由流动相的双相电解萃取的制作方法
由流动相的双相电解萃取的制作方法
【专利说明】由流动相的双相电解萃取
[0001] 本发明涉及用于从样品中萃取化合物的方法和装置。
【背景技术】
[0002] 通常将使用施加电场以增强从一个相到另外的相的传质的溶剂萃取方法称作"电 解萃取(electroextraction)"。当将电场施加于由低传导性有机相和较高传导性或高传导 性水性相组成的不混溶两相液-液体系时，有机相中带电荷的化合物会快速向水性相迀移。 随着进入水性相，迀移速率剧烈降低，导致界面处分析物浓度。
[0003] 起初，研发电解萃取作为化学工程领域的纯化技术以提高产物收率，参见例如1^_ a-3,841,984和US-A-3,472,080。最近，如例如J .Chromatogr .A 1994,687,333-341 和 Electrophoresis 2010,31,3903-3912中所公开，已将电解萃取为了分析目的进行修改，在 毛细管中将化合物由有机相萃取入水性相。尽管这通常是非常有效的方法，但是其需要将 分析物溶解在有机相中，这将其潜在应用限于具有适当溶解度的分子，并且涉及在分析操 作中额外的稀释步骤，即将样品与有机相混合。
[0004] 在W0-A-2007004892中公开了不同的方法。该文中公开了通过包含固定的有机溶 剂的液体膜，将至少一种电离的或部分电离的有机化合物由第一亲水供体溶液向第二亲水 受体溶液电解辅助萃取的方法。尽管该方法可允许由第一水溶液向第二水溶液萃取含水的 分析物样品，但由于与液体膜相关的运输限制以及人造液体膜区分大部分内源性化合物与 生物基质(这在代谢产物学中是非常不期望的）的事实，膜的存在会仅允许有限数目的化合 物进入受体溶液。另外，装置是复杂的，并且所述膜在单次应用后就需要被丢弃。
[0005] 因为目前的电解萃取装备利用固定体积的双相体系，由于在电解萃取方法期间分 析物的耗竭，所述方法是自限制的。此外，由于在所述方法期间溶剂不能够更新，目前的电 解萃取装备不能够用于连续注射。我们研发了一种芯片，所述芯片使得将分析物从连续地 补充的有机供体溶液有力地电解萃取到小体积的不流动(stagnant)的或流动的水溶液中 成为可能。所述芯片适用于许多溶剂类型，并且不使用凝胶、膜来使得双相流体相容。
[0006] 因此，仍然需要改进电解萃取方法的效率。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及将化合物从移动的流体供体相电解萃取到受体相中的方法，其包括以 下步骤:提供导电供体相，所述导电供体相以第一流速移动并与第一电极导电接触，提供导 电受体相，所述导电受体相与所述供体相直接接触并与所述供体相不混溶，而且所述导电 受体相与第二电极导电接触；以及提供支持性的或限制性的相引导模式（phase guide pattern)，以在供体相与受体相之间保持限定的界面，以及(d)在所述第一电极与所述第二 电极之间施加电场。
[0008] 本发明还涉及用于两相电解萃取的装置，其包括：（i)通道，所述通道用于运输流 体流并具有由通道底(channel floor)和两个通道壁限定的体积;和(ii)第一电极，所述第 一电极用于接触第一相并设置于所述通道壁之一，以及第二电极，所述第二电极用于接触 第二相并设置于与所述第一电极相对的通道壁，以便在与流动方向正交的方向上施加电 场，以及在两个电极上施加电场的设备；以及（iii)轮廓相引导（contour phase guide)，所 述轮廓相引导设置于所述通道底，并在距所述通道壁给定距离处，从入口导管至出口导管 沿着所述底的轮廓设置，所述轮廓相引导通过将相边界的弯月面固定(pinning)在所述相 引导来将至少两个相分离。
【附图说明】
[0009]可以从权利要求书、说明书和附图收集这些和其它特征，各个特征(单独地或以其 子组合的形式)可在本发明的实施方案和其它领域实现，并且可代表在此请求保护的有益 的，独立地可保护的构造。在下文中参照附图更详细地描述本发明的实施方案，其中：
[00?0]图1公开电解萃取芯片的俯视示意图，其包含工艺路线(process line up)和本发 明的优选装置。圆圈处与通道以流体连接的导管未显示。
[0011]图2公开真实的EE芯片的俯视图。EE芯片的特征如下所示（从顶部到底部）：Pt电 极;包含两种不混溶的液体的微通道，其通过微通道基底上的相引导保持在合适的位置，而 两个相具有直接的界面；以及又一个Pt电极。该图显示真实的实例，其中沿不流动的水性 相，以30yL/min的流供给乙酸乙酯结晶紫溶液。图2(A)显示放大2.5倍拍摄的图像。
[0012]获得在OV⑶和80V(C)下，沿不流动的水性相以30yL/min供给的乙酸乙酯结晶紫 溶液的消耗和浓度特征，并还将其在2.5倍放大下显示和对比，以增强可视化。
[0013] 图3说明基于三种酰基肉碱的相对回收、平均值和标准差(在0、100、300和500V萃 取电压以及50、75和100yL/min乙酸乙酯供给速率下获得），最优芯片EE参数的测定。
[0014] 图4显示由芯片EE获得的三个LC-MS色谱图的叠加（overlay)，显示了对于在300V 下由50yL/min流速的EtOAc萃取的多个浓度水平的辛酰基肉碱(a)和月桂酰基肉碱(a)获得 的芯片EE校准线。所有样品包含I OOnM浓度的己酰基肉碱，其用作内标。
[0015] 图5显示通过芯片-EE获得的两种肉碱和肽的MS信号增强。
【发明内容】
[0016] 主题方法能够将化合物从供体相直接分离并萃取到一个或多个受体相中，而不需 要分开两个相的物理障碍，例如凝胶、膜或其它复杂的萃取系统下。这能够简化电解萃取方 法，并允许操作连续或半连续方法，而不是目前已知的分批方法。
[0017] 为了分析目的的电解萃取将液-液萃取(LLE)和电泳二者的特征相结合。电解萃取 能够将离子化合物从有机相高速萃取到水性相中。LLE利用分子的分配系数来将分析物从 有机相转移到水性相中，水性相作为不混溶的溶剂体系的一部分。该萃取方法是费时费力 的，并且难于自动化。此外，特别是对于yL大小的分析物混合物，LLE变得不实用。
[0018] 电解萃取是其中在双相溶剂体系上施加电位的技术。所述双相溶剂体系包含分析 物供体有机溶液和分析物受体水溶液。由电位诱导的电场将带电荷的分析物（阴离子/阳离 子）向水性相驱动。由于低电导，电场非常高，因此有机相中的迀移速率非常高。在水性相 中，由于高电导，带电荷的分析物的迀移速率相对地非常低。这意味着带电荷的分析物会堆 积在紧邻有机/水界面后的非常薄的水层中。
[0019] 优选地，通过不断地更新供体溶液，并保持受体溶液不流动，用电解萃取可获得极 高且选择性的分析物增强因子。
[0020] 与LLE相反，由于所施加的电位使迀移速率增加2个或更多个数量级，并由此降低 迀移时间，电解萃取是更快的技术。
[0021] 由于可在相对短的时间内实现优异的增强因子，所述电解萃取方法完全适合作为 分析少量(smalI plugs)样品材料(例如CE-MS或LC-MS)的样品预处理技术。
[0022] 本发明还有益地涉及装置，优选基于带电荷的分析物的迀移并用于分析物富集的 微流体芯片。
[0023] 主题方法的益处在于溶解在相对大体积有机溶剂(例如所述供体相）中的分析物 以相对高的速度迀移到相对小体积的极性受体相(例如含水溶剂）中，从而在短时间间隔内 极大地提高浓度水平。
[0024]主题方法和装置的重要特征是易于操作以及通过在芯片上提供的相引导技术独 立地处理不混溶的溶剂流的能力。
[0025] 该芯片可利用基于电解萃取的分析物富集，但是也可在轻微改变下使用其它电驱 动溶剂分析物增强技术。
[0026] 所述芯片特别适用于自动化操作，并因此能够显著降低在通过与质谱联用的毛细 管电泳(CE-MS)或与质谱联用的液相色谱分析之前，从样品中选择性浓缩阳离子或阴离子 的操作的劳动强度。
[0027] 在所述方法期间，所述供体相和所述受体相是基本上不混溶的，这是特别重要的， 因为至少供体相以第一流速和流动方向流动通过萃取装置。所述受体相可以第二速率流 动，第二速率可以比所述供体相的流速低。为了实现强富集，所述供体相的速率远高于所述 受体相的速率。所述受体相优选甚至是不流动的，这允许相对大体积的供体相沿靠着小体 积的受体相通过，从而富集萃取到受体相中，或者萃取到供体相和受体相之间的界面中的 化合物。然后可将受体相引入导管，以将其定期或以分批的方式移除，得到大大富集的萃取 物样品，从而能够将供体相中的化合物大大地浓缩。
[002 8] 可通过适当地选择在所述方法条件下相组分的互溶性来方便地改善相之间的分 离，这特别适用于更静态的体系，或者可通过物理措施至少部分在动态体系中实现，例如通 过相引导分离流动的相，如在W0-A-2012120102和/或W0-A-2010086179中公开的。本文中的 术语"不混溶的"意指在方法中，各相保持为分离的相。主题方法中应用的相应理解为将分 析萃取物和可能的改性剂溶解或稳定地分散或乳化的稀释剂，从而形成相。
[0029] 本发明涉及通过使用两个分开的相（即供体相和至少一个受体相）的电解萃取进 行的分离。所述方法可包括多个相(例如三个或更多个相)的电解萃取芯片。
[0030] 本发明的供体相和/或受体相可为适合将分析物样品溶解和/或保持在稳定的分 散体或乳液的任意相。所述供体和/或受体相优选是导电的，更优选在分析物样品的存在 下，例如盐的水溶液。所述相可优选包含单一溶剂或溶剂混合物。
[0031] 在所述方法期间，所述供体相和一个或多个受体相保持不混溶。这意味着至少在 本发明的萃取方法应用的时间范围（timescale)下和应用期间，所述各相保持分离。
[0032] 这可通过在所述方法条件下相组分的不混溶性来方便地实现，这特别适用于更静 态的体系，或者可通过物理措施至少部分地在动态体系中实现，例如通过相引导分离流动 的相，如在 W0-A-2012120102 和/或 W0-A-2010086179 中公开的。
[0033] 当将所述方法与电解萃取前的额外的分离方法组合时，这也可有利地自动进行， 这样的体系是特别有用的。
[0034] 本文中"导电的"应理解为向电场提供足够的导电性，即电流和所述至少一种分析 物化合物可穿过相(包括一个或多个受体相）。穿过相的电流原则上可为不引起不稳定性的 任意电流，不稳定性会损害相之间的界面完整性。认为其优选应在较低的微安培范围，即优 选小于100μΑ，但通常大于Ο.ΟΙμΑ。
[0035] 可实施本发明的方法使得带正电荷或带负电荷的化合物被萃取。尽管这可以通过 转换极性，或者使用两个受体相(每个电极处一个受体相)来实现，所述方法还可以有益地 在不存在电场的情况下，或者其中至少间歇地不施加电场的情况下实施，使得中性分析物 通过分步萃取由供体相向受体相的迀移变得更加显著。以这种方法，带电荷的以及不带电 荷的化合物均可被选择性地或顺序地萃取。
