抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法
抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制剂领域，尤其是一种抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法。
【背景技术】
[0002]鸡传染性喉气管炎(ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性接触性呼吸道传染病。鸡传染性喉气管炎按症状表现可分为喉气管炎型和眼型，雏鸡发病多表现为眼型。该病以呼吸困难、咳嗽和咳出血样渗出物或黄色干酪样假膜为特征，受侵害的气管粘膜肿胀、水肿，导致糜烂和出血，发病率接近100 %，死亡率50 %?70 %，蛋鸡产蛋量明显下降。给养禽业造成了巨大的损失，是集约化养鸡场的重要疫病之一。
[0003]喉气管炎型的病鸡表现为精神沉郁、食欲下降、流涕、有湿啰音，呼吸极为困难，病鸡鸡冠、肉髯紫红色，排灰白色、绿色粪便、产蛋鸡产蛋率下降。眼型病鸡表现为流鼻涕，目艮睑红肿，有泡沫样分泌物，眼内有浆液性或脓性分泌物，上下眼睑黏连等症状，病程持续时间较长，可达2-3个月。该病主要在秋冬季节和早春极易发生，多发于成年鸡，病因极其复杂。病鸡主要通过呼吸道分泌物排出病毒，经空气传播；被病毒污染的蛋、饲料、饮水、用具等也会传染。本病除经水平传播外，还可经卵垂直传播，鸡场一旦发生本病，很容易造成连年发生。
[0004]目前尚无治疗本病的的特效药，通常采用消除病因、提高机体抗病能力等对症综合疗法，以缓解症状，减少并发症的发生治疗方法。此法虽对控制本病有一定的效果，但对发病较重的鸡则效果甚微。发病鸡群主要以投服抗菌药物为主，该项措施对防止继发感染有一定作用，但是该方法不能起到预防作用。对于鸡传染性喉气管炎病的易感鸡群，每年定期对鸡接种鸡传染性喉气管炎疫苗是预防鸡传染性喉气管炎的有效方法。其次应增强营养或药物干预，提高自身免疲力。通过药物提高机体抵抗力或调节免疫力也是一种预防鸡传染性喉气管炎的有效方法，转移因子可起到此作用。
[0005]转移因子(Transferfactor, TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能，被誉为T细胞活性的触发剂、细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体特异性和非特异性细胞免疫功能等作用，可以抵抗真菌、病毒等非细菌性感染。TF含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无毒副作用和无种属差异，是一种新型而又安全的免疫制剂。
[0006]目前转移因子的生产主要是通过半透膜透析得到，一次性生产量少，操作费用高，因此需要一种高效、快速、经济的方法来获取转移因子，进而实现转移因子的大规模工业化生产。除此之外，猪脾脏、胸腺以及淋巴结组织作为免疫活性细胞聚集的场所，且是活猪宰杀后的下脚料，成本较低而且材料来源非常广泛，因此从这类细胞中提取特异性转移因子，有重要的理论意义和现实意义。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法。
[0008]本发明抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法，按照以下步骤进行:
[0009](I)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚尿囊液中，330C _37°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-200C一-40°C冰箱内保存备用；
[0010](2)提取病毒抗原:将步骤(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15-20min，4°C、5000rpm离心20_30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4°C、7000rpm离心20_30min,弃去沉淀，收集上清液,经4°C、25000rpm离心20_30min,弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、15000-20000rpm离心2-4h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于_20°C—-400C冰箱内保存备用；
[0011](3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫3-4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_20°C—-40°C保存，备用；
[0012](4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子:
[0013]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0014]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0015]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融4-8次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0016]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0017]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0018]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.1-0.22um的滤膜加压过滤除菌；
[0019]⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
[0020]本发明的优点及有益效果是:
[0021](I)原材料来源丰富、无污染、成本低。猪脾脏、胸腺以及淋巴结组织属于屠宰后猪的下脚料。
[0022](2)破碎组织后，加入低温冻融处理的步骤，特别是在37°C以下溶解，不使小分子物质活性丧失，并能够使鸡传染性喉气管炎病毒转移因子得以充分地提取。
[0023](3)工艺采用了比较先进的中空纤维超滤膜超过滤法，从而缩短了制备时间，保证物质分离过程中活性不被破坏。
[0024](4)提取物经生化测定和若干成分分析，是一种低分子量多肽-核苷酸复合物，是一种不含蛋自质、可溶的小分子物质，平均分子量在5000道尔顿以下。经体内外生物活性试验以及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、免疫活性强、起效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗效确切，安全可靠，既可治疗又可增强抗病能力。该提取物可做成口服液或注射液等剂型，便于应用。
[0025]本发明的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子可以全面或部分抑制鸡传染性喉气管炎病毒，能保护正常机体细胞免受病毒感染。因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸡传染性喉气管炎病毒感染、能够保护正常机体细胞免受鸡传染性喉气管炎病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭到鸡传染性喉气管炎病毒感染的鸡使用转移因子进行治疗，可有效的改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。
【具体实施方式】
[0026]本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是:下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0027]实施例1
[0028]抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备:
[0029](I)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊液中，37°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-20°C冰箱内保存备用；
[0030](2)提取病毒抗原:将(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声20min, 4°C、5000rpm离心30min,弃去沉淀,收集上清液,将上清液经4°C、7000rpm离心20min,弃去沉淀,收集上清液,经4°C、25000rpm离心30min,弃去上清液,取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、ISOOOrpm离心4h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C冰箱内保存备用；
