海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒及其制备方法和在制备电化学免疫探针中的应用
海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒及其制备方法和在制备电化学免疫探针中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒的制备方法和在制备免疫 探针中的应用，属于电化学传感器领域，它可以用于免疫分析和检测。
【背景技术】
[0002] 癌症是一类恶性肿瘤的统称。我国每年有300万人被确诊为癌症，并且这 一数字还在逐年上升。癌症的治疗难度大，死亡率高，是困扰人类的难题之一。研 究表明，早发现早治疗能够有效的提高癌症治愈率同时降低死亡率。癌症的早期筛 查主要针对的是肿瘤标志物。肿瘤标志物通常由胚胎组织和肿瘤组织直接产生， 它的浓度变化能够反应肿瘤的动态变化，并与瘤体大小和临床分期有关（Jo s eph A. Ludwig, John N. Weinstein, Biomarkers in Cancer Staging, Prognosis and Treatment Selection，Nat. Rev. Cancer，2005, 5, 845 - 856.)。一种肿瘤标志物浓度的升高可能与多种 癌症有关，而一种癌症可以分泌多种肿瘤标志物。因此，为了避免单一肿瘤标志物的检测引 起"假阳性"，提高诊断准确率，降低测试费用，同时检测几种肿瘤标志物是目前研究的一个 热点问题。
[0003] 电化学免疫分析技术是一种快速、经济、灵敏度高、可微型化的检测肿瘤标志物的 分析方法（Bhaskara V. Chikkaveeraiah, Ashwinkumar A. Bhirde, Nicole Y. Morgan, Henry S. Eden, Xiaoyuan Chen, Electrochemical Immunosensors for Detection of Cancer Protein Biomarkers，ACS Nano, 2012, 6, 6546 - 6561.)。实现多组分同时检测的电化学免 疫分析技术主要有以下两种。一种是基于位置分辨的阵列方法，此方法通常需要特殊的多 通道工作电极，如溅射沉积电极或热解石墨电极等，这些电极材料为一次性材料，导致测试 成本高并产生大量废弃物。另一种是基于标志物分辨的多探针标记方法，即在不同的二级 抗体上标记不同的电化学活性信号物质，构建夹心型电化学传感界面，直接在一根电极上 实现多种肿瘤标志物的同时检测。后者的优点在于电极可以反复使用，能有效降低成本节 约资源。
[0004] 构建电化学免疫传感器的常用电化学活性物质有二茂铁类聚合物，硫堇、甲苯胺 蓝、普鲁士蓝等有机染料类，醌、酚、醚等聚合物类，由于这类物质难以与抗体直接结合进行 标记，通常需要键合亲水官能团进行改性，或借助纳米材料作为支撑体制成复合材料，间接 标记抗体，制备过程复杂。Cu 2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+等过渡金属类，具有特征的氧化还原电极电 势，常在溶出伏安方法中用作电活性信号物质，但需要强酸溶解，并在电极上镀汞膜富集， 过程繁琐。
[0005] 海藻酸钠是由a -L-古洛糖醛酸（G单元）和β -D-甘露糖醛酸（M单元）两种结 构单元构成无支链的嵌段共聚物，是一种天然的多糖。它的生物相容性好，并具有很好的亲 水性，并含有大量的官能团如羧基和羟基，常用于蛋白细胞等生物活性物质的包埋。G单元 上的Na +与二价金属离子发生离子交换后，使G集团堆积交联成网状结构，发生不可逆的凝 胶化作用。利用此作用可以制备海藻酸交联二价离子的微球。目前制备海藻酸微球的方法 主要有：滴注法、乳化法、溶剂蒸发法、高压静电液滴法和喷雾干燥法。这些方法制备的海藻 酸微球都在微米级别，目前制备粒径均匀、球形度好、纳米级别的海藻酸微球，依然是有待 解决的难题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球及其制 备方法；
[0007] 本发明的目的之二在于提供一种由所述新型海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米 微球制备得到的藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针；
[0008] 本发明的目的之三在于提供一种由藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针制备得到的电化学免疫传感器。
[0009] 本发明的上述目的是通过以下技术手段实现的：
[0010] 本发明在微乳液中利用二价金属离子Cd2+、Pb2+或Cu 2+分别与海藻酸钠交联，形成 海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。这种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球， 用戊二醛活化后可以直接偶联抗体制成免疫探针，其中的二价金属离子产生特征的可分辨 的电化学信号峰，金属离子的氧化还原峰与标记的抗体建立一一对应的关系，峰高与检测 的抗原的浓度有关，从而实现三种肿瘤标志物的同时监测。
[0011] 本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过以下方 法制备得到：
[0012] (1)将l_3g曲拉通，0. 5-1. 5g正己醇，4_6g正辛烷，l_2mL海藻酸钠水溶液混合搅 拌30-90min制备成均匀的微乳液1 ;
[0013] (2)将1-38曲拉通，0.5-1.58正己醇，4-68正辛烷，与1-21^〇(1(：1 2水溶液、 Pb (N03)2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液2 ;
[0014] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应l_6h，产物离心，沉淀用去 离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。
[0015] 在本发明中，优选的，步骤（1)所述的海藻酸钠的水溶液的质量百分比浓度为 1-2%。
[0016] 在本发明中，优选的，步骤（2)所述的CdCl2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M，Pb(N03)2 的水溶液的浓度为〇. 1-2. 0M，CuCl2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M。
[0017] 本发明方法简单，且制备得到纳米尺寸的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜微球，具 有可分辨的金属离子的电化学信号峰。因此使用该海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微 球制备的免疫探针制备电化学免疫传感器，可以实现三种肿瘤标志物的同时检测。
