一种三维纳米纤维组织工程支架及制备方法
一种三维纳米纤维组织工程支架及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种三维纳米纤维组织工程支架及制备方法。
【背景技术】
[0002]基因治疗是一种通过载体将目的基因传递到靶细胞内进行适度表达或干扰以治疗疾病为目的的生物医学治疗方法。基因治疗三个基本要素组成:目的基因、基因运送载体及靶细胞。其中如何获得高效、无毒、可生物降解的基因运送载体，成为当前基因治疗领域的技术瓶颈。
[0003]目前应用于基因治疗的载体可分为病毒型基因载体和非病毒型基因载体两大类。病毒载体(如各种逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等)在体内有较尚的转染效率，但存在着对外源基因的容纳量少(约4.5-30kbp)、稳定性差、勒向特异性差以及潜在的毒性和致癌性等缺点。非病毒载体包括脂质体和阳离子复合物，其优点是安全性好，基因装载容量大，但存在着转染效率低、靶向性差、有效表达时间短，容易被血液中的成分清除等缺点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种三维纳米纤维组织工程支架，此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。
[0005]本发明的另一目的在于提供一种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，以得到可用于基因治疗的三维纳米纤维组织工程支架，此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。
[0006]本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0007]—种三维纳米纤维组织工程支架，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。
[0008]—种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其包括:
[0009]制备壳聚糖-核酸纳米微囊；
[0010]配置丝素蛋白溶液；
[0011 ]将壳聚糖-核酸纳米微囊加入到丝素蛋白溶液中形成纺丝溶液；
[0012]采用纺丝工艺对纺丝溶液进行纺丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝；
[0013]交联丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0014]本发明提供的三维纳米纤维组织工程支架及制备方法的有益效果是:(1)由于三维纳米纤维组织工程支架的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架包被有用于基因治疗的核酸，治疗时，将三维纳米纤维组织工程支架放置于受损组织部位，改变了传统采用注射给药方式，其更具有靶向性。(2)此外，在三维纳米纤维组织工程支架降解的过程中，能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，由于三维纳米纤维组织工程支架的降解过程比较缓慢，因此，核酸能够缓慢地且持续不断地从壳聚糖-核酸纳米纤维支架中转染进入到周围受损组织细胞中，这样使得核酸能够对受损组织中发挥功能的时间更具有持续性也更稳定，表现出时间可控的基因治疗效果，其克服了现有的基因载体其携带的基因在转染受损组织细胞中的表达瞬时性的缺点。(3)还有，本三维纳米纤维组织工程支架采用丝素蛋白和壳聚糖制备而成，仿生天然细胞外基质的，其具有更好地生物相容性、极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构，非常有利于细胞粘附和迀移，为细胞提供了良好的生长微环境。
【附图说明】
[0015]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0016]图1为本发明实施例的壳聚糖-核酸纳米微囊在原子力显微镜下的形态图(图中箭头指示其中一个壳聚糖-核酸纳米微囊，A、B为不同放大倍数下的形态图)；
[0017]图2为本发明实施例的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米微囊和三维纳米纤维组织工程支架的凝胶电泳检测图(ASDNA 1^4虹、8为纯质粒？6?1]6/6??/如0、(:为壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊、D为三维纳米纤维组织工程支架)；
[0018]图3为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架在扫描电镜(S3700，3.0OkV，
11.4_X3.00k)下的形态图(黑色箭头指示三维纳米纤维组织工程支架孔隙中充注的胶原；白色箭头指示包裹在三维纳米纤维组织工程支架纤维上的胶原)；
[0019]图4为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架将携带的pGPU6/GFP/Neo转染至IJ细胞后表达的绿色荧光蛋白检测图(图中A1、A2、A3和A4分别代表生长在三维纳米纤维组织工程支架上的细胞在第7天、14天、21天和28天时细胞内绿色荧光蛋白检测图；B1、B2、B3和B4分别代表使用Lipofectamine 2000转染pGPU6/GFP/Neo质粒后的细胞在第3天、7天、14天和21天时细胞内绿色荧光蛋白检测图；图中箭头指示其中一个表达绿色荧光蛋白的细胞)；
[0020]图5为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架对细胞增殖能力影响的OD值检测图(图中表示差异显著p〈0.05)。
【具体实施方式】
[0021]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品O
[0022]下面对本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架和三维纳米纤维组织工程支架的制备方法进行具体说明。
[0023]三维纳米纤维组织工程支架其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。
[0024]其中，壳聚糖-核酸纳米微囊中的核酸可以是能携带功能基因的质粒例如pGPU6/GFP/Neo、pEGFP-N2、pCMVp-NE0-BAN、pYrb1-LT-l、supersilencing? shRNA、OmicsLink?shRNA等;此外，核酸还可以是siRNA或反义寡核苷酸片段等。
[0025]其中，壳聚糖-核酸纳米微囊中的壳聚糖(chitosan、CS)的分子量范围为50KDa?190KDa，脱乙酰度为75?85%。
[0026]作为优选，该三维纳米纤维组织工程支架包括有胶原包覆层，胶原包覆层包覆丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0027]三维纳米纤维组织工程支架的制备方法包括:
[0028]SI制备壳聚糖-核酸纳米微囊
