miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用
miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及miRNA-9在制备抑制肝癌转移药物中的应用，属于生物化学与分子生 物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 根据世界卫生组织2014年发布的癌症白皮书，肝癌在我国无论男性或者女性的发 病率和致死率都极高，严重地影响了人类的生存和健康。恶性肿瘤细胞与普通肿瘤细胞的 区别是前者具有转移能力，其转移能力越高，恶性程度也就越高，越难W治愈。肿瘤的转移 机制是一个复杂的网络通路，近年来，随着人们对miRNAs的研究发现，有些miRNAs参与调控 肿瘤的发生和发展过程，可W将其作为早期诊断或者早期治疗的分子祀标。
[0003] 随着糖科学的迅速发展，有关肿瘤与糖基化修饰之间的关系已经越来越多的被科 学家证实。唾液酸转移酶属于脊椎动物唾液酸转移酶家族，该家族包括a-2，3，a-2，6，a-2，8 唾液酸转移酶3个亚型。其中a-2,6唾液酸转移酶表达在机体许多种细胞的表面，可催化活 化的唾液酸Wa-2,6糖巧键的形式连接到细胞膜表面的N-乙酷乳糖胺上。唾液酸作为复合 糖的组成部分镶嵌于所有细胞表面W及大多数脊椎动物糖蛋白和糖脂分子的末端最外侧。 唾液酸介导或调制了炎症、病原感染、肿瘤发生发展等诸多病理过程，与人类疾病密切关 联与正常组织相比较发现，恶性肿瘤组织和恶性肿瘤细胞表面糖链结构发生明显变 化。其中，特征连接唾液酸表达的显著上调或下调变化与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移 和预后不良等相关，有的作为肿瘤标记物或预后标记物，也可能成为肿瘤免疫治疗的祀 占[4] O
[0004] miRNAs是真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20~25个核 巧酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，通过 碱基互补配对的方式识别祀mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解祀mRNA或者 阻遏祀mRNA的翻译。自从1993年，Lee等科学家利用遗传分析的方法在秀丽隐杆线虫中发现 了miRNA后，科学家开展了大量关于miRNA相关功能的研究。目前已有很多miRNA被鉴定参与 细胞癌变、转移等病理过程。如:miR21、miR122、miR182、miR34a、miR138、Let-7c等分别参 与乳腺癌、膀脫癌、肺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的发生和转移过哲SHW。其中，有关miRNA参 与调控糖基化修饰的研究也有相关报道。例如，let-7c通过调控甘露糖乙酷基转移酶4的合 成(该酶参与了细胞表面糖基化的修饰过程)抑制了小鼠肝癌细胞的转移W来自秀丽线虫 中的miR-79与其在哺乳动物中同源的miRNA-9通过调控细胞糖基化修饰过程，影响参与哺 乳动物神经元转移的两个祀基因 SQV-5和SQV-7的合成W。然而，关于miRNA-9在小鼠肝癌转 移中的作用机制还未有报道，包括其祀基因的研究也仅限于少数基因。
【发明内容】
[000引针对上述现有技术，本发明提供了 miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。
[0006]本发明是通过W下技术方案实现的：
[0007] 本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达忍片之上，根据忍片 结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞化epal-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞化ca-P)和高转 移能力的小鼠肝癌细胞化ca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，利用RT-qPCR验证忍片结果，找到在S种细胞中存在显著差异的miRNA-9作为研究的基础。接下来， 利用western blotting实验方法发现StGgall在S种细胞中的表达量同样存在显著差异， 并与miNRA-9在=种细胞中的表达差异吻合。为了验证Stegall是miRNA-9的祀基因之一，设 计实验构建了双巧光素酶报告基因，并将miRNA-9的模拟物:miRNA-9 mimic与报告基因共 转染至化pal-6中，通过检测，证实了Stegall为miRNA-9的祀基因。最后，将miRNA-9的模拟 物和抑制物:miRNA-9 mimic、miRNA-9 inh化itor分别转染到上述S种细胞中，发现miRNA-9的mimic可W抑制Stegall在S种细胞中的表达量。同时，miRNA-9在细胞中的过表达可W 抑制其增殖、迁移、侵袭和黏附能力。因此，miRNA-9具有抑制小鼠肿瘤细胞的转移能力，可 W应用于抑制肿瘤转移药物的开发领域。
[0008] 具体地，本发明提供一种miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9 的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本发明还提供miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9 模拟物的的正义链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 在优选的技术方案中，所述miRNA-9或miRNA-9模拟物用于制备抑制肝癌转移药 物。
[0011] 本发明还提供miRNA-9的祀基因，该祀基因为Stegall。
[001引在本发明所述miRNA-9可W用于制备抑制肝癌等转移性肿瘤转移的药物。具体应 用时，可W将miRNA-9的模拟物用于药物设计，也可W构建miRNA-9的真核表达载体，用于基 因治疗。
【附图说明】
[0013] 图1表示miRNA-9在Hca-F, Hca-P和Hepal-eS种小鼠肝癌细胞中的相对表达量的 real-time PCR结果；
[0014] 图2表示StSgal 1蛋白在化a-F，化a-P和化pal -6S种小鼠肝癌细胞中的表达量的 Western Blotting实验结果；
[001引图3表示Stegal 13 ' UTR区域中与miNRA-9结合位点；
[0016] 图4表示双巧光素酶报告基因检测系统分析miR-9的mimic对St6gal-3'UTR/p化-3 巧光强度的影响；
[0017] 图5表示转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inhibito;r、inhibitor NC后StGgall蛋 白在化a-F，Hca-P和化pal-6S种小鼠肝癌细胞中的表达量；
