团的一个例子。
[0027] 图6示出了作为温度函数的熔解概率的一个例子和作为温度函数的结合位置的总 体数量的一个例子。
[0028] 图7示出了作为温度函数的熔解概率的一个例子和作为温度函数的结合位置的总 体数量的一个例子。
[0029] 图8示出了作为未结合荧光基团数目的函数的结合位置的占用水平的例子。
[0030] 图9示出了根据一个实施例的示例性方法。
[0031] 图10示出了作为温度函数的结合位置相对总体数量的一个例子。
[0032] 图11示出了作为温度函数的两个核酸分子种群的光强度的相对强度的荧光信号 分量描述的一个例子。
[0033]图12示意性示出了根据一个实施例的示例性装置。
【附图说明】
[0034]
[0035] 在本文中，术语荧光基团或荧光基团分子或染料用来指报告分子，其能够在第一 波长范围吸收光能，并且作为响应，在第二波长范围发射光能。
[0036]在本文中，术语核酸分子被用来指DNA分子，RNA分子或它们的组合和/或衍生物。 此外，术语靶可替代地被用来指DNA分子，RNA分子或它们的组合和/或衍生物。
[0037] 在本文中，术语种群被用于指一组类似分子。作为一个例子，术语种群可以用于指 一组相似的核酸分子或一组类似的荧光基团。此外，术语种群或术语子群可以被用来指代 一个子组，例如荧光基团种群的第一和第二子组。结合和未结合的荧光基团是子群的例子。
[0038] 在本文中，术语熔解曲线用来指信号或一组值，其描述在感兴趣的温度范围内作 为温度函数的溶液的熔解表现。作为熔解曲线适用的信号的一个例子是由感兴趣的溶液发 射的光强度的荧光信号描述，其是温度的函数。熔解曲线信号的另一个例子是由包含核酸 和荧光基团的溶液发射的光强度的荧光信号描述，其是温度的函数。该值通常用图形表示。 [0039]在本文中，术语发射效率被用于指信号，例如用作熔解曲线的荧光信号的相对光 强度的幅度或相对幅度。
[0040]单链核酸分子、DNA和RNA，具有与使用核苷酸碱基的固有配对能力的第二链特异 性配对的能力，以形成双链结构。双链核酸分子具有特性变性（即从彼此链解离)温度，其依 赖于链的碱基序列。熔解温度（Tm)是二分之一的特定DNA双链体解离并成为单链DNA的温 度。引物-模板DNA双链体的稳定性也可通过其T m测定。
[0041 ]根据本发明的核酸分子是DNA或RNA或它们的任意组合，核酸优选是双链核酸分 子。在扩增反应或与第二核酸杂交产生双链结构后，单链核酸可以被分析。核酸分子可以是 任何类型的，如基因组DNA，mRNA(信使RNA)或siRNA(小干扰RNA)。核酸可以是天然存在的， 改性的或人造的核酸，其可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)被扩增。核酸分子可以包含， 或由任何类型的改性核酸组成。改性核酸的例子为吗啉代和锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、乙 二醇核酸、苏糖核酸和小沟结合剂。
[0042](待分析的）双链核酸分子可以是一种非扩增双链分子。如果该样品的核酸含量足 够高以允许检测，这是可能的。通常，核酸分子在使用PCR ，优选qPCR进行熔解曲线分析前被 扩增。自1980年以来，PCR已被用于在数个数量级扩增核酸分子，例如DNA和RNA (例如参见 US4683202)。定量实时PCR(qPCR)是在其中荧光染料被用于在每个PCR循环后，检测PCR产物 的量的方法(例如参见US5994056)。实时qPCR是用于基因表达分析的一种非常有效的工具。 它是用于样品中的低丰度mRNA的检测和定量的最灵敏的方法。qPCR的已知应用包括例如验 证微阵列结果，单细胞qRT-PCR，包括基因分型的诊断以及病毒、细菌和寄生虫的检测。RNA 分子使用逆转录PCR(rtPCR)被扩增。定量逆转录PCR(qRT-PCR)在用于试验的起始材料是 RNA时被使用。
[0043] 熔解曲线分析（熔解曲线分析）是加热过程中双链核酸分子的解离特性的评估 (US5871908，US6174670)。随着温度升高，双链开始解离，导致吸收强度的上升。熔解温度 (T m)通常由仪器软件从熔解曲线数据通过绘制对温度的负一阶导数(-dF/dT)计算。该导数 熔解峰是熔解温度的最高点。DNA片段的T m依赖于它的长度、G+C组成、序列、链互补性、浓度 和缓冲区成分，诸如盐、染料和PCR增强剂。
[0044] 高分辨率熔解(HRM)分析使得能基于其序列、长度、G+C含量、和链互补性的微小差 异分析核酸样品。它已被用于一些强大的应用，包括突变发现(基因扫描），杂合性缺失筛 查，DNA指纹识别，SNP基因分型，单倍型区段的表征，DNA甲基化分析，DNA映射，物种鉴定，体 细胞获得突变率，HLA兼容性分型，关联(病例/控制)研究，等位基因在种群中的流行和候选 易感基因的鉴定。
[0045]荧光基团在一个波长吸收光能量，并且作为响应，在另一较长波长重新发射光能 量。每个荧光基团均具有吸收光的不同波长范围，和发射光的另一不同波长范围。此属性使 它们能通过实时PCR仪器和通过其它分析工具和/或分析技术用于PCR产品的特异性检测。 [0046]术语淬灭描述给定荧光基团处理的量子产量的降低，其导致所发射的光的强度降 低。猝灭剂是这样的分子，其可以从荧光基团接受能量，然后消散它，而不必与供体荧光基 团发射相同范围的光(光发射）。这两个分子之间的能量传递被称为FRET(荧光共振能量转 移）。当猝灭剂从极为接近其相应的荧光基团分子被移除，荧光基团分子可以再次释放其额 外的能量作为在其特征波长的荧光。FRET荧光基团对的一些例子是FAM-TAMRA和VIC-TAMRA〇
[0047] 存在两种基本功能类型的荧光基团。第一类型的荧光基团具有结合到双链核酸分 子中的能力。SYBR Green I是这种类型的已知荧光基团的一个例子。它是对于qPRC应用最 常用的荧光基团。这种类型的其它合适的荧光基团包括溴化乙锭、BEB0、B0XT0、LC Green， SYT09和Eva Green。
[0048] 第二类型的荧光基团可被用作附着于短核酸链的标记或标签，通常引物或探针。 这种类型的荧光基团的例子包括FAM、HEX、NED和TAMRA。一些这种类型的荧光基团可被用作 淬灭剂分子。已知猝灭剂分子包括其它焚光基团，其从主焚光基团获取能量并在不同波长 发射，和猝灭剂，其不发射可见光如黑洞猝灭剂(BHQ)产品系列。
[0049]用于qPCR和熔解曲线分析的检测化学物质可分为两个基本组：非特异性化学物 质，其通常检测靶结合染料，如DNA结合染料的荧光，和靶特定化学物质，其通常利用荧光探 针和/或引物。在下文中，DNA被用作靶(或核酸分子)的一个例子，但讨论同样也适用于其它 类型的靶(或核酸分子）。
[0050]几种类型的特异性检测化学物质可商购。它们利用被专门设计用于检测靶DNA序 列的标记寡核苷酸探针。荧光标记或标签是优选的。水解探针是最常用的qPCR探针（如 TaqMan探针），但它们不适于在熔解曲线分析中使用。其它靶特异性检测化学物质，也可以 适用于熔解曲线分析，包括发夹探针(其中的分子信标探针是最流行的），LightUp(照亮)探 针和杂交探针(也称为FRET探针），其包括MGB克制杂交探针(Solaris，Pleiades)。
[0051 ]熔解曲线分析的最简单、成本最低的方法，使用DNA结合荧光基团或用于靶DNA序 列的非特异性检测的其它报告分子。这作为标准引物执行起来既快速又经济，并且可以使 用非特异性染料。使用非特异性检测化学物质，试验的灵敏度和特异性仅由PCR引物来确 定。
[0052]通常，PCR仪器被设置为在PCR扩增后，通过逐渐增加温度和监测作为温度函数的 荧光进行熔解曲线分析。作为另一实例，熔解曲线分析可以在PCR扩增完成之后，通过独立 于PCR仪器的仪器或设备进行。当温度高到足以使双链DNA变性时，荧光发生急剧下降，并且 焚光基团分子被释放。
[0053]基本熔解曲线分析通常用于检查PCR反应的特异性。数据通常例如以0.5°C的温度 增量被收集。由于较低的分辨率要求，基本熔解曲线分析可以在非饱和荧光基团条件下例 如使用SYBRGr een进行。
