红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法及用图
红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及高分子化学和纳米制剂技术领域，具体地说是一种用于抗肿瘤药物递 送的长循环酸敏感高分子递药系统的制备及用途。
【背景技术】
[0002] 化疗是最常见的恶性肿瘤治疗手段之一，但是统计表明，目前临床上化疗并未导 致癌症患者死亡率的实质性降低。紫杉醇是最有效的化疗药物之一，主要用于治疗肺癌、卵 巢癌和乳腺癌等。紫杉醇具有聚合和稳定细胞内微管的作用，致使快速分裂的肿瘤细胞在 有丝分裂阶段被牢牢固定，使微管不再分开，可阻断细胞于细胞周期之G2与M期，使癌细胞 复制受阻断而死亡。紫杉醇的低水溶性(0.003mg/ml)大大的限制了它在临床上的应用。目 前被批准临床上使用的紫杉醇制剂有:Taxol愈，由聚氧乙締藍麻油和乙醇（1:1，v/v)形成的 制剂，但聚氧乙締藍麻油会导致严重的副作用，如过敏反应。二代紫杉醇制剂包括 Abraxan泌:，和Gcnexol-PM嚴，与Taxol'K相比，二代制剂降低了毒副作用，提高了耐受剂量， 显示出了良好的药代动力学特性。但是释药和体内循环时间较短问题仍然存在，运也是导 致紫杉醇二代制剂不理想的原因。
[0003] 在肿瘤组织中适时、足量释药是一个祀向纳米递药系统发挥效应的关键一步。为 达到运一目的，肿瘤微环境响应型递药系统在近年来得到很大进步，主要包括抑敏感、溫度 敏感、酶敏感型递药系统，运些递药系统可改善药物释放行为，提高药效。目前紫杉醇聚合 物前药已有大量文献报道，包括?66斗1乂，？64斗1乂，？664斗1乂。虽然与游离紫杉醇相比运些 前药显示出更高的溶解性和肿瘤祀向性，但是仍存在释药不充分的问题。如PGG-PTX 60小 时体外释药仅为10%。为改善运一问题，利用肿瘤组织(pH 6-6.5)及肿瘤细胞内涵体与溶 酶体中（ <抑5)的低抑值的特征，合成了一种pH敏感的高分子水溶性紫杉醇前药PGSC-PTX， 显示出良好的抑敏感性【CN 201510051159.0】。
[0004] 长循环纳米递药系统由于可W延长药物全身传递时间并更好实现肿瘤的祀向效 果而备受关注。目前最常见的方法是用高亲水性物质聚乙二醇(PEG)对纳米粒子进行表面 修饰，且已有PEG化的纳米递药系统上市。但是，有研究发现机体会对PEG化纳米载体产生抗 PEG免疫反应，从而激发其被网状内皮细胞吞隧。由于红细胞在体内良好的循环特性，有研 究者依据红细胞膜的结构特点，对纳米粒子表面进行模拟红细胞膜的修饰来达到延长体内 循环时间的目的，但是运种方法需要进行红细胞膜蛋白鉴别、纯化与化学连接等工作，无疑 增大了纳米粒的制备难度，且难W使纳米载体完全模拟红细胞膜结构特点。张良方副教授 提出利用红细胞膜直接包裹纳米粒，在保留纳米粒功能的同时，赋予纳米粒长循环的特性。 研究表明，与PEG化纳米粒相比，红细胞膜包裹纳米粒的半衰期延长了2.5倍。此外，由于红 细胞膜的易获得性、内源性、低免疫原性等优点，可W大大增加递药系统的成药性。因此，红 细胞膜包裹技术为增加纳米递药系统的体内循环时间、提高药物成药性和有效性提供了一 种简单实用的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对递药系统在体内的长循环、释药问题，提供一种红细胞膜 包裹的载紫杉醇的酸敏感纳米递药系统RBCm/PGSC-Pl'X用于肿瘤治疗药物的制备。将该递 药系统静脉注射入血后，红细胞膜的包裹可保证该递药系统在血液中长循环;在肿瘤酸性 环境中，PGSC-Pl'X可加速降解并释放足量的PTX，杀死肿瘤细胞。该递药系统的成功实施将 为当前肿瘤治疗提供一种合理化方式。
[0006] 实现本发明目的的具体技术方案是：
[0007] -种红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法，该纳米递药系 统由红细胞膜包裹酸敏感高分子前药纳米粒构成，其酸敏感高分子前药为PGSC-PTX，由聚 谷氨酸钢和簇甲半脫氨酸通过肤键连接组成，再与抗癌药物紫杉醇PTX键合形成，其结构如 下：
[0009] 能自组装形成平均粒径为50nm的纳米粒，并可在酸性环境下释放药物PTX;
[0010] 特点在于，所述纳米递药系统的制备方法包括：
[OOW 步骤1:制备红细胞囊泡：取小鼠全血，离屯、操作，破膜释放内含物，得到空红细胞 膜，超声得到均一的红细胞膜囊泡；
[001 ^ 步骤2:红细胞膜囊泡与酸敏感高分子前药比例为50-70亿个:6-lOmg，将酸敏感高 分子前药与红细胞膜囊泡混合，在IOOW，59Hz条件下超声5min;得到粒径均一的红细胞膜包 裹的酸敏感高分子前药纳米粒即所述纳米递药系统RBCm/PGSC-PTX，通过G50葡聚糖凝胶柱 分离纯化；
[0013] 步骤3:测定所述纳米递药系统的粒径、形态；
[0014] 步骤4:测定所述纳米递药系统的长期稳定性；
[0015] 步骤5:测定所述纳米递药系统的血清稳定性；
[0016] 步骤6:测定所述纳米递药系统的体外药物释放特征；
[0017] 步骤7:测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的摄取；
[001引步骤8:巧憶所述纳米递药系统对肺癌细胞的毒性；
[0019] 步骤9:测定巨隧细胞对所述纳米递药系统的摄取；
[0020] 步骤10:测定所述纳米递药系统对红细胞膜的破坏作用；
[0021 ]步骤11:测定所述纳米递药系统在大鼠体内的循环时间；
[0022] 步骤12:测定所述纳米递药系统对肺癌肿瘤生长的抑制作用。
[0023] 所述步骤2采用超声方法包裹酸敏感高分子前药，用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化纳 米递药系统。
[0024] 本发明制备的红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的用途，其特征在 于，该纳米递药系统用于制备能够进行长循环、被动祀向、运送活性物质的抗肿瘤药物。
