发动蛋白1在防治肠道病毒71型感染中的应用
发动蛋白1在防治肠道病毒71型感染中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医学技术领域，具体设及抗肠道病毒71型感染的新祀点及应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠道 A类病毒，是导致手足口病化and-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原体之一。目前，手 足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市暴发手足 口病疫情W来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100万例，死 亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁W下婴幼儿，临床表现为发热，手、足、臀部W 及口腔粘膜等部位出现瘤疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神经系统 (central nervous system，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎W及神经源 性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon T,Lewthwaite P,Perera D,(^irdosa MJ,McMinn P,Ooi MH.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71 丄ancet Infect Dis.2010Nov;10(ll):778-90.]。手足口病特别是重症病 例多由肠道病毒71型化V71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异 高效的抗病毒药物，临床上仍W对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。
[0003] EV71感染具有嗜神经性，易造成严重的CNS疾病及其并发症，运也是导致手足口病 患者发展为重症甚至死亡的主要原因。其中，脑干是最易被EV71感染的部位[Tee，K.K.，et 曰1.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin,population dynamics, natural selection,and seasonal periodicity of the VPlgene.J Virol,2010.84(7): P. 3339-50.]，研究证实在EV71重症患者的脑干神经元等部位均能够检测到EV71基因及抗 原的存在，证明EV71能进入CNS。EV71经血液播散破坏血脑屏障或经周围神经途径逆向轴突 输送感染CNS。但EV71引起的中枢神经系统症状的机制尚不明确[Solomon T，Lewthwaite P,Perera D,Cardosa MJ,Mcminn P,Ooi MH.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71 丄ancet Infect Dis.2010; 10:778-90.]。神经母细胞瘤细胞 (甜-SY5Y)为神经组织来源，具有一定的神经细胞特性。因此，探明EV71感染甜-SY5Y的机制 并W此寻找新的抗病毒祀点，对于防治EV71所导致的中枢神经系统感染至关重要。
[0004] 为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系统完成对 宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此，作为病 毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要祀标。研究表明，EV71 可利用不同的宿主因子和感染途径来入侵不同种类的祀细胞，比如EV71感染化rkat T淋己 细胞系主要利用小窝依赖的内吞途径（caveolar-d邱endent endo巧tosis) [Lin HY,Yang YT,Yu SL,et al.Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71 inf ection. J Virol. 2013，87( 16): 9064-76.]。目前，关于EV71 感染細-SY5Y的途径及机制仍不清楚。
[000引病毒侵入祀细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，运些宿主细 胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞W及分泌中发挥着重要的作用。如 金属蛋白酶调节了细胞粘附，细胞膜分子的降解；小窝蛋白家族分子caveolin-l(CAVl)、 caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)将物质运输至高尔基体;Flotillin分子能够与脂俊 内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；发动蛋白I(DNMl)通过影响囊泡的重新利用在细胞 的内吞和突触囊泡循环中发挥重要作用;GTP酶激活蛋白分子GRAFl在网格蛋白非依赖型的 囊泡运输中具有重要的调节作用；白细胞介素2受体内吞调节了信号通路并影响了细胞增 歹直（Jason Mercer,Mario Schelhaas,et al.Virus Entry by Endocytosis.Annu Rev Biochem. 2010; 79:803-833.) eEzrin蛋白可通过酪氨酸激酶信号调节细胞微管系统，继而 调节了细胞黏附与迁徙等生理过程;Ezrin蛋白也被证实参与了丙型肝炎病毒感染肝细胞 的过程（Bukon邑 TN,Kodys K,Szabo G.Human ezrin-moesin-radixin proteins modulate hepatitis C virus infection.Hepatology.2013,58(5):1569-79.)。外被蛋白复合体 COPA(coatomer protein complex)参与了小泡介导非选择性运输,它参与从内质网到顺面 高尔基体的运输。在运些分子中，caveolin-1被证实参与了EV71感染化rkat T淋己细胞的 过程，而其它分子在EV71感染中的作用还未有报道。
[0006] 胞吞化11(1〇(3八0313)是细胞生理代谢的一个极为重要的过程，也是细胞从环境中 获取物质和回收膜组分的过程。发动蛋白（dynamin)家族是一类鸟巧酸S憐酸酶，是细胞在 进行内吞过程中特异的一种蛋白，它参与囊泡从细胞膜上出芽和剪切的过程。其中发动蛋 白UD醒1)特异性地分布在神经细胞中。现已证实面M 1通过水解GTP提供能量，使网格蛋白 包被的囊泡凹窝与突触前膜分离，最终回收至突触前膜重新利用从而在细胞内吞和突触囊 泡循环中发挥重要作用（Newton AJJirdihausen T,Mu;rthy VN. InMbition of dynamin completely blocks compensatory synaptic vesicle endocytosis.PNAS,2006,103 (47) :17955~17960)。现已证实D醒I在阿尔默茨海默症的发生发展中发挥作用(Brent LK, Robert V,Adriana F,et al.P-amyloid-induced dynamin !depletion in hippocampal neurons.A potential mechanism for early cognitive decline in Alzheimer disease[ J]. J Biol 化 em. 2005.280(36): 31746-31753.)。也有文献报 DNMl 可能通过憐酸 化/去憐酸化方式参与侧颠叶癒癖的发生发展(Cla^on EL，Anggono V，Smillie KJ，化au N,Robinson PJ,Cousin MA.The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles[J].J Neurosci,2009,29(24):7706-7717. )〇