[0018] 图 6 表示 miRNA-9 的模拟物mimic 和抑制物 inhibitor 在Hca-F, Hca-P 和H邱 al-6S 种小鼠肝癌细胞的转染效率；
[0019] 图7表示S种细胞分别转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inhibito;r、inhibitor NC 后细胞增殖能力的变化；
[0020] 图 8表示Hca-F ,Hca-P和 Hepal-GS种小鼠肝癌分别转染 miRNA-9 的mimic、mimi C NCJnhibitor,inhibitor NC后细胞迁移能力的变化；
[0021 ]图 9表示Hca-F，Hca-P和Hepal-6S种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的mimic、mimic NCJnhibitor,inhibitor NC后细胞侵袭能力的变化；
[002引图10表示不同包被浓度下化a-F和化a-P细胞与FN、LN、C0L的黏附能力显著高于 胎pal-6细胞；
[0023] 图 11 表示Hca-F,Hca-P和Hepal-GS种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的 mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC后p-FAK蛋白水平表达量。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规 条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材 料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达忍片之上，根据忍片 结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞化epal-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞化ca-P)和高转 移能力的小鼠肝癌细胞化ca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，根据忍片结 果的分析，确定候选的HiiRNA为miRNA-9，其序列为UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA。
[0026 ]本发明使用的细胞、试剂盒W及试剂：
[0027] 所述肝癌细胞化pal-6为小鼠普通肝癌细胞、所述肝癌细胞化a-P为低转移能力的 小鼠肝癌细胞、所述肝癌细胞化a-F为高转移能力的小鼠肝癌细胞，根据文献(Y.Guo et al.The International Journal of Biochemi stry&Ce 11 Biology, 2014,53,1 ~8)获得。 pG13载体购自（Promega，USA)，pMD-19T载体购自（TaKaRa，Japan)。
[0028] miRNA-9的模拟物、抑制物W及相应阴性对照物的名称和序列如表1。
[0029] 表l.miRNA-9、miRNA-9的模拟物、抑制物W及相应阴性对照物的名称和序列
[0032] 实施例1
[0033] miRNA-9在不同小鼠肝癌细胞中的表达:将对数期的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、Hca-F分别贴壁和悬浮培养在含有90%DMEM、90%RPMI1640和10%FBS的全培培养基中， 在37°C、5%C02的培养条件下培养24h，得到状态良好的小鼠肝癌细胞。收集细胞，通过 Tr i SO1法提取细胞中的总RNA。将提取的总RNA反转录得到CDNA，RNA模板的含量为化g总 RNA。将反转得到的CDNA根据进行real-time PCR检测miRNA-9在S种细胞中的表达量，根据 试剂盒(Bulge-LoopTViRNA qRT-PCR，RIB0BI0)的说明进行，通过PCR反应扩增扩增mi RNA- 9。图1为miRNA-9在S种细胞中的相对表达量，可见miRNA-9在化pal-6中的表达量显著高于 Hca-P和化a-F，说明miRNA-9的表达量与小鼠肝癌细胞的恶性程度负相关。
[0034] 实验结果与忍片结果一致，即miRNA-9在不具有转移能力的小鼠肝癌细胞中的表 达量显著高于具有转移能力的小鼠肝癌细胞。
[00巧]实施例2
[0036] 为了寻找miRNA-9的祀基因，通过化rgetScan、Mi畑B等生物信息预测软件找到了 感兴趣的祀基因之一:StSgal 1，将此作为研究对象。StSgal 1是真核细胞生物中高度保守的 一个糖基转移酶，其在糖链上的表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。
[0037] 具体为：将对数期的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、化a-F分别贴壁和悬浮培养在 含有90%DMEM、90%RPMI1640和10%FBS的全培培养基中，在37°C、5%C02的培养条件下培 养24h，收集细胞，分别提取总蛋白质，通过Western blotting实验，证实了S种细胞中 Stegall的表达，结果如图2所示。结果表明Stegall在化a-F的表达量显著高于化pal-6和 Hca-P，StSgal 1在S种细胞中的相对表达量与miRNA-9在S种细胞中的相对表达量存在正 确的逻辑关系，说明StSgal 1的表达与miNRA-9具有相关性。
[003引为了直接证明Stegall是miRNA-9的祀基因，构建了双巧光素酶报告基因，设计引 物将St6gall3'UTR区域中与miNRA-9结合位点的片段扩增出来(结合位点如图3所示，结合 位点用粗体字标注），并将此段序列连接到pGl-3载体中，然后将其与miRNA-9的mimic共转 染到Hepa 1-6中。
[0039] 扩增片段引物设计：
[0040] 设计引物扩增Stegal 1基因（NM_001252505)的3 ' irre非翻译区片段，并根据pGl-3 载体上的酶切位点选择适合的酶切位点，在引物的5 '端和3 '端分别加入MiilI和化〇11酶切 位点，引物分别命名为St6gall/3'UTR-F(上游引物）St6gall/3'UTR-R(下游引物），引物序 列如下：
[0041 ] St6gal/3 ' UTR-F:5 '-ACGCGTTATAAGGCATCAGGACTGT-3 '
[0042] Stegal1/3 ' UTR-R:5 '-CCGCTCGAGGATTTCTGAAAAAGATATT-3 '
[0043] 上述Stegall基因（NM_001252505)的cDNA序列如沈Q ID 齡.4，总长度为41776口。
