miR-223-3p或miR-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用
miR-223-3p或miR-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用
【专利说明】m i R-223-3p或m i R-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药工程及痛风疾病治疗技术领域，尤其涉及一种内源性非编码小RNA模拟物的新用途，具体涉及miR-223-3p和miR-885-5p模拟物及其用途，具体为制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用。
【背景技术】
[0002]痛风是嘌呤代谢障碍、血尿酸升高引起的单钠尿酸盐结晶在关节或组织内沉积所致的痛风性关节炎和慢性痛风石等疾病，与高尿酸血症直接相关。痛风不仅能够引起关节肿胀及组织损伤，而且可增加心脑血管、肾脏等疾病风险。HUA也与多种疾病存在密切关系，如房颤等。急性痛风性关节炎是痛风的主要临床表现，也是原发性痛风的常见首发症状。流行病学研究显示全球痛风的患病率正在逐年增加，目前在1%_2%左右。
[0003]急性痛风性关节炎作为痛风发病的一个重要阶段，也是一个重要的治疗阶段，如果能够及时控制其发作症状，减少发作次数，不但可以减轻患者的痛苦，而且能够有效延缓疾病的进程;但目前对于急性痛风性关节炎尚缺乏有效治疗。目前，临床上治疗急性痛风性关节炎的常用药物仍是秋水仙碱、非留体类抗炎药及糖皮质激素等。但上述药物不能明显缓解病情和减轻患者的痛苦，而且长期应用不良反应明显。最近研发的靶向药物IL-Ιβ拮抗剂(如Canakinumab、Anakinra等)虽较传统药物有较好效果，但其副作用亦明显增多。因此，寻找一种安全、有效的急性痛风性关节炎治疗药物，是当今医学界亟待解决的问题。
[0004]在急性痛风性关节炎发病机制中，NLRP3炎性体和趋化因子有重要作用;前者激活后可导致IL-Ιβ的释放，而趋化因子可以趋化更多中性粒细胞及单核巨噬细胞到病灶部位引发炎症级联放大反应。见1^3炎症体是由11^3(1111(31601^(16-13；[11(1;[1^ oligomerizat1ndomain(NOD)-1ike receptor containing pyrin domain 3)、ASC(apoptosis-associatedspeck-like protein containing CARD)和procaspase-1 组成的蛋白复合物，参与多种炎症性疾病的发病过程。趋化因子是一类可诱导的、分泌型的前炎症细胞因子，对白细胞及淋巴细胞起特异性趋化吸引作用。趋化因子受体通过与相应配体结合对多种炎症细胞进行趋化和激活，引起一系列生物学效应。目前研究已发现了许多趋化因子参与了急性痛风性关节炎的发病过程，其中CCL2(Chemokine ligand 2)，亦称为单核细胞趋化蛋白I (Monocytechemotactic protein-1，MCP_1)，是痛风性关节炎中研究最多的一种趋化因子，其在急性痛风性关节炎中的作用已被广泛认可。
[0005]MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的RNA，长约18-25nt，高度保守，主要通过与特SmRNA 3 ’ -UTR结合在转录后水平调节靶基因的表达，从而参与细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。目如已发现有5000多种mi RNAs，而且编码表达蛋白的基因中60%以上是受各种miRNAs调控的。miRNAs在很多疾病中有重要作用，例如肿瘤、炎症性疾病等。miRNAs具有高度的保守性和表达的时空特异性，不同的疾病会有不同的mi RNAs特异性表达谱。机体内组织、器官的代谢异常或器质性病变可能导致特定疾病状态下某些血清miRNAs表达水平特异性地升高或降低。虽然miRNAs是当前学术界的研究热点，其在炎症性疾病中的关键调控作用也已被很多研究证实，但目前有关miRNAs在痛风发病机制中作用的研究甚少，也没有研究对miRNAs在痛风治疗中的作用进行研究分析。在miRNAs层面调控关键因子(如NLRP3和趋化因子等)的表达，缓解炎症反应，极有可能为治疗急性痛风性关节炎提供一种新思路和新方法。目前国内外文献及专利数据库均无用miRNA抑制物或模拟物治疗急性痛风性关节炎的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种有效治疗急性痛风性关节炎的新药物，该组合药物以miR-223-3p和miR-885-5p模拟物为核心原料，具有治疗痛风的作用，可抑制关键炎症因子表达，抑制关节液及血清中IL-Ιβ等炎症因子的分泌，从而达到治疗急性痛风性关节炎的效果。
