一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法
一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及疫苗助剂领域，具体设及一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 本发明所设及重组伪狂犬病毒，保藏于中国典型培养物培养中屯、、保藏号为： CCTCC-V201408,可用于制备猪伪狂犬病防治用疫苗。
[0003] 目前，在我国兽用生物制品中，活的冻干疫苗占相当大的比例，国内常用的保护剂 主要为牛奶、薦糖、明胶等，组方简单，保护功能差。如果在2°C~8°C条件下，保存期只有4 ~6月，多需要在-15°CW下保存。加上国内传统的兽用生物制品保护剂的研制相对滞后，使 成品的长期保存和运输受限。所W，耐热冻干保护剂的研究是非常急需的，在20世纪80年 代，发达国家就已开始进行耐热冻干保护剂的研究。我国在耐热冻干保护剂方面的研究起 步较晚，加上中国市场巨大，国外生物制品涌入，市场竞争加剧。为了本国生物制品业的生 存和发展，新型有效的耐热冻干保护剂的研究和应用显得尤为迫切。
[0004] 中国专利申请201310553466.X公开了一种动物活疫苗耐热冻干保护剂，各成分含 量为：乳糖80-200g/L、水解乳白蛋白10-40g/L、聚乙締化咯烧酬5-20g/L、甘露醇0-2〇g/L、谷氨酸钢5-20g/L、精氨酸盐酸盐5-15g/L、水解蚕丝蛋白10-30g/L，制得的疫苗安 全无菌、质量稳定，具有耐热、保存时间长的特点，解决了疫苗在运输过程中需要低溫冷冻、 胆存不便等问题。但该保护剂在36°C溫度下保存时间不长。
[000引因此，有必要提供一种在较高溫度和低溫下保存时间长，病毒损失率低，耐老化程 度高的耐热冻干保护剂。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种外观良好，病毒损失率低，耐老化程度高，保存期长的 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，相应地，本发明还提供该耐热冻干保护剂的制备 方法。
[0007] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻 干保护剂，所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶2-6%、乳糖0.2-4%、薦糖2-5%、植物多糖0.1-0.5%、山梨醇l-3%、k谷氨酸1-1.5%组氨酸0.1-1 %、维生素C 0.2-0.5%、维生素E 0.1-0.3%、无水憐酸二氨钟1-2%、叔下醇0.5-1%和人血清白蛋白0.1-1 %， 余量为注射用水。
[000引优选地，所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶2%、乳糖0.2%、薦糖 2%、植物多糖0.1%、山梨醇i%a-谷氨酸1 % a-组氨酸0.1 %、维生素C 0.2%、维生素E 0.1%、无水憐酸二氨钟1%、叔下醇0.5%和人血清白蛋白0.1 %，余量为注射用水。
[0009]优选地，所述保护剂包括W下重量百分数的组分：水解明胶6%、乳糖4%、薦糖 5%、植物多糖0.3%、山梨醇3%a-谷氨酸1.5% a-组氨酸1 %、维生素C 0.5%、维生素E 0.3%、无水憐酸二氨钟2%、叔下醇1%和人血清白蛋白I %，余量为注射用水。
[0010] 优选地，所述保护剂包括W下重量百分数的组分：水解明胶4%、乳糖2%、薦糖 3.5 %、植物多糖0.5%、山梨醇2%、k谷氨酸1.5 %、k组氨酸0.5 %、维生素C 0.4%、维生素E 0.2%、无水憐酸二氨钟1.5%、叔下醇0.8%和人血清白蛋白0.5%，余量为注射用水。
[0011] 优选地，所述伪狂犬病病毒为重组伪狂犬病病毒，所述重组伪狂犬病病毒保藏于 中国典型培养物培养中屯、，保藏号为:CCTCC-V201408。
[0012] 优选地，所述植物多糖由黄巧多糖和香茹多糖按(1-1.5):(0.5-1)的重量比组成。
[0013] 优选地，所述保护剂还包括W下重量百分数的组分:天冬氨酸0.5-1%。
[0014] 相应地，本发明还提供了一种所述伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方 法，包括如下步骤： а. 取水解明胶、乳糖、薦糖、植物多糖、山梨醇、无水憐酸二氨钟和叔下醇溶于部分注射 用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5-4/5,然后在115-125°C的溫度下进行灭 菌处理15-25min，得到溶液A; б. 取心谷氨酸组氨酸、维生素C、维生素EW及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水 中，用孔径为0.15-0.20WI1的滤膜过滤除菌，得到溶液B; C.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。
