一种在电离辐射灭菌前对功能蛋白进行保护的方法及其专用保护剂的制作方法
一种在电离辐射灭菌前对功能蛋白进行保护的方法及其专用保护剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种在电离福射灭菌前对功能蛋白进行保护 的方法及其专用保护剂，预期解决的技术问题为降低电离福射灭菌对功能蛋白活性的损 伤。
【背景技术】
[0002] 骨形态发生蛋白（BMP)是由骨基质分泌的一种疏水性蛋白质，属于转化生长因子 (TGF-P)超家族成员，由化ist等人于1965年首次提出，于1982年首次从脱巧骨基质提取物 中分离得到的一种功能蛋白。BMP家族包括BMP-I、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12、BMP-14等，其中BMP-2具有诱导未分化成纤维细胞定向分化为成骨细胞的作用，并能调 节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成和促进骨折愈合的功能。目前，BMP已成 功地用于治疗新鲜骨折、骨不连和骨缺损W及脊柱融合等。
[0003] 单纯BMP在体内会被组织液稀释及蛋白酶分解，在局部能保持有效浓度的时间非 常有限，因此BMP常被与合适的载体材料复合，用于治疗。常用的材料有脱矿骨基质、天然高 分子化合物(如可吸收的胶原海绵、透明质酸凝胶）、含巧化合物(如径基憐灰石、可吸收憐 酸巧水泥）、人工合成高分子化合物(如聚乳酸、聚乳酸二聚径基乙酸、聚乳酸聚乙締乙二醇 等），也可W将BMP与氧化铁纳米材料复合使用。
[0004] 灭菌是单纯BMP及BMP与材料复合临床使用前必不可少的。常规湿热灭菌、环氧乙 烧灭菌等都会造成BMP的活性降低。电离福射灭菌是一种良好的冷灭菌方法，灭菌过程中溫 度不会剧烈变化，可用于BMP及其复合材料的灭菌及病毒灭活。电离福射灭菌主要利用X射 线、T射线或高能粒子束灭菌，具有穿透性强、杀菌谱广、作用均匀、基本无损害等优势。钻 60 丫-射线福照灭菌是最具实用价值的电离福射灭菌方法，其灭菌效果与福照剂量有关，福 照剂量越大，灭活效果越好。一般情况下，20-50kGy剂量的钻60 丫-射线几乎能灭活所有的 病毒，但灭活病原体的同时，他对一些蛋白成分的生物活性分子也有影响。
[0005] 目前认为，生物大分子对电离福射的敏感性与其本身质量大小有关，与蛋白相比， 核酸对电离福射灭菌具有更高的敏感性。因此，在进行电离福射灭菌的同时，选择合理的活 性分子保护方式，对功能蛋白进行保护，保留其活性成为可能。国内研究者程文琴等对钻60 T-射线福照灭菌条件下，抗坏血酸、抗坏血酸钢和茶多酪对免疫球蛋白活性的保护作用进 行了研究，=种物质均对免疫球蛋白活性有一定程度的保护作用，但是此类强抗氧化剂常 溫下在空气中不稳定，易被氧化失却保护作用。开洪昭等公布了一种钻60 丫-射线福射灭菌 条件下BMP-2活性保护的方法:将装有BMP溶液的密封离屯、管放入装满水的保溫瓶中进行保 护，该方法在钻60 丫-射线福射灭菌过条件下对BMP-2活性有保护作用。但开洪昭等的方法 不但同时减少了对微生物及病毒的伤害，同时无法减少福射对BMP-2活性带来的间接损害， 并且操作繁琐，规模化生产。如何对电离福射灭菌过程中的骨形态发生蛋白进行保护，成为 一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的问题是提供一种在电离福射灭菌前对功能蛋白或含有所述功 能蛋白的复合材料进行保护的方法及其专用保护剂，预期解决的技术问题为降低电离福射 灭菌对功能蛋白活性的损伤。
[0007] 本发明首先提供了一种在电离福射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复 合材料进行保护的方法，包括如下步骤:在液相体系中，将所述"功能蛋白或含有所述功能 蛋白的复合材料"与组分I和组分n混合;所述组分I可为碳水化合物;所述组分n可为氨基 酸和/或氨基酸盐酸盐。
[000引上述方法中，所述功能蛋白、组分I和组分n混合后还可包括调节pH值至3.5-5.5 的步骤。
[0009] 上述方法中，所述液相体系可为水或盐溶液。所述盐溶液具体可为含憐酸二氨钢 2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL的水溶液。
[0010] 上述方法中，所述液相体系中，所述组分I和所述组分n的质量配比可为如下 (曰1)、（曰2)、（曰3)、（曰4)、（曰5)或（曰6):
[0011] (al)30：0.1-1800；
[0012] (a2)30：16-90；
[0013] (a3)30：16；
[0014] (a4)30:70;
[0015] (a5)30:17.5;
[0016] (a6)30：90〇
[0017] 上述方法中，所述液相体系中，所述功能蛋白、所述组分I和所述组分n的质量配 比可为如下化1)、化2)、化3)、化4)、化5)或化6):
[001 引（bl)l.2:15-30:0.1-1800;
[0019] (b2)l.2:15-30:16-45；
[0020] (b3)l.2:30:16；
[0021] (b4)l.2:15:35；
[0022] (b5)l.2:30:17.5；
[0023] (b6)l.2:15:45。
[0024] 上述方法中，所述液相体系中，所述组分I的浓度可为0. lmg/nO^-30mg/mL，优选为 15mg/ni-30mg/ni;所述组分 n 的浓度可为0. lmg/ni-45mg/mL，优选为 16mg/ni-45mg/mL。
[0025] 上述方法中，所述碳水化合物的加入形式可为薦糖或海藻糖;所述氨基酸的加入 形式可为蛋氨酸和/或色氨酸;所述氨基酸盐酸盐的加入形式可为精氨酸盐酸盐、半脫氨酸 盐酸盐和/或组氨酸盐酸盐。
[00%] 上述方法中，所述方法具体可为如下（cl)、（c2)、（c3)、（c4)、（c5)、（c6)、（c7)、 (c8)、（c9)或(clO):
[0027] (cl)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸 盐;薦糖的浓度为30mg/mレ精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL半脫氨酸盐酸盐的浓度为Img/ HlL;
[00%] (c2)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐 酸盐;海藻糖的浓度为30mg/mL组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL半脫氨酸盐酸盐的浓度为 Im 邑/mM
[0029] (c3)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和蛋氨酸；薦糖 的浓度为15111旨/1]^;组氨酸盐酸盐的浓度为3〇111旨/1]^;蛋氨酸的浓度为5mg/ni;
[0030] (c4)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分n为精氨酸盐酸盐和色氨酸;海 藻糖的浓度为3〇111旨/11〇^;精氨酸盐酸盐的浓度为15111旨/11〇^;色氨酸的浓度为2.5mg/mL
[0031] (c5)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸 盐;薦糖的浓度为15111旨/11〇^;组氨酸盐酸盐的浓度为15111旨/11〇^;精氨酸盐酸盐的浓度为30mg/ mL;
[0032] (c6)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸 盐;功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，薦糖的浓度为30mg/mL精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL 半脫氨酸盐酸盐的浓度为Img/mL
[0033] (c7)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐 酸盐;功能蛋白的浓度为1.2mg/血，海藻糖的浓度为3〇111旨/11〇^;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/ mL半脫氨酸盐酸盐的浓度为Img/mL
[0034] (c8)所述方法中，所述组分I具体可为薦糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和蛋氨 酸;功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，薦糖的浓度为15mg/ni;组氨酸盐酸盐的浓度为30mg/ni; 蛋氨酸的浓度为5mg/ni;
[0035] (c9)所述方法中，所述组分I具体可为海藻糖，所述组分n为精氨酸盐酸盐和色氨 酸；功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，海藻糖的浓度为30mg/mL精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/ ni;色氨酸的浓度为2.5mg/ni;
[0036] (CiO)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸 盐；功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，薦糖的浓度为15mg/mレ组氨酸盐酸盐的浓度具体可为 15mg/mレ精氨酸盐酸盐的浓度为30mg/mL。
[0037] 上述方法中，所述功能蛋白可为如下(dl)、（d2)、（d3)或(d4): [0038] (dl)骨形态发生蛋白；
[0039] (d2)人骨形态发生蛋白；
[0040] (d3)人骨形态发生蛋白-2;
