使用电化学式生物传感器的物质测量方法和测量装置的制造方法
使用电化学式生物传感器的物质测量方法和测量装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于对生物体成分等测量对象物质进行分析的使用电化学式生物传 感器的测量方法和测量装置。
【背景技术】
[0002] 以往，在电化学式的生物传感器中，主要使用的是对电极系施加电压，对基于物质 扩散的Cottrell电流进行测量的方法。例如，在专利文献1中记载了，使反应体系中含有氧 化剂和缓冲剂，将反应进行到反应实质上终止的阶段之后，在电极与试样之间施加电位来 测量Co ttre 11电流。该Cottre 11电流是依赖于扩散的电流，由Cottre 11式（下式（1))所表 示，以包含物质的扩散系数(D)为特征。在反应速度论中可以说其为扩散控速状态。
[0004] 另外，在专利文献2中公开了关于微流体中的分析物的测量中使用微小电极并依 赖于分析物的扩散系数(D)的测量条件。
[0005] 此外，在专利文献3中记载了Cottrell式和扩散系数(D)，公开了通过实验计算出 扩散系数的示例。
[0006] 此外，在专利文献4中记载了针对工作电极的电位，以氧化还原化学种类的扩散控 速的方式对电极间施加电位的工艺。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1:日本特许第2901678号说明书 [0010] 专利文献2:日本特表2009-533658号公报 [0011] 专利文献3:日本特开2011-58900号公报 [0012] 专利文献4:日本特许第3863184号说明书
【发明内容】
[0013]为了使上述的Cottrell电流成立，需要处于物质无浓度变化的状态。即，实质上酶 反应等需要终止。从而必须要确保一定的酶反应时间。此外，由于Cottrell电流与时间的平 方根(，t)成反比，因而随着时间的经过，电流衰减。因此，为了抑制测量的偏差，需要在电 流变动更小的状态下进行计量。其结果，完成计量为止的时间变长。另一方面，在没有电流 的衰减、对基于物质的球状扩散的稳态电流进行检测的微小电极系中，灵敏度小，因而如专 利文献2等中所公开，为了提高绝对灵敏度，需要设置多个电极、构建氧化还原反应循环。鉴 于这些情况，概括来说，在基于扩散控速的测量中，潜在地具有测量时间变长的问题;或者 在基于微小电极系的测量中，潜在地具有需要设置多个电极、电极系变得复杂的问题。
[0014] 因而，本发明的课题在于，在利用电化学式的生物传感器的物质的测量中，能够提 供利用更短的时间以精度良好的简便系统进行测量的方法和装置。
[0015] 发明人着眼于检测基于电化学反应的其它过程的电流而非迄今为止的检测基于 物质扩散的电流值并进行了深入研究，结果发现，在利用电化学式的生物传感器的物质的 测量中，通过检测基于电荷迀移过程而非物质的扩散过程的电流，能够利用更短的时间精 度且良好地进行物质的测量，从而完成了本发明。
[0016]如上，本发明的测量方法包括：
[0017] 将包含物质的试样导入至电化学测量池内，该电化学测量池包含绝缘性基板、在 该绝缘性基板上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含氧化 还原酶的试剂层；
[0018] 对电极施加电压；
[0019] 对电荷迀移控速电流进行检测，该电荷迀移控速电流是通过来源于试样内的所述 物质的电子向电极的迀移而产生的；以及
[0020] 基于所述电荷迀移控速电流，确定试样中所含有的所述物质的浓度。
[0021] 此处，所述电荷迀移控速电流优选为双电层的充电所致的瞬态电流产生后的稳态 电流，更优选由下式(6)所表示。
[0022] 另外，优选氧化还原酶包含吡咯喹啉醌或黄素腺嘌呤二核苷酸、或者具有含有正 铁血红素的亚单元或结构域。
[0023] 更具体地说，优选所述氧化还原酶为具有葡萄糖氧化活性的酶，例如为葡萄糖脱 氢酶;优选测量对象物质为葡萄糖。
[0024] 另外，优选电压通过逐级施加来施加，施加的电压优选为600mV以下。
[0025] 本发明的测量装置由下述部件构成：
[0026] 生物传感器，其包含电化学测量池，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝缘性 基板上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含可与试样中的 测量对象物质发生反应的氧化还原酶的试剂层；
[0027] 控制部，其控制向生物传感器的电压施加；
[0028] 检测部，其检测电荷迀移控速电流，该电荷迀移控速电流是向生物传感器施加电 压而得到的，基于来源于所述物质的电子向电极的迀移；
[0029] 运算部，其根据所述电流值计算出所述物质的浓度；以及
[0030] 输出部，其输出所述计算出的所述物质的浓度。
[0031] 此处，所述控制部优选设定为以通过逐级施加来施加电压的方式进行控制。另外， 在测量装置中，优选测量对象物质为葡萄糖，氧化还原酶为具有葡萄糖氧化活性的酶、例如 为葡萄糖脱氢酶。
[0032] 根据本发明，能够在不会受到扩散的影响的情况下进行物质浓度的测量，因而能 够进一步缩短测量时间。另外，由于能够使电极系简单化，因而能够降低成本。由于这些效 果，能够利用更少的被测物量并且在更短的测量时间内提高测量的操作性，可带来实用性 的提尚。
【附图说明】
[0033] 图1为示出实施例以及比较例的生物传感器的结构的图。图1的(A)为整体立体图、 图1的(B)为分解立体图。
[0034] 图2为示出使用实施例1、2和比较例的生物传感器进行循环伏安法测量的结果的 图。
[0035] 图3为示出使用实施例1和比较例的生物传感器进行计时安培分析法测量的结果 的图。
[0036] 图4为示出使用实施例1的生物传感器并改变电压参数来进行计时安培分析法测 量的结果的图。
[0037] 图5为示出使用实施例3的生物传感器进行计时安培分析法测量的结果的图。
[0038] 图6为对利用实施例1的生物传感器测量的各葡萄糖浓度下的电荷迀移控速的稳 态电流值与由式(5)的理论式计算出的各葡萄糖浓度下的稳态电流的理论值进行作图而得 到的图表。
[0039]图7为示出本发明的测量装置的一个方式的示意图。
[0040]图8为示出使用本发明的测量装置的测量程序的一个方式的流程图。
【具体实施方式】
[0041]下面对本发明的实施方式进行说明，但以下举出的实施方式分别为例示，本发明 并不限于以下的实施方式。
[0042] 本发明的使用生物传感器的物质测量方法包括:将包含物质的试样导入至电化学 测量池内，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝缘性基板上形成的2个以上的电极、以 及配置在该电极中的至少1个电极上且包含氧化还原酶的试剂层;对电极施加电压;对电荷 迀移控速电流进行检测，该电荷迀移控速电流是通过来源于试样内的所述物质的电子向电 极的迀移而产生的；以及基于所述电荷迀移控速电流，确定试样中所含有的所述物质的浓 度。
[0043] 此处，作为测量对象物质，只要为可通过使用本发明的生物传感器的测量方法进 行测量的物质就没有特别限制，优选生物体来源且可作为疾病或健康状态的指标的物质， 例如可以举出葡萄糖、胆固醇等。
[0044] 试样只要为包含测量对象物质的试样就没有特别限制，优选为生物体试样，可以 举出血液、尿等。
[0045] 基于来源于测量对象物质的电子向电极的迀移的电荷迀移控速电流是指，通过氧 化还原酶与测量对象物质的反应，电子由该酶迀移到电极时产生的电流，其是不依赖于时 间的稳态电流，优选为双电层的充电所致的瞬态电流产生后的稳态电流。
[0046]该电荷迀移控速电流优选由下述式(5)所表示。由该式可知，电流与基质的浓度和 酶反应速度常数成比例，设常数项为X时，可展开成式(6)。需要说明的是，尽管式(5)、（6)中 未示出，但在常数项X也可以包含校正系数等。
[0049] 本发明人考虑了酶反应的初速度式（式（2))以及从酶向电极的电子迀移速度式 (式(3))，认为为了对测量对象物质（基质）的浓度进行测量，需要在它们处于等价的状态 (式(4))下进行电流的检测，通过将其展开形成电流式，计算出该电荷迀移控速电流的式 (5)。
[0050] 式(5)为基于不包含所述式（1)的Cottrel l电流中所含的扩散系数(D)的电荷迀移 控速的电流式。由式(5)还可知，电流与酶反应速度常数成比例。在本发明的测量方法中，由 于在不经由基于电子接受物质等介体的氧化还原反应的情况下，电子向电极迀移，因而可 知其不受物质扩散的影响，也不具有时间依赖性。