[0007]为了实现上述目的，本发明涉及的药物以miR-223-3p和miR-885-5p模拟物二者中的一种为核心原料，以海藻酸钠纳米级微囊为载体。
[0008]本发明采用如下技术方案:
[0009]本发明的miR-223-3p或miR-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用。
[0010]所述的miR-223-3p模拟物的核苷酸序列为:5，-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3，。
[0011 ]所述的miR-885-5p模拟物的核苷酸序列为:5，-UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3，。
[0012]制备该药物的过程如下:
[0013]首先采用常规的公知工艺方法合成miR-223-3p和miR-885-5p模拟物；
[0014]然后采用常规的公知工艺方法合成海藻酸钠纳米级微囊，将上述miR-223_3p或miR-885-5p模拟物二者中的一种合成到海藻酸钠纳米级微囊中；
[0015]最后采用常规的公知工艺方法将上述miR纳米微囊物进一步制成稳定的液体制剂或粉状制剂，再加工成形即可。
[0016]本发明的积极效果如下:
[0017]本发明与现有技术相比，miR-223-3p和miR-885-5p模拟物纳米微囊具有疗效快、靶向性强、副作用少、安全性高等优点，是治疗急性痛风性关节炎的新型靶向药物，将极大的造福于社会大众。
【附图说明】
[0018]图1关节腔内注射miR-223-3p模拟物纳米微囊可明显改变滑膜细胞中miR-223-3p的表达水平的不意图(*，〈0.05versus the Control group；#,<0.05versus the Controlgroup)o
[0019]图2关节腔内注射miR-885-5p模拟物纳米微囊可明显改变滑膜细胞中miR-885-5p的表达水平的不意图(*，〈0.05versus the Control group；#,<0.05versus the Controlgroup)o
[0020]图3miR-223-3p mimic纳米微囊可有效减轻关节肿胀程度的示意图(Blankcontrol,空白对照组;miRNA inhibitor ,miRNA抑制物组;miRNA mimic ,miRNA模拟物组；Model group,痛风性关节炎模型组;Colchicine,秋水仙碱组)。
[0021 ] 图4 miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊可明显降低IL-Ιβ表达水平的示意图。
[0022]图5miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学的影响的示意图(HE染色，10 X 20倍光镜下(A，空白对照组;B ,miRNA抑制物组;C，miR-223-3p模拟物组;D，痛风性关节炎模型组;E，秋水仙碱组;F，miR-885_5p模拟物组)。
【具体实施方式】
[0023]下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0024]实施例l:miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊对急性痛风性关节炎大鼠模型的治疗作用
[0025]1.SD大鼠急性痛风性关节炎分组及造模方法
[0026]实验动物为6-8周龄，SPF级SD大鼠，体重180_220g，105只，均为雄性。使用前适应性喂养I周，自由摄食饮水，饮食、饮水、活动正常即开始实验。将105只SD雄性大鼠随机分为7组，分别为miRNA模拟物组、miRNA抑制物组、白藜芦醇组(200mg/kg,Sigma)、mmiRNA模拟物+白藜芦醇组，秋水仙碱组、空白对照组、阴性对照组，每组15只大鼠，各组大鼠在相同条件下摄水饮食。