[0025] 本发明的递药系统具有W下特征:粒径在IOOnm左右，呈球形；在憐酸缓冲液和血 清中均比较稳定;在酸性环境下药物释放特性较好;在细胞实验中毒性明显降低；巨隧细胞 对该系统的摄取明显减少;该系统对红细胞没有破坏作用，可用于静脉注射;该系统在血液 中的循环时间明显比高分子长;该系统对肺癌肿瘤生长有明显抑制作用。
【附图说明】
[00%] 图1为本发明RBCm/PGSC-PTX制备流程图；
[0027] 图2为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的粒径图和透射电镜图；
[00%]图3为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的长期稳定性实验和血清稳定性实验图；
[00巧]图4为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs在不同抑下药物释放对比图；
[0030] 图5为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的体外细胞摄取实验图；
[0031] 图6为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的体外细胞毒性实验图；
[0032] 图7为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的免疫原性试验图；
[0033] 图8为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的溶血性试验图；
[0034] 图9为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的长循环试验图；
[0035] 图10为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的疗效试验图。
【具体实施方式】
[0036] 高分子前药紫杉醇载药量为32.8%。
[0037] 实施例1
[0038] (1)红细胞膜囊泡的制备
[0039] 1)取20g左右重量的小鼠，腹腔注射0.2ml的2 %戊己比妥钢溶液，待完全麻醉后， 剖开剑突及W上部位，暴露屯、脏后，从左屯、室进针，取用肝素钢润洗过的注射器取血(大约 Iml)，取血后转移至2ml含肝素钢的EP管中；
[0040] 2)将全血放入离屯、机中离屯、，900g，20min，弃去上层清液，留下暗红色沉淀，取沉 淀3倍体积的1冲BS放入，并均匀吹散，放入离屯、机离屯、2500g，15min.此为第一次洗涂，重复 操作立次；
[0041] 3)上述最后一次操作后，弃去上层清液，留下沉淀，取沉淀等量的1*PBS放入离屯、 管中吹散，取950ul的0.2mM的抓TA放入离屯、管混匀，待充分溶血后，加入50ul20冲BS，于 21000g，离屯、7min.此为第一次溶血洗涂重复操作五次；
[0042] 4)上述最后一次操作后，弃去上层清液，加入1mlO.2mM的抓TA重悬，即为红细胞膜 悬浮液。
[0043] 5)将得到的红细胞膜悬液在IOOW，59Hz条件下超声5min，得到均匀的红细胞膜囊 泡。
[0044] (2)红细胞膜包裹酸敏感的高分子前药纳米系统的制备
[0045] 1)配制浓度为8mg/ml的高分子前药纳米粒；
[0046] 2)将配置好的上述高分子前药纳米粒与Iml全血中提取的红细胞囊泡混合，在 100W，59化条件下超声5min，得到红细胞膜包裹酸敏感的高分子前药纳米系统；
[0047] 3)用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化上述纳米系统，得到粒径均一的红细胞膜包裹高 分子前药纳米系统。
[004引实施例2
[0049]配置高分子载紫杉醇前药（PGSC-PTX)和红细胞包裹的高分子载紫杉醇前药 (RBCm/PGSC-PTX) Img/ml，超声5分钟后静置2分钟，用马尔文激光粒度仪测定其粒径大小和 粒径分布，图2(A、B)显示纳米颗粒径分布情况，PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒的平 均粒径分别为50nm和IOOnm左右。
[00加]实施例3
[0051 ] PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX的形态通过透射电子显微镜（TEM)来观察，需用1 %的 憐鹤酸负染制备样品，具体如下：（1)滴一滴样品溶液于铜网上，（2)空气中干燥约10分钟， 用滤纸吸去多余的液体，（3)再滴一滴1%的憐鹤酸于铜网上，室溫干燥5分钟后用滤纸吸去 多余的染液，（4)待样品干燥后置于透射电镜下观察。图2(C、D)为PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒的透射电镜图片，两种纳米粒形态均比较规则，呈球形。
[0化2] 实施例4
[0053] 将PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用PBS液配制成1 .Omg/ml，用动态光散射仪(DLS)测 定粒径大小和分散性指数(PDI)，每两天测定一次，连续测定两周，考察纳米粒子的长期稳 定性。结果如图3(A)，两种纳米粒的稳定性良好，放置半个月后粒径无明显变化(p〉0.05)。 [0054] 实施例5
[0055]将PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用 100%FBS配制成 1. Omg/ml，样品置于37°C轻轻震 荡，分别于不同时间点取样在560nm条件下测定吸光值，每组重复测定S次，根据吸光值来 考察样品的血清稳定性。两种纳米粒的血清稳定性如图3(B)，在放置4小时后PGSC-PTX和 RBCm/PGSC -PTX均未发生凝聚，相对稳定。
