miR-506在制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用
miR-506在制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药物 中的应用。
【背景技术】
[0002] 根据最新流行病学调查，膜腺癌位居欧美等发达国家恶性肿瘤死亡率第四位，全 球每年约250万人死于膜腺癌。近20年来我国膜腺癌的发病率持续增高，目前膜腺癌位居恶 性肿瘤死亡率第五位。在膜腺癌的治疗中，外科手术、化疗及放疗等手段的疗效均不尽人 意，其术后1年生存率不到20%，5年生存率仅为4%。因此，发现一种特有的、可用于早期诊 断和预后的标记物和祀向分子，对于战胜膜腺癌具有重要意义。
[0003] microRNAs(miRNAs)是近年来发现的一种长约22个核巧酸的内源性非编码RNA，可 与目的基因3'UTR结合降解mRNA和(或)抑制其翻译，在转录后调控基因表达。人类基因组中 目前已经被鉴定的miRNA数目在1000个W上，miRNA具有高度保守性，在个体生长发育W及 包括肿瘤在内的多中疾病的发生发展过程中发挥重要作用。最近的许多研究发现miRNA参 与肿瘤细胞的增殖、调亡、分化、耐药及侵袭转移，与肿瘤的发生和发展密切相关。
[0004] 研究表明，在不同的肿瘤中，miR-506的功能不尽相同。miR-506在径喜树碱耐药的 结肠癌细胞中高表达，miR-506的过表达可W下调PPARa提高癌细胞的耐药性。在黑色素瘤 中，miR-506可W启动黑色素细胞的恶性转化、促进黑色素瘤的生长。相反，在恶性转化后的 人支气管上皮细胞（16皿E-T)中miR-506低表达;过表达miR-506后可W抑制细胞增殖，诱导 G0/G1细胞周期阻滞，明显抑制细胞的错定非依赖生长W及裸鼠移植瘤模型的生长。但miR-506 在调节膜腺癌的的表达及临床相关性， W 及它所发挥的作用和分子机制仍未见报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药 物中的应用;本发明的目的之二在于提供miR-506与吉西他滨联合用于制备预防或/和治疗 膜腺癌的药物中的应用;本发明的目的之S在于提供检测miR-506的试剂在制备诊断和预 示膜腺癌试剂盒中的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] l、miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药物中的应用。
[000引进一步，所述miR-506在制备抑制膜腺癌细胞增殖的药物中的应用。
[0009] 进一步，所述miR-506在制备抑制膜腺癌成瘤能力的药物中的应用。
[0010] 进一步，所述miR-506在制备诱导膜腺癌细胞细胞周期阻滞的药物中的应用。
[0011] 进一步，所述miR-506在制备诱导膜腺癌细胞调亡的药物中的应用。
[0012] 2、miR-506与吉西他滨联合用于制备预防或/和治疗膜腺癌的药物中的应用。
[OOU] 3、检测miR-506的试剂在制备诊断和预示膜腺癌试剂盒中的应用，miR-506在膜腺 癌中明显低表达。
[0014] 进一步，所述诊断和预示为评估膜腺癌预后效果，miR-506低表达的膜腺癌患者预 后差。
[0015] 本发明的有益效果在于:本发明通过对miR-506在膜腺癌、癌旁组织和正常膜腺表 达进行分析，发现在膜腺癌组织及膜腺癌细胞中miR-506明显低表达，临床分析显示miR-506 低表达的膜腺癌患者预后差，因此 miR-506 可 W 作为诊断和预示膜腺癌的标志物。进一 步探索miR-506低表达的机制，发现miR-506启动子在癌组织中高甲基化，在癌旁及正常膜 腺组织中低甲基化，并且甲基化水平和miR-506表达呈负相关;用去甲基化试剂处理膜腺癌 细胞株后发现miR-506表达上调，表明甲基化可能是miR-506低表达的主要原因，临床分析 还发现高甲基化与膜腺癌患者预后负相关。
[0016] 通过在膜腺癌细胞中过表达miR-506发现miR-506miR-506显著抑制膜腺癌细胞增 殖抑制裸鼠皮下成瘤能力，降低Ki-67表达，流式检测表明miR-506诱导膜腺癌细胞细胞周 期阻滞和调亡，调亡标志物cleaved-PARP和caspase-3在过表达miR-506组中明显上调，因 此miR-506可W作为预防和治疗膜腺癌的药物;通过细胞存活实验还发现miR-506增强膜腺 癌细胞对吉西他滨的敏感性，因此miR-506可W与吉西他滨联合用药，提高吉西他滨的治疗 效果。进一步对治疗或预防膜腺癌的机制进行研究发现，miR-506和SP皿1的表达在细胞株 及膜腺癌组织中呈负相关，miR-506还可W下调PI3K/AKT通路下游相关分子表达，表明miR-506通过SPHK1/PI3K/AKT信号通路抑制膜腺癌生长，促进细胞周期阻滞和调亡，为膜腺癌的 治疗提供了新的标志物，对临床膜腺癌的诊断和治疗具有重要意义。
【附图说明】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0018] 图1为膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506表达结果(a.膜腺癌与癌旁组 织比较结果，Aj表示癌旁组织，T表示膜腺癌组织;b.正常组织与膜腺癌组织比较结果，N表 示正常组织，T表示膜腺癌组织;C.生存分析结果）。
[0019] 图2为膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506启动子甲基化检测结果(a.癌 旁组织与膜腺癌组织比较结果，Aj表示癌旁组织，T表示膜腺癌组织;b.正常组织与膜腺癌 组织比较结果，N表示正常组织，T表示膜腺癌组织;C.甲基化水平与miR-506表达分析结果； d.焦憐酸测序代表图）。
[0020] 图3为去甲基化试剂处理膜腺癌细胞株对miR-506表达的影响及临床生存分析结 果(a.去甲基化试剂处理膜腺癌细胞株与未处理细胞株miR-506表达情况;b.临床生存分析 结果）。