[0041] (d4)序列表的序列2所示的人骨形态发生蛋白-2。
[0042] 上述方法中，所述在电离福射灭菌可为如下(el)、（e2)、（e3)或(e4):
[0043] (el) 丫射线灭菌；
[0044] (e2) W放射性核素钻-60为福射源的丫射线灭菌；
[0045] (e3)W放射性核素钻-60为福射源的丫射线灭菌，福射剂量为15kGy-35kGy;
[0046] (e4) W放射性核素钻-60为福射源的丫射线灭菌，福射剂量为25kGy。
[0047] 本发明还提供了一种对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行电离福射 灭菌的方法。
[0048] 本发明所提供的一种对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行电离福射 灭菌的方法，可包括如下步骤：
[0049] (I)采用上述任一所述在电离福射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合 材料进行保护的方法对所述"功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料"进行前处理；
[0050] (2)进行冷冻干燥；
[0051] (3)电离福射灭菌。
[0052] 本发明还提供了一种在电离福射灭菌前对功能蛋白进行保护的产品。
[0053] 本发明提供的一种在电离福射灭菌前对功能蛋白进行保护的产品，包括上述任一 所述组分I和组分n。
[0054] 所述产品使用时，所述待保护功能蛋白和所述产品的质量配比具体可为如下 ('1)、^2)、（'3)、^4)或^5):
[0055] (fl)1.2:46-60;
[0化6] (f2)1.2：46；
[0057] (f3)1.2:47.5;
[0化引（f4)1.2:50;
[0059] (巧）1.2:60。
[0060] 所述产品具体可为保护剂。
[0061] 上述任一所述电离福射灭菌可为X射线灭菌、丫射线灭菌或高能电子束灭菌。
[0062] 所述丫射线灭菌具体可为W放射性核素钻-60或放射性核素飽-137为福射源的丫 射线。
[0063] 上述任一所述功能蛋白可为骨形态发生蛋白，所述骨形态发生蛋白具体可为人骨 形态发生蛋白。
[0064] 上述任一所述人骨形态发生蛋白，具体可为重组人骨形态发生蛋白BMP-2，其氨基 酸序列具体可为序列表的序列2所示。
[0065] 实验证明，本发明所提供的一种在电离福射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋 白的复合材料进行保护的方法具有抗福射、抗氧化W及保护功能蛋白活性的作用。本发明 提供的保护剂有如下优点：1、安全性高：皆为药用辅料，不存在毒性残留问题;2、稳定性高： 碳水化合物和氨基酸类物质性质稳定，不易被氧化;3、操作简单，可用于实验样品制作，也 适用于规模化生产。
【附图说明】
[0066] 图1为福照灭菌前空白样品的液相色谱图，峰1为riiBMP-2二聚体。
[0067] 图2为福照灭菌后空白样品的液相色谱图，峰4为riiBMP-2二聚体。
[006引图3为福照灭菌后样品1的液相色谱图，峰2为riiBMP-2二聚体。
[0069] 图4为福照灭菌后样品2的液相色谱图，峰2为riiBMP-2二聚体。
[0070] 图5为福照灭菌后样品3的液相色谱图，峰1为riiBMP-2二聚体。
[0071] 图6为福照灭菌后样品4的液相色谱图，峰3为riiBMP-2二聚体。
[0072] 图7为福照灭菌后样品5的液相色谱图，峰2为riiBMP-2二聚体。
[0073] 图8为福照灭菌后样品6的液相色谱图，峰2为riiBMP-2二聚体。
[0074] 图9为福照灭菌后样品7的液相色谱图，峰1为riiBMP-2二聚体。
【具体实施方式】
[0075] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0076] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0077] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验重 复3次，取平均值。
[0078] 下述实施例中的半脫氨酸盐酸盐母液:溶质及其浓度为:半脫氨酸盐酸盐IOOmg/ ml、憐酸二氨钢2.4mg/ml和氯化钢8.8mg/ml;溶剂为水;pH 5.5。
[0079] 下述实施例中的C2C12细胞为购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中 屯、。
[0080] DMEM高糖培养基为美国Hyclone公司产品。
[0081 ] glycine-Na0H缓冲液：含0.1Mglycine-Na0H(p册.6)、lmMMgCl2和lmMZnCl2的水 溶液。
[0082]下述实施例中的精氨酸盐酸盐、半脫氨酸盐酸盐和组氨酸盐酸盐具体为k精氨酸 盐酸盐半脫氨酸盐酸盐和k组氨酸盐酸盐，其化学式依次为式I、式n和式虹：
[0084] 实施例l、riiBMP-2原液的制备
[00化]一、重组菌的构建
[0086] 1、将序列表的序列1自5'末端第64-477位核巧酸所示的双链DNA分子插入载体 祀T-28a ( + )的Nde巧日趾OI酶切位点之间，得到重组质粒。重组质粒中，插入的双链DNA分子 与质粒本身的部分DNA融合，形成序列表的序列I所示的融合基因，表达序列表的序列2所示 的融合蛋白。
[0087] 2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌化21 (DE3)，得到重组菌。
[008引二、riiBMP-2原液的制备
[0089] 取步骤一得到重组菌，然后按照专利CN201310432794.4公开的纯化生产方法经过 包涵体的溶解、复性前纯化、蛋白复性和复性后纯化等步骤，得到rhBMP-2原液。rhBMP-2即 重组人骨形态发生蛋白-2。
[0090] 该 riiBMP-2 原液中 riiBMP-2 的浓度为 1.2mg/mL。
[0091 ]该rhBMP-2原液的组成:溶剂为水，溶质及其溶度如下:憐酸二氨钢2.4mg/mL、氯化 钢8.8mg/mL、rhBMP-2 的浓度为 1.2mg/mL。
[0092] 实施例2、不同功能蛋白保护剂对rhBMP-2的保护效果
[0093] BMP-2二聚体具有诱导形成成骨细胞的生物活性，而BMP-2的多聚体和单体都不具 备所述生物活性。BMP-2通常需要进行福照灭菌，但经钻-60 丫射线福射会产生BMP-2多聚 体，从而失去生物活性。本实施例采用高效液相色谱法检测灭菌前后BMP-2中BMP-2二聚体 的纯度，同时利用C2C12细胞法检测灭菌前后BMP-2的生物学活性，从而评价本发明提供的 前处理方法的作用效果。
[0094] 一、样品的制作
[0095] 1、空白样品
[0096] 取实施例1制备的rhBMP-2原液（溶剂为水，溶质及其浓度如下：rhBMP-2蛋白 1.2mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL) ImL,冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻 干粉命名为空白样品。
[0097] 2、样品 1
[0098] 取99mL实施例1制备的rhBMP-2原液，向其中加入薦糖、精氨酸盐酸盐和ImL半脫氨 酸盐酸盐母液，然后调节抑至5.5,得到混合液1。混合液1中，溶剂为水，溶质及其浓度如下： ;rhBMP-2蛋白1.2mg/mL、薦糖30mg/mL、精氨酸盐酸盐15mg/mL、半脫氨酸盐酸盐Img/mL、憐酸 二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL。
[0099] 取混合液llmL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品1。
[0100] 样品1中，rhBMP-2蛋白、薦糖、精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸盐的质量配比为： 1.2mg:SOmg:15mg:Img D
[0101] 样品1中，组分1(薦糖）和组分n(精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸盐）的质量配比 为：30mg:16mg。
[0102] 样品I中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂（薦糖、精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸 盐）的质量配比为：1.2mg:46mg。
[0103] 3、样品 2
[0104] 取99mL实施例1制备的riiBMP-2原液，向其中加入海藻糖、组氨酸盐酸 盐和ImL半脫 氨酸盐酸盐母液，调节pH至5.5,得到混合液2。混合液2中，溶剂为水，溶质及其浓度如下： ;rhBMP-2蛋白1.2mg/mL、海藻糖30mg/mL、组氨酸盐酸盐15mg/mL、半脫氨酸盐酸盐Img/mL、憐 酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL。
[0105] 取混合液21mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品2。
[0106] 样品2中，rhBMP-2蛋白、海藻糖、组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸盐的质量配比为： 1.2mg:SOmg:15mg:Img D
[0107] 样品2中，组分1(海藻糖)和组分n(组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸盐)的质量配比 为：30mg:16mg。