[0036] 因此，本发明的方法还可在至少间歇地不施加电场的情况下实施，使得中性分析 物通过分布萃取由供体相向受体相迀移。
[0037] 供体和/或一个或多个受体相分别与第一和第二电极导电接触。这种接触可有益 地为在各个相和电极之间直接具有液体接触，或优选通过另外的相将电极与供体或受体相 分离。通过该体系（constellation)，避免或至少减少了分析物样品和/或溶剂组分与电极 之间的还原或氧化反应的发生。
[0038] 本发明的方法允许在非常低的电压下进行，并由此降低分析物与电极的不期望的 电化学反应的可能。适合的电极可以是能够向所述相提供电流的任意电极，优选应用适合 的可商购电极，例如铂丝、导电金属涂层、导电塑料或石墨烯复合材料。
[0039] 向电极施加的电压通常可为0.OlV至30000V，更优选0.1 V至10,000V，甚至更优选 0.1 V至1000V，更优选0.1至500V;并且特别优选0.1 V至300V;并且最终电池在0.1至9V运行。 所施加的电压优选可为DC电压。在一些情况中，所施加的电压可为脉冲电压。电压的极化可 取决于要分离的分析物的种类，并且可以变化。
[0040]优选设置第一电极，使得相对于相的流动，可施加基本上与相流动的方向正交的 电场。
[0041 ]所述供体和/或受体相优选是亲水性的，其包含溶剂或溶剂混合物。适合的溶剂包 括水性溶剂、非极性有机溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜DMS0。本发明的方法 中使用的水性溶剂任选地可为水和另外的溶剂的混合物，所述另外的溶剂与水混溶并且在 受体相的有机溶剂中具有低溶解度，从而形成两个分离的相。亲水性溶剂还可包括与亲水 性有机溶剂混合的水，其中所述有机溶剂可以0-100重量％，更优选0-50重量％，并且更优 选0-20重量％存在。此外，可加入适合的亲水性有机溶剂，其优选与供体或受体相在至多某 水平下混溶。
[0042]优选的亲水性有机溶剂的实例为甲醇、乙醇、乙腈和DMS0。
[0043] 如本申请上下文中使用的术语"受体相"是适合接受化合物的相。
[0044] 至少所述供体相可优选具有这样的PH，在所述pH下，至少部分分析物被部分或完 全离子化。这可通过加入适合的酸或碱来实现，这是本领域公知的。
[0045] 适合的酸可为可将供体溶液的pH调节至1-7的pH范围内的水平的任意酸，由此带 有碱性基团的有机化合物被离子化为阳离子。相应地，适合的碱可为可将供体溶液的PH调 节至7-14的pH范围内的水平的任意碱，由此带有酸性基团的有机化合物被离子化为阴离 子。适合的酸的实例为耶1、冊心!^00!1、0^00!1、!123〇4和113?〇4。适合的碱的实例为似0!1、 Na2CO3、NaHCO3 和 NH3。
[0046] 适合的溶剂还可包括压缩气体，例如丙烷或二氧化碳，其可在亚临界、近临界或超 临界相范围内使用。为了调节这些压缩气体的性质，可任选地加入共溶剂例如乙醇。优选使 用不具有或仅具有轻微毒性或其它生理学上不利效果的溶剂。其它溶剂可包括硅油。
[0047] 其它适合的溶剂包括离子液体。本文中的术语"离子液体"是指在宽温度范围（包 括室温)下为液体的盐。现有技术中已描述离子液体，包括手性的、氟化的以及抗菌的离子 液体。可使离子液体的性能适用于具体应用，并且离子液体可以是有机溶剂的环境友好的 替代物。离子液体可降低成本，处理要求以及与挥发性有机化合物有关的危害。离子液体的 示例性质包括高离子电导率、不挥发性、不可燃性、高的热稳定性、对于液相的宽温度、高溶 解度以及不配位中的至少一个。离子液体中阳离子和阴离子的选择决定物理性质，例如熔 点、粘度、密度、水溶性以及离子液体的其它性质。例如可应用大的、大体积的和不对称的阳 离子，通常得到具有低熔点的离子液体。作为另一实例，阴离子可对于离子液体的整体性质 (例如对空气和水的稳定性)具有更大作用。可通过离子中的至少一种的结构变化或组合不 同的离子来改变离子液体的熔点。
[0048] 离子液体阳离子的实例包括但不限于N-丁基吡啶鑰和1-烷基-3-甲基咪唑鑰（1， 3-二烷基咪唑鑰;烷基mim)。根据离子液体与水的比率、体系温度以及阳离子的烷基链长 度，阴离子的实例包括在水中不混溶的PF6和在水中混溶的BF4-。其它阴离子可包括三氟甲 磺酸根(Tf0，CF 3S02-)、全氟丁基磺酸根(Nf0，CF3(CF2) 3S02-)、双（三氟甲磺酰基）酰胺（bis (triflyl)amide)、三氟乙酸根以及全氟丁酸根(CF3(CF2)3CO 2+)。离子液体的其它实例可包 括卤代铝酸盐，例如氯代铝酸盐。氯代-和溴代-离子液体可具有大的电化学窗口，因为熔化 的盐阻止金属离子种类的溶剂化和溶剂解。离子液体的其它实例可包括1-烷基-3-甲基咪 唑鑰PF6,例如含如 3、如2、]\^0)2、3〇4、？？6、了《)、财0、8?4、了51^衍厶的1-癸基-3-甲基咪唑鑰 PF6、1-丁基-3-甲基咪唑鑰PF6和1-乙基-3-甲基咪唑鑰，具有(：12至&8-烷基链的N-烷基吡 啶鑰氯化物或N-烷基吡啶鑰氯化镍，以及这些物质的任意变体(本领域技术人员已知其为 离子液体）。其它实例包括1-乙基-3-甲基咪唑鑰双（1，2_苯二醇酸根-0,0'）硼酸盐、1-乙 基-3-甲基咪唑鑰双(水杨酸根)硼酸盐、1 -乙基-3-甲基咪唑鑰双(草酸根)硼酸盐。
[0049] 不希望受任何特定理论限制，一个或多个相引导的主要目的是在萃取期间创建供 体相和受体相之间的物理相边界，同时允许待萃取的分子向相界面运输和/或运输通过相 界面。
[0050] 优选地，至少一种或多种受体相是水性相，同时供体相主要包含一种或多种有机 孔(vent(s))，生成有机相。
[0051] 本发明的供体相优选，但不是必须地，与任一受体相基本上不混溶。
[0052] 因此，本文中"基本上不混溶"意指在萃取方法期间，当与受体相和供体相直接接 触时，不与受体相和供体相混合。
[0053]本文中的"基本上不混溶"有利地可具有以下含义:尽管相可溶解一定百分比的其 它相，但由此形成的溶液在所述方法的条件下会保持为分离的相。在本发明中，应理解如果 在所述方法的条件下混合两种溶剂或相时，形成两个分离的相，那么两 种溶剂或溶剂混合 物是不混溶的。
[0054]本发明的一个或多个相界面基本上不受膜或包含中空纤维的任意其它装置支持。 相反，在整个方法期间，相保持为液体，不由膜、凝胶或中空纤维悬浮或保持在其位置上，并 且相分离仅基于方法条件下的溶解度、体系中至少一个相的流动以及一个或多个相引导的 存在。因此，相是相互直接接触的液体，但是由于两种液体的不混溶性而保持分离;相引导 优选将一个或多个界面保持在适当的位置，并允许保持界面的形状。
[0055]可以多种方法构建相引导。一种技术涉及构建锐边(sharp edge)。在这样的锐边 上前进需要改变液-液弯月面的主半径，导致在弯月面上较高的压力下降，由此代表压力屏 障。这一概念也称作"弯月面固定"（meniscus pinning)。
[0056] 因此，代表性的相引导是沿着弯月面整个长度突出伸入液体内的三维结构。将弯 月面固定在所得的延长的突出物需要液体弯月面跨越额外的能量，因此液体被限制，除非 向液体施加额外的能量。另一种代表性的相引导是突出伸入整体材料(bulk material)内 的隆起物。在这一情况下，在相引导前产生固定。此外，相引导可包括通常是有意设计的 (deliberate)弱位置，在此位置跨越相引导所需的能量较低。在这样的位置，如果适当地设 计相引导，液体可跨越相引导。这一有意设计的弱位置也限定了相引导的"稳定性"，这确定 了在弯月面前进或后退期间，大量液体同时面对多个相引导时，相引导溢流的顺序或优先 性。
[0057] 当面对相引导的基底比相引导本身更亲水时，则创建特别通用的相引导。这样的 应用导致弯月面的伸长，并增加角及其半径对于相引导稳定性的作用。
[0058] 因此，取决于相引导的准确设计，其可以完全限制液体;或者可以仅在优选的位置 处允许液体前进或后退，使得液体沿着所选的路线，填充或排空体积中的特定空间，或者采 用特定的形状。
[0059] 代替构建为突出的屏障，相引导可由具有不同程度可湿性的体积的内表面面积限 定。另外，这样的面积可导致需要能量输入，以促进液体弯月面前进跨越它们。
[0060] 在W02010/086179 A2中公开很多相引导结构的设计。
[0061]供体相会具有足够高的导电性，以便在施加电场时，带电荷的分析物化合物能够 离子转移。这可通过例如将相用一种或多种提供导电性的溶剂饱和来方便地实现，例如通 过使用用水饱和的乙酸乙酯作为供体相。用受体相中一种或多种溶剂将供体相饱和还限制 受体相或供体相中的溶剂损失。适合在供体相中使用的溶剂取决于其它两种相的性质和组 成，即必须维持三相体系。
[0062] 在将极性和/或水性相用作供体相时，适合的受体相包括但不限于非极性至中等 极性溶剂，例如线性或支化的环状或非环状烷烃或烯烃，例如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、 环己烷、石油醚，其可任选地被卤素(特别是氯)取代;环状或非环状线性或支化的醚，例如 乙醚、叔丁基甲基醚、叔丁基乙基醚、四氢呋喃；伯、仲或叔醇，特别是烷醇，例如正丁醇、叔 丁醇、环己醇；短链羧酸与短链醇的酯，例如乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯；酮，例如丙酮、 甲基异丁基酮;芳族溶剂，例如甲苯和二甲苯，以及至少两种上述溶剂的混合物。
[0063] 在至少供体相为水性相，特别是供体相和受体相均为水性相时，申请人发现短链 羧酸与短链醇的酯(特别是乙酸乙酯)在萃取一些代谢产物时是非常有效的。
[0064] 本发明的受体相和供体相的选择取决于分离方法。
[0065] 本发明不限于两相体系，但是体系可包含其它相。优选的实施方案包含至少另外 的含有电极的受体相，其中该相与供体相或受体相导电接触。在另一优选的实施方案中，包 含第一电极的第一受体相与供体相直接接触，夹在第一和第二受体相之间的供体有效地起 隔离相的作用，并且第二受体相包含第二电极。图2描绘这样的体系;这里，将两个受体相邻 单个供体相设置，在此，两个受体相也分别与两个电极接触。这一排列可允许将同时萃取并 富集到不同受体相的阳离子和阴离子化合物分离，并因此提供高度选择性和综合性的分 析。
[0066] 在另一优选的实施方案中，以将各受体相包含在例如毛细管中的方式形成电极， 从而使阳离子和阴离子分析物均富集到各自的受体流体中。