[0018] 因此，进一步的，本发明还提出了所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球 在制备海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针中的应用。
[0019] 本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在于通 过以下方法制备得到：
[0020] (1)将以上所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、分 散；
[0021] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离 心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0022] (3)室温下，将活化的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球分别与抗体溶液偶 联，尚心除去上清液；
[0023] (4)沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微 球免疫探针于4°C储存。
[0024] 在本发明中，优选的，步骤（2)中所用戊二醛的质量百分比浓度为5-15%。
[0025] 更进一步的，本发明还提出了所述的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免 疫探针在制备电化学免疫传感器中的应用。按照本发明所述的方法分别制备偶联三种抗体 的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针，将制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻 酸铜纳米微球免疫探针固定在电极的表面，得到能够同时对三种肿瘤标志物进行同时检测 的电化学免疫传感器。
[0026] 在本发明的具体实施例中，作为范例，给出了一种能够同时实现对肿瘤标志物 CEA、AFP和PSA进行检测的电化学免疫传感器，其特征在于通过以下方法制备得到：
[0027] (1)将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去 离子水洗涤、分散；
[0028] (2)将海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离 心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0029] (3)室温下，将活化的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别与抗肿瘤标志 物CEA、AFP或PSA的抗体溶液偶联，离心除去上清液；
[0030] (4)沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微 球免疫探针于4°C储存。
[0031] (5)通过免疫反应将制得的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针固 定在电极的表面，即得。
[0032] 本发明通过将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别偶联了甲胎蛋白 (AFP)、癌胚抗原（CEA)和前列腺特异性抗原（PSA)的抗体后，制备了海藻酸镉、海藻酸铅和 海藻酸铜纳米微球免疫探针，通过免疫反应将制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米 微球免疫探针固定在电 极的表面从而得到了一种电化学免疫传感器，使用该电化学免疫传 感器可以实现对甲胎蛋白、癌胚抗原和前列腺特异性抗原的同时检测，并且具有较低的检 出限、较宽的检测范围和良好的重现性。
[0033] 实验证明：利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球电化学免疫探针同时检 测不同浓度的甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)和前列腺特异性抗原（PSA)，其检测线性范 围均为 0· 01-100ng/mL。检出限分别为 0· 01ng/mL，0. 0086ng/mL 和 0· 0075ng/mL。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明一实施例制备的㈧海藻酸镉纳米微球的透射电镜图片，⑶海藻 酸铅纳米微球的透射电镜图片，（C)海藻酸铜纳米微球的透射电镜图片，（D)海藻酸镉纳米 微球的扫描电镜图片，（E)海藻酸铅纳米微球的扫描电镜图片，（F)海藻酸铜纳米微球的扫 描电镜图片；
[0035] 图2为利用制备的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针同时检测不 同浓度的AFP、CEA和PSA的差分脉冲伏安图（A)、电流与AFP浓度对数（B)、电流与CEA浓 度对数（C)、电流与PSA浓度对数（D)的线性关系图。从图中可以看出该免疫传感器对AFP、 CEA和PSA的检测线性范围均为0. 01-100ng/mL。其检出限分别为，0. 01ng/mL、0. 0086ng/ mL 和 0· 0075ng/mL。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0037] 实施例1 :
[0038] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0039] (1)将2. 0g曲拉通，1. 0g正己醇，3. 0g正辛烷，1. 5mL 1. 5% (w/w)的海藻酸钠水 溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0040] (2)将2. 0g曲拉通，L 0g正己醇，3. 0g正辛烷，与(λ 5M L 5mL的CdCl2水溶液、 Pb (N03) 2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液2。
[0041] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应4h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球；透射电镜观察得到的海藻酸镉， 海藻酸铅以及海藻酸铜纳米微球的形貌如图1A、1B和1C所示。扫描电镜观察得到的海藻 酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的形貌如图1D、1E和1F所示。
[0042] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0043] 2. 1被检测样品：人血清
[0044] 2. 2 方法