[0044] 按照前述方法提取化pal-6细胞中的总RNA，反转录得到cDNA，使用PCR扩增试剂盒 (TaKaRa PCR Amplification Kit,Japan)扩增目的片段。PCR体系如下所示： PC民反应体系（撕冲）： ClNTP 叫 10邻C及Bu瓶r 3 Hl 灭菌蒸溜水 23.7山
[004引 Taq 酶 0.3.ul 上游引物 0.5|il 下游引物 0.5叫 cDNA 叫 1 总体載 30,LU
[0046] PCR 条件为:95°C，预变性 4min; 94°C 变性 40s，60°C 复性 40s，70°C 延伸 60s，40 个循 环;72°C延伸10min;4°C保存。
[0047] 反应结束后，PCR反应产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带进行切 胶回收步骤，收集目的片段（即Stegall的3'UTR片段），测序，序列如SEQ ID No.5,长度 239bp。将目的片段与克隆载体PMD-19T在16°C下过夜连接，目的片段和PMD-19T分别用Mii 11和化Ol I进行双酶切后，进行连接，连接体系如下： pMD19-T Simple V说 1;or 0.5 (SO ng/jiL ) St6galI 3，UT民片段 4.5 ^iL (〇3pmolDNA)
[004引 Sokition I 5.0 JiL 总体巧 10.0睐
[0049] 将连接产物转化至制备好的感受态细胞E.COli JM109中，具体方法如下：
[0050] (1)取200iil感受态细胞溶液，加入IOiil连接产物，混匀，于冰上SOmin;
[0051 ] (2)42°C水浴90秒钟热激，放置于冰水中2min;
[0052] (3)加入37°C预热培养基(无抗性)振荡培养50min;
[0053] (4)取出50iU转化物涂于含Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板放置于解箱中，37 °C培养过夜。
[0054] 筛选阳性克隆：
[0055] (1)随机挑取平板上独立的圆滑的菌落，37°C下摇菌培养约12h，收集菌液后，使用 试剂盒(OMEGA质粒小量提取试剂盒，D6942-01 E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I)提取质 粒。将质粒测序，选取测序正确的质粒与pGl S-Control Vector连接。将质粒和pGL3-Control Vector分别用M山I和化oil进行双酶切，得目的片段和线性载体，在16°C下过夜连 接，连接体系如下： pGO-Control Vector 2 jxl T4 DNA Iigase I jil
[0056] 目的片段 15叫 I O.xT4 Ligation Btrffer 2 jil 总体親 20叫
[0057] 将连接产物转化至感受态细胞中，进行重组质粒的转化实验和质粒提取实验，方 法同上述实验过程。将大量精提取好的重组质粒与miRNA-9的mimic共转染至化pal-6细胞 中，接下来进行双巧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase?Repo;rter Assay System, Promega,USA)
[0058] 具体为：将重组质粒与miRNA-9的模拟物共转染至化pal-6细胞培养12小时后，收 集细胞，用裂解液进行裂解，裂解液按照试剂说明配置蛋火虫巧光素酶检测试剂工作液和 Renilla巧光素酶检测工作液，用巧光测定仪进行检测，检测结果进行统计学分析，结果如 图4所示。图4中，mock为没有转染的Hepa 1-6细胞，mimic为转染了 miRNA-9的模拟物的 Hepal-6细胞，mimic NC为转染了miRNA-9模拟物的阴性对照的H邱al-6细胞，可见，miRNA-9 的模拟物可W显著抑制pGL3的巧光强度，故Stegall为miRNA-9的祀基因之一。
[0059] 实施例3
[0060] 为了进一步寻找miRNA-9与小鼠肝癌细胞转移能力的关系，将miRNA-9的模拟物 (mimic)、miRNA-9的抑制物（inhibitor)和miRNA-9模拟物的阴性对照物（mimic NC)与 miRNA-9抑制物的阴性对照物QnMbitor NC)的分别转染至H邱al-6、Hca-P、Hca-FS种细 胞中。培养36-48小时后，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blotting检测StGgall的表 达水平，结果如图5A-C所示。试验结果可见，转染miRNA-9的mimic可W下调Stegall在细胞 中的表达水平，相应的，转染miRNA-9的inhibitor上调了Stegall的表达水平。
[0061] 实施例4
[0062] 为了进一步研究上调、下调miRNA-9在S种细胞中的表达量对细胞功能的影响，进 行细胞增殖、侵袭、迁移和黏附的实验。
[0063] 1.细胞转染
[0064] 将复苏好的化pal-6、化a-P、Hca-F细胞分别铺在6孔板中，每孔约5*105个细胞。参 照转染试剂(rAoWCT? CP，RIBOBIO，China)说明书，分别稀释miRNA-9的mimic、mimic NC、 inhibitor、inhibitor NC和转染试剂，并按照说明书混合转染试剂与相应的siRNA。置于37 °C，0)2培养箱中解育2地。转染结果在巧光显微镜下观察，结果如图6,如图6A-C分别为在 Hca-F、Hca-P、Hepal-6S种细胞中转染了带有巧光标记的miRNA-9模拟物的阴性对照物 mimic NC后的巧光效果图，表明在该转染条件下转染实验成功，同样，转染其他试剂时，也 表现出良好的转染效率，转染率在60-70 %之间。
[0065] 2.对小鼠肝癌细胞增殖的影响
[0066] 细胞增殖-CCK8实验:采用CCK8试剂盒(DojindoJapan)进行检测，具体方法如下：
[0067] 收集成功转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inWbitor、inWbitor NC，W及未作转 染处理(mock)的化pal-6，化a-P，化a-FS种细胞，用血球计数板计数大约2*104个细胞，并 将记数后的细胞铺在96孔板的每孔中，总体积为10化1，每组设3个复孔。将96孔板放置于 37°C，C02培养箱中分别培养2地、4她、72h、96h。每孔细胞悬液中加 IOiil CCK-8溶液，置于37 °C，0)2培养箱中解育化。测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的 方差分析方法来分析各组数据，结果如图7所示。图7可见，转染了 miRNA-9模拟物(miRNA-9 mimic)的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、化a-F的增殖速率显著低于转染了 miRNA-9抑制物 (miRNA-9 inhibitor)的小鼠肝癌细胞，表明miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、Hca-F的增殖速率。
