Egf配体靶向纳米载药体系及其抗肿瘤治疗应用
Egf配体靶向纳米载药体系及其抗肿瘤治疗应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物纳米载药材料及药物靶向运输领域，具体涉及一种表皮生长因子配体靶向纳米载药体系及其抗肿瘤治疗应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤(癌症)是危害人类健康、威胁人类生命的第一杀手，具有发病率高、死亡率高、治疗困难及易复发等特点。据世界卫生组织最新《世界癌症报告》，2012年全球有1400万新增癌症病例，癌症死亡人数达820万。我国新诊断癌症病例为307万，占全球总数的21.8%，癌症死亡人数约220万，占全球癌症死亡人数的26.9%。而且根据目前的癌症发病趋势，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%。因此，肿瘤治疗面临更加艰巨的任务，而目前化疗作为肿瘤主要治疗手段之一，由于缺乏对肿瘤细胞的选择性，在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了正常组织细胞，进而产生一系列的毒副作用。因此，发展一种引导抗肿瘤药物靶向输送至“病灶”部位、并提高靶区药物浓度的药物载体显得尤为迫切。
[0003]随着纳米技术在肿瘤生物学研究中的不断深入，磁性纳米颗粒(MNPs)因具有良好的生物相容性、低毒性、表面易功能化以及独特的超顺磁性等特点，为肿瘤研究提供了一种新颖、颇具前景的研究材料，以功能化磁性纳米颗粒作为载体、靶向输送抗肿瘤药物成为肿瘤治疗研究的热点。羧甲基壳聚糖(CMC)是壳聚糖经过羧基化反应后生成的一种水溶性衍生物，具有良好的稳定性、组织及血液相容性、可降解性以及有效的膜穿透性等特性。由于它是一种含有活性氨基、羧基的两亲性可降解性多糖，可与多种生物活性物偶联，因而成为新一代药物载体优选的包被材料。通过在磁性纳米颗粒(MNPs)表面包被羧甲基壳聚糖(CMC)可以提高载体的分散稳定性、相容性及水溶性。
[0004]功能化磁性纳米颗粒作为给药载体可克服传统给药方式所带来的缺陷，如药物随着载体被输送至靶区(肿瘤部位)周围使靶区很快达到所需浓度，因此可降低给药剂量，减少药物降解，提高药物稳定性及生物利用度、延长药物的体内循环时间、实现药物的缓释和控释等，将成为肿瘤治疗的主导。但是，目前该领域仍然存在许多技术瓶颈问题尚待解决:治疗性药物面临着如何被特异和有效地转运到靶(肿瘤)细胞的难题;载体能否将药物安全有效地运输到指定部位、转入靶细胞并在胞质中发挥作用;如何改善载体表面性质，以避免载体被肝、脾、肺、骨髓等网状内皮系统吞噬；如何提高载体的载药量等。针对上述问题，靶向功能化磁纳米载体为抗肿瘤药物的靶向运输提供了一个新的方向。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供本发明的目的在于针对目前抗肿瘤药物靶向输送困难、易降解及体内循环时间短等肿瘤治疗中迫切需要解决的问题，构建一种具有配体特异性靶向功能的纳米药物输送体系。
[0006]本发明的技术方案为:EGF配体革El向纳米载药体系，载药体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，其中装载抗肿瘤药物，并在其表面修饰表皮生长因子 EGF。
[0007 ]进一步地，所述磁核为超顺磁性能的四氧化三铁纳米颗粒。
[0008]进一步地，所述抗肿瘤药物为长春新碱VCR。
[0009 ] EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤:
①磁核的制备:利用部分还原三氯化铁溶液共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒；
②磁核包被及药物装载:通过反相微乳液法在四氧化三铁纳米颗粒表面包被羧甲基壳聚糖及装载抗肿瘤药物制备药物-CMC/MNPs;
③EGF修饰药物-CMC/MNPs:采用EDC活化羧基偶联表皮生长因子EGF的方法制备EGF-药物-CMC/ MNPs0
[0010]进一步地，EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤:
①利用部分还原三氯化铁(FeCl3)溶液共沉淀法，磁力搅拌条件下制备载体核四氧化三铁纳米颗粒溶液，脱氧水洗涤、真空干燥、研磨过滤即得四氧化三铁纳米颗粒；
②采用生物相容性的羧甲基壳聚糖(CMC)作为磁核包被材料，利用反相微乳液法在氮气保护的条件下，机械搅拌进行包被和装载抗肿瘤药物，所得产物在外加磁场的条件下进行磁分离洗涤，真空干燥，收集即为药物-CMC/MNPs;
③反应在MES溶液中进行，加入EDC混匀后，加入EGF，振荡反应，所得产物用I3BS磁分离洗涤，即得EGF-药物-CMC/MNPs。
[0011]进一步地，步骤③的具体方法为:
将药物-CMC/MNPs超声分散于MES溶液中，pH 4.5-7.4，加入I mg/mL EDC混匀后，加入
0.5-2 mg/mL表皮生长因子，高速振荡反应2 h，所得产物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)磁分离洗涤，制备得到表皮生长因子配体靶向的载药复合物EGF-药物-CMC/ MNPs。
