树鼩在制备阿尔茨海默病模型中的应用
树鼩在制备阿尔茨海默病模型中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及树駒在制备动物疾病模型中的应用，特别设及树駒在制备阿尔茨海默 病模型中的应用。
【背景技术】
[0002] 树駒（Tupaia belangeri)属树駒目树駒科树駒属的动物，分布在东南亚各国。在 中国大陆，分布于广西、海南、贵州、云南、四川、西藏等地，主要生活于热带和亚热带森林、 灌丛、村落附近。
[0003] 阿尔茨海默病(Alzheimer'S Disease,AD)是一种威胁人类健康的神经系统疾病。 目前对于AD的治疗还没有十分明确的方法。建立良好的AD动物模型，有助于对AD的病因病 机的认识，并可W指导AD的预防和治疗。目前的AD模型按动物种类划分主要有灵长类动物 模型和晒齿类动物模型两大类。灵长类动物模型价格十分昂贵，晒齿类动物模型则与人类 神经系统差别较大。建立一种费用相对低廉，但是比晒齿类动物更接近人类的动物模型对 于AD等神经系统疾病究很有意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何获得费用相对低廉，但是比晒齿类动物更接近 人类的阿尔茨海默病动物模型。
[0005] 为了解决W上技术问题，本发明提供了 W下技术方案：
[0006] S1、树駒、D-半乳糖、的定粉样蛋白l-42(A01-42)、碟膏葦氨酸（IBO)和戊己比妥钢 在制备阿尔茨海默病动物模型中的应用。
[0007] S2、树駒、D-半乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢在制备具有下述 至少一种特性的树駒疾病模型中的应用：
[000引1)胶质细胞增生；
[0009] 2)神经元纤维缠结；
[0010] 3)学习巧区能力下降。
[0011] S3、树駒在制备阿尔茨海默病动物模型中的应用。
[0012] S4、树駒在制备具有下述至少一种特性的树駒疾病模型中的应用：
[OOU] 1)胶质细胞增生；
[0014] 2)神经元纤维缠结；
[001引3)学习巧区能力下降。
[0016] 上述应用中，用于制备阿尔茨海默病动物模型或树駒疾病模型的树駒可为雄性。
[0017] 上述应用中，用于制备阿尔茨海默病动物模型或树駒疾病模型的树駒的月龄可为 3月龄。
[0018] 上述Sl或S2的应用中，树駒、D-半乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥 钢的配比为 Ikg体重：1.5g:83]ig:8：3iig:20mg。
[0019] 上述应用均包括：
[0020] 1)连续30天给树駒给药D-半乳糖，D-半乳糖每天的给药剂量均为50毫克每千克体 重，W开始给药D-半乳糖的当天记为第1天，第31天用1 % (质量百分含量)戊己比妥钢溶液 进行麻醉，1%戊己比妥钢溶液的给药剂量为2mL ? kg^体重；
[0021] 2)将的定粉样蛋白1-42和碟膏葦氨酸注入树駒的海马区，得到所述阿尔茨海默病 动物模型或所述树駒疾病模型;所述的定粉样蛋白1-42和碟膏葦氨酸的给药剂量均为83yg/ Ikg体重。
[0022] 实验证明，与对照组(给药生理盐水的树駒)和空白组相比，对树駒给药D-半乳糖、 0淀粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢得到的树駒模型(模型组)具有如下阿尔茨海 默病表现:学习记忆能力下降，并出现神经胶质细胞增生和神经元纤维缠结。Morris水迷宫 测试结果表明模型组树駒（给药D-半乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢的 树駒）出现了明显的学习记忆功能障碍。病理检测结果表明，模型组树駒脑海马区出现明显 胶质细胞增生和神经元纤维缠结(neurofibrilIa巧化ngles,NFT)，对照组(给药生理盐水 的树駒)和空白组无明显病理改变。