[0031](3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫8天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至-20°C保存，备用；
[0032](4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子:
[0033]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0034]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0035]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融6次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0036]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0037]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0038]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.22 μ m的滤膜加压过滤除菌；
[0039]⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
[0040]实施例2
[0041]抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备:
[0042](I)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9日龄的鸡胚尿囊液中，33°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成 悬液，_20°C冰箱内保存备用；
[0043](2)提取病毒抗原:将(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15min, 4°C、5000rpm离心20min,弃去沉淀,收集上清液,将上清液经4°C、7000rpm离心20min,弃去沉淀,收集上清液,经4°C、25000rpm离心20min,弃去上清液,取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、15000rpm离心2h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C°C冰箱内保存备用；
[0044](3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_20°C °C保存，备用；
[0045](4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子:
[0046]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0047]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0048]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融4次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0049]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0050]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0051]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.22um的滤膜加压过滤除菌；
[0052]⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
[0053]实施例3
[0054]抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备:
[0055](I)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚尿囊液中，35°C°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-40°C冰箱内保存备用；
[0056](2)提取病毒抗原:将(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声20min, 4°C、5000rpm离心30min,弃去沉淀,收集上清液,将上清液经4°C、7000rpm离心30min,弃去沉淀,收集上清液,经4°C、25000rpm离心30min,弃去上清液,取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、20000rpm离心4h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于-40°C冰箱内保存备用；
[0057](3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫8天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_40°C保存，备用；
[0058](4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子:
[0059]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0060]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0061]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融8次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0062]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0063]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0064]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.22um的滤膜加压过滤除菌；
[0065]⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
[0066]对本发明所述工艺制备的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的检测
[0067]对实施例1所述工艺制备的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子(下称“本品”)进行以下检测:
[0068](I)紫外线分光光度测定:本品在250.0-260.0nm处有一高吸收峰，且ABS260/ABS280>2.0。
[0069](2)标准液为淡黄色，pH值在6.0-6.7之间。
[0070](3) 20%磺基水杨酸检测:本品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均为阴性，其不含大分子蛋白质。
[0071](4)多肽含量测定:本品经双缩脉法测定多肽含量为1.811mg/ml。
[0072](5)核酸含量测定:本品经地衣酚法测定核酸含量为676.42 μ g/ml。
[0073](6)细菌学检测:本品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。
[0074](7)E-玫瑰花结形成率比较:鸡外周血林巴细胞表面有鼠红细胞受体，并能与之结合形成E-玫瑰花结，而转移因子对淋巴细胞和大鼠红细胞的结合有一定的促进作用。本品的E-玫瑰花结形成率平均为37.5%，比对照组的增加28.1% (P彡0.01)。
[0075](8)取健康小白鼠10只，口服本品浓缩液，相当于正常口服液剂量的50倍，观察小白鼠的生存能力变化，结果:无任何毒性反应，也无死亡现象出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。
[0076](9)用pro做家兔皮试实验，发现本品具有转移免疫活性的功能。
[0077](10)用鸡传染性喉气管炎病毒抗原做皮试检测，有微弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。