[0007] 目前还没有任何关于D醒I分子在EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)中作用的研 究报道，对于DNMl分子进行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可W 为预防与治疗EV71感染提供新的思路与祀点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新祀点。
[0009] 本发明的另一目的在于提供发动蛋白I(DNMl)分子的新用途，特别是在抗肠道病 毒71型感染中的应用。
[0010]本发明的第S目的在于提供干扰DNMl分子表达的siRNA。
[0011]本发明的主要技术方案是：
[0012]本发明，W人神经母细胞瘤（SH-SY5Y)作为祀细胞，采用RNA干扰技术下调祀细胞 宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)的宿主因子，从而 预防神经系统感染与破坏。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运分子来进行筛选，运些分 子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它们往往也是在病 毒感染过程中易被病毒"劫持"并利用的分子。运些分子包括:金属蛋白酶lO(ADAMlO)、发动 蛋白 I(DNMl)、caveolin-l (CAVl)、caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)、Flotillin蛋白 1 巧LOTI)、GTP酶激活蛋白（GRAFl)、白细胞介素2受体（IL2RB)、化rin蛋白、外被蛋白复合体 (COPA)。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件 对运些基因进行生物学分析，选择编码区作为SiRNA设计的祀序列，然后设计SiRNA,通过下 调运些分子，来观察对EV71感染的影响。
[001引我们发现发动蛋白I(DNMl)在EV71感染甜-SY5Y中发挥着重要的作用，下调DNMl的 表达，能明显抑制EV71的感染。
[0014]本发明的第一方面，提供了发动蛋白I(DNMl)作为一种抗肠道病毒71型感染的新 祀点。
[001 引所述的发动蛋白 I(DNMl) ,GENBANK ID:NM_004408。
[0016] 本发明的第二方面，提供了发动蛋白I(DNMl)在制备预防或治疗肠道病毒71型感 染药物中的应用。
[0017] 进一步地，本发明还提供发动蛋白1(面Ml)在制备预防或治疗手足口病药物中的 应用。
[0018] 本发明所述的发动蛋白UD醒1)在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应 用，该药物具体是指能够抑制或下调DNMl的表达量的试剂。
[0019 ] 所述的抑制下调DNMl的表达量的试剂可W是S i RNA、ShRNA、包含S i RNA、ShRNA的重 组载体(如质粒)等。
[0020]本发明的第S方面，本发明提供了发动蛋白UD醒1)的干扰RNA在制备预防或治疗 肠道病毒71型感染药物中的应用，或发动蛋白1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用， 所述的药物为干扰RNA(SiRNA)，其序列如下：
[0024] 其中，W如SEQ ID N0:6所示的SiRNA下调面Ml的表达量效果最佳，且降低EV71对 SH-SY5Y细胞的感染最为明显。
[0025] 本发明筛选到能够抑制EV71感染細-SY5Y细胞的一个新的宿主细胞分子面Ml。 面M1基因下调W后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了 E V71对細-S Y5 Y细胞的感 染。
[0026] 因此本发明为临床预防和治疗因 EV71感染所导致的神经系统破坏提供了新的祀 点和治疗方案。
【附图说明】
[0027] 图1为转染有效SiRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干扰效 率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；
[002引 CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）；
[0029] NT:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）；
[0030] SiRNA:转染针对各目的基因的SiRNA的甜-SY5Y细胞组(实验组）。
[0031] 图2为免疫巧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，其中A为下调各分子 后对病毒感染性的巧光检测图，B为下调各分子后对病毒感染的抑制率图；
[0032] CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）；
[0033] NT:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）；
[0034] SiRNA:转染针对各目的基因的SiRNA的甜-SY5Y细胞组(实验组）。
[0035] 图3为D醒1下调后对EV71感染的影响，其中A为Western Blot检测DNMl蛋白的表达 图，B为观察EV71的细胞病变效应图，C为检测EV71病毒量图；
[0036] CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）；
[0037] NT-CTRl^:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）；
[003引 D醒1:转染针对D醒1基因的SiRNA(沈Q ID N0:6)的甜-SY5Y细胞组。
[0039] 图4为转染D醒1分子的不同干扰序列后的干扰效率及对EV71感染性的影响图，A为 D醒1基因的mRNA水平检测图，B为EV71病毒量检测图；
[0040] CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）；
[0041 ] NT-CTRl^:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）；
[0042] DNM1-4:转染针对DNMl基因的SiRNA(沈Q ID N0:4)的甜-SY5Y细胞组；
[0043] DNM1-5:转染针对DNMl基因的SiRNA(沈Q ID N0:5)的甜-SY5Y细胞组；
[0044] DNM1-6:转染针对DNMl基因的SiRNA(沈Q ID N0:6)的甜-SY5Y细胞组。
【具体实施方式】
[0045] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0046] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南KNew York:Cold Spring化rbor LaboratoiT Press, 1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0047] 实施例1:
