一种聚乙二醇修饰的巴西芬净及其制备方法
一种聚乙二醇修饰的巴西芬净及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物化学领域，具体设及聚乙二醇修饰的己西芬净及其制备方法。 技术背景
[0002] 随着大量抗菌药物、抗肿瘤药物、皮质激素和免疫抑制剂的使用增多W及器官移 植、介入技术手术和获得性免疫缺陷综合征发病率的逐年上升，深部真菌感染的发病率也 逐年增加。目前只有一些挫类抗真菌药物(两性霉素B，氣胞喀晚和一些挫类药物)在运类治 疗中起到效果。而此类药物，从疗效、药物毒性，抗菌谱W及药物抗性的角度看来，治疗效果 有一定的局限性。其中大环内脂类抗菌素，两性霉素B在临床中运用的效果最好，与其他抗 菌药物不同，两性霉素B是同时作用于成熟的和正在生长的病原菌细胞。然而两性霉素B的 静脉给药具有较大的毒性。因此，我们需要一种更安全、疗效更好的抗菌素。
[0003] 己西芬净是从丝状真菌(Aureobasidiumpullulans)Rioe中分离出来的环醋肤类 抗生素，具有很强的抗真菌能力。在较低的浓度下(0.1-0.5μg/ml)即可对酵母产生毒性。对 其敏感的真菌种类包括：出牙酵母（Saccharomyces cerevi Siae )、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌（Candida glabrata)、构巢曲霉 (Aspe;rgiIlusnidulans)和黑曲霉(A.niger.)。其作用机制是，己西芬净抑制了真菌生长所 依赖的肌醇憐酷胺（inositol phospkxryIceramide，IPC)合成酶的活性，干扰銷脂合成，从 而进一步杀死菌株。并且，己西芬净不会破坏DNA，RNA和蛋白质的合成。
[0004] 聚乙二醇是一种具有高度亲水性的聚合大分子，其无毒，抑中性，是具有较好生物 相容性的独特理化性质的一类高分子聚合物。聚乙二醇具有极强的亲水性，且没有免疫原 性，它与药物连接W后会改变药物的性质，将聚合物自身的优良性质赋予药物分子。此外。 聚乙二醇是迄今为止已知的大分子聚合物中细胞和蛋白吸收水平最低的分子，鉴于其具有 W上优良性质，聚乙二醇已被美国抑A批准作为体内注射药用聚合物分子。
[0005] 聚乙二醇修饰的己西芬净有较强的溶解能力，而由于聚乙二醇在己西芬净周围形 成的屏障，产生了大分子的空间位阻作用，从而减少了己西芬净在体内的酶解，使其半衰 期延长，避免了己西芬净在肾脏中很快代谢消除，提高其治疗效果。
【发明内容】
：
[0006] 本发明设及一种聚乙二醇修饰的己西芬净及其制备方法，目的在于在提高己西芬 净的稳定性、延长其半衰期、提高其治疗效果。
[0007] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:先将聚乙二醇的一端与二班巧 酷亚胺碳酸醋连接形成活泼醋，所述聚乙二醇修饰剂与己西芬净通过醋键连接，得到聚乙 二醇修饰的己西芬净化合物。
[000引具体的，将活化的mPEG通过共价键偶联到己西芬净上，形成通式为D-R的化合物， 其中D为己西芬净，R为聚乙二醇修饰剂阳G-(C = O)-D
[0009] 其中所述聚乙二醇为分子量3W)a~SOKDa的直链聚乙二醇，优选为分子量为3W)a， 6kDa，9kDa，I OkDa，20kDa，30kDa，40kDa，50kDa 更优选分子量为 9kDa。
[0010] mPEG要和己西芬净结合，需要根据连接分子的特性选择活化所需的功能基团，对 mPEG分子的一端进行活化，常见具有生物相容性的活化基团包括醋基、酷胺基、酷亚氨基、 氨基甲酸醋基、簇基、径基、班巧酷亚氨基、环氧基、氧幾基咪挫基、硝基苯基、醒基、半脫氨 酸基、组氨酸基或伯胺等。优选班巧酷亚胺班巧酷醋（SS)、班巧酷亚胺碳酷醋（SC)、对硝基 苯碳酸和醒基(adehyde)等，更优选班巧酷亚胺班巧酷醋(SC)。
[ocm]另外，本发明还提供了该复合物的制备方法，其工艺如下：
【附图说明】
[0013] 图1为己西芬净抗菌活性
[0014] 图2为己西芬净在小鼠内的药代动力学
【具体实施方式】：
[0015] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详述，但是本领域技术人员将会理 解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
[0016] 实施例1制备mPEG-C(=0)-己西芬净 [0017] 1. ImPEG-SC样品的制备（3)
[001引将不同分子量的聚乙二醇阳G分别溶于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的DSC(二 班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲基氨基 化晚），溫控60°C，反应化，浓缩，异丙酸析晶，分别得到不同分子量的PEG班巧酷亚胺活化产 物阳G-SC。
[0019] 1.2mPEG-C(=0)-己西芬净样品制备(5)