[0108] 样品2中，riiBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(海藻糖、组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸 盐）的质量配比为：1.2mg:46mg。
[0109] 4、样品 3
[0110] 取IOOmL实施例1制备的riiBMP-2原液，向其中加入薦糖、组氨酸盐酸盐和蛋氨酸， 调节pH至5.0，得到混合液3。混合液3中，溶剂为水，溶质及其浓度如下:riiBMP-2蛋白1.2mg/ mU薦糖15mg/mL、组氨酸盐酸盐30mg/mL、蛋氨酸5mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢 8.8mg/mL〇
[0111] 取混合液31mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品3。
[0112] 样品3中，riiBMP-2蛋白、薦糖、组氨酸盐酸盐和蛋氨酸的质量配比为：1.2mg:15mg: 30mg:5mg。
[0113] 样品3中，组分I(薦糖）和组分n(组氨酸盐酸盐和蛋氨酸）的质量配比为：30mg: TOmgo
[0114] 样品3中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(薦糖、组氨酸盐酸盐和蛋氨酸）的质量 配比为：1.2mg: 50mg。
[0115] 5、样品 4
[0116] 取IOOmL实施例1制备的rhBMP-2原液，向其中加入海藻糖、精氨酸盐酸盐和色氨 酸，得到混合液4。混合液4中，溶剂为水，溶质及其浓度如下:riiBMP-2蛋白1.2mg/mL、海藻糖 30mg/mL、精氨酸盐酸盐15mg/mL、色氨酸2.5mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8. Smg/ ITlL O
[0117] 取混合液41mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品4。
[0118] 样品4中，rhBMP-2蛋白、海藻糖、精氨酸盐酸盐和色氨酸的质量配比为：1.2mg: 30mg:15mg:2.5mg。
[0119] 样品4中，组分I(薦糖）和组分n(精氨酸盐酸盐和色氨酸）的质量配比为：30mg: 17.5mg O
[0120] 样品4中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(薦糖、精氨酸盐酸盐和色氨酸）的质量 配比为：1.2mg: 47.5mg。
[0121] 6、样品 5
[0122] 取IOOmL实施例1制备的rhBMP-2原液，向其中加入薦糖、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐 酸盐，得到混合液5。混合液5中，溶剂为水，溶质及其浓度如下:riiBMP-2蛋白1.2mg/mL、薦糖 15mg/mL、组氨酸盐酸盐15mg/mL、精氨酸盐酸盐30mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢 8.8mg/mL。
[0123] 取混合液51mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品5。
[0124] 样品5中，rhBMP-2蛋白、薦糖、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸的质量配比为：1.2mg: 15mg:15mg:30mg。
[0125] 样品5中，组分i(薦糖）和组分n(组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸）的质量配比为： 30mg：90mg〇
[01%]样品5中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(薦糖、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸）的 质量配比为：1.2mg: 60mg。
[0127] 7、样品 6
[012引取IOOmL实施例1制备的riiBMP-2原液，向其中加入薦糖，得到混合液6。混合液6中， 溶剂为水，溶质及其浓度如下:riiBMP-2蛋白1.2mg/mL、薦糖30mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL 和氯化钢8.8mg/mL。
[0129] 取混合液61mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品6。
[0130] 样品帥，riiBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(薦糖)的质量配比为：1.2mg:30mg。
[0131] 8、样品 7
[0132] 取100血实施例1制备的riiBMP-2原液，向其中加入组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐， 得到混合液7。所述混合液7中，溶剂为水，溶质及其浓度如下:rhBMP-2蛋白1.2mg/mL、组氨 酸盐酸盐15mg/mL、精氨酸盐酸盐30mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL。
[0133] 取混合液71mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品7。
[0134] 样品7中，rhBMP-2蛋白、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸的质量配比为：1.2mg:15mg: 3 Omgo
[0135] 样品7中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐)的质量 配比为：1.2mg:45mg。
[0136] 二、电离福射灭菌
[0137] 分别将步骤一制备的各个样品（空白样品、样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样 品6或样品7)进行如下操作:取步骤一制备的样品，进行放射性核素钻-60为福射源的T射 线灭菌(福射剂量为25kGy)。
[013引 S、不同功能蛋白保护剂对riiBMP-2的保护效果
[0139] 分别将步骤一制备的空白样品和步骤二得到的各个样品进行如下操作(为了表述 方便，将步骤一制备的样品称为福照灭菌前样品，将步骤二得到的各个样品称为福照灭菌 后样品）：
[0140] 1、采用高效液相色谱法检测各个样品中的riiBMP-2二聚体纯度
[0141 ]高效液相色谱的具体参数:高效液相色谱仪的型号为DIONEX U-3000;使用体积排 阻色谱柱(赛分科技有限公司，SRT SEC-300，7.8 X 300mm，5皿）；流动相组成为0.1 %S氣乙 酸的乙腊溶液:0.1 % S氣乙酸的水溶液=300: 700 (体积比），流速为0.5mL/min。检测波长 为 280nnurhBMP-2 二聚体保留时间为19.2-19.5min。
[0142] 按照面积归一化法计算，rhBMP-2二聚体的峰面积所占总峰面积比例，即为样品 riiBMP-2二聚体的纯度。实验结果见表1。
[0143] 表1.福照灭菌前后各样品的纯度
[0145] 结果表明，福照灭菌后空白样品中riiBMP-2二聚体的纯度为31.05% (图2)，福照灭 菌后样品1中riiBMP-2二聚体的纯度为95.84 % (图3)，福照灭菌后样品2中riiBMP-2二聚体的 纯度为96.05% (图4)，福照灭菌后样品3中riiBMP-2二聚体的纯度为92.31 % (图5)，福照灭 菌后样品4中riiBMP-2二聚体的纯度为93.01 % (图6)，福照灭菌后样品5中riiBMP-2二聚体的 纯度为85.37% (图7)，福照灭菌后样品6中riiBMP-2二聚体的纯度为49.08% (图8)，福照灭 菌后样品6中^181口-2二聚体的纯度为51.90%(图9)。
[0146] 2、C2Ci2细胞法检测样品生物活性
[0147] C2C12细胞在骨形态形成蛋白（BMP-2)的作用下，分化为成骨细胞。而碱性憐酸酶 (ALP)活性是成骨细胞的功能及分化程度指标，因此通过检测检测碱性憐酸酶的含量可W 反映C2C12细胞培养过程中加入的BMP-2的生物活性。
[0148] 检测灭菌后样品的保留活性百分比的方法具体如下：
[0149] 1)溶液准备
[0150] a、血清:胎牛血清或新生牛血清。
[0151] b、完全培养基:含10%血清的DMEM高糖培养基。
[0152] C、基础培养基:含2 %血清的DMEM高糖培养基。
[0153] d、消化液:准确称取膜酶0.05g，抓TA 0.02g，加PBS溶液100mL，揽拌混匀，溶液采 用注射器针头滤器(孔径^ 0.22曲1)经无菌过滤法除菌。分装至EP管，于-20°C保存备用。
[0154] e、细胞裂解液:含1 %NP40的glycine-NaOH缓冲 液。
[0155] f、显色液:含4mg/ml pNPP的glycine-NaOH缓冲液。
[0156] g、终止液:0.2M NaOH水溶液。
[0157] 2)样品准备
[0158] 待测样品为标准品（福照灭菌前样品)或测试样品（福照灭菌后样品）。
[0159] 3)细胞培养
[0160] 用完全培养基培养C2C12细胞至70~80 %的融合度，然后将C2C12细胞消化传代，接 种于96孔板中（每孔接种5000-10000个C2C12细胞)并培养2地。培养条件为5 % C〇2、37°C。
[0161] 4)rhBMP-2作用于细胞
[0162] 完成步骤3)后，取所述96孔板，弃去培养基，每孔加入20化1含待测样品的基础培 养基，继续培养72h。培养条件为5 % C〇2、37°C。