[0054] 电极系为电荷迀移控速这一点可通过利用循环伏安法等对峰值有无或基于电压 的扫描方向的电流的增加趋势进行研究来确认。
[0055] 下面对可在本发明的测量方法中使用的电化学式生物传感器进行说明。
[0056]〈工作电极〉
[0057]工作电极例如可通过在绝缘性基板上配置电极材料、在所得到的电极的附近配置 至少包含氧化还原酶的试剂层来得到。
[0058]电极例如使用碳之类的碳材料来形成。或者也可以使用金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)、 钯之类的金属材料。
[0059] 绝缘性基板例如由聚醚酰亚胺(PEI )、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET )、聚乙烯(PE) 之类的热塑性树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂之类的各种树脂(塑料）、玻璃、陶瓷、纸之类的 绝缘性材料来形成。
[0060]电极和绝缘性基板的尺寸、厚度可进行适当设定。
[0061 ]〈氧化还原酶〉
[0062]氧化还原酶只要为可氧化还原测量对象物质的酶即可，作为催化剂亚单元和催化 剂结构域，可以包含吡咯喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)中的至少一者。例如，作 为包含PQQ的氧化还原酶，可以举出PQQ葡萄糖脱氢酶(PQQGDH);作为包含FAD的氧化还原 酶，可以举出具有包含FAD的α亚单元的细胞色素葡萄糖脱氢酶（CyGDH)、葡萄糖氧化酶 (GOD) 0
[0063]另外，氧化还原酶可以包含电子传递亚单元或电子传递结构域。作为电子传递亚 单元，例如可以举出具有拥有电子转移功能的正铁血红素的亚单元。作为包含该具有正铁 血红素的亚单元的氧化还原酶，可以举出包含细胞色素的酶，例如可以应用葡萄糖脱氢酶、 PQQGDH与细胞色素的融合蛋白。
[0064]另外，作为包含电子传递结构域的酶，可以举出胆固醇氧化酶、吡咯喹啉醌乙醇脱 氢酶(QHEDH(PQQ乙醇脱氢酶）。此外，电子传递结构域优选应用包含细胞色素(其具有拥有 电子转移功能的正铁血红素）的结构域。例如可以举出"QHGDH"（融合酶；带有QHGDH正铁血 红蛋白结构域的⑶H))、山梨糖醇脱氢酶(Sorbitol DH)、D-果糖脱氢酶(Fructose DH)、根 癌农杆菌（Agrobacterium tumef as ience )来源的葡萄糖-3-脱氢酶（Glucose-3-Dehydrogenase)(来自根癌农杆菌的G3DH)、纤维二糖脱氢酶。需要说明的是，作为上述包含 细胞色素的亚单元的示例的PQQGDH与细胞色素的融合蛋白以及作为包含细胞色素的结构 域的示例的PQQGDH的细胞色素结构域例如在国际公开W02005/030807号公报中有公开。 [0065]另外，氧化还原酶优选应用至少由催化剂亚单元和包含细胞色素的亚单元构成的 低聚物酶，细胞色素具有拥有电子受体功能的正铁血红素。
[0066] 需要说明的是，测量对象物质只要为氧化还原酶的基质即可。例如，纤维二糖脱氢 酶可氧化纤维二糖，但也可氧化葡萄糖，因而也可使用葡萄糖作为测量对象物质。
[0067] 为了测量电荷迀移控速电流，优选使工作电极为"直接电子迀移型的酶电极"。此 处，所谓"直接电子迀移型的酶电极"是指下述类型的酶电极:在试剂层中通过酶反应产生 的电子在没有电子传递介体之类的氧化还原物质参与的情况下直接被传递至电极，从而进 行酶与电极间的电子转移。
[0068]需要说明的是，在生理学的反应体系中，产生直接电子迀移的极限距离可以说为 Inm~2nm。从而，按照从酶向电极的电子迀移不会受损的方式来配置酶是重要的。
[0069] 为了测量电荷迀移控速电流，在电极的附近配置氧化还原酶是重要的，作为用于 此的方法没有特别限制，例如可以举出将氧化还原酶化学固定化至电极的方法、使用粘结 剂等将氧化还原酶间接固定化至电极的方法、使氧化还原酶物理吸附至电极的方法等。
[0070] 工作电极上的酶试剂层可以包含导电性颗粒。通过包含导电性颗粒，能够期待电 子向电极更为适宜的传递。具体地说，导电性颗粒可以应用金、铂、银、钯之类的金属制颗 粒、或将碳作为材料的高阶结构体。高阶结构体可以包含例如导电性炭黑、碳纳米管(CNT)、 富勒稀之类的碳颗粒或碳微粒。作为导电性炭黑，可以举出科琴黑(Degussa制造 ）、Black Pearl (Cabot)等等。
[0071] 工作电极上的酶试剂层还可以包含导电性高分子。作为导电性高分子，优选为水 溶性的高分子，可以举出聚苯胺、聚乙撑二氧噻吩等，作为代表例，可以举出三菱丽阳制造 的磺化聚苯胺水溶液(商品名Aquapass)。
[0072] 在工作电极上的酶试剂层还可以包含粘结剂。作为粘结剂，优选水溶性粘结剂，具 体地说，可以举出含有噁唑啉基的水溶性聚合物等。
[0073] 上述这样的工作电极例如按如下方式来制作。即，在绝缘性基板的单面形成作为 电极发挥功能的碳层。例如，可以在规定厚度(例如IOOym左右)的膜状绝缘性基板的单面进 行碳油墨的丝网印刷，形成具有所期望的厚度(例如IOym左右）的碳膜。也可以不使用碳层， 而通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)进行金属材料的成膜从而形成具有所期 望的厚度(例如30nm左右）的金属层。
[0074] 接着，在电极上形成酶试剂层。首先制备包含氧化还原酶与导电性颗粒或导电性 高分子的溶液，将该溶液滴加到电极的表面。该溶液通过在电极上干燥而发生固化，从而能 够得到在电极上形成了酶试剂层的工作电极。
[0075] 作为反电极，只要为作为生物传感器的反电极而通常使用的电极即可，例如可以 使用通过丝网印刷进行成膜的碳电极、通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)进 行成膜的金属电极、通过丝网印刷进行成膜的银/氯化银电极。另外，还可以使用将银/氯化 银电极作为参比电极的3电极系。
[0076] 向电极施加电压的方法没有特别限制，为了有效地测量电荷迀移控速电流，优选 逐级施加。所施加的电压优选为600mV以下、更优选为IOOmV以下。下限没有特别限制，例如 为IOmV以上。
[0077] 测量对象物质的浓度可以基于式(5)由测量电流值计算出。
[0078]另外，还可以使用浓度已知的试样预先制作校正曲线，基于该校正曲线由测量电 流值计算出该浓度。另外，还可以通过将经过试验发现的校正系数乘以式(5)等，来计算出 被测物的浓度。这种情况下，在式(6)的常数项X中也包含校正系数。
[0079]利用本发明的测量方法，能够进行连续测量和间断测量中的任一种。
[0080] 接着，使用附图对本发明的测量装置进行说明。但是，本发明的测量装置并不限于 以下的方式。
[0081] 图7示出了容纳在测量装置2内的主要电子部件的构成例。图7所示的控制计算机 3、恒电位仪3A、电力供给装置21被设置在容纳于壳体内的基板3a上。
[0082]控制计算机3从硬件来说包含CPU(中央运算处理装置)之类的处理器、存储器(RAM (Random Access Memory，随机存取存储器）、R0M(Read Only Memory，只读存储器））之类的 记录介质、以及通信单元，处理器将记录介质（例如ROM)中存储的程序加载至RAM并运行，由 此，作为具备输出部20、控制部22、运算部23和检测部24的装置发挥功能。需要说明的是，控 制计算机3也可以包含半导体存储器(EEPROM，闪存)或硬盘之类的辅助存储装置。
[0083]控制部22对于电压施加的时机、施加电压值等进行控制。
[0084] 电力供给装置21具有电池26,向控制部计算机3或恒电位仪3A供给工作用的电力。 需要说明的是，电力供给装置21也可以设置在壳体的外部。
[0085] 恒电位仪3A为使工作电极的电位相对于参比电极固定的装置，其通过控制部22进 行控制，使用端子CR、W，在葡萄糖传感器4的反电极与工作电极之间通过逐级施加来施加规 定的电压，对在端子W得到的工作电极的响应电流进行测量，将响应电流的测量结果送到检 测部24。