[0015] 优选地，在所述b步骤中加入天冬氨酸。
[0016] 优选地，所述a步骤中，在115°C的溫度下进行灭菌处理15min，所述b步骤中，滤膜 孔径为0.20皿。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下优点： (1)本发明耐热冻干保护剂能够使疫苗在2-8°C下保存期由原来的1年提高到2年， 保存时间显著延长。
[0018] (2)本发明耐热冻干保护剂保护的冻干产品（疫苗），耐热后病毒含量仅下降约 0.1-0.2个滴度，现有的耐热冻干保护剂下降0.8个滴度。
[0019] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
【具体实施方式】
[0020] 本发明部分组分的厂家和货号等信息如下：
实施例1 一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶2%、乳糖0.2%、薦糖2%、植物多糖 0.1%、山梨醇l%、k谷氨酸1%组氨酸0.1%、维生素C 0.2%、维生素E 0.1%、无水憐酸二 氨钟1%、叔下醇0.5%和人血清白蛋白0.1 %，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄巧多 糖0.05%和香茹多糖0.05%组成。
[0021 ]制备方法： а. 取水解明胶、乳糖、黄巧多糖、香茹多糖、薦糖、山梨醇、无水憐酸二氨钟和叔下醇溶 于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5,然后在115°C的溫度下进行 灭菌处理15min，得到溶液A; б. 取心谷氨酸组氨酸、维生素C、维生素EW及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水 中，用孔径为0.20WI1的滤膜过滤除菌，得到溶液B; C.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。 实施例2 -种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶6%、乳糖4%、薦糖5%、植物多糖 0.3%、山梨醇3%a-谷氨酸1.5%a-组氨酸1 %、天冬氨酸0.6%、维生素C 0.5%、维生素 EO.3%、无水憐酸二氨钟2%、叔下醇1%和人血清白蛋白1%，余量为注射用水，其中，所述植物 多糖由黄巧多糖0.2%和香茹多糖0.1%组成。
[002引制备方法： а. 取水解明胶、乳糖、黄巧多糖、香茹多糖、薦糖、山梨醇、无水憐酸二氨钟和叔下醇溶 于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射水总量的3/5,然后在115°C的溫度下进行灭 菌处理15min，得到溶液A; б. 取心谷氨酸组氨酸、天冬氨酸、维生素C、维生素EW及人血清白蛋溶于剩余部分 的注射用水中，用孔径为0.20WI1的滤膜过滤除菌，得到溶液B; C.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。
[0023] 实施例3-种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶4%、乳糖2%、薦糖3.5%、植物多糖 0.5%、山梨醇2%、1^-谷氨酸1.5 % a-组氨酸0.5 %、天冬氨酸1%、维生素C 0.4%、维生素E 0.2%、无水憐酸二氨钟1.5%、叔下醇0.8%和人血清白蛋白0.5 %，余量为注射用水，其中，所 述植物多糖由黄巧多糖0.3%和香茹多糖0.2%组成。
[0024] 制备方法如实施例2。
[0025] 对比例1 一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述植物多糖为黄巧多糖，其余成分如实施例2。
[0026] 制备方法参考实施例2。
[0027] 对比例2-种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述植物多糖由黄巧多糖0.1%和香茹多糖0.2%组成。
[002引制备方法参考实施例2。
[0029] 对比例3-种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶6%、乳糖4%、薦糖5%、植物多糖 0.3%、山梨醇3%、k谷氨酸1.5%组氨酸1 %、天冬氨酸0.6%、维生素EO. 3%、无水憐酸二氨 钟2%、叔下醇1%、人血清白蛋白1 %，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄巧多糖0.2% 和香茹多糖0.1%组成。
[0030] 制备方法参考实施例2。
[0031 ]性能测试 1.制苗用毒液的制备 1.1材料 1.1.1病毒和细胞 重组伪狂犬病病毒巧RV-0RF2为发明人自主构建与保存，该重组伪狂犬病病毒保藏在 中国典型培养物培养中屯、、保藏号为：CCTCC-V201408 ;该重组伪狂犬病病毒可有效表达 PCV2的0RF2基因，可用于制备PCV2-PRV二联基因工程疫苗。ST细胞购自中国兽药监察所。