[0021] 图4为细胞增殖、成瘤能力和细胞周期实验结果(a和b为miR-506过表达细胞膜腺 癌细胞增殖实验结果;C和d为miR-506过表达细胞成瘤能力检测结果;e和f为流式细胞术检 ^UmiR-506过表达细胞膜腺癌细胞细胞周期结果）。
[0022] 图5为细胞调亡实验结果(a和b为流式细胞述检测miR-506诱导膜腺癌细胞调亡结 果；C和d为过表达miR-506对吉西他滨的敏感性实验；e为Western blot检测示过表达miR-506 细胞中 cleaved-PARP 和 caspase-3 表达情况 ）。
[0023] 图6为检测miR-506与SP服1作用（a.正常膜腺细胞株册C-Y5和人膜腺癌细胞株 AsPC-I ,CFPAC-I，Hs766t，PANC-l，BxPC-3的miR-506基因与SPHKl蛋白表达结果；b.miR-506 基因与SPHKl蛋白的线性关系）。
[0024]图7为双巧光素酶报告实验结果(a.野生型和突变型SP皿13'-UTR序列比对图；b. 双巧光素酶报告实验示巧光表达情况）。
[00巧]图8为Western blot检测PI3K/AKT通路下游相关分子表达情况。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 本发明中膜腺癌及癌旁组织从第=军医大学西南医院肝胆外科取得，正常膜腺组 织从器官捐献者获取，手术取出后，组织块W生理盐水冲洗干净，迅速将组织切成小块，部 分样品放入2mL冻存管中与液氮中保存备用。
[00%] -、膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506表达情况
[0029] 首先根据miR-506基因序列：71-uaaggcacc州ucugaguaga-91(SEQ ID NO. 1)，设计 检测miR-506的引物，具体引物序列如下：5'-taaggcacccttctgagtaga-3'（SEQ ID N0.2)， 然后分别取膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织，提取总RNA，反转为cDNA后获得的cDNA为模 板，SEQ ID NO.2所示引物为模板进行RT-qPCR检测miR-506表达情况，结果如图1所示。结果 显示，与癌旁组织相比，miR-506在膜腺癌中低表达（图1中a);与正常膜腺癌组织相比，miR-506 在膜腺癌中低表达(n=84)( 图1 中b);进一步临床生存分析表明miR-506 低表达患者较 miR-506高表达患者预后差（图1中C)。上述结果表明miR-506可W作为区分膜腺癌与正常膜 腺组织W及膜腺癌患者预后标志物。
[0030] 其中提取总RNA方法如下：取约IOOmg组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的化izol (I^KaRa，大连)溶液，研磨组织后，倒1.5m化P管中，再在研磨器内加入0.8ml的化iZOl溶液 洗，后全部再倒入EP管中；颠倒混匀10下，室溫（18~25°C)静置5分钟。分离阶段：每1ml 化izol中加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室溫（18~ 25°C)静置5分钟后12000rmp离屯、15分钟；然后将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-SOOjil)，加入0.5ml异丙醇，混匀后放于室溫（18~25°C)3分钟后ISOOOrmp离屯、10分钟；小屯、 倒掉上清，留取沉淀，加 Iml现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涂RNA沉淀一次，后7500rmp离 屯、5分钟，小屯、倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约20分钟，此时RNA沉淀变透 明）；操作时不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性），再在管中加20iU的DEPC 水溶解，在55-60°C下解育10分钟助溶。RNA的保存提取的RNA保存于-70°C超低溫冰箱中，或 立即用于逆转录。
[0031 ] RT-qPCR检测方法如下：miRNA反转录应用PrimeScript RT reagent kit (hKaRa)，WcDNA为模板，使用miR-506特定的引物及SYBR Premix Ex hq II(TaKaRa)试 剂盒的PCR体系，在Stratagene Mx3000P PCR仪（Agilent Technologies,San1:a Clara,CA, USA)上进行扩增，反应条件为:95°C30s;95°C5s、60°C30s，共40个循环，并WU6作内参，正向 引物序列：5'-。1:。邑。1:1:。邑邑。曰邑。曰。曰-3'（56〇10^.6);反向弓|物序列：5'-aacgcttcacgaatttgcgt-3'（沈Q ID N0.7)。
[0032] 二、检测miR-506启动子区CpG岛的甲基化状态
[0033] 为探索了miR-506低表达的机制，采用亚硫酸氨盐转化焦憐酸测序的方法检测膜 腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506启动子区CpG岛的甲基化状态。焦憐酸测序按上 海生工生物技术有限公司试验方法参照说明书进行，基本流程通过亚硫酸氨盐处理基因组 DNA，使其中未甲基化的C转变成T后，运用特异性引物扩增目的区段，然后用焦憐酸测序技 术测定目标位点中C/T的比率，W此判断目标位点的甲基化程度。其中扩增引物如下：正向 5'一t曰邑t曰t邑邑11邑曰t邑邑t邑邑t邑邑t曰一3'（SEQ ID NO.3)，& S 5'一biOtin- actcaataataaatcaactcatacaacc-3'（SEQ ID 則.4);测]序弓|物：5'-gtggtggtattgattattt1:aat-3'（沈Q ID N0.5)，检测结果如图2所示。