[0020] 本发明的聚乙二醇修饰的己西芬净包括W下步骤:将憐酸缓冲液加入己西芬净溶 液中，调节其pH至6.0-9.0，然后加入mPEG-SC在5~40°C进行反应，优选为25°C，反应时间为 2~6小时，优选为4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分 离后，浓缩，冻干可得不同分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净;所述的己西芬净溶液重量为 Img/mL的水溶液。本发明所述的聚乙二醇修饰己西芬净可W制备抗真菌药物。
[0021 ]实施例2体外抗菌实验比较
[0022] 取未修饰的己西芬净及不同分子量的mPEG修饰后的己西芬净（3kDa、化化、9kDa、 1040曰、2040曰、3040曰、4040曰、5040曰），分别置于37°(30,2,4,6,8，12,24,48,7化定时取样 0.1ml，测定各时间点对抗真菌活性的影响，结果W活性保留百分数表示。试验结果见图1。
[0023] 实施例3不同分子量mPEG修饰的己西芬净在小鼠体内的药代动力学研究
[0024] 雄性昆明中小鼠84只，按随机分成组，每只小鼠快速尾静脉注射给药分子量不同 的己西芬净lOOuL，分别为basi化ngin，mPEG-C( =0)-basi化ngin(3kDa)，mPEG-C( =0)-basifungin(6kDa)，mPEG-C(=0)-basi化ngin(9kDa)，mPEG-C(=0)-basi化ngin(lOkDa)， mPEG-C( =0)-basifungin(20kDa)，mPEG-C( =0)-basifungin(30kDa)，mPEG-C( =0)-6日31化叫111(401^)日），111?66-(：(=0)-6日31化叫111(501^)日）。给药0,2,4,6,8，12,24,48,7化（9 个时间点），眼球取血O.lmL，离屯、取血清，应用放射免疫法测定血药浓度，经时曲线见图2。 其中未经修饰的basifungin在1化时，血药浓度最高为0.74mgA^L，5kDamPEG-C(=0)-basi 化 ngin 在化时 ，血药浓度最高为 0.89mgAiL，9kDam 阳 G-C(=0)-basi 化 ngin 在 1 化时血 药浓度最高为〇.93mgAiL，20kDam阳G-C(=0)-basifungin在24h时血药浓度最高为0.73mg/ yL。W上结果可W得出，经PEG修饰的己西芬净能明显的延缓药物延缓时间，其中随着PEG分 子量的增大，其药物代谢时间越长。综合代谢时间W及药物效果，W9kDa的PEG-(C = O)-b 曰 sifungin 最佳。
[00巧]实施例4 mPEG-C( =0)-basifungin的修饰条件 [00%] 1 .pH值对聚乙二醇修饰己西芬净的影响
[0027] 用25毫摩尔/升的化抽Kk-K出K)4缓冲液调节反应体系，调节反应体系宽起始抑值 5.0~10.0及窄起始pH值6.0~9.0进行实验，维持反应体系己西芬净浓度为0.5毫克/毫升， 溫度25°C，摇床转速20化/min，总体积0.5毫升。反应4小时后，各加20微升30 %冰醋酸终止 反应。结果表明，反应体系起始pH值低于6.0时，PEG修饰己西芬净反应不发生，起始pH值8.0 ~9.0时，有利于阳G修饰己西芬净，聚乙二醇修饰己西芬净的浓度达到0.11~0.12毫克/毫 升，总修饰率为44-50%。结果表明，聚乙二醇修饰己西芬净反应进行的最优选pH为8.3,此 时聚乙二醇己西芬净浓度为0.112毫克/毫升，总修饰率为56.8%。因此，控制反应体系的起 始抑值8.3为宜。
[0028] 2.反应时间对聚乙二醇修饰己西芬净的影响
[0029] 控制起始pH8.3,其他反应条件不变，研究反应对聚乙二醇修饰己西芬净的影响。 分别于反应1、2、3、4、化取样测定聚乙二醇修饰己西芬净的含量。随着反应时间的延长，聚 乙二醇修饰己西芬净含量逐渐增加；当反应达到4h时，聚乙二醇修饰的己西芬净含量达到 最高为0.137毫克/毫升。因此聚乙二醇修饰己西芬净的反应时间W4小时为最优选。
[0030] 3.憐酸缓冲液对聚乙二醇修饰己西芬净的影响
[0031] 控制起始P册.3,反应时间为4小时，其他条件不变。研究憐酸缓冲液对聚乙二醇修 饰己西芬净的影响。分别控制憐酸缓冲溶液浓度为5、10、15、20、25、30、40、50毫摩尔/升，测 定mPEG-C( =0)-basi化ngin的含量。随着憐酸缓冲溶液的增加，mPEG-C( =0)-basifungin 的含量呈逐渐减低的趋势，但缓冲溶液浓度不宜太低，WlO-30毫摩尔/升为宜，优选为25毫 摩尔/升。
[0032] 4.溫度对聚乙二醇修饰己西芬净的影响
[0033] 在优化实验条件下，选择5°C、25°C和40°C进行聚乙二醇修饰己西芬净溫度实验， 反应中定时取样。溫度显著影响聚乙二醇修饰己西芬净的速率，溫度越高，反应速率越快。5 °C下，3小时前，反应速率随着时间的延长而增加，3h后缓慢增加;3小时和24小时mPEG-C(= 0)-basi化ngin的含量分别为0.157毫克/毫升和0.224毫克/毫升，修饰率分别为32.3%和 34%。25°(3和40°(3下，地时111?66-"=0)-6日31化叫111含量达到最大，随后呈缓慢降低趋势。 聚乙二醇己西芬净含量最大值分别为0.227毫克/毫升和 0.260毫克/毫升。修饰率最大值为 51.6 %和59.2 %，因此，最优选溫度为25°C。
