一种与特发性无精子症相关的遗传标记的制作方法
一种与特发性无精子症相关的遗传标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及男性不育症检测领域，尤其涉及一种与特发性无精子症相关的遗传标 记。
【背景技术】
[0002] 全球约有10%~15%的育龄夫妇面临不能生育的问题，其中一半是由于男性不 育。原发性无精子症是造成男性不育的一个非常重要的原因，约影响1%的成年男性。男性 不育发病因素具有复杂性和多样性的特点，包括疾病、营养不良、内分泌紊乱、基因缺陷和 环境因素等，其具体发病机制尚不明确，但从家族病例报道和小鼠模型的研究成果中可以 推断遗传因素起了很大作用。近年来，随着现代分子生物学技术的发展，人们已发现近200 个基因与男性不育症的发生密切相关；采用基因敲除技术，发现近400个基因与小鼠精子 发生密切相关，这些基因的突变、缺失或表达异常，可能是男性不育症发生的重要原因。对 这些突变基因的研究将有助于男性不育症的诊断，也有助于将来在体外受精过程中防止将 遗传缺陷带给下一代。
[0003] 雄激素受体（AR，NCBI Gene ID:367)是一种重要的类固醇激素受体，在男性性分 化和维持正常精子发生过程中发挥关键作用。AR属于核转录因子调控的类固醇激素作用 的家族。AR有4个蛋白结构，包括N末端反式激活结构域（NTD)，DNA结合域（DBD)，铰链区 (HR)和羧基配体结合域（LBD)。它能结合雄激素，包括睾酮⑴和5 α -二氢睾酮（DHT)的 配体结合域，从而介导核易位和AR的转录调节功能。
[0004] 在过去的几年中，确定了一些AR突变或多态性，可以导致或与遗传疾病相关，如 完全或部分雄激素不敏感综合征（CAIS和PAIS)。然而，还需要深入地研究以揭示AR突变 与特发性无精子症（IA)的关系，为特发性无精子症的诊断提供依据和指导。
【发明内容】
[0005] 为了确定IA患者AR基因突变的情况，我们将776例IA患者和709例正常生育男 性的AR基因外显子测序，首次新发现5个错义突变和1个同义突变与IA的发生相关。
[0006] 基于本发明的发现，本发明提供一种与特发性无精子症相关的遗传标记，其位 于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，其中，上述序列的突变位点选自 c. 868T>C、c. 1484G>A、c. 1888C>T、c. 569C>T、c. 616A>G 和 c. 11490T 中的一个或多个。
[0007] 前5个突变位点是错义突变，第6个突变位点是同义突变。
[0008] 上述突变分别是在如SEQ ID NO: 1所示的AR基因序列的编码区的第868位、1484 位、1888 位、569 位、616 位、1279 位和 1149 位。
[0009] 前5个突变位点依次分别对应的氨基酸变化情况是p. C290R、p. S495N、p. R630W、 p. T190I和p. S206G，即第290位氨基酸由C变为R、第495位氨基酸由S变为N、第630位 氨基酸由R变为W、第190位氨基酸由T变为I、第206位氨基酸由S变为G。第6个突变位 点没有对应的氨基酸变化。
[0010] 作为本发明的优选方案，上述序列的突变位点选自c.868T>C、c. 1484G>A和 c. 1888C>T中的一个或多个。
[0011] 作为本发明的优选方案，上述序列的突变位点选自c. 18880T。
[0012] 通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了 AR基因的6个新的突变位点， 构建AR基因野生型及突变体表达质粒转染到细胞内进行研究，通过实验发现其功能有明 显差异，表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生，从而能够通过上述突变 来实现对男性不育症（尤其是特发性无精子症）的诊断检测。
【附图说明】
[0013] 图1为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点测序图谱；
[0014] 图2为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点影响的进化保守性的氨基酸；