[0027]2.药品与试剂:选用白藜芦醇(Sigma公司，HPLC法测定纯度均2 98% )，大鼠用药剂量参照人鼠体表面积转换换算公式;秋水仙碱组用秋水仙碱，用注射用水配制成10%溶液备用；首先采用常规的公知工艺方法合成miR-223-3p和miR-885-5p模拟物，具体miRNA核苷酸序 列为:miR-223-3p(5 ’ -UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3，)和miR-885_5p( 5 ’ -UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3，);然后采用常规的公知工艺方法合成海藻酸钠纳米级微囊，将上述miR-223-3p和miR-885-5p模拟物二者中的一种合成到海藻酸钠纳米级微囊中；最后采用常规的公知工艺方法将上述miR纳米微囊物进一步制成稳定的液体制剂。miRNA模拟物组和miRNA抑制物组分别用miRNA的模拟物纳米微囊针剂及抑制物纳米微囊针剂进行踝关节腔内注射。
[0028]3.尿酸钠溶液的制备:取194ml蒸馏水加6ml氢氧化钠(IN)，煮沸后加Ig尿酸，用IN盐酸调PH值至7.2，搅拌冷却，贮存于4°C冰箱中24小时，去上清液，用滤纸将沉淀物水分吸干，干燥即得尿酸钠结晶，实验前将尿酸钠结晶180°C高温干燥3小时，用体积分数95 %的乙醇洗涤，2000r/min离心15分钟3次，室温自然干燥;取250mg尿酸钠结晶加9ml生理盐水，Iml吐温80，加热搅拌，配置成1ml 25mg/ml的尿酸盐溶液备用。
[0029]4.造模方法:将105只SD大鼠正常饲养I周后，空白对照组、阴性对照组均用0.9%氯化钠注射液灌胃，白藜芦醇组和秋水仙碱组按相应的药物和剂量灌胃I日I次，5天;miRNA模拟物组和miRNA抑制物组分别用miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物的纳米微囊针剂进行踝关节腔内注射(0.05mL,浓度为5mg/ml)。5天后按McCarty DJ经典造模方法造模，造模成功后空白对照组、阴性对照组均用0.9 %氯化钠注射液灌胃继续予0.9 %氯化钠注射液灌胃泊藜芦醇组和秋水仙碱组按相应的药物和剂量灌胃I日I次，3日；miRNA模拟物组和miRNA抑制物组分别用miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊针剂进行踝关节腔内注射(0.05mL，浓度为5mg/mL)，l日I次，3日。造模方法按照McCarty DJ经典造模方法，10%水合氯醛按0.35mg/g麻醉各组大鼠，酒精消毒大鼠右侧距小腿关节，用6号注射针在受试大鼠右侧距小腿关节背侧从45°C方向插入胫骨肌腱内侧，将质量浓度为25mg/ml(0.05mL)的尿酸钠溶液注入距小腿关节腔，伸曲、旋转运动1min。
[0030]5.关节肿胀情况评估和步态分析:造模前及造模后Oh、3h、6h、12h、24h、36h、48h缚线法测取右侧距小腿关节同一部位周径(取均值)观察大鼠踝关节肿胀情况。使用AnimalWalkway动物步态分析系统对大鼠步态及肌力改变进行分析比较。
[0031 ] 6.ELI SA法测蛋白水平:灌胃前、灌胃后及造模后3h、6h、12h、24h、36h、48h小时内眦取血。用ELISA法检测大鼠血清中的C反应蛋白、IL-lf3、CCL2、TNF-a和靶基因表达水平。同时用ELI SA法测大鼠关节滑液中IL-Ιβ和靶基因表达水平。
[0032]7.大鼠踝关节滑膜组织取材:10%水合氯醛按0.5ml/100g麻醉大鼠，超净工作台，仰卧位固定，常规碘酒、酒精消毒术野;延踝关节正中纵行切开皮肤，直至暴露出以踝关节为中心约3cmX 3cm的区域，以有齿镊钝性分离肌肉、肌腱等组织，显露纤维囊;在上缘距踝关节中心0.5cm处向下纵行切开关节囊，切口约lcm，用眼科剪及有齿镊小心剥开纤维囊，纤维膜内侧面可见一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，小心剥离滑膜组织，以眼科镊轻轻夹住其游离端，用刀片切下;取得的组织部分放10%福尔马林溶液中固定，待做病理切片及组织免疫荧光化学检测，另一部分放入冻存管立即插入碎冰，4小时内转入液氮中保存，待做Western blot、免疫组化与实时荧光定量PCR检测。踝关节滑膜病理切片:造模72h后，麻醉大鼠，取右侧踝关节滑膜，置于10%中性福尔马林溶液固定，5%的硝酸脱钙，常规脱水，透明、包埋、切片和苏木素-伊红染色，光镜下观察局部病理组织学变化。
[0033]8.免疫组化、Western Blot方法检靶基因在关节滑膜组织的表达:
[0034]组织经病理证实后进行切片，免疫组化采用靶基因兔抗人单克隆抗体，SP试剂盒等。切片一抗4°C孵育过夜，次日缓冲洗涤加二抗溶液，室温孵育lh，进行底物成色反应。用PBS液代替一抗作阴性对照，比较两组标本蛋白表达差异。