[0048] 1设计、合成各宿主细胞分子的特异性SiRNA序列。
[0049] 1.1针对各个目的基因，检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的 网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区作为SiRNA设计的祀序列。 参照SiRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确 保无同源性;排除aitisense链的5'端连续8个碱基与其它基因配对的潜在SiRNA;排除任何 一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3 个最佳的动力学参数祀点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。
[0050] 1.2单链SiRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。
[0051 ] 表1. SiRNA祀点的设计
[0052]
[0054] 2 SiRNA序列筛选与干扰效果鉴定
[005引 2.1 RNA 转染
[0056] 转染步骤参照Lipofectamine 2000说明书
[0057] 1)提前12-16小时将甜-SY5Y细胞(购自ATCC，保藏号:ATCC CRk2266)铺在24孔细 胞培养板上培养，使得转染时细胞密度为80 % -90 %。
[005引 2)取化化ipofectamine 2000加入50化opti-MEM中并轻柔混匀，室溫解育5分钟； 另取扣L浓度为扣M的干扰RNA和50化opti-MEM混合。解育结束后，将稀释的Lipofectamine 2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔吹吸混匀。室溫解育20min后，加入甜-SY5Y细胞中， 补加400化opti-MEM，使得RNA终浓度为50nM。
[0059] 3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。
[0060] 2.2实时巧光定量PCR(RT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平
[0061 ] 1 )TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：
[0062] 转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1ml TRIzol,充分混合室溫裂解细胞3-5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4°C、12,000转离屯、15分钟。取上层水相 并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室溫沉淀10分钟。于4°C、12,000转离 屯、10分钟。弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇。于4°C、12,000离屯、5分钟。充分弃上清，室溫惊 干RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。
[0063] 2)利用化kara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步骤如下：
[0064] 在PCR管中加入如下反应体系，
[00巧]SXPrimeScript Buffer 化L
[0066] PrimeScript RT Enzyme Mix 0.化1
[0067] Random 6 mers 0.化1
[0068] Total RNA 500ng
[0069] foiase Free d出0 up to lOuL
[0070] 轻柔混合混匀，置于37°C反应15分钟，然后置于85°C加热5秒钟灭活逆转录酶。
[0071] 3)巧光定量RT-PCR检测
[0072] 利用1:akara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反应，反应体系如下， SYB民 Premix Ex TaqiOuL Forward Primer 化4.l山 民evers Primer 化4.uL
[0073] DNA 模板 2)iL 加2〇 7.2.UL Total 2 Ou L
[0074] 利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，95°C预变性2min，进行40个PCR循 环，95°C5 秒，60°C30 秒。
[007引 3细胞毒性实验
[0076] 采用CCK-8方法检现赠染SiRNA后对细胞增殖的影响，具体步骤如下：
[OOW]收集对数生长期细胞，W每孔3000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜贴壁后，转 染各SiRNA,培养48小时后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基，每孔加入含10化CCK-8的 新鲜培养基11化L，培养化后用多功能酶标仪在45化m波长检测各孔吸光度值。实验独立重 复3次，计算平均值。
[007引 4 EV71病毒感染甜-SY5Y细胞
[0079] 4.1 SH-SY5Y细胞的EV71病毒感染实验
[0080] SH-SY5Y细胞转染RNA后72小时，进行EV71病毒感染实验。将培养上清吸出，用预溫 PBS润洗2次，WMOI=O. 1的病毒量接种EV71，37°C解育化后弃去病毒液，并用预溫PBS润洗3 次，加入新鲜培 养基继续培养。
[0081 ] 4.2免疫巧光染色检测EV71抗原表达
[0082] SH-SY5Y细胞感染病毒后继续培养4她，采用免疫巧光法检测病毒抗原的表达，具 体步骤如下；
[0083] 1)细胞固定:将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入10化1预 冷甲醇，于-20°C条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。
[0084] 2)透膜：固定后的细胞每孔加入10化1 0.1%化^〇诚-100，室溫解育15111111，用预 冷PBS洗涂3次。
[00化]3)封闭：每孔加入10化1 3%BSA，于室溫下解育化。
[0086] 4)-抗解育：每孔加入EV71特异性鼠源单抗IOFOQ :2000稀释HOOiil，室溫解育 Ih，用预冷的PBS洗涂3次。
[0087] 5)二抗解育:每孔加入AF 488巧光标记抗鼠 IgGd :1000稀释HOOyl，室溫避光解 育化，用预冷的PBS避光洗涂2次。
[0088] 6)标记细胞核:每孔加入细胞核巧光染料DAPI (1: 5000，PBS稀释），室溫避光解育 15min，用预冷的PBS避光洗涂3次。
[0089] 7)巧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞克隆数。
[0090] 4.3蛋白免疫印迹。
[0091] (1)用蛋白裂解液分别提取对照组与D醒1干扰组甜-SY5Y细胞的总蛋白。
[0092] (2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5%浓度的聚丙締酷胺凝胶中电泳，并 截取相应条带用电转仪转到PVD刊莫上。
[009引（3)蛋白的非特异性位点用5%的脱脂牛奶封闭，然后用面Ml抗体封闭，4°C过夜， 用TBST缓冲液洗=遍，洗去一抗。
[0094] (4)然后用HRP标记的二抗室溫解育2小时，继而用TBST缓冲液洗S遍。
[0095] (5)最后，利用显色液显色并拍照分析.
