一种新颖的纳米人工红细胞、人工血液及其制备方法
一种新颖的纳米人工红细胞、人工血液及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明是关于一种新颖的纳米人工红细胞、人工血液及其制备方法，以应用于解决体内供氧问题。
【背景技术】
[0002]临床输血的应用已非常广泛，但目前输血仍存在诸多问题:1.血液可能携带病原体(肝炎病毒、HIV等)，一些疾病可能通过输血传播;2.血型不匹配导致凝集反应，可威胁被输血人的生命;3.血液来源短缺;4.血液的储存时间短(42天)。近来，纳米技术使人工氧载体得到快速发展，引起人们广泛关注。人工氧载体是具有载氧功能的纳米/微米尺寸的颗粒，可大规模合成，并且不会导致交叉感染和凝集反应。目前临床上已经有多种人工氧载体产品作为血液代用品得到应用，这些氧载体包括全氟碳化合物、聚血红蛋白、交联血红蛋白、血红蛋白脂质体等。
[0003]全氟碳化合物因其疏水性难与血浆混合，生物相容性较差，且存在严重副作用。聚血红蛋白与交联血红蛋白，由于血红蛋白分子没有纳米颗粒的保护，不易维持血红蛋白在体内的功能稳定性，而且容易被机体清除。血红蛋白脂质体在体内的结构稳定性较差，所包裹血红蛋白易泄露。
[0004]“脂质体包封猪血红蛋白的制备及评价”(梁培德)公开了关于一种脂质体包封猪血红蛋白的技术，具体是采用卵磷脂包封猪血红蛋白，对工艺条件进行了优化，包封率稳定在(41.87±0.46)%。
[0005]“基于脂质体包封血红蛋白构建人工红细胞的工艺研究及其评价”(谢家馨)、“人工红细胞及微囊包被血红蛋白的制备与鉴定”(樊晶，王学谦，《中国输血杂志》2004年02期)公开了一种脂质体包封血红蛋白的技术，其中，首先通过低渗法制备高纯度、高浓度的膜蛋白，然后根据界面缩聚法的原理，利用匀速微囊制备喷头，将含有2，3-DPG、膜蛋白和血红蛋白水相直接滴入到含磷脂的植物油中，通过高速搅拌使囊心物(2，3-DPG与血红蛋白单体、二聚体构建的不稳定的四聚体)的周围形成单个球状膜壳型微囊。其中，谢家馨报道的人工红细胞的包埋率为53%，樊晶等人报道的人工红细胞的包埋率为27.7%。
[000?]基于目如的现有技术状况，仍有待进一步提尚人工红细胞的包封率，提尚人工血液的稳定性。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的在于提供一种新颖的结构稳定的纳米人工红细胞。
[0008]本发明的另一目的在于提供所述纳米人工红细胞的制备方法，提高人工红细胞的包封率和稳定性。
[0009]本发明的另一目的在于提供一种含有所述纳米人工红细胞的人工血液。
[0010]—方面，本发明提供了一种纳米人工红细胞，该纳米人工红细胞采用血红蛋白作为载氧分子，血红蛋白被聚合物包载形成核心；核心外采用用聚乙二醇分子修饰的磷脂分子层模拟细胞膜保护血红蛋白分子;并且，该纳米人工红细胞的尺寸为50-200nm。
[0011]根据本发明的具体实施方案，本发明的纳米人工红细胞中，所述血红蛋白为动物血红蛋白分子，例如牛血红蛋白分子或猪血红蛋白分子。血红蛋白采用动物血液提取的血红蛋白，能以高亲和力结合氧气分子，在体内可逆地将氧气释放，能替代血液输送氧气的功能。本发明采用聚合物分子包载动物血红蛋白分子作为核心;核心外为磷脂分子层，并以聚乙二醇分子修饰以获得良好生物相容性和长循环效果。
[0012]另一方面，本发明还提供了一种纳米人工红细胞的制备方法，该方法包括:
[0013]卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白加入乙醇水溶液中；其中，卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白的质量比为300?350: 200?300: 1500?2000 ；优选地，其中，卵磷脂在乙醇水溶液中的浓度为80?150yg/mL，更优选为100?120yg/mL;所述乙醇水溶液为浓度3?5 %的乙醇水溶液；
[0014]将浓度I?3mg/mL的PLGA的乙腈溶液逐滴加入到上述含有卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白的乙醇水溶液中，采用超声波细胞破碎仪以1?30kHz的频率及15?70W的功率超声5?1min，制得棕红色溶液；