[0015] 图3为在AR基因上发现的3个IA病人特异的错义突变的位置；
[0016] 图4为3个AR突变体对下游靶基因 MMTV表达的影响，NC表示阴性对照，WT表示 野生型。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0018] 1实验内容
[0019] 1.1标本的收集
[0020] 本申请人从2007年6月到2011年10月共收集1880例无精子症病人，其中特发 性无精子症病人为776例，我们的筛选标准为：1)随机检查三次精液中无精子；2)生殖系 统或盆腔无阻塞、炎症和损伤；3)无核型异常和Y染色体微缺失，另将709例正常可育男性 (至少育有一个孩子且未行IVF、ICSI、頂SI等人类辅助生殖技术）作为对照进行研究。每 例受试者均认真签署知情同意书，本次研究通过医院伦理委员会的审查批准。
[0021] 1.2外显子测序
[0022] 抽取外周血提取基因组DNA，用枸橼酸钠抗凝管收集研究对象的外周血，迅速置 于-80°C冰箱中备用，用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取外周血DNA。
[0023] 取出5微克基因组DNA送华大基因研究中心（深圳）进行外显子捕获、测序，在特 发性无精子症患者中筛选出AR基因中的9个突变位点中，其中7个错义突变和2个同义突 变，与dbSNP135数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库中的数据相比对，有5种错义突 变和1个同义突变是我们首次发现的新突变。
[0024] 1.3验证错义突变
[0025] 以提取的外周血基因组DNA为模板，使用设计合成的3对引物对仅在特发性无精 子症患者（W320, W691，W530)AR基因存在的3个错义突变位点（c. 868T>C、c. 1484G>A和 c. 1888C>T)进行特异性扩增，AR序列从NCBI数据库中查得（NCBI Gene ID:367)。引物由 Invitrogen公司合成，所合成的3对引物对见表1。
[0026] 表1AR突变位点验证引物
[0027]
[0029] PCR扩增条件为：98°C预变性 2min，然后以 98°C 10s、60°C 30s、72°C 45s 进行 35 个 循环，最后72°C延伸5min。
[0030] DNA电泳：取3 μ 1的PCR产物在1 %琼脂糖凝胶孔中，140V电泳，15min，紫外凝胶 成像系统拍照观察电泳图，确保单一条带，其余PCR产物送上海英潍捷基公司测序，引物对 Primerl、Primer2和Primer3扩增到的PCR产物片段序列分别如序列表中SEQ ID N0:8、 SEQIDN0:9和SEQIDN0:10所示。
[0031] 1. 4 AR突变体表达质粒的构建
[0032] 以 pcDNA3. l_AR(Mou L 等人，Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells. BiolReprod. 2013 Aug 15 ;89 (2) : 32.)为模 板，使用设计合成的3对点突变引物，构建AR的3种突变体表达质粒。引物由Invitrogen 公司合成，所合成的3对点突变引物见表2。
[0033] 表2 AR 3对定点突变引物
[0034]
[0035] 1· 5双荧光素酶报告基因实验
[0036] 1. 5. 1质粒准备
[0037] 野生型 AR 表达载体：pcDNA3· 1-AR WT (WT 组）
[0038] 突变型 AR 表达载体：pcDNA3· 1-AR C29〇R (C29〇R 组）
[0039] pcDNA3. 1-AR S495N(S495N 组）
[0040] pcDNA3. 1-AR R630W(R630W 组）
[0041] 1. 5. 2 HeLa 细胞培养
[0042] 将HeLa细胞用含10%胎牛血清DMEM培养基在37°C、5% 0)2和95%湿度条件下 培养。贴壁细胞在长满瓶底时，用〇. 25%胰蛋白酶消化后按比例进行传代培养。
[0043] 1. 5. 3 HeLa细胞瞬时转染
[0044] 将HeLa细胞接种于24孔板，待细胞贴壁后进行转染，方法参考转染试剂 Lipofectamine? 2000说明书。转染6h后，用移液枪吸弃每孔培养液，每孔再加入新的1640 培养基500 μ 1，减少Lipofectamine? 2000对细胞的毒性。