[0054]在HRM实验中，数据通常以0.2°C和更小的温度增量被收集。以染料为基础的HRM分 析利用DNA结合荧光基团，其可以在饱和条件下被使用，而不抑制DNA聚合酶，例如LC Green 和Eva Green。饱和浓度防止熔解期间染料分子再分配，并提供更好的分辨率。基于探针的 熔解的不同之处只在于，通常，PCR扩增步骤是不对称的，这意味着其中一条链被设计为比 另一条链更有效地扩增。
[0055] 也可以添加非特异性染料(例如Β0ΧΤ0，ΒΕΒ0)到基于探针的qPCR反应中，如例如在 文章"恪角军Combining sequence-specific probes and DNA binding dyes in real-time PCR for specific nucleic acid quantification and melting curve analysis'，， Kristina Lind，Anders Stahlberg ,Neven Zoric，和Mikael Kubista，BioTechniques: 40:315-319，2006年3月。所获得的优点是使用熔解分析检查qPCR反应的特异性的能力，而 不必在qPCR阶段之后单独添加染料。这减少了污染的风险。
[0056] 本发明的实施例使得能够考虑到从第一熔解区域解离的荧光基团的重定位，从而 例如在非饱和条件下能够进行HRM分析。
[0057] 虽然术语种群在本文中主要用于指一组相似的核酸分子或核酸序列，例如，指一 组扩增的DNA或RNA序列，该术语也可以用于指一组其它种类的类似分子。作为术语的用法 的另一个例子，一组相似类型的焚光基团分子可以被称为(单个)种群焚光基团，例如相似 类型的所有荧光基团。作为进一步的例子，荧光基团可以按照它的结合状态被分配为单独 的种群，例如结合到核酸分子的第一种群的荧光基团可以构成荧光基团的第一种群(或第 一子群），结合到核酸分子的第二种群的荧光基团可以被视为构成荧光基团的第二种群(或 第二子群），而未结合荧光基团可被认为是荧光基团的第三种群(或第三子群）。（在这方面， 请参阅下文中荧光基团和它们的结合状态的更详细描述）。
[0058] 图1示出了示例性熔解曲线110。熔解曲线，例如熔解曲线110,是在所感兴趣的温 度范围内在研究中的溶液中的一种或多种核酸分子种群的恪解行为的描述，其中术语种群 是指一组相似的核酸分子。换言之，熔解曲线110描述了溶液作为整体的熔解行为。这种核 酸分子例如可以是由PCR过程产生的DNA革E1序列，如前文所述。核酸分子的进一步例子包括 由其它方法扩增的片段，所述其它方法包括等温扩增，例如从限制性内切酶消化所得的提 取片段和例如从免疫沉淀得到的沉淀片段。
[0059]所研究的溶液中所包括的一个或多个核酸分子种群的每一个均显示出熔解行为， 即其类型和序列的特征。如果溶液包含两个或多个不同序列的核酸分子种群，熔解曲线是 两个或多个核酸分子种群的共同熔解行为的指示，并且在不借助于复杂的分析技术的情况 下，它通常不可能提取特定于任何单个核酸分子种群的熔解曲线。如果溶液包含核酸分子 的单个种群，熔解曲线110可以直接指示单个核酸分子种群的熔解行为。然而，取决于作为 熔解曲线110推导基础应用的其它类型荧光基团或报告分子的特性，描述作为整体的溶液 的熔解行为的熔解曲线110,与特定于包含在溶液中的单个核酸分子种群的熔解曲线之间 的关系在某种程度上可能更复杂。因此，进一步的分析可能被需要，以基于整体熔解曲线 110提取单个核酸分子种群的熔解行为。
[0060] 下文中，为了描述的简洁和清楚，荧光基团分子被简称为荧光基团。在感兴趣的溶 液中的荧光基团可以是未结合于溶液的任何核酸分子的自由荧光基团，即未结合荧光基 团。可替代地，荧光基团可以结合到溶液中的核酸分子中的一个。由荧光基团发射的光通常 取决于其至溶液中的核酸分子的一个的结合，即取决于荧光基团的结合状态。作为一个例 子，未结合双链DNA结合荧光基团以第一光强度发射光，而当它们被结合到双链核酸分子的 种群时，它们以第二光强度发射光，其中第一光强度显著低于第二光强度。第二光强度依赖 于核酸分子中双链区域的量，从而提供了依赖于供相应的荧光基团结合的核酸分子的序 列，其在熔解或再退火过程中可检测。用作本文中的示例的第一和第二光强度和/或由荧光 基团发射的光的波长依赖于所用的荧光基团的特性。第一和第二光强度可以进一步依赖于 环境因素，例如周围溶液的化学组成。
[0061] 熔解曲线110的例子是由感兴趣的溶液发射的光强度的荧光信号描述，其是温度 的函数。适合于表示熔解曲线数据以及因此表示熔解曲线110的荧光信号，熔解可以通过为 所研究的溶液提供已知数量、已知浓度和/或已知体积的特定类型荧光基团分子，并将溶液 的温度从起始温度提高到最终温度，而在同一时间使用第一波长的光激发溶液-特别是其 中的荧光基团，所述第一波长是所使用的荧光基团分子的类型的特征。其结果是，荧光基团 分子以第二波长发射光，所述第二波长是所采用的荧光基团分子的特征。因此，由溶液发射 的光构成荧光信号，所述荧光信号因此是熔解曲线数据的描述。
[0062] 虽然由荧光基团种群发射的光的强度可以是恒定的或基本上恒定，而与温度无 关，通常由荧光基团种群发射的光的强度进一步依赖于温度(并且因而依赖于核酸的解离 状态），例如使得荧光基团种群的有效发射效率随着温度的升高而降低。升高温度意味着溶 液的分子表现出更多的运动，并且因此分子之间碰撞的概率增加。进入激发态的焚光基团 通常导致荧光基团以其波长特性发射光，但碰撞可以通过声子的相互作用提供从激发态的 替代松弛路径，由此导致尽管激发态，荧光基团也不能发光。因此，对于某些荧光基团种群， 增加温度意味着降低发射效率。
[0063] 作为这方面的一个例子，发射效率ru,tot可以表现出随着温度的升高呈指数衰减， 例如根据按照公式(1)的参数函数。
[0064]
( 1 )
[0065]其中参数Hi表示给定荧光基团种群的基准发射效率，T表示温度，并且参数^表示 由于分子间的碰撞，对于给定荧光基团种群的发射效率衰减系数。作为非限制性示例，参数 ^的值可以在从5至5001/°C的范围内。下标i=0的情况下参数表示用于未结合荧光基团种 群的公式（1)的相应参数，而在下标i>0的情况下参数表示用于结合到所感兴趣的溶液中的 核酸分子种群中的一个的荧光基团的公式（1)的相应参数。基准发射效率的值m用于指示 未结合荧光基团种群相较于溶液中的其它荧光基团，即相较于结合到核酸分子种群中的一 个的分子的荧光基团种群的相对发射效率，并且因而它们的绝对值，对于根据公式(1)的发 射效率模型的适用性，通常不是至关重要的。然而，如果这样的信息是可获得的，对于给定 类型的荧光基团和/或对于给定的核酸分子种群，能够使用先验已知的参考值。代替将发射 效率建模为随温度升高的单调指数衰减，衰减可替代地可以例如通过表现出随温度升高单 调减少的线性函数或分段线性函数来建模。按照公式（1)在给定温度下发射效率ru,tot的温 度描述函数的一个例子是由图2中的实线曲线提供的。
[0066] 虽然发射效率随着温度升高的单调衰减可以被认为是几种类型的荧光基团的特 征，某些类型荧光基团的特征可以随温度而变化，并且因此其发射效率可能会表现出对温 度更复杂的依赖性。或者，溶液可含有具有温度有关行为的猝灭剂分子。例如。在低温下猝 灭的荧光基团可以表明发射效率，按照根据公式(2)的参数函数，其是温度的函数。
[0067]
( 2 )
[0068] 其中所述参数τη表示由于分子间的碰撞，对于给定的荧光基团种群的发射效率衰 减系数，并且参数T2i表示由于淬灭发射效率的衰减系数，而公式(2)的其余参数表示与如针 对公式（1)所述相同的物理特性。按照公式(2)在给定温度下发射效率ru, tclt的温度描述的函 数的一个例子是由图2中的虚线曲线提供的。
[0069] 所研究的溶液通常包括一个或多个核酸分子序列的每一个的大量实例，换句话 说，该溶液可被视为包括一个或多个核酸分子种群，每个种群包括大量具有特征序列的相 应核酸分子。一个或多个双链核酸分子种群的每一个包含荧光基团可以结合的结合位置的 总体数量化，其中下标i表示相应的核酸分子种群。通常，对于给定的核酸种群，仅有结合位 置的总体数量化的一部分被占用。所占用的结合位置的数量被表示为m，并且因此占用水平 以rn/Ni表不。
