乙肝核心抗原病毒样颗粒作为肿瘤治疗性疫苗载体的应用
乙肝核心抗原病毒样颗粒作为肿瘤治疗性疫苗载体的应用
【技术领域】
[0001]
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种乙肝核心抗原病毒样颗粒(HBcAg)作为肿瘤治疗性疫苗载体的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002]
宫颈癌是威害妇女健康最为严重的疾病之一，在女性肿瘤发病率中占第二位。在全世界范围内，每年大约有49.3万个新发病例和27.4万个死亡病例，而在所有的宫颈癌病例中几乎都可检测到HPV的存在。HPV感染还弓丨起肛门癌，外阴癌，阴道癌和阴茎癌，此外，HPV感染也是头颈癌等非生殖道癌发生的重要原因。现在已经明确高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生和存在的必要因素。而在高危型HPV中，16、18型与70%的宫颈癌相关。尽管国际上已商业化的预防性HPV疫苗能够诱导有效的抗体免疫应答并且针对特定的HPV型别如HPV16和18等多数高危型HPV的感染产生显著的保护作用，但是其对于已经建立的HPV感染或肿瘤，没有明显治疗效果。因此，研制治疗性HPV疫苗，针对癌前病变和肿瘤进行免疫治疗，具有对HPV相关疾病治疗控制的广阔应用前景。
[0003]HPV E6、E7是导致细胞发生转化的关键因子，在宫颈癌细胞中持续表达，因此目前治疗性HPV疫苗的研究主要致力于通过靶向E6和E7诱导强的特异的T细胞介导的免疫应答。策略包括:1)表位氨基酸修饰以增强与MHC分子的亲合力;2)抗原修饰改造以指导其加工递呈途径与效率;3)引入细胞因子、趋化因子，共刺激分子以增强及控制免疫应答向所需类型发展;4)优化疫苗递送途径和免疫程序；以及5)利用抗原肽/蛋白、细菌与病毒活载体、核酸、及细胞等不同疫苗形式。然而，目前为止没有任何治疗性HPV疫苗针对CIN病人或肿瘤患者产生有效的临床治疗效果。因此，我们亟需一个在肿瘤免疫抑制和免疫逃逸的微环境下能够诱导强有力的肿瘤特异性细胞免疫应答的候选疫苗。
[0004]应用有效的载体增强特异性抗原的免疫原性是一个重要的疫苗学手段。乙肝核心抗原(HBcAg)能够在大肠杆菌E.coli中有效的自我组装成病毒样颗粒，并且其结构的固有特点使得它具有很强的免疫原性并能产生高滴度的特异性抗体。因此HBcAg颗粒已经成为一个应用广泛的呈递异源抗原并诱导体液免疫应答的强有力的疫苗载体。此外，呈递自体分子和抗原肽的HBcAg病毒样颗粒能够打破免疫耐受，诱导特异的自身抗体并在疾病模型中成功干预功能紊乱的靶分子引起的病理效应。然而，HBcAg病毒样颗粒是否具有作为治疗性疫苗载体并促进抗原特异的细胞免疫应答的潜能仍未确定。
[0005]本研究旨在探讨呈递HPV16 E7 CTLs模式表位的HBcAg病毒样颗粒疫苗是否具有诱导肿瘤特异性的细胞免疫应答和抑制肿瘤生长的能力，明确HBcAg病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。
【发明内容】
[0006] 编码E749-57的正负寡核苷酸片段退火复性获得DNA片段，并以基因工程手段连入乙肝核心抗原HBcAg第78和79为氨基酸之间，将重组质粒转化进入大肠杆菌Dh5a后挑取阳性重组子，提取质粒进行测序鉴定。
[0007]将pHBcAg_E749-57重组质粒转化进Dh5a感受态细胞，以IPTG诱导表达重组蛋白HBcAg-E749-57，表达产物经超声破碎后收集上清中的重组蛋白。重组蛋白经硫酸铵盐析法和10%?50%的蔗糖密度梯度离心进行纯化。纯化的重组蛋白进行HPLC分析，根据出峰时间鉴定重组蛋白是否组装成病毒样颗粒及其纯度。此外，通过电镜观察组装成病毒样颗粒(VLPs)和未组装成病毒样颗粒(non-VLPs)的重组蛋白形态。