[0023] 树駒的遗传学研究表明其生物学上比晒齿类动物更接近灵长类动物化i RX，Xu W,Wang Z,et al.2012.Proteomic characteristics of the liver and skeletal muscle in the Chinese tree shrew(Tupaia belangeri chinensis)[J].Protein Cell, 3(9) :691-700;许凌，范宇，蒋学龙，等.2013.树駒进化分类地位的分子证据[J].动物学研 究，34(2) :70-76),有着明显大于大鼠的大脑和更高级的神经系统，应用树駒进行神经系统 疾病研究有着良好的前景。但与其他灵长类动物相比，又具有体型小，繁殖能力强的特点， 同时，树駒有着远低于非人灵长类动物的价格，在实验操作上也更为简便。开发树駒模型， 有助于减少非人灵长类动物的实验用量。
【附图说明】
[0024] 图1为树駒海马皿病理组织图片。A.空白组树駒海马，未见异常;B.对照组树駒海 马，未见异常;C.模型组树駒，海马见胶质细胞增生。
[00巧]图2为树駒海马Bieloschsky锻银法病理组织切片。A.空白组树駒海马，未见异常； B.对照组树駒海马，未见异常;C.模型组树駒，海马见神经元纤维缠结(NFT)。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 下述实施例中的树駒均为滨西亚种。
[00測 1材料
[0029] 1.1实验动物
[0030] 树駒(滨西亚种），雄性，30只，3月龄，体质量120g±10g，昆明医学院实验动物中屯、 提供。实验动物生产许可证号:SCXK (滨)2013-0002。
[0031] 1.2主要试剂和仪器
[0032] 的定粉样蛋白l-42(A01-42)，碟膏葦氨酸（ibotenic acid,化0)，D半乳糖(D-gal) 美国Sigma公司生产;A01-42浓度为2g/L，用灭菌生理盐水配制，在37°C下解育72h，使其成 为凝聚态的A化-42。
[0033] 脑立体定向仪:RWD68002,深圳市瑞沃德生命科技有限公司；微量注射器:上海安 亭微量进样器厂;电子天平:ML204，瑞±梅特勒-托利多公司。
[0034] 2 方法
[0035] 2.1动物分组
[0036] 将30只树駒按体重随机分为3组:模型组，对照注射组，空白组，每组10只动物。
[0037] 模型组:给药D-半乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢。树駒、D-半 乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢的配比为Ikg体重：1.5g:83yg:8化g: 20mg〇
[0038] 对照注射组:操作与模型组相同，所有药物改为生理盐水，注射剂量和部位与模型 组相同。
[0039] 空白组，不做任何处理。
[0040] 2.2动物模型的建立：
[0041] 动物实验在广西医科大学实验动物中屯、进行。实验动物使用许可证号：SYXK桂 2009-0004。
[0042] 每只模型组树駒连续30d腹腔注射D-Gal 50mg ? (kg ? d)-i，使其早衰。第31天用 1%(质量百分含量)戊己比妥钢溶液，2血? kg-i体重，腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将树駒固 定于大鼠脑立体定向仪上。沿头顶部正中切开皮肤暴露矢状缝，W矢状缝同对耳线的交点 作为起始原点，在向前3.3mm，左右两侧各旁开5mm处钻开烦骨，将微量注射器针头通过立体 定位仪经开孔垂直刺入脑10mm，缓慢匀速进针时，用时5min使针尖达到树駒海马区(海马区 定位参照树駒脑立体定位图谱）（杨文光等，1990 )，缓慢推入A01-42和化O混合液化L (含AP 1-42 IOiig和化Ol化g，溶于生理盐水）15min内注射完毕，留针IOmin后缓慢提出针头，缝合， 75%乙醇溶液消毒。