[0086] 运算部23由检测出的电流值进行测量对象物质的浓度的运算并存储。输出部20与 显示部单元25之间 进行数据通信，将由运算部23得到的测量对象物质的浓度的运算结果发 送到显示部单元25。显示部单元25例如可以将由测量装置2接收到的葡萄糖浓度的运算结 果利用规定的格式显示在显示画面上。
[0087] 图8为示出利用控制计算机3进行的葡萄糖浓度测量处理的示例的流程图。
[0088] 在图8中，在控制计算机3的CPU(控制部22)受理葡萄糖浓度测量的开始指示时，控 制部22控制恒电位仪3A，通过逐级施加向工作电极施加规定的电压，开始测量来自工作电 极的响应电流(步骤S01)。需要说明的是，可以将检测到传感器向测量装置的安装作为浓度 测量开始指示。
[0089]接着，恒电位仪3A测量通过电压施加得到的响应电流，该响应电流即为基于来源 于试样内的测量对象物质(此处为葡萄糖)的电子向电极的迀移的电荷迀移控速电流，优选 为在双电层的充电所致的瞬态电流产生后例如在自电压施加起1~20秒后的稳态电流，将 测量的电流值送到检测部24(步骤S02)。
[0090] 运算部23基于电流值进行运算处理，计算出葡萄糖浓度（步骤S03)。例如，控制计 算机3的运算部23预先保存与配置在电极上的葡萄糖脱氢酶相对应的葡萄糖浓度的计算式 (基于上述式(5)或式(6)的计算式)或葡萄糖浓度的校正曲线数据，使用这些计算式或校正 曲线计算出葡萄糖浓度。
[0091] 输出部20将葡萄糖浓度的计算结果通过在其与显示部单元25之间形成的通信链 路发送到显示部单元25(步骤S04)。其后，控制部22对于测量错误的有无进行检测（步骤 S05)，若没有错误则终止测量，将葡萄糖浓度显示在显示部上。若有错误，则在进行错误显 示后，结束基于图8的流程的处理。另外，还能够将计算结果保存在运算部23中，并在之后调 用计算结果，显示在显示部上进行确认。需要说明的是，此处，是在计算结果向显示部单元 25的发送(步骤S04)之后利用控制部22进行测量错误检测（步骤S05)，但也可以对调这些步 骤的顺序。
[0092] 下面举出实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限定于下述实施例的方 式。
[0093][实施例1]
[0094]下面使用葡萄糖传感器对生物传感器的实施例进行说明。
[0095]〈葡萄糖传感器的制造方法〉
[0096] 葡萄糖传感器的结构的一例示于图1。
[0097] 如图1所示，葡萄糖传感器1具有罩板10、隔板11和基板12。
[0098] 在罩板10设有孔部13,在隔板11设有与孔部13连通同时前端部14a敞开的细宽度 的缝隙14。在罩板10和隔板11被层叠在基板12的上表面12a的状态下，利用缝隙14限定出毛 细管15。该毛细管15藉由缝隙14的前开口部14a和孔部13与外部连通。前端开口部14a构成 试样液导入口 15a，从该试样液导入口 15a供给的试样液由于毛细管现象向着孔部13在毛细 管15内行进。
[0099]在基板12的上表面12a设有第1电极16、第2电极17、和试剂层18。
[0100] 第1和第2电极16、17作为整体在基板12的长边方向延伸，它们的端部16a、17a在基 板12的短边方向延伸。基板12的上表面12a以第1和第2电极16、17的端部16a、16b、17a、17b 露出的方式被绝缘膜19覆盖。
[0101] 试剂层18按照在第1和第2电极16、17的端部16a、17a间搭桥的方式进行设置。该试 剂层18包含葡萄糖脱氢酶。
[0102] 更具体地说，葡萄糖传感器通过下述方法制作。
[0103] 〈基底电极〉
[0104] 作为基底电极材料，使用导电性碳油墨(旭化成研究所制FTU系列），利用丝网印刷 方法在聚对苯二甲酸乙二醇酯基材（东丽制E-22)(长50mm、宽5mm、厚250μπι)的一个表面进 行该油墨的图案化印刷，形成2电极图案。此外，在实施例中，在一个电极上涂布银-氯化银 油墨(BAS社制造），以80°C干燥20分钟，形成银-氯化银电极，作为反电极。
[0105] 接下来，将绝缘性树脂聚酯油墨(旭化成研究所制UVF系列）在上述电极上进行丝 网印刷。由电极图案和绝缘图案形成的电极面积分别设定为0.5_ 2。
[0106] 〈酶试剂层的形成(实施例1、2)>
[0107]在电极上，制备包含含有细胞色素的葡萄糖脱氢酶(CyGDH)、导电性颗粒(炭黑:科 琴黑KJB)、作为导电助剂的导电性高分子(聚苯胺)和粘结剂(含有噁唑啉基的水溶性聚合 物）的酶试剂，在电极上滴加0.04yL，以100°C干燥30分钟，从而形成酶试剂层。酶试剂的最 终浓度如下。
[0108] 〈酶试剂的配方〉
[0109] * KJB：0.4wt%
[0110] ?酶（Cy ⑶ H):7mg/mL
[0111] ?磷酸钠缓冲液：IOmM pH7
[0112] ?粘结剂(EP0CR0S WS-700、日本触媒制造)5.0%(w/v)
[0113] ?聚苯胺(Aquapass、三菱丽阳制造)0.2%(w/v)
[0114] 需要说明的是，在实施例2中，不添加聚苯胺而添加蒸馏水，除此以外的配方与实 施例1相同。
[0115] 〈酶试剂层的形成(实施例3)>
[0116] 不使用Cy⑶H而使用基于PQQGDH的含有细胞色素的QHGDH(PQQGDH与细胞色素的融 合蛋白）。
[0117] 按照以下的配方制备酶试剂，在电极上滴加0.08yL，于100°C干燥2小时，从而形成 酶试剂层。
[0118]〈酶试剂的配方〉
[0119] · LION糊料(含有科琴黑:W-311N)(LI0N制造）：2.4wt%
[0120] ?酶（QHGDH): 2 · 3mg/mL
[0121 ] · HEPES缓冲液：20mM pH7
[0122] ?粘结剂(EP0CR0S WS-700、日本触媒制造)6.0%(w/v)
[0123] ?聚苯胺(Aquapass、三菱丽阳制造)0.4% (w/v)
[0124] [比较例]
[0125] 〈酶试剂层的形成(比较例)>
[0126] 在电极上，制备包含电子接受物质（钌氨络合物)和作为粘结剂的无机凝胶(蒙皂 石）的酶试剂(第一试剂），在电极上滴加〇.3yL，于30°C干燥10分钟，从而形成第一试剂层。 第一试剂的最终浓度如下。
[0127] 〈第一试剂的配方〉
[0128] ?蒙皂石(SWN、C〇-〇p 化学社制造）：0.3%(w/v)
[0129] · [Ru(NH3)6]Cl3(Aldrich制造）：5.0% (w/v)
[0130] 接下来，将5000U/mL的含有细胞色素的葡萄糖脱氢酶(CyGDH或QHGDH)的IOyL水溶 液分注在第一试剂层的上表面，于30°C干燥10分钟，从而形成酶试剂层。需要说明的是，在 比较例中，基底电极将利用与实施例1相同的方法制作的碳电极作为工作电极和反电极。
[0131] 〈毛细管形成〉
[0132] 实施例1、2、3和比较例中均利用下述的方法形成毛细管。
[0133] 在上述形成了酶试剂层的基底电极中，将具有开口部的隔板配置在绝缘层上，此 外，在上述隔板上配置具有作为空气孔的贯通孔的罩，制成葡萄糖传感器。夹在上述罩与绝 缘层之间的隔板的开口部的空间成为毛细管结构，因而将其作为试样供给部。
[0134]〈循环伏安法测量〉
[0135] 在实施例1、2和比较例中，通过研究循环伏安法波形来评价葡萄糖传感器的电极 响应特性。循环伏安法波形如下进行研究：在向葡萄糖传感器的试样供给部导入葡萄糖浓 度为lOOmg/dL的全血后，按照扫描速度为20mV/sec、施加电压为-200mV4+800mV--200mV 进行扫描，测量扫描时的响应电流，由此对循环伏安法波形进行研究。图2为通过测量得到 的循环伏安法波形。
[0136] 在循环伏安法测量中，在电极系进行扩散控速的情况下，最初，随着电极反应速度 的上升，电流上升，其后若电流呈扩散依赖性，则电流减少，从而，作为结果，显现出峰值。在 比较例中，明确显现出了基于扩散控速的峰值，在对实施例1和实施例2进行观察时，显示出 了未显现出明确的峰值、电流平稳地增加的趋势。从而可确认，在本发明中并非为扩散控 速、而为电荷迀移控速电 流。另外，由于无论有无导电性高分子均无法进行峰值的确认，因 而认为导电性高分子并不是改变电极系的控速过程的因子。从而，为了进行电荷迀移控速 电流的检测，可以使用导电性高分子、也可以不使用导电性高分子，但在包含导电性高分子 的实施例1中显示出了高电流值，因而可知导电性高分子具有提高响应灵敏度的效果。如上 可知，实施例1和2中均产生了电荷迀移控速电流，在实施例2的测量中也未产生不当状况。 在下述的试验中，作为代表例，使用实施例1的传感器进行评价。