[0045] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0046] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用10% (w/w)的戊二醛水溶 液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0047] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0048] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0049] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0050] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01Μ，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0051] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0052] 3、结果
[0053] 对血清样品的检测结果如下表1所示：
[0054] 表 1
[0055]
[0056] 实施例2 :
[0057] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0058] (1)将2. 5g曲拉通，1. 5g正己醇，3. 5g正辛烷，2. OmL 1. 5% (w/w)的海藻酸钠水 溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0059] (2)将2. 5g曲拉通，L 5g正己醇，3. 5g正辛烷，与L 0M 2. OmL的CdCl2水溶液、 Pb (N03)2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌1小时制备成均匀的微乳液2。
[0060] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应5h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。
[0061] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0062] 2. 1被检测样品：人血清
[0063] 2. 2 方法
[0064] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0065] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用12% (w/w)的戊二醛水溶 液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0066] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0067] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0068] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0069] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0070] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0071] 3、结果
[0072] 对血清样品的检测结果如下表2所示，：
[0073] 表 2
[0074]
[0075] 实施例3 :
[0076] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0077] (1)将1. 5g曲拉通，0· 5g正己醇，2. 5g正辛烧，1. OmL 1. 5%的海藻酸钠水溶液混 合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0078] (2)将1. 5g曲拉通，0· 5g正己醇，2. 5g正辛烷，与(λ 75M L OmL的CdCl2水溶液， 或Pb (N03) 2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30min制备成均匀的微乳液2。
[0079] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液 2中，室温下搅拌反应3h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球。
[0080] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0081] 2. 1被检测样品：人血清
[0082] 2. 2 方法
[0083] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0084] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用8% (w/w)的戊二醛水溶液 处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0085] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0086] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0087] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0088] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01Μ，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0089] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0090] 3、结果
[0091] 对血清样品的检测结果如下表3所示：
[0092] 表 3
[0093]
[0094] 实施例4 :本发明的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针的检测线 性范围及检出限的测定
[0095] 1、海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针的制备：
[0096] 按照实施例1的方法制备海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针。
[0097] 2、免疫传感器构建过程：