[0068] 3.对小鼠肝癌细胞的转移能力
[0069] Transwe 11小室法检测mi RNA-9对H邱a 1 -6、Hca-P、Hca-F细胞迁移能力的影响：同 细胞增殖实验一样，收集转染后培养2地的各组细胞，使用 PBS洗涂细胞3次（10(K)rpm离屯、 5min)，调整细胞密度至5 X IO4个/ml，吸取约10化1不含FBS的培养基将各组细胞悬液按每 孔10化1的量加入化answe 11小室中，每组细胞设3个复孔。在24孔板的下室内分别加入60化 1全培养基，37°C，5 % C〇2培养箱中培养细胞2地。PBS冲洗各小室3次，用棉签擦拭上室的上 层细胞(未穿过小室的细胞）。另取24孔板，在每孔中加入约20化1 4%的多聚甲醒，将小室 置于其中，使膜浸没在多聚甲醒中，固定15min后，取出化answell小室，用PBS冲洗S次，冲 洗小室下部未固定的细胞。接下来，待膜风干后将小室浸在含0.1 %结晶紫溶液的24孔板 中，染色15min"PBS小屯、洗膜3次，至小室上多余的结晶紫染色洗去。正置显微镜观察 Transwell小室下底面发生转移的细胞，并对转移的细胞进行计数，各组细胞间的差异采用 单因素方差分析，SPSS13.0统计学软件进行分析，结果如图8所示，其中图8A-C分别为对 Hepal-6、Hca-P、Hca-F的实验结果。图8中可见，转染miRNA-9的mimic,相对于转染了 miRNA-9的inhibitor, S种细胞的转移能力明显被抑制，而加入inhibitor时S种细胞的转移能力 都显著高于未处理的=种细胞，说明miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞的转移能力。
[0070] 4.对细胞侵袭能力的影响
[0071 ] Transwell 小室检测转染 miRNA-9 的mimic 和inhibitor 后 Heapl-6 ,Hca-P 和 Hca-F S种细胞侵袭能力的变化:将BD胶置于4°C过夜融化，待胶融化后，将BD胶分别与无血清的 DM抓、RPMI1640培养基按1:10的比例混匀，加入混合液10化1于各个小室中。将小室置于在 37°C、5 % C〇2培养箱中解育30min。吸出胶融化后小室中残余的空培养基，加入转染好的各 组细胞于小室中，细胞数量约5 X 1〇4个/ml。其余步骤同化answell小室实验检测细胞的迁 移能力。此实验需要注意铺胶前需要全程保证冰上操作，避免超过l〇°C。结果如图9所示，其 中图9A-C分别为对H邱al-6、Hca-P、Hca-F的实验结果。图9中可见，转染miRNA-9的mimic后 穿过小室的细胞数量显著低于转染了miRNA-9的inhibitor的细胞数量。说明miRNA-9可W 抑制小鼠肝癌的侵袭能力，相反的，mi RNA-9的inhi b i tor可W提高小鼠肝癌细胞的侵袭能 力。
[0072] 5.对细胞黏附能力的影响
[0073] W小鼠肝癌化a-F，化a-P和化pa 1-6细胞为研究对象，观察两种细胞与主要细胞外 基质成分FN(纤连蛋白）、LN(层粘连蛋白）、C0L(胶原蛋白）黏附能力的差异。不同浓度(5nM 和IOnM)的FN、LN、C0L分别包被96孔板，4°C包被过夜，其中牛血清白蛋白（BSA)及多聚赖氨 酸(P-LYS)的包被分别作为阴性和阳性对照。使用含0.1 % BSA的无血清培养基悬浮细胞，并 种植于包被好的96-we 11板中，37°C解育1小时。冷PBS洗掉未结合的细胞，使用40 %甲醇配 审揃0.3%结晶紫标记结合细胞，染色持续30min，d地2〇清洗后，570nm波长下检测结果。每 个处理需要S个复孔。结果如图10所示：在不同包被浓度下，Hca-F和化a-P细胞与FN、LN、 COL的黏附能力显著高于化pal-6细胞。
[0074]由图7-9的实验结果可推断miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞的转移能力。
[007引 实施例5
[0076] 为了找到miRNA-9对细胞黏附功能改变的信号通路，在实施例4中所述的miRNA-9 对小鼠肝癌Hca-F，Hca-P和H邱al -6细胞肝癌Hca-F，Hca-P和H邱al-6细胞实验结果的基础 上，设计实验如下所示：
[0077] 小鼠肝癌Hca-F ,Hca-P和Hepal-6细胞分别用miRNA-9的mimic、mimiC NC、 inhibitor、inhibitor NC转染后，培养24小时，用于如下试验。
[0078] 免疫印迹分析蛋白憐酸化水平
[0079] 。W IQnM的FN包被细胞培养板，4°C包被过夜；
[0080] 2)使用含0.1%BSA的无血清培养基悬浮各转染细胞和未转染细胞(mock)，并种植 于包被好的细胞培养板中，37°C解育1小时；
[0081 ] 3)冷PBS洗掉未结合的细胞后细胞裂解液充分裂解结合细胞，BCA蛋白定量后进行 Western blot检测；
[0082] 4)其中利用FAK抗体检测FAK的总蛋白水平，P-FAK抗体检测其憐酸化水平。
[0083] 得到的结果如图11所示，其中图IlA-C分别为对化pal-6、化a-P、化a-F的实验结果 可见，转染了miRNA-9的mimic的S种细胞的P-FAK蛋白水平表达量下降，显著低于转染了 miNRA-9的inhibitor的细胞，说明miRNA-9是通过抑制FAK蛋白憐酸化水平来降低细胞的黏 附能力。
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【主权项】
1. miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQ ID N0.1所 不。 2. miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9模拟物的的正义 链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。 5.St6gall在制备抑制肝癌转移药物中的应用，其特征在于，所述St6gall为如权利要 求1所述的miRNA-9的靶基因。
【专利摘要】本发明公开了miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQ？ID？NO.1所示。通过研究发现，miRNA-9在高转移能力的小鼠肝癌细胞中的表达量显著低于不具有转移能力的小鼠肝癌细胞，同时本发明还发现上调miRNA-9后小鼠肝癌细胞的增殖、侵袭、转移和黏附能力均减弱。因此认为，miRNA-9可以抑制小鼠肝癌细胞的转移，降低小鼠肝癌细胞的恶性程度。针对具有转移能力的小鼠肝癌细胞，将miRNA-9或其类似物miRNA-9的mimic制备成抑制肿瘤转移的药物，或也可以构建miRNA-9的真核表达载体，用于基因治疗。
【IPC分类】A61K31/7105, A61K48/00, A61P35/04
【公开号】CN105497917
【申请号】CN201510920950