[0035]冰浴中匀浆大鼠踝关节滑膜组织，提取胞质蛋白、核蛋白、膜蛋白，并以BCA法测定蛋白浓度，进行10 % SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上，室温下用5 %脱脂奶粉封闭2小时，然后与相应抗体磷酸稀醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、IkB、NF-kB p65、caveolin_l、sp3、和β-actin4°C孵育过夜；次日以TBST洗膜，与相应二抗孵育2小时，暗室中以ECL试剂显影，应用Bandscan软件分析目标蛋白与内参照GAPDH蛋白灰度值，计算相对灰度值，以相对灰度值进行组间比较。
[0036]9.实时荧光定量PCR测靶基因mRNA及miRNAs水平
[0037]通过特异性的实时荧光定量PCR方法检测关节滑膜靶基因mRNA及miRNAs表达量的变化。组织样本液氮研磨，加TRIzoI进行细胞裂解，加入氯仿震荡、离心、弃上清液，获得组织RNA，通过加尾法反转录成miRNA cDNA，反应条件为37°C 15min，85°C 5s，稀释后备用。以U6基因作为内参基因。相应miRNA及内参基因U6 snRNA检测引物由生物科技有限公司提供。使用美国Applied B1systems公司的7500 Real Time PCR System Real Time PCR扩增仪进行PCR反应，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测靶基因mRNA及miRNA的表达。
[0038]10.主要结果:
[0039]关节腔内注射miR-223-3p模拟物纳米微囊可明显改变滑膜细胞中miR-223-3p的表达水平(见附图1)。同样，关节腔内注射miR-885-5p模拟物纳米微囊可明显改变滑膜细胞中miR-885-5p的表达水平(见附图2).miR-223-3p模拟物纳米微囊和miR-885-5p模拟物纳米微囊可有效减轻关节肿胀程度(见附图3)。11^1?-223-3?模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊可明显降低IL-Ιβ表达水平(见附图4)。踝关节组织病理结果显示，关节腔内注射miR-223-3p和miR-885-5p模拟物纳米微囊可减轻急性痛风性关节炎大鼠踝关节组织的水肿和炎细胞浸润(见附图5)。
[0040]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1.miR-223-3p或miR-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的miR-223-3p模拟物的核苷酸序列为:5，-腳CA⑶U腳CAAAUACCCCA-3，。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的miR-885-5p模拟物的核苷酸序列为:5，-UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3，。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于:制备该药物的过程如下: 首先采用常规的公知工艺方法合成miR-223-3p和miR-885-5p模拟物； 然后采用常规的公知工艺方法合成海藻酸钠纳米级微囊，将上述miR-223-3pSmiR-885-5p模拟物二者中的一种合成到海藻酸钠纳米级微囊中； 最后采用常规的公知工艺方法将上述miR纳米微囊物进一步制成稳定的液体制剂或粉状制剂，再加工成形即可。
【专利摘要】本发明公开了miR-223-3p或miR-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用。所述的miR-223-3p模拟物的核苷酸序列为：5’-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3’。所述的miR-885-5p模拟物的核苷酸序列为：5’-UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3’。本发明与现有技术相比，miR-223-3p和miR-885-5p模拟物纳米微囊具有疗效快、靶向性强、副作用少、安全性高等优点，是治疗急性痛风性关节炎的新型靶向药物，将极大的造福于社会大众。
【IPC分类】A61K48/00, A61P19/02, A61P19/06
【公开号】CN105497915
【申请号】CN201510428589
【发明人】王颜刚, 侯旭, 车奎, 王斌