[0012]主动革E向磁性纳米颗粒通过其表面偶联特定的配体(或抗体)与革E细胞表面相应受体特异性地结合，促进靶细胞对治疗药物的摄入，避免被肝、脾、肺、骨髓等网状内皮系统巨噬细胞的吞噬，大大提高载体的特异性、靶向性及选择性，提高药物在肿瘤组织中的浓度。
[0013]表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erbBl在细胞膜上表达的多功能糖蛋白，能与表皮生长因子(EGF)配体特异性结合。在不同分化程度的肿瘤组织中，其表达水平随肿瘤恶性级别的增高而增高，这种表皮生长因子受体差异性表达使得表皮生长因子受体成为一种潜在的肿瘤靶向分子标志物，因此，我们选择表皮生长因子配体作为修饰磁纳米颗粒的靶向分子，通过表皮生长因子受体与其配体表皮生长因子在细胞膜上特异性结合，构建表皮生长因子配体主动革El向的磁纳米颗粒作为抗肿瘤药物输送载体，提高抗肿瘤药物的革巴向性、选择性和聚集性。
[0014]本发明与现有技术相比具有如下优点:
本发明制备的表皮生长因子(EG1靶向纳米载体，具有高度的靶向选择性，相比非靶向的纳米载药体系，显著提高药物的生物利用率，减少对正常组织细胞的毒副作用。
[0015]本发明纳米载体和载药体系的制备方法操作简便、反应条件温和，制备产物可作为抗肿瘤药物的广泛载体，为高效的抗肿瘤药物靶向输送载体研究提供了一种新的发展方向。
【附图说明】
[0016]图1为EGF偶联纳米载药体系的构建及靶向抑制胶质瘤增殖示意图。
[0017]图2为实施例1所构建纳米载药体系的透射电子显微镜(TEM)图。
[0018]图3为实施例1EGF靶向纳米载药体系的红外光谱(FT-1R)图。
[0019]图4为实施例2EGF靶向纳米载药体系的磁响应图。
[0020]图5为实施例3EGF靶向纳米载药体系抑制U251细胞增殖。
[0021]图6为实施例4EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞活性降低。
[0022]图7为实施例5EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞骨架损伤。
[0023]图8为实施例6EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞凋亡。
[0024]图9为实施例7EGF靶向纳米载药体系阻滞U251细胞周期进程。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0026]实施例1
一种EGF配体靶向纳米载药体系的构建示意图参见图1，其具体的制备步骤如下:
(I)磁核即超顺磁性纳米颗粒(MNPs)的制备:吸取10.5 mL去离子水于三颈烧瓶中，加入3mL2mol/L的FeCl3溶液，以适当的速度开始磁力搅拌；匀速滴加2 mL的Na2SO3;当颜色由红棕色又还原为黄色时，开始缓慢滴加80 mU^NH3.H2O溶液，并剧烈搅拌，黑色沉淀迅速生成;继续搅拌40 min，以保证反应完全；用脱氧水洗涤黑色沉淀3次，45°C条件下真空干燥，仔细研磨过滤即得Fe3O4粉末。
[0027](2)采用反向微乳液法制备药物-CMC/MNPs:取适量抗肿瘤药物、CMC及MNPs(质量比2:1)溶于5mL的去离子水(DI)中，在氮气(N2)保护下，超声处理30 min，形成悬浮液。同时，在三口烧瓶中加入50mL液体石錯和司盘80，在氮气(N2)保护下55°水浴，600 rpm搅拌至乳状物;然后把上述悬浮液逐滴滴加至三口烧瓶中，高速搅拌2 h，然后低速搅拌10 h，形成油包水微乳液，在外加磁场的条件下进行磁分离沉淀，用石油醚，异丙醇交替洗涤三次，最后至于石油醚中，真空干燥。收集即为药物-CMC/MNPs粉末。
[0028](3)采用EDC活化羧基偶联EGF的方法制备EGF-药物-CMC/MNPs:取5mgCMC/MNPs或药物-CMC/MNPs粉末，紫外照射10 min后加入1.5 mLEP管中，再加入0.5 mLMES溶液，超声5min，使粉末充分溶解；同时，加入20 yL EDC于上述CMC/ MNPs溶液，混合后加入5 yL的EGF，放置于ZDY-1型震荡仪，高速震荡反应。用PBS磁分离洗涤，最后置于PBS，即得EGF-药物-CMC/MNPso
[0029 ]上述实施例中的抗肿瘤药物为长春新碱(VCR )，制备的配体革El向药物磁纳米颗粒复合物为 EGF-VCR-CMC/MNPs。
[0030]将制得的载体CMC/ MNPs采用透射电子显微镜(TEM)进行表征，可观察到图2的现象。图2表明样品的形貌为球形或椭圆形纳米颗粒，平均粒径为±60 nm。
[0031 ] 将制得的载药EGF-VCR-CMC/ MNPs采用红外光谱表征产物的组成，可观察到图3的结果。图3表明成功制备超顺磁性载体核MNPs(Fe-0特征吸收峰在567.7cm—工);羧甲基壳聚糖(CMC)成功包被超顺磁性载体核MNPs，抗肿瘤药物长春新碱(VCR)成功装载、且EGF靶向修饰成功。
[0032]磁响应性能检测:将制备的EGF-VCR-CMC/MNPs分散于DI水中，在外加磁场和自然状态下，每隔一定时间(0、10、20、30、40、50、60 min)利用紫外-可见光分光光度计测量其570 nm处透光率的变化。通过透光率数值的变化，观察纳米颗粒磁响应能力。图4是EGF纳米载药体系EGF-VCR-CMC/ MNPs在自 然状态和磁场状态下的磁响应图，从图中可以看出，EGF-VCR-CMC/ MNPs载药体系在自然状态下具有良好的分散性，放入磁场中具有良好的磁响应性。