[0029]具体地，先将壳聚糖和核酸分别溶于乙酸钠缓冲溶液中，乙酸钠溶液的pH为5.4?5.6，制得0.16?0.24mg/mL壳聚糖溶液和0.08?0.12mg/mL的核酸溶液，再将壳聚糖溶液与核酸溶液分别加热到50?55°C，再将壳聚糖溶液与核酸溶液混合，在漩涡振荡器上在2400?2600rpm的转速下振荡混匀25?40s，然后室温静置30?60min，得到含有壳聚糖-核酸纳米微囊的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液。作为优选，控制得到的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液中壳聚糖与核酸的质量比为1.8?2.2:1。优选地，壳聚糖与核酸的质量比为2:1，使得形成的壳聚糖-核酸纳米微囊大小均一，其粒径绝大多数分布在20?25nm的纳米级别，更易于细胞吸附，有助于提高转染效率。
[0030]其中，壳聚糖作为天然生物材料，除了具有抗菌消炎作用外，还可包裹核酸形成壳聚糖-核酸纳米微囊，核酸通过壳聚糖的包裹能偶避免核酸在转染到细胞中之前被核酸酶等降解。另外，壳聚糖-核酸纳米微囊的粒径大小适于细胞吞噬，且其表面易于与细胞膜吸附，保证了核酸能够顺利转染到细胞中。
[0031]其中，丝素蛋白作为天然生物材料，具有较强的力学性能和较好的生物相容性。
[0032]其中，核酸可以是能携带功能基因的质粒，质粒又可以是过表达载体例如pGPU6/GFP/Neo、PEGFP-N2、pCMVp-NE0-BAN或者抑制载体例如pYrbi O-LT-1、supersilencingTMshRNA、OmicsLink? shRNA 等;此外，核酸还可以是siRNA或反义寡核苷酸片段等。
[0033]其中，作为优选，壳聚糖的分子量范围为50KDa_190KDa，脱乙酰度为75?85%。
[0034]S2配置丝素蛋白溶液
[0035]具体地，将丝素蛋白溶于甲酸或三氟乙酸溶液中，搅拌混匀，使丝素蛋白彻底溶解，得到质量百分数为18?22%的丝素蛋白溶液。优选地，丝素蛋白溶液的质量百分数为20%
[0036]S3制备纺丝溶液
[0037]具体地，将壳聚糖-核酸纳米微囊溶液与丝素蛋白溶液按体积比为0.1?0.12:1的比例均匀混合，优选地，按体积比0.1:1的比例均匀混合，得到纺丝溶液。
[0038]S4制备丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0039]采用纺丝工艺对纺丝溶液进行纺丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，优选地，采用静电纺丝技术制备丝素蛋白-纳米纤维丝。
[0040]优选地，采用高压静电纺丝技术对纺丝溶液进行纺丝。具体地，将纺丝溶液注射加入到高压静电纺丝装置中进行纺丝，调节纺丝装置的电压为8?16KV、注射速度4?12μ!7min、接收距离10?16cm，得到丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，再将丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联即交叉堆叠形成具有三维立体结构的丝素蛋白-壳聚糖-核酸三维纳米纤维支架。
[0041]采用高压静电纺丝技术制备的丝素蛋白-壳聚糖-核酸三维纳米纤维支架支架具有极高的比表面积、高孔隙率和良好的连通性，非常有利于细胞的粘附、迀移和增殖。
[0042]S5灭菌、交联加固处理
[0043]优选地，将丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架置于高压灭菌容器中，于121°C下，湿热灭菌15?20min。通过湿热灭菌后，使得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架处于无菌状态，又使得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架上的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝发生交联固定加强的效果，增强丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架的机械性能以及力学支撑性。
[0044]S6胶原包被
[0045]优选地，将丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架浸泡在胶原溶液中培养包被，制得胶原包覆层包覆的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0046]优选地，将壳聚糖-核酸纳米纤维支架浸泡在0.8?1.2mg/mL的胶原溶液中，于36?38°C条件下浸泡至少12小时以上。
[0047]胶原为组织细胞外基质的最主要成分，生物相容性高，非常易于细胞的黏附生长，同时很容易降解。在丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架的孔隙内填充胶原以及丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架上进行胶原包覆更易于细胞最初的黏附生长，并且随着胶原的降解，细胞可以爬入该支架孔隙内部，接受壳聚糖-纳米微囊的携带的核酸的功能调控，利于细胞进行修复。
[0048]当然，可根据三维纳米纤维组织工程支架的具体使用的受体类别选择相适应胶原进行包被，使得三维纳米纤维组织工程支架与受体的相容性更高。若在小鼠体上使用，则用小鼠来源的胶原进行培养包被，例如小鼠尾胶原;若猪体上使用，则用猪体来源的胶原;在人体上使用，则用人体来源的胶原。
[0049]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0050]实施例1
[0051 ]首先，制备壳聚糖-核酸纳米微囊
[0052]将壳聚糖和核酸分别溶于pH为5.5的50mM乙酸钠缓冲溶液中，本实施例中，所用核酸为质粒pGHJ6/GFP/Ne0(其能够在细胞中表达绿色荧光蛋白)，当然，可根据具体的使用情况选择合适的核酸；制得0.2mg/mL的壳聚糖溶液和0.lmg/mL的pGPU6/GFP/Neo溶液;再将壳聚糖溶液与pGPU6/GFP/Neo溶液分别加热到50°C，再按1:1体积比将壳聚糖溶液与pGPU6溶液混合，在漩涡振荡器上混匀，2500rpm,30s ；然后室温静置30min，得到含有pGPU6/GFP/Neo的壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液。其中，壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液中壳聚糖与口6131]6/6??/他0的质量比为2:1。
[0053]其次，配置丝素蛋白溶液
[0054]将脱胶处理后的丝素蛋白溶于甲酸溶液中，搅拌混匀，使丝素蛋白彻底溶解，得到质量百分数为20 %的丝素蛋白溶液。其中，丝素蛋白的分子量为50Kda，脱乙酰度为80 %。
[0055]然后，制备纺丝溶液。
[0056]将壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液与丝素蛋白溶液按体积比为0.1:1的比例混合。本实施例中，将10yL壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液与ImL的丝素蛋白溶液混合，在磁力搅拌器上混勾，500rpm、30min，得到纺丝溶液。