[0098] 20 μ L 200 μ g ·ιΛ 1的AFP、CEA和PSA的捕获抗体混合溶液在4°C条件下在多孔钼 修饰的玻碳电极上孵化过夜。电极表面多余的抗体用〇. 1M，pH = 7. 3的PBS清洗掉。然后， 使用150μ L，2%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异性吸附。电极用0. 1M，pH =7. 3的PBS过量牛血清白蛋白冲洗后用浓度分别为0. 01，0. 05, 0. 1，0. 5, 1，5, 10, 50, 10 Ong · mL 1的AFP、CEA或PSA抗原混合溶液在37°C下孵育超过40min。未反应的抗原使用 0. 1M，pH = 7. 3的PBS清洗掉，在37°C下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海 藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40分钟。然后，免疫传感电极用0. 1M，pH = 7. 3的PBS 清洗到过量的免疫探针。免疫反应完成后，以0. 1M，pH = 6. 5的PBS为检测液，用方波伏安 法检测电流响应信号。
[0099] 3、结果
[0100] 图2为海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针同时检测不同浓度的 AFP、CEA和PSA的差分脉冲伏安图（A)、电流与AFP浓度对数（B)、电流与CEA浓度对数（〇、 电流与PSA浓度对数（D)的线性关系图。
[0101] 从图中可以看出该免疫传感器对AFP、CEA和PSA的检测线性范围均为 0· 01-100ng/mL。其检出限分别为，0· 01ng/mL、0. 0086ng/mL 和 0· 0075ng/mL。
【主权项】
1. 一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过以下方法制备得 到： (1) 将l-3g曲拉通，0. 5-1. 5g正己醇，4-6g正辛烷，l-2mL海藻酸钠水溶液混合搅拌 30-90min制备成均匀的微乳液1 ; (2) 将l-3g曲拉通，0· 5-1. 5g正己醇，4-6g正辛烧，与l-2mL的CdCl2水溶液、Pb (N03) 2 水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液2 ; (3) 将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应l-6h，产物离心，沉淀用去离子 水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。2. 如权利要求1所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于：步骤 (1)所述的海藻酸钠的水溶液的质量百分比浓度为1-2%。3. 如权利要求1所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于：步骤 ⑵所述的CdCl2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M，Pb (N03) 2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M，CuCl2 的水溶液的浓度为〇. 1-2. 0M。4. 权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球在制备海藻酸 镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针中的应用。5. -种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在于通过以下方法 制备得到： (1) 将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子 水洗涤、分散； (2) 将海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离心， 沉淀用去离子水洗涤、分散； (3) 室温下，将活化的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球分别与抗体溶液偶联， 离心除去上清液； (4) 沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免 疫探针于4°C储存。6. 如权利要求5所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在 于：步骤（2)中所用戊二醛的质量百分比浓度为5-15%。7. 权利要求5-6任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针在制 备电化学免疫传感器中的应用，优选的，按照权利要求5的方法分别制备偶联不同种抗体 的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针，将制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻 酸铜纳米微球免疫探针固定在电极的表面，得到能够同时对三种肿瘤标志物进行检测的电 化学免疫传感器。8. -种能够同时实现对肿瘤标志物CEA、AFP和PSA进行检测的电化学免疫传感器，其 特征在于通过以下方法制备得到： (1) 将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子 水洗涤、分散； (2) 将海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离心， 沉淀用去离子水洗涤、分散； (3) 室温下，将活化的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别与抗肿瘤标志物 CEA、AFP或PSA的抗体溶液偶联，离心除去上清液； (4) 沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免 疫探针于4°C储存。 (5) 通过免疫反应将制得的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针固定在 电极的表面，即得。9.权利要求8所述的电化学免疫传感器在制备对肿瘤标志物CEA、AFP和PSA进行同 时检测的试剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒及其制备方法和在制备电化学免疫探针中的应用。本发明通过在微乳液中用镉离子、铅离子或铜离子分别交联海藻酸钠制备了纳米级的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜球形颗粒，且能产生可分辨电化学信号。本发明制备方法的特点是制备条件温和，无需外加信号物质即可直接用于标记。使用此海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒标记不同抗体制备的电化学免疫传感器，能够实现不分区的三靶标的同时检测。本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒免疫探针，以及由其制备得到的电化学免疫传感器在免疫传感领域将具有广泛的应用前景。
【IPC分类】G01N33/543, G01N33/574, C08J3/14, C08L5/04
【公开号】CN105504314
【申请号】CN201410488196
【发明人】马占芳, 王子凤