[0067] 本发明的方法可涉及萃取阳离子分析物、阴离子分析物，还有利地涉及萃取中性 物质。在后一种情况中，通过相界面的分离可在不施加场的情况下进行，并因此简单地基于 分布萃取。
[0068] 不希望受任何特定理论限制，相信小的受体相体积可允许选择性地从供体相移出 化合物，甚至在无电场的情况下，但是后一种情况显著提高方法的效率。分布萃取可有利地 通过优化相(例如在微流体芯片中）的表面与体积的比率来优化。
[0069] 分析物化合物的离子化可通过调节PH、加入络合剂或相转移剂(例如对于碳水化 合物(糖)代谢物来说加入硼酸盐，其可起相转移剂的作用)来实现，或者简单地通过在电极 上施加足够高的电流来实现。相的界面优选起滤器的作用，确保蛋白质的过滤，并移除相界 面处的粉尘。
[0070] 可有利地调节相，以实现对于一些分析物期望的选择性。这可有利地通过改变相 的组成来实现。供体相还可包含添加剂，例如离子对，其可起相转移催化剂的作用，或者将 极性提高至期望的水平。电场也可是交替的或交流的。
[0071 ]可通过本发明的方法分离的分析物的实例包括有机化合物，例如药品、药物、着色 剂、毒物、污染物、食品添加剂和代谢产物;核苷酸，例如DNA或RNA;蛋白质、肽、氨基酸、碳水 化合物、脂质、多糖、脂肪酸和磷脂。申请人发现，由于供体相和受体相之间溶解性的差异， 例如可阻止高度带电荷的较大分子的转移，使得较小且更易运动的化合物在受体相中选择 性浓缩。
[0072]供体相可为直接从生物源取的样品，其中分析物化合物已经是溶解的状态。这可 例如是来自人的生物流体之一的样品、来自饮用水或废水的水样品、饮料、来自制备或工业 生物化学、有机或发酵方法的样品。生物样品的实例为血、血清、尿、唾液(salvia)、痰、精 液、细胞裂解液、胚胎裂解液、细胞流体、母乳或(脑)脊髓液。其它样品包括分离方法(例如 LC或HPLC)的馏分。
[0073]本发明的方法优选以使得供体相或受体相是可移动的（即可将它们从体系移除） 的方式实施。其实例为使用芯片，所述芯片包含在腔中并排的以流体连接的方式存在的受 体流体和供体流体，其中通过至少一个相引导将相边界维持在合适的位置。
[0074]可以多种方法构建相引导。一种技术涉及构建锐边(sharp edge)。在这样的锐边 上前进需要改变液-液弯月面的主半径，导致在弯月面上较高的压力下降，由此代表压力屏 障。这一概念也称作"弯月面固定"（meniscus pinning)。
[0075]因此，代表性的相引导是沿着弯月面整个长度突出伸入液体内的三维结构。将弯 月面固定在所得的延长的突出物需要液体弯月面跨越额外的能量，因此液体被限制，除非 向液体施加额外的能量。另一种代表性的相引导是突出伸入整体材料(bulk material)内 的隆起物。在这一情况下，在相引导前产生固定。此外，相引导可包含通常是有意设计的弱 位置，在此位置跨越相引导所需的能量较低。在这样的位置，如果适当地设计相引导，液体 可跨越相引导。这一有意设计的弱位置也限定了相引导的"稳定性"，这确定了在弯月面前 进或后退期间，大量液体同时面对多个相引导时，相引导溢流的顺序或优先性。
[0076] 当面对相引导的基底比相引导本身更亲水时，则创建特别通用的相引导。这样的 应用导致弯月面的伸长，并增加角及其半径对于相引导稳定性的作用。
[0077] 因此，取决于相引导的准确设计，其可以完全限制液体;或者可以仅在优选的位置 处允许液体前进或后退，使得液体沿着所选的路线，填充或排空体积中的特定空间，或者采 用特定的形状。
[0078] 代替构建为突出的屏障，相引导可由具有不同程度可湿性的体积的内表面面积限 定。另外，这样的面积可导致需要能量输入，以促进液体弯月面前进跨越它们。
[0079] 但是，可设置相引导(操作其以限定液体）以允许液体受控地穿越由相引导代表的 屏障；和/或混合限制在相引导或相引导组合(其限定插入的屏障结构）的相对侧的两种液 体。在W02010/086179A2中描述实现这些效果的设置，其中详细说明"限制性相引导"的概 念，其在本文中描述的本发明的实施方案中特别有用。
[0080] 该管可包含一个或多个所采用的相。
[0081 ]在从供体相转移组分时，富集有所述组分的受体相可通过将相从腔移除来有利地 并且简单地从受体相移出。因此，然后可使由此获得的富集的受体 流体直接进行另外的分 析分离或分离步骤，例如当将浓缩的液滴用于质谱时。适合的另外的分离和/或分析方法包 括但不限于 LC，例如 RP、NP、HILIC、TLC;CE、NMR、MS、UV/VIS、ED、纳升级LC(nanoLC)、HPLC、 UPLC;UHPLC;RP-(UV/VIS)-EV-NP-MS;RP-(UV/VIS)-EV-NMR;NP-(UV/VIS)-EV-CE-MS/RP-(UV/VIS) -EV-CE-MS; RP (UV/VIS) -EV-TLC/NP- (UV/VIS) -EV-TLC; EV-纳升级 LC 和 CE-EV，其 中MS是非常优选的。适合的MS技术的实例包括GC/MS或GC-MS/MS;特别是纳电喷雾-直接-进 样_MS(nanoe lectrospray-Direct-Infusion-MS )，例如在US-A-2010078553或WO-A-2008118808中公开的那些，其也称作Advion TriVersa(DI-MS);CE-MS;LC-MS;GC-MS和NMR。
[0082] 进入本发明的方法的分析物还可以是上述公开的分离方法的所得物。受体相可以 是氘化相，其中富集的电萃取样品可进行NMR方法检测。
[0083] 通常，本发明的方法允许将分析物从较大的供体相浓缩到小的受体相中，从而导 致分析物的浓缩。后者对于不够敏感的方法是重要的，因此进一步应用由此浓缩的受体相， 其中溶剂的存在例如对于方法的分离度会是有害的，所述方法例如其中需要交换溶剂的分 离方法。
[0084] 本发明的装置还涉及从两个移动的流体相电解萃取的装置。
[0085] 可如此改善装置的几何结构，使得就液-液界面之间的接触面积而言的效率最大 化，降低分析物迀移路径长度，并由此降低迀移时间，以及当对于各具体应用，该分析物供 体溶液变得快要耗竭时供给样品溶液的自动控制机制。此外，可有利地修改装置，并使其自 动化，使其与检测和/或分离方法(CE-MS或LC-MS)在线联用。所述装置还可联用多维分离平 台，例如LC X LC和LC X CE，其包含LCxLC领域技术人员目前未知的调控技术。
[0086] 认为截面的具体几何结构是不相关的，条件是所述装置适合转移流体，例如还可 应用于刻蚀在微流体芯片中的通道，并且允许应用一个或多个相引导。
[0087] 对于溶剂和/或液体进料中携带的组分而言，适合的壁材料是基本上惰性的，并且 在本发明的主题装置中采用的温度或条件下也不变形。代表性的材料包括硅、金属和/或合 金，例如金、铜或不锈钢、玻璃和热固性聚合物材料，例如交联环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲 酯、环烯烃(共)聚合物、聚酰亚胺、氟-乙烯聚合物和/或聚碳酸酯。
[0088]优选的装置包含电解萃取芯片，电解萃取芯片由惰性的、基本上不导电的材料(例 如环烯烃共聚物)制成，这归因于它的光学(透明）和化学(对于有机溶剂相对惰性)性能。所 述芯片优选包含至少两个通道，这两个通道各自具有入口和出口，并且通过相引导分隔。或 者，可使用平板印刷方法由晶片(waiver)(例如硅)刻蚀芯片，以限定两个通道、导管和/或 轮廓相引导。
[0089] 然后可将电极有利地沉积(例如通过溅射)在给定位置处的表面。
[0090] 优选的实施方案包括两个8mm宽的、正交溅射置于通道壁上的薄膜铂电极。
[0091] -旦引入有机供体相和一个或多个水性受体相，垂直于有机相的流动施加电场， 进行电解萃取方法。
[0092] 通过使用相引导来实现稳定的双相界面，相引导通常是存在于流体通道中的小特 征(feature)，其由于弯月面固定效应而将液-液界面稳定。非常易于引入任意芯片结构，并 降低污染风险。
[0093] 受体相通常与第二电极导电接触。这可通过在至少一个与受体相接触的点加入导 电材料，从而形成第二电极来方便地实现;或者通过使受体相与装置的腔中的电极接触来 方便地实现。
[0094] 样品可包含溶解的组分，或者在供体相中悬浮或乳化的组分。
[0095] 实施例1
[0096] 在如图1所示的用于电解萃取的装置中进行实验。
[0097] 材料和方法
[0098] 化学品：甲苯、2-丙醇、乙腈（ACN)和甲醇（均为分析级）购自Biosolve B.V. (Valkenswaard，荷兰）JCS试剂级2-丙醇、EtOAc(分析级）和酰基肉碱（肉碱、己酰基肉碱、 辛酰基肉碱和月桂酰基肉碱)购自Sigma-Aldrich(St .Louis ,MO,美国）。脱矿质水为使用 Merck MiIlipore水纯化系统（Billerica ,MA，美国）内部制备的。结晶紫（CV)购自Merck (Darmstadt，德国）。甲酸（FA)购自 Fisher Scientific-Acros Organi cs( Hampton，NH,美 国）。
[0099] 仪器和材料
[0100]用于沉积1〇〇111]1厚的钼电极的薄膜沉积系统是由〇61'1丨1^〇11(?_每￡^&〇11，瑞士）制备 的Leybold Heraeus Z-400。具有中心尖的两件式注射器(Two-part syringe)(2.5ml)购自 Terumo(Tokyo，日本）dKDS 100注射栗购自 KD Scientific Inc · (Holliston，MA,美国）。用 Capella MCE电源，CapiliX(Leeuwarden,荷兰）施加电场。十八烷基InertsiI 0DS-3柱（5μ m, 100mm X I ·0mm)购自GL Sciences Inc · , (Torrance,CA,美国）oHPLC为Agilentl 100系列 (Santa Clara,CA,美国）。检测器为Bruker Daltonics MicrOTOF质谱仪（Bremen,德国）。 [0101] 芯片的制备