[0008]将该病毒样颗粒以治疗性策略免疫小鼠，观察小鼠肿瘤生长情况，发现以HBcAg-E749-57病毒样颗粒的形式免疫后，小鼠肿瘤生长受到显著抑制;观测时间点结束后，收集免疫后的小鼠脾脏，进行ELISP0T检测分泌IFN- γ的淋巴细胞数目，发现以HBcAg_E749-57病毒样颗粒免疫后，小鼠体内产生了较高水平的分泌IFN-γ的淋巴细胞数目。
[0009]应用免疫记忆实验检测HBcAg-E749—57病毒样颗粒疫苗对小鼠的保护性持续时间，发现小鼠在第三次免疫后15周仍然存在免疫记忆应答，小鼠接种肿瘤细胞后，ELISP0T检测显示疫苗组显著提高了分泌IFN-γ的淋巴细胞水平。
【附图说明】
[0010]
图1显示了重组质粒pHBcAg- E749-57的质粒构建图谱；
图2显示了SDS-PAGE分析重组蛋白HBcAg- E749-57的诱导表达；
图3显示了重组蛋白HBcAg- E749-57蔗糖密度梯度离心的SDS-PAGE分析；
图4显示了重组蛋白HBcAg- E749-5?病毒样颗粒形式(VLPs)的纯度和形态的HPLC凝胶过滤分析；
图5显示了重组蛋白HBcAg- E749-5?非病毒样颗粒形式(non-VLPs)的纯度和形态的HPLC凝胶过滤分析；
图6显示了电镜观察到重组蛋白HBcAg- E749-5?形成VLPs的形态；
图7显示了电镜观察到重组蛋白HBcAg- E749-57形成non-VLPs的形态；
图8显示了病毒样颗粒疫苗以治疗性策略免疫小鼠后显著抑制了肿瘤的生长(n=9/
组)；
图9显示了经ELISP0T分析，病毒样颗粒疫苗以治疗性策略免疫小鼠后显著提高了分泌IFN- γ的淋巴细胞水平(η=5/组)；
图10显示了免疫记忆实验的实验程序；
图11显示了经ELISP0T分析，病毒样颗粒疫苗第三次免疫后15周小鼠仍然存在免疫应答(η=4/组)；
图12显示了病毒样颗粒疫苗免疫第三次免疫15周后仍然产生了显著的肿瘤抑制效果(η=10/组)；
图13显示了免疫记忆实验肿瘤接种后I周，经ELISP0T分析，病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后产生了高水平的分泌IFN-γ的淋巴细胞(η=4/组)。
【具体实施方式】
[0011]
通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示范性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。
[0012]实施例
实施例1:重组表达质粒PHBcAg- E749-57的构建
编码E 7 4 9 — 5 7的寡核苷酸序列(正链:5 ’ -gatctCGTGCTCACTACAACATCGTTACCTTCggatccggtg-3 ’ ；负链:5’-aattcaccggatccGAAGGTAACGATGTTGTAGTGAGCACGa-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在10μ1的体系内正负寡核苷酸片段以0.1mM的浓度1:1混合退火复性， 复性体系具体为:正负寡核苷酸各2μ1，10XPCR Buffer Ιμ?，水5μ1。在95°C的条件下变性30秒，缓慢直至冷却至室温退火复性，从而形成编码抗原肽的双链DNA片段。形成的双链DNA片段构建至pTh1HisA-HBcAg载体BamHI和EcoRI酶切位点之间。载体pTh1HisA-HBcAg，由本室构建，是将改造过的HBcAg( 1-149氨基酸)基因克隆于pTh1HisA表达载体(图1)。连接体系为:E749-57DNA片段 2.84μ1，pTh1HisA-HBcAg载体 6.14μ1，10ΧΤ4 Buffer 1.5μ1，Τ4连接酶 Iμ?，水:3.5μ1，16°C连接过夜。将DNA连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆并测序鉴定。
[0013]实施例2:重组表达质粒pHBcAg- E749-57的诱导表达