【申请人】首都师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月22日
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒的制备方法和在制备免疫 探针中的应用，属于电化学传感器领域，它可以用于免疫分析和检测。
【背景技术】
[0002] 癌症是一类恶性肿瘤的统称。我国每年有300万人被确诊为癌症，并且这 一数字还在逐年上升。癌症的治疗难度大，死亡率高，是困扰人类的难题之一。研 究表明，早发现早治疗能够有效的提高癌症治愈率同时降低死亡率。癌症的早期筛 查主要针对的是肿瘤标志物。肿瘤标志物通常由胚胎组织和肿瘤组织直接产生， 它的浓度变化能够反应肿瘤的动态变化，并与瘤体大小和临床分期有关（Jo s eph A. Ludwig, John N. Weinstein, Biomarkers in Cancer Staging, Prognosis and Treatment Selection，Nat. Rev. Cancer，2005, 5, 845 - 856.)。一种肿瘤标志物浓度的升高可能与多种 癌症有关，而一种癌症可以分泌多种肿瘤标志物。因此，为了避免单一肿瘤标志物的检测引 起"假阳性"，提高诊断准确率，降低测试费用，同时检测几种肿瘤标志物是目前研究的一个 热点问题。
[0003] 电化学免疫分析技术是一种快速、经济、灵敏度高、可微型化的检测肿瘤标志物的 分析方法（Bhaskara V. Chikkaveeraiah, Ashwinkumar A. Bhirde, Nicole Y. Morgan, Henry S. Eden, Xiaoyuan Chen, Electrochemical Immunosensors for Detection of Cancer Protein Biomarkers，ACS Nano, 2012, 6, 6546 - 6561.)。实现多组分同时检测的电化学免 疫分析技术主要有以下两种。一种是基于位置分辨的阵列方法，此方法通常需要特殊的多 通道工作电极，如溅射沉积电极或热解石墨电极等，这些电极材料为一次性材料，导致测试 成本高并产生大量废弃物。另一种是基于标志物分辨的多探针标记方法，即在不同的二级 抗体上标记不同的电化学活性信号物质，构建夹心型电化学传感界面，直接在一根电极上 实现多种肿瘤标志物的同时检测。后者的优点在于电极可以反复使用，能有效降低成本节 约资源。
[0004] 构建电化学免疫传感器的常用电化学活性物质有二茂铁类聚合物，硫堇、甲苯胺 蓝、普鲁士蓝等有机染料类，醌、酚、醚等聚合物类，由于这类物质难以与抗体直接结合进行 标记，通常需要键合亲水官能团进行改性，或借助纳米材料作为支撑体制成复合材料，间接 标记抗体，制备过程复杂。Cu 2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+等过渡金属类，具有特征的氧化还原电极电 势，常在溶出伏安方法中用作电活性信号物质，但需要强酸溶解，并在电极上镀汞膜富集， 过程繁琐。
[0005] 海藻酸钠是由a -L-古洛糖醛酸（G单元）和β -D-甘露糖醛酸（M单元）两种结 构单元构成无支链的嵌段共聚物，是一种天然的多糖。它的生物相容性好，并具有很好的亲 水性，并含有大量的官能团如羧基和羟基，常用于蛋白细胞等生物活性物质的包埋。G单元 上的Na +与二价金属离子发生离子交换后，使G集团堆积交联成网状结构，发生不可逆的凝 胶化作用。利用此作用可以制备海藻酸交联二价离子的微球。目前制备海藻酸微球的方法 主要有：滴注法、乳化法、溶剂蒸发法、高压静电液滴法和喷雾干燥法。这些方法制备的海藻 酸微球都在微米级别，目前制备粒径均匀、球形度好、纳米级别的海藻酸微球，依然是有待 解决的难题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球及其制 备方法；
[0007] 本发明的目的之二在于提供一种由所述新型海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米 微球制备得到的藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针；
[0008] 本发明的目的之三在于提供一种由藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针制备得到的电化学免疫传感器。
[0009] 本发明的上述目的是通过以下技术手段实现的：
[0010] 本发明在微乳液中利用二价金属离子Cd2+、Pb2+或Cu 2+分别与海藻酸钠交联，形成 海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。这种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球， 用戊二醛活化后可以直接偶联抗体制成免疫探针，其中的二价金属离子产生特征的可分辨 的电化学信号峰，金属离子的氧化还原峰与标记的抗体建立一一对应的关系，峰高与检测 的抗原的浓度有关，从而实现三种肿瘤标志物的同时监测。
[0011] 本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过以下方 法制备得到：
[0012] (1)将l_3g曲拉通，0. 5-1. 5g正己醇，4_6g正辛烷，l_2mL海藻酸钠水溶液混合搅 拌30-90min制备成均匀的微乳液1 ;
[0013] (2)将1-38曲拉通，0.5-1.58正己醇，4-68正辛烷，与1-21^〇(1(：1 2水溶液、 Pb (N03)2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液2 ;
[0014] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应l_6h，产物离心，沉淀用去 离子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。
[0015] 在本发明中，优选的，步骤（1)所述的海藻酸钠的水溶液的质量百分比浓度为 1-2%。
[0016] 在本发明中，优选的，步骤（2)所述的CdCl2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M，Pb(N03)2 的水溶液的浓度为〇. 1-2. 0M，CuCl2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M。
[0017] 本发明方法简单，且制备得到纳米尺寸的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜微球，具 有可分辨的金属离子的电化学信号峰。因此使用该海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微 球制备的免疫探针制备电化学免疫传感器，可以实现三种肿瘤标志物的同时检测。
[0018] 因此，进一步的，本发明还提出了所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球 在制备海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针中的应用。