[0056] 实施例6
[0057] PGSC-PTX和RBCm/PGSC-Pl'X的释药性能：用PH为7.4，6.5，的两种缓冲盐溶液分别 配制一定浓度的PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX，每组S个重复，将所有样品放置于37°C恒溫振 荡器中。分别在不同时间点取每种样品两个PH缓冲盐溶液各一组，用乙酸乙醋萃取溶液中 释放出来的紫杉醇，用高效液相色谱仪测定紫杉醇的含量(标准曲线法）。如图4所示，PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX在PH 6.5时紫杉醇释放速度和释放量均高于PH 7.4 JGSC-PTX在PH 6.5和PH 7.4时紫杉醇释放量差值比RBCm/PGSC-PTX大，酸敏感性较好。
[0化引实施例7
[0059] 体外细胞摄取：WNCI-H460细胞为模型，将细胞W3X104cells/ml的密度种于24 孔板中培养24小时，然后用载有巧光染料DIO的PGSC-PTX和RBCm/PGSC-Pl'X药物处理地，同 时设置对照组。加药处理后用PBS洗涂S次，分别用激光共聚焦定性和流式细胞仪定量评价 细胞摄取情况。用激光共聚焦定性分析需要将红细胞用DIL染料染成红色，细胞核用 化chest染成蓝色。流式细胞仪分析的细胞先用PBS洗涂S次，用用PBS洗涂，消化、离屯、，将 沉淀重悬，流式细胞仪检测。如图5所示，激光共聚焦结果定性观察显示，相比RBCm/PGSC-PTX，PGSC-PTX更容易被细胞摄取.流式细胞仪定量考察也结果显示，NCI-H460细胞对PGSC-PTX纳米粒子的摄取明显多于对RBCm/PGSC-PTX纳米粒子的摄取(P<0.05)。
[0060] 实施例8
[0061 ] PGSC-PTX和RBCm/PGSC-Pl'X的细胞毒性评价:体外细胞毒性实验WNCI-H460细胞 为模型，采用CCK-8试剂盒分析ICso值来考察PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX和游离的PTX对细胞 的抑制率，具体方法:将密度为3*104cells/ml的非小细胞肺癌细胞NCI-H460悬液种于96孔 板中，放置在5 %C〇2条件下的37°C培养箱，培养24小时；向96孔板中加入不同浓度的化XOl、 PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTXS种药物溶液，并设置空白对照，和阴性对照（不加药），每组设 S个复孔;加药后将96孔板放置在5%C02条件下的37°C培养箱中继续解育48小时;移去孔 中的液体，每孔再次加入10化1新鲜培养基和IOyl CCK-8试剂;将96孔板放在37°C恒溫震荡 箱中轻微震荡培养4小时；用酶标仪测定在450nm处的OD值。
[0062] 细胞的存活率计算公式：
[0063] 细胞活力（％) = [A(加药)-A(空白）]/[A(不加药)-A(空白）]X100%。
[0064] 公式中；
[0065] A(空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有非小细胞肺癌细胞NCI-H460的孔的OD 值；
[0066] A(加药）：具有非小细胞肺癌细胞NCI-H460、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值；
[0067] A(不加药）：具有非小细胞肺癌细胞NCI-H460、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的 OD值。如图6所示，Taxol ,PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX处理NCI-H460细胞4她后，ICsq值分别为 0.0037化g/ml，0.190化g/m巧PO. 376祉g/ml。很显然，PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX的ICso值明 显低于化XOl的ICso值，说明高分子通过键合形式连接紫杉醇形成的两种纳米粒子，毒性明 显降低。
[006引实施例9
[0069] 免疫原性实验：W巨隧细胞Raw 264.7细胞为模型，将细胞^3*10如6113/1111的密 度种于24空板中培养24小时，然后用载有巧光染料DIO的PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX药物处 理地，同时设置对照组。加药处理后用PBS洗涂，消化、离屯、，将沉淀重悬，流式细胞仪检测。 如图7所示，流式细胞仪定量考察NCI-H460细胞对RBCm/PGSC-PTX纳米粒子的摄取明显少于 对PGSC-PTX纳米粒子的摄取(P<0.0 Ol)。运说明红细胞膜包裹纳米粒子可W降低巨隧细胞 的摄取，逃避肝脏的清除，降低了免疫原性。
[0070] 实施例10
[0071 ]溶血性实验：目的是考察纳米药物对红细胞的破坏程度，W此来验证能否采用静 脉注射的方式进行给药，具体实验步骤:取大鼠全血离屯、（100化9111，4°0,5111111)，用生理盐水 洗涂S次，得到的红细胞用生理盐水稀释，获得2% (v/v)的红细胞悬液。将不同浓度的 PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX，吐溫80，藍麻油乙醇（Sigma-Al化ich)，蒸馈水和生理盐水加入 到2% (v/v)的红细胞悬液中，37°C解育3小时，将样品离屯、去除没有溶血的红细胞，将得到 的悬液用紫外分光光度计于545nm下检测吸光值，每组重复测定=次，溶血率按下列公式计 算：
[0072] 溶血率=(样品A值-阴性对照管A值)/(阳性对照A值-阴性对照A值）X 100%
[0073] 其中：样品--PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX,吐溫80和藍麻油乙醇