[00创 1.1.2血清、培养基和膜蛋白酶类试剂 胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，膜蛋白酶为Sigma公司产品。氯化钢、氯化钟、 葡萄糖、Na肥03、抓TA为分析纯试剂。
[003 3] 1.1.3试验动物与抗体检测试剂盒 35日龄PRV抗体阴性、PCV2抗体阴性断奶仔猪购自新兴某猪场，PRVgB抗体检测试剂盒 为IDEXX公司产品，PCV2抗体检测试剂盒为武汉科前公司产品。
[0034] 1.2制备方法 选用生长良好单层ST细胞，倾去细胞生长液，加入0.3%。重组病毒巧RV-0RF2病毒液， 37°C吸附化后，加入适量细胞维持液(2%FBS的DMEM)，37°C继续培养，当全部细胞出现CPE 时，冻融收获病毒，置-80°C W下保存备用。
[0035] 耐热保护剂配方的确定 取实施例1-3和对比例1-3的耐热冻干保护剂，将各配方保护剂分别与上述巧RV-0RF2 病毒悬液Wl: 1混合配苗分装，3mL/瓶，按照设计的冻干曲线进行冻干试验，冻干后测定病 毒滴度，筛选出最佳的耐热保护剂配方，确定为生产条件。产品在-80°C预冻过夜后，转入 C皿1ST公司的ALPHA1-4冻干机的冻干箱内，探索主干燥时的真空度及干燥时间，测试结果 见表1。
[0036] 表1本发明实施例1-3W及对比例1-3冻干前后疫苗的毒价(TCIDso/瓶）
结论:各试验组冻干后，疫苗外观良好，微黄色海绵状疏松团块，体积略有萎缩，疫苗脱 离瓶壁，无结晶，其中，实施例2效果最好，冻干前疫苗滴度为107'78TCI化〇/瓶，冻干后疫苗滴 度为10 5'S4 TCI化〇/瓶，冻干后疫苗滴度仅下降了0.2个滴度，对比例1-3组由于缺少了某个 成分，其冻干后疫苗滴度与冻干前相比均具有明显下降。同时确定主干燥真空度为0.14-0.16mbar、主干燥时间约为6-化，冷凝器溫度为-55°C。
[0037] PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的生产 按上述筛选出的实施例2作为最佳保护剂配方配制保护剂，与巧RV-0RF2病毒悬液按1: 1混合配苗分装，生产3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗，分别批号为:20120501，20120502， 20120503。
[0038] PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的安全性检验与毒价测定。
[0039] 3.1.1疫苗的安全性检验:将上述S批疫苗注射35日龄PRV抗体阴性与PCV2抗体 阴性的健康断奶仔猪5头，颈部肌肉注射10头份/头，连续观察局部及全身性不良反应21日， 连续21如观察临床症状及进行测定体溫，所有接种猪均无临床症状及无体溫升高。
[0040] 3.1.2疫苗的毒价测定：WST细胞按Reed-Muench两氏法测定与计算疫苗滴度 TCIDso,测得冻干前疫苗滴度为IO 7'58TCIDso/瓶。
[0041 ] 3.1.3疫苗的耐老化试验和保存期试验。
[0042] 耐老化试验方法：在上述3批疫苗中每批随机抽取疫苗5瓶于37°C存放7d后测定 其TCIDsq，并观察物理性状，判断疫苗的热稳定性。
[0043] 保存期试验方法:在上述3批疫苗中每批随机抽取疫苗5瓶于2°C-8°C保存2年。试 验结果如表2 表2 3批疫苗耐老化试验和保存期试验
由上表可知，5瓶疫苗在37°C放置7天的耐老化试验后，物理性状良好，每瓶疫苗的病毒 滴度仅下降0.1-0.2个滴度，在于2°C-8°C保存2年，疫苗病毒含量均无明显下降，可见该配 方能有效提高疫苗的保存期。
[0044] 3.1.4疫苗的效力试验 将3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗，于37°C保存7天后，分别免疫35日龄PRV抗体与 PCV2抗体双阴性健康断奶仔猪5头，免疫剂量1头份，颈部肌肉注射，2周后二免，首免后2周 与二免后2周分别采血，分离血清，用PRVgB抗体检测试剂盒与PCV2抗体检测试剂盒分别测 定PRV抗体与PCV2抗体。PRV gB抗体检测试剂盒判断标准:S/N值大于0.7为阴性，小于0.6为 阳性，位于两者之间为可疑;PCV2抗体检测试剂盒判断标准:OD630值大于0.42为阳性，小于 0.38为阴性，位于两者之间为可疑。
[004引 试验结果:PRV浊抗体检测：3批疫苗免疫猪在首免后2周，除一头可疑外，其它均 转阳，二免后2周所有免疫猪全部转阳；PCV2抗体检测：本实验3批疫苗免疫猪在首免后2 周，除一头阴性外，其它均转阳，二免后2周所有免疫猪全部转阳，且二免后2周的抗体平均 值显著高于一免后2周，结果说明，本发明耐热冻干保护剂中的各种成分及在有效的保存时 间内并不影响疫苗的免疫效力，二免后2周，所有免疫猪均能产生高水平的化ISA抗体。
[0046] 综上所述，本研究筛选到的冻干保护剂配方是一个很好耐热冻干保护剂，可W用 于重组伪狂犬病病毒活疫苗产品的冻干。