[0163] 5)碱性憐酸酶测定
[0164] 完成步骤4)后，取所述96孔板，弃去培养基，每孔加入20化1的PBS缓冲液(将化Cl 8 . Og，KCl 0.2g，化油POa . 44g和KH2PO4O . 2g溶于900ml注射用水，调pH至7.4，定容至 1000 mL,灭菌)洗涂两遍，吸干残液;然后每孔加入I(K)山细胞裂解液，室溫作用比;最后每孔 加入SOiil显色液，37°C作用40-60min后，用SOiil终止液终止反应。测定反应液的光吸收值 (检测光谱为405nm，参比光谱为465nm，光吸收值= 405nm光吸收值-465nm光吸收值）。
[0165] 6)灭菌后样品保留活性百分比
[0166] 步骤5)的实验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算 结果：
[0168] 化为测试样品预稀释倍数；
[0169] 化为标准品预稀释倍数；
[0170] Es为测试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
[0171] 化为标准品半效量的稀释倍数。
[0172] 实验结果见表2。结果表明，本发明提供的功能蛋白保护剂具有保护电离福射灭菌 过程中rhBMP-2活性的作用。
[0173] 表2.福照灭菌后各样品保留活性百分比
【主权项】
1. 一种在电离辐射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行保护的方 法，包括如下步骤:在液相体系中，将所述"功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料"与组 分I和组分Π 混合;所述组分I为碳水化合物;所述组分Π 为氨基酸和/或氨基酸盐酸盐。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述液相体系中，所述组分I和所述组分Π 的 质量配比为如下(al)、（a2)、（a3)、（a4)、（a5)S(a6): (al)30：0.1-1800； (a2)30：16-90； (a3)30：16； (a4)30：70； (a5)30：17.5； (a6)30：90〇3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述液相体系中，所述功能蛋白、所述组分I 和所述组分Π 的质量配比为如下(bl)、（b2)、（b3)、（b4)、（b5)S(b6): (bl)l.2:15-30:0.1-1800； (b2)1.2：15-30：16-45； (b3)l.2：30：16； (b4)l.2：15：35； (b5)l.2:30:17.5； (b6)1.2:15:45。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述液相体系中，所述组分I的浓度为0. lmg/ mL-30mg/mL，优选为 15mg/mL-30mg/mL;所述组分 Π 的浓度为0 · lmg/mL-45mg/mL，优选为 16mg/mL-45mg/mL 〇5. 如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于： 所述碳水化合物的加入形式为蔗糖或海藻糖； 所述氨基酸的加入形式为蛋氨酸和/或色氨酸； 所述氨基酸盐酸盐的加入形式为精氨酸盐酸盐、半胱氨酸盐酸盐和/或组氨酸盐酸盐。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为如下（cl)、（c2)、（C3)、（C4)、 (c5)、（c6)、（c7)、（c8)、（c9)S(clO): (cl)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为精氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸盐； 鹿糖的浓度为30mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;半胱氨酸盐酸盐的浓度为lmg/mL; (c2)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸 盐；海藻糖的浓度为30mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;半胱氨酸盐酸盐的浓度为 lmg/mL； (c3)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和蛋氨酸；蔗糖的浓 度为15mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为30mg/mL;蛋氨酸的浓度为5mg/mL; (c4)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分Π 为精氨酸盐酸盐和色氨酸;海藻糖 的浓度为30mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;色氨酸的浓度为2.5mg/mL; (c5)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐;蔗 糖的浓度为15mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为30mg/mL; (c6)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为精氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸盐； 功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，鹿糖的浓度为30mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;半胱 氨酸盐酸盐的浓度为lmg/mL; (c7)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸 盐；功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，海藻糖的浓度为30mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/ mL;半胱氨酸盐酸盐的浓度为lmg/mL; (c8)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和蛋氨酸；功能蛋白 的浓度为1 · 2mg/mL，鹿糖的浓度为15mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为30mg/mL;蛋氨酸的浓度 为5mg/mL; (c9)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分Π 为精氨酸盐酸盐和色氨酸;功能蛋 白的浓度为1.2mg/mL，海藻糖的浓度为30mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;色氨酸的 浓度为2.5mg/mL; (clO)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐;功 能蛋白的浓度为1.2mg/mL，鹿糖的浓度为15mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;精氨酸 盐酸盐的浓度为30mg/mL。7. 如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述功能蛋白为如下（dl)、（d2)、 (d3)或(d4): (dl)骨形态发生蛋白； (d2)人骨形态发生蛋白； (d3)人骨形态发生蛋白-2; (d4)序列表的序列2所示的人骨形态发生蛋白-2。8. 如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述在电离辐射灭菌为如下（el)、 (e2)、（e3)或(e4): (el) γ射线灭菌； (e2)以放射性核素钴-60为辐射源的γ射线灭菌； (e3)以放射性核素钴-60为辐射源的γ射线灭菌，辐射剂量为15kGy-35kGy; (e4)以放射性核素钴-60为辐射源的γ射线灭菌，辐射剂量为25kGy。9. 一种对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行电离辐射灭菌的方法，包括如 下步骤： (1) 采用权利要求1至7中任一所述的方法对所述"功能蛋白或含有所述功能蛋白的复 合材料"进行前处理； (2) 进行冷冻干燥； (3) 电离辐射灭菌。10. -种在电离辐射灭菌前对功能蛋白进行保护的产品，包括权利要求1、权利要求2和 权利要求5中任一所述组分I和组分Π 。
【专利摘要】本发明公开了一种在电离辐射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行保护的方法。其包括如下步骤：在液相体系中，将所述“功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料”与组分Ⅰ和组分Ⅱ混合；所述组分Ⅰ为碳水化合物；所述组分Ⅱ为氨基酸和/或氨基酸盐酸盐。实验证明，本发明所提供的方法具有抗辐射、抗氧化以及保护功能蛋白活性的作用，具有如下优点：1、安全性高：皆为药用辅料，不存在毒性残留问题；2、稳定性高：碳水化合物和氨基酸类物质性质稳定，不易被氧化；3、操作简单，可用于实验样品制作，也适用于规模化生产。
【IPC分类】A61L2/00
【公开号】CN105497925
【申请号】CN201510998411