[0015]超滤，并进行脱氧处理，得到所述纳米人工红细胞。
[0016]根据本发明的具体实施方案，本发明的纳米人工红细胞的制备方法中，超声处理时，同时监控制备时的液体温度，利用冰浴将温度控制在40摄氏度以下，防止血红蛋白受热变性。
[0017]根据本发明的具体实施方案，本发明的纳米人工红细胞的制备方法中，所述超滤采用10kDa的超滤管进行，离心超滤两次。其中，优选的离心条件为5000?7500r/min，每次离心5?1min0
[0018]根据本发明的具体实施方案，本发明的纳米人工红细胞的制备方法中，脱氧处理是通过将氮气通入人工血液(放置于有导气系统的密闭环境中)进行脱氧处理。
[0019]本发明的纳米人工红细胞在脱氧状态下可储存两年以上，在充入氧气后，可替代血液载氧功能。
[0020]另一方面，本发明还提供了一种人工血液，其中包括本发明所述的纳米人工红细胞。优选地，所述纳米人工红细胞的浓度为0.15?0.25mmol/L。
[0021]此外，所述人工血液还包括Na2HP04、KH2P04、NaCl和超纯水等血液中的常规组分。这些常规组分的用量可参照现有技术进行。
[0022]例如，在本发明的一具体实施方案中，本发明的人工血液包括以下组分:
[0023]纳米人工红细胞(血红蛋白浓度0.2mmol/L)、Na2HP04( 10mmol/L)、KH2P04(2mmol/L)、NaCl(137mmol/L)和KCl(2.7mmol/L)、超纯水余量。本发明的人工血液可以是将所述组分充分混合后配制得到。
[0024]本发明的有益技术效果:
[0025]本发明中采用动物血红蛋白作为载氧分子，不会引起交叉感染和凝集反应;可大规模合成，结构稳定，储存时间可达两年以上。血红蛋白分子得到纳米人工红细胞的保护，包封率高，不易泄露，功能稳定性好。且该纳米人工红细胞在缺氧环境中能稳定释放所载的氧气，在体内具有良好的生物相容性、结构稳定性和功能稳定性，高效地为机体输送氧气，且不会导致明显的副作用。本发明的制备方法简便易行，便于操作推广。
【附图说明】
[0026]图1为本发明的人工血液中纳米人工红细胞的透射电子显微镜照片。
[0027]图2为相比于通氧纯净水和通氧游离血红蛋白，纳米人工红细胞在缺氧环境的溶解氧浓度曲线。
[0028]图3显示本发明的人工血液的酸稳定性测试结果。
[0029]图4显示本发明的人工血液的热稳定性测试结果。
【具体实施方式】
[0030]为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0031]实施例1:纳米人工红细胞的制备
[0032]PLGA溶于乙腈中，浓度为2mg/mL ； 300yg卵磷脂、20 0yg DSPE-PEG(2000)、1500yg血红蛋白加入3mL 4%乙醇水溶液中；ImL PLGA乙腈溶液逐滴加入4%乙醇水溶液中，期间采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率及35W的功率超声5min(同时监控制备时的液体温度，利用冰浴将温度控制在40摄氏度以下，防止血红蛋白受热变性)，制得棕红色溶液。采用10kDa的超滤管5000r/min离心超滤两次(每次离心1min)，并通入氮气做脱氧处理，即得纳米人工红细胞。
[0033]图1为本发明的人工血液中纳米人工红细胞的透射电子显微镜照片。其粒径通过粒度分析仪测得平均粒径为70nm。本实施例中，对血红蛋白的包封率为86.18 ± 2.37 %。
[0034]实施例2:纳米人工红细胞的制备
[0035]PLGA溶于乙腈中，浓度为2mg/mL;350yg卵磷脂、200yg DSPE_PEG(5000)、2000yg血红蛋白加入3mL 4%乙醇水溶液中；ImL PLGA乙腈溶液逐滴加入4%乙醇水溶液中，期间采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率及35W的功率超声5min(同时监控制备时的液体温度，利用冰浴将温度控制在40摄氏度以下，防止血红蛋白受热变性)，制得棕红色溶液。采用10kDa的超滤管7000r/min离心超滤两次(每次离心5min)，并通入氮气做脱氧处理，即得纳米人工红细胞。其粒径通过粒度分析仪测得平均粒径为70nm。本实施例中，对血红蛋白的包封率为 72.23±4.14%。