[0102] 基于对乙酸乙酯的化学耐性，选择环烯烃共聚物（COC)载玻片（75.5 X 25.5 X 1.5mm)作为芯片衬底。COC芯片从Microfluidic ChipShop GmbH(Jena,德国）获得。使用计 算机辅助设计软件设计芯片。Dassault Systgmes SolidWorks Corp. (V6lizy-Vi I Iacoublay,法国）的 Solid Works? Premium 2010 用于产生模型，CNC Software , Inc · (Tolland,CT,美国）的 Mastercam? Design X3用于通过ArtSoft USA产生G-代码和 Mach3,并且 Newfangled Solutions LLC(Fayette, ME,美国）的一部分用于在 Taig 3000CNC-铁刀（mill), Supertech EMC-xy z-GSBX 驱动器（Phoenix ,Arizona,美国）的XYZ 运 动中对G-代码解码。以5.000RPM，100mm/min的供给速率，0· Imm/步的步距(plunge step)， lmm/min的主轴进刀速率(plunge rate)操作铣刀（0.50mm直径）。用软刷移除毛边，通过用 水清洗芯片表面并最终用压缩空气将所述芯片吹干来移除颗粒。提供掩模以保证薄膜铂的 溅射，以实现电极。在〇.5kV，在大约10-5mbar，采用40标准立方厘米/分钟的氩气流进行铂 沉积，持续40。所述溅射工艺得到大约75- 125nm厚的电极。通过溶剂粘合将载玻片密封。通 过将衬底表面置于70:30体积/体积％的甲苯和2-丙醇中持续45秒，使衬底表面活化。用过 量的ACS试剂级2-丙醇淬灭活化工艺，并使用压缩空气将表面干燥。在对准(aligning)衬底 后，使用以25.97kg/cm 2( ± 1.56kg/cm2)操作的热压机（110°C)密封芯片，持续15分钟。
[0103] 所制备的电解萃取芯片的概述
[0104]通过微细铣削(micro-mi I ling)和溶剂粘合技术制备如图1所示的EE-芯片。分析 物供体通道的尺寸为15.OOx 2.OOx 0.50mm，并且分析物受体通道的尺寸为10.OOx 2.OOx 0.50。所有的铣削特征具有±0.05mm的精确度。位于分析物供体通道和受体通道中间的衬 底材料的隆起物（8.0 0 X 0.4 0 X 0.2 0mm)用作两种不混溶的溶剂流的稳定剂。两个大约 8. OOmm长和75-125nm厚的垂直电极沿所述通道溅射。在通道的起始端和末端处钻孔（ID 1.2mm)，其用作溶剂入口/出口。使用溶剂粘合技术来制备密封的芯片。
[0105]通过将EE工艺的典型的耗竭和浓度效应可视化来评估芯片-E E的可行性。图2a中 的黑色箭头标记沿不流动的水性相流动的乙酸乙酯(EtOAc)溶液的流动方向，所述乙酸乙 酯(EtOAc)溶液含有结晶紫离子并且以30yL/min流动。在施加 OV和80V各30秒后获得的结晶 紫的耗竭和浓度性质如图2b和图2c所示。白色虚线强调耗竭和浓度性质。芯片的流速的实 际芯片处理能力为在IkV的电势下大约300yL/min。由于焦耳加热，更高的流速和电势导致 显著的突破效应或EE方法的中断。
[0106] 最优流速和电压的确定
[0107] 通过包含三种酰基肉碱（己酰基肉碱;辛酰基肉碱；月桂酰基肉碱）的样品的基于 芯片的电解萃取以及通过LC-MS分析水性样品等分试样来评估三种流速(例如50、75和100μ L/min)和四种萃取电压(例如0、100、300和500V)中的最适条件。在OV下，尚没有电场，由于 扩散，分析物会从有机相缓慢地迀移至水性相。扩散能够将大约15%的初始肉碱浓度转移 至水性相。在100V下，电场将带正电荷分析物向水性相的迀移速率加速。从水性相回收大约 50 %的肉碱。在300V下，对于所有三种分析物供体流速，回收大约100 %的肉碱。在500V下， 回收率降低至50 %。
[0108] 线性和重现性
[0109] 通过在20-200nM范围内的六个浓度水平下的辛酰基肉碱和月桂酰基肉碱的LC-MS 分析，测试芯片萃取的分析物的线性。所有浓度水平一式三份地测量。将辛酰基肉碱和月桂 酰基肉碱在乙酸乙酯中溶解，以5〇μ?7π?η的流速栗抽，并在300V下萃取。样品混合物还包含 IOOnM浓度的己酰基肉碱，其用作内标。所示的对于辛酰基肉碱和月桂酰基肉碱获得的回归 系数分别为〇. 9909和0.9888。
[0110]通过比较校正曲线斜率的相对标准差来得到方法的重现性。
[0111] 增强因子
[0112]通过除以四种模型化合物的MS信号比率来测定用芯片-EE体系获得的信号增强因 子。在300V和OV下获得信号比率，后一电压为对于被动扩散导致的分析物转移的对照实验。 [0113]为了通过芯片-EE测定对于MS的信号增强因子，制备包含三种肉碱和肽（己酰基肉 碱、辛酰基肉碱和血管紧张肽)的样品。
[0114] 将分析物由ImL的有机供体相萃取到X mL的水性相。其中施加0伏的对照实验用于 测定分析物通过被动扩散由有机相转移到水性相的效应。然后将水性相收集到Eppendorf 小瓶(2mL)中，并通过LC-MS离线测量。将实验在不同的浓度水平下重复三次。对于其中施加 30伏电势的实验，重复同一实验条件。在图6中显示对于两种肉碱和肽的信号的示例性增 加。
[0115] 在所测试的浓度范围下，两个校正曲线均显示良好的线性。95%的置信区间表明 对于辛酰基肉碱和对于月桂酰基肉碱的回归均显著超过0。通过比较校正曲线斜率的相对 标准偏差来检查方法的重现性。发现相对标准偏差是令人满意的，对于辛酰基肉碱曲线为 20%，对于月桂酰基肉碱曲线为21%。通过用5%FA(v/v)水溶液填充并施加电压来测试每 一新批次的芯片。如果测量的电流与另一芯片相同，则评价所述芯片性能良好。
[0116] 上述实施例说明本发明的主题方法和装置的有效性，特别是当联用高敏感性分析 方法，例如纳电喷雾-直接-进样-MS时。
【主权项】
1. 将化合物从移动的流体供体相电解萃取到受体相中的方法，其包括以下步骤： a) 提供导电供体相，所述导电供体相以第一流速移动并与第一电极导电接触， b) 提供导电受体相，所述导电受体相与所述供体相直接接触并与所述供体相不混溶， 而且所述导电受体相与第二电极导电接触；以及 c) 提供支持性的或限制性的相引导模式，以在供体相与受体相之间保持限定的界面， 以及 (d)在所述第一电极与所述第二电极之间施加电场。2. 权利要求1的方法，其中所述受体相以低于所述第一流速的第二流速与所述供体相 在相同方向移动，所述受体相优选是不流动的。3. 前述权利要求中任一项的方法，其中在所述方法的时间范围和条件下，所述供体相 和/或受体相保持不混溶。4. 前述权利要求中任一项的方法，其中以足够长的时间施加足够高的电场，以使得至 少部分的分析物化合物从所述供体相迀移至所述受体相，或者迀移至供体相与受体相之间 的界面。5. 前述权利要求中任一项的方法，其中另外的受体相存在于所述第一受体相的相对侧 并与所述供体相直接接触，并且其中所述第一电极设置在所述另外的受体相中，并且其中 与所述供体相的导电接触通过所述另外的受体相发生。6. 前述权利要求中任一项的方法，其还包括移出包含迀移的分析物的受体相，并使所 述移出的受体相接受另外的分离和/或分析方法。7. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述供体相来自前面的分离和/或分析方法。8. 权利要求6或权利要求7的方法，其中所述另外的分离和/或分析方法包括LC，例如 RP、NP、TLC;CE、NMR、MS以及联用的方法，例如GC/MS或GC-MS/MS;特别是纳电喷雾-直接-进 样-MS、UV/VIS、纳升级LC、HPLC、UPLC;RP- (UV/VIS) -EV-NP-MS;RP- (UV/VIS) -EV-NMR;NP-(UV/VIS)-EV-CE-MS/RP-(UV/VIS)-EV-CE-MS;RP(UV/VIS)-EV-TLC/NP-(UV/VIS)-EV-TLC; EV-纳升级LC和CE-EV。9. 用于权利要求1-8中任一项的两相电解萃取方法的装置，其包括： (i) 通道，所述通道用于运输流体流并具有由通道底和两个通道壁限定的体积;和 (ii) 第一电极，所述第一电极用于接触第一相并设置于所述通道壁之一，以及第二电 极，所述第二电极用于接触第二相并设置于与所述第一电极相对的通道壁，以便在与流动 方向正交的方向上施加电场，以及在两个电极上施加电场的设备；以及 (iii) 轮廓相引导，所述轮廓相引导设置于所述通道底，并在距所述通道壁给定距离 处，从入口导管至出口导管沿着所述底的轮廓设置，所述轮廓相引导通过将相边界的弯月 面固定在所述相引导来将至少两个相分离。10. 权利要求9的装置，其中腔被在所述腔内部形成的至少一个相引导在内部分为至少 第一体积和第二体积，其还包括： (iv) 至少第一和第二入口流体导管，所述至少第一和第二入口流体导管与所述通道腔 和所述导管的上游外部以流体连接，其中所述第一和第二入口导管分别与第一和第二体积 以流体连接，以及 (iii)至少第一和第二出口导管，所述至少第一和第二出口导管分别与所述腔体积的 第一和第二下游部分以及所述通道的外部以流体连接。11. 权利要求9或10的装置，其中所述相引导包括凹槽、隆起物或具有不同可湿性的材 料，并起到毛细管压力边界的作用，跨越流动的液-液弯月面的整个长度，使得所述弯月面 至少部分地沿所述相引导对齐。12. 权利要求9-11中任一项的装置，其中所述通道包括两个相引导，所述两个相引导在 填充方法期间的一些时间点及时限制前进或后退的液体，其中所述相引导的区别在于它们 对于以预定顺序限制所述相引导的顺序和/或选择性溢流的稳定性。13. 权利要求9-12中任一项的装置，其中所述通道是基本上透明的。14. 权利要求9-13中任一项的装置，其中所述通道壁之间的距离(通道宽度)为100μπι至 2mm〇15. 权利要求10-14中任一项的装置用于富集组分、过滤蛋白质和/或从生物样品中移 除粉尘的用途。16. 制备用于两相电解萃取的装置的方法，其包括： (a) 提供合适的惰性基质材料，以及 (b) 将所述基质材料成形为通道和所述通道中的相引导，所述通道包括至少两个通道 壁以及至少一个入口和一个出口导管，以及 (b)向所述通道壁提供电极。
【专利摘要】本发明涉及将将化合物从移动的流体供体相电解萃取到受体相中的方法，其包括以下步骤：提供导电供体相，所述导电供体相以第一流速移动并与第一电极导电接触，提供导电受体相，所述导电受体相与所述供体相直接接触并与所述供体相不混溶，而且所述导电受体相与第二电极导电接触；以及提供支持性的或限制性的相引导模式，以在供体相与受体相之间保持限定的界面，以及(d)在所述第一电极与所述第二电极之间施加电场。
【IPC分类】B01L3/00, G01N1/40, B01D11/04
【公开号】CN105492883
【申请号】CN201480041892
【发明人】J-W·斯洪恩, P·林登伯格, V·范杜伊内恩, A·厄迪特, P·武尔托, T·汉克迈耶
【申请人】莱顿大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月19日
