用于体液中的颗粒和可溶性化学实体的体外检测的系统和方法
用于体液中的颗粒和可溶性化学实体的体外检测的系统和方法
【技术领域】
[0001]本发明总体上涉及体液中的颗粒和化学实体的体外检测。具体而言，本发明涉及
[1] 识别、分类以及计数体液中的颗粒和/或(2)确定体液样品中的可溶性化学实体的浓度 的系统和方法。
【背景技术】
[0002] 体外医学诊断测试广泛地用于检测体液中的异常，作为诊断疾病的辅助。大多数 的这种测试在复杂的、高度自动化的、昂贵的仪器中处理大量体液样品的医院实验室或参 考实验室内发生，这些仪器需要昂贵的维护成本，并且需要高技能的操作人员来执行和解 释测试并且确保仪器适当地操作。
[0003] 由于实验室系统较大并且复杂，所以个人不能在家里、在大部分医生的办公室内 或者甚至在门诊诊所或急诊室内使用。在这些设置中存在测试的需要，来减少将样品输送 给远程实验室的需要，并且提供更多立即应答，这些立即应答可以及时改变患者行为或者 医生介入和治疗。
[0004] 为了满足这种床边检测的需要，已经研制了几种系统。最值得一提的是，广泛使用 葡萄糖测试仪来监控血糖水平，作为控制胰岛素使用的辅助，并且改变糖尿病患者的饮食 习惯。不用仪器的干化学测试条用于检测尿液(尿液分析)的异常、大便标本的直肠的流血、 以及使用尿液分析试条的怀孕。诊断制造商研制了一些系统，用于检测在血液和尿液内的 细胞，这些系统不如中心实验室等效物复杂，但是这些系统依然相当昂贵并且操作复杂，因 此，未满足血液学的护理装置的真正需求点。使用仪器仪表的免疫测定的床边检测系统迄 今为止在很大程度上不成功。
[0005] 显然，由于实验室分析人员使用广泛不同的技术来实现这些类型的化验所需要的 敏感度和精度的苛刻要求，所以没有单个仪器或技术可以执行通常在医院实验室执行的大 量测试。由于用户仅仅想要购买一种仪器，所以具有可以执行大量测试的仪器是非常可取 的。这不仅减少了初期投资，而且降低了操作和保持很多不同装置的复杂度。
[0006] 直到最近，使用数字成像的床边检测显微镜的设计不实际。显微镜样品在研究实 验室内进行了一段时间的数字成像。直到最近，用于这些系统内的传感器昂贵。而且，直到 最近，传感器具有有限数量的像素，构成具有差质量的显微镜数字图像的分辨率并且仅仅 允许具有小视野。这个限制通常难以精确地识别和分类体液颗粒，并且同时难以观看足够 大的体积，以提供精确地计算统计。而且，直到最近，用于显微镜检查中的传感器的辐射源 昂贵、难以保持并且难以用于简单设计中。
[0007]过去10年见证了 CMOS和CCD技术的大幅改进，大幅降低价格并且提高了成像传感 器的分辨率。电磁辐射源（最明显地，LED技术）也具有演变，能够辐射显微镜样品，用于传 输、散射、荧光以及磷光。这些技术进步现在允许设计通过新型方式使用这些部件的系统， 以实现便宜、高质量以及通用的数字显微镜。通过使用与用于中心实验室系统内的检测器 相当的对辐射和敏感度具有响应的CMOS传感器，能够使用利用CMOS传感器的数字显微镜来 执行化学和免疫测定测试，具有与医院实验室系统相似的特征。
[0008] 现有医院实验室仪器在其成本和复杂性方面也具有缺点。例如，在用于血液学和 尿液分析的实验室流式细胞仪内，假设流过检测器的颗粒与干扰颗粒广泛地分开，以便所 获得的任何信号来自单个颗粒，没有背景干扰。这导致例如，在使用Sysmex分析仪分析的尿 液样品中具有无定形水晶时，造成红血细胞和白血细胞的识别和分类具有误差。甚至在使 用高度敏感并且昂贵的光电放大器检测器时，使用流动分析的所有实验室血细胞计数器 (流式细胞仪)必须使用昂贵的激光源，来实现检测高速穿过该激光源的单细胞的信号。这 种方法需要辐射、辐射检测部件以及复杂的射流控制，其昂贵并且需要由高度训练的人员 操作和维修。本发明克服了在颗粒识别、分类以及计算中具有更低成本和更低复杂度的所 有这些限制。
[0009] 免疫测定通常需要复杂的仪器，其协同多个反应步骤，以实现很多免疫测定需要 的高敏感度和特异性。通常，免疫测定需要分离步骤。这个步骤尤其需要复杂的机械和流体 处理操作，这使低成本分析仪不实际。本发明不需要洗涤，因此，使使用在本发明中描述的 检测方法的免疫测定降低成本和复杂度，这是在床边检测装置中可取的特征。
【发明内容】
[0010] 本公开涉及一种将在视野内的二维物体分类的显微镜方法、一种测量设备、以及 一种用于测量设备的样品室。进一步，公开了一种执行免疫测定的方法以及一种执行期望 的化学实体的化验的方法。
[0011] 本公开涉及一种体外诊断测试系统和方法，用于执行血液学、化学、尿液分析以及 与使用体液的免疫测定相似的测试。本发明可以使用具有有线或无线连接性的任何计算 机，例如，USB端口或蓝牙连接能力，分别用于与单独显微镜测量设备通信。本发明可以使用 嵌入测量设备内的计算机。
[0012] 计算机可以与台式计算机一样复杂，或者与平板电脑一样简单，例如，微型iPad或 Samsung Galaxy。包含应用软件，其允许用户识别样品，选择要进行的测试，并且开始测试 序列。使用蓝牙无线地或者通过USB连接硬连线地将高电平信号传输给显微镜设备。可替代 地，计算机可以嵌入测量设备内。
[0013] 公开一种将在视野内的作为二维物体的颗粒分类的显微镜方法。所述方法可以包 括通过第一电磁辐射源，照射所述视野;并且投射所产生的图像(第一图像)在图像传感器 上，以获得所述视野的第一数字表示。所述方法可以包括使用所述第一数字表示来识别在 所述第一数字表示内的第一物体;并且使用所述第一物体边缘的边缘坐标来限定包含在所 述第一物体的第一数字表示内的限制所述第一物体的区域的区域，然后，确定所述第一物 体的一个或多个物体特性。可选地，该方法包括通过从所述第一物体的第一数字表示的边 界中减去一个像素来分离接触的颗粒。所述方法可以包括使用所述边缘坐标或至少一些边 缘坐标来限定与第一物体的边缘相邻但是位于所述第一物体外面的区域，以计算所述第一 电磁辐射的背景强度，并且补偿背景强度，例如，通过从所述第一物体的电磁强度中减去这 个平均背景强度。所述方法可以包括使用在所述第一物体(第一图像)的边缘内的区域的电 磁强度，来通过参考标准曲线或其他参考曲线，确定在吸收光的第一物体内的颗粒特性。
[0014] 还公开了一种显微镜测量设备，其包括图像传感器、物镜以及一个或多个电磁辐 射源，包括用于照射显微镜镜台的第一电磁辐射源和/或用于照射显微镜镜台的第二电磁 辐射源。所述图像传感器可有线或者无线连接至单独计算机，所述计算机被配置为从在所 述显微镜设备内的所述图像传感器收集的图像中识别物体并且将物体分类。
[0015] 进一步，公开了一种供显微镜测量设备使用的样品室，所述样品室包括相隔5和50 微米的两个平面，用于包含样品，所述样品室被配置为包含介于5与IOOuL之间的液体，所述 样品室的形状允许使样品均匀地并且可再现地填充至所述样品室，并且防止在完成分析之 前移动样品或者蒸发样品。
[0016] 公开了一种进行免疫测定的方法，所述方法使用显微镜测量设备，所述显微镜测 量设备包括图像传感器、物镜、用于修改辐射、发射或散射辐射的光特性和/或用于引导透 射、散射的电磁福射以及发射的电磁福射的可选的滤光器组件、可以导通和断开的至少一 个电磁辐射源，并且所述显微镜测量设备被配置为与单独计算机有线或者无线通信，该计 算机包含成像软件并且被配置为从在所述显微镜设备内的所述图像传感器收集的图像中 识别物体并且将物体分类。所述方法包括一个或多个以下步骤：
[0017] a)使用连接至以介于每分钟0 · Imm与每分钟2mm之间的速率沉淀在水溶液中的分 散的固相颗粒的特异性抗体以及特异性地结合于全血中的分析物的颗粒上的抗体；
[0018] b)竞争性使用标记的分析物或者非竞争性地使用标记的覆盖抗体，检测连接至抗 体结合的固相的分析物，其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供 足够浓度的颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤，其中，沉淀颗粒的图像由第 一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的边界或边缘，以及
[0019] c)在暴露到第二电磁福射中之后，确定位于由第一电磁福射限定的边界内的电磁 辐射的强度；以及
[0020] d)在暴露到第二电磁福射中之后，确定位于由第一电磁福射限定的边界外的电磁 辐射的强度，并且从位于由第一电磁辐射限定的边界内的电磁辐射的强度中减去位于由第 一电磁辐射限定的边界外的电磁辐射的强度，有效地减去背景电磁辐射，由此比较第二电 磁辐射的强度和标准曲线，以推导出化验的分析物的浓度。
[0021] 进一步地，公开了一种使用结合伴侣进行期望化学实体的化验的方法，用于连接 至可分散的固相物体的期望化学实体，所述显微镜测量设备包括图像传感器、物镜、用于修 改辐射、发射或散射辐射的光特性和/或用于引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电磁辐 射的可选的滤光器组件、能够导通和断开的至少一个电磁辐射源，并且所述显微镜测量设 备被配置为与单独的计算机有线或者无线地通信，所述计算机包含成像软件并且被配置为 识别并且分类从所述显微镜测量设备中的所述图像传感器收集的图像中的物体，并且控制 用于按照通过以下将视野内的二维物体分类的方法来操作显微镜的软件：
[0022] a)利用第一电磁辐射源来辐射所述视野内的物体，
[0023] b)将生成的图像投射到图像传感器上，
[0024] c)使用所述视野内的物体的生成的数字表示，来使用ImageJ软件识别颗粒作为所 述数字表示内的物体，
[0025] d)使用每个物体的边缘的坐标来限定在所述物体的所述数字表示内包含的围绕 每个物体的区域的区域，
[0026] e)确定每个物体的数字表示中的面积、直径和平均强度，
[0027] f)通过从所述物体的所述数字表示的边界中减去一个像素来分离接触的颗粒，使 得接触颗粒能够被识别、枚举和适当地分类，
[0028] g)使用所述边缘坐标来限定与物体的边缘相邻但是位于所述物体外面的区域，以 计算电磁源的背景强度，并且从每个物体的数字表示的边缘内包含的物体的电磁强度中减 去平均的该背景强度，
[0029] h)使用在物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收光的 物体内的化学实体的浓度，
[0030] i)根据将所述第一组物体进一步分类到子集的需要，根据提供关于所述物体的所 述数字表示的预定边界内的物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁源顺序地询 问相同的第一物体，以及
[0031] j)利用η个额外的第一电磁辐射源询问相同视野，每个电磁辐射源因以下而区分 开:基于物体的电磁特性来唯一地区分所述视野内的物体的一些电磁特性;然后，利用尽可 能多的额外电磁辐射源曝光物体，以细分包含在由第一电磁辐射源识别的边界内的物体，
[0032] k)使用连接至分散的固相的任何结合伴侣，来捕捉体液中的期望的化学实体，并 且竞争性地使用所述化学实体的第二标记的捕捉伴侣或者非竞争性地使用所述期望的化 学实体的标记的衍生物来检测所述期望的化学实体；
[0033] 1)其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供足够浓度的 颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤；
[0034] m)其中，沉淀颗粒的图像由第一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的 边界或边缘；
[0035] η)以及在暴露于第二电磁福射中之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的边界 内的电磁辐射的强度；以及
[0036] 〇)在暴露于第二电磁福射中之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的边界外的 电磁辐射的强度，并且从位于由所述第一电磁辐射限定的边界内的电磁辐射的强度中减去 位于由所述第一电磁辐射限定的边界外的电磁辐射的强度；以及
[0037] ρ)比较所述第二电磁辐射的强度和标准曲线，以推导化验的分析物的浓度。
[0038] 显微镜设备的宽度和高度与iPad相似，但是几英寸的厚度(虽然具有更大的版本） 在某些应用中有用。该设备的设计具有简单的概念，并且制造和操作成本低。
[0039]显微镜设备使用显微镜检测来检测在体液内的颗粒，例如，白血细胞或红血细胞。 为了实现这个目的，该设备具有利用不同波长、方向以及特性的照射依次照射样品的阵列。 样品吸收、散射并且可以重新发射由物镜放大的电磁辐射的并且投射在CMOS或CCD传感器 上。传感器的数字图像传送给计算机，其中，图像处理软件识别、分类并且枚举在图像内物 体。
[0040] 本发明的独特特征是使用物体的不同照射装置获得视野的多个图像的概念，而视 野保持静止。通过使用不同照射装置获得视野的多个图像，最终能够正确地识别和分类物 体。
[0041] 本发明的另一个特征在于，使用电磁辐射的一个源的第一数字图像用于基于在这 个图像内的每个物体的一个照射特性来识别物体坐标和边界，然后，使用不同的电磁辐射 捕捉一个或多个额外图像。由于具有使每个图像注册(registering)至第一个图像的装置， 所以能够验证每个数字图像的特性是第一物体的特性。在基于单个图像的普通显微镜中， 背景信号可以误解为属于物体。
【附图说明】
[0042]图1示出了通过利用第一电磁辐射，接着利用第二电磁辐射照射样品中沉淀到样 品室的底部的物体所创建的数字图像的实施例；
[0043]图2示出了与包含图像处理应用程序和用户界面软件的计算机一起使用的显微镜 测量设备的构造；
[0044] 图3示出了显微镜测量设备的部件的示意图；
[0045] 图4不出了样品室的侧视图和顶视图的不意图；
[0046] 图5示出了计算机上的软件应用程序和显微镜测量设备上的固件应用程序以及软 件和固件应用程序如何协同处理的示例性步骤；
[0047] 图6示出了操作人员可以执行的用于处理血液样品的步骤；
[0048] 图7示出了使用本发明的免疫测定应用；以及 [0049 ]图8示出了针对网状细胞应用的图像处理步骤。
【具体实施方式】
[0050] 在本发明的以下描述中，参照构成本发明的一部分的附图的描述，并且在附图中 通过说明的方式，示出了说明本发明的原理的示例性实施方式以及可以实践本发明的方 式。要理解的是，其他实施方式可以用于实践本发明，并且在不背离本发明的范围的情况 下，可以对其作出结构和功能的变化。进一步，关于附图记载的特征不必限于在图中公开的 特征的具体组合。
[0051] 所述方法可以包括根据将第一物体进一步分类成第一子集的需要，根据提供关于 第一物体的第一数字表示的预定边界内的第一物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多 的电磁福射源，例如至少2个、3个或更多个来顺序地询问（interrogating)第一物体。
[0052] 所述方法可以包括通过第二电磁辐射源询问所述视野，以获得所述视野的第二数 字表示，所述第二电磁辐射源与第一电磁辐射源由一些电磁特性来区分开，基于第二物体 的电磁特性唯一地区分在所述视野内的第二物体。然后，所述方法可以包括根据进一步将 所述第二物体分成第二子集的需要，根据提供关于所述第二数字表示的第二物体的唯一光 学信息的需要，利用尽可能多的额外电磁辐射源来暴露所述第二物体，以再细分包含在由 第一电磁辐射源识别的边界内的物体。
[0053]所述电磁辐射源辐射可以被配置为辐射具有从IOOnm到2000nm的范围中选择的波 长的光。所述光可以包括紫外线、可见以及红外线光谱的部分。
[0054]所述电磁辐射源辐射可以被配置为辐射从IOOnm到1000 nm的范围中选择的波长的 光。所述光可以促使天然存在的荧光团或人工导入的荧光团的荧光激发。由所述激发的荧 光团发射的光可以用于产生帮助将相应的物体分类的图像。
[0055]所述电磁辐射源辐射可以被配置为辐射从IOOnm到2000nm的范围中选择的波长的 光。可以由在所述物体内 的化学实体或颗粒吸收光，以便包含所述吸收实体或颗粒的相应 图像具有更低强度的检测的电磁辐射。
[0056]所述方法可以包括使用通过不同的角度贯穿（intersect，相交)所述样品的电磁 辐射源，来造成在所述视野内的物体具有不同强度的电磁辐射散射。
[0057]所述方法可以包括:使用通过与所述检测的传感器区域0到80°垂直来贯穿所述视 野内的物体的电磁辐射，例如，第一电磁源和/或第二电磁源，以便所述显微镜的物镜捕捉 通过不同的角度散射的光，例如，第一电磁源的第一角度和/或第二电磁源的第二角度。第 一和第二角度可以不同。
[0058] 所述方法可以包括使用具有相同或不同的偏振特性的电磁源，例如，具有第一偏 振特性的第一电磁源和具有第二偏振特性的第二电磁源。
[0059] 所述方法可以包括使用引起天然存在的磷光体和/或认为导入的磷光体的磷光的 电磁源。
[0060] 所述方法可以包括使用透射的光源从血红蛋白的俗特谱带来创建来自动物或人 的血液中的红细胞的图像。所述方法可以包括使用这些图像来计算颗粒特性，例如，红细胞 的面积、直径以及体积、在红细胞内的血红蛋白的浓度。可以通过激发连接至在网状细胞内 的网硬蛋白的核酸结合荧光团，来在所有红细胞之中确定网状细胞。所述方法可以包括识 别具有荧光发射的那些红细胞。
[0061 ]所述方法可以包括通过荧光团处理动物或人的体液的白细胞。所述方法可以包括 (例如)使用激发光源检测白细胞。可以在检测传感器上投射所述发射光，以形成荧光白细 胞的数字表示。所述方法可以包括使用核酸结合的荧光团，来检测动物或人的体液的白细 胞。可以从吖啶酯、噻唑橙以及溴化乙啶的组中选择所述核酸结合的荧光团。
[0062] 所述方法可以包括计算所述荧光发射实体的直径、浓度以及与所述二维荧光图像 对应的物体的体积。所述方法可以包括使用一个或多个特性，例如，所述荧光发射实体的直 径、浓度和/或所述物体的体积，来帮助将白细胞分成淋巴细胞、粒细胞以及单核细胞。
[0063] 所述方法可以包括使用两个或多个荧光激发源或者两个或多个荧光发射检测波 长来检测不同的发荧光种类，以便可以检测在白细胞内的不同实体。所述方法可以包括使 用荧光的强度和量来进一步将白细胞的子集分类。
[0064] 所述方法可以包括使用从300nm到SOOnm的可见光，所述可见光通过与所述传感器 成60到90°垂直的角度照亮粒细胞，例如，以便在白细胞内的细胞质颗粒激烈地散射光，而 没有颗粒的细胞质不散射光或者散射具有非常低的强度的光。
[0065]在该方法中，可以首先使用荧光(第一图像)来确定人类或动物体液的白细胞，然 后，将淋巴细胞和单核细胞确定为具有可以忽略的散射光的图像(第二图像）。
[0066]所述方法可以包括使用1到50个兆像素图像传感器，例如，CMOS或C⑶传感器。
[0067] 可以通过电子开关导通和断开所述电磁源，电子开关提供利用2-10个不同的电磁 源依次询问相同视野的能力，这仅仅由电磁源的空间的约束条件以及用于成像所述视野的 时间的约束条件限制。
[0068] 所述方法可以包括具有一次性或者可再用的观察室，其包含感兴趣的颗粒的液体 分散并且允许计算在统计上的大量(significant number)颗粒。所述观看或样品室可以具 有在50微米与IOmm之间的厚度。
[0069] 所述方法可以包括将物镜放在所述检测CMOS或CCD传感器之间，所述物镜提供充 分的放大倍数，以确定物体尺寸，且也具有充分的视野，以允许在统计上大量计算在所述视 野内的物体。所述物镜可以具有在2X与15X之间的放大倍数。
[0070] 所述方法可以包括使用用于识别红细胞的红细胞俗特谱带以及用于检测白细胞 的核酸结合荧光团的荧光来检测在体液内的红细胞和白细胞，而没有分离和/或溶解红细 胞。
[0071] 所述方法可以使用球形化试剂，例如但不限于N-十二烷基-N，N_二甲基-3-铵基_ 1-丙磺酸钠，来将红细胞从双凹圆盘转换成均匀的球体。所述球形化试剂不影响白细胞的 形态或散射特性。
[0072] 所述方法可以使用保持红细胞的自然双凹圆盘形状的试剂。
[0073] 所述方法可以包括在30秒到10分钟内选择性溶解红细胞，而不影响白细胞的形态 或光散射特性。
[0074]所述方法可以将氯化铵pH 8.0(例如，0.1 M氯化铵)用作具有或没有球形化试剂的 红细胞溶解试剂。
[0075] 所述显微镜测量设备用于检测在体液内的颗粒或高或低分子量化学实体。体液可 以包括但不限于血液、尿液、脊髓液、唾液、腹膜液以及肺灌洗，并且提供使用单个测量设备 的完整范围（complete range，全套)体外诊断测试。
[0076] 所述显微镜测量设备可以被配置为执行血液学、尿液分析、化学过程、免疫测定 和/或凝结的体外诊断测试中的一个或多个。
[0077]所述显微镜测量设备可以包括滤光器组件，其包括第一滤光器、第一反射镜以及 第一分束器中的至少一个，所述第一滤光器被配置为修改辐射、发射或散射辐射的光特性， 所述第一反射镜和/或所述第一分束器被配置为引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电 磁辐射。
[0078]所述光学组件可以被配置为将所述物镜的光从垂直平面重新引导到水平平面，以 便相机的高度介于2cm与15cm之间。
[0079]所述显微镜测量设备可以包括放在所述显微镜镜台之下的光源，例如，灯圈。所述 光源可以被配置为用于正面落射光照明（front surface epi-illumination)。
[0080] 所述显微镜测量设备可以被配置为提供透过所述物镜的正面落射光照明。
[0081] 所述显微镜测量设备可以被配置为执行荧光显微镜检查。所述显微镜测量设备可 以被配置为执行透射显微镜检查。所述显微镜测量设备可以被配置为执行光散射显微镜检 查。
[0082] 所述显微镜测量设备可以包括多个电磁辐射源。所述显微镜测量设备可以被配置 为通过使用不同的电磁辐射源顺序地照明在所述显微镜镜台内的物体，来在同一组物体上 顺序地执行透射、光散射和/或荧光显微镜检查。
[0083] 所述显微镜测量设备可以被配置为提供介于与通过所述物镜的散射光路的路径 在0与60°垂直之间的照明，例如，通过第一电磁辐射源。
[0084]所述显微镜测量设备可以被配置为提供与通过所述物镜的散射光路的路径在60 至80°垂直之间的照明，例如，通过第一电磁辐射源和/或通过第二电磁辐射源。
[0085]所述显微镜测量设备可以包括设置在所述镜台与所述物镜之间的一个或多个LED (发光二极管）。所述显微镜测量设备可以被配置为通过透射光照明在所述显微镜镜台内的 样品。所述显微镜测量设备可以被配置为将荧光激发源的照明时间控制在20毫秒与10秒之 间，例如，以实现足够荧光发射强度，用于所述图像传感器利用荧光发射检测感兴趣的物 体。
[0086] 所述显微镜测量设备可以被配置为将放置成从与通过所述物镜的散射光路的路 径成0至80°垂直之间的LED的照明时间控制在20毫秒与10秒之间，例如，以实现充分的光散 射，以检测兴趣物体。
[0087] 所述测量设备可以被配置为使用感兴趣化学反应专有的发射的电磁辐射。
[0088] 所述测量设备可以被配置为使用安装在可移动镜台上的干化学测试条来执行化 学分析，通过计算提供一致读数的干反应垫的面积来确定所述检测的面积(area)。
[0089] 所述显微镜镜台可以是固定或可移动的，并且被配置为用于保持样品室放在所述 物镜前面，同时由所述电磁辐射源照明。所述显微镜镜台可以是可移动的，并且被配置为允 许在所述样品室内通过所述物镜观看1到10个观看区域。所述镜台可以手动或者在马达控 制下可移动。所述显微镜镜台可以被配置为将所述样品室在所述图像传感器的成像表面与 物体所在的表面之间保持固定的距离，例如，+/-10微米，例如，从而不需要在拍摄图像之前 聚焦。
[0090] 所述显微镜镜台可以包含固定参考区域，其允许所述显微镜测量设备调整所述电 磁辐射源的照明强度，验证用于帮助将在样品内的物体分类的强度的范围。固定参考区域 可以允许所述显微镜测量设备的放大和聚焦的质量控制，无需操作人员介入。