[0078]本发明所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子可制作成口服液或注射液剂型。若应用常规冻干工艺，可进一步得到抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的粉末，结合常规辅料，可制成胶囊、片剂等剂型。
【主权项】
1.一种抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行: (1)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚尿囊液中，330C _37°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-200C一-40°C冰箱内保存备用； (2)提取病毒抗原:将步骤(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15-20min，4°C、5000rpm离心20_30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4°C、7000rpm离心20_30min,弃去沉淀，收集上清液,经4°C、25000rpm离心20_30min,弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、15000-20000rpm离心2_4h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于_20°C—-400C冰箱内保存备用； (3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫3-4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_20°C—-40°C保存，备用； (4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子: ①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗； ②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液； ③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融4-8次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎； ④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟,取上层血红色液体,再用G2砂心漏斗过滤，取滤液； ⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子； ⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.1-0.22um的滤膜加压过滤除菌； ⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
【专利摘要】本发明涉及一种抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法。本发明按照以下步骤进行：将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9-11日龄鸡胚的尿囊液制备病毒抗原；提取鸡喉气管炎病毒抗原；用上述提取的病毒抗原免疫猪；从免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子。因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸡传染性喉气管炎病毒感染、能够保护正常机体细胞免受鸡传染性喉气管炎病毒侵害的作用，从而降低发病率。
【IPC分类】A61P31/20, A61K38/02, C07K1/34
【公开号】CN105497867
【申请号】CN201410503521
【发明人】陈庆忠, 安同伟, 刘芳
【申请人】天津嘉瑞生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月26日
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制剂领域，尤其是一种抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法。
【背景技术】
[0002]鸡传染性喉气管炎(ILT)是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的一种急性接触性呼吸道传染病。鸡传染性喉气管炎按症状表现可分为喉气管炎型和眼型，雏鸡发病多表现为眼型。该病以呼吸困难、咳嗽和咳出血样渗出物或黄色干酪样假膜为特征，受侵害的气管粘膜肿胀、水肿，导致糜烂和出血，发病率接近100 %，死亡率50 %?70 %，蛋鸡产蛋量明显下降。给养禽业造成了巨大的损失，是集约化养鸡场的重要疫病之一。
[0003]喉气管炎型的病鸡表现为精神沉郁、食欲下降、流涕、有湿啰音，呼吸极为困难，病鸡鸡冠、肉髯紫红色，排灰白色、绿色粪便、产蛋鸡产蛋率下降。眼型病鸡表现为流鼻涕，目艮睑红肿，有泡沫样分泌物，眼内有浆液性或脓性分泌物，上下眼睑黏连等症状，病程持续时间较长，可达2-3个月。该病主要在秋冬季节和早春极易发生，多发于成年鸡，病因极其复杂。病鸡主要通过呼吸道分泌物排出病毒，经空气传播；被病毒污染的蛋、饲料、饮水、用具等也会传染。本病除经水平传播外，还可经卵垂直传播，鸡场一旦发生本病，很容易造成连年发生。
[0004]目前尚无治疗本病的的特效药，通常采用消除病因、提高机体抗病能力等对症综合疗法，以缓解症状，减少并发症的发生治疗方法。此法虽对控制本病有一定的效果，但对发病较重的鸡则效果甚微。发病鸡群主要以投服抗菌药物为主，该项措施对防止继发感染有一定作用，但是该方法不能起到预防作用。对于鸡传染性喉气管炎病的易感鸡群，每年定期对鸡接种鸡传染性喉气管炎疫苗是预防鸡传染性喉气管炎的有效方法。其次应增强营养或药物干预，提高自身免疲力。通过药物提高机体抵抗力或调节免疫力也是一种预防鸡传染性喉气管炎的有效方法，转移因子可起到此作用。
[0005]转移因子(Transferfactor, TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能，被誉为T细胞活性的触发剂、细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体特异性和非特异性细胞免疫功能等作用，可以抵抗真菌、病毒等非细菌性感染。TF含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无毒副作用和无种属差异，是一种新型而又安全的免疫制剂。
[0006]目前转移因子的生产主要是通过半透膜透析得到，一次性生产量少，操作费用高，因此需要一种高效、快速、经济的方法来获取转移因子，进而实现转移因子的大规模工业化生产。除此之外，猪脾脏、胸腺以及淋巴结组织作为免疫活性细胞聚集的场所，且是活猪宰杀后的下脚料，成本较低而且材料来源非常广泛，因此从这类细胞中提取特异性转移因子，有重要的理论意义和现实意义。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法。
[0008]本发明抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法，按照以下步骤进行:
[0009](I)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚尿囊液中，330C _37°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-200C一-40°C冰箱内保存备用；
[0010](2)提取病毒抗原:将步骤(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15-20min，4°C、5000rpm离心20_30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4°C、7000rpm离心20_30min,弃去沉淀，收集上清液,经4°C、25000rpm离心20_30min,弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、15000-20000rpm离心2-4h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于_20°C—-400C冰箱内保存备用；
[0011](3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫3-4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_20°C—-40°C保存，备用；