[0036]实施例3:纳米人工红细胞的制备
[0037]参照实施例1，改变超声波功率为65W，制得纳米人工红细胞。其粒径通过粒度分析仪测得平均粒径为62nm。本实施例中，对血红蛋白的包封率为76.24± 1.77%。
[0038]纳米人工红细胞的性能测试:
[0039]直径35mm、高50mm的附有通气导管的带塞广口瓶，加入1mL纯净水;将氮气通入纯净水脱氧，使溶解氧浓度低于0.4mg/L。另一个广口瓶中，将氧气通过导管通入纳米人工红细胞溶液中(其中含实施例1的纳米人工红细胞0.2mmol/L)，使其载氧，溶液中溶解氧浓度高于30mg/L。将ImL充氧的纳米人工红细胞溶液以注射器注入脱氧纯净水中，混合均匀后在密闭环境下检测溶解氧浓度以观察纳米人工红细胞的氧气释放曲线。
[0040]图2为相比于通氧纯净水和通氧游离血红蛋白，纳米人工红细胞在缺氧环境的溶解氧浓度曲线。实验结果显示，纳米人工红细胞在缺氧环境中能稳定释放所载的氧气，2小时后能使体系的溶解氧浓度达到7.7mg/L0
[0041]以实施例1的纳米人工红细胞配制成人工血液，该人工血液配方为:纳米人工红细胞(血红蛋白浓度0.2mmo I/L)、Na2HPO4(1mmoI/L)、KH2PO4(2mmoI/L)、NaCI (137mmo I/L)和KCl(2.7mmol/L)、超纯水余量。将人工红细胞以配方配制成人工血液后，充氧至溶解氧浓度30mg/L以上，之后通过滴加盐酸调节pH。图3显示该人工血液与作为对照的游离血红蛋白溶液的酸稳定性测试结果。图中从左至右的两个样品分别为游离血红蛋白溶液、本发明的人工血液，可以看出，本发明的人工血液在弱酸性环境(pH = 6.7)中不会沉淀，载氧能力没有损失;而对照样品在弱酸性条件下出现蛋白沉淀。
[0042]以实施例1的纳米人工红细胞配制成人工血液，该人工血液配方为:纳米人工红细胞(血红蛋白浓度0.2mmo I/L)、Na2HPO4(1mmoI/L)、KH2PO4(2mmoI/L)、NaCI (137mmo I/L)和KCl(2.7mmol/L)、超纯水余量。将人工红细胞以配方配制成人工血液后，充氧至溶解氧浓度30mg/L以上，之后测定样品在室温25摄氏度及加热至60摄氏度下的稳定性。图4显示该人工血液与作为对照的游离血红蛋白溶液的热稳定性测试结果。图中从左至右的两个样品分别为游离血红蛋白溶液、本发明的人工血液，可以看出，本发明的人工血液在高热环境(60摄氏度)中不会发生血红蛋白的变性，载氧能力没有损失;而对照样品在高温条件下出现蛋白变性。
[0043]另，将实施例1、实施例2、实施例3的纳米人工红细胞于2?6摄氏度冷藏条件下储存，储存时间达两年，纳米人工红细胞的载氧能力无显著下降，功能稳定性好。
【主权项】
1.一种纳米人工红细胞，该纳米人工红细胞采用血红蛋白作为载氧分子，血红蛋白被聚合物包载形成核心;核心外采用用聚乙二醇分子修饰的磷脂分子层模拟细胞膜保护血红蛋白分子;并且，该纳米人工红细胞的尺寸为50-200nm。2.根据权利要求1所述的纳米人工红细胞，其中，所述血红蛋白为动物血红蛋白。3.一种纳米人工红细胞的制备方法，该方法包括: 卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白加入乙醇水溶液中；其中，卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白的质量比为 300 ?350: 200 ?300: 1500 ?2000 ； 将浓度I?3mg/mL的PLGA的乙腈溶液逐滴加入到上述含有卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白的乙醇水溶液中，采用超声波细胞破碎仪以10?30kHz的频率及15?70W的功率超声5?1min，制得棕红色溶液； 超滤，并进行脱氧处理，得到所述纳米人工红细胞。