[0019] 本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在于通 过以下方法制备得到：
[0020] (1)将以上所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、分 散；
[0021] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离 心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0022] (3)室温下，将活化的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球分别与抗体溶液偶 联，尚心除去上清液；
[0023] (4)沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微 球免疫探针于4°C储存。
[0024] 在本发明中，优选的，步骤（2)中所用戊二醛的质量百分比浓度为5-15%。
[0025] 更进一步的，本发明还提出了所述的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免 疫探针在制备电化学免疫传感器中的应用。按照本发明所述的方法分别制备偶联三种抗体 的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针，将制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻 酸铜纳米微球免疫探针固定在电极的表面，得到能够同时对三种肿瘤标志物进行同时检测 的电化学免疫传感器。
[0026] 在本发明的具体实施例中，作为范例，给出了一种能够同时实现对肿瘤标志物 CEA、AFP和PSA进行检测的电化学免疫传感器，其特征在于通过以下方法制备得到：
[0027] (1)将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去 离子水洗涤、分散；
[0028] (2)将海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离 心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0029] (3)室温下，将活化的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别与抗肿瘤标志 物CEA、AFP或PSA的抗体溶液偶联，离心除去上清液；
[0030] (4)沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微 球免疫探针于4°C储存。
[0031] (5)通过免疫反应将制得的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针固 定在电极的表面，即得。
[0032] 本发明通过将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别偶联了甲胎蛋白 (AFP)、癌胚抗原（CEA)和前列腺特异性抗原（PSA)的抗体后，制备了海藻酸镉、海藻酸铅和 海藻酸铜纳米微球免疫探针，通过免疫反应将制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米 微球免疫探针固定在电 极的表面从而得到了一种电化学免疫传感器，使用该电化学免疫传 感器可以实现对甲胎蛋白、癌胚抗原和前列腺特异性抗原的同时检测，并且具有较低的检 出限、较宽的检测范围和良好的重现性。
[0033] 实验证明：利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球电化学免疫探针同时检 测不同浓度的甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)和前列腺特异性抗原（PSA)，其检测线性范 围均为 0· 01-100ng/mL。检出限分别为 0· 01ng/mL，0. 0086ng/mL 和 0· 0075ng/mL。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明一实施例制备的㈧海藻酸镉纳米微球的透射电镜图片，⑶海藻 酸铅纳米微球的透射电镜图片，（C)海藻酸铜纳米微球的透射电镜图片，（D)海藻酸镉纳米 微球的扫描电镜图片，（E)海藻酸铅纳米微球的扫描电镜图片，（F)海藻酸铜纳米微球的扫 描电镜图片；
[0035] 图2为利用制备的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针同时检测不 同浓度的AFP、CEA和PSA的差分脉冲伏安图（A)、电流与AFP浓度对数（B)、电流与CEA浓 度对数（C)、电流与PSA浓度对数（D)的线性关系图。从图中可以看出该免疫传感器对AFP、 CEA和PSA的检测线性范围均为0. 01-100ng/mL。其检出限分别为，0. 01ng/mL、0. 0086ng/ mL 和 0· 0075ng/mL。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0037] 实施例1 :
[0038] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0039] (1)将2. 0g曲拉通，1. 0g正己醇，3. 0g正辛烷，1. 5mL 1. 5% (w/w)的海藻酸钠水 溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0040] (2)将2. 0g曲拉通，L 0g正己醇，3. 0g正辛烷，与(λ 5M L 5mL的CdCl2水溶液、 Pb (N03) 2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液2。
[0041] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应4h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球；透射电镜观察得到的海藻酸镉， 海藻酸铅以及海藻酸铜纳米微球的形貌如图1A、1B和1C所示。扫描电镜观察得到的海藻 酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的形貌如图1D、1E和1F所示。
[0042] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0043] 2. 1被检测样品：人血清
[0044] 2. 2 方法