[0070] 当给定的核酸分子种群熔解时，其结合位置的总体数量K随着温度的升高而降 低，并在同一时间给定的核酸分子种群从其结合位置释放荧光基团。因此，给定核酸分子种 群的结合位置的占用水平m/Ni也改变。这种现象在下文中更详细地讨论。从给定核酸分子 种群释放的荧光基团成为未结合荧光基团，结合到溶液的另一核酸分子种群的荧光基团或 结合到溶液的相同核酸种群的另一结合位置的荧光基团。因此，从给定核酸分子释放的荧 光基团从给定核酸分子的结合位置到别的地方改变位置，但不从溶液中消失，因此，溶液中 的荧光基团的总体数量n tclt保持恒定，尽管给定核酸分子群种熔解。因此，在溶液中的荧光 基团的总体数量ntot可以例如由公式(3)表示：
[湖]
⑶
[0072] 其中参数n〇(T)表不在温度T卜浴液中的未结合荧光基团的数量，参数m(T)代表在 温度T下结合到核酸分子种群i的荧光基团的数量，并且参数Ntgt表示在溶液中的核酸分子 种群的总体数量。因此，参数n〇(T)可被认为是未结合荧光基团的种群相对大小的指示，而 参数m(T)可被认为是结合到核酸分子种群i的分子的荧光基团种群的相对大小的指示。
[0073]图3通过在给定温度T下指示未结合荧光基团的种群310,结合到第一种群核酸分 子的荧光基团种群320和结合到第二种群核酸分子的荧光基团种群330示意性示出了此模 型。在该图示中，黑色圆圈表示结合到相应核酸分子种群的荧光基团，而白色圆圈表示在第 一和第二种群320,330的核酸分子内的未占用结合位置。因此根据图3的示例，在给定温度 T，有22个未结合荧光基团，10个结合到第一种群320的核酸分子的16个结合位置的荧光基 团，因而提供10/16 = 0.625的占用水平，以及13个结合到第二种群330的核酸分子的20个结 合位置的荧光基团，从而提供了 13/20 = 0.65的占用水平。
[0074] 图4示出了用于溶液的示例性熔解曲线，所述溶液包括第一种群320和第二种群 330的核酸分子，熔解曲线从50°C延伸至100°C。在温度1^ = 601,并且通常在第一种群320 的核酸分子发生任何熔解之前，结合位置的总体数量和与其结合的荧光基团数量是在图3 的示例中所示的那些，即沁=16，111 = 10，犯=20并且112 = 13。在温度12和/或在温度了2周围， T2是第一种群320的核酸分子的平均熔解温度，由于熔解，第一种群320的核酸分子开始放 松结合位置，即NKhpNKTs)。因此，一些结合到第一种群320的核酸分子的荧光基团成为 未结合焚光基团310,并且它们中一些进一步结合到第二种群330的核酸分子。在温度T2和/ 或温度T 2周围荧光基团结合状态的这种变化在图5a中示意性地被示出。
[0075] 在温度T3,第一种群320的核酸分子已经完全熔解，并且因此失去了所有的结合位 置，= 而在Τ4具有平均熔解温度的第二种群330的核酸分子仍然继续具有初始的 结合位置的总体数量，即Ν 2 = 20,并且在本实施例中，与其结合的荧光基团的数量为η2=17。 在温度Τ3和/或温度Τ3周围的荧光基团的结合状态在图5b中被示意性地示出。
[0076] 此外，在温度T4和/或温度T4周围，T4是第二种群330的核酸分子的平均熔解温度， 第二种群330的核酸分子由于熔解开始放松结合位置，即N 2(T3)>N2(T4)。因此，一些结合到 第二种群330的核酸分子的荧光基团成为未结合荧光基团310。荧光基团的结合状态在温度 Τ4和/或温度T4周围的这种变化在图5c中被示意性地示出。最后，在温度!^，第二种群330的 核酸分子也已经完全熔解并且因此失去了它们的所有结合位置，即Ν 2(Τ5)=0。因此，该溶液 的所有荧光基团都成为未结合荧光基团310。在温度T#P/或温度1~ 5周围的荧光基团的结合 状态在图5d中被示意性地示出。
[0077] 给定的核酸分子种群的熔解过程可以由熔解行为的概率密度函数描述来建模，其 是时间的函数，特别是在熔解温度Tm>1和/或在熔解温度T m>1的周围。作为一个例子，核酸分 子种群i的熔解概率可以被假定遵循正态分布，因此熔解概率可以被表示为温度的函数，成 为高斯概率密度函数
[0078] (4)
[0079] 其中T表示温度，参数NM表示在已经基本上发生任何熔解之前，种群i的核酸分子 的结合位置的总体数量，参数T m>1代表种群i的核酸分子的熔解温度，并且参数〇1代表核酸 分子种群i的熔解宽度。熔解温度T m>1和熔解宽度〇1是表征核酸分子种群的参数，并且因此 这些参数可以例如被用于识别核酸分子种群。
[0080] 因此，用于核酸分子种群i的结合位置的总体数量可以通过累计概率分布来获得
[0081] C 5 )
[0082] 其中erf〇是误差函数，如本领域已知的，其表现出S形。误差函数erf〇被定义为
[0083]
[0084] 根据公式(4)，作为温度函数的熔解概率通过图6中左侧的曲线所示的例子被示 出，其中Tm>1 = 75°C，〇1 = 3°C，而图6中右侧的曲线描绘了相应数量的总体结合位置，根据式 (5)，其是温度的函数。
[0085] 适于建模核酸分子种群i的熔解的概率密度函数的另一实例是逻辑概率分布，其 根据
[0086] ( 6 )[0087] 因此，用于核酸分子种群i的结合位置的总体数量可以通过累计概率分布来获得
[0088] (7)
[0089] 个例子。
[0090] 根据公式(6)，作为温度函数的熔解概率通过图7中左侧的曲线所示的例子被示 出，其中Tm>1 = 75°C，并且〇1 = 3°C，而图7中右侧的曲线描绘了相应数量的总体结合位置，根 据式(7)，其是温度的函数。
[0091] 本文所描述的正态分布和逻辑分布用作合适的概率密度函数的非限制性例子，该 函数可以被应用以基于参数函数建模熔解概率。此外，相应的累计概率分布用作合适的S型 函数的非限制性例子，用于建模结合位置的相应的总体数量，其是温度的函数。在这方面， 概率密度函数可以应用不同于公式(5)和(7)中所采用的S型函数的S型函数，例如累计学生 t分布，反正切，双曲正切以及多个代数函数。因此，已知类型的另一分布或甚至任意分布与 合适的相应累计分布函数一起可以被应用。分布的类型可以是先验已知的，或分布的类型 可基于所测得的数据，例如基于熔解曲线或其导数被确定或近似。
[0092] 如在之前已经简要地指出的，对于种群i的核酸分子，仅结合位置的总体数量化的 一部分被占用。通常，占用水平取决于溶液中的未结合荧光基团数量。因为，如上所述，当温 度达到或超过它们的熔解温度时，溶液中的核酸分子释放荧光基团，并且所述链彼此分离， 溶液中的未结合荧光基团的数量取决于温度，并且因此占用水平mUVNdT)也至少间接地 依赖于温度。作为一个例子，种群i的核酸分子的占用水平ηΚ?/ΝΚΤ)可以使用参数函数被 建模，该参数函数为未结合荧光基团数量的指数函数，
[0093]
( 8 )
[0094] 其中参数n〇(T)表示在温度T溶液中的未结合荧光基团的数量，参数γι代表了用于 种群i的核酸分子的填充平衡系数。填充平衡系数取决于所使用的荧光基团，并且可以因此 独立于核酸分子种群，即公式(8)中的参数丫 1可以由适用于所有核酸分子种群的参数γ来 代替。图8中的实线曲线示出了占用水平ndlO/NdT)的一个例子，根据公式(8)，其是未结合 荧光基团的数量的函数。种群i的核酸分子的占用的结合位置的数量m(T)以及因此与其结 合的荧光基团的数量可以基于公式(8)被解决，其为
[0095：
( 9 )
[0096] 由于在溶液中的荧光基团的总体数量ntclt保持恒定，将公式(9)代入公式(3)能够 通过相应的结合位置的总体数量表示结合到溶液中的各核酸分子种群的荧光基团数量，并 因此将公式(3)重写成
[0097]
( 1〇)
[0098] 作为另一个例子，种群i的核酸分子的占用水平mUVNdT)可以用参数函数来建 模，该参数函数是进一步涉及谐波振荡的未结合荧光基团数量的指数函数，为：
[0099]
[0100] 其中X =。而公式（11)的其它参数在公式(8)的上下文中被描述。图8中的 虚线曲线示出了占用水平rnUVNdT)的一个例子，根据公式（11)，其是未结合荧光基团数 量的函数。因此，公式（11)可通过结合位置的相应总体数量，例如在公式(3)中沿针对公式 (9)如上所示的线，来表达结合到溶液中的各核酸分子种群的荧光基团数量。