4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述卵磷脂在乙醇水溶液中的浓度为80?.150yg/mL.5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其中，所述乙醇水溶液为浓度3?5%的乙醇水溶液。6.根据权利要求3所述的制备方法，其中，超声处理时，同时监控制备时的液体温度，利用冰浴将温度控制在40摄氏度以下。7.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述超滤采用10kDa的超滤管进行，离心超滤两次。8.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述脱氧处理是通过通入氮气进行脱氧处理。9.一种人工血液，其中包括权利要求1或2所述的纳米人工红细胞； 优选地，该人工血液中还包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和超纯水。10.根据权利要求9所述的人工血液其中，所述纳米人工红细胞的浓度为0.1 5?.0.25mmol/L。
【专利摘要】本发明提供了一种新颖的纳米人工红细胞、人工血液及其制备方法，所述的纳米人工红细胞采用血红蛋白作为载氧分子，血红蛋白被聚合物包载形成核心；核心外采用用聚乙二醇分子修饰的磷脂分子层模拟细胞膜保护血红蛋白分子；并且，该纳米人工红细胞的尺寸为50-200nm。本发明的纳米人工红细胞可大规模合成，结构稳定，包封率高，不易泄露，在体内具有良好的生物相容性、结构稳定性和功能稳定性，高效地为机体输送氧气，且不会导致明显的副作用。本发明的方法简便易行，便于操作推广。
【IPC分类】A61K47/24, A61K47/34, A61K35/14, A61K38/42, A61P7/08
【公开号】CN105497881
【申请号】CN201510960466
【发明人】蔡林涛, 罗震宇, 郑明彬, 赵鹏飞, 陈泽, 倪大鹏
【申请人】中国科学院深圳先进技术研究院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月21日
【技术领域】
[0001]本发明是关于一种新颖的纳米人工红细胞、人工血液及其制备方法，以应用于解决体内供氧问题。
【背景技术】
[0002]临床输血的应用已非常广泛，但目前输血仍存在诸多问题:1.血液可能携带病原体(肝炎病毒、HIV等)，一些疾病可能通过输血传播;2.血型不匹配导致凝集反应，可威胁被输血人的生命;3.血液来源短缺;4.血液的储存时间短(42天)。近来，纳米技术使人工氧载体得到快速发展，引起人们广泛关注。人工氧载体是具有载氧功能的纳米/微米尺寸的颗粒，可大规模合成，并且不会导致交叉感染和凝集反应。目前临床上已经有多种人工氧载体产品作为血液代用品得到应用，这些氧载体包括全氟碳化合物、聚血红蛋白、交联血红蛋白、血红蛋白脂质体等。
[0003]全氟碳化合物因其疏水性难与血浆混合，生物相容性较差，且存在严重副作用。聚血红蛋白与交联血红蛋白，由于血红蛋白分子没有纳米颗粒的保护，不易维持血红蛋白在体内的功能稳定性，而且容易被机体清除。血红蛋白脂质体在体内的结构稳定性较差，所包裹血红蛋白易泄露。
[0004]“脂质体包封猪血红蛋白的制备及评价”(梁培德)公开了关于一种脂质体包封猪血红蛋白的技术，具体是采用卵磷脂包封猪血红蛋白，对工艺条件进行了优化，包封率稳定在(41.87±0.46)%。
[0005]“基于脂质体包封血红蛋白构建人工红细胞的工艺研究及其评价”(谢家馨)、“人工红细胞及微囊包被血红蛋白的制备与鉴定”(樊晶，王学谦，《中国输血杂志》2004年02期)公开了一种脂质体包封血红蛋白的技术，其中，首先通过低渗法制备高纯度、高浓度的膜蛋白，然后根据界面缩聚法的原理，利用匀速微囊制备喷头，将含有2，3-DPG、膜蛋白和血红蛋白水相直接滴入到含磷脂的植物油中，通过高速搅拌使囊心物(2，3-DPG与血红蛋白单体、二聚体构建的不稳定的四聚体)的周围形成单个球状膜壳型微囊。其中，谢家馨报道的人工红细胞的包埋率为53%，樊晶等人报道的人工红细胞的包埋率为27.7%。