[0043] 脑内注射后观察动物外观、饮食、饮水、自主活动情况，四周后进行行为学指标观 察。
[0044] 2.3行为学指标检测
[0045] 采用经典的Morris水迷宫进行行为学指标观察，观察树駒的学习记忆能力。
[0046] Morris水迷宫系统由盛水的圆形水槽迷宫，隐藏在水面下的平台，视频分析系统 (包括摄像机、数字图像采集卡、计算机系统和分析软件）组成。水迷宫水池直径150cm，深 60cm，摄像镜头安放于水池中屯、上方3m高度。按东南西北四个方向将水池平均划分为4个象 限：东北(肥）、西北(NW)、东南（SE)、西南（SW)，将各象限水池壁中点标为入水点，入水点处 贴上醒目标记W区分不同象限。站台半径5畑1，高30畑1，纯黑色塑料材质，固定放置于任一象 限的中央，水池中水面高出站台平面0.5cm，将水槽中水用奶粉调成白色，W肉眼看不见平 台为准，保持水溫(21±0.5)°C。房间内光照恒定，保持完全安静，无光线直射在水池内。
[0047] 先对树駒进行水迷宫适应性训练，再进行正式指标检测。
[004引 2.3.1水迷宫适应性训练将树駒头朝池壁放入水中，引导树駒找到水下平台。放 入位置随机取东、西、南、北4个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间（S)。在前几次 训练中，如果运个时间超过75s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10s。连续训练7d， 每天2次，筛选游泳能力好，能自主找到平台的树駒进行正式实验。
[0049] 2.3.2正式指标检测定位巡航实验(navigation test)早上8: 30至10:00之间进 行，每次75s，连续测试4d。将树駒随机地头朝池壁按东北(肥）、西北(NW)、东南（SE)、西南 (SW)4个象限轻轻放入池中，记录动物寻找并爬上平台所需的时间即逃避潜伏期和游泳速 度。动物找到平台后使其在平台上停留10s，让其适应平台站立和周围环境，如果动物在75s 内未找到平台，计算机停止跟踪，记录逃避潜伏期时间为75s，并由实验者将动物引导至平 台，让其停留15s。每次训练结束，迅速用吸水毛巾将动物毛发擦干，并用电吹风吹干，W防 动物低体溫。
[0050] 空间探索实验(probe test):定位航行试验结束后次日撤走平台，任选一个入水 点将小鼠面向池壁放入水中，游泳时间均为90s，记下其穿越原平台所在区域的次数 (化equence)，W此作为空间记忆力的成绩。
[0化1] 2.4病理学检测
[0052]行为学指标检测结束后，采用1%戊己比妥钢溶液按0.15mL/100g体质量对树駒腹 腔注射麻醉。待树駒麻醉后固定，从树駒胸骨剑突处开胸，经左屯、室插管至主动脉，快速灌 注生理盐水IOOmL冲洗血液，之后用4%多聚甲醒SOOmL灌注，取脑组织后立刻固定于4%中 性福尔马林溶液中，常规石蜡切片，肥染色，观察脑组织形态改变，神经纤维缠结形成情况 用Bieloschsky锻银法检测。
[0化3] 2.5统计分析
[0化4] 所有计量资料数据采用；±6表示，所有数据均用SPSS19.0统计软件包进行统计 学处理，进行单因素方差分析(ANOVA)根据方差齐性与否，分别选用不同的检验方法，即方 差齐的资料的两两比较用LS的去检验，方差不齐的资料的两两比较用Games-Howell法检验， W双侧a = 0.05为显著性水准。
[0化5] 3.结果
[0056] 3.1行为学观察
[0057] 3.1.1定位巡航实验结果空白组与对照组的学习进度类似，随着时间延长而潜伏 期下降，两组之间没有明显的差别。模型组从第3天开始潜伏期明显长于空白组，差异有显 著性(P<0.05)，从第4天起与对照组也出现的明显差异，见表1。
[0化引表1S组树駒在定位巡航实验中的逃避潜伏期(s)(x+s，n = 10)