[0045] 1. 5. 4双荧光素酶报告系统检测转录因子活性
[0046] 1)转染24h后收集细胞，用移液枪吸弃每孔培养液，每孔加入PBS 1ml洗涤2次；
[0047] 2)将 5XPassive Lysis Buffer 稀释成 1 XPassive Lysis Buffer，用移液枪向 每孔加入 100 μ 1 Passive Lysis Buffer ;
[0048] 3)室温下在摇床上裂解细胞15min，用微量移液枪分别吸取每孔细胞裂解液5 μ 1 至一个干净的1. 5mL透明ΕΡ中；
[0049] 4)在避光环境中依次向每个EP管中加入19 μ 1 Luciferase Assay II Buffer后 用单管光度计检测萤火虫荧光照度；
[0050] 5)在避光环境中依次再向每个EP管中加入19 μ 1 STOP Buffer后用单管光度计 检测海肾荧光照度，以萤火虫荧光来校正海肾荧光减少实验误差。测定报告基因的相对活 性。
[0051] 1.6统计学分析
[0052] 所用统计学方法来自于SPSS17. 0软件，每组数据以均数土标准差（X土s)表示， 组间均值的比较采用独立样本t检验，P〈0. 05为有统计学意义。
[0053] 2实验结果
[0054] 2. 1特发性无精子症患者AR基因点突变的鉴定
[0055] 对776例特发性无精子症患者和709例正常可育男性的AR基因的外显子测序 结果分析，如表3所示：AR基因的9个突变均为纯合突变，前7个为错义突变，最后2个 为同义突变。与dbSNP135数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库中的数据相比对， 有 5 个错义突变（c. 868T>C，c. 1484G>A，c. 1888C>T，c. 569C>T，c. 616A>G)和 1 个同义 突变（c. 1149C>T)是我们首次发现的新突变。在709例正常可育男性中有3个错义突变 (c. 868T>C，c. 1484G>A，c. 18880T)和1个同义突变（c. 11490T)是不存在的。我们进一 步用PCR测序验证这3个错义突变，结果如图1所示。
[0056] 在不同物种中AR氨基酸序列的同源性比较显示R630W的突变影响了一个高度 保守的氨基酸（图 2)，图 2 是米用 MegAlign(Demonstration System DNASTAR, Inc.)软 件对不同蛋白进行比对得到的，其中AR蛋白的编号如下：人（human) (NP_000035. 2)， 黑渥渥（chimpanzee) (ΧΡ_009437511· 1)，恒河猴（rhesus) (ΝΡ_001028083· 1)，牛（cow) (ΝΡ_001231056·1)，大鼠（rat)(NP_036634.1)，小鼠（mouse)(NP_038504.1)和鸡 (chicken) (NP_001035179. 1)。图2中方框表示突变的位置，*表示保守序列。
[0057] 基于保守型分析，SIFT和Polyphen 2. 0软件分析的结果显示，R630W的突变可能 影响蛋白的功能（表4)。这3个错义突变的位置如图3所示。
[0058] 表3 AR点突变在特发性无精子症组和正常组中的情况
[0059]
[0060] 注：病人编号以W开头，编号1-7为错义突变，编号8、9为同义突变。
[0061] 表4 SIFT和PolyPhen 2. 0软件预测错义突变对蛋白功能的影响
[0062]
[0063] 注：SIFT得分彡0· 05 :破坏，彡0· 05 :容忍；
[0064] PolyPhen-2:很可能破坏（概率得分>0· 85)，可能破坏（概率得分>0· 15)，良性 (保持）。
[0065] 2. 2 AR突变体功能的变化
[0066] 为了评估我们发现的病人特有的AR错义突变是否影响了其调节功能，我们采用 双焚光素酶报告基因实验，将MMTV_LUC(Mou L等人，Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells.BiolReprod. 2013 Aug 15; 89 (2) : 32)与AR野生型及3种突变体质粒分别共转染到HeLa细胞中，由于AR属于配体依 赖性转录因子，因此我们转染后用雄激素进行处理，将检测到的萤火虫荧光值/海参荧光 值来表示启动子的活性。与野生型AR -致，AR C290R和S495N突变体也可以激活MMTV启 动子的活性，仅AR R630W突变体与野生型有显著差异，不能激活MMTV启动子的活性（见图 4)。这些结果表明，R630W变体抑制AR转录调控活性。