[0045] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0046] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用10% (w/w)的戊二醛水溶 液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0047] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0048] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0049] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0050] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01Μ，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0051] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0052] 3、结果
[0053] 对血清样品的检测结果如下表1所示：
[0054] 表 1
[0055]
[0056] 实施例2 :
[0057] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0058] (1)将2. 5g曲拉通，1. 5g正己醇，3. 5g正辛烷，2. OmL 1. 5% (w/w)的海藻酸钠水 溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0059] (2)将2. 5g曲拉通，L 5g正己醇，3. 5g正辛烷，与L 0M 2. OmL的CdCl2水溶液、 Pb (N03)2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌1小时制备成均匀的微乳液2。
[0060] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应5h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。
[0061] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0062] 2. 1被检测样品：人血清
[0063] 2. 2 方法
[0064] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0065] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用12% (w/w)的戊二醛水溶 液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0066] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0067] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0068] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0069] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0070] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0071] 3、结果
[0072] 对血清样品的检测结果如下表2所示，：
[0073] 表 2
[0074]
[0075] 实施例3 :
[0076] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0077] (1)将1. 5g曲拉通，0· 5g正己醇，2. 5g正辛烧，1. OmL 1. 5%的海藻酸钠水溶液混 合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0078] (2)将1. 5g曲拉通，0· 5g正己醇，2. 5g正辛烷，与(λ 75M L OmL的CdCl2水溶液， 或Pb (N03) 2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30min制备成均匀的微乳液2。
[0079] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液 2中，室温下搅拌反应3h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球。
[0080] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0081] 2. 1被检测样品：人血清
[0082] 2. 2 方法
[0083] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0084] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用8% (w/w)的戊二醛水溶液 处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0085] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0086] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0087] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0088] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01Μ，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0089] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0090] 3、结果
[0091] 对血清样品的检测结果如下表3所示：
[0092] 表 3
[0093]
[0094] 实施例4 :本发明的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针的检测线 性范围及检出限的测定
[0095] 1、海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针的制备：
[0096] 按照实施例1的方法制备海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针。
[0097] 2、免疫传感器构建过程：
[0098] 20 μ L 200 μ g ·ιΛ 1的AFP、CEA和PSA的捕获抗体混合溶液在4°C条件下在多孔钼 修饰的玻碳电极上孵化过夜。电极表面多余的抗体用〇. 1M，pH = 7. 3的PBS清洗掉。然后， 使用150μ L，2%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异性吸附。电极用0. 1M，pH =7. 3的PBS过量牛血清白蛋白冲洗后用浓度分别为0. 01，0. 05, 0. 1，0. 5, 1，5, 10, 50, 10 Ong · mL 1的AFP、CEA或PSA抗原混合溶液在37°C下孵育超过40min。未反应的抗原使用 0. 1M，pH = 7. 3的PBS清洗掉，在37°C下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海 藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40分钟。然后，免疫传感电极用0. 1M，pH = 7. 3的PBS 清洗到过量的免疫探针。免疫反应完成后，以0. 1M，pH = 6. 5的PBS为检测液，用方波伏安 法检测电流响应信号。