[0047] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能W此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂包括以下重量百 分数的组分:水解明胶2-6%、乳糖0.2-4%、蔗糖2-5%、植物多糖0.1-0.5%、山梨醇1-3%、L-谷氨酸1-1.5%、L-组氨酸0.1-1 %、维生素 C 0.2-0.5%、维生素 E 0.1-0.3%、无水磷酸二 氢钾1-2%、叔丁醇0.5-1%和人血清白蛋白0.1-1 %，余量为注射用水。2. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂 包括以下重量百分数的组分:水解明胶2%、乳糖0.2%、蔗糖2%、植物多糖0.1%、山梨醇1%、 L-谷氨酸1 %、L-组氨酸0.1 %、维生素 C 0.2%、维生素 E 0.1%、无水磷酸二氢钾1%、叔丁醇 0.5%和人血清白蛋白0.1 %，余量为注射用水。3. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂 包括以下重量百分数的组分:水解明胶6%、乳糖4%、蔗糖5%、植物多糖0.3%、山梨醇3%、L-谷氨酸1.5%、L-组氨酸1 %、维生素 C 0.5%、维生素 E 0.3%、无水磷酸二氢钾2%、叔丁醇1%和 人血清白蛋白1 %，余量为注射用水。4. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂 包括以下重量百分数的组分:水解明胶4%、乳糖2%、蔗糖3.5%、植物多糖0.5%、山梨醇2%、 L-谷氨酸1.5%、L-组氨酸0.5%、维生素 C 0.4%、维生素 E 0.2%、无水磷酸二氢钾1.5%、叔 丁醇0.8%和人血清白蛋白0.5%，余量为注射用水。5. 根据权利要求1-4任一所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于:所述 伪狂犬病病毒为重组伪狂犬病病毒，所述重组伪狂犬病病毒保藏于中国典型培养物培养中 心，保藏号为:CCTCC-V201408。6. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述植物多 糖由黄芪多糖和香菇多糖按(1-1.5) :(0.5-1)的重量比组成。7. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂 还包括以下重量百分数的组分:天冬氨酸〇. 5-1%。8. 一种根据权利要求1- 7任一所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法， 其特征在于，包括如下步骤： a. 取水解明胶、乳糖、蔗糖、植物多糖、山梨醇、无水磷酸二氢钾和叔丁醇溶于部分注射 用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5-4/5,然后在115-125°C的温度下进行灭 菌处理15-25min，得到溶液A; b. 取L-谷氨酸、L-组氨酸、维生素 C、维生素 E以及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水 中，用孔径为0.15-0.20μπι的滤膜过滤除菌，得到溶液B; c. 将a步骤得到的溶液Α与b步骤得到的溶液Β按1:1的体积比混合，即得产品。9. 根据权利要求8所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于， 在所述b步骤中加入天冬氨酸。10. 根据权利要求8所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在 于，所述a步骤中，在115°C的温度下进行灭菌处理15min，所述b步骤中，滤膜孔径为0.20μπι。
【专利摘要】本发明涉及一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶2-6％、乳糖0.2-4％、蔗糖2-5％、植物多糖0.1-0.5%、山梨醇1-3%、L-谷氨酸1-1.5％、L-组氨酸0.1-1％、维生素C？0.2-0.5%、维生素E？0.1-0.3%、无水磷酸二氢钾1-2%、叔丁醇0.5-1%、人血清白蛋白0.1-1％，余量为注射用水。本发明还提供了该伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。本发明伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂具有能够显著延长疫苗在2-8℃以及在36℃下的保存期，此外其制备方法简单，便于生产应用。
【IPC分类】A61K47/42, A61K39/12, A61P31/20, A61K47/04, A61K47/36, A61K39/245, A61K47/26, A61K47/22, A61P31/22, A61K47/18, A61K47/10
【公开号】CN105497904