由图2可知，miR-506启 动子在癌组织中高甲基化，在癌旁及正常膜腺组织中低甲基化（图2中a和b);然后分析甲基 化与甲基化的相关性，显示甲基化水平和miR-506表达呈负相关（图2中C和d)。[0034] 然后检测膜腺癌细胞株miR-506启动子区CpG岛的甲基化状态，人膜腺癌细胞株 AsPC-I，PANC-I，BxPC-3，Hs76化和CFPAC-I购自 ATCC(MANASSAS，USA)，人正常膜腺上皮细胞 HPC-Y5购自中科院。PANC-I，Hs766t，CFPAC-I和HPC-Y5细胞培养在DMEM高糖培养基中 (Gibico) ,AsPC-I和BxPC-3培养在1640培养基(Gibico)中。上述培养基均含有10 %的FBS (G化ico)，1 %的双抗(含lOOu/ml青霉素，lOOng/ml链霉素，碧云天）。所有细胞放于37°C培 养箱，5 %C02，用化M的去甲基化试剂5-氮杂-2 ' -脱氧胞巧（5-aza-CdR，Sigma，USA)处理膜 腺癌细胞72小时，然后RT-qPCR检测去甲基化处理细胞的miR-506表达情况，同时W未加去 甲基化试剂的细胞作为对照，并分析临床生存情况，结果如图3所示。结果显示，去甲基化试 剂处理膜腺癌细胞株后发现miR-506表达上调（图3中a)，表明甲基化可能是miR-506低表达 的主要原因；临床生存分析还发现高甲基化与膜腺癌患者预后负相关(图3中b)。
[0035] S、miR-506对膜腺癌细胞增殖，细胞周期，调亡和耐药的影响
[0036] 1、细胞增殖实验
[0037] 在96孔板中分别接种等量的（约1*103个)miR-506过表达AsPC-I细胞和对照细胞 悬液（IOOy 1/孔），将培养板放在培养箱中预培养(37°C，5 %C〇2)，向每孔加入1 Oiil CCK8溶 液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数），解育1-4小时后，用酶标仪测定在 450nm处的吸光度，用GraphPad Prism v6统计分析各组数据，结果如图4中a和b所示。结果 显示，miR-506显著抑制膜腺癌细胞增殖。
[0038] 2、成瘤能力实验
[0039] 首先制备miR-506过表达AsPC-I细胞，具体方法如下:将40化1去核酸酶水加入管 中，震荡 10秒钟，溶解 1 ipofectamine2000(Invihogen)，然后与miR-506mimic混合，荡后在 加入转染试剂，再次震荡，将混合液在室溫放置10-15分钟；同时按照上述方法培养细胞，然 后吸去培养板中的培养基，用PBS清洗一次，加入混合液，将细胞放回培养箱中培养6-8小 时，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
[0040] 然后miR-506过表达细胞接种于裸鼠右侧蔽下，实验裸鼠为4-6周龄雌性裸鼠，由 第=军医大学大坪医院动物所提供，标准条件饲养。接种方法采用常规消化细胞脱壁后稀 释为细胞悬液，计数，1 X IO6/只接种于裸鼠右侧蔽下miR-506过表达细胞和AsPC-I细胞作 为对照组，一个月后观察检测成瘤情况，结果如图4中C所示。结果显示，miR-506过表达细胞 成瘤能力低于对照组，表明miR-506能够抑制裸鼠皮下成瘤能力。然后通过免疫组化检测 Ki-67蛋白的表达量，结果如图4中d所示。结果显示，miR-506过表达细胞Ki-67表达量低于 对照组，表明miR-506能够抑制Ki-67表达。
[0041] 3、细胞周期实验
[0042] 按照miR-506过表达AsPC-I细胞的制备方法，制备miR-506过表达PANC-I细胞。然 后流氏细胞检测miR-506过表达AsPC-I细胞和miR-506过表达AsPC-I细胞的细胞周期，具体 方法如下:收集对数生长期细胞，计数，W (1~5) X 105/孔接种于6孔板，置37°C，5 % C〇2条件 下培养过夜，使细胞贴壁。各组转染细胞培养48小时后中止培养，膜酶消化后，收集细胞于 流式管lOOOr/min离屯、5min，弃上，冷PBS洗涂细胞3次，离屯、去上清;一边震荡一边向细胞沉 淀中加入体积分数为70%预冷乙醇混匀，4°C固定1她W上；离屯、，弃去乙醇上清，加入预冷 的PBS洗沉淀1次，离屯、去上清;加入RNA酶(50mg/L)10iil/孔和PK50mg/L)300山/孔，震荡混 匀，室溫、避光反应30min;流式细胞仪进行DNA检测，用Modif it软件（BD Bioscience, Sparks,MD, USA)分析各时相细胞周期的比例，结果如图4中e和f所示。结果显示，miR-506过 表达AsPC-I细胞和miR-506过表达AsPC-I细胞较对照组G0/G1期细胞比例增多，而S期细胞 比例减少，表明miR-506诱导膜腺癌细胞细胞周期阻滞。
[0043] 4、细胞调亡实验
[0044] 将细胞用不含抓TA的膜酶消化收集(注:膜酶消化时间不易过长，否则容易引起假 阳性）；用PBS洗涂细胞二次(2000rpm离屯、5min)收集1~5X105细胞;加入SOOiil的Binding Buffer(凯基，南京）悬浮细胞；加入扣1 Annexin V-FITC(凯基，南京）混匀后，加入化1 Propidium Iodide(凯基，南京），混匀；室溫、避光、反应5~15min后进行流式细胞仪的检测 miR-506过表达AsPC-I细胞和miR-506过表达AsPC-I细胞的调亡，结果如图5中a和b所示。结 果显示，miR-506过表达AsPC-I细胞和miR-506过表达AsPC-I细胞调亡率高于对照组，表明 miR-506能够诱导膜腺癌细胞调亡。
[0045] 为了进一步验证miR-506对膜腺癌细胞调亡的影响，将生长至对数生长期的miR- 506 过表达 AsPC-I 细胞和 miR-506 过表达 AsPC-I 细胞分别用浓度为 和 200iiM 的吉西他滨处理，然后检测细胞的存活率，结果如图5中C和d所示。结果显示，随着吉西他滨 的浓度增加实验组和对照组细胞的存活率均呈下降趋势，但是miR-506过表达AsPC-I细胞 比对照AsPC-I细胞下降速度更为明显，表明miR-506能够增强膜腺癌细胞对吉西他滨的敏 感性。