[0101] 虽然公式(8)和（11)所提供的参数函数的非限制性示例适于建模占用水平m(T)/ NKT)为未结合荧光基团数量的函数，不同于这些的函数，甚至是任意函数也可以被应用。 [0102]之前的描述已经假设，所研究的溶液设置有单一类型的荧光基团，因此具有依赖 于它们的结合状态的类似行为，并为温度的函数。然而，可以使用两种或更多种不同类型的 荧光基团以获得熔解曲线数据的相应两个或多个荧光信号描述。而根据例如在图3和图5a 至5d的上下文所描述的模型，单个结合位置被假定为能够一次仅结合给定类型的单个荧光 基团，它可以假设单个结合位置能够同时结合不同类型的两个或多个荧光基团。
[0103]优选地，不同类型的荧光基团发射不同波长的光，以有利于源自不同类型的荧光 基团的光之间的区分。此外，不同类型的荧光基团在发射效率上可呈现不同的变化，其是温 度的函数，和/或DNA靶结合位置的占用水平的不同进化，其是在所研究的溶液中的未结合 荧光基团的数量的函数。而荧光基团行为的前一方面可以例如基于公式（1)或(2)被建模， 发射效率模型的参数是针对两种或多种类型的荧光基团中的每一种是不同的。类似地，虽 然核酸分子行为的后一方面可以例如基于公式(8)或（11)被建模，占用水平模型的参数针 对两种或多种类型的荧光基团中的每一种是不同的。因此，使用两种或多种不同类型的荧 光基团用来提供熔解曲线数据的两个或多个荧光信号描述，该荧光信号描述至少部分相互 独立，因此，提高了分析的精度和可靠性。
[0104] 适于建模包含一个或多个核酸分子种群的溶液特性的示例性公式被描述，为了描 述的清楚和简便起见，其使用荧光基团作为报告分子的一个例子，该荧光基团响应于通过 具有合适特性的光的激发，在其特性波长发射光。但是，在这方面，荧光基团用作合适的报 告分子的非限制性例子。
[0105] 在一般情况下，所研究的溶液可以被提供有任何报告分子，当其结合状态改变时， 其改变其可测量性质中的一个或多个。作为这方面的另一实例，可以应用依赖于其结合状 态改变其电-化学势的报告分子。因此，熔解曲线数据可以由从溶液中测量的电化学势的信 号描述来表示，其是温度的函数。作为进一步的例子，可以应用依赖于其结合状态改变从其 发出的热能的报告分子。因此，熔解曲线数据可以由溶液发射的热能的信号描述来表示，其 是温度的函数。作为再一示 例，可以应用依赖于其结合状态改变报告-靶复合物的质量的报 告分子。因此，熔解曲线数据可以由报告-靶复合物的重量的信号描述来表示，其是温度的 函数。
[0106] 荧光基团的使用可以类似于使用两种或更多种不同类型荧光基团的方式，与不同 类型的报告分子的使用相结合。例如，如果应用两种荧光基团和依赖于它们的结合状态改 变它们的电化学势的标记分子，能够获得由所研究的溶液发射的光的荧光信号描述表示的 第一熔解曲线，其是温度的函数，和由所研究的溶液的电化学势的信号描述表示的第二熔 解曲线，其是温度的函数，两个熔解曲线都作为熔解曲线数据的表示，因此有利于以与仅靠 单一类型的报告分子的情况相比，更准确且可靠的方式分析熔解行为。
[0107] 返回到焚光基团作为报告分子的一个例子，考虑到核酸分子和焚光基团的上述特 性和它们之间的关系，代表在给定温度下的熔解曲线数据的荧光信号F(T)可根据下式被建 模
[_
… (12)
[0109] 其中参数Fo(T)表示在温度T下在所研究的溶液中由未结合荧光基团发射的光的 例如组合强度的荧光，并且参数FJT)表示在温度T下由结合至种群i的核酸分子的荧光基 团发射的光的例如组合强度的焚光。换句话说，参数Fo(T)可被认为是代表由未结合焚光基 团的种群发射的光，而参数^(1〇可以被认为是代表由结合到核酸分子种群i的分子的荧光 基团种群发射的光，公式（12)从而将荧光信号F(T)估计或表示为两个或多个信号分量的总 和。因此，公式（12)建模在给定温度下整体熔解曲线的荧光信号描述，其是第一信号分量和 一组第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由未结合荧光基团发射的 组合光强度，每个第二信号分量表示在给定温度下由结合到相应种群的核酸分子的荧光基 团发射的组合光强度。公式(12)可以被写为
[0110]
(13)
[0111]其中参数n〇(T)表示在温度T未结合荧光基团的相对数量，参数m(T)代表在温度T 结合到种群i的核酸分子的荧光基团的相对数量，参数/函数n〇,tclt(T)表示在温度τ单个未结 合荧光基团的平均发射效率，并且参数/函数ru.tcWT)代表在温度T结合到种群i的核酸分子 的单个荧光基团的平均发射效率。公式（13)可被认为提供第一信号分量，其是第一项n〇(T) 和第二项ηο,Μ(Τ)的乘积，并提供各第二信号分量，其是各第三项m(T)和各第四项ru,tclt(T) 的乘积。
[0112] 未结合荧光基团的数量η〇(Τ)和结合到核酸分子的荧光基团数量m(T)是相对的， 因为它们并不一定需要指示荧光基团的实际相应数量，但n〇(T)和m(T)的值足以指示未结 合荧光基团的实际数量和结合到所述一个或多个核酸分子种群的每个的荧光基团的实际 数量的比值一或以另一种方式，指示未结合荧光基团的实际数量和结合到所述一个或多个 核酸分子种群的每个的荧光基团的实际数量，相对于荧光基团的总体数量n tclt的比值。因 此，作为一个例子，结合到第一给定种群的核酸分子的荧光基团的相对数量m(T)相对于结 合到第二给定种群的核酸分子的荧光基团的相对数量r^(T)用作在所研究的溶液中第一给 定种群的核酸分子相对于第二给定种群的核酸分子的浓度的指示。
[0113] 如前所述，荧光基团的发射效率可通过合适的温度函数，例如根据公式（1)或（2) 的函数被建模。作为一个例子，如果假设根据公式（1)的模型表不焚光基团的发射效率，公 式（13)可以写为
[0114]
[0115] 公式（14)因此可以被认为是由一个参数函数提供建模公式（13)的第二项的一个 例子，该参数函数是未结合荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，并且将公式（13) 的各第四项建模为相应的参数函数，该参数函数是结合到相应核酸分子种群的荧光基团的 发射效率的描述，其是温度的函数。
[0116] 作为一个例子，如果进一步应用根据公式(8)的模型，其确定为未结合荧光基团的 函数的占用水平nKO/NdT)，将公式(9)代入式(14)，得到：
[0117]
5
[0118] 从而从公式中消除结合在每个核酸分子种群中的荧光基团的相对数量m(T)。因 此，公式（15)可以被认为是将公式（13)的每个第三项建模成为在给定温度下用于核酸分子 各种群的结合位置的总体数量和所述结合位置的总体数量的占用水平描述的参数函数值 的乘积的一个例子，该参数函数是溶液中未结合荧光基团的相对数量的函数。
[0119] 此外，由于用于给定核酸分子种群的结合位置的总体数量可以如前文所述被建 模，例如，其可以用公式(5)替代Ni(T)，以改写式(15)为
[0120]
[0121]因此，公式（16)用作一个例子，其将用于公式（15)的给定核酸分子种群的结合位 置的总体数量建模为参数函数，该参数函数是各种群的核酸分子的熔解概率的描述，其是 温度的函数。
[0122] 将熔解曲线数据表示为温度函数的荧光信号F(T)可以基于在感兴趣的温度范围 内的多个测量，其中所测量的信号KT)可能涉及不准确性和可能甚至测量误差。作为一个 例子，该荧光信号F(T)可基于公式(17)得到。
[0123] I(T)=A · F(T)+B (17)
[0124] 其中项A是调整因子并且项B是偏移，从而提供线性失真的示例性模型。例如，调整 因子A和偏移B可能由以下原因引起，所采用的用于测量荧光信号F(T)的设备的特性，诸如 光检测器性质，所采用的作为设备的一部分的可能的放大器的增益，所采用的作为设备的 一部分的模拟-数字转换器的特性等。因此，某些校正和/或补偿可以被进行以补偿和/或最 小化所测量的信号失真的影响，以便基于测量信号KT)获得荧光信号F(T)。因此，由于校正 和/或补偿可能影响荧光信号F(T)的绝对值，服从例如基于公式（12)至（16)中的一个的建 模的荧光信号F(T)可以是标准化的荧光信号F n_(T)。标准化可能涉及例如在给定的参考 温度，将标准化的荧光信号Fn_(T)的值设置为给定的参考值，例如设为值1，并且例如根据 公式（18)，相应地使荧光信号F(T)的其金倌标准化。