[0060] 注:a与空白组比较，P<0.05结果达到显著水平;b与对照组比较P<0.05，结果达到 显著水平
[0061] 3.1.2空间探索实验结果显示在捜索策略上，空白组和对照组树駒有一定的趋向 性，更倾向于在原有平台的象限进行捜索，两组之间无显著差别;模型组则出现随机捜索的 趋势，模型组与空白组比较差异显著(P<〇.05)。在游泳速率上，S组无明显差别，见表2。
[0062] 表2S组树駒空间探索实验结果(S)(三± s，n = 10)
[0064] 注:a与空白组比较，P<0.05结果达到显著水平;b与对照组比较P<0.05,结果达到 显著水平。
[0065] 在对树駒的水迷宫实验结果进行分析后发现，模型组的学习记忆能力，有明显的 下降，但没有发现树駒在水中的协调运动能力受到明显影响。脑内注射制作神经系统疾病 模型的缺陷之一就是脑内注射会对脑组织产生物理破坏，形成类似外伤的损害，从而产生 一定的干扰，利用微累注射技术能减小物理损伤，但也并不是完美的解决方案。为了排除注 射器贯穿脑组织对树駒智力的损伤，本实验设计了脑内注射生理盐水的对照组，结果表明 生理盐水脑内注射未对树駒的水迷宫实验表现产生明显影响。证明模型组的学习记忆能力 下降确实是因为药物毒性作用而引起的而非物理损伤所致。
[0066] 3.2树駒海马区胶质细胞增生及NTF形成情况
[0067] 3.2.1肥染色模型组树駒海马皮质肥染色切片可观察到胶质细胞增生，而空白组 和对照组未见明显病理改变，见图1。
[0068] 3.2.2Bieloschsky锻银法Bieloschsky锻银法切片可W看到模型组树駒海马形 成NFT，而空白组、对照组均未看到明显病理改变，见图2。
【主权项】
1. 树駒、D-半乳糖、β淀粉样蛋白1-42、鹅膏蕈氨酸和戊巴比妥钠在制备阿尔茨海默病 动物模型中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述树駒为雄性。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述树駒的月龄为3月龄。4. 树駒、D-半乳糖、β淀粉样蛋白1-42、鹅膏蕈氨酸和戊巴比妥钠在制备具有下述至少 一种特性的树駒疾病模型中的应用： 1) 胶质细胞增生； 2) 神经元纤维缠结； 3) 学习记忆能力下降。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用于制备所述树駒疾病模型的树駒为雄 性。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：用于制备所述树駒疾病模型的树駒的 月龄为3月龄。7. 树駒在制备阿尔茨海默病动物模型中的应用。8. 树駒在制备具有下述至少一种特性的树駒疾病模型中的应用： 1) 胶质细胞增生； 2) 神经元纤维缠结； 3) 学习记忆能力下降。9. 根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于:权利要求7所述树駒为雄性； 权利要求8中所述用于制备所述树駒疾病模型的树駒为雄性。10. 根据权利要求7或8或9所述的应用，其特征在于:权利要求7所述树駒的月龄为3月 龄;权利要求8中所述用于制备所述树駒疾病模型的树駒的月龄为3月龄。
【专利摘要】本发明公开了树鼩在制备阿尔茨海默病模型中的应用。本发明提供了以下技术方案：S1、树鼩、D-半乳糖、β淀粉样蛋白1-42、鹅膏蕈氨酸和戊巴比妥钠在制备阿尔茨海默病动物模型中的应用。S2、树鼩、D-半乳糖、β淀粉样蛋白1-42、鹅膏蕈氨酸和戊巴比妥钠在制备具有下述至少一种特性的树鼩疾病模型中的应用：1)胶质细胞增生；2)神经元纤维缠结；3)学习记忆能力下降。
【IPC分类】A61K49/00, A01K67/02
【公开号】CN105497920
【申请号】CN201510984868
【发明人】欧阳轶强, 梁振鑫
【申请人】广西医科大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月24日