[0046] 为了证明细胞存活率下降是由细胞调亡机制引起的，通过Western blot检测miR-506 过表达 AsPC-I 细胞和 miR-506 过表达 AsPC-I 细胞调亡标志物 Cleaved-PARP 和 caspase-3 的表达量，结果如图5中e所示。结果显示，miR-506过表达AsPC-I细胞比对照AsPC-I细胞调 亡标志物cleaved-PARP和caspase-3表达明显上调。
[0047] 四、验证miR-506作用于SPWl
[004引分别取人正常膜腺细胞株册C-Y5和人膜腺癌细胞株AsPC-I ,CFPAC-I，Hs766t， PANC-I，BxPC-3，提取总RNA然后检测miR-506基因情况和SPHKl蛋白表达情况，结果如图6中 a和b所示。结果显示，miR-506与SPHKl表达呈负相关，表明miR-506可能直接作用于SPHKl。 然后采用巧光素酶检测miR-506过表达对SP皿1的影响，具体方法如下:将野生型和突变型 SPHK13'-UTR(图7中a)插入pGL3载体Xba I and Fse I位点（吉凯，上海）；肥K293T细胞转染 miR-5061entivirus和对照，然后用Lipofectamine LTX(Invitrogen,CamariIlo,CA,USA) 再共转50ng pGLSvector和IOng P化-TK vector。巧光素酶检测：将Luciferase Assay Buffer lKpromega)完全加入到Luciferase Assay Substrate瓶中，完全溶解底物，形成 Luciferase Assay Reagent,分装保存于-80°C，一年内有效；裂解细胞前，将化ssive Lysis Buffer 5 X使用D-Hanks稀释配制成化ssive Lysis Buffer IX;吸去24孔板中培 养基，加入300ul的化SSive Lysis Buffer IX，放至4°C冰箱反应20min左右W待细胞充分 裂解，吹打混匀，放至-80°C超低溫冰箱过夜使其裂解更加彻底。上机检测前，提前将Stopfe Glo? Buff er放于室溫下溶解、平衡，将Stop&Glo? Substrate 50 X加入到Stop&Glo⑩ Buffer中，使其充分溶解，形成稀释成Stop&Glo⑥Substrate 1 X Reagent eStop&创0⑥ Substrate 1 X Reagent需要现配现用，配好的Stop&Glo愈 Substrate 1 X Reagent在常溫下 48小时内有效。常溫下溶解前面步骤中的细胞裂解液，吸取20]11于1〇。1^611111曰义13〇巧检测 板中，加入40ul Luciferase Assay Reagent,震荡混匀后立即使用酶标仪检测firefly luminescence。检测firefIy luminescence后，再在每孔中加入40]il Stop& Glo愈Reagent， 震荡混匀后立即使用酶标仪检测Reni I la luminescence,结果如图7中b所示。结果显示，巧 光在转染野生型SP皿13'-171如勺11111?-506过表达的细胞中显著下调，表明11111?-506可^直接 与SP服13 '-UTR结合下调SP服1。
[0049] 最后利用Western blot检测miR-506过表达AsPC-I细胞PI3K/AKT通路相关分子的 表达情况，包括SP服1，P-AKT，Akt，p-lKBa，IkBq，NF-kB和Bcl2，同时Wgapdh为对照，结果如 图8所示。结果表明miR-506可W通过调控PI3K/AKT通路，下调下游相关分子。
[0050] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. miR-506在制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述miR-506在制备抑制胰腺癌细胞增殖 的药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述miR-506在制备抑制胰腺癌成瘤能力 的药物中的应用。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述miR-506在制备诱导胰腺癌细胞细胞 周期阻滞的药物中的应用。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述miR-506在制备诱导胰腺癌细胞凋亡 的药物中的应用。 6. miR-506与吉西他滨联合用于制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用。7. 检测miR-506的试剂在制备诊断和预示胰腺癌试剂盒中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为评估胰腺癌预后效果。
【专利摘要】本发明公开了miR-506在制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用，首次将miR-506作为胰腺癌的标志物，证实了miR-506表达在人胰腺癌组织和细胞中均显著下调，其原因是由于基因启动子CpG岛甲基化所致；同时也证实胰腺癌中SPHK1是miR-506的直接作用靶标，过表达miR-506通过SPHK1/PI3K/AKT信号通路抑制胰腺癌生长，促进细胞周期阻滞和凋亡，提高对吉西他滨化疗的敏感性，进一步临床相关性分析表明miR-506能作为胰腺癌预后检测的标志物；对胰腺癌的诊断和治疗具有重要意义。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/7068, A61K48/00, A61K31/7088
【公开号】CN105497919
【申请号】CN201510975322
【发明人】李健, 王槐志