【申请号】CN201510966953
【发明人】陈瑞爱, 黄红亮, 谢小雨, 唐兆新, 徐家华, 高艳, 张文炎
【申请人】肇庆大华农生物药品有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月22日
【技术领域】
[0001] 本发明设及疫苗助剂领域，具体设及一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 本发明所设及重组伪狂犬病毒，保藏于中国典型培养物培养中屯、、保藏号为： CCTCC-V201408,可用于制备猪伪狂犬病防治用疫苗。
[0003] 目前，在我国兽用生物制品中，活的冻干疫苗占相当大的比例，国内常用的保护剂 主要为牛奶、薦糖、明胶等，组方简单，保护功能差。如果在2°C~8°C条件下，保存期只有4 ~6月，多需要在-15°CW下保存。加上国内传统的兽用生物制品保护剂的研制相对滞后，使 成品的长期保存和运输受限。所W，耐热冻干保护剂的研究是非常急需的，在20世纪80年 代，发达国家就已开始进行耐热冻干保护剂的研究。我国在耐热冻干保护剂方面的研究起 步较晚，加上中国市场巨大，国外生物制品涌入，市场竞争加剧。为了本国生物制品业的生 存和发展，新型有效的耐热冻干保护剂的研究和应用显得尤为迫切。
[0004] 中国专利申请201310553466.X公开了一种动物活疫苗耐热冻干保护剂，各成分含 量为：乳糖80-200g/L、水解乳白蛋白10-40g/L、聚乙締化咯烧酬5-20g/L、甘露醇0-2〇g/L、谷氨酸钢5-20g/L、精氨酸盐酸盐5-15g/L、水解蚕丝蛋白10-30g/L，制得的疫苗安 全无菌、质量稳定，具有耐热、保存时间长的特点，解决了疫苗在运输过程中需要低溫冷冻、 胆存不便等问题。但该保护剂在36°C溫度下保存时间不长。
[000引因此，有必要提供一种在较高溫度和低溫下保存时间长，病毒损失率低，耐老化程 度高的耐热冻干保护剂。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种外观良好，病毒损失率低，耐老化程度高，保存期长的 重组伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，相应地，本发明还提供该耐热冻干保护剂的制备 方法。
[0007] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻 干保护剂，所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶2-6%、乳糖0.2-4%、薦糖2-5%、植物多糖0.1-0.5%、山梨醇l-3%、k谷氨酸1-1.5%组氨酸0.1-1 %、维生素C 0.2-0.5%、维生素E 0.1-0.3%、无水憐酸二氨钟1-2%、叔下醇0.5-1%和人血清白蛋白0.1-1 %， 余量为注射用水。
[000引优选地，所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶2%、乳糖0.2%、薦糖 2%、植物多糖0.1%、山梨醇i%a-谷氨酸1 % a-组氨酸0.1 %、维生素C 0.2%、维生素E 0.1%、无水憐酸二氨钟1%、叔下醇0.5%和人血清白蛋白0.1 %，余量为注射用水。
[0009]优选地，所述保护剂包括W下重量百分数的组分：水解明胶6%、乳糖4%、薦糖 5%、植物多糖0.3%、山梨醇3%a-谷氨酸1.5% a-组氨酸1 %、维生素C 0.5%、维生素E 0.3%、无水憐酸二氨钟2%、叔下醇1%和人血清白蛋白I %，余量为注射用水。
[0010] 优选地，所述保护剂包括W下重量百分数的组分：水解明胶4%、乳糖2%、薦糖 3.5 %、植物多糖0.5%、山梨醇2%、k谷氨酸1.5 %、k组氨酸0.5 %、维生素C 0.4%、维生素E 0.2%、无水憐酸二氨钟1.5%、叔下醇0.8%和人血清白蛋白0.5%，余量为注射用水。
[0011] 优选地，所述伪狂犬病病毒为重组伪狂犬病病毒，所述重组伪狂犬病病毒保藏于 中国典型培养物培养中屯、，保藏号为:CCTCC-V201408。
[0012] 优选地，所述植物多糖由黄巧多糖和香茹多糖按(1-1.5):(0.5-1)的重量比组成。
[0013] 优选地，所述保护剂还包括W下重量百分数的组分:天冬氨酸0.5-1%。
[0014] 相应地，本发明还提供了一种所述伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方 法，包括如下步骤： а. 取水解明胶、乳糖、薦糖、植物多糖、山梨醇、无水憐酸二氨钟和叔下醇溶于部分注射 用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5-4/5,然后在115-125°C的溫度下进行灭 菌处理15-25min，得到溶液A; б. 取心谷氨酸组氨酸、维生素C、维生素EW及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水 中，用孔径为0.15-0.20WI1的滤膜过滤除菌，得到溶液B; C.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。