[0137] 〈计时安培分析法测量〉
[0138] 利用计时安培分析法测量对葡萄糖传感器的电极响应特性进行评价。计时安培分 析法测量如下进行研究:在对葡萄糖传感器的试样导入部导入葡萄糖浓度为l〇〇mg/dL的全 血后，对工作电极逐级施加400mV，对响应电流进行测量。
[0139] 使用所制作的传感器进行计时安培分析法测量的结果示于图3。在实施例1和比较 例中，在电压施加后均流过瞬态电流。其是基于电极表面的双电层的充电的电流。所谓双电 层是在电极表面与溶液的界面处为了保持溶液侧的电气中和而由电解质离子的排列而产 生的层。在比较例的生物传感器中，在充电电流产生后，对于所观察到的基于扩散控速的 Cottrell电流，基于式（1)，确认到电流按IATt减少。另一方面，在使用实施例1的生物传感 器的情况下，尽管并非为微小电极系，但在充电电流产生后，迅速地检测到了稳态电流，通 过测量该稳态电流，能够对葡萄糖的浓度进行测量。本实施例中的测量电流并非为扩散控 速而为电荷迀移控速的，与基于扩散控速的测量相比，确认到能够进行短时间测量。
[0140] 〈计时安培分析法测量(电压参数)>
[0141] 在实施例1中，利用计时安培分析法测量对葡萄糖传感器的电极响应特性进行评 价。计时安培分析法测量如下进行研究：在对葡萄糖传感器的试样导入部导入葡萄糖浓度 为Omg/dL或者336mg/dL的全血后，对工作电极施加逐级电压，测量10秒后的响应电流。将测 量电压分别变为600、400、200、100、70mV进行测量。
[0142] 使用所制作的传感器进行计时安培分析法测量的结果示于图4。在各电压下，在葡 萄糖为336mg/dL时确认到同等水平的基于电荷迀移控速的稳态电流响应。另外，确认到葡 萄糖为Omg/dL时的电流值低，因而在各测量电压下能够进行葡萄糖的测量。在本测量中，利 用逐级电压施加10秒后的电流值进行了测量，由图4的结果确认到，在逐级电压施加后1~2 秒左右可以确认到稳态电流，特别是在施加电压低的70mV施加时，在1秒以内检测到稳态电 流，因而能够进行短时间测量。由图4还可知，通过降低施加电压，能够减小试样中所含有的 共存物质的氧化还原反应所致的背景电流，因而不仅能够缩短测量时间，而且还具有能够 抑制测量误差的效果。
[0143] 〈计时安培分析法测量~实施例3>
[0144] 利用计时安培分析法测量对使用QHGDH的葡萄糖传感器的电极响应特性进行评 价。计时安培分析法测量如下进行研究：在对葡萄糖传感器的试样导入部导入葡萄糖浓度 为Omg/dL或者600mg/dL的全血后，对工作电极逐级施加200mV，对响应电流进行测量。
[0145] 结果示于图5。在葡萄糖为600mg/dL确认到基于电荷迀移控速的稳态电流响应。另 一方面，在葡萄糖为Omg/dL时的电流值低，并非为稳态电流响应，因而可知，在使用含有细 胞色素的QHGDH制作的传感器中，也能够基于由葡萄糖所致的电荷迀移控速带来的稳态电 流响应进行葡萄糖浓度的测量。需要说明的是，得到由电荷迀移控速带来的稳态电流响应 的时间为15秒左右，认为其是由于酶的精炼度等的影响。
[0146] 〈理论式的检证〉
[0147] 对实施例1的传感器施加70mV的逐级电压，相对于10秒后测量的各葡萄糖浓度下 的电荷迀移控速的稳态电流值，进行在式(5)的理论式中在表1的条件下计算出的各葡萄糖 浓度下的稳态电流的理论值的计算结果的比较(图6)。
[0148]其结果可知，计算值(理论值）与测量结果非常一致。通过由理论值与测量结果的 误差确定校正系数并乘以式(5)等，也能够提高计算值(理论值)与测量结果的一致程度。需 要说明的是，在本测量方法中，在电压的逐级施加后测量了 10秒后的电流值，但如上所述， 在逐级电压施加后，当然可在1~2秒左右测量稳态电流。
[0149] 【表1】
[0150]
[0151] 【标号说明】
[0152] 1:葡萄糖传感器；10:罩板；11:隔板；12:基板；13:孔部；14:缝隙；15:毛细管；16: 第1电极；17:第2电极；18:试剂层；19:绝缘膜;2:测量装置;20:输出部;21:电力供给装置； 22:控制部;23:运算部;24:检测部;25:显示部单元;26:电池;3:控制计算机;3A:恒电位仪； 3a:基板;CR、W:端子;4:葡萄糖传感器。
【主权项】
1. 一种使用生物传感器的物质测量方法，该物质测量方法包括以下步骤： 将包含物质的试样导入至电化学测量池内，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝 缘性基板上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含氧化还原 酶的试剂层； 对电极施加电压； 对电荷迀移控速电流进行检测，该电荷迀移控速电流是来源于试样内的所述物质的电 子向电极迀移而产生的；以及 基于所述电荷迀移控速电流，确定试样中所含有的所述物质的浓度。2. 根据权利要求1所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 所述电荷迀移控速电流是双电层的充电所致的瞬态电流产生后的稳态电流。3. 根据权利要求1或2所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中，所述电流由下式 (6)表不，Λ:基质（S)的浓度(mol/cm3) Kcat/Km:酶反应速度常数 X:常数项。4. 根据权利要求1~3中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 氧化还原酶包含吡咯喹啉醌或黄素腺嘌呤二核苷酸。5. 根据权利要求1~4中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 氧化还原酶具有含有正铁血红素的亚单元或结构域。6. 根据权利要求1~5中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 氧化还原酶具有葡萄糖氧化活性。7. 根据权利要求1~6中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。8. 根据权利要求1~7中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 通过逐级施加来施加电压。9. 根据权利要求8所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 施加600mV以下的电压。10. -种测量装置，其由下述部件构成： 生物传感器，其包含电化学测量池，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝缘性基板 上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含能够与试样中的测 量对象物质发生反应的氧化还原酶的试剂层； 控制部，其控制向生物传感器的电压施加； 检测部，其检测电荷迀移控速电流，该电荷迀移控速电流是向生物传感器施加电压而 得到的，基于来源于所述物质的电子向电极的迀移； 运算部，其由所述电流值计算出所述物质的浓度；以及 输出部，其输出所述计算出的所述物质的浓度。11. 根据权利要求10所述的测量装置，其中， 所述控制部控制为通过逐级施加来施加电压。12. 根据权利要求10或11所述的测量装置，其中， 所述物质为葡萄糖、氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。
【专利摘要】使用生物传感器的物质测量方法，该物质测量方法包括以下步骤：将包含物质的试样导入至电化学测量池内，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝缘性基板上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含氧化还原酶的试剂层；对电极施加电压；对电荷迁移控速电流进行检测，该电荷迁移控速电流是通过来源于试样内的所述物质的电子向电极的迁移而产生的；以及基于所述电荷迁移控速电流，确定试样中所含有的所述物质的浓度。
【IPC分类】G01N27/416, G01N27/327
【公开号】CN105492902
【申请号】CN201480044602
【发明人】胜木幸治