【发明人】张嘉宁, 韩逸, 李文利
【申请人】大连理工大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月11日
【技术领域】
[0001] 本发明设及miRNA-9在制备抑制肝癌转移药物中的应用，属于生物化学与分子生 物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 根据世界卫生组织2014年发布的癌症白皮书，肝癌在我国无论男性或者女性的发 病率和致死率都极高，严重地影响了人类的生存和健康。恶性肿瘤细胞与普通肿瘤细胞的 区别是前者具有转移能力，其转移能力越高，恶性程度也就越高，越难W治愈。肿瘤的转移 机制是一个复杂的网络通路，近年来，随着人们对miRNAs的研究发现，有些miRNAs参与调控 肿瘤的发生和发展过程，可W将其作为早期诊断或者早期治疗的分子祀标。
[0003] 随着糖科学的迅速发展，有关肿瘤与糖基化修饰之间的关系已经越来越多的被科 学家证实。唾液酸转移酶属于脊椎动物唾液酸转移酶家族，该家族包括a-2，3，a-2，6，a-2，8 唾液酸转移酶3个亚型。其中a-2,6唾液酸转移酶表达在机体许多种细胞的表面，可催化活 化的唾液酸Wa-2,6糖巧键的形式连接到细胞膜表面的N-乙酷乳糖胺上。唾液酸作为复合 糖的组成部分镶嵌于所有细胞表面W及大多数脊椎动物糖蛋白和糖脂分子的末端最外侧。 唾液酸介导或调制了炎症、病原感染、肿瘤发生发展等诸多病理过程，与人类疾病密切关 联与正常组织相比较发现，恶性肿瘤组织和恶性肿瘤细胞表面糖链结构发生明显变 化。其中，特征连接唾液酸表达的显著上调或下调变化与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移 和预后不良等相关，有的作为肿瘤标记物或预后标记物，也可能成为肿瘤免疫治疗的祀 占[4] O
[0004] miRNAs是真核生物中一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约20~25个核 巧酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，通过 碱基互补配对的方式识别祀mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解祀mRNA或者 阻遏祀mRNA的翻译。自从1993年，Lee等科学家利用遗传分析的方法在秀丽隐杆线虫中发现 了miRNA后，科学家开展了大量关于miRNA相关功能的研究。目前已有很多miRNA被鉴定参与 细胞癌变、转移等病理过程。如:miR21、miR122、miR182、miR34a、miR138、Let-7c等分别参 与乳腺癌、膀脫癌、肺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的发生和转移过哲SHW。其中，有关miRNA参 与调控糖基化修饰的研究也有相关报道。例如，let-7c通过调控甘露糖乙酷基转移酶4的合 成(该酶参与了细胞表面糖基化的修饰过程)抑制了小鼠肝癌细胞的转移W来自秀丽线虫 中的miR-79与其在哺乳动物中同源的miRNA-9通过调控细胞糖基化修饰过程，影响参与哺 乳动物神经元转移的两个祀基因 SQV-5和SQV-7的合成W。然而，关于miRNA-9在小鼠肝癌转 移中的作用机制还未有报道，包括其祀基因的研究也仅限于少数基因。
【发明内容】
[000引针对上述现有技术，本发明提供了 miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用。
[0006]本发明是通过W下技术方案实现的：
[0007] 本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达忍片之上，根据忍片 结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞化epal-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞化ca-P)和高转 移能力的小鼠肝癌细胞化ca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，利用RT-qPCR验证忍片结果，找到在S种细胞中存在显著差异的miRNA-9作为研究的基础。接下来， 利用western blotting实验方法发现StGgall在S种细胞中的表达量同样存在显著差异， 并与miNRA-9在=种细胞中的表达差异吻合。为了验证Stegall是miRNA-9的祀基因之一，设 计实验构建了双巧光素酶报告基因，并将miRNA-9的模拟物:miRNA-9 mimic与报告基因共 转染至化pal-6中，通过检测，证实了Stegall为miRNA-9的祀基因。最后，将miRNA-9的模拟 物和抑制物:miRNA-9 mimic、miRNA-9 inh化itor分别转染到上述S种细胞中，发现miRNA-9的mimic可W抑制Stegall在S种细胞中的表达量。同时，miRNA-9在细胞中的过表达可W 抑制其增殖、迁移、侵袭和黏附能力。因此，miRNA-9具有抑制小鼠肿瘤细胞的转移能力，可 W应用于抑制肿瘤转移药物的开发领域。
[0008] 具体地，本发明提供一种miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9 的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 本发明还提供miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物的应用，所述miRNA-9 模拟物的的正义链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 在优选的技术方案中，所述miRNA-9或miRNA-9模拟物用于制备抑制肝癌转移药 物。
[0011] 本发明还提供miRNA-9的祀基因，该祀基因为Stegall。
[001引在本发明所述miRNA-9可W用于制备抑制肝癌等转移性肿瘤转移的药物。具体应 用时，可W将miRNA-9的模拟物用于药物设计，也可W构建miRNA-9的真核表达载体，用于基 因治疗。
【附图说明】
[0013] 图1表示miRNA-9在Hca-F, Hca-P和Hepal-eS种小鼠肝癌细胞中的相对表达量的 real-time PCR结果；
[0014] 图2表示StSgal 1蛋白在化a-F，化a-P和化pal -6S种小鼠肝癌细胞中的表达量的 Western Blotting实验结果；
[001引图3表示Stegal 13 ' UTR区域中与miNRA-9结合位点；
[0016] 图4表示双巧光素酶报告基因检测系统分析miR-9的mimic对St6gal-3'UTR/p化-3 巧光强度的影响；
[0017] 图5表示转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inhibito;r、inhibitor NC后StGgall蛋 白在化a-F，Hca-P和化pal-6S种小鼠肝癌细胞中的表达量；