[0033]细胞培养实验
胶质瘤U251细胞在5°/‘02和37°(3环境下使用含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素以及100 yg/mL链霉素的RPM1-1640细胞培养液进行常规培养。当细胞生长达90%汇合时，按1:3比例进行常规传代，以保证细胞处于对数生长期。用胰酶处理处于对数生长期的细胞，细胞悬液计数后，按照Ix 14的密度接种至96孔培养板进行培养。实验设置非靶向CMC/MNPs组、靶向EGF-CMC/MNPs组、非靶向VCR-CMC/MNPs和靶向EGF-VCR-CMC/MNPs加药组，每组设置3个重复。培养2处后，加入各浓度载药体系(0、50、100、200、400、800 yg/mL)。处理24h后吸出孔内液体，用I3BS洗两次后，加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT，于培养箱中继续孵育4 h后，加入150 yL的二甲基亚砜(DMS0)，避光振荡孵育15 min后，用微孔板扫描分光光度计测570 nm处的吸光度值。
[0034]利用MTT法检测各种纳米载体处理对U251细胞增殖能力的影响。从图5中可以看出，与未处理的对照相比，在测试浓度范围内，CMC/MNPs和EGF-CMC/MNPs载体组对U251细胞的增殖能力均为产生影响;VCR-CMC/MNPs和EGF-VCR-CMC/MNPs组均明显降低了 U251细胞的增殖能力，且EGF-VCR-CMC/MNPs组对U251细胞的增殖能力产生了更加明显的影响。
[0035]细胞活性分析实验
0.25%胰蛋白酶消化液37°C条件消化处于对数生长期的U251细胞3 min； 1000 rpm离心5 min收集细胞，计数，待用。将细胞按2xl04细胞/孔的密度接种至24孔板进行培养。实验中设置对照组(未处理的U251细胞)、EGF靶向和非靶向加药组，每组设置3个重复。培养48h后加入各浓度载药体系(O、50、100、200、400、800 yg/mL)，细胞经过处理24h后，分别加入终浓度为I yg/mL的二乙酸荧光素(FDA)溶液和终浓度为20 yg/mL的碘化丙啶(PI)溶液，室温条件下孵育10 min，PBS缓冲液洗涤，荧光显微镜下观察细胞的活性。
[0036]利用荧光染料roA/PI双染法分析非靶向VCR-CMC/MNPs和靶向EGF-VCR-CMC/MNPs处理对U251活性的影响。经过FDA/PI双染后活性良好的细胞被FDA染成绿色，而死细胞或受损细胞则被PI染成红色。从图6可以看出，与未处理的U2 51细胞相比，靶向EGF-VCR-CMC/MNPs处理对U251细胞活性的影响明显强于非靶向组VCR-CMC/MNPs。
[0037]细胞凋亡检测实验
收集处于对数生长期的U251胶质瘤细胞，按照IxlO6的密度将细胞接种至六孔板中，培养48 h后，分别加入不同浓度的VCR-CMC/MNPs和EGF-VCR-CMC/MNPs，继续培养12 h后，收集细胞。用PBS洗两次，将细胞置于1.5 mLEP管中，1000r/min离心5min。然后，每个EP管中加入500 yL的CTAB，其中CTAB中加β-巯基乙醇至终体积为0.1%，再加终浓度为20 yg/mL的RNase，65°水浴30 min，每隔5 min轻轻摇晃;再用酸-氯仿-异戊醇抽提，收集上清液;加入等体积的无水乙醇，_20°C沉淀2 h;在低温离心机中离心5min;弃去上清液，加入500 yL75%的预冷乙醇，离心，上清液弃去，将EP管倒置于吸水纸上，使乙醇除净;每管再加20 yL的TE溶解;1%的琼脂糖电泳。电泳后，用凝胶成像系统，观察DNA条带。
[0038]利用DNAladder法检测VCR-CMC/MNPs和EGF-VCR-CMC/MNPs处理对U251 细胞凋亡的影响。从图7可以看出，随着纳米体系浓度的不断升高，DNA ladder更加明显，而且EGF-VCR-CMC/MNPs处理的U251细胞的DNA ladder更加明显，这说明靶向EGF-VCR-CMC/MNPs处理会引起更多U251细胞凋亡。
[0039]用罗丹明标记的鬼笔环肽，检测非靶向组VCR-CMC/MNP s和靶向组EGF-VCR-CMC/MNPs处理后的U251细胞的形态及细胞骨架肌动蛋白F-actin的结构
将细胞接种至24孔板中，培养24 h后，加药处理;处理24 h将加有药物的培养基弃去，用I3BS漂洗；用2.5%的异戊醛固定细胞10-15 min;PBS漂洗两次，加0.5%的TritonX-1OO透化细胞10-15 min;用I3BS漂洗两次，加200 yL罗丹明标记的鬼笔坏肽工作液，孵育30 min；PBS漂洗三次;DAPI染料复染细胞核；用PBS漂洗细胞两次，倒置荧光显微镜观察照相。
[0040]鬼笔环肽是从毒蘑菇中提取出来的一种多肽蛋白，其作用是稳定微丝结构。鬼笔环肽与F-actin有很高的亲和性，能够与之特异性结合，其结合十分稳定。图8表明与未处理的对照组相比，VCR-CMC/MNPs和EGF-VCR-CMC/ MNPs均能引起U251细胞形态的改变，对细胞骨架产生损伤作用，且靶向组对U251细胞骨架的损伤更为明显。