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月22日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药物 中的应用。
【背景技术】
[0002] 根据最新流行病学调查，膜腺癌位居欧美等发达国家恶性肿瘤死亡率第四位，全 球每年约250万人死于膜腺癌。近20年来我国膜腺癌的发病率持续增高，目前膜腺癌位居恶 性肿瘤死亡率第五位。在膜腺癌的治疗中，外科手术、化疗及放疗等手段的疗效均不尽人 意，其术后1年生存率不到20%，5年生存率仅为4%。因此，发现一种特有的、可用于早期诊 断和预后的标记物和祀向分子，对于战胜膜腺癌具有重要意义。
[0003] microRNAs(miRNAs)是近年来发现的一种长约22个核巧酸的内源性非编码RNA，可 与目的基因3'UTR结合降解mRNA和(或)抑制其翻译，在转录后调控基因表达。人类基因组中 目前已经被鉴定的miRNA数目在1000个W上，miRNA具有高度保守性，在个体生长发育W及 包括肿瘤在内的多中疾病的发生发展过程中发挥重要作用。最近的许多研究发现miRNA参 与肿瘤细胞的增殖、调亡、分化、耐药及侵袭转移，与肿瘤的发生和发展密切相关。
[0004] 研究表明，在不同的肿瘤中，miR-506的功能不尽相同。miR-506在径喜树碱耐药的 结肠癌细胞中高表达，miR-506的过表达可W下调PPARa提高癌细胞的耐药性。在黑色素瘤 中，miR-506可W启动黑色素细胞的恶性转化、促进黑色素瘤的生长。相反，在恶性转化后的 人支气管上皮细胞（16皿E-T)中miR-506低表达;过表达miR-506后可W抑制细胞增殖，诱导 G0/G1细胞周期阻滞，明显抑制细胞的错定非依赖生长W及裸鼠移植瘤模型的生长。但miR-506 在调节膜腺癌的的表达及临床相关性， W 及它所发挥的作用和分子机制仍未见报道。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药 物中的应用;本发明的目的之二在于提供miR-506与吉西他滨联合用于制备预防或/和治疗 膜腺癌的药物中的应用;本发明的目的之S在于提供检测miR-506的试剂在制备诊断和预 示膜腺癌试剂盒中的应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] l、miR-506在制备预防或/和治疗膜腺癌的药物中的应用。
[000引进一步，所述miR-506在制备抑制膜腺癌细胞增殖的药物中的应用。
[0009] 进一步，所述miR-506在制备抑制膜腺癌成瘤能力的药物中的应用。
[0010] 进一步，所述miR-506在制备诱导膜腺癌细胞细胞周期阻滞的药物中的应用。
[0011] 进一步，所述miR-506在制备诱导膜腺癌细胞调亡的药物中的应用。
[0012] 2、miR-506与吉西他滨联合用于制备预防或/和治疗膜腺癌的药物中的应用。
[OOU] 3、检测miR-506的试剂在制备诊断和预示膜腺癌试剂盒中的应用，miR-506在膜腺 癌中明显低表达。
[0014] 进一步，所述诊断和预示为评估膜腺癌预后效果，miR-506低表达的膜腺癌患者预 后差。
[0015] 本发明的有益效果在于:本发明通过对miR-506在膜腺癌、癌旁组织和正常膜腺表 达进行分析，发现在膜腺癌组织及膜腺癌细胞中miR-506明显低表达，临床分析显示miR-506 低表达的膜腺癌患者预后差，因此 miR-506 可 W 作为诊断和预示膜腺癌的标志物。进一 步探索miR-506低表达的机制，发现miR-506启动子在癌组织中高甲基化，在癌旁及正常膜 腺组织中低甲基化，并且甲基化水平和miR-506表达呈负相关;用去甲基化试剂处理膜腺癌 细胞株后发现miR-506表达上调，表明甲基化可能是miR-506低表达的主要原因，临床分析 还发现高甲基化与膜腺癌患者预后负相关。
[0016] 通过在膜腺癌细胞中过表达miR-506发现miR-506miR-506显著抑制膜腺癌细胞增 殖抑制裸鼠皮下成瘤能力，降低Ki-67表达，流式检测表明miR-506诱导膜腺癌细胞细胞周 期阻滞和调亡，调亡标志物cleaved-PARP和caspase-3在过表达miR-506组中明显上调，因 此miR-506可W作为预防和治疗膜腺癌的药物;通过细胞存活实验还发现miR-506增强膜腺 癌细胞对吉西他滨的敏感性，因此miR-506可W与吉西他滨联合用药，提高吉西他滨的治疗 效果。进一步对治疗或预防膜腺癌的机制进行研究发现，miR-506和SP皿1的表达在细胞株 及膜腺癌组织中呈负相关，miR-506还可W下调PI3K/AKT通路下游相关分子表达，表明miR-506通过SPHK1/PI3K/AKT信号通路抑制膜腺癌生长，促进细胞周期阻滞和调亡，为膜腺癌的 治疗提供了新的标志物，对临床膜腺癌的诊断和治疗具有重要意义。
【附图说明】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0018] 图1为膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506表达结果(a.膜腺癌与癌旁组 织比较结果，Aj表示癌旁组织，T表示膜腺癌组织;b.正常组织与膜腺癌组织比较结果，N表 示正常组织，T表示膜腺癌组织;C.生存分析结果）。
[0019] 图2为膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506启动子甲基化检测结果(a.癌 旁组织与膜腺癌组织比较结果，Aj表示癌旁组织，T表示膜腺癌组织;b.正常组织与膜腺癌 组织比较结果，N表示正常组织，T表示膜腺癌组织;C.甲基化水平与miR-506表达分析结果； d.焦憐酸测序代表图）。
[0020] 图3为去甲基化试剂处理膜腺癌细胞株对miR-506表达的影响及临床生存分析结 果(a.去甲基化试剂处理膜腺癌细胞株与未处理细胞株miR-506表达情况;b.临床生存分析 结果）。
[0021] 图4为细胞增殖、成瘤能力和细胞周期实验结果(a和b为miR-506过表达细胞膜腺 癌细胞增殖实验结果;C和d为miR-506过表达细胞成瘤能力检测结果;e和f为流式细胞术检 ^UmiR-506过表达细胞膜腺癌细胞细胞周期结果）。