【发明人】彭继学, 张东刚, 屈长宏, 苑晓佩, 陈红蕾, 南南
【申请人】烟台正海生物科技股份有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月25日
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种在电离福射灭菌前对功能蛋白进行保护 的方法及其专用保护剂，预期解决的技术问题为降低电离福射灭菌对功能蛋白活性的损 伤。
【背景技术】
[0002] 骨形态发生蛋白（BMP)是由骨基质分泌的一种疏水性蛋白质，属于转化生长因子 (TGF-P)超家族成员，由化ist等人于1965年首次提出，于1982年首次从脱巧骨基质提取物 中分离得到的一种功能蛋白。BMP家族包括BMP-I、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12、BMP-14等，其中BMP-2具有诱导未分化成纤维细胞定向分化为成骨细胞的作用，并能调 节成骨细胞和成软骨细胞的分化，诱导异位骨形成和促进骨折愈合的功能。目前，BMP已成 功地用于治疗新鲜骨折、骨不连和骨缺损W及脊柱融合等。
[0003] 单纯BMP在体内会被组织液稀释及蛋白酶分解，在局部能保持有效浓度的时间非 常有限，因此BMP常被与合适的载体材料复合，用于治疗。常用的材料有脱矿骨基质、天然高 分子化合物(如可吸收的胶原海绵、透明质酸凝胶）、含巧化合物(如径基憐灰石、可吸收憐 酸巧水泥）、人工合成高分子化合物(如聚乳酸、聚乳酸二聚径基乙酸、聚乳酸聚乙締乙二醇 等），也可W将BMP与氧化铁纳米材料复合使用。
[0004] 灭菌是单纯BMP及BMP与材料复合临床使用前必不可少的。常规湿热灭菌、环氧乙 烧灭菌等都会造成BMP的活性降低。电离福射灭菌是一种良好的冷灭菌方法，灭菌过程中溫 度不会剧烈变化，可用于BMP及其复合材料的灭菌及病毒灭活。电离福射灭菌主要利用X射 线、T射线或高能粒子束灭菌，具有穿透性强、杀菌谱广、作用均匀、基本无损害等优势。钻 60 丫-射线福照灭菌是最具实用价值的电离福射灭菌方法，其灭菌效果与福照剂量有关，福 照剂量越大，灭活效果越好。一般情况下，20-50kGy剂量的钻60 丫-射线几乎能灭活所有的 病毒，但灭活病原体的同时，他对一些蛋白成分的生物活性分子也有影响。
[0005] 目前认为，生物大分子对电离福射的敏感性与其本身质量大小有关，与蛋白相比， 核酸对电离福射灭菌具有更高的敏感性。因此，在进行电离福射灭菌的同时，选择合理的活 性分子保护方式，对功能蛋白进行保护，保留其活性成为可能。国内研究者程文琴等对钻60 T-射线福照灭菌条件下，抗坏血酸、抗坏血酸钢和茶多酪对免疫球蛋白活性的保护作用进 行了研究，=种物质均对免疫球蛋白活性有一定程度的保护作用，但是此类强抗氧化剂常 溫下在空气中不稳定，易被氧化失却保护作用。开洪昭等公布了一种钻60 丫-射线福射灭菌 条件下BMP-2活性保护的方法:将装有BMP溶液的密封离屯、管放入装满水的保溫瓶中进行保 护，该方法在钻60 丫-射线福射灭菌过条件下对BMP-2活性有保护作用。但开洪昭等的方法 不但同时减少了对微生物及病毒的伤害，同时无法减少福射对BMP-2活性带来的间接损害， 并且操作繁琐，规模化生产。如何对电离福射灭菌过程中的骨形态发生蛋白进行保护，成为 一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的问题是提供一种在电离福射灭菌前对功能蛋白或含有所述功 能蛋白的复合材料进行保护的方法及其专用保护剂，预期解决的技术问题为降低电离福射 灭菌对功能蛋白活性的损伤。
[0007] 本发明首先提供了一种在电离福射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复 合材料进行保护的方法，包括如下步骤:在液相体系中，将所述"功能蛋白或含有所述功能 蛋白的复合材料"与组分I和组分n混合;所述组分I可为碳水化合物;所述组分n可为氨基 酸和/或氨基酸盐酸盐。
[000引上述方法中，所述功能蛋白、组分I和组分n混合后还可包括调节pH值至3.5-5.5 的步骤。
[0009] 上述方法中，所述液相体系可为水或盐溶液。所述盐溶液具体可为含憐酸二氨钢 2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL的水溶液。
[0010] 上述方法中，所述液相体系中，所述组分I和所述组分n的质量配比可为如下 (曰1)、（曰2)、（曰3)、（曰4)、（曰5)或（曰6):
[0011] (al)30：0.1-1800；
[0012] (a2)30：16-90；
[0013] (a3)30：16；
[0014] (a4)30:70;
[0015] (a5)30:17.5;
[0016] (a6)30：90〇
[0017] 上述方法中，所述液相体系中，所述功能蛋白、所述组分I和所述组分n的质量配 比可为如下化1)、化2)、化3)、化4)、化5)或化6):
[001 引（bl)l.2:15-30:0.1-1800;
[0019] (b2)l.2:15-30:16-45；
[0020] (b3)l.2:30:16；
[0021] (b4)l.2:15:35；
[0022] (b5)l.2:30:17.5；
[0023] (b6)l.2:15:45。
[0024] 上述方法中，所述液相体系中，所述组分I的浓度可为0. lmg/nO^-30mg/mL，优选为 15mg/ni-30mg/ni;所述组分 n 的浓度可为0. lmg/ni-45mg/mL，优选为 16mg/ni-45mg/mL。
[0025] 上述方法中，所述碳水化合物的加入形式可为薦糖或海藻糖;所述氨基酸的加入 形式可为蛋氨酸和/或色氨酸;所述氨基酸盐酸盐的加入形式可为精氨酸盐酸盐、半脫氨酸 盐酸盐和/或组氨酸盐酸盐。
[00%] 上述方法中，所述方法具体可为如下（cl)、（c2)、（c3)、（c4)、（c5)、（c6)、（c7)、 (c8)、（c9)或(clO):
[0027] (cl)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸 盐;薦糖的浓度为30mg/mレ精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL半脫氨酸盐酸盐的浓度为Img/ HlL;
[00%] (c2)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐 酸盐;海藻糖的浓度为30mg/mL组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL半脫氨酸盐酸盐的浓度为 Im 邑/mM
[0029] (c3)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和蛋氨酸；薦糖 的浓度为15111旨/1]^;组氨酸盐酸盐的浓度为3〇111旨/1]^;蛋氨酸的浓度为5mg/ni;
[0030] (c4)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分n为精氨酸盐酸盐和色氨酸;海 藻糖的浓度为3〇111旨/11〇^;精氨酸盐酸盐的浓度为15111旨/11〇^;色氨酸的浓度为2.5mg/mL
[0031] (c5)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸 盐;薦糖的浓度为15111旨/11〇^;组氨酸盐酸盐的浓度为15111旨/11〇^;精氨酸盐酸盐的浓度为30mg/ mL;
[0032] (c6)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸 盐;功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，薦糖的浓度为30mg/mL精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL 半脫氨酸盐酸盐的浓度为Img/mL
[0033] (c7)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐 酸盐;功能蛋白的浓度为1.2mg/血，海藻糖的浓度为3〇111旨/11〇^;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/ mL半脫氨酸盐酸盐的浓度为Img/mL
[0034] (c8)所述方法中，所述组分I具体可为薦糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和蛋氨 酸;功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，薦糖的浓度为15mg/ni;组氨酸盐酸盐的浓度为30mg/ni; 蛋氨酸的浓度为5mg/ni;
[0035] (c9)所述方法中，所述组分I具体可为海藻糖，所述组分n为精氨酸盐酸盐和色氨 酸；功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，海藻糖的浓度为30mg/mL精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/ ni;色氨酸的浓度为2.5mg/ni;
[0036] (CiO)所述方法中，所述组分I为薦糖，所述组分n为组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸 盐；功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，薦糖的浓度为15mg/mレ组氨酸盐酸盐的浓度具体可为 15mg/mレ精氨酸盐酸盐的浓度为30mg/mL。
[0037] 上述方法中，所述功能蛋白可为如下(dl)、（d2)、（d3)或(d4): [0038] (dl)骨形态发生蛋白；
[0039] (d2)人骨形态发生蛋白；