[000?]基于目如的现有技术状况，仍有待进一步提尚人工红细胞的包封率，提尚人工血液的稳定性。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的在于提供一种新颖的结构稳定的纳米人工红细胞。
[0008]本发明的另一目的在于提供所述纳米人工红细胞的制备方法，提高人工红细胞的包封率和稳定性。
[0009]本发明的另一目的在于提供一种含有所述纳米人工红细胞的人工血液。
[0010]—方面，本发明提供了一种纳米人工红细胞，该纳米人工红细胞采用血红蛋白作为载氧分子，血红蛋白被聚合物包载形成核心；核心外采用用聚乙二醇分子修饰的磷脂分子层模拟细胞膜保护血红蛋白分子;并且，该纳米人工红细胞的尺寸为50-200nm。
[0011]根据本发明的具体实施方案，本发明的纳米人工红细胞中，所述血红蛋白为动物血红蛋白分子，例如牛血红蛋白分子或猪血红蛋白分子。血红蛋白采用动物血液提取的血红蛋白，能以高亲和力结合氧气分子，在体内可逆地将氧气释放，能替代血液输送氧气的功能。本发明采用聚合物分子包载动物血红蛋白分子作为核心;核心外为磷脂分子层，并以聚乙二醇分子修饰以获得良好生物相容性和长循环效果。
[0012]另一方面，本发明还提供了一种纳米人工红细胞的制备方法，该方法包括:
[0013]卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白加入乙醇水溶液中；其中，卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白的质量比为300?350: 200?300: 1500?2000 ；优选地，其中，卵磷脂在乙醇水溶液中的浓度为80?150yg/mL，更优选为100?120yg/mL;所述乙醇水溶液为浓度3?5 %的乙醇水溶液；
[0014]将浓度I?3mg/mL的PLGA的乙腈溶液逐滴加入到上述含有卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白的乙醇水溶液中，采用超声波细胞破碎仪以1?30kHz的频率及15?70W的功率超声5?1min，制得棕红色溶液；
[0015]超滤，并进行脱氧处理，得到所述纳米人工红细胞。
[0016]根据本发明的具体实施方案，本发明的纳米人工红细胞的制备方法中，超声处理时，同时监控制备时的液体温度，利用冰浴将温度控制在40摄氏度以下，防止血红蛋白受热变性。
[0017]根据本发明的具体实施方案，本发明的纳米人工红细胞的制备方法中，所述超滤采用10kDa的超滤管进行，离心超滤两次。其中，优选的离心条件为5000?7500r/min，每次离心5?1min0
[0018]根据本发明的具体实施方案，本发明的纳米人工红细胞的制备方法中，脱氧处理是通过将氮气通入人工血液(放置于有导气系统的密闭环境中)进行脱氧处理。
[0019]本发明的纳米人工红细胞在脱氧状态下可储存两年以上，在充入氧气后，可替代血液载氧功能。
[0020]另一方面，本发明还提供了一种人工血液，其中包括本发明所述的纳米人工红细胞。优选地，所述纳米人工红细胞的浓度为0.15?0.25mmol/L。
[0021]此外，所述人工血液还包括Na2HP04、KH2P04、NaCl和超纯水等血液中的常规组分。这些常规组分的用量可参照现有技术进行。
[0022]例如，在本发明的一具体实施方案中，本发明的人工血液包括以下组分:
[0023]纳米人工红细胞(血红蛋白浓度0.2mmol/L)、Na2HP04( 10mmol/L)、KH2P04(2mmol/L)、NaCl(137mmol/L)和KCl(2.7mmol/L)、超纯水余量。本发明的人工血液可以是将所述组分充分混合后配制得到。
[0024]本发明的有益技术效果:
[0025]本发明中采用动物血红蛋白作为载氧分子，不会引起交叉感染和凝集反应;可大规模合成，结构稳定，储存时间可达两年以上。血红蛋白分子得到纳米人工红细胞的保护，包封率高，不易泄露，功能稳定性好。且该纳米人工红细胞在缺氧环境中能稳定释放所载的氧气，在体内具有良好的生物相容性、结构稳定性和功能稳定性，高效地为机体输送氧气，且不会导致明显的副作用。本发明的制备方法简便易行，便于操作推广。
【附图说明】