将重组质粒转化进入大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单克隆进行诱导表达，具体方法为，将阳性克隆接种至已加入氨苄西林(100mg/mL)的LB培养基中，培养16小时后以1:5的比例转接菌液进入新的带氨苄西林的LB培养基中，待菌株生长至对数期时，加入IPTG( lmmol/L)进行诱导表达，控制诱导表达温度为37°C，诱导表达4个小时(图2)。
[0014]实施例3:重组蛋白pHBcAg- E749-57的制备与纯化
将诱导表达过夜后的样品以室温12000g离心10分钟，收集菌体，以PBS重悬菌体后进行超声波破碎，破碎条件为15%最大功率，工作5秒，停5秒，持续10分钟。破碎后的样品以12000〖离心10分钟，收集上清后并进行40%硫酸钱沉淀室温沉淀30min。12，000rpm(?13000g)、20°C离心1min。弃掉上清，沉淀用20%硫酸铵溶液洗涤，12，OOOrpmC?13000g)、20°(3离心10111；[11，重复洗涤三次，沉淀用50(^1?13重悬，12，000印111(?1300(^)、20°(3离心15111；[11，收集上清。
[0015]经SDS-PAGE分析后，重组蛋白经10%?50%的蔗糖密度梯度离心进行纯化，离心后的样品从上至下逐层取样，每层Iml(图3)。纯化的重组蛋白进行HPLC分析，柱子为SRT SEC-1000，流速0.2ml/min，流动相为roS。根据出峰时间鉴定重组蛋白组装成病毒样颗粒(图4)及未组装成病毒样颗粒(non-VLPs)(图5)。此外，将纯化的重组蛋白经磷钨酸负染后，电镜观察病毒样颗粒(VLPs)(图6)及非病毒样颗粒(图7)。
[0016]实施例4小鼠移植肿瘤模型建立和治疗性策略免疫干预
小鼠右侧腹皮下注射混合Basement Membrane MatrixCBD B1science)的I X 15 TC-1细胞，建立小鼠HPV移植肿瘤模型。在治疗性实验中，小鼠首先接种肿瘤细胞，小鼠肿瘤生长至2mm时进行疫苗免疫，小鼠分为五组即PBS组(s.c.)、NP组(s.c.)、B4_VLPs组(s.c.)、B4-none VLPs组(s.c.)，每组9只小鼠，免疫剂量为50 yg，每只ΙΟΟμΙ，免疫3次，每次间隔I周。小鼠肿瘤大小每隔三天测量一次。(图8)。肿瘤接种后63天，应用ELISP0T试剂盒(达科为)检测抗原特异性的分泌IFN-γ的淋巴细胞，应用Ε749-57肽进行刺激，操作步骤按照说明书进行。去小鼠脾脏以每孔细胞数为3Χ 15个铺至96孔细胞培养板，并应用5yg/ml的短肽E749-57进行体外刺激，37°C、5% CO2培养箱内培养16-20h(图9)。
[0017]实施例5 HBcAg- E749-57治疗性疫苗引起的免疫记忆的持续性
小鼠分为四组，免疫程序如图10，分别为:(I)疫苗组:10只小鼠首先免疫病毒样颗粒疫苗，免疫三次，每次间隔一周，免疫剂量为50yg，根据检测组结果观察免疫应答情况，最后一次免疫15周后接种肿瘤细胞TC-1，一周后取4只小鼠脾脏进行免疫学检测(图13)，剩余小鼠继续观察肿瘤大小(图12)。(2)载体组:10只小鼠首先注射NP作为载体对照组，注射三次，每次间隔一周，注射剂量为50yg，根据检测组结果观察免疫应答情况，最后一次免疫15周后接种肿瘤细胞TC-1，两周后取4只小鼠脾脏进行免疫学检测，剩余小鼠继续观察肿瘤大小。接种肿瘤细胞后10周取剩余小鼠脾脏，肿瘤进行后续免疫检测；(3)PBS组:10只小鼠首先注射PBS作为空白对照组，注射三次，每次间隔一周，根据检测组结果观察免疫应答情况，最后一次免疫15周后接种肿瘤细胞TC-1，两周后取4只小鼠脾脏进行免疫学检测，剩余小鼠继续观察肿瘤大小。接种肿瘤细胞后10周取剩余小鼠脾脏，肿瘤进行后续免疫检测；(4)检测组:16只小鼠免疫B4疫苗，免疫三次，每次间隔一周，免疫剂量为50yg，最后一次免疫后取四个检测点观察小鼠免疫应答情况，分别为最后一次免疫后2周、5周、7周和15周进行检测。每次检测取4只小鼠的脾脏进行ELISP0T分析，观察小鼠免疫应答情况(图11)。