[0067] 2. 3临床信息及激素水平检测
[0068] 带有3个错义突变（c. 868T>C，c. 1484G>A，c. 18880T)的患者进一步进行了阴囊 超声检查，结果显示阴囊睾丸小，具有均匀的回声特性和广泛的低回声；没有观察到固体或 囊性病变。表5总结了这三例患者的临床和激素水平数据。这些患者都没有男性不育症的 家族史。所有AR突变患者均不存在CAIS或PAIS的个人或家族史。
[0069] 表5.带有3个错义突变的患者的临床信息及激素水平检测
[0070] LUU"」 3可祀
[0073] 越来越多的证据表明，AR是调节雄激素应答基因表达的配体依赖性转录因子。雄 激素和AR对男性生精功能和生育能力至关重要。
[0074] 虽然已经报道AR基因有超过700个突变和多态性，只有5突变位于外显子1，并在 无精子症患者有不同程度生精障碍或MAIS。所有这些患者的外生殖器正常，复杂的临床表 现和我们的报告都证实了这个方面。与此同时，雄性AR基因敲除小鼠表现出雌性个体的典 型外观，这类似于一个人雄激素不敏感综合征或睾丸女性化变异小鼠。
[0075] 在本发明的研究中，我们测序了 776个IA患者AR的编码序列。R630W突变定位于 AR的DNA结合结构域，在776例患者中的发现了一个患者有这个突变，但是不存在于709个 生育男性以及报告在公共数据库中的其他个体。使用PolyPhen-2和Sift软件分析R630W 突变，预测有对蛋白质结构会产生影响。此外，AR的氨基酸序列的局部比对分析表明，受影 响的精氨酸残基在多个物种高度保守，包括鸡。这个突变附件的氨基酸都很保守，提示突变 可能对AR的功能有较大的影响。
[0076] 当我们试图评估AR对不育患者的致病作用时，一个关键的问题要解决的是突变 的AR是否影响其转录调节功能。正如预期，我们发现R630W突变影响了 AR对MMTV启动子 的转录调节功能。
[0077] 总之，我们通过大规模并行测序技术确定了 AR基因的七个错义突变和两个同义 突变。通过功能试验表明，R630W突变抑制AR的正常转录调节功能。
[0078] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种与特发性无精子症相关的遗传标记，其特征在于，其位于AR基因的编码区，其 核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，其中，所述序列的突变位点选自c. 868T>C、c. 1484G>A、 c. 1888C>T、c. 569C>T、c. 616A>G和c. 1149C>T中的一个或多个。2. 根据权利要求1所述的遗传标记，其特征在于，所述序列的突变位点选自c. 868 T>C、c. 1484G>A和c. 1888C>T中的一个或多个。3. 根据权利要求1所述的遗传标记，其特征在于，所述序列的突变位点选自c. 1888 C>T〇
【专利摘要】本发明公开了一种与特发性无精子症相关的遗传标记，其位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，其中，所述序列的突变位点选自c.868？T>C、c.1484G>A、c.1888？C>T、c.569？C>T、c.616？A>G和c.1149？C>T中的一个或多个。通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了AR基因的6个新的突变位点，构建AR基因野生型及突变体表达质粒转染到细胞内进行研究，通过实验发现其功能有明显差异，表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生，从而能够通过上述突变来实现对男性不育症（尤其是特发性无精子症）的诊断检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105492631
【申请号】CN201580000583