[0091] 所述样品室可以包括用于合并样品和试剂的腔室。所述样品室可以包括用于精确 地测量样品部分(例如，5-50uL的样品）和试剂部分(例如，50到500uL的试剂），然后，在将所 述样品引入所述样品室的观察区域内之前，合并和混合所述样品和所述试剂的装置。
[0092] 所述样品室可以具有包括两个相应的平面的第一壁和第二壁，所述第一和第二壁 的厚度介于100微米与4mm之间。选择所述壁的厚度和成分，以尽可能减少或减少从所述表 面中进入所述腔室内的光谱反射和/或光散射，否者会有助于背景散射。所述样品室可以具 有Imm乘以Imm到5mm乘以5mm的观看区域并且具有从100微米到20mm的高度。所述样品室可 以被配置为允许样品沉淀60秒到24小时，例如，以便沉淀的颗粒停在所述样品室的底部，并 且可以由所述显微镜测量设备观看、识别以及分类。
[0093] 所述样品室可以包括封闭物，用于在填充所述样品室之后，封闭所述样品室，例 如，以便在沉降时间期间减少蒸发或者不发生蒸发。
[0094] 本发明可以以系统来体现，该系统包括在图1、图2、图3、图4、图5以及图6中描绘的 并且在以下说明书中描述的一个或多个元件。
[0095]图1示出了辐射源1，其辐射包含颗粒或物体2的样品室3。显微镜设备12(图2)开启 辐射源1。辐射源1辐射样品室3,并且来自辐射源1的辐射被样品室3内的颗粒或物体2吸收。 所产生的辐射穿过样品室，并且落在位于样品室之下的二维CMOS或CCD传感器4上。CMOS或 CXD传感器可以是黑色和白色或者彩色。它必须对辐射源1敏感。为了说明的目的，在图1中 的辐射源1与样品室和传感器的平坦表面垂直，因此，说明透射的辐射。辐射源1不需要限于 透射的辐射。
[0096] 在显微镜设备(在图2中显示为12)的固件控制下，显微镜设备(在图2中显示为12) 捕捉透射的辐射的数字图像5。在这个说明中，在样品室3内的颗粒或物体2吸收来自辐射源 1的辐射，使得数字图像5在基本白色的背景上具有黑色物体6(阴影度取决于辐射的吸收 度）。数字图像5保存在位于显微镜设备上的固件存储器内，稍后，传输给计算机10(图2)，用 于进一步图像处理、结果计算以及报告给装置的用户。
[0097]在捕捉和保存第一图像5之后，显微镜设备12(图2)关闭辐射源1，并且在样品室3 依然在同一位置时打开辐射源7。辐射源7应当在不同的方面(波长、相对于样品的位置、辐 射源的准直程度或质量，例如偏振程度)与辐射源1不同。
[0098] 在所显示的说明中，辐射源7是引起辐射散射的源。如果辐射源7使的样品室3内的 物体或颗粒2将辐射散射给传感器4,那么散射的辐射投射在传感器4上，并且在数字图像8 内观察为在基本上黑色的背景上的白色区域9(白色阴影的强度取决于散射的辐射的强 度）。图1示出了一种情况，其中，在样品室内的物体之一吸收光并且在数字图像6上产生黑 点，但是不散射辐射，因此，不会将辐射散射至传感器并在数字图像8内产生白色区域。这个 颗粒在这个特性上与其他两个颗粒不同，并且根据这个差异，可以按不同的类别来精确地 分类。
[0099] 要理解的是，图1仅仅是本发明的一个可能的实施方式。第一辐射源1或第二辐射 源7可以从任何角度或位置包围样品室，仅仅由充分并且均匀地照明样品室的能力来限制。 具体而言，辐射源可以通过10° (与样品室的表面几乎平行)到与样品室的表面垂直的80°的 角度照明样品室以及室内的物体。在本发明的一个实施方式中，定位成以与平行于传感器 的观察室的表面的垂线介于20°与60°之间来照明观察室内的物体的660nm LED，促使在全 血中的粒细胞比单核细胞或淋巴细胞更强烈地散射光，允许将粒细胞明确分类成不同的颗 粒类型。
[0100] 辐射源1和2可以具有从IOOnm到2000nm的波长的范围。辐射源1和2可以准直到不 同的程度或者不准直，或者辐射的质量可以通过任何方式修改，例如，通过使光偏振。辐射 源可以激发保持在颗粒或者颗粒的某些部分内的荧光或磷光，该些颗粒发射在传感器4上 投射的辐射。本发明不限于可以依次打开和关闭来获得具有允许颗粒类型的识别和分类的 唯一性质的相应数字图像的辐射源的数量。
[0101] 本发明的一个特征是通过不同的辐射源依次辐射样品室以及在样品室内的物体， 并且处理相应的数字图像。可能的依次辐射源和相应图像的数量不受到在图1中的具体实 例限制。可能使用1到10个依次辐射，这仅仅受空间和成本的限制的约束。
[0102] 本发明的另一个特征是通过仅仅打开或关闭需要短持续时间来到达稳定的操作 条件，从而通过具有不同辐射特性(例如但不限于波长、偏振、准直、照明角度等）的不同辐 射源辐射样品室以及在样品室内的物体的能力。对于该装置实际的是，辐射源应该能够在1 毫秒到1000毫秒内到达稳定的操作条件。发光二极管是这种辐射源的一个具体实例，与需 要大量时间来到达稳定的操作条件的辐射源(例如，氙或钨灯)相比，这种辐射源提供了这 个优点。
[0103] 本发明的另一个重要特征是使用第一辐射源1来检测在观察室内的物体或颗粒， 并且使用第一数字图像5来确定物体的坐标、区域以及边界或边缘。第一辐射源1必须提供 物体2的足够对比度，以允许使用常用的图像处理工具，例如，从美国国立卫生研究院可获 得的免费软件的ImageJ软件。这种软件以及数字图像处理领域的技术人员已知的相当的商 用产品包含用于将数字图像(例如，5)转换成二进制图像的算法，该图像允许颗粒或者物体 检测、计数、求图像内的面积、直径、形状以及辐射强度。尺寸、强度或者形状阈值通常用于 识别和枚举数字图像内的满足储存在显微镜设备存储器内的预先定义的标准的颗粒和物 体。
[0104] 物体的来自辐射源7的辐射将产生数字图像，例如，用于限定在第二数字图像内的 每个物体的物体坐标的数字图像8。比较物体在数字图像5内的坐标和物体在第二数字图像 8内的坐标。使用嵌入显微镜设备固件的规则，不管坐标可以相隔多远，依然将物体视为相 同，图像处理软件使在第二数字图像8内的物体与在第一数字图像5内的物体匹配。如果具 有匹配，那么在数字图像8内的物体的辐射特性归因于在数字图像5内的具有匹配坐标的相 应物体。这种方法降低了辐射特性归因于干扰的风险（例如，在具有对数字图像5内的物体 施加的阈值限制之外的作用的同时，由对辐射源7具有不同作用的颗粒引起的非特定散射 或荧光或散射或荧光）。
[0105] 在使在两个不同的图像内的颗粒的坐标匹配之后，在数字图像5和8内的物体的边 界之外的辐射的强度可以平均化，并且从在物体的边界内的辐射的强度中减去作为背景， 以提供更精确的辐射强度估值。交替地，可以利用置信度选择围绕物体的边界的2到10个像 素边界层，并且用来对物体的辐射强度进行背景校正。
[0106] 本发明的另一个重要特征是在图2中的显微镜设备12控制样品室的辐射的持续时 间的能力。在投射辐射的情况下，根据辐射源的强度以及传感器的敏感度，传感器4、样品室 3以及在样品室2内的物体的曝光时间可以从1毫秒到200毫秒变化。对于从物体散射光或者 引起物体的荧光或磷光的辐射源，根据辐射源的强度以及传感器的敏感度，传感器4、样品 室3以及在样品室2内的物体的曝光时间可以从100晕秒到10秒变化。
[0107] 图2示出了系统的主要部件。应用软件驻留在计算装置10上，该计算装置可以是具 有通用串行总线(USB)端口或用于与显微镜设备12通信的蓝牙功能的任何装置。
[0108] 计算装置可以是台式个人电脑、移动电脑、平板电脑（例如，微型iPad或Samsung Galaxy)。在示图中通过无线通信11的符号显示了在计算机10与显微镜设备12之间的蓝牙 通信。在图3中 更详细地描述显微镜设备的各部件。收集体液样品，这些体液样品与一个或 多个试剂14结合，并且传输给样品室13,样品室插入显微镜设备12内，用于辐射和图像获 取。
[0109] 图3是示出部件放在显微镜设备内的方式的本发明的一个示例性实施方式的示意 图。在这个图中表示部件的其他布置或者附加其他部件至这些表示的部件，没有背离本发 明的范围。
[0110] 如果在这个说明中，与样品室16的平面垂直地并且与传感器26的平面平行地引导 辐射，那么放在样品室16之上的辐射源15(也在图4中更详细地显示)提供光束的透射显微 镜的辐射。辐射源15还可以是灯阵列，其也能够通过与样品室16垂直的平面的0°到90°的角 度辐射样品室16。这个离轴辐射可以通过在样品室16内的颗粒造成辐射源15的辐射的前向 散射。
[0111] 样品室16由显微镜镜台17保持在原位。显微镜镜台17和样品室16的平面是水平 的。显微镜镜台17可被固定。显微镜镜台17还可以手动或者在马达控制下移动，将样品室16 的各部分定位以进行辐射和显微镜成像。
[0112] 在镜台之下是辐射源18的子镜台阵列。这个辐射阵列的一个构造是发射具有不同 波长的光的LED灯的环。这个阵列辐射样品室16的底面以及沉淀到样品室16的底面的颗粒。 在本发明的一些实施方式中，这个阵列18可以为样品室16内的颗粒几乎以直角提供LED照 明，但是可以提供与样品室16的底部平面构成10°到约80°的辐射。在一个实施方式中，这个 阵列（1)为样品室16的颗粒提供660nm LED照明，造成光的散射由物镜19收集的并且投射在 传感器26上，以及（2)在以下序列中，通过450nm到500nm的LED灯，照明在样品室内的物体， 激发在颗粒内的荧光团，促使荧光团发射更长波长650nm的荧光，发射的光由显微镜物镜19 收集并且投射在传感器26上。
[0113]显微镜物镜19放在样品室16、显微镜镜台17以及辐射源18的子镜台阵列之下。显 微镜物镜19与显微镜镜台17、样品室16以及辐射源18的子镜台阵列的平面垂直地定位。物 镜可以是5X到20X的物镜。物镜被选定为在样品室16的单个视野内查看最大数量的颗粒，而 不牺牲分辨率或者精确地确定颗粒的辐射特性的能力。定位使得在CMOS或CCD传感器26上 将在样品室内的颗粒放大5倍的IOx物镜是很多这种实施方式的明智选择。对于本发明的一 个实施方式，使用尼康的1(^物镜(]?此001020?1?1311八(31^〇1(^嫩0.2510 10.5111111)。由 于IOx物镜19通过5.1倍的放大因数将颗粒投射在传感器上，所以能够具有大约10到50微米 的景深，使得如果样品室牢固地保持在原位，那么不需要调焦该装置。
[0114]本领域的技术人员已知将物镜19放在显微镜镜台17和样品室16之下，作为具有倒 置的显微镜镜台的显微镜。由于辐射源通常造成的背景干扰在本构造中尽可能减少，所以 这个构造对于本发明优选。在倒置的构造中，在辐射样品之前，辐射不必穿过无颗粒样品或 样品室16的多个表面。同样，在由物镜19收集之前，从物体中散射或发射的辐射不穿过无颗 粒溶液或者样品室16的多个表面。
[0115]在本发明的一个实施方式中，直角反射镜20将物镜19的光从垂直平面中引入水平 平面内，穿过滤光器27进入传感器26。该反射镜的目的是使显微镜设备的总高度小于2至3 英寸，以便可以容易地停留在平坦的台面上。也可以按照以下作出本发明，即没有直角反射 镜20，滤光器27和传感器26直接放在物镜19之下。
[0116]除了所显示的部件以外的部件的可替代的布置是使用分束器代替直角反射镜20， 该分束器将位于垂直平面内的物镜的光重新引导至位于水平平面内的传感器26上。在这个 布置中，还能够将辐射源放在分束器之下，并且来自该源的辐射透过物镜19照射在样品室 16内的颗粒上。这个布置具有以下优点：将光聚焦在颗粒上，且在位于颗粒之上的流体上具 有更少的光，尽可能增大在颗粒上的辐射，并且尽可能减少在周围流体内的潜在干扰材料 上的辐射。在使用透过物镜引导的辐射源引起荧光激发时，这个构造是有用的。在这个构造 中，能够在辐射源与分束器之间增加滤光器，或者必要时，进一步调节辐射。
[0117]图3描绘了放在直角反射镜20(或分束器)与传感器26之间的福射滤光器27。福射 滤光器27的目的是阻止某些波长的辐射到达传感器26。
[0118]传感器26是二维阵列的像素。可以是小至在早期实施方式中使用的0.5兆像素，直 到20兆像素或以上的最大可购买的传感器。在成本约束内可能获得的最大传感器最佳。更 大的传感器提供更好的分辨率，或者在具有与更小的传感器相同的分辨率时，允许查看样 品的更大区域。传感器可以是彩色传感器或黑白传感器。由于对辐射源的波长的选择，提供 颜色信息并且能够通过更加可控的方式这样做，所以黑白传感器是大部分应用的优选实施 方式。此外，由于所有像素可用于通过规定的波长成像，所以使用黑白传感器，提供更好的 分辨率。
[0119]在图3中的显微镜设备可以使用蓝牙卡25或蓝牙适配器与计算机10(图2)无线通 信。显微镜设备还可以使用通用串行总线(USB)24与计算机10通信和/或从计算机10中接收 电力。显微镜设备还可以由电池23供电。计算机可以可选地嵌入测量装置内。
[0120]显微镜设备具有至少一个印刷电路板，其具有存储器23,用于储存从传感器25中 捕捉的图像以及用于控制辐射源、通信、功率和传感器以及任何其他可选的电动装置所需 要的信息和固件应用程序。印刷电路板还包含微处理器22,其操作控制辐射源、通信、功率 和传感器以及任何其他可选的电动装置的显微镜设备特有的固件应用程序。
[0121] 图4是样品室的一个实施方式。图4的上部示意图是样品室的侧视图。底部示意图 是样品室的顶视图。样品室可以是一次性或可再次使用。
[0122] 样品室具有通过垫圈32隔开的上部光学表面30和下部光学表面32,以形成包含液 体样品的空心样品阱29。通过入口28将样品引入样品室内，空气通过出口31逸出。
[0123] 上部光学表面30和下部光学表面33可以由光学级丙烯酸、玻璃或具有相当的光学 质量的任何材料构成。两片表面都应当是平坦的，且表面理想地应当从一端或边到另一端 或边不应改变大于+/-5微米，这是因为由于面对包含样品的腔室26的表面将确定样品室的 容积，并且从而影响颗粒或可溶性化学实体的浓度的任何计算。还重要的是，满足这些容 差，以便位于包含样品的空心阱26的底部上的所有颗粒在物镜的焦平面内。
[0124] 根据应用，垫圈32将上部光学表面30和下部光学表面33分开50微米到10mm。垫圈 可以是单独材料(例如，双面胶带)或者可以是上部光学表面30或下部光学表面33的模制特 征。垫圈32、上部光学表面30以及下部光学表面33粘结在一起，以便流体不不从样品阱29中 泄露。在任一种情况下，垫圈都应具有恒定的厚度，优选地确保样品阱的高度具有+/-5微米 或某个容差，确保可靠的容积测定适合于规定的应用。
[0125] 图5是在计算机10上的软件应用程序（在图5的左边的"用户界面计算机应用程 序"）以及在显微镜设备12上的固件应用程序(在图5的右边的"显微镜设备固件"）的一个可 能的实施方式。箭头表示在处理样品中将在计算机10与显微镜设备12之间发生的通信。
[0126] 用户界面计算机应用程序包括步骤52:
[0127] ?操作人员选择开始处理样品的选项；
[0128] ?开始从计算机中向显微镜发送处理信号；
[0129] ?该信号包括关于要处理的样品的类型的信息。
[0130]显微镜设备固件继续进入步骤54:
[0131] ?打开电源；
[0132] ?调整暗电流；
[0133] ?调整LED强度；
[0134] ?准备对计算机的信号进行处理；
[0135] ?储存在显微镜内的样品特定信息用于确定类型和持续时间或辐射。
[0136] 用户界面计算机应用继续进入步骤56:
[0137] ?提不用户插入样品室；
[0138] ?用户确认插入样品室并且将信号发送给显微镜，以启动定时器。
[0139] 显微镜设备固件继续进入步骤58:
[0140] ?启动定时器，并且在经过预定的时间之后开始处理；
[0141] ?根据需要激活可选的马达或栗。
[0142] 显微镜设备固件继续进入步骤60:
[0143] ?样品室由适合于样品的每个电磁福射依次福射；
[0144] ?在通过用于产生图像的辐射类型确定的每个辐射之后，捕捉数字图像；
[0145] ?将图像传输给计算机，用于图像处理。
[0146] 用户界面计算机应用继续进入步骤62:
[0147] ?应用程序进行图像处理，以确定在视野内和/或在整个视野内的颗粒的身份、数 量、尺寸以及辐射强度；
[0148] ?应用程序进行计算，以确定浓度；
[0149] ?将结果储存在存储器内并且向用户显示，以供审查；
[0150] ?通过互联网将结果可选地传输给远程站点。
[0151] 图6描述了在本发明的一个实施方式中操作人员可能采取的步骤，以将体液样品 引入显微镜设备12内。这个实例示出了用于确定网状细胞的全血样品。为了获得全血，操作 人员首先使用柳叶刀刺破手指并且使用精确的移液装置来测量5到50uL的全血，放入具有 500uL到5000uL的试剂的容器内，并且通过将容器颠倒3次或更多次或者通过轻轻地吸入和 分散混合物3次或更多次，来使全血和试剂混合。操作人员将混合物传输到样品室内，并且 将样品室插入显微镜装置内。
[0152] 图7表示基于发明的免疫测定应用。在这个实例中，包含大分子37的体液与包含由 附接至颗粒38的白色新月形表示的抗体的试剂混合。连接至大颗粒的抗体可以沉淀在水溶 液内，但是可分散在水溶液内。连接至大颗粒的抗体与在大分子37上的第一站点结合。试剂 还包含第二抗体，其由具有星形39的阴影半新月形表示。星形表示标记。在这个实例中，标 记是在使用促使标记发荧光的波长光照亮时与发荧光的抗体共价结合的分子。
[0153] 如图7中所述，在试剂与体液混合并且放入样品室内时，大分子37与连接至颗粒38 的抗体结合，并且具有荧光标记39的第二抗体与大分子37结合，所述大分子与连接至颗粒 38的抗体结合，以形成颗粒-抗体-大分子-标记的抗体的复合体。这些复合体沉淀到样品室 的底部并且进入在图像传感器44上放大颗粒复合体的物镜43及其焦平面内。样品室由光学 透明的材料制成，该材料透射适当频率的光。
[0154] 在样品室底部上的颗粒由激发连接至颗粒的荧光标记的波长的光照明。在样品的 底面之间的一圈LED 42照亮样品室的底面和颗粒结合的标记。理想地，这些LED应通过非常 低的角度照亮颗粒，以便在激发样品时，非结合的（即，未反应的）标记的抗体39可能发荧 光。
[0155] 在这种类型的免疫测定方案中，与颗粒结合的标记的量随着在样品内的大分子37 的量的增大而增大。标准的曲线可以构造成表示观察的标记强度与分子浓度之间的关系。
[0156] 通常，这种类型的免疫测定需要与连接至颗粒38的抗体结合的大分子37的未结合 标记39和颗粒结合的标记40分离，以使化验精确。
[0157] 在图7的免疫测定方案中，在颗粒结合的标记沉淀到腔室的底部时，发生分离。如 在本发明中所公开的，通过在显微镜检测器的焦平面内使颗粒成像，仅仅检测在样品室的 限制区域内的标记。通过增大样品室的高度，分离程度可以增大，并且背景荧光减小。
[0158] 此外，没有标记的颗粒沉淀到样品室的底部，但是不完全覆盖腔室。在颗粒与灯之 间具有空间，光可以渗入溶液内并且激发非颗粒结合的标记。荧光引起非特定的背景荧光， 退化化验的敏感度。
[0159] 通过首先使用第一光源(例如，造成散射的光源)识别在焦平面内的颗粒，使用这 个第一照明来确定颗粒边界，然后，确定由第二荧光激发光源从每个颗粒边界内发射的荧 光强度，可以部分消除未结合至颗粒的标记的这个非特定的背景荧光。进一步，位于颗粒边 界外面的荧光信号可以用于确定可以从颗粒结合的荧光中减去的非特定荧光，以提高化验 的精度。
[0160] -种相似的方法可以用于竞争性免疫测定，除了小分子特有的颗粒结合抗体竞争 标记的小分子以外。沉淀到样品室的底部的颗粒结合标记的量与在样品内的小分子浓度相 关。
[0161] 以上描述和图7应不将本发明的范围限于仅仅免疫测定。在图7中连接至颗粒38的 白色新月形可以是结合至生物或化学起因的可溶性化学实体的生物或化学成因的任何分 子。例如，可以是结合至甲状腺激素的激素受体。可以是结合至可溶性核酸的核酸。可以是 结合至可溶性生物素的分子状抗生物素蛋白。还可以是结合可溶性化学或生物实体的合成 嵌合实体。
[0162] 通过这种方式，在图7中具有标记39的新月形结合伴侣可以是标记的抗体，但是也 可以是标记的激素受体、核酸或可以标记并且结合至在溶液内的可溶性实体的任何生物或 化学实体。
[0163] 免疫测定是可以通过本发明检测的可溶性化学实体(包括生物或化学起因）的检 测的一个实例。由于这些免疫测定基于检测与颗粒结合的特定辐射信号的概念，所以以下 示例性实施方式也显示了免疫测定运行的方式。
[0164] 实例 1
[0165] 本发明的一个实施方式用于确定在全血内的网状细胞。
[0166] 5uL手指采血的全血与5000uL试剂相结合。试剂包含63ug/mL(0.19mM)月桂酰胺丙 基甜菜碱（lauramidopropyIbetaine)、20mM碳酸氢钠、5mM EDTA四钠脱水以及96mM氯化钠。 将最终的pH调整为8.1;必要时，最终的渗压强度是272m0sm，且具有NaCl或水。这个试剂通 过0.2微米的过滤器过滤并且储存在室温中长达2个月，使细胞呈球形的能力没有明显的退 化或损失。
[0167] 显微镜设备包含在图3中描述的元件，除了是竖立(而非颠倒）的显微镜以外。物镜 19是来自Nikon Instruments的IOX物镜（CFI LU Plan Fluor BD 10X)。对于透射显微镜， 辐射源15是尼康卤素灯，410nm滤光器放在照明路径内。将样品辐射80毫秒，并且将位(bit) 设置为235。
[0168] 对于焚光，使用尼康萊灯（Nikon Instruments ,X-Cite 120X1 Fluor System)将 样品照明2000毫秒。这可以使用Phillips Rebel Lumiled(Blue(470nm)Luxeon Rebel [email protected])LED代替。将这些光源放在图3中的直角反射镜20之下。这个照明方案代替 在图3中的子镜台辐射源18。
[0169] 使用FITC滤光器立方体（Semrock Corporation,FITC-3540B)代替在图3中的直角 反射镜30。这个滤光器立方体包含分束器，该分束器使荧光照明源的光穿过滤光器，该滤光 器仅仅允许窄带蓝光穿过物镜19,进入样品室16内。Semrock滤光器立方体还包含用作与在 图3中的辐射滤光器27相同的目的的滤光器。
[0170] 在图3中的传感器26是5MP CMOS相机以及图像捕捉软件(Pixelink Corporation, Ottawa，Canada)。在IOX物镜与照相机之间的0 · 5X中继透镜（Edmund Optics ,NT58-376 0.5X视频显微镜耦合器)在照相机的传感器上提供了5. IX的总体放大。通过优化在物镜与 传感器之间的距离，可以在这个系统的最终版本中去除中继透镜。
[0171] 将稀释样品引入商用显微镜样品室（来自德国ibidi.com Ibidi的产品编号 81121)内，其设计与在图4中描述的相似。腔室具有100微米高、5 mm宽以及50mm长（容积 25uL)〇
[0172] 这个构造在用于正面本发明的原理，这是因为该构造可以与易于商用的部件快速 组装。确实需要去除等同于在图30中的辐射滤光器27的滤光器，以通过透射光照明样品。如 图3中所示，在最终的原型中，不需要这个人工干预。
[0173]为每个样品捕捉410nm波长透射图像和焚光图像。使用来自National Institute of Health的ImageJ开源软件（ImageJ)处理图像。编写特殊的插件程序（用于ImageJ的 Reticulocyte Plugin)，其（1)根据用户定义的尺寸和强度阈值，计算在透射或焚光图像中 观察的颗粒的数量，（2)为每个颗粒透射颗粒，计算MCH和MCV，并且(3)将网状细胞确定为用 户定义的强度和尺寸的荧光颗粒。确定每个透射和荧光颗粒的坐标，并且用于识别与发荧 光的颗粒对应的在透射图像内的红细胞。
[0174]图8概述了由图像软件使用的步骤的一个实例，在此处是ImageJ插入程序，以识别 网状细胞和红细胞并且将其分类。对于本应用，将颗粒阈值设定为20像素的颗粒的最小直 径以及80像素的最大直径。要"匹配"的在荧光和透射图像内的物体需要相隔不超过70像 素。在荧光图像内的物体的强度阈值具有40的最小强度阈值以及255的最大阈值。
[0175] 处理102第一(透射）图像，然后，处理104第二（荧光）图像。随后，在第一和第二图 像内的颗粒被匹配106,并且总结108网状细胞的结果。
[0176] 处理102第一图像，包括一个或多个步骤：
[0177] 1、使整个图像的背景强度均匀；
[0178] 2、减去背景并且将背景设置为255;
[0179] 3、使用标准的Image J函数使图像二值化；