[0018] 图 6 表示 miRNA-9 的模拟物mimic 和抑制物 inhibitor 在Hca-F, Hca-P 和H邱 al-6S 种小鼠肝癌细胞的转染效率；
[0019] 图7表示S种细胞分别转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inhibito;r、inhibitor NC 后细胞增殖能力的变化；
[0020] 图 8表示Hca-F ,Hca-P和 Hepal-GS种小鼠肝癌分别转染 miRNA-9 的mimic、mimi C NCJnhibitor,inhibitor NC后细胞迁移能力的变化；
[0021 ]图 9表示Hca-F，Hca-P和Hepal-6S种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的mimic、mimic NCJnhibitor,inhibitor NC后细胞侵袭能力的变化；
[002引图10表示不同包被浓度下化a-F和化a-P细胞与FN、LN、C0L的黏附能力显著高于 胎pal-6细胞；
[0023] 图 11 表示Hca-F,Hca-P和Hepal-GS种小鼠肝癌分别转染miRNA-9的 mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC后p-FAK蛋白水平表达量。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的方法，通常按照常规 条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材 料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025] 本发明的数据基础建立在小鼠肝癌细胞中microRNA差异表达忍片之上，根据忍片 结果，筛选出在小鼠普通肝癌细胞化epal-6)、低转移能力的小鼠肝癌细胞化ca-P)和高转 移能力的小鼠肝癌细胞化ca-F)中存在显著表达差异的miRNAs作为候选miRNA，根据忍片结 果的分析，确定候选的HiiRNA为miRNA-9，其序列为UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA。
[0026 ]本发明使用的细胞、试剂盒W及试剂：
[0027] 所述肝癌细胞化pal-6为小鼠普通肝癌细胞、所述肝癌细胞化a-P为低转移能力的 小鼠肝癌细胞、所述肝癌细胞化a-F为高转移能力的小鼠肝癌细胞，根据文献(Y.Guo et al.The International Journal of Biochemi stry&Ce 11 Biology, 2014,53,1 ~8)获得。 pG13载体购自（Promega，USA)，pMD-19T载体购自（TaKaRa，Japan)。
[0028] miRNA-9的模拟物、抑制物W及相应阴性对照物的名称和序列如表1。
[0029] 表l.miRNA-9、miRNA-9的模拟物、抑制物W及相应阴性对照物的名称和序列
[0032] 实施例1
[0033] miRNA-9在不同小鼠肝癌细胞中的表达:将对数期的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、Hca-F分别贴壁和悬浮培养在含有90%DMEM、90%RPMI1640和10%FBS的全培培养基中， 在37°C、5%C02的培养条件下培养24h，得到状态良好的小鼠肝癌细胞。收集细胞，通过 Tr i SO1法提取细胞中的总RNA。将提取的总RNA反转录得到CDNA，RNA模板的含量为化g总 RNA。将反转得到的CDNA根据进行real-time PCR检测miRNA-9在S种细胞中的表达量，根据 试剂盒(Bulge-LoopTViRNA qRT-PCR，RIB0BI0)的说明进行，通过PCR反应扩增扩增mi RNA- 9。图1为miRNA-9在S种细胞中的相对表达量，可见miRNA-9在化pal-6中的表达量显著高于 Hca-P和化a-F，说明miRNA-9的表达量与小鼠肝癌细胞的恶性程度负相关。
[0034] 实验结果与忍片结果一致，即miRNA-9在不具有转移能力的小鼠肝癌细胞中的表 达量显著高于具有转移能力的小鼠肝癌细胞。
[00巧]实施例2
[0036] 为了寻找miRNA-9的祀基因，通过化rgetScan、Mi畑B等生物信息预测软件找到了 感兴趣的祀基因之一:StSgal 1，将此作为研究对象。StSgal 1是真核细胞生物中高度保守的 一个糖基转移酶，其在糖链上的表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关。
[0037] 具体为：将对数期的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、化a-F分别贴壁和悬浮培养在 含有90%DMEM、90%RPMI1640和10%FBS的全培培养基中，在37°C、5%C02的培养条件下培 养24h，收集细胞，分别提取总蛋白质，通过Western blotting实验，证实了S种细胞中 Stegall的表达，结果如图2所示。结果表明Stegall在化a-F的表达量显著高于化pal-6和 Hca-P，StSgal 1在S种细胞中的相对表达量与miRNA-9在S种细胞中的相对表达量存在正 确的逻辑关系，说明StSgal 1的表达与miNRA-9具有相关性。
[003引为了直接证明Stegall是miRNA-9的祀基因，构建了双巧光素酶报告基因，设计引 物将St6gall3'UTR区域中与miNRA-9结合位点的片段扩增出来(结合位点如图3所示，结合 位点用粗体字标注），并将此段序列连接到pGl-3载体中，然后将其与miRNA-9的mimic共转 染到Hepa 1-6中。
[0039] 扩增片段引物设计：
[0040] 设计引物扩增Stegal 1基因（NM_001252505)的3 ' irre非翻译区片段，并根据pGl-3 载体上的酶切位点选择适合的酶切位点，在引物的5 '端和3 '端分别加入MiilI和化〇11酶切 位点，引物分别命名为St6gall/3'UTR-F(上游引物）St6gall/3'UTR-R(下游引物），引物序 列如下：
[0041 ] St6gal/3 ' UTR-F:5 '-ACGCGTTATAAGGCATCAGGACTGT-3 '
[0042] Stegal1/3 ' UTR-R:5 '-CCGCTCGAGGATTTCTGAAAAAGATATT-3 '
[0043] 上述Stegall基因（NM_001252505)的cDNA序列如沈Q ID 齡.4，总长度为41776口。
[0044] 按照前述方法提取化pal-6细胞中的总RNA，反转录得到cDNA，使用PCR扩增试剂盒 (TaKaRa PCR Amplification Kit,Japan)扩增目的片段。PCR体系如下所示： PC民反应体系（撕冲）： ClNTP 叫 10邻C及Bu瓶r 3 Hl 灭菌蒸溜水 23.7山