[0026]图1为本发明的人工血液中纳米人工红细胞的透射电子显微镜照片。
[0027]图2为相比于通氧纯净水和通氧游离血红蛋白，纳米人工红细胞在缺氧环境的溶解氧浓度曲线。
[0028]图3显示本发明的人工血液的酸稳定性测试结果。
[0029]图4显示本发明的人工血液的热稳定性测试结果。
【具体实施方式】
[0030]为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
[0031]实施例1:纳米人工红细胞的制备
[0032]PLGA溶于乙腈中，浓度为2mg/mL ； 300yg卵磷脂、20 0yg DSPE-PEG(2000)、1500yg血红蛋白加入3mL 4%乙醇水溶液中；ImL PLGA乙腈溶液逐滴加入4%乙醇水溶液中，期间采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率及35W的功率超声5min(同时监控制备时的液体温度，利用冰浴将温度控制在40摄氏度以下，防止血红蛋白受热变性)，制得棕红色溶液。采用10kDa的超滤管5000r/min离心超滤两次(每次离心1min)，并通入氮气做脱氧处理，即得纳米人工红细胞。
[0033]图1为本发明的人工血液中纳米人工红细胞的透射电子显微镜照片。其粒径通过粒度分析仪测得平均粒径为70nm。本实施例中，对血红蛋白的包封率为86.18 ± 2.37 %。
[0034]实施例2:纳米人工红细胞的制备
[0035]PLGA溶于乙腈中，浓度为2mg/mL;350yg卵磷脂、200yg DSPE_PEG(5000)、2000yg血红蛋白加入3mL 4%乙醇水溶液中；ImL PLGA乙腈溶液逐滴加入4%乙醇水溶液中，期间采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率及35W的功率超声5min(同时监控制备时的液体温度，利用冰浴将温度控制在40摄氏度以下，防止血红蛋白受热变性)，制得棕红色溶液。采用10kDa的超滤管7000r/min离心超滤两次(每次离心5min)，并通入氮气做脱氧处理，即得纳米人工红细胞。其粒径通过粒度分析仪测得平均粒径为70nm。本实施例中，对血红蛋白的包封率为 72.23±4.14%。
[0036]实施例3:纳米人工红细胞的制备
[0037]参照实施例1，改变超声波功率为65W，制得纳米人工红细胞。其粒径通过粒度分析仪测得平均粒径为62nm。本实施例中，对血红蛋白的包封率为76.24± 1.77%。
[0038]纳米人工红细胞的性能测试:
[0039]直径35mm、高50mm的附有通气导管的带塞广口瓶，加入1mL纯净水;将氮气通入纯净水脱氧，使溶解氧浓度低于0.4mg/L。另一个广口瓶中，将氧气通过导管通入纳米人工红细胞溶液中(其中含实施例1的纳米人工红细胞0.2mmol/L)，使其载氧，溶液中溶解氧浓度高于30mg/L。将ImL充氧的纳米人工红细胞溶液以注射器注入脱氧纯净水中，混合均匀后在密闭环境下检测溶解氧浓度以观察纳米人工红细胞的氧气释放曲线。
[0040]图2为相比于通氧纯净水和通氧游离血红蛋白，纳米人工红细胞在缺氧环境的溶解氧浓度曲线。实验结果显示，纳米人工红细胞在缺氧环境中能稳定释放所载的氧气，2小时后能使体系的溶解氧浓度达到7.7mg/L0
[0041]以实施例1的纳米人工红细胞配制成人工血液，该人工血液配方为:纳米人工红细胞(血红蛋白浓度0.2mmo I/L)、Na2HPO4(1mmoI/L)、KH2PO4(2mmoI/L)、NaCI (137mmo I/L)和KCl(2.7mmol/L)、超纯水余量。将人工红细胞以配方配制成人工血液后，充氧至溶解氧浓度30mg/L以上，之后通过滴加盐酸调节pH。图3显示该人工血液与作为对照的游离血红蛋白溶液的酸稳定性测试结果。图中从左至右的两个样品分别为游离血红蛋白溶液、本发明的人工血液，可以看出，本发明的人工血液在弱酸性环境(pH = 6.7)中不会沉淀，载氧能力没有损失;而对照样品在弱酸性条件下出现蛋白沉淀。