[0034] 实施例5 ：3kDaCH3〇-(CH2CH2〇)日日-C = 〇-basifungin的制备
[00对将分子量为3kDa的C曲0-(C此C此0)50-0H溶于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应化，浓缩，用异丙酸析晶，得到3W)a分子量的PEG活化产物PEG-SC。
[0036] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得?j3kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)日日-C(=0)-basifungin;
[0037] 实施例6 化DaCH3〇-(CH2CH2〇)i日日-C(=0)-basifungin的制备
[003引将分子量为化Da的C出0-(C出C此0)100-0田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应化，浓缩，用异丙酸析晶，得到9W)a分子量的PEG活化产物PEG-SC。
[0039] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得?j6kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)1日日-C( =0)-basifungin;
[0040] 实施例7 9kDaCH3〇-(CH2CH2〇)i日日-C(=0)-basifungin的制备
[OOW 将分子量为9kDa的C曲0-(C出C此Ohso-OH溶于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应化，浓缩，用异丙酸析晶，得到9W)a分子量的PEG活化产物PEG-SC。
[0042] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得?JgkDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)1日日-C( =0)-basifungin;
[0043] 实施例 8 10kDaCH3〇-(CH2CH2〇)i6〇-C(=0)-basifungin 的制备
[0044] 将分子量为IOkDa的C曲0-(C出C此0)160-0田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到IOkDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[0045] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到IOkDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)16日-〔（=0)-basifungin;
[0046] 实施例9 20kDaCH3〇-(CH2CH2〇)3日日-C = 〇-basifungin的制备
[0047] 将分子量为20kDa的C曲0-(C出C此0)330-0田容于适量的二氯甲烧中，加入I. I当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到20kDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[004引将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在40°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到20kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)3日日-C( =0)-basifungin;
[0049] 实施例 10 30kDaCH3〇-(CH2CH2〇)日日日-C(=0)-basifungin的制备
[0050] 将分子量为30kDa的C曲0-(C出C此0)日〇〇-〇田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到30kDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[0051] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到30kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)日日日-C( =0)-basifungin; [0化2]实施例 11 40kDaCH3〇-(CH2CH2〇)6 日日-C(=0)-basifungin 的制备