【发明人】牟丽莎, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年7月1日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及男性不育症检测领域，尤其涉及一种与特发性无精子症相关的遗传标 记。
【背景技术】
[0002] 全球约有10%~15%的育龄夫妇面临不能生育的问题，其中一半是由于男性不 育。原发性无精子症是造成男性不育的一个非常重要的原因，约影响1%的成年男性。男性 不育发病因素具有复杂性和多样性的特点，包括疾病、营养不良、内分泌紊乱、基因缺陷和 环境因素等，其具体发病机制尚不明确，但从家族病例报道和小鼠模型的研究成果中可以 推断遗传因素起了很大作用。近年来，随着现代分子生物学技术的发展，人们已发现近200 个基因与男性不育症的发生密切相关；采用基因敲除技术，发现近400个基因与小鼠精子 发生密切相关，这些基因的突变、缺失或表达异常，可能是男性不育症发生的重要原因。对 这些突变基因的研究将有助于男性不育症的诊断，也有助于将来在体外受精过程中防止将 遗传缺陷带给下一代。
[0003] 雄激素受体（AR，NCBI Gene ID:367)是一种重要的类固醇激素受体，在男性性分 化和维持正常精子发生过程中发挥关键作用。AR属于核转录因子调控的类固醇激素作用 的家族。AR有4个蛋白结构，包括N末端反式激活结构域（NTD)，DNA结合域（DBD)，铰链区 (HR)和羧基配体结合域（LBD)。它能结合雄激素，包括睾酮⑴和5 α -二氢睾酮（DHT)的 配体结合域，从而介导核易位和AR的转录调节功能。
[0004] 在过去的几年中，确定了一些AR突变或多态性，可以导致或与遗传疾病相关，如 完全或部分雄激素不敏感综合征（CAIS和PAIS)。然而，还需要深入地研究以揭示AR突变 与特发性无精子症（IA)的关系，为特发性无精子症的诊断提供依据和指导。
【发明内容】
[0005] 为了确定IA患者AR基因突变的情况，我们将776例IA患者和709例正常生育男 性的AR基因外显子测序，首次新发现5个错义突变和1个同义突变与IA的发生相关。
[0006] 基于本发明的发现，本发明提供一种与特发性无精子症相关的遗传标记，其位 于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，其中，上述序列的突变位点选自 c. 868T>C、c. 1484G>A、c. 1888C>T、c. 569C>T、c. 616A>G 和 c. 11490T 中的一个或多个。
[0007] 前5个突变位点是错义突变，第6个突变位点是同义突变。
[0008] 上述突变分别是在如SEQ ID NO: 1所示的AR基因序列的编码区的第868位、1484 位、1888 位、569 位、616 位、1279 位和 1149 位。
[0009] 前5个突变位点依次分别对应的氨基酸变化情况是p. C290R、p. S495N、p. R630W、 p. T190I和p. S206G，即第290位氨基酸由C变为R、第495位氨基酸由S变为N、第630位 氨基酸由R变为W、第190位氨基酸由T变为I、第206位氨基酸由S变为G。第6个突变位 点没有对应的氨基酸变化。
[0010] 作为本发明的优选方案，上述序列的突变位点选自c.868T>C、c. 1484G>A和 c. 1888C>T中的一个或多个。
[0011] 作为本发明的优选方案，上述序列的突变位点选自c. 18880T。
[0012] 通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了 AR基因的6个新的突变位点， 构建AR基因野生型及突变体表达质粒转染到细胞内进行研究，通过实验发现其功能有明 显差异，表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生，从而能够通过上述突变 来实现对男性不育症（尤其是特发性无精子症）的诊断检测。
【附图说明】
[0013] 图1为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点测序图谱；
[0014] 图2为无精子症患者AR基因的3个错义突变位点影响的进化保守性的氨基酸；
[0015] 图3为在AR基因上发现的3个IA病人特异的错义突变的位置；