[0057]接着，制备丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0058]将纺丝溶液注射加入到静电纺丝装置中进行纺丝，调节纺丝装置的电压为12KV、注射速度8yL/min、接收距离1cm，得到丝素蛋白_壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维丝，丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维丝自身交联，形成具有三维立体结构的丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架。
[0059]然后，然后进行灭菌交联加固处理，将丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架置于高压灭菌容器中，于121°C下，湿热灭菌20min，在灭菌的同时，也就对丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架进行了交联加固处理。
[0060]接着，胶原包被，以增强丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架的生物相容性。
[0061 ] 将丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架浸泡在lmg/mL的小鼠尾胶原中培养包被，于37°C条件下浸泡培养12小时，得到具有胶原包覆层以及胶原填充的丝素蛋白-壳聚糖核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架，即成型的具有更高生物相容性的三维纳米纤维组织工程支架。
[0062]对经上述制备方法制备的壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊和三维纳米纤维组织工程支架的进行各项性能检测，具体实验过程如下。
[0063](1)对壳聚糖-核酸(?6?1]6/6??/他0)纳米微囊的形态检测
[0064]取壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊，在原子力显微镜检测壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊的形态。结果如图1所示。
[0065]由图1可知，壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊的粒径均在65nm之内，颗粒大小均匀。
[0066](2)对壳聚糖-pGPU6/GFP/Neo纳米微囊的凝胶电泳阻滞实验
[0067]取Icm2大小的三维纳米纤维组织工程支架和6yL壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液进行凝胶电泳阻滞实验，用IyL DNA Marker和IyL纯质粒pGPU6/GFP/Neo作参照，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，时间35min，经凝胶成像系统拍摄。结果如图2所不O
[0068]由图2可知，由于壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊掩盖了 pGPU6/GFP/Neo本身所带的负电荷，使其无法在电泳中从负极向正极移动而被阻滞于上样孔中。同样地，三维纳米纤维组织工程支架，其包裹的pGPU6/GFP/Neo也没有游离出壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊，完全被阻滞于上样孔中。由此表明壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊在三维纳米纤维组织工程支架中的结构完整。
[0069](3)对三维纳米纤维组织工程支架的显微形态检测
[0070]将三维纳米纤维组织工程支架进行喷金处理后，在扫描电镜(日立公司S-3700N，SEM)下观察其纤维形貌。结果如图3所示。
[0071]由图3可知，三维纳米纤维组织工程支架的三维立体结构完整，具有较高的孔隙率以及纤维形态较好，且孔间有胶原填充。
[0072](4)对三维纳米纤维组织工程支架的体外转染细胞能力检测
[0073]三维纳米纤维组织工程支架介导pGPU6/GFP/Neo转染大鼠骨髓间质干细胞(bMSCs)，检测pGPU6/GFP/Neo在bMSCs中的表达情况。
[0074]大鼠骨髓间质干细胞传代细胞培养
[0075]取出液氮中冻存的细胞，在37°C的温水中解冻，将细胞悬液移入15mL离心管中，加5mL DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2mL DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞 悬液加入培养皿中，补加6mL DMEM完全培养液，将培养皿置于5 % CO2、37°C培养箱中培养，培养3天后用于转染。
[0076]细胞转染
[0077]在24孔培养板上，按Lipofectamine 2000说明书进行操作，以利用Lipofectamine2000介导pGPU6/GFP/Neo转染到bMSCs作为对照组，每孔pGPU6/GFP/Neo加入量lyg、Lipofectamine 2000加入量IyL，设3个平行孔。将实施例的三维纳米纤维组织工程支架置入孔中，利用三维纳米纤维组织工程支架介导pGPU6/GFP/Neo转染到bMSCs作为实验组，每孔置入表面覆盖有三维纳米纤维组织工程支架的载玻片，三维纳米纤维组织工程支架的厚度为0.3mm左右，设3个平行孔。将传代培养的bMSCs胰酶消化，离心，计数，按每孔细胞数为IXlO5个接种到对照组和实验组的培养孔中，振荡数秒后，将24孔培养板放入5%CO2、37°C培养箱中培养，24h后每天观察，用倒置荧光显微镜检测核酸即pGPU6/GFP/Neo在细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。根据细胞生长情况和时间，适量补加含10%胎牛血清的完全培养基。结果如图4所不。
[0078]由图4可知，生长在三维纳米纤维组织工程支架的实验组bMSCs在28天内都可稳定、持续性表达绿色焚光蛋白(如图4中的Al、42、六3和六4所示。)，而利用Lipofectamine2000介导转染的对照组bMSCs的绿色焚光蛋白表达在7天后消弱，14天后消失(如图4中的B1、B2、B3和B4所示)。由此表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架能够随着自身的缓慢降解而逐步释放携带pGHJ6/GFP/Ne0的壳聚糖纳米微囊，其介导pGPU6/GFP/Neo与细胞膜结合，使其转入胞内表达绿色荧光蛋白质，其在细胞内的表达时间更长，也就表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架能够随着自身的缓慢降解而逐步释放携带的核酸的壳聚糖-核酸纳米微囊，介导核酸在受体细胞中长时程的发挥功能。
[0079](5)三维纳米纤维组织工程支架的细胞毒性检测