[0022] 图5为细胞调亡实验结果(a和b为流式细胞述检测miR-506诱导膜腺癌细胞调亡结 果；C和d为过表达miR-506对吉西他滨的敏感性实验；e为Western blot检测示过表达miR-506 细胞中 cleaved-PARP 和 caspase-3 表达情况 ）。
[0023] 图6为检测miR-506与SP服1作用（a.正常膜腺细胞株册C-Y5和人膜腺癌细胞株 AsPC-I ,CFPAC-I，Hs766t，PANC-l，BxPC-3的miR-506基因与SPHKl蛋白表达结果；b.miR-506 基因与SPHKl蛋白的线性关系）。
[0024]图7为双巧光素酶报告实验结果(a.野生型和突变型SP皿13'-UTR序列比对图；b. 双巧光素酶报告实验示巧光表达情况）。
[00巧]图8为Western blot检测PI3K/AKT通路下游相关分子表达情况。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 本发明中膜腺癌及癌旁组织从第=军医大学西南医院肝胆外科取得，正常膜腺组 织从器官捐献者获取，手术取出后，组织块W生理盐水冲洗干净，迅速将组织切成小块，部 分样品放入2mL冻存管中与液氮中保存备用。
[00%] -、膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506表达情况
[0029] 首先根据miR-506基因序列：71-uaaggcacc州ucugaguaga-91(SEQ ID NO. 1)，设计 检测miR-506的引物，具体引物序列如下：5'-taaggcacccttctgagtaga-3'（SEQ ID N0.2)， 然后分别取膜腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织，提取总RNA，反转为cDNA后获得的cDNA为模 板，SEQ ID NO.2所示引物为模板进行RT-qPCR检测miR-506表达情况，结果如图1所示。结果 显示，与癌旁组织相比，miR-506在膜腺癌中低表达（图1中a);与正常膜腺癌组织相比，miR-506 在膜腺癌中低表达(n=84)( 图1 中b);进一步临床生存分析表明miR-506 低表达患者较 miR-506高表达患者预后差（图1中C)。上述结果表明miR-506可W作为区分膜腺癌与正常膜 腺组织W及膜腺癌患者预后标志物。
[0030] 其中提取总RNA方法如下：取约IOOmg组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的化izol (I^KaRa，大连)溶液，研磨组织后，倒1.5m化P管中，再在研磨器内加入0.8ml的化iZOl溶液 洗，后全部再倒入EP管中；颠倒混匀10下，室溫（18~25°C)静置5分钟。分离阶段：每1ml 化izol中加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室溫（18~ 25°C)静置5分钟后12000rmp离屯、15分钟；然后将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-SOOjil)，加入0.5ml异丙醇，混匀后放于室溫（18~25°C)3分钟后ISOOOrmp离屯、10分钟；小屯、 倒掉上清，留取沉淀，加 Iml现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涂RNA沉淀一次，后7500rmp离 屯、5分钟，小屯、倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约20分钟，此时RNA沉淀变透 明）；操作时不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性），再在管中加20iU的DEPC 水溶解，在55-60°C下解育10分钟助溶。RNA的保存提取的RNA保存于-70°C超低溫冰箱中，或 立即用于逆转录。
[0031 ] RT-qPCR检测方法如下：miRNA反转录应用PrimeScript RT reagent kit (hKaRa)，WcDNA为模板，使用miR-506特定的引物及SYBR Premix Ex hq II(TaKaRa)试 剂盒的PCR体系，在Stratagene Mx3000P PCR仪（Agilent Technologies,San1:a Clara,CA, USA)上进行扩增，反应条件为:95°C30s;95°C5s、60°C30s，共40个循环，并WU6作内参，正向 引物序列：5'-。1:。邑。1:1:。邑邑。曰邑。曰。曰-3'（56〇10^.6);反向弓|物序列：5'-aacgcttcacgaatttgcgt-3'（沈Q ID N0.7)。
[0032] 二、检测miR-506启动子区CpG岛的甲基化状态
[0033] 为探索了miR-506低表达的机制，采用亚硫酸氨盐转化焦憐酸测序的方法检测膜 腺癌、癌旁组织及正常膜腺组织中miR-506启动子区CpG岛的甲基化状态。焦憐酸测序按上 海生工生物技术有限公司试验方法参照说明书进行，基本流程通过亚硫酸氨盐处理基因组 DNA，使其中未甲基化的C转变成T后，运用特异性引物扩增目的区段，然后用焦憐酸测序技 术测定目标位点中C/T的比率，W此判断目标位点的甲基化程度。其中扩增引物如下：正向 5'一t曰邑t曰t邑邑11邑曰t邑邑t邑邑t邑邑t曰一3'（SEQ ID NO.3)，& S 5'一biOtin- actcaataataaatcaactcatacaacc-3'（SEQ ID 則.4);测]序弓|物：5'-gtggtggtattgattattt1:aat-3'（沈Q ID N0.5)，检测结果如图2所示。由图2可知，miR-506启 动子在癌组织中高甲基化，在癌旁及正常膜腺组织中低甲基化（图2中a和b);然后分析甲基 化与甲基化的相关性，显示甲基化水平和miR-506表达呈负相关（图2中C和d)。