[0180] 4、将ImageJ水分界线用于分离可以接触的颗粒；
[0181] 5、在水分界线之后确定颗粒数量，并且校正颗粒；
[0182] 6、如果水分界线仅仅提高颗粒数量〈5%，那么报告校正的颗粒数量;如果>5%，那 么稀释样品并且重复；
[0183] 7、基于在最终产品的开发期间确定的强度和尺寸的限制，使用ImageJ确定颗粒数 量、颗粒坐标、直径以及平均强度；以及
[0184] 8、保存在透射图像中所有颗粒的结果。
[0185] 处理104(荧光)第二图像，包括一个或多个步骤：
[0186] 1、使整个图像的背景强度均匀；
[0187] 2、减去背景；
[0188] 3、将白色电平设置为255;
[0189] 4、使用标准的Image J函数使图像二值化；
[0190] 5、将ImageJ水分界线用于分离可以接触的颗粒；
[0191] 6、在水分界线之后确定颗粒数量，并且校正颗粒；
[0192] 7、如果在水分界线之后，颗粒数量增大〈5%，那么考虑该数量精确；如果>5%，那 么必须稀释样品并且重新运行；
[0193] 8、基于强度和尺寸的限制，使用ImageJ确定颗粒数量、坐标、直径以及平均强度； 以及
[0194] 9、保存在荧光图像中所有颗粒的结果。
[0195] 匹配106在第一和第二图像内的颗粒包括一个或多个步骤：
[0196] 1、比较在透射和荧光图像内的颗粒的坐标；
[0197] 2、如果在透射和荧光图像内的颗粒的坐标小于可接受的在开发期间确定的数量， 那么在透射图像内的颗粒分类为网状细胞;以及
[0198] 3、记录在透射和荧光图像内匹配的颗粒之间的距离。
[0199] 总结108网状细胞的结果（即，对于具有高于预定尺寸和强度的相应荧光图像的透 射颗粒)包括一个或多个步骤：
[0200] 1、透射强度；
[0201] 2、每个颗粒的像素的平均数量；
[0202] 3、平均颗粒直径；
[0203] 4、计算的红细胞体积;和/或
[0204] 5、计算的血红蛋白浓度。
[0205]表1示出了本发明的精确数据或特征。
[0208]表2示出了本发明与Sysmex血液分析仪的方法比较。
[0209]表2:
[0211]其中：
[0212] RBC浓度：红细胞/uL
[0213] MCH:平均红细胞血红蛋白含量pg
[0214] MCV:平均(红细胞的）红细胞容积fL
[0215] MCHr:网状细胞的平均红细胞血红蛋白含量pg JCHr主要是光散射具有某种贡献 的光学密度的测度，并且可以具有细胞体积的小贡献。
[0216] CHr:网状细胞血红蛋白含量。Bayer使用Advia 120网状细胞血红蛋白含量的这个 缩写词。这应大略等同于MCHr。CHr是光散射测量。
[0217] RET HE:网状细胞血红蛋白。Sysmex使用网状细胞血红蛋白含量的Sysmex XE-2100确定的这个缩写词。RET HE应大略等同于MCHr和CHrAET HE是前向光散射的测度。细 胞体积和血红蛋白含量影响这个值。细胞体积的影响通过这个参数更明显。
[0218] 实例2
[0219] 本发明的第二实施方式用于确定在全血内的粒细胞。
[0220] 在这个实施方式中，使用包含样品室的特殊储存匣，自动进行在图6中概述的很多 手动样品和试剂操作人员步骤。在EDTA真空采血管内收集全血，并且插入这个储存匣内。在 储存匣内的流体回路将全血从真空采血管中自动移动到精确地分割IOOuL的全血的回路 内。该装置将具有IOmL试剂的包含全血的区段冲入混合室内。
[0221 ] 试剂包含535mgm的氯化铵、84mgm的碳酸氢钠、38mgm的EDTA、IOmgm的叠氮化钠、 Imgm的吖啶橙以及IOOmL的蒸馏水。叮啶橙是核酸结合燃料，其仅仅在细胞核内或者在细胞 质内与核酸结合时发光。还可以在细胞核内结合至一些复合糖。这个试剂溶解红细胞，允许 更容易检测白细胞。保留了正确地检测、分类以及枚举白细胞所需要的白细胞的大部分形 ??τ O
[0222] 使用通过连接至位于储存匣之下的马达的磁铁旋转的1/8英寸直径的不锈钢滚珠 轴承，混合试剂全血混合物。在混合试剂之后，全血混合物在储存匣以及收集的光学图像内 自动传送给样品室。使用空气压力，推动流体通过通道。本发明可以可选地包括进入样品室 内的这些步骤。
[0223] 显微镜设备包含在图3中描述的元件。这个早期原型是颠倒的显微镜。透镜19是来 自Nikon Instruments的IOX物镜（CFI LU Plan Fluor BD 10Χ)。对于透射显微镜，福射源 15是具有大约640和680nm的峰值发射波长的红色LED。
[0224] 对于荧光，使用一圈红蓝交替的LED照明样品。该配置对于在图3中的子镜台辐射 源18相同。蓝色LED具有在450nm与500nm之间的峰值波长发射，并且红色LED具有在640与 680nm之间的峰值发射。在这圈内具有6个蓝色和6个红色LED。将其定位成通过位于样品室 16的水平平面之下的10°与45°之间的角度照明在图5中的样品室16。通过这种方式定位LED 的目的是将照明源放置成与物镜的轴尽可能接近90°。在这个位置中，接近直角散射的光可 以由物镜捕捉。粒细胞通过直角密集地散射光，而单核细胞和淋巴细胞不通过直角散射光， 因此，直角散射光可以用于将粒细胞分类。
[0225] 装置具有直角反射镜20,与在图3中一样。
[0226] 在图3中的传感器26是0.5MP CXD照相机。见照相机放置成与物镜相距某个距离， 以在传感器上实现物体的5X到IOX的放大。
[0227] 图像捕捉软件是专用的，但是执行与ImageJ软件的步骤相似的图像处理步骤，在 图8中描述的这个匹配的透射和荧光图像内具有插件。然而，在这种情况下，第一数字图像 是荧光图像，并且第二数字图像是直角散射光的图像。
[0228] 在使用这种方法的15个样品中在粒细胞计数的方法比较中，这种方法具有0.86的 相关系数，并且由用于医院实验室内的库尔特计数器产生。回归线的斜率是0.98,并且回归 线的截距是0.0。
[0229] 还公开了根据任何以下实施方式的方法和设备：
[0230] 实施方式1. 一种将在视野内的二维物体分类的显微镜方法，具有以下步骤：
[0231] a)通过第一电磁辐射源，照射在视野内的物体；
[0232] b)在CMOS或C⑶传感器上投射所产生的图像，
[0233] c)使用在视野内的物体的所产生的数字表示来识别颗粒作为在数字表示内的物 体，例如，使用图像软件，例如，Image J软件，
[0234] d)使用每个物体的边缘的坐标来限定包含在所述物体的数字表示内的限制每个 物体的区域的区域，
[0235] e)确定每个物体的数字表示的面积、直径以及平均强度，
[0236] f)通过从所述物体的数字表示的边界中减去一个像素来可选地分离接触的颗粒， 以便可以识别、枚举并且适当地分类接触的颗粒；
[0237] g)使用所述边缘坐标来限定与物体的边缘相邻但是位于所述物体外面的区域，以 计算所述电磁辐射的背景强度，并且从包含在每个物体的数字表述的边缘内的物体的电磁 强度中减去这个平均背景强度；
[0238] h)使用在所述物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收 光的物体内的化学实体的浓度；
[0239] i)根据进一步将第一组物体分成子集的需要，根据提供关于在所述物体内的数字 表示的预定边界内的物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁辐射源顺序询问相 同的第一物体，以及
[0240] j)通过η个额外的第一电磁辐射源询问相同的视野，每个电磁源通过基于所述物 体的电磁特性来唯一地区分在所述视野内的物体的某种电磁特性区分开;然后，利用尽可 能多的额外电磁辐射源暴露所述物体，以再细分包含在由第一辐射源识别的边界内的物 体。
[0241] 实施方式2.根据实施方式1所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射是具有从 IOOnm到2000nm的波长的光，所述光包括紫外线、可见以及红外线光谱的部分。
[0242] 实施方式3.根据实施方式1-2中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射是 从IOOnm到1000 nm的光，所述光促使荧光激发天然存在的荧光团或认为导入的荧光团，由所 述激发的荧光团发射的光用于产生帮助将相应的物体分类的图像。
[0243] 实施方式4.根据实施方式1-3中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射是 由在所述物体内的化学实体吸收的从IOOnm到2000nm的光，以便包含所述吸收实体的相应 图像具有更低强度的检测的电磁辐射。
[0244] 实施方式5.根据实施方式1-4中任一项所述的方法，所述方法使用通过不同的角 度与所述样品相贯穿的电磁源，来造成在所述视野内的物体具有不同强度的电磁辐射散 射。
[0245] 实施方式6.根据实施方式1-5中任一项所述的方法，所述方法使用通过与所述检 测的传感器区域〇到80度垂直地贯穿在所述视野内的物体的电磁辐射，以便所述显微镜的 物镜捕捉通过不同的角度散射的光。
[0246] 实施方式7.根据实施方式1-6中任一项所述的方法，所述方法使用具有不同的偏 振特性的电磁源。
[0247] 实施方式8.根据实施方式1-7中任一项所述的方法，所述方法使用引起天然存在 的磷光体或人工导入的磷光体的磷光的电磁源。
[0248] 实施方式9.根据实施方式1-8中任一项所述的方法，所述方法使用透射的光源从 血红蛋白的俗特谱带创建来自动物或人的血液中的红细胞的图像，并且使用这些图像来计 算红细胞的面积、直径以及容积、在红细胞内的血红蛋白的浓度，并且其中，通过激发连接 至在网状细胞内的网硬蛋白的核酸结合荧光团，在所有红细胞之中确定网状细胞，并且识 别具有荧光发射的那些红细胞。
[0249] 实施方式10.根据实施方式1-9中任一项所述的方法，其中，使用激发光源检测通 过荧光团处理的动物或人的血液中的白细胞，并且在检测传感器上投射所述发射光，以形 成荧光白细胞的数字表示。
[0250] 实施方式11.根据实施方式10所述的方法，其中，动物或人的血液的白细胞的检测 使用核酸结合的荧光团。
[0251] 实施方式12.根据实施方式11所述的方法，其中，所述核酸结合的荧光团例如但不 限于吖啶酯、或噻唑橙、或溴化乙啶。
[0252] 实施方式13.根据实施方式10-12中任一项所述的方法，其中，计算所述荧光发射 实体的直径、浓度以及与所述二维荧光图像对应的物体的容积，并且用于帮助将白细胞分 成淋巴细胞、粒细胞以及单核细胞。
[0253] 实施方式14.根据实施方式10-13中任一项所述的方法，其中，两个或多个荧光激 发源或者两个或多个荧光发射检测波长用于检测不同的荧光种类，以便可以检测在白细胞 内的不同实体，并且荧光的强度和量用于进一步将白细胞的子集分类。
[0254] 实施方式15.根据实施方式1-14中任一项所述的方法，并且使用从300nm到800nm 的可见光，所述可见光通过与所述传感器从60到90°垂直的角度照亮粒细胞，以便在白细胞 内的细胞质颗粒激烈地散射光，而没有颗粒的细胞质不散射光或者散射具有非常低的强度 的光。
[0255] 实施方式16.在通过与所述传感器从60到90°垂直的角度利用300到800nm的光照 亮相同物体所再细分的这些图像之中分类粒细胞，粒细胞是具有强度的散射光的那些图 像。
[0256] 实施方式17.根据实施方式1-16中任一项所述的方法，其中，首先使用荧光来确定 人类或动物血液的白细胞，然后，将淋巴细胞和单核细胞确定为具有可以忽略的散射光的 图像。
[0257] 实施方式18.根据实施方式1-17中任一项所述的方法，并且使用1到50个兆像素 CMOS或CCD传感器。
[0258] 实施方式19.根据实施方式1-18中任一项所述的方法，其中，可以通过电子开关打 开和关闭所述电磁源，提供2-10个不同的电磁源依次询问相同视野的能力，这仅仅由电磁 源的空间的约束条件以及用于成像所述视野的时间的约束条件限制。
[0259]实施方式20.根据实施方式1-19中任一项所述的方法，并且具有一次性或者可再 用的观察室，其包含感兴趣颗粒的液体分散并且允许计算在统计上的大量颗粒。
[0260]实施方式21.根据实施方式20所述的方法，其中，所述观察室具有介于50微米与 IOmm之间的厚度。
[0261]实施方式22.根据实施方式18所述的方法，其中，将物镜放在所述检测CMOS或CCD 传感器之间，所述物镜提供足够的放大倍数，以确定物体尺寸，且还具有充分的视野，以允 许在统计上大量计算在所述视野内的物体。
[0262]实施方式23.根据实施方式22所述的方法，其中，所述物镜具有介于2X与15X之间 的放大倍数。
[0263]实施方式24.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，所述方法使用用于识别红 细胞的红细胞俗特谱带以及用于检测白细胞的核酸结合荧光团的荧光来检测在体液内的 红细胞和白细胞，而不分离或溶解红细胞。
[0264] 实施方式25.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，所述方法使用球形化试剂， 例如但不限于N-十二烷基-N，N_二甲基-3-铵基-1-丙磺酸钠，来将红细胞从双凹圆盘转换 成均匀的球体，并且不影响白细胞的形态或散射特性。
[0265] 实施方式26.根据实施方式25所述的方法，所述方法不使用成球形的试剂，而是使 用保持红细胞的自然双凹圆盘形状的试剂。
[0266] 实施方式27.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，所述方法在30秒到10分钟 内选择性溶解红细 胞，而不影响白细胞的形态或光散射特性。
[0267] 实施方式28.根据实施方式26-27中任一项所述的方法，所述方法将0.1 M氯化铵pH 8.0用作具有或没有球形化试剂的红细胞溶解试剂。
[0268]实施方式29. -种显微镜测量设备，其包括CMOS传感器、物镜、用于修改照射、发射 或散射辐射的光特性的可选的滤光器、用于引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电磁辐 射的可选的反射镜或分束器、可以打开和关闭的电磁辐射装置，所述显微镜测量设备与单 独计算机有线或者无线通信，计算机包含在所述显微镜设备内从所述CMOS传感器中收集的 图像中识别物体并且将物体分类的成像软件，以及控制软件，用于操作显微镜。
[0269]实施方式30.根据实施方式29所述的测量设备，所述测量设备具有单独的电源或 者可连接至外部电源。
[0270]实施方式31.根据实施方式29-30中任一项所述的测量设备，并且所述显微镜测量 设备用于检测在体液内的颗粒或高或低分子量化学实体，包括但不限于血液、尿液、脊髓 液、唾液、腹膜液以及肺灌洗，并且提供使用单个检测测量设备的全套体外诊断测试。
[0271]实施方式32.根据实施方式29-31中任一项所述的测量设备，所述显微镜测量设备 执行血液学、尿液分析、化学、免疫测定和/或凝结的体外诊断测试。
[0272]实施方式33.根据实施方式29-32中任一项所述的测量设备，所述测量设备使用反 射镜和/或分束器，其被配置为将所述物镜的光从垂直平面中重新引导到水平平面中，以便 相机的高度介于2cm与15cm之间。
[0273]实施方式34.根据实施方式29-33中任一项所述的测量设备，其通过放在所述显微 镜镜台之下的灯圈或相似的照明装置提供正面落射光照明。
[0274] 实施方式35.根据实施方式29-34中任一项所述的测量设备，所述测量设备提供通 过所述物镜的正面落射光照明。
[0275] 实施方式36.根据实施方式29-35中任一项所述的测量设备，所述测量设备具有执 行荧光显微镜检查的能量。
[0276] 实施方式37.根据实施方式29-36中任一项所述的测量设备，所述测量设备可以执 行透射显微镜检查。
[0277] 实施方式38.根据实施方式29-37中任一项所述的测量设备，所述测量设备可以执 行光散射显微镜检查。
[0278]实施方式39.根据实施方式29-38中任一项所述的测量设备，所述测量设备可以通 过使用不同的照明源顺序地照明在所述视野内的物体，来在同一组物体上依次执行透射、 光散射和/或荧光显微镜检查。
[0279]实施方式40.根据实施方式39所述的显微镜测量设备，所述测量设备可以提供介 于与通过所述物镜的散射光路的路径0与60°垂直之间的照明。
[0280]实施方式41.根据实施方式39-40中任一项所述的测量设备，所述测量设备提供从 与通过所述物镜的散射光路的路径60与80°垂直之间的照明。
[0281]实施方式42.根据实施方式37所述的显微镜测量设备，所述测量设备使用一个或 多个LED通过透射光照明样品，所述样品放在所述LED与所述显微镜物镜之间。
[0282]实施方式43.根据实施方式37所述的显微镜测量设备，所述测量设备将荧光激发 源的照明时间控制在20毫秒与10秒之间，以实现充分荧光发射强度，用于CMOS传感器通过 荧光发射检测感兴趣的物体。
[0283]实施方式44.根据实施方式37所述的显微镜测量设备，所述测量设备将放置成介 于与通过所述物镜的散射光路的路径0与80°垂直之间的LED的照明时间控制在20毫秒与10 秒之间，以实现充分的光散射，以检测兴趣物体。
[0284]实施方式45.根据实施方式29-44中任一项所述的测量设备，所述测量设备具有用 于保持样品室放在所述物镜的前面同时由所述光源照明，所述镜台可以是固定或可移动 的。
[0285] 实施方式46.根据实施方式45所述的显微镜测量设备，其中，所述镜台允许在所述 样品室内通过所述物镜观看1到10个观看区域，所述镜台手动或者在马达控制下移动。
[0286] 实施方式47.根据实施方式45-46中任一项所述的测量设备，其中，所述镜台将所 述样品室保持在所述CMOS传感器的表面与物体所在的表面之间的固定距离(+/-10微米）， 从而不需要在拍摄图像之前聚焦。
[0287] 实施方式48.根据实施方式45-47中任一项所述的测量设备，其中，所述镜台包含 固定参考区域，其允许所述显微镜调整所述光源的照明强度，验证用于帮助将在样品内的 物体分类的强度的范围，并且允许所述显微镜的放大和聚焦的质量控制，无需操作人员介 入。
[0288]实施方式49.根据实施方式45-48中任一项所述的测量设备，其中，所述可移动镜 台中断（interrupt)所述测量设备用于在样品室内检测从一个视野到另一个视野的运动的 传感器，触发照明装置和CMOS传感器用于捕捉图像，以便不需要操作人员介入来捕捉多个 图像。
[0289]实施方式50.根据实施方式45-49中任一项所述的测量设备，其中，所述可移动镜 台包含传感器，所述传感器使用确定所述样品室引入所述显微镜内的时间的这个能力，来 在所述样品室内感测从一个视野到另一个视野的运动，然后，在将所述样品室引入所述测 量设备内之后，通过在10秒与10分钟之间的固定间隔，在所述样品室内从视野中捕捉图像。
[0290] 实施方式51. -种用于根据权利要求29所述的显微镜测量设备的样品室，所述样 品室包含保持在相隔5和50微米的两个平面之间保持的样品，并且包含介于5与IOOuL之间 的液体，所述腔室的形状允许使样品均匀地并且可再现地填充所述腔室，并且防止在完成 分析之前移动样品或者蒸发样品。
[0291] 实施方式52.根据实施方式51所述的样品室，所述样品室也具有用于合并样品和 试剂的腔室。
[0292] 实施方式53.根据实施方式51-52中任一项所述的样品室，所述样品室包括以下装 置，用于精确地测量5-50uL的样品和50到500uL的试剂，然后，在将所述样品引入所述样品 室的观察区域内之前，合并和混合所述样品和所述试剂。
[0293] 实施方式54.根据实施方式51-53中任一项所述的样品室，所述样品室具有两个平 面，所述平面的厚度介于100微米与4_之间，选择所述表面的厚度和成分，以尽可能减少从 所述表面中进入所述腔室内的光谱反射和光散射，否则会有助于背景散射。
[0294] 实施方式55.根据实施方式51-54中任一项所述的样品室，所述样品室具有Imm乘 以Imm到5mm乘以5mm的观看区域并且具有从100微米到20mm的高度。
[0295] 实施方式56.根据实施方式51-55中任一项所述的样品室，所述样品室被配置为允 许样品沉淀60秒到24小时，以便沉淀的颗粒停在所述腔室的底部，并且可以由根据实施方 式29-50中任一项所述的显微镜测量设备观看、识别以及分类。
[0296] 实施方式57.根据实施方式51-56中任一项所述的样品室，所述样品室具有一种装 置，用于在填充所述样品室之后，封闭所述样品室，以便在沉降时间期间不发生蒸发。
[0297] 实施方式58.-种使用显微镜测量设备进行免疫测定的方法，所述显微镜测量设 备包括CMOS传感器、物镜、用于修改照射、发射或散射辐射的光特性的可选的滤光器、用于 引导透射、散射的电磁福射以及发射的电磁福射的可选的反射镜或分束器、可以打开和关 闭的电磁辐射装置，并且具有与单独计算机有线或者无线通信，计算机包含在所述显微镜 设备内从所述CMOS传感器中收集的图像中识别物体并且将物体分类的成像软件的，以及控 制软件，用于操作显微镜，
[0298] a)使用连接至以介于每分钟0 . Imm与每分钟2mm之间的速率沉淀在水溶液中的分 散的固相颗粒的特异性抗体以及特异性地结合于全血中的分析物的颗粒上的抗体；
[0299] b)竞争性使用标记的分析物或者非竞争性地使用标记的覆盖抗体，检测连接至抗 体结合的固相的分析物，其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供 足够浓度的颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤，其中，沉淀颗粒的图像由第 一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的边界或边缘，以及
[0300] c)在暴露到第二电磁福射中之后，确定位于由第一电磁福射限定的边界内的电磁 辐射的强度；以及
[0301 ] d)在暴露到第二电磁福射中之后，确定位于由第一电磁福射限定的边界外的电磁 辐射的强度，并且从位于由第一电磁辐射限定的边界内的电磁辐射的强度中减去位于由第 一电磁辐射限定的边界外的电磁辐射的强度，有效地减去背景电磁辐射，据此，比较第二电 磁辐射的强度和标准曲线，以获得化验的分析物的浓度。
[0302]实施方式59.-种使用结合伴侣进行期望化学实体的化验的方法，用于连接至可 分散的固相物体的期望化学实体，所述显微镜测量设备包括图像传感器、物镜、用于修改辐 射、发射或散射辐射的光特性和/或用于引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电磁辐射的 可选的滤光器组件、能够导通和断开的至少一个电磁辐射源，并且所述显微镜测量设备被 配置为与单独的计算机有线或者无线地通信，所述计算机包含成像软件并且被配置为识别 并且分类从所述显微镜测量设备中的所述图像传感器收集的图像中的物体，并且控制用于 按照通过以下将视野内的二维物体分类的方法来操作显微镜的软件：
[0303] a)利用第一电磁辐射源来辐射所述视野内的物体，
[0304] b)将生成的图像投射到图像传感器上，
[0305] c)使用所述视野内的物体的生成的数字表示，来使用ImageJ软件识别颗粒作为所 述数字表示内的物体，
[0306] d)使用每个物体的边缘的坐标来限定在所述物体的所述数字表示内包含的围绕 每个物体的区域的区域，
[0307] e)确定每个物体的数字表示中的面积、直径和平均强度，
[0308] f)通过从所述物体的所述数字表示的边界中减去一个像素来分离接触的颗粒，使 得接触颗粒能够被识别、枚举和适当地分类，
[0309] g)使用所述边缘坐标来限定与物体的边缘相邻但是位于所述物体外面的区域，以 计算电磁源的背景强度，并且从每个物体的数字表示的边缘内包含的物体的电磁强度中减 去平均的该背景强度，
[0310] h)使用在物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收光的 物体内的化学实体的浓度，