[0016] 图4为3个AR突变体对下游靶基因 MMTV表达的影响，NC表示阴性对照，WT表示 野生型。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0018] 1实验内容
[0019] 1.1标本的收集
[0020] 本申请人从2007年6月到2011年10月共收集1880例无精子症病人，其中特发 性无精子症病人为776例，我们的筛选标准为：1)随机检查三次精液中无精子；2)生殖系 统或盆腔无阻塞、炎症和损伤；3)无核型异常和Y染色体微缺失，另将709例正常可育男性 (至少育有一个孩子且未行IVF、ICSI、頂SI等人类辅助生殖技术）作为对照进行研究。每 例受试者均认真签署知情同意书，本次研究通过医院伦理委员会的审查批准。
[0021] 1.2外显子测序
[0022] 抽取外周血提取基因组DNA，用枸橼酸钠抗凝管收集研究对象的外周血，迅速置 于-80°C冰箱中备用，用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取外周血DNA。
[0023] 取出5微克基因组DNA送华大基因研究中心（深圳）进行外显子捕获、测序，在特 发性无精子症患者中筛选出AR基因中的9个突变位点中，其中7个错义突变和2个同义突 变，与dbSNP135数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库中的数据相比对，有5种错义突 变和1个同义突变是我们首次发现的新突变。
[0024] 1.3验证错义突变
[0025] 以提取的外周血基因组DNA为模板，使用设计合成的3对引物对仅在特发性无精 子症患者（W320, W691，W530)AR基因存在的3个错义突变位点（c. 868T>C、c. 1484G>A和 c. 1888C>T)进行特异性扩增，AR序列从NCBI数据库中查得（NCBI Gene ID:367)。引物由 Invitrogen公司合成，所合成的3对引物对见表1。
[0026] 表1AR突变位点验证引物
[0027]
[0029] PCR扩增条件为：98°C预变性 2min，然后以 98°C 10s、60°C 30s、72°C 45s 进行 35 个 循环，最后72°C延伸5min。
[0030] DNA电泳：取3 μ 1的PCR产物在1 %琼脂糖凝胶孔中，140V电泳，15min，紫外凝胶 成像系统拍照观察电泳图，确保单一条带，其余PCR产物送上海英潍捷基公司测序，引物对 Primerl、Primer2和Primer3扩增到的PCR产物片段序列分别如序列表中SEQ ID N0:8、 SEQIDN0:9和SEQIDN0:10所示。
[0031] 1. 4 AR突变体表达质粒的构建
[0032] 以 pcDNA3. l_AR(Mou L 等人，Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells. BiolReprod. 2013 Aug 15 ;89 (2) : 32.)为模 板，使用设计合成的3对点突变引物，构建AR的3种突变体表达质粒。引物由Invitrogen 公司合成，所合成的3对点突变引物见表2。
[0033] 表2 AR 3对定点突变引物
[0034]
[0035] 1· 5双荧光素酶报告基因实验
[0036] 1. 5. 1质粒准备
[0037] 野生型 AR 表达载体：pcDNA3· 1-AR WT (WT 组）
[0038] 突变型 AR 表达载体：pcDNA3· 1-AR C29〇R (C29〇R 组）
[0039] pcDNA3. 1-AR S495N(S495N 组）
[0040] pcDNA3. 1-AR R630W(R630W 组）
[0041] 1. 5. 2 HeLa 细胞培养
[0042] 将HeLa细胞用含10%胎牛血清DMEM培养基在37°C、5% 0)2和95%湿度条件下 培养。贴壁细胞在长满瓶底时，用〇. 25%胰蛋白酶消化后按比例进行传代培养。
[0043] 1. 5. 3 HeLa细胞瞬时转染
[0044] 将HeLa细胞接种于24孔板，待细胞贴壁后进行转染，方法参考转染试剂 Lipofectamine? 2000说明书。转染6h后，用移液枪吸弃每孔培养液，每孔再加入新的1640 培养基500 μ 1，减少Lipofectamine? 2000对细胞的毒性。