[0080]将本实施例制备的三维纳米纤维组织工程支架放入24孔培养板中作为实验组，以TCP处理的玻片爬片作为对照组(TCP)。将传代培养的兔骨髓间质干细胞胰酶消化，离心，计数，按每孔细胞数约为IXlO5个接种到实验组和对照组的培养孔中，振荡数秒后，将24孔培养板放入5 % C02，37°C培养箱中培养。然后分别于Id、3d、5d、7d天对实验组和对照组取样，每个时间点取3个样，通过四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖情况。将培养到相应时间的24孔培养板移至超净工作台内，弃去旧培养液，用预热的PBS溶液冲洗3次，每孔加入空白培养基360μ1，随后加入40μ1 MTT，培养4小时，紫色沉淀产生，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入400μ1甲臜(Formazan)溶解液，避光振荡1min使结晶物充分溶解。吸取溶液加入96孔培养板中，每孔ΙΟΟμΙ，在570波长下用酶标仪测定各孔的OD值，细胞毒性小，细胞增殖越多越快，则OD值越高;细胞毒性越大，则OD值越低。每组设3复孔，并重复实验3次。结果如图5所不O
[0081 ]由图5可知，在Id、3d、5d时，实验组的细胞密度均低于对照组，但实验组的细胞增殖速率高于对照组，在7d时，实验组的细胞增值率与对照组已无明显差异。由此表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架对细胞的毒性非常小，细胞在三维纳米纤维组织工程支架上能够稳定增殖。
[0082]综上所述，本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架制备方法能够制得三维纳米纤维组织工程支架，且制得的三维纳米纤维组织工程支架具有以下优点:(I)三维纳米纤维组织工程支架(以下简称支架)具有较高的孔隙率以及比表面积，由于采用丝素蛋白来作为支架的材料以及在支架表层和孔隙具有胶原，其具有较高的生物相容性以及机械性能，非常有利于细胞粘附和迀移，为细胞提供了良好的生长微环境，非常适用于肌腱和韧带等组织的再生修复，再配合其所携带的具有功能的核酸，调控细胞或受损组织细胞中相关基因的表达，确保了其治愈效果更明显。(2)相对于现有的口服或注射给药的基因治疗方式，使用该支架治疗时，可将该支架直接放置于受损组织部位，其更具有靶向性，避免了药物全身弥漫性的毒副作用。(3)此外，在该支架降解的过程中，其能够缓慢地释放出所包被的功能性的核酸。因此，核酸随着支架的降解而持续不断地从支架中转染进入到细胞或周围受损组织细胞中，这样使得核酸能够在受损组织中发挥功能的时间更具有持续性，时间更长，其克服了现有基因治疗技术中在非病毒载体在细胞中表达瞬时性的缺点和病毒载体的潜在致癌风险。
[0083]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。2.根据权利要求1所述的三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，所述壳聚糖-核酸纳米微囊中的核酸为质粒、siRNA或反义寡核苷酸片段，所述壳聚糖-核酸纳米微囊中的所述壳聚糖的分子量范围为50KDa?190KDa，脱乙酰度为75?85%。3.根据权利要求1所述的三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，还包括胶原包覆层，所述胶原包覆层包覆所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。4.一种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，其包括: 制备壳聚糖-核酸纳米微囊； 配置丝素蛋白溶液； 将所述壳聚糖-核酸纳米微囊加入到所述丝素蛋白溶液中形成纺丝溶液； 采用纺丝工艺对所述纺丝溶液进行纺丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝； 交联所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。5.根据权利要求4所述的用作基因载体的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，配置所述丝素蛋白溶液包括:将丝素蛋白溶于甲酸或三氟乙酸溶液中，得到所述丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液的质量百分数为18?22%。6.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，制备所述壳聚糖-核酸纳米微囊包括:先将壳聚糖和核酸分别溶于乙酸钠缓冲溶液中，制得壳聚糖溶液和核酸溶液，再将所述壳聚糖溶液与所述核酸溶液分别加热并混合，得到含有所述壳聚糖-核酸纳米微囊的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液，所述壳聚糖-核酸纳米微囊溶液中所述壳聚糖与所述核酸的质量比为1.8?2.2:1。7.根据权利要求6所述的三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，将所述壳聚糖-核酸纳米微囊溶液与丝素蛋白溶液按体积比为0.1?0.12:1的比例混合，得到所述纺丝溶液。8.根据权利要求6所述的纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述核酸为质粒、siRNA或反义寡核苷酸片段，所述壳聚糖的分子量范围为50KDa-190KDa，脱乙酰度为75?85%。9.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，对所述纺丝溶液进行纺丝包括:将所述纺丝溶液注射加入到静电纺丝装置进行纺丝，调节所述纺丝装置的电压为8?16KV、注射速度4?12yL/min、接收距离10?16cm，得到所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝。10.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，还包括将所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架浸泡在胶原溶液中培养包被，制得具有胶原包覆层包覆的所述丝素蛋白-壳聚糖核酸-纳米纤维支架。
【专利摘要】本发明公开了一种三维纳米纤维组织工程支架，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带核酸的壳聚糖-核酸纳米微囊，壳聚糖-核酸纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。此外，本发明还公开了此三维纳米纤维组织工程支架的制备方法。
【IPC分类】A61K47/48, D04H1/728, D01F1/10, D01F4/00, D01D5/00, A61K48/00
【公开号】CN105497913
【申请号】CN201610094210
【发明人】银国利, 花扣珍, 傅晓斌, 蒋锦琴, 刘丹丹, 张琦
【申请人】浙江医学高等专科学校
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月19日
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种三维纳米纤维组织工程支架及制备方法。