[0034] 然后检测膜腺癌细胞株miR-506启动子区CpG岛的甲基化状态，人膜腺癌细胞株 AsPC-I，PANC-I，BxPC-3，Hs76化和CFPAC-I购自 ATCC(MANASSAS，USA)，人正常膜腺上皮细胞 HPC-Y5购自中科院。PANC-I，Hs766t，CFPAC-I和HPC-Y5细胞培养在DMEM高糖培养基中 (Gibico) ,AsPC-I和BxPC-3培养在1640培养基(Gibico)中。上述培养基均含有10 %的FBS (G化ico)，1 %的双抗(含lOOu/ml青霉素，lOOng/ml链霉素，碧云天）。所有细胞放于37°C培 养箱，5 %C02，用化M的去甲基化试剂5-氮杂-2 ' -脱氧胞巧（5-aza-CdR，Sigma，USA)处理膜 腺癌细胞72小时，然后RT-qPCR检测去甲基化处理细胞的miR-506表达情况，同时W未加去 甲基化试剂的细胞作为对照，并分析临床生存情况，结果如图3所示。结果显示，去甲基化试 剂处理膜腺癌细胞株后发现miR-506表达上调（图3中a)，表明甲基化可能是miR-506低表达 的主要原因；临床生存分析还发现高甲基化与膜腺癌患者预后负相关(图3中b)。
[0035] S、miR-506对膜腺癌细胞增殖，细胞周期，调亡和耐药的影响
[0036] 1、细胞增殖实验
[0037] 在96孔板中分别接种等量的（约1*103个)miR-506过表达AsPC-I细胞和对照细胞 悬液（IOOy 1/孔），将培养板放在培养箱中预培养(37°C，5 %C〇2)，向每孔加入1 Oiil CCK8溶 液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数），解育1-4小时后，用酶标仪测定在 450nm处的吸光度，用GraphPad Prism v6统计分析各组数据，结果如图4中a和b所示。结果 显示，miR-506显著抑制膜腺癌细胞增殖。
[0038] 2、成瘤能力实验
[0039] 首先制备miR-506过表达AsPC-I细胞，具体方法如下:将40化1去核酸酶水加入管 中，震荡 10秒钟，溶解 1 ipofectamine2000(Invihogen)，然后与miR-506mimic混合，荡后在 加入转染试剂，再次震荡，将混合液在室溫放置10-15分钟；同时按照上述方法培养细胞，然 后吸去培养板中的培养基，用PBS清洗一次，加入混合液，将细胞放回培养箱中培养6-8小 时，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
[0040] 然后miR-506过表达细胞接种于裸鼠右侧蔽下，实验裸鼠为4-6周龄雌性裸鼠，由 第=军医大学大坪医院动物所提供，标准条件饲养。接种方法采用常规消化细胞脱壁后稀 释为细胞悬液，计数，1 X IO6/只接种于裸鼠右侧蔽下miR-506过表达细胞和AsPC-I细胞作 为对照组，一个月后观察检测成瘤情况，结果如图4中C所示。结果显示，miR-506过表达细胞 成瘤能力低于对照组，表明miR-506能够抑制裸鼠皮下成瘤能力。然后通过免疫组化检测 Ki-67蛋白的表达量，结果如图4中d所示。结果显示，miR-506过表达细胞Ki-67表达量低于 对照组，表明miR-506能够抑制Ki-67表达。
[0041] 3、细胞周期实验
[0042] 按照miR-506过表达AsPC-I细胞的制备方法，制备miR-506过表达PANC-I细胞。然 后流氏细胞检测miR-506过表达AsPC-I细胞和miR-506过表达AsPC-I细胞的细胞周期，具体 方法如下:收集对数生长期细胞，计数，W (1~5) X 105/孔接种于6孔板，置37°C，5 % C〇2条件 下培养过夜，使细胞贴壁。各组转染细胞培养48小时后中止培养，膜酶消化后，收集细胞于 流式管lOOOr/min离屯、5min，弃上，冷PBS洗涂细胞3次，离屯、去上清;一边震荡一边向细胞沉 淀中加入体积分数为70%预冷乙醇混匀，4°C固定1她W上；离屯、，弃去乙醇上清，加入预冷 的PBS洗沉淀1次，离屯、去上清;加入RNA酶(50mg/L)10iil/孔和PK50mg/L)300山/孔，震荡混 匀，室溫、避光反应30min;流式细胞仪进行DNA检测，用Modif it软件（BD Bioscience, Sparks,MD, USA)分析各时相细胞周期的比例，结果如图4中e和f所示。结果显示，miR-506过 表达AsPC-I细胞和miR-506过表达AsPC-I细胞较对照组G0/G1期细胞比例增多，而S期细胞 比例减少，表明miR-506诱导膜腺癌细胞细胞周期阻滞。
[0043] 4、细胞调亡实验
[0044] 将细胞用不含抓TA的膜酶消化收集(注:膜酶消化时间不易过长，否则容易引起假 阳性）；用PBS洗涂细胞二次(2000rpm离屯、5min)收集1~5X105细胞;加入SOOiil的Binding Buffer(凯基，南京）悬浮细胞；加入扣1 Annexin V-FITC(凯基，南京）混匀后，加入化1 Propidium Iodide(凯基，南京），混匀；室溫、避光、反应5~15min后进行流式细胞仪的检测 miR-506过表达AsPC-I细胞和miR-506过表达AsPC-I细胞的调亡，结果如图5中a和b所示。结 果显示，miR-506过表达AsPC-I细胞和miR-506过表达AsPC-I细胞调亡率高于对照组，表明 miR-506能够诱导膜腺癌细胞调亡。
[0045] 为了进一步验证miR-506对膜腺癌细胞调亡的影响，将生长至对数生长期的miR- 506 过表达 AsPC-I 细胞和 miR-506 过表达 AsPC-I 细胞分别用浓度为 和 200iiM 的吉西他滨处理，然后检测细胞的存活率，结果如图5中C和d所示。结果显示，随着吉西他滨 的浓度增加实验组和对照组细胞的存活率均呈下降趋势，但是miR-506过表达AsPC-I细胞 比对照AsPC-I细胞下降速度更为明显，表明miR-506能够增强膜腺癌细胞对吉西他滨的敏 感性。