[0012](4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子:
[0013]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0014]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0015]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融4-8次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0016]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0017]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0018]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.1-0.22um的滤膜加压过滤除菌；
[0019]⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
[0020]本发明的优点及有益效果是:
[0021](I)原材料来源丰富、无污染、成本低。猪脾脏、胸腺以及淋巴结组织属于屠宰后猪的下脚料。
[0022](2)破碎组织后，加入低温冻融处理的步骤，特别是在37°C以下溶解，不使小分子物质活性丧失，并能够使鸡传染性喉气管炎病毒转移因子得以充分地提取。
[0023](3)工艺采用了比较先进的中空纤维超滤膜超过滤法，从而缩短了制备时间，保证物质分离过程中活性不被破坏。
[0024](4)提取物经生化测定和若干成分分析，是一种低分子量多肽-核苷酸复合物，是一种不含蛋自质、可溶的小分子物质，平均分子量在5000道尔顿以下。经体内外生物活性试验以及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、免疫活性强、起效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗效确切，安全可靠，既可治疗又可增强抗病能力。该提取物可做成口服液或注射液等剂型，便于应用。
[0025]本发明的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子可以全面或部分抑制鸡传染性喉气管炎病毒，能保护正常机体细胞免受病毒感染。因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸡传染性喉气管炎病毒感染、能够保护正常机体细胞免受鸡传染性喉气管炎病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭到鸡传染性喉气管炎病毒感染的鸡使用转移因子进行治疗，可有效的改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。
【具体实施方式】
[0026]本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是:下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0027]实施例1
[0028]抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备:
[0029](I)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊液中，37°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-20°C冰箱内保存备用；
[0030](2)提取病毒抗原:将(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声20min, 4°C、5000rpm离心30min,弃去沉淀,收集上清液,将上清液经4°C、7000rpm离心20min,弃去沉淀,收集上清液,经4°C、25000rpm离心30min,弃去上清液,取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、ISOOOrpm离心4h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C冰箱内保存备用；
[0031](3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫8天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至-20°C保存，备用；
[0032](4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子:
[0033]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0034]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0035]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融6次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0036]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0037]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0038]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.22 μ m的滤膜加压过滤除菌；
[0039]⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
[0040]实施例2
[0041]抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备:
[0042](I)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9日龄的鸡胚尿囊液中，33°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成 悬液，_20°C冰箱内保存备用；
[0043](2)提取病毒抗原:将(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15min, 4°C、5000rpm离心20min,弃去沉淀,收集上清液,将上清液经4°C、7000rpm离心20min,弃去沉淀,收集上清液,经4°C、25000rpm离心20min,弃去上清液,取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、15000rpm离心2h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C°C冰箱内保存备用；
[0044](3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_20°C °C保存，备用；
[0045](4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子:
[0046]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0047]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0048]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融4次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0049]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0050]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0051]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.22um的滤膜加压过滤除菌；
[0052]⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
[0053]实施例3
[0054]抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备:
[0055](I)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚尿囊液中，35°C°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-40°C冰箱内保存备用；