[0096] 4.4 RT-PCR检测细胞中EV71病毒量
[0097] SH-SY5Y细胞感染病毒后继续培养4她，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总 RNA，并逆转录获得CDNA，通过RT-PCR检测EV71病毒量。具体步骤同2.2所示。
[009引实验结果；
[0099] 1设计、合成并筛选有效的SiRNA
[0100] 针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰祀点序列，并利用设计软件进行 预评估测定，选择3个最佳的动力学参数祀点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰 序列，如表1所示。
[0101] 采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到SH-SY5Y细胞中去，4化后通过 RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳的S iRNA序列(表2中加粗序 列)进行后续实验，其干扰效率如表2所示。
[0102] 表2 RT-PCR法检测SiRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率
[0103]
[0105] 注:CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）
[0106] NT:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）
[0107] SiRNA:转染针对各目的基因的SiRNA的SH-SY5Y细胞组(实验组）。
[0108] 2 SiRNA干扰后的干扰效率W及细胞毒性检测
[0109] 挑选出的针对各宿主分子的有效SiRNA转染細-SY5Y细胞，转染后4她通过RT-PCR 法检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后对SH-SY5Y细胞毒性的影响。
[0110] 结果如图1所示，转染有效SiRNA组与c?i且相比，转染各SiRNA后能够明显抑制相 应基因的表达水平(p<0.01)。转染D醒I siRNA(SEQ ID N0:6)的抑制效率可达到77%。
[0111] 细胞毒性实验表明，各SiRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P>0.05)，对细 胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。
[0112] 3 SiRNA干扰后对EV71病毒感染的影响
[0113] 转染各宿主分子的有效SiRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染相同剂量 的EV71病毒，感染4她后，采用免疫巧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，发现 与对照组相比，转染面Ml siRNA(SEQ ID N0:6)使D醒1基因下调后，明显降低了EV71对甜-SY5Y细胞的感染（图2A)。通过计算病毒量发现，DNMl基因下调后对病毒的抑制率达到 81.43%，而其余分子的下调并没有明显抑制EV71对SH-SY5Y细胞的感染(P>0.05)(图2B)。
[0114] 为明确D醒1对EV71感染的抑制作用，在转染D醒1分子SiRNA后，通过免疫印迹法检 测面Ml蛋白分子的表达，并在感染EV71后观察细胞病变情况，W及通过RT-PCR检测EV71病 毒量。结果显示，转染D醒1分子siRNA(SEQ ID N0:6)后，能够明显抑审化醒1蛋白分子的表达 (图3A)。与对照组相比，DNMl蛋白表达下调后，能够抑制细胞病变且細-SY5Y细胞中的病毒 量也显著下降（图3B，C)，与免疫巧光法检测结果相一致。运些结果表明，与对照细胞相比， 下调DNMl基因后EV71对SH-SY5Y细胞的感染能力明显下降，病毒量减少。
[0115] 进一步，分别转染S条D醒1分子的SiRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不同 的SiRNA对面Ml分子的下调效率不同（图4A)，其中SiRNA(SEQ ID NO: 6)的干扰效率最高，与 前面的结果相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发现，S条DNMl分子的SiRNA对病毒感 染的抑制率均可达到7 2 % W上，而且随着对D醒1分子的下调效率的增高，对EV71感染的抑 制率也在升高（图4B)，提示D醒1分子在EV71感染甜-SY5Y中发挥着重要作用。因此，面Ml可 作为抑制EV71对SH-SY5Y细胞感染的新的宿主祀点。
[0116] 通过W上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制EV71感染甜-SY5Y细胞的一个新 的宿主细胞分子D醒IdD醒1基因下调W后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71 对SH-SY5Y细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因 EV71感染所导致的神经系统损害 提供了新的祀点和治疗方案。
[0117] W上已对本发明创造的实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施 例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型 或替换，运些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 发动蛋白D匪1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。2. 发动蛋白D匪1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的发动蛋白D匪1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的 应用，其特征在于，所述的药物是指能够抑制或下调DNM1表达量的试剂。4. 根据权利要求3所述的发动蛋白D匪1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的 应用，其特征在于，所述的能够抑制或下调DW1表达量的试剂是·Μ1的siRNA、shRNA或包含 s iRNA、shRNA的重组载体。5. 根据权利要求1所述的发动蛋白D匪1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的 应用，其特征在于，所述的药物是D匪1的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自以下任一： CUCGAGAAUUUCGUAGGCAUlKSEQ ID N0:4)、 CUGAACGAAAGUUCUUCCUUU(SEQ ID N0:5)^ GAGAUCAGAUCGACACCUAUU(SEQ ID N0:6)〇6. 根据权利要求2所述发动蛋白MM1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用，其特 征在于，所述的药物是指能够抑制或下调DNM1表达量的试剂。7. 根据权利要求6所述的发动蛋白MM1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用，其 特征在于，所述的能够抑制或下调DNM1表达量的试剂是DNM1的s i RNA、shRNA或包含s i RNA、 shRNA的重组载体。8. 根据权利要求2所述发动蛋白MM1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用，其特 征在于，所述的药物是DNM1的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自以下任一： CUCGAGAAUUUCGUAGGCAUlKSEQ ID N0:4)、 CUGAACGAAAGUUCUUCCUUU(SEQ ID N0:5)^ GAGAUCAGAUCGACACCUAUU(SEQ ID N0:6)〇