[0125] t 、 (18)
[0126] 因为它通常足以考虑跨越感兴趣的温度范围的相对荧光，为了确定核酸分子种群 的相对浓度和/或所采用的荧光基团的温度相关行为，应用标准化的荧光信号F n〇rm(T)代替 (近似)荧光信号F(T)，所述F(T)是基于对所测量的信号I(T)施加校正和/或补偿获得的，在 这方面不影响建模的结果。
[0127] 尽管在这里在公式（17)的上下文中被描述，标准化可被应用于任何荧光信号，例 如应用于基于不同的、可能的非线性、失真模型获得的荧光信号，或甚至通过未知推导手段 获得的荧光信号。此外，标准化可以利用不同于公式(18)中的例举的参考温度和/或通过使 用不同标准化方案进行。
[0128] 鉴于上述情况，由公式（12)在概念层次描述的熔解模型和在公式（13)至（16)中采 用各种例举的进一步层次的细节可被用于溶液的熔解曲线分析，所述溶液包括核酸分子的 一个或多个种群和恒定数量的至少单一类型的荧光基团。
[0129] 作为一个例子，图9描绘了流程图，其示出了用于分析熔解曲线的方法900,其表征 溶液的熔解，所述溶液包括一种或多种类型的核酸分子和恒定数量的至少第一类型的荧光 基团。方法900包括如步骤910中所指出的获得熔解在感兴趣的温度范围内的熔解曲线数据 的荧光信号描述。荧光信号表示由所述第一类型的荧光基团发射的光的强度，其是温度的 函数。方法900还包括按照如通过公式（13)至（16)中的一个所描述的熔解模型，在感兴趣的 温度范围内的多个温度下，建模所获得的荧光信号，如方框920所示。也就是说，由公式（13) 至（16)所述的熔解模型被应用于估计或表示荧光信号。方法900还包括利用数值分析确定 所应用的熔解模型的项或其参数的值，以表征熔解的各分量，如方框930所示。方法900可以 进一步包括输出数值分析的结果，例如提供该结果以将其显示在仪器的显示装置上，或提 供该结果用于存储在该装置的存储器中，以用于在该装置或另一装置中的随后进一步使 用。可能被应用于执行在方框910,920和930中所示的过程的功能、操作和/或程序的非限制 性实例将在下文中被描述。
[0130]获得荧光信号(方框910)可以包括，例如，从存储设备，例如从计算机的存储器中 读取预组成的荧光信号。作为另一实例，获得荧光信号可包括将所研究的溶液暴露于感兴 趣的温度范围内的多个温度，而在同一时间使用合适波长的光激发溶液，以使其中的荧光 基团在一个波长发射光，该波长是所采用的荧光基团的类型的特征，并捕获代表所发出的 光的信号，作为熔解曲线数据的荧光信号描述。作为进一步的例子，该荧光信号可通过将也 是熔解曲线数据的描述的另一种类型的源信号，转换成(直接)代表由所述荧光基团发射的 光的强度的作为温度函数的荧光信号而获得。作为一个例子，该荧光信号可基于作为温度 函数的熔解曲线的负一阶导数的信号描述获得。这样的源信号可被获得作为熔解分析的结 果，因为它将(平均)熔解温度方便地表示为信号中的峰值。
[0131 ]建模所获得的焚光信号(方框920)可包括例如根据公式（12)在多个温度的每一个 下，将荧光信号建模为第一信号分量和一组第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示 在给定温度下由溶液中的所述第一类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信 号分量表示在所述给定温度下由结合到核酸分子相应种群的所述荧光基团发射的组合光 强度。根据公式（13)，第一信号分量可被提供为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在 所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的相对数量，并且所述第二项表示在所述给 定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发射效率。每个第二信号分量被提供为相应的第 三项和相应的第四项的乘积，所述第三项表示在所述给定温度下，结合到核酸分子相应种 群的所述荧光基团的相对数量，并且所述第四项表示在所述给定温度下结合到核酸分子的 相应种群的所述荧光基团的发射效率。而且，根据公式（13)的熔解模型的第二项可例如根 据按照公式（1)或公式(2)的参数函数被进一步建模，根据公式（13)的每个所述第三项可例 如根据公式(9)和可能进一步例如通过公式(5)或公式(7)进一步被建模，这取决于熔解模 型的预期应用和关于熔解模型的项和/或参数的值的可能先验知识。
[0132] 利用数值分析(方框930)可以包括利用数值分析确定在所述多个温度下，所述第 一项、所述第二项、每个所述第三项和每个所述第四项的值，使得所获得的荧光信号和所建 模的荧光信号之间的差满足预定标准。所获得的荧光信号与所建模的荧光信号之间的差满 足预定标准可包括例如差最小化成本函数。如果荧光信号在公式（13)的基础上直接被建 模，在所述多个温度下第一、第二、第三和第四项的值可以直接被确定。如果荧光信号例如 在公式（14)至（16)中的一个的基础上被建模，其中所述第二、第三和第四项中的一个或多 个可基于相应参数函数被建模，为由一个或多个参数函数表示的项确定值可以包括确定相 应参数函数的参数值。
[0133] 在某些情况下，熔解模型的一个或多个参数值是预先知道的。因此，利用数值分析 确定熔解模型的第一、第二、第三和第四项的值可以包括在感兴趣的温度范围内的多个温 度下，将所述项中的至少一个设置为相应的预定值，并采用数值分析确定在所述多个温度 下熔解模型的其它项的值。这因此意味着在熔解模型中代入项和/或参数的预定值，并应用 数值分析导出剩余未知项和/或参数的值。
[0134] 方法900还可以被应用于分析熔解曲线，其表征溶液的熔解，所述溶液还包括恒定 数量的第二类型荧光基团。对于这样的应用，方法900可以进一步包括应用在方框910的上 下文中所描述的过程，以便获得表示由第二类型荧光基团发射的光的强度的第二荧光信 号，应用在方框920的上下文中所描述的过程，以通过采用类似于施加于(第一)荧光信号的 方法来建模第二荧光信号，并应用在方框930的上下文中所描述的过程，以利用数值分析来 确定熔解模型的第一项、第二项、各第三项和各第四项的值，使得所获得的第二荧光信号和 相应的建模的荧光信号之间的差满足预定标准。因此，例如基于第一类型荧光基团或基于 第二类型荧光基团确定的用于第 一、第二、第三和第四项的确定的值的组，可被选择来表示 溶液的熔解，其提供了与相应荧光信号的更好匹配。
[0135] 在下文中，通过描述单个计算或模拟轮，基于例如在示例性方法900的情况下的熔 解模型，提供了熔解特性的计算示例。
[0136] a)通过将所采用版本的熔解模型的所有参数设定为期望的值，开始一轮模拟/计 算。例如，如果应用根据公式（16)的熔解模型，荧光基团的总体数量n tclt，未结合荧光基团的 发射特性的参数描述(nm)，结合到核酸分子的各种群的荧光基团的发射特性的参数描述 (丫：^^丄用于核酸分子的各种群的熔解参数⑴^~几一以及核酸分子种群的总体数 量(N tgt)被设置为期望值。
[0137] b)根据本实例，作为数值分析的第一计算步骤中，在感兴趣的温度范围内作为温 度的函数的结合位置的总体数目NJT)被确定。这例如可以在公式(5)的基础上进行。作为 这方面的一个例子，图10示出了用于溶液的结合位置的相对总体数量化")的曲线描述，所 述溶液包括核酸分子的两个种群(标有"靶Γ和"靶2"，即N tgt = 2)，其中用于核酸分子的两 个种群的熔解参数是
[0138] Tm, i = 75°C，Tm,2 = 90°C，〇1 = 〇2 = l°c，Νι,ο = 1 · 7，N2,o = 1 · 5。
[0139] c)作为该实例接下来的步骤，用于各核酸分子种群的结合位置的计算总体数量化 (T)被采用，其和溶液中的荧光基团的总体数量11_保持恒定，而与温度无关(参照公式(3)) 这一事实的知识一起，来基于公式（10)计算未结合荧光基团的数量n〇(T)。虽然未结合荧光 基团的数量η〇(Τ)在一般的情况下不能使用分析方法基于公式（10)得到解决，本领域中已 知的数值方法，如牛顿迭代，可以被用来确定no (Τ)。因此，使用ntclt，Ni (Τ)，NtgjP γ i的值的 知识，m(T)的值可以例如在公式(9)的基础上被解决。作为这方面的一个例子，图10还示出 了作为温度函数的未结合荧光基团的相对数量n〇(T)的曲线描述。