[0074] 阴性对照管一一生理盐水 [00对阳性对照一一蒸馈水
[0076] 如图8示，PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒子在浓度为8mg/ml条件下都几乎 没有使红细胞溶解，相比而言，表面活性剂TweenSO在2mg/ml时就已全部溶血，藍麻油乙醇 化L)在2mg/ml时也已溶血62%。因此，PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒子的溶血性可 W忽略不计，运说明PGSC-PTX，RBCm/PGSC-Pl'X两种纳米粒子静脉注射后不会引起贫血毒 性。
[0077] 实施例11
[0078] 长循环试验:将载有巧光染料DID的两种纳米粒子PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用生 理盐水配置成5mg/ml，尾静脉注射给SD大鼠，分别在注射后不同时间点眼眶取血获得样品， 用巧光分光光度计检测。如图9示，在2地和4她时，RBCm/PGSC-PTX在血液中的滞留率分别为 25%和14% ,PGSC-PTX在血液中的滞留率分别为7%和6%。经计算得出PGSC-PTX和RBCm/ PGSC-PTX曲线下面积分别为850.2和2082，由此可见，经红细胞膜包裹后长循环时间明显延 长，从而使药物有足够的时间到达肿瘤部位。
[0079] 实施例12
[0080] 将NCI-H460细胞按常规条件（37°C，5 % C〇2)培养，待细胞融合度达到80-90 %时， 用含抓TA的0.25 %膜酶消化细胞并离屯、收集，用PH 7.4PBS洗涂细胞两次计数，制备成终浓 度为5X IO6个/mL的单细胞悬液，用ImL注射器将细胞接种到裸鼠的右肩皮下，每只裸鼠接 种0.1血，当肿瘤长至IOO-ISOmm 3时备用。当肿瘤长至IOO-ISOmm3时（记作0天），将荷瘤小鼠 随机分成8组，每组6只，分别设为生理盐水对照组，Taxol(50mg/kg)组，PGSC-PTX(80mg/ kg )，RBCm/PGSC-PTX (80mg/kg)组，尾静脉注射给药，考察如下指标：
[0081] 肿瘤生长曲线：每两天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，根据公式v = l/2(长 径/短径2)，算肿瘤的体积，绘制肿瘤体积随时间变化的生长曲线。
[0082] 体重变化曲线:每两天称量模型鼠的体重，绘制其体重随时间的变化曲线，如果模 型鼠体重降低超过15%，可认为该载药系统的毒性较大。
[0083] 疗效实验结果如图10所示，与I'axoKSOmg/kg)组和PGSC-PTX(SOmgAg)组，相比， RBCm/PGSC-PTX NPs(SOmgAg)表现出明显的抑制肿瘤生长的效果。
【主权项】
1. 一种红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法，该纳米递药系统 由红细胞膜包裹酸敏感高分子前药纳米粒构成，其酸敏感高分子前药为PGSC-PTX，由聚谷 氨酸钢和簇甲半脫氨酸通过肤键连接组成，再与抗癌药物紫杉醇PTX键合形成，其结构如 下：能自组装形成平均粒径为50nm的纳米粒，并可在酸性环境下释放药物PTX;其特征在 于，所述纳米递药系统的制备方法包括： 步骤1:制备红细胞囊泡:取小鼠全血，离屯、操作，破膜释放内含物，得到空红细胞膜，超 声得到均匀的红细胞膜囊泡； 步骤2:红细胞膜囊泡与酸敏感高分子前药比例为50-70亿个:6-lOmg，将酸敏感高分子 前药与红细胞膜囊泡混合，在l〇〇W，59Hz条件下超声5min;得到粒径均一的红细胞膜包裹的 酸敏感高分子前药纳米粒即所述纳米递药系统，通过G50葡聚糖凝胶柱分离纯化； 步骤3:测定所述纳米递药系统的粒径、形态； 步骤4:测定所述纳米递药系统的长期稳定性； 步骤5:测定所述纳米递药系统的血清稳定性； 步骤6:测定所述纳米递药系统的体外药物释放特征； 步骤7:测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的摄取； 步骤8:测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的毒性； 步骤9:测定巨隧细胞对所述纳米递药系统的摄取； 步骤10:测定所述纳米递药系统对红细胞膜的破坏作用； 步骤11:测定所述纳米递药系统在大鼠体内的循环时间； 步骤12:测定所述纳米递药系统对肺癌肿瘤生长的抑制作用。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2采用超声方法包裹酸敏感高 分子前药，用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化纳米递药系统。3. -种权利要求1所述方法制备的红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的 用途，其特征在于，该纳米递药系统用于制备能够进行长循环、被动祀向、运送活性物质的 抗肿瘤药物。
【专利摘要】本发明公开了一种红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法及用途，其中高分子是由聚谷氨酸钠和羧甲半胱氨酸通过肽键连接组成，再与抗癌药物紫杉醇键合，形成高分子前药；用红细胞膜包裹高分子前药，得到红细胞膜包裹的酸敏感的高分子递药系统。该递药系统具有以下特征：粒径在100nm左右，呈球形；在磷酸缓冲液和血清中均比较稳定；在酸性环境下药物释放特性较好；在细胞实验中毒性明显降低；巨噬细胞对该系统的摄取明显减少；该系统对红细胞没有破坏作用，可用于静脉注射；该系统在血液中的循环时间明显比高分子长；该系统对肺癌肿瘤生长有明显抑制作用。
【IPC分类】A61K31/337, A61P35/00, A61K47/48
【公开号】CN105497912
【申请号】CN201610040717