[(K)对将分子量为40kDa的C出0-(C出C出0)650-0田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到40kDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[0054]将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到40kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)6日日-C( =0)-basifungin; [0055]实施例 12 50kDaCH3〇-(CH2CH2〇)8日日-C(=0)-basifungin的制备 [0056] 将分子量为SOkDa的C曲0-(C出C此0)8〇〇-〇田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到SOkDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[0057]将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到SOkDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)8日日-C( =0)-basifungin。
【主权项】
1. 一种聚乙二醇修饰的巴西芬净化合物及其制备方法，其特征在于，巴西芬净通过酯 键与不同分子量的聚乙二醇相连，具体通式为D-R，其中D为巴西芬净抗真菌药物，R为PEG-(C = 0)-〇2. 根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的巴西芬净化合物，其特征在于巴西芬净D的修 饰位点为其环上的羟基。3. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的聚乙二醇可为直链型或支链型聚 乙二醇，优选直链型聚乙二醇。4. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，PEG的分子量为3kDa~50kDa，优选分子 量为 3kDa，6kDa，9k，1 OkDa，20kDa，30kDa，40kDa，50kDa，更优选分子量为 9kDa。5. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R连接的活化基团包括酯基、酰胺基、酰 亚氨基、氨基甲酸酯基、羧基、羟基、琥珀酰亚氨基、环氧基、氧羰基咪唑基、硝基苯基、醛基、 半胱氨酸基、组氨酸基或伯胺等。6. 根据权利力要求5所述的活化基团，优选琥珀酰亚胺琥珀酰酯（SS)、琥珀酰亚胺碳酰 酯(SC)、对硝基苯碳酸和醛基(adehyde)。7. 根据权利力要求5所述的活化基团，更优选琥珀酰亚胺碳酰酯(SC)。8. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物在保持巴西芬净原有活性的同 时，具有更好的抗真菌作用。9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于巴西芬净通过酯键与不同分子量的聚 乙二醇相连，具体地，将PEG活化，形成端基为琥珀酰亚胺碳酸酯的活化物，再在碱性条件下 与巴西芬净的羟基通过酯键结合，得到聚乙二醇修饰的巴西芬净的化合物。10. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体指以下步骤： (1) mPEG修饰剂的制备 (2) 与巴西芬净进行反应 (3) 纯化，得到目标修饰产物。11. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于反应体系pH值为6.0~10.0，优选pH值 为6.0~9.0，更优选pH为8.3。12. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于反应时间2~6h，优选反应时间为3~ 5h，更优选反应时间为4h。13. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于反应体系的磷酸盐缓冲液浓度为5~ 50mmol/L，优选磷酸盐缓冲液的浓度为10~30mmol/L，更优选磷酸盐缓冲液的浓度为 25mmol/L〇14. 根据权利要求8所描述的制备方法，其特征在于反应体系的温度为5~40°C，优选温 度为25°C。
【专利摘要】本发明涉及一种聚乙二醇修饰的巴西芬净及其制备方法。其特征是，先将不同分子量的聚乙二醇的一端与二琥珀酰亚胺碳酸酯形成活泼酯，再与巴西芬净通过酯键连接，得到不同分子量的聚乙二醇修饰的巴西芬净。本发明中的聚乙二醇修饰的巴西芬净在保持原有活性的同时，其稳定性增强，在体内半衰期延长。
【IPC分类】A61K38/08, A61P31/10, A61K47/48
【公开号】CN105497910
【申请号】CN201510970112
【发明人】刘自成, 姚志勇, 李新宇, 支钦, 周莹
【申请人】深圳市健元医药科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月21日
【技术领域】