【公告号】EP3011305A1, US20160114261, WO2014204311A1
【专利说明】由流动相的双相电解萃取
[0001] 本发明涉及用于从样品中萃取化合物的方法和装置。
【背景技术】
[0002] 通常将使用施加电场以增强从一个相到另外的相的传质的溶剂萃取方法称作"电 解萃取(electroextraction)"。当将电场施加于由低传导性有机相和较高传导性或高传导 性水性相组成的不混溶两相液-液体系时，有机相中带电荷的化合物会快速向水性相迀移。 随着进入水性相，迀移速率剧烈降低，导致界面处分析物浓度。
[0003] 起初，研发电解萃取作为化学工程领域的纯化技术以提高产物收率，参见例如1^_ a-3,841,984和US-A-3,472,080。最近，如例如J .Chromatogr .A 1994,687,333-341 和 Electrophoresis 2010,31,3903-3912中所公开，已将电解萃取为了分析目的进行修改，在 毛细管中将化合物由有机相萃取入水性相。尽管这通常是非常有效的方法，但是其需要将 分析物溶解在有机相中，这将其潜在应用限于具有适当溶解度的分子，并且涉及在分析操 作中额外的稀释步骤，即将样品与有机相混合。
[0004] 在W0-A-2007004892中公开了不同的方法。该文中公开了通过包含固定的有机溶 剂的液体膜，将至少一种电离的或部分电离的有机化合物由第一亲水供体溶液向第二亲水 受体溶液电解辅助萃取的方法。尽管该方法可允许由第一水溶液向第二水溶液萃取含水的 分析物样品，但由于与液体膜相关的运输限制以及人造液体膜区分大部分内源性化合物与 生物基质(这在代谢产物学中是非常不期望的）的事实，膜的存在会仅允许有限数目的化合 物进入受体溶液。另外，装置是复杂的，并且所述膜在单次应用后就需要被丢弃。
[0005] 因为目前的电解萃取装备利用固定体积的双相体系，由于在电解萃取方法期间分 析物的耗竭，所述方法是自限制的。此外，由于在所述方法期间溶剂不能够更新，目前的电 解萃取装备不能够用于连续注射。我们研发了一种芯片，所述芯片使得将分析物从连续地 补充的有机供体溶液有力地电解萃取到小体积的不流动(stagnant)的或流动的水溶液中 成为可能。所述芯片适用于许多溶剂类型，并且不使用凝胶、膜来使得双相流体相容。
[0006] 因此，仍然需要改进电解萃取方法的效率。
【发明内容】
[0007] 本发明涉及将化合物从移动的流体供体相电解萃取到受体相中的方法，其包括以 下步骤:提供导电供体相，所述导电供体相以第一流速移动并与第一电极导电接触，提供导 电受体相，所述导电受体相与所述供体相直接接触并与所述供体相不混溶，而且所述导电 受体相与第二电极导电接触；以及提供支持性的或限制性的相引导模式（phase guide pattern)，以在供体相与受体相之间保持限定的界面，以及(d)在所述第一电极与所述第二 电极之间施加电场。
[0008] 本发明还涉及用于两相电解萃取的装置，其包括：（i)通道，所述通道用于运输流 体流并具有由通道底(channel floor)和两个通道壁限定的体积;和(ii)第一电极，所述第 一电极用于接触第一相并设置于所述通道壁之一，以及第二电极，所述第二电极用于接触 第二相并设置于与所述第一电极相对的通道壁，以便在与流动方向正交的方向上施加电 场，以及在两个电极上施加电场的设备；以及（iii)轮廓相引导（contour phase guide)，所 述轮廓相引导设置于所述通道底，并在距所述通道壁给定距离处，从入口导管至出口导管 沿着所述底的轮廓设置，所述轮廓相引导通过将相边界的弯月面固定(pinning)在所述相 引导来将至少两个相分离。
【附图说明】
[0009]可以从权利要求书、说明书和附图收集这些和其它特征，各个特征(单独地或以其 子组合的形式)可在本发明的实施方案和其它领域实现，并且可代表在此请求保护的有益 的，独立地可保护的构造。在下文中参照附图更详细地描述本发明的实施方案，其中：
[00?0]图1公开电解萃取芯片的俯视示意图，其包含工艺路线(process line up)和本发 明的优选装置。圆圈处与通道以流体连接的导管未显示。
[0011]图2公开真实的EE芯片的俯视图。EE芯片的特征如下所示（从顶部到底部）：Pt电 极;包含两种不混溶的液体的微通道，其通过微通道基底上的相引导保持在合适的位置，而 两个相具有直接的界面；以及又一个Pt电极。该图显示真实的实例，其中沿不流动的水性 相，以30yL/min的流供给乙酸乙酯结晶紫溶液。图2(A)显示放大2.5倍拍摄的图像。
[0012]获得在OV⑶和80V(C)下，沿不流动的水性相以30yL/min供给的乙酸乙酯结晶紫 溶液的消耗和浓度特征，并还将其在2.5倍放大下显示和对比，以增强可视化。
[0013] 图3说明基于三种酰基肉碱的相对回收、平均值和标准差(在0、100、300和500V萃 取电压以及50、75和100yL/min乙酸乙酯供给速率下获得），最优芯片EE参数的测定。
[0014] 图4显示由芯片EE获得的三个LC-MS色谱图的叠加（overlay)，显示了对于在300V 下由50yL/min流速的EtOAc萃取的多个浓度水平的辛酰基肉碱(a)和月桂酰基肉碱(a)获得 的芯片EE校准线。所有样品包含I OOnM浓度的己酰基肉碱，其用作内标。
[0015] 图5显示通过芯片-EE获得的两种肉碱和肽的MS信号增强。
【发明内容】
[0016] 主题方法能够将化合物从供体相直接分离并萃取到一个或多个受体相中，而不需 要分开两个相的物理障碍，例如凝胶、膜或其它复杂的萃取系统下。这能够简化电解萃取方 法，并允许操作连续或半连续方法，而不是目前已知的分批方法。
[0017] 为了分析目的的电解萃取将液-液萃取(LLE)和电泳二者的特征相结合。电解萃取 能够将离子化合物从有机相高速萃取到水性相中。LLE利用分子的分配系数来将分析物从 有机相转移到水性相中，水性相作为不混溶的溶剂体系的一部分。该萃取方法是费时费力 的，并且难于自动化。此外，特别是对于yL大小的分析物混合物，LLE变得不实用。
[0018] 电解萃取是其中在双相溶剂体系上施加电位的技术。所述双相溶剂体系包含分析 物供体有机溶液和分析物受体水溶液。由电位诱导的电场将带电荷的分析物（阴离子/阳离 子）向水性相驱动。由于低电导，电场非常高，因此有机相中的迀移速率非常高。在水性相 中，由于高电导，带电荷的分析物的迀移速率相对地非常低。这意味着带电荷的分析物会堆 积在紧邻有机/水界面后的非常薄的水层中。
[0019] 优选地，通过不断地更新供体溶液，并保持受体溶液不流动，用电解萃取可获得极 高且选择性的分析物增强因子。
[0020] 与LLE相反，由于所施加的电位使迀移速率增加2个或更多个数量级，并由此降低 迀移时间，电解萃取是更快的技术。
[0021] 由于可在相对短的时间内实现优异的增强因子，所述电解萃取方法完全适合作为 分析少量(smalI plugs)样品材料(例如CE-MS或LC-MS)的样品预处理技术。
[0022] 本发明还有益地涉及装置，优选基于带电荷的分析物的迀移并用于分析物富集的 微流体芯片。
[0023] 主题方法的益处在于溶解在相对大体积有机溶剂(例如所述供体相）中的分析物 以相对高的速度迀移到相对小体积的极性受体相(例如含水溶剂）中，从而在短时间间隔内 极大地提高浓度水平。
[0024]主题方法和装置的重要特征是易于操作以及通过在芯片上提供的相引导技术独 立地处理不混溶的溶剂流的能力。
[0025] 该芯片可利用基于电解萃取的分析物富集，但是也可在轻微改变下使用其它电驱 动溶剂分析物增强技术。
[0026] 所述芯片特别适用于自动化操作，并因此能够显著降低在通过与质谱联用的毛细 管电泳(CE-MS)或与质谱联用的液相色谱分析之前，从样品中选择性浓缩阳离子或阴离子 的操作的劳动强度。
[0027] 在所述方法期间，所述供体相和所述受体相是基本上不混溶的，这是特别重要的， 因为至少供体相以第一流速和流动方向流动通过萃取装置。所述受体相可以第二速率流 动，第二速率可以比所述供体相的流速低。为了实现强富集，所述供体相的速率远高于所述 受体相的速率。所述受体相优选甚至是不流动的，这允许相对大体积的供体相沿靠着小体 积的受体相通过，从而富集萃取到受体相中，或者萃取到供体相和受体相之间的界面中的 化合物。然后可将受体相引入导管，以将其定期或以分批的方式移除，得到大大富集的萃取 物样品，从而能够将供体相中的化合物大大地浓缩。
[002 8] 可通过适当地选择在所述方法条件下相组分的互溶性来方便地改善相之间的分 离，这特别适用于更静态的体系，或者可通过物理措施至少部分在动态体系中实现，例如通 过相引导分离流动的相，如在W0-A-2012120102和/或W0-A-2010086179中公开的。本文中的 术语"不混溶的"意指在方法中，各相保持为分离的相。主题方法中应用的相应理解为将分 析萃取物和可能的改性剂溶解或稳定地分散或乳化的稀释剂，从而形成相。
[0029] 本发明涉及通过使用两个分开的相（即供体相和至少一个受体相）的电解萃取进 行的分离。所述方法可包括多个相(例如三个或更多个相)的电解萃取芯片。
[0030] 本发明的供体相和/或受体相可为适合将分析物样品溶解和/或保持在稳定的分 散体或乳液的任意相。所述供体和/或受体相优选是导电的，更优选在分析物样品的存在 下，例如盐的水溶液。所述相可优选包含单一溶剂或溶剂混合物。
[0031] 在所述方法期间，所述供体相和一个或多个受体相保持不混溶。这意味着至少在 本发明的萃取方法应用的时间范围（timescale)下和应用期间，所述各相保持分离。
[0032] 这可通过在所述方法条件下相组分的不混溶性来方便地实现，这特别适用于更静 态的体系，或者可通过物理措施至少部分地在动态体系中实现，例如通过相引导分离流动 的相，如在 W0-A-2012120102 和/或 W0-A-2010086179 中公开的。
[0033] 当将所述方法与电解萃取前的额外的分离方法组合时，这也可有利地自动进行， 这样的体系是特别有用的。
[0034] 本文中"导电的"应理解为向电场提供足够的导电性，即电流和所述至少一种分析 物化合物可穿过相(包括一个或多个受体相）。穿过相的电流原则上可为不引起不稳定性的 任意电流，不稳定性会损害相之间的界面完整性。认为其优选应在较低的微安培范围，即优 选小于100μΑ，但通常大于Ο.ΟΙμΑ。
[0035] 可实施本发明的方法使得带正电荷或带负电荷的化合物被萃取。尽管这可以通过 转换极性，或者使用两个受体相(每个电极处一个受体相)来实现，所述方法还可以有益地 在不存在电场的情况下，或者其中至少间歇地不施加电场的情况下实施，使得中性分析物 通过分步萃取由供体相向受体相的迀移变得更加显著。以这种方法，带电荷的以及不带电 荷的化合物均可被选择性地或顺序地萃取。