[0311] i)根据将所述第一组物体进一步分类到子集的需要，根据提供关于所述物体的所 述数字表示的预定边界内的物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁源顺序地询 问相同的第一物体，以及
[0312] j)利用η个额外的第一电磁辐射源询问相同视野，每个电磁辐射源因以下而区分 开:基于物体的电磁特性来唯一地区分所述视野内的物体的一些电磁特性;然后，利用尽可 能多的额外电磁辐射源曝光物体，以细分包含在由第一电磁辐射源识别的边界内的物体，
[0313] k)使用连接至分散的固相的任何结合伴侣，来捕捉体液中的期望的化学实体，并 且竞争性地使用所述化学实体的第二标记的捕捉伴侣或者非竞争性地使用所述期望的化 学实体的标记的衍生物来检测所述期望的化学实体；
[0314] 1)其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供足够浓度的 颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤；
[0315] m)其中，沉淀颗粒的图像由第一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的 边界或边缘；
[0316] η)以及在暴露于第二电磁福射中之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的边界 内的电磁辐射的强度；以及
[0317] 〇)在暴露于第二电磁福射中之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的边界外的 电磁辐射的强度，并且从位于由所述第一电磁辐射限定的边界内的电磁辐射的强度中减去 位于由所述第一电磁辐射限定的边界外的电磁辐射的强度；以及
[0318] ρ)比较所述第二电磁辐射的强度和标准曲线，以推导化验的分析物的浓度。
[0319]实施方式60.根据实施方式59所述的方法，所述方法包括使用专用于感兴趣的比 色化学反应的有色产品的波长的透射LED光，打开或关闭所述LED以实现期望的辐射波长。 [0320]实施方式61.根据实施方式29-50中任一项所述的测量设备，其中，所述测量设备 被配置为使用专用于感兴趣化学反应的发射的电磁辐射。
[0321]实施方式62.根据实施方式29-50中任一项所述的测量设备，所述测量设备被配置 为使用安装在可移动镜台上的干化学测试条来执行化学分析，通过计算提供一致读数的干 反应垫的面积来确定所述检测的面积。
【主权项】
1. 一种分类视野内的作为二维物体的颗粒的显微镜方法，所述方法包括： a) 利用第一电磁辐射源照射所述视野； b) 将生成的图像投射到图像传感器上以获得所述视野的第一数字表示； c) 使用所述第一数字表示来识别所述第一数字表示内的第一物体； d) 使用所述第一物体的边缘的边缘坐标来限定在所述第一物体的所述第一数字表示 内包含的围绕所述第一物体的区域的区域； e) 确定所述第一物体的一个或多个物体特性； f) 通过从所述第一物体的所述第一数字表示的边界中减去一个或多个像素来分离接 触的颗粒； g) 使用所述边缘坐标来限定与第一物体的边缘相邻但是位于所述第一物体外面的区 域，以计算所述第一电磁辐射源的背景强度，并且从所述第一物体的电磁强度中减去平均 的该背景强度；以及 h) 使用在所述第一物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收 光的所述第一物体内的颗粒特性。2. 根据权利要求1所述的方法，所述方法包括:根据将所述第一物体进一步分类到第一 子集的需要，根据提供关于所述第一物体的所述第一数字表示的预定边界内的所述第一物 体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁辐射源顺序地询问所述第一物体。3. 根据权利要求1-2中任一项所述的方法，所述方法包括:利用第二电磁辐射源询问所 述视野以获得所述视野的第二数字表示，所述第二电磁辐射源通过以下与所述第一电磁辐 射源区分开:基于第二物体的电磁特性来唯一地区分所述视野内的所述第二物体的一些电 磁特性;然后，根据将所述第二物体进一步分类到第二子集的需要，根据提供关于所述第二 数字表示的所述第二物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的额外电磁辐射源暴露所 述第二物体，以细分包含在由第一电磁辐射源识别的边界内的物体。4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，电磁辐射源辐射的光的波长选自于 lOOnm到2000nm的范围，所述光包括紫外线、可见以及红外线光谱的部分。5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射的光的波长选 自于lOOnm到lOOOnm的范围，所述光引起天然存在的焚光团或人工导入的焚光团的焚光激 发，其中，由所激发的荧光团发射的光被用来创建帮助分类相应的物体的图像。6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射的光的波长选 自于lOOnm到2000nm的范围，其中，光由物体内的化学实体或颗粒吸收，使得包含吸收实体 或颗粒的相应图像具有较低强度的检测的电磁辐射。7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用电磁辐射源在不同的 角度贯穿样品来引起所述视野内的物体散射不同强度的电磁辐射。8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用电磁源从与检测传感 器区域成0至80度垂直来贯穿所述视野内的物体，使得显微镜的物镜捕捉在不同的角度散 射的光。9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用具有不同的偏振特性 的电磁源。10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用电磁源诱导天然存在 的磷光体或人工导入的磷光体的磷光。11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用透射光源从血红蛋白 的俗特谱带创建来自动物或人的血液的红细胞的图像，并且使用这些图像来计算颗粒特 性，诸如所述红细胞的面积、直径和体积、以及所述红细胞内的血红蛋白的浓度，并且其中， 通过激发附接至网状细胞中的网硬蛋白的核酸结合荧光团并且识别具有荧光发射的那些 红细胞，来识别所有红细胞之中的网状细胞。12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:利用荧光团处理来自动物 或人的体液的白细胞，并且通过使用激发光源检测白细胞，并且发射的光被透射在检测传 感器上以形成发荧光白细胞的数字表示。13. 根据权利要求12所述的方法，所述方法包括:使用核酸结合荧光团用于检测来自动 物或人的体液的白细胞。14. 根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中，所述核酸结合荧光团选自于吖啶 酯、噻唑橙和溴化乙啶的组。15. 根据权利要求12-14中任一项所述的方法，所述方法包括:计算荧光发射实体的直 径、浓度以及对应于二维荧光图像的物体的体积，并且使用所述荧光发射实体的直径、浓度 以及所述物体的体积来帮助将所述白细胞分类成淋巴细胞、粒细胞和单核细胞。16. 根据权利要求12-15中任一项所述的方法，所述方法包括:使用两个或更多荧光激 发源或者两个或更多荧光发射检测波长来检测不同的发荧光种类，使得白细胞内的不同实 体能够被检测，并且使用荧光的强度和量来进一步将白细胞的子集分类。17. 根据权利要求12-16中任一项所述的方法，所述方法包括:使用从300nm到800nm的 可见光在介于与传感器成60和90度垂直之间的角度照亮粒细胞，使得白细胞中的细胞质颗 粒强烈地散射光，而没有颗粒的细胞质不散射光或者散射强度非常低的光。18. 根据权利要求12-17中任一项所述的方法，所述方法包括:在通过利用300到800nm 的光在与所述传感器成60到90度垂直的角度照亮相同物体所细分的这些图像之中分类粒 细胞，而粒细胞是具有高强度的散射光的那些图像。19. 根据权利要求1所述的方法，其中，首先使用荧光来识别来自人或动物的体液的白 细胞，且然后将淋巴细胞和单核细胞识别为具有可忽略的散射光的图像。20. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用1到50兆像素的CMOS 或C⑶传感器。21. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，利用电子开关能够导通和断开电磁 源，所述电子开关提供利用2-10个不同的电磁源顺序地询问相同视野的能力，2-10个不同 的电磁源仅限于由用于所述电磁源的空间的约束条件以及用于成像所述视野的时间的约 束条件。22. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:具有一次性或者可再使用 的观察室，所述方法包含感兴趣的颗粒的液体分散并且允许统计上的大量颗粒被计数。23. 根据权利要求23所述的方法，其中，所述观察室具有介于50微米与10mm之间的厚 度。24. 根据权利要求18所述的方法，所述方法包括:将物镜放在检测CMOS或CCD传感器之 间，所述物镜提供足够的放大倍数来确定物体尺寸，并且也具有足够的视野来允许所述视 野中的物体的统计上的大量计数。25. 根据权利要求24所述的方法，其中，所述物镜具有介于2X与15X之间的放大倍数。26. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:利用用来识别红细胞的红 细胞的俗特谱带以及用来检测白细胞的核酸结合荧光团的荧光在体液中检测红细胞和白 细胞两者，而不使用红细胞的分离或溶解。27. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法使用诸如但不限于N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸钠的球形化试剂将红细胞从双凹圆盘转换成均匀球体，其 中，所述球形化试剂不影响白细胞的形态或散射特性。28. 根据权利要求25所述的方法，所述方法不使用球形化的试剂，而是使用保持所述红 细胞的天然双凹圆盘形状的试剂。29. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:在30秒到10分钟内选择性 地溶解红细胞，而不影响白细胞的形态或光散射特性。30. 根据权利要求29所述的方法，所述方法将0.1M氯化铵、pH8.0用作具有或不具有球 形化试剂的红细胞溶解试剂。31. -种显微镜测量设备，包括图像传感器、物镜以及用于照射显微镜镜台的第一电磁 辐射源，所述图像传感器有线或者无线地连接至单独的计算机，所述计算机被配置为识别 并且分类从所述显微镜设备中的所述图像传感器收集的图像中的物体。32. 根据权利要求31所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备用于检测体液 中的颗粒或者高或低分子量的化学实体，所述体液包括但不限于血液、尿液、脊髓液、唾液、 腹膜液和肺灌洗，并且使用单个测量设备提供完整范围的体外诊断测试。33. 根据权利要求31-32中任一项所述的显微镜测量设备，所述显微镜测量设备被配置 为执行血液学、尿液分析、化学、免疫测定和/或凝结的体外诊断测试。34. 根据权利要求31-33中任一项所述的显微镜测量设备，包括滤光器组件，所述滤光 器组件包括第一滤光器、第一反射镜和第一分束器中的至少一个，所述第一滤光器被配置 为修改辐射、发射或散射的辐射的光特性，所述第一反射镜和/或所述第一分束器被配置为 引导透射、散射的电磁福射以及发射的电磁福射。35. 根据权利要求34所述的显微镜测量设备，其中，所述光学组件被配置为将来自所述 物镜的光从垂直平面重新引导到水平平面，使得相机的高度介于2cm与15cm之间。36. 根据权利要求31-35中任一项所述的显微镜测量设备，包括设置在所述显微镜镜台 之下的诸如灯圈的光源，其中，所述光源被配置用于正面落射光照明。37. 根据权利要求31-36中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为提供透过所述物镜的正面落射光照明。38. 根据权利要求31-37中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为执行荧光显微镜检查。39. 根据权利要求31-38中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为执行透射显微镜检查。40. 根据权利要求31-36中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为执行光散射显微镜检查。41. 根据权利要求31-40中任一项所述的显微镜测量设备，包括多个电磁辐射源，其中， 所述显微镜测量设备被配置为通过利用不同的电磁辐射源照明所述显微镜镜台中的物体， 来对同一组物体顺序地执行透射、光散射和/或荧光显微镜检查。42. 根据权利要求31-41中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为介于与透过所述物镜的散射光路的路径成〇与60度垂直之间来提供照明。43. 根据权利要求31-41中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为从与透过所述物镜的散射光路的路径成60至80度垂直来提供照明。44. 根据权利要求31-43中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 包括设置在所述镜台与所述物镜之间的一个或多个LED，其中，所述显微镜测量设备被配置 为利用透射光照明所述显微镜镜台中的样品。45. 根据权利要求31-44中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为将荧光激发源的照明时间控制在20毫秒与10秒之间，以实现足够的荧光发射强 度，用于所述图像传感器利用荧光发射来检测感兴趣的物体。46. 根据权利要求31-45中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为将从与透过所述物镜的散射光路的路径成〇至80度垂直放置的LED的照明时间控 制在20毫秒与10秒之间，以实现足够的光散射来检测感兴趣的物体。47. 根据权利要求31-46中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜镜台是固 定的或可移动的，并且被配置为用于保持样品室放置在所述物镜的前方的同时被电磁辐射 源照明。48. 根据权利要求47所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜镜台是可移动的，并且 被配置为允许所述样品室中的1至10个观察区域透过所述物镜被观察，并且其中，所述镜台 是手动地或者在马达控制下可移动。49. 根据权利要求31-48中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜镜台被配 置为将所述样品室保持在所述图像传感器的成像表面与搁置物体的表面之间的固定距离， 例如+/-10微米，从而避免在拍摄图像之前聚焦的需要。50. 根据权利要求31-49中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜镜台包含 固定参考区域，所述固定参考区域允许所述显微镜测量设备调整电磁辐射源的照明强度， 验证用来帮助将样品中的物体分类的强度的范围，并且所述固定参考区域允许所述显微镜 测量设备的放大倍数和焦点的质量控制而无需操作人员介入。51. -种供显微镜测量设备使用的样品室，所述样品室包括用于包含样品的相隔5和50 微米的两个平坦表面，所述样品室被配置为包含介于5与100uL之间的液体，所述样品室的 形状允许对所述样品室均匀且可再现地填充样品，并且防止在完成分析之前样品移动或者 样品蒸发。52. 根据权利要求51所述的样品室，所述样品室包括用于将样品与试剂合并的腔室。53. 根据权利要求51-52中任一项所述的样品室，所述样品室包括：用于精确地测量5-50uL的样品和50到500uL的试剂，且然后在将所述样品导入所述样品室的观察区域之前，合 并并且混合所述样品和所述试剂的装置。54. 根据权利要求51-53中任一项所述的样品室，所述样品室具有带有两个相应的平坦 表面的第一壁和第二壁，所述第一和第二壁的厚度介于100微米与4mm之间，选择壁的厚度 和成分以最小化从表面进入所述腔室的光谱反射和光散射，否则会有助于背景散射。55. 根据权利要求51-54中任一项所述的样品室，所述样品室具有1mm乘以1mm直到5mm 乘以5mm的观察区域并且具有从100微米到20mm的高度。56. 根据权利要求51-55中任一项所述的样品室，所述样品室被配置为允许样品在60秒 到24小时沉淀，使得沉淀的颗粒搁置在所述样品室的底部，并且能够通过所述显微镜测量 设备观察、识别和分类。57. 根据权利要求51-56中任一项所述的样品室，所述样品室包括封闭物，用于在填充 所述样品室之后封闭所述样品室，使得在沉降时间期间不发生蒸发。58. -种使用显微镜测量设备进行免疫测定的方法，所述显微镜测量设备包括图像传 感器、物镜、用于修改照射、发射或散射的辐射的光特性和/或用于引导透射、散射的电磁辐 射以及发射的电磁辐射的可选的滤光器组件、能够导通和断开的至少一个电磁辐射源，并 且所述显微镜测量设备被配置为与单独的计算机有线或者无线地通信，所述计算机包含成 像软件并且被配置为识别并且分类从所述显微镜测量设备中的所述图像传感器收集的图 像中的物体，其中，所述方法包括： a) 使用连接至以介于每分钟0.1mm与每分钟2mm之间的速率沉淀在水溶液中的分散的 固相颗粒的特异性抗体以及特异性地结合于全血中的分析物的颗粒上的抗体， b) 竞争性使用标记的分析物或者非竞争性地使用标记的覆盖抗体，检测连接至抗体结 合的固相的分析物，其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供足够 浓度的颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤，其中，沉淀颗粒的图像由第一电 磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的边界或边缘，以及 c) 在暴露于第二电磁福射之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的所述边界内的电 磁辐射的强度，以及 d) 在暴露于第二电磁福射之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的所述边界外的电 磁辐射的强度，并且从位于由所述第一电磁辐射限定的所述边界内的电磁辐射的强度中减 去位于由所述第一电磁辐射限定的所述边界外的电磁辐射的强度，有效地减去背景电磁辐 射，由此比较所述第二电磁辐射的强度和标准曲线，以推导化验的分析物的浓度。59. -种使用结合伴侣进行期望化学实体的化验的方法，用于连接至可分散的固相物 体的期望化学实体，显微镜测量设备包括图像传感器、物镜、用于修改照射、发射或散射的 辐射的光特性和/或用于引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电磁辐射的可选的滤光器 组件、能够导通和断开的至少一个电磁辐射源，并且所述显微镜测量设备被配置为与单独 的计算机有线或者无线地通信，所述计算机包含成像软件并且被配置为识别并且分类从所 述显微镜测量设备中的所述图像传感器收集的图像中的物体，以及包含用于按照通过以下 将视野内的二维物体分类的方法来操作显微镜的控制软件： a) 利用第一电磁辐射源来辐射所述视野内的所述物体， b) 将生成的图像投射到图像传感器上， c) 使用所述视野内的所述物体的生成的数字表示，来使用ImageJ软件识别颗粒作为所 述数字表示内的物体， d) 使用每个物体的边缘的坐标来限定在所述物体的所述数字表示内包含的围绕每个 物体的区域的区域， e) 确定每个物体的所述数字表示的面积、直径和平均强度， f) 通过从所述物体的所述数字表示的边界中减去一个像素来分离接触的颗粒，使得接 触颗粒能够被识别、枚举和适当地分类， g) 使用边缘坐标来限定与所述物体的边缘相邻但是位于所述物体外面的区域，以计算 电磁源的背景强度，并且从每个物体的数字表示的边缘内包含的所述物体的电磁强度中减 去平均的该背景强度， h) 使用在所述物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收光的 所述物体内的化学实体的浓度， i) 根据将第一组物体进一步分类到子集的需要，根据提供关于所述物体的所述数字表 示的预定边界内的所述物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁源顺序地询问相 同的第一物体，以及 j) 利用η个额外的第一电磁辐射源询问相同的视野，每个电磁辐射源因以下而区分开： 基于所述物体的电磁特性来唯一地区分所述视野内的物体的一些电磁特性;然后，利用尽 可能多的额外电磁辐射源暴露所述物体，以细分包含在由第一辐射源识别的边界内的物 体， k) 使用连接至分散的固相的任何结合伴侣，来捕捉体液中的期望的化学实体，并且竞 争性地使用所述化学实体的第二标记的捕捉伴侣或者非竞争性地使用所述期望的化学实 体的标记的衍生物来检测所述期望的化学实体； l) 其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择所述观察室的高度以提供足够浓度的 颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤； m) 其中，沉淀颗粒的图像由第一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的边界 或边缘； η)以及在暴露于第二电磁福射之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的所述边界内 的电磁辐射的强度； 〇)以及在暴露于第二电磁福射之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的所述边界外 的电磁辐射的强度，并且确定从位于由所述第一电磁辐射限定的所述边界内的电磁辐射的 强度中减去位于由所述第一电磁辐射限定的所述边界外的电磁辐射的强度；以及 Ρ)比较所述第二电磁辐射的强度和标准曲线，以推导化验的分析物的浓度。60. 根据权利要求59所述的执行化学测试的方法，所述方法包括:使用专用于感兴趣的 比色化学反应的有色产物的波长的透射LED光，其中，所述方法包括接通或断开LED以实现 期望波长的辐射。61. 根据权利要求31-50中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为使用专用于感兴趣的化学反应的发射的电磁辐射。62. 根据权利要求31-50中任一项所述的显微镜测量设备，所述显微镜测量设备被配置 为使用安装在可移动镜台上的干化学测试条来进行化学分析，通过计算提供一致读数的干 反应垫的面积来确定检测的面积。
【专利摘要】一种用于检测体液中的颗粒和可溶性化学实体的系统和方法，包括的系统包括显微镜设备、样品室以及试剂，且包括的方法用来检测、分类以及枚举体液中的颗粒和化学实体。包含颗粒的体液与试剂结合沉淀至观察室的底部，将颗粒带入数字显微镜检测器的焦点处。识别为在捕捉的数字图像内吸收或发射电磁辐射的区域的颗粒可以基于第一数字图像的预定义区域内的附加吸收或发射的电磁辐射进一步分类。
【IPC分类】G01N15/14
【公开号】CN105492887
【申请号】CN201480027187
【发明人】理查德·哈理·特纳