[0001] 本发明设及药物化学领域，具体设及聚乙二醇修饰的己西芬净及其制备方法。 技术背景
[0002] 随着大量抗菌药物、抗肿瘤药物、皮质激素和免疫抑制剂的使用增多W及器官移 植、介入技术手术和获得性免疫缺陷综合征发病率的逐年上升，深部真菌感染的发病率也 逐年增加。目前只有一些挫类抗真菌药物(两性霉素B，氣胞喀晚和一些挫类药物)在运类治 疗中起到效果。而此类药物，从疗效、药物毒性，抗菌谱W及药物抗性的角度看来，治疗效果 有一定的局限性。其中大环内脂类抗菌素，两性霉素B在临床中运用的效果最好，与其他抗 菌药物不同，两性霉素B是同时作用于成熟的和正在生长的病原菌细胞。然而两性霉素B的 静脉给药具有较大的毒性。因此，我们需要一种更安全、疗效更好的抗菌素。
[0003] 己西芬净是从丝状真菌(Aureobasidiumpullulans)Rioe中分离出来的环醋肤类 抗生素，具有很强的抗真菌能力。在较低的浓度下(0.1-0.5μg/ml)即可对酵母产生毒性。对 其敏感的真菌种类包括：出牙酵母（Saccharomyces cerevi Siae )、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomycespombe)、光滑念珠菌（Candida glabrata)、构巢曲霉 (Aspe;rgiIlusnidulans)和黑曲霉(A.niger.)。其作用机制是，己西芬净抑制了真菌生长所 依赖的肌醇憐酷胺（inositol phospkxryIceramide，IPC)合成酶的活性，干扰銷脂合成，从 而进一步杀死菌株。并且，己西芬净不会破坏DNA，RNA和蛋白质的合成。
[0004] 聚乙二醇是一种具有高度亲水性的聚合大分子，其无毒，抑中性，是具有较好生物 相容性的独特理化性质的一类高分子聚合物。聚乙二醇具有极强的亲水性，且没有免疫原 性，它与药物连接W后会改变药物的性质，将聚合物自身的优良性质赋予药物分子。此外。 聚乙二醇是迄今为止已知的大分子聚合物中细胞和蛋白吸收水平最低的分子，鉴于其具有 W上优良性质，聚乙二醇已被美国抑A批准作为体内注射药用聚合物分子。
[0005] 聚乙二醇修饰的己西芬净有较强的溶解能力，而由于聚乙二醇在己西芬净周围形 成的屏障，产生了大分子的空间位阻作用，从而减少了己西芬净在体内的酶解，使其半衰 期延长，避免了己西芬净在肾脏中很快代谢消除，提高其治疗效果。
【发明内容】
：
[0006] 本发明设及一种聚乙二醇修饰的己西芬净及其制备方法，目的在于在提高己西芬 净的稳定性、延长其半衰期、提高其治疗效果。
[0007] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:先将聚乙二醇的一端与二班巧 酷亚胺碳酸醋连接形成活泼醋，所述聚乙二醇修饰剂与己西芬净通过醋键连接，得到聚乙 二醇修饰的己西芬净化合物。
[000引具体的，将活化的mPEG通过共价键偶联到己西芬净上，形成通式为D-R的化合物， 其中D为己西芬净，R为聚乙二醇修饰剂阳G-(C = O)-D
[0009] 其中所述聚乙二醇为分子量3W)a~SOKDa的直链聚乙二醇，优选为分子量为3W)a， 6kDa，9kDa，I OkDa，20kDa，30kDa，40kDa，50kDa 更优选分子量为 9kDa。
[0010] mPEG要和己西芬净结合，需要根据连接分子的特性选择活化所需的功能基团，对 mPEG分子的一端进行活化，常见具有生物相容性的活化基团包括醋基、酷胺基、酷亚氨基、 氨基甲酸醋基、簇基、径基、班巧酷亚氨基、环氧基、氧幾基咪挫基、硝基苯基、醒基、半脫氨 酸基、组氨酸基或伯胺等。优选班巧酷亚胺班巧酷醋（SS)、班巧酷亚胺碳酷醋（SC)、对硝基 苯碳酸和醒基(adehyde)等，更优选班巧酷亚胺班巧酷醋(SC)。
[ocm]另外，本发明还提供了该复合物的制备方法，其工艺如下：
【附图说明】
[0013] 图1为己西芬净抗菌活性
[0014] 图2为己西芬净在小鼠内的药代动力学
【具体实施方式】：
[0015] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详述，但是本领域技术人员将会理 解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
[0016] 实施例1制备mPEG-C(=0)-己西芬净 [0017] 1. ImPEG-SC样品的制备（3)
[001引将不同分子量的聚乙二醇阳G分别溶于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的DSC(二 班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲基氨基 化晚），溫控60°C，反应化，浓缩，异丙酸析晶，分别得到不同分子量的PEG班巧酷亚胺活化产 物阳G-SC。
[0019] 1.2mPEG-C(=0)-己西芬净样品制备(5)