[0140] d)作为本实施例的最后步骤，第一信号分量Fo(T)，第二信号分量FKT)和所产生的 建模的焚光信号F(T)被确定。这可以被实现，由于发射特性(％，T〇，ru，Ti)的参数描述也被 设置为期望值，相应的发射效率可例如基于公式（1)被确定，并且建模荧光信号分量Fo(T) 和?"! 1)可以根据公式（14)导出。作为这方面的一个例子，建模的荧光信号F(T)可与所得到 的荧光信号进行比较，并且其间的差或相似性可通过使用合适的预定成本函数进行评估。 图11不出了信号分量Fi(T)，其表不由本实例的核酸分子的两个种群的每一个(标记为"革巴 Γ和"靶2"）及其总和（"测量的信号"）所发射的光的组合强度，其中用于核酸分子的两个种 群的熔解参数与图10的情况下相同，并且发射特性的参数描述为1() = 50^1^ = 0.01， =^2=1,111 = 112 = 1^1=12 = 5014 0
[0141] 在上面的例子中，在步骤a)中的设置的期望的参数值可以表示用于熔解模型的各 项和/或参数的已知和因此预定的值，并且因此通过a)至d)的单个模拟/运算轮可足以确定 用于其余项和/或参数的值。
[0142] 作为另一实例，在步骤a)中设置的期望参数值中的一些可以是用于熔解模型的各 项和/或参数的已知和因此预定的参数值，而其它期望的参数值是应用于给定模拟/计算轮 的未知项和/或参数值的候选值。因此，从a)至d)的多个模拟/计算轮可能被需要来测试候 选值的所有期望组合，同时保持已知参数在整个模拟轮中处于它们的预定值，以评估各模 仿的荧光信号F(T)和所观察到的荧光信号之间的匹配。一旦所有期望的组合已被模拟，得 到模仿的荧光信号F(T)与观测到的荧光信号之间的最佳匹配的候选值(和预定参数值）的 组合被选择以代表熔解。
[0143] 作为这方面的一个例子，发射特性(no, TQ，ru，Ti)的参数描述在整个模拟轮可能具 有已知的并且因此预定的值，而其余参数，包括用于核酸分子的各种群的熔解参数(T m,η σηΝΜ)以及核酸分子种群的总体数量Ntgt可能具有由模拟来确定的未知值。作为这方面的 另一个例子，用于核酸分子的各种群的熔解参数 (Tm i，〇i，Ni Q)以及核酸分子种群的总体数 量Ntgt和它们的相对浓度在整个模拟轮中可能具有已知并且因此预定的值，而发射特性 (ri 〇，TQ，rU，Ti)的参数描述可具有由模拟来确定的未知值。在进一步的示例方案中，熔解模 型的所有参数可以被认为是未知参数，可能需要大量模拟/运算轮。
[0144] 在一个情况下，其中熔解模型的多个项或参数具有未知值，可能有利的是，限制各 候选值的范围和/或数量，以减少分析过程的复杂性并增加结束于正确和有意义的结果的 可能性。候选值可在所述情况下例如基于典型值的先验知识被选择。作为另一示例，所观察 到的荧光信号的特性或熔解曲线数据整体可以被用于选择例如用于熔解温度Tmu和熔解宽 度〇 1的候选值的适当范围。作为一个具体的例子，如果假定在图1中所示的整体熔解曲线， 可以看到，由于该整体熔解曲线的急剧下降，核酸分子的一个或多个种群的熔解看起来好 像发生在75°C及其附近，并且更进一步，核酸分子的一个或多个种群的熔解发生在90°C及 其附近。因此，该数值分析可以被限制为例如仅考虑用于参数UP 〇1的值，连同Nu的适当 相应值，其中参数UP〇1的值在75°C附近和90°C附近的适当温度子范围内，并且通过假定 核酸分子的1，2, ...，Nmax种群在两个温度子范围熔解，以避免用于这些参数的值的考虑，这 种考虑看起来无论如何不可能提供具有能观察到荧光信号的适当模型。
[0145]按照本发明的实施例的熔解曲线分析可被使用的一个实际例子是典型的SNP检测 情境，其中所研究的样品可以是对于感兴趣的SNP的纯合或杂合的。在纯合的情况下，基因 组中的靶的两个副本在感兴趣区域是相同的并且靶DNA包括两条互补链。在杂合的情况下， 在感兴趣的区域内存在两种不同类型的序列。最初，当杂合样品未被扩增时，这两个不同的 序列都包括互补链，但在变性和/或扩增后，这四个不同链可以导致两个原始同源双链和两 个新创建的异源双链的不匹配的方式配对。典型的是两异源双链比任一原始同源双链具有 显著降低的T m。因此，有可能的是，当两个不同的异源双链熔解时，四个分离链可以形成两 个同源双链。在根据本发明的实施例的熔解曲线分析方面，这意味着，当两个单独的异源双 链核酸种群熔解时，自由的单链核酸链可以形成具有相应结合位置的两个新型同源双链体 核酸种群。因此，当温度变化时，靶的数量N tgjP所述靶的相应种群可以改变。如果有必要， 根据本发明的实施例的熔解曲线分析可将这种从一个种群到另一个种群的转变纳入考虑。
[0146] 应用于示例性方法900的情况下，例如以实现通过a)至d)的一个或多个模拟/运算 轮的数值分析，基本上可以应用本领域中已知的任何数值分析方法。适用的方法的非限制 性实例包括，Levenberg-Marquardt算法，其也被称为阻尼最小二乘法，高斯-牛顿算法，梯 度下降法，内尔德-米德法，共辄梯度法，随机搜索法等。
[0147] 在根据公式（12)至（16)的任一个的模型的应用中，感兴趣的温度范围优选覆盖从 温度范围的下端到温度范围的上端，该温度范围的下端低于所研究溶液中的任何核酸分子 种群的熔解，该温度范围的上端高于所研究溶液中的任何核酸分子种群的熔解温度。从50 °C延伸到高达100°C的温度范围通常足以覆盖感兴趣的核酸分子种群的熔解行为的分析。 然而，延伸至低于50°C的温度和/或高于100°C的温度的温度范围可以被应用。可替代地，鉴 于熔解行为的预先知识，感兴趣的更集中的温度范围可以被应用。在这方面，感兴趣的温度 范围通常至少覆盖整体熔解曲线的至少陡降部分，其通常表明一个或多个核酸分子种群的 熔解，以保证捕捉完整熔解行为以及因此所研究的溶液中任何熔解基本已发生之前的情 况，以能够确定包括在溶液中的核酸分子种群的初始相对浓度。
[0148] 作为非限制性的进一步的例子，图12示意性地示出了示例性装置1200,其可被用 于实施上文所描述的熔解曲线分析方法900或其变型。该装置1200包括处理器1210和存储 器1220,处理器1210被配置为从存储器1220读取和写入到存储器1220。装置1200还可以包 括通信接口 1230,诸如网络卡或网络适配器，使得能够与一个或多个其它装置进行无线或 有线通信。该装置1200还可以包括用户接口 1240,用于提供数据、命令和/或其它输入到处 理器1210,和/或用于从处理器1210接收数据或其它输出，用户接口 1240包括例如显示器、 一个或多个键、键盘、鼠标或相应定点装置、触摸屏等中的一者或多者。装置1200可以包括 图12的实例中没有示出的其它部件。
[0149] 虽然处理器1210在图12的例子中被提供为单个部件，处理器1210可以被实现为一 个或多个单独的部件。虽然存储器1220被示为单个部件，存储器1220可以被实现为一个或 多个单独的部件，其中的一些或全部可以被集成/可移除和/或可以提供永久/半永久/动 态/高速缓存的存储。
[0150] 该装置1200可以被实施为具有足够处理能力的专用或通用设备。可替代地，装置 1200可以被实施为专用于实施上文所述的熔解曲线分析方法或其变型和与熔解曲线分析 相关的可能方法或功能的装置。
[0151] 存储器1220可以存储计算机程序1250,其包含当被加载到处理器1210并由处理器 1210执行时，控制装置1200的操作的计算机可执行指令。作为实例，计算机程序1250可包括 一个或多个指令的一个或多个序列。该计算机程序1250可以被提供为计算机程序代码。处 理器1210能够通过从存储器1220读取包括在其中的一个或多个指令的一个或多个序列，来 加载和执行该计算机程序1250。一个或多个指令的一个或多个序列可以被配置为，当由一 个或多个处理器执行时，引起装置，例如装置1200,执行上文所描述的熔解曲线分析的方法 或其变型。