【申请人】理查德·哈理·特纳
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年3月10日
【公告号】CA2905564A1, EP2973408A2, US20160042507, WO2014141034A2, WO2014141034A3
【技术领域】
[0001]本发明总体上涉及体液中的颗粒和化学实体的体外检测。具体而言，本发明涉及
[1] 识别、分类以及计数体液中的颗粒和/或(2)确定体液样品中的可溶性化学实体的浓度 的系统和方法。
【背景技术】
[0002] 体外医学诊断测试广泛地用于检测体液中的异常，作为诊断疾病的辅助。大多数 的这种测试在复杂的、高度自动化的、昂贵的仪器中处理大量体液样品的医院实验室或参 考实验室内发生，这些仪器需要昂贵的维护成本，并且需要高技能的操作人员来执行和解 释测试并且确保仪器适当地操作。
[0003] 由于实验室系统较大并且复杂，所以个人不能在家里、在大部分医生的办公室内 或者甚至在门诊诊所或急诊室内使用。在这些设置中存在测试的需要，来减少将样品输送 给远程实验室的需要，并且提供更多立即应答，这些立即应答可以及时改变患者行为或者 医生介入和治疗。
[0004] 为了满足这种床边检测的需要，已经研制了几种系统。最值得一提的是，广泛使用 葡萄糖测试仪来监控血糖水平，作为控制胰岛素使用的辅助，并且改变糖尿病患者的饮食 习惯。不用仪器的干化学测试条用于检测尿液(尿液分析)的异常、大便标本的直肠的流血、 以及使用尿液分析试条的怀孕。诊断制造商研制了一些系统，用于检测在血液和尿液内的 细胞，这些系统不如中心实验室等效物复杂，但是这些系统依然相当昂贵并且操作复杂，因 此，未满足血液学的护理装置的真正需求点。使用仪器仪表的免疫测定的床边检测系统迄 今为止在很大程度上不成功。
[0005] 显然，由于实验室分析人员使用广泛不同的技术来实现这些类型的化验所需要的 敏感度和精度的苛刻要求，所以没有单个仪器或技术可以执行通常在医院实验室执行的大 量测试。由于用户仅仅想要购买一种仪器，所以具有可以执行大量测试的仪器是非常可取 的。这不仅减少了初期投资，而且降低了操作和保持很多不同装置的复杂度。
[0006] 直到最近，使用数字成像的床边检测显微镜的设计不实际。显微镜样品在研究实 验室内进行了一段时间的数字成像。直到最近，用于这些系统内的传感器昂贵。而且，直到 最近，传感器具有有限数量的像素，构成具有差质量的显微镜数字图像的分辨率并且仅仅 允许具有小视野。这个限制通常难以精确地识别和分类体液颗粒，并且同时难以观看足够 大的体积，以提供精确地计算统计。而且，直到最近，用于显微镜检查中的传感器的辐射源 昂贵、难以保持并且难以用于简单设计中。
[0007]过去10年见证了 CMOS和CCD技术的大幅改进，大幅降低价格并且提高了成像传感 器的分辨率。电磁辐射源（最明显地，LED技术）也具有演变，能够辐射显微镜样品，用于传 输、散射、荧光以及磷光。这些技术进步现在允许设计通过新型方式使用这些部件的系统， 以实现便宜、高质量以及通用的数字显微镜。通过使用与用于中心实验室系统内的检测器 相当的对辐射和敏感度具有响应的CMOS传感器，能够使用利用CMOS传感器的数字显微镜来 执行化学和免疫测定测试，具有与医院实验室系统相似的特征。
[0008] 现有医院实验室仪器在其成本和复杂性方面也具有缺点。例如，在用于血液学和 尿液分析的实验室流式细胞仪内，假设流过检测器的颗粒与干扰颗粒广泛地分开，以便所 获得的任何信号来自单个颗粒，没有背景干扰。这导致例如，在使用Sysmex分析仪分析的尿 液样品中具有无定形水晶时，造成红血细胞和白血细胞的识别和分类具有误差。甚至在使 用高度敏感并且昂贵的光电放大器检测器时，使用流动分析的所有实验室血细胞计数器 (流式细胞仪)必须使用昂贵的激光源，来实现检测高速穿过该激光源的单细胞的信号。这 种方法需要辐射、辐射检测部件以及复杂的射流控制，其昂贵并且需要由高度训练的人员 操作和维修。本发明克服了在颗粒识别、分类以及计算中具有更低成本和更低复杂度的所 有这些限制。
[0009] 免疫测定通常需要复杂的仪器，其协同多个反应步骤，以实现很多免疫测定需要 的高敏感度和特异性。通常，免疫测定需要分离步骤。这个步骤尤其需要复杂的机械和流体 处理操作，这使低成本分析仪不实际。本发明不需要洗涤，因此，使使用在本发明中描述的 检测方法的免疫测定降低成本和复杂度，这是在床边检测装置中可取的特征。
【发明内容】
[0010] 本公开涉及一种将在视野内的二维物体分类的显微镜方法、一种测量设备、以及 一种用于测量设备的样品室。进一步，公开了一种执行免疫测定的方法以及一种执行期望 的化学实体的化验的方法。
[0011] 本公开涉及一种体外诊断测试系统和方法，用于执行血液学、化学、尿液分析以及 与使用体液的免疫测定相似的测试。本发明可以使用具有有线或无线连接性的任何计算 机，例如，USB端口或蓝牙连接能力，分别用于与单独显微镜测量设备通信。本发明可以使用 嵌入测量设备内的计算机。
[0012] 计算机可以与台式计算机一样复杂，或者与平板电脑一样简单，例如，微型iPad或 Samsung Galaxy。包含应用软件，其允许用户识别样品，选择要进行的测试，并且开始测试 序列。使用蓝牙无线地或者通过USB连接硬连线地将高电平信号传输给显微镜设备。可替代 地，计算机可以嵌入测量设备内。
[0013] 公开一种将在视野内的作为二维物体的颗粒分类的显微镜方法。所述方法可以包 括通过第一电磁辐射源，照射所述视野;并且投射所产生的图像(第一图像)在图像传感器 上，以获得所述视野的第一数字表示。所述方法可以包括使用所述第一数字表示来识别在 所述第一数字表示内的第一物体;并且使用所述第一物体边缘的边缘坐标来限定包含在所 述第一物体的第一数字表示内的限制所述第一物体的区域的区域，然后，确定所述第一物 体的一个或多个物体特性。可选地，该方法包括通过从所述第一物体的第一数字表示的边 界中减去一个像素来分离接触的颗粒。所述方法可以包括使用所述边缘坐标或至少一些边 缘坐标来限定与第一物体的边缘相邻但是位于所述第一物体外面的区域，以计算所述第一 电磁辐射的背景强度，并且补偿背景强度，例如，通过从所述第一物体的电磁强度中减去这 个平均背景强度。所述方法可以包括使用在所述第一物体(第一图像)的边缘内的区域的电 磁强度，来通过参考标准曲线或其他参考曲线，确定在吸收光的第一物体内的颗粒特性。
[0014] 还公开了一种显微镜测量设备，其包括图像传感器、物镜以及一个或多个电磁辐 射源，包括用于照射显微镜镜台的第一电磁辐射源和/或用于照射显微镜镜台的第二电磁 辐射源。所述图像传感器可有线或者无线连接至单独计算机，所述计算机被配置为从在所 述显微镜设备内的所述图像传感器收集的图像中识别物体并且将物体分类。
[0015] 进一步，公开了一种供显微镜测量设备使用的样品室，所述样品室包括相隔5和50 微米的两个平面，用于包含样品，所述样品室被配置为包含介于5与IOOuL之间的液体，所述 样品室的形状允许使样品均匀地并且可再现地填充至所述样品室，并且防止在完成分析之 前移动样品或者蒸发样品。
[0016] 公开了一种进行免疫测定的方法，所述方法使用显微镜测量设备，所述显微镜测 量设备包括图像传感器、物镜、用于修改辐射、发射或散射辐射的光特性和/或用于引导透 射、散射的电磁福射以及发射的电磁福射的可选的滤光器组件、可以导通和断开的至少一 个电磁辐射源，并且所述显微镜测量设备被配置为与单独计算机有线或者无线通信，该计 算机包含成像软件并且被配置为从在所述显微镜设备内的所述图像传感器收集的图像中 识别物体并且将物体分类。所述方法包括一个或多个以下步骤：
[0017] a)使用连接至以介于每分钟0 · Imm与每分钟2mm之间的速率沉淀在水溶液中的分 散的固相颗粒的特异性抗体以及特异性地结合于全血中的分析物的颗粒上的抗体；
[0018] b)竞争性使用标记的分析物或者非竞争性地使用标记的覆盖抗体，检测连接至抗 体结合的固相的分析物，其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供 足够浓度的颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤，其中，沉淀颗粒的图像由第 一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的边界或边缘，以及
[0019] c)在暴露到第二电磁福射中之后，确定位于由第一电磁福射限定的边界内的电磁 辐射的强度；以及
[0020] d)在暴露到第二电磁福射中之后，确定位于由第一电磁福射限定的边界外的电磁 辐射的强度，并且从位于由第一电磁辐射限定的边界内的电磁辐射的强度中减去位于由第 一电磁辐射限定的边界外的电磁辐射的强度，有效地减去背景电磁辐射，由此比较第二电 磁辐射的强度和标准曲线，以推导出化验的分析物的浓度。
[0021] 进一步地，公开了一种使用结合伴侣进行期望化学实体的化验的方法，用于连接 至可分散的固相物体的期望化学实体，所述显微镜测量设备包括图像传感器、物镜、用于修 改辐射、发射或散射辐射的光特性和/或用于引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电磁辐 射的可选的滤光器组件、能够导通和断开的至少一个电磁辐射源，并且所述显微镜测量设 备被配置为与单独的计算机有线或者无线地通信，所述计算机包含成像软件并且被配置为 识别并且分类从所述显微镜测量设备中的所述图像传感器收集的图像中的物体，并且控制 用于按照通过以下将视野内的二维物体分类的方法来操作显微镜的软件：
[0022] a)利用第一电磁辐射源来辐射所述视野内的物体，
[0023] b)将生成的图像投射到图像传感器上，
[0024] c)使用所述视野内的物体的生成的数字表示，来使用ImageJ软件识别颗粒作为所 述数字表示内的物体，
[0025] d)使用每个物体的边缘的坐标来限定在所述物体的所述数字表示内包含的围绕 每个物体的区域的区域，
[0026] e)确定每个物体的数字表示中的面积、直径和平均强度，
[0027] f)通过从所述物体的所述数字表示的边界中减去一个像素来分离接触的颗粒，使 得接触颗粒能够被识别、枚举和适当地分类，
[0028] g)使用所述边缘坐标来限定与物体的边缘相邻但是位于所述物体外面的区域，以 计算电磁源的背景强度，并且从每个物体的数字表示的边缘内包含的物体的电磁强度中减 去平均的该背景强度，
[0029] h)使用在物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收光的 物体内的化学实体的浓度，
[0030] i)根据将所述第一组物体进一步分类到子集的需要，根据提供关于所述物体的所 述数字表示的预定边界内的物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁源顺序地询 问相同的第一物体，以及
[0031] j)利用η个额外的第一电磁辐射源询问相同视野，每个电磁辐射源因以下而区分 开:基于物体的电磁特性来唯一地区分所述视野内的物体的一些电磁特性;然后，利用尽可 能多的额外电磁辐射源曝光物体，以细分包含在由第一电磁辐射源识别的边界内的物体，
[0032] k)使用连接至分散的固相的任何结合伴侣，来捕捉体液中的期望的化学实体，并 且竞争性地使用所述化学实体的第二标记的捕捉伴侣或者非竞争性地使用所述期望的化 学实体的标记的衍生物来检测所述期望的化学实体；
[0033] 1)其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供足够浓度的 颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤；
[0034] m)其中，沉淀颗粒的图像由第一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的 边界或边缘；
[0035] η)以及在暴露于第二电磁福射中之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的边界 内的电磁辐射的强度；以及
[0036] 〇)在暴露于第二电磁福射中之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的边界外的 电磁辐射的强度，并且从位于由所述第一电磁辐射限定的边界内的电磁辐射的强度中减去 位于由所述第一电磁辐射限定的边界外的电磁辐射的强度；以及
[0037] ρ)比较所述第二电磁辐射的强度和标准曲线，以推导化验的分析物的浓度。
[0038] 显微镜设备的宽度和高度与iPad相似，但是几英寸的厚度(虽然具有更大的版本） 在某些应用中有用。该设备的设计具有简单的概念，并且制造和操作成本低。
[0039]显微镜设备使用显微镜检测来检测在体液内的颗粒，例如，白血细胞或红血细胞。 为了实现这个目的，该设备具有利用不同波长、方向以及特性的照射依次照射样品的阵列。 样品吸收、散射并且可以重新发射由物镜放大的电磁辐射的并且投射在CMOS或CCD传感器 上。传感器的数字图像传送给计算机，其中，图像处理软件识别、分类并且枚举在图像内物 体。
[0040] 本发明的独特特征是使用物体的不同照射装置获得视野的多个图像的概念，而视 野保持静止。通过使用不同照射装置获得视野的多个图像，最终能够正确地识别和分类物 体。
[0041] 本发明的另一个特征在于，使用电磁辐射的一个源的第一数字图像用于基于在这 个图像内的每个物体的一个照射特性来识别物体坐标和边界，然后，使用不同的电磁辐射 捕捉一个或多个额外图像。由于具有使每个图像注册(registering)至第一个图像的装置， 所以能够验证每个数字图像的特性是第一物体的特性。在基于单个图像的普通显微镜中， 背景信号可以误解为属于物体。
【附图说明】
[0042]图1示出了通过利用第一电磁辐射，接着利用第二电磁辐射照射样品中沉淀到样 品室的底部的物体所创建的数字图像的实施例；
[0043]图2示出了与包含图像处理应用程序和用户界面软件的计算机一起使用的显微镜 测量设备的构造；
[0044] 图3示出了显微镜测量设备的部件的示意图；
[0045] 图4不出了样品室的侧视图和顶视图的不意图；
[0046] 图5示出了计算机上的软件应用程序和显微镜测量设备上的固件应用程序以及软 件和固件应用程序如何协同处理的示例性步骤；
[0047] 图6示出了操作人员可以执行的用于处理血液样品的步骤；
[0048] 图7示出了使用本发明的免疫测定应用；以及 [0049 ]图8示出了针对网状细胞应用的图像处理步骤。
【具体实施方式】
[0050] 在本发明的以下描述中，参照构成本发明的一部分的附图的描述，并且在附图中 通过说明的方式，示出了说明本发明的原理的示例性实施方式以及可以实践本发明的方 式。要理解的是，其他实施方式可以用于实践本发明，并且在不背离本发明的范围的情况 下，可以对其作出结构和功能的变化。进一步，关于附图记载的特征不必限于在图中公开的 特征的具体组合。
[0051] 所述方法可以包括根据将第一物体进一步分类成第一子集的需要，根据提供关于 第一物体的第一数字表示的预定边界内的第一物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多 的电磁福射源，例如至少2个、3个或更多个来顺序地询问（interrogating)第一物体。
[0052] 所述方法可以包括通过第二电磁辐射源询问所述视野，以获得所述视野的第二数 字表示，所述第二电磁辐射源与第一电磁辐射源由一些电磁特性来区分开，基于第二物体 的电磁特性唯一地区分在所述视野内的第二物体。然后，所述方法可以包括根据进一步将 所述第二物体分成第二子集的需要，根据提供关于所述第二数字表示的第二物体的唯一光 学信息的需要，利用尽可能多的额外电磁辐射源来暴露所述第二物体，以再细分包含在由 第一电磁辐射源识别的边界内的物体。
[0053]所述电磁辐射源辐射可以被配置为辐射具有从IOOnm到2000nm的范围中选择的波 长的光。所述光可以包括紫外线、可见以及红外线光谱的部分。
[0054]所述电磁辐射源辐射可以被配置为辐射从IOOnm到1000 nm的范围中选择的波长的 光。所述光可以促使天然存在的荧光团或人工导入的荧光团的荧光激发。由所述激发的荧 光团发射的光可以用于产生帮助将相应的物体分类的图像。
[0055]所述电磁辐射源辐射可以被配置为辐射从IOOnm到2000nm的范围中选择的波长的 光。可以由在所述物体内 的化学实体或颗粒吸收光，以便包含所述吸收实体或颗粒的相应 图像具有更低强度的检测的电磁辐射。
[0056]所述方法可以包括使用通过不同的角度贯穿（intersect，相交)所述样品的电磁 辐射源，来造成在所述视野内的物体具有不同强度的电磁辐射散射。
[0057]所述方法可以包括:使用通过与所述检测的传感器区域0到80°垂直来贯穿所述视 野内的物体的电磁辐射，例如，第一电磁源和/或第二电磁源，以便所述显微镜的物镜捕捉 通过不同的角度散射的光，例如，第一电磁源的第一角度和/或第二电磁源的第二角度。第 一和第二角度可以不同。
[0058] 所述方法可以包括使用具有相同或不同的偏振特性的电磁源，例如，具有第一偏 振特性的第一电磁源和具有第二偏振特性的第二电磁源。
[0059] 所述方法可以包括使用引起天然存在的磷光体和/或认为导入的磷光体的磷光的 电磁源。
[0060] 所述方法可以包括使用透射的光源从血红蛋白的俗特谱带来创建来自动物或人 的血液中的红细胞的图像。所述方法可以包括使用这些图像来计算颗粒特性，例如，红细胞 的面积、直径以及体积、在红细胞内的血红蛋白的浓度。可以通过激发连接至在网状细胞内 的网硬蛋白的核酸结合荧光团，来在所有红细胞之中确定网状细胞。所述方法可以包括识 别具有荧光发射的那些红细胞。
[0061 ]所述方法可以包括通过荧光团处理动物或人的体液的白细胞。所述方法可以包括 (例如)使用激发光源检测白细胞。可以在检测传感器上投射所述发射光，以形成荧光白细 胞的数字表示。所述方法可以包括使用核酸结合的荧光团，来检测动物或人的体液的白细 胞。可以从吖啶酯、噻唑橙以及溴化乙啶的组中选择所述核酸结合的荧光团。
[0062] 所述方法可以包括计算所述荧光发射实体的直径、浓度以及与所述二维荧光图像 对应的物体的体积。所述方法可以包括使用一个或多个特性，例如，所述荧光发射实体的直 径、浓度和/或所述物体的体积，来帮助将白细胞分成淋巴细胞、粒细胞以及单核细胞。
[0063] 所述方法可以包括使用两个或多个荧光激发源或者两个或多个荧光发射检测波 长来检测不同的发荧光种类，以便可以检测在白细胞内的不同实体。所述方法可以包括使 用荧光的强度和量来进一步将白细胞的子集分类。
[0064] 所述方法可以包括使用从300nm到SOOnm的可见光，所述可见光通过与所述传感器 成60到90°垂直的角度照亮粒细胞，例如，以便在白细胞内的细胞质颗粒激烈地散射光，而 没有颗粒的细胞质不散射光或者散射具有非常低的强度的光。
[0065]在该方法中，可以首先使用荧光(第一图像)来确定人类或动物体液的白细胞，然 后，将淋巴细胞和单核细胞确定为具有可以忽略的散射光的图像(第二图像）。
[0066]所述方法可以包括使用1到50个兆像素图像传感器，例如，CMOS或C⑶传感器。
[0067] 可以通过电子开关导通和断开所述电磁源，电子开关提供利用2-10个不同的电磁 源依次询问相同视野的能力，这仅仅由电磁源的空间的约束条件以及用于成像所述视野的 时间的约束条件限制。
[0068] 所述方法可以包括具有一次性或者可再用的观察室，其包含感兴趣的颗粒的液体 分散并且允许计算在统计上的大量(significant number)颗粒。所述观看或样品室可以具 有在50微米与IOmm之间的厚度。
[0069] 所述方法可以包括将物镜放在所述检测CMOS或CCD传感器之间，所述物镜提供充 分的放大倍数，以确定物体尺寸，且也具有充分的视野，以允许在统计上大量计算在所述视 野内的物体。所述物镜可以具有在2X与15X之间的放大倍数。
[0070] 所述方法可以包括使用用于识别红细胞的红细胞俗特谱带以及用于检测白细胞 的核酸结合荧光团的荧光来检测在体液内的红细胞和白细胞，而没有分离和/或溶解红细 胞。
[0071] 所述方法可以使用球形化试剂，例如但不限于N-十二烷基-N，N_二甲基-3-铵基_ 1-丙磺酸钠，来将红细胞从双凹圆盘转换成均匀的球体。所述球形化试剂不影响白细胞的 形态或散射特性。
[0072] 所述方法可以使用保持红细胞的自然双凹圆盘形状的试剂。
[0073] 所述方法可以包括在30秒到10分钟内选择性溶解红细胞，而不影响白细胞的形态 或光散射特性。
[0074]所述方法可以将氯化铵pH 8.0(例如，0.1 M氯化铵)用作具有或没有球形化试剂的 红细胞溶解试剂。
[0075] 所述显微镜测量设备用于检测在体液内的颗粒或高或低分子量化学实体。体液可 以包括但不限于血液、尿液、脊髓液、唾液、腹膜液以及肺灌洗，并且提供使用单个测量设备 的完整范围（complete range，全套)体外诊断测试。
[0076] 所述显微镜测量设备可以被配置为执行血液学、尿液分析、化学过程、免疫测定 和/或凝结的体外诊断测试中的一个或多个。
[0077]所述显微镜测量设备可以包括滤光器组件，其包括第一滤光器、第一反射镜以及 第一分束器中的至少一个，所述第一滤光器被配置为修改辐射、发射或散射辐射的光特性， 所述第一反射镜和/或所述第一分束器被配置为引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电 磁辐射。
[0078]所述光学组件可以被配置为将所述物镜的光从垂直平面重新引导到水平平面，以 便相机的高度介于2cm与15cm之间。
[0079]所述显微镜测量设备可以包括放在所述显微镜镜台之下的光源，例如，灯圈。所述 光源可以被配置为用于正面落射光照明（front surface epi-illumination)。
[0080] 所述显微镜测量设备可以被配置为提供透过所述物镜的正面落射光照明。
[0081] 所述显微镜测量设备可以被配置为执行荧光显微镜检查。所述显微镜测量设备可 以被配置为执行透射显微镜检查。所述显微镜测量设备可以被配置为执行光散射显微镜检 查。
[0082] 所述显微镜测量设备可以包括多个电磁辐射源。所述显微镜测量设备可以被配置 为通过使用不同的电磁辐射源顺序地照明在所述显微镜镜台内的物体，来在同一组物体上 顺序地执行透射、光散射和/或荧光显微镜检查。
[0083] 所述显微镜测量设备可以被配置为提供介于与通过所述物镜的散射光路的路径 在0与60°垂直之间的照明，例如，通过第一电磁辐射源。
[0084]所述显微镜测量设备可以被配置为提供与通过所述物镜的散射光路的路径在60 至80°垂直之间的照明，例如，通过第一电磁辐射源和/或通过第二电磁辐射源。
[0085]所述显微镜测量设备可以包括设置在所述镜台与所述物镜之间的一个或多个LED (发光二极管）。所述显微镜测量设备可以被配置为通过透射光照明在所述显微镜镜台内的 样品。所述显微镜测量设备可以被配置为将荧光激发源的照明时间控制在20毫秒与10秒之 间，例如，以实现足够荧光发射强度，用于所述图像传感器利用荧光发射检测感兴趣的物 体。
[0086] 所述显微镜测量设备可以被配置为将放置成从与通过所述物镜的散射光路的路 径成0至80°垂直之间的LED的照明时间控制在20毫秒与10秒之间，例如，以实现充分的光散 射，以检测兴趣物体。
[0087] 所述测量设备可以被配置为使用感兴趣化学反应专有的发射的电磁辐射。
[0088] 所述测量设备可以被配置为使用安装在可移动镜台上的干化学测试条来执行化 学分析，通过计算提供一致读数的干反应垫的面积来确定所述检测的面积(area)。
[0089] 所述显微镜镜台可以是固定或可移动的，并且被配置为用于保持样品室放在所述 物镜前面，同时由所述电磁辐射源照明。所述显微镜镜台可以是可移动的，并且被配置为允 许在所述样品室内通过所述物镜观看1到10个观看区域。所述镜台可以手动或者在马达控 制下可移动。所述显微镜镜台可以被配置为将所述样品室在所述图像传感器的成像表面与 物体所在的表面之间保持固定的距离，例如，+/-10微米，例如，从而不需要在拍摄图像之前 聚焦。
[0090] 所述显微镜镜台可以包含固定参考区域，其允许所述显微镜测量设备调整所述电 磁辐射源的照明强度，验证用于帮助将在样品内的物体分类的强度的范围。固定参考区域 可以允许所述显微镜测量设备的放大和聚焦的质量控制，无需操作人员介入。