[0020] 本发明的聚乙二醇修饰的己西芬净包括W下步骤:将憐酸缓冲液加入己西芬净溶 液中，调节其pH至6.0-9.0，然后加入mPEG-SC在5~40°C进行反应，优选为25°C，反应时间为 2~6小时，优选为4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分 离后，浓缩，冻干可得不同分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净;所述的己西芬净溶液重量为 Img/mL的水溶液。本发明所述的聚乙二醇修饰己西芬净可W制备抗真菌药物。
[0021 ]实施例2体外抗菌实验比较
[0022] 取未修饰的己西芬净及不同分子量的mPEG修饰后的己西芬净（3kDa、化化、9kDa、 1040曰、2040曰、3040曰、4040曰、5040曰），分别置于37°(30,2,4,6,8，12,24,48,7化定时取样 0.1ml，测定各时间点对抗真菌活性的影响，结果W活性保留百分数表示。试验结果见图1。
[0023] 实施例3不同分子量mPEG修饰的己西芬净在小鼠体内的药代动力学研究
[0024] 雄性昆明中小鼠84只，按随机分成组，每只小鼠快速尾静脉注射给药分子量不同 的己西芬净lOOuL，分别为basi化ngin，mPEG-C( =0)-basi化ngin(3kDa)，mPEG-C( =0)-basifungin(6kDa)，mPEG-C(=0)-basi化ngin(9kDa)，mPEG-C(=0)-basi化ngin(lOkDa)， mPEG-C( =0)-basifungin(20kDa)，mPEG-C( =0)-basifungin(30kDa)，mPEG-C( =0)-6日31化叫111(401^)日），111?66-(：(=0)-6日31化叫111(501^)日）。给药0,2,4,6,8，12,24,48,7化（9 个时间点），眼球取血O.lmL，离屯、取血清，应用放射免疫法测定血药浓度，经时曲线见图2。 其中未经修饰的basifungin在1化时，血药浓度最高为0.74mgA^L，5kDamPEG-C(=0)-basi 化 ngin 在化时 ，血药浓度最高为 0.89mgAiL，9kDam 阳 G-C(=0)-basi 化 ngin 在 1 化时血 药浓度最高为〇.93mgAiL，20kDam阳G-C(=0)-basifungin在24h时血药浓度最高为0.73mg/ yL。W上结果可W得出，经PEG修饰的己西芬净能明显的延缓药物延缓时间，其中随着PEG分 子量的增大，其药物代谢时间越长。综合代谢时间W及药物效果，W9kDa的PEG-(C = O)-b 曰 sifungin 最佳。
[00巧]实施例4 mPEG-C( =0)-basifungin的修饰条件 [00%] 1 .pH值对聚乙二醇修饰己西芬净的影响
[0027] 用25毫摩尔/升的化抽Kk-K出K)4缓冲液调节反应体系，调节反应体系宽起始抑值 5.0~10.0及窄起始pH值6.0~9.0进行实验，维持反应体系己西芬净浓度为0.5毫克/毫升， 溫度25°C，摇床转速20化/min，总体积0.5毫升。反应4小时后，各加20微升30 %冰醋酸终止 反应。结果表明，反应体系起始pH值低于6.0时，PEG修饰己西芬净反应不发生，起始pH值8.0 ~9.0时，有利于阳G修饰己西芬净，聚乙二醇修饰己西芬净的浓度达到0.11~0.12毫克/毫 升，总修饰率为44-50%。结果表明，聚乙二醇修饰己西芬净反应进行的最优选pH为8.3,此 时聚乙二醇己西芬净浓度为0.112毫克/毫升，总修饰率为56.8%。因此，控制反应体系的起 始抑值8.3为宜。
[0028] 2.反应时间对聚乙二醇修饰己西芬净的影响
[0029] 控制起始pH8.3,其他反应条件不变，研究反应对聚乙二醇修饰己西芬净的影响。 分别于反应1、2、3、4、化取样测定聚乙二醇修饰己西芬净的含量。随着反应时间的延长，聚 乙二醇修饰己西芬净含量逐渐增加；当反应达到4h时，聚乙二醇修饰的己西芬净含量达到 最高为0.137毫克/毫升。因此聚乙二醇修饰己西芬净的反应时间W4小时为最优选。
[0030] 3.憐酸缓冲液对聚乙二醇修饰己西芬净的影响
[0031] 控制起始P册.3,反应时间为4小时，其他条件不变。研究憐酸缓冲液对聚乙二醇修 饰己西芬净的影响。分别控制憐酸缓冲溶液浓度为5、10、15、20、25、30、40、50毫摩尔/升，测 定mPEG-C( =0)-basi化ngin的含量。随着憐酸缓冲溶液的增加，mPEG-C( =0)-basifungin 的含量呈逐渐减低的趋势，但缓冲溶液浓度不宜太低，WlO-30毫摩尔/升为宜，优选为25毫 摩尔/升。
[0032] 4.溫度对聚乙二醇修饰己西芬净的影响
[0033] 在优化实验条件下，选择5°C、25°C和40°C进行聚乙二醇修饰己西芬净溫度实验， 反应中定时取样。溫度显著影响聚乙二醇修饰己西芬净的速率，溫度越高，反应速率越快。5 °C下，3小时前，反应速率随着时间的延长而增加，3h后缓慢增加;3小时和24小时mPEG-C(= 0)-basi化ngin的含量分别为0.157毫克/毫升和0.224毫克/毫升，修饰率分别为32.3%和 34%。25°(3和40°(3下，地时111?66-"=0)-6日31化叫111含量达到最大，随后呈缓慢降低趋势。 聚乙二醇己西芬净含量最大值分别为0.227毫克/毫升和 0.260毫克/毫升。修饰率最大值为 51.6 %和59.2 %，因此，最优选溫度为25°C。