[0152] 因此，装置1200可以包括至少一个处理器1210和至少一个存储器1220,其包括用 于一个或多个程序的计算机程序代码，至少一个存储器1220和计算机程序代码，其被配置 为与至少一个处理器1210-起，使装置1200执行上文所述的熔解曲线分析方法或其变型。 [0153]计算机程序1250可以独立于装置被提供，并且该计算机程序1250可以经由任何合 适传输机构在装置1200处被提供。作为一个例子，所述传输机构可以包括至少一个具有存 储于其上的程序代码的计算机可读非暂时性介质，和程序代码，当被装置执行时，其使装置 至少执行处理以实施前述熔解曲线分析方法或其变型。传输机构例如可以是计算机可读存 储介质，计算机程序产品，存储器装置的记录介质，诸如CD-R0M、DVD，相应的光学介质，有形 地体现计算机程序1250的制造制品等。作为进一步的例子，传输机构可以是配置成可靠地 传送计算机程序1250的信号。
[0154] 参照处理器不应被理解为仅包括可编程处理器，而是也可以包括专用电路，诸如 现场可编程门阵列(FPGA)、专用电路(ASIC)，信号处理器等。在前面的描述中描述的特性， 可以明确描述组合之外的组合被应用。虽然功能已经参照某些特征被描述，这些功能可以 通过已经描述的或未描述的其它特征执行。虽然特征已经参照某些实施例被描述，这些特 征也可以存在于已经描述的或未描述的其它实施例中。
[0155] 作为一个例子，本发明的实施例可以适用于促进与癌症的诊断或预知相关的已知 基因组的特定区域内的变体的基因分型。样品DNA将优选进行纯化，之后，它的区域或一部 分将通过使用例如PCR扩增。PCR步骤可以被优化以即使在dsDNA结合荧光基团存在下也发 生，实现实时监测扩增，为内部质量控制检测失效扩增，和熔解分析，而不需要打开该试管 用于任何其它试剂的添加。在PCR步骤后，扩增产物将能够在相同的仪器内，通过运行熔解 曲线分析技术被分析。由于所使用的染料的特性将是已知，根据本发明的实施例的熔解曲 线分析为在扩增样品中识别不同分子的数量和它们的比例提供了有力的工具。除了识别先 前已知的突变变体的存在，按照本发明的实施例的熔解曲线分析也可以应用 于找到先前未 知的也可能相关的变体。而通常所有这样的显示出任何变化的标志的样品将必须用另一种 技术诸如定序进行确认，例如在筛选大量只包括少量具有变化的样本的情况下，按照本发 明的实施例的熔解曲线分析有可能节约成本，因为待测序样品的数量可显著减少。
[0156] 按照本发明的实施例的熔解曲线分析也可实现基于靶定量的熔解曲线。作为一个 例子，基于扩增效率的方法已经在公开号W02010/128206A1中更彻底地被描述，其是在相同 的反应中使用相同的引物被扩增的相同扩增，并且具有几乎相同的序列。在该方法中，靶被 与具有几乎相同的序列的已知量片段混合。扩增后，两个靶的相对数量通过分析熔解曲线 数据进行评估。在W02010/128206A1中，熔解峰值必须相对良好地分离，以允许传统的熔解 曲线分析方法适应两个靶的熔解峰值。同样，标准系列的已知靶比率被需要，以校准分析系 统。相反，当使用根据本发明的实施例的熔解曲线分析用于分析时，具有相关序列的靶的熔 点彼此更接近，使试验的设计更容易。对于W02010/128206A1的方法，具有尽可能相似的序 列也是有利的，因为相似性确保这两个目标相等的扩增效率，即相似的扩增效率对试验是 关键的。将根据本发明的实施例的熔解曲线分析用于量化也将消除为每一个不同类型的试 验运行标准系列的要求。
【主权项】
1. 一种用于分析熔解曲线的方法，所述熔解曲线表征溶液的熔解，所述溶液包含核酸 分子的一个或多个种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团，所述方法包括： 获得在温度范围内熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述荧光基团发射 的作为温度函数的光强度； 在所述温度范围内的多个温度下将所述荧光信号建模成为第一信号分量和一组一个 或多个第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由所述溶液中的所述第 一类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信号分量分别表示在所述给定的温 度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度， 其中，所述第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在所述 给定温度下所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，所述第二项表示在所述给定温度 下所述第一类型的未结合荧光基团的发射效率，并且 其中每个第二信号分量均被提供作为相应的第三项和相应的第四项的乘积，所述第三 项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且所述 第四项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和 利用数值分析来确定在所述多个温度下所述第一项、所述第二项、所述第三项和所述 第四项的值，使得所述荧光信号和模仿的荧光信号之间的差满足预定标准。2. 根据权利要求1所述的方法，其中建模所述荧光信号还包括 将每个所述第三项建模为在所述给定温度下用于相应核酸分子种群的结合位置的总 体数量和第一参数函数的值的乘积，所述第一参数函数是所述结合位置的总体数量的占用 水平的描述，所述第一参数函数是所述溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核 酸分子种群的熔解概率的描述，所述第二参数函数是温度的函数，并且 其中确定每个所述第三项的值包括确定所述第一参数函数和所述第二参数函数的参 数值。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第二参数函数是呈现S形形状的函数。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述第二参数函数被定义为：其中T表示给定的温度，参数N1,〇表示在已经基本上发生任何熔解以前，相应核酸分子 种群的结合位置的总体数量，参数Tm, i表示相应核酸分子种群的平均熔解温度，并且参数〇1 表示用于相应核酸分子种群的熔解宽度，并且其中erf(x)是误差函数。5. 根据权利要求2至4中的任一项所述的方法，其中所述第一参数函数被定义为其中，no表不在溶液中的所述第一类型未结合焚光基团的相对数量，并且参数γ i表不 用于相应核酸分子种群的填充平衡系数。6. 根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中建模所述荧光信号进一步包括： 由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函数是所述第一类型的未结合荧光基 团的发射效率的描述，所述第三参数函数是温度的函数，和 由相应的第四参数函数建模每个所述第四项，所述第四参数函数是结合到相应的核酸 分子种群的所述荧光基团的发射效率的描述，所述第四参数函数是温度的函数， 其中确定用于所述第二项的值包括确定所述第三参数函数的参数值，并且其中确定用 于每个所述第四项的值包括确定用于相应第四参数函数的参数值。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述第三参数函数被定义为：其中参数n〇表示所述第一类型的未结合荧光基团的相对基准发射效率，τ表示给定的温 度，并且参数το表示所述第一类型的未结合荧光基团的温度衰减系数，并且 其中，所述第四参数函数被定义为其中参数m表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对基准发射效率，T表示 给定的温度，并且参数^表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的温度衰减系数。8. 根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中利用数值分析包括 在所述多个温度下将所述项中的至少一项设置为预定值，和 在所述多个温度下采用数值分析确定其它项的值。