[0015] 优选地，在所述b步骤中加入天冬氨酸。
[0016] 优选地，所述a步骤中，在115°C的溫度下进行灭菌处理15min，所述b步骤中，滤膜 孔径为0.20皿。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有如下优点： (1)本发明耐热冻干保护剂能够使疫苗在2-8°C下保存期由原来的1年提高到2年， 保存时间显著延长。
[0018] (2)本发明耐热冻干保护剂保护的冻干产品（疫苗），耐热后病毒含量仅下降约 0.1-0.2个滴度，现有的耐热冻干保护剂下降0.8个滴度。
[0019] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
【具体实施方式】
[0020] 本发明部分组分的厂家和货号等信息如下：
实施例1 一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶2%、乳糖0.2%、薦糖2%、植物多糖 0.1%、山梨醇l%、k谷氨酸1%组氨酸0.1%、维生素C 0.2%、维生素E 0.1%、无水憐酸二 氨钟1%、叔下醇0.5%和人血清白蛋白0.1 %，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄巧多 糖0.05%和香茹多糖0.05%组成。
[0021 ]制备方法： а. 取水解明胶、乳糖、黄巧多糖、香茹多糖、薦糖、山梨醇、无水憐酸二氨钟和叔下醇溶 于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5,然后在115°C的溫度下进行 灭菌处理15min，得到溶液A; б. 取心谷氨酸组氨酸、维生素C、维生素EW及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水 中，用孔径为0.20WI1的滤膜过滤除菌，得到溶液B; C.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。 实施例2 -种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶6%、乳糖4%、薦糖5%、植物多糖 0.3%、山梨醇3%a-谷氨酸1.5%a-组氨酸1 %、天冬氨酸0.6%、维生素C 0.5%、维生素 EO.3%、无水憐酸二氨钟2%、叔下醇1%和人血清白蛋白1%，余量为注射用水，其中，所述植物 多糖由黄巧多糖0.2%和香茹多糖0.1%组成。
[002引制备方法： а. 取水解明胶、乳糖、黄巧多糖、香茹多糖、薦糖、山梨醇、无水憐酸二氨钟和叔下醇溶 于部分注射用水中，该部分的注射用水占注射水总量的3/5,然后在115°C的溫度下进行灭 菌处理15min，得到溶液A; б. 取心谷氨酸组氨酸、天冬氨酸、维生素C、维生素EW及人血清白蛋溶于剩余部分 的注射用水中，用孔径为0.20WI1的滤膜过滤除菌，得到溶液B; C.将a步骤得到的溶液A与b步骤得到的溶液B按1:1的体积比混合，即得产品。
[0023] 实施例3-种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶4%、乳糖2%、薦糖3.5%、植物多糖 0.5%、山梨醇2%、1^-谷氨酸1.5 % a-组氨酸0.5 %、天冬氨酸1%、维生素C 0.4%、维生素E 0.2%、无水憐酸二氨钟1.5%、叔下醇0.8%和人血清白蛋白0.5 %，余量为注射用水，其中，所 述植物多糖由黄巧多糖0.3%和香茹多糖0.2%组成。
[0024] 制备方法如实施例2。
[0025] 对比例1 一种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述植物多糖为黄巧多糖，其余成分如实施例2。
[0026] 制备方法参考实施例2。
[0027] 对比例2-种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述植物多糖由黄巧多糖0.1%和香茹多糖0.2%组成。
[002引制备方法参考实施例2。
[0029] 对比例3-种重组伪狂犬病毒疫苗耐热冻干保护剂 所述保护剂包括W下重量百分数的组分:水解明胶6%、乳糖4%、薦糖5%、植物多糖 0.3%、山梨醇3%、k谷氨酸1.5%组氨酸1 %、天冬氨酸0.6%、维生素EO. 3%、无水憐酸二氨 钟2%、叔下醇1%、人血清白蛋白1 %，余量为注射用水，其中，所述植物多糖由黄巧多糖0.2% 和香茹多糖0.1%组成。
[0030] 制备方法参考实施例2。
[0031 ]性能测试 1.制苗用毒液的制备 1.1材料 1.1.1病毒和细胞 重组伪狂犬病病毒巧RV-0RF2为发明人自主构建与保存，该重组伪狂犬病病毒保藏在 中国典型培养物培养中屯、、保藏号为：CCTCC-V201408 ;该重组伪狂犬病病毒可有效表达 PCV2的0RF2基因，可用于制备PCV2-PRV二联基因工程疫苗。ST细胞购自中国兽药监察所。