【技术领域】
[0001] 本发明设及树駒在制备动物疾病模型中的应用，特别设及树駒在制备阿尔茨海默 病模型中的应用。
【背景技术】
[0002] 树駒（Tupaia belangeri)属树駒目树駒科树駒属的动物，分布在东南亚各国。在 中国大陆，分布于广西、海南、贵州、云南、四川、西藏等地，主要生活于热带和亚热带森林、 灌丛、村落附近。
[0003] 阿尔茨海默病(Alzheimer'S Disease,AD)是一种威胁人类健康的神经系统疾病。 目前对于AD的治疗还没有十分明确的方法。建立良好的AD动物模型，有助于对AD的病因病 机的认识，并可W指导AD的预防和治疗。目前的AD模型按动物种类划分主要有灵长类动物 模型和晒齿类动物模型两大类。灵长类动物模型价格十分昂贵，晒齿类动物模型则与人类 神经系统差别较大。建立一种费用相对低廉，但是比晒齿类动物更接近人类的动物模型对 于AD等神经系统疾病究很有意义。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何获得费用相对低廉，但是比晒齿类动物更接近 人类的阿尔茨海默病动物模型。
[0005] 为了解决W上技术问题，本发明提供了 W下技术方案：
[0006] S1、树駒、D-半乳糖、的定粉样蛋白l-42(A01-42)、碟膏葦氨酸（IBO)和戊己比妥钢 在制备阿尔茨海默病动物模型中的应用。
[0007] S2、树駒、D-半乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢在制备具有下述 至少一种特性的树駒疾病模型中的应用：
[000引1)胶质细胞增生；
[0009] 2)神经元纤维缠结；
[0010] 3)学习巧区能力下降。
[0011] S3、树駒在制备阿尔茨海默病动物模型中的应用。
[0012] S4、树駒在制备具有下述至少一种特性的树駒疾病模型中的应用：
[OOU] 1)胶质细胞增生；
[0014] 2)神经元纤维缠结；
[001引3)学习巧区能力下降。
[0016] 上述应用中，用于制备阿尔茨海默病动物模型或树駒疾病模型的树駒可为雄性。
[0017] 上述应用中，用于制备阿尔茨海默病动物模型或树駒疾病模型的树駒的月龄可为 3月龄。
[0018] 上述Sl或S2的应用中，树駒、D-半乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥 钢的配比为 Ikg体重：1.5g:83]ig:8：3iig:20mg。
[0019] 上述应用均包括：
[0020] 1)连续30天给树駒给药D-半乳糖，D-半乳糖每天的给药剂量均为50毫克每千克体 重，W开始给药D-半乳糖的当天记为第1天，第31天用1 % (质量百分含量)戊己比妥钢溶液 进行麻醉，1%戊己比妥钢溶液的给药剂量为2mL ? kg^体重；
[0021] 2)将的定粉样蛋白1-42和碟膏葦氨酸注入树駒的海马区，得到所述阿尔茨海默病 动物模型或所述树駒疾病模型;所述的定粉样蛋白1-42和碟膏葦氨酸的给药剂量均为83yg/ Ikg体重。
[0022] 实验证明，与对照组(给药生理盐水的树駒)和空白组相比，对树駒给药D-半乳糖、 0淀粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢得到的树駒模型(模型组)具有如下阿尔茨海 默病表现:学习记忆能力下降，并出现神经胶质细胞增生和神经元纤维缠结。Morris水迷宫 测试结果表明模型组树駒（给药D-半乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢的 树駒）出现了明显的学习记忆功能障碍。病理检测结果表明，模型组树駒脑海马区出现明显 胶质细胞增生和神经元纤维缠结(neurofibrilIa巧化ngles,NFT)，对照组(给药生理盐水 的树駒)和空白组无明显病理改变。