【专利摘要】本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。本发明以人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞的宿主因子，从而保护中枢神经系统的功能。本发明通过实验发现发动蛋白1(dynamin1,DNM1)分子在EV71感染SH-SY5Y中发挥着重要的作用，下调DNM1的表达，能明显抑制EV71的感染。本发明提供了DNM1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。
【IPC分类】A61K48/00, A61P31/14, A61K31/7105
【公开号】CN105497918
【申请号】CN201510964583
【发明人】彭浩然, 朱勇喆, 朱耐伟, 徐庆强, 戚中田, 宋洪元
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月21日
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物医学技术领域，具体设及抗肠道病毒71型感染的新祀点及应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠道 A类病毒，是导致手足口病化and-foot-mouth disease，HFMD)的主要病原体之一。目前，手 足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市暴发手足 口病疫情W来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100万例，死 亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁W下婴幼儿，临床表现为发热，手、足、臀部W 及口腔粘膜等部位出现瘤疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神经系统 (central nervous system，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎W及神经源 性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon T,Lewthwaite P,Perera D,(^irdosa MJ,McMinn P,Ooi MH.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71 丄ancet Infect Dis.2010Nov;10(ll):778-90.]。手足口病特别是重症病 例多由肠道病毒71型化V71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异 高效的抗病毒药物，临床上仍W对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。
[0003] EV71感染具有嗜神经性，易造成严重的CNS疾病及其并发症，运也是导致手足口病 患者发展为重症甚至死亡的主要原因。其中，脑干是最易被EV71感染的部位[Tee，K.K.，et 曰1.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin,population dynamics, natural selection,and seasonal periodicity of the VPlgene.J Virol,2010.84(7): P. 3339-50.]，研究证实在EV71重症患者的脑干神经元等部位均能够检测到EV71基因及抗 原的存在，证明EV71能进入CNS。EV71经血液播散破坏血脑屏障或经周围神经途径逆向轴突 输送感染CNS。但EV71引起的中枢神经系统症状的机制尚不明确[Solomon T，Lewthwaite P,Perera D,Cardosa MJ,Mcminn P,Ooi MH.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71 丄ancet Infect Dis.2010; 10:778-90.]。神经母细胞瘤细胞 (甜-SY5Y)为神经组织来源，具有一定的神经细胞特性。因此，探明EV71感染甜-SY5Y的机制 并W此寻找新的抗病毒祀点，对于防治EV71所导致的中枢神经系统感染至关重要。
[0004] 为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系统完成对 宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此，作为病 毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要祀标。研究表明，EV71 可利用不同的宿主因子和感染途径来入侵不同种类的祀细胞，比如EV71感染化rkat T淋己 细胞系主要利用小窝依赖的内吞途径（caveolar-d邱endent endo巧tosis) [Lin HY,Yang YT,Yu SL,et al.Caveolar endocytosis is required for human PSGL-1-mediated enterovirus 71 inf ection. J Virol. 2013，87( 16): 9064-76.]。目前，关于EV71 感染細-SY5Y的途径及机制仍不清楚。
[000引病毒侵入祀细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，运些宿主细 胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞W及分泌中发挥着重要的作用。如 金属蛋白酶调节了细胞粘附，细胞膜分子的降解；小窝蛋白家族分子caveolin-l(CAVl)、 caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)将物质运输至高尔基体;Flotillin分子能够与脂俊 内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；发动蛋白I(DNMl)通过影响囊泡的重新利用在细胞 的内吞和突触囊泡循环中发挥重要作用;GTP酶激活蛋白分子GRAFl在网格蛋白非依赖型的 囊泡运输中具有重要的调节作用；白细胞介素2受体内吞调节了信号通路并影响了细胞增 歹直（Jason Mercer,Mario Schelhaas,et al.Virus Entry by Endocytosis.Annu Rev Biochem. 2010; 79:803-833.) eEzrin蛋白可通过酪氨酸激酶信号调节细胞微管系统，继而 调节了细胞黏附与迁徙等生理过程;Ezrin蛋白也被证实参与了丙型肝炎病毒感染肝细胞 的过程（Bukon邑 TN,Kodys K,Szabo G.Human ezrin-moesin-radixin proteins modulate hepatitis C virus infection.Hepatology.2013,58(5):1569-79.)。外被蛋白复合体 COPA(coatomer protein complex)参与了小泡介导非选择性运输,它参与从内质网到顺面 高尔基体的运输。在运些分子中，caveolin-1被证实参与了EV71感染化rkat T淋己细胞的 过程，而其它分子在EV71感染中的作用还未有报道。