【发明人】王依婷, 南丽娟, 彭婷, 孙磊, 周靖娥, 肖晔, 王 华, 高猎防, 闫志强, 王镜, 朱建中, 俞磊
【申请人】华东师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月21日
【技术领域】
[0001] 本发明设及高分子化学和纳米制剂技术领域，具体地说是一种用于抗肿瘤药物递 送的长循环酸敏感高分子递药系统的制备及用途。
【背景技术】
[0002] 化疗是最常见的恶性肿瘤治疗手段之一，但是统计表明，目前临床上化疗并未导 致癌症患者死亡率的实质性降低。紫杉醇是最有效的化疗药物之一，主要用于治疗肺癌、卵 巢癌和乳腺癌等。紫杉醇具有聚合和稳定细胞内微管的作用，致使快速分裂的肿瘤细胞在 有丝分裂阶段被牢牢固定，使微管不再分开，可阻断细胞于细胞周期之G2与M期，使癌细胞 复制受阻断而死亡。紫杉醇的低水溶性(0.003mg/ml)大大的限制了它在临床上的应用。目 前被批准临床上使用的紫杉醇制剂有:Taxol愈，由聚氧乙締藍麻油和乙醇（1:1，v/v)形成的 制剂，但聚氧乙締藍麻油会导致严重的副作用，如过敏反应。二代紫杉醇制剂包括 Abraxan泌:，和Gcnexol-PM嚴，与Taxol'K相比，二代制剂降低了毒副作用，提高了耐受剂量， 显示出了良好的药代动力学特性。但是释药和体内循环时间较短问题仍然存在，运也是导 致紫杉醇二代制剂不理想的原因。
[0003] 在肿瘤组织中适时、足量释药是一个祀向纳米递药系统发挥效应的关键一步。为 达到运一目的，肿瘤微环境响应型递药系统在近年来得到很大进步，主要包括抑敏感、溫度 敏感、酶敏感型递药系统，运些递药系统可改善药物释放行为，提高药效。目前紫杉醇聚合 物前药已有大量文献报道，包括?66斗1乂，？64斗1乂，？664斗1乂。虽然与游离紫杉醇相比运些 前药显示出更高的溶解性和肿瘤祀向性，但是仍存在释药不充分的问题。如PGG-PTX 60小 时体外释药仅为10%。为改善运一问题，利用肿瘤组织(pH 6-6.5)及肿瘤细胞内涵体与溶 酶体中（ <抑5)的低抑值的特征，合成了一种pH敏感的高分子水溶性紫杉醇前药PGSC-PTX， 显示出良好的抑敏感性【CN 201510051159.0】。
[0004] 长循环纳米递药系统由于可W延长药物全身传递时间并更好实现肿瘤的祀向效 果而备受关注。目前最常见的方法是用高亲水性物质聚乙二醇(PEG)对纳米粒子进行表面 修饰，且已有PEG化的纳米递药系统上市。但是，有研究发现机体会对PEG化纳米载体产生抗 PEG免疫反应，从而激发其被网状内皮细胞吞隧。由于红细胞在体内良好的循环特性，有研 究者依据红细胞膜的结构特点，对纳米粒子表面进行模拟红细胞膜的修饰来达到延长体内 循环时间的目的，但是运种方法需要进行红细胞膜蛋白鉴别、纯化与化学连接等工作，无疑 增大了纳米粒的制备难度，且难W使纳米载体完全模拟红细胞膜结构特点。张良方副教授 提出利用红细胞膜直接包裹纳米粒，在保留纳米粒功能的同时，赋予纳米粒长循环的特性。 研究表明，与PEG化纳米粒相比，红细胞膜包裹纳米粒的半衰期延长了2.5倍。此外，由于红 细胞膜的易获得性、内源性、低免疫原性等优点，可W大大增加递药系统的成药性。因此，红 细胞膜包裹技术为增加纳米递药系统的体内循环时间、提高药物成药性和有效性提供了一 种简单实用的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对递药系统在体内的长循环、释药问题，提供一种红细胞膜 包裹的载紫杉醇的酸敏感纳米递药系统RBCm/PGSC-Pl'X用于肿瘤治疗药物的制备。将该递 药系统静脉注射入血后，红细胞膜的包裹可保证该递药系统在血液中长循环;在肿瘤酸性 环境中，PGSC-Pl'X可加速降解并释放足量的PTX，杀死肿瘤细胞。该递药系统的成功实施将 为当前肿瘤治疗提供一种合理化方式。
[0006] 实现本发明目的的具体技术方案是：
[0007] -种红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法，该纳米递药系 统由红细胞膜包裹酸敏感高分子前药纳米粒构成，其酸敏感高分子前药为PGSC-PTX，由聚 谷氨酸钢和簇甲半脫氨酸通过肤键连接组成，再与抗癌药物紫杉醇PTX键合形成，其结构如 下：
[0009] 能自组装形成平均粒径为50nm的纳米粒，并可在酸性环境下释放药物PTX;
[0010] 特点在于，所述纳米递药系统的制备方法包括：
[OOW 步骤1:制备红细胞囊泡：取小鼠全血，离屯、操作，破膜释放内含物，得到空红细胞 膜，超声得到均一的红细胞膜囊泡；
[001 ^ 步骤2:红细胞膜囊泡与酸敏感高分子前药比例为50-70亿个:6-lOmg，将酸敏感高 分子前药与红细胞膜囊泡混合，在IOOW，59Hz条件下超声5min;得到粒径均一的红细胞膜包 裹的酸敏感高分子前药纳米粒即所述纳米递药系统RBCm/PGSC-PTX，通过G50葡聚糖凝胶柱 分离纯化；
[0013] 步骤3:测定所述纳米递药系统的粒径、形态；
[0014] 步骤4:测定所述纳米递药系统的长期稳定性；
[0015] 步骤5:测定所述纳米递药系统的血清稳定性；
[0016] 步骤6:测定所述纳米递药系统的体外药物释放特征；
[0017] 步骤7:测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的摄取；
[001引步骤8:巧憶所述纳米递药系统对肺癌细胞的毒性；
[0019] 步骤9:测定巨隧细胞对所述纳米递药系统的摄取；
[0020] 步骤10:测定所述纳米递药系统对红细胞膜的破坏作用；
[0021 ]步骤11:测定所述纳米递药系统在大鼠体内的循环时间；
[0022] 步骤12:测定所述纳米递药系统对肺癌肿瘤生长的抑制作用。
[0023] 所述步骤2采用超声方法包裹酸敏感高分子前药，用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化纳 米递药系统。