[00创 1.1.2血清、培养基和膜蛋白酶类试剂 胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco公司，膜蛋白酶为Sigma公司产品。氯化钢、氯化钟、 葡萄糖、Na肥03、抓TA为分析纯试剂。
[003 3] 1.1.3试验动物与抗体检测试剂盒 35日龄PRV抗体阴性、PCV2抗体阴性断奶仔猪购自新兴某猪场，PRVgB抗体检测试剂盒 为IDEXX公司产品，PCV2抗体检测试剂盒为武汉科前公司产品。
[0034] 1.2制备方法 选用生长良好单层ST细胞，倾去细胞生长液，加入0.3%。重组病毒巧RV-0RF2病毒液， 37°C吸附化后，加入适量细胞维持液(2%FBS的DMEM)，37°C继续培养，当全部细胞出现CPE 时，冻融收获病毒，置-80°C W下保存备用。
[0035] 耐热保护剂配方的确定 取实施例1-3和对比例1-3的耐热冻干保护剂，将各配方保护剂分别与上述巧RV-0RF2 病毒悬液Wl: 1混合配苗分装，3mL/瓶，按照设计的冻干曲线进行冻干试验，冻干后测定病 毒滴度，筛选出最佳的耐热保护剂配方，确定为生产条件。产品在-80°C预冻过夜后，转入 C皿1ST公司的ALPHA1-4冻干机的冻干箱内，探索主干燥时的真空度及干燥时间，测试结果 见表1。
[0036] 表1本发明实施例1-3W及对比例1-3冻干前后疫苗的毒价(TCIDso/瓶）
结论:各试验组冻干后，疫苗外观良好，微黄色海绵状疏松团块，体积略有萎缩，疫苗脱 离瓶壁，无结晶，其中，实施例2效果最好，冻干前疫苗滴度为107'78TCI化〇/瓶，冻干后疫苗滴 度为10 5'S4 TCI化〇/瓶，冻干后疫苗滴度仅下降了0.2个滴度，对比例1-3组由于缺少了某个 成分，其冻干后疫苗滴度与冻干前相比均具有明显下降。同时确定主干燥真空度为0.14-0.16mbar、主干燥时间约为6-化，冷凝器溫度为-55°C。
[0037] PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的生产 按上述筛选出的实施例2作为最佳保护剂配方配制保护剂，与巧RV-0RF2病毒悬液按1: 1混合配苗分装，生产3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗，分别批号为:20120501，20120502， 20120503。
[0038] PCV2-PRV二联基因工程活疫苗的安全性检验与毒价测定。
[0039] 3.1.1疫苗的安全性检验:将上述S批疫苗注射35日龄PRV抗体阴性与PCV2抗体 阴性的健康断奶仔猪5头，颈部肌肉注射10头份/头，连续观察局部及全身性不良反应21日， 连续21如观察临床症状及进行测定体溫，所有接种猪均无临床症状及无体溫升高。
[0040] 3.1.2疫苗的毒价测定：WST细胞按Reed-Muench两氏法测定与计算疫苗滴度 TCIDso,测得冻干前疫苗滴度为IO 7'58TCIDso/瓶。
[0041 ] 3.1.3疫苗的耐老化试验和保存期试验。
[0042] 耐老化试验方法：在上述3批疫苗中每批随机抽取疫苗5瓶于37°C存放7d后测定 其TCIDsq，并观察物理性状，判断疫苗的热稳定性。
[0043] 保存期试验方法:在上述3批疫苗中每批随机抽取疫苗5瓶于2°C-8°C保存2年。试 验结果如表2 表2 3批疫苗耐老化试验和保存期试验
由上表可知，5瓶疫苗在37°C放置7天的耐老化试验后，物理性状良好，每瓶疫苗的病毒 滴度仅下降0.1-0.2个滴度，在于2°C-8°C保存2年，疫苗病毒含量均无明显下降，可见该配 方能有效提高疫苗的保存期。
[0044] 3.1.4疫苗的效力试验 将3批PCV2-PRV二联基因工程活疫苗，于37°C保存7天后，分别免疫35日龄PRV抗体与 PCV2抗体双阴性健康断奶仔猪5头，免疫剂量1头份，颈部肌肉注射，2周后二免，首免后2周 与二免后2周分别采血，分离血清，用PRVgB抗体检测试剂盒与PCV2抗体检测试剂盒分别测 定PRV抗体与PCV2抗体。PRV gB抗体检测试剂盒判断标准:S/N值大于0.7为阴性，小于0.6为 阳性，位于两者之间为可疑;PCV2抗体检测试剂盒判断标准:OD630值大于0.42为阳性，小于 0.38为阴性，位于两者之间为可疑。
[004引 试验结果:PRV浊抗体检测：3批疫苗免疫猪在首免后2周，除一头可疑外，其它均 转阳，二免后2周所有免疫猪全部转阳；PCV2抗体检测：本实验3批疫苗免疫猪在首免后2 周，除一头阴性外，其它均转阳，二免后2周所有免疫猪全部转阳，且二免后2周的抗体平均 值显著高于一免后2周，结果说明，本发明耐热冻干保护剂中的各种成分及在有效的保存时 间内并不影响疫苗的免疫效力，二免后2周，所有免疫猪均能产生高水平的化ISA抗体。
[0046] 综上所述，本研究筛选到的冻干保护剂配方是一个很好耐热冻干保护剂，可W用 于重组伪狂犬病病毒活疫苗产品的冻干。