[0099] 3、结果
[0100] 图2为海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针同时检测不同浓度的 AFP、CEA和PSA的差分脉冲伏安图（A)、电流与AFP浓度对数（B)、电流与CEA浓度对数（〇、 电流与PSA浓度对数（D)的线性关系图。
[0101] 从图中可以看出该免疫传感器对AFP、CEA和PSA的检测线性范围均为 0· 01-100ng/mL。其检出限分别为，0· 01ng/mL、0. 0086ng/mL 和 0· 0075ng/mL。
【主权项】
1. 一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过以下方法制备得 到： (1) 将l-3g曲拉通，0. 5-1. 5g正己醇，4-6g正辛烷，l-2mL海藻酸钠水溶液混合搅拌 30-90min制备成均匀的微乳液1 ; (2) 将l-3g曲拉通，0· 5-1. 5g正己醇，4-6g正辛烧，与l-2mL的CdCl2水溶液、Pb (N03) 2 水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液2 ; (3) 将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应l-6h，产物离心，沉淀用去离子 水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。2. 如权利要求1所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于：步骤 (1)所述的海藻酸钠的水溶液的质量百分比浓度为1-2%。3. 如权利要求1所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于：步骤 ⑵所述的CdCl2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M，Pb (N03) 2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M，CuCl2 的水溶液的浓度为〇. 1-2. 0M。4. 权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球在制备海藻酸 镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针中的应用。5. -种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在于通过以下方法 制备得到： (1) 将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子 水洗涤、分散； (2) 将海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离心， 沉淀用去离子水洗涤、分散； (3) 室温下，将活化的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球分别与抗体溶液偶联， 离心除去上清液； (4) 沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免 疫探针于4°C储存。6. 如权利要求5所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在 于：步骤（2)中所用戊二醛的质量百分比浓度为5-15%。7. 权利要求5-6任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针在制 备电化学免疫传感器中的应用，优选的，按照权利要求5的方法分别制备偶联不同种抗体 的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针，将制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻 酸铜纳米微球免疫探针固定在电极的表面，得到能够同时对三种肿瘤标志物进行检测的电 化学免疫传感器。8. -种能够同时实现对肿瘤标志物CEA、AFP和PSA进行检测的电化学免疫传感器，其 特征在于通过以下方法制备得到： (1) 将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子 水洗涤、分散； (2) 将海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离心， 沉淀用去离子水洗涤、分散； (3) 室温下，将活化的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别与抗肿瘤标志物 CEA、AFP或PSA的抗体溶液偶联，离心除去上清液； (4) 沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免 疫探针于4°C储存。 (5) 通过免疫反应将制得的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针固定在 电极的表面，即得。9.权利要求8所述的电化学免疫传感器在制备对肿瘤标志物CEA、AFP和PSA进行同 时检测的试剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒及其制备方法和在制备电化学免疫探针中的应用。本发明通过在微乳液中用镉离子、铅离子或铜离子分别交联海藻酸钠制备了纳米级的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜球形颗粒，且能产生可分辨电化学信号。本发明制备方法的特点是制备条件温和，无需外加信号物质即可直接用于标记。使用此海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒标记不同抗体制备的电化学免疫传感器，能够实现不分区的三靶标的同时检测。本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒免疫探针，以及由其制备得到的电化学免疫传感器在免疫传感领域将具有广泛的应用前景。
【IPC分类】G01N33/543, G01N33/574, C08J3/14, C08L5/04
【公开号】CN105504314
【申请号】CN201410488196
【发明人】马占芳, 王子凤
【申请人】首都师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月22日
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