9. 根据权利要求8所述的方法， 其中所述设置包括将所述第二项和每个所述第四项设置为相应的预定值，并且 其中所述采用包括采用数值分析确定所述第一项和每个所述第三项的值，以能够确定 溶液中的一种或多种核酸分子种群的相对浓度和/或特性。10. 根据权利要求8所述的方法， 其中所述设置包括将所述第一项和每个所述第三项设置为相应的预定值，并且 其中所述采用包括采用数值分析确定所述第二项和每个所述第四项的值，以能够确定 所述第一类型的荧光基团的特性。11. 根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核酸分子 包括源自聚合酶链反应的一种或多种类型的DNA靶序列。12. 根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述第一类型的荧光基团包括下 列多个基团之一：LC Green，LC Green+，Eva Green，SYT09,SYBR Green。13. -种计算机程序，包括一个或多个指令的一个或多个序列，其在由一个或多个处理 器执行时使得装置至少执行根据权利要求1至12中任一项所述的方法。14. 一种计算机程序产品，包括至少一个具有存储在其上的程序代码的计算机可读非 暂时性介质，所述程序代码，当由装置执行时，使所述装置至少执行根据权利要求1至12中 的任一项所述的方法。15. -种用于分析熔解曲线的装置，所述熔解曲线表征溶液的熔解，所述溶液包含核酸 分子的一个或多个种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团，所述装置包括至少一个处 理器和至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于一个或多个程序的计算机程序代 码，所述至少一个存储器和所述计算机程序代码被配置为，与所述至少一个处理器一起，使 所述装置至少执行以下内容： 获得在温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一类型的 焚光基团发射的作为温度函数的光强度， 在所述温度范围内的多个温度下将所述荧光信号建模为第一信号分量和一组一个或 多个第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由所述溶液中的所述第一 类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信号分量分别表示在所述给定的温度 下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度， 其中，所述第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在所述 给定温度下所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，所述第二项表示在所述给定温度 下所述第一类型的未结合荧光基团的发射效率，并且 其中每个第二信号分量被提供作为相应的第三项和相应的第四项的乘积，所述第三项 表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且所述第 四项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和 利用数值分析来确定在所述多个温度下所述第一项、所述第二项、所述第三项和所述 第四项的值，使得第一荧光信号和模仿的荧光信号之间的差满足预定标准。16. 根据权利要求15所述的装置，其中建模所述荧光信号还包括 建模每个所述第三项作为在所述给定温度下用于相应核酸分子种群的结合位置的总 体数量和第一参数函数值的乘积，所述第一参数函数是所述结合位置的总体数量的占用水 平的描述，所述第一参数函数是溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核 酸分子种群的熔解概率的描述，所述第二参数函数是温度的函数，并且 其中确定用于每个所述第三项的值包括确定所述第一参数函数和所述第二参数函数 的参数值。17. 根据权利要求16所述的装置，其中所述第二参数函数是呈现S形形状的函数。18. 根据权利要求17所述的装置，其中所述第二参数函数被定义为其中T表示给定的温度，参数N1,〇表示在已经基本上发生任何熔解以前，相应核酸分子 种群的结合位置的总体数量，参数Tm, i表示相应核酸分子种群的平均熔解温度，并且参数〇1 表示相应核酸分子种群的熔解宽度，并且其中erf(x)是误差函数。19. 根据权利要求17或18所述的装置，其中所述第一参数函数被定义为其中，no表示在溶液中的所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，并且参数丫1表 示用于相应核酸分子种群的填充平衡系数。20. 根据权利要求15至19中的任一项所述的装置，其中建模所述荧光信号还包括 由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函数是所述第一类型的未结合荧光基 团的发射效率的描述，所述第三参数函数是温度的函数，和 由相应的第四参数函数建模每个所述第四项，所述第四参数函数是结合到相应的核酸 分子种群的所述荧光基团的发射效率的描述，所述第四参数函数是温度的函数， 其中确定用于所述第二项的值包括确定所述第三参数函数的参数值，并且其中确定用 于每个所述第四项的值包括确定用于相应第四参数函数的参数值。21. 根据权利要求20所述的装置，其中所述第三参数函数被定义为其中参数n〇表示所述第一类型的未结合荧光基团的相对基准发射效率，τ表示给定的温 度，并且参数το表示所述第一类型的未结合荧光基团的温度衰减系数，并且 其中所述第四参数函数被定义为其中参数m表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对基准发射效率，T表示 给定的温度，并且参数^表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的温度衰减系数。22. 根据权利要求15至21中的任一项所述的装置，其中利用数值分析来确定所述第一 项、所述第二项、所述第三项和所述第四项的值包括 在所述多个温度下将所述项的至少一个设置为预定值，和 在所述多个温度下采用数值分析确定其它项的值。23. 根据权利要求22所述的装置， 其中，所述设置包括将所述第二项和每个所述第四项设置为相应的预定值，并且 其中，所述采用包括采用数值分析确定所述第一项和每个所述第三项的值，以确定溶 液中的一种或多种核酸分子种群的相对浓度和/或特性。24. 根据权利要求22所述的装置， 其中，所述设置包括将所述第一项和每个所述第三项设置为相应的预定值，并且 其中，所述采用包括使用数值分析确定所述第二项和每个所述第四项的值，以确定溶 液中的所述第一类型的荧光基团的特性。
【专利摘要】提供一种用于利用荧光表征具有独特的Tm的诸如PCR产物的核酸分子的高分辨率率熔解曲线分析的方法。所述技术包括将原始熔解曲线数据建模称为至少两个信号分量的总和，第一信号分量表示由未结合/自由荧光基团发射的高强度，并且一个或多个第二信号分量表示由结合到双链DNA的荧光基团发射的组合光强度。数值分析被用来确定有助于总信号的不同分量的值，使得模型尽可能严密地匹配原始荧光数据。该方法使得即使在非饱和燃料浓度下仍能够提高靶合适的混合物的分辨率，因为考虑到从低温双链到在较高温度下熔解的双链的插入染料的再分配效果。
【IPC分类】G06F19/20, C12Q1/68
【公开号】CN105492624
【申请号】CN201380077243
【发明人】T·冯莱伯, J·库克拉, D·科昂
【申请人】恩姆菲舍尔科技公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2013年4月23日
【公告号】EP2989209A1, US20160085908, WO2014174143A1
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