[0024] 本发明制备的红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的用途，其特征在 于，该纳米递药系统用于制备能够进行长循环、被动祀向、运送活性物质的抗肿瘤药物。
[0025] 本发明的递药系统具有W下特征:粒径在IOOnm左右，呈球形；在憐酸缓冲液和血 清中均比较稳定;在酸性环境下药物释放特性较好;在细胞实验中毒性明显降低；巨隧细胞 对该系统的摄取明显减少;该系统对红细胞没有破坏作用，可用于静脉注射;该系统在血液 中的循环时间明显比高分子长;该系统对肺癌肿瘤生长有明显抑制作用。
【附图说明】
[00%] 图1为本发明RBCm/PGSC-PTX制备流程图；
[0027] 图2为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的粒径图和透射电镜图；
[00%]图3为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的长期稳定性实验和血清稳定性实验图；
[00巧]图4为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs在不同抑下药物释放对比图；
[0030] 图5为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的体外细胞摄取实验图；
[0031] 图6为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的体外细胞毒性实验图；
[0032] 图7为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的免疫原性试验图；
[0033] 图8为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的溶血性试验图；
[0034] 图9为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的长循环试验图；
[0035] 图10为本发明RBCm/PGSC-PTX NPs的疗效试验图。
【具体实施方式】
[0036] 高分子前药紫杉醇载药量为32.8%。
[0037] 实施例1
[0038] (1)红细胞膜囊泡的制备
[0039] 1)取20g左右重量的小鼠，腹腔注射0.2ml的2 %戊己比妥钢溶液，待完全麻醉后， 剖开剑突及W上部位，暴露屯、脏后，从左屯、室进针，取用肝素钢润洗过的注射器取血(大约 Iml)，取血后转移至2ml含肝素钢的EP管中；
[0040] 2)将全血放入离屯、机中离屯、，900g，20min，弃去上层清液，留下暗红色沉淀，取沉 淀3倍体积的1冲BS放入，并均匀吹散，放入离屯、机离屯、2500g，15min.此为第一次洗涂，重复 操作立次；
[0041] 3)上述最后一次操作后，弃去上层清液，留下沉淀，取沉淀等量的1*PBS放入离屯、 管中吹散，取950ul的0.2mM的抓TA放入离屯、管混匀，待充分溶血后，加入50ul20冲BS，于 21000g，离屯、7min.此为第一次溶血洗涂重复操作五次；
[0042] 4)上述最后一次操作后，弃去上层清液，加入1mlO.2mM的抓TA重悬，即为红细胞膜 悬浮液。
[0043] 5)将得到的红细胞膜悬液在IOOW，59Hz条件下超声5min，得到均匀的红细胞膜囊 泡。
[0044] (2)红细胞膜包裹酸敏感的高分子前药纳米系统的制备
[0045] 1)配制浓度为8mg/ml的高分子前药纳米粒；
[0046] 2)将配置好的上述高分子前药纳米粒与Iml全血中提取的红细胞囊泡混合，在 100W，59化条件下超声5min，得到红细胞膜包裹酸敏感的高分子前药纳米系统；
[0047] 3)用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化上述纳米系统，得到粒径均一的红细胞膜包裹高 分子前药纳米系统。
[004引实施例2
[0049]配置高分子载紫杉醇前药（PGSC-PTX)和红细胞包裹的高分子载紫杉醇前药 (RBCm/PGSC-PTX) Img/ml，超声5分钟后静置2分钟，用马尔文激光粒度仪测定其粒径大小和 粒径分布，图2(A、B)显示纳米颗粒径分布情况，PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒的平 均粒径分别为50nm和IOOnm左右。
[00加]实施例3
[0051 ] PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX的形态通过透射电子显微镜（TEM)来观察，需用1 %的 憐鹤酸负染制备样品，具体如下：（1)滴一滴样品溶液于铜网上，（2)空气中干燥约10分钟， 用滤纸吸去多余的液体，（3)再滴一滴1%的憐鹤酸于铜网上，室溫干燥5分钟后用滤纸吸去 多余的染液，（4)待样品干燥后置于透射电镜下观察。图2(C、D)为PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒的透射电镜图片，两种纳米粒形态均比较规则，呈球形。
[0化2] 实施例4
[0053] 将PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用PBS液配制成1 .Omg/ml，用动态光散射仪(DLS)测 定粒径大小和分散性指数(PDI)，每两天测定一次，连续测定两周，考察纳米粒子的长期稳 定性。结果如图3(A)，两种纳米粒的稳定性良好，放置半个月后粒径无明显变化(p〉0.05)。 [0054] 实施例5
[0055]将PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用 100%FBS配制成 1. Omg/ml，样品置于37°C轻轻震 荡，分别于不同时间点取样在560nm条件下测定吸光值，每组重复测定S次，根据吸光值来 考察样品的血清稳定性。两种纳米粒的血清稳定性如图3(B)，在放置4小时后PGSC-PTX和 RBCm/PGSC -PTX均未发生凝聚，相对稳定。