【申请人】青岛大学附属医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年7月21日
【专利说明】m i R-223-3p或m i R-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药工程及痛风疾病治疗技术领域，尤其涉及一种内源性非编码小RNA模拟物的新用途，具体涉及miR-223-3p和miR-885-5p模拟物及其用途，具体为制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用。
【背景技术】
[0002]痛风是嘌呤代谢障碍、血尿酸升高引起的单钠尿酸盐结晶在关节或组织内沉积所致的痛风性关节炎和慢性痛风石等疾病，与高尿酸血症直接相关。痛风不仅能够引起关节肿胀及组织损伤，而且可增加心脑血管、肾脏等疾病风险。HUA也与多种疾病存在密切关系，如房颤等。急性痛风性关节炎是痛风的主要临床表现，也是原发性痛风的常见首发症状。流行病学研究显示全球痛风的患病率正在逐年增加，目前在1%_2%左右。
[0003]急性痛风性关节炎作为痛风发病的一个重要阶段，也是一个重要的治疗阶段，如果能够及时控制其发作症状，减少发作次数，不但可以减轻患者的痛苦，而且能够有效延缓疾病的进程;但目前对于急性痛风性关节炎尚缺乏有效治疗。目前，临床上治疗急性痛风性关节炎的常用药物仍是秋水仙碱、非留体类抗炎药及糖皮质激素等。但上述药物不能明显缓解病情和减轻患者的痛苦，而且长期应用不良反应明显。最近研发的靶向药物IL-Ιβ拮抗剂(如Canakinumab、Anakinra等)虽较传统药物有较好效果，但其副作用亦明显增多。因此，寻找一种安全、有效的急性痛风性关节炎治疗药物，是当今医学界亟待解决的问题。
[0004]在急性痛风性关节炎发病机制中，NLRP3炎性体和趋化因子有重要作用;前者激活后可导致IL-Ιβ的释放，而趋化因子可以趋化更多中性粒细胞及单核巨噬细胞到病灶部位引发炎症级联放大反应。见1^3炎症体是由11^3(1111(31601^(16-13；[11(1;[1^ oligomerizat1ndomain(NOD)-1ike receptor containing pyrin domain 3)、ASC(apoptosis-associatedspeck-like protein containing CARD)和procaspase-1 组成的蛋白复合物，参与多种炎症性疾病的发病过程。趋化因子是一类可诱导的、分泌型的前炎症细胞因子，对白细胞及淋巴细胞起特异性趋化吸引作用。趋化因子受体通过与相应配体结合对多种炎症细胞进行趋化和激活，引起一系列生物学效应。目前研究已发现了许多趋化因子参与了急性痛风性关节炎的发病过程，其中CCL2(Chemokine ligand 2)，亦称为单核细胞趋化蛋白I (Monocytechemotactic protein-1，MCP_1)，是痛风性关节炎中研究最多的一种趋化因子，其在急性痛风性关节炎中的作用已被广泛认可。
[0005]MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的RNA，长约18-25nt，高度保守，主要通过与特SmRNA 3 ’ -UTR结合在转录后水平调节靶基因的表达，从而参与细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。目如已发现有5000多种mi RNAs，而且编码表达蛋白的基因中60%以上是受各种miRNAs调控的。miRNAs在很多疾病中有重要作用，例如肿瘤、炎症性疾病等。miRNAs具有高度的保守性和表达的时空特异性，不同的疾病会有不同的mi RNAs特异性表达谱。机体内组织、器官的代谢异常或器质性病变可能导致特定疾病状态下某些血清miRNAs表达水平特异性地升高或降低。虽然miRNAs是当前学术界的研究热点，其在炎症性疾病中的关键调控作用也已被很多研究证实，但目前有关miRNAs在痛风发病机制中作用的研究甚少，也没有研究对miRNAs在痛风治疗中的作用进行研究分析。在miRNAs层面调控关键因子(如NLRP3和趋化因子等)的表达，缓解炎症反应，极有可能为治疗急性痛风性关节炎提供一种新思路和新方法。目前国内外文献及专利数据库均无用miRNA抑制物或模拟物治疗急性痛风性关节炎的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种有效治疗急性痛风性关节炎的新药物，该组合药物以miR-223-3p和miR-885-5p模拟物为核心原料，具有治疗痛风的作用，可抑制关键炎症因子表达，抑制关节液及血清中IL-Ιβ等炎症因子的分泌，从而达到治疗急性痛风性关节炎的效果。