[0023] 树駒的遗传学研究表明其生物学上比晒齿类动物更接近灵长类动物化i RX，Xu W,Wang Z,et al.2012.Proteomic characteristics of the liver and skeletal muscle in the Chinese tree shrew(Tupaia belangeri chinensis)[J].Protein Cell, 3(9) :691-700;许凌，范宇，蒋学龙，等.2013.树駒进化分类地位的分子证据[J].动物学研 究，34(2) :70-76),有着明显大于大鼠的大脑和更高级的神经系统，应用树駒进行神经系统 疾病研究有着良好的前景。但与其他灵长类动物相比，又具有体型小，繁殖能力强的特点， 同时，树駒有着远低于非人灵长类动物的价格，在实验操作上也更为简便。开发树駒模型， 有助于减少非人灵长类动物的实验用量。
【附图说明】
[0024] 图1为树駒海马皿病理组织图片。A.空白组树駒海马，未见异常;B.对照组树駒海 马，未见异常;C.模型组树駒，海马见胶质细胞增生。
[00巧]图2为树駒海马Bieloschsky锻银法病理组织切片。A.空白组树駒海马，未见异常； B.对照组树駒海马，未见异常;C.模型组树駒，海马见神经元纤维缠结(NFT)。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027] 下述实施例中的树駒均为滨西亚种。
[00測 1材料
[0029] 1.1实验动物
[0030] 树駒(滨西亚种），雄性，30只，3月龄，体质量120g±10g，昆明医学院实验动物中屯、 提供。实验动物生产许可证号:SCXK (滨)2013-0002。
[0031] 1.2主要试剂和仪器
[0032] 的定粉样蛋白l-42(A01-42)，碟膏葦氨酸（ibotenic acid,化0)，D半乳糖(D-gal) 美国Sigma公司生产;A01-42浓度为2g/L，用灭菌生理盐水配制，在37°C下解育72h，使其成 为凝聚态的A化-42。
[0033] 脑立体定向仪:RWD68002,深圳市瑞沃德生命科技有限公司；微量注射器:上海安 亭微量进样器厂;电子天平:ML204，瑞±梅特勒-托利多公司。
[0034] 2 方法
[0035] 2.1动物分组
[0036] 将30只树駒按体重随机分为3组:模型组，对照注射组，空白组，每组10只动物。
[0037] 模型组:给药D-半乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢。树駒、D-半 乳糖、的定粉样蛋白1-42、碟膏葦氨酸和戊己比妥钢的配比为Ikg体重：1.5g:83yg:8化g: 20mg〇
[0038] 对照注射组:操作与模型组相同，所有药物改为生理盐水，注射剂量和部位与模型 组相同。
[0039] 空白组，不做任何处理。
[0040] 2.2动物模型的建立：
[0041] 动物实验在广西医科大学实验动物中屯、进行。实验动物使用许可证号：SYXK桂 2009-0004。
[0042] 每只模型组树駒连续30d腹腔注射D-Gal 50mg ? (kg ? d)-i，使其早衰。第31天用 1%(质量百分含量)戊己比妥钢溶液，2血? kg-i体重，腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将树駒固 定于大鼠脑立体定向仪上。沿头顶部正中切开皮肤暴露矢状缝，W矢状缝同对耳线的交点 作为起始原点，在向前3.3mm，左右两侧各旁开5mm处钻开烦骨，将微量注射器针头通过立体 定位仪经开孔垂直刺入脑10mm，缓慢匀速进针时，用时5min使针尖达到树駒海马区(海马区 定位参照树駒脑立体定位图谱）（杨文光等，1990 )，缓慢推入A01-42和化O混合液化L (含AP 1-42 IOiig和化Ol化g，溶于生理盐水）15min内注射完毕，留针IOmin后缓慢提出针头，缝合， 75%乙醇溶液消毒。
[0043] 脑内注射后观察动物外观、饮食、饮水、自主活动情况，四周后进行行为学指标观 察。