[0036] 因此，本发明的方法还可在至少间歇地不施加电场的情况下实施，使得中性分析 物通过分布萃取由供体相向受体相迀移。
[0037] 供体和/或一个或多个受体相分别与第一和第二电极导电接触。这种接触可有益 地为在各个相和电极之间直接具有液体接触，或优选通过另外的相将电极与供体或受体相 分离。通过该体系（constellation)，避免或至少减少了分析物样品和/或溶剂组分与电极 之间的还原或氧化反应的发生。
[0038] 本发明的方法允许在非常低的电压下进行，并由此降低分析物与电极的不期望的 电化学反应的可能。适合的电极可以是能够向所述相提供电流的任意电极，优选应用适合 的可商购电极，例如铂丝、导电金属涂层、导电塑料或石墨烯复合材料。
[0039] 向电极施加的电压通常可为0.OlV至30000V，更优选0.1 V至10,000V，甚至更优选 0.1 V至1000V，更优选0.1至500V;并且特别优选0.1 V至300V;并且最终电池在0.1至9V运行。 所施加的电压优选可为DC电压。在一些情况中，所施加的电压可为脉冲电压。电压的极化可 取决于要分离的分析物的种类，并且可以变化。
[0040]优选设置第一电极，使得相对于相的流动，可施加基本上与相流动的方向正交的 电场。
[0041 ]所述供体和/或受体相优选是亲水性的，其包含溶剂或溶剂混合物。适合的溶剂包 括水性溶剂、非极性有机溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜DMS0。本发明的方法 中使用的水性溶剂任选地可为水和另外的溶剂的混合物，所述另外的溶剂与水混溶并且在 受体相的有机溶剂中具有低溶解度，从而形成两个分离的相。亲水性溶剂还可包括与亲水 性有机溶剂混合的水，其中所述有机溶剂可以0-100重量％，更优选0-50重量％，并且更优 选0-20重量％存在。此外，可加入适合的亲水性有机溶剂，其优选与供体或受体相在至多某 水平下混溶。
[0042]优选的亲水性有机溶剂的实例为甲醇、乙醇、乙腈和DMS0。
[0043] 如本申请上下文中使用的术语"受体相"是适合接受化合物的相。
[0044] 至少所述供体相可优选具有这样的PH，在所述pH下，至少部分分析物被部分或完 全离子化。这可通过加入适合的酸或碱来实现，这是本领域公知的。
[0045] 适合的酸可为可将供体溶液的pH调节至1-7的pH范围内的水平的任意酸，由此带 有碱性基团的有机化合物被离子化为阳离子。相应地，适合的碱可为可将供体溶液的PH调 节至7-14的pH范围内的水平的任意碱，由此带有酸性基团的有机化合物被离子化为阴离 子。适合的酸的实例为耶1、冊心!^00!1、0^00!1、!123〇4和113?〇4。适合的碱的实例为似0!1、 Na2CO3、NaHCO3 和 NH3。
[0046] 适合的溶剂还可包括压缩气体，例如丙烷或二氧化碳，其可在亚临界、近临界或超 临界相范围内使用。为了调节这些压缩气体的性质，可任选地加入共溶剂例如乙醇。优选使 用不具有或仅具有轻微毒性或其它生理学上不利效果的溶剂。其它溶剂可包括硅油。
[0047] 其它适合的溶剂包括离子液体。本文中的术语"离子液体"是指在宽温度范围（包 括室温)下为液体的盐。现有技术中已描述离子液体，包括手性的、氟化的以及抗菌的离子 液体。可使离子液体的性能适用于具体应用，并且离子液体可以是有机溶剂的环境友好的 替代物。离子液体可降低成本，处理要求以及与挥发性有机化合物有关的危害。离子液体的 示例性质包括高离子电导率、不挥发性、不可燃性、高的热稳定性、对于液相的宽温度、高溶 解度以及不配位中的至少一个。离子液体中阳离子和阴离子的选择决定物理性质，例如熔 点、粘度、密度、水溶性以及离子液体的其它性质。例如可应用大的、大体积的和不对称的阳 离子，通常得到具有低熔点的离子液体。作为另一实例，阴离子可对于离子液体的整体性质 (例如对空气和水的稳定性)具有更大作用。可通过离子中的至少一种的结构变化或组合不 同的离子来改变离子液体的熔点。
[0048] 离子液体阳离子的实例包括但不限于N-丁基吡啶鑰和1-烷基-3-甲基咪唑鑰（1， 3-二烷基咪唑鑰;烷基mim)。根据离子液体与水的比率、体系温度以及阳离子的烷基链长 度，阴离子的实例包括在水中不混溶的PF6和在水中混溶的BF4-。其它阴离子可包括三氟甲 磺酸根(Tf0，CF 3S02-)、全氟丁基磺酸根(Nf0，CF3(CF2) 3S02-)、双（三氟甲磺酰基）酰胺（bis (triflyl)amide)、三氟乙酸根以及全氟丁酸根(CF3(CF2)3CO 2+)。离子液体的其它实例可包 括卤代铝酸盐，例如氯代铝酸盐。氯代-和溴代-离子液体可具有大的电化学窗口，因为熔化 的盐阻止金属离子种类的溶剂化和溶剂解。离子液体的其它实例可包括1-烷基-3-甲基咪 唑鑰PF6,例如含如 3、如2、]\^0)2、3〇4、？？6、了《)、财0、8?4、了51^衍厶的1-癸基-3-甲基咪唑鑰 PF6、1-丁基-3-甲基咪唑鑰PF6和1-乙基-3-甲基咪唑鑰，具有(：12至&8-烷基链的N-烷基吡 啶鑰氯化物或N-烷基吡啶鑰氯化镍，以及这些物质的任意变体(本领域技术人员已知其为 离子液体）。其它实例包括1-乙基-3-甲基咪唑鑰双（1，2_苯二醇酸根-0,0'）硼酸盐、1-乙 基-3-甲基咪唑鑰双(水杨酸根)硼酸盐、1 -乙基-3-甲基咪唑鑰双(草酸根)硼酸盐。
[0049] 不希望受任何特定理论限制，一个或多个相引导的主要目的是在萃取期间创建供 体相和受体相之间的物理相边界，同时允许待萃取的分子向相界面运输和/或运输通过相 界面。
[0050] 优选地，至少一种或多种受体相是水性相，同时供体相主要包含一种或多种有机 孔(vent(s))，生成有机相。
[0051] 本发明的供体相优选，但不是必须地，与任一受体相基本上不混溶。
[0052] 因此，本文中"基本上不混溶"意指在萃取方法期间，当与受体相和供体相直接接 触时，不与受体相和供体相混合。
[0053]本文中的"基本上不混溶"有利地可具有以下含义:尽管相可溶解一定百分比的其 它相，但由此形成的溶液在所述方法的条件下会保持为分离的相。在本发明中，应理解如果 在所述方法的条件下混合两种溶剂或相时，形成两个分离的相，那么两 种溶剂或溶剂混合 物是不混溶的。
[0054]本发明的一个或多个相界面基本上不受膜或包含中空纤维的任意其它装置支持。 相反，在整个方法期间，相保持为液体，不由膜、凝胶或中空纤维悬浮或保持在其位置上，并 且相分离仅基于方法条件下的溶解度、体系中至少一个相的流动以及一个或多个相引导的 存在。因此，相是相互直接接触的液体，但是由于两种液体的不混溶性而保持分离;相引导 优选将一个或多个界面保持在适当的位置，并允许保持界面的形状。
[0055]可以多种方法构建相引导。一种技术涉及构建锐边(sharp edge)。在这样的锐边 上前进需要改变液-液弯月面的主半径，导致在弯月面上较高的压力下降，由此代表压力屏 障。这一概念也称作"弯月面固定"（meniscus pinning)。
[0056] 因此，代表性的相引导是沿着弯月面整个长度突出伸入液体内的三维结构。将弯 月面固定在所得的延长的突出物需要液体弯月面跨越额外的能量，因此液体被限制，除非 向液体施加额外的能量。另一种代表性的相引导是突出伸入整体材料(bulk material)内 的隆起物。在这一情况下，在相引导前产生固定。此外，相引导可包括通常是有意设计的 (deliberate)弱位置，在此位置跨越相引导所需的能量较低。在这样的位置，如果适当地设 计相引导，液体可跨越相引导。这一有意设计的弱位置也限定了相引导的"稳定性"，这确定 了在弯月面前进或后退期间，大量液体同时面对多个相引导时，相引导溢流的顺序或优先 性。
[0057] 当面对相引导的基底比相引导本身更亲水时，则创建特别通用的相引导。这样的 应用导致弯月面的伸长，并增加角及其半径对于相引导稳定性的作用。
[0058] 因此，取决于相引导的准确设计，其可以完全限制液体;或者可以仅在优选的位置 处允许液体前进或后退，使得液体沿着所选的路线，填充或排空体积中的特定空间，或者采 用特定的形状。
[0059] 代替构建为突出的屏障，相引导可由具有不同程度可湿性的体积的内表面面积限 定。另外，这样的面积可导致需要能量输入，以促进液体弯月面前进跨越它们。
[0060] 在W02010/086179 A2中公开很多相引导结构的设计。
[0061]供体相会具有足够高的导电性，以便在施加电场时，带电荷的分析物化合物能够 离子转移。这可通过例如将相用一种或多种提供导电性的溶剂饱和来方便地实现，例如通 过使用用水饱和的乙酸乙酯作为供体相。用受体相中一种或多种溶剂将供体相饱和还限制 受体相或供体相中的溶剂损失。适合在供体相中使用的溶剂取决于其它两种相的性质和组 成，即必须维持三相体系。
[0062] 在将极性和/或水性相用作供体相时，适合的受体相包括但不限于非极性至中等 极性溶剂，例如线性或支化的环状或非环状烷烃或烯烃，例如丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、 环己烷、石油醚，其可任选地被卤素(特别是氯)取代;环状或非环状线性或支化的醚，例如 乙醚、叔丁基甲基醚、叔丁基乙基醚、四氢呋喃；伯、仲或叔醇，特别是烷醇，例如正丁醇、叔 丁醇、环己醇；短链羧酸与短链醇的酯，例如乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯；酮，例如丙酮、 甲基异丁基酮;芳族溶剂，例如甲苯和二甲苯，以及至少两种上述溶剂的混合物。
[0063] 在至少供体相为水性相，特别是供体相和受体相均为水性相时，申请人发现短链 羧酸与短链醇的酯(特别是乙酸乙酯)在萃取一些代谢产物时是非常有效的。
[0064] 本发明的受体相和供体相的选择取决于分离方法。
[0065] 本发明不限于两相体系，但是体系可包含其它相。优选的实施方案包含至少另外 的含有电极的受体相，其中该相与供体相或受体相导电接触。在另一优选的实施方案中，包 含第一电极的第一受体相与供体相直接接触，夹在第一和第二受体相之间的供体有效地起 隔离相的作用，并且第二受体相包含第二电极。图2描绘这样的体系;这里，将两个受体相邻 单个供体相设置，在此，两个受体相也分别与两个电极接触。这一排列可允许将同时萃取并 富集到不同受体相的阳离子和阴离子化合物分离，并因此提供高度选择性和综合性的分 析。
[0066] 在另一优选的实施方案中，以将各受体相包含在例如毛细管中的方式形成电极， 从而使阳离子和阴离子分析物均富集到各自的受体流体中。
[0067] 本发明的方法可涉及萃取阳离子分析物、阴离子分析物，还有利地涉及萃取中性 物质。在后一种情况中，通过相界面的分离可在不施加场的情况下进行，并因此简单地基于 分布萃取。