[0056] 实施例6
[0057] PGSC-PTX和RBCm/PGSC-Pl'X的释药性能：用PH为7.4，6.5，的两种缓冲盐溶液分别 配制一定浓度的PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX，每组S个重复，将所有样品放置于37°C恒溫振 荡器中。分别在不同时间点取每种样品两个PH缓冲盐溶液各一组，用乙酸乙醋萃取溶液中 释放出来的紫杉醇，用高效液相色谱仪测定紫杉醇的含量(标准曲线法）。如图4所示，PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX在PH 6.5时紫杉醇释放速度和释放量均高于PH 7.4 JGSC-PTX在PH 6.5和PH 7.4时紫杉醇释放量差值比RBCm/PGSC-PTX大，酸敏感性较好。
[0化引实施例7
[0059] 体外细胞摄取：WNCI-H460细胞为模型，将细胞W3X104cells/ml的密度种于24 孔板中培养24小时，然后用载有巧光染料DIO的PGSC-PTX和RBCm/PGSC-Pl'X药物处理地，同 时设置对照组。加药处理后用PBS洗涂S次，分别用激光共聚焦定性和流式细胞仪定量评价 细胞摄取情况。用激光共聚焦定性分析需要将红细胞用DIL染料染成红色，细胞核用 化chest染成蓝色。流式细胞仪分析的细胞先用PBS洗涂S次，用用PBS洗涂，消化、离屯、，将 沉淀重悬，流式细胞仪检测。如图5所示，激光共聚焦结果定性观察显示，相比RBCm/PGSC-PTX，PGSC-PTX更容易被细胞摄取.流式细胞仪定量考察也结果显示，NCI-H460细胞对PGSC-PTX纳米粒子的摄取明显多于对RBCm/PGSC-PTX纳米粒子的摄取(P<0.05)。
[0060] 实施例8
[0061 ] PGSC-PTX和RBCm/PGSC-Pl'X的细胞毒性评价:体外细胞毒性实验WNCI-H460细胞 为模型，采用CCK-8试剂盒分析ICso值来考察PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX和游离的PTX对细胞 的抑制率，具体方法:将密度为3*104cells/ml的非小细胞肺癌细胞NCI-H460悬液种于96孔 板中，放置在5 %C〇2条件下的37°C培养箱，培养24小时；向96孔板中加入不同浓度的化XOl、 PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTXS种药物溶液，并设置空白对照，和阴性对照（不加药），每组设 S个复孔;加药后将96孔板放置在5%C02条件下的37°C培养箱中继续解育48小时;移去孔 中的液体，每孔再次加入10化1新鲜培养基和IOyl CCK-8试剂;将96孔板放在37°C恒溫震荡 箱中轻微震荡培养4小时；用酶标仪测定在450nm处的OD值。
[0062] 细胞的存活率计算公式：
[0063] 细胞活力（％) = [A(加药)-A(空白）]/[A(不加药)-A(空白）]X100%。
[0064] 公式中；
[0065] A(空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有非小细胞肺癌细胞NCI-H460的孔的OD 值；
[0066] A(加药）：具有非小细胞肺癌细胞NCI-H460、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值；
[0067] A(不加药）：具有非小细胞肺癌细胞NCI-H460、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的 OD值。如图6所示，Taxol ,PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX处理NCI-H460细胞4她后，ICsq值分别为 0.0037化g/ml，0.190化g/m巧PO. 376祉g/ml。很显然，PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX的ICso值明 显低于化XOl的ICso值，说明高分子通过键合形式连接紫杉醇形成的两种纳米粒子，毒性明 显降低。
[006引实施例9
[0069] 免疫原性实验：W巨隧细胞Raw 264.7细胞为模型，将细胞^3*10如6113/1111的密 度种于24空板中培养24小时，然后用载有巧光染料DIO的PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX药物处 理地，同时设置对照组。加药处理后用PBS洗涂，消化、离屯、，将沉淀重悬，流式细胞仪检测。 如图7所示，流式细胞仪定量考察NCI-H460细胞对RBCm/PGSC-PTX纳米粒子的摄取明显少于 对PGSC-PTX纳米粒子的摄取(P<0.0 Ol)。运说明红细胞膜包裹纳米粒子可W降低巨隧细胞 的摄取，逃避肝脏的清除，降低了免疫原性。
[0070] 实施例10
[0071 ]溶血性实验：目的是考察纳米药物对红细胞的破坏程度，W此来验证能否采用静 脉注射的方式进行给药，具体实验步骤:取大鼠全血离屯、（100化9111，4°0,5111111)，用生理盐水 洗涂S次，得到的红细胞用生理盐水稀释，获得2% (v/v)的红细胞悬液。将不同浓度的 PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX，吐溫80，藍麻油乙醇（Sigma-Al化ich)，蒸馈水和生理盐水加入 到2% (v/v)的红细胞悬液中，37°C解育3小时，将样品离屯、去除没有溶血的红细胞，将得到 的悬液用紫外分光光度计于545nm下检测吸光值，每组重复测定=次，溶血率按下列公式计 算：
[0072] 溶血率=(样品A值-阴性对照管A值)/(阳性对照A值-阴性对照A值）X 100%
[0073] 其中：样品--PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX,吐溫80和藍麻油乙醇