[0040] (d3)人骨形态发生蛋白-2;
[0041] (d4)序列表的序列2所示的人骨形态发生蛋白-2。
[0042] 上述方法中，所述在电离福射灭菌可为如下(el)、（e2)、（e3)或(e4):
[0043] (el) 丫射线灭菌；
[0044] (e2) W放射性核素钻-60为福射源的丫射线灭菌；
[0045] (e3)W放射性核素钻-60为福射源的丫射线灭菌，福射剂量为15kGy-35kGy;
[0046] (e4) W放射性核素钻-60为福射源的丫射线灭菌，福射剂量为25kGy。
[0047] 本发明还提供了一种对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行电离福射 灭菌的方法。
[0048] 本发明所提供的一种对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行电离福射 灭菌的方法，可包括如下步骤：
[0049] (I)采用上述任一所述在电离福射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合 材料进行保护的方法对所述"功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料"进行前处理；
[0050] (2)进行冷冻干燥；
[0051] (3)电离福射灭菌。
[0052] 本发明还提供了一种在电离福射灭菌前对功能蛋白进行保护的产品。
[0053] 本发明提供的一种在电离福射灭菌前对功能蛋白进行保护的产品，包括上述任一 所述组分I和组分n。
[0054] 所述产品使用时，所述待保护功能蛋白和所述产品的质量配比具体可为如下 ('1)、^2)、（'3)、^4)或^5):
[0055] (fl)1.2:46-60;
[0化6] (f2)1.2：46；
[0057] (f3)1.2:47.5;
[0化引（f4)1.2:50;
[0059] (巧）1.2:60。
[0060] 所述产品具体可为保护剂。
[0061] 上述任一所述电离福射灭菌可为X射线灭菌、丫射线灭菌或高能电子束灭菌。
[0062] 所述丫射线灭菌具体可为W放射性核素钻-60或放射性核素飽-137为福射源的丫 射线。
[0063] 上述任一所述功能蛋白可为骨形态发生蛋白，所述骨形态发生蛋白具体可为人骨 形态发生蛋白。
[0064] 上述任一所述人骨形态发生蛋白，具体可为重组人骨形态发生蛋白BMP-2，其氨基 酸序列具体可为序列表的序列2所示。
[0065] 实验证明，本发明所提供的一种在电离福射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋 白的复合材料进行保护的方法具有抗福射、抗氧化W及保护功能蛋白活性的作用。本发明 提供的保护剂有如下优点：1、安全性高：皆为药用辅料，不存在毒性残留问题;2、稳定性高： 碳水化合物和氨基酸类物质性质稳定，不易被氧化;3、操作简单，可用于实验样品制作，也 适用于规模化生产。
【附图说明】
[0066] 图1为福照灭菌前空白样品的液相色谱图，峰1为riiBMP-2二聚体。
[0067] 图2为福照灭菌后空白样品的液相色谱图，峰4为riiBMP-2二聚体。
[006引图3为福照灭菌后样品1的液相色谱图，峰2为riiBMP-2二聚体。
[0069] 图4为福照灭菌后样品2的液相色谱图，峰2为riiBMP-2二聚体。
[0070] 图5为福照灭菌后样品3的液相色谱图，峰1为riiBMP-2二聚体。
[0071] 图6为福照灭菌后样品4的液相色谱图，峰3为riiBMP-2二聚体。
[0072] 图7为福照灭菌后样品5的液相色谱图，峰2为riiBMP-2二聚体。
[0073] 图8为福照灭菌后样品6的液相色谱图，峰2为riiBMP-2二聚体。
[0074] 图9为福照灭菌后样品7的液相色谱图，峰1为riiBMP-2二聚体。
【具体实施方式】
[0075] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0076] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0077] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验重 复3次，取平均值。
[0078] 下述实施例中的半脫氨酸盐酸盐母液:溶质及其浓度为:半脫氨酸盐酸盐IOOmg/ ml、憐酸二氨钢2.4mg/ml和氯化钢8.8mg/ml;溶剂为水;pH 5.5。
[0079] 下述实施例中的C2C12细胞为购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中 屯、。
[0080] DMEM高糖培养基为美国Hyclone公司产品。
[0081 ] glycine-Na0H缓冲液：含0.1Mglycine-Na0H(p册.6)、lmMMgCl2和lmMZnCl2的水 溶液。
[0082]下述实施例中的精氨酸盐酸盐、半脫氨酸盐酸盐和组氨酸盐酸盐具体为k精氨酸 盐酸盐半脫氨酸盐酸盐和k组氨酸盐酸盐，其化学式依次为式I、式n和式虹：
[0084] 实施例l、riiBMP-2原液的制备
[00化]一、重组菌的构建
[0086] 1、将序列表的序列1自5'末端第64-477位核巧酸所示的双链DNA分子插入载体 祀T-28a ( + )的Nde巧日趾OI酶切位点之间，得到重组质粒。重组质粒中，插入的双链DNA分子 与质粒本身的部分DNA融合，形成序列表的序列I所示的融合基因，表达序列表的序列2所示 的融合蛋白。
[0087] 2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌化21 (DE3)，得到重组菌。
[008引二、riiBMP-2原液的制备
[0089] 取步骤一得到重组菌，然后按照专利CN201310432794.4公开的纯化生产方法经过 包涵体的溶解、复性前纯化、蛋白复性和复性后纯化等步骤，得到rhBMP-2原液。rhBMP-2即 重组人骨形态发生蛋白-2。
[0090] 该 riiBMP-2 原液中 riiBMP-2 的浓度为 1.2mg/mL。
[0091 ]该rhBMP-2原液的组成:溶剂为水，溶质及其溶度如下:憐酸二氨钢2.4mg/mL、氯化 钢8.8mg/mL、rhBMP-2 的浓度为 1.2mg/mL。
[0092] 实施例2、不同功能蛋白保护剂对rhBMP-2的保护效果
[0093] BMP-2二聚体具有诱导形成成骨细胞的生物活性，而BMP-2的多聚体和单体都不具 备所述生物活性。BMP-2通常需要进行福照灭菌，但经钻-60 丫射线福射会产生BMP-2多聚 体，从而失去生物活性。本实施例采用高效液相色谱法检测灭菌前后BMP-2中BMP-2二聚体 的纯度，同时利用C2C12细胞法检测灭菌前后BMP-2的生物学活性，从而评价本发明提供的 前处理方法的作用效果。
[0094] 一、样品的制作
[0095] 1、空白样品
[0096] 取实施例1制备的rhBMP-2原液（溶剂为水，溶质及其浓度如下：rhBMP-2蛋白 1.2mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL) ImL,冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻 干粉命名为空白样品。
[0097] 2、样品 1
[0098] 取99mL实施例1制备的rhBMP-2原液，向其中加入薦糖、精氨酸盐酸盐和ImL半脫氨 酸盐酸盐母液，然后调节抑至5.5,得到混合液1。混合液1中，溶剂为水，溶质及其浓度如下： ;rhBMP-2蛋白1.2mg/mL、薦糖30mg/mL、精氨酸盐酸盐15mg/mL、半脫氨酸盐酸盐Img/mL、憐酸 二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL。
[0099] 取混合液llmL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品1。
[0100] 样品1中，rhBMP-2蛋白、薦糖、精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸盐的质量配比为： 1.2mg:SOmg:15mg:Img D
[0101] 样品1中，组分1(薦糖）和组分n(精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸盐）的质量配比 为：30mg:16mg。
[0102] 样品I中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂（薦糖、精氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸 盐）的质量配比为：1.2mg:46mg。
[0103] 3、样品 2
[0104] 取99mL实施例1制备的riiBMP-2原液，向其中加入海藻糖、组氨酸盐酸 盐和ImL半脫 氨酸盐酸盐母液，调节pH至5.5,得到混合液2。混合液2中，溶剂为水，溶质及其浓度如下： ;rhBMP-2蛋白1.2mg/mL、海藻糖30mg/mL、组氨酸盐酸盐15mg/mL、半脫氨酸盐酸盐Img/mL、憐 酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL。
[0105] 取混合液21mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品2。
[0106] 样品2中，rhBMP-2蛋白、海藻糖、组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸盐的质量配比为： 1.2mg:SOmg:15mg:Img D
[0107] 样品2中，组分1(海藻糖)和组分n(组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸盐)的质量配比 为：30mg:16mg。