[0042]以实施例1的纳米人工红细胞配制成人工血液，该人工血液配方为:纳米人工红细胞(血红蛋白浓度0.2mmo I/L)、Na2HPO4(1mmoI/L)、KH2PO4(2mmoI/L)、NaCI (137mmo I/L)和KCl(2.7mmol/L)、超纯水余量。将人工红细胞以配方配制成人工血液后，充氧至溶解氧浓度30mg/L以上，之后测定样品在室温25摄氏度及加热至60摄氏度下的稳定性。图4显示该人工血液与作为对照的游离血红蛋白溶液的热稳定性测试结果。图中从左至右的两个样品分别为游离血红蛋白溶液、本发明的人工血液，可以看出，本发明的人工血液在高热环境(60摄氏度)中不会发生血红蛋白的变性，载氧能力没有损失;而对照样品在高温条件下出现蛋白变性。
[0043]另，将实施例1、实施例2、实施例3的纳米人工红细胞于2?6摄氏度冷藏条件下储存，储存时间达两年，纳米人工红细胞的载氧能力无显著下降，功能稳定性好。
【主权项】
1.一种纳米人工红细胞，该纳米人工红细胞采用血红蛋白作为载氧分子，血红蛋白被聚合物包载形成核心;核心外采用用聚乙二醇分子修饰的磷脂分子层模拟细胞膜保护血红蛋白分子;并且，该纳米人工红细胞的尺寸为50-200nm。2.根据权利要求1所述的纳米人工红细胞，其中，所述血红蛋白为动物血红蛋白。3.一种纳米人工红细胞的制备方法，该方法包括: 卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白加入乙醇水溶液中；其中，卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白的质量比为 300 ?350: 200 ?300: 1500 ?2000 ； 将浓度I?3mg/mL的PLGA的乙腈溶液逐滴加入到上述含有卵磷脂、DSPE-PEG、血红蛋白的乙醇水溶液中，采用超声波细胞破碎仪以10?30kHz的频率及15?70W的功率超声5?1min，制得棕红色溶液； 超滤，并进行脱氧处理，得到所述纳米人工红细胞。4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述卵磷脂在乙醇水溶液中的浓度为80?.150yg/mL.5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其中，所述乙醇水溶液为浓度3?5%的乙醇水溶液。6.根据权利要求3所述的制备方法，其中，超声处理时，同时监控制备时的液体温度，利用冰浴将温度控制在40摄氏度以下。7.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述超滤采用10kDa的超滤管进行，离心超滤两次。8.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述脱氧处理是通过通入氮气进行脱氧处理。9.一种人工血液，其中包括权利要求1或2所述的纳米人工红细胞； 优选地，该人工血液中还包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和超纯水。10.根据权利要求9所述的人工血液其中，所述纳米人工红细胞的浓度为0.1 5?.0.25mmol/L。
【专利摘要】本发明提供了一种新颖的纳米人工红细胞、人工血液及其制备方法，所述的纳米人工红细胞采用血红蛋白作为载氧分子，血红蛋白被聚合物包载形成核心；核心外采用用聚乙二醇分子修饰的磷脂分子层模拟细胞膜保护血红蛋白分子；并且，该纳米人工红细胞的尺寸为50-200nm。本发明的纳米人工红细胞可大规模合成，结构稳定，包封率高，不易泄露，在体内具有良好的生物相容性、结构稳定性和功能稳定性，高效地为机体输送氧气，且不会导致明显的副作用。本发明的方法简便易行，便于操作推广。
【IPC分类】A61K47/24, A61K47/34, A61K35/14, A61K38/42, A61P7/08
【公开号】CN105497881
【申请号】CN201510960466
【发明人】蔡林涛, 罗震宇, 郑明彬, 赵鹏飞, 陈泽, 倪大鹏
【申请人】中国科学院深圳先进技术研究院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月21日
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