[0047] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能W此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂包括以下重量百 分数的组分:水解明胶2-6%、乳糖0.2-4%、蔗糖2-5%、植物多糖0.1-0.5%、山梨醇1-3%、L-谷氨酸1-1.5%、L-组氨酸0.1-1 %、维生素 C 0.2-0.5%、维生素 E 0.1-0.3%、无水磷酸二 氢钾1-2%、叔丁醇0.5-1%和人血清白蛋白0.1-1 %，余量为注射用水。2. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂 包括以下重量百分数的组分:水解明胶2%、乳糖0.2%、蔗糖2%、植物多糖0.1%、山梨醇1%、 L-谷氨酸1 %、L-组氨酸0.1 %、维生素 C 0.2%、维生素 E 0.1%、无水磷酸二氢钾1%、叔丁醇 0.5%和人血清白蛋白0.1 %，余量为注射用水。3. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂 包括以下重量百分数的组分:水解明胶6%、乳糖4%、蔗糖5%、植物多糖0.3%、山梨醇3%、L-谷氨酸1.5%、L-组氨酸1 %、维生素 C 0.5%、维生素 E 0.3%、无水磷酸二氢钾2%、叔丁醇1%和 人血清白蛋白1 %，余量为注射用水。4. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂 包括以下重量百分数的组分:水解明胶4%、乳糖2%、蔗糖3.5%、植物多糖0.5%、山梨醇2%、 L-谷氨酸1.5%、L-组氨酸0.5%、维生素 C 0.4%、维生素 E 0.2%、无水磷酸二氢钾1.5%、叔 丁醇0.8%和人血清白蛋白0.5%，余量为注射用水。5. 根据权利要求1-4任一所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于:所述 伪狂犬病病毒为重组伪狂犬病病毒，所述重组伪狂犬病病毒保藏于中国典型培养物培养中 心，保藏号为:CCTCC-V201408。6. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述植物多 糖由黄芪多糖和香菇多糖按(1-1.5) :(0.5-1)的重量比组成。7. 根据权利要求1所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，其特征在于，所述保护剂 还包括以下重量百分数的组分:天冬氨酸〇. 5-1%。8. 一种根据权利要求1- 7任一所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法， 其特征在于，包括如下步骤： a. 取水解明胶、乳糖、蔗糖、植物多糖、山梨醇、无水磷酸二氢钾和叔丁醇溶于部分注射 用水中，该部分的注射用水占注射用水总量的2/5-4/5,然后在115-125°C的温度下进行灭 菌处理15-25min，得到溶液A; b. 取L-谷氨酸、L-组氨酸、维生素 C、维生素 E以及人血清白蛋溶于剩余部分的注射用水 中，用孔径为0.15-0.20μπι的滤膜过滤除菌，得到溶液B; c. 将a步骤得到的溶液Α与b步骤得到的溶液Β按1:1的体积比混合，即得产品。9. 根据权利要求8所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在于， 在所述b步骤中加入天冬氨酸。10. 根据权利要求8所述的伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法，其特征在 于，所述a步骤中，在115°C的温度下进行灭菌处理15min，所述b步骤中，滤膜孔径为0.20μπι。
【专利摘要】本发明涉及一种伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂，所述保护剂包括以下重量百分数的组分：水解明胶2-6％、乳糖0.2-4％、蔗糖2-5％、植物多糖0.1-0.5%、山梨醇1-3%、L-谷氨酸1-1.5％、L-组氨酸0.1-1％、维生素C？0.2-0.5%、维生素E？0.1-0.3%、无水磷酸二氢钾1-2%、叔丁醇0.5-1%、人血清白蛋白0.1-1％，余量为注射用水。本发明还提供了该伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。本发明伪狂犬病病毒疫苗耐热冻干保护剂具有能够显著延长疫苗在2-8℃以及在36℃下的保存期，此外其制备方法简单，便于生产应用。
【IPC分类】A61K47/42, A61K39/12, A61P31/20, A61K47/04, A61K47/36, A61K39/245, A61K47/26, A61K47/22, A61P31/22, A61K47/18, A61K47/10
【公开号】CN105497904
【申请号】CN201510966953
【发明人】陈瑞爱, 黄红亮, 谢小雨, 唐兆新, 徐家华, 高艳, 张文炎
【申请人】肇庆大华农生物药品有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月22日
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