[0108] 样品2中，riiBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(海藻糖、组氨酸盐酸盐和半脫氨酸盐酸 盐）的质量配比为：1.2mg:46mg。
[0109] 4、样品 3
[0110] 取IOOmL实施例1制备的riiBMP-2原液，向其中加入薦糖、组氨酸盐酸盐和蛋氨酸， 调节pH至5.0，得到混合液3。混合液3中，溶剂为水，溶质及其浓度如下:riiBMP-2蛋白1.2mg/ mU薦糖15mg/mL、组氨酸盐酸盐30mg/mL、蛋氨酸5mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢 8.8mg/mL〇
[0111] 取混合液31mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品3。
[0112] 样品3中，riiBMP-2蛋白、薦糖、组氨酸盐酸盐和蛋氨酸的质量配比为：1.2mg:15mg: 30mg:5mg。
[0113] 样品3中，组分I(薦糖）和组分n(组氨酸盐酸盐和蛋氨酸）的质量配比为：30mg: TOmgo
[0114] 样品3中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(薦糖、组氨酸盐酸盐和蛋氨酸）的质量 配比为：1.2mg: 50mg。
[0115] 5、样品 4
[0116] 取IOOmL实施例1制备的rhBMP-2原液，向其中加入海藻糖、精氨酸盐酸盐和色氨 酸，得到混合液4。混合液4中，溶剂为水，溶质及其浓度如下:riiBMP-2蛋白1.2mg/mL、海藻糖 30mg/mL、精氨酸盐酸盐15mg/mL、色氨酸2.5mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8. Smg/ ITlL O
[0117] 取混合液41mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品4。
[0118] 样品4中，rhBMP-2蛋白、海藻糖、精氨酸盐酸盐和色氨酸的质量配比为：1.2mg: 30mg:15mg:2.5mg。
[0119] 样品4中，组分I(薦糖）和组分n(精氨酸盐酸盐和色氨酸）的质量配比为：30mg: 17.5mg O
[0120] 样品4中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(薦糖、精氨酸盐酸盐和色氨酸）的质量 配比为：1.2mg: 47.5mg。
[0121] 6、样品 5
[0122] 取IOOmL实施例1制备的rhBMP-2原液，向其中加入薦糖、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐 酸盐，得到混合液5。混合液5中，溶剂为水，溶质及其浓度如下:riiBMP-2蛋白1.2mg/mL、薦糖 15mg/mL、组氨酸盐酸盐15mg/mL、精氨酸盐酸盐30mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢 8.8mg/mL。
[0123] 取混合液51mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品5。
[0124] 样品5中，rhBMP-2蛋白、薦糖、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸的质量配比为：1.2mg: 15mg:15mg:30mg。
[0125] 样品5中，组分i(薦糖）和组分n(组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸）的质量配比为： 30mg：90mg〇
[01%]样品5中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(薦糖、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸）的 质量配比为：1.2mg: 60mg。
[0127] 7、样品 6
[012引取IOOmL实施例1制备的riiBMP-2原液，向其中加入薦糖，得到混合液6。混合液6中， 溶剂为水，溶质及其浓度如下:riiBMP-2蛋白1.2mg/mL、薦糖30mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL 和氯化钢8.8mg/mL。
[0129] 取混合液61mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品6。
[0130] 样品帥，riiBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(薦糖)的质量配比为：1.2mg:30mg。
[0131] 8、样品 7
[0132] 取100血实施例1制备的riiBMP-2原液，向其中加入组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐， 得到混合液7。所述混合液7中，溶剂为水，溶质及其浓度如下:rhBMP-2蛋白1.2mg/mL、组氨 酸盐酸盐15mg/mL、精氨酸盐酸盐30mg/mL、憐酸二氨钢2.4mg/mL和氯化钢8.8mg/mL。
[0133] 取混合液71mL，冷冻干燥，制备成冻干粉。将该冻干粉命名为样品7。
[0134] 样品7中，rhBMP-2蛋白、组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸的质量配比为：1.2mg:15mg: 3 Omgo
[0135] 样品7中，rhBMP-2蛋白与功能蛋白保护剂(组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐)的质量 配比为：1.2mg:45mg。
[0136] 二、电离福射灭菌
[0137] 分别将步骤一制备的各个样品（空白样品、样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样 品6或样品7)进行如下操作:取步骤一制备的样品，进行放射性核素钻-60为福射源的T射 线灭菌(福射剂量为25kGy)。
[013引 S、不同功能蛋白保护剂对riiBMP-2的保护效果
[0139] 分别将步骤一制备的空白样品和步骤二得到的各个样品进行如下操作(为了表述 方便，将步骤一制备的样品称为福照灭菌前样品，将步骤二得到的各个样品称为福照灭菌 后样品）：
[0140] 1、采用高效液相色谱法检测各个样品中的riiBMP-2二聚体纯度
[0141 ]高效液相色谱的具体参数:高效液相色谱仪的型号为DIONEX U-3000;使用体积排 阻色谱柱(赛分科技有限公司，SRT SEC-300，7.8 X 300mm，5皿）；流动相组成为0.1 %S氣乙 酸的乙腊溶液:0.1 % S氣乙酸的水溶液=300: 700 (体积比），流速为0.5mL/min。检测波长 为 280nnurhBMP-2 二聚体保留时间为19.2-19.5min。
[0142] 按照面积归一化法计算，rhBMP-2二聚体的峰面积所占总峰面积比例，即为样品 riiBMP-2二聚体的纯度。实验结果见表1。
[0143] 表1.福照灭菌前后各样品的纯度
[0145] 结果表明，福照灭菌后空白样品中riiBMP-2二聚体的纯度为31.05% (图2)，福照灭 菌后样品1中riiBMP-2二聚体的纯度为95.84 % (图3)，福照灭菌后样品2中riiBMP-2二聚体的 纯度为96.05% (图4)，福照灭菌后样品3中riiBMP-2二聚体的纯度为92.31 % (图5)，福照灭 菌后样品4中riiBMP-2二聚体的纯度为93.01 % (图6)，福照灭菌后样品5中riiBMP-2二聚体的 纯度为85.37% (图7)，福照灭菌后样品6中riiBMP-2二聚体的纯度为49.08% (图8)，福照灭 菌后样品6中^181口-2二聚体的纯度为51.90%(图9)。
[0146] 2、C2Ci2细胞法检测样品生物活性
[0147] C2C12细胞在骨形态形成蛋白（BMP-2)的作用下，分化为成骨细胞。而碱性憐酸酶 (ALP)活性是成骨细胞的功能及分化程度指标，因此通过检测检测碱性憐酸酶的含量可W 反映C2C12细胞培养过程中加入的BMP-2的生物活性。
[0148] 检测灭菌后样品的保留活性百分比的方法具体如下：
[0149] 1)溶液准备
[0150] a、血清:胎牛血清或新生牛血清。
[0151] b、完全培养基:含10%血清的DMEM高糖培养基。
[0152] C、基础培养基:含2 %血清的DMEM高糖培养基。
[0153] d、消化液:准确称取膜酶0.05g，抓TA 0.02g，加PBS溶液100mL，揽拌混匀，溶液采 用注射器针头滤器(孔径^ 0.22曲1)经无菌过滤法除菌。分装至EP管，于-20°C保存备用。
[0154] e、细胞裂解液:含1 %NP40的glycine-NaOH缓冲 液。
[0155] f、显色液:含4mg/ml pNPP的glycine-NaOH缓冲液。
[0156] g、终止液:0.2M NaOH水溶液。
[0157] 2)样品准备
[0158] 待测样品为标准品（福照灭菌前样品)或测试样品（福照灭菌后样品）。
[0159] 3)细胞培养
[0160] 用完全培养基培养C2C12细胞至70~80 %的融合度，然后将C2C12细胞消化传代，接 种于96孔板中（每孔接种5000-10000个C2C12细胞)并培养2地。培养条件为5 % C〇2、37°C。
[0161] 4)rhBMP-2作用于细胞
[0162] 完成步骤3)后，取所述96孔板，弃去培养基，每孔加入20化1含待测样品的基础培 养基，继续培养72h。培养条件为5 % C〇2、37°C。
[0163] 5)碱性憐酸酶测定