【申请人】爱科来株式会社, 日本生物工程研究所有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年8月7日
【公告号】EP3032250A1, US20160177365, WO2015020149A1
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于对生物体成分等测量对象物质进行分析的使用电化学式生物传 感器的测量方法和测量装置。
【背景技术】
[0002] 以往，在电化学式的生物传感器中，主要使用的是对电极系施加电压，对基于物质 扩散的Cottrell电流进行测量的方法。例如，在专利文献1中记载了，使反应体系中含有氧 化剂和缓冲剂，将反应进行到反应实质上终止的阶段之后，在电极与试样之间施加电位来 测量Co ttre 11电流。该Cottre 11电流是依赖于扩散的电流，由Cottre 11式（下式（1))所表 示，以包含物质的扩散系数(D)为特征。在反应速度论中可以说其为扩散控速状态。
[0004] 另外，在专利文献2中公开了关于微流体中的分析物的测量中使用微小电极并依 赖于分析物的扩散系数(D)的测量条件。
[0005] 此外，在专利文献3中记载了Cottrell式和扩散系数(D)，公开了通过实验计算出 扩散系数的示例。
[0006] 此外，在专利文献4中记载了针对工作电极的电位，以氧化还原化学种类的扩散控 速的方式对电极间施加电位的工艺。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1:日本特许第2901678号说明书 [0010] 专利文献2:日本特表2009-533658号公报 [0011] 专利文献3:日本特开2011-58900号公报 [0012] 专利文献4:日本特许第3863184号说明书
【发明内容】
[0013]为了使上述的Cottrell电流成立，需要处于物质无浓度变化的状态。即，实质上酶 反应等需要终止。从而必须要确保一定的酶反应时间。此外，由于Cottrell电流与时间的平 方根(，t)成反比，因而随着时间的经过，电流衰减。因此，为了抑制测量的偏差，需要在电 流变动更小的状态下进行计量。其结果，完成计量为止的时间变长。另一方面，在没有电流 的衰减、对基于物质的球状扩散的稳态电流进行检测的微小电极系中，灵敏度小，因而如专 利文献2等中所公开，为了提高绝对灵敏度，需要设置多个电极、构建氧化还原反应循环。鉴 于这些情况，概括来说，在基于扩散控速的测量中，潜在地具有测量时间变长的问题;或者 在基于微小电极系的测量中，潜在地具有需要设置多个电极、电极系变得复杂的问题。
[0014] 因而，本发明的课题在于，在利用电化学式的生物传感器的物质的测量中，能够提 供利用更短的时间以精度良好的简便系统进行测量的方法和装置。
[0015] 发明人着眼于检测基于电化学反应的其它过程的电流而非迄今为止的检测基于 物质扩散的电流值并进行了深入研究，结果发现，在利用电化学式的生物传感器的物质的 测量中，通过检测基于电荷迀移过程而非物质的扩散过程的电流，能够利用更短的时间精 度且良好地进行物质的测量，从而完成了本发明。
[0016]如上，本发明的测量方法包括：
[0017] 将包含物质的试样导入至电化学测量池内，该电化学测量池包含绝缘性基板、在 该绝缘性基板上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含氧化 还原酶的试剂层；
[0018] 对电极施加电压；
[0019] 对电荷迀移控速电流进行检测，该电荷迀移控速电流是通过来源于试样内的所述 物质的电子向电极的迀移而产生的；以及
[0020] 基于所述电荷迀移控速电流，确定试样中所含有的所述物质的浓度。
[0021] 此处，所述电荷迀移控速电流优选为双电层的充电所致的瞬态电流产生后的稳态 电流，更优选由下式(6)所表示。
[0022] 另外，优选氧化还原酶包含吡咯喹啉醌或黄素腺嘌呤二核苷酸、或者具有含有正 铁血红素的亚单元或结构域。
[0023] 更具体地说，优选所述氧化还原酶为具有葡萄糖氧化活性的酶，例如为葡萄糖脱 氢酶;优选测量对象物质为葡萄糖。
[0024] 另外，优选电压通过逐级施加来施加，施加的电压优选为600mV以下。
[0025] 本发明的测量装置由下述部件构成：
[0026] 生物传感器，其包含电化学测量池，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝缘性 基板上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含可与试样中的 测量对象物质发生反应的氧化还原酶的试剂层；
[0027] 控制部，其控制向生物传感器的电压施加；
[0028] 检测部，其检测电荷迀移控速电流，该电荷迀移控速电流是向生物传感器施加电 压而得到的，基于来源于所述物质的电子向电极的迀移；
[0029] 运算部，其根据所述电流值计算出所述物质的浓度；以及
[0030] 输出部，其输出所述计算出的所述物质的浓度。
[0031] 此处，所述控制部优选设定为以通过逐级施加来施加电压的方式进行控制。另外， 在测量装置中，优选测量对象物质为葡萄糖，氧化还原酶为具有葡萄糖氧化活性的酶、例如 为葡萄糖脱氢酶。
[0032] 根据本发明，能够在不会受到扩散的影响的情况下进行物质浓度的测量，因而能 够进一步缩短测量时间。另外，由于能够使电极系简单化，因而能够降低成本。由于这些效 果，能够利用更少的被测物量并且在更短的测量时间内提高测量的操作性，可带来实用性 的提尚。
【附图说明】
[0033] 图1为示出实施例以及比较例的生物传感器的结构的图。图1的(A)为整体立体图、 图1的(B)为分解立体图。
[0034] 图2为示出使用实施例1、2和比较例的生物传感器进行循环伏安法测量的结果的 图。
[0035] 图3为示出使用实施例1和比较例的生物传感器进行计时安培分析法测量的结果 的图。
[0036] 图4为示出使用实施例1的生物传感器并改变电压参数来进行计时安培分析法测 量的结果的图。
[0037] 图5为示出使用实施例3的生物传感器进行计时安培分析法测量的结果的图。
[0038] 图6为对利用实施例1的生物传感器测量的各葡萄糖浓度下的电荷迀移控速的稳 态电流值与由式(5)的理论式计算出的各葡萄糖浓度下的稳态电流的理论值进行作图而得 到的图表。
[0039]图7为示出本发明的测量装置的一个方式的示意图。
[0040]图8为示出使用本发明的测量装置的测量程序的一个方式的流程图。
【具体实施方式】
[0041]下面对本发明的实施方式进行说明，但以下举出的实施方式分别为例示，本发明 并不限于以下的实施方式。
[0042] 本发明的使用生物传感器的物质测量方法包括:将包含物质的试样导入至电化学 测量池内，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝缘性基板上形成的2个以上的电极、以 及配置在该电极中的至少1个电极上且包含氧化还原酶的试剂层;对电极施加电压;对电荷 迀移控速电流进行检测，该电荷迀移控速电流是通过来源于试样内的所述物质的电子向电 极的迀移而产生的；以及基于所述电荷迀移控速电流，确定试样中所含有的所述物质的浓 度。
[0043] 此处，作为测量对象物质，只要为可通过使用本发明的生物传感器的测量方法进 行测量的物质就没有特别限制，优选生物体来源且可作为疾病或健康状态的指标的物质， 例如可以举出葡萄糖、胆固醇等。
[0044] 试样只要为包含测量对象物质的试样就没有特别限制，优选为生物体试样，可以 举出血液、尿等。
[0045] 基于来源于测量对象物质的电子向电极的迀移的电荷迀移控速电流是指，通过氧 化还原酶与测量对象物质的反应，电子由该酶迀移到电极时产生的电流，其是不依赖于时 间的稳态电流，优选为双电层的充电所致的瞬态电流产生后的稳态电流。
[0046]该电荷迀移控速电流优选由下述式(5)所表示。由该式可知，电流与基质的浓度和 酶反应速度常数成比例，设常数项为X时，可展开成式(6)。需要说明的是，尽管式(5)、（6)中 未示出，但在常数项X也可以包含校正系数等。
[0049] 本发明人考虑了酶反应的初速度式（式（2))以及从酶向电极的电子迀移速度式 (式(3))，认为为了对测量对象物质（基质）的浓度进行测量，需要在它们处于等价的状态 (式(4))下进行电流的检测，通过将其展开形成电流式，计算出该电荷迀移控速电流的式 (5)。