[0034] 实施例5 ：3kDaCH3〇-(CH2CH2〇)日日-C = 〇-basifungin的制备
[00对将分子量为3kDa的C曲0-(C此C此0)50-0H溶于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应化，浓缩，用异丙酸析晶，得到3W)a分子量的PEG活化产物PEG-SC。
[0036] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得?j3kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)日日-C(=0)-basifungin;
[0037] 实施例6 化DaCH3〇-(CH2CH2〇)i日日-C(=0)-basifungin的制备
[003引将分子量为化Da的C出0-(C出C此0)100-0田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应化，浓缩，用异丙酸析晶，得到9W)a分子量的PEG活化产物PEG-SC。
[0039] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得?j6kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)1日日-C( =0)-basifungin;
[0040] 实施例7 9kDaCH3〇-(CH2CH2〇)i日日-C(=0)-basifungin的制备
[OOW 将分子量为9kDa的C曲0-(C出C此Ohso-OH溶于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应化，浓缩，用异丙酸析晶，得到9W)a分子量的PEG活化产物PEG-SC。
[0042] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得?JgkDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)1日日-C( =0)-basifungin;
[0043] 实施例 8 10kDaCH3〇-(CH2CH2〇)i6〇-C(=0)-basifungin 的制备
[0044] 将分子量为IOkDa的C曲0-(C出C此0)160-0田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到IOkDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[0045] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到IOkDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)16日-〔（=0)-basifungin;
[0046] 实施例9 20kDaCH3〇-(CH2CH2〇)3日日-C = 〇-basifungin的制备
[0047] 将分子量为20kDa的C曲0-(C出C此0)330-0田容于适量的二氯甲烧中，加入I. I当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到20kDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[004引将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在40°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到20kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)3日日-C( =0)-basifungin;
[0049] 实施例 10 30kDaCH3〇-(CH2CH2〇)日日日-C(=0)-basifungin的制备
[0050] 将分子量为30kDa的C曲0-(C出C此0)日〇〇-〇田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到30kDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[0051] 将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到30kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)日日日-C( =0)-basifungin; [0化2]实施例 11 40kDaCH3〇-(CH2CH2〇)6 日日-C(=0)-basifungin 的制备