【主权项】
1.一种乙肝核心抗原病毒样颗粒(HBcAg)可以作为肿瘤治疗性疫苗的载体，其特征在于:将肿瘤抗原呈递于HBcAg表面后能在机体内诱发较强的针对所呈递抗原的细胞免疫应答，诱导机体产生有效的免疫记忆，对人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤具有显著的抑制作用。2.该乙肝核心抗原病毒样颗粒作为宫颈癌治疗性疫苗载体的构建，其方法为:将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆至pTh1HisA载体，再将E749-57的正负寡核苷酸序列经退火复性后形成的DNA片段插入到HBcAg的78-79为氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg-E749-57o3.该乙肝核心抗原病毒样颗粒作为宫颈癌治疗性疫苗载体的应用，其特征在于:将所述的呈递E749-57的乙肝核心抗原病毒样颗粒按照50yg的接种量，皮下接种。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说，本发明提供了一种乙肝核心抗原病毒样颗粒（HBcAg）作为宫颈癌治疗性疫苗载体的应用。其制备方法：选择HPV16？E749-57CTLs表位肽段，经基因重组将其DNA片段插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之间，得到的重组质粒pHBcAg-E749-57转化入大肠杆菌DH5α，经诱导表达及纯化，得到呈递E749-57的HBcAg病毒样颗粒疫苗。经该病毒样颗粒疫苗免疫荷瘤小鼠后能够诱导机体产生较强的HPV16E7特异性的细胞免疫应答，并显著抑制肿瘤的生长。
【IPC分类】A61K39/12, C12N15/66, A61P35/00
【公开号】CN105497886
【申请号】CN201510972747
【发明人】马雁冰, 褚晓杰, 李杨, 龙琼, 夏烨, 黄惟巍
【申请人】中国医学科学院医学生物学研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月23日
【技术领域】
[0001]
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种乙肝核心抗原病毒样颗粒(HBcAg)作为肿瘤治疗性疫苗载体的构建方法及其应用。
【背景技术】
[0002]
宫颈癌是威害妇女健康最为严重的疾病之一，在女性肿瘤发病率中占第二位。在全世界范围内，每年大约有49.3万个新发病例和27.4万个死亡病例，而在所有的宫颈癌病例中几乎都可检测到HPV的存在。HPV感染还弓丨起肛门癌，外阴癌，阴道癌和阴茎癌，此外，HPV感染也是头颈癌等非生殖道癌发生的重要原因。现在已经明确高危型HPV的持续感染是宫颈癌发生和存在的必要因素。而在高危型HPV中，16、18型与70%的宫颈癌相关。尽管国际上已商业化的预防性HPV疫苗能够诱导有效的抗体免疫应答并且针对特定的HPV型别如HPV16和18等多数高危型HPV的感染产生显著的保护作用，但是其对于已经建立的HPV感染或肿瘤，没有明显治疗效果。因此，研制治疗性HPV疫苗，针对癌前病变和肿瘤进行免疫治疗，具有对HPV相关疾病治疗控制的广阔应用前景。
[0003]HPV E6、E7是导致细胞发生转化的关键因子，在宫颈癌细胞中持续表达，因此目前治疗性HPV疫苗的研究主要致力于通过靶向E6和E7诱导强的特异的T细胞介导的免疫应答。策略包括:1)表位氨基酸修饰以增强与MHC分子的亲合力;2)抗原修饰改造以指导其加工递呈途径与效率;3)引入细胞因子、趋化因子，共刺激分子以增强及控制免疫应答向所需类型发展;4)优化疫苗递送途径和免疫程序；以及5)利用抗原肽/蛋白、细菌与病毒活载体、核酸、及细胞等不同疫苗形式。然而，目前为止没有任何治疗性HPV疫苗针对CIN病人或肿瘤患者产生有效的临床治疗效果。因此，我们亟需一个在肿瘤免疫抑制和免疫逃逸的微环境下能够诱导强有力的肿瘤特异性细胞免疫应答的候选疫苗。