[0041 ] 流式细胞仪处理对U251周期的影响:首先收获不同浓度VCR-CMC/ MNPs和EGF-VCR-CMC/MNPs (0、50、100、200、400、800 yg/mL)12 h后的细胞，并将其离散成细胞悬液，PBS缓冲液洗涤三次并计数后，取IxlO6个细胞的细胞悬液重悬于500 yL PBS缓冲液中；缓慢加入I mL预冷的70%乙醇至上述细胞悬液中，混匀后4°C过夜固定;将细胞悬液离心弃去固定液，重悬于I mL PBS缓冲液中，1000 r/min离心5 min，弃去PBS缓冲液;加入I mL PI染液(50yg/mL)，4°C避光孵育I h;流式细胞仪检测细胞周期分布，然后用CellQuest软件(BDB1sciences公司)进行分析。试验中设置未处理的U251细胞为对照。
[0042]研究利用PI染色、流式细胞仪分析了纳米载体处理对U251细胞周期分布的影响。从图9可以看出，与未处理的对照相比，随着纳米载体浓度的增加，Gl期细胞比例明显增高，这说明U251细胞的增殖被阻滞在GI期。
[0043]以上所述实施例仅表达了本申请的【具体实施方式】，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
【主权项】
1.EGF配体革El向纳米载药体系，其特征在于，载药体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，其中装载抗肿瘤药物，并在其表面修饰表皮生长因子EGF。2.根据权利要求1所述的EGF配体靶向纳米载药体系，其特征在于，所述磁核为具有独特超顺磁性能的四氧化三铁纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的EGF配体靶向纳米载药体系，其特征在于，所述抗肿瘤药物为长春新碱VCR。4.根据权利要求1-3任一项所述的EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: ①磁核的制备:利用部分还原三氯化铁溶液共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒； ②磁核包被及药物装载:通过反相微乳液法在四氧化三铁纳米颗粒表面包被羧甲基壳聚糖及装载抗肿瘤药物，制备药物-CMC/MNPs; ③EGF修饰药物-CMC/MNPs:采用EDC活化羧基偶联表皮生长因子EGF的方法制备EGF-药物-CMC/ MNPs05.根据权利要求4所述的EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: ①利用部分还原三氯化铁(FeCl3)溶液共沉淀法，磁力搅拌条件下制备载体核四氧化三铁纳米颗粒溶液，脱氧水洗涤、真空干燥、研磨过滤即得四氧化三铁纳米颗粒； ②采用生物相容性的羧甲基壳聚糖(CMC)作为磁核包被材料，利用反相微乳液法在氮气保护的条件下，机械搅拌进行包被和装载抗肿瘤药物，所得产物在外加磁场的条件下进行磁分离洗涤，真空干燥，收集即为药物-CMC/MNPs; ③反应在MES溶液中进行，加入EDC混匀后，加入EGF，振荡反应，所得产物用PBS磁分离洗涤，即得EGF-药物-CMC/MNPs。6.根据权利要求4或5所述的EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于，步骤③的具体方法为: 将药物-CMC/MNPs超声分散于MES溶液中，pH 4.5-7.4，加入I mg/mL EDC混匀后，加入0.5-2 mg/mL表皮生长因子，高速振荡反应2 h，所得产物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)磁分离洗涤，制备得到表皮生长因子配体靶向的载药复合物EGF-药物-CMC/ MNPs。7.根据权利要求1-3任一项所述的一种表皮生长因子配体靶向纳米载药体系在肿瘤治疗中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种EGF配体靶向纳米载药体系及其抗肿瘤治疗应用，载药体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，转载抗肿瘤药物于包被层中，并在羧甲基壳聚糖表面修饰表皮生长因子EGF。本发明的表皮生长因子配体靶向纳米载药体系具有生物相容性好、稳定性高、缓释性能好及靶向性特异的特点，使得该体系对肿瘤细胞具有高度的靶向选择性，可定向释放药物于肿瘤部位，进而发挥靶向抑制和杀死肿瘤细胞的作用，提高药物的生物利用率，为肿瘤靶向治疗提供一个新策略。本发明纳米载体和载药体系的制备方法操作简便、反应条件温和，制备产物可作为抗肿瘤药物的广泛载体，为高效的抗肿瘤药物靶向输送载体研究提供了一种新的发展方向。
【IPC分类】A61K47/36, A61K31/475, A61K47/02, A61P35/00, A61K47/42
【公开号】CN105497902
【申请号】CN201510987772
【发明人】王雪琴, 张慧茹, 崔柳青, 何慧, 王小珍, 常岩岩
【申请人】河南工业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月24日