[0006] 胞吞化11(1〇(3八0313)是细胞生理代谢的一个极为重要的过程，也是细胞从环境中 获取物质和回收膜组分的过程。发动蛋白（dynamin)家族是一类鸟巧酸S憐酸酶，是细胞在 进行内吞过程中特异的一种蛋白，它参与囊泡从细胞膜上出芽和剪切的过程。其中发动蛋 白UD醒1)特异性地分布在神经细胞中。现已证实面M 1通过水解GTP提供能量，使网格蛋白 包被的囊泡凹窝与突触前膜分离，最终回收至突触前膜重新利用从而在细胞内吞和突触囊 泡循环中发挥重要作用（Newton AJJirdihausen T,Mu;rthy VN. InMbition of dynamin completely blocks compensatory synaptic vesicle endocytosis.PNAS,2006,103 (47) :17955~17960)。现已证实D醒I在阿尔默茨海默症的发生发展中发挥作用(Brent LK, Robert V,Adriana F,et al.P-amyloid-induced dynamin !depletion in hippocampal neurons.A potential mechanism for early cognitive decline in Alzheimer disease[ J]. J Biol 化 em. 2005.280(36): 31746-31753.)。也有文献报 DNMl 可能通过憐酸 化/去憐酸化方式参与侧颠叶癒癖的发生发展(Cla^on EL，Anggono V，Smillie KJ，化au N,Robinson PJ,Cousin MA.The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles[J].J Neurosci,2009,29(24):7706-7717. )〇
[0007] 目前还没有任何关于D醒I分子在EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)中作用的研 究报道，对于DNMl分子进行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可W 为预防与治疗EV71感染提供新的思路与祀点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新祀点。
[0009] 本发明的另一目的在于提供发动蛋白I(DNMl)分子的新用途，特别是在抗肠道病 毒71型感染中的应用。
[0010]本发明的第S目的在于提供干扰DNMl分子表达的siRNA。
[0011]本发明的主要技术方案是：
[0012]本发明，W人神经母细胞瘤（SH-SY5Y)作为祀细胞，采用RNA干扰技术下调祀细胞 宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)的宿主因子，从而 预防神经系统感染与破坏。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运分子来进行筛选，运些分 子在宿主细胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它们往往也是在病 毒感染过程中易被病毒"劫持"并利用的分子。运些分子包括:金属蛋白酶lO(ADAMlO)、发动 蛋白 I(DNMl)、caveolin-l (CAVl)、caveolin-2(CAV2)、caveolin-3(CAV3)、Flotillin蛋白 1 巧LOTI)、GTP酶激活蛋白（GRAFl)、白细胞介素2受体（IL2RB)、化rin蛋白、外被蛋白复合体 (COPA)。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件 对运些基因进行生物学分析，选择编码区作为SiRNA设计的祀序列，然后设计SiRNA,通过下 调运些分子，来观察对EV71感染的影响。
[001引我们发现发动蛋白I(DNMl)在EV71感染甜-SY5Y中发挥着重要的作用，下调DNMl的 表达，能明显抑制EV71的感染。
[0014]本发明的第一方面，提供了发动蛋白I(DNMl)作为一种抗肠道病毒71型感染的新 祀点。
[001 引所述的发动蛋白 I(DNMl) ,GENBANK ID:NM_004408。
[0016] 本发明的第二方面，提供了发动蛋白I(DNMl)在制备预防或治疗肠道病毒71型感 染药物中的应用。
[0017] 进一步地，本发明还提供发动蛋白1(面Ml)在制备预防或治疗手足口病药物中的 应用。
[0018] 本发明所述的发动蛋白UD醒1)在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应 用，该药物具体是指能够抑制或下调DNMl的表达量的试剂。
[0019 ] 所述的抑制下调DNMl的表达量的试剂可W是S i RNA、ShRNA、包含S i RNA、ShRNA的重 组载体(如质粒)等。
[0020]本发明的第S方面，本发明提供了发动蛋白UD醒1)的干扰RNA在制备预防或治疗 肠道病毒71型感染药物中的应用，或发动蛋白1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用， 所述的药物为干扰RNA(SiRNA)，其序列如下：
[0024] 其中，W如SEQ ID N0:6所示的SiRNA下调面Ml的表达量效果最佳，且降低EV71对 SH-SY5Y细胞的感染最为明显。
[0025] 本发明筛选到能够抑制EV71感染細-SY5Y细胞的一个新的宿主细胞分子面Ml。 面M1基因下调W后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了 E V71对細-S Y5 Y细胞的感 染。
[0026] 因此本发明为临床预防和治疗因 EV71感染所导致的神经系统破坏提供了新的祀 点和治疗方案。
【附图说明】
[0027] 图1为转染有效SiRNA后的干扰效率及细胞毒性检测，图中主坐标轴表示干扰效 率，次坐标轴表示对细胞毒性的影响；
[002引 CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）；
[0029] NT:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）；
[0030] SiRNA:转染针对各目的基因的SiRNA的甜-SY5Y细胞组(实验组）。
[0031] 图2为免疫巧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，其中A为下调各分子 后对病毒感染性的巧光检测图，B为下调各分子后对病毒感染的抑制率图；
[0032] CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）；
[0033] NT:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）；
[0034] SiRNA:转染针对各目的基因的SiRNA的甜-SY5Y细胞组(实验组）。
[0035] 图3为D醒1下调后对EV71感染的影响，其中A为Western Blot检测DNMl蛋白的表达 图，B为观察EV71的细胞病变效应图，C为检测EV71病毒量图；
[0036] CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）；
[0037] NT-CTRl^:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）；
[003引 D醒1:转染针对D醒1基因的SiRNA(沈Q ID N0:6)的甜-SY5Y细胞组。
[0039] 图4为转染D醒1分子的不同干扰序列后的干扰效率及对EV71感染性的影响图，A为 D醒1基因的mRNA水平检测图，B为EV71病毒量检测图；
[0040] CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）；
[0041 ] NT-CTRl^:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）；
[0042] DNM1-4:转染针对DNMl基因的SiRNA(沈Q ID N0:4)的甜-SY5Y细胞组；
[0043] DNM1-5:转染针对DNMl基因的SiRNA(沈Q ID N0:5)的甜-SY5Y细胞组；