【背景技术】
[0002]基因治疗是一种通过载体将目的基因传递到靶细胞内进行适度表达或干扰以治疗疾病为目的的生物医学治疗方法。基因治疗三个基本要素组成:目的基因、基因运送载体及靶细胞。其中如何获得高效、无毒、可生物降解的基因运送载体，成为当前基因治疗领域的技术瓶颈。
[0003]目前应用于基因治疗的载体可分为病毒型基因载体和非病毒型基因载体两大类。病毒载体(如各种逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等)在体内有较尚的转染效率，但存在着对外源基因的容纳量少(约4.5-30kbp)、稳定性差、勒向特异性差以及潜在的毒性和致癌性等缺点。非病毒载体包括脂质体和阳离子复合物，其优点是安全性好，基因装载容量大，但存在着转染效率低、靶向性差、有效表达时间短，容易被血液中的成分清除等缺点。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种三维纳米纤维组织工程支架，此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。
[0005]本发明的另一目的在于提供一种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，以得到可用于基因治疗的三维纳米纤维组织工程支架，此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。
[0006]本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0007]—种三维纳米纤维组织工程支架，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。
[0008]—种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其包括:
[0009]制备壳聚糖-核酸纳米微囊；
[0010]配置丝素蛋白溶液；
[0011 ]将壳聚糖-核酸纳米微囊加入到丝素蛋白溶液中形成纺丝溶液；
[0012]采用纺丝工艺对纺丝溶液进行纺丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝；
[0013]交联丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0014]本发明提供的三维纳米纤维组织工程支架及制备方法的有益效果是:(1)由于三维纳米纤维组织工程支架的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架包被有用于基因治疗的核酸，治疗时，将三维纳米纤维组织工程支架放置于受损组织部位，改变了传统采用注射给药方式，其更具有靶向性。(2)此外，在三维纳米纤维组织工程支架降解的过程中，能够缓慢地自然降解并释放出携带有核酸的壳聚糖纳米微囊，壳聚糖纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，由于三维纳米纤维组织工程支架的降解过程比较缓慢，因此，核酸能够缓慢地且持续不断地从壳聚糖-核酸纳米纤维支架中转染进入到周围受损组织细胞中，这样使得核酸能够对受损组织中发挥功能的时间更具有持续性也更稳定，表现出时间可控的基因治疗效果，其克服了现有的基因载体其携带的基因在转染受损组织细胞中的表达瞬时性的缺点。(3)还有，本三维纳米纤维组织工程支架采用丝素蛋白和壳聚糖制备而成，仿生天然细胞外基质的，其具有更好地生物相容性、极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构，非常有利于细胞粘附和迀移，为细胞提供了良好的生长微环境。
【附图说明】
[0015]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0016]图1为本发明实施例的壳聚糖-核酸纳米微囊在原子力显微镜下的形态图(图中箭头指示其中一个壳聚糖-核酸纳米微囊，A、B为不同放大倍数下的形态图)；
[0017]图2为本发明实施例的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米微囊和三维纳米纤维组织工程支架的凝胶电泳检测图(ASDNA 1^4虹、8为纯质粒？6?1]6/6??/如0、(:为壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊、D为三维纳米纤维组织工程支架)；
[0018]图3为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架在扫描电镜(S3700，3.0OkV，
11.4_X3.00k)下的形态图(黑色箭头指示三维纳米纤维组织工程支架孔隙中充注的胶原；白色箭头指示包裹在三维纳米纤维组织工程支架纤维上的胶原)；
[0019]图4为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架将携带的pGPU6/GFP/Neo转染至IJ细胞后表达的绿色荧光蛋白检测图(图中A1、A2、A3和A4分别代表生长在三维纳米纤维组织工程支架上的细胞在第7天、14天、21天和28天时细胞内绿色荧光蛋白检测图；B1、B2、B3和B4分别代表使用Lipofectamine 2000转染pGPU6/GFP/Neo质粒后的细胞在第3天、7天、14天和21天时细胞内绿色荧光蛋白检测图；图中箭头指示其中一个表达绿色荧光蛋白的细胞)；
[0020]图5为本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架对细胞增殖能力影响的OD值检测图(图中表示差异显著p〈0.05)。
【具体实施方式】
[0021]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品O
[0022]下面对本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架和三维纳米纤维组织工程支架的制备方法进行具体说明。
[0023]三维纳米纤维组织工程支架其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。
[0024]其中，壳聚糖-核酸纳米微囊中的核酸可以是能携带功能基因的质粒例如pGPU6/GFP/Neo、pEGFP-N2、pCMVp-NE0-BAN、pYrb1-LT-l、supersilencing? shRNA、OmicsLink?shRNA等;此外，核酸还可以是siRNA或反义寡核苷酸片段等。
[0025]其中，壳聚糖-核酸纳米微囊中的壳聚糖(chitosan、CS)的分子量范围为50KDa?190KDa，脱乙酰度为75?85%。
[0026]作为优选，该三维纳米纤维组织工程支架包括有胶原包覆层，胶原包覆层包覆丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0027]三维纳米纤维组织工程支架的制备方法包括:
[0028]SI制备壳聚糖-核酸纳米微囊