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物纳米载药材料及药物靶向运输领域，具体涉及一种表皮生长因子配体靶向纳米载药体系及其抗肿瘤治疗应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤(癌症)是危害人类健康、威胁人类生命的第一杀手，具有发病率高、死亡率高、治疗困难及易复发等特点。据世界卫生组织最新《世界癌症报告》，2012年全球有1400万新增癌症病例，癌症死亡人数达820万。我国新诊断癌症病例为307万，占全球总数的21.8%，癌症死亡人数约220万，占全球癌症死亡人数的26.9%。而且根据目前的癌症发病趋势，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%。因此，肿瘤治疗面临更加艰巨的任务，而目前化疗作为肿瘤主要治疗手段之一，由于缺乏对肿瘤细胞的选择性，在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了正常组织细胞，进而产生一系列的毒副作用。因此，发展一种引导抗肿瘤药物靶向输送至“病灶”部位、并提高靶区药物浓度的药物载体显得尤为迫切。
[0003]随着纳米技术在肿瘤生物学研究中的不断深入，磁性纳米颗粒(MNPs)因具有良好的生物相容性、低毒性、表面易功能化以及独特的超顺磁性等特点，为肿瘤研究提供了一种新颖、颇具前景的研究材料，以功能化磁性纳米颗粒作为载体、靶向输送抗肿瘤药物成为肿瘤治疗研究的热点。羧甲基壳聚糖(CMC)是壳聚糖经过羧基化反应后生成的一种水溶性衍生物，具有良好的稳定性、组织及血液相容性、可降解性以及有效的膜穿透性等特性。由于它是一种含有活性氨基、羧基的两亲性可降解性多糖，可与多种生物活性物偶联，因而成为新一代药物载体优选的包被材料。通过在磁性纳米颗粒(MNPs)表面包被羧甲基壳聚糖(CMC)可以提高载体的分散稳定性、相容性及水溶性。
[0004]功能化磁性纳米颗粒作为给药载体可克服传统给药方式所带来的缺陷，如药物随着载体被输送至靶区(肿瘤部位)周围使靶区很快达到所需浓度，因此可降低给药剂量，减少药物降解，提高药物稳定性及生物利用度、延长药物的体内循环时间、实现药物的缓释和控释等，将成为肿瘤治疗的主导。但是，目前该领域仍然存在许多技术瓶颈问题尚待解决:治疗性药物面临着如何被特异和有效地转运到靶(肿瘤)细胞的难题;载体能否将药物安全有效地运输到指定部位、转入靶细胞并在胞质中发挥作用;如何改善载体表面性质，以避免载体被肝、脾、肺、骨髓等网状内皮系统吞噬；如何提高载体的载药量等。针对上述问题，靶向功能化磁纳米载体为抗肿瘤药物的靶向运输提供了一个新的方向。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供本发明的目的在于针对目前抗肿瘤药物靶向输送困难、易降解及体内循环时间短等肿瘤治疗中迫切需要解决的问题，构建一种具有配体特异性靶向功能的纳米药物输送体系。
[0006]本发明的技术方案为:EGF配体革El向纳米载药体系，载药体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，其中装载抗肿瘤药物，并在其表面修饰表皮生长因子 EGF。
[0007 ]进一步地，所述磁核为超顺磁性能的四氧化三铁纳米颗粒。
[0008]进一步地，所述抗肿瘤药物为长春新碱VCR。
[0009 ] EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤:
①磁核的制备:利用部分还原三氯化铁溶液共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒；
②磁核包被及药物装载:通过反相微乳液法在四氧化三铁纳米颗粒表面包被羧甲基壳聚糖及装载抗肿瘤药物制备药物-CMC/MNPs;
③EGF修饰药物-CMC/MNPs:采用EDC活化羧基偶联表皮生长因子EGF的方法制备EGF-药物-CMC/ MNPs0
[0010]进一步地，EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤:
①利用部分还原三氯化铁(FeCl3)溶液共沉淀法，磁力搅拌条件下制备载体核四氧化三铁纳米颗粒溶液，脱氧水洗涤、真空干燥、研磨过滤即得四氧化三铁纳米颗粒；
②采用生物相容性的羧甲基壳聚糖(CMC)作为磁核包被材料，利用反相微乳液法在氮气保护的条件下，机械搅拌进行包被和装载抗肿瘤药物，所得产物在外加磁场的条件下进行磁分离洗涤，真空干燥，收集即为药物-CMC/MNPs;
③反应在MES溶液中进行，加入EDC混匀后，加入EGF，振荡反应，所得产物用I3BS磁分离洗涤，即得EGF-药物-CMC/MNPs。
[0011]进一步地，步骤③的具体方法为:
将药物-CMC/MNPs超声分散于MES溶液中，pH 4.5-7.4，加入I mg/mL EDC混匀后，加入
0.5-2 mg/mL表皮生长因子，高速振荡反应2 h，所得产物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)磁分离洗涤，制备得到表皮生长因子配体靶向的载药复合物EGF-药物-CMC/ MNPs。