[0004]应用有效的载体增强特异性抗原的免疫原性是一个重要的疫苗学手段。乙肝核心抗原(HBcAg)能够在大肠杆菌E.coli中有效的自我组装成病毒样颗粒，并且其结构的固有特点使得它具有很强的免疫原性并能产生高滴度的特异性抗体。因此HBcAg颗粒已经成为一个应用广泛的呈递异源抗原并诱导体液免疫应答的强有力的疫苗载体。此外，呈递自体分子和抗原肽的HBcAg病毒样颗粒能够打破免疫耐受，诱导特异的自身抗体并在疾病模型中成功干预功能紊乱的靶分子引起的病理效应。然而，HBcAg病毒样颗粒是否具有作为治疗性疫苗载体并促进抗原特异的细胞免疫应答的潜能仍未确定。
[0005]本研究旨在探讨呈递HPV16 E7 CTLs模式表位的HBcAg病毒样颗粒疫苗是否具有诱导肿瘤特异性的细胞免疫应答和抑制肿瘤生长的能力，明确HBcAg病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。
【发明内容】
[0006] 编码E749-57的正负寡核苷酸片段退火复性获得DNA片段，并以基因工程手段连入乙肝核心抗原HBcAg第78和79为氨基酸之间，将重组质粒转化进入大肠杆菌Dh5a后挑取阳性重组子，提取质粒进行测序鉴定。
[0007]将pHBcAg_E749-57重组质粒转化进Dh5a感受态细胞，以IPTG诱导表达重组蛋白HBcAg-E749-57，表达产物经超声破碎后收集上清中的重组蛋白。重组蛋白经硫酸铵盐析法和10%?50%的蔗糖密度梯度离心进行纯化。纯化的重组蛋白进行HPLC分析，根据出峰时间鉴定重组蛋白是否组装成病毒样颗粒及其纯度。此外，通过电镜观察组装成病毒样颗粒(VLPs)和未组装成病毒样颗粒(non-VLPs)的重组蛋白形态。
[0008]将该病毒样颗粒以治疗性策略免疫小鼠，观察小鼠肿瘤生长情况，发现以HBcAg-E749-57病毒样颗粒的形式免疫后，小鼠肿瘤生长受到显著抑制;观测时间点结束后，收集免疫后的小鼠脾脏，进行ELISP0T检测分泌IFN- γ的淋巴细胞数目，发现以HBcAg_E749-57病毒样颗粒免疫后，小鼠体内产生了较高水平的分泌IFN-γ的淋巴细胞数目。
[0009]应用免疫记忆实验检测HBcAg-E749—57病毒样颗粒疫苗对小鼠的保护性持续时间，发现小鼠在第三次免疫后15周仍然存在免疫记忆应答，小鼠接种肿瘤细胞后，ELISP0T检测显示疫苗组显著提高了分泌IFN-γ的淋巴细胞水平。
【附图说明】
[0010]
图1显示了重组质粒pHBcAg- E749-57的质粒构建图谱；
图2显示了SDS-PAGE分析重组蛋白HBcAg- E749-57的诱导表达；
图3显示了重组蛋白HBcAg- E749-57蔗糖密度梯度离心的SDS-PAGE分析；
图4显示了重组蛋白HBcAg- E749-5?病毒样颗粒形式(VLPs)的纯度和形态的HPLC凝胶过滤分析；
图5显示了重组蛋白HBcAg- E749-5?非病毒样颗粒形式(non-VLPs)的纯度和形态的HPLC凝胶过滤分析；
图6显示了电镜观察到重组蛋白HBcAg- E749-5?形成VLPs的形态；
图7显示了电镜观察到重组蛋白HBcAg- E749-57形成non-VLPs的形态；
图8显示了病毒样颗粒疫苗以治疗性策略免疫小鼠后显著抑制了肿瘤的生长(n=9/
组)；
图9显示了经ELISP0T分析，病毒样颗粒疫苗以治疗性策略免疫小鼠后显著提高了分泌IFN- γ的淋巴细胞水平(η=5/组)；
图10显示了免疫记忆实验的实验程序；
图11显示了经ELISP0T分析，病毒样颗粒疫苗第三次免疫后15周小鼠仍然存在免疫应答(η=4/组)；
图12显示了病毒样颗粒疫苗免疫第三次免疫15周后仍然产生了显著的肿瘤抑制效果(η=10/组)；
图13显示了免疫记忆实验肿瘤接种后I周，经ELISP0T分析，病毒样颗粒疫苗免疫小鼠后产生了高水平的分泌IFN-γ的淋巴细胞(η=4/组)。