[0045] 1. 5. 4双荧光素酶报告系统检测转录因子活性
[0046] 1)转染24h后收集细胞，用移液枪吸弃每孔培养液，每孔加入PBS 1ml洗涤2次；
[0047] 2)将 5XPassive Lysis Buffer 稀释成 1 XPassive Lysis Buffer，用移液枪向 每孔加入 100 μ 1 Passive Lysis Buffer ;
[0048] 3)室温下在摇床上裂解细胞15min，用微量移液枪分别吸取每孔细胞裂解液5 μ 1 至一个干净的1. 5mL透明ΕΡ中；
[0049] 4)在避光环境中依次向每个EP管中加入19 μ 1 Luciferase Assay II Buffer后 用单管光度计检测萤火虫荧光照度；
[0050] 5)在避光环境中依次再向每个EP管中加入19 μ 1 STOP Buffer后用单管光度计 检测海肾荧光照度，以萤火虫荧光来校正海肾荧光减少实验误差。测定报告基因的相对活 性。
[0051] 1.6统计学分析
[0052] 所用统计学方法来自于SPSS17. 0软件，每组数据以均数土标准差（X土s)表示， 组间均值的比较采用独立样本t检验，P〈0. 05为有统计学意义。
[0053] 2实验结果
[0054] 2. 1特发性无精子症患者AR基因点突变的鉴定
[0055] 对776例特发性无精子症患者和709例正常可育男性的AR基因的外显子测序 结果分析，如表3所示：AR基因的9个突变均为纯合突变，前7个为错义突变，最后2个 为同义突变。与dbSNP135数据库、千人基因组数据库和ExAC数据库中的数据相比对， 有 5 个错义突变（c. 868T>C，c. 1484G>A，c. 1888C>T，c. 569C>T，c. 616A>G)和 1 个同义 突变（c. 1149C>T)是我们首次发现的新突变。在709例正常可育男性中有3个错义突变 (c. 868T>C，c. 1484G>A，c. 18880T)和1个同义突变（c. 11490T)是不存在的。我们进一 步用PCR测序验证这3个错义突变，结果如图1所示。
[0056] 在不同物种中AR氨基酸序列的同源性比较显示R630W的突变影响了一个高度 保守的氨基酸（图 2)，图 2 是米用 MegAlign(Demonstration System DNASTAR, Inc.)软 件对不同蛋白进行比对得到的，其中AR蛋白的编号如下：人（human) (NP_000035. 2)， 黑渥渥（chimpanzee) (ΧΡ_009437511· 1)，恒河猴（rhesus) (ΝΡ_001028083· 1)，牛（cow) (ΝΡ_001231056·1)，大鼠（rat)(NP_036634.1)，小鼠（mouse)(NP_038504.1)和鸡 (chicken) (NP_001035179. 1)。图2中方框表示突变的位置，*表示保守序列。
[0057] 基于保守型分析，SIFT和Polyphen 2. 0软件分析的结果显示，R630W的突变可能 影响蛋白的功能（表4)。这3个错义突变的位置如图3所示。
[0058] 表3 AR点突变在特发性无精子症组和正常组中的情况
[0059]
[0060] 注：病人编号以W开头，编号1-7为错义突变，编号8、9为同义突变。
[0061] 表4 SIFT和PolyPhen 2. 0软件预测错义突变对蛋白功能的影响
[0062]
[0063] 注：SIFT得分彡0· 05 :破坏，彡0· 05 :容忍；
[0064] PolyPhen-2:很可能破坏（概率得分>0· 85)，可能破坏（概率得分>0· 15)，良性 (保持）。
[0065] 2. 2 AR突变体功能的变化
[0066] 为了评估我们发现的病人特有的AR错义突变是否影响了其调节功能，我们采用 双焚光素酶报告基因实验，将MMTV_LUC(Mou L等人，Identification of Ube2b as a novel tARget of androgen receptor in mouse sertoli cells.BiolReprod. 2013 Aug 15; 89 (2) : 32)与AR野生型及3种突变体质粒分别共转染到HeLa细胞中，由于AR属于配体依 赖性转录因子，因此我们转染后用雄激素进行处理，将检测到的萤火虫荧光值/海参荧光 值来表示启动子的活性。与野生型AR -致，AR C290R和S495N突变体也可以激活MMTV启 动子的活性，仅AR R630W突变体与野生型有显著差异，不能激活MMTV启动子的活性（见图 4)。这些结果表明，R630W变体抑制AR转录调控活性。