[0012]主动革E向磁性纳米颗粒通过其表面偶联特定的配体(或抗体)与革E细胞表面相应受体特异性地结合，促进靶细胞对治疗药物的摄入，避免被肝、脾、肺、骨髓等网状内皮系统巨噬细胞的吞噬，大大提高载体的特异性、靶向性及选择性，提高药物在肿瘤组织中的浓度。
[0013]表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erbBl在细胞膜上表达的多功能糖蛋白，能与表皮生长因子(EGF)配体特异性结合。在不同分化程度的肿瘤组织中，其表达水平随肿瘤恶性级别的增高而增高，这种表皮生长因子受体差异性表达使得表皮生长因子受体成为一种潜在的肿瘤靶向分子标志物，因此，我们选择表皮生长因子配体作为修饰磁纳米颗粒的靶向分子，通过表皮生长因子受体与其配体表皮生长因子在细胞膜上特异性结合，构建表皮生长因子配体主动革El向的磁纳米颗粒作为抗肿瘤药物输送载体，提高抗肿瘤药物的革巴向性、选择性和聚集性。
[0014]本发明与现有技术相比具有如下优点:
本发明制备的表皮生长因子(EG1靶向纳米载体，具有高度的靶向选择性，相比非靶向的纳米载药体系，显著提高药物的生物利用率，减少对正常组织细胞的毒副作用。
[0015]本发明纳米载体和载药体系的制备方法操作简便、反应条件温和，制备产物可作为抗肿瘤药物的广泛载体，为高效的抗肿瘤药物靶向输送载体研究提供了一种新的发展方向。
【附图说明】
[0016]图1为EGF偶联纳米载药体系的构建及靶向抑制胶质瘤增殖示意图。
[0017]图2为实施例1所构建纳米载药体系的透射电子显微镜(TEM)图。
[0018]图3为实施例1EGF靶向纳米载药体系的红外光谱(FT-1R)图。
[0019]图4为实施例2EGF靶向纳米载药体系的磁响应图。
[0020]图5为实施例3EGF靶向纳米载药体系抑制U251细胞增殖。
[0021]图6为实施例4EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞活性降低。
[0022]图7为实施例5EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞骨架损伤。
[0023]图8为实施例6EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞凋亡。
[0024]图9为实施例7EGF靶向纳米载药体系阻滞U251细胞周期进程。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0026]实施例1
一种EGF配体靶向纳米载药体系的构建示意图参见图1，其具体的制备步骤如下:
(I)磁核即超顺磁性纳米颗粒(MNPs)的制备:吸取10.5 mL去离子水于三颈烧瓶中，加入3mL2mol/L的FeCl3溶液，以适当的速度开始磁力搅拌；匀速滴加2 mL的Na2SO3;当颜色由红棕色又还原为黄色时，开始缓慢滴加80 mU^NH3.H2O溶液，并剧烈搅拌，黑色沉淀迅速生成;继续搅拌40 min，以保证反应完全；用脱氧水洗涤黑色沉淀3次，45°C条件下真空干燥，仔细研磨过滤即得Fe3O4粉末。
[0027](2)采用反向微乳液法制备药物-CMC/MNPs:取适量抗肿瘤药物、CMC及MNPs(质量比2:1)溶于5mL的去离子水(DI)中，在氮气(N2)保护下，超声处理30 min，形成悬浮液。同时，在三口烧瓶中加入50mL液体石錯和司盘80，在氮气(N2)保护下55°水浴，600 rpm搅拌至乳状物;然后把上述悬浮液逐滴滴加至三口烧瓶中，高速搅拌2 h，然后低速搅拌10 h，形成油包水微乳液，在外加磁场的条件下进行磁分离沉淀，用石油醚，异丙醇交替洗涤三次，最后至于石油醚中，真空干燥。收集即为药物-CMC/MNPs粉末。
[0028](3)采用EDC活化羧基偶联EGF的方法制备EGF-药物-CMC/MNPs:取5mgCMC/MNPs或药物-CMC/MNPs粉末，紫外照射10 min后加入1.5 mLEP管中，再加入0.5 mLMES溶液，超声5min，使粉末充分溶解；同时，加入20 yL EDC于上述CMC/ MNPs溶液，混合后加入5 yL的EGF，放置于ZDY-1型震荡仪，高速震荡反应。用PBS磁分离洗涤，最后置于PBS，即得EGF-药物-CMC/MNPso
[0029 ]上述实施例中的抗肿瘤药物为长春新碱(VCR )，制备的配体革El向药物磁纳米颗粒复合物为 EGF-VCR-CMC/MNPs。
[0030]将制得的载体CMC/ MNPs采用透射电子显微镜(TEM)进行表征，可观察到图2的现象。图2表明样品的形貌为球形或椭圆形纳米颗粒，平均粒径为±60 nm。
[0031 ] 将制得的载药EGF-VCR-CMC/ MNPs采用红外光谱表征产物的组成，可观察到图3的结果。图3表明成功制备超顺磁性载体核MNPs(Fe-0特征吸收峰在567.7cm—工);羧甲基壳聚糖(CMC)成功包被超顺磁性载体核MNPs，抗肿瘤药物长春新碱(VCR)成功装载、且EGF靶向修饰成功。
[0032]磁响应性能检测:将制备的EGF-VCR-CMC/MNPs分散于DI水中，在外加磁场和自然状态下，每隔一定时间(0、10、20、30、40、50、60 min)利用紫外-可见光分光光度计测量其570 nm处透光率的变化。通过透光率数值的变化，观察纳米颗粒磁响应能力。图4是EGF纳米载药体系EGF-VCR-CMC/ MNPs在自 然状态和磁场状态下的磁响应图，从图中可以看出，EGF-VCR-CMC/ MNPs载药体系在自然状态下具有良好的分散性，放入磁场中具有良好的磁响应性。