【具体实施方式】
[0011]
通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示范性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。
[0012]实施例
实施例1:重组表达质粒PHBcAg- E749-57的构建
编码E 7 4 9 — 5 7的寡核苷酸序列(正链:5 ’ -gatctCGTGCTCACTACAACATCGTTACCTTCggatccggtg-3 ’ ；负链:5’-aattcaccggatccGAAGGTAACGATGTTGTAGTGAGCACGa-3’)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在10μ1的体系内正负寡核苷酸片段以0.1mM的浓度1:1混合退火复性， 复性体系具体为:正负寡核苷酸各2μ1，10XPCR Buffer Ιμ?，水5μ1。在95°C的条件下变性30秒，缓慢直至冷却至室温退火复性，从而形成编码抗原肽的双链DNA片段。形成的双链DNA片段构建至pTh1HisA-HBcAg载体BamHI和EcoRI酶切位点之间。载体pTh1HisA-HBcAg，由本室构建，是将改造过的HBcAg( 1-149氨基酸)基因克隆于pTh1HisA表达载体(图1)。连接体系为:E749-57DNA片段 2.84μ1，pTh1HisA-HBcAg载体 6.14μ1，10ΧΤ4 Buffer 1.5μ1，Τ4连接酶 Iμ?，水:3.5μ1，16°C连接过夜。将DNA连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆并测序鉴定。
[0013]实施例2:重组表达质粒pHBcAg- E749-57的诱导表达
将重组质粒转化进入大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取单克隆进行诱导表达，具体方法为，将阳性克隆接种至已加入氨苄西林(100mg/mL)的LB培养基中，培养16小时后以1:5的比例转接菌液进入新的带氨苄西林的LB培养基中，待菌株生长至对数期时，加入IPTG( lmmol/L)进行诱导表达，控制诱导表达温度为37°C，诱导表达4个小时(图2)。
[0014]实施例3:重组蛋白pHBcAg- E749-57的制备与纯化
将诱导表达过夜后的样品以室温12000g离心10分钟，收集菌体，以PBS重悬菌体后进行超声波破碎，破碎条件为15%最大功率，工作5秒，停5秒，持续10分钟。破碎后的样品以12000〖离心10分钟，收集上清后并进行40%硫酸钱沉淀室温沉淀30min。12，000rpm(?13000g)、20°C离心1min。弃掉上清，沉淀用20%硫酸铵溶液洗涤，12，OOOrpmC?13000g)、20°(3离心10111；[11，重复洗涤三次，沉淀用50(^1?13重悬，12，000印111(?1300(^)、20°(3离心15111；[11，收集上清。
[0015]经SDS-PAGE分析后，重组蛋白经10%?50%的蔗糖密度梯度离心进行纯化，离心后的样品从上至下逐层取样，每层Iml(图3)。纯化的重组蛋白进行HPLC分析，柱子为SRT SEC-1000，流速0.2ml/min，流动相为roS。根据出峰时间鉴定重组蛋白组装成病毒样颗粒(图4)及未组装成病毒样颗粒(non-VLPs)(图5)。此外，将纯化的重组蛋白经磷钨酸负染后，电镜观察病毒样颗粒(VLPs)(图6)及非病毒样颗粒(图7)。
[0016]实施例4小鼠移植肿瘤模型建立和治疗性策略免疫干预