[0007]为了实现上述目的，本发明涉及的药物以miR-223-3p和miR-885-5p模拟物二者中的一种为核心原料，以海藻酸钠纳米级微囊为载体。
[0008]本发明采用如下技术方案:
[0009]本发明的miR-223-3p或miR-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用。
[0010]所述的miR-223-3p模拟物的核苷酸序列为:5，-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3，。
[0011 ]所述的miR-885-5p模拟物的核苷酸序列为:5，-UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3，。
[0012]制备该药物的过程如下:
[0013]首先采用常规的公知工艺方法合成miR-223-3p和miR-885-5p模拟物；
[0014]然后采用常规的公知工艺方法合成海藻酸钠纳米级微囊，将上述miR-223_3p或miR-885-5p模拟物二者中的一种合成到海藻酸钠纳米级微囊中；
[0015]最后采用常规的公知工艺方法将上述miR纳米微囊物进一步制成稳定的液体制剂或粉状制剂，再加工成形即可。
[0016]本发明的积极效果如下:
[0017]本发明与现有技术相比，miR-223-3p和miR-885-5p模拟物纳米微囊具有疗效快、靶向性强、副作用少、安全性高等优点，是治疗急性痛风性关节炎的新型靶向药物，将极大的造福于社会大众。
【附图说明】
[0018]图1关节腔内注射miR-223-3p模拟物纳米微囊可明显改变滑膜细胞中miR-223-3p的表达水平的不意图(*，〈0.05versus the Control group；#,<0.05versus the Controlgroup)o
[0019]图2关节腔内注射miR-885-5p模拟物纳米微囊可明显改变滑膜细胞中miR-885-5p的表达水平的不意图(*，〈0.05versus the Control group；#,<0.05versus the Controlgroup)o
[0020]图3miR-223-3p mimic纳米微囊可有效减轻关节肿胀程度的示意图(Blankcontrol,空白对照组;miRNA inhibitor ,miRNA抑制物组;miRNA mimic ,miRNA模拟物组；Model group,痛风性关节炎模型组;Colchicine,秋水仙碱组)。
[0021 ] 图4 miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊可明显降低IL-Ιβ表达水平的示意图。
[0022]图5miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊对急性痛风性关节炎大鼠滑膜组织病理学的影响的示意图(HE染色，10 X 20倍光镜下(A，空白对照组;B ,miRNA抑制物组;C，miR-223-3p模拟物组;D，痛风性关节炎模型组;E，秋水仙碱组;F，miR-885_5p模拟物组)。
【具体实施方式】
[0023]下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0024]实施例l:miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊对急性痛风性关节炎大鼠模型的治疗作用
[0025]1.SD大鼠急性痛风性关节炎分组及造模方法
[0026]实验动物为6-8周龄，SPF级SD大鼠，体重180_220g，105只，均为雄性。使用前适应性喂养I周，自由摄食饮水，饮食、饮水、活动正常即开始实验。将105只SD雄性大鼠随机分为7组，分别为miRNA模拟物组、miRNA抑制物组、白藜芦醇组(200mg/kg,Sigma)、mmiRNA模拟物+白藜芦醇组，秋水仙碱组、空白对照组、阴性对照组，每组15只大鼠，各组大鼠在相同条件下摄水饮食。