[0029]具体地，先将壳聚糖和核酸分别溶于乙酸钠缓冲溶液中，乙酸钠溶液的pH为5.4?5.6，制得0.16?0.24mg/mL壳聚糖溶液和0.08?0.12mg/mL的核酸溶液，再将壳聚糖溶液与核酸溶液分别加热到50?55°C，再将壳聚糖溶液与核酸溶液混合，在漩涡振荡器上在2400?2600rpm的转速下振荡混匀25?40s，然后室温静置30?60min，得到含有壳聚糖-核酸纳米微囊的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液。作为优选，控制得到的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液中壳聚糖与核酸的质量比为1.8?2.2:1。优选地，壳聚糖与核酸的质量比为2:1，使得形成的壳聚糖-核酸纳米微囊大小均一，其粒径绝大多数分布在20?25nm的纳米级别，更易于细胞吸附，有助于提高转染效率。
[0030]其中，壳聚糖作为天然生物材料，除了具有抗菌消炎作用外，还可包裹核酸形成壳聚糖-核酸纳米微囊，核酸通过壳聚糖的包裹能偶避免核酸在转染到细胞中之前被核酸酶等降解。另外，壳聚糖-核酸纳米微囊的粒径大小适于细胞吞噬，且其表面易于与细胞膜吸附，保证了核酸能够顺利转染到细胞中。
[0031]其中，丝素蛋白作为天然生物材料，具有较强的力学性能和较好的生物相容性。
[0032]其中，核酸可以是能携带功能基因的质粒，质粒又可以是过表达载体例如pGPU6/GFP/Neo、PEGFP-N2、pCMVp-NE0-BAN或者抑制载体例如pYrbi O-LT-1、supersilencingTMshRNA、OmicsLink? shRNA 等;此外，核酸还可以是siRNA或反义寡核苷酸片段等。
[0033]其中，作为优选，壳聚糖的分子量范围为50KDa_190KDa，脱乙酰度为75?85%。
[0034]S2配置丝素蛋白溶液
[0035]具体地，将丝素蛋白溶于甲酸或三氟乙酸溶液中，搅拌混匀，使丝素蛋白彻底溶解，得到质量百分数为18?22%的丝素蛋白溶液。优选地，丝素蛋白溶液的质量百分数为20%
[0036]S3制备纺丝溶液
[0037]具体地，将壳聚糖-核酸纳米微囊溶液与丝素蛋白溶液按体积比为0.1?0.12:1的比例均匀混合，优选地，按体积比0.1:1的比例均匀混合，得到纺丝溶液。
[0038]S4制备丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0039]采用纺丝工艺对纺丝溶液进行纺丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，优选地，采用静电纺丝技术制备丝素蛋白-纳米纤维丝。
[0040]优选地，采用高压静电纺丝技术对纺丝溶液进行纺丝。具体地，将纺丝溶液注射加入到高压静电纺丝装置中进行纺丝，调节纺丝装置的电压为8?16KV、注射速度4?12μ!7min、接收距离10?16cm，得到丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，再将丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联即交叉堆叠形成具有三维立体结构的丝素蛋白-壳聚糖-核酸三维纳米纤维支架。
[0041]采用高压静电纺丝技术制备的丝素蛋白-壳聚糖-核酸三维纳米纤维支架支架具有极高的比表面积、高孔隙率和良好的连通性，非常有利于细胞的粘附、迀移和增殖。
[0042]S5灭菌、交联加固处理
[0043]优选地，将丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架置于高压灭菌容器中，于121°C下，湿热灭菌15?20min。通过湿热灭菌后，使得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架处于无菌状态，又使得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架上的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝发生交联固定加强的效果，增强丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架的机械性能以及力学支撑性。
[0044]S6胶原包被
[0045]优选地，将丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架浸泡在胶原溶液中培养包被，制得胶原包覆层包覆的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0046]优选地，将壳聚糖-核酸纳米纤维支架浸泡在0.8?1.2mg/mL的胶原溶液中，于36?38°C条件下浸泡至少12小时以上。
[0047]胶原为组织细胞外基质的最主要成分，生物相容性高，非常易于细胞的黏附生长，同时很容易降解。在丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架的孔隙内填充胶原以及丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架上进行胶原包覆更易于细胞最初的黏附生长，并且随着胶原的降解，细胞可以爬入该支架孔隙内部，接受壳聚糖-纳米微囊的携带的核酸的功能调控，利于细胞进行修复。
[0048]当然，可根据三维纳米纤维组织工程支架的具体使用的受体类别选择相适应胶原进行包被，使得三维纳米纤维组织工程支架与受体的相容性更高。若在小鼠体上使用，则用小鼠来源的胶原进行培养包被，例如小鼠尾胶原;若猪体上使用，则用猪体来源的胶原;在人体上使用，则用人体来源的胶原。
[0049]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0050]实施例1
[0051 ]首先，制备壳聚糖-核酸纳米微囊
[0052]将壳聚糖和核酸分别溶于pH为5.5的50mM乙酸钠缓冲溶液中，本实施例中，所用核酸为质粒pGHJ6/GFP/Ne0(其能够在细胞中表达绿色荧光蛋白)，当然，可根据具体的使用情况选择合适的核酸；制得0.2mg/mL的壳聚糖溶液和0.lmg/mL的pGPU6/GFP/Neo溶液;再将壳聚糖溶液与pGPU6/GFP/Neo溶液分别加热到50°C，再按1:1体积比将壳聚糖溶液与pGPU6溶液混合，在漩涡振荡器上混匀，2500rpm,30s ；然后室温静置30min，得到含有pGPU6/GFP/Neo的壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液。其中，壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液中壳聚糖与口6131]6/6??/他0的质量比为2:1。
[0053]其次，配置丝素蛋白溶液
[0054]将脱胶处理后的丝素蛋白溶于甲酸溶液中，搅拌混匀，使丝素蛋白彻底溶解，得到质量百分数为20 %的丝素蛋白溶液。其中，丝素蛋白的分子量为50Kda，脱乙酰度为80 %。
[0055]然后，制备纺丝溶液。
[0056]将壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液与丝素蛋白溶液按体积比为0.1:1的比例混合。本实施例中，将10yL壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液与ImL的丝素蛋白溶液混合，在磁力搅拌器上混勾，500rpm、30min，得到纺丝溶液。
[0057]接着，制备丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。