[(K)对将分子量为40kDa的C出0-(C出C出0)650-0田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到40kDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[0054]将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到40kDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)6日日-C( =0)-basifungin; [0055]实施例 12 50kDaCH3〇-(CH2CH2〇)8日日-C(=0)-basifungin的制备 [0056] 将分子量为SOkDa的C曲0-(C出C此0)8〇〇-〇田容于适量的二氯甲烧中，加入1.1当量的 DSC(二班巧酷亚胺碳酸醋），2当量的DIEA(二异丙基乙胺），加入0.2当量的DMAP(N，N-二甲 基氨基化晚），溫控60°C，反应8h，浓缩，用异丙酸析晶，得到SOkDa分子量的PEG活化产物 PEG-SCo
[0057]将憐酸缓冲液加入己西芬净溶液中，调节其抑至8.3,然后加入阳G-SC在25°C进行 反应4小时。将反应混合液用色谱分离，流动相为含氯化钢醋酸缓冲液，色谱分离后，浓缩， 冻干得到SOkDa分子量的聚乙二醇修饰的己西芬净C出0-(师师0)8日日-C( =0)-basifungin。
【主权项】
1. 一种聚乙二醇修饰的巴西芬净化合物及其制备方法，其特征在于，巴西芬净通过酯 键与不同分子量的聚乙二醇相连，具体通式为D-R，其中D为巴西芬净抗真菌药物，R为PEG-(C = 0)-〇2. 根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的巴西芬净化合物，其特征在于巴西芬净D的修 饰位点为其环上的羟基。3. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于所述的聚乙二醇可为直链型或支链型聚 乙二醇，优选直链型聚乙二醇。4. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，PEG的分子量为3kDa~50kDa，优选分子 量为 3kDa，6kDa，9k，1 OkDa，20kDa，30kDa，40kDa，50kDa，更优选分子量为 9kDa。5. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R连接的活化基团包括酯基、酰胺基、酰 亚氨基、氨基甲酸酯基、羧基、羟基、琥珀酰亚氨基、环氧基、氧羰基咪唑基、硝基苯基、醛基、 半胱氨酸基、组氨酸基或伯胺等。6. 根据权利力要求5所述的活化基团，优选琥珀酰亚胺琥珀酰酯（SS)、琥珀酰亚胺碳酰 酯(SC)、对硝基苯碳酸和醛基(adehyde)。7. 根据权利力要求5所述的活化基团，更优选琥珀酰亚胺碳酰酯(SC)。8. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物在保持巴西芬净原有活性的同 时，具有更好的抗真菌作用。9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于巴西芬净通过酯键与不同分子量的聚 乙二醇相连，具体地，将PEG活化，形成端基为琥珀酰亚胺碳酸酯的活化物，再在碱性条件下 与巴西芬净的羟基通过酯键结合，得到聚乙二醇修饰的巴西芬净的化合物。10. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于具体指以下步骤： (1) mPEG修饰剂的制备 (2) 与巴西芬净进行反应 (3) 纯化，得到目标修饰产物。11. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于反应体系pH值为6.0~10.0，优选pH值 为6.0~9.0，更优选pH为8.3。12. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于反应时间2~6h，优选反应时间为3~ 5h，更优选反应时间为4h。13. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于反应体系的磷酸盐缓冲液浓度为5~ 50mmol/L，优选磷酸盐缓冲液的浓度为10~30mmol/L，更优选磷酸盐缓冲液的浓度为 25mmol/L〇14. 根据权利要求8所描述的制备方法，其特征在于反应体系的温度为5~40°C，优选温 度为25°C。
【专利摘要】本发明涉及一种聚乙二醇修饰的巴西芬净及其制备方法。其特征是，先将不同分子量的聚乙二醇的一端与二琥珀酰亚胺碳酸酯形成活泼酯，再与巴西芬净通过酯键连接，得到不同分子量的聚乙二醇修饰的巴西芬净。本发明中的聚乙二醇修饰的巴西芬净在保持原有活性的同时，其稳定性增强，在体内半衰期延长。
【IPC分类】A61K38/08, A61P31/10, A61K47/48
【公开号】CN105497910
【申请号】CN201510970112
【发明人】刘自成, 姚志勇, 李新宇, 支钦, 周莹
【申请人】深圳市健元医药科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月21日
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