[0050] 式(5)为基于不包含所述式（1)的Cottrel l电流中所含的扩散系数(D)的电荷迀移 控速的电流式。由式(5)还可知，电流与酶反应速度常数成比例。在本发明的测量方法中，由 于在不经由基于电子接受物质等介体的氧化还原反应的情况下，电子向电极迀移，因而可 知其不受物质扩散的影响，也不具有时间依赖性。
[0054] 电极系为电荷迀移控速这一点可通过利用循环伏安法等对峰值有无或基于电压 的扫描方向的电流的增加趋势进行研究来确认。
[0055] 下面对可在本发明的测量方法中使用的电化学式生物传感器进行说明。
[0056]〈工作电极〉
[0057]工作电极例如可通过在绝缘性基板上配置电极材料、在所得到的电极的附近配置 至少包含氧化还原酶的试剂层来得到。
[0058]电极例如使用碳之类的碳材料来形成。或者也可以使用金(Au)、铂(Pt)、银(Ag)、 钯之类的金属材料。
[0059] 绝缘性基板例如由聚醚酰亚胺(PEI )、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET )、聚乙烯(PE) 之类的热塑性树脂、聚酰亚胺树脂、环氧树脂之类的各种树脂(塑料）、玻璃、陶瓷、纸之类的 绝缘性材料来形成。
[0060]电极和绝缘性基板的尺寸、厚度可进行适当设定。
[0061 ]〈氧化还原酶〉
[0062]氧化还原酶只要为可氧化还原测量对象物质的酶即可，作为催化剂亚单元和催化 剂结构域，可以包含吡咯喹啉醌(PQQ)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)中的至少一者。例如，作 为包含PQQ的氧化还原酶，可以举出PQQ葡萄糖脱氢酶(PQQGDH);作为包含FAD的氧化还原 酶，可以举出具有包含FAD的α亚单元的细胞色素葡萄糖脱氢酶（CyGDH)、葡萄糖氧化酶 (GOD) 0
[0063]另外，氧化还原酶可以包含电子传递亚单元或电子传递结构域。作为电子传递亚 单元，例如可以举出具有拥有电子转移功能的正铁血红素的亚单元。作为包含该具有正铁 血红素的亚单元的氧化还原酶，可以举出包含细胞色素的酶，例如可以应用葡萄糖脱氢酶、 PQQGDH与细胞色素的融合蛋白。
[0064]另外，作为包含电子传递结构域的酶，可以举出胆固醇氧化酶、吡咯喹啉醌乙醇脱 氢酶(QHEDH(PQQ乙醇脱氢酶）。此外，电子传递结构域优选应用包含细胞色素(其具有拥有 电子转移功能的正铁血红素）的结构域。例如可以举出"QHGDH"（融合酶；带有QHGDH正铁血 红蛋白结构域的⑶H))、山梨糖醇脱氢酶(Sorbitol DH)、D-果糖脱氢酶(Fructose DH)、根 癌农杆菌（Agrobacterium tumef as ience )来源的葡萄糖-3-脱氢酶（Glucose-3-Dehydrogenase)(来自根癌农杆菌的G3DH)、纤维二糖脱氢酶。需要说明的是，作为上述包含 细胞色素的亚单元的示例的PQQGDH与细胞色素的融合蛋白以及作为包含细胞色素的结构 域的示例的PQQGDH的细胞色素结构域例如在国际公开W02005/030807号公报中有公开。 [0065]另外，氧化还原酶优选应用至少由催化剂亚单元和包含细胞色素的亚单元构成的 低聚物酶，细胞色素具有拥有电子受体功能的正铁血红素。
[0066] 需要说明的是，测量对象物质只要为氧化还原酶的基质即可。例如，纤维二糖脱氢 酶可氧化纤维二糖，但也可氧化葡萄糖，因而也可使用葡萄糖作为测量对象物质。
[0067] 为了测量电荷迀移控速电流，优选使工作电极为"直接电子迀移型的酶电极"。此 处，所谓"直接电子迀移型的酶电极"是指下述类型的酶电极:在试剂层中通过酶反应产生 的电子在没有电子传递介体之类的氧化还原物质参与的情况下直接被传递至电极，从而进 行酶与电极间的电子转移。
[0068]需要说明的是，在生理学的反应体系中，产生直接电子迀移的极限距离可以说为 Inm~2nm。从而，按照从酶向电极的电子迀移不会受损的方式来配置酶是重要的。
[0069] 为了测量电荷迀移控速电流，在电极的附近配置氧化还原酶是重要的，作为用于 此的方法没有特别限制，例如可以举出将氧化还原酶化学固定化至电极的方法、使用粘结 剂等将氧化还原酶间接固定化至电极的方法、使氧化还原酶物理吸附至电极的方法等。
[0070] 工作电极上的酶试剂层可以包含导电性颗粒。通过包含导电性颗粒，能够期待电 子向电极更为适宜的传递。具体地说，导电性颗粒可以应用金、铂、银、钯之类的金属制颗 粒、或将碳作为材料的高阶结构体。高阶结构体可以包含例如导电性炭黑、碳纳米管(CNT)、 富勒稀之类的碳颗粒或碳微粒。作为导电性炭黑，可以举出科琴黑(Degussa制造 ）、Black Pearl (Cabot)等等。
[0071] 工作电极上的酶试剂层还可以包含导电性高分子。作为导电性高分子，优选为水 溶性的高分子，可以举出聚苯胺、聚乙撑二氧噻吩等，作为代表例，可以举出三菱丽阳制造 的磺化聚苯胺水溶液(商品名Aquapass)。
[0072] 在工作电极上的酶试剂层还可以包含粘结剂。作为粘结剂，优选水溶性粘结剂，具 体地说，可以举出含有噁唑啉基的水溶性聚合物等。
[0073] 上述这样的工作电极例如按如下方式来制作。即，在绝缘性基板的单面形成作为 电极发挥功能的碳层。例如，可以在规定厚度(例如IOOym左右)的膜状绝缘性基板的单面进 行碳油墨的丝网印刷，形成具有所期望的厚度(例如IOym左右）的碳膜。也可以不使用碳层， 而通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)进行金属材料的成膜从而形成具有所期 望的厚度(例如30nm左右）的金属层。
[0074] 接着，在电极上形成酶试剂层。首先制备包含氧化还原酶与导电性颗粒或导电性 高分子的溶液，将该溶液滴加到电极的表面。该溶液通过在电极上干燥而发生固化，从而能 够得到在电极上形成了酶试剂层的工作电极。
[0075] 作为反电极，只要为作为生物传感器的反电极而通常使用的电极即可，例如可以 使用通过丝网印刷进行成膜的碳电极、通过物理蒸镀(PVD，例如溅射)或化学蒸镀(CVD)进 行成膜的金属电极、通过丝网印刷进行成膜的银/氯化银电极。另外，还可以使用将银/氯化 银电极作为参比电极的3电极系。
[0076] 向电极施加电压的方法没有特别限制，为了有效地测量电荷迀移控速电流，优选 逐级施加。所施加的电压优选为600mV以下、更优选为IOOmV以下。下限没有特别限制，例如 为IOmV以上。
[0077] 测量对象物质的浓度可以基于式(5)由测量电流值计算出。
[0078]另外，还可以使用浓度已知的试样预先制作校正曲线，基于该校正曲线由测量电 流值计算出该浓度。另外，还可以通过将经过试验发现的校正系数乘以式(5)等，来计算出 被测物的浓度。这种情况下，在式(6)的常数项X中也包含校正系数。
[0079]利用本发明的测量方法，能够进行连续测量和间断测量中的任一种。
[0080] 接着，使用附图对本发明的测量装置进行说明。但是，本发明的测量装置并不限于 以下的方式。
[0081] 图7示出了容纳在测量装置2内的主要电子部件的构成例。图7所示的控制计算机 3、恒电位仪3A、电力供给装置21被设置在容纳于壳体内的基板3a上。
[0082]控制计算机3从硬件来说包含CPU(中央运算处理装置)之类的处理器、存储器(RAM (Random Access Memory，随机存取存储器）、R0M(Read Only Memory，只读存储器））之类的 记录介质、以及通信单元，处理器将记录介质（例如ROM)中存储的程序加载至RAM并运行，由 此，作为具备输出部20、控制部22、运算部23和检测部24的装置发挥功能。需要说明的是，控 制计算机3也可以包含半导体存储器(EEPROM，闪存)或硬盘之类的辅助存储装置。
[0083]控制部22对于电压施加的时机、施加电压值等进行控制。
[0084] 电力供给装置21具有电池26,向控制部计算机3或恒电位仪3A供给工作用的电力。 需要说明的是，电力供给装置21也可以设置在壳体的外部。
[0085] 恒电位仪3A为使工作电极的电位相对于参比电极固定的装置，其通过控制部22进 行控制，使用端子CR、W，在葡萄糖传感器4的反电极与工作电极之间通过逐级施加来施加规 定的电压，对在端子W得到的工作电极的响应电流进行测量，将响应电流的测量结果送到检 测部24。
[0086] 运算部23由检测出的电流值进行测量对象物质的浓度的运算并存储。输出部20与 显示部单元25之间 进行数据通信，将由运算部23得到的测量对象物质的浓度的运算结果发 送到显示部单元25。显示部单元25例如可以将由测量装置2接收到的葡萄糖浓度的运算结 果利用规定的格式显示在显示画面上。