[0044] 2.3行为学指标检测
[0045] 采用经典的Morris水迷宫进行行为学指标观察，观察树駒的学习记忆能力。
[0046] Morris水迷宫系统由盛水的圆形水槽迷宫，隐藏在水面下的平台，视频分析系统 (包括摄像机、数字图像采集卡、计算机系统和分析软件）组成。水迷宫水池直径150cm，深 60cm，摄像镜头安放于水池中屯、上方3m高度。按东南西北四个方向将水池平均划分为4个象 限：东北(肥）、西北(NW)、东南（SE)、西南（SW)，将各象限水池壁中点标为入水点，入水点处 贴上醒目标记W区分不同象限。站台半径5畑1，高30畑1，纯黑色塑料材质，固定放置于任一象 限的中央，水池中水面高出站台平面0.5cm，将水槽中水用奶粉调成白色，W肉眼看不见平 台为准，保持水溫(21±0.5)°C。房间内光照恒定，保持完全安静，无光线直射在水池内。
[0047] 先对树駒进行水迷宫适应性训练，再进行正式指标检测。
[004引 2.3.1水迷宫适应性训练将树駒头朝池壁放入水中，引导树駒找到水下平台。放 入位置随机取东、西、南、北4个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间（S)。在前几次 训练中，如果运个时间超过75s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10s。连续训练7d， 每天2次，筛选游泳能力好，能自主找到平台的树駒进行正式实验。
[0049] 2.3.2正式指标检测定位巡航实验(navigation test)早上8: 30至10:00之间进 行，每次75s，连续测试4d。将树駒随机地头朝池壁按东北(肥）、西北(NW)、东南（SE)、西南 (SW)4个象限轻轻放入池中，记录动物寻找并爬上平台所需的时间即逃避潜伏期和游泳速 度。动物找到平台后使其在平台上停留10s，让其适应平台站立和周围环境，如果动物在75s 内未找到平台，计算机停止跟踪，记录逃避潜伏期时间为75s，并由实验者将动物引导至平 台，让其停留15s。每次训练结束，迅速用吸水毛巾将动物毛发擦干，并用电吹风吹干，W防 动物低体溫。
[0050] 空间探索实验(probe test):定位航行试验结束后次日撤走平台，任选一个入水 点将小鼠面向池壁放入水中，游泳时间均为90s，记下其穿越原平台所在区域的次数 (化equence)，W此作为空间记忆力的成绩。
[0化1] 2.4病理学检测
[0052]行为学指标检测结束后，采用1%戊己比妥钢溶液按0.15mL/100g体质量对树駒腹 腔注射麻醉。待树駒麻醉后固定，从树駒胸骨剑突处开胸，经左屯、室插管至主动脉，快速灌 注生理盐水IOOmL冲洗血液，之后用4%多聚甲醒SOOmL灌注，取脑组织后立刻固定于4%中 性福尔马林溶液中，常规石蜡切片，肥染色，观察脑组织形态改变，神经纤维缠结形成情况 用Bieloschsky锻银法检测。
[0化3] 2.5统计分析
[0化4] 所有计量资料数据采用；±6表示，所有数据均用SPSS19.0统计软件包进行统计 学处理，进行单因素方差分析(ANOVA)根据方差齐性与否，分别选用不同的检验方法，即方 差齐的资料的两两比较用LS的去检验，方差不齐的资料的两两比较用Games-Howell法检验， W双侧a = 0.05为显著性水准。
[0化5] 3.结果
[0056] 3.1行为学观察
[0057] 3.1.1定位巡航实验结果空白组与对照组的学习进度类似，随着时间延长而潜伏 期下降，两组之间没有明显的差别。模型组从第3天开始潜伏期明显长于空白组，差异有显 著性(P<0.05)，从第4天起与对照组也出现的明显差异，见表1。
[0化引表1S组树駒在定位巡航实验中的逃避潜伏期(s)(x+s，n = 10)
[0060] 注:a与空白组比较，P<0.05结果达到显著水平;b与对照组比较P<0.05，结果达到 显著水平