[0027]2.药品与试剂:选用白藜芦醇(Sigma公司，HPLC法测定纯度均2 98% )，大鼠用药剂量参照人鼠体表面积转换换算公式;秋水仙碱组用秋水仙碱，用注射用水配制成10%溶液备用；首先采用常规的公知工艺方法合成miR-223-3p和miR-885-5p模拟物，具体miRNA核苷酸序 列为:miR-223-3p(5 ’ -UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3，)和miR-885_5p( 5 ’ -UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3，);然后采用常规的公知工艺方法合成海藻酸钠纳米级微囊，将上述miR-223-3p和miR-885-5p模拟物二者中的一种合成到海藻酸钠纳米级微囊中；最后采用常规的公知工艺方法将上述miR纳米微囊物进一步制成稳定的液体制剂。miRNA模拟物组和miRNA抑制物组分别用miRNA的模拟物纳米微囊针剂及抑制物纳米微囊针剂进行踝关节腔内注射。
[0028]3.尿酸钠溶液的制备:取194ml蒸馏水加6ml氢氧化钠(IN)，煮沸后加Ig尿酸，用IN盐酸调PH值至7.2，搅拌冷却，贮存于4°C冰箱中24小时，去上清液，用滤纸将沉淀物水分吸干，干燥即得尿酸钠结晶，实验前将尿酸钠结晶180°C高温干燥3小时，用体积分数95 %的乙醇洗涤，2000r/min离心15分钟3次，室温自然干燥;取250mg尿酸钠结晶加9ml生理盐水，Iml吐温80，加热搅拌，配置成1ml 25mg/ml的尿酸盐溶液备用。
[0029]4.造模方法:将105只SD大鼠正常饲养I周后，空白对照组、阴性对照组均用0.9%氯化钠注射液灌胃，白藜芦醇组和秋水仙碱组按相应的药物和剂量灌胃I日I次，5天;miRNA模拟物组和miRNA抑制物组分别用miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物的纳米微囊针剂进行踝关节腔内注射(0.05mL,浓度为5mg/ml)。5天后按McCarty DJ经典造模方法造模，造模成功后空白对照组、阴性对照组均用0.9 %氯化钠注射液灌胃继续予0.9 %氯化钠注射液灌胃泊藜芦醇组和秋水仙碱组按相应的药物和剂量灌胃I日I次，3日；miRNA模拟物组和miRNA抑制物组分别用miR-223-3p模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊针剂进行踝关节腔内注射(0.05mL，浓度为5mg/mL)，l日I次，3日。造模方法按照McCarty DJ经典造模方法，10%水合氯醛按0.35mg/g麻醉各组大鼠，酒精消毒大鼠右侧距小腿关节，用6号注射针在受试大鼠右侧距小腿关节背侧从45°C方向插入胫骨肌腱内侧，将质量浓度为25mg/ml(0.05mL)的尿酸钠溶液注入距小腿关节腔，伸曲、旋转运动1min。
[0030]5.关节肿胀情况评估和步态分析:造模前及造模后Oh、3h、6h、12h、24h、36h、48h缚线法测取右侧距小腿关节同一部位周径(取均值)观察大鼠踝关节肿胀情况。使用AnimalWalkway动物步态分析系统对大鼠步态及肌力改变进行分析比较。
[0031 ] 6.ELI SA法测蛋白水平:灌胃前、灌胃后及造模后3h、6h、12h、24h、36h、48h小时内眦取血。用ELISA法检测大鼠血清中的C反应蛋白、IL-lf3、CCL2、TNF-a和靶基因表达水平。同时用ELI SA法测大鼠关节滑液中IL-Ιβ和靶基因表达水平。
[0032]7.大鼠踝关节滑膜组织取材:10%水合氯醛按0.5ml/100g麻醉大鼠，超净工作台，仰卧位固定，常规碘酒、酒精消毒术野;延踝关节正中纵行切开皮肤，直至暴露出以踝关节为中心约3cmX 3cm的区域，以有齿镊钝性分离肌肉、肌腱等组织，显露纤维囊;在上缘距踝关节中心0.5cm处向下纵行切开关节囊，切口约lcm，用眼科剪及有齿镊小心剥开纤维囊，纤维膜内侧面可见一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，小心剥离滑膜组织，以眼科镊轻轻夹住其游离端，用刀片切下;取得的组织部分放10%福尔马林溶液中固定，待做病理切片及组织免疫荧光化学检测，另一部分放入冻存管立即插入碎冰，4小时内转入液氮中保存，待做Western blot、免疫组化与实时荧光定量PCR检测。踝关节滑膜病理切片:造模72h后，麻醉大鼠，取右侧踝关节滑膜，置于10%中性福尔马林溶液固定，5%的硝酸脱钙，常规脱水，透明、包埋、切片和苏木素-伊红染色，光镜下观察局部病理组织学变化。
[0033]8.免疫组化、Western Blot方法检靶基因在关节滑膜组织的表达:
[0034]组织经病理证实后进行切片，免疫组化采用靶基因兔抗人单克隆抗体，SP试剂盒等。切片一抗4°C孵育过夜，次日缓冲洗涤加二抗溶液，室温孵育lh，进行底物成色反应。用PBS液代替一抗作阴性对照，比较两组标本蛋白表达差异。