[0087] 图8为示出利用控制计算机3进行的葡萄糖浓度测量处理的示例的流程图。
[0088] 在图8中，在控制计算机3的CPU(控制部22)受理葡萄糖浓度测量的开始指示时，控 制部22控制恒电位仪3A，通过逐级施加向工作电极施加规定的电压，开始测量来自工作电 极的响应电流(步骤S01)。需要说明的是，可以将检测到传感器向测量装置的安装作为浓度 测量开始指示。
[0089]接着，恒电位仪3A测量通过电压施加得到的响应电流，该响应电流即为基于来源 于试样内的测量对象物质(此处为葡萄糖)的电子向电极的迀移的电荷迀移控速电流，优选 为在双电层的充电所致的瞬态电流产生后例如在自电压施加起1~20秒后的稳态电流，将 测量的电流值送到检测部24(步骤S02)。
[0090] 运算部23基于电流值进行运算处理，计算出葡萄糖浓度（步骤S03)。例如，控制计 算机3的运算部23预先保存与配置在电极上的葡萄糖脱氢酶相对应的葡萄糖浓度的计算式 (基于上述式(5)或式(6)的计算式)或葡萄糖浓度的校正曲线数据，使用这些计算式或校正 曲线计算出葡萄糖浓度。
[0091] 输出部20将葡萄糖浓度的计算结果通过在其与显示部单元25之间形成的通信链 路发送到显示部单元25(步骤S04)。其后，控制部22对于测量错误的有无进行检测（步骤 S05)，若没有错误则终止测量，将葡萄糖浓度显示在显示部上。若有错误，则在进行错误显 示后，结束基于图8的流程的处理。另外，还能够将计算结果保存在运算部23中，并在之后调 用计算结果，显示在显示部上进行确认。需要说明的是，此处，是在计算结果向显示部单元 25的发送(步骤S04)之后利用控制部22进行测量错误检测（步骤S05)，但也可以对调这些步 骤的顺序。
[0092] 下面举出实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不限定于下述实施例的方 式。
[0093][实施例1]
[0094]下面使用葡萄糖传感器对生物传感器的实施例进行说明。
[0095]〈葡萄糖传感器的制造方法〉
[0096] 葡萄糖传感器的结构的一例示于图1。
[0097] 如图1所示，葡萄糖传感器1具有罩板10、隔板11和基板12。
[0098] 在罩板10设有孔部13,在隔板11设有与孔部13连通同时前端部14a敞开的细宽度 的缝隙14。在罩板10和隔板11被层叠在基板12的上表面12a的状态下，利用缝隙14限定出毛 细管15。该毛细管15藉由缝隙14的前开口部14a和孔部13与外部连通。前端开口部14a构成 试样液导入口 15a，从该试样液导入口 15a供给的试样液由于毛细管现象向着孔部13在毛细 管15内行进。
[0099]在基板12的上表面12a设有第1电极16、第2电极17、和试剂层18。
[0100] 第1和第2电极16、17作为整体在基板12的长边方向延伸，它们的端部16a、17a在基 板12的短边方向延伸。基板12的上表面12a以第1和第2电极16、17的端部16a、16b、17a、17b 露出的方式被绝缘膜19覆盖。
[0101] 试剂层18按照在第1和第2电极16、17的端部16a、17a间搭桥的方式进行设置。该试 剂层18包含葡萄糖脱氢酶。
[0102] 更具体地说，葡萄糖传感器通过下述方法制作。
[0103] 〈基底电极〉
[0104] 作为基底电极材料，使用导电性碳油墨(旭化成研究所制FTU系列），利用丝网印刷 方法在聚对苯二甲酸乙二醇酯基材（东丽制E-22)(长50mm、宽5mm、厚250μπι)的一个表面进 行该油墨的图案化印刷，形成2电极图案。此外，在实施例中，在一个电极上涂布银-氯化银 油墨(BAS社制造），以80°C干燥20分钟，形成银-氯化银电极，作为反电极。
[0105] 接下来，将绝缘性树脂聚酯油墨(旭化成研究所制UVF系列）在上述电极上进行丝 网印刷。由电极图案和绝缘图案形成的电极面积分别设定为0.5_ 2。
[0106] 〈酶试剂层的形成(实施例1、2)>
[0107]在电极上，制备包含含有细胞色素的葡萄糖脱氢酶(CyGDH)、导电性颗粒(炭黑:科 琴黑KJB)、作为导电助剂的导电性高分子(聚苯胺)和粘结剂(含有噁唑啉基的水溶性聚合 物）的酶试剂，在电极上滴加0.04yL，以100°C干燥30分钟，从而形成酶试剂层。酶试剂的最 终浓度如下。
[0108] 〈酶试剂的配方〉
[0109] * KJB：0.4wt%
[0110] ?酶（Cy ⑶ H):7mg/mL
[0111] ?磷酸钠缓冲液：IOmM pH7
[0112] ?粘结剂(EP0CR0S WS-700、日本触媒制造)5.0%(w/v)
[0113] ?聚苯胺(Aquapass、三菱丽阳制造)0.2%(w/v)
[0114] 需要说明的是，在实施例2中，不添加聚苯胺而添加蒸馏水，除此以外的配方与实 施例1相同。
[0115] 〈酶试剂层的形成(实施例3)>
[0116] 不使用Cy⑶H而使用基于PQQGDH的含有细胞色素的QHGDH(PQQGDH与细胞色素的融 合蛋白）。
[0117] 按照以下的配方制备酶试剂，在电极上滴加0.08yL，于100°C干燥2小时，从而形成 酶试剂层。
[0118]〈酶试剂的配方〉
[0119] · LION糊料(含有科琴黑:W-311N)(LI0N制造）：2.4wt%
[0120] ?酶（QHGDH): 2 · 3mg/mL
[0121 ] · HEPES缓冲液：20mM pH7
[0122] ?粘结剂(EP0CR0S WS-700、日本触媒制造)6.0%(w/v)
[0123] ?聚苯胺(Aquapass、三菱丽阳制造)0.4% (w/v)
[0124] [比较例]
[0125] 〈酶试剂层的形成(比较例)>
[0126] 在电极上，制备包含电子接受物质（钌氨络合物)和作为粘结剂的无机凝胶(蒙皂 石）的酶试剂(第一试剂），在电极上滴加〇.3yL，于30°C干燥10分钟，从而形成第一试剂层。 第一试剂的最终浓度如下。
[0127] 〈第一试剂的配方〉
[0128] ?蒙皂石(SWN、C〇-〇p 化学社制造）：0.3%(w/v)
[0129] · [Ru(NH3)6]Cl3(Aldrich制造）：5.0% (w/v)
[0130] 接下来，将5000U/mL的含有细胞色素的葡萄糖脱氢酶(CyGDH或QHGDH)的IOyL水溶 液分注在第一试剂层的上表面，于30°C干燥10分钟，从而形成酶试剂层。需要说明的是，在 比较例中，基底电极将利用与实施例1相同的方法制作的碳电极作为工作电极和反电极。
[0131] 〈毛细管形成〉
[0132] 实施例1、2、3和比较例中均利用下述的方法形成毛细管。
[0133] 在上述形成了酶试剂层的基底电极中，将具有开口部的隔板配置在绝缘层上，此 外，在上述隔板上配置具有作为空气孔的贯通孔的罩，制成葡萄糖传感器。夹在上述罩与绝 缘层之间的隔板的开口部的空间成为毛细管结构，因而将其作为试样供给部。
[0134]〈循环伏安法测量〉
[0135] 在实施例1、2和比较例中，通过研究循环伏安法波形来评价葡萄糖传感器的电极 响应特性。循环伏安法波形如下进行研究：在向葡萄糖传感器的试样供给部导入葡萄糖浓 度为lOOmg/dL的全血后，按照扫描速度为20mV/sec、施加电压为-200mV4+800mV--200mV 进行扫描，测量扫描时的响应电流，由此对循环伏安法波形进行研究。图2为通过测量得到 的循环伏安法波形。
[0136] 在循环伏安法测量中，在电极系进行扩散控速的情况下，最初，随着电极反应速度 的上升，电流上升，其后若电流呈扩散依赖性，则电流减少，从而，作为结果，显现出峰值。在 比较例中，明确显现出了基于扩散控速的峰值，在对实施例1和实施例2进行观察时，显示出 了未显现出明确的峰值、电流平稳地增加的趋势。从而可确认，在本发明中并非为扩散控 速、而为电荷迀移控速电 流。另外，由于无论有无导电性高分子均无法进行峰值的确认，因 而认为导电性高分子并不是改变电极系的控速过程的因子。从而，为了进行电荷迀移控速 电流的检测，可以使用导电性高分子、也可以不使用导电性高分子，但在包含导电性高分子 的实施例1中显示出了高电流值，因而可知导电性高分子具有提高响应灵敏度的效果。如上 可知，实施例1和2中均产生了电荷迀移控速电流，在实施例2的测量中也未产生不当状况。 在下述的试验中，作为代表例，使用实施例1的传感器进行评价。
[0137] 〈计时安培分析法测量〉