[0074] 阴性对照管一一生理盐水 [00对阳性对照一一蒸馈水
[0076] 如图8示，PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒子在浓度为8mg/ml条件下都几乎 没有使红细胞溶解，相比而言，表面活性剂TweenSO在2mg/ml时就已全部溶血，藍麻油乙醇 化L)在2mg/ml时也已溶血62%。因此，PGSC-PTX，RBCm/PGSC-PTX两种纳米粒子的溶血性可 W忽略不计，运说明PGSC-PTX，RBCm/PGSC-Pl'X两种纳米粒子静脉注射后不会引起贫血毒 性。
[0077] 实施例11
[0078] 长循环试验:将载有巧光染料DID的两种纳米粒子PGSC-PTX和RBCm/PGSC-PTX用生 理盐水配置成5mg/ml，尾静脉注射给SD大鼠，分别在注射后不同时间点眼眶取血获得样品， 用巧光分光光度计检测。如图9示，在2地和4她时，RBCm/PGSC-PTX在血液中的滞留率分别为 25%和14% ,PGSC-PTX在血液中的滞留率分别为7%和6%。经计算得出PGSC-PTX和RBCm/ PGSC-PTX曲线下面积分别为850.2和2082，由此可见，经红细胞膜包裹后长循环时间明显延 长，从而使药物有足够的时间到达肿瘤部位。
[0079] 实施例12
[0080] 将NCI-H460细胞按常规条件（37°C，5 % C〇2)培养，待细胞融合度达到80-90 %时， 用含抓TA的0.25 %膜酶消化细胞并离屯、收集，用PH 7.4PBS洗涂细胞两次计数，制备成终浓 度为5X IO6个/mL的单细胞悬液，用ImL注射器将细胞接种到裸鼠的右肩皮下，每只裸鼠接 种0.1血，当肿瘤长至IOO-ISOmm 3时备用。当肿瘤长至IOO-ISOmm3时（记作0天），将荷瘤小鼠 随机分成8组，每组6只，分别设为生理盐水对照组，Taxol(50mg/kg)组，PGSC-PTX(80mg/ kg )，RBCm/PGSC-PTX (80mg/kg)组，尾静脉注射给药，考察如下指标：
[0081] 肿瘤生长曲线：每两天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，根据公式v = l/2(长 径/短径2)，算肿瘤的体积，绘制肿瘤体积随时间变化的生长曲线。
[0082] 体重变化曲线:每两天称量模型鼠的体重，绘制其体重随时间的变化曲线，如果模 型鼠体重降低超过15%，可认为该载药系统的毒性较大。
[0083] 疗效实验结果如图10所示，与I'axoKSOmg/kg)组和PGSC-PTX(SOmgAg)组，相比， RBCm/PGSC-PTX NPs(SOmgAg)表现出明显的抑制肿瘤生长的效果。
【主权项】
1. 一种红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法，该纳米递药系统 由红细胞膜包裹酸敏感高分子前药纳米粒构成，其酸敏感高分子前药为PGSC-PTX，由聚谷 氨酸钢和簇甲半脫氨酸通过肤键连接组成，再与抗癌药物紫杉醇PTX键合形成，其结构如 下：能自组装形成平均粒径为50nm的纳米粒，并可在酸性环境下释放药物PTX;其特征在 于，所述纳米递药系统的制备方法包括： 步骤1:制备红细胞囊泡:取小鼠全血，离屯、操作，破膜释放内含物，得到空红细胞膜，超 声得到均匀的红细胞膜囊泡； 步骤2:红细胞膜囊泡与酸敏感高分子前药比例为50-70亿个:6-lOmg，将酸敏感高分子 前药与红细胞膜囊泡混合，在l〇〇W，59Hz条件下超声5min;得到粒径均一的红细胞膜包裹的 酸敏感高分子前药纳米粒即所述纳米递药系统，通过G50葡聚糖凝胶柱分离纯化； 步骤3:测定所述纳米递药系统的粒径、形态； 步骤4:测定所述纳米递药系统的长期稳定性； 步骤5:测定所述纳米递药系统的血清稳定性； 步骤6:测定所述纳米递药系统的体外药物释放特征； 步骤7:测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的摄取； 步骤8:测定所述纳米递药系统对肺癌细胞的毒性； 步骤9:测定巨隧细胞对所述纳米递药系统的摄取； 步骤10:测定所述纳米递药系统对红细胞膜的破坏作用； 步骤11:测定所述纳米递药系统在大鼠体内的循环时间； 步骤12:测定所述纳米递药系统对肺癌肿瘤生长的抑制作用。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2采用超声方法包裹酸敏感高 分子前药，用G50葡聚糖凝胶柱分离纯化纳米递药系统。3. -种权利要求1所述方法制备的红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的 用途，其特征在于，该纳米递药系统用于制备能够进行长循环、被动祀向、运送活性物质的 抗肿瘤药物。
【专利摘要】本发明公开了一种红细胞膜包裹的酸敏感高分子前药纳米递药系统的制备方法及用途，其中高分子是由聚谷氨酸钠和羧甲半胱氨酸通过肽键连接组成，再与抗癌药物紫杉醇键合，形成高分子前药；用红细胞膜包裹高分子前药，得到红细胞膜包裹的酸敏感的高分子递药系统。该递药系统具有以下特征：粒径在100nm左右，呈球形；在磷酸缓冲液和血清中均比较稳定；在酸性环境下药物释放特性较好；在细胞实验中毒性明显降低；巨噬细胞对该系统的摄取明显减少；该系统对红细胞没有破坏作用，可用于静脉注射；该系统在血液中的循环时间明显比高分子长；该系统对肺癌肿瘤生长有明显抑制作用。
【IPC分类】A61K31/337, A61P35/00, A61K47/48
【公开号】CN105497912
【申请号】CN201610040717
【发明人】王依婷, 南丽娟, 彭婷, 孙磊, 周靖娥, 肖晔, 王 华, 高猎防, 闫志强, 王镜, 朱建中, 俞磊
【申请人】华东师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月21日
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