[0058]将纺丝溶液注射加入到静电纺丝装置中进行纺丝，调节纺丝装置的电压为12KV、注射速度8yL/min、接收距离1cm，得到丝素蛋白_壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维丝，丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维丝自身交联，形成具有三维立体结构的丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架。
[0059]然后，然后进行灭菌交联加固处理，将丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架置于高压灭菌容器中，于121°C下，湿热灭菌20min，在灭菌的同时，也就对丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架进行了交联加固处理。
[0060]接着，胶原包被，以增强丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架的生物相容性。
[0061 ] 将丝素蛋白-壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架浸泡在lmg/mL的小鼠尾胶原中培养包被，于37°C条件下浸泡培养12小时，得到具有胶原包覆层以及胶原填充的丝素蛋白-壳聚糖核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米纤维支架，即成型的具有更高生物相容性的三维纳米纤维组织工程支架。
[0062]对经上述制备方法制备的壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊和三维纳米纤维组织工程支架的进行各项性能检测，具体实验过程如下。
[0063](1)对壳聚糖-核酸(?6?1]6/6??/他0)纳米微囊的形态检测
[0064]取壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊，在原子力显微镜检测壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊的形态。结果如图1所示。
[0065]由图1可知，壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊的粒径均在65nm之内，颗粒大小均匀。
[0066](2)对壳聚糖-pGPU6/GFP/Neo纳米微囊的凝胶电泳阻滞实验
[0067]取Icm2大小的三维纳米纤维组织工程支架和6yL壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊溶液进行凝胶电泳阻滞实验，用IyL DNA Marker和IyL纯质粒pGPU6/GFP/Neo作参照，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压80V，时间35min，经凝胶成像系统拍摄。结果如图2所不O
[0068]由图2可知，由于壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊掩盖了 pGPU6/GFP/Neo本身所带的负电荷，使其无法在电泳中从负极向正极移动而被阻滞于上样孔中。同样地，三维纳米纤维组织工程支架，其包裹的pGPU6/GFP/Neo也没有游离出壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊，完全被阻滞于上样孔中。由此表明壳聚糖-核酸(pGPU6/GFP/Neo)纳米微囊在三维纳米纤维组织工程支架中的结构完整。
[0069](3)对三维纳米纤维组织工程支架的显微形态检测
[0070]将三维纳米纤维组织工程支架进行喷金处理后，在扫描电镜(日立公司S-3700N，SEM)下观察其纤维形貌。结果如图3所示。
[0071]由图3可知，三维纳米纤维组织工程支架的三维立体结构完整，具有较高的孔隙率以及纤维形态较好，且孔间有胶原填充。
[0072](4)对三维纳米纤维组织工程支架的体外转染细胞能力检测
[0073]三维纳米纤维组织工程支架介导pGPU6/GFP/Neo转染大鼠骨髓间质干细胞(bMSCs)，检测pGPU6/GFP/Neo在bMSCs中的表达情况。
[0074]大鼠骨髓间质干细胞传代细胞培养
[0075]取出液氮中冻存的细胞，在37°C的温水中解冻，将细胞悬液移入15mL离心管中，加5mL DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，置于离心机中，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入2mL DMEM完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞 悬液加入培养皿中，补加6mL DMEM完全培养液，将培养皿置于5 % CO2、37°C培养箱中培养，培养3天后用于转染。
[0076]细胞转染
[0077]在24孔培养板上，按Lipofectamine 2000说明书进行操作，以利用Lipofectamine2000介导pGPU6/GFP/Neo转染到bMSCs作为对照组，每孔pGPU6/GFP/Neo加入量lyg、Lipofectamine 2000加入量IyL，设3个平行孔。将实施例的三维纳米纤维组织工程支架置入孔中，利用三维纳米纤维组织工程支架介导pGPU6/GFP/Neo转染到bMSCs作为实验组，每孔置入表面覆盖有三维纳米纤维组织工程支架的载玻片，三维纳米纤维组织工程支架的厚度为0.3mm左右，设3个平行孔。将传代培养的bMSCs胰酶消化，离心，计数，按每孔细胞数为IXlO5个接种到对照组和实验组的培养孔中，振荡数秒后，将24孔培养板放入5%CO2、37°C培养箱中培养，24h后每天观察，用倒置荧光显微镜检测核酸即pGPU6/GFP/Neo在细胞中绿色荧光蛋白的表达情况。根据细胞生长情况和时间，适量补加含10%胎牛血清的完全培养基。结果如图4所不。
[0078]由图4可知，生长在三维纳米纤维组织工程支架的实验组bMSCs在28天内都可稳定、持续性表达绿色焚光蛋白(如图4中的Al、42、六3和六4所示。)，而利用Lipofectamine2000介导转染的对照组bMSCs的绿色焚光蛋白表达在7天后消弱，14天后消失(如图4中的B1、B2、B3和B4所示)。由此表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架能够随着自身的缓慢降解而逐步释放携带pGHJ6/GFP/Ne0的壳聚糖纳米微囊，其介导pGPU6/GFP/Neo与细胞膜结合，使其转入胞内表达绿色荧光蛋白质，其在细胞内的表达时间更长，也就表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架能够随着自身的缓慢降解而逐步释放携带的核酸的壳聚糖-核酸纳米微囊，介导核酸在受体细胞中长时程的发挥功能。
[0079](5)三维纳米纤维组织工程支架的细胞毒性检测