[0046] 为了证明细胞存活率下降是由细胞调亡机制引起的，通过Western blot检测miR-506 过表达 AsPC-I 细胞和 miR-506 过表达 AsPC-I 细胞调亡标志物 Cleaved-PARP 和 caspase-3 的表达量，结果如图5中e所示。结果显示，miR-506过表达AsPC-I细胞比对照AsPC-I细胞调 亡标志物cleaved-PARP和caspase-3表达明显上调。
[0047] 四、验证miR-506作用于SPWl
[004引分别取人正常膜腺细胞株册C-Y5和人膜腺癌细胞株AsPC-I ,CFPAC-I，Hs766t， PANC-I，BxPC-3，提取总RNA然后检测miR-506基因情况和SPHKl蛋白表达情况，结果如图6中 a和b所示。结果显示，miR-506与SPHKl表达呈负相关，表明miR-506可能直接作用于SPHKl。 然后采用巧光素酶检测miR-506过表达对SP皿1的影响，具体方法如下:将野生型和突变型 SPHK13'-UTR(图7中a)插入pGL3载体Xba I and Fse I位点（吉凯，上海）；肥K293T细胞转染 miR-5061entivirus和对照，然后用Lipofectamine LTX(Invitrogen,CamariIlo,CA,USA) 再共转50ng pGLSvector和IOng P化-TK vector。巧光素酶检测：将Luciferase Assay Buffer lKpromega)完全加入到Luciferase Assay Substrate瓶中，完全溶解底物，形成 Luciferase Assay Reagent,分装保存于-80°C，一年内有效；裂解细胞前，将化ssive Lysis Buffer 5 X使用D-Hanks稀释配制成化ssive Lysis Buffer IX;吸去24孔板中培 养基，加入300ul的化SSive Lysis Buffer IX，放至4°C冰箱反应20min左右W待细胞充分 裂解，吹打混匀，放至-80°C超低溫冰箱过夜使其裂解更加彻底。上机检测前，提前将Stopfe Glo? Buff er放于室溫下溶解、平衡，将Stop&Glo? Substrate 50 X加入到Stop&Glo⑩ Buffer中，使其充分溶解，形成稀释成Stop&Glo⑥Substrate 1 X Reagent eStop&创0⑥ Substrate 1 X Reagent需要现配现用，配好的Stop&Glo愈 Substrate 1 X Reagent在常溫下 48小时内有效。常溫下溶解前面步骤中的细胞裂解液，吸取20]11于1〇。1^611111曰义13〇巧检测 板中，加入40ul Luciferase Assay Reagent,震荡混匀后立即使用酶标仪检测firefly luminescence。检测firefIy luminescence后，再在每孔中加入40]il Stop& Glo愈Reagent， 震荡混匀后立即使用酶标仪检测Reni I la luminescence,结果如图7中b所示。结果显示，巧 光在转染野生型SP皿13'-171如勺11111?-506过表达的细胞中显著下调，表明11111?-506可^直接 与SP服13 '-UTR结合下调SP服1。
[0049] 最后利用Western blot检测miR-506过表达AsPC-I细胞PI3K/AKT通路相关分子的 表达情况，包括SP服1，P-AKT，Akt，p-lKBa，IkBq，NF-kB和Bcl2，同时Wgapdh为对照，结果如 图8所示。结果表明miR-506可W通过调控PI3K/AKT通路，下调下游相关分子。
[0050] 最后说明的是，W上优选实施例仅用W说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可W在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. miR-506在制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述miR-506在制备抑制胰腺癌细胞增殖 的药物中的应用。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述miR-506在制备抑制胰腺癌成瘤能力 的药物中的应用。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述miR-506在制备诱导胰腺癌细胞细胞 周期阻滞的药物中的应用。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述miR-506在制备诱导胰腺癌细胞凋亡 的药物中的应用。 6. miR-506与吉西他滨联合用于制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用。7. 检测miR-506的试剂在制备诊断和预示胰腺癌试剂盒中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述诊断和预示为评估胰腺癌预后效果。
【专利摘要】本发明公开了miR-506在制备预防或/和治疗胰腺癌的药物中的应用，首次将miR-506作为胰腺癌的标志物，证实了miR-506表达在人胰腺癌组织和细胞中均显著下调，其原因是由于基因启动子CpG岛甲基化所致；同时也证实胰腺癌中SPHK1是miR-506的直接作用靶标，过表达miR-506通过SPHK1/PI3K/AKT信号通路抑制胰腺癌生长，促进细胞周期阻滞和凋亡，提高对吉西他滨化疗的敏感性，进一步临床相关性分析表明miR-506能作为胰腺癌预后检测的标志物；对胰腺癌的诊断和治疗具有重要意义。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/7068, A61K48/00, A61K31/7088
【公开号】CN105497919
【申请号】CN201510975322
【发明人】李健, 王槐志
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月22日
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