[0068] 不希望受任何特定理论限制，相信小的受体相体积可允许选择性地从供体相移出 化合物，甚至在无电场的情况下，但是后一种情况显著提高方法的效率。分布萃取可有利地 通过优化相(例如在微流体芯片中）的表面与体积的比率来优化。
[0069] 分析物化合物的离子化可通过调节PH、加入络合剂或相转移剂(例如对于碳水化 合物(糖)代谢物来说加入硼酸盐，其可起相转移剂的作用)来实现，或者简单地通过在电极 上施加足够高的电流来实现。相的界面优选起滤器的作用，确保蛋白质的过滤，并移除相界 面处的粉尘。
[0070] 可有利地调节相，以实现对于一些分析物期望的选择性。这可有利地通过改变相 的组成来实现。供体相还可包含添加剂，例如离子对，其可起相转移催化剂的作用，或者将 极性提高至期望的水平。电场也可是交替的或交流的。
[0071 ]可通过本发明的方法分离的分析物的实例包括有机化合物，例如药品、药物、着色 剂、毒物、污染物、食品添加剂和代谢产物;核苷酸，例如DNA或RNA;蛋白质、肽、氨基酸、碳水 化合物、脂质、多糖、脂肪酸和磷脂。申请人发现，由于供体相和受体相之间溶解性的差异， 例如可阻止高度带电荷的较大分子的转移，使得较小且更易运动的化合物在受体相中选择 性浓缩。
[0072]供体相可为直接从生物源取的样品，其中分析物化合物已经是溶解的状态。这可 例如是来自人的生物流体之一的样品、来自饮用水或废水的水样品、饮料、来自制备或工业 生物化学、有机或发酵方法的样品。生物样品的实例为血、血清、尿、唾液(salvia)、痰、精 液、细胞裂解液、胚胎裂解液、细胞流体、母乳或(脑)脊髓液。其它样品包括分离方法(例如 LC或HPLC)的馏分。
[0073]本发明的方法优选以使得供体相或受体相是可移动的（即可将它们从体系移除） 的方式实施。其实例为使用芯片，所述芯片包含在腔中并排的以流体连接的方式存在的受 体流体和供体流体，其中通过至少一个相引导将相边界维持在合适的位置。
[0074]可以多种方法构建相引导。一种技术涉及构建锐边(sharp edge)。在这样的锐边 上前进需要改变液-液弯月面的主半径，导致在弯月面上较高的压力下降，由此代表压力屏 障。这一概念也称作"弯月面固定"（meniscus pinning)。
[0075]因此，代表性的相引导是沿着弯月面整个长度突出伸入液体内的三维结构。将弯 月面固定在所得的延长的突出物需要液体弯月面跨越额外的能量，因此液体被限制，除非 向液体施加额外的能量。另一种代表性的相引导是突出伸入整体材料(bulk material)内 的隆起物。在这一情况下，在相引导前产生固定。此外，相引导可包含通常是有意设计的弱 位置，在此位置跨越相引导所需的能量较低。在这样的位置，如果适当地设计相引导，液体 可跨越相引导。这一有意设计的弱位置也限定了相引导的"稳定性"，这确定了在弯月面前 进或后退期间，大量液体同时面对多个相引导时，相引导溢流的顺序或优先性。
[0076] 当面对相引导的基底比相引导本身更亲水时，则创建特别通用的相引导。这样的 应用导致弯月面的伸长，并增加角及其半径对于相引导稳定性的作用。
[0077] 因此，取决于相引导的准确设计，其可以完全限制液体;或者可以仅在优选的位置 处允许液体前进或后退，使得液体沿着所选的路线，填充或排空体积中的特定空间，或者采 用特定的形状。
[0078] 代替构建为突出的屏障，相引导可由具有不同程度可湿性的体积的内表面面积限 定。另外，这样的面积可导致需要能量输入，以促进液体弯月面前进跨越它们。
[0079] 但是，可设置相引导(操作其以限定液体）以允许液体受控地穿越由相引导代表的 屏障；和/或混合限制在相引导或相引导组合(其限定插入的屏障结构）的相对侧的两种液 体。在W02010/086179A2中描述实现这些效果的设置，其中详细说明"限制性相引导"的概 念，其在本文中描述的本发明的实施方案中特别有用。
[0080] 该管可包含一个或多个所采用的相。
[0081 ]在从供体相转移组分时，富集有所述组分的受体相可通过将相从腔移除来有利地 并且简单地从受体相移出。因此，然后可使由此获得的富集的受体 流体直接进行另外的分 析分离或分离步骤，例如当将浓缩的液滴用于质谱时。适合的另外的分离和/或分析方法包 括但不限于 LC，例如 RP、NP、HILIC、TLC;CE、NMR、MS、UV/VIS、ED、纳升级LC(nanoLC)、HPLC、 UPLC;UHPLC;RP-(UV/VIS)-EV-NP-MS;RP-(UV/VIS)-EV-NMR;NP-(UV/VIS)-EV-CE-MS/RP-(UV/VIS) -EV-CE-MS; RP (UV/VIS) -EV-TLC/NP- (UV/VIS) -EV-TLC; EV-纳升级 LC 和 CE-EV，其 中MS是非常优选的。适合的MS技术的实例包括GC/MS或GC-MS/MS;特别是纳电喷雾-直接-进 样_MS(nanoe lectrospray-Direct-Infusion-MS )，例如在US-A-2010078553或WO-A-2008118808中公开的那些，其也称作Advion TriVersa(DI-MS);CE-MS;LC-MS;GC-MS和NMR。
[0082] 进入本发明的方法的分析物还可以是上述公开的分离方法的所得物。受体相可以 是氘化相，其中富集的电萃取样品可进行NMR方法检测。
[0083] 通常，本发明的方法允许将分析物从较大的供体相浓缩到小的受体相中，从而导 致分析物的浓缩。后者对于不够敏感的方法是重要的，因此进一步应用由此浓缩的受体相， 其中溶剂的存在例如对于方法的分离度会是有害的，所述方法例如其中需要交换溶剂的分 离方法。
[0084] 本发明的装置还涉及从两个移动的流体相电解萃取的装置。
[0085] 可如此改善装置的几何结构，使得就液-液界面之间的接触面积而言的效率最大 化，降低分析物迀移路径长度，并由此降低迀移时间，以及当对于各具体应用，该分析物供 体溶液变得快要耗竭时供给样品溶液的自动控制机制。此外，可有利地修改装置，并使其自 动化，使其与检测和/或分离方法(CE-MS或LC-MS)在线联用。所述装置还可联用多维分离平 台，例如LC X LC和LC X CE，其包含LCxLC领域技术人员目前未知的调控技术。
[0086] 认为截面的具体几何结构是不相关的，条件是所述装置适合转移流体，例如还可 应用于刻蚀在微流体芯片中的通道，并且允许应用一个或多个相引导。
[0087] 对于溶剂和/或液体进料中携带的组分而言，适合的壁材料是基本上惰性的，并且 在本发明的主题装置中采用的温度或条件下也不变形。代表性的材料包括硅、金属和/或合 金，例如金、铜或不锈钢、玻璃和热固性聚合物材料，例如交联环氧树脂、聚甲基丙烯酸甲 酯、环烯烃(共)聚合物、聚酰亚胺、氟-乙烯聚合物和/或聚碳酸酯。
[0088]优选的装置包含电解萃取芯片，电解萃取芯片由惰性的、基本上不导电的材料(例 如环烯烃共聚物)制成，这归因于它的光学(透明）和化学(对于有机溶剂相对惰性)性能。所 述芯片优选包含至少两个通道，这两个通道各自具有入口和出口，并且通过相引导分隔。或 者，可使用平板印刷方法由晶片(waiver)(例如硅)刻蚀芯片，以限定两个通道、导管和/或 轮廓相引导。
[0089] 然后可将电极有利地沉积(例如通过溅射)在给定位置处的表面。
[0090] 优选的实施方案包括两个8mm宽的、正交溅射置于通道壁上的薄膜铂电极。
[0091] -旦引入有机供体相和一个或多个水性受体相，垂直于有机相的流动施加电场， 进行电解萃取方法。
[0092] 通过使用相引导来实现稳定的双相界面，相引导通常是存在于流体通道中的小特 征(feature)，其由于弯月面固定效应而将液-液界面稳定。非常易于引入任意芯片结构，并 降低污染风险。
[0093] 受体相通常与第二电极导电接触。这可通过在至少一个与受体相接触的点加入导 电材料，从而形成第二电极来方便地实现;或者通过使受体相与装置的腔中的电极接触来 方便地实现。
[0094] 样品可包含溶解的组分，或者在供体相中悬浮或乳化的组分。
[0095] 实施例1
[0096] 在如图1所示的用于电解萃取的装置中进行实验。
[0097] 材料和方法
[0098] 化学品：甲苯、2-丙醇、乙腈（ACN)和甲醇（均为分析级）购自Biosolve B.V. (Valkenswaard，荷兰）JCS试剂级2-丙醇、EtOAc(分析级）和酰基肉碱（肉碱、己酰基肉碱、 辛酰基肉碱和月桂酰基肉碱)购自Sigma-Aldrich(St .Louis ,MO,美国）。脱矿质水为使用 Merck MiIlipore水纯化系统（Billerica ,MA，美国）内部制备的。结晶紫（CV)购自Merck (Darmstadt，德国）。甲酸（FA)购自 Fisher Scientific-Acros Organi cs( Hampton，NH,美 国）。
[0099] 仪器和材料
[0100]用于沉积1〇〇111]1厚的钼电极的薄膜沉积系统是由〇61'1丨1^〇11(?_每￡^&〇11，瑞士）制备 的Leybold Heraeus Z-400。具有中心尖的两件式注射器(Two-part syringe)(2.5ml)购自 Terumo(Tokyo，日本）dKDS 100注射栗购自 KD Scientific Inc · (Holliston，MA,美国）。用 Capella MCE电源，CapiliX(Leeuwarden,荷兰）施加电场。十八烷基InertsiI 0DS-3柱（5μ m, 100mm X I ·0mm)购自GL Sciences Inc · , (Torrance,CA,美国）oHPLC为Agilentl 100系列 (Santa Clara,CA,美国）。检测器为Bruker Daltonics MicrOTOF质谱仪（Bremen,德国）。 [0101] 芯片的制备