[0091] 所述样品室可以包括用于合并样品和试剂的腔室。所述样品室可以包括用于精确 地测量样品部分(例如，5-50uL的样品）和试剂部分(例如，50到500uL的试剂），然后，在将所 述样品引入所述样品室的观察区域内之前，合并和混合所述样品和所述试剂的装置。
[0092] 所述样品室可以具有包括两个相应的平面的第一壁和第二壁，所述第一和第二壁 的厚度介于100微米与4mm之间。选择所述壁的厚度和成分，以尽可能减少或减少从所述表 面中进入所述腔室内的光谱反射和/或光散射，否者会有助于背景散射。所述样品室可以具 有Imm乘以Imm到5mm乘以5mm的观看区域并且具有从100微米到20mm的高度。所述样品室可 以被配置为允许样品沉淀60秒到24小时，例如，以便沉淀的颗粒停在所述样品室的底部，并 且可以由所述显微镜测量设备观看、识别以及分类。
[0093] 所述样品室可以包括封闭物，用于在填充所述样品室之后，封闭所述样品室，例 如，以便在沉降时间期间减少蒸发或者不发生蒸发。
[0094] 本发明可以以系统来体现，该系统包括在图1、图2、图3、图4、图5以及图6中描绘的 并且在以下说明书中描述的一个或多个元件。
[0095]图1示出了辐射源1，其辐射包含颗粒或物体2的样品室3。显微镜设备12(图2)开启 辐射源1。辐射源1辐射样品室3,并且来自辐射源1的辐射被样品室3内的颗粒或物体2吸收。 所产生的辐射穿过样品室，并且落在位于样品室之下的二维CMOS或CCD传感器4上。CMOS或 CXD传感器可以是黑色和白色或者彩色。它必须对辐射源1敏感。为了说明的目的，在图1中 的辐射源1与样品室和传感器的平坦表面垂直，因此，说明透射的辐射。辐射源1不需要限于 透射的辐射。
[0096] 在显微镜设备(在图2中显示为12)的固件控制下，显微镜设备(在图2中显示为12) 捕捉透射的辐射的数字图像5。在这个说明中，在样品室3内的颗粒或物体2吸收来自辐射源 1的辐射，使得数字图像5在基本白色的背景上具有黑色物体6(阴影度取决于辐射的吸收 度）。数字图像5保存在位于显微镜设备上的固件存储器内，稍后，传输给计算机10(图2)，用 于进一步图像处理、结果计算以及报告给装置的用户。
[0097]在捕捉和保存第一图像5之后，显微镜设备12(图2)关闭辐射源1，并且在样品室3 依然在同一位置时打开辐射源7。辐射源7应当在不同的方面(波长、相对于样品的位置、辐 射源的准直程度或质量，例如偏振程度)与辐射源1不同。
[0098] 在所显示的说明中，辐射源7是引起辐射散射的源。如果辐射源7使的样品室3内的 物体或颗粒2将辐射散射给传感器4,那么散射的辐射投射在传感器4上，并且在数字图像8 内观察为在基本上黑色的背景上的白色区域9(白色阴影的强度取决于散射的辐射的强 度）。图1示出了一种情况，其中，在样品室内的物体之一吸收光并且在数字图像6上产生黑 点，但是不散射辐射，因此，不会将辐射散射至传感器并在数字图像8内产生白色区域。这个 颗粒在这个特性上与其他两个颗粒不同，并且根据这个差异，可以按不同的类别来精确地 分类。
[0099] 要理解的是，图1仅仅是本发明的一个可能的实施方式。第一辐射源1或第二辐射 源7可以从任何角度或位置包围样品室，仅仅由充分并且均匀地照明样品室的能力来限制。 具体而言，辐射源可以通过10° (与样品室的表面几乎平行)到与样品室的表面垂直的80°的 角度照明样品室以及室内的物体。在本发明的一个实施方式中，定位成以与平行于传感器 的观察室的表面的垂线介于20°与60°之间来照明观察室内的物体的660nm LED，促使在全 血中的粒细胞比单核细胞或淋巴细胞更强烈地散射光，允许将粒细胞明确分类成不同的颗 粒类型。
[0100] 辐射源1和2可以具有从IOOnm到2000nm的波长的范围。辐射源1和2可以准直到不 同的程度或者不准直，或者辐射的质量可以通过任何方式修改，例如，通过使光偏振。辐射 源可以激发保持在颗粒或者颗粒的某些部分内的荧光或磷光，该些颗粒发射在传感器4上 投射的辐射。本发明不限于可以依次打开和关闭来获得具有允许颗粒类型的识别和分类的 唯一性质的相应数字图像的辐射源的数量。
[0101] 本发明的一个特征是通过不同的辐射源依次辐射样品室以及在样品室内的物体， 并且处理相应的数字图像。可能的依次辐射源和相应图像的数量不受到在图1中的具体实 例限制。可能使用1到10个依次辐射，这仅仅受空间和成本的限制的约束。
[0102] 本发明的另一个特征是通过仅仅打开或关闭需要短持续时间来到达稳定的操作 条件，从而通过具有不同辐射特性(例如但不限于波长、偏振、准直、照明角度等）的不同辐 射源辐射样品室以及在样品室内的物体的能力。对于该装置实际的是，辐射源应该能够在1 毫秒到1000毫秒内到达稳定的操作条件。发光二极管是这种辐射源的一个具体实例，与需 要大量时间来到达稳定的操作条件的辐射源(例如，氙或钨灯)相比，这种辐射源提供了这 个优点。
[0103] 本发明的另一个重要特征是使用第一辐射源1来检测在观察室内的物体或颗粒， 并且使用第一数字图像5来确定物体的坐标、区域以及边界或边缘。第一辐射源1必须提供 物体2的足够对比度，以允许使用常用的图像处理工具，例如，从美国国立卫生研究院可获 得的免费软件的ImageJ软件。这种软件以及数字图像处理领域的技术人员已知的相当的商 用产品包含用于将数字图像(例如，5)转换成二进制图像的算法，该图像允许颗粒或者物体 检测、计数、求图像内的面积、直径、形状以及辐射强度。尺寸、强度或者形状阈值通常用于 识别和枚举数字图像内的满足储存在显微镜设备存储器内的预先定义的标准的颗粒和物 体。
[0104] 物体的来自辐射源7的辐射将产生数字图像，例如，用于限定在第二数字图像内的 每个物体的物体坐标的数字图像8。比较物体在数字图像5内的坐标和物体在第二数字图像 8内的坐标。使用嵌入显微镜设备固件的规则，不管坐标可以相隔多远，依然将物体视为相 同，图像处理软件使在第二数字图像8内的物体与在第一数字图像5内的物体匹配。如果具 有匹配，那么在数字图像8内的物体的辐射特性归因于在数字图像5内的具有匹配坐标的相 应物体。这种方法降低了辐射特性归因于干扰的风险（例如，在具有对数字图像5内的物体 施加的阈值限制之外的作用的同时，由对辐射源7具有不同作用的颗粒引起的非特定散射 或荧光或散射或荧光）。
[0105] 在使在两个不同的图像内的颗粒的坐标匹配之后，在数字图像5和8内的物体的边 界之外的辐射的强度可以平均化，并且从在物体的边界内的辐射的强度中减去作为背景， 以提供更精确的辐射强度估值。交替地，可以利用置信度选择围绕物体的边界的2到10个像 素边界层，并且用来对物体的辐射强度进行背景校正。
[0106] 本发明的另一个重要特征是在图2中的显微镜设备12控制样品室的辐射的持续时 间的能力。在投射辐射的情况下，根据辐射源的强度以及传感器的敏感度，传感器4、样品室 3以及在样品室2内的物体的曝光时间可以从1毫秒到200毫秒变化。对于从物体散射光或者 引起物体的荧光或磷光的辐射源，根据辐射源的强度以及传感器的敏感度，传感器4、样品 室3以及在样品室2内的物体的曝光时间可以从100晕秒到10秒变化。
[0107] 图2示出了系统的主要部件。应用软件驻留在计算装置10上，该计算装置可以是具 有通用串行总线(USB)端口或用于与显微镜设备12通信的蓝牙功能的任何装置。
[0108] 计算装置可以是台式个人电脑、移动电脑、平板电脑（例如，微型iPad或Samsung Galaxy)。在示图中通过无线通信11的符号显示了在计算机10与显微镜设备12之间的蓝牙 通信。在图3中 更详细地描述显微镜设备的各部件。收集体液样品，这些体液样品与一个或 多个试剂14结合，并且传输给样品室13,样品室插入显微镜设备12内，用于辐射和图像获 取。
[0109] 图3是示出部件放在显微镜设备内的方式的本发明的一个示例性实施方式的示意 图。在这个图中表示部件的其他布置或者附加其他部件至这些表示的部件，没有背离本发 明的范围。
[0110] 如果在这个说明中，与样品室16的平面垂直地并且与传感器26的平面平行地引导 辐射，那么放在样品室16之上的辐射源15(也在图4中更详细地显示)提供光束的透射显微 镜的辐射。辐射源15还可以是灯阵列，其也能够通过与样品室16垂直的平面的0°到90°的角 度辐射样品室16。这个离轴辐射可以通过在样品室16内的颗粒造成辐射源15的辐射的前向 散射。
[0111] 样品室16由显微镜镜台17保持在原位。显微镜镜台17和样品室16的平面是水平 的。显微镜镜台17可被固定。显微镜镜台17还可以手动或者在马达控制下移动，将样品室16 的各部分定位以进行辐射和显微镜成像。
[0112] 在镜台之下是辐射源18的子镜台阵列。这个辐射阵列的一个构造是发射具有不同 波长的光的LED灯的环。这个阵列辐射样品室16的底面以及沉淀到样品室16的底面的颗粒。 在本发明的一些实施方式中，这个阵列18可以为样品室16内的颗粒几乎以直角提供LED照 明，但是可以提供与样品室16的底部平面构成10°到约80°的辐射。在一个实施方式中，这个 阵列（1)为样品室16的颗粒提供660nm LED照明，造成光的散射由物镜19收集的并且投射在 传感器26上，以及（2)在以下序列中，通过450nm到500nm的LED灯，照明在样品室内的物体， 激发在颗粒内的荧光团，促使荧光团发射更长波长650nm的荧光，发射的光由显微镜物镜19 收集并且投射在传感器26上。
[0113]显微镜物镜19放在样品室16、显微镜镜台17以及辐射源18的子镜台阵列之下。显 微镜物镜19与显微镜镜台17、样品室16以及辐射源18的子镜台阵列的平面垂直地定位。物 镜可以是5X到20X的物镜。物镜被选定为在样品室16的单个视野内查看最大数量的颗粒，而 不牺牲分辨率或者精确地确定颗粒的辐射特性的能力。定位使得在CMOS或CCD传感器26上 将在样品室内的颗粒放大5倍的IOx物镜是很多这种实施方式的明智选择。对于本发明的一 个实施方式，使用尼康的1(^物镜(]?此001020?1?1311八(31^〇1(^嫩0.2510 10.5111111)。由 于IOx物镜19通过5.1倍的放大因数将颗粒投射在传感器上，所以能够具有大约10到50微米 的景深，使得如果样品室牢固地保持在原位，那么不需要调焦该装置。
[0114]本领域的技术人员已知将物镜19放在显微镜镜台17和样品室16之下，作为具有倒 置的显微镜镜台的显微镜。由于辐射源通常造成的背景干扰在本构造中尽可能减少，所以 这个构造对于本发明优选。在倒置的构造中，在辐射样品之前，辐射不必穿过无颗粒样品或 样品室16的多个表面。同样，在由物镜19收集之前，从物体中散射或发射的辐射不穿过无颗 粒溶液或者样品室16的多个表面。
[0115]在本发明的一个实施方式中，直角反射镜20将物镜19的光从垂直平面中引入水平 平面内，穿过滤光器27进入传感器26。该反射镜的目的是使显微镜设备的总高度小于2至3 英寸，以便可以容易地停留在平坦的台面上。也可以按照以下作出本发明，即没有直角反射 镜20，滤光器27和传感器26直接放在物镜19之下。
[0116]除了所显示的部件以外的部件的可替代的布置是使用分束器代替直角反射镜20， 该分束器将位于垂直平面内的物镜的光重新引导至位于水平平面内的传感器26上。在这个 布置中，还能够将辐射源放在分束器之下，并且来自该源的辐射透过物镜19照射在样品室 16内的颗粒上。这个布置具有以下优点：将光聚焦在颗粒上，且在位于颗粒之上的流体上具 有更少的光，尽可能增大在颗粒上的辐射，并且尽可能减少在周围流体内的潜在干扰材料 上的辐射。在使用透过物镜引导的辐射源引起荧光激发时，这个构造是有用的。在这个构造 中，能够在辐射源与分束器之间增加滤光器，或者必要时，进一步调节辐射。
[0117]图3描绘了放在直角反射镜20(或分束器)与传感器26之间的福射滤光器27。福射 滤光器27的目的是阻止某些波长的辐射到达传感器26。
[0118]传感器26是二维阵列的像素。可以是小至在早期实施方式中使用的0.5兆像素，直 到20兆像素或以上的最大可购买的传感器。在成本约束内可能获得的最大传感器最佳。更 大的传感器提供更好的分辨率，或者在具有与更小的传感器相同的分辨率时，允许查看样 品的更大区域。传感器可以是彩色传感器或黑白传感器。由于对辐射源的波长的选择，提供 颜色信息并且能够通过更加可控的方式这样做，所以黑白传感器是大部分应用的优选实施 方式。此外，由于所有像素可用于通过规定的波长成像，所以使用黑白传感器，提供更好的 分辨率。
[0119]在图3中的显微镜设备可以使用蓝牙卡25或蓝牙适配器与计算机10(图2)无线通 信。显微镜设备还可以使用通用串行总线(USB)24与计算机10通信和/或从计算机10中接收 电力。显微镜设备还可以由电池23供电。计算机可以可选地嵌入测量装置内。
[0120]显微镜设备具有至少一个印刷电路板，其具有存储器23,用于储存从传感器25中 捕捉的图像以及用于控制辐射源、通信、功率和传感器以及任何其他可选的电动装置所需 要的信息和固件应用程序。印刷电路板还包含微处理器22,其操作控制辐射源、通信、功率 和传感器以及任何其他可选的电动装置的显微镜设备特有的固件应用程序。
[0121] 图4是样品室的一个实施方式。图4的上部示意图是样品室的侧视图。底部示意图 是样品室的顶视图。样品室可以是一次性或可再次使用。
[0122] 样品室具有通过垫圈32隔开的上部光学表面30和下部光学表面32,以形成包含液 体样品的空心样品阱29。通过入口28将样品引入样品室内，空气通过出口31逸出。
[0123] 上部光学表面30和下部光学表面33可以由光学级丙烯酸、玻璃或具有相当的光学 质量的任何材料构成。两片表面都应当是平坦的，且表面理想地应当从一端或边到另一端 或边不应改变大于+/-5微米，这是因为由于面对包含样品的腔室26的表面将确定样品室的 容积，并且从而影响颗粒或可溶性化学实体的浓度的任何计算。还重要的是，满足这些容 差，以便位于包含样品的空心阱26的底部上的所有颗粒在物镜的焦平面内。
[0124] 根据应用，垫圈32将上部光学表面30和下部光学表面33分开50微米到10mm。垫圈 可以是单独材料(例如，双面胶带)或者可以是上部光学表面30或下部光学表面33的模制特 征。垫圈32、上部光学表面30以及下部光学表面33粘结在一起，以便流体不不从样品阱29中 泄露。在任一种情况下，垫圈都应具有恒定的厚度，优选地确保样品阱的高度具有+/-5微米 或某个容差，确保可靠的容积测定适合于规定的应用。
[0125] 图5是在计算机10上的软件应用程序（在图5的左边的"用户界面计算机应用程 序"）以及在显微镜设备12上的固件应用程序(在图5的右边的"显微镜设备固件"）的一个可 能的实施方式。箭头表示在处理样品中将在计算机10与显微镜设备12之间发生的通信。
[0126] 用户界面计算机应用程序包括步骤52:
[0127] ?操作人员选择开始处理样品的选项；
[0128] ?开始从计算机中向显微镜发送处理信号；
[0129] ?该信号包括关于要处理的样品的类型的信息。
[0130]显微镜设备固件继续进入步骤54:
[0131] ?打开电源；
[0132] ?调整暗电流；
[0133] ?调整LED强度；
[0134] ?准备对计算机的信号进行处理；
[0135] ?储存在显微镜内的样品特定信息用于确定类型和持续时间或辐射。
[0136] 用户界面计算机应用继续进入步骤56:
[0137] ?提不用户插入样品室；
[0138] ?用户确认插入样品室并且将信号发送给显微镜，以启动定时器。
[0139] 显微镜设备固件继续进入步骤58:
[0140] ?启动定时器，并且在经过预定的时间之后开始处理；
[0141] ?根据需要激活可选的马达或栗。
[0142] 显微镜设备固件继续进入步骤60:
[0143] ?样品室由适合于样品的每个电磁福射依次福射；
[0144] ?在通过用于产生图像的辐射类型确定的每个辐射之后，捕捉数字图像；
[0145] ?将图像传输给计算机，用于图像处理。
[0146] 用户界面计算机应用继续进入步骤62:
[0147] ?应用程序进行图像处理，以确定在视野内和/或在整个视野内的颗粒的身份、数 量、尺寸以及辐射强度；
[0148] ?应用程序进行计算，以确定浓度；
[0149] ?将结果储存在存储器内并且向用户显示，以供审查；
[0150] ?通过互联网将结果可选地传输给远程站点。
[0151] 图6描述了在本发明的一个实施方式中操作人员可能采取的步骤，以将体液样品 引入显微镜设备12内。这个实例示出了用于确定网状细胞的全血样品。为了获得全血，操作 人员首先使用柳叶刀刺破手指并且使用精确的移液装置来测量5到50uL的全血，放入具有 500uL到5000uL的试剂的容器内，并且通过将容器颠倒3次或更多次或者通过轻轻地吸入和 分散混合物3次或更多次，来使全血和试剂混合。操作人员将混合物传输到样品室内，并且 将样品室插入显微镜装置内。
[0152] 图7表示基于发明的免疫测定应用。在这个实例中，包含大分子37的体液与包含由 附接至颗粒38的白色新月形表示的抗体的试剂混合。连接至大颗粒的抗体可以沉淀在水溶 液内，但是可分散在水溶液内。连接至大颗粒的抗体与在大分子37上的第一站点结合。试剂 还包含第二抗体，其由具有星形39的阴影半新月形表示。星形表示标记。在这个实例中，标 记是在使用促使标记发荧光的波长光照亮时与发荧光的抗体共价结合的分子。
[0153] 如图7中所述，在试剂与体液混合并且放入样品室内时，大分子37与连接至颗粒38 的抗体结合，并且具有荧光标记39的第二抗体与大分子37结合，所述大分子与连接至颗粒 38的抗体结合，以形成颗粒-抗体-大分子-标记的抗体的复合体。这些复合体沉淀到样品室 的底部并且进入在图像传感器44上放大颗粒复合体的物镜43及其焦平面内。样品室由光学 透明的材料制成，该材料透射适当频率的光。
[0154] 在样品室底部上的颗粒由激发连接至颗粒的荧光标记的波长的光照明。在样品的 底面之间的一圈LED 42照亮样品室的底面和颗粒结合的标记。理想地，这些LED应通过非常 低的角度照亮颗粒，以便在激发样品时，非结合的（即，未反应的）标记的抗体39可能发荧 光。
[0155] 在这种类型的免疫测定方案中，与颗粒结合的标记的量随着在样品内的大分子37 的量的增大而增大。标准的曲线可以构造成表示观察的标记强度与分子浓度之间的关系。
[0156] 通常，这种类型的免疫测定需要与连接至颗粒38的抗体结合的大分子37的未结合 标记39和颗粒结合的标记40分离，以使化验精确。
[0157] 在图7的免疫测定方案中，在颗粒结合的标记沉淀到腔室的底部时，发生分离。如 在本发明中所公开的，通过在显微镜检测器的焦平面内使颗粒成像，仅仅检测在样品室的 限制区域内的标记。通过增大样品室的高度，分离程度可以增大，并且背景荧光减小。
[0158] 此外，没有标记的颗粒沉淀到样品室的底部，但是不完全覆盖腔室。在颗粒与灯之 间具有空间，光可以渗入溶液内并且激发非颗粒结合的标记。荧光引起非特定的背景荧光， 退化化验的敏感度。
[0159] 通过首先使用第一光源(例如，造成散射的光源)识别在焦平面内的颗粒，使用这 个第一照明来确定颗粒边界，然后，确定由第二荧光激发光源从每个颗粒边界内发射的荧 光强度，可以部分消除未结合至颗粒的标记的这个非特定的背景荧光。进一步，位于颗粒边 界外面的荧光信号可以用于确定可以从颗粒结合的荧光中减去的非特定荧光，以提高化验 的精度。
[0160] -种相似的方法可以用于竞争性免疫测定，除了小分子特有的颗粒结合抗体竞争 标记的小分子以外。沉淀到样品室的底部的颗粒结合标记的量与在样品内的小分子浓度相 关。
[0161] 以上描述和图7应不将本发明的范围限于仅仅免疫测定。在图7中连接至颗粒38的 白色新月形可以是结合至生物或化学起因的可溶性化学实体的生物或化学成因的任何分 子。例如，可以是结合至甲状腺激素的激素受体。可以是结合至可溶性核酸的核酸。可以是 结合至可溶性生物素的分子状抗生物素蛋白。还可以是结合可溶性化学或生物实体的合成 嵌合实体。
[0162] 通过这种方式，在图7中具有标记39的新月形结合伴侣可以是标记的抗体，但是也 可以是标记的激素受体、核酸或可以标记并且结合至在溶液内的可溶性实体的任何生物或 化学实体。
[0163] 免疫测定是可以通过本发明检测的可溶性化学实体(包括生物或化学起因）的检 测的一个实例。由于这些免疫测定基于检测与颗粒结合的特定辐射信号的概念，所以以下 示例性实施方式也显示了免疫测定运行的方式。
[0164] 实例 1
[0165] 本发明的一个实施方式用于确定在全血内的网状细胞。
[0166] 5uL手指采血的全血与5000uL试剂相结合。试剂包含63ug/mL(0.19mM)月桂酰胺丙 基甜菜碱（lauramidopropyIbetaine)、20mM碳酸氢钠、5mM EDTA四钠脱水以及96mM氯化钠。 将最终的pH调整为8.1;必要时，最终的渗压强度是272m0sm，且具有NaCl或水。这个试剂通 过0.2微米的过滤器过滤并且储存在室温中长达2个月，使细胞呈球形的能力没有明显的退 化或损失。
[0167] 显微镜设备包含在图3中描述的元件，除了是竖立(而非颠倒）的显微镜以外。物镜 19是来自Nikon Instruments的IOX物镜（CFI LU Plan Fluor BD 10X)。对于透射显微镜， 辐射源15是尼康卤素灯，410nm滤光器放在照明路径内。将样品辐射80毫秒，并且将位(bit) 设置为235。
[0168] 对于焚光，使用尼康萊灯（Nikon Instruments ,X-Cite 120X1 Fluor System)将 样品照明2000毫秒。这可以使用Phillips Rebel Lumiled(Blue(470nm)Luxeon Rebel [email protected])LED代替。将这些光源放在图3中的直角反射镜20之下。这个照明方案代替 在图3中的子镜台辐射源18。
[0169] 使用FITC滤光器立方体（Semrock Corporation,FITC-3540B)代替在图3中的直角 反射镜30。这个滤光器立方体包含分束器，该分束器使荧光照明源的光穿过滤光器，该滤光 器仅仅允许窄带蓝光穿过物镜19,进入样品室16内。Semrock滤光器立方体还包含用作与在 图3中的辐射滤光器27相同的目的的滤光器。
[0170] 在图3中的传感器26是5MP CMOS相机以及图像捕捉软件(Pixelink Corporation, Ottawa，Canada)。在IOX物镜与照相机之间的0 · 5X中继透镜（Edmund Optics ,NT58-376 0.5X视频显微镜耦合器)在照相机的传感器上提供了5. IX的总体放大。通过优化在物镜与 传感器之间的距离，可以在这个系统的最终版本中去除中继透镜。
[0171] 将稀释样品引入商用显微镜样品室（来自德国ibidi.com Ibidi的产品编号 81121)内，其设计与在图4中描述的相似。腔室具有100微米高、5 mm宽以及50mm长（容积 25uL)〇
[0172] 这个构造在用于正面本发明的原理，这是因为该构造可以与易于商用的部件快速 组装。确实需要去除等同于在图30中的辐射滤光器27的滤光器，以通过透射光照明样品。如 图3中所示，在最终的原型中，不需要这个人工干预。
[0173]为每个样品捕捉410nm波长透射图像和焚光图像。使用来自National Institute of Health的ImageJ开源软件（ImageJ)处理图像。编写特殊的插件程序（用于ImageJ的 Reticulocyte Plugin)，其（1)根据用户定义的尺寸和强度阈值，计算在透射或焚光图像中 观察的颗粒的数量，（2)为每个颗粒透射颗粒，计算MCH和MCV，并且(3)将网状细胞确定为用 户定义的强度和尺寸的荧光颗粒。确定每个透射和荧光颗粒的坐标，并且用于识别与发荧 光的颗粒对应的在透射图像内的红细胞。
[0174]图8概述了由图像软件使用的步骤的一个实例，在此处是ImageJ插入程序，以识别 网状细胞和红细胞并且将其分类。对于本应用，将颗粒阈值设定为20像素的颗粒的最小直 径以及80像素的最大直径。要"匹配"的在荧光和透射图像内的物体需要相隔不超过70像 素。在荧光图像内的物体的强度阈值具有40的最小强度阈值以及255的最大阈值。
[0175] 处理102第一(透射）图像，然后，处理104第二（荧光）图像。随后，在第一和第二图 像内的颗粒被匹配106,并且总结108网状细胞的结果。
[0176] 处理102第一图像，包括一个或多个步骤：