[0067] 2. 3临床信息及激素水平检测
[0068] 带有3个错义突变（c. 868T>C，c. 1484G>A，c. 18880T)的患者进一步进行了阴囊 超声检查，结果显示阴囊睾丸小，具有均匀的回声特性和广泛的低回声；没有观察到固体或 囊性病变。表5总结了这三例患者的临床和激素水平数据。这些患者都没有男性不育症的 家族史。所有AR突变患者均不存在CAIS或PAIS的个人或家族史。
[0069] 表5.带有3个错义突变的患者的临床信息及激素水平检测
[0070] LUU"」 3可祀
[0073] 越来越多的证据表明，AR是调节雄激素应答基因表达的配体依赖性转录因子。雄 激素和AR对男性生精功能和生育能力至关重要。
[0074] 虽然已经报道AR基因有超过700个突变和多态性，只有5突变位于外显子1，并在 无精子症患者有不同程度生精障碍或MAIS。所有这些患者的外生殖器正常，复杂的临床表 现和我们的报告都证实了这个方面。与此同时，雄性AR基因敲除小鼠表现出雌性个体的典 型外观，这类似于一个人雄激素不敏感综合征或睾丸女性化变异小鼠。
[0075] 在本发明的研究中，我们测序了 776个IA患者AR的编码序列。R630W突变定位于 AR的DNA结合结构域，在776例患者中的发现了一个患者有这个突变，但是不存在于709个 生育男性以及报告在公共数据库中的其他个体。使用PolyPhen-2和Sift软件分析R630W 突变，预测有对蛋白质结构会产生影响。此外，AR的氨基酸序列的局部比对分析表明，受影 响的精氨酸残基在多个物种高度保守，包括鸡。这个突变附件的氨基酸都很保守，提示突变 可能对AR的功能有较大的影响。
[0076] 当我们试图评估AR对不育患者的致病作用时，一个关键的问题要解决的是突变 的AR是否影响其转录调节功能。正如预期，我们发现R630W突变影响了 AR对MMTV启动子 的转录调节功能。
[0077] 总之，我们通过大规模并行测序技术确定了 AR基因的七个错义突变和两个同义 突变。通过功能试验表明，R630W突变抑制AR的正常转录调节功能。
[0078] 以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种与特发性无精子症相关的遗传标记，其特征在于，其位于AR基因的编码区，其 核苷酸序列如SEQIDN0:1所示，其中，所述序列的突变位点选自c. 868T>C、c. 1484G>A、 c. 1888C>T、c. 569C>T、c. 616A>G和c. 1149C>T中的一个或多个。2. 根据权利要求1所述的遗传标记，其特征在于，所述序列的突变位点选自c. 868 T>C、c. 1484G>A和c. 1888C>T中的一个或多个。3. 根据权利要求1所述的遗传标记，其特征在于，所述序列的突变位点选自c. 1888 C>T〇
【专利摘要】本发明公开了一种与特发性无精子症相关的遗传标记，其位于AR基因的编码区，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，其中，所述序列的突变位点选自c.868？T>C、c.1484G>A、c.1888？C>T、c.569？C>T、c.616？A>G和c.1149？C>T中的一个或多个。通过大规模测序在特发性无精子症病人中筛选出了AR基因的6个新的突变位点，构建AR基因野生型及突变体表达质粒转染到细胞内进行研究，通过实验发现其功能有明显差异，表明AR基因的上述突变可能导致特发性无精子症的发生，从而能够通过上述突变来实现对男性不育症（尤其是特发性无精子症）的诊断检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105492631
【申请号】CN201580000583
【发明人】牟丽莎, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年7月1日
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