[0056](2)提取病毒抗原:将(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声20min, 4°C、5000rpm离心30min,弃去沉淀,收集上清液,将上清液经4°C、7000rpm离心30min,弃去沉淀,收集上清液,经4°C、25000rpm离心30min,弃去上清液,取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15%、30%、45%、60%及80%的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、20000rpm离心4h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于-40°C冰箱内保存备用；
[0057](3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫8天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_40°C保存，备用；
[0058](4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子:
[0059]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0060]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0061]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融8次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0062]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0063]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0064]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.22um的滤膜加压过滤除菌；
[0065]⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
[0066]对本发明所述工艺制备的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的检测
[0067]对实施例1所述工艺制备的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子(下称“本品”)进行以下检测:
[0068](I)紫外线分光光度测定:本品在250.0-260.0nm处有一高吸收峰，且ABS260/ABS280>2.0。
[0069](2)标准液为淡黄色，pH值在6.0-6.7之间。
[0070](3) 20%磺基水杨酸检测:本品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均为阴性，其不含大分子蛋白质。
[0071](4)多肽含量测定:本品经双缩脉法测定多肽含量为1.811mg/ml。
[0072](5)核酸含量测定:本品经地衣酚法测定核酸含量为676.42 μ g/ml。
[0073](6)细菌学检测:本品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。
[0074](7)E-玫瑰花结形成率比较:鸡外周血林巴细胞表面有鼠红细胞受体，并能与之结合形成E-玫瑰花结，而转移因子对淋巴细胞和大鼠红细胞的结合有一定的促进作用。本品的E-玫瑰花结形成率平均为37.5%，比对照组的增加28.1% (P彡0.01)。
[0075](8)取健康小白鼠10只，口服本品浓缩液，相当于正常口服液剂量的50倍，观察小白鼠的生存能力变化，结果:无任何毒性反应，也无死亡现象出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。
[0076](9)用pro做家兔皮试实验，发现本品具有转移免疫活性的功能。
[0077](10)用鸡传染性喉气管炎病毒抗原做皮试检测，有微弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移活性和特异性。
[0078]本发明所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子可制作成口服液或注射液剂型。若应用常规冻干工艺，可进一步得到抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的粉末，结合常规辅料，可制成胶囊、片剂等剂型。
【主权项】
1.一种抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行: (1)制备病毒抗原:将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚尿囊液中，330C _37°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-200C一-40°C冰箱内保存备用； (2)提取病毒抗原:将步骤(I)中得到的悬液反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15-20min，4°C、5000rpm离心20_30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4°C、7000rpm离心20_30min,弃去沉淀，收集上清液,经4°C、25000rpm离心20_30min,弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、15000-20000rpm离心2_4h，根据鸡传染性喉气管炎病毒的分子量确定鸡传染性喉气管炎病毒所在位置，吸出并置于_20°C—-400C冰箱内保存备用； (3)将步骤(2)制备病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取步骤(2)制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫3-4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_20°C—-40°C保存，备用； (4)从步骤(3)得到的免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子: ①原材料的制备及预处理:取步骤(3)接种鸡喉气管炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗； ②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液； ③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融4-8次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎； ④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30分钟,取上层血红色液体,再用G2砂心漏斗过滤，取滤液； ⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子； ⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.1-0.22um的滤膜加压过滤除菌； ⑦分装:4°C密封保存，即得所述的抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子提取液。
【专利摘要】本发明涉及一种抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子的制备方法。本发明按照以下步骤进行：将鸡传染性喉气管炎病毒接种于9-11日龄鸡胚的尿囊液制备病毒抗原；提取鸡喉气管炎病毒抗原；用上述提取的病毒抗原免疫猪；从免疫猪中提取抗鸡传染性喉气管炎病毒转移因子。因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸡传染性喉气管炎病毒感染、能够保护正常机体细胞免受鸡传染性喉气管炎病毒侵害的作用，从而降低发病率。
【IPC分类】A61P31/20, A61K38/02, C07K1/34
【公开号】CN105497867
【申请号】CN201410503521
【发明人】陈庆忠, 安同伟, 刘芳
【申请人】天津嘉瑞生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月26日
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