[0033]细胞培养实验
胶质瘤U251细胞在5°/‘02和37°(3环境下使用含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素以及100 yg/mL链霉素的RPM1-1640细胞培养液进行常规培养。当细胞生长达90%汇合时，按1:3比例进行常规传代，以保证细胞处于对数生长期。用胰酶处理处于对数生长期的细胞，细胞悬液计数后，按照Ix 14的密度接种至96孔培养板进行培养。实验设置非靶向CMC/MNPs组、靶向EGF-CMC/MNPs组、非靶向VCR-CMC/MNPs和靶向EGF-VCR-CMC/MNPs加药组，每组设置3个重复。培养2处后，加入各浓度载药体系(0、50、100、200、400、800 yg/mL)。处理24h后吸出孔内液体，用I3BS洗两次后，加入终浓度为0.5 mg/mL的MTT，于培养箱中继续孵育4 h后，加入150 yL的二甲基亚砜(DMS0)，避光振荡孵育15 min后，用微孔板扫描分光光度计测570 nm处的吸光度值。
[0034]利用MTT法检测各种纳米载体处理对U251细胞增殖能力的影响。从图5中可以看出，与未处理的对照相比，在测试浓度范围内，CMC/MNPs和EGF-CMC/MNPs载体组对U251细胞的增殖能力均为产生影响;VCR-CMC/MNPs和EGF-VCR-CMC/MNPs组均明显降低了 U251细胞的增殖能力，且EGF-VCR-CMC/MNPs组对U251细胞的增殖能力产生了更加明显的影响。
[0035]细胞活性分析实验
0.25%胰蛋白酶消化液37°C条件消化处于对数生长期的U251细胞3 min； 1000 rpm离心5 min收集细胞，计数，待用。将细胞按2xl04细胞/孔的密度接种至24孔板进行培养。实验中设置对照组(未处理的U251细胞)、EGF靶向和非靶向加药组，每组设置3个重复。培养48h后加入各浓度载药体系(O、50、100、200、400、800 yg/mL)，细胞经过处理24h后，分别加入终浓度为I yg/mL的二乙酸荧光素(FDA)溶液和终浓度为20 yg/mL的碘化丙啶(PI)溶液，室温条件下孵育10 min，PBS缓冲液洗涤，荧光显微镜下观察细胞的活性。
[0036]利用荧光染料roA/PI双染法分析非靶向VCR-CMC/MNPs和靶向EGF-VCR-CMC/MNPs处理对U251活性的影响。经过FDA/PI双染后活性良好的细胞被FDA染成绿色，而死细胞或受损细胞则被PI染成红色。从图6可以看出，与未处理的U2 51细胞相比，靶向EGF-VCR-CMC/MNPs处理对U251细胞活性的影响明显强于非靶向组VCR-CMC/MNPs。
[0037]细胞凋亡检测实验
收集处于对数生长期的U251胶质瘤细胞，按照IxlO6的密度将细胞接种至六孔板中，培养48 h后，分别加入不同浓度的VCR-CMC/MNPs和EGF-VCR-CMC/MNPs，继续培养12 h后，收集细胞。用PBS洗两次，将细胞置于1.5 mLEP管中，1000r/min离心5min。然后，每个EP管中加入500 yL的CTAB，其中CTAB中加β-巯基乙醇至终体积为0.1%，再加终浓度为20 yg/mL的RNase，65°水浴30 min，每隔5 min轻轻摇晃;再用酸-氯仿-异戊醇抽提，收集上清液;加入等体积的无水乙醇，_20°C沉淀2 h;在低温离心机中离心5min;弃去上清液，加入500 yL75%的预冷乙醇，离心，上清液弃去，将EP管倒置于吸水纸上，使乙醇除净;每管再加20 yL的TE溶解;1%的琼脂糖电泳。电泳后，用凝胶成像系统，观察DNA条带。
[0038]利用DNAladder法检测VCR-CMC/MNPs和EGF-VCR-CMC/MNPs处理对U251 细胞凋亡的影响。从图7可以看出，随着纳米体系浓度的不断升高，DNA ladder更加明显，而且EGF-VCR-CMC/MNPs处理的U251细胞的DNA ladder更加明显，这说明靶向EGF-VCR-CMC/MNPs处理会引起更多U251细胞凋亡。
[0039]用罗丹明标记的鬼笔环肽，检测非靶向组VCR-CMC/MNP s和靶向组EGF-VCR-CMC/MNPs处理后的U251细胞的形态及细胞骨架肌动蛋白F-actin的结构
将细胞接种至24孔板中，培养24 h后，加药处理;处理24 h将加有药物的培养基弃去，用I3BS漂洗；用2.5%的异戊醛固定细胞10-15 min;PBS漂洗两次，加0.5%的TritonX-1OO透化细胞10-15 min;用I3BS漂洗两次，加200 yL罗丹明标记的鬼笔坏肽工作液，孵育30 min；PBS漂洗三次;DAPI染料复染细胞核；用PBS漂洗细胞两次，倒置荧光显微镜观察照相。
[0040]鬼笔环肽是从毒蘑菇中提取出来的一种多肽蛋白，其作用是稳定微丝结构。鬼笔环肽与F-actin有很高的亲和性，能够与之特异性结合，其结合十分稳定。图8表明与未处理的对照组相比，VCR-CMC/MNPs和EGF-VCR-CMC/ MNPs均能引起U251细胞形态的改变，对细胞骨架产生损伤作用，且靶向组对U251细胞骨架的损伤更为明显。