[0035]冰浴中匀浆大鼠踝关节滑膜组织，提取胞质蛋白、核蛋白、膜蛋白，并以BCA法测定蛋白浓度，进行10 % SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜上，室温下用5 %脱脂奶粉封闭2小时，然后与相应抗体磷酸稀醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、IkB、NF-kB p65、caveolin_l、sp3、和β-actin4°C孵育过夜；次日以TBST洗膜，与相应二抗孵育2小时，暗室中以ECL试剂显影，应用Bandscan软件分析目标蛋白与内参照GAPDH蛋白灰度值，计算相对灰度值，以相对灰度值进行组间比较。
[0036]9.实时荧光定量PCR测靶基因mRNA及miRNAs水平
[0037]通过特异性的实时荧光定量PCR方法检测关节滑膜靶基因mRNA及miRNAs表达量的变化。组织样本液氮研磨，加TRIzoI进行细胞裂解，加入氯仿震荡、离心、弃上清液，获得组织RNA，通过加尾法反转录成miRNA cDNA，反应条件为37°C 15min，85°C 5s，稀释后备用。以U6基因作为内参基因。相应miRNA及内参基因U6 snRNA检测引物由生物科技有限公司提供。使用美国Applied B1systems公司的7500 Real Time PCR System Real Time PCR扩增仪进行PCR反应，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测靶基因mRNA及miRNA的表达。
[0038]10.主要结果:
[0039]关节腔内注射miR-223-3p模拟物纳米微囊可明显改变滑膜细胞中miR-223-3p的表达水平(见附图1)。同样，关节腔内注射miR-885-5p模拟物纳米微囊可明显改变滑膜细胞中miR-885-5p的表达水平(见附图2).miR-223-3p模拟物纳米微囊和miR-885-5p模拟物纳米微囊可有效减轻关节肿胀程度(见附图3)。11^1?-223-3?模拟物和miR-885-5p模拟物纳米微囊可明显降低IL-Ιβ表达水平(见附图4)。踝关节组织病理结果显示，关节腔内注射miR-223-3p和miR-885-5p模拟物纳米微囊可减轻急性痛风性关节炎大鼠踝关节组织的水肿和炎细胞浸润(见附图5)。
[0040]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1.miR-223-3p或miR-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的miR-223-3p模拟物的核苷酸序列为:5，-腳CA⑶U腳CAAAUACCCCA-3，。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的miR-885-5p模拟物的核苷酸序列为:5，-UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3，。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于:制备该药物的过程如下: 首先采用常规的公知工艺方法合成miR-223-3p和miR-885-5p模拟物； 然后采用常规的公知工艺方法合成海藻酸钠纳米级微囊，将上述miR-223-3pSmiR-885-5p模拟物二者中的一种合成到海藻酸钠纳米级微囊中； 最后采用常规的公知工艺方法将上述miR纳米微囊物进一步制成稳定的液体制剂或粉状制剂，再加工成形即可。
【专利摘要】本发明公开了miR-223-3p或miR-885-5p模拟物在制备治疗急性痛风性关节炎药物中的应用。所述的miR-223-3p模拟物的核苷酸序列为：5’-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3’。所述的miR-885-5p模拟物的核苷酸序列为：5’-UCCAUUACACUACCCUGCCUCU-3’。本发明与现有技术相比，miR-223-3p和miR-885-5p模拟物纳米微囊具有疗效快、靶向性强、副作用少、安全性高等优点，是治疗急性痛风性关节炎的新型靶向药物，将极大的造福于社会大众。
【IPC分类】A61K48/00, A61P19/02, A61P19/06
【公开号】CN105497915
【申请号】CN201510428589
【发明人】王颜刚, 侯旭, 车奎, 王斌
【申请人】青岛大学附属医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年7月21日
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