[0061] 3.1.2空间探索实验结果显示在捜索策略上，空白组和对照组树駒有一定的趋向 性，更倾向于在原有平台的象限进行捜索，两组之间无显著差别;模型组则出现随机捜索的 趋势，模型组与空白组比较差异显著(P<〇.05)。在游泳速率上，S组无明显差别，见表2。
[0062] 表2S组树駒空间探索实验结果(S)(三± s，n = 10)
[0064] 注:a与空白组比较，P<0.05结果达到显著水平;b与对照组比较P<0.05,结果达到 显著水平。
[0065] 在对树駒的水迷宫实验结果进行分析后发现，模型组的学习记忆能力，有明显的 下降，但没有发现树駒在水中的协调运动能力受到明显影响。脑内注射制作神经系统疾病 模型的缺陷之一就是脑内注射会对脑组织产生物理破坏，形成类似外伤的损害，从而产生 一定的干扰，利用微累注射技术能减小物理损伤，但也并不是完美的解决方案。为了排除注 射器贯穿脑组织对树駒智力的损伤，本实验设计了脑内注射生理盐水的对照组，结果表明 生理盐水脑内注射未对树駒的水迷宫实验表现产生明显影响。证明模型组的学习记忆能力 下降确实是因为药物毒性作用而引起的而非物理损伤所致。
[0066] 3.2树駒海马区胶质细胞增生及NTF形成情况
[0067] 3.2.1肥染色模型组树駒海马皮质肥染色切片可观察到胶质细胞增生，而空白组 和对照组未见明显病理改变，见图1。
[0068] 3.2.2Bieloschsky锻银法Bieloschsky锻银法切片可W看到模型组树駒海马形 成NFT，而空白组、对照组均未看到明显病理改变，见图2。
【主权项】
1. 树駒、D-半乳糖、β淀粉样蛋白1-42、鹅膏蕈氨酸和戊巴比妥钠在制备阿尔茨海默病 动物模型中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述树駒为雄性。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述树駒的月龄为3月龄。4. 树駒、D-半乳糖、β淀粉样蛋白1-42、鹅膏蕈氨酸和戊巴比妥钠在制备具有下述至少 一种特性的树駒疾病模型中的应用： 1) 胶质细胞增生； 2) 神经元纤维缠结； 3) 学习记忆能力下降。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用于制备所述树駒疾病模型的树駒为雄 性。6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：用于制备所述树駒疾病模型的树駒的 月龄为3月龄。7. 树駒在制备阿尔茨海默病动物模型中的应用。8. 树駒在制备具有下述至少一种特性的树駒疾病模型中的应用： 1) 胶质细胞增生； 2) 神经元纤维缠结； 3) 学习记忆能力下降。9. 根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于:权利要求7所述树駒为雄性； 权利要求8中所述用于制备所述树駒疾病模型的树駒为雄性。10. 根据权利要求7或8或9所述的应用，其特征在于:权利要求7所述树駒的月龄为3月 龄;权利要求8中所述用于制备所述树駒疾病模型的树駒的月龄为3月龄。
【专利摘要】本发明公开了树鼩在制备阿尔茨海默病模型中的应用。本发明提供了以下技术方案：S1、树鼩、D-半乳糖、β淀粉样蛋白1-42、鹅膏蕈氨酸和戊巴比妥钠在制备阿尔茨海默病动物模型中的应用。S2、树鼩、D-半乳糖、β淀粉样蛋白1-42、鹅膏蕈氨酸和戊巴比妥钠在制备具有下述至少一种特性的树鼩疾病模型中的应用：1)胶质细胞增生；2)神经元纤维缠结；3)学习记忆能力下降。
【IPC分类】A61K49/00, A01K67/02
【公开号】CN105497920
【申请号】CN201510984868
【发明人】欧阳轶强, 梁振鑫
【申请人】广西医科大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月24日
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