[0044] DNM1-6:转染针对DNMl基因的SiRNA(沈Q ID N0:6)的甜-SY5Y细胞组。
【具体实施方式】
[0045] 现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
[0046] 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具 体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南KNew York:Cold Spring化rbor LaboratoiT Press, 1989)中所述的条件，或按照常规条件，或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0047] 实施例1:
[0048] 1设计、合成各宿主细胞分子的特异性SiRNA序列。
[0049] 1.1针对各个目的基因，检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的 网络资源及常用软件对各目的基因进行生物学分析，选择编码区作为SiRNA设计的祀序列。 参照SiRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确 保无同源性;排除aitisense链的5'端连续8个碱基与其它基因配对的潜在SiRNA;排除任何 一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定，选择3 个最佳的动力学参数祀点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰序列，见表1。
[0050] 1.2单链SiRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。
[0051 ] 表1. SiRNA祀点的设计
[0052]
[0054] 2 SiRNA序列筛选与干扰效果鉴定
[005引 2.1 RNA 转染
[0056] 转染步骤参照Lipofectamine 2000说明书
[0057] 1)提前12-16小时将甜-SY5Y细胞(购自ATCC，保藏号:ATCC CRk2266)铺在24孔细 胞培养板上培养，使得转染时细胞密度为80 % -90 %。
[005引 2)取化化ipofectamine 2000加入50化opti-MEM中并轻柔混匀，室溫解育5分钟； 另取扣L浓度为扣M的干扰RNA和50化opti-MEM混合。解育结束后，将稀释的Lipofectamine 2000转染试剂加入稀释的RNA中，并轻柔吹吸混匀。室溫解育20min后，加入甜-SY5Y细胞中， 补加400化opti-MEM，使得RNA终浓度为50nM。
[0059] 3)转染后6-8小时更换含有双抗的新鲜培养基。
[0060] 2.2实时巧光定量PCR(RT-PCR)检测各宿主分子的mRNA水平
[0061 ] 1 )TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总RNA，具体步骤如下：
[0062] 转染48小时后，去培养上清，在细胞中加入1ml TRIzol,充分混合室溫裂解细胞3-5分钟。加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15秒。于4°C、12,000转离屯、15分钟。取上层水相 并转移到新的EP管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室溫沉淀10分钟。于4°C、12,000转离 屯、10分钟。弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇。于4°C、12,000离屯、5分钟。充分弃上清，室溫惊 干RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀，得到总RNA。
[0063] 2)利用化kara反转录试剂盒获取对照组与干扰组细胞的cDNA，具体步骤如下：
[0064] 在PCR管中加入如下反应体系，
[00巧]SXPrimeScript Buffer 化L
[0066] PrimeScript RT Enzyme Mix 0.化1
[0067] Random 6 mers 0.化1
[0068] Total RNA 500ng
[0069] foiase Free d出0 up to lOuL
[0070] 轻柔混合混匀，置于37°C反应15分钟，然后置于85°C加热5秒钟灭活逆转录酶。
[0071] 3)巧光定量RT-PCR检测
[0072] 利用1:akara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反应，反应体系如下， SYB民 Premix Ex TaqiOuL Forward Primer 化4.l山 民evers Primer 化4.uL
[0073] DNA 模板 2)iL 加2〇 7.2.UL Total 2 Ou L
[0074] 利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，95°C预变性2min，进行40个PCR循 环，95°C5 秒，60°C30 秒。
[007引 3细胞毒性实验
[0076] 采用CCK-8方法检现赠染SiRNA后对细胞增殖的影响，具体步骤如下：
[OOW]收集对数生长期细胞，W每孔3000个的密度接种于96孔板。待细胞过夜贴壁后，转 染各SiRNA,培养48小时后检测细胞增殖情况。弃去原有培养基，每孔加入含10化CCK-8的 新鲜培养基11化L，培养化后用多功能酶标仪在45化m波长检测各孔吸光度值。实验独立重 复3次，计算平均值。
[007引 4 EV71病毒感染甜-SY5Y细胞
[0079] 4.1 SH-SY5Y细胞的EV71病毒感染实验
[0080] SH-SY5Y细胞转染RNA后72小时，进行EV71病毒感染实验。将培养上清吸出，用预溫 PBS润洗2次，WMOI=O. 1的病毒量接种EV71，37°C解育化后弃去病毒液，并用预溫PBS润洗3 次，加入新鲜培 养基继续培养。
[0081 ] 4.2免疫巧光染色检测EV71抗原表达
[0082] SH-SY5Y细胞感染病毒后继续培养4她，采用免疫巧光法检测病毒抗原的表达，具 体步骤如下；
[0083] 1)细胞固定:将96孔板中的培养液移去，加入PBS清洗细胞2次，每孔加入10化1预 冷甲醇，于-20°C条件下固定20min，用预冷的PBS清洗细胞3次。
[0084] 2)透膜：固定后的细胞每孔加入10化1 0.1%化^〇诚-100，室溫解育15111111，用预 冷PBS洗涂3次。
[00化]3)封闭：每孔加入10化1 3%BSA，于室溫下解育化。
[0086] 4)-抗解育：每孔加入EV71特异性鼠源单抗IOFOQ :2000稀释HOOiil，室溫解育 Ih，用预冷的PBS洗涂3次。
[0087] 5)二抗解育:每孔加入AF 488巧光标记抗鼠 IgGd :1000稀释HOOyl，室溫避光解 育化，用预冷的PBS避光洗涂2次。
[0088] 6)标记细胞核:每孔加入细胞核巧光染料DAPI (1: 5000，PBS稀释），室溫避光解育 15min，用预冷的PBS避光洗涂3次。
[0089] 7)巧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞克隆数。
[0090] 4.3蛋白免疫印迹。
[0091] (1)用蛋白裂解液分别提取对照组与D醒1干扰组甜-SY5Y细胞的总蛋白。
[0092] (2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5%浓度的聚丙締酷胺凝胶中电泳，并 截取相应条带用电转仪转到PVD刊莫上。
[009引（3)蛋白的非特异性位点用5%的脱脂牛奶封闭，然后用面Ml抗体封闭，4°C过夜， 用TBST缓冲液洗=遍，洗去一抗。
[0094] (4)然后用HRP标记的二抗室溫解育2小时，继而用TBST缓冲液洗S遍。
[0095] (5)最后，利用显色液显色并拍照分析.