[0164] 完成步骤4)后，取所述96孔板，弃去培养基，每孔加入20化1的PBS缓冲液(将化Cl 8 . Og，KCl 0.2g，化油POa . 44g和KH2PO4O . 2g溶于900ml注射用水，调pH至7.4，定容至 1000 mL,灭菌)洗涂两遍，吸干残液;然后每孔加入I(K)山细胞裂解液，室溫作用比;最后每孔 加入SOiil显色液，37°C作用40-60min后，用SOiil终止液终止反应。测定反应液的光吸收值 (检测光谱为405nm，参比光谱为465nm，光吸收值= 405nm光吸收值-465nm光吸收值）。
[0165] 6)灭菌后样品保留活性百分比
[0166] 步骤5)的实验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算 结果：
[0168] 化为测试样品预稀释倍数；
[0169] 化为标准品预稀释倍数；
[0170] Es为测试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
[0171] 化为标准品半效量的稀释倍数。
[0172] 实验结果见表2。结果表明，本发明提供的功能蛋白保护剂具有保护电离福射灭菌 过程中rhBMP-2活性的作用。
[0173] 表2.福照灭菌后各样品保留活性百分比
【主权项】
1. 一种在电离辐射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行保护的方 法，包括如下步骤:在液相体系中，将所述"功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料"与组 分I和组分Π 混合;所述组分I为碳水化合物;所述组分Π 为氨基酸和/或氨基酸盐酸盐。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述液相体系中，所述组分I和所述组分Π 的 质量配比为如下(al)、（a2)、（a3)、（a4)、（a5)S(a6): (al)30：0.1-1800； (a2)30：16-90； (a3)30：16； (a4)30：70； (a5)30：17.5； (a6)30：90〇3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述液相体系中，所述功能蛋白、所述组分I 和所述组分Π 的质量配比为如下(bl)、（b2)、（b3)、（b4)、（b5)S(b6): (bl)l.2:15-30:0.1-1800； (b2)1.2：15-30：16-45； (b3)l.2：30：16； (b4)l.2：15：35； (b5)l.2:30:17.5； (b6)1.2:15:45。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述液相体系中，所述组分I的浓度为0. lmg/ mL-30mg/mL，优选为 15mg/mL-30mg/mL;所述组分 Π 的浓度为0 · lmg/mL-45mg/mL，优选为 16mg/mL-45mg/mL 〇5. 如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于： 所述碳水化合物的加入形式为蔗糖或海藻糖； 所述氨基酸的加入形式为蛋氨酸和/或色氨酸； 所述氨基酸盐酸盐的加入形式为精氨酸盐酸盐、半胱氨酸盐酸盐和/或组氨酸盐酸盐。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为如下（cl)、（c2)、（C3)、（C4)、 (c5)、（c6)、（c7)、（c8)、（c9)S(clO): (cl)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为精氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸盐； 鹿糖的浓度为30mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;半胱氨酸盐酸盐的浓度为lmg/mL; (c2)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸 盐；海藻糖的浓度为30mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;半胱氨酸盐酸盐的浓度为 lmg/mL； (c3)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和蛋氨酸；蔗糖的浓 度为15mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为30mg/mL;蛋氨酸的浓度为5mg/mL; (c4)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分Π 为精氨酸盐酸盐和色氨酸;海藻糖 的浓度为30mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;色氨酸的浓度为2.5mg/mL; (c5)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐;蔗 糖的浓度为15mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为30mg/mL; (c6)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为精氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸盐； 功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，鹿糖的浓度为30mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;半胱 氨酸盐酸盐的浓度为lmg/mL; (c7)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和半胱氨酸盐酸 盐；功能蛋白的浓度为1.2mg/mL，海藻糖的浓度为30mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/ mL;半胱氨酸盐酸盐的浓度为lmg/mL; (c8)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和蛋氨酸；功能蛋白 的浓度为1 · 2mg/mL，鹿糖的浓度为15mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为30mg/mL;蛋氨酸的浓度 为5mg/mL; (c9)所述方法中，所述组分I为海藻糖，所述组分Π 为精氨酸盐酸盐和色氨酸;功能蛋 白的浓度为1.2mg/mL，海藻糖的浓度为30mg/mL;精氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;色氨酸的 浓度为2.5mg/mL; (clO)所述方法中，所述组分I为蔗糖，所述组分Π 为组氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐;功 能蛋白的浓度为1.2mg/mL，鹿糖的浓度为15mg/mL;组氨酸盐酸盐的浓度为15mg/mL;精氨酸 盐酸盐的浓度为30mg/mL。7. 如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于:所述功能蛋白为如下（dl)、（d2)、 (d3)或(d4): (dl)骨形态发生蛋白； (d2)人骨形态发生蛋白； (d3)人骨形态发生蛋白-2; (d4)序列表的序列2所示的人骨形态发生蛋白-2。8. 如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于:所述在电离辐射灭菌为如下（el)、 (e2)、（e3)或(e4): (el) γ射线灭菌； (e2)以放射性核素钴-60为辐射源的γ射线灭菌； (e3)以放射性核素钴-60为辐射源的γ射线灭菌，辐射剂量为15kGy-35kGy; (e4)以放射性核素钴-60为辐射源的γ射线灭菌，辐射剂量为25kGy。9. 一种对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行电离辐射灭菌的方法，包括如 下步骤： (1) 采用权利要求1至7中任一所述的方法对所述"功能蛋白或含有所述功能蛋白的复 合材料"进行前处理； (2) 进行冷冻干燥； (3) 电离辐射灭菌。10. -种在电离辐射灭菌前对功能蛋白进行保护的产品，包括权利要求1、权利要求2和 权利要求5中任一所述组分I和组分Π 。
【专利摘要】本发明公开了一种在电离辐射灭菌前对功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料进行保护的方法。其包括如下步骤：在液相体系中，将所述“功能蛋白或含有所述功能蛋白的复合材料”与组分Ⅰ和组分Ⅱ混合；所述组分Ⅰ为碳水化合物；所述组分Ⅱ为氨基酸和/或氨基酸盐酸盐。实验证明，本发明所提供的方法具有抗辐射、抗氧化以及保护功能蛋白活性的作用，具有如下优点：1、安全性高：皆为药用辅料，不存在毒性残留问题；2、稳定性高：碳水化合物和氨基酸类物质性质稳定，不易被氧化；3、操作简单，可用于实验样品制作，也适用于规模化生产。
【IPC分类】A61L2/00
【公开号】CN105497925
【申请号】CN201510998411
【发明人】彭继学, 张东刚, 屈长宏, 苑晓佩, 陈红蕾, 南南
【申请人】烟台正海生物科技股份有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月25日
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