[0177] 1、使整个图像的背景强度均匀；
[0178] 2、减去背景并且将背景设置为255;
[0179] 3、使用标准的Image J函数使图像二值化；
[0180] 4、将ImageJ水分界线用于分离可以接触的颗粒；
[0181] 5、在水分界线之后确定颗粒数量，并且校正颗粒；
[0182] 6、如果水分界线仅仅提高颗粒数量〈5%，那么报告校正的颗粒数量;如果>5%，那 么稀释样品并且重复；
[0183] 7、基于在最终产品的开发期间确定的强度和尺寸的限制，使用ImageJ确定颗粒数 量、颗粒坐标、直径以及平均强度；以及
[0184] 8、保存在透射图像中所有颗粒的结果。
[0185] 处理104(荧光)第二图像，包括一个或多个步骤：
[0186] 1、使整个图像的背景强度均匀；
[0187] 2、减去背景；
[0188] 3、将白色电平设置为255;
[0189] 4、使用标准的Image J函数使图像二值化；
[0190] 5、将ImageJ水分界线用于分离可以接触的颗粒；
[0191] 6、在水分界线之后确定颗粒数量，并且校正颗粒；
[0192] 7、如果在水分界线之后，颗粒数量增大〈5%，那么考虑该数量精确；如果>5%，那 么必须稀释样品并且重新运行；
[0193] 8、基于强度和尺寸的限制，使用ImageJ确定颗粒数量、坐标、直径以及平均强度； 以及
[0194] 9、保存在荧光图像中所有颗粒的结果。
[0195] 匹配106在第一和第二图像内的颗粒包括一个或多个步骤：
[0196] 1、比较在透射和荧光图像内的颗粒的坐标；
[0197] 2、如果在透射和荧光图像内的颗粒的坐标小于可接受的在开发期间确定的数量， 那么在透射图像内的颗粒分类为网状细胞;以及
[0198] 3、记录在透射和荧光图像内匹配的颗粒之间的距离。
[0199] 总结108网状细胞的结果（即，对于具有高于预定尺寸和强度的相应荧光图像的透 射颗粒)包括一个或多个步骤：
[0200] 1、透射强度；
[0201] 2、每个颗粒的像素的平均数量；
[0202] 3、平均颗粒直径；
[0203] 4、计算的红细胞体积;和/或
[0204] 5、计算的血红蛋白浓度。
[0205]表1示出了本发明的精确数据或特征。
[0208]表2示出了本发明与Sysmex血液分析仪的方法比较。
[0209]表2:
[0211]其中：
[0212] RBC浓度：红细胞/uL
[0213] MCH:平均红细胞血红蛋白含量pg
[0214] MCV:平均(红细胞的）红细胞容积fL
[0215] MCHr:网状细胞的平均红细胞血红蛋白含量pg JCHr主要是光散射具有某种贡献 的光学密度的测度，并且可以具有细胞体积的小贡献。
[0216] CHr:网状细胞血红蛋白含量。Bayer使用Advia 120网状细胞血红蛋白含量的这个 缩写词。这应大略等同于MCHr。CHr是光散射测量。
[0217] RET HE:网状细胞血红蛋白。Sysmex使用网状细胞血红蛋白含量的Sysmex XE-2100确定的这个缩写词。RET HE应大略等同于MCHr和CHrAET HE是前向光散射的测度。细 胞体积和血红蛋白含量影响这个值。细胞体积的影响通过这个参数更明显。
[0218] 实例2
[0219] 本发明的第二实施方式用于确定在全血内的粒细胞。
[0220] 在这个实施方式中，使用包含样品室的特殊储存匣，自动进行在图6中概述的很多 手动样品和试剂操作人员步骤。在EDTA真空采血管内收集全血，并且插入这个储存匣内。在 储存匣内的流体回路将全血从真空采血管中自动移动到精确地分割IOOuL的全血的回路 内。该装置将具有IOmL试剂的包含全血的区段冲入混合室内。
[0221 ] 试剂包含535mgm的氯化铵、84mgm的碳酸氢钠、38mgm的EDTA、IOmgm的叠氮化钠、 Imgm的吖啶橙以及IOOmL的蒸馏水。叮啶橙是核酸结合燃料，其仅仅在细胞核内或者在细胞 质内与核酸结合时发光。还可以在细胞核内结合至一些复合糖。这个试剂溶解红细胞，允许 更容易检测白细胞。保留了正确地检测、分类以及枚举白细胞所需要的白细胞的大部分形 ??τ O
[0222] 使用通过连接至位于储存匣之下的马达的磁铁旋转的1/8英寸直径的不锈钢滚珠 轴承，混合试剂全血混合物。在混合试剂之后，全血混合物在储存匣以及收集的光学图像内 自动传送给样品室。使用空气压力，推动流体通过通道。本发明可以可选地包括进入样品室 内的这些步骤。
[0223] 显微镜设备包含在图3中描述的元件。这个早期原型是颠倒的显微镜。透镜19是来 自Nikon Instruments的IOX物镜（CFI LU Plan Fluor BD 10Χ)。对于透射显微镜，福射源 15是具有大约640和680nm的峰值发射波长的红色LED。
[0224] 对于荧光，使用一圈红蓝交替的LED照明样品。该配置对于在图3中的子镜台辐射 源18相同。蓝色LED具有在450nm与500nm之间的峰值波长发射，并且红色LED具有在640与 680nm之间的峰值发射。在这圈内具有6个蓝色和6个红色LED。将其定位成通过位于样品室 16的水平平面之下的10°与45°之间的角度照明在图5中的样品室16。通过这种方式定位LED 的目的是将照明源放置成与物镜的轴尽可能接近90°。在这个位置中，接近直角散射的光可 以由物镜捕捉。粒细胞通过直角密集地散射光，而单核细胞和淋巴细胞不通过直角散射光， 因此，直角散射光可以用于将粒细胞分类。
[0225] 装置具有直角反射镜20,与在图3中一样。
[0226] 在图3中的传感器26是0.5MP CXD照相机。见照相机放置成与物镜相距某个距离， 以在传感器上实现物体的5X到IOX的放大。
[0227] 图像捕捉软件是专用的，但是执行与ImageJ软件的步骤相似的图像处理步骤，在 图8中描述的这个匹配的透射和荧光图像内具有插件。然而，在这种情况下，第一数字图像 是荧光图像，并且第二数字图像是直角散射光的图像。
[0228] 在使用这种方法的15个样品中在粒细胞计数的方法比较中，这种方法具有0.86的 相关系数，并且由用于医院实验室内的库尔特计数器产生。回归线的斜率是0.98,并且回归 线的截距是0.0。
[0229] 还公开了根据任何以下实施方式的方法和设备：
[0230] 实施方式1. 一种将在视野内的二维物体分类的显微镜方法，具有以下步骤：
[0231] a)通过第一电磁辐射源，照射在视野内的物体；
[0232] b)在CMOS或C⑶传感器上投射所产生的图像，
[0233] c)使用在视野内的物体的所产生的数字表示来识别颗粒作为在数字表示内的物 体，例如，使用图像软件，例如，Image J软件，
[0234] d)使用每个物体的边缘的坐标来限定包含在所述物体的数字表示内的限制每个 物体的区域的区域，
[0235] e)确定每个物体的数字表示的面积、直径以及平均强度，
[0236] f)通过从所述物体的数字表示的边界中减去一个像素来可选地分离接触的颗粒， 以便可以识别、枚举并且适当地分类接触的颗粒；
[0237] g)使用所述边缘坐标来限定与物体的边缘相邻但是位于所述物体外面的区域，以 计算所述电磁辐射的背景强度，并且从包含在每个物体的数字表述的边缘内的物体的电磁 强度中减去这个平均背景强度；
[0238] h)使用在所述物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收 光的物体内的化学实体的浓度；
[0239] i)根据进一步将第一组物体分成子集的需要，根据提供关于在所述物体内的数字 表示的预定边界内的物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁辐射源顺序询问相 同的第一物体，以及
[0240] j)通过η个额外的第一电磁辐射源询问相同的视野，每个电磁源通过基于所述物 体的电磁特性来唯一地区分在所述视野内的物体的某种电磁特性区分开;然后，利用尽可 能多的额外电磁辐射源暴露所述物体，以再细分包含在由第一辐射源识别的边界内的物 体。
[0241] 实施方式2.根据实施方式1所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射是具有从 IOOnm到2000nm的波长的光，所述光包括紫外线、可见以及红外线光谱的部分。
[0242] 实施方式3.根据实施方式1-2中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射是 从IOOnm到1000 nm的光，所述光促使荧光激发天然存在的荧光团或认为导入的荧光团，由所 述激发的荧光团发射的光用于产生帮助将相应的物体分类的图像。
[0243] 实施方式4.根据实施方式1-3中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射是 由在所述物体内的化学实体吸收的从IOOnm到2000nm的光，以便包含所述吸收实体的相应 图像具有更低强度的检测的电磁辐射。
[0244] 实施方式5.根据实施方式1-4中任一项所述的方法，所述方法使用通过不同的角 度与所述样品相贯穿的电磁源，来造成在所述视野内的物体具有不同强度的电磁辐射散 射。
[0245] 实施方式6.根据实施方式1-5中任一项所述的方法，所述方法使用通过与所述检 测的传感器区域〇到80度垂直地贯穿在所述视野内的物体的电磁辐射，以便所述显微镜的 物镜捕捉通过不同的角度散射的光。
[0246] 实施方式7.根据实施方式1-6中任一项所述的方法，所述方法使用具有不同的偏 振特性的电磁源。
[0247] 实施方式8.根据实施方式1-7中任一项所述的方法，所述方法使用引起天然存在 的磷光体或人工导入的磷光体的磷光的电磁源。
[0248] 实施方式9.根据实施方式1-8中任一项所述的方法，所述方法使用透射的光源从 血红蛋白的俗特谱带创建来自动物或人的血液中的红细胞的图像，并且使用这些图像来计 算红细胞的面积、直径以及容积、在红细胞内的血红蛋白的浓度，并且其中，通过激发连接 至在网状细胞内的网硬蛋白的核酸结合荧光团，在所有红细胞之中确定网状细胞，并且识 别具有荧光发射的那些红细胞。
[0249] 实施方式10.根据实施方式1-9中任一项所述的方法，其中，使用激发光源检测通 过荧光团处理的动物或人的血液中的白细胞，并且在检测传感器上投射所述发射光，以形 成荧光白细胞的数字表示。
[0250] 实施方式11.根据实施方式10所述的方法，其中，动物或人的血液的白细胞的检测 使用核酸结合的荧光团。
[0251] 实施方式12.根据实施方式11所述的方法，其中，所述核酸结合的荧光团例如但不 限于吖啶酯、或噻唑橙、或溴化乙啶。
[0252] 实施方式13.根据实施方式10-12中任一项所述的方法，其中，计算所述荧光发射 实体的直径、浓度以及与所述二维荧光图像对应的物体的容积，并且用于帮助将白细胞分 成淋巴细胞、粒细胞以及单核细胞。
[0253] 实施方式14.根据实施方式10-13中任一项所述的方法，其中，两个或多个荧光激 发源或者两个或多个荧光发射检测波长用于检测不同的荧光种类，以便可以检测在白细胞 内的不同实体，并且荧光的强度和量用于进一步将白细胞的子集分类。
[0254] 实施方式15.根据实施方式1-14中任一项所述的方法，并且使用从300nm到800nm 的可见光，所述可见光通过与所述传感器从60到90°垂直的角度照亮粒细胞，以便在白细胞 内的细胞质颗粒激烈地散射光，而没有颗粒的细胞质不散射光或者散射具有非常低的强度 的光。
[0255] 实施方式16.在通过与所述传感器从60到90°垂直的角度利用300到800nm的光照 亮相同物体所再细分的这些图像之中分类粒细胞，粒细胞是具有强度的散射光的那些图 像。
[0256] 实施方式17.根据实施方式1-16中任一项所述的方法，其中，首先使用荧光来确定 人类或动物血液的白细胞，然后，将淋巴细胞和单核细胞确定为具有可以忽略的散射光的 图像。
[0257] 实施方式18.根据实施方式1-17中任一项所述的方法，并且使用1到50个兆像素 CMOS或CCD传感器。
[0258] 实施方式19.根据实施方式1-18中任一项所述的方法，其中，可以通过电子开关打 开和关闭所述电磁源，提供2-10个不同的电磁源依次询问相同视野的能力，这仅仅由电磁 源的空间的约束条件以及用于成像所述视野的时间的约束条件限制。
[0259]实施方式20.根据实施方式1-19中任一项所述的方法，并且具有一次性或者可再 用的观察室，其包含感兴趣颗粒的液体分散并且允许计算在统计上的大量颗粒。
[0260]实施方式21.根据实施方式20所述的方法，其中，所述观察室具有介于50微米与 IOmm之间的厚度。
[0261]实施方式22.根据实施方式18所述的方法，其中，将物镜放在所述检测CMOS或CCD 传感器之间，所述物镜提供足够的放大倍数，以确定物体尺寸，且还具有充分的视野，以允 许在统计上大量计算在所述视野内的物体。
[0262]实施方式23.根据实施方式22所述的方法，其中，所述物镜具有介于2X与15X之间 的放大倍数。
[0263]实施方式24.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，所述方法使用用于识别红 细胞的红细胞俗特谱带以及用于检测白细胞的核酸结合荧光团的荧光来检测在体液内的 红细胞和白细胞，而不分离或溶解红细胞。
[0264] 实施方式25.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，所述方法使用球形化试剂， 例如但不限于N-十二烷基-N，N_二甲基-3-铵基-1-丙磺酸钠，来将红细胞从双凹圆盘转换 成均匀的球体，并且不影响白细胞的形态或散射特性。
[0265] 实施方式26.根据实施方式25所述的方法，所述方法不使用成球形的试剂，而是使 用保持红细胞的自然双凹圆盘形状的试剂。
[0266] 实施方式27.根据实施方式1-23中任一项所述的方法，所述方法在30秒到10分钟 内选择性溶解红细 胞，而不影响白细胞的形态或光散射特性。
[0267] 实施方式28.根据实施方式26-27中任一项所述的方法，所述方法将0.1 M氯化铵pH 8.0用作具有或没有球形化试剂的红细胞溶解试剂。
[0268]实施方式29. -种显微镜测量设备，其包括CMOS传感器、物镜、用于修改照射、发射 或散射辐射的光特性的可选的滤光器、用于引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电磁辐 射的可选的反射镜或分束器、可以打开和关闭的电磁辐射装置，所述显微镜测量设备与单 独计算机有线或者无线通信，计算机包含在所述显微镜设备内从所述CMOS传感器中收集的 图像中识别物体并且将物体分类的成像软件，以及控制软件，用于操作显微镜。
[0269]实施方式30.根据实施方式29所述的测量设备，所述测量设备具有单独的电源或 者可连接至外部电源。
[0270]实施方式31.根据实施方式29-30中任一项所述的测量设备，并且所述显微镜测量 设备用于检测在体液内的颗粒或高或低分子量化学实体，包括但不限于血液、尿液、脊髓 液、唾液、腹膜液以及肺灌洗，并且提供使用单个检测测量设备的全套体外诊断测试。
[0271]实施方式32.根据实施方式29-31中任一项所述的测量设备，所述显微镜测量设备 执行血液学、尿液分析、化学、免疫测定和/或凝结的体外诊断测试。
[0272]实施方式33.根据实施方式29-32中任一项所述的测量设备，所述测量设备使用反 射镜和/或分束器，其被配置为将所述物镜的光从垂直平面中重新引导到水平平面中，以便 相机的高度介于2cm与15cm之间。
[0273]实施方式34.根据实施方式29-33中任一项所述的测量设备，其通过放在所述显微 镜镜台之下的灯圈或相似的照明装置提供正面落射光照明。
[0274] 实施方式35.根据实施方式29-34中任一项所述的测量设备，所述测量设备提供通 过所述物镜的正面落射光照明。
[0275] 实施方式36.根据实施方式29-35中任一项所述的测量设备，所述测量设备具有执 行荧光显微镜检查的能量。
[0276] 实施方式37.根据实施方式29-36中任一项所述的测量设备，所述测量设备可以执 行透射显微镜检查。
[0277] 实施方式38.根据实施方式29-37中任一项所述的测量设备，所述测量设备可以执 行光散射显微镜检查。
[0278]实施方式39.根据实施方式29-38中任一项所述的测量设备，所述测量设备可以通 过使用不同的照明源顺序地照明在所述视野内的物体，来在同一组物体上依次执行透射、 光散射和/或荧光显微镜检查。
[0279]实施方式40.根据实施方式39所述的显微镜测量设备，所述测量设备可以提供介 于与通过所述物镜的散射光路的路径0与60°垂直之间的照明。
[0280]实施方式41.根据实施方式39-40中任一项所述的测量设备，所述测量设备提供从 与通过所述物镜的散射光路的路径60与80°垂直之间的照明。
[0281]实施方式42.根据实施方式37所述的显微镜测量设备，所述测量设备使用一个或 多个LED通过透射光照明样品，所述样品放在所述LED与所述显微镜物镜之间。
[0282]实施方式43.根据实施方式37所述的显微镜测量设备，所述测量设备将荧光激发 源的照明时间控制在20毫秒与10秒之间，以实现充分荧光发射强度，用于CMOS传感器通过 荧光发射检测感兴趣的物体。
[0283]实施方式44.根据实施方式37所述的显微镜测量设备，所述测量设备将放置成介 于与通过所述物镜的散射光路的路径0与80°垂直之间的LED的照明时间控制在20毫秒与10 秒之间，以实现充分的光散射，以检测兴趣物体。
[0284]实施方式45.根据实施方式29-44中任一项所述的测量设备，所述测量设备具有用 于保持样品室放在所述物镜的前面同时由所述光源照明，所述镜台可以是固定或可移动 的。
[0285] 实施方式46.根据实施方式45所述的显微镜测量设备，其中，所述镜台允许在所述 样品室内通过所述物镜观看1到10个观看区域，所述镜台手动或者在马达控制下移动。
[0286] 实施方式47.根据实施方式45-46中任一项所述的测量设备，其中，所述镜台将所 述样品室保持在所述CMOS传感器的表面与物体所在的表面之间的固定距离(+/-10微米）， 从而不需要在拍摄图像之前聚焦。
[0287] 实施方式48.根据实施方式45-47中任一项所述的测量设备，其中，所述镜台包含 固定参考区域，其允许所述显微镜调整所述光源的照明强度，验证用于帮助将在样品内的 物体分类的强度的范围，并且允许所述显微镜的放大和聚焦的质量控制，无需操作人员介 入。
[0288]实施方式49.根据实施方式45-48中任一项所述的测量设备，其中，所述可移动镜 台中断（interrupt)所述测量设备用于在样品室内检测从一个视野到另一个视野的运动的 传感器，触发照明装置和CMOS传感器用于捕捉图像，以便不需要操作人员介入来捕捉多个 图像。
[0289]实施方式50.根据实施方式45-49中任一项所述的测量设备，其中，所述可移动镜 台包含传感器，所述传感器使用确定所述样品室引入所述显微镜内的时间的这个能力，来 在所述样品室内感测从一个视野到另一个视野的运动，然后，在将所述样品室引入所述测 量设备内之后，通过在10秒与10分钟之间的固定间隔，在所述样品室内从视野中捕捉图像。
[0290] 实施方式51. -种用于根据权利要求29所述的显微镜测量设备的样品室，所述样 品室包含保持在相隔5和50微米的两个平面之间保持的样品，并且包含介于5与IOOuL之间 的液体，所述腔室的形状允许使样品均匀地并且可再现地填充所述腔室，并且防止在完成 分析之前移动样品或者蒸发样品。
[0291] 实施方式52.根据实施方式51所述的样品室，所述样品室也具有用于合并样品和 试剂的腔室。
[0292] 实施方式53.根据实施方式51-52中任一项所述的样品室，所述样品室包括以下装 置，用于精确地测量5-50uL的样品和50到500uL的试剂，然后，在将所述样品引入所述样品 室的观察区域内之前，合并和混合所述样品和所述试剂。
[0293] 实施方式54.根据实施方式51-53中任一项所述的样品室，所述样品室具有两个平 面，所述平面的厚度介于100微米与4_之间，选择所述表面的厚度和成分，以尽可能减少从 所述表面中进入所述腔室内的光谱反射和光散射，否则会有助于背景散射。
[0294] 实施方式55.根据实施方式51-54中任一项所述的样品室，所述样品室具有Imm乘 以Imm到5mm乘以5mm的观看区域并且具有从100微米到20mm的高度。
[0295] 实施方式56.根据实施方式51-55中任一项所述的样品室，所述样品室被配置为允 许样品沉淀60秒到24小时，以便沉淀的颗粒停在所述腔室的底部，并且可以由根据实施方 式29-50中任一项所述的显微镜测量设备观看、识别以及分类。
[0296] 实施方式57.根据实施方式51-56中任一项所述的样品室，所述样品室具有一种装 置，用于在填充所述样品室之后，封闭所述样品室，以便在沉降时间期间不发生蒸发。
[0297] 实施方式58.-种使用显微镜测量设备进行免疫测定的方法，所述显微镜测量设 备包括CMOS传感器、物镜、用于修改照射、发射或散射辐射的光特性的可选的滤光器、用于 引导透射、散射的电磁福射以及发射的电磁福射的可选的反射镜或分束器、可以打开和关 闭的电磁辐射装置，并且具有与单独计算机有线或者无线通信，计算机包含在所述显微镜 设备内从所述CMOS传感器中收集的图像中识别物体并且将物体分类的成像软件的，以及控 制软件，用于操作显微镜，
[0298] a)使用连接至以介于每分钟0 . Imm与每分钟2mm之间的速率沉淀在水溶液中的分 散的固相颗粒的特异性抗体以及特异性地结合于全血中的分析物的颗粒上的抗体；
[0299] b)竞争性使用标记的分析物或者非竞争性地使用标记的覆盖抗体，检测连接至抗 体结合的固相的分析物，其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供 足够浓度的颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤，其中，沉淀颗粒的图像由第 一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的边界或边缘，以及
[0300] c)在暴露到第二电磁福射中之后，确定位于由第一电磁福射限定的边界内的电磁 辐射的强度；以及
[0301 ] d)在暴露到第二电磁福射中之后，确定位于由第一电磁福射限定的边界外的电磁 辐射的强度，并且从位于由第一电磁辐射限定的边界内的电磁辐射的强度中减去位于由第 一电磁辐射限定的边界外的电磁辐射的强度，有效地减去背景电磁辐射，据此，比较第二电 磁辐射的强度和标准曲线，以获得化验的分析物的浓度。
[0302]实施方式59.-种使用结合伴侣进行期望化学实体的化验的方法，用于连接至可 分散的固相物体的期望化学实体，所述显微镜测量设备包括图像传感器、物镜、用于修改辐 射、发射或散射辐射的光特性和/或用于引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电磁辐射的 可选的滤光器组件、能够导通和断开的至少一个电磁辐射源，并且所述显微镜测量设备被 配置为与单独的计算机有线或者无线地通信，所述计算机包含成像软件并且被配置为识别 并且分类从所述显微镜测量设备中的所述图像传感器收集的图像中的物体，并且控制用于 按照通过以下将视野内的二维物体分类的方法来操作显微镜的软件：
[0303] a)利用第一电磁辐射源来辐射所述视野内的物体，
[0304] b)将生成的图像投射到图像传感器上，
[0305] c)使用所述视野内的物体的生成的数字表示，来使用ImageJ软件识别颗粒作为所 述数字表示内的物体，
[0306] d)使用每个物体的边缘的坐标来限定在所述物体的所述数字表示内包含的围绕 每个物体的区域的区域，
[0307] e)确定每个物体的数字表示中的面积、直径和平均强度，
[0308] f)通过从所述物体的所述数字表示的边界中减去一个像素来分离接触的颗粒，使 得接触颗粒能够被识别、枚举和适当地分类，
[0309] g)使用所述边缘坐标来限定与物体的边缘相邻但是位于所述物体外面的区域，以 计算电磁源的背景强度，并且从每个物体的数字表示的边缘内包含的物体的电磁强度中减 去平均的该背景强度，
[0310] h)使用在物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收光的 物体内的化学实体的浓度，