[0138] 利用计时安培分析法测量对葡萄糖传感器的电极响应特性进行评价。计时安培分 析法测量如下进行研究:在对葡萄糖传感器的试样导入部导入葡萄糖浓度为l〇〇mg/dL的全 血后，对工作电极逐级施加400mV，对响应电流进行测量。
[0139] 使用所制作的传感器进行计时安培分析法测量的结果示于图3。在实施例1和比较 例中，在电压施加后均流过瞬态电流。其是基于电极表面的双电层的充电的电流。所谓双电 层是在电极表面与溶液的界面处为了保持溶液侧的电气中和而由电解质离子的排列而产 生的层。在比较例的生物传感器中，在充电电流产生后，对于所观察到的基于扩散控速的 Cottrell电流，基于式（1)，确认到电流按IATt减少。另一方面，在使用实施例1的生物传感 器的情况下，尽管并非为微小电极系，但在充电电流产生后，迅速地检测到了稳态电流，通 过测量该稳态电流，能够对葡萄糖的浓度进行测量。本实施例中的测量电流并非为扩散控 速而为电荷迀移控速的，与基于扩散控速的测量相比，确认到能够进行短时间测量。
[0140] 〈计时安培分析法测量(电压参数)>
[0141] 在实施例1中，利用计时安培分析法测量对葡萄糖传感器的电极响应特性进行评 价。计时安培分析法测量如下进行研究：在对葡萄糖传感器的试样导入部导入葡萄糖浓度 为Omg/dL或者336mg/dL的全血后，对工作电极施加逐级电压，测量10秒后的响应电流。将测 量电压分别变为600、400、200、100、70mV进行测量。
[0142] 使用所制作的传感器进行计时安培分析法测量的结果示于图4。在各电压下，在葡 萄糖为336mg/dL时确认到同等水平的基于电荷迀移控速的稳态电流响应。另外，确认到葡 萄糖为Omg/dL时的电流值低，因而在各测量电压下能够进行葡萄糖的测量。在本测量中，利 用逐级电压施加10秒后的电流值进行了测量，由图4的结果确认到，在逐级电压施加后1~2 秒左右可以确认到稳态电流，特别是在施加电压低的70mV施加时，在1秒以内检测到稳态电 流，因而能够进行短时间测量。由图4还可知，通过降低施加电压，能够减小试样中所含有的 共存物质的氧化还原反应所致的背景电流，因而不仅能够缩短测量时间，而且还具有能够 抑制测量误差的效果。
[0143] 〈计时安培分析法测量~实施例3>
[0144] 利用计时安培分析法测量对使用QHGDH的葡萄糖传感器的电极响应特性进行评 价。计时安培分析法测量如下进行研究：在对葡萄糖传感器的试样导入部导入葡萄糖浓度 为Omg/dL或者600mg/dL的全血后，对工作电极逐级施加200mV，对响应电流进行测量。
[0145] 结果示于图5。在葡萄糖为600mg/dL确认到基于电荷迀移控速的稳态电流响应。另 一方面，在葡萄糖为Omg/dL时的电流值低，并非为稳态电流响应，因而可知，在使用含有细 胞色素的QHGDH制作的传感器中，也能够基于由葡萄糖所致的电荷迀移控速带来的稳态电 流响应进行葡萄糖浓度的测量。需要说明的是，得到由电荷迀移控速带来的稳态电流响应 的时间为15秒左右，认为其是由于酶的精炼度等的影响。
[0146] 〈理论式的检证〉
[0147] 对实施例1的传感器施加70mV的逐级电压，相对于10秒后测量的各葡萄糖浓度下 的电荷迀移控速的稳态电流值，进行在式(5)的理论式中在表1的条件下计算出的各葡萄糖 浓度下的稳态电流的理论值的计算结果的比较(图6)。
[0148]其结果可知，计算值(理论值）与测量结果非常一致。通过由理论值与测量结果的 误差确定校正系数并乘以式(5)等，也能够提高计算值(理论值)与测量结果的一致程度。需 要说明的是，在本测量方法中，在电压的逐级施加后测量了 10秒后的电流值，但如上所述， 在逐级电压施加后，当然可在1~2秒左右测量稳态电流。
[0149] 【表1】
[0150]
[0151] 【标号说明】
[0152] 1:葡萄糖传感器；10:罩板；11:隔板；12:基板；13:孔部；14:缝隙；15:毛细管；16: 第1电极；17:第2电极；18:试剂层；19:绝缘膜;2:测量装置;20:输出部;21:电力供给装置； 22:控制部;23:运算部;24:检测部;25:显示部单元;26:电池;3:控制计算机;3A:恒电位仪； 3a:基板;CR、W:端子;4:葡萄糖传感器。
【主权项】
1. 一种使用生物传感器的物质测量方法，该物质测量方法包括以下步骤： 将包含物质的试样导入至电化学测量池内，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝 缘性基板上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含氧化还原 酶的试剂层； 对电极施加电压； 对电荷迀移控速电流进行检测，该电荷迀移控速电流是来源于试样内的所述物质的电 子向电极迀移而产生的；以及 基于所述电荷迀移控速电流，确定试样中所含有的所述物质的浓度。2. 根据权利要求1所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 所述电荷迀移控速电流是双电层的充电所致的瞬态电流产生后的稳态电流。3. 根据权利要求1或2所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中，所述电流由下式 (6)表不，Λ:基质（S)的浓度(mol/cm3) Kcat/Km:酶反应速度常数 X:常数项。4. 根据权利要求1~3中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 氧化还原酶包含吡咯喹啉醌或黄素腺嘌呤二核苷酸。5. 根据权利要求1~4中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 氧化还原酶具有含有正铁血红素的亚单元或结构域。6. 根据权利要求1~5中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 氧化还原酶具有葡萄糖氧化活性。7. 根据权利要求1~6中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。8. 根据权利要求1~7中的任意一项所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 通过逐级施加来施加电压。9. 根据权利要求8所述的使用生物传感器的物质测量方法，其中， 施加600mV以下的电压。10. -种测量装置，其由下述部件构成： 生物传感器，其包含电化学测量池，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝缘性基板 上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含能够与试样中的测 量对象物质发生反应的氧化还原酶的试剂层； 控制部，其控制向生物传感器的电压施加； 检测部，其检测电荷迀移控速电流，该电荷迀移控速电流是向生物传感器施加电压而 得到的，基于来源于所述物质的电子向电极的迀移； 运算部，其由所述电流值计算出所述物质的浓度；以及 输出部，其输出所述计算出的所述物质的浓度。11. 根据权利要求10所述的测量装置，其中， 所述控制部控制为通过逐级施加来施加电压。12. 根据权利要求10或11所述的测量装置，其中， 所述物质为葡萄糖、氧化还原酶为葡萄糖脱氢酶。
【专利摘要】使用生物传感器的物质测量方法，该物质测量方法包括以下步骤：将包含物质的试样导入至电化学测量池内，该电化学测量池包含绝缘性基板、在该绝缘性基板上形成的2个以上的电极、以及配置在该电极中的至少1个电极上且包含氧化还原酶的试剂层；对电极施加电压；对电荷迁移控速电流进行检测，该电荷迁移控速电流是通过来源于试样内的所述物质的电子向电极的迁移而产生的；以及基于所述电荷迁移控速电流，确定试样中所含有的所述物质的浓度。
【IPC分类】G01N27/416, G01N27/327
【公开号】CN105492902
【申请号】CN201480044602
【发明人】胜木幸治
【申请人】爱科来株式会社, 日本生物工程研究所有限责任公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年8月7日
【公告号】EP3032250A1, US20160177365, WO2015020149A1
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