[0041 ] 流式细胞仪处理对U251周期的影响:首先收获不同浓度VCR-CMC/ MNPs和EGF-VCR-CMC/MNPs (0、50、100、200、400、800 yg/mL)12 h后的细胞，并将其离散成细胞悬液，PBS缓冲液洗涤三次并计数后，取IxlO6个细胞的细胞悬液重悬于500 yL PBS缓冲液中；缓慢加入I mL预冷的70%乙醇至上述细胞悬液中，混匀后4°C过夜固定;将细胞悬液离心弃去固定液，重悬于I mL PBS缓冲液中，1000 r/min离心5 min，弃去PBS缓冲液;加入I mL PI染液(50yg/mL)，4°C避光孵育I h;流式细胞仪检测细胞周期分布，然后用CellQuest软件(BDB1sciences公司)进行分析。试验中设置未处理的U251细胞为对照。
[0042]研究利用PI染色、流式细胞仪分析了纳米载体处理对U251细胞周期分布的影响。从图9可以看出，与未处理的对照相比，随着纳米载体浓度的增加，Gl期细胞比例明显增高，这说明U251细胞的增殖被阻滞在GI期。
[0043]以上所述实施例仅表达了本申请的【具体实施方式】，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
【主权项】
1.EGF配体革El向纳米载药体系，其特征在于，载药体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，其中装载抗肿瘤药物，并在其表面修饰表皮生长因子EGF。2.根据权利要求1所述的EGF配体靶向纳米载药体系，其特征在于，所述磁核为具有独特超顺磁性能的四氧化三铁纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的EGF配体靶向纳米载药体系，其特征在于，所述抗肿瘤药物为长春新碱VCR。4.根据权利要求1-3任一项所述的EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: ①磁核的制备:利用部分还原三氯化铁溶液共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒； ②磁核包被及药物装载:通过反相微乳液法在四氧化三铁纳米颗粒表面包被羧甲基壳聚糖及装载抗肿瘤药物，制备药物-CMC/MNPs; ③EGF修饰药物-CMC/MNPs:采用EDC活化羧基偶联表皮生长因子EGF的方法制备EGF-药物-CMC/ MNPs05.根据权利要求4所述的EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: ①利用部分还原三氯化铁(FeCl3)溶液共沉淀法，磁力搅拌条件下制备载体核四氧化三铁纳米颗粒溶液，脱氧水洗涤、真空干燥、研磨过滤即得四氧化三铁纳米颗粒； ②采用生物相容性的羧甲基壳聚糖(CMC)作为磁核包被材料，利用反相微乳液法在氮气保护的条件下，机械搅拌进行包被和装载抗肿瘤药物，所得产物在外加磁场的条件下进行磁分离洗涤，真空干燥，收集即为药物-CMC/MNPs; ③反应在MES溶液中进行，加入EDC混匀后，加入EGF，振荡反应，所得产物用PBS磁分离洗涤，即得EGF-药物-CMC/MNPs。6.根据权利要求4或5所述的EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，其特征在于，步骤③的具体方法为: 将药物-CMC/MNPs超声分散于MES溶液中，pH 4.5-7.4，加入I mg/mL EDC混匀后，加入0.5-2 mg/mL表皮生长因子，高速振荡反应2 h，所得产物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)磁分离洗涤，制备得到表皮生长因子配体靶向的载药复合物EGF-药物-CMC/ MNPs。7.根据权利要求1-3任一项所述的一种表皮生长因子配体靶向纳米载药体系在肿瘤治疗中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种EGF配体靶向纳米载药体系及其抗肿瘤治疗应用，载药体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，转载抗肿瘤药物于包被层中，并在羧甲基壳聚糖表面修饰表皮生长因子EGF。本发明的表皮生长因子配体靶向纳米载药体系具有生物相容性好、稳定性高、缓释性能好及靶向性特异的特点，使得该体系对肿瘤细胞具有高度的靶向选择性，可定向释放药物于肿瘤部位，进而发挥靶向抑制和杀死肿瘤细胞的作用，提高药物的生物利用率，为肿瘤靶向治疗提供一个新策略。本发明纳米载体和载药体系的制备方法操作简便、反应条件温和，制备产物可作为抗肿瘤药物的广泛载体，为高效的抗肿瘤药物靶向输送载体研究提供了一种新的发展方向。
【IPC分类】A61K47/36, A61K31/475, A61K47/02, A61P35/00, A61K47/42
【公开号】CN105497902
【申请号】CN201510987772
【发明人】王雪琴, 张慧茹, 崔柳青, 何慧, 王小珍, 常岩岩
【申请人】河南工业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月24日
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