[0102] 基于对乙酸乙酯的化学耐性，选择环烯烃共聚物（COC)载玻片（75.5 X 25.5 X 1.5mm)作为芯片衬底。COC芯片从Microfluidic ChipShop GmbH(Jena,德国）获得。使用计 算机辅助设计软件设计芯片。Dassault Systgmes SolidWorks Corp. (V6lizy-Vi I Iacoublay,法国）的 Solid Works? Premium 2010 用于产生模型，CNC Software , Inc · (Tolland,CT,美国）的 Mastercam? Design X3用于通过ArtSoft USA产生G-代码和 Mach3,并且 Newfangled Solutions LLC(Fayette, ME,美国）的一部分用于在 Taig 3000CNC-铁刀（mill), Supertech EMC-xy z-GSBX 驱动器（Phoenix ,Arizona,美国）的XYZ 运 动中对G-代码解码。以5.000RPM，100mm/min的供给速率，0· Imm/步的步距(plunge step)， lmm/min的主轴进刀速率(plunge rate)操作铣刀（0.50mm直径）。用软刷移除毛边，通过用 水清洗芯片表面并最终用压缩空气将所述芯片吹干来移除颗粒。提供掩模以保证薄膜铂的 溅射，以实现电极。在〇.5kV，在大约10-5mbar，采用40标准立方厘米/分钟的氩气流进行铂 沉积，持续40。所述溅射工艺得到大约75- 125nm厚的电极。通过溶剂粘合将载玻片密封。通 过将衬底表面置于70:30体积/体积％的甲苯和2-丙醇中持续45秒，使衬底表面活化。用过 量的ACS试剂级2-丙醇淬灭活化工艺，并使用压缩空气将表面干燥。在对准(aligning)衬底 后，使用以25.97kg/cm 2( ± 1.56kg/cm2)操作的热压机（110°C)密封芯片，持续15分钟。
[0103] 所制备的电解萃取芯片的概述
[0104]通过微细铣削(micro-mi I ling)和溶剂粘合技术制备如图1所示的EE-芯片。分析 物供体通道的尺寸为15.OOx 2.OOx 0.50mm，并且分析物受体通道的尺寸为10.OOx 2.OOx 0.50。所有的铣削特征具有±0.05mm的精确度。位于分析物供体通道和受体通道中间的衬 底材料的隆起物（8.0 0 X 0.4 0 X 0.2 0mm)用作两种不混溶的溶剂流的稳定剂。两个大约 8. OOmm长和75-125nm厚的垂直电极沿所述通道溅射。在通道的起始端和末端处钻孔（ID 1.2mm)，其用作溶剂入口/出口。使用溶剂粘合技术来制备密封的芯片。
[0105]通过将EE工艺的典型的耗竭和浓度效应可视化来评估芯片-E E的可行性。图2a中 的黑色箭头标记沿不流动的水性相流动的乙酸乙酯(EtOAc)溶液的流动方向，所述乙酸乙 酯(EtOAc)溶液含有结晶紫离子并且以30yL/min流动。在施加 OV和80V各30秒后获得的结晶 紫的耗竭和浓度性质如图2b和图2c所示。白色虚线强调耗竭和浓度性质。芯片的流速的实 际芯片处理能力为在IkV的电势下大约300yL/min。由于焦耳加热，更高的流速和电势导致 显著的突破效应或EE方法的中断。
[0106] 最优流速和电压的确定
[0107] 通过包含三种酰基肉碱（己酰基肉碱;辛酰基肉碱；月桂酰基肉碱）的样品的基于 芯片的电解萃取以及通过LC-MS分析水性样品等分试样来评估三种流速(例如50、75和100μ L/min)和四种萃取电压(例如0、100、300和500V)中的最适条件。在OV下，尚没有电场，由于 扩散，分析物会从有机相缓慢地迀移至水性相。扩散能够将大约15%的初始肉碱浓度转移 至水性相。在100V下，电场将带正电荷分析物向水性相的迀移速率加速。从水性相回收大约 50 %的肉碱。在300V下，对于所有三种分析物供体流速，回收大约100 %的肉碱。在500V下， 回收率降低至50 %。
[0108] 线性和重现性
[0109] 通过在20-200nM范围内的六个浓度水平下的辛酰基肉碱和月桂酰基肉碱的LC-MS 分析，测试芯片萃取的分析物的线性。所有浓度水平一式三份地测量。将辛酰基肉碱和月桂 酰基肉碱在乙酸乙酯中溶解，以5〇μ?7π?η的流速栗抽，并在300V下萃取。样品混合物还包含 IOOnM浓度的己酰基肉碱，其用作内标。所示的对于辛酰基肉碱和月桂酰基肉碱获得的回归 系数分别为〇. 9909和0.9888。
[0110]通过比较校正曲线斜率的相对标准差来得到方法的重现性。
[0111] 增强因子
[0112]通过除以四种模型化合物的MS信号比率来测定用芯片-EE体系获得的信号增强因 子。在300V和OV下获得信号比率，后一电压为对于被动扩散导致的分析物转移的对照实验。 [0113]为了通过芯片-EE测定对于MS的信号增强因子，制备包含三种肉碱和肽（己酰基肉 碱、辛酰基肉碱和血管紧张肽)的样品。
[0114] 将分析物由ImL的有机供体相萃取到X mL的水性相。其中施加0伏的对照实验用于 测定分析物通过被动扩散由有机相转移到水性相的效应。然后将水性相收集到Eppendorf 小瓶(2mL)中，并通过LC-MS离线测量。将实验在不同的浓度水平下重复三次。对于其中施加 30伏电势的实验，重复同一实验条件。在图6中显示对于两种肉碱和肽的信号的示例性增 加。
[0115] 在所测试的浓度范围下，两个校正曲线均显示良好的线性。95%的置信区间表明 对于辛酰基肉碱和对于月桂酰基肉碱的回归均显著超过0。通过比较校正曲线斜率的相对 标准偏差来检查方法的重现性。发现相对标准偏差是令人满意的，对于辛酰基肉碱曲线为 20%，对于月桂酰基肉碱曲线为21%。通过用5%FA(v/v)水溶液填充并施加电压来测试每 一新批次的芯片。如果测量的电流与另一芯片相同，则评价所述芯片性能良好。
[0116] 上述实施例说明本发明的主题方法和装置的有效性，特别是当联用高敏感性分析 方法，例如纳电喷雾-直接-进样-MS时。
【主权项】
1. 将化合物从移动的流体供体相电解萃取到受体相中的方法，其包括以下步骤： a) 提供导电供体相，所述导电供体相以第一流速移动并与第一电极导电接触， b) 提供导电受体相，所述导电受体相与所述供体相直接接触并与所述供体相不混溶， 而且所述导电受体相与第二电极导电接触；以及 c) 提供支持性的或限制性的相引导模式，以在供体相与受体相之间保持限定的界面， 以及 (d)在所述第一电极与所述第二电极之间施加电场。2. 权利要求1的方法，其中所述受体相以低于所述第一流速的第二流速与所述供体相 在相同方向移动，所述受体相优选是不流动的。3. 前述权利要求中任一项的方法，其中在所述方法的时间范围和条件下，所述供体相 和/或受体相保持不混溶。4. 前述权利要求中任一项的方法，其中以足够长的时间施加足够高的电场，以使得至 少部分的分析物化合物从所述供体相迀移至所述受体相，或者迀移至供体相与受体相之间 的界面。5. 前述权利要求中任一项的方法，其中另外的受体相存在于所述第一受体相的相对侧 并与所述供体相直接接触，并且其中所述第一电极设置在所述另外的受体相中，并且其中 与所述供体相的导电接触通过所述另外的受体相发生。6. 前述权利要求中任一项的方法，其还包括移出包含迀移的分析物的受体相，并使所 述移出的受体相接受另外的分离和/或分析方法。7. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述供体相来自前面的分离和/或分析方法。8. 权利要求6或权利要求7的方法，其中所述另外的分离和/或分析方法包括LC，例如 RP、NP、TLC;CE、NMR、MS以及联用的方法，例如GC/MS或GC-MS/MS;特别是纳电喷雾-直接-进 样-MS、UV/VIS、纳升级LC、HPLC、UPLC;RP- (UV/VIS) -EV-NP-MS;RP- (UV/VIS) -EV-NMR;NP-(UV/VIS)-EV-CE-MS/RP-(UV/VIS)-EV-CE-MS;RP(UV/VIS)-EV-TLC/NP-(UV/VIS)-EV-TLC; EV-纳升级LC和CE-EV。9. 用于权利要求1-8中任一项的两相电解萃取方法的装置，其包括： (i) 通道，所述通道用于运输流体流并具有由通道底和两个通道壁限定的体积;和 (ii) 第一电极，所述第一电极用于接触第一相并设置于所述通道壁之一，以及第二电 极，所述第二电极用于接触第二相并设置于与所述第一电极相对的通道壁，以便在与流动 方向正交的方向上施加电场，以及在两个电极上施加电场的设备；以及 (iii) 轮廓相引导，所述轮廓相引导设置于所述通道底，并在距所述通道壁给定距离 处，从入口导管至出口导管沿着所述底的轮廓设置，所述轮廓相引导通过将相边界的弯月 面固定在所述相引导来将至少两个相分离。10. 权利要求9的装置，其中腔被在所述腔内部形成的至少一个相引导在内部分为至少 第一体积和第二体积，其还包括： (iv) 至少第一和第二入口流体导管，所述至少第一和第二入口流体导管与所述通道腔 和所述导管的上游外部以流体连接，其中所述第一和第二入口导管分别与第一和第二体积 以流体连接，以及 (iii)至少第一和第二出口导管，所述至少第一和第二出口导管分别与所述腔体积的 第一和第二下游部分以及所述通道的外部以流体连接。11. 权利要求9或10的装置，其中所述相引导包括凹槽、隆起物或具有不同可湿性的材 料，并起到毛细管压力边界的作用，跨越流动的液-液弯月面的整个长度，使得所述弯月面 至少部分地沿所述相引导对齐。12. 权利要求9-11中任一项的装置，其中所述通道包括两个相引导，所述两个相引导在 填充方法期间的一些时间点及时限制前进或后退的液体，其中所述相引导的区别在于它们 对于以预定顺序限制所述相引导的顺序和/或选择性溢流的稳定性。13. 权利要求9-12中任一项的装置，其中所述通道是基本上透明的。14. 权利要求9-13中任一项的装置，其中所述通道壁之间的距离(通道宽度)为100μπι至 2mm〇15. 权利要求10-14中任一项的装置用于富集组分、过滤蛋白质和/或从生物样品中移 除粉尘的用途。16. 制备用于两相电解萃取的装置的方法，其包括： (a) 提供合适的惰性基质材料，以及 (b) 将所述基质材料成形为通道和所述通道中的相引导，所述通道包括至少两个通道 壁以及至少一个入口和一个出口导管，以及 (b)向所述通道壁提供电极。
【专利摘要】本发明涉及将将化合物从移动的流体供体相电解萃取到受体相中的方法，其包括以下步骤：提供导电供体相，所述导电供体相以第一流速移动并与第一电极导电接触，提供导电受体相，所述导电受体相与所述供体相直接接触并与所述供体相不混溶，而且所述导电受体相与第二电极导电接触；以及提供支持性的或限制性的相引导模式，以在供体相与受体相之间保持限定的界面，以及(d)在所述第一电极与所述第二电极之间施加电场。
【IPC分类】B01L3/00, G01N1/40, B01D11/04
【公开号】CN105492883
【申请号】CN201480041892
【发明人】J-W·斯洪恩, P·林登伯格, V·范杜伊内恩, A·厄迪特, P·武尔托, T·汉克迈耶
【申请人】莱顿大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年6月19日
【公告号】EP3011305A1, US20160114261, WO2014204311A1
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