小鼠右侧腹皮下注射混合Basement Membrane MatrixCBD B1science)的I X 15 TC-1细胞，建立小鼠HPV移植肿瘤模型。在治疗性实验中，小鼠首先接种肿瘤细胞，小鼠肿瘤生长至2mm时进行疫苗免疫，小鼠分为五组即PBS组(s.c.)、NP组(s.c.)、B4_VLPs组(s.c.)、B4-none VLPs组(s.c.)，每组9只小鼠，免疫剂量为50 yg，每只ΙΟΟμΙ，免疫3次，每次间隔I周。小鼠肿瘤大小每隔三天测量一次。(图8)。肿瘤接种后63天，应用ELISP0T试剂盒(达科为)检测抗原特异性的分泌IFN-γ的淋巴细胞，应用Ε749-57肽进行刺激，操作步骤按照说明书进行。去小鼠脾脏以每孔细胞数为3Χ 15个铺至96孔细胞培养板，并应用5yg/ml的短肽E749-57进行体外刺激，37°C、5% CO2培养箱内培养16-20h(图9)。
[0017]实施例5 HBcAg- E749-57治疗性疫苗引起的免疫记忆的持续性
小鼠分为四组，免疫程序如图10，分别为:(I)疫苗组:10只小鼠首先免疫病毒样颗粒疫苗，免疫三次，每次间隔一周，免疫剂量为50yg，根据检测组结果观察免疫应答情况，最后一次免疫15周后接种肿瘤细胞TC-1，一周后取4只小鼠脾脏进行免疫学检测(图13)，剩余小鼠继续观察肿瘤大小(图12)。(2)载体组:10只小鼠首先注射NP作为载体对照组，注射三次，每次间隔一周，注射剂量为50yg，根据检测组结果观察免疫应答情况，最后一次免疫15周后接种肿瘤细胞TC-1，两周后取4只小鼠脾脏进行免疫学检测，剩余小鼠继续观察肿瘤大小。接种肿瘤细胞后10周取剩余小鼠脾脏，肿瘤进行后续免疫检测；(3)PBS组:10只小鼠首先注射PBS作为空白对照组，注射三次，每次间隔一周，根据检测组结果观察免疫应答情况，最后一次免疫15周后接种肿瘤细胞TC-1，两周后取4只小鼠脾脏进行免疫学检测，剩余小鼠继续观察肿瘤大小。接种肿瘤细胞后10周取剩余小鼠脾脏，肿瘤进行后续免疫检测；(4)检测组:16只小鼠免疫B4疫苗，免疫三次，每次间隔一周，免疫剂量为50yg，最后一次免疫后取四个检测点观察小鼠免疫应答情况，分别为最后一次免疫后2周、5周、7周和15周进行检测。每次检测取4只小鼠的脾脏进行ELISP0T分析，观察小鼠免疫应答情况(图11)。
【主权项】
1.一种乙肝核心抗原病毒样颗粒(HBcAg)可以作为肿瘤治疗性疫苗的载体，其特征在于:将肿瘤抗原呈递于HBcAg表面后能在机体内诱发较强的针对所呈递抗原的细胞免疫应答，诱导机体产生有效的免疫记忆，对人乳头瘤病毒感染引起的肿瘤具有显著的抑制作用。2.该乙肝核心抗原病毒样颗粒作为宫颈癌治疗性疫苗载体的构建，其方法为:将编码截断的乙肝病毒核心抗原HBcAg克隆至pTh1HisA载体，再将E749-57的正负寡核苷酸序列经退火复性后形成的DNA片段插入到HBcAg的78-79为氨基酸之间，得到重组质粒pHBcAg-E749-57o3.该乙肝核心抗原病毒样颗粒作为宫颈癌治疗性疫苗载体的应用，其特征在于:将所述的呈递E749-57的乙肝核心抗原病毒样颗粒按照50yg的接种量，皮下接种。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说，本发明提供了一种乙肝核心抗原病毒样颗粒（HBcAg）作为宫颈癌治疗性疫苗载体的应用。其制备方法：选择HPV16？E749-57CTLs表位肽段，经基因重组将其DNA片段插入到乙肝病毒核心抗原HBcAg的78-79位氨基酸之间，得到的重组质粒pHBcAg-E749-57转化入大肠杆菌DH5α，经诱导表达及纯化，得到呈递E749-57的HBcAg病毒样颗粒疫苗。经该病毒样颗粒疫苗免疫荷瘤小鼠后能够诱导机体产生较强的HPV16E7特异性的细胞免疫应答，并显著抑制肿瘤的生长。
【IPC分类】A61K39/12, C12N15/66, A61P35/00
【公开号】CN105497886
【申请号】CN201510972747
【发明人】马雁冰, 褚晓杰, 李杨, 龙琼, 夏烨, 黄惟巍
【申请人】中国医学科学院医学生物学研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月23日
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