[004引 Taq 酶 0.3.ul 上游引物 0.5|il 下游引物 0.5叫 cDNA 叫 1 总体載 30,LU
[0046] PCR 条件为:95°C，预变性 4min; 94°C 变性 40s，60°C 复性 40s，70°C 延伸 60s，40 个循 环;72°C延伸10min;4°C保存。
[0047] 反应结束后，PCR反应产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的条带进行切 胶回收步骤，收集目的片段（即Stegall的3'UTR片段），测序，序列如SEQ ID No.5,长度 239bp。将目的片段与克隆载体PMD-19T在16°C下过夜连接，目的片段和PMD-19T分别用Mii 11和化Ol I进行双酶切后，进行连接，连接体系如下： pMD19-T Simple V说 1;or 0.5 (SO ng/jiL ) St6galI 3，UT民片段 4.5 ^iL (〇3pmolDNA)
[004引 Sokition I 5.0 JiL 总体巧 10.0睐
[0049] 将连接产物转化至制备好的感受态细胞E.COli JM109中，具体方法如下：
[0050] (1)取200iil感受态细胞溶液，加入IOiil连接产物，混匀，于冰上SOmin;
[0051 ] (2)42°C水浴90秒钟热激，放置于冰水中2min;
[0052] (3)加入37°C预热培养基(无抗性)振荡培养50min;
[0053] (4)取出50iU转化物涂于含Amp的LB琼脂平板培养基上，将平板放置于解箱中，37 °C培养过夜。
[0054] 筛选阳性克隆：
[0055] (1)随机挑取平板上独立的圆滑的菌落，37°C下摇菌培养约12h，收集菌液后，使用 试剂盒(OMEGA质粒小量提取试剂盒，D6942-01 E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I)提取质 粒。将质粒测序，选取测序正确的质粒与pGl S-Control Vector连接。将质粒和pGL3-Control Vector分别用M山I和化oil进行双酶切，得目的片段和线性载体，在16°C下过夜连 接，连接体系如下： pGO-Control Vector 2 jxl T4 DNA Iigase I jil
[0056] 目的片段 15叫 I O.xT4 Ligation Btrffer 2 jil 总体親 20叫
[0057] 将连接产物转化至感受态细胞中，进行重组质粒的转化实验和质粒提取实验，方 法同上述实验过程。将大量精提取好的重组质粒与miRNA-9的mimic共转染至化pal-6细胞 中，接下来进行双巧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase?Repo;rter Assay System, Promega,USA)
[0058] 具体为：将重组质粒与miRNA-9的模拟物共转染至化pal-6细胞培养12小时后，收 集细胞，用裂解液进行裂解，裂解液按照试剂说明配置蛋火虫巧光素酶检测试剂工作液和 Renilla巧光素酶检测工作液，用巧光测定仪进行检测，检测结果进行统计学分析，结果如 图4所示。图4中，mock为没有转染的Hepa 1-6细胞，mimic为转染了 miRNA-9的模拟物的 Hepal-6细胞，mimic NC为转染了miRNA-9模拟物的阴性对照的H邱al-6细胞，可见，miRNA-9 的模拟物可W显著抑制pGL3的巧光强度，故Stegall为miRNA-9的祀基因之一。
[0059] 实施例3
[0060] 为了进一步寻找miRNA-9与小鼠肝癌细胞转移能力的关系，将miRNA-9的模拟物 (mimic)、miRNA-9的抑制物（inhibitor)和miRNA-9模拟物的阴性对照物（mimic NC)与 miRNA-9抑制物的阴性对照物QnMbitor NC)的分别转染至H邱al-6、Hca-P、Hca-FS种细 胞中。培养36-48小时后，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blotting检测StGgall的表 达水平，结果如图5A-C所示。试验结果可见，转染miRNA-9的mimic可W下调Stegall在细胞 中的表达水平，相应的，转染miRNA-9的inhibitor上调了Stegall的表达水平。
[0061] 实施例4
[0062] 为了进一步研究上调、下调miRNA-9在S种细胞中的表达量对细胞功能的影响，进 行细胞增殖、侵袭、迁移和黏附的实验。
[0063] 1.细胞转染
[0064] 将复苏好的化pal-6、化a-P、Hca-F细胞分别铺在6孔板中，每孔约5*105个细胞。参 照转染试剂(rAoWCT? CP，RIBOBIO，China)说明书，分别稀释miRNA-9的mimic、mimic NC、 inhibitor、inhibitor NC和转染试剂，并按照说明书混合转染试剂与相应的siRNA。置于37 °C，0)2培养箱中解育2地。转染结果在巧光显微镜下观察，结果如图6,如图6A-C分别为在 Hca-F、Hca-P、Hepal-6S种细胞中转染了带有巧光标记的miRNA-9模拟物的阴性对照物 mimic NC后的巧光效果图，表明在该转染条件下转染实验成功，同样，转染其他试剂时，也 表现出良好的转染效率，转染率在60-70 %之间。
[0065] 2.对小鼠肝癌细胞增殖的影响
[0066] 细胞增殖-CCK8实验:采用CCK8试剂盒(DojindoJapan)进行检测，具体方法如下：
[0067] 收集成功转染miRNA-9的mimic、mimic NC、inWbitor、inWbitor NC，W及未作转 染处理(mock)的化pal-6，化a-P，化a-FS种细胞，用血球计数板计数大约2*104个细胞，并 将记数后的细胞铺在96孔板的每孔中，总体积为10化1，每组设3个复孔。将96孔板放置于 37°C，C02培养箱中分别培养2地、4她、72h、96h。每孔细胞悬液中加 IOiil CCK-8溶液，置于37 °C，0)2培养箱中解育化。测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的 方差分析方法来分析各组数据，结果如图7所示。图7可见，转染了 miRNA-9模拟物(miRNA-9 mimic)的小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、化a-F的增殖速率显著低于转染了 miRNA-9抑制物 (miRNA-9 inhibitor)的小鼠肝癌细胞，表明miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞化pal-6、化a-P、Hca-F的增殖速率。
[0068] 3.对小鼠肝癌细胞的转移能力