[0096] 4.4 RT-PCR检测细胞中EV71病毒量
[0097] SH-SY5Y细胞感染病毒后继续培养4她，采用TRIzol提取对照组与干扰组细胞的总 RNA，并逆转录获得CDNA，通过RT-PCR检测EV71病毒量。具体步骤同2.2所示。
[009引实验结果；
[0099] 1设计、合成并筛选有效的SiRNA
[0100] 针对各个目的基因序列，我们设计了多个RNA干扰祀点序列，并利用设计软件进行 预评估测定，选择3个最佳的动力学参数祀点进入后续实验流程，每一基因共合成3条干扰 序列，如表1所示。
[0101] 采用体外转染的方法，将各个基因的干扰RNA转染到SH-SY5Y细胞中去，4化后通过 RT-PCR法检测各干扰RNA的干扰效率，最终筛选到干扰效果最佳的S iRNA序列(表2中加粗序 列)进行后续实验，其干扰效率如表2所示。
[0102] 表2 RT-PCR法检测SiRNA干扰序列对相关宿主基因的下调效率
[0103]
[0105] 注:CTRL不转染任何SiRNA的SH-SY5Y细胞组(空细胞组）
[0106] NT:转染non-化巧eting SiRNA的甜-SY5Y细胞组（阴性对照组）
[0107] SiRNA:转染针对各目的基因的SiRNA的SH-SY5Y细胞组(实验组）。
[0108] 2 SiRNA干扰后的干扰效率W及细胞毒性检测
[0109] 挑选出的针对各宿主分子的有效SiRNA转染細-SY5Y细胞，转染后4她通过RT-PCR 法检测各干扰RNA的干扰效率，同时采用CCK8检测转染后对SH-SY5Y细胞毒性的影响。
[0110] 结果如图1所示，转染有效SiRNA组与c?i且相比，转染各SiRNA后能够明显抑制相 应基因的表达水平(p<0.01)。转染D醒I siRNA(SEQ ID N0:6)的抑制效率可达到77%。
[0111] 细胞毒性实验表明，各SiRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P>0.05)，对细 胞正常的生理功能未产生影响，可用于后续实验。
[0112] 3 SiRNA干扰后对EV71病毒感染的影响
[0113] 转染各宿主分子的有效SiRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后，感染相同剂量 的EV71病毒，感染4她后，采用免疫巧光法检测各宿主分子下调后对EV71感染的影响，发现 与对照组相比，转染面Ml siRNA(SEQ ID N0:6)使D醒1基因下调后，明显降低了EV71对甜-SY5Y细胞的感染（图2A)。通过计算病毒量发现，DNMl基因下调后对病毒的抑制率达到 81.43%，而其余分子的下调并没有明显抑制EV71对SH-SY5Y细胞的感染(P>0.05)(图2B)。
[0114] 为明确D醒1对EV71感染的抑制作用，在转染D醒1分子SiRNA后，通过免疫印迹法检 测面Ml蛋白分子的表达，并在感染EV71后观察细胞病变情况，W及通过RT-PCR检测EV71病 毒量。结果显示，转染D醒1分子siRNA(SEQ ID N0:6)后，能够明显抑审化醒1蛋白分子的表达 (图3A)。与对照组相比，DNMl蛋白表达下调后，能够抑制细胞病变且細-SY5Y细胞中的病毒 量也显著下降（图3B，C)，与免疫巧光法检测结果相一致。运些结果表明，与对照细胞相比， 下调DNMl基因后EV71对SH-SY5Y细胞的感染能力明显下降，病毒量减少。
[0115] 进一步，分别转染S条D醒1分子的SiRNA观察对病毒感染性的影响。结果表明不同 的SiRNA对面Ml分子的下调效率不同（图4A)，其中SiRNA(SEQ ID NO: 6)的干扰效率最高，与 前面的结果相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发现，S条DNMl分子的SiRNA对病毒感 染的抑制率均可达到7 2 % W上，而且随着对D醒1分子的下调效率的增高，对EV71感染的抑 制率也在升高（图4B)，提示D醒1分子在EV71感染甜-SY5Y中发挥着重要作用。因此，面Ml可 作为抑制EV71对SH-SY5Y细胞感染的新的宿主祀点。
[0116] 通过W上实验结果证明：本发明筛选到能够抑制EV71感染甜-SY5Y细胞的一个新 的宿主细胞分子D醒IdD醒1基因下调W后，不影响细胞正常的生理功能，但明显抑制了EV71 对SH-SY5Y细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因 EV71感染所导致的神经系统损害 提供了新的祀点和治疗方案。
[0117] W上已对本发明创造的实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施 例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型 或替换，运些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【主权项】
1. 发动蛋白D匪1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。2. 发动蛋白D匪1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的发动蛋白D匪1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的 应用，其特征在于，所述的药物是指能够抑制或下调DNM1表达量的试剂。4. 根据权利要求3所述的发动蛋白D匪1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的 应用，其特征在于，所述的能够抑制或下调DW1表达量的试剂是·Μ1的siRNA、shRNA或包含 s iRNA、shRNA的重组载体。5. 根据权利要求1所述的发动蛋白D匪1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的 应用，其特征在于，所述的药物是D匪1的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自以下任一： CUCGAGAAUUUCGUAGGCAUlKSEQ ID N0:4)、 CUGAACGAAAGUUCUUCCUUU(SEQ ID N0:5)^ GAGAUCAGAUCGACACCUAUU(SEQ ID N0:6)〇6. 根据权利要求2所述发动蛋白MM1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用，其特 征在于，所述的药物是指能够抑制或下调DNM1表达量的试剂。7. 根据权利要求6所述的发动蛋白MM1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用，其 特征在于，所述的能够抑制或下调DNM1表达量的试剂是DNM1的s i RNA、shRNA或包含s i RNA、 shRNA的重组载体。8. 根据权利要求2所述发动蛋白MM1在制备预防或治疗手足口病药物中的应用，其特 征在于，所述的药物是DNM1的干扰RNA，所述的干扰RNA的序列选自以下任一： CUCGAGAAUUUCGUAGGCAUlKSEQ ID N0:4)、 CUGAACGAAAGUUCUUCCUUU(SEQ ID N0:5)^ GAGAUCAGAUCGACACCUAUU(SEQ ID N0:6)〇
【专利摘要】本发明涉及生物医学技术领域，是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。本发明以人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞的宿主因子，从而保护中枢神经系统的功能。本发明通过实验发现发动蛋白1(dynamin1,DNM1)分子在EV71感染SH-SY5Y中发挥着重要的作用，下调DNM1的表达，能明显抑制EV71的感染。本发明提供了DNM1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。
【IPC分类】A61K48/00, A61P31/14, A61K31/7105
【公开号】CN105497918
【申请号】CN201510964583
【发明人】彭浩然, 朱勇喆, 朱耐伟, 徐庆强, 戚中田, 宋洪元
【申请人】中国人民解放军第二军医大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月21日
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