[0311] i)根据将所述第一组物体进一步分类到子集的需要，根据提供关于所述物体的所 述数字表示的预定边界内的物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁源顺序地询 问相同的第一物体，以及
[0312] j)利用η个额外的第一电磁辐射源询问相同视野，每个电磁辐射源因以下而区分 开:基于物体的电磁特性来唯一地区分所述视野内的物体的一些电磁特性;然后，利用尽可 能多的额外电磁辐射源曝光物体，以细分包含在由第一电磁辐射源识别的边界内的物体，
[0313] k)使用连接至分散的固相的任何结合伴侣，来捕捉体液中的期望的化学实体，并 且竞争性地使用所述化学实体的第二标记的捕捉伴侣或者非竞争性地使用所述期望的化 学实体的标记的衍生物来检测所述期望的化学实体；
[0314] 1)其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供足够浓度的 颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤；
[0315] m)其中，沉淀颗粒的图像由第一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的 边界或边缘；
[0316] η)以及在暴露于第二电磁福射中之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的边界 内的电磁辐射的强度；以及
[0317] 〇)在暴露于第二电磁福射中之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的边界外的 电磁辐射的强度，并且从位于由所述第一电磁辐射限定的边界内的电磁辐射的强度中减去 位于由所述第一电磁辐射限定的边界外的电磁辐射的强度；以及
[0318] ρ)比较所述第二电磁辐射的强度和标准曲线，以推导化验的分析物的浓度。
[0319]实施方式60.根据实施方式59所述的方法，所述方法包括使用专用于感兴趣的比 色化学反应的有色产品的波长的透射LED光，打开或关闭所述LED以实现期望的辐射波长。 [0320]实施方式61.根据实施方式29-50中任一项所述的测量设备，其中，所述测量设备 被配置为使用专用于感兴趣化学反应的发射的电磁辐射。
[0321]实施方式62.根据实施方式29-50中任一项所述的测量设备，所述测量设备被配置 为使用安装在可移动镜台上的干化学测试条来执行化学分析，通过计算提供一致读数的干 反应垫的面积来确定所述检测的面积。
【主权项】
1. 一种分类视野内的作为二维物体的颗粒的显微镜方法，所述方法包括： a) 利用第一电磁辐射源照射所述视野； b) 将生成的图像投射到图像传感器上以获得所述视野的第一数字表示； c) 使用所述第一数字表示来识别所述第一数字表示内的第一物体； d) 使用所述第一物体的边缘的边缘坐标来限定在所述第一物体的所述第一数字表示 内包含的围绕所述第一物体的区域的区域； e) 确定所述第一物体的一个或多个物体特性； f) 通过从所述第一物体的所述第一数字表示的边界中减去一个或多个像素来分离接 触的颗粒； g) 使用所述边缘坐标来限定与第一物体的边缘相邻但是位于所述第一物体外面的区 域，以计算所述第一电磁辐射源的背景强度，并且从所述第一物体的电磁强度中减去平均 的该背景强度；以及 h) 使用在所述第一物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收 光的所述第一物体内的颗粒特性。2. 根据权利要求1所述的方法，所述方法包括:根据将所述第一物体进一步分类到第一 子集的需要，根据提供关于所述第一物体的所述第一数字表示的预定边界内的所述第一物 体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁辐射源顺序地询问所述第一物体。3. 根据权利要求1-2中任一项所述的方法，所述方法包括:利用第二电磁辐射源询问所 述视野以获得所述视野的第二数字表示，所述第二电磁辐射源通过以下与所述第一电磁辐 射源区分开:基于第二物体的电磁特性来唯一地区分所述视野内的所述第二物体的一些电 磁特性;然后，根据将所述第二物体进一步分类到第二子集的需要，根据提供关于所述第二 数字表示的所述第二物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的额外电磁辐射源暴露所 述第二物体，以细分包含在由第一电磁辐射源识别的边界内的物体。4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，电磁辐射源辐射的光的波长选自于 lOOnm到2000nm的范围，所述光包括紫外线、可见以及红外线光谱的部分。5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射的光的波长选 自于lOOnm到lOOOnm的范围，所述光引起天然存在的焚光团或人工导入的焚光团的焚光激 发，其中，由所激发的荧光团发射的光被用来创建帮助分类相应的物体的图像。6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述电磁辐射源辐射的光的波长选 自于lOOnm到2000nm的范围，其中，光由物体内的化学实体或颗粒吸收，使得包含吸收实体 或颗粒的相应图像具有较低强度的检测的电磁辐射。7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用电磁辐射源在不同的 角度贯穿样品来引起所述视野内的物体散射不同强度的电磁辐射。8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用电磁源从与检测传感 器区域成0至80度垂直来贯穿所述视野内的物体，使得显微镜的物镜捕捉在不同的角度散 射的光。9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用具有不同的偏振特性 的电磁源。10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用电磁源诱导天然存在 的磷光体或人工导入的磷光体的磷光。11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用透射光源从血红蛋白 的俗特谱带创建来自动物或人的血液的红细胞的图像，并且使用这些图像来计算颗粒特 性，诸如所述红细胞的面积、直径和体积、以及所述红细胞内的血红蛋白的浓度，并且其中， 通过激发附接至网状细胞中的网硬蛋白的核酸结合荧光团并且识别具有荧光发射的那些 红细胞，来识别所有红细胞之中的网状细胞。12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:利用荧光团处理来自动物 或人的体液的白细胞，并且通过使用激发光源检测白细胞，并且发射的光被透射在检测传 感器上以形成发荧光白细胞的数字表示。13. 根据权利要求12所述的方法，所述方法包括:使用核酸结合荧光团用于检测来自动 物或人的体液的白细胞。14. 根据权利要求12-13中任一项所述的方法，其中，所述核酸结合荧光团选自于吖啶 酯、噻唑橙和溴化乙啶的组。15. 根据权利要求12-14中任一项所述的方法，所述方法包括:计算荧光发射实体的直 径、浓度以及对应于二维荧光图像的物体的体积，并且使用所述荧光发射实体的直径、浓度 以及所述物体的体积来帮助将所述白细胞分类成淋巴细胞、粒细胞和单核细胞。16. 根据权利要求12-15中任一项所述的方法，所述方法包括:使用两个或更多荧光激 发源或者两个或更多荧光发射检测波长来检测不同的发荧光种类，使得白细胞内的不同实 体能够被检测，并且使用荧光的强度和量来进一步将白细胞的子集分类。17. 根据权利要求12-16中任一项所述的方法，所述方法包括:使用从300nm到800nm的 可见光在介于与传感器成60和90度垂直之间的角度照亮粒细胞，使得白细胞中的细胞质颗 粒强烈地散射光，而没有颗粒的细胞质不散射光或者散射强度非常低的光。18. 根据权利要求12-17中任一项所述的方法，所述方法包括:在通过利用300到800nm 的光在与所述传感器成60到90度垂直的角度照亮相同物体所细分的这些图像之中分类粒 细胞，而粒细胞是具有高强度的散射光的那些图像。19. 根据权利要求1所述的方法，其中，首先使用荧光来识别来自人或动物的体液的白 细胞，且然后将淋巴细胞和单核细胞识别为具有可忽略的散射光的图像。20. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:使用1到50兆像素的CMOS 或C⑶传感器。21. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，利用电子开关能够导通和断开电磁 源，所述电子开关提供利用2-10个不同的电磁源顺序地询问相同视野的能力，2-10个不同 的电磁源仅限于由用于所述电磁源的空间的约束条件以及用于成像所述视野的时间的约 束条件。22. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:具有一次性或者可再使用 的观察室，所述方法包含感兴趣的颗粒的液体分散并且允许统计上的大量颗粒被计数。23. 根据权利要求23所述的方法，其中，所述观察室具有介于50微米与10mm之间的厚 度。24. 根据权利要求18所述的方法，所述方法包括:将物镜放在检测CMOS或CCD传感器之 间，所述物镜提供足够的放大倍数来确定物体尺寸，并且也具有足够的视野来允许所述视 野中的物体的统计上的大量计数。25. 根据权利要求24所述的方法，其中，所述物镜具有介于2X与15X之间的放大倍数。26. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:利用用来识别红细胞的红 细胞的俗特谱带以及用来检测白细胞的核酸结合荧光团的荧光在体液中检测红细胞和白 细胞两者，而不使用红细胞的分离或溶解。27. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法使用诸如但不限于N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸钠的球形化试剂将红细胞从双凹圆盘转换成均匀球体，其 中，所述球形化试剂不影响白细胞的形态或散射特性。28. 根据权利要求25所述的方法，所述方法不使用球形化的试剂，而是使用保持所述红 细胞的天然双凹圆盘形状的试剂。29. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括:在30秒到10分钟内选择性 地溶解红细胞，而不影响白细胞的形态或光散射特性。30. 根据权利要求29所述的方法，所述方法将0.1M氯化铵、pH8.0用作具有或不具有球 形化试剂的红细胞溶解试剂。31. -种显微镜测量设备，包括图像传感器、物镜以及用于照射显微镜镜台的第一电磁 辐射源，所述图像传感器有线或者无线地连接至单独的计算机，所述计算机被配置为识别 并且分类从所述显微镜设备中的所述图像传感器收集的图像中的物体。32. 根据权利要求31所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备用于检测体液 中的颗粒或者高或低分子量的化学实体，所述体液包括但不限于血液、尿液、脊髓液、唾液、 腹膜液和肺灌洗，并且使用单个测量设备提供完整范围的体外诊断测试。33. 根据权利要求31-32中任一项所述的显微镜测量设备，所述显微镜测量设备被配置 为执行血液学、尿液分析、化学、免疫测定和/或凝结的体外诊断测试。34. 根据权利要求31-33中任一项所述的显微镜测量设备，包括滤光器组件，所述滤光 器组件包括第一滤光器、第一反射镜和第一分束器中的至少一个，所述第一滤光器被配置 为修改辐射、发射或散射的辐射的光特性，所述第一反射镜和/或所述第一分束器被配置为 引导透射、散射的电磁福射以及发射的电磁福射。35. 根据权利要求34所述的显微镜测量设备，其中，所述光学组件被配置为将来自所述 物镜的光从垂直平面重新引导到水平平面，使得相机的高度介于2cm与15cm之间。36. 根据权利要求31-35中任一项所述的显微镜测量设备，包括设置在所述显微镜镜台 之下的诸如灯圈的光源，其中，所述光源被配置用于正面落射光照明。37. 根据权利要求31-36中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为提供透过所述物镜的正面落射光照明。38. 根据权利要求31-37中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为执行荧光显微镜检查。39. 根据权利要求31-38中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为执行透射显微镜检查。40. 根据权利要求31-36中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为执行光散射显微镜检查。41. 根据权利要求31-40中任一项所述的显微镜测量设备，包括多个电磁辐射源，其中， 所述显微镜测量设备被配置为通过利用不同的电磁辐射源照明所述显微镜镜台中的物体， 来对同一组物体顺序地执行透射、光散射和/或荧光显微镜检查。42. 根据权利要求31-41中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为介于与透过所述物镜的散射光路的路径成〇与60度垂直之间来提供照明。43. 根据权利要求31-41中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为从与透过所述物镜的散射光路的路径成60至80度垂直来提供照明。44. 根据权利要求31-43中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 包括设置在所述镜台与所述物镜之间的一个或多个LED，其中，所述显微镜测量设备被配置 为利用透射光照明所述显微镜镜台中的样品。45. 根据权利要求31-44中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为将荧光激发源的照明时间控制在20毫秒与10秒之间，以实现足够的荧光发射强 度，用于所述图像传感器利用荧光发射来检测感兴趣的物体。46. 根据权利要求31-45中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为将从与透过所述物镜的散射光路的路径成〇至80度垂直放置的LED的照明时间控 制在20毫秒与10秒之间，以实现足够的光散射来检测感兴趣的物体。47. 根据权利要求31-46中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜镜台是固 定的或可移动的，并且被配置为用于保持样品室放置在所述物镜的前方的同时被电磁辐射 源照明。48. 根据权利要求47所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜镜台是可移动的，并且 被配置为允许所述样品室中的1至10个观察区域透过所述物镜被观察，并且其中，所述镜台 是手动地或者在马达控制下可移动。49. 根据权利要求31-48中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜镜台被配 置为将所述样品室保持在所述图像传感器的成像表面与搁置物体的表面之间的固定距离， 例如+/-10微米，从而避免在拍摄图像之前聚焦的需要。50. 根据权利要求31-49中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜镜台包含 固定参考区域，所述固定参考区域允许所述显微镜测量设备调整电磁辐射源的照明强度， 验证用来帮助将样品中的物体分类的强度的范围，并且所述固定参考区域允许所述显微镜 测量设备的放大倍数和焦点的质量控制而无需操作人员介入。51. -种供显微镜测量设备使用的样品室，所述样品室包括用于包含样品的相隔5和50 微米的两个平坦表面，所述样品室被配置为包含介于5与100uL之间的液体，所述样品室的 形状允许对所述样品室均匀且可再现地填充样品，并且防止在完成分析之前样品移动或者 样品蒸发。52. 根据权利要求51所述的样品室，所述样品室包括用于将样品与试剂合并的腔室。53. 根据权利要求51-52中任一项所述的样品室，所述样品室包括：用于精确地测量5-50uL的样品和50到500uL的试剂，且然后在将所述样品导入所述样品室的观察区域之前，合 并并且混合所述样品和所述试剂的装置。54. 根据权利要求51-53中任一项所述的样品室，所述样品室具有带有两个相应的平坦 表面的第一壁和第二壁，所述第一和第二壁的厚度介于100微米与4mm之间，选择壁的厚度 和成分以最小化从表面进入所述腔室的光谱反射和光散射，否则会有助于背景散射。55. 根据权利要求51-54中任一项所述的样品室，所述样品室具有1mm乘以1mm直到5mm 乘以5mm的观察区域并且具有从100微米到20mm的高度。56. 根据权利要求51-55中任一项所述的样品室，所述样品室被配置为允许样品在60秒 到24小时沉淀，使得沉淀的颗粒搁置在所述样品室的底部，并且能够通过所述显微镜测量 设备观察、识别和分类。57. 根据权利要求51-56中任一项所述的样品室，所述样品室包括封闭物，用于在填充 所述样品室之后封闭所述样品室，使得在沉降时间期间不发生蒸发。58. -种使用显微镜测量设备进行免疫测定的方法，所述显微镜测量设备包括图像传 感器、物镜、用于修改照射、发射或散射的辐射的光特性和/或用于引导透射、散射的电磁辐 射以及发射的电磁辐射的可选的滤光器组件、能够导通和断开的至少一个电磁辐射源，并 且所述显微镜测量设备被配置为与单独的计算机有线或者无线地通信，所述计算机包含成 像软件并且被配置为识别并且分类从所述显微镜测量设备中的所述图像传感器收集的图 像中的物体，其中，所述方法包括： a) 使用连接至以介于每分钟0.1mm与每分钟2mm之间的速率沉淀在水溶液中的分散的 固相颗粒的特异性抗体以及特异性地结合于全血中的分析物的颗粒上的抗体， b) 竞争性使用标记的分析物或者非竞争性地使用标记的覆盖抗体，检测连接至抗体结 合的固相的分析物，其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择观察室的高度以提供足够 浓度的颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤，其中，沉淀颗粒的图像由第一电 磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的边界或边缘，以及 c) 在暴露于第二电磁福射之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的所述边界内的电 磁辐射的强度，以及 d) 在暴露于第二电磁福射之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的所述边界外的电 磁辐射的强度，并且从位于由所述第一电磁辐射限定的所述边界内的电磁辐射的强度中减 去位于由所述第一电磁辐射限定的所述边界外的电磁辐射的强度，有效地减去背景电磁辐 射，由此比较所述第二电磁辐射的强度和标准曲线，以推导化验的分析物的浓度。59. -种使用结合伴侣进行期望化学实体的化验的方法，用于连接至可分散的固相物 体的期望化学实体，显微镜测量设备包括图像传感器、物镜、用于修改照射、发射或散射的 辐射的光特性和/或用于引导透射、散射的电磁辐射以及发射的电磁辐射的可选的滤光器 组件、能够导通和断开的至少一个电磁辐射源，并且所述显微镜测量设备被配置为与单独 的计算机有线或者无线地通信，所述计算机包含成像软件并且被配置为识别并且分类从所 述显微镜测量设备中的所述图像传感器收集的图像中的物体，以及包含用于按照通过以下 将视野内的二维物体分类的方法来操作显微镜的控制软件： a) 利用第一电磁辐射源来辐射所述视野内的所述物体， b) 将生成的图像投射到图像传感器上， c) 使用所述视野内的所述物体的生成的数字表示，来使用ImageJ软件识别颗粒作为所 述数字表示内的物体， d) 使用每个物体的边缘的坐标来限定在所述物体的所述数字表示内包含的围绕每个 物体的区域的区域， e) 确定每个物体的所述数字表示的面积、直径和平均强度， f) 通过从所述物体的所述数字表示的边界中减去一个像素来分离接触的颗粒，使得接 触颗粒能够被识别、枚举和适当地分类， g) 使用边缘坐标来限定与所述物体的边缘相邻但是位于所述物体外面的区域，以计算 电磁源的背景强度，并且从每个物体的数字表示的边缘内包含的所述物体的电磁强度中减 去平均的该背景强度， h) 使用在所述物体的边缘内的区域的电磁强度，来通过参考标准曲线确定在吸收光的 所述物体内的化学实体的浓度， i) 根据将第一组物体进一步分类到子集的需要，根据提供关于所述物体的所述数字表 示的预定边界内的所述物体的唯一光学信息的需要，利用尽可能多的电磁源顺序地询问相 同的第一物体，以及 j) 利用η个额外的第一电磁辐射源询问相同的视野，每个电磁辐射源因以下而区分开： 基于所述物体的电磁特性来唯一地区分所述视野内的物体的一些电磁特性;然后，利用尽 可能多的额外电磁辐射源暴露所述物体，以细分包含在由第一辐射源识别的边界内的物 体， k) 使用连接至分散的固相的任何结合伴侣，来捕捉体液中的期望的化学实体，并且竞 争性地使用所述化学实体的第二标记的捕捉伴侣或者非竞争性地使用所述期望的化学实 体的标记的衍生物来检测所述期望的化学实体； l) 其中，分散的颗粒沉淀到观察室的底部，选择所述观察室的高度以提供足够浓度的 颗粒，使得实现化验的期望敏感度不需要洗涤步骤； m) 其中，沉淀颗粒的图像由第一电磁辐射来识别，并且确定该第一图像的物体的边界 或边缘； η)以及在暴露于第二电磁福射之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的所述边界内 的电磁辐射的强度； 〇)以及在暴露于第二电磁福射之后，确定位于由所述第一电磁福射限定的所述边界外 的电磁辐射的强度，并且确定从位于由所述第一电磁辐射限定的所述边界内的电磁辐射的 强度中减去位于由所述第一电磁辐射限定的所述边界外的电磁辐射的强度；以及 Ρ)比较所述第二电磁辐射的强度和标准曲线，以推导化验的分析物的浓度。60. 根据权利要求59所述的执行化学测试的方法，所述方法包括:使用专用于感兴趣的 比色化学反应的有色产物的波长的透射LED光，其中，所述方法包括接通或断开LED以实现 期望波长的辐射。61. 根据权利要求31-50中任一项所述的显微镜测量设备，其中，所述显微镜测量设备 被配置为使用专用于感兴趣的化学反应的发射的电磁辐射。62. 根据权利要求31-50中任一项所述的显微镜测量设备，所述显微镜测量设备被配置 为使用安装在可移动镜台上的干化学测试条来进行化学分析，通过计算提供一致读数的干 反应垫的面积来确定检测的面积。
【专利摘要】一种用于检测体液中的颗粒和可溶性化学实体的系统和方法，包括的系统包括显微镜设备、样品室以及试剂，且包括的方法用来检测、分类以及枚举体液中的颗粒和化学实体。包含颗粒的体液与试剂结合沉淀至观察室的底部，将颗粒带入数字显微镜检测器的焦点处。识别为在捕捉的数字图像内吸收或发射电磁辐射的区域的颗粒可以基于第一数字图像的预定义区域内的附加吸收或发射的电磁辐射进一步分类。
【IPC分类】G01N15/14
【公开号】CN105492887
【申请号】CN201480027187
【发明人】理查德·哈理·特纳
【申请人】理查德·哈理·特纳
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年3月10日
【公告号】CA2905564A1, EP2973408A2, US20160042507, WO2014141034A2, WO2014141034A3
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