[0080]将本实施例制备的三维纳米纤维组织工程支架放入24孔培养板中作为实验组，以TCP处理的玻片爬片作为对照组(TCP)。将传代培养的兔骨髓间质干细胞胰酶消化，离心，计数，按每孔细胞数约为IXlO5个接种到实验组和对照组的培养孔中，振荡数秒后，将24孔培养板放入5 % C02，37°C培养箱中培养。然后分别于Id、3d、5d、7d天对实验组和对照组取样，每个时间点取3个样，通过四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖情况。将培养到相应时间的24孔培养板移至超净工作台内，弃去旧培养液，用预热的PBS溶液冲洗3次，每孔加入空白培养基360μ1，随后加入40μ1 MTT，培养4小时，紫色沉淀产生，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入400μ1甲臜(Formazan)溶解液，避光振荡1min使结晶物充分溶解。吸取溶液加入96孔培养板中，每孔ΙΟΟμΙ，在570波长下用酶标仪测定各孔的OD值，细胞毒性小，细胞增殖越多越快，则OD值越高;细胞毒性越大，则OD值越低。每组设3复孔，并重复实验3次。结果如图5所不O
[0081 ]由图5可知，在Id、3d、5d时，实验组的细胞密度均低于对照组，但实验组的细胞增殖速率高于对照组，在7d时，实验组的细胞增值率与对照组已无明显差异。由此表明，本实施例的三维纳米纤维组织工程支架对细胞的毒性非常小，细胞在三维纳米纤维组织工程支架上能够稳定增殖。
[0082]综上所述，本发明实施例的三维纳米纤维组织工程支架制备方法能够制得三维纳米纤维组织工程支架，且制得的三维纳米纤维组织工程支架具有以下优点:(I)三维纳米纤维组织工程支架(以下简称支架)具有较高的孔隙率以及比表面积，由于采用丝素蛋白来作为支架的材料以及在支架表层和孔隙具有胶原，其具有较高的生物相容性以及机械性能，非常有利于细胞粘附和迀移，为细胞提供了良好的生长微环境，非常适用于肌腱和韧带等组织的再生修复，再配合其所携带的具有功能的核酸，调控细胞或受损组织细胞中相关基因的表达，确保了其治愈效果更明显。(2)相对于现有的口服或注射给药的基因治疗方式，使用该支架治疗时，可将该支架直接放置于受损组织部位，其更具有靶向性，避免了药物全身弥漫性的毒副作用。(3)此外，在该支架降解的过程中，其能够缓慢地释放出所包被的功能性的核酸。因此，核酸随着支架的降解而持续不断地从支架中转染进入到细胞或周围受损组织细胞中，这样使得核酸能够在受损组织中发挥功能的时间更具有持续性，时间更长，其克服了现有基因治疗技术中在非病毒载体在细胞中表达瞬时性的缺点和病毒载体的潜在致癌风险。
[0083]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。2.根据权利要求1所述的三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，所述壳聚糖-核酸纳米微囊中的核酸为质粒、siRNA或反义寡核苷酸片段，所述壳聚糖-核酸纳米微囊中的所述壳聚糖的分子量范围为50KDa?190KDa，脱乙酰度为75?85%。3.根据权利要求1所述的三维纳米纤维组织工程支架，其特征在于，还包括胶原包覆层，所述胶原包覆层包覆所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。4.一种三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，其包括: 制备壳聚糖-核酸纳米微囊； 配置丝素蛋白溶液； 将所述壳聚糖-核酸纳米微囊加入到所述丝素蛋白溶液中形成纺丝溶液； 采用纺丝工艺对所述纺丝溶液进行纺丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝； 交联所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝，制得丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架。5.根据权利要求4所述的用作基因载体的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，配置所述丝素蛋白溶液包括:将丝素蛋白溶于甲酸或三氟乙酸溶液中，得到所述丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液的质量百分数为18?22%。6.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，制备所述壳聚糖-核酸纳米微囊包括:先将壳聚糖和核酸分别溶于乙酸钠缓冲溶液中，制得壳聚糖溶液和核酸溶液，再将所述壳聚糖溶液与所述核酸溶液分别加热并混合，得到含有所述壳聚糖-核酸纳米微囊的壳聚糖-核酸纳米微囊溶液，所述壳聚糖-核酸纳米微囊溶液中所述壳聚糖与所述核酸的质量比为1.8?2.2:1。7.根据权利要求6所述的三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，将所述壳聚糖-核酸纳米微囊溶液与丝素蛋白溶液按体积比为0.1?0.12:1的比例混合，得到所述纺丝溶液。8.根据权利要求6所述的纳米纤维支架的制备方法，其特征在于，所述核酸为质粒、siRNA或反义寡核苷酸片段，所述壳聚糖的分子量范围为50KDa-190KDa，脱乙酰度为75?85%。9.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程支架的制备方法，其特征在于，对所述纺丝溶液进行纺丝包括:将所述纺丝溶液注射加入到静电纺丝装置进行纺丝，调节所述纺丝装置的电压为8?16KV、注射速度4?12yL/min、接收距离10?16cm，得到所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝。10.根据权利要求4所述的三维纳米纤维组织工程的制备方法，其特征在于，还包括将所述丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架浸泡在胶原溶液中培养包被，制得具有胶原包覆层包覆的所述丝素蛋白-壳聚糖核酸-纳米纤维支架。
【专利摘要】本发明公开了一种三维纳米纤维组织工程支架，其包括丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架，该丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维支架由含有壳聚糖-核酸纳米微囊和丝素蛋白的纺丝溶液经纺丝工艺制成的丝素蛋白-壳聚糖-核酸纳米纤维丝交联制成。此三维纳米纤维组织工程支架不仅能够为细胞提供良好的类似于细胞外基质的生长微环境和足够的力学支撑，而且能够缓慢地自然降解并释放出携带核酸的壳聚糖-核酸纳米微囊，壳聚糖-核酸纳米微囊又可以将其携带的核酸导入到细胞中，发挥局部靶向、时间可控的基因治疗作用。此外，本发明还公开了此三维纳米纤维组织工程支架的制备方法。
【IPC分类】A61K47/48, D04H1/728, D01F1/10, D01F4/00, D01D5/00, A61K48/00
【公开号】CN105497913
【申请号】CN201610094210
【发明人】银国利, 花扣珍, 傅晓斌, 蒋锦琴, 刘丹丹, 张琦
【申请人】浙江医学高等专科学校
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年2月19日
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