[0069] Transwe 11小室法检测mi RNA-9对H邱a 1 -6、Hca-P、Hca-F细胞迁移能力的影响：同 细胞增殖实验一样，收集转染后培养2地的各组细胞，使用 PBS洗涂细胞3次（10(K)rpm离屯、 5min)，调整细胞密度至5 X IO4个/ml，吸取约10化1不含FBS的培养基将各组细胞悬液按每 孔10化1的量加入化answe 11小室中，每组细胞设3个复孔。在24孔板的下室内分别加入60化 1全培养基，37°C，5 % C〇2培养箱中培养细胞2地。PBS冲洗各小室3次，用棉签擦拭上室的上 层细胞(未穿过小室的细胞）。另取24孔板，在每孔中加入约20化1 4%的多聚甲醒，将小室 置于其中，使膜浸没在多聚甲醒中，固定15min后，取出化answell小室，用PBS冲洗S次，冲 洗小室下部未固定的细胞。接下来，待膜风干后将小室浸在含0.1 %结晶紫溶液的24孔板 中，染色15min"PBS小屯、洗膜3次，至小室上多余的结晶紫染色洗去。正置显微镜观察 Transwell小室下底面发生转移的细胞，并对转移的细胞进行计数，各组细胞间的差异采用 单因素方差分析，SPSS13.0统计学软件进行分析，结果如图8所示，其中图8A-C分别为对 Hepal-6、Hca-P、Hca-F的实验结果。图8中可见，转染miRNA-9的mimic,相对于转染了 miRNA-9的inhibitor, S种细胞的转移能力明显被抑制，而加入inhibitor时S种细胞的转移能力 都显著高于未处理的=种细胞，说明miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞的转移能力。
[0070] 4.对细胞侵袭能力的影响
[0071 ] Transwell 小室检测转染 miRNA-9 的mimic 和inhibitor 后 Heapl-6 ,Hca-P 和 Hca-F S种细胞侵袭能力的变化:将BD胶置于4°C过夜融化，待胶融化后，将BD胶分别与无血清的 DM抓、RPMI1640培养基按1:10的比例混匀，加入混合液10化1于各个小室中。将小室置于在 37°C、5 % C〇2培养箱中解育30min。吸出胶融化后小室中残余的空培养基，加入转染好的各 组细胞于小室中，细胞数量约5 X 1〇4个/ml。其余步骤同化answell小室实验检测细胞的迁 移能力。此实验需要注意铺胶前需要全程保证冰上操作，避免超过l〇°C。结果如图9所示，其 中图9A-C分别为对H邱al-6、Hca-P、Hca-F的实验结果。图9中可见，转染miRNA-9的mimic后 穿过小室的细胞数量显著低于转染了miRNA-9的inhibitor的细胞数量。说明miRNA-9可W 抑制小鼠肝癌的侵袭能力，相反的，mi RNA-9的inhi b i tor可W提高小鼠肝癌细胞的侵袭能 力。
[0072] 5.对细胞黏附能力的影响
[0073] W小鼠肝癌化a-F，化a-P和化pa 1-6细胞为研究对象，观察两种细胞与主要细胞外 基质成分FN(纤连蛋白）、LN(层粘连蛋白）、C0L(胶原蛋白）黏附能力的差异。不同浓度(5nM 和IOnM)的FN、LN、C0L分别包被96孔板，4°C包被过夜，其中牛血清白蛋白（BSA)及多聚赖氨 酸(P-LYS)的包被分别作为阴性和阳性对照。使用含0.1 % BSA的无血清培养基悬浮细胞，并 种植于包被好的96-we 11板中，37°C解育1小时。冷PBS洗掉未结合的细胞，使用40 %甲醇配 审揃0.3%结晶紫标记结合细胞，染色持续30min，d地2〇清洗后，570nm波长下检测结果。每 个处理需要S个复孔。结果如图10所示：在不同包被浓度下，Hca-F和化a-P细胞与FN、LN、 COL的黏附能力显著高于化pal-6细胞。
[0074]由图7-9的实验结果可推断miRNA-9可W抑制小鼠肝癌细胞的转移能力。
[007引 实施例5
[0076] 为了找到miRNA-9对细胞黏附功能改变的信号通路，在实施例4中所述的miRNA-9 对小鼠肝癌Hca-F，Hca-P和H邱al -6细胞肝癌Hca-F，Hca-P和H邱al-6细胞实验结果的基础 上，设计实验如下所示：
[0077] 小鼠肝癌Hca-F ,Hca-P和Hepal-6细胞分别用miRNA-9的mimic、mimiC NC、 inhibitor、inhibitor NC转染后，培养24小时，用于如下试验。
[0078] 免疫印迹分析蛋白憐酸化水平
[0079] 。W IQnM的FN包被细胞培养板，4°C包被过夜；
[0080] 2)使用含0.1%BSA的无血清培养基悬浮各转染细胞和未转染细胞(mock)，并种植 于包被好的细胞培养板中，37°C解育1小时；
[0081 ] 3)冷PBS洗掉未结合的细胞后细胞裂解液充分裂解结合细胞，BCA蛋白定量后进行 Western blot检测；
[0082] 4)其中利用FAK抗体检测FAK的总蛋白水平，P-FAK抗体检测其憐酸化水平。
[0083] 得到的结果如图11所示，其中图IlA-C分别为对化pal-6、化a-P、化a-F的实验结果 可见，转染了miRNA-9的mimic的S种细胞的P-FAK蛋白水平表达量下降，显著低于转染了 miNRA-9的inhibitor的细胞，说明miRNA-9是通过抑制FAK蛋白憐酸化水平来降低细胞的黏 附能力。
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【主权项】
1. miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQ ID N0.1所 不。 2. miRNA-9的模拟物在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9模拟物的的正义 链序列如SEQ ID NO.2所示，反义链序列如SEQ ID NO.3所示。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。 5.St6gall在制备抑制肝癌转移药物中的应用，其特征在于，所述St6gall为如权利要 求1所述的miRNA-9的靶基因。
【专利摘要】本发明公开了miRNA-9在制备抑制肿瘤转移药物中的应用，所述miRNA-9的序列如SEQ？ID？NO.1所示。通过研究发现，miRNA-9在高转移能力的小鼠肝癌细胞中的表达量显著低于不具有转移能力的小鼠肝癌细胞，同时本发明还发现上调miRNA-9后小鼠肝癌细胞的增殖、侵袭、转移和黏附能力均减弱。因此认为，miRNA-9可以抑制小鼠肝癌细胞的转移，降低小鼠肝癌细胞的恶性程度。针对具有转移能力的小鼠肝癌细胞，将miRNA-9或其类似物miRNA-9的mimic制备成抑制肿瘤转移的药物，或也可以构建miRNA-9的真核表达载体，用于基因治疗。
【IPC分类】A61K31/7105, A61K48/00, A61P35/04
【公开号】CN105497917
【申请号】CN201510920950
【发明人】张嘉宁, 韩逸, 李文利
【申请人】大连理工大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月11日
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